CN102662049B - 基于碳纳米材料的免疫分析方法 - Google Patents
基于碳纳米材料的免疫分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102662049B CN102662049B CN201210138986.XA CN201210138986A CN102662049B CN 102662049 B CN102662049 B CN 102662049B CN 201210138986 A CN201210138986 A CN 201210138986A CN 102662049 B CN102662049 B CN 102662049B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- immunoreagent
- carbon point
- carbon
- immune complex
- mark
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 99
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 96
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title abstract description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 10
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 8
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 claims description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 6
- OZECDDHOAMNMQI-UHFFFAOYSA-H cerium(3+);trisulfate Chemical compound [Ce+3].[Ce+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O OZECDDHOAMNMQI-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 6
- 229910000333 cerium(III) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000012286 potassium permanganate Substances 0.000 claims description 6
- 238000001027 hydrothermal synthesis Methods 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- -1 potassium ferricyanide Chemical compound 0.000 claims description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 238000010170 biological method Methods 0.000 claims description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 2
- FJVZDOGVDJCCCR-UHFFFAOYSA-M potassium periodate Chemical compound [K+].[O-]I(=O)(=O)=O FJVZDOGVDJCCCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 10
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 abstract description 5
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 abstract 2
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 abstract 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 description 5
- HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N n'-hydroxybutanediamide Chemical compound NC(=O)CCC(=O)NO HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- POKOASTYJWUQJG-UHFFFAOYSA-M 1-butylpyridin-1-ium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCC[N+]1=CC=CC=C1 POKOASTYJWUQJG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910004613 CdTe Inorganic materials 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+);selenium(2-) Chemical compound [Se-2].