CN111065920A - 基于前列腺特异性膜抗原的前列腺癌患者筛查方法 - Google Patents

基于前列腺特异性膜抗原的前列腺癌患者筛查方法 Download PDF

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Abstract

根据本发明的一实施例，通过血中循环癌细胞标记因子及前列腺特异性膜抗原的光学图像分析来提供前列腺癌患者筛查方法。

Description

基于前列腺特异性膜抗原的前列腺癌患者筛查方法
技术领域
本发明涉及前列腺癌患者筛查方法，更详细地，涉及通过基于血中循环癌细胞的前列腺特异性膜抗原及血中循环癌细胞的标记因子的光学分析的前列腺癌患者筛查方法。
背景技术
前列腺癌为男性身上发病的常见癌症之一，是在西方第二个常见癌症，在韩国也呈现出恶性肿瘤当中最快的增加趋势。当前列腺癌限定于前列腺时，由于可根治，因此持续努力早期发现此症状。作为前列腺癌的肿瘤标记物，前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen；PSA)在1971年发现在精浆液和1979年发现在前列腺组织之后，起初是出于治疗后的追踪观察的目的导入，但是逐渐开始应用于筛检。血清前列腺特异性抗原检查，从1980年代后半期出于筛检目的广泛利用于临床上，作为单一检查法呈现最优秀的灵敏度，给前列腺癌的诊断与治疗带来划时代的变化。导入前列腺特异性抗原之后，不仅在诊断当时表示淋巴结转移的频率减小为小于5％，而且初诊时发现为转移癌的患者人数急剧减少，由此被评价为呈现前列腺癌的早期诊断和向低病期移动的分期移动(stagemigration)的效果。即使有着这种作为肿瘤标记物的成果，但将前列腺特异性抗原使用在筛检时的最大问题在于特异性不足和存在过度诊断及过度治疗的可能性。在这种背景下提出需要开发可代替或者弥补以往的前列腺特异性抗原的作用的新肿瘤标记物的必要性，与此相关的是，前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)作为新肿瘤标记物备受瞩目。前列腺特异性膜抗原虽然是发现在90％以上前列腺癌的膜蛋白，但是也发现在大部分的实体癌的血管中。因此，若将前列腺特异性膜抗原作为靶子，则会破坏前列腺癌本身，而且还会破坏向前列腺癌供给血液的血管结构，因此前列腺特异性膜抗原具有相当大的优点。
在患者的治疗及预防方面，识别对前列腺癌治疗剂起反应的患者或看似对该治疗剂起反应的患者可成为用于有效治疗前列腺癌的目标。前列腺癌可利用血清前列腺特异性抗原检查、超声波检查、组织活检等的方法来执行诊断，前列腺特异性膜抗原的表达形态能够以组织活检执行检查。但是，就组织活检而言，难以从患者身上反复采集，且可对患者带来身体负担。因此，当前需要可减少患者的负担的同时确认前列腺特异性膜抗原的技术。
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于，通过光学图像分析来探测血中循环癌细胞中表达的前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)，由此提供筛查前列腺癌患者的方法。
本发明要实现的技术问题不局限于以上提及的技术问题，本发明所属技术领域的普通技术人员可从以下记载内容中明确地理解未提及的其他技术问题。
用于解决问题的方案
为了实现上述技术问题，本发明一实施方式的前列腺癌患者筛查方法可包括：从前列腺癌患者中获取血液的步骤；从上述血液中利用生物芯片来分离血中循环癌细胞的步骤；将分离的上述血中循环癌细胞和与血中循环癌细胞特异性结合的荧光标记物及与前列腺特异性膜抗原特异性结合的荧光标记物进行反应的步骤；将与上述荧光标记物进行反应的血中循环癌细胞及前列腺特异性膜抗原作为对象接收多个波长范围的各个光学图像的步骤；在上述多个波长范围的整个或一部分光学图像中测定上述血中循环癌细胞及上述前列腺特异性膜抗原的荧光强度来执行第一次过滤的步骤；在上述多个波长范围的整个或一部分光学图像中测定上述血中循环癌细胞的形态学(morphology)来执行第二次过滤的步骤；在将上述多个波长范围的各个光学图像中的整个或一部分合并的整合图像中测定上述血中循环癌细胞的形态学来执行第三次过滤的步骤。
在本发明的实施例中，与上述血中循环癌细胞特异性结合的荧光标记物可以为选自由对波形蛋白(vimentin)表示特异性的抗体、对上皮细胞粘附分子(EpCAM)表示特异性的抗体及对细胞角蛋白(CK)表示特异性的抗体组成的组中的至少一种。
在本发明的实施例中，在接收上述光学图像的步骤中，上述多个波长范围的光学图像可包括蓝色波长范围图像、绿色波长范围图像及红色波长范围图像。
在本发明的实施例中，可在上述蓝色波长范围图像中执行上述第一次过滤的步骤及执行上述第二次过滤的步骤来判别血中循环癌细胞的细胞核。
在本发明的实施例中，可在上述绿色波长范围图像和上述红色波长范围图像中的一个以上图像中执行上述第一次过滤的步骤来判别血中循环癌细胞的细胞膜。
在本发明的实施例中，上述血中循环癌细胞的形态学可包括细胞面积、细胞大小及真圆度(circularity)中的一个以上。
在本发明的实施例中，执行上述第一次过滤的步骤可包括：在上述多个波长范围的整个或一部分光学图像中测定血中循环癌细胞的大小的步骤；以及设定由相比于测定的上述血中循环癌细胞的大小大预先设定的比率或量的多边形或圆形成的区域，并在上述区域内测定血中循环癌细胞的荧光强度来执行第一次过滤的步骤。
