CN103026228A - 用于分离肿瘤细胞的方法、系统和装置 - Google Patents

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Abstract

本公开的实施方案致力于特定细胞和/或污染物的分离/捕获，以及癌症的确定、监测和治疗。而且，一些实施方案致力于用于在体内或体外从体液中去除癌、干细胞和/或肿瘤细胞的方法、系统和装置，从而预防或阻止癌的增生。一些实施方案提供了例如具有大量开孔(优选地精确的数目)的血相容性膜，其在分离过程期间对体液中存在的细胞产生的不利影响，无论是在定性还是定量上，都是最小的。例如，在一些实施方案中，大多数的循环肿瘤细胞被滤器捕获，同时大多数的例如白细胞被允许通过，并且通过的白细胞保持其活力。

Description

用于分离肿瘤细胞的方法、系统和装置
相关申请
本申请要求获得如下专利申请的利益和优先权：2010年3月31日提交的荷兰专利申请号NL1037837，题目为“用于分离循环肿瘤细胞的装置和方法(Device and Method for Separation of Circulating Tumor Cells)”，和2010年11月4日提交的荷兰专利申请号NL1038359，题目为“用于分离循环肿瘤细胞的装置和方法(Device and Method for Separation of Circulating TumorCells)”。其每一个公开通过提述以其整体并入本文。
本公开的领域
本公开的实施方案涉及如下的方法、系统和装置，其用于如下之一并且在一些实施方案中用于两者：从血液分离和计数循环肿瘤细胞(CTC)。
本公开的背景
当癌细胞(循环肿瘤细胞或CTC)从原发癌迁移入外周血和/或淋巴循环时，认为原发癌的转移开始。因此去除这些CTC是重要的。尽管CTC最终可被毛细血管或淋巴结捕集(trap)，但是已知CTC能够通过循环系统移动(travel)多次。
除了出于任何诊断或治疗原因而去除CTC之外，捕获CTC用于分析，包括任何用于药物发现/开发等的实验，也是重要的。因此，从体液捕获CTC用于后面的用途也是重要的。
从血液分离和计数循环肿瘤细胞可以用于临床评估转移癌，也可用于监测各种治疗模式的治疗效果。目前用于从血液分离和计数CTC的技术基于磁珠分离、密度梯度离心和过滤方法，或者其组合。
尽管已显示生物功能化表面(例如选择素CD62)用于捕捉或粘附CTC，这些表面具有如下的缺点，如仅能获得癌细胞的特定部分，和仅能用于特定的时间。而且，蛋白质和其他功能细胞可粘附于生物功能化的表面，这可触发免疫反应。
实施方案概要
本公开的一些实施方案提供了用于如下任意或全部的方法、系统和/或装置：从流体分离CTC，从流体分离污染物(例如任何细胞类型，包括细菌和病毒细胞)，从体液分离CTC/污染物，从血液分离CTC/污染物，和从至少一种未处理和未加工血液中分离CTC/污染物。在任何前述中，本公开的一些实施方案提供的方法、系统和装置不仅用于分离CTC/污染物，而且在进行这些的时候还保持至少一种组分、细胞(例如红细胞、白血球/白细胞、血小板、细菌、病毒)的活力。一些实施方案提供了用于如下至少一种的方法、系统和/或装置：评估、监测和治疗一种或多种癌症。而且，在任何或全部实施方案中，工艺(和用于执行这些工艺的系统和/或装置)可在体外或体内或者同时在体外和体内完成任何或者全部指出的功能性。这种能力，根据一些实施方案，可以帮助如下的至少一种：阻止、预防和治疗疾病，如癌症(和/或其增生)。
因此，本公开至少一些实施方案的目的是捕集和/或捕获体液例如血液样品中的CTC。在一些实施方案中，目的是捕获通过循环系统移动的CTC，从而可以预防或者至少阻止癌症的增生。
捕获可以定义为通过使用滤器从流体分离靶颗粒(例如细胞)，所述滤器通过将靶颗粒保留或结合于膜的表面的至少一种来分离颗粒，所述膜具有预定的厚度并在膜上有具有预定尺寸、形状和布置中至少一种的开孔。根据一些实施方案，捕获可包括将靶颗粒保留和结合于膜的表面的涂层，其可包括例如亲合性体(例如抗体)。
本公开至少一些实施方案的目的是通过体外或体内至少一种从体液(样品，或直接从患者)去除癌细胞以防止、阻止癌的增生(和/或治疗癌症)，并且对体液中任何其他细胞的存在具有最小的不良作用，无论是定量地还是定性地。在一些实施方案中，经过滤的体液可导回入该体液所来源的患者，和/或被储存用于如下任一种：实验、在患者或另一位患者中使用、分析等。
本公开至少一些实施方案的另一个目的是提供用于如下至少一种的方法、系统和/或装置：临床评估和监测对靶向的癌症的治疗效果。
本公开至少一些实施方案的另一个目的是提供实时的、非侵入性的体外液体活组织检查，基本上没有患者血液的物质损失(并且在一些实施方案中，没有患者血液的材料损失)以捕集和/或捕获统计上显著数量的细胞(例如105)，其然后可用于药物试验验证(drug trial validation)、治疗决定、遗传研究和/或其他相关的诊断和/或治疗方法。例如，磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3激酶或PI3K)是涉及细胞功能如细胞生长、增殖、分化、运动、存活和细胞内运输的酶家族，其进而涉及癌细胞。因此，液体CTC活组织检查可用于确定CTC中是否发生了(例如)这些酶的一种或多种的突变。因此，这种确定可用作确定对于患者的恰当治疗的因素。
根据本公开的至少一些实施方案，一个特定的特征是，含有CTC的体液不需要预处理以供过滤，例如，本公开的实施方案不需要富集、稀释、固定(例如固定剂如甲醛)等，从体液捕获或以其他方式分离CTC。已知的用于过滤CTC的现有技术系统都需要一些形式的富集或细胞固定，即，(例如)患者的血液样品的稀释。这种与众不同的特征在体外系统中是特别重要的，因为(例如)将患者血液连续稀释或固定到已知的现有技术系统所必需的程度(例如10:1)是不现实的。本领域的普通技术人员会意识到，相对于能够一次从患者抽取的血量(最大20ml)，这种稀释程度会固有地限制这些系统的功用。因此，与本公开的实施方案相比，这些系统仅能够捕获相对少量的CTC。参见例如“3D microfilter device for viable circulating tumor cell(CTC)enrichment from blood”,Zheng等,Springer Science+Business Media,LLC,2010年10月27日;和“Isolation of circulating tumor cells using amicrovortex-generating herringbone-chip”,Stott等,PNAS,2010年10月26日。所述两个公开通过提述以它们的整体并入本文。
遍及本公开以及权利要求中所述，首字母缩略词CTC(循环肿瘤细胞)可包括如下细胞类型和/或分类的任一种：癌细胞、肿瘤细胞(恶性或良性)和干细胞。在一些实施方案中，CTC还可包括细菌和病毒、污染物和/或任何期望从体液捕获的靶向的颗粒，用于如下的至少一种：储存、分析、实验、诊断、治疗和处理。因此，癌细胞包括任何肿瘤、恶性和/或患病细胞。