[Cd+2] UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical class 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PROQIPRRNZUXQM-UHFFFAOYSA-N (16alpha,17betaOH)-Estra-1,3,5(10)-triene-3,16,17-triol Natural products OC1=CC=C2C3CCC(C)(C(C(O)C4)O)C4C3CCC2=C1 PROQIPRRNZUXQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O acridine;hydron Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3[NH+]=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000011365 complex material Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- PROQIPRRNZUXQM-ZXXIGWHRSA-N estriol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H]([C@H](O)C4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 PROQIPRRNZUXQM-ZXXIGWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960001348 estriol Drugs 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000000504 luminescence detection Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002910 rare earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M sodium;1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].ON1C(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C1=O RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明提供一种基于碳纳米材料（碳点）的免疫检测方法，包括如下步骤：步骤A，制备碳点并在碳点的表面标记免疫试剂抗原或抗体，使之成为免疫试剂标记碳点；步骤B，将免疫试剂标记碳点、待测样本、以及免疫试剂抗原或抗体包被的固相物质混合完成免疫反应形成免疫复合物；将所述免疫复合物与游离免疫试剂进行分离；和步骤C，对所述免疫复合物加入氧化剂进行化学发光检测，和/或对其直接进行荧光检测。在本发明中，利用该碳纳米材料可进行化学发光和荧光两种免疫检测，其光学稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测和分析领域，具体涉及一种基于碳纳米材料（碳点）的免疫分析方法。
背景技术
免疫分析因其独有的特异性，在临床诊断和环境检测等方面得到广泛利用。在免疫分析诸多的检测方法中，化学发光检测方法因其灵敏度高、线性范围宽、仪器简单、分析快速和自动化程度高等优点得到重视。目前常用的化学发光免疫分析的常用标记可以分为三类。其一，化学发光物质直接标记。该类物质主要有酰肼类化合物（例如鲁米诺，异鲁米诺及其衍生物）、吖啶酯及其衍生物、和咪唑类化合物。鲁米诺及其衍生物必须在适当的催化剂存在下才可以观测其化学发光反应。吖啶酯及其衍生物在双氧水的引发下可直接完成瞬时发光；但吖啶酯的稳定性及吖啶酯衍生物的制备是限制该标记物广泛应用的因素。其二，使用酶对免疫试剂进行标记。因以酶所用底物作为发光剂，故可将其归类于化学发光免疫分析。目前常用的酶标记物有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等。在免疫试剂的标记和保存过程中需考虑酶活性保持等问题。其三，纳米材料标志物。纳米材料是指三位空间尺寸中至少有一维处于纳米数量级的材料。因其尺寸处于纳米级别，使其具有特殊的光电性质。在免疫分析中，常用的纳米材料标记物有金属纳米粒子、CdTe和CdSe等半导体量子点、荧光二氧化硅纳米球、和纳米稀土荧光配合物材料等。卢建忠研究小组使用纳米金作为标记物，在免疫反应之后用溴水等氧化物质将其氧化成三价金离子，利用其对鲁米诺发光体系的催化作用进行检测[A.P.Fan et al.,Anal.Chem.,2005,77:3238]。李等利用硝酸和盐酸将金纳米离子溶解后，用于发光体系[Z.P.Li et al.,Anal.Chim.Acta,2005,551:85]；方法需要引进毒性较大或氧化性的物质，不是最为理想的。CdTe和CdSe等半导体量子点虽具有传统荧光染料试剂不具备的特点，诸如光稳定性好，发光强度高，激发光谱宽，发光光谱狭窄以及荧光寿命长等的优点，但是大多数光学性能好的量子点均含有重金属物质，存在一定的生物毒害性，其真正的应用还有很多问题需要解决。因此在化学发光免疫分析中，光学性能优异，且稳定好，无毒害作用的标记物的开发具有极其重要的意义。碳点是一类生物兼容性好，且光学性能优异的碳纳米材料。碳点在免疫分析中的应用很少；目前仅有将其作为抗体载体，用于电化学免疫分析的报道[D.Du et al.,Anal.Chem.,2010,82:2989][R.J.Cui et al.,Adv.Funct.Mater.2008,18:2197]。其优异的光学性能尚未在免疫分析中得到应用。