在本发明的实施例中，分离上述血中循环癌细胞的步骤可在大气压为1000至1020hPa的条件下实现。
在本发明的实施例中，上述生物芯片可以为由牛血清白蛋白(BSA)溶液涂敷的高密度微芯片。
在本发明的实施例中，上述高密度微芯片可具有尺寸特异性。
在本发明的实施例中，上述牛血清白蛋白溶液能够以0.05至0.15％的浓度进行涂敷。
发明效果
根据本发明的实施例，可通过血中循环癌细胞中表达的前列腺特异性膜抗原(PSMA)的图像分析来挑选出前列腺癌患者。
本发明的效果不局限于上述的效果，应被理解为包括可从本发明的发明内容或权利要求书中记载的发明的结构推论的所有效果
附图说明
图1表示分离血中循环癌细胞的过程。
图2为拍摄利用高密度微芯片来分离的血中循环癌细胞的照片。
图3为表示本发明的培养液中培养的血中循环癌细胞的生长及分裂和一般的培养液中培养的血中循环癌细胞的生长及分裂的图表。
图4为表示利用本发明的培养液由本发明中使用的水凝胶涂敷的培养板中培养的血中循环癌细胞的生长及分裂和一般的培养板中培养的血中循环癌细胞的生长及分裂的图表。
图5为蓝色、绿色及红色波长范围的血中循环癌细胞光学图像的样品照片。
图6为将图5所示的血中循环癌细胞光学图像合并的整合图像照片。
图7表示由多种荧光染料或标记结合而成的血中循环癌细胞的形状和其荧光强度的测定结果。
图8为实现光学血中循环癌细胞识别方法的程序的驱动例。
图9为使用前列腺癌细胞株及白细胞加标(spike-in)载玻片的血中循环癌细胞的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)及分化簇45(CD45)的免疫荧光图像。
图10为前列腺癌患者的样品中血中循环癌细胞的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚、上皮细胞粘附分子、前列腺特异性膜抗原及分化簇45的免疫荧光图像。
具体实施方式
以下，详细说明本发明的实施例，可使本发明所属技术领域的普通技术人员容易实施。但是，本发明能够以多种不同的形态实现，不局限于在此说明的实施例。
实施例1：高密度微芯片的制备
在实验中使用的高密度微芯片中，气孔的大小(pore-size)形成为5.5～8.5μm，大小小于5.5μm的白细胞(WBC，white blood cell)及红细胞(RBC，red blood cell)使芯片通过而去除芯片，尺寸大于5.5μm的靶细胞为制备成使其卡在芯片上可选择性地回收特定尺寸的微芯片。
作为参考，为了确认高密度微芯片的细胞回收率，将癌症患者的癌细胞尖刺(spiking)10个、100个、1000个，利用芯片使其通过，从而执行察看芯片上的癌细胞的回收率的实验。将其的结果示于下列表1中。
表1
试样 尖刺细胞数 回收的细胞数 细胞回收率(％)
1 10 9 90
2 100 86 86
3 1000 850 85
计算芯片的细胞回收率，其结果呈现约80％以上的高的细胞回收率，为了再次确认回收的细胞为癌细胞，对现有的癌症检查中使用的细胞角蛋白(CK)抗体进行染色来确认的结果可见，均为细胞角蛋白阳性，是癌细胞。
实施例2：血中循环癌细胞(CTC)分离过程
1.在5ml的血液中放入250μl的抗体聚合物之后，混合3秒钟左右，然后在常温下反应20分钟。
2.加入装有1％胎牛血清(FBS)的5ml的磷酸盐缓冲液(PBS)。
3.在装有15ml的Ficoll溶液的50ml的试管(tube)中缓慢放入10ml的反应溶液。
4.在1200g中将溶液离心分离20分钟，来第一次去除血球细胞。
5.为了防止不必要的细胞的吸附，利用0.1％牛血清白蛋白溶液将高密度微芯片(HD Microporous chip，滤网)处理10分钟并涂敷之后，利用磷酸盐缓冲液冲洗。
6.将Ficoll的上清溶液放在滤网上，以重力过滤微量存在的红细胞来第二次分离纯度高的血中循环癌细胞。这并不进行离心分离或免疫珠(immunobead)之类的处理，从而防止血中循环癌细胞受损。
7.分离的血中循环癌细胞通过染色进行鉴定。
实施例3：分离的血中循环癌细胞的短期培养
将利用本发明的高密度微芯片来分离的血中循环癌细胞接种(seeding)于由具有中性电荷且带有亲水性的水凝胶涂敷的超低吸附(Ultra low attachment)培养板。上述培养板装有包含11ng/ml的胰岛素、22ng/ml的转铁蛋白、2ng/ml的EGF及8μM的罗氏激酶抑制剂的培养液，就上述短期培养而言，从开始培养的时间点到14天期间，在细胞培养箱中，在37℃及5～10％CO2条件下实施培养。
实施例4：血中循环癌细胞的确认
根据上述实施例3短期培养的血中循环癌细胞为了通过染色方法确认是癌细胞，利用以下方法来执行细胞染色过程。
1.执行作为细胞离心分离法的细胞离心涂片法(cytospin)过程，将回收的细胞固定于染色用载玻片。
2.执行渗透(permeabilization)过程，以便于可使抗体进入细胞内部。
3.利用磷酸盐缓冲液来执行冲洗(washing)过程。
4.利用磷酸盐缓冲液来制备1％牛血清白蛋白(BSA，bovine serum albumin)，为了减少非特异性反应(non-specific binding)和内源性过氧化物酶活性(endogenousperoxidase activity)，执行阻断(blocking)过程。
5.利用第一抗体，使上皮细胞粘附分子(EpCAM，epithelial cell adhesionmolecule)、广谱细胞角蛋白(pan-CK，pan-cytokeratin)及分化簇45(白细胞共同标记物，leukocyte common marker)在常温下反应60分钟。