而且，短语体液除了涵盖任何身体的体液例如血液之外，在一些实施方案中还可意指任何含有供捕获的癌细胞的样品流体。
在一些实施方案中，一个重要的特征是使体液(例如血液)中含有的大多数，优选地全部或基本上全部的白细胞(其也可以称为白血球，在整个本公开中，该短语可以和白细胞互换使用)通过，并且全部或者基本上全部的通过的白细胞保持活力，同时捕获(或者以其他方式过滤、保持、分离)体液中全部或基本上全部的CTC。在一些治疗性实施方案中，这种功能性能够保持和/或提高患者的免疫系统。
而且，在一些实施方案中，捕获的CTC可与树突细胞(例如来自细胞系)融合以产生杂合细胞，其然后可用于活化患者的免疫系统(即，将融合的CTC/树突细胞放置回患者内)。将杂合细胞给予患者时，预期细胞表达患者的肿瘤特异性抗原谱。在患者的免疫系统具有足够的健康白血球情况下，有更大的机会患者的免疫系统将产生足够的响应以杀死癌细胞。为此，预期需要有至少100,000个杂合细胞以供其发生。因此，根据本公开的一些实施方案的装置可从血液收获相对大量的CTC(例如大于100,000个)。而且，在一些实施方案中，通过如下的至少一种捕获CTC：保留(retention)和与附着于膜表面上的肿瘤特异抗原结合。
在一些实施方案中，提供了融合以从捕获的CTC产生杂合细胞的方法。例如，将具有CTC(例如约100,000或更多)的膜置于细胞融合室的底部上，膜表面(具有CTC)朝上。优选地，将等量的树突细胞供料(导入)室内。树突细胞缓慢沉积在CTC的顶部(通过如下至少一种：重力或者通过膜中的开孔过滤)。接着，施加足够的RF脉冲序列(pulse train)(如本领域已知的)使树突细胞与CTC融合，这导致杂合细胞的形成。例如，将具有细胞的膜置于交变场，例如约250-300V/cm，1MHz(例如)，以使细胞悬液稳定化。接着，施加足够幅度(例如约1500V/cm)和持续时间(例如约30-50μs)的融合脉冲。融合脉冲之后，再次施加相同频率的交变场以在胞质混合和双核杂合细胞周围的膜的重建过程中保持细胞之间的接触。
在一些实施方案中，特别是关于诊断实施方案，使大多数白细胞(如前面指出的，优选基本上全部的白细胞，最优选全部白细胞)通过的特征是一个重要的特征，因为在评估患者的癌症和规划治疗中对捕获的CTC进行DNA分析是关键的。因此，在滤器/膜上具有白细胞是较不理想的。
在一些实施方案中，提供了用于从患者的体液分离CTC同时保留体液中含有的白细胞的方法。该方法包括提供具有过流能力的滤器，使至少含有多个CTC和多个白细胞的体液流过滤器，通过滤器捕获体液中所含的大多数CTC，和使大多数的白细胞通过滤器，其中基本上全部的通过的白细胞保持活力。
在这些实施方案中，例如，捕获的CTC和通过的白细胞中至少一种的大多数选自下组：大于约75%、大于约80%、大于约85%、大于约90%、大于约95%、大于约99%、和大于约99.9%。
此外，在这些实施方案中，将滤器最初优化以捕获第一类型的CTC，体液中存在的第一类型的CTC的大多数被捕获。这种优化可包括用具有预定过滤面积和每单位过滤面积上预定数量和预定宽度的过滤开孔的第一滤器以预定的过滤压力过滤预定量体液的第一样品，通过第一滤器捕获预定量体液中含有的CTC，确定捕获的CTC量，该量与捕获百分比相关，和从预定量体液的第二样品重复过滤CTC，该捕获百分比小于预定的捕获百分比，其中对于随后的重复过滤，对先前重复过滤中的过滤压力、过滤面积、每单位过滤面积上过滤开孔的数量和过滤开孔宽度中的至少一项进行修饰。在一些实施方案中，对于给定的滤器类型，固定的CTC显示更高的捕获效率。
同样地，在一些实施方案中，捕获的未固定的CTC可通过将它们以足够高的压力(例如50-500mbar)推挤通过具有相对窄宽度(例如约3-6微米)的开孔的膜而失活。可施加脉冲，例如约每秒一次，间隔约15分钟以将CTC挤压通过膜开孔，因此可用于在(例如)治疗期间从膜清除由血液捕获的不想要的CTC。在一些实施方案中，优选将脉冲持续时间保持(尽可能)较短，以使对其他血细胞的任何可能的不利影响最小化。因此，本公开还提供了用于使用这个特征从患者的血液捕获CTC的体外系统的一些实施方案。
在一些实施方案中，膜表面上捕获的CTC可使用导电的硼或磷掺杂的金刚石样碳膜(DLC)失活/杀死。这些导电膜可经受相对高的电压脉冲而不会破坏材料，从而生成强自由基(radical)分子，其攻击导电膜表面上存在的所有有机物质。在温和的电压脉冲下，膜表面上存在的CTC会被失活(例如在治疗期间)，而在高电压下驱动时，甚至可以实现膜的完全清洁(例如用于灭菌)。
根据一些实施方案中，滤器包括膜，所述膜具有一定厚度并且包含多个在膜上布置并且穿过膜的开孔。在一些实施方案中，膜的厚度和开孔的宽度经优选配置以捕获大多数的CTC和/或其他污染物，并通过体液中的大多数的白细胞和/或其他“良好”组分并保持其活力。
在一些实施方案中，提供了用于保持和/或增强癌症患者的免疫系统的方法，并包括将预定量的癌症患者的血液流导向滤器，通过滤器捕获血液中含有的大多数CTC，使大多数白细胞通过滤器，其中基本上全部的通过的白细胞均保持活力，和将含有通过的白细胞的过滤的血液导回入患者。与先前的实施方案相似，捕获的CTC和通过的白细胞中至少一种的大多数选自下组：大于约75%、大于约80%、大于约85%、大于约90%、大于约95%、大于约99%、和大于约99.9%。
在一些实施方案中，提供了用于从还至少含有白细胞的体液捕获CTC的系统，并包括泵，具有入口和出口的滤器，在体液来源和滤器之间建立流体联通的第一导管，和在滤器和泵之间建立流体联通的第二导管。滤器经配置以捕获体液中含有的大多数CTC并使大多数白细胞通过滤器，其中基本上全部的通过的白细胞均保持活力。
在这些实施方案中，可另外包括如下的任意和全部：用于确定第一导管内压力的第一压力传感器，和用于确定第二导管内压力的第二压力传感器。泵选自下组：蠕动泵、齿轮泵、螺杆泵(progressive cavity pump)、罗茨泵、文丘里泵、活塞/往复泵、压缩气体/空气泵和前述的任何组合。
在本公开提供的任何系统(甚至是装置组件)实施方案中，也可以包括控制器用于控制操作和/或监测装置/系统的流速和压力的至少一种。
在一些实施方案中，提供了用于从患者的血液捕获CTC的体外系统，并且包括控制器，其任意地包括泵环响应计时器、泵、滤器、在患者血液供应和泵之间建立流体联通的第一导管，在泵和滤器之间建立流体联通的第二导管，和用于提供从滤器流出的流体联通的第三导管。滤器经配置以捕获血液中含有的大多数CTC并使大多数白细胞通过滤器，其中基本上全部的通过的白细胞均保持活力。
在这些实施方案中，第三导管在滤器和患者或容器之间建立流体联通，并可还包括个阀，在那里第三导管提供在滤器和阀之间的流体联通。在更进一步的实施方案中，可以为这种系统提供第四导管，用于在阀和患者之间建立流体联通，在那里将经过滤的血液输送回患者。
这些实施方案可进一步包括至少一个压力传感器，用于监测进入滤器装配体的流体联通的压力，或者至少两个压力传感器，一个压力传感器监测患者与泵之间的流体联通的压力，第二个压力传感器监测泵与滤器之间流体联通的压力。更进一步，这些系统可另外包括第三和第四压力传感器，第三压力传感器监测滤器和阀之间的压力，第四压力传感器用于监测阀与患者之间的压力。
