CN104830318B - 一种高聚集态荧光发射的荧光标记分子及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种高聚集态荧光发射的荧光标记分子，化合物名称为(2Z,2’Z)‑3,3’‑(2,5‑二(二苯胺基)‑1,4‑苯基)二(2‑(3,5‑二(三氟甲基)苯基)丙烯腈，分子式为C52H30F12N4，在波长为365nm的紫外灯照射下发出红色荧光；制备的荧光标记分子中的纳米粒子在水溶液中用普兰尼克包覆，在波长大于650nm的近红外光区标记肿瘤细胞。本发明的优点是：该荧光标记分子具有聚集诱导发光特性和高聚集态发光的优点，亮度高、毒性小；用于标记肿瘤细胞操作简单、成本低、特异性好，可有效避免生物组织自发荧光的干扰，提高荧光成像的灵敏度，为肿瘤细胞近红外荧光标记方法的研究提供了一种可用的荧光标记材料。
Description
技术领域
本发明涉及基于荧光的光学成像技术，特别是一种高聚集态荧光发射的荧光标记分子及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤(癌症)是威胁人类健康的主要疾病之一。以我国为例，《2013中国肿瘤登记年报》显示，2010年，全国恶性肿瘤发病率为235.23/10万(男性268.65/10万，女性200.21/10万)，死亡率为148.81/10万(男性186.37/10万，女性109.42/10万)，这意味着平均每天每分钟就有6人被诊断为恶性肿瘤。按照平均寿命74岁计算，人一生中患恶性肿瘤的几率是22％，恶性肿瘤已经成为一种常见疾病。除加强预防外，早期诊断可发现早期恶性肿瘤并及时给予治疗，不仅可以提高生存率，同时也能够改善病人的生存质量。在肿瘤诊断方面,目前应用较为成熟的医学成像手段有：磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)、电子计算机X射线断层扫描(CT)、超声波扫描(B超)等。然而，这些非光学成像手段存在着辐射大、成本高、操作复杂、特异性差等一系列缺点。与这些方法不同，光学成像尤其是基于荧光的光学成像技术具有对样品无辐射损伤、非侵入、灵敏度高和可实时成像等优点，在恶性肿瘤的早期诊断和治疗方面有着广阔的应用前景。其中，近红外发光(650-900nm)的荧光标记材料可有效避免生物组织自发荧光的干扰，并且体内血红蛋白、水、脂质对近红区荧光的吸收系数也最低，这有助于提高荧光成像的灵敏度，受到研究人员的青睐。
“聚集诱导发光(Aggregation-induced emission,AIE)”的概念是香港科技大学唐本忠院士于2001年首次提出的。他们发现1-甲基-1,2,3,4,5-五苯基噻咯(MPPS)在完全溶于溶液中时，基本没有荧光发射，而聚集态或固态表现出非常强的荧光发射，因此提出了“聚集诱导发光”的概念。AIE分子在聚集态或固态条件下优异的发光性质，为彻底解决传统有机荧光材料的荧光自淬灭问题提供了一个全新的途径。此后，国内外众多研究者对于AIE现象进行了深入的研究探索，利用AIE分子构筑新型化学/生物荧光探针的研究已成为研究热点，并且取得一些颇有意义的研究成果。在荧光生物成像方面，利用AIE分子构筑的荧光标记材料不仅解决了传统荧光分子的聚集荧光淬灭问题，并且通过增加荧光分子负载浓度的方法，可以极大地提高荧光标记材料的荧光强度和抗光漂白能力。目前，近红外发光(荧光发射大于650nm)的AIE分子的种类不多。它们的荧光发射波谱只有部分在近红外区，并且荧光量子效率也需进一步提高。因此，发展新型近红外发光，荧光量子效率高的AIE分子将其用于恶性肿瘤的荧光标记和诊断，能够减小生物组织的背景干扰，提高荧光成像的信号强度和信噪比。
发明内容
本发明的目的是针对上述存在问题，提供一种高聚集态荧光发射的荧光标记分子及其制备方法，该荧光标记分子具有聚集诱导发光特性和高聚集态发光的优点，在水溶液中用两亲性聚合物分子F127将其包覆，所制备的荧光纳米粒子可标记肿瘤细胞，近红外发光、亮度高、毒性小。
本发明的技术方案：
一种高聚集态荧光发射的荧光标记分子，化合物名称为(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二(二苯胺基)-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈[(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-bis(diphenylamino)-1,4-phenylene)bis(2-(3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl)acrylonitrile),DPTPA]，分子式为C52H30F12N4，在波长为365nm的紫外灯照射下发出红色荧光，该化合物DPTPA的分子结构式为：