6.使与上述第一抗体相结合的荧光标记的第二抗体在常温下反应60分钟。
7.利用磷酸盐缓冲液执行冲洗过程。
8.最终，为了对细胞核进行染色，放入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，4′,6-diamidino-2-phenylindole)溶液(solution)之后，盖上盖玻片，并在常温下反应10分钟。
9.一边观察染色的细胞一边手动计算染色的比率及回收率。
实施例5：血中循环癌细胞及前列腺特异性膜抗原荧光图像分析
1.准备在上述实施例4中荧光标记的血中循环癌细胞。
2.使对前列腺特异性膜抗原(Prostate Specific Membrane Antigen(RabbitmAb，cell signaling technology)表示特异性的第一抗体(小鼠)与上述实施例4中荧光标记的血中循环癌细胞进行反应之后，使第二抗体(Goat anti-Rabbit IgG(H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody，Alexa Fluor 546，Thermo)进行反应，来对前列腺特异性膜抗原进行荧光标记。
3.上述反应之后，将血中循环癌细胞装载于载玻片上，然后使上述载玻片位于智能活检细胞图像分析仪(Smart Biopsy Cell Image Analyzer)(CIA 020)的平台上。
4.设定多个波长范围来拍摄图像之后，测定荧光强度。
5.当在多个波长范围中测定上述荧光强度时，测定血中循环癌细胞及前列腺特异性膜抗原的荧光波长来执行第一次过滤。
6.通过上述第一次过滤，对血中循环癌细胞的细胞核及细胞膜测定荧光标记物(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚、上皮细胞粘附分子、细胞角蛋白、分化簇45)的荧光波长(蓝色、绿色及红色)。
7.执行上述测定的荧光波长中重新对标记有血中循环癌细胞的荧光物质的波长下测定血中循环癌细胞的面积、细胞的大小及圆形的真圆度(circularity)的第二次过滤。
8.在上述第二次过滤中，在上述第一次过滤的图像中进一步测定及分析血中循环癌细胞的细胞核，并执行排除染色有分化簇45(红色)的细胞的过程。
9.对上述第一次过滤及第二次过滤图像进行整体整合之后，执行重新测定及分析血中循环癌细胞的面积、细胞的大小及圆形的真圆度(circularity)的第三次过滤。
10.测定各个荧光波长的强度，对其进行数值化。
比较例1：根据培养液的血中循环癌细胞的培养的细胞数变化
在通常用于细胞培养的细胞培养液和本发明的培养液中，对血中循环癌细胞的分裂及生长程度进行比较实验。通常用于细胞培养的培养液包含25nM的亚硒酸钠(sodiumselenite)、50nM的氢化可的松(Hydrocortisone)、0.01mM的乙醇胺(ethanolamine)、0.01mM的磷酸乙醇胺(phosphorylethanolamine)、100pM的三碘甲状腺素(triiodothyronine)、0.5％(w/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin)、10mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.5mM的丙酮酸钠(sodium pyruvate)、4.5mM的L-谷氨酰胺(L-glutamine)及1X的抗生素-抗真菌(antibiotic-antimycotic)，本发明的培养液与上述实施例3相同。并且，培养条件除了利用一般的板之外与实施例3相同。
参照图3可知，分化簇45(-)为对于培养的细胞中除了血中循环癌细胞之外的细胞的生物标记，正常生长培养基(Normal growth media)是指一般的细胞培养液，CG生长培养基(CG growth media)是指本发明的培养液。图3表示在本发明的培养液中培养出更多血中循环癌细胞，由此可知本发明的培养液与一般的培养液相比，对血中循环癌细胞的分裂及培养更有效。
上述的本发明的说明用于例示，本发明所属技术领域的普通技术人员应当理解，在不变更本发明的技术思想或必要特征的情况下，能够以其他具体的形态容易变形。因此，应理解为以上记述的多个实施例在所有方面是例示性的，而非限定。例如，以单一型说明的各个结构要素能够以分散的方式实施，同样，说明分散的多个结构要素也能够以结合的形态实施。
本发明的范围由所附的发明要求保护范围表示，应解释为从发明要求保护范围的含义及范围以及其等同概念导出的所有变更或变形的形态包括在本发明的范围。
以下，参照附图，说明本发明。但是，本发明能够以多种不同的形态实现，因此不局限于在此说明的实施例。并且，在图中，为了明确说明本发明，省略与说明无关的部分，在说明书全文中，对于类似的部分，标注类似的附图标记。
在说明书全文中，当一个部分与另一部分相“连接(相连、接触、结合)”时，其不仅包括“直接连接”的情况，还包括在其中隔着其他部件“间接连接”的情况。并且，当一个部分“包括”另一结构要素时，除非有特别反对的记载，则不排除其他结构要素，而是指还可具有其他结构要素。
在本说明书中使用的术语仅用于说明特定的实施例，并无限定本发明的意图。单数的表现除非文脉上有明确不同的含义，则包括复数的表现。应当理解，在本说明书中，“包括”或“具有”等的术语用于指定说明书上记载的特征、数字、步骤、动作、结构要素、部件或组合这些的组合物的存在，而不预先排除一个或其以上的其他特征或数字、步骤、动作、结构要素、部件或组合这些的组合物的存在或附加可能性。
