CN111303111A - 一类新型黄菁近红外二区染料、制备方法及荧光成像应用 - Google Patents

一类新型黄菁近红外二区染料、制备方法及荧光成像应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一类新型黄菁近红外二区染料、制备方法及荧光成像应用。所述近红外二区染料具有式Ⅰ所示结构。经测试表明，本发明所提供的近红外二区染料具有明显的近红外二区荧光发射，能够实现对半胱氨酸等重要生物标志物的特异性检测，并且可用于原位成像。
Figure DDA0002421523130000011

Description

一类新型黄菁近红外二区染料、制备方法及荧光成像应用
技术领域
本发明属于精细化工领域，具体涉及一类新型黄菁近红外二区染料(Flavnirine)、制备方法及其荧光成像应用。
背景技术
对疾病的早期诊断是目前全世界生物学家和医疗工作者关注的热点，特别是利用灵敏度高、特异性强的检测手段实时、原位监测生物标志物具有重大挑战。相比于传统的光学成像技术如超声、CT或MRI等，荧光成像技术由于其非侵入式、高时空分辨率、实时性的显著优势，已经受到医学诊断、治疗等领域的广泛关注。目前，近红外一区(NIR-I，650-900nm)荧光染料(例如FDA批准的吲哚菁绿ICG等)已经被广泛应用于基础和临床研究。但是，NIR-I荧光成像技术由于穿透性不足等问题，仍然是在实际应用于手术指导和深层组织成像中的瓶颈制约。相较而言，近红外二区(NIR-II，1000-1700nm)的荧光信号能在保持微米级成像精度的同时，兼具了更高的信噪比和更深的组织穿透。因此，发展具有新颖结构的NIR-II染料将在疾病早期、特异性诊断方面展现出极大的应用潜力和市场价值。
苯并二噻二唑类染料和菁染料衍生物是已知的典型的NIR-II染料，通常基于共轭体系的拓展实现长波长荧光发射。但上述两类染料往往需要较为复杂的合成，难以进一步引入识别单元实现功能化，对生物标志物的特异性响应。此外，由于较大的π共轭体系，使得该类染料的化学稳定性和光稳定性较差，应用收到限制。因此，发展结构新颖、合成简便、稳定性好、易功能化的新型高性能NIR-II染料，已经成为重大的挑战和亟待解决的难题。
发明内容
本发明涉及一类新型结构简单、合成简便、稳定性好、可生物识别的黄菁NIR-II染料(Flavnirine)的制备及其荧光成像应用。该类染料以黄酮衍生物作为吸电子辅助荧光单元，以色烯衍生物作为电子给体，显著增加了该类染料的Stokes位移，实现了对染料吸收波长和发射波长的有效调控，其发射波长拓展至NIR-II区域。基于该类NIR-II荧光染料，通过引入磷酸酯、丙烯酰基、三氟甲磺酸酯等作为特异性识别单元，构建了系列点亮型NIR-II荧光探针。该类探针在活体肿瘤中实现了高信噪比、特异性的检测示踪成像。
本发明通过下述方案实施：
一类新型黄菁近红外二区染料(Flavnirine)，其结构为式Ⅰ所示：
Figure BDA0002421523110000021
式Ⅰ中，
X为O或N；
R1独立选自式Ⅱ所示基团(其中曲线标记处为取代位，下同)中的任意一种；
其中所述式Ⅱ中：Y为O，S；R4选自H，二甲基氨基或二乙基氨基中的一种；R5选自H，磺酸基，二甲基氨基或二苯基氨基的一种；R6选自C1～C4的烃基或烃基磺酸盐的一种；
Figure BDA0002421523110000022
R2独立选自H或Ⅲ所示基团的任意一种；
Figure BDA0002421523110000023
R3独立选自式Ⅳ所示的检测基团的任意一种；
Figure BDA0002421523110000024
本发明另一个目的在于，揭示上述式I所示化合物的一种用途，即式I所示化合物作为NIR-II荧光探针在生物成像中的应用；或者说，在制备基于黄酮衍生物的NIR-II荧光探针。
此外，本发明还有一个目的在于，提供一种制备式I所示化合物的方法，所示方法的主要步骤是：由式Ⅱ所示化合物与式Ⅴ所示化合物经Knoevenagel缩合反应，制得目标化合物。
Figure BDA0002421523110000031
通用制备方法：
黄菁NIR-II染料合成采用模块化制备方式，合成简便，原料易得：以环己酮为起始原料，依次通过甲酰化反应、取代反应等，得到色烯衍生物；色烯衍生物进一步与黄酮衍生物发生Knoevenagel缩合反应，最后经过甲基去保护制得黄菁NIR-II染料(Flavnirine-OH)。进一步通过酰化反应等，可基于黄菁染料制得NIR-II荧光探针。
