CN102940893B - 具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂及其制备方法。该造影剂以上转换发光材料碳纳米球为核，通过偶联剂，在碳纳米球表面修饰钆螯合剂而得到的，其中碳纳米球、偶联剂和钆螯合剂的摩尔比为：1:1:1-10:1:1。该双功能造影剂具有粒径小、结晶度高、分散均匀、性能稳定、荧光和磁共振信号均较强的特点。所得的产物能满足临床应用的需求。

Description

具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种碳纳米球造影剂及其制备方法，特别是一种具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂及其制备方法。

背景技术

在生物医学领域，对细胞、生物分子进行染色、标记和检测一直是生物医学分析的重要内容。近年来，随着纳米科技的迅速发展，纳米材料在生物标记中的应用引起了人们的广泛关注。利用纳米颗粒作为新型标记物用于生物标记，不仅能够有效克服传统有机染料标记物的缺陷，还为生物标记技术拓宽了发展的方向。目前，用于生物分析领域的荧光纳米标记材料主要有量子点、稀土掺杂的发光纳米颗粒（如上转换发光纳米颗粒）、荧光碳纳米材料等。传统量子点一般都是基于金属元素的半导体纳米晶，毒性相对较大，其生物安全性是进行生物活体标记的一个重要限制因素。上转换发光纳米颗粒的激发光为红外光，可以有效避免生物体自体荧光的干扰，从而提高检测的灵敏度及信噪比。红外光激发对生物组织有很强的穿透能力，对生物样品造成光损伤也较小。另外，上转换纳米颗粒还具有毒性低、稳定性好、发光强度高等优点，在生物标记和检测等领域有很好的应用潜力。近年来，出现了一种新型的荧光碳纳米材料——荧光碳纳米粒子，其具有丰富的荧光性质，并且与量子点、上转换发光纳米颗粒比较，荧光碳纳米粒子除了稳定性好、发光强度高等优点外，表面具有丰富的含氧基团，功能化容易。最重要的是低毒，科学家从共聚糖中提取出碳纳米，然后在动物细胞中检验这些纳米颗粒的毒性，结果发现，即使在很高的浓度下，这些纳米颗粒也仅具有很小的毒性，甚至是无毒的。因而，发展碳纳米粒子在生物医药领域的应用具有重要的实际意义。

在当今的癌症临床诊断中，磁共振成像（MRI）技术已成为最有力的检测手段之一。此技术已广泛应用于人体组织或器官的检查，特别用于肿瘤的早期诊断，可使治疗成功率有很大程度的提高。但是，当MRI用来监测微小组织的病灶、分子活动或者细胞活动时灵敏度并不高。因此，为确保临床诊断的灵敏度和准确性，45%以上的MRI检查需要使用造影剂提高图像对比度。近年来，随着MRI成像新技术的发展及其在临床诊断中的应用，MRI造影剂的研究和开发面临更大的挑战。其中，双功能造影剂的制备和应用已成为研究的热点之一。目前，荧光/磁性碳纳米材料已得到了发展（中国发明专利：羧基化的磁性碳纳米球及其制备方法，公开号：CN101492183A；何小蝶等，Journal of Colloid and Interface Science, 2010, 356, 107-110）。但是这些荧光/磁性碳纳米材料的磁性部分均来自Fe₃O₄，其在MRI中属于阴性造影剂。而临床最常用的阳性造影剂（如钆螯合物）在荧光/磁性碳纳米材料的制备和应用中未见报道。

发明内容

本发明目的之一在于针对现有技术的不足，提供一种具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂。该造影剂以碳纳米球为上转换发光材料，以钆螯合物为磁共振成像物质，通过选择不同碳源和调节制备条件，得到具备不同上转换发光性能的碳纳米球。进一步地，通过表面嫁接不同数量的钆螯合物，得到不同磁共振成像性能的双功能造影剂。

本发明的目的之二在于提供该造影剂的制备方法。

为实现这样的目的，本发明以生物质碳源为基质，通过水热法得到碳纳米球。进一步地，通过偶联剂，将螯合剂与碳纳米球连接，最后与钆盐反应，形成钆螯合物，即可得到碳纳米球和钆螯合物结合的双功能造影剂。

根据上述原理，本发明采用如下技术方案：

一种具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂，其特征在于该造影剂是以碳纳米球为核，通过偶联剂，在碳纳米球表面修饰钆螯合剂而得到的，其中碳纳米球、偶联剂和钆螯合剂的摩尔比为：1:1:1-10:1:1。

上述的偶联剂可以为：1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），其中EDC和NHS的摩尔比为1:1。

上述的钆螯合剂可以为：二乙基三胺五乙酸（DTPA）、1, 4, 7, 10-四氮杂环十二烷, N, N’, N’’, N’’’四乙酸（DOTA）或5,8-双羧甲基-11-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]-3-氧代-2,5,8,11-四氮杂十三烷基-13-羧酸（DTPA-BMA）。