还可以另外提供气泡传感器以感知例如第三导管内体液中的气泡。
本公开的任何和全部实施方案可进一步包括一个或多个计数装置，用于计数或者以其他方式表征捕获的污染物、CTC等。这些计数装置/系统可包括例如：CASY细胞计数器和库尔特计数器(另见，例如美国专利号7738094,7136152,6974692,6350619,5962238,5556764,4296373和3977995；前述参考文献的每一个通过提述以它们的整体并入本文)。
在一些实施方案中，提供了一种利用分离系统从体液分离癌细胞的方法，其中该分离系统包括控制器、用于提供第一定向流速的泵、滤器、在体液来源和滤器之间建立流体联通的第一导管、在滤器装配体和泵之间建立流体联通的第二导管、用于监测第一导管中流体联通的第一压力P1的第一压力传感器、用于监测第二导管中流体联通的压力P2的第二压力传感器、和用于控制至少泵的操作的控制器。该方法可包括以预定的时间间隔测量压力P1和P2，其中对于每一个时间间隔，该方法进一步包括确定P1和P2之间的压力差值，并将该压力差值与预定的目标压力范围进行比较。目标压力范围包括目标压力值±压力滞后值。在这些实施方案中，当输入的压力差值处于目标压力范围内时，泵的第一定向流速被解锁(unchained)，程序返回测量随后的时间间隔的压力P1和P2，当输入的压力差值处于目标压力范围之外时，则确定新的泵流速，并将泵的第一定向流速变为新的泵流速，程序返回测量随后的时间间隔的压力P1和P2。
在这些实施方案中，系统进一步包括泵环响应计时器，其中泵环响应计时器以倒数方式操作，并且新的泵流速的计算包括：当检测到输入压力差值大于目标压力值和压力滞后值之和时，新的泵流速为第一定向泵流速减去流速步长(step size)。而且，当检测到输入压力差值小于目标压力值和压力滞后值之差时，新的泵流速为第一定向泵流速加上流速步长。在这些实施方案中，选择流速步长以消除过调(overshoot)。
在一些实施方案中，提供了用于诊断癌症和/或癌症类型的方法，并包括提供具有过流能力的滤器，使包含至少多个CTC和多个白细胞的体液流过滤器，通过滤器捕获体液中含有的大多数CTC，使大多数的白细胞通过滤器，其中基本上全部通过的白细胞均保持活力，对捕获的CTC进行分析，和确定癌症和/或CTC的癌症类型。
在一些实施方案中，提供了癌症治疗方法，并包括提供具有过流能力的滤器，使包含至少多个CTC和多个白细胞的体液流过滤器，通过滤器捕获体液中含有的大多数CTC，使大多数的白细胞通过滤器，其中基本上全部通过的白细胞均保持活力，对捕获的CTC进行分析，确定癌症和/或CTC的癌症类型，和确定用于所确定癌症的治疗。
在一些实施方案中，提供了用于保持和/或增强患者的免疫系统的方法，并包括提供具有过流能力的滤器，使包含至少多个污染物和多个白细胞的体液流过滤器，通过滤器捕获体液中含有的大多数污染物，使大多数的白细胞通过滤器，其中基本上全部所通过的白细胞均保持活力，和将含有通过的白细胞的经过滤的体液导回入患者。
在一些实施方案中，提供了用于从患者体液分离污染物同时保留体液中含有的白细胞的方法，并包括提供具有过流能力的滤器，使包含至少多个污染物和多个白细胞的体液流过滤器，通过滤器捕获体液中含有的大多数污染物，使大多数的白细胞通过滤器，其中基本上全部通过的白细胞均保持活力。
在一些实施方案中，提供了用于CTC/树突细胞融合的方法，并包括提供具有一定数量CTC的膜，将具有CTC的膜置于细胞融合室的底部，使具有CTC的膜表面朝上，向室内供料至少相应量的树突细胞，其中树突细胞沉积在CTC上，和施加RF脉冲序列(例如见上文)，其中树突细胞与CTC融合以形成杂合细胞。
在一些实施方案中，提供了用于涂布含有膜的CTC滤器的方法，并包括提供具有氮化硅的第一表面的膜，该氮化硅含有Si-H和NH2官能度的至少一种，其中在第一表面上存在氧化硅层。该方法还可包括去除膜的第一表面上的氧化硅层，使氮化硅表面与含有末端烯基或炔基中至少一种的化合物反应，以通过Si-C键直接共价附接于表面。
因此，许多其他的实施方案是可能的，包括多种治疗和诊断实施方案。例如，本公开的一些实施方案包括从体液捕获CTC、遗传分析捕获的CTC、确定癌症类型和/或确定治疗方法。确定治疗方法可为可用于所确定的癌症的任何治疗方法。因此，本公开的实施方案包括用于确定癌症(和/或癌症类型)的方法，用于确定癌症治疗的方法，和用于治疗癌症的方法，其使用例如本公开的一些实施方案的过滤/分离特征。
根据一些实施方案的膜的开孔可为约3μm-约5μm，在一些实施方案中，可包括约5μm-约8μm的宽度。
一个或多个上文提到的关于本文公开的任意和全部方法、系统和装置的实施方案，以及由本公开支持的任何其他实施方案，可以包括一个或多个如下特征：
-优化滤器以捕获第一类型的CTC，并捕获体液中存在的第一类型的CTC的大多数；
-这种优化(如上所述)可包括如下的一种或多种(并优选数种或全部)：用具有预定的过滤面积和每单位过滤面积上预定量和预定宽度的滤器开孔的第一滤器以预定的过滤压力过滤预定量体液的第一样品，通过第一滤器捕获预定量体液中含有的CTC，确定捕获的CTC的量，该量与捕获百分比相关，和从预定量体液的第二样品重复过滤CTC，该捕获百分比小于预定的捕获百分比。对于随后的重复过滤，对先前重复过滤中的过滤压力、过滤面积、每单位过滤面积上滤器开孔的数量和滤器开孔宽度中的至少一项进行修饰。
-膜的厚度和开孔的宽度经配置以捕获大多数CTC，并使体液中大多数的白细胞通过并保留活力；
-体液在流过滤器之前不进行处理；
-体液在流过滤器之前不用固定剂处理；
-方法中捕获的CTC和通过的白细胞中至少一种的大多数选自下组：大于约75%、大于约80%、大于约85%、大于约90%、大于约95%、大于约99%、和大于约99.9%；
-压力传感器确定沿着任何和全部流体导管的压力；
-泵选自下组：蠕动泵、齿轮泵、螺杆泵、罗茨泵、文丘里泵、活塞/往复泵、压缩气体/空气泵和前述的任何组合；
-一个或多个控制器、处理器、监测器、传感器、存储、联通和电路，用于本文公开的任何方法、系统和/或装置的控制操作、报告、联通和/或监测，其藉由模拟方式、数字方式或其组合；
-一个或多个流体导管用于在任何所公开元件(例如，滤器、泵、传感器、容器、患者、阀等)之间建立流体联通；
-一个或多个阀；
-在系统(例如泵、滤器、导管、阀)的任何位置提供的压力和/或气泡传感器；
-在根据一些实施方案的系统/装置中任何位置提供的一个或多个计数装置，用于计数或者表征捕获的CTC、污染物和通过的细胞(例如白细胞)中的至少一种；
-过滤膜，其包括功能化的抗体和/或受体分子，其经配置以附着于一种或多种CTC的至少一部分，其中这些受体分子可配置在两性离子涂层上以避免其他物质的非选择性吸附；
-计时器，例如泵环响应计时器，其中所述计时器以倒数方式操作；
-用于计算新的泵流速的方法、系统和装置，其可包括如下的一个或多个(优选数个或全部)：当检测到输入压力差值大于目标压力值和压力滞后值之和时，新的泵流速为(comprise)第一定向泵流速减去流速步长，和当检测到输入压力差值小于目标压力值和压力滞后值之差时，新的泵流速为第一定向泵流速加上流速步长；和