一种所述高聚集态荧光发射的荧光标记分子的制备方法，步骤如下：
1)将1,4-二溴-2,5-二甲醛基苯、3,5-二(三氟甲基)苯与无水乙醇均匀混合，得到混合液；
2)将NaOH溶解于无水乙醇中，得到NaOH-乙醇溶液；
3)在N2保护下将NaOH-乙醇溶液滴加到混合液中，室温下搅拌反应1小时，冷却至室温后过滤，将所得固体用水、乙醇交替清洗三次，干燥后用氯仿重结晶，得到黄色晶体(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈；
4)将(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈、2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯、三(二亚苄基丙酮)二钯、磷酸钾和二苯胺均匀混合，在N2保护下逐滴加入甲苯，110℃下回流24小时，得到反应液；
5)将上述反应液倒入水中，反应液与水的体积比为1:10，用氯仿萃取三次，合并萃取液用饱和食盐水清洗后用无水硫酸镁干燥，旋转蒸发后得粗产品；
6)将上述粗产品用体积比为1：1的二氯甲烷-石油醚混合液作洗脱剂柱层析，然后用氯仿重结晶纯化，制得红色晶体状高聚集态荧光发射的荧光标记分子。
所述1,4-二溴-2,5-二甲醛基苯、3,5-二(三氟甲基)苯与无水乙醇的用量比为1.130mmol：2.260mmol：20mL。
所述NaOH-乙醇溶液中NaOH与无水乙醇的用量比为16.70mmol：10mL。
所述(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈、2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯、三(二亚苄基丙酮)二钯、磷酸钾、二苯胺与甲苯的用量比为0.2mmol：0.06mmol：0.03mmol：2mmol：2mmol：1mL。
所述荧光标记分子DPTPA的合成路线表示如下：
一种所述高聚集态荧光发射的荧光标记分子的应用，将制备的荧光标记分子中的纳米粒子在水溶液中用普兰尼克包覆，在波长大于650nm的近红外光区标记肿瘤细胞，方法是：
1)将荧光标记分子(DPTPA)和普兰尼克(F127)溶解于四氢呋喃中形成均一溶液，荧光标记分、普兰尼克与四氢呋喃的用量比为1mg：20mg：2mL；
2)将上述溶液缓慢逐滴滴加至水中，DPTPA与水的用量比为1mg：5mL，搅拌10-12小时以使四氢呋喃充分挥发，制得荧光纳米粒子细胞培养液，其中纳米粒子的浓度为4mg/mL；
3)肿瘤细胞荧光成像实验：
细胞的共聚焦成像实验在Nikon A1型荧光共聚焦显微镜上进行，选取对数生长期的A549细胞-人体肺腺癌上皮细胞，按每孔接种10000个细胞接种于96孔板中，培养24h，然后吸出培养液，加入荧光纳米粒子细胞培养液，并保持每个孔中纳米粒子的浓度为40μg/mL，继续培养12h，最后用新鲜的细胞培养液清洗细胞以除去未标记的纳米粒子，在荧光共聚焦显微镜下观察，激发波长为488nm，在大于650nm范围收集图像。
本发明的积极效果是：
该荧光标记分子具有聚集诱导发光特性和高聚集态发光的优点，近红外发光、亮度高、毒性小，荧光发射范围位于长波长600-750nm处，具有大于160nm的斯托克斯位移；用于标记肿瘤细胞操作简单、成本低、特异性好，可有效避免生物组织自发荧光的干扰，提高荧光成像的灵敏度，为以后的肿瘤细胞近红外荧光标记方法的研究提供了一种可用的荧光标记材料。
附图说明
图1为荧光分子DPTPA的紫外-可见吸收光谱图。
图2为荧光分子DPTPA在不同比例的四氢呋喃-水混合溶液中的荧光光谱图。
图3为以F127包覆DPTPA所制备的纳米粒子标记A549细胞的激光共聚焦照片。
图4为以F127包覆DPTPA所制备的纳米粒子对A549细胞的细胞毒性实验。
具体实施方式
下面通过实施例具体的说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。
实施例：