上述的碳纳米球采用生物质碳作为碳源制备得到。

上述的生物质碳源为：纤维素、可溶性淀粉、壳聚糖、蔗糖或葡萄糖。

一种制备上述的具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.将螯合剂和偶联剂按等摩尔比溶于二甲基亚砜（DMSO）中，室温下搅拌24小时；将碳纳米球分散于该溶液中，并控制螯合剂与碳纳米球的摩尔比为1:1～1:10，再次加入与螯合剂等摩尔的耦合剂，室温下搅拌24小时；经过滤，用无水乙醇和去离子水依次洗涤，干燥，得到表面修饰有螯合物的碳纳米球；

b.将步骤a所得碳纳米球分散于去离子水中，加入与步骤a所用的螯合剂等摩尔的钆盐，搅拌24小时后，将产物过滤，用无水乙醇洗涤，真空抽干，即得到具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂。

上述的碳纳米微球采用生物质碳作为碳源制备得到，具体方法为：将生物质碳源溶于去离子中配制成浓度为15～150g/L的溶液，充分搅拌均匀配制成反应液；将该反应液在80～200 ??C条件下，反应时间1～24小时，反应结束后，自然冷却到55～65 ??C，用乙醇和去离子水依次洗涤，离心分离，真空烘干，得到碳纳米球。

上述的生物质碳源可以为：纤维素、可溶性淀粉、壳聚糖、蔗糖或葡萄糖。

上述的螯合剂可以为：二乙基三胺五乙酸（DTPA）、1, 4, 7, 10-四氮杂环十二烷, N, N’, N’’, N’’’四乙酸（DOTA）或5,8-双羧甲基-11-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]-3-氧代-2,5,8,11-四氮杂十三烷基-13-羧酸（DTPA-BMA）。

上述的钆盐可以为：六水硝酸钆（Gd(NO₃)₃·6H₂O）、六水氯化钆（GdCl₃??6H₂O），八水硫酸钆（Gd₂(SO₄)₃??8H₂O）或乙酸钆（Gd(OOCCH₃)₃??xH₂O）。

本发明的优点在于：

（1）本发明以生物质碳源为原料制备碳纳米球。所用原料生物安全性高、毒性小，碳纳米球表面具有丰富的含氧基团，易于进一步功能化。

（2）本发明通过EDC/NHS偶联的方法将钆螯合物连接到碳纳米球表面，即可得到双功能造影剂。制备方法工艺简单，可操作性强，连接效率高。

（3）本发明制备的双功能造影剂具有良好的物理化学稳定性、上转换发光性能和磁共振成像性能。

该双功能造影剂具有粒径小、结晶度高、分散均匀、性能稳定、荧光和磁共振信号均较强的特点。所得的产物能满足临床应用的需求。

附图说明

图1为实施例一所制备的双功能造影剂的扫描电镜图。

图2为以800 nm为激发波长，所制备的双功能造影剂的上转换荧光光谱图。

图3为实施例二所制备的双功能造影剂的扫描电镜图。

图4以800 nm为激发波长，所制备的双功能造影剂的上转换荧光光谱图。

图5为实施例三所制备的双功能造影剂的扫描电镜图。

图6为以800 nm为激发波长，所制备的双功能造影剂的上转换荧光光谱图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。

实施例一：具体方法为：

1、将1 g（3 × 10^-3 mol）可溶性淀粉溶于20 mL去离子中，配成浓度为50g/L的溶液，充分搅拌。将反应液转入带有25 ml聚四氟乙烯内胆的高压反应釜，在160 ??C条件下，反应时间12小时，反应结束后，反应釜自然冷却到约60 ??C，用乙醇和去离子水依次洗涤数次，离心分离，真空烘干，得到碳纳米球。

2、在50 mL DMSO中加入3 × 10^-3 mol DTPA，完全溶解后，分别加入3 × 10^-3 mol的NHS和EDC，室温下搅拌24小时。将3 × 10^-3 mol碳纳米球分散于该溶液中，再次加入3 × 10^-3 mol的NHS和EDC，室温下搅拌24小时。将产物过滤，用无水乙醇和去离子水依次洗涤数次，真空抽干，得到表面修饰DTPA的碳纳米球。

3、将表面修饰DTPA的碳纳米球分散于一定量的去离子水中，加入3 × 10^-3 mol的Gd(NO₃)₃·6H₂O，搅拌24小时后，将产物过滤，用无水乙醇洗涤数次，真空抽干。

图1为所制备的双功能造影剂的扫描电镜图。由图可见，样品分布均匀，尺寸约为100纳米。

图2为以800 nm为激发波长，所制备的双功能造影剂的上转换荧光光谱图。由图可见，发射波长为540 nm。另外磁共振成像中信号强度为425。

实施例二：具体步骤为：

1、将1.1 g（6 × 10^-3 mol）葡萄糖溶于20 mL去离子中，配成浓度为55g/L的溶液，充分搅拌。将反应液转入带有25 ml聚四氟乙烯内胆的高压反应釜，在200 ??C条件下，反应时间6小时，反应结束后，反应釜自然冷却到约60 ??C，用乙醇和去离子水依次洗涤数次，离心分离，真空烘干，得到碳纳米球。

