CN104805011A - 一种微流控芯片及利用其捕获循环肿瘤细胞的方法 - Google Patents

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陈弘达
陈红梅
耿照新
曹亚鹏
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    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting

Abstract

本发明提供了一种微流控芯片及利用其捕获循环肿瘤细胞的方法。该微流控芯片包括：分离腔室，其第一侧的中部位置具有样品注入口，第二侧的上部和下部分别具有待测粒子富集处和样品流出口；微柱阵列，形成于分离腔室内，样品注入口和样品流出口之间；外部磁场组件，用于在分离腔室内形成自下而上的磁场。其中，由样品注入口注入的样品中，表面连接磁珠的待测粒子受到磁场的作用力向上方运动，在待测粒子富集处富集或贴附在分离腔室的顶壁上；表面未连接磁珠的待测粒子由该微柱阵列进行拦截捕获；样品中除待测粒子之外的其他成分由于重力作用透过微柱阵列。本发明结合了两种捕获方法，实现了高捕获率、高通量、高纯度循环肿瘤细胞捕获。

Description

一种微流控芯片及利用其捕获循环肿瘤细胞的方法
技术领域
本发明涉及微流控芯片以及医疗检测技术领域，尤其涉及一种微流控芯片及利用其捕获循环肿瘤细胞的方法。
背景技术
随着社会的进步，生命健康的问题也日益引起人们的重视。而癌症则是影响人类生命健康的一个重大的难题。如何攻克这一难题使得人们就像对待感冒一样对待癌症是人类孜孜以求的主题和努力寻求的方向。传统的手术，化疗，放疗的方法成本高，费时，复杂，给病人带来较大痛苦。循环肿瘤细胞(CTCs)是肿瘤转移过程中血液循环系统中存活的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞(CTCs)检测有助于早期发现肿瘤的微转移。并且CTCs的数目与癌症的严重程度有着密切的联系。
微流控芯片则具有体积小，成本低，所需样品的量少的特点，是一种低成本，高速度，高通量研究CTCs的可行方法，是一种非侵入性的新型诊断工具。现有的利用微流控芯片研究CTCs的捕获分离方法可分为两类：
(1)第一类利用亲和性(Affinicity reaction)原理进行细胞的捕获与分离，该方法依赖于在微流控芯片的内部的微通道或微结构上修饰能够与细胞表面抗原结合的特异性抗体如anti-EpCAM。45岁之前，超过90％的肿瘤均源于上皮细胞。但在不同的肿瘤细胞中，EpCAM的表达各有不同。而且当肿瘤细胞发生上皮间质转化(EMT)时，肿瘤细胞的EpCAM的表达降低。因此依赖于该方法捕获CTCs有可能会失去一部分不表达或低表达EpCAM的肿瘤细胞。
(2)另一类是依赖于物理特性比如尺寸形变进行捕获的，CTCs比血细胞大且不易形变的特征，滤过血细胞。例如Abnova公司的ClearCellCXSystem就是基于大小形变的原理设计制造而成。三个间距为5微米的圆柱构成一个“爪形”结构，重复排列。捕获住肿瘤细胞，白细胞与红细胞则通过形变滤过。但由于CTCs与白细胞的尺寸有重叠的部分，所以一部分CTCs可能会通过滤网或微柱间隙。因为经历了EMT的转变，所以漏掉的CTCs恶性的程度更高。且容易破裂和纯度不高。
理想的检测CTCs的平台应具备以下特征：(1)高敏感性：能够检测到每一个CTC；(2)高特异性：没有假阳性；(3)可重复性：可接受的片上及片后操作的可变化性；(4)高纯度：分离的CTCs没有其他的细胞；(5)保持细胞的活性和完整性：以便于进一步的特征分析和孵育。(6)对于病人来说低成本。1ml的血液中仅有1-100个肿瘤细胞却有107个白细胞和109个红细胞使得这项工作极具有挑战性。
