CN111804356B - 微流控芯片及其制备方法和微流控装置及致病菌的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微流控芯片及其制备方法和微流控装置及致病菌的检测方法。该微流控芯片包括芯片层，在所述芯片层内具有通道结构，在所述通道结构内具有表面修饰有适配体的阵列结构。采用该微流控芯片进而制备的微流控装置，可用于食物中致病菌的快速、高灵敏性检测，且检测效果稳定性高。

Description

微流控芯片及其制备方法和微流控装置及致病菌的检测方法
技术领域
本发明涉及一种微流控芯片及其制备方法，一种微流控装置，以及一种致病菌的检测方法。
背景技术
食源性致病微生物引起的食物中毒是全球共同关注的食品安全问题。据世界卫生组织估计，全球每年食源性疾病患者中，70％以上是由致病微生物引起的。近几年据国家卫生计生办公厅和国家疾控中心的统计数据，致病微生物性食物中毒人数始终占居食品中毒事件的首位。中国是最大的食品消费国、生产国和进口国，提高食源性致病微生物检测水平和应对食品安全突发事件的能力，是我们面临的迫切任务。对其进行快读、准确、灵敏的检测为有效控制传染性疾病的扩散、维护公众健康安全具有至关重要的作用。
食源性致病微生物种属繁多、性质各异、致病机理复杂、受污染的食品基质更是千差万别。现有的检测技术(微生物检验、免疫学检测和分子生物学技术等)各有其不足，面临着诸多难题：操作过程复杂、检测时间过长、检测靶标覆盖率低、假阳性高、适合现场检测的仪器和试剂较少等。
现有的采用微流控检测食源性致病菌的装置或方法，存在种属特异性不高，检测时间慢等问题，例如，CN109813695A公开了一种基于微流控芯片的微生物检测系统及其检测方法，其利用声波对不同直径大小的细菌进行分离富集，存在特异性较差的问题。
CN107904161A公开了一种可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片及其制备方法和检测方法，其利用免疫磁珠进行致病菌的捕获，由于免疫磁珠只能被固定在芯片通道的底部，对于上层溶液中的致病菌的捕获能力有限，免疫磁珠的微流控芯片的捕获效率不超过50％。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种新的微流控芯片，采用该微流控芯片进而制备的微流控装置，可用于食物中致病菌的快速、高灵敏性检测，且检测效果稳定性高。
本发明第一方面提供了一种微流控芯片，包括芯片层，在所述芯片层内具有通道结构，在所述通道结构内具有表面修饰有适配体的阵列结构。
根据本发明所述的微流控芯片的一些实施方式，所述阵列结构的材质选自PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)和玻璃中的一种或多种。上述材料的可塑性较强，采用上述材料进行致病菌检测具有较好的检测效果。采用其中的PDMS修饰效果更佳。
根据本发明所述的微流控芯片的一些实施方式，所述芯片层的材质选自PDMS、PMMA和玻璃中的一种或多种。
根据本发明所述的微流控芯片的一些实施方式，所述微流控芯片还包括与芯片层键合的基底。所述基底的材质优选为PDMS、PMMA或玻璃。
根据本发明所述的微流控芯片的一些实施方式，所述修饰的方法为化学修饰。优选地，所述修饰的方法包括将阵列结构依次进行等离子体氧化处理、硅烷偶联剂处理和交联改性处理，然后与末端氨基化修饰的适配体接触。从而得到表面修饰有适配体的阵列结构。
根据本发明所述的微流控芯片的一些实施方式，通道结构的高度与阵列结构的高度相同或不同，优选为相同。高度相同的情况下，极大的提高了捕获效率。
根据本发明所述的微流控芯片的一些实施方式，所述阵列结构包含多个结构单元。
根据本发明所述的微流控芯片的一些实施方式，每个结构单元的形状为圆柱状。
根据本发明所述的微流控芯片的一些实施方式，垂直于流体流动方向上，相邻两个结构单元的距离为20-100μm，优选为20-50μm。相邻两个结构单元的距离是指中心到中心的距离，例如为圆柱结构单位，则为圆心至圆心。
根据本发明所述的微流控芯片的一些实施方式，每个结构单元的直径与高度的比例为1:1-10，优选为1:1-3。
根据本发明所述的微流控芯片的一些实施方式，结构单元水平截面总面积覆盖通道结构水平截面面积的20-80％，优选为20-60％，更优选为30-50％。例如结构单元为圆柱，圆柱的底面半径为r，单个结构单元水平截面面积则为πr2，结构单元水平截面总面积则为所有结构单元的πr2之和。“通道结构水平截面面积”是指水平方向上，通道结构的面积。