以下，参照附图，详细说明本发明的实施例。
本发明一实施方式的前列腺癌患者筛查方法可包括：步骤(a)，从前列腺癌患者中获取血液；步骤(b)，从上述血液中利用生物芯片来分离血中循环癌细胞；步骤(c)，对与血中循环癌细胞特异性结合的荧光标记物及与前列腺特异性膜抗原特异性结合的荧光标记物进行反应；步骤(d)，将与上述荧光标记物进行反应的血中循环癌细胞及前列腺特异性膜抗原作为对象接收多个波长范围的各个光学图像；步骤(e)，在上述多个波长范围的整个或一部分光学图像中测定上述血中循环癌细胞及上述前列腺特异性膜抗原的荧光强度来执行第一次过滤；步骤(f)，在上述多个波长范围的整个或一部分光学图像中测定上述血中循环癌细胞的形态学(morphology)来执行第二次过滤；步骤(g)，在将上述多个波长范围的各个光学图像中的整个或一部分合并的整合图像中测定上述血中循环癌细胞的形态学来执行第三次过滤。
上述血中循环癌细胞(CTC，Circulating Tumor Cells)是指在恶性肿瘤患者的外周血中发现的肿瘤细胞。血中循环癌细胞非常稀少，可求的标本的量非常受限。血中循环癌细胞的检测及特性分析中的技术包括多重逆转录定量聚合酶链式反应方法、基于影像化的接近法、微滤法及微芯片装置，不局限于此。血中循环癌细胞可作用为以液态活检试样个别化的治疗和治疗之后可必然地提供经过观察的肿瘤生物学标记物。并且，血中循环癌细胞可用作用于理解肿瘤的生物学特性及肿瘤细胞的播种的靶，但不局限于此。根据本发明的一实施例，上述血中循环癌细胞可以为来源于前列腺癌的细胞。
上述生物芯片是指对由半导体之类的无机物形成的固态底物将来源于生物的脱氧核糖核酸(DNA)、蛋白质、酶、抗体、微生物、动植物细胞及器官、神经细胞等的物质以高密度进行集成化并进行组合来制备成现有的半导体芯片形态的混合器件，指利用生物分子的固有的功能，并得到基因表达形态、基因结合、蛋白质分布等的生物学信息或提高生化工序及反应速度或信息处理速度的工具或装置。
上述高密度微芯片是指可基于生物芯片的作用原理分离特定尺寸的物质的生物芯片。
上述高密度微芯片可基于血液细胞的大小差异，并在10分钟以内以约90％的回收率捕捉血中循环癌细胞。
在本发明的实施例中，上述高密度微芯片的气孔大小(pore size)可优选为5.5至8.5μm，可更优选为6.5至7.5μm。当气孔的大小小于5.5μm时，红细胞及白细胞无法通过芯片而卡在芯片上，从而无法被去除，当气孔的大小大于8.5μm时，气孔的大小大于血中循环癌细胞的大小，致使血中循环癌细胞通过芯片，从而无法选择性地回收血中循环癌细胞。在本发明的一实施例中，上述高密度微芯片的气孔形状可以为圆形、四角形或椭圆形状，可优选为四角形。
在本发明的一实施例中，上述高密度微芯片的气孔能够以规则性的图案进行排列。在本发明的另一实施例中，具体地，上述高密度微芯片可将不锈钢、镍、铝或铜作为原材料来制备。上述气孔可通过利用微机电系统(MEMS，Micro-electro Mechanical Systems)技术的蚀刻(etching)形成。
气孔中的相邻的两个气孔之间的间隔窄于血中循环癌细胞的直径。根据本发明的一实施例，两个气孔之间的间隔可相对于血中循环癌细胞的直径以45～65％形成。上述高密度微芯片不因在通道流动的血液或溶液的压力而发生变形。
血液通过气孔之后，向外排出，血液中的血中循环癌细胞无法通过气孔而残留于表面。根据本发明的优选一实施例，上述血中循环癌细胞可以为来源于前列腺癌的细胞。
变形率比非靶细胞，即，比血中循环癌细胞高的红细胞容易通过气孔。
血中循环癌细胞进行过滤之后，血中循环癌细胞可反向或正向供给溶液来将其向外排出。根据本发明的一实施例，可反向供给溶液，以便于可将血中循环癌细胞的受损最小化。上述溶液可利用注射器、注射泵、柱塞泵等来供给。根据本发明的一实施例，上述溶液可由稀释血液的稀释剂、水(Water)及稀释用酸形成。可将通过供给上述溶液而向外排出的血中循环癌细胞回收于容器(Container)，例如，可通过试管、培养皿等简便地采集。
另一方面，当施加约100mmHg的压力时，直径为7.5～15μm的血中循环癌细胞通过直径为8μm的管。通过直径为8μm的管的直径为15μm的血中循环癌细胞具有约53％的变形率。当反冲洗(Back washing)，即，与血液的流动相反的方向使溶液流动来使直径为7.5μm的血中循环癌细胞向外排出时，若考虑血中循环癌细胞的变形率，则两个气孔之间的间隔优选为4μm以下。例如，众所周知，非小细胞肺癌和乳腺癌的癌细胞的直径达到40μm左右。当进行反冲洗时，若考虑直径为40μm的血中循环癌细胞的变形率，则优选地，将两个气孔之间的间隔设定为21μm以下。当直径为7.5μm的血中循环癌细胞存在于间隔大于4μm的两个气孔之间时，血中循环癌细胞可不因溶液的流动而发生变形，从而从表面中脱落。并且，直径为40μm的癌细胞也可不从间隔大于21μm的两个气孔之间的表面中脱落。在本发明的高密度微芯片中，考虑到溶液的压力，两个气孔之间的间隔相对于血中循环癌细胞的直径以45～65％形成。当间隔大于65％，即，大于约4.9μm时，直径为7.5μm的血中循环癌细胞可不因反冲洗而从两个气孔之间的表面中脱落。当间隔大于65％，即，大于26μm时，直径为40μm的血中循环癌细胞可不因反冲洗而从两个气孔之间的表面中脱落。当为了使附着于两个气孔之间的表面的血中循环癌细胞强制性地脱落而提高溶液的压力时，发生血中循环癌细胞的受损，从而降低生存的血中循环癌细胞的采集率。当对于直径为7.5μm的血中循环癌细胞的间隔小于45％，即，小于约3.375μm时，上述高密度微芯片因血液和溶液的流动而破损的担忧高。
