CN111004624B - 一种具有ptt效应及聚集诱导发光增强效应的近红外荧光探针的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有PTT效应及聚集诱导发光增强效应的近红外荧光探针的制备,该荧光探针由具有近红外激发及发射的传统荧光核IR‑780碘化物与具有聚集诱导发光分子TPE通过氧醚键连接构成。该探针与IR‑780碘化物相比,在乙醇溶液中荧光强度明显增强,在混合溶剂中表现出典型的AIEE效应;浓度为0.3µM时能选择性地针对多种癌细胞产生光热杀伤效果,且该浓度对正常细胞无明显杀伤作用,具有显著的杀伤选择性。该探针制备简单,具有很好的光稳定性和光热转化能力,并且激发与发射均处于近红外区域,背景干扰与对生物体发损伤均较小,具有诊疗一体化功能,有望应用于临床研究中。
Description
技术领域
本发明属于荧光生物诊疗技术领域,具体涉及一类具有PTT效应及聚集诱导发光增强效应的近红外荧光探针的制备。
背景技术
在光学成像技术中,波长范围位于(700–1000 nm)近红外(NIR)荧光成像由于其优良的性能而受到广泛关注。由于生物体和组织在此区域具有较低的吸收和自发荧光,且对近红外光散射也较少,可以减少背景干扰,提高灵敏度,同时近红外光在组织细胞内具有较强的穿透性,对细胞有较小的光损伤。
传统的荧光染料通常含有共轭的平面结构,在稀溶液中或者单分散状态下荧光亮度很强,但在高浓度下或者固体状态下,由于发生分子间的π-π堆积,使激发态分子通常以非辐射方式回到基态,导致荧光猝灭。造成浓度猝灭的主要原因是聚集体的形成,即“聚集诱导荧光猝灭(ACQ)”。这种ACQ现象严重阻碍了荧光染料在光电子和生物成像等众多应用领域的应用。2001年,Tang课题组发现一些噻咯分子在稀溶液状态下不发光,而在聚集状态下发出明亮的荧光,将此现象形象的定义为“聚集诱导发光(AIE)”。AIE的发展为发光材料的进一步发展提供了一个崭新的平台,使固态有机发光材料在光电器件,化学传感,生物成像等方面有了一个质的飞跃。
近年来,具有光敏效果的光疗法包括光热治疗(PTT)和光动力治疗(PDT),由于其微创性、低的不良反应性、抗癌的广谱性、可控性和协同治疗等特点,显示了独特的应用优势。国内外学者设计了多种模式下的荧光成像及化疗或光疗相结合的方式,为肿瘤诊断和治疗一体化提供了一条可行途径。因此,开发具有靶向性、光学稳定性、毒性小或者治疗作用的功能性近红外荧光染料和探针成为生命科学研究领域的热点。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种具有PTT效应及聚集诱导发光增强特性的近红外荧光探针分子,该探针能够定位于细胞线粒体,并在近红外区激发与发射,对细胞损伤小,背景干扰小。
本发明的荧光探针具有明显的光学杀伤作用,在0.3 µM时能选择性地针对多种癌细胞产生光热杀伤,同时对正常细胞无明显杀伤,具有光学杀伤选择性的优势,可为诊疗一体化提供有效的光热治疗试剂。
本发明提供了荧光探针的制备方法,包括步骤如下:
氮气保护下,以无水DMF为溶剂,IR-780与1,2-二苯基-1,2-二(4-羟基苯)乙烯在三乙胺作用下,80°C反应5小时,制备得到终产物荧光探针IR780-O-TPE。
本发明还提供了所述荧光探针对线粒体的定位。
与现有技术相比,本发明的有益效果为。
本发明的具有PTT效应及聚集诱导发光增强效应的近红外荧光探针具有如下特点:(1)具有AIEE效应,具备良好的光稳定性及抗光漂白性;(2)该探针激发与发射均处于近红外区,对细胞损伤及背景干扰较小;(3)该探针能靶向线粒体,可作为近红区线粒体探针的补充;(4)该探针具有良好的光热转化性能,在较低浓度时可对多种癌细胞进行光学杀伤,具有抗癌广谱性。该探针良好的光学特性及光热特性可进一步开发为临床诊疗试剂。
附图说明
图1为本发明荧光探针的结构图。
图2为本发明荧光探针的合成路线。
图3为本发明荧光探针(10 μM)在乙醇溶液里的紫外吸收。
图4为本发明荧光探针(10 μM)在乙醇/正己烷混合溶液里的荧光发射,Ex=720nm。
图5为本发明荧光探针在不同浓度时乙醇溶液里的PTT效应。
图6为本发明荧光探针在Hela细胞中线粒体的定位。
图7为本发明荧光探针在Hela细胞中的光稳定性研究。
图8为本发明荧光探针对不同癌细胞系的PTT效应。
图9为本发明荧光探针对不同正常细胞系的PTT效应。
具体实施方式
下面结合附图和实例,对本发明荧光探针及其制备方法和应用的具体实现作进一步说明。
实施例1:
探针IR780-O-TPE的合成,合成路线图如图2。
具体合成步骤:
向10 mL两口瓶中加入IR-780碘化物(20 mg,0.03 mmol),1,2-二苯基-1,2-二(4-羟基苯)乙烯(40.0 mg 0.11 mmol),真空-氮气置换3次,然后用注射器加入2 mL无水DMF,0.2 mL无水三乙胺。氮气保护下,加热至85℃反应5 h,TLC检测反应,反应完全后,不经其他处理,直接油泵蒸干溶剂,粗产物用硅胶快速柱分离,用CH2Cl2:CH3OH=20:1的洗脱液进行洗脱,得20 mg墨绿色固体,收率约为80%。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.92 (d, 2H), 7.55(d, 2H), 7.35(t, 2H), 7.27–7.24 (m, 3H), 7.18 (t, 2H), 7.12−7.01 (m, 17H),6.12 (d, 2H), 4.09 (t, 4H), 2.76 (t, 4H), 2.08 (t, 2H), 1.90-1.85 (m, 4H),1.35 (s, 12H), 1.05 (t, 6H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.31, 162.12,147.41, 132.12, 131.32, 131.28, 131.05, 130.99, 129.48, 128.80, 128.21,127.92, 127.72, 124.82, 121.95, 110.72, 100.30, 48.52, 45.97, 29.68, 27.95,25.18, 24.41, 21.10, 20.77, 11.69. HRMS (ESI) m/z: [M]+, 计算, 867.4884;实际值, 867.4885。
实施例2:
紫外可见吸收光谱:配制10 μM IR780-O-TPE与IR-780碘化物的乙醇溶液,进行300–900 nm的紫外可见光谱扫描,结果如图3。
实施例3:
AIEE性质测试:IR780-O-TPE易溶于乙醇,不溶于正己烷。在万分之一分析天平上称取适量IR780-O-TPE,加入适量乙醇溶解,使其浓度为1 mM作为母液。用移液枪吸取 10 μL母液于EP管中,按比例加入乙醇,随后,在振动下,将溶液加入到正己烷中,制备含正己烷ƒh为90%,70%,50%,30%,10%,0%的乙醇/正己烷混合溶液,使溶液终浓度为 10 μM,配制好的混合液室温静置1 h,测定荧光光谱,结果如图4。
实施例4:
PTT:配制终浓度为10 μM、30 μM、50 μM的IR780-O-TPE乙醇溶液2 mL,配制终浓度为10 μM的IR780-O-TPE DMEM溶液2 mL。将溶液置于24孔细胞培养板中,插入温度计,用808 nm激光照射,电流设为0.5 A,使照射功率为0.5 W/cm2。分别记录0 min,0.5 min,1min–10 min(每隔一分钟记录一次温度值),绘制成温度-时间曲线图,结果如图5。
实施例5:
将HeLa细胞接种在35 mm玻璃底培养皿中(共聚焦专用),密度为3*105/皿,培养过夜。将皿中的培养基弃去,分别加入5 μM的探针IR780-O-TPE,培养30 min后,再加入100nM的Mito-tracker Green,继续培养60 min。激光共聚焦观察前,吸出培养液,并用PBS洗3次。探针IR780-O-TPE的检测条件为:633 nm激发,发射收集650–800 nm波段。Mito-TrackerGreen检测条件为:488 nm激发,发射收集500–530 nm波段,结果如图6。
实施例6:
将HeLa细胞接种在35 mm玻璃底培养皿中(共聚焦专用),密度为3*105/皿,培养过夜。将皿中的培养基弃去,分别加入10 μM的探针IR780-O-TPE、10 μM IR-780碘化物,孵育30 min后,直接进行共聚焦进行荧光与时间检测。检测条件如上,结果如图7。
实施例7:
将HeLa、A549、MDA-MB-231细胞以每孔20000的密度接种于96孔板中,培养24 h。将化合物IR780-OP-TPE、IR780-O-TPE和IR-780碘化物的母液分别用培养基稀释成不同的浓度(0.3、0.6、1.2 μM)。将培养板中的培养基吸出,加入不同浓度的探针,每个浓度设置3个复孔,继续培养24 h,用808 nm激光照射每孔,电流为0.36 A,使照射功率为0.5 W/cm2,照射5 min。继续培养24 h,加入20 μL MTT溶液(0.5 mg /mL),孵育4 h。吸出MTT溶液及培养基的混合液,每孔加入150 μL DMSO,摇床震荡10 min以充分溶解形成的甲瓒晶体。使用酶标仪记录570 nm处的紫外吸收值,并用以下公式计算细胞生长活力:活力(%) = (实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)*100%,得到细胞毒性数据。结果如图8。
实施例8:
将NIH-3T3、MLG、bEnd.3细胞以每孔20000的密度接种于96孔板中,培养24 h。将化合物IR780-OP-TPE、IR780-O-TPE和IR-780碘化物的母液分别用培养基稀释成不同的浓度(0.3、0.6、1.2 μM)。将培养板中的培养基吸出,加入不同浓度的探针,每个浓度设置3个复孔,继续培养24 h,用808 nm激光照射每孔,电流为0.36 A,使照射功率为0.5 W/cm2,照射5 min。继续培养24 h,其余操作如上,结果如图9。
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