CN105861297A - 一种循环肿瘤细胞检测芯片及其应用 - Google Patents

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宋彦龄
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Abstract

本发明涉及到一种循环肿瘤细胞检测芯片及其应用。该微流控芯片结合确定性侧向位移及特异性生物亲和识别原理，实现了外周血中循环肿瘤细胞的协同高效率、高纯度捕获检测。在微芯片内，设计了修饰有亲和识别分子如核酸适体或抗体、具有特定几何排列方式的三角形微柱阵列。通过调控三角形阵列的旋转角度、距离、偏移角度等参数，可控制不同尺寸的细胞经过微通道的流动行为。该芯片可实现三方面的功能从而提高循环肿瘤细胞的捕获效率和纯度。同时，亦设计了一种气驱动进样系统，可一路气压同时控制多路液流。

Description

一种循环肿瘤细胞检测芯片及其应用
技术领域
本发明涉及一种循环肿瘤细胞检测芯片设计、理论模拟及应用，涉及微流控芯片及临床诊断领域。
背景技术
随着人们对肿瘤转移机制研究的深入，越来越多人认识到肿瘤的早期诊断、及时治疗以及预后检测，在降低癌症死亡率，减少和控制癌症发病率方面的重要性，更意识到循环肿瘤细胞的检测在早期发现肿瘤转移、监测术后复发、评估疗效及预后,以及选择合适的个体化治疗等方面的重要影响。因此，越来越多的现代检测技术发展应用到循环肿瘤细胞的检测领域中，但是，循环肿瘤细胞的检测面临最大挑战即是在血液中含量稀少——1mL外周血中可能只含有1-10个循环肿瘤细胞，却有109个红细胞，106个白细胞的高背景干扰。如何从含有数亿个非靶标细胞的复杂血液环境中准确分离出几个肿瘤细胞，发展一种高灵敏、高准确度、高通量、保持捕获细胞活性、经济的富集外周血循环肿瘤细胞的方法是目前需要突破的瓶颈。
目前循环肿瘤细胞检测主要存在的问题包括：1、捕获效率低，容易出现假阴性。主要原因是多数捕获依赖于抗体和抗原的相互识别，然而抗体存在着特异性差、结合能力低、易失活、寿命短的缺点，导致CTC无法达到理想的富集效率。例如，CellSearch系统有105的富集率，但是CTC在血液中的存在比例是1：109～1010，相差了四个数量级。另外，大量高生产成本，高储运成本的抗体的使用，直接导致最终测试成本的增加，Cell Search的一次测试费就高达600美元。2、在高背景的血液细胞背景下，容易产生非特异的细胞捕获，产生假阳性。3、对捕获的细胞伤害较大，释放效率低，难以对捕获的循环肿瘤细胞进行单细胞分析。
微流控芯片具有高通量、高比表面积、体积小和消耗少等特点，因此可以设计成具有低成本、高富集效率、高选择性等优点的循环肿瘤细胞捕获微流控芯片。目前利用微流控芯片进行循环肿瘤细胞检测的方法主要有两种：1)利用亲和性识别捕获；2)利用物理特性差异，比如利用微孔过滤循环肿瘤细胞和其他细胞或者确定横向位移方式根据细胞大小对细胞进行分离。但是这些方式仍然存在捕获效率低，非特异性吸附非靶细胞，细胞活性差等问题。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种超高捕获效率的循环肿瘤细胞检测芯片。
本发明的第二目的在于提供一种基于微流控芯片上实现循环肿瘤细胞捕获的方法。
本发明的目的通过以下的技术方案实现：
一种特异性循环肿瘤细胞捕获芯片，其特征在于：芯片设有至少三个进样孔和至少三个出样孔；进样孔和出样孔之间为三角形微柱阵列，三角形微柱阵列按照确定性侧向位移原理排列；所述微阵列表面修饰特异性识别分子，所述的特异性识别分子包括核酸适体或者抗体。
所述的抗体优选为EpCAM抗体或者其他循环肿瘤细胞标志物抗体。
所述的核酸适体可以通过筛选得到，优选的序列包括EpCAM或者其他循环肿瘤细胞标志物核酸适体。
在本发明的较佳实施例中，三角形微柱阵列中，每个三角形的旋转角度θ为0-180度、临界直径为0-50μm。
一种循环肿瘤细胞的捕获装置，其特征在于，包括前述的芯片，还包括