Figure BDA0002421523110000032
通用检测方法：
该类探针首先与被检测物(如酶或活性小分子)作用，检测基团离去，释放出具有酚羟基负离子的NIR-II荧光染料母体，经过825nm近红外光的激发，发射出1000-1200nm的NIR-II荧光。
附图说明
图1.Flavnirine-OH(详见实施例1)在二氯甲烷、二甲基亚砜和正丁醇中的紫外吸收图谱(1×10-5M)；其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光度。
图2.Flavnirine-OH(详见实施例1)在二氯甲烷、二甲基亚砜和正丁醇中的荧光图谱(1×10-5M)；
其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。
图3.探针Flavnirine-1随半胱氨酸增加吸收光谱的变化(1×10-5M)，测试体系为PBS和DMSO(PBS比例为40％)；其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光度。
图4.探针Flavnirine-1随半胱氨酸增加NIR-II荧光光谱的变化(1×10-5M)，测试体系为PBS和DMSO(PBS比例为40％)，激发波长为825nm；其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。
图5.探针Flavnirine-1在A549皮下瘤模型小鼠上的NIR-II荧光活体成像应用。
具体实施方式
在本发明一个优选的技术方案中：
X为O；
R1独立选自式Ⅱ所示基团中的任意一种；
其中所述式Ⅱ中：Y为O，S；R4为二甲基氨基；R5选自磺酸基，二甲基氨基或二苯基氨基中的一种；R6选自乙基、丁基、丙基磺酸盐、丁基磺酸盐中的一种；
R2独立选自H或式Ⅲ所示基团的任意一种；
R3独立选自式Ⅱ所示的检测基团的任意一种；
在进一步优选的技术方案中，Y为O，R4为二甲基氨基，R5选自磺酸基、二甲基氨基或二苯基氨基中的一种，R6选自乙基、丁基、丙基磺酸盐、丁基磺酸盐中的一种；
更进一步优选的R5选自磺酸基、二甲基氨基或二苯基氨基中的一种，R6为丁基磺酸盐；
更进一步优选的R5为磺酸基。
下面通过实施例对本发明作进一步的阐述，其目的仅在于更好地理解本发明的内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围：
实施例1
具体合成路线如下：
Figure BDA0002421523110000041
1. 1-甲酰基-2-溴环己烯的合成
Figure BDA0002421523110000051
在250mL三口瓶中加入N,N-二甲基甲酰胺(4.87mL,63.16mmol)和50mL氯仿，向反应体系中滴加三溴化磷(4.96mL,52.63mmol)，0.5h后加入环己酮(2.07g,21.05mmol)，室温搅拌15h。反应结束后，将反应液倒入碎冰中淬灭三溴化磷，用碳酸钠调节pH至7，分液取有机相，干燥、过滤、旋蒸得橘黄色液体，直接进行下一步反应。
2.色烯衍生物的合成
Figure BDA0002421523110000052
在100mL两口瓶中加入1-甲酰基-2-溴环己烯(1.89g,10.00mmol)、2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(1.52g,10.00mmol)、Cs2CO3(9.77g,30.00mmol)，100mLN,N-二甲基甲酰胺溶解，氩气保护，室温搅拌反应16h。反应结束后，旋蒸除去N,N-二甲基甲酰胺，柱层析分离，展开剂为二氯甲烷和乙酸乙酯(乙酸乙酯体积比为5％)，得到500mg橘黄色固体，产率21％。
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ＝1.69-1.75(m,2H,-CH2-),2.45(t,J＝6.04Hz,2H,-CH2-),2.55-2.59(m,2H,-CH2-),3.85(s,3H,-OCH3),6.65-6.67(m,3H,Ph-H,alkene-H),7.07-7.10(d,J＝9.12Hz,1H,Ph-H),10.31(s,1H,-CHO).