在本发明的一实施例中，可使上述试样反复通过上述高密度微芯片。具体地，血中循环癌细胞在上述高密度微芯片中分离一次之后，可重新将分离的上述血中循环癌细胞装载于上述高密度微芯片来进行分离，可反复上述分离过程。
在本发明的一实施例中，通过上述高密度微芯片的血中循环癌细胞分离并不以将包含血中循环癌细胞的溶液装载于高密度微芯片之后，施加特定的人为压力的方式实现，而是可利用重力来分离血中循环癌细胞。通过本发明的高密度微芯片来分离血中循环癌细胞，可将人为压力对血中循环癌细胞的损伤最小化来将存在于患者体内的状态维持不变。
在本发明的一实施例中，为了当血中循环癌细胞分离时，将上述高密度微芯片引起的血中循环癌细胞损伤最小化或更有效地反复使用上述高密度微芯片，或使血中循环癌细胞回收率更加有效，上述高密度微芯片可由特定物质进行涂敷。上述特定物质具体地可以为可与血中循环癌细胞特异性结合的抗体，只要是不对细胞带来物理或化学损伤的生物材料即可。根据本发明的一实施例，上述特定物质可以为牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin)或抗体。上述抗体例如可由抗上皮细胞粘附分子抗体(Anti-Epithelial CellAdhesion Molecule antibody，Anti-EpCAM antibody)、抗细胞角蛋白抗体(Anti-Cytokeratin antibody，Anti-CK antibody)等形成。根据本发明的优选一实施例，上述特定物质可以为牛血清白蛋白(BSA，Bovine Serum Albumin)。
上述BSA(Bovine Serum Albumin)溶液是指牛血清白蛋白。分子量为约66.4kDa左右的蛋白质，是多存在于大部分动物的蛋白质。牛血清白蛋白在生物化学/生物学中，培养细胞时可作为细胞的营养成分来添加，并且，多用于蛋白质的定量中用于获得检查曲线的标准物，当使用限制酶时，应使用少量的酶(蛋白质)，因而还可为了补充溶液内的蛋白质浓度而添加。并且，还可用于多种生化实验(免疫印迹(Western blot)、免疫细胞化学(Immunocytochemistry)、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)等)中附着要检测特定抗体的蛋白质之前，以防止非特异性结合(nonspecific binding)，即，抗体附着于无需的蛋白质或无需的位置的非特异性结合。
根据本发明的一实施例，可利用离心分离法来使外周血反应于由上述牛血清白蛋白溶液涂敷的高密度微芯片，以去除除了血中循环癌细胞之外的其他生物高分子。根据本发明的一实施例，利用上述高密度微芯片的分离可借助重力实现，具体地，可在大气压为1000至1020hPa的条件下实现。优选地，可在大气压为1000至1015hPa的条件下实现。更优选地，可在大气压为1000至1013hPa的条件下实现。
根据本发明的一实施例，上述牛血清白蛋白溶液可涂敷于上述高密度微芯片的上面、下面或上述气孔的内侧面。优选地，可均涂敷于上述高密度微芯片的上面、下面及上述气孔的内侧面。
根据本发明的一实施例，上述牛血清白蛋白溶液能够以0.05至0.15％浓度进行涂敷。根据本发明的优选实施例，上述牛血清白蛋白溶液能够以0.08至0.012％浓度进行涂敷。
根据本发明的一实施例，上述牛血清白蛋白溶液可进行5至15分钟的涂敷处理。根据本发明的优选一实施例，上述牛血清白蛋白溶液可进行8至12分钟的涂敷处理。
参照图1，为了从患者的血液中优先去除血球细胞，在采集的患者的血液中放入抗体聚合物之后，均匀地混合之后，在常温条件下发生反应。之后，加入含有1％胎牛血清的磷酸盐缓冲液溶液，并将Ficoll溶液放置于反应溶液之后，通过离心分离第一次去除血球细胞。像这样，第一次去除本发明中无需的血球细胞之后，利用由牛血清白蛋白溶液特别涂敷的高密度微芯片来过滤红细胞，从而分离纯度高的血中循环癌细胞。分离的血中循环癌细胞通过染色进行鉴定。当利用由上述牛血清白蛋白涂敷的高密度微芯片时，可在使本发明中要分离的血中循环癌细胞受损最小化的状态下进行分离。
根据本发明的一实施例，在从上述血液中利用生物芯片来分离血中循环癌细胞的步骤之后，可进一步执行将分离的血中循环癌细胞短期培养的步骤。
在本发明的一实施例中，上述短期培养中使用的培养液可由选自由胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子(EGF，Epidermal Growth Factor)及罗氏激酶(ROCK，Rho Kinase)抑制剂组成的组中的至少3个形成。
上述胰岛素为人类的物质代谢系统的激素中之一，在胰脏(器官)的朗格汉斯岛β细胞中分泌而起到规定地维持作为血液中的葡萄糖数值的血糖量的作用。当血糖量提高规定以上时，分泌胰岛素，并促进将血液内的葡萄糖流入至细胞内而重新以多糖类(糖原)的形态储存的作用。本发明的短期培养步骤中使用的培养液包含上述胰岛素，从而当培养血中癌细胞时，与以往的血中循环肿瘤细胞培养液相比，可更加促进细胞生长及分裂。根据本发明的一实施例，上述胰岛素可以为3～50ng/ml、3～45ng/ml、3～40ng/ml、3～30ng/ml、4～50ng/ml、4～45ng/ml、4～30ng/ml、5～50ng/ml、5～45ng/ml或5～30ng/ml。