至少一气体进样装置，所述的气体进样装置通过气压控制三个进样通道的进样以及控制流过微流控芯片的液体的流体压力。
本发明设计了一种一路气压同时分别控制多路液流的装置。该装置通过多个阀门将一路气压分为多路并联的气压，通过阀门可以分别控制几路气压大小，从而通过气压大小控制后续的液流速度及流量。该装置可以用于循环肿瘤细胞的捕获芯片的样品及缓冲溶液注入，及其他基于此原理的液体进样。
本发明的芯片在特定旋转角度的三角形微柱阵列上修饰靶向识别分子包括核酸适体或者抗体并以基于DLD(deterministic lateral displacement，确定性侧向位移)原理排列。结合了确定性侧向位移及特异性识别两种捕获原理，既利用物理性质差异，同时也利用循环肿瘤细胞表面标志物不同。调控了用于循环肿瘤细胞捕获确定性侧向位移芯片的参数，循环肿瘤细胞按三角形微柱阵列偏移方向运动，而小尺寸细胞按液流方向移动，提高了尺寸大于临界直径的循环肿瘤细胞与三角形微柱阵列的碰撞概率，减少了尺寸小于临界直径的血液细胞的碰撞概率。旋转三角形呈特定角度，使三角形微柱阵列的三面呈现梯度剪应力，增加靶标细胞和微阵列上识别分子的接触时间，提高捕获效率和纯度。
本发明的又一技术方案为：
循环肿瘤细胞捕获的方法，包括如下步骤：
1)将含有循环肿瘤细胞的血液样品或者缓冲溶液通过进样孔注入，缓冲溶液通过另两个进样孔注入；
2)细胞进入捕获微阵列，由于表面标志物以及尺寸不同，循环肿瘤细胞和微阵列实现多次接触，最终进行捕获；
3)通过核酸酶水解核酸适体或者消化细胞膜表面蛋白对捕获的循环肿瘤细胞进行释放；
优选地，在芯片中，调控三角形阵列的旋转角度(0-180度)、临界直径(0-50μm)、流速(0-10mL/h)等参数为特定值，调控之前包括以下的模拟和优化步骤：
基于Computational Fluid Dynamic(计算流体动力学，CFD)对不同尺寸细胞通过微阵列的路径模拟；基于液固两相流动反应(fluid-solid interaction)对不同尺寸细胞定向取代动力学模拟；基于任意拉格朗日欧拉法对修正几何学的动力学以及移动边界进行模拟。
本发明的优点如下：
1)调控临界直径(critical diameter，Dc)0-50μm，结合确定性侧向位移实现空间的分离,确定尺寸大于临界直径尺寸的循环肿瘤细胞按三角形微柱阵列偏移方向运动，而小尺寸血液细胞按液流方向移动而降低了碰微概率；
2)三角形微柱阵列旋转为带θ角度(0-180度)的DLD阵列，旋转后可以降低剪应力，增加靶标细胞和微阵列上识别分子的接触时间，并且三角形微柱阵列的三面呈现梯度剪应力，均利于提高靶标细胞捕获效率以及捕获纯度；
3)结合基于尺寸及特异性识别两种原理进行循环肿瘤细胞捕获，结合确定性侧向位移区分以及特异性识别的原理对靶标细胞进行高效捕获，既利用了循环肿瘤细胞与血液细胞尺寸大小的差别，同时也利用循环肿瘤细胞表面特异性标志物的差别；
4)调控三角形阵列的旋转角度(0-180度)、临界直径(0-50μm)、流速(0-10mL/h)等参数为特定值，使得基于两种捕获原理的芯片设计捕获效率最优。
本发明的CTC捕获效率可以达到：缓冲溶液及血液中捕获效率达到95％以上。
附图说明
图1为芯片设计及工作原理示意图。图1A为基于微三角柱阵列、微漩涡碰撞、侧面高效捕获的细胞捕获芯片及细胞流动速度模拟结果；图1B为循环肿瘤细胞、白细胞及红细胞流动路径，其中大颗粒代表循环肿瘤细胞，中等颗粒代表白细胞，扁平颗粒代表红细胞。
图2为不同尺寸颗粒通过三角形微阵列的路径。图2A为20微米和10微米颗粒理论模拟路径，20微米颗粒移动路径在下方，10微米颗粒移动路径在上方；图2B为不同颗粒实际运动路径，上方路径为小颗粒路径，下方路径为大颗粒路径。
图3A为10、15、20微米颗粒和三角形微阵列碰撞概率计算结果；图3B为循环肿瘤细胞及血液细胞对三角形微阵列碰撞概率趋势，其中左、中、右分别代表循环肿瘤细胞、白细胞和红细胞。