本发明第二方面提供了一种微流控芯片的制备方法，包括：
(1)形成具有通道结构的芯片层，其中所述通道结构内具有阵列结构；
(2)在所述阵列结构的表面修饰适配体。
根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，所述修饰适配体的方法包括依次进行等离子体氧化处理、硅烷偶联剂处理和交联改性处理，然后与末端氨基化修饰的适配体接触。
根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，所述等离子体氧化的条件包括：等离子体暴露30-60s。例如但不限于：常温下，300mT，20W条件下等离子体暴露30-60s。
根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，所述硅烷偶联剂选自3-氨丙基三乙氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷和乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷中的一种或多种。
根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，所述硅烷偶联剂处理的条件包括：采用偶联剂处理30-90min。例如但不限于：20-40℃下，将等离子体氧化处理后的产物与硅烷偶联剂溶液(4-10％，v/v，溶解在乙醇中)处理30-90min。
根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，所述交联改性采用戊二醛和/或京尼平进行交联改性。更优选地，所述交联改性处理时间为30-90min。所述交联改性例如但不限于：20-40℃下，戊二醛溶液和/或京尼平溶液(4-10％，v/v，溶解在PBS缓冲液中)30-90min。
根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，所述末端氨基化修饰的适配体，其中末端氨基化的方法可以根据《基于微流控芯片的化学发光/电致化学发光生物传感器》[D],王俊茗,清华大学,2018,第28页的方法获得。在本发明中，适配体需要根据检测目标致病菌并通过筛选获得。
根据本发明所述的制备方法的一些具体实施方式，形成具有通道结构的芯片层，其中所述通道结构内具有阵列结构。例如但不限于：通过曝光将SU-8负性胶光刻到硅片上形成具有特定结构(通道形貌和预留的进样孔、出样孔以及废液收集孔等)的模具，倒入模具中的PDMS与固化液反应后可在模具上形成所需的结构，揭下后在所需位置进行打孔，得到芯片层，在所述芯片层内具有通道结构，然后在等离子体清洗仪中与玻璃基底进行键合包封。优选地，制成的通道结构的高度与阵列结构(圆柱)的高度相同。
本发明第三方面提供了一种微流控装置，包括进样单元，以及至少一组与所述进样单元依次连通的微流控芯片和检测单元，在微流控芯片的入口端设置试剂注入口，其中，所述微流控芯片为上述的微流控芯片或根据上述的制备方法得到的微流控芯片。
根据本发明所述的微流控装置的一些实施方式，进样单元可以包括进样单元进样口和进样单元分流通道等。
根据本发明所述的微流控装置的一些实施方式，所述微流控装置还包括覆盖在微流控芯片顶部的盖片。
根据本发明所述的微流控装置的一些实施方式，所述微流控装置还包括与检测单元出口连通的废液收集单元。
本发明第四方面提供了一种采用上述的微流控装置进行致病菌检测的方法，包括：
(1)从进样单元通入的样品进入微流控芯片的通道结构，通道结构内的阵列结构表面的适配体捕获样品中的致病菌；
(2)对捕获的致病菌进行裂解，然后与试剂注入口通入的发光体系接触，通过检测单元进行检测。
根据本发明所述的检测方法的一些实施方式，所述发光体系为荧光素酶发光体系；
根据本发明所述的检测方法的一些实施方式，所述发光体系包括细菌裂解剂和荧光素发光剂。优选地，所述荧光素发光剂可以包括荧光素、荧光素酶以及氯化镁。
根据本发明所述的检测方法的一些实施方式，细菌裂解剂的选择可以根据检测目标致病菌进行选择。例如针对大肠杆菌O157:H7细菌裂解剂可以为苯扎溴铵。
根据本发明所述的检测方法的一些实施方式，荧光素发光剂的选择可以根据检测目标致病菌进行选择。例如针对大肠杆菌O157:H7，荧光素发光剂包括荧光素、荧光素酶和微量的氯化镁，或者采用商购的试剂盒进行，例如购自Promega公司(北京)的试剂盒。
