JP2002506200A - 微細孔に閉じ込められたセル個体群を含むバイオセンサアレイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 化学的な及び生物的な物質に対して唯一の応答特性を有する、個々のセル又はランダムに混合されたセルの個体群が、基質内の複数のディスクリートサイトに配置されているバイオセンサ、センサアレイ、検出方法及び検出装置が提供される。１つの好ましい実施形態においては、ディスクリートサイトが光ファイバアレイ内の個々のファイバの末端部に形成されたマイクロウエルを含んでいる。バイオセンサアレイは、アレイ内の各タイプの位置及び個性を決定するために光学的に探査可能な符号化機構を利用し、かつ分析対象物に対する多数の個々のセルの応答の同時測定を可能にする。検出方法は、特徴的かつ検出可能な仕様で生物的に重要な化合物に応答するために、セル個体群の唯一の能力を利用する。バイオセンサアレイ及び測定方法は、生物的活性物質の研究、現場における環境監視、種々の生物プロセスの監視、及び多くの組み合わせの化学収集物の高処理能力でのろ過に用いられることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、概して、バイオセンサ、バイオセンサアレイおよび化学物質および
生体物質の分析のための検出装置、検出方法に関する。より具体的には、本発明
は、バイオセンサ、バイオセンサアレイ、細胞および細胞を混合した集団を利用
して化学物質および生体物質を分析する検出装置、検出方法に関する。

【０００２】 （背景技術） 化学、生物学および医学の重要な技術的進歩は、微量なサンプルのミクロ分析
能力によることが一般に知られている。しかし、微量で分析測定を行うことは、
少量のサンプルの取り扱い、検体の単離および単一細胞生理機能のミクロ分析で
生じる困難性のために、長い間の難題であった。

【０００３】 ナノリットル、ピコリットルおよびフェムトリットルの体積研究は、インビト
ロおよびインビボ細胞検査、電気化学、マトリックスアシストレーザ離脱イオン
化質量分析、ミクロカラム液体クロマトグラフィ、ミクロ滴定およびキャピラリ
ー電気泳動を含む応用の範囲内での探求であった。細胞検査は、R.M. Wightman らによるProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:10754 (1991); R. H. Chowらによ るNature 356:60 (1992); T. K. ChenらによるAnal. Chem. 66:3031 (1994); S.
E. ZerbyらによるNeurochem. 66:651 (1996); P. A. GarisらによるJ. Neurosc
i. 14:6084 (1994); G. ChenらによるJ. Neurosci. 15:7747 (1995) を参照され
たい。電気化学は、R. A. ClarkらによるAnal. Chem. 69(2):259 (1997) を参照
されたい。マトリックスアシストレーザ離脱イオン化質量分析は、S. Jespersen
らによるRapid Commun. Mass Spectrom. 8:581 (1994) を参照されたい。ミクロ
カラム液体クロマトグラフィは、I. A. HollandらによるAnal. Chem. 67:3275 (
1995); M.D. OatesらによるAnal. Chem. 62:1573 (1990) を参照されたい。ミク
ロ滴定は、M. GratzlらによるAnal. Chem. 65:2085 (1993); C. YiらによるAnal
. Chem. 66:1976 (1994) を参照されたい。キャピラリー電気泳動は、M. Jansso
nらによるJ. Chromatogr. 626:310 (1992); P. Beyer HietpasらによるJ. Liq.
Chromatogr. 18:3557 (1995) を参照されたい。

【０００４】 ClarkらによるAnal. Chem. 69(2):259 (1997) は、従来のフォトリソグラフィ
マスクおよびフォトレジスト技術を用いて電気化学ミクロ分析のためのピコリッ
トルのミクロ瓶を製造し、シリコンウェハテンプレート上のポリスチレンのミク
ロ瓶の型を移す方法を開示する。これらのミクロ瓶は、典型的には、型表面のレ
ジストエッチングの制御および型移送プロセスの困難さのために、大きさおよび
形状が一様ではない。

【０００５】 ParkらによるScience 276:1401 (1997) は、窒化シリコンの反応型イオンエッ
チングにおいて、ポリスチレン−ポリブタジエン順序ダイブロックコポリマー(p
olystyrene-polybutadiene, ordered, diblock copolymers) をマスクとして用 いてナノメータサイズのホールアレイを生成する改良型リソグラフィ法を開示す
る。この複数ステップの方法は、ピコメーターサイズのホールアレイの生成が可
能である。ピコメーターサイズのホールは、典型的には、２０ナノメーターの直
径、２０ナノメーターの深さを有し、間隔が４０ナノメーターである。１０¹¹ホ
ール／ｃｍ²までのホール密度が開示されている。この方法により生成されるホ ールのサイズおよび間隔の範囲は、コポリマーミクロドメインのサイズにより制
限される。ホールを形成するのに用いられるエッチング法の制御の困難性に起因
して、この方法でホールサイズおよび間隔を均一に維持するのは困難である。

【０００６】 DeutschらによるCytometry 16:214 (1994) は、ブランク化（blankened）ニッ
ケルプレート内の、ミクロンサイズの円錐形ホールからなる多孔性電気めっきニ
ッケルミクロアレイを開示する。ホールサイズは、上限値７μｍから下限値３μ
ｍであり、８μｍの深さである。アレイは、個々の細胞を捕らえ、そのミクロ環
境の変化に対する反応を研究するための細胞担体として用いられる。米国特許第
4,772,540号では、Deutschらはまた、フォトレジストおよび電気めっき技術を組
み合わせて用いて、そのようなアレイを作成する方法を開示している。

【０００７】 Corning Costar Corp（アクトン、マサチューセッツ州）は、商標PixWell^TMを
用いて、小型化アッセイ向けの商業的ミクロウェルアレイを生産する。これらの
アレイは、ミクロ形成されたガラスプレートから製造され、ウェル密度４３５６
ウェル／ｃｍ²、２０μｍの深さのテーパ状ウェルで直径４０μｍである。

【０００８】 ミクロウェルアレイは、生体細胞の研究に特に有用である。細胞研究では、ロ
ーカル環境における変化や操作に対する、個々の細胞の反応の測定が必要である
。このような研究向けに設計されたどのような方法や装置も、細胞生存力を維持
し、個々の細胞の位置を識別し、反応測定を個々の細胞と関連付けできなければ
ならない。

【０００９】 細胞内の研究に用いられる、生存可能な蛍光プローブが利用できるので、生体
細胞の蛍光測定は、細胞機能の研究に非常に有用である。よって蛍光光学測定は
細胞研究によく利用される。蛍光光学測定は、３種類の一般的な細胞測定方法が
利用できる。すなわち、細胞集団の体積測定、細胞集団または個々の細胞の動的
測定、および個々の細胞の静的測定である。

【００１０】 全細胞集団の特性は、概して複数の細胞を有するサンプルボリュームの体積測
定で研究できる。この方法は、細胞集団がかなり同質な場合には好ましい。一般
的に認識されているこの方法の制限は、背景蛍光（background fluorescence） の存在である。背景蛍光は、測定の感度、および細胞集団内の相違や異種性の識
別能力を減少させる。

【００１１】 フローサイトメトリー法は、体積細胞集団測定に生じた背景蛍光の問題を低減
するのによく利用される [ M. R. GauciらによるCytometry 25:388 (1996); R.C
. BoltzらによるCytometry 17:128 (1994)]。これらの方法では、細胞蛍光発光 は、励起光ビームを通して層流により細胞が移送されたときに測定される。フロ
ーサイトメトリー法は、後続の静的な細胞測定のため少量の細胞の予備的な分類
および基板上への沈積を行う静的な方法と組み合せることができる [Hoggらへの
米国特許第4,009,435号、KanzらによるCytometry 7:491 (1986); Schildkrautら
によるJ. Histochem Cytochem 27:289 (1979) ]。

【００１２】 Gauciらは、細胞のサイズ、形状および体積が、光の散乱により測定し、蛍光 染料を利用して、細胞のタンパク質含有量および核酸総含有量を決定する方法を
開示する。この方法はさらに、１秒に約１００細胞の速度で、さまざまな細胞の
数を数え、大きさをそろえることができる。

【００１３】 フローサイメトリー技術は、一般的に各細胞を短期間で個別に測定する場合に
制限される。この方法では、同一の細胞に時間をかけて反復して測定を行うこと
はできない。それは、励起光ビーム内の典型的な細胞のドウェル時間は、典型的
には数マイクロ秒だからである。加えて、そのような短い測定時間では、個々の
細胞蛍光発光による蓄積強度は低いので、正確さを欠き、その測定の信頼性に制
限してしまう。

【００１４】 RegnierらによるTrends in Anal. Chem. 14 (4):177 (1995) は、単細胞分析 のための、侵襲性の、電気泳動により媒介されたミクロ分析法が記載されている
。この方法は、キャピラリー電気泳動カラムの注入端におけるテーパ状ミクロイ
ンジェクタを利用し、個々の細胞膜を突き破り、細胞質のサンプルを取り出す。
この方法は、１度に１つの細胞の細胞含有量を測定する。この方法は、一般的に
、酸化容易な種類の検出に制限される。

【００１５】 HoganらによるTrends in Anal. Chem. 12(1):4 (1993) は、マイクロカラム分
離技術を開示する。マイクロカラム分離技術は、従来のガスクロマトグラフ質量
分析計、小細胞容積のミクロ薄層クロマトグラフィーまたは高圧液体操作のいず
れかと組み合わせて利用される。この方法の感度には制限があり、検出のための
標的混合物の前選択が要求される。 静的な方法は、一般に個々の細胞を測定するには好ましい方法である。測定方 法は、従来の光学顕微鏡による個々の細胞の観察から、コンピュータ化されたイ
メージ分析システムによるレーザスキャン顕微鏡の利用までに及ぶ。L. Hartら によるAnal. Quant. Cytol. Histol. 12:127 (1990) を参照されたい。このよう
な方法は、典型的には実際の測定に先立って、個々の細胞を基板に接着する必要
がある。ここで、単一の細胞または単一の細胞層を基板に接着する際に、および
細胞環境の分析または操作の間、固定位置に細胞を維持する際に問題が生じる。
加えて、個々の細胞の反復測定には、典型的には個々の細胞の位置の物理的なイ
ンデックス付け、各細胞を順次スキャニングする機構の提供、および個々の細胞
の反復分析のためのインデックス付けした位置への復帰が必要である。

【００１６】 HuangらによるTrends in Anal. Chem. 14(4) 158 (1995) は、静的な電気化学
法と、単一細胞の生化学環境をモニタする電極を開示する。この方法は、微小電
極リファレンスの製造および手動の位置付けと、細胞内での動作電極（working
electrode）が必要である。この方法は、単一細胞または細胞外部でのインシュ リン、酸化窒素およびグルコースを検出するのに利用される。この方法は、一般
に細胞内の酸化還元反応の研究に限定されている。

【００１７】 Inceらによる、J. Immunol. Methods 128:227 (1990) は、制御された環境下 で、単一細胞の研究のための閉チャンバ装置を開示する。この方法は、細胞研究
のため、極端な環境条件を生成可能な、ミクロ潅流チャンバを利用する。様々な
溶解液がチャンバ内を通過すると、個々の細胞は、２枚のカバーグラスによって
適当な位置に保持される。この方法の１つの制限は、封じられたガス気泡を除去
するのが困難なことである。ガス気泡は、高い度合いで自己蛍光を引き起こし、
よって背景蛍光のために測定感度が減少する。

【００１８】 従来の静的な方法で生じた制限を克服するために、DeutschらによるCytometry
16:214 (1994) および、Weinreb およびDeutschは、米国特許第4,729,949号、 第5,272,081号および第5,310,674号および第5,506,141号は、細胞集団内での個 々の細胞の反復光学測定装置および方法を開示する。ここでは各細胞の位置は、
細胞環境の操作の間保護される。

【００１９】 ドイッシュ等（Deutsch, et al.,）により開示された装置の中心的な特徴はセ
ルキャリヤ（cell carrier）であり、該セルキャリヤは、吸引力を作用させるこ
とによって個々の細胞（セル：cell）を捕捉し保持するために、円錐形をしたア
パーチュア（aperture）若しくはトラップ（trap）の二次元的な配列を備えてい
る。上記セルキャリヤは、典型的には、ドイッシュ等に付与された米国特許第４
，７７２，５４０号に開示されている電気メッキ−フォトレジスト（photoresis
t）法によって製作される。セルキャリヤの目的は、セル周囲をマニピュレート （manipulate）している間、セルを定まったアレイ（array）位置に維持するた めの手段を設けることである。個々のセルは、吸引力によってセルキャリヤの穴
部内に付勢され、そして、ウェルズ（wells）は、その後に、バック−エミッテ ッド（back-emitted）偏光および強度を読み出す低強度の偏光ビーム（beam）で
照射される。二つの異なるリエージェント（reagent）が連続してセルと反応し たときには測定値が比較される。開示された方法では、ベースライン（baseline
）制御とアナライト（analyte）測定の両方のために二つの別々のセルキャリヤ が必要である。

【００２０】 ドイッシュ等の方法および装置は、患者から採取したセルサンプル（cell sam
ple）の健康状態と生存能力を調べるための診断的な試験において病理医によっ て採用されてきた。その方法および装置は、癌のスクリーニング（screening） ［ドイッシュ等；サイタメトリ（Cytometry）１６：２１４（１９９４），サイ タメトリ １６：２１４（１９９４）及びヨーロピアン Ｊ． 癌 ３２Ａ（１０）
：１７５８（１９９６）］並びにリウマチ様の関節炎［ツルジル等（Zurgil et
al.,） Isr. J. Med. S ci. ３３：２７３（１９９７）］の両方に適用されてお
り、そこでは、腫瘍抗原および細胞分裂誘起物質に曝すことによって誘発される
細胞質のマトリックス（matrix）の内部粘性率およびストラクチュアードネス（
structuredness）における変化に基づいて、健康な細胞に対して悪性のリンパ球
を識別するのに蛍光の偏光測定が用いられる。