-可选择流速步长(见上文)以消除过调(overshoot)。
通过参考下文的附图和其后的详细说明，本申请中公开的方法、系统和装置的这些和其他的实施方案、目标和优点将变得更加显而易见。
附图简述
图1图解了根据本公开一些实施方案的用于捕获癌细胞的膜的截面图。
图2A和2B图解了根据本公开一些实施方案的膜，以20倍放大显示在从流体流分离出来之后癌细胞的存在；图2A图解了不具有两性离子涂层的膜的实施方案，而图2B图解了具有两性离子涂层的膜的实施方案。
图3A图解了根据本公开一些实施方案的用于从有限的流体样品分离CTC(和/或其他细胞、污染物等)的系统的示意图。
图3B图解了图3A中所示示意图的示例系统的透视图，用于根据本公开的一些实施方案从有限的流体样品分离CTC。
图4A图解了根据本公开一些实施方案的用于从大量流体样品(例如直接/间接来自患者的显著量的血液)分离CTC(和/或其他细胞、污染物等)的体外系统的示意图。
图4B图解了图4A中所示的示意图的体外系统的透视图，用于根据本公开的一些实施方案从大量流体样品分离CTC。
图5图解了根据本公开的一些实施方案用于控制流体样品(例如体液)流过图3A-B中提供的示例系统的示例的工艺流程。
图6的表格例证了在正常成人组织中发现的上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)的分布(参见，例如，Balzar,M.等,“The Biology of the 17-1A antigen(Ep-CAM),”J.Mol.Med.,77:699-712(1999))。
图7的表格例证了人恶性瘤形成中的Ep-CAM表达(参见，例如，Balzar,M.等,“The Biology of the 17-1A antigen(Ep-CAM),”J.Mol.Med.,77:699-712(1999))。
图8A和8B是根据本公开一些实施方案的具有沿其表面布置的开孔的滤器膜的(不同放大倍数的)放大照片。
实施方案的详细说明
本公开的至少一些实施方案提供了用于分离(其也可以称作捕获或过滤，在本公开全文中分离、捕获和过滤可以互换使用)体液(例如血液)中含有的大多数CTC的方法、系统和装置，其中这些实施方案包括血相容性滤器。这种滤器可包括提供有大量开孔的膜或类似结构(例如微筛/滤器；开孔也可以称作孔)，并且在一些实施方案中，开孔是精确的。也就是说，根据一些实施方案，开孔的容差(tolerance)在如下之内：小于约0.5μm，小于约0.25μm，小于约0.1μm，小于约0.05μm，小于约0.025μm，小于约0.01μm。值得注意的是，在一些实施方案中，膜可为任何具有一定厚度的一般为薄、平的板样结构，包括例如中空纤维、刻痕蚀刻膜(tracked etch membranes)、微机械膜、PDMS膜等；这些材料可为单层的或者是复杂/复合的结构(例如三维的)。
根据一些实施方案，大多数包括，但不仅限于，大于约：50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,99%,99.9%和99.99%，和这些百分比之间的值(用于如下至少一种：捕获CTC和/或其他预定的特定细胞和/或污染物；和使白细胞和/或过滤介质(即体液)的其他重要(vital)组分通过)。
在一些实施方案中，在分离/过滤过程中(对于本公开的实施方案，分离和过滤同义地使用)，膜上提供的开孔对体液中存在的组分和/或正常细胞，特别地对体液中存在的白细胞，无论是定量上还是定性上，均具有最小的影响，而且在一些实施方案中，具有极小的不利影响。而且，至少在一些所公开的实施方案中，过滤体液的结果是如下至少一种：基本上没有溶血，基本上没有血小板损伤和/或活化，和基本上没有白细胞损伤、活化和/或保留发生。在一些实施方案中，体液过滤具有至少一种如下的结果：没有溶血，没有血小板损伤和/或活化，和没有白细胞损伤、活化和/或保留发生，以及补体系统活化、凝固系统活化、血栓(thrombosis)等(例如。用于测试体外血系统的ISO要求)。
在一些实施方案中，定量和定性意指例如红细胞通过膜而溶血小于约1%，小于约0.8%，小于约0.5%，或者小于约0.1%(取决于实施方案)。根据一些实施方案，定量和定性意指例如膜能够保留大多数的CTC，包括例如75%,80%,85%,90%,95%,99%,99.9%和99.99%；并允许大多数的血小板通过，超过约90%，并在其他实施方案中，优选超过：约95%，约99%，约99.9%和约99.99%，和这些百分数之间的数值的血小板通过而无任何明显的血小板活化。而且，在一些实施方案中，定量和定性意指例如膜能够保留CTC并允许超过约95%的白细胞通过，且对白细胞具有最小损伤至基本上没有损伤和/或具有最小的白细胞活化至基本上没有白细胞活化。而且，根据一些实施方案，这些(大多数)百分数可为：约99%，约99.9%，和约99.99%(取决于实施方案)。对于这些实施方案，定性也可意味着通过滤器的大多数白细胞的活力被保留(例如健康的、有功能的)。根据一些实施方案，大多数通过的白细胞包括，但不仅限于，大于约：95%,99%,99.9%,99.99%,99,9999和99.999999%，和这些百分数之间的数值(通常，保留的白细胞的最大数目小于膜中开孔的数目，因为通过的白细胞的实际数目要大许多数量级)。因此，细胞(例如通过的白细胞)的活力可定义为健康的、有能力的和/或良好的细胞，其能够在例如人或动物体内贡献其预期的功能性。
表1.涂覆方法(+意味着有利，-意味着不利)
 要求  SAM   ATRP  浸渍涂覆+固化   CVD+修饰
 共形(conformal)  +   +  -   +
 可控厚度  -   +/-  -   +
 表面独立  -   -  +   +
 无溶剂  -   -  -   +
 处理后粗糙度小  +   +  -   +
 可放缩性(scalability)  -   -  +   +
表1总结了可以得到的用于在氮化硅上施加有机涂层的一些方法实施方案的数个特征。理想地，优选的是，该技术可通过表面独立的和可以放缩的处理过程产生具有可控厚度和低粗糙度的共形涂层。例如自组装单层(SAM)可用于使具有共形有机层的表面功能化。这种方法一般需要形成单层的有机化合物的特异反应性以与预期的表面相匹配。例如，氮氧化硅(silicon oxy nitride)可以用用于单层沉积的有机硅烷功能化或者氢封端的氮化硅可以用烯烃或炔烃功能化。这种处理的缺点包括可放缩性和厚度控制。然而，通过将原子转移自由基聚合(ATRP)用于生长聚合物层可改进厚度控制，尽管这仍然需要表面上特定的反应基团，即ATRP聚合引发剂和基于溶剂的处理。
用于向根据一些实施方案的膜施加涂层的可选工程是浸渍涂覆，其中表面被浸渍于具有单体或聚合物材料的溶液中。去除之后，在表面上留下溶液薄膜并干燥，产生有机材料的薄层，其随后被固化。此过程是底物独立的并可以放缩，但提供对共形涂层和最终膜的厚度的较弱控制。化学气相沉积(CVD)可用于向根据一些实施方案的膜施加涂层。CVD是用于在底物上施加膜的气相过程，并且常常用于无机材料。最近开发出了用于有机膜的CVD的方法，例如等离子体增强的CVD、脉冲等离子体CVD、热丝CVD和引发的CVD。这些方法允许以共形方式沉积具有可控厚度的有机聚合物膜。这些过程的优点在于，它们是表面独立的、无溶剂并且可以放缩。