根据本发明所述的检测方法的一些实施方式，所述裂解的方法包括通入表面活性剂。在本发明中，表面活性剂以能够使致病菌(细菌)破裂并释放出三磷酸腺苷即可，例如，所述表面活性剂可以为但不限于：甘露糖赤藓糖醇脂、苯扎溴铵、四级铵盐等，优选为苯扎溴铵和/或四级铵盐。
根据本发明所述的检测方法的一些实施方式，所述检测方法为化学发光检测法。
根据本发明所述的检测方法的一些实施方式，在步骤(2)之后，该方法还包括采用已知浓度的标准样品并结合外标法校准捕获率。
本发明第五方面提供了上述的微流控芯片或根据上述的方法制备的微流控芯片或上述的微流控装置或上述的致病菌检测的方法在食源性致病微生物中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明的微流控芯片通过在阵列结构表面修饰经过多重筛选的核酸适配体，优选地采用特定结构和优选覆盖率的微柱阵列结构，使得本发明的微流控芯片具有高度的种属特异性，可以实现对某一特定种致病菌(细菌)的特异性捕获，避免了假阳性结果的产生，而且能够高效浓缩微生物。
(2)本发明微流控芯片的通道结构的高度与阵列结构的高度可以相同或不同，在优选的高度相同的情况下，能保障整个通道中流经的液体通过结构单元(例如圆柱)之间的间隙，增大了致病菌(细菌)与阵列柱上适配体接触的几率，极大的提高了捕获效率。
(3)本发明的微流控装置设有样品入口和优选的废液收集单元，并且微流控芯片的入口端设置有试剂注入口，避免了试剂之间的交叉污染以对检测检测造成影响。细菌被捕获后，在试剂注入口处加入荧光素酶发光体系，可直接对所捕获的细菌进行定量检测，化学发光原理如图4所示。
(4)本发明的微流控装置可以为多通道的设计，例如15个通道等，可以实现多种致病菌的同时检测，具有高通量的特点。
(5)采用本发明的微流控装置及检测方法，结合细菌内衡量的三磷酸腺苷(ATP)与荧光素反应产生化学发光的特点，对捕获的细菌实现实时的定量检测，具有高灵敏度的优点，可以达到每毫升样品中最低100cfu的检出限。
(6)采用本发明的微流控芯片进而制备的微流控装置，能够实现对于食物样品中低含量的致病菌微生物的快速富集、鉴定及检测。与传统的实时检测芯片相比，本芯片具有极高的特异性捕捉效率，能从极低的浓度样品中高倍数的富集目标细菌，可作为食源性致病菌一次性检测或多次用检测使用，检测效果稳定性高。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的微流控装置(除盖板)的示意图；
图2为本发明实施例1提供的微流控装置的盖板的示意图；
图3为本发明实施例1提供的阵列结构表面修饰适配体的流程示意图；
图4为本发明实施例2提供的化学发光检测法的反应原理图；
图5为本发明实施例2提供的荧光检测结果图。
附图标记说明
1、进样单元 1(1)、进样单元进样口 1(2)、进样单元分流通道
2、试剂注入口 3、微流控芯片 3(1)、通道结构
3(2)、表面修饰有适配体的阵列结构 4、检测单元
5、废液收集单元 6、盖板
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
【制备例1】
针对含大肠杆菌O157:H7致病菌的末端氨基化修饰的适配体的制备方法：适配体(aptamer)由DNA或RNA构成(主要是DNA)，比蛋白质体积更小，经筛选富集后，可以拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度，同时合成更容易，稳定性更好，适配体序列结构通过如下文献获得(Xingkai Hao,Poying Yeh,Yubo Qin,Yuqian Jiang,Zhenyu Qiu,Shuying Li,TaoLe,Xudong Cao,Aptamer surface functionalization of microfluidic devices usingdendrimers as multi-handled templates and its application in sensitivedetections of foodborne pathogenic bacteria,Analytica Chimica Acta,Volume1056,2019,Pages 96-107,ISSN 0003-2670)，并且经过验证均具有良好的种属特异性。每段适配体末端直接合成有氨基基团，用于后期与修饰后的PMDS交联。大肠杆菌O157H7:O7特异性氨基化修饰适配体序列如下：5'/NH2/CCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCAGGTGTGACGG/3′。