【００２１】 ドイッシュ等の方法および装置は、３個のステッピングモータで駆動されるス
キャニングテーブル（scanning table）と、マッピング（mapping），インデッ クシング（indexing）及び個々のセルをセルキャリヤ内に位置させるためにコン
ピュータ制御システムの使用を必要とする。かかる機械的なスキャニング方法を
用いることは、バックラッシュ（backlash）及び繰り返し測定のための個々のセ
ル位置の再現可能なポジショニング（positioning）で遭遇する従来の機械的な 問題のために、測定の再現性と精度における制限を招くことになる。更に、全配
列の機械的なスキャニングは、配列中の各セルの測定時間を長くしてしまう。

【００２２】 ドイッシュ等の方法は、更に、蛍光の発光レスポンス（response）がセルキャ
リヤから光学的な検出体に通されるときの偏光上の種々の光学システム要素の著
しい影響に起因するある固有の制限を有している蛍光の偏光測定による制限を受
ける。バーリンデリ等（Birindelli, et al.,）［ヨーロピアン Ｊ． 癌 ３３（
８）：１３３３（１９９７）］は、また、信頼できる測定値を得るためには各条
件に対して少なくとも３つの測定スキャンの平均をとることを必要とするエレク
トロ・ポラリセーション値（electropolarisation values）における変動に起因
する、この方法における制限を明らかにしている。更に、セルの研究のためには
、偏光測定は、一般に、偏光における検出可能な変化を生み出すために細胞質粘
性率における十分な変化を創生する、セルレスポンスに制限される。全てのセル
レスポンスが検出可能な粘度変化によって達成されるわけではないので、その方
法は、更に、細胞質におけるかかる粘度変化を創り出す細胞活動に限られること
になる。

【００２３】 ザール等（Zare, et al.,）［サイエンス（Science）２６７：７４（１９９５
）；バイオフォトニクス インターナショナル（Biophotonics International）
; ３月−４月号，第１７頁（１９９５）］は、マイクロコラム（microcolumn） 分離技術によって分別された複合的な生物化学上の材料に対する生体細胞の反応
に基づいたバイオセンサ・システム（biosensor system）を開示している。ガラ
ス製のカバースリップ（cover slip）上に配置された細胞は、蛍光性のプロウブ
（probe）で取り扱われ、その後、細胞内でのカルシウム・レベル（calcium lev
el）の変化と同様に、アセチルコリン（acetylcoline），ブラジキニン（bradyk
inin）およびアデノシン（adenosine）三燐酸塩を含む一連の生物化学的なコン パウンド（compound）に対して敏感であることが示される。

【００２４】 ヨング等（Yeung, et al.,）［Acc. Chem. Res. ２７：４０９（１９９４）］
は、単一セルレスポンスの研究のための数多くの方法を再検討し、アナライト測
定に基づいてセル母集団内での著しい変動や不均一性を考察している。例えば、
引用文献は、生物化学的に反応性のあるコンパウンドに細胞を曝すための、かか
るコンパウンドに反応して創り出された個々の細胞の細胞内の流体を抽出するた
めの、そして、キャピラリ・コラム（capillary）内で移動回数からアナライト を識別するための、キャピラリ電気泳動法を開示している。他の蛍光性に基づい
た分析も開示されている。セル母集団内での個々のセルレスポンスにおける顕著
なセル・ツウ・セル（cell-to-cell）の変動および不均一が観察され、その差異
が、個々のセルと接触して生物学的なコンパウンドと化学的なコンパウンドとを
識別する方法を与え得る。

【００２５】 マコンネル等（McConnell, et al.,）［サイエンス（Science）２５７：１９ ０６（１９９２）］は、セルがその周囲のものを酸性化する速度を測定するため
のライト（light）呼び出し可能な電位差計センサを用いる、”サイトセンサ（C
ytosensor）”として知られるマイクロフィジオメータ（microphysiometer）装 置を開示している。このセンサは、局部的なペーハ（pH）における検出可能な変
化を生み出すセルレスポンスを監視するための小型化されたペーハ（pH）電極と
して作用する。開示された装置は、セルからの陽子の排出の測定に限られ、従っ
て、アナライトに対する酸を出すセルレスポンスの検出しかできない。

【００２６】 キム等（Kim, et al.,）に付与された米国特許第５，１７７，０１２号は、ブ
ドウ糖と果糖を調べるためのバイオセンサを開示している。そのバイオセンサは
、セル全体を有機溶剤で処理し、処理したセルの残留物を支持体に固定してペー
ハ（pH）電極に適用されるセル全体の膜を形成することにより作成される。

【００２７】 ピンケル等（Pinkel, et al.,）に付与された米国特許第５，６９０，８９４ 号は、例えば、核酸，抗体，蛋白質，レクチン（lectins）、および細胞，組織 ，自然の若しくは遺伝子工学的な微生物から誘導された他の材料などの材料であ
る生物学上の”バインディング・パートナ（binding partner）”を用いるバイ オセンサを開示している。これらのエイジェント（agent）はファイバ光アレイ （fiber optic array）と結び付けて使用され、そこでは、バインディング・パ ートナの各種が光検出器と組み合わされた光ファイバの束内のファイバのグルー
プによって、独特のやり方でアドレス付けられる。上記アレイは、生物学的なバ
インディング・パートナの広範なアレイをスクリーニング（screening）できる ように設計されている。

【００２８】 数多くの先行技術に係る方法がセル単体またはセルの母集団の分析をもたらし
ており、これら方法の幾つかのものは対象とするアナライトに対するセルレスポ
ンスの監視を提供しているが、開示された方法は、いずれも、化学的および生物
学的なアナライトによってもたらされた生物学的な刺激に対する個々のセルのレ
スポンスを同時に監視するために、大規模なモノカルチュア（monoculture）の 集団または生体セルの混ざり合った集団を採用することを提供するものではない
。従って、ユニークで検出可能なやり方で生物学的に重要なコンパウンドに反応
する生体セルの集団の能力を有効に利用するバイオセンサ・アレイ及び方法が求
められている。そのようなコンパウンドに対する生体セルの選択性は、薬剤のス
クリーニングや複合的な生物学的流体の分析において相当な価値と有用性がある
ので、生体セルのユニークな特性を利用するバイオセンサは、数十万の候補の医
薬的なコンパウンドが評価されなければならない組み合わせのライブラリ（libr
ary）の高いスループット（throughput）スクリーニングにおいて明確な有利性 をもたらすであろう。これに加えて、かかるセンサは、生体セルの周囲に対する
高い感受性が活用され得るバイオプロセス（bioprocess）や環境汚染の監視にも
役立つであろう。

【００２９】 発明の要旨 概説的に言えば、本発明は、化学上の及び生物学上の材料を分析するための、
バイオセンサ、バイオセンサ・アレイ、バイオセンサ検出システム及び検出方法
を提供するものである。より詳しく言えば、本発明は、化学上の及び生物学上の
材料を分析するために、生体セル及び生体セルの混ざり合った母集団を用いたバ
イオセンサ、バイオセンサ・アレイ、検出装置および検出方法を提供するもので
ある。

【００３０】 本発明のバイオセンサ・アレイは、生体セルのモノカルチュアか、生体セルの
無作為に混合させた母集団のいずれかを備えており、そこでは、アレイ内の個々
のセルが、基体上で光学的に読み出し可能で離散した、個々のセルの大きさ及び
形状に順応した部位に位置する。ある一つの実施態様においては、上記離散した
部位は、個々のセルの大きさ及び形状に順応するために予備成形されたマイクロ
ウェル（microwell）又は微小空洞（マイクロキャビティ：microcavity）を備え
ている。バイオセンサ・アレイ検出方法は、セル周囲内に生物学的な又は化学的
な材料の存在することによって化学的に又は生物学的に刺激された個々のセルが
、セル内の又は細胞質周囲における変化を創り出すことにより反応するという良
く知られた事実に依存しており、上記変化とは、セル自体内部で、又は、セルに
付着するか、セル内に取り込まれるか、若しくは局部的なセル周囲に付け加えら
れた、例えば、フルオロフォール、クロモフォール又は染料のような指示コンパ
ウンドから、光学的に応答指令信号を与えられることができ、また検出され得る
ものである。本発明のバイオセンサは、このように生体セルの生物学的に重要な
コンパウンドに反応する能力を利用している。そのようなコンパウンドに対する
生体セルの選択性は、薬剤のスクリーニングや複合的な生物学的流体の分析にお
いて相当な価値と有用性があるので、本発明のバイオセンサは、数十万の候補の
コンパウンドが評価されなければならない組み合わせのライブラリの高いスルー
プット・スクリーニングにおいて明確な有利性を提供する。

【００３１】 当該技術分野において熟練した者であれば分かるように、本発明のバイオセン
サ・アレイには、種々の基体材料および基体形状が採用され得る。個々のセルの
付着または組み合わせのために適切な、そして、セルアレイの光学的な呼びかけ
信号およびセル・レスポンスの検出にアクセス可能な離散した部位を与えるため
に採用され得る如何なる基体または材料も、アレイ基体として特に有用であろう
。候補となる基体材料は、これらに限定されるものではないが、ガラス、ポリマ
ー、セラミック、金属、及びこれらの材料で形成される複合物を含む。基体表面
の幾何学形状は、平面状、球面状、凹面状、凸面状および織り目状であり得る。
好ましくは、好適な基体は、アレイの光学的な呼びかけ信号および重要なアナラ
イトに対するセル・レスポンスの検出をもたらすように形作られるであろう。

【００３２】 好適な実施の形態では、本発明のバイオセンサアレイが、細胞配置用のサブス
トレートとして作用するファイバオプティックアレイ（fiber optic array）に 組み込まれる。「ファイバオプティックアレイ」又は他の文法的に同等なものは
、ここで、ファイバ束における分離した個々のファイバとしてグループ化される
、若しくは、予め形成された単一のファイバオプティックアレイとして軸方向に
沿って組み付けられる、複数の個々のファイバ又はファイバストランド（fiber
strands）を意味するものである。かかるアレイ内の個々のファイバは、例えば 、イメージングファイバの場合など、一様にすなわち一貫した構成で配置されて
も、あるいは、ランダムに方向付けられ、一貫していなくてもよい。ファイバオ
プティックアレイが、センササブストレートとして採用される場合、ファイバオ
プティック束又はファイバオプティックアレイにおける各ファイバの末端部は、
キャビティ又はマイクロウェル（microwell）を作るべく、化学的にエッチング される。本発明のバイオセンサアレイの概念をあらわす模式図が、図１に示され
る。好適な実施の形態では、細胞のモノカルチャ（monoculture）又は細胞ライ ン（cell line）の混合集団による個々の生きた細胞が、マイクロウェル内にて 分散させられる。マイクロウェルは、ファイバ束又はファイバアレイにおける個
々のファイバのコアの異方性エッチングにより形成される。マイクロウェルは、
周囲の外装材を損なわれないままに残しつつ、個々のファイバストランドの中心
に集められたコアの部分を移動させるよう、エッチング工程を制御することによ
り形成される。結果的なエッチング済みのキャビティは、個々の細胞を収容する
ように寸法付けられている。その個々のファイバコアが適切にサイズ設定される
ファイバオプティック束又はファイバオプティックアレイを選択することにより
、また、エッチングの状態を慎重に制御することにより、マイクロウェルの直径
及び奥行が、いかなる所望の細胞のタイプのサイズにも調和するように、あらゆ
る都合のよい寸法範囲において、制御されまた調整され得る。

【００３３】 １つの実施の形態では、分離したサブストレートのサイト（cite）又はマイク
ロウェルの内面が、コラーゲン，フィブロネクチン（fibronectin），ポリリシ ン（polylysine），ポリエチレン・グリコール（polyethylene glycol），ポリ スチレン（polystyrene）、又は、金，プラチナ若しくはパラジウム（palladium
）のような金属などの薄膜の生物学的に融和し得る材料で被覆されている。別の
実施の形態では、例えば、発螢光団（fluorophore），発色団（chromophore）又
は色素などの指標合成物（indicator compound）が、化学的な若しくは生物学的
な刺激に対する細胞のレスポンスを検出するために、マイクロウェルの表面に付
着させられている。

【００３４】 バイオセンサを、光学的に呼掛け可能な（interrogatable）サブストレート又
はファイバオプティックアレイへ組み込むことにより、本発明のバイオセンサの
イノベーション（innovation）は、分離した検出素子，ＣＣＤカメラ又はかかる
デバイスと光学的に通信し得るファイバオプティックアレイ又は束内の個々の光
ファイバを備えた、分離したサブストレートのサイト又はマイクロウェルに配置
される個々の細胞の光結合を規定するということにある。「光結合」，「光通信
」又は「オプティカル・コーペレーション（optical cooperation）」又は他の 文法的に同等なものは、ここで、従来の光学的なトレイン素子（train element ）又は光学ファイバを用いて、アレイ内の分離したサイトに配置される個々の細
胞に対して若しくはそれらから光を伝えることにより、励起光を用いて、バイオ
センサ内の個々の細胞を光学的に刺激する、若しくは、検体に対するアレイ内の
個々の細胞の光学的なレスポンスを光学的に呼び掛ける性能を意味する。典型的
なファイバオプティックアレイは、数千の分離した個々のファイバストランドを
含んでおり、その結果、本発明は、アレイ内の数千の細胞の個々の光結合及び呼
掛けに備えるもので、それによって、アレイ内の各細胞集団用に、多数の独立し
た細胞のレスポンスの測定を規定している。有用な細胞集団の数、及び、それに
対応した各細胞集団における多数の個々の細胞の両方のため、本発明の重要なイ
ノベーションは、各細胞集団内の細胞から得られる複数の独立した測定の特質の
あるオプティックレスポンスの特性の積算したり増加させたりすることを規定す
るもので、それによって、バイオセンサの検出限界及び感度を改良することがで
きる。