早期利用抗体捕获的微流控芯片效率低，无法应用于不表达EpCAM(上皮粘附分子)的CTCs，而且由于EMT(epithelial-mesenchymaltransition)，可能会丧失一部分CTCs。新近改进的微漩产生的鱼鳞形的芯片改变微柱阵列为鱼鳞形，提高了细胞与抗体修饰的柱子的碰撞几率。提高了捕获效率与纯度。但如何将捕获住的循环肿瘤细胞洗释下来以做进一步的分析却成为问题并且矩形凹槽也将会对细胞产生一定破坏作用。单纯利用尺寸的捕获(ISET：isolation by size of epithelial tumor cells)可能会损失一部分和白细胞尺寸有重叠部分的CTCs，尤其是那些尺寸较小的CTCs。同样存在如何将肿瘤细胞洗释下来以作近一步分析的缺陷，并且通量小。现有的微流控芯片的流速基本上是1ml/hr，而临床使用的血液样品是7.5ml，所以还不能满足临床的需求。
免疫磁珠分选是微流控芯片分选CTCs的常用方法之一。操作简单，效率高。将CTCs与磁性微球结合具有磁性，使其通过具有微孔的磁性滤网芯片或与小室相通的主管道，小室中装有磁铁，从而被吸引在磁性滤网芯片上或捕获在小室中。David Issadore设计了一种利用霍尔效应计数磁化CTCs的方法。单细胞液流的血液样品通过霍尔探测器时会产生一个霍尔电压，从而精确计数CTCs的数目。该方法选择性高，灵敏度高，芯片管道无需修饰，可以很好地控制细胞捕获与释放。还有DEP的方法，操作复杂，并且有可能破坏CTCs的原有特性，使得这些微流控芯片不能满足临床的微型，可携，低功率，高整合能力和对病人的低成本。
然而，现有的捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片因为不能同时实现所有的功能和要求，所以目前唯一应用于临床的只有捕获率不高的得到美国FDA认证的Cell Search。仅局限于乳腺癌，结直肠癌和前列腺癌。还有可能的非上皮细胞或非肿瘤上皮细胞的上皮表达所致的假阳性结果。目前也由于微流控芯片的种种缺陷，局限了临床的应用仅限于美国FDA认证的Cell Search。该方法也存在半自动，高成本，低效率的缺陷。假阳性比率高，富集后的CTCs没有生物活性，仅针对EpCAM阳性，无法检测不表达EpCAM的恶性CTCs。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于上述技术问题，本发明提供了一种高捕获率、高通量、高纯度的微流控芯片及利用其捕获循环肿瘤细胞的方法。
(二)技术方案
根据本发明的一个方面，提供了一种微流控芯片。该微流控芯片包括：分离腔室，其第一侧的中部位置具有样品注入口6，第二侧的上部和下部分别具有待测粒子富集处7和样品流出口8；微柱阵列2，形成于分离腔室内，样品注入口6和样品流出口8之间；外部磁场组件，用于在分离腔室内形成自下而上的磁场5。其中，由样品注入口6注入的样品中，表面连接磁珠的待测粒子受到磁场的作用力向上方运动，在待测粒子富集处7富集或贴附在分离腔室的顶壁上；表面未连接磁珠或连接磁珠较少的待测粒子由该微柱阵列2进行拦截捕获；样品中除待测粒子之外的其他成分由于重力作用透过微柱阵列2。
根据本发明的另一个方面，还提供了一种利用上述的微流控芯片捕获循环肿瘤细胞的方法。该方法包括：步骤A：将血液样品中的循环肿瘤细胞包被具有磁性的免疫磁珠；步骤B：将血液样品注入微流控芯片的分离腔室内；步骤C：在分离腔室内产生自下而上的磁场5，血液样品中包被免疫磁珠的循环肿瘤细胞在磁场方向产生向上的侧位移，部分肿瘤细胞在待测粒子富集处7被收集，部分肿瘤细胞被粘附在分离腔室的顶壁；步骤D：血液样品中未连接上磁珠或连接磁珠较少的循环肿瘤细胞由微柱阵列之间的间隙被捕获，而血液样品中除循环肿瘤细胞之外的其他成分在重力的作用下钻过微柱阵列流入底部，在样品流出口8被收集；步骤E：收集位于待测粒子富集处7、分离腔室的顶壁，及微柱阵列2上方的循环肿瘤细胞。
(三)有益效果
从上述技术方案可以看出，本发明微流控芯片及利用其捕获循环肿瘤细胞的方法具有以下有益效果：
(1)结合了两种捕获方法，确保了高捕获率；
(2)两种捕获方法同时使用，用血量小，耗时短，1ml的血液样品预期可在20-30分钟内完成；
(3)使用与变阻器相连的可控直流电，可控性强，易操作；
(4)微流控芯片及其基底均可用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作，成本低。
附图说明
图1A为根据本发明第一实施例微流控芯片在工作状态的剖视图；