Mass spectrometry(ESI positive ion mode for[M+H]+):m/z:calcd forC15H15O3 +:243.1016；found:243.1017.
3.Flavnirine-OCH3的合成
Figure BDA0002421523110000053
在50mL单口瓶中加入二甲基氨基黄酮杂环(50mg,0.137mmol)与色烯衍生物(33mg,0.137mmol)，溶于15mL乙醇，加入乙酸钠(33mg,0.411mmol)，氩气保护反应7h，反应温度为90℃。反应结束后，旋蒸除去乙醇，柱层析分离，展开剂为二氯甲烷和甲醇(甲醇体积比为1％)，得29mg黑色固体，产率36％。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ＝1.84(t,J＝5.6Hz,2H,-CH2-),2.71(s,2H,-CH2-),2.77(s,2H,-CH2-)3.26(s,6H,-N(CH3)2),3.92(s,3H,-OCH3),6.95-6.98(dd,1H,Ph-H),7.08(s,1H,Ph-H),7.19-7.26(m,2H,Ph-H),7.34-7.38(d,J＝14.52Hz,2H,alkene-H),7.48-7.50(d,J＝8.26Hz,1H,Ph-H),7.68-7.70(m,3H,Ph-H),8.21(s,1H,Ph-H),8.40-8.43(m,3H,Ph-H),8.78-8.81(d,J＝14.2Hz,1H,alkene-H).
Mass spectrometry(ESI positive ion mode for[M]+):m/z:calcd forC33H30NO3 +:488.2220；found:488.2219.
4.Flavnirine-OH的合成
Figure BDA0002421523110000061
在50mL两口瓶中加入Flavnirine-OCH3(50mg,0.085mmol)，溶于20mL二氯甲烷，冰水浴条件下滴加三溴化硼(1mL,0.010mol)，之后室温搅拌氩气保护反应24h。反应结束后，向反应液中滴加水淬灭反应，加入100mL二氯甲烷，水洗3次(100mL×3)，无水硫酸钠干燥、过滤、旋蒸得黑色固体。柱层析分离，展开剂为二氯甲烷和甲醇(甲醇体积比为2％)，得到10mg黑色固体，产率20％。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ＝1.82(m,2H,-CH2-),2.67(t,2H,-CH2-),2.74(t,2H,-CH2-),3.15(s,6H,-N(CH3)2),6.70-6.72(dd,J1＝8.68Hz,J2＝1.68Hz,1H,Ph-H),6.86(s,1H,Ph-H),6.94-7.00(m,3H,Ph-H),7.38-7.41(d,J＝8.76Hz,1H,Ph-H),7.47(s,1H,Ph-H),7.62-7.64(m,3H,Ph-H),7.90(s,1H,Ph-H),8.15-8.17(d,J＝9.4Hz,1H,Ph-H),8.27-8.28(m,2H,Ph-H),8.46-8.49(d,J＝13.56Hz,1H,alkene-H).
Mass spectrometry(ESI positive ion mode for[M]+):m/z:calcd forC32H28NO3 +:474.2064；found:474.2064.