【００３５】 本発明の付加的なイノベーションは、アレイ内の多数の細胞集団を分散させ、
また、各集団における多数の個々の細胞を与えることにより、生物学的及び化学
的検体についてのバイオセンサアレイの識別性能が、多数の細胞集団からの数千
の細胞のレスポンスに備えて、著しく向上させられることである。この特徴は、
人間の嗅覚系の実際の性質を擬態するものである。該嗅覚系では、上皮層内に見
出される、それら自体では特に感度を有しない、ほぼ１千の異なるレセプタ細胞
のタイプの各グループ化に際して、数千のレセプタ細胞からの合成信号が、大き
く増幅された香りに対する感覚レスポンスを導く［コーエル（Kauer）他，トレ ンド・ニューロサイ（Trends Neurosci）．１４：７９（１９９１）を参照のこ と。そのため、本発明の１つの実施の形態は、バイオセンサアレイにおける多数
の細胞の低レベルのレスポンスを積算することにより、検体に対するバイオセン
サアレイの感度を著しく向上させるべく、人間の嗅覚系にて見出される、発展す
る香りの増幅プロセスを擬態する。低い検体濃度における複数の細胞からのレス
ポンスを積算することにより、ノイズに対する信号の比の実質的な改良が、実現
され、また、それに対応して、バイオセンサアレイの検出限界の抑制が得られる
。

【００３６】 本発明のバイオセンサアレイの独自の特徴は、アレイにおける個々の細胞及び
細胞集団の各々が、細胞のタイプの同一性およびランダムに混合した細胞集団が
採用される場所を維持するために、コード化され得ることである。細胞は、マイ
クロウェル内にそれらを配置するのに先立って、若しくは、マイクロウェル内の
配置に続いて、コード化されてもよい。本発明は、ランダムに混合した個々の細
胞および発螢光団の又は発色団の色素の合成物を備えた細胞集団をコード化する
ために、若しくは、螢光を発すべく遺伝学的に処理された、自己コード化された
細胞を用いるのに備えるものである。細胞集団はランダムに混合され得るもので
あるが、この革新的な特徴は、細胞のアレイが励起光のエネルギーにより照明さ
れた場合に、若しくは、生物学的な刺激を被った場合に、特質のあるオプティカ
ルレスポンス・シグニチャアを介して決定されるべき各細胞のタイプの同一性及
び場所を規定する。

【００３７】 １つの実施の形態では、細胞又は細胞集団が、化学ルミネセンス，生物ルミネ
センスをあらわす、又は、その生物学的な刺激に対するオプティカルレスポンス
が、独特な検出可能の螢光信号を生ずる、緑の発螢光団の蛋白質の変異体などの
、細胞集団を選択することにより、自己コード化される。集団内の細胞が刺激に
対する独特な一時のオプティカルレスポンスを生ずる場合には、他の細胞集団が
採用されてもよい。遺伝学的に処理された細胞株が自然に発生することが採用さ
れてもよい。

【００３８】 他の様々な実施の形態では、細胞が、細胞に付着された，細胞により吸収され
た若しくは局部的な細胞の環境に与えられた色素合成物で、コード化されてもよ
い。有用なコード化色素の例としては、発螢光団，発色団、ステイン（stain） 又は色素合成物が含まれる。例えば、フルオレセイン（fluorescein），ローダ ミン（rhodamine），ナフサリミド（naphthalimides），フィコビリプロテイン （phycobiliprotein），ニトロベンゾクサジアゾール（nitorobenzoxadiazole）
などの、従来の細胞の発螢光団プローブが採用されてもよい。適切なコード化色
素を選択するために特に有用な参照文献は、Ｒ．Ｐ．ホーグランド（Haugland）
，螢光プローブ及びリサーチ化学のハンドブック（第六版），モレキュラー・プ
ローブ社（Molecular Probes Inc.）（ユージン（Eugene），オーアール（OR） ，１９９６）であり、ここでは、引用することにより組み込まれる。

【００３９】 色素合成物がコード化のために採用される場合、バイオセンサアレイ内の細胞
集団は、励起光を用いて上記アレイを励起させ、ランダムに分散した集団内の細
胞のタイプを、励起に対するそれらのレスポンスにより、インデックス付けする
ことによって、容易に解読される。１つの実施の形態では、単一の発螢光団の若
しくは発色団の材料又は色素が、細胞のコード化に用いられる。他の実施の形態
では、２つ又はそれ以上のコード化用の材料若しくは色素が、細胞集団をコード
化するために用いられてもよく、また、励起光のエネルギーに曝されることによ
り生成される、上記色素についてのオプティカルレスポンス強度の比が、上記ア
レイを備えた細胞集団の構成要素をコード化し識別するのに採用される。また別
の実施の形態では、共通の検体に対して曝される場合に、細胞が、励起光により
解読されてもよい。また別の実施の形態では、コード化された細胞が、ｐH又は Ｃａ⁺²表示器を用いて、属の細胞活性体に対するそれらのレスポンスにより解読
されてもよい。

【００４０】 本発明の革新的な細胞コード化の特徴は、アレイを機械的に走査し、細胞の場
所を機械的に指し示し（indexing）、アレイ内の個々の細胞の測定用に、上記ア
レイを機械的に位置決めする必要をなくすることにより、従来技術のデバイスの
制限を克服するものである。本発明は、そのため、各細胞についての一連の測定
値を取得すべく、アレイを機械的に走査する必要なく、アレイ内の全ての細胞及
び細胞集団の迅速な同時の測定を規定する。その結果、アレイ内の全ての細胞の
レスポンスの監視および測定が、第１の細胞の測定と最後の細胞の測定との間に
、長期の遅れをもたらすことなしに、同時に実行される。全ての細胞のレスポン
スを測定する能力は、同時に、短期の細胞のレスポンス及び長期の細胞レスポン
スの両方を監視する性能を規定する。この革新的な特徴は、迅速で生物学的に重
要な細胞の処理および短い時間尺度での細胞のレスポンスを監視することを可能
とする。加えて、短い時間尺度上での細胞のレスポンスを同時に測定する能力は
、バイオセンサアレイの環境における変化に対する、個々の細胞及び細胞集団の
レスポンス比の測定を可能とする。この特徴は、生物学的又は化学的検体につい
て有用な、付加的な識別用レスポンスの情報に備えるものである。

【００４１】 本発明のバイオセンサアレイは、自然に存在する細胞及び細胞集団、又は、遺
伝学的に処理された細胞株を採用することができる。実質的には、いかなる細胞
のタイプ及びサイズも、細胞のサイズを、個々の光ファイバのオプティックコア
の直径やエッチングの条件に一致させることにより、適応させることが可能であ
る。１つの実施の形態では、ＮＩＨ ３Ｔ３のマウス繊維芽細胞が採用された。
また別の実施の形態では、大腸菌，ブドウ状球菌，骨格筋細胞の先駆物質である
筋芽細胞，中性好性白血球細胞，リンパ球細胞，赤芽細胞，骨芽細胞，軟骨細胞
，好塩基性白血球，エオシン好性白血球，含脂肪細胞，無脊髄動物のニューロン
（ヘリックス・アスペリア（Helix aspera）），哺乳類のニューロン、若しくは
、副腎髄質の細胞などの他の細胞のタイプが、同様に採用されてもよい。上記マ
イクロウェルが個々の細胞のサイズに適応し得ることを条件とすれば、いかなる
細胞のタイプ又は細胞集団のタイプの組合せも採用することができる。

【００４２】 化学的な刺激または生物的な刺激に対する細胞集団および個々の細胞の光学的
反応は、個々の細胞と適当な指標を結びつけることによって、一般に応答信号が
送信され、検出される。この適当な指標は、発蛍光団、発色団、ステイン、色素
化合物のいずれかであってもよい。例えば、フルオレセイン(fluoresceins)、ロ
ーダミン(rhodamines)、ナフサリミド(naphthalimides)、フィコビリンプロテイ
ン(phycobiliproteins)、ニトロベンゾクサジアゾール(nitrobenzoxadiazole)等
の従来の細胞の発蛍光団プローブが採用されてもよい。その代わりとして、浸透
細胞膜プロテイン指標または不浸透細胞膜プロテイン指標、イオン指標、活性酸
素指標、ｐＨ指標が採用されてもよい。適当な指標を選択するための特に有用な
参考文献は、アール．ピー．ホーグランド(R.P.Haugland)、蛍光プローブおよび
リサーチ化学のハンドブック（第６版）、モレキューラ・プローブ社(Molecular
Probes Inc.)(ユージン(Eugene)、オーアール(OR)、１９９６)であり、ここで は、引用することにより組み込まれる。細胞の反応を変化させない指標を与える
いずれかの適切な指標または指標の組み合わせが採用されてもよい。別の実施の
形態の変形において、指標は、例えば細胞膜に付着させることによって、または
細胞質に吸収もしくは注入させることによって、細胞に直接組み込ませてもよく
、またはマイクロウェル内に含まれる液体のような細胞の外部環境に加えられて
もよい。また別の実施の形態において、指標は、マイクロウェルの表面に取りつ
けられてもよい。

【００４３】 個々の細胞、または細胞のアレイおよび細胞集団は、光学的な応答信号が送信
されてもよく、検体に対する細胞の反応は、当業者に知られている従来の光学的
方法および器具によって測定されてもよい。細胞は、アークランプ、レーザ、ま
たは発光ダイオード等の適切な励起光エネルギー源で光学的な応答信号が送信さ
れてもよい。この光エネルギー源は、色素指標を活性化させるために、適当な波
長の光を生じることができる。この色素指標は、細胞集団をコード化するために
、または対象としている検体に対して応答するために採用されてもよい。個々の
細胞または細胞集団の光学的反応は、適切な光学的検出手段でモニターされ、測
定されてもよい。この適切な光学的検出手段は、フィルムまたは、光導電セル、
光電管、光ダイオード、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ等の従来の光学的検出器
を含むが、これらに限定されない。好ましい実施の形態において、検体に対する
各細胞とさまざまな細胞の副次集団の反応を検出するためのバイオセンサアレイ
の蛍光像を捕らえるために、ＣＣＤカメラが採用されてもよい。この実施の形態
において、個々の細胞の反応と、アレイ反応の捕らえられた像の両方が、検体を
検出するために採用されてもよい。

【００４４】 要約すれば、本発明に係るバイオセンサアレイと検出方法は、先行技術の装置
の限界を克服することにおいて、多くの明確な利点を提供する。センサアレイは
、市販のオプティカルイメージングファイバから容易に作成されて、精巧な機械
加工または成形プロセスを必要としない、費用効率の高い、高密度で、精密に成
形されたバイオセンサアレイとなる。光ファイバおよびファイバオプティックア
レイは、さまざまな直径のファイバコアを入手可能であるために、多くの細胞の
タイプおよび大きさは、本発明に係る装置および方法に適応させることが可能で
ある。さらに、細胞は、すぐにランダムな方法でマイクロウェルアレイに分散さ
せることが可能である。このときに、新規な細胞コード化技術により、個々の細
胞または細胞集団を配置するために、物理的に指し示す、または探知する必要が
ない。本発明のバイオセンサおよびセンサアレイを採用する検知方法および検知
システムは、先行技術の装置が直面した細胞の操作における限界の多くを回避す
る。細胞がアレイのマイクロウェル内に配置されたならば、機械的な走査機構を
必要としないイメージングカメラおよび従来の光学機器を採用する従来のイメー
ジングシステムおよびその方法は、何千もの細胞の反応を同時にモニターするこ
とができる。測定データの分析は、市販のイメージングソフトウェアを実行する
ことによって容易に行われ、ニューラルネットワークとその他の統計的方法を組
み合わせたパターン認識技術を用いてバイオセンサーアレイの画像を処理する。

【００４５】 本発明に係るバイオセンサアレイおよび検知方法は、多数の有用なアプリケー
ションのために使用される。この場合、個々の細胞は、局所的な細胞環境におい
て生物的または化学的な物質の存在によって化学的または生物的に刺激される。
さらに、個々の細胞は、適当な指標の存在により、または自然的なもしくは遺伝
工学的な化学ルミネセンスもしくは生物発光のいずれかを表に出す特別な細胞タ
イプの独特の光学的反応により、光学的に検出可能な反応を生じることによって
環境に対して反応する。したがって、本発明に係るバイオセンサアレイおよび方
法は、生物的に意味のある化合物に対する生きている細胞の反応する能力を利用
している。当該化合物に対する生きている細胞の選択性は、複雑な生物的な液体
の分析および薬剤の選抜において、かなり有用性、有効性を有するので、本発明
のバイオセンサは、組み合わせライブラリのハイスループット選抜に対して利点
を与える。この組み合わせライブラリは、数十万の候補化合物が評価されたもの
であるはずである。

【００４６】 構造および方法の新規のさまざまな詳細と、その他の利点を含む本発明の上記
およびその他の特徴は、添付図面と添付クレームの参照と共により詳しく記載さ
れるであろう。本発明を実施する特定の装置および方法は、説明として示されて
おり、本発明を限定するものではないことは当業者には理解できるであろう。本
発明の原則と特徴は、本発明の範囲から離れることなくさまざまな実施の形態お
よび多数の実施の形態において使用されてもよい。

【００４７】 本発明は、添付クレームによって特に示されている。本発明のその他の特徴お
よび利点は、明細書および添付図面を参照することによってより明確になるはず
である。