图1B为图1A所示微流控芯片沿微柱阵列位置的横切面剖视图；
图2为根据本发明第二实施例利用图1A和图1B所示微流控芯片捕获循环肿瘤细胞的方法的流程图；
图3为100％连接上直径4.5微米具有磁性的免疫磁珠的肿瘤细胞；
图4为一个各面各方向都连接上免疫磁珠的肿瘤细胞；
【主要元件】
1-微流控芯片；                   2-微柱阵列；
3-基底；                         4-线圈；
5-磁场；                         6-样品注入口；
7-CTCs富集处；                   8-血细胞流出口；
9-连接免疫磁珠的循环肿瘤细胞；   10-白细胞；
11-红细胞。
具体实施方式
本发明结合磁性与尺寸两种方式，利用了两种捕获肿瘤细胞CTCs的方法以提高捕获效率，高纯度地有效实现细胞分离，高通量地以满足临床的7.5ml的要求。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。需要说明的是，在附图或说明书正文中，未绘示或描述的实现方式，均为所属技术领域中普通技术人员所知的形式，将不再详细说明。
一、微流控芯片
在本发明的一个示例性实施例中，提供了一种微流控芯片。图1A为根据本发明第一实施例微流控芯片在工作状态的剖视图。图1B为图1A所示微流控芯片沿微柱阵列位置的横切面剖视图。请参照图1A和图1B，本实施例微流控芯片1包括：
基底3；
分离腔室，由键合于基底上可塑性材料形成，在该分离腔室第一侧的中部位置具有样品注入口6，第二侧的上部和下部分别具有CTCs富集处7和血细胞流出口8；
微柱阵列2，形成于分离腔室内，样品注入口和血细胞流出口8之间；
外部磁场组件，用于在分离腔室内形成自下而上的磁场5；
其中，由样品注入口注入的样品中，表面连接磁珠的CTCs受到上述磁场的作用力向上方运动，由CTCs富集处7富集或贴附在分离腔室的顶壁上；表面未连接磁珠或连接磁珠较少的CTCs经过微柱阵列2，由微柱阵列2进行拦截捕获；血细胞(红细胞和白细胞)由于重力作用，透过微柱阵列2由血细胞流出口8流出。
以下分别对本发明实施例微流控芯片的各个组成部分进行详细说明。
基底3可以采用载玻片或其他各种类型的材料。位于其上方的分离腔室以及位于该分离腔室内的微柱阵列由PDMS(聚二甲基硅氧烷)制作而成。关于基底和制作分离腔室的可塑性材料、基底和可塑性材料之间的键合、分离腔室的制备工艺等内容，均是本领域技术人员非常了解的内容，此处不再详细描述。
本实施例中，微柱阵列2为沿水平方向设置的两排微柱。其中，微柱为圆柱形微柱，其直径为100μm，两圆柱形微柱的间距为7μm。需要说明的是，可以根据实际情况适当放大缩小微柱间距，间距可设为6μm或5μm；或改变微柱的横截面形状如设置成豌豆形；或适当增加微柱的高度即腔室的厚度使得血细胞在重力的作用下易于通过柱间隙；或增加微柱阵列2中微柱的排数；或调整圆柱形微柱的直径(50μm～100μm)等。
本实施例中，外部磁场组件包括：直流电源、可调电阻，以及水平缠绕于分离腔室外侧的线圈4。通过在线圈4上施加电流，可以在分离腔室内产生自下而上的磁场。并且，通过控制流过线圈的电流的大小，进而可以控制磁场的大小。一般情况下，该磁场的大小大约介于0.8T-1.2T之间。
需要说明的是，除了本实施例的电磁组件之外，还可利用马蹄形磁铁在分离腔室内产生自下而上的磁场，此处不再赘述。
此外，本实施例中提到的方向用语，例如“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等，仅是参考附图的方向，并非用来限制本发明的保护范围。
二、捕获循环肿瘤细胞的方法
在本发明的另一个实施例中，还提供了一种利用实施例一微流控芯片的捕获循环肿瘤细胞的方法。该方法分为两种：表达EpCAM的循环肿瘤细胞的捕获，和不表达EpCAM的循环肿瘤细胞的捕获，其可实现7.5ml临床血液样品的检测。
需要说明的是，为了达到简要说明的目的，上述实施例一中任何可作相同应用的技术特征叙述皆并于此，无需再重复相同叙述。
图2为根据本发明第二实施例利用图1A和图1B所示微流控芯片捕获循环肿瘤细胞的方法的流程图。如图2所示，本实施例捕获循环肿瘤细胞的方法包括：