在一些实施方案中，提供了方法、系统和/或装置，其包括具有开孔的膜，并且其还包括在膜表面上的具有一定厚度的血相容性涂层，优选小于约500纳米。根据一些实施方案的这种血相容性涂层例如在涂层材料和血液之间包括最小的相互作用，且优选不诱导不可控的细胞或血浆蛋白质级联活化(例如通过蛋白吸附)，从而防止血液凝结和血小板聚集。防止形成血凝块和蛋白聚集物是有利的，因为前述会阻碍过滤并不利地影响装置性能。
在一些实施方案中，涂层可为无机材料，如钛、氮化钛、二氧化钛，和/或有机材料。有机材料可为疏水性质的，如聚硅氧烷和PTFE(聚四氟乙烯)或亲水的，如pHEMA(聚-2-甲基丙烯酸羟乙酯)和两性离子聚合物材料(含有带相反电荷基团的聚合物)。同样，含有疏水和亲水单体两者的共聚物产生具有纳米尺寸结构域并具有交替疏水和亲水结构域的聚合物膜是有效的血液接触材料。在一些实施方案中，优选的是涂层是耐久的和可重复使用的，因为已发现公知的PEO(聚氧化乙烯)或PEG(聚乙二醇)涂层相对不稳定，并且已发现这些分子在数天内会由于碳链的进一步氧化而分解。因此，在一些实施方案中，应当避免PEO和PEG涂层。
根据一些实施方案的涂层包括含有两性离子基团的分子，如磷酸胆碱、磺基甜菜碱、羧基甜菜碱、或胺-N-氧化物亚群。根据一些实施方案的用两性离子聚合物以磷酸胆碱、磺基甜菜碱或羧基甜菜碱基团修饰的膜，在溶血和血小板活化方面显示出优异的血相容性，并且还防止膜开孔的阻塞。由于两性离子基团与公知的(稳定化)渗透剂具有紧密的相似性，所以例如三甲基胺-N-氧化物来源的聚合物，即含有N-氧化物基团，也可有效地作为血相容性涂层。
在一些实施方案中，从长久应用方面考虑，血相容性分子被共价附接于膜表面。共价键是一种化学结合形式，其特征为原子间分享电子对。例如，有可能使用硅烷或硅氧烷化学在氮化硅的天然氧化物(native oxide)上共价附接。然而，这些键容易水解，因此关于根据本公开一些实施方案的膜上的耐久表面涂层，通过直接硅-碳或氮-碳键的附接是优选的和/或最佳的。这可以例如通过去除膜顶部上的氧化硅层并使含有Si-H和NH2官能团的裸露的氮化硅表面与含有末端烯烃或炔烃基团的化合物反应，从而通过Si-C键直接共价附接于表面上而实现。该反应可使用表面的热或光化学活化的至少一种，并使表面与来自气相或液相的至少一种(即，纯净的液体化合物和/或溶解的溶剂)的反应物接触而完成。类似地，可将裸露的氮化硅的NH2基团用于有机基团的共价附接(可使用例如卤代烃/卤代烷、醛、酸酐和酸性卤化物基团)，可用于表面功能化。化合物可含有另一种官能团，如烯基、羧酸、酯、酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺或环氧化物，使表面适合于表面的进一步功能化。
根据一些实施方案，以与氮化硅相似的方式，可用含有末端烯烃或炔烃基团的化合物涂布氢封端的金刚石样碳膜，用于通过C-C键直接共价附接于表面。金刚石样碳还可通过例如用氧等离子体处理表面而被功能化，以使表面具有醛和羧基官能团。这种表面可进一步修饰，例如通过将羧酸基团转变成N-羟基琥珀酰亚胺酯或五氟苯酯，适合于用例如抗体将表面进一步官能化。可选择地，可以使用基于胺的等离子体以获得胺封端的金刚石样碳膜。这些胺封端的金刚石样碳膜可与例如卤代烃/卤代烷、醛、酸酐和酸性卤化物基团反应。
与表面共价偶联的聚合物涂层可以通过具有聚合引发剂(例如乙烯基苯甲基氯化物或α-溴异丁酸)的单层，或在用于嫁接聚合物的表面上提供可聚合基团，例如乙烯基、丙烯酸酯或马来酸基团获得。这些经修饰的表面可用于产生聚合物层，即，使基于例如丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺、苯乙烯、乙烯基吡啶、乙烯基咪唑或其他乙烯基单体的单体与亲水的例如两性离子或PEO基团聚合以产生亲水的聚合物层。该聚合可通过例如单体的游离自由基聚合，和/或可控的活性聚合技术，如原子转移自由基聚合(ATRP)或引发的化学气相沉积而完成。在聚合过程中添加交联单体，例如二乙烯基苯或乙二醇甲基丙烯酸酯，也可以有益于获得具有增加的化学和机械稳定性的交联的水凝胶层。
两性离子聚合物可通过首先使单体与两性离子前体官能团，例如叔胺、吡啶、咪唑基团聚合而产生，所述前体随后可通过化学反应变成两性离子基团。这些前体聚合物，例如聚(二甲基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯基吡啶)或聚(乙烯基咪唑)可通过直接在天然氧化物覆盖的氮化硅表面上或者在通过氢氟酸蚀刻去除氧化物而获得的天然氮化硅层上的聚合物沉积而获得，即藉由从溶液聚合例如ATRP，或者气相聚合过程，例如(脉冲的)等离子体聚合或引发的化学气相沉积。可选择地，聚合物可接枝在单层上，从而在表面上提供可聚合的基团，例如乙烯基、丙烯酸酯或马来酸基团。随后，这些聚合物可以通过聚合物中的叔氮原子与例如丙内酯、氯乙酸、溴乙酸、1,3-丙烷磺酸内酯/1,3-丙烷砜(1,3-propane sulfone)、过氧化氢和/或3-氯过氧苯甲酸的化学反应转变成两性离子聚合物。
本领域的技术人员会意识到，根据本公开的一些实施方案，这些耐久的生物或血相容性涂层与上面实施例中提到的膜的组合，除了从血液捕获CTC/污染物之外，还具有同样合适的应用，包括例如血浆提取，白细胞分离，水、食品、饮料和健康传播微生物污染物的计数技术(enumeration techniques)，所述健康传播微生物污染物如军团菌属(Legionella)、沙门氏菌属(Salmonella)、大肠杆菌(E.coli)、李斯特菌属(Listeria)以及血液传播细菌和病毒感染。在一些实施方案中，多孔氮化硅或金刚石样碳膜上的两性离子涂层也可以用于如下应用，例如用作喷嘴板上的亲水防垢涂层，用于乳化、吸入、涂点(spotting)、喷墨和其他喷洒用途。
有利地，在一些实施方案中，为了从样品流体选择性捕获污染物，在膜表面(或者如果膜的表面上提供有涂层的话，在涂层表面)提供有抗体，或者更一般地说，亲合体或受体分子，与生物相容性涂层组合。该涂层减少非靶标物质的非特异性结合和/或增强检测的选择性。
例如，一部分或大部分膜表面积(具有或不具有涂层)可用能够粘附于至少一部分CTC的抗体(例如CD326)覆盖。在这种情况下，目的是使CTC与表面通过附接于附着在具有官能团如醛、胺、酯、氨基、N-羟基琥珀酰亚胺或环氧化物的表面上的小引物(primer)而产生共价连接。这还可以与例如如上所述的血相容性涂层组合而完成。
