CN103275712B

CN103275712B - 一种基于掺钆碳点的双模式分子探针制备方法及应用

Info

Publication number: CN103275712B
Application number: CN201310206723.2A
Authority: CN
Inventors: 顾微; 宫宁强; 王昊; 肖宁; 陈璐; 李彦楠; 叶玲
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2033-05-29
Also published as: CN103275712A

Abstract

一种基于掺钆碳点的双模式分子探针，通过下述方法得到：A)以碳水化合物为碳源，加入至多元醇溶剂中制备混合液；B)以无机酸作为催化剂，加入到步骤A的混合液中；C)以GdCl₃为钆源，加入到步骤B的混合液中；D)对步骤C的产物进行微波加热30-60s；E)经分子截留量为100Da或500Da的透析袋透析后得到掺钆碳点水溶液。该掺钆碳点可直接用于肿瘤细胞MRI-光学双模式成像。

Description

一种基于掺钆碳点的双模式分子探针制备方法及应用

技术领域

本发明属于纳米材料领域，具体涉及一种掺钆碳点作为MRI-光学双模式分子探针。

本发明还涉及上述基于掺钆碳点的双模式分子探针“由下而上”的制备方法。

本发明还涉及上述基于掺钆碳点的双模式分子探针在细胞标记中的应用。

本发明还涉及上述基于掺钆碳点的双模式分子探针作为MRI T1造影增强剂。

背景技术

分子影像技术可在分子水平上实现生物有机体生理和病理变化的实时，动态和无创成像。与传统的医学影像技术相比，分子影像技术对生物体内分子水平的变化进行在体成像，获得它们生物体内部实际的分布图像。因此，有助于早期的诊断疾病、促进药物研制和分析生命机理。根据成像的原理不同，可将分子影像学的成像技术分为核医学、光学和磁共振(Magnetic resonance imaging，MRI)等。核医学分子成像主要包括PET和SPECT，它们对体内的放射性核素产生的γ射线进行成像，穿透度深，灵敏度高，但放射性源可引起电离辐射，长期对人体有害。MRI是一种无损伤和无电离辐射高分辨的影像技术，是诊断肿瘤、指导外科手术最为有效的方法之一。但MRI灵敏度较低，需要使用MRI造影剂影响体内局部组织中水质子弛豫时间，与周围组织形成对比而产生增强的造影作用。根据作用原理不同，可将MRI造影剂分为T1(加权像中增强信号强度)和T2(加权像中降低信号强度)造影剂。目前，临床使用MRI造影剂主要是Gd螯合物的T1造影剂，但这类造影剂缺乏组织特异性，而且对于肾功能不健全者还会因造影剂的大量使用导致肾源纤维化。在光学分子成像中，荧光分子成像利用了具有特异性的荧光分子探针标记特定分子或细胞，且具有灵敏度较高、时间分辨率高、快捷简便、费用低、相对高通量等诸多优点。但光学分子成像由于穿透距离短，目前主要用于小动物成像。

由上可见，现有的各种成像技术都具有各自的优势，但也分别存在灵敏度、选择性、分辨率以及安全性等方面的不足，因此在实验研究或者临床应用都受到了一定的限制。双模式分子影像技术为这个问题的解决提供了可能，通过将两种不同分子影像探针进行“优势互补”，克服了单一分子影像技术的固有局限性，从而使获取的影像结果更为精确可靠，已成为分子成像的发展趋势。其中，将MRI与光学成像技术进行联合的双模式分子影像技术，即能提供高分辨率的结构组织学信息，又能实现高灵敏的功能学显像，为疾病的精准诊疗提供重要的影像依据。

目前，MRI-光学双模式分子探针的研究仍处于起步阶段，研制低毒性、低成本、高弛豫率、靶向性强、体内稳定性好的双模式造影剂是仍是基础和关键。最近的研究成果显示纳米粒可以对钆弛豫时间有显著的降低作用，因此纳米粒被视为新一代造影剂的主要发展方向。

碳点是一种新型发光纳米材料，与半导体量子点和传统有机染料相比，具有水分散性好、毒性小、荧光强度高且稳定性好，不仅是一种理想的光学分子探针，而且提供了构建双模式分子探针的平台。