【实施例1】
(1)制备微流控芯片
通过掩膜法制备具有通道结构的芯片层，其中通道结构内具有阵列结构，阵列结构的材质和芯片层的材质均为PDMS，芯片层与基底键合，基底的材质为玻璃，阵列结构包含1000个结构单元，每个结构单元的形状为圆柱状，直径为20μm；垂直于流体流动方向上，相邻两个结构单元的距离为40μm；通道结构和阵列结构的高度均为50μm；每个结构单元的直径与高度的比例为1:2.5，结构单元水平截面总面积覆盖通道结构水平截面面积的30％，然后进行等离子体氧化处理(常温下，300mT，20W条件下等离子体暴露60s)，再在常温下与3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液(5％，v/v，溶解在乙醇中)处理60min，然后室温下采用戊二醛溶液(4％，v/v，溶解在PBS缓冲液中)处理60min，然后与制备例1得到的末端氨基化修饰的适配体接触。阵列结构表面修饰适配体的流程示意图如图3所述。
(2)微流控装置
如图1和图2所示，微流控装置包括进样单元1，以及15组与进样单元依次连通的步骤(1)得到微流控芯片3和检测单元4，检测单元4出口连通废液收集单元5，在微流控芯片顶部设置盖片6(PMMA材质)，在每个微流控芯片3的入口端设置试剂注入口2。进样单元1包括进样单元进样口1(1)和进样单元分流通道1(2)。
【实施例2】
(1)按照实施例1的方法制备微流控芯片
(2)微流控装置
微流控装置包括进样单元，以及1组与进样单元依次连通的步骤(1)得到微流控芯片和检测单元，检测单元出口连通废液收集单元，在微流控芯片顶部设置盖片(PMMA材质)，在每个微流控芯片的入口端设置试剂注入口。进样单元包括进样单元进样口和进样单元分流通道。
(3)致病菌的检测
从进样单元进样口1(1)处注入将含大肠杆菌O157:H7致病菌的样品，通入微流控芯片的通道结构，样品溶液被均匀分流到不同的通道结构中，通过结构内的阵列结构表面的适配体捕获样品中的致病菌；接着在进样单元进样口1(1)处通入PBS缓冲液对未被结合的样品进行冲洗，此步骤以及之前步骤产生的废液均由废液收集单元5进行收集。完成捕获后，从试剂注入口2通入荧光素酶发光体系，该体系中包括细菌裂解剂苯扎溴铵和荧光素发光反应所需的荧光素、荧光素酶和氯化镁。细菌裂解后释放出的三磷酸腺苷(ATP)与荧光素发生反应生成荧光，在此之后在检测单元4的检测腔室对反应后的溶液进行抽取，进行化学发光检测。其中大肠杆菌O157:H7致病菌的化学发光法检测的反应原理图如图4所示。
检测后按照下式进行计算捕获率，结果见表1。
捕获率＝Nc/N0，其中，Nc是捕获到的细菌数，单位为cfu/mL；N0是空白对照组的细菌数，单位为cfu/mL。
在相同的实验条件下，依次从样品进样单元加入十倍等度稀释的细菌样品溶液，其浓度分别为102个/mL、103个/mL、104个/mL、105个/mL、106个/mL、107个/mL，所得的荧光检测定量结果如图5所示。表示在此浓度范围内，定量结果稳定，根据所建立的标准曲线可以准确定量。
【实施例3】
(1)制备微流控芯片
按照实施例1的步骤(1)制备微流控芯片，不同的是，结构单元水平截面总面积覆盖通道结构水平截面面积的50％。
(2)微流控装置
微流控装置包括进样单元，以及1组与进样单元依次连通的步骤(1)得到微流控芯片和检测单元，检测单元出口连通废液收集单元，在微流控芯片顶部设置盖片(PMMA材质)，在每个微流控芯片的入口端设置试剂注入口。进样单元包括进样单元进样口和进样单元分流通道。
(3)按照实施例2的步骤(3)进行致病菌的检测。
检测后计算捕获率，结果见表1。
【实施例4】
(1)制备微流控芯片
按照实施例1的步骤(1)制备微流控芯片，不同的是，结构单元水平截面总面积覆盖通道结构水平截面面积的15％。
(2)微流控装置
微流控装置包括进样单元，以及1组与进样单元依次连通的步骤(1)得到微流控芯片和检测单元，检测单元出口连通废液收集单元，在微流控芯片顶部设置盖片(PMMA材质)，在每个微流控芯片的入口端设置试剂注入口。进样单元包括进样单元进样口和进样单元分流通道。
(3)按照实施例2的步骤(3)进行致病菌的检测。
检测后计算捕获率，结果见表1。
【实施例5】
(1)制备微流控芯片
按照实施例1的步骤(1)制备微流控芯片，不同的是，结构单元水平截面总面积覆盖通道结构水平截面面积的90％。
(2)微流控装置