一种高聚集态荧光发射的荧光标记分子，化合物名称为(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二(二苯胺基)-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈[(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-bis(diphenylamino)-1,4-phenylene)bis(2-(3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl)acrylonitrile),DPTPA]，分子式为C52H30F12N4，在波长为365nm的紫外灯照射下发出红色荧光，该化合物DPTPA的分子结构式为：
其制备方法，步骤如下：
1)在100mL圆底烧瓶中，将0.3300g(1.130mmol)1,4-二溴-2,5-二甲醛基苯、0.5718g(2.260mmol 3,5-二(三氟甲基)苯与20mL无水乙醇均匀混合，得到混合液；
2)将6.0g(16.70mmol)NaOH溶解于10mL无水乙醇中，得到NaOH-乙醇溶液；
3)利用恒压低液漏斗，在N2保护下将NaOH-乙醇溶液滴加到混合液中，室温下搅拌反应1小时，冷却至室温后过滤，将所得固体用水、乙醇交替清洗三次，干燥后用氯仿重结晶，得到黄色晶体(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈；
4)干燥好的带有冷凝管和恒压滴液漏斗的25mL两口瓶中，将0.1520g(0.2mmol)(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈、27.6mg(0.06mmol)2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯、17.5mg(0.03mmol)三(二亚苄基丙酮)二钯、0.4245g(2mmol)磷酸钾和0.3384g(2mmol)二苯胺均匀混合，在N2保护下逐滴加入1mL甲苯，110℃下回流24小时，得到反应液；
5)将10mL上述反应液倒入100mL水中，用氯仿萃取三次，合并萃取液用饱和食盐水清洗后用无水硫酸镁干燥，旋转蒸发后得粗产品；
6)将上述粗产品用体积比为1：1的二氯甲烷-石油醚混合液作洗脱剂柱层析，然后用氯仿重结晶纯化，制得红色晶体状高聚集态荧光发射的荧光标记分子。
该荧光标记分子的基本数据：
1H NMR(400MHz,DSMO-d6,TMS,ppm):δ6.96(t,J＝14.8Hz,4H),7.07-7.09(d,8H),7.26(t,8H),7.64(s,2H),7.82(s,4H),8.13(s,4H)；MS(HPLC-MS)m/z:937.23(M+),938.22(M++1)。
该荧光标记分子的光物理性质：
1)荧光分子DPTPA的紫外-可见吸收光谱：
将荧光分子DPTPA溶于四氢呋喃的溶液中，至终浓度为1.0×10-5Μ，如图1所示：测得其紫外-可见吸收光谱的最大吸收330nm左右，并且在505nm左右也有一较小的吸收峰，吸收范围为300-550nm。
2)荧光分子DPTPA在不同比例的四氢呋喃-水混合溶液中的荧光光谱：
荧光分子DPTPA在四氢呋喃溶液中，几乎没有荧光，当溶液中水含量为60％时，荧光强度明显增强，并且荧光强度随着水含量的提高而逐渐增强。从图2中可以看出，当混合溶液中水含量小于60％时，溶液几乎没有荧光，这时的溶液是澄清的，没有聚集体产生；当水含量达到60％时，荧光分子DPTPA开始聚集，荧光强度明显增强，当水含量为70％时，溶液的荧光强度是其纯乙腈溶液荧光强度的35倍。由此可见，荧光分子DPTPA具有典型的AIE性能。
该荧光标记分子的应用：
所述高聚集态荧光发射的荧光标记分子的应用，将制备的荧光标记分子中的纳米粒子在水溶液中用两亲性聚合物分子F127包覆，在波长大于650nm的近红外光区标记肿瘤细胞，方法是：
1)将荧光标记分子(DPTPA)和普兰尼克(F127)溶解于四氢呋喃中形成均一溶液，荧光标记分、普兰尼克与四氢呋喃的用量比为1mg：20mg：2mL；
2)将上述溶液缓慢逐滴滴加至水中，DPTPA与水的用量比为1mg：5mL，搅拌10-12小时以使四氢呋喃充分挥发，制得荧光纳米粒子细胞培养液，其中纳米粒子的浓度为4mg/mL；
3)肿瘤细胞荧光成像实验：