【００４８】 好ましい実施の形態の詳細な説明 Ａ．マイクロウェルアレイの作成 本発明は、少なくとも第１基質を含むアレイ化合物に、個々のサイトを含む表
面を与える。ここの「アレイ(array)」とはアレイ形状である複数の細胞を意味 する。アレイの大きさは、化合物と、アレイの最終用途とに左右される。ほぼ２
つの異なる細胞から数百万の細胞を含むアレイまで、作成されることが可能であ
り、非常に大きなファイバオプティクスアレイも可能である。一般的に、アレイ
は、細胞および基質の大きさに依存して、２つから百万ぐらいまたはそれ以上含
み、同様に、アレイの最終用途に応じて、超高密度、高密度、中密度、低密度、
超低密度のアレイが作成されてもよい。超高密度アレイの好ましい範囲は、ほぼ
１０，０００，０００からほぼ２，０００，０００，０００であり（ここの全て
の数はｃｍ２当たりである）、ほぼ１００，０００，０００からほぼ１，０００
，０００，０００が好ましい。高密度アレイは、ほぼ１００，０００からほぼ１
０，０００，０００の範囲にあり、ほぼ１，０００，０００からほぼ５，０００
，０００が特に好ましい。中密度アレイは、ほぼ１０，０００からほぼ１００，
０００の範囲にあることが特に好ましく、ほぼ２０，０００からほぼ５０，００
０にあることがさらに好ましい。低密度アレイは一般に１０，０００より少なく
、ほぼ１，０００からほぼ５，０００が好ましい。超低密度アレイは、１，００
０より少なく、ほぼ１０からほぼ１０００が好ましく、ほぼ１００からほぼ５０
０が特に好ましい。一部の実施の形態において、本発明の化合物は、アレイ形状
でなくてもよく、つまり一部の実施の形態の場合、単一の細胞を含む化合物が作
成されてもよい。さらに、一部のアレイにおいて、異なる化合物または同一の化
合物のいずれかで複数の基質が使用されてもよい。したがって例えば、大きなア
レイは、複数の小さな基質を含んでもよい。

【００４９】 さらに、本化合物の１つの利点は、特にファイバオプティックを使用すること
によって非常に高密度アレイを作成することが可能なことである。したがって、
例えば、細胞はだいたい２００ｆｍまたはそれ以下であり、非常に小さなファイ
バが知られているので、１ｍｍ２のファイバオプティック束において、２５０，
０００と同じぐらいまたはそれ以上（ある例では、１００万）の異なるファイバ
を有することが可能である。密度に関しては、０．５ｃｍ２当たり１５，０００
，０００個（ある例では、２５−５０万）の細胞およびファイバより多いものも
得られる。

【００５０】 ここで、「基質(substrate)」または「ソリッドサポート(solid support)」ま
たは他の文法的に同等なものは、細胞の結合および付着に適当な別々のサイトを
含むように改質されることが可能な物質であり、さらに少なくとも１つの検出方
法に対して敏感に反応する物質であることを意味する。当業者が理解しているよ
うに、可能な基質の数は非常に多い。可能な基質は、ガラス、改質または機能的
ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、スチレンおよびその他の材料
の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テ
フロンＪ等を含む）、多糖類、ナイロン、ニトロセルロース、シリコンおよび改
質シリコンを含むシリカまたはシリカベース材料、樹脂、カーボン、金属、無機
ガラス、プラスチック、オプティカルファイバ束、他の重合体の変形を含むが、
これらに限定されない。一般に、基質は光学的に検出可能であるが、それ自体は
、それほど蛍光性を有しない。

【００５１】 当業者に理解されるように一般に基板は平坦（平面又はプレーナー）であるが
、さらに基板の別の構成を用いてもよい。例として、例えば複数のセルをプラス
チックの多孔のブロックに埋め込むことによって、三次元構成を用いることがで
き、上記多孔のブロックは複数のセルへのサンプルアクセスと、共焦点型顕微鏡
を用いて検出することとを可能にする。同様に、フロースルーのサンプル解析を
し、サンプルボリュームを最小化するために、複数のセルは管の内側の表面に配
置してもよい。好ましい基板は、以下に記述されるような光ファイバー束と、ガ
ラス、ポリスチレン及び別のプラスチック及びアクリルのような平面のプレーナ
ー基板とを含む。

【００５２】 ある好ましい実施形態において、一般に、米国特許出願シリアル番号第０８／
９４４，８５０号及び米国特許出願シリアル番号第０８／５１９，０６２号、国
際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０５０２５号及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０９１
６３号に記述されているように、基板は光ファイバー束又はアレーであり、これ
ら先行文献のすべては参照され、特にここに参照文献として含まれている。好ま
しい実施形態は、予め形成されたユニタリのファイバー光アレーを利用する。「
予め形成されたユニタリのファイバー光アレー」によって、ここでは、同軸に配
置され、それらの長さ方向に沿って結合された、互いに分離した個別のファイバ
ー光撚り線を意味する。上記複数のファイバーの撚り線は個別にクラッディング
されている。しかしながら、予め形成されたユニタリのアレーが別のファイバー
光フォーマットから特徴付けられる１つの事実は、上記ファイバーを個別に物理
的に取り扱うことができないということである。すなわち１つの撚り線は、一般
に、その長さ方向に沿ったどの点においても、別のファイバー撚り線から物理的
に分離することができないということである。一般に、本明細書の議論はファイ
バー光アレーに集中しているが、当業者には理解されるように、ここに記述され
た任意の実施形態において、上に記述されたような別の基板を用いてもよい。

【００５３】 基板の少なくとも１つの表面は、互いに分離した、個別のサイトを含み、のち
に複数のセルを結合するために修正される。これらのサイトは物理的に変えられ
たサイト、すなわち複数のセルを保持できる、基板上の複数のウェル又は小さな
凹部のような物理的に構成した複数のサイトを備え、それによってセルはウェル
の中に静止し、又は別の力（磁力又は圧縮力）を用いる複数のサイトを備え、又
は生物学的又は化学的に機能的にされた複数のサイト、静電的に変えられた複数
のサイト、疎水的／親水的に機能的にされた複数のサイト、粘着性の複数のスポ
ットなどのような、化学的に変えられたサイト又は活性のサイトを備える。

【００５４】 上記サイトは１つのパターン、すなわち規則的なデザイン又は構成でもよく、
又はランダムに分布されたパターンでもよい。１つの好ましい実施形態は複数の
サイトの規則的なパターンを用い、上記複数のサイトはＸ―Ｙ座標平面にアドレ
ス指定される。この意味の「パターン」は、反復する単位セル、好ましくは基板
上に高密度の複数のセルを割り当てるものを含む。しかしながら、これらのサイ
トは分離したサイトでありえないことを注意するべきである。すなわち、接着剤
又は化学的な機能性からなる一様な表面を用いることができ、例えば、このこと
はセルを任意の位置において付着することを可能にする。すなわち、基板の表面
は、個別のサイトが別のサイトと連続であるか非連続であるかにかかわらず、上
記個別のサイトにおいて複数のセルの付着を可能にするように修正される。この
ように、基板の表面は修正され、それによって結合された単一のセルのみを有す
る分離した複数のサイトを形成し、又はそれに代わって、基板の表面は修正され
、複数のセルは任意の場所に行くことができるが、それらは分離した複数のサイ
トで終わる。

【００５５】 好ましい実施形態において、基板の表面は複数のマイクロウェル（microwell ）、すなわち基板の表面の複数の凹部を含むように修正される。このことは、本
技術において一般に知られているように、フォトリソグラフィー、スタンプ技術
、プレス加工、鋳造、成型、マイクロエッチング、電解析出、化学的又は物理的
な蒸気蒸着、マスク又はテンプレートの使用、電気化学機械加工、レーザ機械加
工又は切除又は剥離（ablation）、電子ビームの機械加工又は切除又は剥離、及
び従来の機械加工を含み、しかしそれらに制限されないさまざまな技術を用いて
実行することができる。当業者には理解されるように、用いられる技術は基板の
組成及び形状に依存する。

【００５６】 ある好ましい実施形態において、複数の物理的な改変が基板の表面に形成され
、複数のサイトが生成される。ある好ましい実施形態において、基板はファイバ
ー光束であり、基板の表面は、一般に米国出願シリアル番号第０８／８１８，１
９９号及び第０９／１５１，８７７号に記述されているように、ファイバー束の
末端であり、これによって上記先行文献の双方は参照され、特にここに参照文献
として含まれている。この実施形態において、複数のウェルは個別の複数のファ
イバーを備えるファイバー光束の末端又はディスタルエンドに形成される。この
実施形態において、個別のファイバーのコアはクラッディングに対してエッチン
グされ、小さなウェル又は凹部がファイバーの１つの末端に形成される。ウェル
の要求された深さは、ウェルに付加されるべきセルのサイズに依存する。

【００５７】 この実施形態においては一般に、複数のセルは複数のウェルに電子対を共有せ
ずに結合されているが、さらに以下に略述されるようにウェルは生物学的又は化
学的に機能的にされている。それには架橋剤を用いてもよく、又は物理的なバリ
アー、すなわちセル上にフィルム又は膜を用いてもよい。

【００５８】 ある好ましい実施形態において、基板の表面は生物学的又は化学的に修正され
た複数のサイトを含むように修正され、上記修正された複数のサイトは、電子対
を共有する方法又は電子対を共有しない方法のいずれかで、本発明のセルを基板
上の互いに分離した複数のサイト又は位置に結合するために用いることができる
。この文脈における「化学的に修正されたサイト」は、 アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、チオール基を含む複数の化学的な官能
基のパターンを付加することを含み、上記の官能基を用いて、対応する反応性の
官能基を一般にそれらの表面にも含む複数のセルを結合することができ、 （前もって化学的に機能化しておき接着剤を付加するか、又は接着剤を直接付
加するかのいずれかにより）、複数のセルを結合するために用いることができる
接着剤のパターンを付加することと、 複数のセルの静電的な結合のために、すなわち複数のセルが複数のサイトに向
かい合う荷電した基を備えるときに、荷電した複数の基（化学的な官能性に類似
である）のパターンを付加することと、 複数のサイトを区別的に疎水的又は親水的にする複数の化学的な官能基のパタ
ーンを付加することとを含み、適当な実験的条件下での同様な疎水的又は親水的
なセルの上記付加は、水への親和性の基準に基づいて複数のセルの複数のサイト
への結合をもたらすが、 これらに制限されない。それにかわって、生物学的な修正は、抗原／抗体の対、
酵素／基質又は阻害剤の対、受容基−リガンドの対、炭水化物及びそれらの結合
パートナー（レクチンなど）を含むが、それらに制限されない、結合リガンド又
は結合パートナーの対を用いることを含む。

【００５９】 ある好ましい実施形態において、コア及びクラッディングする材料の間でエッ
チング速度が異なるという利点がある選択的なエッチング処理によって、光画像
ファイバーのディスタル面（distal face）においてマイクロメーターのサイズ の複数のウェルのアレーが生成される。この処理は以前に、パンタノ（Pantano ）他によってChem. Mater. 8:2832 (1996)に、及びウォルト（Walt）他によって
米国特許出願シリアル番号第０８／８１８，１９９号に開示されている。エッチ
ングの反応時間と条件を調整し、結果として生じるマイクロウェルのサイズ及び
体積に対して、望まれた制御を及ぼすことを達成する。このように、マイクロウ
ェルはサイズを調整され、任意の所望されたセルの型の１つのセルに適応させる
。

【００６０】 センサーアレーのデザインは、商業的に利用可能な光ファイバー及びファイバ
ー光アレー、又は注文生産のファイバー及びファイバーアレーのいずれかを用い
る、さまざまなセルのサイズ及び構成を調整適応化する。センサーを製作するた
めの候補となるファイバー又は光ファイバーアレーの主な必要条件は、個別のフ
ァイバーがエッチング可能なコアを有するということである。

【００６１】 １つの実施形態において、マイクロウェルの内側の表面は、上で概略が述べら
れた基板の生物学的な修正に類似の、生物学的に適合性のある材料の薄いフィル
ム又は保護層でコーティングしてもよい。例えば、フィブロネクチン、コラーゲ
ンを含む任意の数の既知のポリマー、ポリリシン及び別のポリアミノ酸、ポリエ
チレングリコール及びポリスチレン、発育因子、ホルモン、サイトカインなどを
含むが、それらに制限されない、セルの成長又は付着又は接続をサポートするこ
とが知られている材料を用いることができる。同様に、上で概略が述べられたよ
うな結合リガンドを、ウェルの表面上にコーティングしてもよい。それに加えて
、例えば金のような金属、白金、又はパラジウムのような金属のコーティング又
はフィルムを用いてもよい。それに代わる実施形態において、例えば発蛍光団（
fluorophore）、発色団（chromophore）又は染料のような指標化合物を、化学的
又は生物学的な刺激物へのセルの応答を検出するために、マイクロウェルの表面
に結合してもよい。

【００６２】 マイクロウェルを製造する方法は、適当なサイズのマイクロウェルに結合する
ために広範囲のサイズのセルを調整するように、任意のサイズのファイバーに適
応される。例えば、１．６から１００μｍの範囲の直径のコアを有する光ファイ
バーは、ガリレオ・エレクトロ−オプティクス・コーポレーション（Galileo El
ectro-Optics Corp.）（スターブリッジ、マサチューセッツ）又はエドムンド・
サイエンティフィック（Edmund Scientific）（バリントン、ニュージャージー ）のいずれかより商業的に利用可能である。それに加えて、より大きなサイズは
注文によって利用可能である。このように、適当なサイズのファイバーを利用し
て、典型的には０．７から１．５μｍの細胞の寸法を持つ大腸菌や、典型的には
上は１５０μｍまでの細胞の寸法を持つ哺乳類の神経のような、異なるサイズの
セルを研究することができる。