微流控装置包括进样单元，以及1组与进样单元依次连通的步骤(1)得到微流控芯片和检测单元，检测单元出口连通废液收集单元，在微流控芯片顶部设置盖片(PMMA材质)，在每个微流控芯片的入口端设置试剂注入口。进样单元包括进样单元进样口和进样单元分流通道。
(3)按照实施例2的步骤(3)进行致病菌的检测。
检测后计算捕获率，结果见表1。
【实施例6】
(1)制备微流控芯片
按照实施例1的步骤(1)制备微流控芯片，不同的是，每个结构单元的形状为正三角形(俯视为正三角形)，三角形的高为20μm。
(2)微流控装置
微流控装置包括进样单元，以及1组与进样单元依次连通的步骤(1)得到微流控芯片和检测单元，检测单元出口连通废液收集单元，在微流控芯片顶部设置盖片(PMMA材质)，在每个微流控芯片的入口端设置试剂注入口。进样单元包括进样单元进样口和进样单元分流通道。
(3)按照实施例2的步骤(3)进行致病菌的检测。
检测后计算捕获率，结果见表1。
【实施例7】
(1)制备微流控芯片
按照实施例1的步骤(1)制备微流控芯片，不同的是，通道结构的高度为50μm，阵列结构的高度为20μm。
(2)微流控装置
微流控装置包括进样单元，以及1组与进样单元依次连通的步骤(1)得到微流控芯片和检测单元，检测单元出口连通废液收集单元，在微流控芯片顶部设置盖片(PMMA材质)，在每个微流控芯片的入口端设置试剂注入口。进样单元包括进样单元进样口和进样单元分流通道。
(3)按照实施例2的步骤(3)进行致病菌的检测。
检测后计算捕获率，结果见表1。
【实施例8】
(1)制备微流控芯片
按照实施例1的步骤(1)制备微流控芯片，不同的是，不进行等离子体氧化处理，即：
通过掩膜法制备具有通道结构的芯片层，其中通道结构内具有阵列结构，阵列结构的材质和芯片层的材质均为PDMS，芯片层与基底键合，基底的材质为玻璃，阵列结构包含1000个结构单元，每个结构单元的形状为圆柱状，直径为20μm；垂直于流体流动方向上，相邻两个结构单元的距离为40μm；通道结构和阵列结构的高度均为50μm；每个结构单元的直径与高度的比例为1:2.5，结构单元水平截面总面积覆盖通道结构水平截面面积的30％，然后在常温下与3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液(5％，v/v，溶解在乙醇中)处理60min，再在室温下采用戊二醛溶液(4％，v/v，溶解在PBS缓冲液中)处理60min，然后与制备例1得到的末端氨基化修饰的适配体接触。
(2)微流控装置
微流控装置包括进样单元，以及1组与进样单元依次连通的步骤(1)得到微流控芯片和检测单元，检测单元出口连通废液收集单元，在微流控芯片顶部设置盖片(PMMA材质)，在每个微流控芯片的入口端设置试剂注入口。进样单元包括进样单元进样口和进样单元分流通道。
(3)按照实施例2的步骤(3)进行致病菌的检测。
检测后计算捕获率，结果见表1。
【实施例9】
(1)制备微流控芯片
按照实施例1的步骤(1)制备微流控芯片，不同的是，不进行硅烷偶联剂处理处理，即：
通过掩膜法制备具有通道结构的芯片层，其中通道结构内具有阵列结构，阵列结构的材质和芯片层的材质均为PDMS，芯片层与基底键合，基底的材质为玻璃，阵列结构包含1000个结构单元，每个结构单元的形状为圆柱状，直径为20μm；垂直于流体流动方向上，相邻两个结构单元的距离为40μm；通道结构和阵列结构的高度均为50μm；每个结构单元的直径与高度的比例为1:2.5，结构单元水平截面总面积覆盖通道结构水平截面面积的30％，然后进行等离子体氧化处理(常温下，300mT，20W条件下等离子体暴露60s)，再在室温下采用戊二醛溶液(4％，v/v，溶解在PBS缓冲液中)处理60min，然后与制备例1得到的末端氨基化修饰的适配体接触。
(2)微流控装置
微流控装置包括进样单元，以及1组与进样单元依次连通的步骤(1)得到微流控芯片和检测单元，检测单元出口连通废液收集单元，在微流控芯片顶部设置盖片(PMMA材质)，在每个微流控芯片的入口端设置试剂注入口。进样单元包括进样单元进样口和进样单元分流通道。
(3)按照实施例2的步骤(3)进行致病菌的检测。
检测后计算捕获率，结果见表1。
【实施例10】
(1)制备微流控芯片
按照实施例1的步骤(1)制备微流控芯片，不同的是，不进行交联改性处理，即：