在本公开的一些实施方案中，提供了膜(其在下文中也可以称作滤器、CTC滤器、分离膜和/或分离装置)，其能够接收具有CTC(或用于捕获的其他污染物)的流体流。这种体液可包括约5毫巴.秒的粘度(例如血液)，该膜在100帕压力下能够以约1ml/min/cm2膜面积过滤。因此，对于粘度比水高至5倍的流体，约1cm2膜面积在100Pa (即1mbar)的压力下能够过滤至少3ml/min。在一些实施方案中，提供了膜，其能够以高达约10ml/min/cm2或者更大的流速从血液去除CTC(或其他类似的污染物)。在一些实施方案中，对于粘度为约5毫巴.秒的体液，在约4托的压力下通过约9mm2的膜面积，膜的过流能力可大于约40ml/小时，产生约1ml/min/cm2的流速。在12托9mm2为5ml/小时。因此，这些实施方案能够使小型化的分离装置对于体内和体外应用的至少一种具有高通过量。
在一些实施方案中，膜中的开孔可为圆形的，呈狭缝状，以及其他有利于捕获CTC(和/或其他有害组元/细胞)和使必需的和/或健康的组分通过的之一或两者的形状。在一些实施方案中，狭缝比其他形状的开孔具有更大通过量(即单位时间内通过给定表面的单位面积的流体的量)的优势。在一些实施方案中，当膜的开孔包括小于约8微米的直径(即宽度)时，可改进CTC的分离，并且在一些实施方案中，如果开孔小于约5微米，则获得甚至可加改进的分离结果。在一些实施方案中，狭缝包含一般具有长度和宽度且长度大于宽度的形状，并可包括例如约10:1(长度比宽度)的纵横比，在这些实施方案中，可以实现圆整或尖锐的角(corner)。在一些实施方案中，这些狭缝可包含一般地长方形形状，这些长方形形状的角可包括半径。在本公开的其他实施方案中，包括可为椭圆形的狭缝。
在一些实施方案中，当膜的孔隙率(开孔的合并的表面积与包含开孔的膜的总表面积的比值)为至少25%时，可实现白血球(即白细胞)活化和/或保留、血小板活化和溶血的充分最小化。另外，在一些实施方案中，当膜上两个开孔之间最近的中心与中心距离小于开孔直径(宽度)的约2倍时，可获得高操作通过量，这样能够对于小型化的分离装置使用高通量的膜。
根据一些实施方案，膜可以保留超过约85%的CTC，甚至当过滤未经处理(例如未稀释、未处理、未固定等)的血液时亦如此。本领域的技术人员会意识到，在一些实施方案中，当膜的厚度为膜中开孔宽度的约1%-约30%，和优选约5%-约25%时，已观察到预料不到的优点；例如在一些实施方案中，为小于约0.5μm-约2.5μm(例如对于约5μm-10μm的开孔)；并且在一些实施方案中，为约0.1μm-约0.5μm。这样，在这些实施方案中，当膜包括这样的厚度时，红细胞和白细胞的通过均更快。还显示这种厚度有助于下列至少一种的最小化：溶血、白细胞活化和/或保留、和血小板活化。这些优点可以理解为是由于在上述厚度范围内细胞越过膜的开孔的次数增加导致的，因为例如使对通过开孔的细胞的负面影响最小。
因此，在一些实施方案中，白细胞的通过可不仅取决于孔或开孔的大小、形状和/或数量(例如每单位膜面积的数量)，还取决于膜的厚度。如上所述，当膜的厚度为开孔宽度的约例如5%-约25%时，已观察到白细胞在相对低的跨膜压力通过开孔(从而通过膜)的通过时间更短。在这些实施方案中，对于宽度为约3-8微米的孔或狭缝(即开孔)时，甚至在低至约1-10mbar的跨膜压力下，基本上全部的白细胞(并且在一些实施方案中，全部的白细胞)均能够通过膜中的开孔，同时已发现对于CTC(例如上皮癌细胞)的基本上保留(并且根据一些实施方案，完全保留)。而且已经发现，通过的白细胞均保持活力。
在一些实施方案中，提供了具有可控内应力的膜。这些膜通过薄膜沉积方法制造，所述方法使(膜的)内应力在室温下小于(例如)材料的最大屈服应力的约10%。
根据本公开一些实施方案的方法、系统和装置的一个特定的特征是，在使含有CTC的流体(体液或其他)流动通过膜进行分离时，CTC不会补集在膜的开孔/孔内，而是沿着膜的表面(或者如果存在膜的涂层，则在涂层上)排列(end up)。这种特征能够容易地从流体中去除CTC。在一些实施方案中，这种效应可以理解为可得到的低粘性(即更滑的)白细胞的结果，其防止CTC紧密靠近开孔入口—这至少在开孔小于约5微米，更具体地，约3-约5微米的实验中已经观察到。这种透过和保留结果通常是使用由已知聚合物制成的相对厚的膜所无法获得的，如聚酯、聚碳酸酯、聚酰亚胺、尼龙和聚对二甲苯(parylene)。对于较厚的膜，已观察到开孔的基本阻塞，特别是被白细胞。因此，在一些实施方案中，这些聚合物材料的特征是相对小的杨氏模量值，即杨氏模量小于10GPa和/或屈服强度小于1GPa，并且一般不适合于制造根据本公开一些实施方案的机械稳定且薄的膜。因此，在一些实施方案中，由杨氏模量大于约10GPa和屈服强度大于约1GPa的材料制造膜。这样，可以制造具有高压力强度的机械稳定且相对薄的膜，甚至是厚度仅为数百纳米，更具体为约50-约500纳米的膜。根据一些实施方案，用于去除CTC的系统和/或装置包括至少一个膜(其可包含在滤器组件和/或外罩中)、用于接收来自患者的体液的入口、和用于将这些“经过滤的”体液输回患者的出口。
作为CTC的实例，可以参考Ep-CAM。图6和7图解了Ep-CAM在正常(图6)和癌组织(图7)中的分布。如文章“The Biology of the 17-1A antigen(Ep-CAM)”Balzar,M.等1(Balzar,M.等,“The Biology of the 17-1A antigen(Ep-CAM)”,J.Mol.Med.,77:699-712(1999)，此参考文献通过提述以其整体并入本文)中指出的，Ep-CAM在成人体内是严格的上皮分子，并且在所有简单、假复层和移行上皮(transitional epithelia)的基底外侧细胞膜处检测到。Balzar文献于702。许多癌瘤表达高水平的Ep-CAM(见图7)。Balzar文献于704。
图8A和8B是根据本公开一些实施方案的膜的放大照片。因此，显示膜800a,800b(以不同放大倍数，图8B的放大倍数更大)，具有(例如)有序的狭缝形状的开孔(例如)802a,802b，其中角可包括半径。
实施例1
参考图1，使用单晶硅晶片1，制造富硅氮化硅膜，具有孔尺寸为5微米的开孔(见图1)。氮化硅膜包括厚度为400纳米的层2，其通过例如低压化学气相沉积过程(LPCVD)沉积在750μm厚的抛光的硅晶片1上，导致相对低的内拉伸应力(例如，通过在沉积过程中以可控的方式选择硅和氮化物的比例)。在一些实施方案中，所获得的富硅氮化硅层的弹性模量为约290GPa，屈服应力为约4GPa。接着，通过旋转涂覆形成光敏层3。该层用直径为约5微米的孔4绘图(patterned)，并通过将膜通过(例如)光掩模暴露于UV光而产生。光敏层3、4中的图形通过例如反应离子蚀刻(RIE)转移到氮化硅膜5上/内，从而在膜中形成开孔5。最后，用深度反应性离子蚀刻(根据一些实施方案)对单晶100硅体进行各向异性蚀刻形成大通孔6。可选择地，用热丝化学气相沉积方法和硼掺杂的乙基醇前体可以获得硼掺杂的金刚石样碳膜(DLC)。DLC膜中孔的蚀刻可以用二氧化硅掩模进行。所得DLC膜的典型数值包括弹性模量大于约100GPa，和屈服应力大于约2GPa。