发明内容
本发明中，发明人合成一种具备荧光性质且光学性能稳定的碳纳米材料粒子。当其与一些氧化试剂共存时候，可以观察到很强的化学发光。通过红外表征，该材料表面具备丰富的羧基和羟基官能团，证实该材料具有很好的生物标记前景。在对该材料进行免疫试剂标记之后，利用其可以建立高灵敏且安全无毒的免疫分析方法。
本发明提供一种基于碳纳米材料（碳点）的免疫分析方法，包括如下步骤：步骤A，制备碳点并在碳点的表面标记免疫试剂抗原或抗体，使之成为免疫试剂标记碳点；步骤B，将免疫试剂标记碳点、待测样本、以及免疫试剂抗原或抗体包被的固相物质混合完成免疫反应形成免疫复合物；将所述免疫复合物与游离免疫试剂进行分离；和步骤C，对所述免疫复合物加入氧化剂进行化学发光检测，和/或对其直接进行荧光检测。
依据本发明，优选所述碳点为以PEG1500、甘油和丝氨酸混合制备得到。合成本发明中碳纳米材料的途径有两种。第一种，微波加热法合成：利用微波加热的方式将PEG1500和甘油先混合，在微波加热下形成透明黏稠状液体，而后加入碳源丝氨酸，利用微波对碳源进一步加热，使得试剂之间互相交联形成碳点（碳纳米材料）；第二种，水热法合成法：将PEG1500、甘油和丝氨酸放入反应釜中，密封反应釜后于250℃加热3小时即得。本发明中，所述碳点粒径优选为3~4nm，其表面带有羧基和羟基基团。3-4nm的碳点在免疫试剂上的标记对免疫试剂生物活性影响较小，且碳点材料原料无毒、环保。
在本发明中，所述步骤A中碳点与免疫试剂抗原或抗体的结合为化学键直接结合或生物方法间接键合。所述化学键直接结合，即碳点通过化学共价键直接和免疫试剂（特异性抗原或抗体）相连，因在碳纳米材料上有丰富的羧基基团，则如利用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）及其水溶性同系物Sulfo-NHS与缩合剂如1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与碳纳米材料表面的羧基混合后反应生成具有氨基反应活性的NHS活泼酯，而后将其与免疫试剂上的氨基进行结合，实现碳纳米材料的免疫试剂标记。所述生物方法间接键合，即通过间接方式将碳点与免疫试剂偶联，具体使用如生物素-亲和素方式、互补DNA之间的相互作用方式等方式。例如，将免疫试剂进行生物素化，而碳纳米材料与亲和素结合，通过生物素-亲和素之间特异性以及强作用力，将免疫试剂与碳纳米材料相连。
优选所述步骤B中固相物质为磁性颗粒、聚合物微球、玻璃微珠和96孔微板中的一种或多种。
在本发明中，所述步骤B中待测样本优选为小分子目标物或者大分子目标物；具体为小分子抗体、抗原，或为大分子抗体、抗原。且可根据待测样本的特点，选择所述步骤B中免疫反应的模式为夹心反应模式或竞争反应模式。在所述夹心反应模式中，其免疫反应的完成采取如下两种方式之一：即待测样本、免疫试剂包被的固相物质混合发生免疫反应形成一种免疫复合物，再与免疫试剂标记碳点混合形成免疫复合物（两步法）；或者免疫试剂标记碳点、待测样本、以及免疫试剂包被的固相物质三者混合发生免疫反应形成免疫复合物（一步法）。
本发明中，优选步骤C中所述化学发光检测为氧化剂与碳点产生化学发光后，由光电倍增管对产生的化学发光强度进行采集记录；所述荧光检测为使用荧光分光光度计对碳点的荧光强度进行检测。
优选本发明的步骤A中用磷酸盐缓冲液洗涤和/或保存所述免疫试剂标记碳点，在步骤B中用磷酸盐缓冲液洗涤所述免疫复合物；所述磷酸盐缓冲液由磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾溶液组成；步骤C中所述氧化剂为高锰酸钾、硫酸铈、高碘酸钾和铁氰化钾中的一种或多种。
在本发明中，利用该碳纳米材料可进行化学发光和荧光两种免疫检测，其光学稳定性好。在化学发光免疫检测中，直接加入单一的氧化物质如硫酸铈、高锰酸钾或铁氰化钾等强氧化剂便能引发化学发光反应；避免传统方法中复杂的化学发光底物的制备和保存问题。
附图说明
图1是碳纳米材料的荧光光谱图；
图2是碳纳米材料的红外表征图；
图3是免疫反应的模式图（上为双抗体夹心模式，下为竞争法模式）；
图4是免疫检测IgG时化学发光强度与荧光强度随IgG浓度变化图。
具体实施方式
以下实施方式仅为本发明的优选实施例，不能以此限制本发明的范围。
实施例1
一、荧光碳纳米材料的合成
微波加热法合成荧光碳纳米材料：将1.0g PEG1500和15mL甘油混合，微波加热1分钟后形成透明黏稠状液体，而后加入0.5g丝氨酸作碳源，利用微波对该混合物加热10分钟，试剂之间互相交联形成碳点；通过透析除去杂质后，将碳点存储于4℃冰箱，或将碳点旋转蒸干后保存。
水热法合成荧光碳纳米材料：将1.0g PEG1500、15mL甘油和0.5g丝氨酸混于反应釜中，密封后于250℃加热3小时；待其恢复至室温，通过透析除去杂质后，将碳点存储于4℃冰箱。
不管是以微波加热法还是水热法合成的荧光碳纳米材料，其碳点性质相同；图1为碳点的荧光光谱图，从左至右激发波长由260nm开始，依次递增20nm；从图可见，碳点具有强荧光发射峰且发射峰的位置与其激发波长有光。图2为碳点的红外光谱表征图；从图中可知碳点表面含有丰富的羟基和羧基结构，这非常有利于碳点与生物物质的结合。
二、碳点在羊抗人IgG上的标记
取5mg碳点将其溶于1mL 0.01M磷酸盐缓冲液中，加入0.4mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.6mg的N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应15分钟；再加入1.4μL2-巯基乙醇淬灭EDC；在反应液中加入1mg羊抗人IgG，室温反应2小时；然后用0.01M赖氨酸封闭碳点上多余的氨基结合位点以减小非特异吸附。将上述溶液转移至透析袋中透析过夜后，于磷酸盐缓冲液中密封保存。