通过掩膜法制备具有通道结构的芯片层，其中通道结构内具有阵列结构，阵列结构的材质和芯片层的材质均为PDMS，芯片层与基底键合，基底的材质为玻璃，阵列结构包含1000个结构单元，每个结构单元的形状为圆柱状，直径为20μm；垂直于流体流动方向上，相邻两个结构单元的距离为40μm；通道结构和阵列结构的高度均为50μm；每个结构单元的直径与高度的比例为1:2.5，结构单元水平截面总面积覆盖通道结构水平截面面积的30％，然后进行等离子体氧化处理(常温下，300mT，20W条件下等离子体暴露60s)，再在常温下与3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液(5％，v/v，溶解在乙醇中)处理60min，然后与制备例1得到的末端氨基化修饰的适配体接触。
(2)微流控装置
微流控装置包括进样单元，以及1组与进样单元依次连通的步骤(1)得到微流控芯片和检测单元，检测单元出口连通废液收集单元，在微流控芯片顶部设置盖片(PMMA材质)，在每个微流控芯片的入口端设置试剂注入口。进样单元包括进样单元进样口和进样单元分流通道。
(3)按照实施例2的步骤(3)进行致病菌的检测。
检测后计算捕获率，结果见表1。
表1
实施例 捕获率(％)
实施例2 85
实施例3 83
实施例4 65
实施例5 55
实施例6 50
实施例7 45
实施例8 8
实施例9 15
实施例10 7
以上所述的仅是本发明的优选实例。应当指出对于本领域的普通技术人员来说，在本发明所提供的技术启示下，作为本领域的公知常识，还可以做出其它等同变型和改进，也应视为本发明的保护范围。

Claims (21)

1.一种微流控装置，包括进样单元，以及多组与所述进样单元依次连通的微流控芯片和检测单元，多组的微流控芯片之间并联设置，多组的检测单元之间并联设置，所述微流控装置还设置与检测单元出口连通的废液收集单元，在微流控芯片的入口端分别设置试剂注入口，其中，所述微流控芯片包括芯片层，在所述芯片层内具有通道结构，在所述通道结构内具有表面修饰有适配体的阵列结构；所述修饰的方法包括将阵列结构依次进行等离子体氧化处理、硅烷偶联剂处理和交联改性处理，然后与末端氨基化修饰的适配体接触；其中所述阵列结构包含多个结构单元，结构单元水平截面总面积覆盖通道结构水平截面面积的30-50％，每个结构单元的形状为圆柱状。
2.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述阵列结构的材质选自聚二甲基硅氧烷、聚甲基苯烯酸甲酯和玻璃中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述微流控芯片还包括与芯片层键合的基底。
4.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，通道结构的高度与阵列结构的高度相同或不同。
5.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，垂直于流体流动方向上，相邻两个结构单元的距离为20-100μm。
6.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，垂直于流体流动方向上，相邻两个结构单元的距离为20-50μm。
7.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，每个结构单元的直径与高度的比例为1:1-10。
8.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，每个结构单元的直径与高度的比例为1:1-3。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的微流控装置，其特征在于，所述微流控芯片的制备方法，包括：
(1)形成具有通道结构的芯片层，其中所述通道结构内具有阵列结构；
(2)在所述阵列结构的表面修饰适配体；
所述修饰适配体的方法包括依次进行等离子体氧化处理、硅烷偶联剂处理和交联改性处理，然后与末端氨基化修饰的适配体接触。
10.根据权利要求9所述的微流控装置，其特征在于，所述等离子体氧化的条件包括：等离子体暴露30-60s。
11.根据权利要求9所述的微流控装置，其特征在于，所述硅烷偶联剂选自3-氨丙基三乙氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷和乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷中的一种或多种。
12.根据权利要求9所述的微流控装置，其特征在于，所述硅烷偶联剂处理的条件包括：采用偶联剂处理30-90min。
13.根据权利要求9所述的微流控装置，其特征在于，所述交联改性采用戊二醛和/或京尼平进行交联改性。