步骤A：将血液样品中的循环肿瘤细胞包被具有磁性的免疫磁珠；
本实施例中，CTCs连接磁性免疫磁珠的方法包括：在1ml的肿瘤细胞悬液中加25微升的免疫磁珠溶液，半小时之内每隔5分钟上下颠倒混匀数次该细胞悬液，即可得到如图3的效果。当然，为了细胞悬液混合均匀，也可使用摇床。
本实施例方法是否能够成功在很大的程度上取决于循环肿瘤细胞连接免疫磁珠的效率。如果所有的CTCs都能连接上直径4.5微米的免疫磁珠，并且每个肿瘤细胞连接的免疫磁珠越多，就能够使得CTCs具有磁性越强，在定向强磁场的作用下做沿着磁场方向的运动越明显，并越容易被强磁场吸引在芯片上。同时将肿瘤细胞的尺寸放大。
图3所示是乳腺癌细胞MCF-7连接磁性免疫磁珠的图片，在该图片中，所有的肿瘤细胞都连接上了直径4.5微米的磁性免疫磁珠。使得肿瘤细胞具有磁性并放大了4.5微米-9微米，从而确保两种捕获方法的有效实施。
图4是一个肿瘤细胞连接具有磁性的免疫磁珠，连接效果十分好的图片。在该图片中，乳腺癌细胞MCF-7在各个方位都连接上具有磁性的免疫磁珠，从而有效确保磁性捕获的成功。并且该肿瘤细胞的尺寸被有效的放大了9微米，确保了尺寸捕获的极大可能。
经验证，绝大部分的CTCs在半小时之内即可近100％的连接上带有磁性的免疫磁珠，仅靠磁性即可实现CTCs的捕获。
步骤B：将血液样品注入微流控芯片的分离腔室内
步骤C：通过外部磁场组件在分离腔室内产生自下而上的磁场5，表达EpCAM(上皮粘附分子)的循环肿瘤细胞9在微柱阵列上向前运动的同时，沿强磁场方向有一个向上的侧位移，部分包被磁珠的循环肿瘤细胞在肿瘤细胞富集处7被收集，还有部分包被磁珠的肿瘤细胞被强磁场吸引，粘附在分离腔室的顶壁上；
本实施例中，用大小可调的直流电在线圈上产生电流，通电螺线圈内的磁场在微流控芯片内达到最强，控制磁场的大小。在不需要控制磁场大小的情况下，亦可利用马蹄形磁铁的内部定向的磁场，产生对连接免疫磁珠的CTCs的定向运动以及吸引作用。
步骤D：血液样品中未连接上磁珠或连接磁珠较少的CTCs可再次利用微柱阵列2之间较小的间隙被捕获，而血液样品中除CTCs之外的其他成分在重力的作用下通过形变钻过微柱阵列流入底部，在右侧下方血细胞流出口8被收集。
本步骤中，血液样品从微流控芯片的样品注入口通入，尺寸较大的肿瘤细胞留在微流控芯片微柱阵列之上，白细胞10和红细胞11在重力的作用下通过形变流到微流控芯片的底部8，实现捕获与分离。
步骤E：将微流控芯片置于水平向CTCs富集处7倾斜，并用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗，在肿瘤细胞富集处7收集捕获住的循环肿瘤细胞，其中包括：(1)已存在于CTCs富集处的循环肿瘤细胞；(2)粘附于分离腔室顶壁上的循环肿瘤细胞；(3)由微柱阵列所捕获的循环肿瘤细胞，从而实现高富集率和确保循环肿瘤细胞的活性。
其中，需要注意的是，血液样品通完之后，冲洗循环肿瘤细胞之前，可静置几分钟以备血细胞在重力作用下从血细胞出口流走。
需要说明的是，除非特别描述或必须依序发生的步骤，本实施例上述步骤的顺序并无限制于以上所列，且可根据所需设计而变化或重新安排。
至此，已经结合附图对本发明两实施例进行了详细描述。依据以上描述，本领域技术人员应当对本发明微流控芯片及利用其捕获循环肿瘤细胞的方法有了清楚的认识。
此外，上述对各元件和方法的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换，例如：
(1)关于微柱阵列中微柱的排数、直径等可以根据需要进行调整；
(2)外部磁场组件可以采用电磁组件，还可以采用马蹄形磁铁在分离腔室内产生相应磁场，此外，电磁组件也可以采用除直流电源和可调电阻之外的其他形式；
(3)待测粒子富集处7和样品流出口8可以设置于分离腔室的同一侧，也可以设置于分离腔室的不同侧，并且，样品注入口6和样品流出口8可以相对设置，也可以相邻设置，或设置于分离腔室的同一侧，均可以实现本发明；
(4)除了可以用于血液样品中循环肿瘤细胞的检测之外，本发明的微流控芯片还可以用于其他可包被磁性粒子、并且待测粒子与其之外的其他粒子在尺寸上存在差异的待测粒子检测上；