上述转铁蛋白为β球蛋白的一种，是与吸收于血清中的二分子的三价铁离子相结合，从而介导转铁蛋白受体来向细胞内供给细胞增殖或血红蛋白生产所需的铁的铁转运蛋白。血清中的99％以上铁与转铁蛋白相结合，正常情况下，转铁蛋白的约1/3可与铁相结合。本发明的短期培养步骤中使用的培养液包含上述转铁蛋白，从而当培养血中循环癌细胞时，与以往的血中循环肿瘤细胞培养液相比，可更加促进细胞生长及分裂。根据本发明的一实施例，上述转铁蛋白可以为3～50ng/ml、3～45ng/ml、3～40ng/ml、3～30ng/ml、4～50ng/ml、4～45ng/ml、4～30ng/ml、5～50ng/ml、5～45ng/ml或5～30ng/ml。
上述表皮生长因子(EGF，Epidermal Growth Factor)为与表皮生长因子受体相结合来促进细胞的生长及分裂的多肽性生长因子。并且，上述表皮生长因子除了促进蛋白质合成或核糖核酸(RNA)合成之外，可诱导鸟氨酸脱羧酶。本发明的短期培养步骤中使用的培养液包含上述表皮生长因子，从而当培养血中循环癌细胞时，与以往的血中循环肿瘤细胞培养液相比，可更加促进细胞生长及分裂。根据本发明的实施例，上述表皮生长因子可以为0.5～10ng/ml、0.5～9ng/ml、0.5～8ng/ml、0.5～7ng/ml、0.5～6ng/ml、0.5～5ng/ml、0.7～10ng/ml、0.7～9ng/ml、0.7～8ng/ml、0.7～7ng/ml、0.7～6ng/ml、0.7～5ng/ml、1～10ng/ml、1～9ng/ml、1～8ng/ml、1～7ng/ml、1～6ng/ml或1～5ng/ml。
上述Rho相关蛋白激酶(ROCK，Rho-associated protein kinase)抑制剂是指可将罗氏激酶(ROCK)作为靶抑制或降低其功能的化合物。其中，罗氏激酶为属于丝氨酸-苏氨酸激酶的AGC家族(PKA/PKG/PKC)的激酶。上述罗氏激酶与作用于细胞骨架来控制细胞的运动及形态的过程相关。具体地，上述罗氏激酶可作用为细胞的移动及肌动蛋白组织化的调节因子。上述罗氏激酶与糖尿病、出血性脑血管疾病、帕金森氏病之类的神经退行性疾病相关，上述罗氏激酶抑制剂可用于治疗及抑制上述罗氏激酶相关疾病。根据本发明的一实施例，上述罗氏激酶抑制剂可以为选自由法舒地尔(Fasudil)、利帕舒地尔(Ripasudil)、RKI-1447及Y27632组成的组中的至少一种。上述法舒地尔作为罗氏激酶抑制剂的一种，可用于治疗脑血管痉挛，还可对肺动脉高压治疗有效。上述利帕舒地尔作为上述法舒地尔的衍生物，可作用为罗氏激酶抑制剂，还可用于治疗青光眼或高眼压症。上述RKI-1447可抑制罗氏激酶1和罗氏激酶2。上述Y27632可通过细胞为了结合酶的催化剂部位而与腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)竞争，从而抑制罗氏激酶1和罗氏激酶2。根据本发明的一实施例，上述罗氏激酶抑制剂可以为3～30μm、3～27μm、3～24μm、3～21μm、4～20μm、4～30μm、4～27μm、4～24μm、4～21μm、4～20μm、5～30μm、5～27μm、5～24μm、5～21μm或5～20μm。
本发明的短期培养中使用的上述培养板可具有用于防止细胞粘附的表面。根据本发明的一实施例，血中循环癌细胞可在漂浮状态下培养，因而能够以使上述培养板的表面防止细胞粘附的方式进行涂敷。上述培养板的表面可由水凝胶进行涂敷。上述水凝胶是指将水作为分散介质的凝胶，水溶胶因冷却而丧失流动性或具有三维网络结构和微晶结构的亲水性高分子包含水来膨胀而形成。具体地，上述水凝胶作为借助共价键、氢键、范德华键或物理键等的凝聚力进行交联的亲水性高分子，是具有在水溶液上将大量的水含在内部而可膨润的三维高分子网络结构的物质。像这样，在吸收水的状态下，呈现与生物体的组织相似的动作。上述水凝胶以温度、pH等发生相变，从而可使膨胀比不连续地发生变化，可用于隐形眼镜、医疗用电极、细胞培养中。根据本发明的一实施例，上述水凝胶能够以共价键涂敷于上述培养板来防止血中癌细胞粘附于培养板表面。根据本发明的再一实施例，上述水凝胶可具有中性电荷的同时具有亲水性。上述具有中性电荷是指电荷处于非正非负的状态，上述亲水性是指对于水的强的亲和力，指可容易溶解于水中。
在本发明的一实施例中，上述短期培养的步骤可从开始培养的时间点进行到1至15天。在本发明的再一实施例中，可以为5至15天，优选地，可以为10至15天。更优选地，可以为12至15天。
与上述血中循环癌细胞特异性结合的荧光标记物是指可与存在于血中循环癌细胞本身或内外部的物质特异性结合的荧光物质。根据本发明的一实施例，可识别血中循环癌细胞的荧光标记物可与细胞核特异性结合，或可与存在于细胞内外部的蛋白质或脱氧核糖核酸、核糖核酸等特异性结合。具体地，在细胞核中，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚可用作荧光标记物，可使用与作为中间丝蛋白的波形蛋白(vimentin)特异性结合的荧光标记物，可使用与前列腺特异性抗原(PSA，prostate specific antigen)和前列腺特异性膜抗原(PSMA，prostate specific membrane antigen)特异性结合的荧光标记物，可使用与上皮细胞粘附分子(EpCAM，epithelial cell adhesion molecule)和细胞角蛋白(CK，cytokeratin)特异性结合的荧光标记物，可使用与用作非靶细胞去除单元的分化簇45特异性结合的荧光标记物。与上述血中循环癌细胞特异性结合的荧光标记物可由核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、核酸或蛋白质形成，可以为由蛋白质形成的抗体。作为与上述血中循环癌细胞特异性结合的荧光标记物，只要是可与血中循环癌细胞特异性结合来识别的物质即可。