然后向经过处理的硅晶片提供约30纳米厚的两性离子涂层，例如其具有用已知化学方法获得的磺酸甜菜碱基团，并共价附接于氮化硅。然后，用氧等离子体处理该经加工的晶片，随后与约2.5%溶于乙醇的(3-三甲氧基甲硅烷基)丙基2-溴-2-甲基丙酸酯的烷氧基硅烷溶液反应约2小时。然后，将晶片从溶液中取出，并用乙醇冲洗，和在氩气流下干燥。然后用例如原子转移自由基聚合从表面接枝聚合物。溶于异丙醇/水(3/1)中的磺酸甜菜碱甲基丙烯酰胺单体和联吡啶配体的溶液用氩气吹干20分钟，并在氩气氛下添加于CuBr。将含有单体和配体的CuBr溶液添加到引发剂涂布的晶片(在氩气氛下)，并允许聚合反应进行3个小时。将晶片从溶液中取出，用洁净的温水/异丙醇混合物冲洗，并在氩气流下干燥。可选地，经加工的硅晶片提供有厚度为约10-50纳米的二氧化钛涂层。将完成的晶片切成芯片，各具有约(例如)10x 25mm的尺寸。每个芯片含有约125万个直径为约5微米的孔。
因此，在用于从流体去除CTC的方法中，向来自健康志愿者的500ml血液中有目的地添加1,500个前列腺上皮癌细胞(肿瘤细胞)，并使用过滤模块以终端模式在低压下将其挤压通过上述滤器(例如包含根据本文公开的一些实施方案的膜，例如200a,200b的组件或模块；这些膜可为包(package)，和/或称作滤器、膜和/或膜芯片)之一约15分钟。测量的通过的血液的溶血小于0.1%，通过的白细胞大于99.9%，且血小板的回收大于99.999%。然后，将膜芯片从模块中移出，将膜处/上收集的细胞重悬于400μl含有UV可激发的核酸染料DAPI(分子探针)和用荧光染料Cy3标记的细胞角蛋白单克隆抗体(鉴定上皮细胞)的缓冲液中。洗涤步骤之后，膜芯片在20x放大倍数下观察到肿瘤细胞204a,204b的存在(参见，例如图2A)。使用荧光显微术鉴定至少1,450+/-50个细胞。观察到氮化硅膜没有自发荧光，膜是平的且容易进入显微镜的焦平面。在此实施例1所用的实施方案中，膜开孔202a,202b中不存在白细胞(参见，例如图2A)可归因于使用了(例如)两性离子涂层，若没有这个涂层，在许多膜开孔中可存在白细胞202b。
因此，如上面的实施例所例证的，本公开的一些实施方案还提供了分离和计数CTC的方法、系统和装置，并特别地，使用例如薄而机械平坦且稳定的膜还能够用于诊断或者在治疗处理过程中使用。通过使用已用能够附接于CTC的抗体(例如CD326)功能化的膜，可进一步优化细胞计数。
实施例2
CTC计数。向来自健康志愿者的8ml血液中有目的地添加约10个前列腺上皮细胞，并使用过滤模块以终端模式在4托的低压下使其流过具有20,000个狭缝状孔(5x 10微米)的3mm x 3mm膜芯片约15分钟。过滤之后，膜芯片用10ml PBS以终端方式洗涤。接着，使用2%甲醛PBS溶液处理5分钟以固定捕获的细胞。进行后续的洗涤。
-用10ml PBS洗涤
-用1ml 0.2%Triton X-100PBS溶液洗涤，以诱导细胞渗透性；
-用BSA阻断剂洗涤，以防止抗体的非特异性吸附；
-用1ml抗-CD45溶液(50μl的CD45-APC储液溶于1ml PBS中)洗涤；
-10ml PBS洗涤步骤
-1ml抗-细胞角蛋白(50μl抗-CK-PE储液溶于1ml PBS中)
-10ml PBS洗涤；
-1ml DAPI溶液洗涤；和
-10ml PBS洗涤。
然后，将膜保存在4℃直至成像。使用荧光显微术，发现所有添加到血液样品中的前列腺癌细胞均被回收。
实施例3
用于基因治疗的CTC富集。使用过滤模块以终端方式将来自患者的血液(8ml)进料通过具有40,000个狭缝形孔(具有约3x 10微米的尺寸)的膜芯片约15分钟，以收集约10个CTC。为了对收集的CTC进行DNA分析而不干扰健康血细胞的其他DNA，通过一个或多个如下的步骤控制膜滤器上或其中的细胞：
-用10ml PBS中以末端模式洗涤膜滤器；
-将捕获的细胞置于低渗溶液中以允许细胞溶胀。孔内部的细胞(通常是白细胞)被捕集，而膜顶部上的CTC则可以被冲洗出，非常容易地洗脱用于进一步的DNA分析；
-膜滤器提供有抗粘涂层(PTFE,TiO2,两性离子,PEO,HEMA)，以使用收缩细胞的超渗溶液将所有位于孔中的白细胞推出；和
-用具有以磁珠AB标记的选择性标记固定白细胞。
-膜滤器提供有与CTC偶联的EPCAM(CD326)的磁珠。接着使用磁力将CTC从膜表面移走用于进一步的研究。
实施例4
患者血液的CTC清除。使用体外过滤模块以终端模式将来自患者的血液通过膜芯片或者膜芯片阵列，其累积表面积为约10cm2，并具有狭缝形状的孔(例如在此情况中，狭缝形状的孔大小为3x 10微米)约60分钟，以收集几乎全部的患者CTC。在12托的跨膜压力下，患者血液的平均流速为2.0升/小时/10cm2。因此，在临床或流动设施中也可以进行长时间(例如1-2小时)，其能够清除患者整个血量的CTC。根据具体的要求，在此过程中可以添加抗凝剂，如本领域已知的(参考血浆交换术)，尽管如本公开较早前提到的，在一些实施方案中是不需要的。在长期进行之后，可以这种方式获得显著量的CTC用于基因治疗和其他治疗模式。
一般地，利用根据本公开一些实施方案的膜进行的细胞分离可通过如下的至少一种(并在一些实施方案中是数种，并且在一些实施方案中是全部)加以确定：开孔的直径/尺寸、膜的厚度和在膜上安排的开孔/孔的密度(以及其他的特征)，并由细胞与材料表面之间的生物化学相互作用加以确定，包括例如细胞在膜表面上的粘附能力和/或使用涂层的所述能力。
在本公开的一些实施方案中，提供了使用如上讨论的用于捕获和/或收集CTC的一种或其他CTC收集芯片的自动系统。这些系统包括控制程序(其也可以称作控制算法)，其具有预定的输入、输出和控制参数。图5图解了根据本公开一些实施方案的控制程序的概要图(high-level diagram)。
图3A-B和4A-B是根据本公开一些实施方案的用于捕获CTC的示例系统的示意图和透视模型图，其包括根据本公开一种或其他的所述CTC滤器实施方案的CTC滤器。图3A-B图解了系统300，其包括有限流体样品310(例如血液)，其可以提供在样品容器(例如如图3B中所示的注射器体(syringebody))中，通过流体导管312与滤器组件330流体联通，该滤器组件330包括用于从样品分离CTC的CTC滤器(例如参见图1)，用于监测进入CTC滤器的输入压力的第一压力传感器320，其以沿流体导管312的一部分提供的流体流方向位于CTC滤器330的前面(其包括例如根据一些实施方案的膜)，用于监测来自CTC滤器的输出压力的第二流体传感器340，其以沿流体导管342的一部分的流体流方向位于CTC滤器的后面，和注射泵350。注射泵向流体导管342的端部施加负压，以将含有CTC的流体样品抽出样品容器，并通过CTC滤器和多个流体导管以及压力传感器，然后作为经过滤的流体收集在注射泵的容器(例如注射器体)内。还提供了多种电子器件360(图3A中未显示)，包括(但不仅限于)控制器、处理器、调节器、电路、传感器、通信(例如wifi,蓝牙,细胞和/或导线连接-例如以太网(Ethernet))、存储器和电源(例如电池、AC和/或DC电源)，下文称为多种电子器件(其可为一种或多种所述的部件，但不仅限于这些所述的部件)；这些可以如图3B所示布置在例如隔间(compartment)内。可将多种电子器件提供至如下的至少一个：监测器、控制器、通讯(输入和/或输出系统)和系统的电源。本领域的技术人员会意识到，可以使用其他类型的泵抽吸和过滤流体样品，包括但不仅限于，蠕动泵、齿轮泵、螺杆泵、罗茨泵、文丘里泵、活塞/往复泵、压缩气体/空气泵和类似物。