细胞的共聚焦成像实验在Nikon A1型荧光共聚焦显微镜上进行，选取对数生长期的A549细胞-人体肺腺癌上皮细胞，按每孔接种10000个细胞接种于96孔板中，培养24h，然后吸出培养液，加入荧光纳米粒子细胞培养液，并保持每个孔中纳米粒子的浓度为40μg/mL，继续培养12h，最后用新鲜的细胞培养液清洗细胞以除去未标记的纳米粒子，在荧光共聚焦显微镜下观察，激发波长为488nm，在大于650nm范围收集图像。
如图3所示，F127包覆DPTPA的纳米粒子能够被A549细胞所吞噬，在细胞中，纳米粒子都可以发出明亮的红色荧光(大于650nm)，说明荧光纳米粒子具有细胞近红外荧光标记功能，可以作为一种新型的成像试剂应用于肿瘤细胞成像的研究中。
4)以普兰尼克(F127)包覆DPTPA所制备的纳米粒子对A549细胞的细胞毒性实验：
实验采用CCK-8法来评价F127包覆DPTPA荧光纳米粒子对A549细胞的毒性作用。如图4所示，在含有25、50、100μg/mL的F127包覆DPTPA荧光纳米粒子的培养基中培养24小时，A549细胞增殖情况没有受到明显的影响，细胞的存活率大于80％。数据表明，这些纳米粒子(≤100μg/mL)基本没有细胞毒性，可以作为细胞荧光成像标记材料使用。
Claims (5)
1.一种高聚集态荧光发射的荧光标记分子，其特征在于：化合物名称为(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二(二苯胺基)-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈[(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-bis(diphenylamino)-1,4-phenylene)bis(2-(3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl)acrylonitrile),DPTPA]，分子式为C52H30F12N4，在波长为365nm的紫外灯照射下发出红色荧光，该化合物DPTPA的分子结构式为：
2.一种如权利要求1所述高聚集态荧光发射的荧光标记分子的制备方法，其特征在于步骤如下：
1)将1,4-二溴-2,5-二甲醛基苯、3,5-二(三氟甲基)苯乙腈与无水乙醇均匀混合，得到混合液；
2)将NaOH溶解于无水乙醇中，得到NaOH-乙醇溶液；
3)在N2保护下将NaOH-乙醇溶液滴加到混合液中，室温下搅拌反应1小时，冷却至室温后过滤，将所得固体用水、乙醇交替清洗三次，干燥后用氯仿重结晶，得到黄色晶体(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈；
4)将(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈、2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯、三(二亚苄基丙酮)二钯、磷酸钾和二苯胺均匀混合，在N2保护下逐滴加入甲苯，110℃下回流24小时，得到反应液；
5)将上述反应液倒入水中，反应液与水的体积比为1:10，用氯仿萃取三次，合并萃取液用饱和食盐水清洗后用无水硫酸镁干燥，旋转蒸发后得粗产品；
6)将上述粗产品用体积比为1：1的二氯甲烷-石油醚混合液作洗脱剂柱层析，然后用氯仿重结晶纯化，制得红色晶体状高聚集态荧光发射的荧光标记分子。
3.根据权利要求2所述高聚集态荧光发射的荧光标记分子的制备方法，其特征在于：所述1,4-二溴-2,5-二甲醛基苯、3,5-二(三氟甲基)苯乙腈与无水乙醇的用量比为1.130mmol：2.260mmol：20mL。
4.根据权利要求2所述高聚集态荧光发射的荧光标记分子的制备方法，其特征在于：所述NaOH-乙醇溶液中NaOH与无水乙醇的用量比为16.70mmol：10mL。
5.根据权利要求2所述高聚集态荧光发射的荧光标记分子的制备方法，其特征在于：所述(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈、2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯、三(二亚苄基丙酮)二钯、磷酸钾、二苯胺与甲苯的用量比为0.2mmol：0.06mmol：0.03mmol：2mmol：2mmol：1mL。
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