图4为三角形微阵列旋转θ角度后对剪应力以及接触时间影响。图4A为剪应力的变化，其中浅色为正三角形微阵列为一个定值，黑色代表旋转θ角度三角形微阵列，其剪应力随距离增加而下降；图4B为细胞与三角形微阵列接触时间，其中浅色为正三角形微阵列，黑色代表旋转θ角度三角形微阵列；图4C为正三角形微阵列模拟情况；图4D为旋转θ角度三角形微阵列模拟情况。
图5为三角形微阵列旋转θ角度后对循环肿瘤细胞捕获效率影响。图5A左侧上图为理论模拟旋转θ角度三角形微阵列捕获细胞情况，5A左侧下图实际捕获情况，图5A右侧上图为理论模拟正三角形微阵列捕获细胞情况，5A右侧下图实际捕获情况；图5B为对旋转θ角度三角形微阵列捕获细胞效率以及正三角形微阵列捕获细胞效率。
图6为循环肿瘤细胞捕获芯片的捕获效率及纯度。图6A为芯片表面修饰核酸适体芯片对循环肿瘤细胞捕获效率及纯度，其中左柱代表缓冲溶液捕获效率，中柱代表血液中捕获效率，右柱代表捕获纯度；图6B为芯片表面修饰抗体对循环肿瘤细胞捕获效率及纯度，其中左柱代表缓冲溶液捕获效率，中柱代表血液中捕获效率，右柱代表捕获纯度；图6C为捕获后芯片荧光成像，其中包括目标循环肿瘤细胞和白细胞；图6D为释放后细胞免疫荧光成像，绿色为细胞角蛋白抗体染色，红色为上皮细胞粘附因子抗体染色，蓝色为细胞核染色。
图7A为芯片实物图，图7B为通过气压控制液流的循环肿瘤细胞进样系统实物图，图7C为进样系统及捕获系统设计图。
具体实施方式
本发明结合靶向识别与尺寸两种方式，利用了两种捕获肿瘤细胞CTCs的方法以提高捕获效率，高纯度地有效实现细胞分离的要求。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。需要说明的是，在附图或说明书正文中，未绘示或描述的实现方式，均为所属技术领域中普通技术人员所知的形式，将不再详细说明。
实施例1 循环肿瘤细胞捕获芯片及捕获装置
参见图1和图7，制作芯片，芯片包括两层PDMS和一层玻璃芯片，将PDMS、PDMS、玻璃芯片依次键和；芯片设有三个进样孔和三个出样孔；进样孔和出样孔之间为三角形微柱阵列，三角形微柱阵列按照确定性侧向位移原理排列。
在本实施例中，三个进样孔设于左侧一端，三个出样孔设于右侧一端。
参见图7C，微流控芯片捕获循环肿瘤细胞的气驱动控制进样装置，包括：芯片左侧的前后两个进样口分别和一缓冲液容器通过管道连接，左侧中间的进样口和血液样品容器通过管道连接。缓冲液容器和血液样品容器分别和图7B所示的气压装置连接，气压装置能够通过气体驱动缓冲液容器和血液样品容器中的缓冲液或血液进入芯片。芯片右端的三个出样孔连接至一收集容器中。
参见图1，芯片中的三角形微柱外接圆半径为rp，行间距为λ，列间距G，依次递增Δλ排列微阵列，循环肿瘤细胞尺寸大于普通血液细胞，微柱阵列可以和循环肿瘤细胞多次接触，提高捕获效率。大于临界直径大的循环肿瘤细胞更大的几率被免疫捕获，而小于临界直径的血液细胞比较小的接触几率。旋转θ角度三角形微阵列，使三角形微柱阵列的三面呈现梯度剪应力，增加靶标细胞和微阵列上识别分子的接触时间，提高捕获效率和纯度。
实施例2
图2为不同尺寸颗粒通过三角形微阵列的路径。图2A为20微米和10微米颗粒理论模拟路径，20微米颗粒移动路径在下方，10微米颗粒移动路径在上方；
通过COMSOL Multiphysics软件进行模拟。
图2B为不同颗粒实际运动路径，上方路径为小颗粒路径，下方路径为大颗粒路径。
此时三角柱上没有结合抗体或核酸适体。
实施例3
通过COMSOL Multiphysics软件进行模拟。图3A为10、15、20微米颗粒和三角形微阵列碰撞概率计算结果；图3B为循环肿瘤细胞及血液细胞对三角形微阵列碰撞概率趋势，其中左、中、右分别代表循环肿瘤细胞、白细胞和红细胞。
实施例4
图4为三角形微阵列旋转θ角度后对剪应力以及接触时间影响。图4A为剪应力的变化，其中浅色为正三角形微阵列为一个定值，黑色代表旋转θ角度三角形微阵列，其剪应力随距离增加而下降；图4B为细胞与三角形微阵列接触时间，其中浅色为正三角形微阵列，黑色代表旋转θ角度三角形微阵列；图4C为正三角形微阵列模拟情况；图4D为旋转θ角度三角形微阵列模拟情况。流速为1mL/hr，通过显微镜进行拍照，MATLAB软件对图片中颗粒的运动进行分析。