【００６３】 １つの実施形態において、ガリレオ・エレクトロ−オプティクス・コーポレー
ション（スターブリッジ、マサチューセッツ）から利用可能な、１ｍｍの外径と
７μｍの個別のファイバーコア直径を持つファイバー光アレーが用いられた。フ
ァイバー光アレーの１つの端部は、マークファイブラブ（Mark V Lab）（イース
トグランビー、コネチカット）から利用可能な１２，９，３，１，０．３μｍの
アルミニウム酸化物の一連のラッピングフィルムを用いて研磨されている。次い
で上記ファイバーは約１分間の超音波処理をされ、研磨手順からのすべての残留
物を除去する。１００μＬのフッ化水素酸（５０％）と、０．２ｇのフッ化アン
モニウムと、６００μＬの脱イオン化水とを含む緩衝処理をされた７００μＬの
フッ化水素酸溶液に、ファイバーのディスタル面を垂直にほぼ６５秒間浸すこと
によって、エッチング手順が実行された。次いで上記ファイバーは脱イオン化水
によってすすがれ、１分間超音波処理をされ、エッチング手順の間に形成された
かもしれないすべての塩を除去する。この実施形態において、エッチングの反応
時間は、ウェルのサイズが直径において７ミクロン、深さにおいて３ミクロン、
かつ体積において約９０ｆＬであるように調整される。走査型電子顕微鏡（ＳＥ
Ｍ）及び原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）の双方を、エッチングされたマイクロウェル
を特徴付けるために用いてもよい。図２ａにおいて、エッチング手順によって形
成された典型的なマイクロウェルアレーが、ＡＦＭ顕微鏡写真で図示されている
（ディジタル・インスツルメンツ・ナノスコープ・ＩＩＩａ（Digital Instrume
nts Nanoscope IIIa）、サンタバーバラ、カリフォルニア）。図２において、マ
イクロウェルアレーの斜視図が提供されている。これらの図において図示されて
いるように、この処理によって形成されたマイクロウェルは、ファイバー光アレ
ーの一様な特徴構造のために非常に均一である。

【００６４】 Ｂ．セルの型の選択 事実上は、光ファイバーの光学的なコアの直径にセルのサイズを一致させるこ
とによって、任意の型及びサイズのセルを調整して、本発明のセンサーを製造す
ることができる。事実上は、自然に発生した、又は遺伝子工学で作られた（すな
わち外来性核酸を含む）真核生物又は原核生物の細胞の型を、植物、無脊椎動物
、細菌及び哺乳類の細胞に対して用いてもよく、上記哺乳類の細胞は、緑の蛍光
を発する変成たんぱく質（green fluoresent protein mutants）、霊長類の動物
、げっ歯類の動物及び人間の細胞を含み、細胞系（cell line）が複数の細胞型 の組合わせと同様に好ましい。

【００６５】 一実施の形態としては、ＮＩＨ３Ｔ３マウスの繊維芽細胞が利用される。この
細胞は、およそ１５〜２０μｍの大きさである。また、別の細胞としては、Ｅ．
ｃｏｌｉバクテリアは１×３μｍ、ブドウ球菌はおよそ１μｍ、骨格筋の基とな
る筋芽細胞は１５〜２０μｍ、好中球白血球細胞は１０μｍ、リンパ球白血球細
胞は１０μｍ、赤血球細胞は５μｍ、骨芽細胞は１５〜２０μｍ、軟骨細胞は１
５〜２０μｍ、好塩基性白血球細胞は１０μｍ、好酸球白血球細胞は１０μｍ、
脂肪性肥満細胞は２０μｍ、無脊椎動物のニューロン（Ｈｅｌｉｘ ａｓｐｅｒ
ａ）は１２５μｍ、哺乳類のニューロンは、４〜１４０μｍ、また、アドレノ骨
髄(adrenomedullary)細胞は１３〜１６μｍ、メラノサイト(melanocyte)は２０ μｍ、上皮細胞は２０μｍ、それに内皮細胞は１５〜２０μｍのものを同様に利
用してもよい。さらに、以下のものに限られるわけではないが、適当な細胞には
、全ての型の腫瘍細胞（特に、メラノーマ、骨髄性白血病、それに肺臓、乳房、
卵巣、結腸、腎臓、前立腺、すい臓、こう丸の癌細胞）、心筋細胞、内皮細胞、
上皮細胞、リンパ球細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞）、肥満細胞、好酸球白血球、肝細胞
、単核白血球を含む白血球、造血(haemopoetic)性幹細胞や神経、皮膚、肺臓、 腎臓、肝臓、それに筋肉等の幹細胞、破骨細胞、軟骨細胞、それに接合性の組織
細胞、ケラチン細胞、メラノサイト、肝細胞、腎臓細胞、それに脂肪細胞である
。また、適当な細胞には、これに限られるわけではないが、公知の研究された細
胞、ＪｕｒｋａｔのＴ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ等を含む。特に
有用な細胞列は、American Type Culture Co.(Rockville, MD)から発行されてい
て入手できる「ATCC Cell Lines and Hybridomas」(8^thed.,1994)、「Bacteria
and Bacteriophages」(19^thed.,1996)、「Yeast」(1995)、「Mycology and Bota
ny」(19^thed.,1996)、「Protists:Algae and Protozoa」(18^thed.,1993)に見出 すことができ、これらの全ては参考文献としてここに含まれる。

【００６６】 Ｃ．マイクロウエル(Microwell)中への細胞分散 いったんマイクロウエルの大きさを特定の細胞の大きさに適合するように調整
したならば、細胞アレーを生成する次のステップは、細胞をそのマイクロウエル
内にランダムに分散させることである。図３は、マイクロウエルアレーに細胞を
分散させて配置する方法を示す略線図である。細胞の集団は、通常のように細胞
が必要とする条件に適合する成長培養液(growth media)で培養される。培養液(c
ulture media)は、細胞系(cell line)プロバイダ、雑誌記事、それに参考テキス
トで提供されているいずれかの作り方で作られる。特に培養液の準備に有用な参
考資料は、参考文献としてここに含まれるAmerican Type Culture Co.（Rockvil
le, MD)から提供されるATCC Quality Control Methods for Cell Lines(2^thed.,
)である。培養後、通常は、無菌技術を用いてトリプシン処理を行って、細胞を 細胞培養皿から引き離し、成長培養液中に懸濁させる。

【００６７】 ある実施形態では、ＮＩＨ３Ｔ３のマウスの繊維芽細胞は、American Type Cu
lture Co.（Rockville, MD)から入手可能である。トリプシン−ＥＤＴＡ（０． ０５％トリプシン、０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ．４Ｎａ）等のたんぱく質分解酵素
によって付着している細胞を培養皿から除去することで細胞をウエル内にランダ
ムに分散させている。このトリプシン−ＥＤＴＡは、ＧｉｂｃｏＢＲＬ(Grand I
sland, NY)から提供されている。また、無菌技術を用いて、１％のストレプトマ
イシン、１％のＬ−グルタミン２００ｍＭ、それに１０％の子牛胎児の血清を用
いてなる、ダルベッコ(Dulbecco)による変形イーグル培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ(G
rand Island, NY)から入手）等の単一細胞懸濁液中に細胞を入れる。

【００６８】 ウエル内に細胞を分散させるために、約１．５ｍｌの細胞懸濁液が２０００Ｒ
ＰＭで３．５分間、遠心法によって濃縮される。上澄みを流して、遠心分離チュ
ーブを軽くたたいて細胞を再分散させる。次いで、細胞の懸濁液は、直径１．５
ｍｍの毛細管(capillary tube)に加えられる。マイクロウエルアレーに細胞を加
える前に、マイクロウエルを含む光ファイバアレーの端部は、約１５分間、細胞
培養液を真空で超音波処理して、フラッシュして、培養液でマイクロウエルを満
たす。ファイバのマイクロウエル末端は、毛細管に挿入され、試験用フィルムの
薄い細片で適所に確保される。毛細管／ファイバ組織(set-up)は、垂直位置で１
〜２時間培養され、懸濁した細胞をウエルに住みつかせ、ウエルの底に付着させ
る。マイクロウエルを満たすために必要な時間の長さは、細胞がマイクロウエル
の底に付着するのに必要な時間に依存するのみである。ウエルに適応しない過剰
な細胞は、成長培養液から湿った綿棒で除去される。図４は、エッチングされた
マイクロウエル内に分散している一つの細胞のＳＥＭ写真である。

【００６９】 いったん細胞がマイクロウエル内に置かれたら、細胞はおよそ１〜２時間でた
んぱく質接触でマイクロウエルの表面に付着する。マイクロウエル内の細胞培養
液は、光ファイバアレーの末端面を新しい培養液にさらして周期的に培養液を補
給してもよく、マイクロウエルのキャビティに栄養物を分散させてもよい。およ
そ、細胞は１２〜１５時間ごとに分裂する。マイクロウエルのサイズによって個
々の細胞を制限する傾向がある一方、アレーは、制限された細胞分裂の超過時間
に適応する。マイクロウエルの容積によって、細胞分裂を制限するが、それは、
細胞同士が接触する場合に生じる周知の接触活動抑制(contact inhibition)の現
象によるためである。

【００７０】 Ｄ．細胞生存能力の確立 ある実施形態では、ウエル内の細胞生存能力は、ｐＨ指標として、２’−７’
−ビス−（２カルボキシエチル）−５−（６−）−カルボキシフルオレセイン（
ＢＣＥＣＦ−ＡＭ）を用いて研究されている。このｐＨ指標は、５０５ｎｍの波
長での励起と、５３５ｎｍの波長での光放出を持ち、モレキュラープローブ（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手できる。Ｂ
ＣＥＣＦ骨格のアセトキシメチル（ＡＭ）は、溶液中で非蛍光性である。ＢＣＥ
ＣＦ−ＡＭは、細胞膜を透過して細胞内に入っていき、いったん細胞内に入ると
、非特異性のエステラーゼによって親油性のブロッキング群は分裂して、その結
果、蛍光強度を増加させる。この蛍光性強度の増加は、細胞生存能力を示してい
る。図５は、細胞生存能力の確立のためにセンサアレーで使用される方法のある
実施形態を概略的に示すものである。

【００７１】 生存能力のテストのために、あらかじめマイクロウエルに分散された符号化さ
れた細胞のアレーを１分間、１μＭのＢＣＥＣＦ−ＡＭ溶液に浸す。細胞アレー
を移動して、残りの染料を完全に除去するようにすすぐ。細胞反応としての蛍光
イメージは、健康な細胞のｐＨにより蛍光強度が増加するのをモニタするため、
１．０秒の取得時間を使って３０秒ごとに取得される。生存能力測定の前に、細
胞位置のテンプレートは、ここに記載された符号化法を用いて符号化された細胞
の励起を介して生成され、個々の細胞の位置は、アレー内で健康な細胞の位置を
特定するために生存能力測定イメージに置かれる。符号化された細胞の蛍光イメ
ージは図６と図７に示され、親油性群が細胞内のＢＣＥＣＦ−ＡＭ染料から分離
されることにより、細胞の蛍光強度反応は、漸進的な増加を示す。細胞を含まな
いウエルの蛍光強度反応は、無視しうる。

【００７２】 別の実施形態では、モレキュラープローブから提供を受けることができるＢＣ
ＥＣＦ−デキストラン(Dextran)は、細胞生存能力測定に用いられる。この染料 の０．１μＭ溶液がマイクロウエルアレーに含まれる細胞培養液に加えられる。
ＢＣＥＣＦは２つの波長４９０ｎｍと４４０ｎｍでの励起を必要とし、各波長に
ついて５３０ｎｍで放出される光強度はｐＨに比例する。この染料は、細胞膜を
介して細胞内に入るのを妨げるために大きなデキストラン群を共役させている。
そのため、ＢＣＥＣＦ−デキストランは、細胞代謝による外部細胞環境のｐＨの
低下をモニタできる。図１０は、細胞代謝によって細胞環境のｐＨが徐々に低下
している９つの細胞の平均的反応を示している。

【００７３】 別の実施形態では、市販の細胞生存能力検定物のモレキュラープローブ（Ｅｕ
ｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手可能なＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）が利用される。こ
の検定物によって、細胞間のエステラーゼ活性と形質膜の完全な状態に基づく２
色蛍光の細胞生存能力検定できる。生きている細胞は、酵素による細胞透過性の
非蛍光性カルセインＡＭから蛍光性カルセインへの変化で見分けることができ、
この蛍光性カルセインは、４９５ｎｍの波長での励起と５１５ｎｍの波長での放
出を伴う。死んだ細胞は、エチジウムのホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）の核酸との
結合によって見分けることができ、このホモ二量体は、４９５ｎｍの波長での励
起と６３５ｎｍの波長での光放出を伴い、核酸との結合で蛍光強度は４０倍に増
加する。ＥｔｈＤ−１は、生きている細胞の完全な形質膜によって遮断される。
この染料は事実上細胞との相互作用の前は非蛍光性であるので、バックグランド
の蛍光レベルは、この検定方法では本質的に低い。

【００７４】 通常の手順では、２μＭのカルセインと４μＭのＥｔｈＤ−１作用溶液は、血
清(serium)フリーの培養液に準備される。ＮＩＨ３Ｔ３のマウスの繊維芽細胞は
、マイクロウエルアレーの末端面で培養される。イメージファイバの基部面は、
イメージシステムに合焦される。イメージファイバの末端面の細胞アレーは、染
料なしで、血清(serium)フリーの培養液に置かれる。細胞アレーは、４９５ｎｍ
の波長で励起して、２５の細胞の集団からの光放出値は、５１５ｎｍ（生きてい
る細胞）と６３５ｎｍ（死んだ細胞）の波長で３００ｍｓの間、取得される。こ
れらの値は、これらの測定を研究するバックグランドとして役立つ。そして、細
胞アレーは、染料溶液に置かれ、その細胞アレーは、４９５ｎｍで励起され、２
５細胞からの光放出値は、５１５ｎｍ（生きている細胞）と６３５ｎｍ（死んだ
細胞）の波長で１分ごとに３００ｍｓ間取得され、３０分間にわたって繰り返さ
れる。全測定は室温で行われる。生きている細胞と死んだ細胞の平均的な蛍光強
度は、各光放出波長でのバックグランド蛍光を取り去った後に時間についてプロ
ットされる。

【００７５】 この検定は、バイオセンサーアレーのマイクロウエルを細胞挿入前に培養液で
満たす前処理方法を評価するために用いられる。好ましい実施形態では、種々の
処理後にマイクロウエルに置かれた細胞の生存能力を比較することによって、細
胞挿入前に真空下で１５分間マイクロウエルアレーを音波処理することが、マイ
クロウエルが培養液で満たされるのを確実にするので、生存能力を改善すること
がわかる。図１１ａでは、なにも前処理をすることなく行われた場合について、
死んだ細胞と生きている細胞の平均的な蛍光強度が時間についてプロットされて
いる。図１１ｂでは、所定のマイクロウエルアレーについての結果がプロットさ
れている。２つの図を比較することで、細胞挿入前にマイクロウエルをあらかじ
め培養液で満たすことの有利さを明らかにしている。この例では、細胞を加える
前にマイクロウエルアレーが音波処理されていないと、細胞は、即時に死を迎え
る。一方、この例では、マイクロウエルアレーに培養液を満たすために、マイク
ロウエルが真空下で音波処理された場合には、細胞は約２０分間生育できること
を示している。