上述前列腺特异性抗原(PSA，prostate specific antigen)作为在前列腺的上皮细胞中合成的蛋白分解酶，是在前列腺以外的组织中几乎不表达而用于筛查前列腺癌的有用的生物标记。但是，由于仅靠上述前列腺特异性抗原来筛查前列腺癌患者时受到很多限制，因此可代替上述前列腺特异性抗原或者可使用追加的生物标记，前列腺特异性膜抗原(Prostate specific membrane antigen，PSMA)可作为其例子。
上述前列腺特异性膜抗原(Prostate specific membrane antigen，PSMA)是从前列腺上皮细胞的细胞膜中分泌的叶酸水解酶(folate hydrolase)之一，其表达在中枢神经系统或正常小肠及大肠粘膜、肾小管、阳性及恶性的前列腺上皮，其中最多生成在前列腺。上述前列腺特异性膜抗原比起正常前列腺组织，能够更多地表达在前列腺癌组织，这可通过ELISA方法或蛋白质印迹(Western blot)检查进行定量测定。并且，上述前列腺特异性膜抗原可用于通过在前列腺特异性膜抗原的相关抗体附着同位素来诊断前列腺癌的免疫显像试验(immunoscintigraphic test)了解前列腺细胞的位置。上述前列腺特异性膜抗原的相关抗体例如可以是7E11，同位素可以是铟11(indium 11)。
与上述前列腺特异性膜抗原特异性结合的荧光标记物可以是可与前列腺特异性膜抗原特异性结合的荧光物质，具体地可以是可与前列腺特异性膜抗原特异性结合的抗体。
根据本发明的一实施例，通过上述前列腺特异性膜抗原及血中循环癌细胞的图像分析可判别或筛查出前列腺癌患者。根据本发明的另一实施例，通过上述前列腺特异性膜抗原及血中循环癌细胞的图像分析可预测前列腺癌患者的预后或者分析前列腺癌的诊断及病程。
上述光学图像可通过成像系统来生成。根据本发明的一实施例，上述成像系统可以为细胞成像系统，上述细胞成像系统为例如在载玻片之类的平台上放置染色的细胞，根据多种不同波长观察细胞，并进行拍摄的系统。细胞成像系统可包括自动细胞计数(cellcounting)模块、荧光强度(intensity)分析模块、基于细胞学(cytology)的细胞分类/识别(cell classification/cognition)模块。并且，作为用户便利功能，能够以用户界面包括测定(Measurement)功能、报告(Report)自动生成功能、数据库(DB)管理功能。这种细胞成像系统包括区别细胞、培养液、碎屑(debris)等，并用于判别用户所需的细胞并进行计数的数字影像分析设备。本发明一实施例的细胞成像系统可从光学图像中准确识别荧光标记的或结合有标记的靶细胞，并进行计数。
上述光学图像可以为利用从物体反射的反射光来进行摄像的光学图像。细胞光学图像可以为利用细胞成像装置来输出而在背景上将细胞和碎屑等进行摄像的。这种光学图像可由对各个特定波长范围拼接(stitching)多个分割图像来形成的一个图像文件提供。其中，多个波长范围的光学图像可包括蓝色波长范围图像、绿色波长范围图像及红色波长范围图像。蓝色波长范围的光学图像尤其有用于判别血中循环癌细胞的细胞核，绿色波长范围及红色波长范围的光学图像尤其有用于判别血中循环癌细胞的细胞膜。此外，可利用多种颜色(彩色)的波长范围来识别特定荧光标记物或标记。
在上述第一次过滤或第二次过滤中，当血中循环癌细胞或前列腺特异性膜抗原识别不以所需的水平实现时，可经过光学图像数据的数据过滤，并再一次执行第一次过滤或第二次过滤，可经过多次的数据过滤。并且，在执行第一次过滤或第二次过滤之后，可存储图像数据并将其输出。
并且，可在第一波长范围的光学图像中执行第一次过滤步骤及第二次过滤步骤，接着，还可在与第一波长范围不同的第二波长范围的光学图像中执行第一次过滤步骤及第二次过滤步骤中的一个以上步骤。
例如，第一波长范围可以为蓝色波长范围，第二波长范围可以为绿色或红色波长范围。此时，可在蓝色波长范围图像中执行第一过滤过程及第二过滤过程来判别血中循环癌细胞的细胞核。并且，可在绿色波长范围图像和红色波长范围图像中的一个以上图像中执行第一过滤过程来判别血中循环癌细胞的细胞膜。可通过这种第一次过滤及第二次过滤从光学图像中准确识别细胞。例如，通过绿色及红色波长范围图像，例如，白细胞和癌细胞等的对于靶细胞的识别性变高。在图5中示出实际血中循环癌细胞的蓝色波长范围图像(a)、绿色波长范围图像(b)及红色波长范围图像(c)的样品照片。
另一方面，在第二次过滤过程中，测定血中循环癌细胞的形态学，其中，血中循环癌细胞的形态学可包括细胞面积(area)、细胞大小(diameter)及真圆度(circularity)中的一个以上。
在本发明的一实施例中，前列腺特异性膜抗原的荧光强度通过来自与前列腺特异性膜抗原特异性结合的荧光标记物的多个波长范围的整个或一部分光学图像中进行测定，可对其执行第一次过滤。
除了前列腺特异性膜抗原之外，若更具体察看测定血中循环癌细胞的荧光强度来执行第一次过滤的过程，则可在多个波长范围的整个或一部分光学图像中测定细胞的大小之后，设定由比测定的细胞的大小大预先设定的比率或量的多边形或圆形成的区域，并在该区域内测定细胞的荧光强度来执行第一次过滤。