实施例5 循环肿瘤细胞捕获及释放
芯片上结合核酸适体sgc8aptamer，捕获效率CCRF-CEM 98％及白细胞0.83％。EpCAM抗体修饰的捕获效率为99％SW480及0.004％白细胞。
对于血液样品，向1mL正常血液中计入1000个CCRF-CEM细胞，对于核酸适配体修饰的芯片平均捕获效率为95.6％，抗体修饰的芯片捕获效率为95％。1)荧光预染色的靶细胞或者对照细胞通过细胞计数后重悬到1％FBS的DPBS缓冲溶液或者健康人血液；
2)将样品通过进样系统从进样孔a注入，缓冲溶液通过b、c注入；
3)捕获后可以通过加入核酸适体的互补序列或者核酸酶针对以核酸适体为靶向识别分子的芯片进行释放，或者加入蛋白酶或者EDTA针对以抗体修饰的芯片进行释放；
4)释放后细胞通过计数统计，与注入的细胞数相除，计算捕获效率；
5)对释放细胞进行活细胞染色，计算活细胞比率；
6)对释放细胞进行免疫荧光成像，进行细胞角蛋白抗体，上皮细胞粘附因子抗体，细胞核染色，如图5所示。
图5为三角形微阵列旋转θ角度后对循环肿瘤细胞捕获效率影响。图5A左侧上图为理论模拟旋转θ角度三角形微阵列捕获细胞情况，5A左侧下图实际捕获情况，图5A右侧上图为理论模拟正三角形微阵列捕获细胞情况，5A右侧下图实际捕获情况；图5B为对旋转θ角度三角形微阵列捕获细胞效率以及正三角形微阵列捕获细胞效率。
图6为循环肿瘤细胞捕获芯片的捕获效率及纯度。图6A为芯片表面修饰核酸适体芯片对循环肿瘤细胞捕获效率及纯度，其中左柱代表缓冲溶液捕获效率，中柱代表血液中捕获效率，右柱代表捕获纯度；
图6B为芯片表面修饰抗体对循环肿瘤细胞捕获效率及纯度，其中左柱代表缓冲溶液捕获效率，中柱代表血液中捕获效率，右柱代表捕获纯度；
图6C为捕获后芯片荧光成像，其中包括目标循环肿瘤细胞和白细胞；
图6D为释放后细胞免疫荧光成像，绿色为细胞角蛋白抗体染色，红色为上皮细胞粘附因子抗体染色，蓝色为细胞核染色。

Claims (5)

1.一种特异性循环肿瘤细胞捕获芯片，其特征在于：芯片设有至少三个进样孔和至少三个出样孔；进样孔和出样孔之间为三角形微柱阵列，三角形微柱阵列按照确定性侧向位移原理排列；所述微阵列表面修饰特异性识别分子，所述的特异性识别分子包括核酸适体或者抗体。
2.如权利要求1所述的一种特异性循环肿瘤细胞捕获芯片，其特征在于：三角形微柱阵列中，每个三角形的旋转角度为0-180度、临界直径为0-50μm。
3.一种循环肿瘤细胞的捕获装置，其特征在于，包括权利要求1或2所述的芯片，还包括至少一气体进样装置，所述的气体进样装置通过气压控制三个进样通道的进样以及控制流过微流控芯片的液体的流体压力。
4.一种分离检测循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制作权利要求1至2所述的芯片；
2)在所述的三角形微阵列表面修饰特异性识别分子，包括核酸适体或者抗体；
3)调控三角形阵列的旋转角度0-180度、临界直径0-50μm、流速0-10mL/h，使得基于两种捕获原理的芯片设计捕获效率最优；
4)将样品加入到芯片中进行循环肿瘤细胞的捕获；
5)通过核酸酶水解核酸适体或者消化细胞膜表面蛋白对捕获的循环肿瘤细胞进行释放，并检测。
5.如权利要求4所述的一种分离检测循环肿瘤细胞的方法，,其特征在于，步骤4)中，调控三角形阵列的旋转角度0-180度、临界直径0-50μm、流速0-10mL/h之前，包括以下的模拟和优化步骤：
1)基于计算流体动力学对不同尺寸细胞通过微阵列的路径模拟；
2)基于液固两相流动反应对不同尺寸细胞定向取代动力学模拟；
3)基于任意拉格朗日欧拉法数值模拟对修正几何学的动力学以及移动边界进行模拟。
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