本发明公开了基于掺钆碳点的双模式分子探针的制备。该双模式分子探针制备方法具有工艺简单、产率高、环境友好等特点。所制备掺钆碳点兼具MRI造影和光学成像能力，可作为一种新型分子探针用于MRI--光学双模式成像。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于掺钆碳点的光学-MRI双模式分子探针。

本发明的又一目的在于提供一种制备基于掺钆碳点的光学-MRI双模式分子探针的方法。

为实现上述目的，本发明提供的基于掺钆碳点的光学-MRI双模式分子探针，是通过下述方法得到：

A)以碳水化合物为碳源，加入到多元醇溶剂中制备混合液；

B)以无机酸作为催化剂，加入到步骤A的混合液中；

C)在步骤B的混合液中，加入GdCl₃；

D)对步骤C的产物进行微波加热，得到在365nm紫外光激发下发绿色荧光的掺钆碳点水溶液。

其中，步骤D之后包括步骤E：将步骤D的产物离心，上清液经分子截留量为100Da或500Da的透析袋进行透析。

本发明提供的制备上述掺钆碳点的方法，是以多元醇为溶剂，无机酸为催化剂，以碳水化合物为碳源，加入三价钆离子，通过微波加热法制备得到，主要步骤为：

A)以碳水化合物作为碳源，以多元醇作为溶剂，制备混合液；

B)以无机酸作为催化剂，加入到步骤A的混合液中；

C)在步骤B的混合液中，加入GdCl₃；

D)对步骤C的产物进行微波加热30-60s后得到碳点的水溶液；

E)将步骤D的产物离心，上清液进行透析。

其中，碳水化合物为蔗糖，多元醇为一缩二乙二醇或甘油，无机酸为浓硫酸或浓盐酸，透析袋的截留量为100Da或500Da。

其中，碳水化合物的质量浓度为10-30％，碳水化合物与多元醇的体积比为1-3∶3-1，无机酸的加入量为20到100μl/L，GdCl₃加入量为1到25mg/ml。。

其中，微波加热是以500-1000W的家用微波炉作为微波源。

本发明提供的掺钆碳点可以应用于细胞标记，将培养后的细胞加入含有掺钆碳点的培养基进行共孵育。

本发明提供的掺钆碳点可作为MRI T1造影增强剂。

本发明所公开的制备掺钆碳点制备方法具有工艺简单、产率高、环境友好等特点。且所制备的掺钆碳点兼具MRI造影和光学成像能力，可作为一种新型分子探针用于MRI-光学双模式成像。