14.根据权利要求9所述的微流控装置，其特征在于，所述交联改性处理时间为30-90min。
15.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述微流控装置还包括覆盖在微流控芯片顶部的盖片。
16.一种采用权利要求1-15中任意一项所述的微流控装置进行致病菌检测的方法，包括：
(1)从进样单元通入的样品进入微流控芯片的通道结构，通道结构内的阵列结构表面的适配体捕获样品中的致病菌；
(2)对捕获的致病菌进行裂解，然后与试剂注入口通入的发光体系接触，通过检测单元进行检测。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述发光体系为荧光素酶发光体系。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述发光体系包括细菌裂解剂和荧光素发光剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述荧光素发光剂包括荧光素、荧光素酶和氯化镁。
20.根据权利要求16-19中任意一项所述的方法，其特征在于，所述裂解的方法包括通入表面活性剂；和/或，
所述检测方法为化学发光检测法。
21.权利要求1-15中任意一项所述的微流控装置或权利要求16-20中任意一项所述的致病菌检测的方法在食源性致病微生物中的应用。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113514453B (zh) * 2021-04-21 2022-07-15 清华大学 一种检测细菌的微流控芯片、检测仪及检测方法及应用
CN113533719B (zh) * 2021-06-18 2023-08-22 清华大学 基于微流控芯片的食源性致病菌的检测方法
CN114018812B (zh) * 2021-11-10 2023-10-20 重庆大学 一种细菌采集检测一体化微流控荧光芯片及其应用
CN114252602B (zh) * 2021-12-22 2023-09-12 清华大学深圳国际研究生院 微流控芯片、基于微流控芯片的检测系统及细菌的检测方法
CN114966051B (zh) * 2022-05-22 2023-10-24 北京百奥纳芯生物科技有限公司 一种微流控蛋白质芯片及其制作方法与应用
CN115322982B (zh) * 2022-08-15 2023-08-15 北京工商大学 一种载细胞微胶囊的制备方法及其应用
CN115430469B (zh) * 2022-09-01 2023-08-04 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种用于病原菌快速检测的滑动微流控芯片
CN116952914A (zh) * 2023-07-27 2023-10-27 宁波大学 一种荧光检测黑盒装置及致病菌检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8835624B1 (en) * 2013-10-23 2014-09-16 National Tsing Hua University Influenza A H1N1 subtype-specific aptamer and applications thereof
CN107044972A (zh) * 2017-05-25 2017-08-15 沈阳优宁生物科技有限公司 一种微流控芯片荧光免疫快速检测试剂盒及其制备和检测方法
CN109852530A (zh) * 2019-03-29 2019-06-07 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种集循环肿瘤细胞捕获、裂解与核酸检测于一体的微流控芯片及其装置以及方法
CN110437978A (zh) * 2019-08-12 2019-11-12 北京航空航天大学 细菌总量、细菌孢子量的一体化的检测微流控芯片
WO2020113192A1 (en) * 2018-11-28 2020-06-04 Cornell University Systems and methods for on-chip analysis of nucleic acids and for multiplexed analysis of cells