三、磁性微粒子与抗体的结合
取1mL羧基修饰的磁性微粒子（5mg/mL），将其置于0.01M磷酸盐缓冲液中，加入0.4mg EDC和0.6mg NHS，室温反应15分钟；再加入1.4μL 2-巯基乙醇淬灭EDC；在反应液中加入1mg兔抗人IgG，室温反应2小时；然后用0.01M赖氨酸封闭碳点上多余的氨基结合位点以减小非特异吸附；最后通过磁性分离将与磁性微粒子结合的抗体与未结合的抗体相分离。
四、夹心反应模式的免疫反应及其免疫检测
在此实施例中，待测样本为人IgG。
该免疫分析方法（免疫反应）可使用一步法和两步法。一步法：将IgG抗原、碳点标记羊抗人IgG和磁性微粒子标记的兔抗人IgG进行混合，在37℃下反应1小时形成免疫复合物；利用磁性微粒子的磁性将形成的免疫复合物与游离的免疫试剂相分离；加入氧化试剂硫酸铈或高锰酸钾，使其与碳点作用发生化学发光反应，使用BPCL超微弱化学发光检测仪对该体系产生的光学信号进行采集。或者采用荧光分光光度计，对免疫复合物上碳点的荧光强度进行定量。从图4可见，化学发光检测和荧光检测均能准确地检出碳点信号。
两步法：将IgG抗原和磁性微粒子标记的兔抗人IgG进行混合，在37℃下反应1小时形成免疫复合物；利用磁性微粒子的磁性将形成的免疫复合物与游离的免疫试剂相分离；在上述复合物中加入碳点标记羊抗人IgG，使之形成磁颗粒兔抗人IgG-人IgG-碳点标记羊抗人IgG免疫复合物，于37℃反应1小时后，利用磁性分离出免疫复合物；加入氧化试剂硫酸铈或高锰酸钾，使其与碳点作用发生化学发光反应，使用BPCL超微弱化学发光检测仪对该体系产生的光学信号进行采集。或者采用荧光分光光度计，对免疫复合物上碳点的荧光强度进行定量。
上述方法中，不论使用一步法还是两步法，均能顺利实现本发明的免疫分析目的。
需要说明的是，在本发明中，待测样本可以为抗原或抗体。图3反应模式中的待测样本均显示为抗原形式，实质上该待测样本身可以是一种抗体，如本实施例中“人IgG”本身是一种抗体，在此例和此图中却显示为待测样本抗原并作为抗原使用；相应的“羊抗人IgG”即为其抗原“人IgG”的抗体。
实施例2
竞争反应模式的免疫反应及其免疫检测：
在此实施例中，待测样本为疾病标志物。具体为大分子疾病标志物如肿瘤标志物CA153、CEA和AFP等，或为小分子化合物如三碘甲腺原氨酸、雌二醇和雌三醇等。
首先使用如实施例1中步骤三相似的方法将抗小分子抗体（如抗三碘甲腺原氨酸抗体）与磁性颗粒结合；然后使用如实施例1中步骤二相似的方法将小分子标准物质三碘甲腺原氨酸进行碳点标记；再将抗体磁颗粒复合物、该碳点标记三碘甲腺原氨酸（免疫碳点）、以及待测样本溶液加入反应器内进行竞争反应1小时后形成免疫复合物，利用磁性分离器分离出免疫复合物。加入氧化试剂硫酸铈或高锰酸钾，使其与碳点作用发生化学发光反应，使用BPCL超微弱化学发光检测仪对该体系产生的光学信号进行采集。或者采用荧光分光光度计，对免疫复合物上碳点的荧光强度进行定量。
Claims (9)
1.一种基于碳纳米材料的免疫分析方法，其中，所述碳纳米材料又称为碳点，所述方法包括如下步骤：
步骤A，制备碳点并在碳点的表面标记免疫试剂抗原或抗体，使之成为免疫试剂标记碳点；
步骤B，将免疫试剂标记碳点、待测样本、以及免疫试剂抗原或抗体包被的固相物质混合完成免疫反应形成免疫复合物；将所述免疫复合物与游离免疫试剂进行分离；
步骤C，对所述免疫复合物加入氧化剂进行化学发光检测，或对其直接进行荧光检测；
其中，所述碳点为以PEG1500、甘油和丝氨酸混合制备得到。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳点制备方法为微波合成法或水热合成法，其中所述微波合成法为利用微波加热的方式将PEG1500和甘油先混合，在微波加热下形成透明黏稠状液体，而后加入碳源丝氨酸，利用微波对碳源进一步加热，使得试剂之间互相交联形成碳点；所述水热合成法为将PEG1500、甘油和丝氨酸放入反应釜中，密封反应釜后于250℃加热3小时即得。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述碳点粒径为3～4nm，其表面带有羧基和羟基基团。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A中碳点与免疫试剂抗原或抗体的结合为化学键直接结合或生物方法间接键合。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B中固相物质为磁性颗粒、聚合物微球、玻璃微珠和96孔微板中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据待测样本的特点，选择所述步骤B中免疫反应的模式为夹心反应模式或竞争反应模式。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤B中夹心反应模式免疫反应的完成采取如下两种方式之一：即待测样本、免疫试剂包被的固相物质混合发生免疫反应形成一种免疫复合物，再与免疫试剂标记碳点混合形成免疫复合物；或者免疫试剂标记碳点、待测样本、以及免疫试剂包被的固相物质三者混合发生免疫反应形成免疫复合物。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中所述化学发光检测为氧化剂与碳点产生化学发光后，由光电倍增管对产生的化学发光强度进行采集记录；所述荧光检测为使用荧光分光光度计对碳点的荧光强度进行检测。