实施例2
1.Flavnirine-1的合成
Figure BDA0002421523110000071
在50mL单口瓶中加入Flavnirine-OH(20mg,0.042mmol)，溶于20mL二氯甲烷，加入三乙胺(0.023mL,0.169mmol)，冰水浴条件下滴加丙烯酰氯(0.015mL,0.169mmol)，室温搅拌氩气保护反应16h。反应结束后，加入100mL二氯甲烷溶解，水洗3次(100mL×3)，无水硫酸钠干燥、过滤、旋蒸得黑色固体。柱层析分离，展开剂为二氯甲烷和甲醇(甲醇体积比为2％)，得17mg黑色固体，产率65％。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ＝1.81-1.83(m,2H,-CH2-),2.67-2.70(m,4H,-CH2-),3.23(s,6H,-N(CH3)2),6.26-6.28(m,1H,Ph-H),6.45-6.52(m,1H,Ph-H),6.61-6.65(d,J＝17.2Hz,1H,alkene-H),6.98(s,1H,Ph-H),7.10-7.12(dd,J1＝8.36Hz,J2＝2.12Hz,1H,Ph-H),7.18-7.23(m,3H,Ph-H),7.42(s,1H,Ph-H),7.48-7.51(d,J＝8.36Hz,1H,Ph-H),7.62-7.71(m,3H,Ph-H),8.14(s,1H,Ph-H),8.32-8.39(m,3H,Ph-H),8.58-8.62(d,J＝14.68Hz,1H,alkene-H).
Mass spectrometry(ESI positive ion mode for[M]+):m/z:calcd forC35H30NO4 +:528.2169；found:528.2171.
2.Flavnirine-2的合成
Figure BDA0002421523110000072
在50mL单口瓶中加入Flavnirine-OH(30mg,0.063mmol)，溶于20mL二氯甲烷，加入三乙胺(0.035mL,0.254mmol)，冰水浴条件下滴加三氟甲磺酸酐(0.043mL,0.254mmol)，室温搅拌氩气保护反应16h。反应结束后，加入100mL二氯甲烷溶解，水洗3次(100mL×3)，无水硫酸钠干燥、过滤、旋蒸得黑色固体。柱层析分离，展开剂为二氯甲烷和甲醇(甲醇体积比为2％)，得15mg黑色固体，产率34％。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ＝1.82-1.85(m,2H,-CH2-),2.67-2.69(m,2H,-CH2-),2.75-2.76(m,2H,-CH2-),3.30(s,6H,-N(CH3)2),7.20(s,1H,Ph-H),7.24-7.27(dd,J1＝8.60Hz,J2＝2.44Hz,1H,Ph-H),7.35-7.41(m,3H,Ph-H),7.59-7.61(d,J＝8.56Hz,1H,Ph-H),7.67-7.76(m,4H,Ph-H),8.32(s,1H,Ph-H),8.43-8.45(d,J＝7.80Hz,2H,Ph-H),8.50-8.52(d,J＝9.48Hz,1H,Ph-H),8.58-8.62(d,J＝14.68Hz,1H,alkene-H).
Mass spectrometry(ESI positive ion mode for[M]+):m/z:calcd forC33H27F3NO5S+:606.1557；found:606.1557.
实施例3
染料Flavnirine-OH的吸收、荧光光谱
取实施例1制备的染料Flavnirine-OH溶于分析纯二甲基亚砜(DMSO)中，制成1.0×10-3M的储备液。分别取30μL上述储备液加入到3mL二氯甲烷、二甲基亚砜和正丁醇中，混合均匀后转移至光学石英比色皿(10×10mm)中测试其吸收和荧光光谱。如图1所示，其最大吸收波长位于760nm左右。如图2所示，以760nm作为激发波长NIR-II发射峰大约位于900-1200nm之间。
实施例4
探针Flavnirine-1对半胱氨酸的光谱响应