2、在50 mL DMSO中加入6 × 10^-3 mol DOTA，完全溶解后，分别加入6 × 10^-3 mol的NHS和EDC，室温下搅拌24小时。将3 × 10^-2 mol碳纳米球分散于该溶液中，再次加入6 × 10^-3 mol的NHS和EDC，室温下搅拌12小时。将产物过滤，用无水乙醇和去离子水依次洗涤数次，真空抽干，得到表面修饰DOTA的碳纳米球。

3、将表面修饰DOTA的碳纳米球分散于一定量的去离子水中，加入6 × 10^-3 mol的Gd(OOCCH₃)₃??xH₂O，搅拌24小时后，将产物过滤，用无水乙醇洗涤数次，真空抽干。

图3为所制备的双功能造影剂的扫描电镜图。由图可见，样品分布均匀，尺寸约为150纳米。

图4为以800 nm为激发波长，所制备的双功能造影剂的上转换荧光光谱图由图可见，发射波长为470 nm。另外，磁共振成像中信号强度为560。

实施例三：具体步骤为：

1、将2.05g（6 × 10^-3 mol）蔗糖溶于20 mL去离子中，配成浓度为102.5g/L的溶液，充分搅拌。将反应液转入带有25 ml聚四氟乙烯内胆的高压反应釜，在100 ??C条件下，反应时间20小时，反应结束后，反应釜自然冷却到约60 ??C，用乙醇和去离子水依次洗涤数次，离心分离，真空烘干，得到碳纳米球。

2、在50 mL DMSO中加入6 × 10^-3 mol DTPA-BMA，完全溶解后，分别加入6 × 10 ^-3 mol的NHS和EDC，室温下搅拌24小时。将2 × 10^-2 mol碳纳米球分散于该溶液中，再次加入6 × 10 ^-3 mol的NHS和EDC，室温下搅拌6小时。将产物过滤，用无水乙醇和去离子水依次洗涤数次，真空抽干，得到表面修饰DTPA-BMA的碳纳米球。

3、将表面修饰DTPA-BMA的碳纳米球分散于一定量的去离子水中，加入6 × 10^-3 mol的GdCl₃??6H₂O，搅拌24小时后，将产物过滤，用无水乙醇洗涤数次，真空抽干。

图5为所制备的双功能造影剂的扫描电镜图。由图可见，样品分布均匀，尺寸约为200纳米。

图6为以800 nm为激发波长，所制备的双功能造影剂的上转换荧光光谱图。由图可见，发射波长为470和533 nm。另外，磁共振成像中信号强度为510。 

Claims (6)

1.一种具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂，该造影剂以上转换发光材料碳纳米球为核，通过偶联剂，在碳纳米球表面修饰钆螯合剂而得到的，其中碳纳米球、偶联剂和钆螯合剂的摩尔比为：1:1:1-10:1:1，其特征在于该造影剂按如下方法制备：

a.将螯合剂和偶联剂按等摩尔比溶于二甲基亚砜（DMSO）中，室温下搅拌24小时；将碳纳米球分散于该溶液中，并控制螯合剂与碳纳米球的摩尔比为1:1～1:10，再次加入与螯合剂等摩尔的耦合剂，室温下搅拌24小时；经过滤，用无水乙醇和去离子水依次洗涤，干燥，得到表面修饰有螯合物的碳纳米球；

b.将步骤a所得碳纳米球分散于去离子水中，加入与步骤a所用的螯合剂等摩尔的钆盐，搅拌24小时后，将产物过滤，用无水乙醇洗涤，真空抽干，即得到具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂。

2.根据权利要求1所述的具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂，其特征在于所述的偶联剂为：1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），其中EDC和NHS的摩尔比为1:1。

3.根据权利要求1所述的具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂，其特征在于所述的钆螯合剂为：二乙基三胺五乙酸（DTPA）、1, 4, 7, 10-四氮杂环十二烷, N, N’, N’’, N’’’四乙酸（DOTA）或5,8-双羧甲基-11-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]-3-氧代-2,5,8,11-四氮杂十三烷基-13-羧酸（DTPA-BMA）。            

4.根据权利要求1所述的具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂，其特征在于所述的碳纳米球采用生物质碳作为碳源制备得到。

5.根据权利要求4所述的具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂，其特征在于所述的生物质碳源为：纤维素、可溶性淀粉、壳聚糖、蔗糖或葡萄糖。

6.根据权利要求1的具有上转换发光和磁共振成像双功能的造影剂，其特征在于所述的钆盐为六水硝酸钆、六水氯化钆，八水硫酸钆或乙酸钆。

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