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤A中用磷酸盐缓冲液洗涤和/或保存所述免疫试剂标记碳点，在步骤B中用磷酸盐缓冲液洗涤所述免疫复合物；所述磷酸盐缓冲液由磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾溶液组成；步骤C中所述氧化剂为高锰酸钾、硫酸铈、高碘酸钾和铁氰化钾中的一种或多种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210138986.XA CN102662049B (zh) | 2012-05-07 | 2012-05-07 | 基于碳纳米材料的免疫分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210138986.XA CN102662049B (zh) | 2012-05-07 | 2012-05-07 | 基于碳纳米材料的免疫分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102662049A CN102662049A (zh) | 2012-09-12 |
| CN102662049B true CN102662049B (zh) | 2014-03-26 |
Family
ID=46771580
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210138986.XA Expired - Fee Related CN102662049B (zh) | 2012-05-07 | 2012-05-07 | 基于碳纳米材料的免疫分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102662049B (zh) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103275712B (zh) * | 2013-05-29 | 2014-12-03 | 首都医科大学 | 一种基于掺钆碳点的双模式分子探针制备方法及应用 |
| CN103308679A (zh) * | 2013-06-03 | 2013-09-18 | 江苏大学 | 用纳米荧光碳点免疫标记检测细菌的方法 |
| CN103344756B (zh) * | 2013-07-15 | 2015-09-09 | 中南大学湘雅二医院 | 一种用于检测p24抗原的碳量子点试纸条的制备方法 |
| CN104597018B (zh) * | 2015-01-22 | 2017-04-05 | 广西师范学院 | 一种利用荧光碳点探针检测高锰酸钾的方法 |
| WO2016127320A1 (zh) * | 2015-02-10 | 2016-08-18 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 一种用于检测胃泌素-17的试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN105181956B (zh) * | 2015-09-30 | 2017-10-10 | 华东理工大学 | 基于金属离子特异响应的荧光检测法在免疫检测中的应用 |
| CN107102146A (zh) * | 2017-04-01 | 2017-08-29 | 南京医科大学 | 一种定量检测血清中神经胶质纤维酸性蛋白的方法 |
| CN107957492A (zh) * | 2017-11-18 | 2018-04-24 | 安徽师范大学 | 一种基于碳点标记的荧光免疫吸附测定超痕量油胺枝接聚琥珀酰亚胺的方法 |
| CN111804356B (zh) * | 2020-07-16 | 2021-11-09 | 清华大学 | 微流控芯片及其制备方法和微流控装置及致病菌的检测方法 |
| CN114384246B (zh) * | 2022-01-14 | 2023-10-13 | 山东大学 | 一种以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒 |
| CN115343484B (zh) * | 2022-10-19 | 2023-01-03 | 山东大学 | 一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5976820A (en) * | 1995-08-28 | 1999-11-02 | Jolley; Michael E. | Detection of antibodies to bacterial antigens by flourescence polarization |
| CN1884430A (zh) * | 2006-06-30 | 2006-12-27 | 上海师范大学 | 一种荧光碳纳米管及其制备方法和应用 |
| CN101441212A (zh) * | 2008-12-04 | 2009-05-27 | 上海交通大学 | 量子点标记荧光免疫多种抗原同步检测方法 |
| CN101980018A (zh) * | 2010-10-29 | 2011-02-23 | 上海交通大学 | 用于测定莱克多巴胺的免疫生物传感器的制备方法 |
-
2012
- 2012-05-07 CN CN201210138986.XA patent/CN102662049B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5976820A (en) * | 1995-08-28 | 1999-11-02 | Jolley; Michael E. | Detection of antibodies to bacterial antigens by flourescence polarization |