【００７６】 Ｅ．細胞集団の符号化 本発明におけるバイオセンサアレーの特有の特徴は、ランダムに混合された細
胞集団が利用されている場合に、アレー内の細胞の同一性を維持するために各細
胞集団の細胞が個々に符号化されていることである。細胞は、単一の発蛍光団や
発色団の染料、又はこれらの染料の比で符号化されていてもよい。別の場合には
、細胞に無毒の蛍光性化合物を細胞質に注入するか、緑色蛍光性のたんぱく質変
異体のような化学ルミネセンスやバイオルミネセンスを示す自然物や遺伝的に設
計された細胞系(cell line)を利用してもよい。多数の細胞集団は、バイオセン サアレー内にランダムに混合されていてもよいが、アレーが励起光エネルギーに
よって照射された場合には、各細胞タイプと位置は、特性光反応サインを介して
決定される。細胞はマイクロウエル内に配置される前に符号化されていてもよく
、別の場合には、以下の配置でもよい。ある実施形態では、単一の発蛍光団や発
色団の物質や染料が細胞の符号化に用いられる。別の実施形態では、２以上の符
号化物質や染料は、細胞集団を符号化するためや、励起光エネルギーにさらされ
て発生する各物質や染料からの光学反応の光強度比を符号化するために用いられ
てもよく、この２以上の符号化物質や染料は、細胞集団内にある個々の細胞の位
置を特定し、それらをアレー内に配置するために用いられる。別の種々の実施形
態では、細胞は、染料化合物によって符号化されていてもよく、この染料化合物
は、細胞に吸収されて、又は、局所的な細胞環境で供給されて細胞と結合する。

【００７７】 広範な種類の発蛍光団、発色団、染料または色素化合物がエンコーディング細
胞として使用されてもよい。エンコーディング色素は、細胞膜に対して浸透性ま
たは非浸透性であってよい。非浸透性の色素はアセトキシメチルエステルとコン
ジュゲートし、細胞により取りこまれる。一つの実施形態において、従来のコン
ジュゲートまたは反応性細胞膜染料、細胞トレーサ、又は、フルオレセイン、ロ
ーダミン、エオシン、ナフタリミド、フィコビリンプロテイン、ニトロベンゾオ
キサジアゾ-ルのような細胞プローブが使用されてもよい。別の実施形態では、 ＳＹＴＯ（分子プローブ）（登録商標）のようなシアニン色素、アミン反応性色
素、チオール反応性色素、親油性色素や、アクリンオレンジのようなＤＮＡ挿入
剤（DNA intercalator）が使用されてもよい。一つの実施形態において、蛍光体
または発色体のエンザイム基板が、細胞に取りこまれてもよい。グリコシダーゼ
、フォスファターゼ、ルシファラーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼのような細胞間エンザイムにより処理され、かつ、細胞集団に対
しエンコーディングを行なってもよい。別の実施形態において、細胞有機色素プ
ローブがエンコーディングのために使用されてもよい。１つの実施形態において
、カーボシアニンや親油性アミノスタイラルス（lipophilicaminostyrls）のよ うな細胞膜プローブがエンコーディングのために使用されてもよい。

【００７８】 例として、テーブル１とテーブル２は、種々の色素と、それらに対応する本発
明のセンサアレイの細胞集団のエンコーディングに役に立つ励起及び発光波長の
一部分的のリストを与える。さらに、他の種類のエンコーディング色素について
特に有効となる参考文献は、「蛍光プローブと調査化学薬品のハンドブック（６
版）」（Ｒ.Ｐホーグランド著、分子プローブ社（ウジェーヌ、ＯＲ、１９９６ ））である。

【００７９】 細胞をエンコーディングすることにより、アレイを機械的な走査、細胞の位置
の機械的なインデックス、各細胞の測定のためのアレイの機械的な配置の必要性
が消滅する。さらに、各細胞がエンコードされるため、各細胞の応答が特定の細
胞集団のタイプに直ちに関連しているので、アレイ内の全ての細胞をエンコード
することにより、同時にアレイ全体の測定が可能となる。このように細胞をエン
コードすることにより、各細胞を連続的に測定するためにアレイを機械的に走査
することなく、全ての細胞及びアレイ内の細胞集団を迅速に同時に測定すること
ができる。最初の細胞の測定と最後の細胞の測定の間で遅延を増大させずにアレ
イ内の全ての細胞の応答の監視と測定を同時に行なうため、本発明のバイオセン
サアレイは、生物学的な刺激に対する細胞の短い期間の応答と長い期間の応答の
双方とも監視することができる。このように本発明のバイオセンサアレイは、細
胞の応答と検体に関する応答の双方を測定できる独特の機能を有する。この特徴
により、関心のある生物学的または化学的な検体の検出に対して有効な応答情報
の識別が可能となる。

【００８０】

【００８１】 一つの実施形態においては、多くのエンコーディング色素と方法が利用可能で
あり、外部蛍光細胞膜ラベル、励起波長４９０ｎｍで発光波長５０２ｎｍについ
てＰＫＨ６７、及び、励起波長５５１ｎｍで発光波長５６７ｎｍについてＰＫＨ
２６が利用された。ＰＫＨ２６とＰＫＨ６７は、ザイナクシス・セル・サイエン
ス（Zynaxis Cell Science）社（マーベルン、ＰＡ）により製造されてZyn-Link
erの商標（ファノス・テクノロジー社）で販売され、ホーガン等による米国特許
第５,６６５,３２８号の方法により製造され、シグマ（Sigma）社（セントルイ ス、Ｍｏ）により利用可能な色素のファミリーの一部分である。本実施形態にお
いて、双方の色素は繊維芽細胞に供給され、センサアレイ内に配置される前の細
胞をエンコードした。エンコードされた細胞は、増殖媒体（growth media）で充
填されたマイクロウェルに配置された。そして、エンコードされた細胞は、ファ
イバ光アレイを介して伝送された励起光により照射され、発生した細胞の蛍光発
光応答は同じファイバを通して集められ、検出システムに入力される。図６は、
本発明のバイオセンサアレイ内のエンコードされた細胞集団ＰＫＨ２６の典型的
な蛍光光学画像を示す。図８は、本発明のバイオセンサアレイ内のエンコードさ
れた細胞集団ＰＫＨ６７の典型的な蛍光光学画像を示す。エンコードされた細胞
を含むそれらのマイクロウェルのみが、エンコーディング色素波長で励起により
蛍光信号を発生することに注意すべきである。

【００８２】 典型的なエンコーディング手順において、外部または内部のエンコーディング
ラベルが、センサアレイ内に配置する前に細胞集団を懸濁する（suspend）ため に与えられる。一つの実施形態において、外部のラベルは、細胞に対して、漿( しよう)液（serum）を含まない媒体により懸濁された細胞を洗浄し、その後、２
０００ＲＰＭ（回転／分）で５分間細胞を遠心分離し、やわらかいペレットにす
ることにより、与えられる。上清は除去され、遠心分離チューブは、再度懸濁す
るために液がとられる。シグマ社による、染料材料として利用できる約１ｍＬの
希釈液Ｃが、細胞に加えられ、チューブは混合のために反転させられる。エンコ
ーディングする直前に、４×１０^-5Ｍの希釈溶液Ｃの色素溶液が準備される。懸
濁された細胞は、色素の溶液に加えられ、細胞／色素溶液をピペットで取ること
により混合され、５分間保温される。エンコーディング反応を停止するために、
細胞に２ｍＬの牛の胎児の漿(しよう)液が加えられ、１分間保温され、その後、
４ｍＬの成長媒体を加えることにより希釈される。そして、細胞は、２０００Ｒ
ＰＭで１０分間遠心分離にかけられ、細胞を染料溶液から抽出する。上清は除去
され、細胞は新しいチューブに移される。最後に、細胞は、１０ｍＬの増殖媒体
を加え、遠心分離し、細胞を再度懸濁することにより、最小の３度の洗浄がなさ
れる。

【００８３】

【００８４】 ＰＫＨ２６とＰＫＨ６７の色素を用いて、エンコーディング方法を説明するた
めに、エンコードされたＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞がセンサアレイ内のマイ
クロウェル内に分散させられ、アレイ内のエンコードされた細胞の位置は５５１
ｎｍの波長での細胞の励起により決定される。励起したとき、エンコードされた
細胞は、センサアレイ内で独特の検出可能な蛍光パターンを形成する。そのとき
、センサアレイにおいては、そのパターンが、ＢＣＥＣＦと５０５ｎｍの励起波
長を用いて細胞の生存能力（cell viability）の測定のための位置のテンプレー
トを与える。ラベルとＢＣＥＣＦ−ＡＭ色素をエンコードするＰＫＨ２５の励起
波長及び発光波長は２つの色素間で干渉しないように十分に分離される。図６は
、バイオセンサにおけるエンコードされた細胞ＰＫＨ２６の位置を特定する特徴
的な蛍光画像パターンである。類似のプロシージャが、対応する特徴的な蛍光画
像パターンが図８に示されるＰＫＨ６７のマウス繊維芽細胞をエンコードするた
めに、続いて行なわれた。

【００８５】 単一の色素を持つ各細胞集団をエンコードすることに加え、アレイ内の各細胞
集団は、個別の波長範囲で特徴的な蛍光強度比を発生する独特の色素比でエンコ
ードされてもよい。色素比の範囲は、多数の細胞集団を識別するために有効な一
連のエンコード比を発生さ細胞２つ以上の色素の組み合わせが採用されてもよい
。細胞集団をエンコードするために使用される特定の色素比により生成される蛍
光強度比は、各発光波長で平均強度から背景強度を引き、２つの値を除算して、
その特定の比の範囲を得る。

【００８６】 １つの実施形態において、２つの別々のＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞の集団
が、ＰＨＫ６７とＰＨＫ２６の色素の比が１：５または５：１のいずれかで細胞
膜によりラベリングされることによりエンコードされた。各細胞集団は約１２５
のエンコードされた細胞からなっていた。細胞集団は、４９０ｎｍと５５１ｎｍ
の励起波長で照射され、発光した蛍光強度比は５０２ｎｍと５６７ｎｍに測定さ
れた。各色素比に対する平均強度比は２日間にわたって測定された。ＰＫＨ６７
／ＰＫＨ２６が１：５のときの初期の平均強度比は、０．０８６３であり、５：
１の色素比のとき、その比は０．７０１４であった。１：５の比のときの最後の
平均の強度比は０．２６５５であった。５：１の比に対しては０．９０９０であ
り、それは、細胞の分離が起こった場合であっても、それらの比が合理的に安定
し、また、まだ色素比が時間的に分離可能のままであることを示す。このように
、色素比は、本発明のバイオセンサアレイの上に無秩序に散在された細胞集団を
識別し、かつ、配置するための有効な代替のエンコーディング機構を提供するこ
とができる。

【００８７】 Ｆ．インジケータ色素 個々の細胞及び細胞集団の化学的または生物学的な刺激に対する光学的な応答
は、典型的には、結合した個々の細胞を、発蛍光団、発色団、染料、色素化合物
のいずれかであってもよい適当なインジケータと結合させることにより、尋問さ
れ、検出される。もし、インジケータが細胞応答を含まなければ、任意の適当な
インジケータ又はインジケータの組み合わせが利用されてもよい。

【００８８】 例えば、フルオレセイン、ローダミン、ナフタリミド、フィコビリンプロテイ
ン、ニトロベンゾールジアゾ−ルのような従来の細胞発蛍光団プローブが利用さ
れてもよい。代わりに、浸透性または非浸透性の細胞膜ポテンシャルインジケー
タ、イオンインジケータ、反応オゾンインジケータ、及び、ｐＨインジケータが
採用されてもよい。一例として、本発明のバイオセンサアレイに対して特定の利
用を有する多数のインジケータがテーブル３とテーブル８にそれらの特有の励起
及び発光波長とともにリストに挙げられている。適当なインジケータを選択する
ために特に有効となる参考文献は、「蛍光プローブと調査化学薬品のハンドブッ
ク（６版）」（Ｒ.Ｐホーグランド著、モレキュラ・プローブ社（ウジェーヌ、 ＯＲ、１９９６））である。

【００８９】

【００９０】

【００９１】

【００９２】

【００９３】

【００９４】

【００９５】

【００９６】

【００９７】 １つの実施の形態において、インジケータは、細胞膜の付着物、膜浸透インジ
ケータによる細胞質への吸着、又は、細胞質へのミクロ注入によって直接細胞に
組み込まれてもよい。他の実施の形態において、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ^TMのような超微細な蛍光を発するミクロスフェア
は、細胞により摂取され、インジケータとして用いられる。もう１つの環境にお
いて、インジケータは、マイクロウェル（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ)に含まれる培養 基フルードに加えられる。もう１つの実施の形態において、インジケータは、従
来のインジケータをガラス表面へ結合するためのシラニゼーション（ｓｉｌａｎ
ｉｚａｔｉｏｎ）処置によりマイクロウェルの表面に付着されてもよい。

【００９８】 １つの実施の形態において、刺激を与えたときに化学ルミネセンス、生物ルミ
ネセンス又は、変色を発生する天然の又は遺伝子学的に強化された細胞列は、内
因性の光の応答を生成するという理由から、分離したインジケータを必要とせず
単独で利用される。そのような細胞の標本は、緑色の蛍光性の蛋白質変異体を含
む。他の実施の形態において、酵素を生成する細胞は、蛍光性生成物を発生する
ような光の応答を可能とする試薬を用いて利用される。例えば、ルシフェレン（
ｌｕｃｉｆｅｒｅｎ）の面前で細胞により発行酵素が発生する時、生物学的刺激
を受ければ、細胞は、蛍光性の応答を生成する。