在图7中示出结合有多种荧光染料或标记的血中循环癌细胞的形状和其荧光强度的测定结果，分别示出利用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚来将细胞核进行染色的情况(a)、将波形蛋白(vimentin)用作标记的情况(b)、将上皮细胞粘附分子(EpCAM，epithelial celladhesion molecule)和细胞角蛋白(CK，cytokeratins)用作标记的情况(c)及将分化簇45用作标记或非靶细胞去除单元的情况(d)。对于各个情况，例如，可在蓝色波长范围光学图像中测定细胞的大小之后，设定具有比测定的大小10％以上的大小的四角形，并在该四角形内测定细胞的荧光强度来执行第一次过滤。之后，还可在其他彩色，例如，绿色、红色、黄色波长范围光学图像中在相同的坐标和大小的区域测定荧光强度。图7的(a)至(d)分别为蓝色、绿色、黄色及红色波长范围图像，在图7的(e)中表示各个波长范围图像中的荧光强度测定结果。
在上述第三次过滤步骤中，在将多个波长范围的各个光学图像中的整个或一部分合并的整合图像中测定血中循环癌细胞的形态学来执行第三次过滤。其中，血中循环癌细胞的形态学可包括细胞面积、细胞大小及真圆度中的一个以上。
例如，如图6所示，可生成将蓝色波长范围光学图像、绿色波长范围图像及红色波长范围图像全部合并的整合图像，并从该整合图像中测定血中循环癌细胞的形态学来执行第三次过滤。
上述第三次过滤可对整个血中循环癌细胞执行，还可对在第一次过滤过程及第二次过滤过程中难以识别细胞补充执行。当需要进一步识别时，可经过单独的数据过滤，或经过多次的第三次过滤过程。
上述图像分析可利用计算机程序来执行。这种计算机程序可利用处理器、控制器、算术逻辑单元(ALU，arithmetic logic unit)、数字信号处理器(digital signalprocessor)、微型计算机、现场可编程门阵列(FPGA，field programmable gate array)、可编程逻辑单元(PLU，programmable logic unit)、微处理器或可执行指令(instruction)并响应的其他任何装置之类的一个以上的通用计算机或特殊目的计算机来实现。
图8作为实现图像分析的程序的驱动例，是通过算法实现本发明实施例的光学图像分析的分析软件的用户界面中的一例。通过该软件，可在短时间内自动实现细胞的识别和计数。

Claims (11)

1.一种前列腺癌患者筛查方法，其特征在于，包括：
从前列腺癌患者中获取血液的步骤；
从所述血液中利用生物芯片来分离血中循环癌细胞的步骤；
将分离的所述血中循环癌细胞和与血中循环癌细胞特异性结合的荧光标记物及与前列腺特异性膜抗原特异性结合的荧光标记物进行反应的步骤；
将与所述荧光标记物进行反应的血中循环癌细胞及前列腺特异性膜抗原作为对象接收多个波长范围的各个光学图像的步骤；
在所述多个波长范围的整个或一部分光学图像中测定所述血中循环癌细胞及所述前列腺特异性膜抗原的荧光强度来执行第一次过滤的步骤；
在所述多个波长范围的整个或一部分光学图像中测定所述血中循环癌细胞的形态学来执行第二次过滤的步骤；
在将所述多个波长范围的各个光学图像中的整个或一部分合并的整合图像中测定所述血中循环癌细胞的形态学来执行第三次过滤的步骤。
2.根据权利要求1所述的前列腺癌患者筛查方法，其特征在于，与所述血中循环癌细胞特异性结合的荧光标记物为选自由对波形蛋白表示特异性的抗体、对上皮细胞粘附分子表示特异性的抗体及对细胞角蛋白表示特异性的抗体组成的组中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的前列腺癌患者筛查方法，其特征在于，在接收所述光学图像的步骤中，所述多个波长范围的光学图像包括蓝色波长范围图像、绿色波长范围图像及红色波长范围图像。
4.根据权利要求3所述的前列腺癌患者筛查方法，其特征在于，在所述蓝色波长范围图像中执行所述第一次过滤的步骤及执行所述第二次过滤的步骤来判别血中循环癌细胞的细胞核。
5.根据权利要求3所述的前列腺癌患者筛查方法，其特征在于，在所述绿色波长范围图像和所述红色波长范围图像中的一个以上图像中执行所述第一次过滤的步骤来判别血中循环癌细胞的细胞膜。
6.根据权利要求1所述的前列腺癌患者筛查方法，其特征在于，所述血中循环癌细胞的形态学包括细胞面积、细胞大小及真圆度中的一个以上。
7.根据权利要求1所述的前列腺癌患者筛查方法，其特征在于，执行所述第一次过滤的步骤包括：
在所述多个波长范围的整个或一部分光学图像中测定血中循环癌细胞的大小的步骤；以及
设定由相比于测定的所述血中循环癌细胞的大小大预先设定的比率或量的多边形或圆形成的区域，并在所述区域内测定血中循环癌细胞的荧光强度来执行第一次过滤的步骤。
8.根据权利要求1所述的前列腺癌患者筛查方法，其特征在于，分离所述血中循环癌细胞的步骤在大气压为1000至1020hPa的条件下实现。
9.根据权利要求1所述的前列腺癌患者筛查方法，其特征在于，所述生物芯片为由牛血清白蛋白溶液涂敷的高密度微芯片。
10.根据权利要求9所述的前列腺癌患者筛查方法，其特征在于，所述高密度微芯片具有尺寸特异性。
11.根据权利要求9所述的前列腺癌患者筛查方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白溶液以0.05至0.15％的浓度进行涂敷。
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