| CN1884430A (zh) * | 2006-06-30 | 2006-12-27 | 上海师范大学 | 一种荧光碳纳米管及其制备方法和应用 |
| CN101441212A (zh) * | 2008-12-04 | 2009-05-27 | 上海交通大学 | 量子点标记荧光免疫多种抗原同步检测方法 |
| CN101980018A (zh) * | 2010-10-29 | 2011-02-23 | 上海交通大学 | 用于测定莱克多巴胺的免疫生物传感器的制备方法 |
Non-Patent Citations (10)
| Title |
|---|
| Carbon Dots for Multiphoton Bioimaging;Li Cao et al;《Communication》;20071231;第129卷;11318-11319 * |
| CdSe量子点标记免疫求蛋白及光谱性质研究;刘晶莹等;《化学试剂》;20120430;第34卷(第4期);309-311 * |
| Fluorescent Carbon Nanoparticles: Synthesis, Characterization, and Bioimaging Application;S.C.Ray et al;《J.Phys.Chem.C》;20091231;第113卷;18546-18551 * |
| Li Cao et al.Carbon Dots for Multiphoton Bioimaging.《Communication》.2007,第129卷11318-11319. |
| Quantum-Sized Carbon Dots for Bright and Colorful Photoluminescence;Ya-Ping Sun et al;《Communications》;20061231;第128卷;7756-7757 * |
| S.C.Ray et al.Fluorescent Carbon Nanoparticles: Synthesis, Characterization, and Bioimaging Application.《J.Phys.Chem.C》.2009,第113卷18546-18551. |
| Ya-Ping Sun et al.Quantum-Sized Carbon Dots for Bright and Colorful Photoluminescence.《Communications》.2006,第128卷7756-7757. |
| 刘晶莹等.CdSe量子点标记免疫求蛋白及光谱性质研究.《化学试剂》.2012,第34卷(第4期),309-311. |
| 荧光碳点的合成及对酿酒酵母的毒性研究;黄淮青等;《无机化学学报》;20120131;第28卷(第1期);13-19 * |
| 黄淮青等.荧光碳点的合成及对酿酒酵母的毒性研究.《无机化学学报》.2012,第28卷(第1期),13-19. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102662049A (zh) | 2012-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102662049B (zh) | 基于碳纳米材料的免疫分析方法 | |
| Zhao et al. | Recent improvements in enzyme-linked immunosorbent assays based on nanomaterials | |
| Lin et al. | In situ synthesis of fluorescent polydopamine nanoparticles coupled with enzyme-controlled dissolution of MnO 2 nanoflakes for a sensitive immunoassay of cancer biomarkers | |
| Qian et al. | Engineering luminescent metal nanoclusters for sensing applications | |
| Hamd-Ghadareh et al. | An amplified comparative fluorescence resonance energy transfer immunosensing of CA125 tumor marker and ovarian cancer cells using green and economic carbon dots for bio-applications in labeling, imaging and sensing | |
| Chen et al. | Alkaline phosphatase-triggered in situ formation of silicon-containing nanoparticles for a fluorometric and colorimetric dual-channel immunoassay | |
| Mickert et al. | Measurement of sub-femtomolar concentrations of prostate-specific antigen through single-molecule counting with an upconversion-linked immunosorbent assay | |