【００９９】 もう１つの実施の形態において、マルチプルインジケータは、細胞配列の中、
細胞群の中、又は、化学または生物学上異なる物質の変種に対して行う細胞応答
を同時に監視するため提供されるような個々の細胞の中において利用されてもよ
い。２つ又はそれ以上のインジケータが利用される場合は、狭いスペクトル帯域
幅のスペクトル分類を用いた色素が特に有益であって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ＢＯＤＩＰＹ^TMがある。

【０１００】 （Ｇ．光学的測定） 本発明のバイオセンサー配列の中にある個々の細胞と細胞群は、光学的に検査
されてもいいし、細胞応答は、当業者に周知で従来の光学的構成要素を用いるこ
とによりモニターされてもよい。細胞に対する外部の光学的刺激が光学的応答を
引き出すために利用されている場合は、アークランプ、フォトダイオード、又は
レーザーのような公知の光源が励起光エネルギーとして利用されてもよい。細胞
応答は、光電子増倍管、フォトダイオード、フォトレジスター、電荷結合装置（
ＣＣＤ）カメラのような公知の検波器によりモニターされてもよい。レンズ、フ
ィルタ、ビームスプリッタ、ダイコロイック、プリズム及び鏡のような公知の光
学縦列構成要素は、光源や検波器からの光を搬送し、分離した培養基に光を送る
か、あるいは、光ファイバー線を経由して個々の細胞に光を送るかのどちらで利
用されてもよい。光学的測定で利用されるいくつかの特定の装置構成において重
要な必要条件は、光学的基盤の組み合せが光学的に配列状に結合している細胞の
ための検波器と光源を設けていることである。特定の装置構成が実験上の光学測
定で利用されている場合については後述しているが、他の構成であっても、機能
的に同等で特定の測定要件に適したものであればよい。

【０１０１】 蛍光性の測定のために利用される計測器は、オリンパス社（Ｌａｋｅ Ｓｕｃ
ｃｅｓｓ，ＮＹ）製の垂直構造から水平構造へ改造されたエピフルアーレセンス
マイクロスコープである。計測システム１００の概略図を図９に示す。７５Ｗの
キセノンランプ１１０からの白光は、集光レンズ１１２により視準（光を平行に
する。）され、励起フィルタ１２０を経由し、ダイコロイックミラー１３０によ
り反射され、対物レンズ１４０を用いてイメージングファイバー２００の最も近
い端部２１０にフォーカスされる。中間濃度フィルタ１２２は、励起の光明暗度
の調整に利用されてもよい。イメージングファイバー２００は、スピンドルアン
ドホイヤー社（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）により提供されるＸ−Ｙポジショナー１
５０とＺ−トランスレーション１５２により精密に位置付けられる。励起光は、
ファイバー２００の中を伝送され、ファイバー末端の端部１２１にあるバイオセ
ンサー配列３００に到達する。放射された蛍光性の光は、バイオセンサー配列か
ら、ファイバー２００、ダイコロイックミラー１３０を経由し、エッミッション
フィルタ１６０によりフィルタ処理された後、フォトメトリックス社（Ｔｕｓｃ
ｏｎ，ＡＺ）製の電荷結合装置（ＣＣＤ）カメラ１７０であるＰＸＬ^TMにより検
出される。倍率レンズ１６５は、必要ならば利用されてもよい。データは、シグ
ナルアナリスティックス社（Ｖｉｅｎｎａ，ＶＡ）により提供される工業用の画
像処理ソフトウェアＩＰＬａｂ３．０が搭載されたアップルパワーマッキントッ
シュ４４０（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）であるデスクトップコンピュータ１８
０で処理される。１つの実施の形態において、ベンチ−トップ（ｂｅｎｃｈ−ｔ
ｏｐ）測定システムは、このような計測のために利用される一方、コンパクトで
携帯性にすぐれた測定システムは、光学的で電子的な従来の構成要素により組み
立てられてよい。

【０１０２】 Ｈ．バイオセンサー配列の適用 本発明のバイオセンサー、バイオセンサー配列、検出装置及び検出方法は、ス
クリーニングと検出を目的とする従来のさまざまな分析評価に適用することがで
きる。バイオセンサーは、事実上のいくらかの分析評価のために形成され、多数
の符号化された細胞群が小さいサンプル上で大多数の分析評価の伝導するために
シングルセンサー配列で利用されているような高スループットなスクリーニング
に対して明確な優位性を与える。多数の符号化された細胞群は、特定の検査評価
で利用され、検体に対して一意の応答を提供するために遺伝子学的に強化された
細胞である。バイオセンサー配列は、このようにして結合ライブラリーをスクリ
ーニングする時に強大な有効性を発揮すると共に、ミクロンサイズのビーズにお
いて結合された生物学上重要な分子のような、極めて微細なサンプルにおける大
多数の分析評価の伝導を可能とする。本発明のバイオセンサーは、生物学上の刺
激を与えた検体において検出細胞応答が存在する実質的ないくらかの検体測定に
適用される。

【０１０３】 本発明のバイオセンサー配列及び方法は、生きた細胞群の独特の能力を独特な
検出方法を用いて生物学上重要な化合物に対して応答するために利用する。その
ような化合物のために生きた細胞を選択することは、極めて価値があり、薬品を
用いたスクリーニングや複合生物製剤液の分析において有益であるため、生きた
細胞群の独特な特性を利用するバイオセンサーは、１０万種の候補製薬化合物が
評価される組み合せライブラリの高スループットなスクリーニングにおいて明確
な優位性を提供する。加えて、そのようなバイオセンサー及び検出手段は、バイ
オプロセスのオフライン監視か、あるいは、生きた細胞のローカルな環境に対し
て生きた細胞の高められた刺激反応性が活用される場合の環境汚染に対する適切
な監視かのどちらかのために利用される。

【０１０４】 このように、本発明は、重要な検体に対する個々の細胞の応答を検出する手段
を提供する。“重要な検体”、“標的検体”、“候補活性エージェント”、“候
補薬品”または、ここで述べられている文法的に同義な言い回しは、いくらかの
分子、例えば、蛋白質、オリゴペプチド、小さな有機分子、多糖類、ポリスクレ
オチド、などを意味し、光学的性質を含む細胞表現型を直接または、間接的に改
めるためにその機能が試される。一般に、多数の分析評価の混合物は、多様な濃
縮に対して異なる応答を獲得するために異なる薬品と並行して精製される。一般
的には、これらの濃縮の１つは、負の制御、即ち、零濃縮または、検出レベル以
下で有効に働く。

【０１０５】 非常に多くの化学的分類を包含する検体は、一般的に有機分子なのだが、好ま
しくは、分子重量が１００以上２５００ダルトン以下の小さい有機化合物である
ほうがよい。検体は、蛋白質を伴う構造上の相互作用に必要な機能グループを有
し、特に水素結合が重要で、一般的には、アミン、カルホルニ基、ヒドロキシル
基又は、カルボキシル基グループを少なくとも含み、好ましくは、機能上の化学
グループの２つを含む。候補エージェントは、上述の機能上のグループの１つ又
はそれ以上の代用として、環状炭素又は、複素環式の構造及び、又は、芳香族、
ポリアロマティク（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ）構造をしばしば有する。候補エ
ージェントは、ペプチドを含む生体分子、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、
ピリミジン、誘導体、生体構造アナログまたは、それらの化合物においても発見
される。特に好ましいのはペプチドである。

【０１０６】 候補エージェントは、合成物または、天然化合物のライブラリーを含む多様な
ソースから獲得される。例えば、無作為化されたオリゴヌクレオチドの圧搾を含
む有機化合物及び生体分子には、結合に対して広い多様性があり、手段の多くは
、任意で且つ管理されたその結合に対して有効である。もうひとつは、バクテリ
ア、菌類、植物及び動物のエキスに属する天然化合物のライブラリが有効であり
、容易に精製可能である。その上、天然または人工的に生成されたライブラリと
化合物は、従来の化学的、物理的及び生物学的手段により容易に修飾可能である
。公知の薬理学上のエージェントは、化学構造アナログを生成するためにアシル
化、アルキレート化、エステル化、アミディフィケーション（ａｍｉｄｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ）のような管理されたまたは任意の化学的改良を受けてもよい。

【０１０７】 好ましい実施の形態においては、候補活性エージェントは、自然発生の蛋白質
または、自然発生の蛋白質の断片である。このように、例えば、蛋白質を含む細
胞の抽出物、又は、任意または管理された蛋白質からなる細胞の抽出物のダイジ
ェストが利用されてもよい。このように、原核生物的又は、真核生物的な蛋白質
は、本発明の方法においてはスクリーニングで利用される。本実施の形態で特に
好ましいのは、バクテリア、菌類、ウィルス、哺乳類の蛋白質のライブラリであ
って、後者になるほど好ましく、人間の蛋白質がことのほか好ましい。

【０１０８】 ペプチドは、あらましは上述した通り、任意のペプチドまたは、“偏りのある
”任意のペプチドとしての天然発生の蛋白質のダイジェストであってよい。“無
作為化”、又は、ここに述べられる文法的に同義な言い回しは、核酸及びペプチ
ドがそれぞれ本質的に任意のヌクレオチド及びアミノ酸からなることを意味する
。一般的に、これらの任意のペプチドは（又は、以下で論ずる核酸。）は、化学
的に合成され、それらは、任意の位置でいくらかのヌクレオチド又は、アミノ酸
と結合してもよい。その合成処理は、無作為化された蛋白質か又は、核酸を生成
するため、合成シーケンス期間中の全ての構成又は、ほとんどの採り得る結合を
可能とするために設計され、かようにして、無作為化された候補活性の蛋白質の
エージェントのライブラリを形成する。

【０１０９】 １実施形態では、いずれのポジションにおいても、好みの順番や一定を持たな
いライブラリが十分にランダム化される。好ましい実施例では、ライブラリはバ
イアスされる。つまり、順番ないのいくつかの位置が一定に保たれるか、限られ
た可能な番号から選択される。例えば、好ましい実施例では、核またはアミノ酸
の残滓、例えば、ハイドロフォビックアミノ酸、ハイドロフィリックの残滓、ド
メインを結びつける核酸を形成する(小さいか大きい)残滓に基づくステリカリィ
、クロスリンクのための結晶の生成、ＳＨ−３ドメインのためのプロリン、シリ
ネス、スレオニン、ティロシンまたはフォスフォリエーションサイトのためのヒ
スティディンその他またはパーネスなどは、限定したクラスないでランダム化さ
れる。

【０１１０】 プロテンに対して一般に上述したように、核酸選出の薬品は自然に核酸、ラン
ダムの核酸または“バイアス”のランダム核酸を発生させる。例えば、プロカリ
オティクのダイジェストまたはオイカリオティクのゲノムは上述のプロテインと
して使用されてもよい。

【０１１１】 本文における“核酸”はＤＮＡおよびＲＮＡの双方を含み、そして核酸類似物
はＰＮＡを含む。好ましい実施例では、選出薬品剤は有機のケミカルの一部であ
り、それの広い変化は文献で利用できる。

【０１１２】 以下の例では、バイオセンサアレイやこの発明の方法を実行し採用することに
有用な、多くの特定の分析を提供するが、それらは、想像されるこの出願の範囲
または、この発明のバイオセンサに伴う多数のセルの集団に採用できる検知法を
制限するものではない。

【０１１３】 一つの実施例では、バイオセンサアレイは、バイオプロセス内の個々のセルま
たはセルの固体の酸化還元状態を遠隔にモニターするために採用できる。例えば
、ＮＡＤＨに依存の蛍光は、バクテリア、菌類、プラントまたは動物のセルで測
定できる。ＮＡＤ(Ｐ)／ＮＡＤ(Ｐ)Ｈは、Luong その他による Practical Fluor
escence G.Guilault ed.,Marcel Dekker(ニューヨーク,1990 により開示された 方法を用いたて発酵プロセスにおいて、好気性から非好気性の物質交代への変化
をモニターすることで測定できる。

【０１１４】 替わりに、バイオセンサアレイは、アレイ内でセル集団の応答を識別可能とす
るために、Hughes その他による Analytica Chimica Acta 307:393(1995)により
開示された方法を用いることにより、環境中の汚染菌に応答するセルのプロセス
の適したモニター装置のために採用されてもよい。この方法では、蛍光体でみた
され、蛍光遺伝子の酵素プローブで表面が変更されたミクロンサイズの領域は、
セルにより取り込まれ、そして酵素の活動がその領域の表面で発生し、検出可能
な蛍光信号を生じる。

【０１１５】 更に別の実施例では、バイオセンサアレイは、金属化合物の適したモニタリン
グおよび光学検出のために、遺伝子技術のバイオ発光のバクテリアに採用できる
。例えば、アンチモナイトおよび亜ヒ酸塩に応答するセル集団は、Ramanathan その他によるAnal Chem.69:3380(1997)に開示の方法を採用することにより、バ イオセンサ内のセル集団内に用いられてもよい。この方法では、セルの染色体は
、金属濃度に応じてバクテリア発光の表れを調整する。

【０１１６】 別の実施例では、バイオセンサ内のセル集団は、蛍光タンパク質に依存するＡ
ＴＰでエンコードできる。例えば蛍の発光素であり、Koop その他による Bioche
m.J.295:165(1993)で開示された方法に基づき病理学研究のためにねずみの肝臓 に注入される。病理学的な外傷にさらされた時、それらのセルは、細胞質のＡＴ
Ｐ内で減少を示し、セル内に毒素の入った程度に関係して直接的に発光が変化す
る。

【０１１７】 一つの実施例では、バイオセンサ内のセル集団は、緑の蛍光たんぱく質でエン
コードされてもよい(T.Gura,Science276:1989(1997),Niswender その他によるJ.
Microscopy 180(2):109(1995),Cubitt その他によるTIB 20:448(1995),Miyawaki
その他によるNature 388:882(1997を参照)。区別できる蛍光発光の波長をもつ ＧＦＰのいくつかの遺伝子的技術の変位は利用可能である。これらのたんぱく質
は、セル内の遺伝子表現およびＣａ+レベルの指示を発光する付加的なユーティ リティをもつ。