附图说明

图1为本发明制备的掺钆碳点在日光(A)和365nm紫外光照射下(B)的照片。

图2为本发明制备的掺钆碳点在不同紫外激发波长下的光致发光(PL)谱图(激发波长由320nm至400nm，步长为20nm)。

图3为本发明制备的掺钆碳点标记C6肿瘤细胞(A)明场和(B)405nm激发下的激光共聚焦图。

图4为纯水(A)和本发明制备的掺钆碳点水溶液(B)的MRI T1扫描图比较效果。

具体实施方式

本发明的“由下而上”制备方法，是以高沸点的多元醇作为溶剂，以无机酸作为催化剂，以碳水化合物作为碳源，加入三价钆离子，通过微波加热法一步制备得到一种掺钆碳点。

本发明的掺钆碳点制备方法，其包括以下步骤：

A)以碳水化合物水溶液作为碳源，与多元醇混合；

B)以无机酸作为催化剂，加入步骤A中所述的体系；

C)在步骤B中所述的体系，加入钆离子；

D)以微波作为热源，对步骤C中的体系进行加热；

E)以截留分子量100Da或500Da的透析袋透析纯化得到掺钆碳点水溶液。

本发明另一目的在于将所制备的掺钆碳点用于光学成像，其包括以下步骤：

A)将掺钆碳点与细胞在37℃、5％CO₂条件下共孵育；

B)激光共聚焦显微镜观察A中所述掺钆碳点对细胞光学成像情况。

本发明另一目的在于将所制备的掺钆碳点作为MRI T1造影增强剂，其包括以下步骤：

A)将掺钆碳点配制成一定浓度的水溶液；

B)在磁共振成像仪上进行MRI T1扫描。

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案

实施例一：

1)以1ml质量浓度为30％蔗糖水溶液作为碳源，与一缩二乙二醇(或甘油)按体积比1∶3混合，反应总体积为4ml；

2)以200μl浓硫酸(或浓盐酸)作为催化剂，加入步骤1中的所述体系；

3)加入100mg的GdCl₃，加入步骤2中的所述体系；

4)以500-1000W的家用微波炉作为热源，对步骤3的体系进行微波加热50s；

5)以截留分子量100Da的透析袋透析纯化得到碳点水溶液；

6)所得碳点的光致发光性质表征：在日光下没有显示任何颜色(图1A)，用波长365nm的紫外灯对碳量子点水溶液样品进行照射，可观察到明显绿光(图1B)；用荧光分光光度计获得不同紫外激发波长(340-440nm，步长20nm)下碳点的光致发光(PL)谱图，进一步证实本发明所制备碳点在紫外激发下发出绿色荧光(图2)。ICP-AES测得掺钆量为20％。

实施例二：

1)将C6细胞接种于放有盖玻片的6孔培养皿中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养；

2)细胞贴壁后，吸去上清液，加入含有本发明制备的掺钆碳点培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中共孵育24h；

3)取出盖玻片，用PBS缓冲液清洗，固定细胞；

4)在激光共聚焦显微镜下(405nm)观察细胞成像(图3)，掺钆碳点标记的细胞在405nm激发下发出绿色荧光。其中图3A是C6肿瘤细胞明场的激光共聚焦图，图3B是405nm激发下的激光共聚焦图。

实施例三：

1)将掺钆碳点配制成浓为0.25mg/ml的水溶液；

2)在7T磁共振成像仪上分别进行纯水和掺钆碳点水溶液的MRI T1扫描。掺钆碳点(图4B)与纯水(图4A)相比，具有明显的T1增强效果。

Claims

1.一种基于掺钆绿色荧光碳点的双模式分子探针，通过下述方法得到：

A)以碳水化合物为碳源，加入到多元醇溶剂中制备混合液；

B)以无机酸作为催化剂，加入到步骤A的混合液中；

C)在步骤B的混合液中，加入钆离子；

D)对步骤C的混合液进行微波加热，得到掺钆绿色荧光碳点水溶液，在紫外激发下发出绿色荧光。

2.根据权利要求1所述的双模式分子探针，其中，步骤D之后包括步骤E：将步骤D的产物离心，上清液经分子截留量为100Da或500Da的透析袋进行透析，除去游离Gd离子。

3.根据权利要求1所述的双模式分子探针，其中，碳水化合物为蔗糖，多元醇为一缩二乙二醇或甘油，无机酸为浓硫酸或浓盐酸，钆离子为GdCl₃。

4.根据权利要求1或3所述的双模式分子探针，其中，碳水化合物的质量浓度为10-30％，碳水化合物与多元醇的体积比为1-3:3-1，无机酸的加入量为20到100μl/L，GdCl₃加入量为1到25mg/ml。

5.制备权利要求1所述基于掺钆绿色荧光碳点的双模式分子探针的方法，以多元醇为溶剂，无机酸为催化剂，以碳水化合物为碳源，通过微波加热法制备得到，其步骤为：

B)以无机酸作为催化剂，加入到步骤A的混合液中；

C)在步骤B的混合液中，加入钆离子；

D)对步骤C的产物进行微波加热得到掺钆绿色荧光碳点水溶液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，碳水化合物为蔗糖，多元醇为一缩二乙二醇或甘油，无机酸为浓硫酸或浓盐酸，钆离子为GdCl₃。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其中，碳水化合物的质量浓度为10-30％，碳水化合物与多元醇的体积比为1-3:3-1，无机酸的加入量为20到100μl/L，GdCl₃加入量为1到25mg/ml。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其中，微波加热是以500-1000W的家用微波炉作为微波源。

9.权利要求1制备的基于掺钆绿色荧光碳点的双模式分子探针在细胞标记中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中，是将培养后的细胞加入含有掺钆绿色荧光碳点的培养基进行共孵育。

11.权利要求1制备的基于掺钆绿色荧光碳点的双模式分子探针作为MRI造影增强剂的应用。