| Li et al. | Recent progress in fluorescent probes for metal ion detection | |
| Luo et al. | Fluorescent silicon nanoparticles-based ratiometric fluorescence immunoassay for sensitive detection of ethyl carbamate in red wine | |
| Chen et al. | Sensitive fluorescent detection of H2O2 and glucose in human serum based on inner filter effect of squaric acid-iron (III) on the fluorescence of upconversion nanoparticle | |
| Zhou et al. | A novel electrochemiluminescent immunosensor based on the quenching effect of aminated graphene on nitrogen-doped carbon quantum dots | |
| Li et al. | Self-assembled graphene quantum dots induced by cytochrome c: a novel biosensor for trypsin with remarkable fluorescence enhancement | |
| Li et al. | Fluorescent labels in biosensors for pathogen detection | |
| Tang et al. | Nanoparticle-based immunoassays in the biomedical field | |
| Li et al. | Simultaneous electrochemical immunoassay of three liver cancer biomarkers using distinguishable redox probes as signal tags and gold nanoparticles coated carbon nanotubes as signal enhancers | |
| Su et al. | Strategies in liquid-phase chemiluminescence and their applications in bioassay | |
| Shi et al. | Progress on the application of electrochemiluminescence biosensor based on nanomaterials | |
| Sun et al. | Silver-amplified fluorescence immunoassay via aggregation-induced emission for detection of disease biomarker | |
| Yuan et al. | Aptamer‐based luminescence energy transfer from near‐infrared‐to‐near‐infrared upconverting nanoparticles to gold nanorods and its application for the detection of thrombin | |
| Wang et al. | Nanomaterial-enhanced chemiluminescence reactions and their applications | |
| Li et al. | Gold nanoparticle labeling with tyramide signal amplification for highly sensitive detection of alpha fetoprotein in human serum by ICP-MS | |
| Fang et al. | Tuning surface states to achieve the modulated fluorescence of carbon dots for probing the activity of alkaline phosphatase and immunoassay of α-fetoprotein | |
| Chanda et al. | Light emitting probes–approaches for interdisciplinary applications | |
| Liu et al. | Up-conversion fluorescence biosensor for sensitive detection of CA-125 tumor markers | |
| Hou et al. | A carbon nanoparticle-peptide fluorescent sensor custom-made for simple and sensitive detection of trypsin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140326 |