【０１１８】 別の実施例では、バイオセンサアレイは、Cobbold その他によるCellBiology1
:311(1990)で開示された方法に基づくaequorinまたはfura-2のごとき蛍光マーカ
ーを用い、単一のセル内のカルシウムレベルおよびカルシウム発振の適したモニ
ターにより、セルの分裂の測定に用いられる。

【０１１９】 この分野のこれらにより理解されるように、本発明の分析は広く多種の方法で
、又、広く多種の目的で実行される。例えば、セルは特定の分析に対する検知シ
ステムとして用いられ、セルは、特定の解析で特性が光学的に検知可能に変化を
受ける。これとは別に、セルは、光学的に検出可能なセルの表現型を変える能力
のために、薬剤選出のライブラリを覆うために用いられる。例えば、治療力のあ
る適切なセルの表面の受容器官の表現は増大されてもよく、そのため、受容器官
は蛍光のリーガンドを束ねることができ、同様に、治療学的に適切な酵素は活動
化され、その結果、蛍光反応が発生する。このように、増大および減少の双方を
含むあらゆる調整がモニターされてもよい。同様に、緑の蛍光タンパクおよびそ
れらの誘導体のごときリポーターのゲネスの使用は、例えば誘導できるプロモー
ターの使用を通じて、内部反応の適切な解析のために、スクリーン処理の高いス
ループットを容易にする。

【０１２０】 一般に、好ましい実施例では、解析前に候補の影響薬剤はセルに加算され、セ
ルはいくらかの期間のために、培養するために許可される。“管理”または“実
行”はここでは、理解および内部反応動作により、またはセル表面の動作により
、薬剤がセルに作用する方法で、候補薬剤がセルに加算されることを意味する。
いくつかの実施例では、タンパク質性候補薬剤(つまりペプチド)をエンコードす
る核酸は、retrovial構成のごときウイルス構成に置かれ、そしてセルに加算さ れる。その結果、ペプチド薬剤の表現は、達成される。ＰＣＴ US97/01019を参 照。

【０１２１】 候補薬剤がセルに与えられると、もし、しばらくの期間、好ましい生理学上の
状況下で培養することが所望され、許可されるなら、セルは洗浄され得る。

【０１２２】 ここで概略した反応は、当業者にはわかるように種々の方法で達成できる。反
応のコンポーネントは同時に加算されてもよく、あるいはいずれかの順にしても
よい。更に、他の様々な試薬を含む反応は、分析物に含まれてもよい。これらは
、光学検知を容易にするために使用され、そして／または無特性またはバックグ
ランドの内部反応を減じる、塩、緩衝剤、アルブミンのごとき中性タンパク、洗
浄剤、その他、を含んでもよい。又、プロテーゼ防止剤、ヌクレアーゼ防止剤、
反ミクロバイアル薬剤その他のごとき、他方で分析効率を改善する試薬が使用さ
れてもよい。

【０１２３】 一般に少なくとも薬剤の少なくとも１つのコンポーネントがラベル化される。
“ラベル化”は、ここでは合成物が直接にまたは非直接的に検出可能な信号、例
えば、デジオソトープ、蛍光、酵素、抗体、電磁粒子のような粒子、を与えるラ
ベルでラベル化されることを意味する。特定の拘束分子はバイオチンおよびスト
レプタビディン、ディグオキシンおよび非ディグオキシンその他のように対を含
む。特定の拘束部材のために、補足的部材は通常、上述の公知の手順に従い、検
出を与える分子でラベル化される。そのラベルは直接的または非直接的に検出可
能な信号を与える。

【０１２４】 アレイが実行されると、実験結果、つのまり、ターゲットの解析の有無、分子
タイプの選出薬剤、その他を決定するためにデータが分析される。これは一般に
コンピュータで実行される。

【０１２５】 このように、薬剤の影響は認識される。薬学的な活動との化合物はセルのタイ
プを変更できる。上述のように薬学的な活動をもつ化合物は、生理学的な許容可
能なキャリァ内でホストに与えられる。薬剤は多種多用な方法、口頭、表示例え
ば皮下的に与えられる。イントラダクションの方法に基づき、化合物は種々の方
法で公式化される。その公式における治療学的な活動化合物の集中は０．１−wt
％で変化する。

【０１２６】 薬学的の組成は種々の形態、粒状、タブレット、ピル、座薬、カプセル、懸濁
液、軟膏、ローションおよび同様なもので与えられる。薬学的なグレードの組織
または非組織的なキャリァおよび／または口および局部使用に適した希釈剤を、
治療学活動の化合物を含む組成を作るために使用できる。この分野で公知の希釈
剤は、水性のメディア、植物および動物オイルおよび脂肪を含む。安定化薬剤、
湿ったおよび乳化薬剤、適したｐＨ値を安全にするために浸透圧または緩衝剤を
変える塩および皮膚浸透増強剤を補助剤として使用できる。

【０１２７】 この発明は好ましい実施例に基づき説明したが、当業者であれば、本発明の趣
旨から逸脱することなく種々の変形をが可能であろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のバイオセンサアレイ概念の概略図である。

【図２】 ａ−ｂは、本発明のバイオセンサアレイにおいて使用されるマイ
クロウェルアレイの原子間力顕微鏡写真である。

【図３】 本発明のバイオセンサアレイのために使用されるマイクロウェル
において細胞を配置するための方法の概略図である。

【図４】 マイクロウェルにおける単一のＮＩＨ ３Ｔ３のマウス繊維芽細
胞のＳＥＭ顕微鏡写真である。

【図５】 本発明のバイオセンサアレイ内の細胞集団の細胞生存力を安定さ
せるための方法の概略説明図である。

【図６】 本発明のバイオセンサアレイにおける細胞生存力を確実にテスト
するために細胞の位置を識別する独特の蛍光イメージパターンである。

【図７】 図６において識別された生存できる細胞集団の合わせた蛍光強度
の時間的な反応を示す。

【図８】 本発明のバイオセンサアレイ内のコード化された細胞集団の蛍光
性オプティカルイメージである。

【図９】 マイクロウェルセンサアレイの光学測定のために使用される測定
システムの概略ブロック図である。

【図１０】 ９個のバイオセンサアレイ細胞の時間に対する平均ＢＣＥＣＦ
蛍光性のプロットである。

【図１１】 ａ−ｂは、マイクロウェルを培養基で満たすために前処理を行
う場合と行わない場合の両方について、マイクロウェルに挿入される細胞の生存
力を比較する。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年２月５日（２００１．２．５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ローラ・テイラー アメリカ合衆国02155マサチューセッツ州 メッドフォード、ブラッドベリー・アベニ ュー15エイ番 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 BB31 BB51 CA01 CB01 DA12 DA13 DA14 DA30 DA36 DA80 DB07 FA11 FA12 FA16 FA19 FA20 FA29 FA40 FB03 FB07 FB11 FB12 FB15 GC22 GC30 HA09 HA11 HA14 HA16 HA20 JA01 JA02 JA07 JA20 4B063 QA01 QQ05 QR58 QR66 QR84 QS36 QS39 QX02

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）複数のディスクリートサイトを含んでいる基質と、 ｂ）それぞれ、上記ディスクリートサイトの１つに分布されている複数のセル
   とを含んでいて、各セルが少なくとも１つの光学的に探査可能な物質で符号化さ
   れている、少なくとも１つの分析対象物に対する個々のセルの応答を検出するた
   めのバイオセンサ。
2. 【請求項２】 上記基質がそれぞれ末端部と基端部とを有している複数のフ
   ァイバを含んでいる光ファイバアレイを含み、上記ディスクリートサイトがそれ
   ぞれ上記末端部の端面に形成された複数のマイクロウエルを含み、かつ上記複数
   のセルの各個が上記マイクロウエルの１つに分布させられ、上記セルの各々が、
   上記アレイ中の少なくとも１つの上記ファイバの末端部に光学的に結合されかつ
   光通信状態となっている、請求項１に記載のバイオセンサ。
3. 【請求項３】 上記サイトが、約１μｍから約２００μｍまでの範囲の内直
   径と、約０.２５μｍから約２００μｍまでの範囲の深さと、約１ｆＬから約５ ナノリットルまでの範囲の体積を有している、請求項１又は２に記載のバイオセ
   ンサ。
4. 【請求項４】 上記ファイバが、さらに、約１μｍから約２００μｍまでの
   範囲の直径を有するファイバコアを含んでいる、請求項２又は３に記載のバイオ
   センサ。
5. 【請求項５】 上記サイトの表面が、生物的に両立しうる物質で被覆されて
   いる、請求項１、２、３又は４に記載のバイオセンサ。
6. 【請求項６】 上記セルの少なくとも１つに、指標化合物が付加又は挿入さ
   れている、請求項１、２、３、４又は５に記載のバイオセンサ。
7. 【請求項７】 上記複数のセルが、少なくとも２セル個体群を含む、請求項
   １、２、３、４、５又は６に記載のバイオセンサ。
8. 【請求項８】 各セル個体群が、染料、蛍光体、着色体、化学発光化合物及
   び生物発光化合物からなる群から選択された少なくとも１つの光学的に探査可能
   な物質で符号化されている、請求項７に記載のバイオセンサ。
9. 【請求項９】 ｉ）複数のディスクリートサイトを含んでいる基質と、 ii）それぞれ上記ディスクリートサイトの１つに分布させられている複数のセ
   ルとを含んでいて、各セルが少なくとも１つの光学的に探査可能な物質で符号化
   されている、ａ）バイオセンサアレイと、 ｂ）上記基質上で上記ディスクリートサイトに光学的に結合されかつ光通信状
   態となっていて、上記ディスクリートサイト内に分布させられている上記セルの
   、分析物に対する光学的な応答を検出することができる検出手段とを含んでいる
   、少なくとも１つの分析対象物に対する個々のセルの応答を検出するための装置
   。
10. 【請求項１０】 上記基質が、それぞれ末端部と基端部とを有している複数
    のファイバを含んでいる光ファイバアレイを含み、 上記ディスクリートサイトが、それぞれ上記ファイバの上記末端部の端面に形
    成された複数のマイクロウエルを含み、 上記複数のセルの各個が上記マイクロウエルの１つに分布させられ、 かつ、上記検出手段が、上記ファイバ端末部で上記セルの光学的な応答を検出
    するために、上記ファイバの基端部と光学的に結合されかつ光通信状態となって
    いる、請求項９に記載の装置。
11. 【請求項１１】 さらに、上記ファイバの端部に結合された励起光エネルギ
    手段を含んでいる、請求項９又は１０に記載の装置。
12. 【請求項１２】 さらに、複数の上記セルから、検出された光学的な応答の
    画像を把握するための画像把握手段を含んでいる、請求項９、１０又は１１に記
    載の装置。
13. 【請求項１３】 上記画像把握手段が、電荷結合素子又はＣＣＤカメラを含
    んでいる、請求項１２に記載の装置。
14. 【請求項１４】 ｉ）複数のディスクリートサイトを含んでいる基質と、 ii）それぞれ上記ディスクリートサイトの１つに分布させられている複数のセ
    ルとを含んでいて、各セルが少なくとも１つの光学的に探査可能な物質で符号化
    されている、ａ）バイオセンサアレイを準備する過程と、 ｂ）上記バイオセンサアレイを分析対象物と接触させる過程と、 ｃ）上記セルの光学的な応答を検出するようになっている、少なくとも１つの
    対象分析物に対する個々のセルの応答を検出する過程とを含んでいる、少なくと
    も１つの分析対象物に対する個々のセルの応答を検出するための方法。
15. 【請求項１５】 ａ）上記のバイオセンサアレイを準備する過程が、 ｉ）それぞれ末端部と基端部とを有している複数のファイバを含んでいる光フ
    ァイバアレイを含んでいる基質を含み、 ii）上記ディスクリートサイトが、それぞれ上記ファイバの上記末端部の端面
    に形成された複数のマイクロウエルを含み、 iii）上記複数のセルの各個が、上記マイクロウエルの１つの中に分布させら れ、 ｂ）上記の検出過程が、上記ファイバ末端部で上記セルの光学的応答を検出す
    るために、上記ファイバの基端部に光学的に結合されかつ光通信状態にある検出
    手段を準備する過程を含んでいる、請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 上記分析対象物が、光学的に検出可能なラベルを含んでい
    る、請求項１４又は１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 上記バイオセンサが、複数の分析物に接触させられるよう
    になっている、請求項１４、１５又は１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 ａ）複数のディスクリートサイトを含んでいる基質を準備
    する過程と、 ｂ）各セルが上記ディスクリートサイトの１つに分布させられるように、上記
    基質を複数のセルに接触させる過程とを含んでいる、少なくとも１つの分析対象
    物に対する個々のセルの応答を検出するためのバイオセンサアレイを製作する方
    法。
19. 【請求項１９】 ａ）上記の基質を準備する過程が、 ｉ）それぞれ末端部と基端部とを有している複数のファイバと、 ii）それぞれ上記末端部の端面に形成された複数のマイクロウエルとを含んで
    いる光ファイバアレイとを含み、 ｂ）上記の接触させる過程が、各セルが上記マイクロウエルの１つに挿入され
    るように、上記光ファイバアレイを複数のセルと接触させるようになっている、
    請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 上記複数のセルが、少なくとも２セル個体群を含んでいる
    、請求項１８又は１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 各セル個体群が、染料、蛍光体、着色体、化学発光化合物
    及び生物発光化合物からなる群から選択された少なくとも１つの光学的に探査可
    能な物質で符号化されている、請求項１８、１９又は２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 さらに、上記の符号化されたセルに励起光エネルギを照射
    することにより生成された発光エネルギにより、上記アレイ中の個々のセルの位
    置を表示する過程を含んでいる、請求項２１に記載の方法。