取实施例1制备的探针Flavnirine-1溶于分析纯二甲基亚砜中，制成1.0×10-3M的储备液。半胱氨酸溶于去离子水中，制成1.0×10-3M的储备液。然后制备多组3mL的PBS缓冲液体积比为40％的DMSO/PBS混合溶剂。取30μL上述储备液加入到已制备的DMSO/PBS混合溶剂中，分别加入不同比例的半胱氨酸，混合均匀，在37℃条件下孵育30min后测试其荧光光谱。如图3所示，当探针Flavnirine-1与半胱氨酸反应后，其吸收光谱中825nm处吸收峰急剧升高。如图4所示，以825nm为激发光，随着半胱氨酸比例的增加，其900-1200nm处的NIR-II荧光强度逐渐增强。
实施例5
探针Flavnirine-1应用于活体检测
本发明中所有活体实验均遵守实验室动物饲养和使用的规章制度，并得到华东理工大学大学动物饲养和使用委员会批准。实验用荷瘤裸鼠购自上海斯莱克动物实验有限公司，饲养在无菌室中层流通风橱内的无菌鼠笼中，使用高压蒸汽处理过的食物和水进行喂食。
为评估探针Flavnirine-1活体应用性能，采用荷瘤裸鼠作为成像对象。一组A549(人肺癌细胞)皮下瘤小鼠原位注射半胱氨酸抑制剂N-乙基马来酰亚胺(NEM)，一组注射生理盐水。30min后同时对两组小鼠注射1.0×10-5M的探针Flavnirine-1溶液。注射后，使用Optical and X-ray Small Animal Imaging System对小鼠进行整体的光学成像，激发波长和接收波长分别为808nm和900-1700nm。成像实验前，对裸鼠进行含2.5％的异氟烷气体麻醉。从图5中看出，原位注射化合物Flavnirine-1后，未提前注射NEM小鼠出现明显的荧光信号。而注射NEM小鼠荧光信号较弱。表明化合物Flavnirine-1具有很好的点亮NIR-II荧光活体成像特性，可进一步应用于生物活体测试中。

Claims (8)

1.一类新型黄菁近红外二区染料，其结构为式Ⅰ所示：
Figure FDA0002421523100000011
式Ⅰ中：
X为O或N；
R1独立选自式Ⅱ所示基团(其中曲线标记处为取代位)中的任意一种；
其中所述式Ⅱ中：Y为O或S；R4选自H、二甲基氨基或二乙基氨基中的一种；R5选自H、磺酸基、二甲基氨基或二苯基氨基的一种；R6选自C1～C4的烃基或烃基磺酸盐的一种；
Figure FDA0002421523100000012
R2独立选自H或Ⅲ所示基团的任意一种；
Figure FDA0002421523100000013
R3独立选自式Ⅱ所示的检测基团的任意一种；
Figure FDA0002421523100000014
2.根据权利要求1所述的一类新型黄菁近红外二区染料，其结构为式Ⅰ所示，其特征在于：
X为O；
R1独立选自式Ⅱ所示基团中的任意一种；
其中所述式Ⅱ中：Y为O或S；R4为二甲基氨基；R5选自磺酸基、二甲基氨基或二苯基氨基中的一种；R6选自乙基、丁基、丙基磺酸盐或丁基磺酸盐中的一种；
Figure FDA0002421523100000021
3.根据权利要求1所述的一类新型黄菁近红外二区染料，其特征在于：Y为O，R4为二甲基氨基，R5选自磺酸基、二甲基氨基或二苯基氨基中的一种，R6选自乙基、丁基、丙基磺酸盐或丁基磺酸盐中的一种。
4.根据权利要求1所述的一类新型黄菁近红外二区染料，其特征在于：R5选自磺酸基、二甲基氨基或二苯基氨基中的一种，R6为丁基磺酸盐。
5.根据权利要求1所述的一类新型黄菁近红外二区染料，其特征在于：R5为磺酸基。
6.一种如权利要求1所述的一类新型黄菁近红外二区染料的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
以环己酮为原料，依次通过甲酰化反应、取代反应，得到色烯衍生物；色烯衍生物进一步与黄酮衍生物发生Knoevenagel缩合反应，最后经过甲基去保护制得黄菁近红外二区染料(Flavnirine-OH)。
7.一种基于黄酮衍生物的NIR-II荧光探针，如权利要求6所述的一类新型黄菁近红外二区染料，通过酰化反应，基于黄菁染料制得系列近红外二区荧光探针。
8.一种如权利要求7所述的一类新型黄菁近红外二区染料在原位成像的应用。
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