(5)本文可提供包含特定值的参数的示范，但这些参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应值。
综上所述，本发明同时采用两种捕获方法：强磁场中的吸引作用，基于大小的尺寸捕获，两种捕获方法的结合确保了高的捕获效率，并且有效地实现高捕获率下的高通量及高纯度，以满足临床的需求。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种微流控芯片，其特征在于，包括：
分离腔室，其第一侧的中部位置具有样品注入口(6)，第二侧的上部和下部分别具有待测粒子富集处(7)和样品流出口(8)；
微柱阵列(2)，形成于所述分离腔室内，样品注入口(6)和样品流出口(8)之间；
外部磁场组件，用于在所述分离腔室内形成自下而上的磁场(5)；
其中，由样品注入口(6)注入的样品中，表面连接磁珠的待测粒子受到所述磁场的作用力向上方运动，在所述待测粒子富集处(7)富集或贴附在所述分离腔室的顶壁上；表面未连接磁珠或连接磁珠较少的待测粒子由该微柱阵列(2)进行拦截捕获；样品中除待测粒子之外的其他成分由于重力作用透过所述微柱阵列(2)。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，还包括：
基底(3)；
可塑性材料，形成于所述基底(3)上；
所述分离腔室在所述基底(3)和可塑性材料之间形成。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述基底(3)为载玻片或聚二甲基硅氧烷，所述可塑性材料为聚二甲基硅氧烷。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微柱阵列(2)包括：沿水平方向设置的一排或多排的微柱，其中，该微柱的横截面形状为圆形或豌豆形。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述外部磁场组件形成磁场(5)的磁场强度介于0.8T-1.2T之间。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述外部磁场组件包括：
线圈(4)，水平缠绕于所述分离腔室外侧；
其中，在所述线圈(4)上施加电流，以在所述分离腔室内产生自下而上的磁场(5)，通过改变所述电流的大小，调节所述磁场(5)的大小。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述样品为血液样品，所述待测粒子为循环肿瘤细胞，所述微柱阵列(2)同排微柱中相邻两微柱之间的间距介于5～7μm之间。
8.一种利用权利要求7所述的微流控芯片捕获循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括：
步骤A：将血液样品中的循环肿瘤细胞包被具有磁性的免疫磁珠；
步骤B：将血液样品注入微流控芯片的所述分离腔室内；
步骤C：在分离腔室内产生自下而上的磁场(5)，血液样品中包被免疫磁珠的循环肿瘤细胞在磁场方向产生向上的侧位移，部分肿瘤细胞在待测粒子富集处(7)被收集，部分肿瘤细胞被粘附在分离腔室的顶壁；
步骤D：血液样品中未连接上磁珠或连接磁珠较少的循环肿瘤细胞由微柱阵列之间的间隙被捕获，而血液样品中除循环肿瘤细胞之外的其他成分在重力的作用下钻过微柱阵列流入底部，在样品流出口(8)被收集；
步骤E：收集位于待测粒子富集处(7)、分离腔室的顶壁，及微柱阵列(2)上方的循环肿瘤细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤A包括：在肿瘤细胞悬液中加免疫磁珠溶液，并使两者混合均匀，得到血液样品。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤E包括：将微流控芯片置于水平向待测粒子富集处(7)倾斜，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，以收集循环肿瘤细胞。
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