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4755871B2 (ja) * 2005-09-16 2011-08-24 株式会社山武 バイオチップ用基板及びバイオチップの製造方法
CN102183648A (zh) * 2011-01-26 2011-09-14 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 生物发光检测特种致病菌使用的检测方法和检测用试剂盒
CN102288755B (zh) * 2011-07-19 2013-11-13 浙江大学 一种用于微生物现场快速检测的pdms多通道免疫分析芯片
CN102590506A (zh) * 2012-02-16 2012-07-18 上海师范大学 一种快速检测筛选金黄色葡萄球菌的方法
CN102662049B (zh) * 2012-05-07 2014-03-26 清华大学 基于碳纳米材料的免疫分析方法
US20150031014A1 (en) * 2013-07-25 2015-01-29 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Detecting analytes with a ph meter
KR101667148B1 (ko) * 2015-04-28 2016-10-17 이화여자대학교 산학협력단 표적 소분자 검출용 미세 유동 장치, 이의 제조방법 및 이를 이용한 표적 소분자 검출 방법
CN105861297A (zh) * 2016-03-29 2016-08-17 厦门大学 一种循环肿瘤细胞检测芯片及其应用
WO2018111782A1 (en) * 2016-12-12 2018-06-21 Cepheid Integrated immuno-pcr and nucleic acid analysis in an automated reaction cartridge
CN107185612B (zh) * 2017-03-17 2020-12-01 庶安永龄(厦门)健康产业有限公司 一种应用于外泌体捕获的微流体芯片及其制备方法
CN110093254A (zh) * 2019-06-06 2019-08-06 上海海洋大学 一种用于快速捕获或检测细胞的微流控芯片及方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8835624B1 (en) * 2013-10-23 2014-09-16 National Tsing Hua University Influenza A H1N1 subtype-specific aptamer and applications thereof
CN107044972A (zh) * 2017-05-25 2017-08-15 沈阳优宁生物科技有限公司 一种微流控芯片荧光免疫快速检测试剂盒及其制备和检测方法
WO2020113192A1 (en) * 2018-11-28 2020-06-04 Cornell University Systems and methods for on-chip analysis of nucleic acids and for multiplexed analysis of cells
CN109852530A (zh) * 2019-03-29 2019-06-07 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种集循环肿瘤细胞捕获、裂解与核酸检测于一体的微流控芯片及其装置以及方法
CN110437978A (zh) * 2019-08-12 2019-11-12 北京航空航天大学 细菌总量、细菌孢子量的一体化的检测微流控芯片

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Aptamer surface functionalization of microfluidic devices using dendrimers as multi-handled templates and its application in sensitive detections of foodborne pathogenic bacteria";Xingkai Hao;《Analytica Chimica Acta》;20190129;全文 *

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