图4A-B图解了根据一些实施方案的体外系统400，用于从直接来自患者的患者血液中除去CTC。在一些实施方案中，这种系统可以用于从基本上全部的患者血液(并且优选全部的患者血液)去除CTC。因此，来自患者的体液402(例如血液)沿流体联通路径404导向泵408(例如蠕动泵、齿轮泵、螺杆泵、罗茨泵、文丘里泵、活塞/往复泵、压缩气体/空气泵等)。沿流体导管以流动的方向在泵之前提供压力传感器406，用于监测压力P1(CTC滤器的输入压力)，沿流体导管411以流动的方向在泵之后提供压力传感器410，用于监测压力P2(CTC滤器的输出压力)。然后，将体液402导向CTC滤器412，其中将CTC从流中去除。之后，将血液通过导管414返回至患者。沿导管的部分中(例如沿导管414)可提供至少一个气泡传感器413，并且在一些实施方案中，可以提供两个这样的气泡传感器。压力传感器420提供压力P3的指示，而压力传感器424提供压力P4的指示。在一些实施方案中，在压力传感器420和424之间，可提供阀426(例如管夹截流阀(pinch shutoff valve))。从该点，将经过滤的体液导回至患者用于并入到患者体内(例如进入患者的血流)。还可以提供支路428以引导全部或部分液流围绕滤器流动。如图3A-B所示的实施方案所述，可将多种电子器件提供至如下的至少一种：监测器、控制器、通讯(输入和/或输出系统)和系统的电源。
根据这些实施方案，例如，图3A-B中所示实施方案：
-可在CTC滤器(例如滤器芯片)的输入侧以mm Hg测量输入压力；
-可在CTC滤器/芯片(其例如在有限样品系统中可在泵之前；例如参见图3A-B)的输出侧以mm Hg测量输出压力；
-压力差值是计算的通过滤器输入和输出压力传感器(例如320、324)测量的压力的差
-目标压力值是在分离工艺过程中待实现并且优选保持的跨CTC滤器/芯片的压力差；
-压力滞后值是泵流速调节之前允许的跨CTC滤器/芯片的绝对压力偏差；
-环响应计时器值代表连续自动控制过程执行之间的最小时间；一般地，当初始自动控制过程完成时，计时器启动，在执行任何进一步的过程之前终止；
-流速步长是自动控制过程执行的连续执行之间对泵流速值进行修改的值；和
-泵流速值是用于设定系统泵流速的自动控制过程输出。
因此，在一些实施方案中，用于分离(即过滤)出CTC的自动控制过程的重要功能是保持恒定的跨CTC滤器的压力差。为了这个目的，根据一些实施方案的CTC控制过程能够通过执行至少多个如下步骤并且在一些实施方案中执行全部的如下步骤来实现这种功能性。图5图解了该控制过程的实施方案。
含有CTC的体液被该系统处理。以预定的时间间隔以mm Hg测量滤器输入和滤器输出压力(即通过输入压力传感器320和通过输出压力传感器340)。利用这些值，计算压力差值。然后将输入压力差值与计算的(预定的)目标压力范围进行比较。目标压力范围可包含或组成为目标压力值±压力滞后值。如果输入压力差值在目标压力范围内，则CTC控制过程终止而不对泵流速值进行修改并跳转回步骤1；否则按照如下定义的计算新的泵流速值。
如前所述，CTC控制过程的目的之一是确定，并且如果需要，更新为新的泵流速值，从而使系统维持基本上恒定的跨CTC滤器压力值而无过调~即不过超过目标压力差值多于特定的百分比(或停滞)。为此，泵流速值优选以周期基础更新，以使压力过调最小。为了实现这个目的，CTC控制过程的执行可根据泵环响应计时器内设置的值加以限制。该计时器向零倒数，意图(根据一些实施方案)限制和/或阻断控制过程的执行。一旦计时器终止，控制过程发动并初始确定压力误差范围及其相应方向(即正向或反向)的至少一个(并优选两者)。一旦计算出压力误差和/或方向，CTC控制过程即根据如下数学公式之一确定新的泵流速值：
方程式(1)：压力差值>(目标压力值+压力滞后值)。在方程(1)的情况下，当前泵流速值将减去流速步长。
方程式(2)：压力差值<(目标压力值-压力滞后值)。在方程(2)的情况下，当前泵流速值将加上流速步长。
在一些实施方案中，选择流速步长以消除过调，尽管这可能导致压力振荡。完成时，泵的控制器用更新的泵流速值更新，其对实际的泵速度进行更新。然后重复该过程。
在一些实施方案中，所提到的CTC控制过程基本上避免(并优选完全避免)血液的溶血和膜的开孔/孔被白细胞阻塞。还值得注意的是，在一些实施方案中，用于从血液过滤CTC的方法、系统和装置可以在具有或不具有抗凝剂(例如肝素、柠檬酸盐)的条件下操作。
本公开的一些实施方案提供了用于给定血量的具有预定的孔数的膜。在这些实施方案中，能够确保当CTC偶然停在开孔上方时，只有不显著数目的开孔被(CTC)阻塞。例如，捕获10,000个CTC可能需要超过100万个孔。
根据多种实施方案列出的任何百分数(例如捕获的CTC、通过的白细胞等的大多数)还包括所列这些之间的百分数。
尽管一些实施方案已描述为单流系统，但所提供的多种实施方案的平行和系列设置也在本公开的范围内。因此，通过利用平行流设置，可以缩短用于从体液捕获(例如)CTC的处理时间。而且，还可以提供系列设置，用于捕获至少一种类型的CTC(和/或污染物、细胞等)，和顺序的滤器设置(subsequent filters setup)，以捕获至少一种类型的CTC，和/或其他类型的CTC和/或污染物。因此，这些特征可为任何所公开实施方案的一部分。
本文公开的多种实施方案(例如体外系统)的实施可以利用控制器和其他电子装置/处理器实现，包括例如数字电路、集成电路、特殊设计的ASIC(应用特异性集成电路)、计算机硬件、固件、软件和/或其组合。这些实施方案可包括在一种或多种计算机程序中实施，其能够在包含至少一个可编程处理器的可编程系统上执行和/或翻译，其可用于特殊或一般目的的偶联，以从存储系统、至少一个输入设备和至少一个输出设备接收数据和指令，并向其发送数据和指令。
这些计算机程序(也称作程序、软件、软件应用或代码)包括用于例如可编程处理器的机器指令，并可以用高级过程的和/或面向对象的编程语言，和/或用汇编/机器语言实施。如本文所使用的，术语“机器可读介质”是指任何计算机程序产品、装置和/或器件(例如磁盘、光盘、存储器、可编程逻辑器件(PLD))，用于向可编程处理器提供机器指令和/或数据，包括接收机器指令作为机器可读信号的机器可读介质。术语“机器可读信号”是指用于向可编程处理器提供机器指令和/或数据的任何信号。
为了提供与用户(例如患者、医护人员)的界面，一些实施方案可包括通过具有用于向用户显示信息的显示器(例如CRT(阴极射线管)或LCD(液晶显示)监视器等)和用户可以向计算机提供输入的键盘和/或点击设备(例如鼠标或轨迹球)的计算机实施。例如，这种程序可以通过分配单元、远程控制、PC、膝上电脑、智能手机、媒体播放器或个人数据助理(PDA)存储、执行或操作。其他类型的装置也可以用于提供与用户的交互；例如提供给用户的反馈可为任何形式的感官反馈(例如视觉反馈、听觉反馈或触觉反馈)；并且来自用户的输入可以任何形式接收，包括声音、言语或触觉输入。
本公开的一些实施方案可以在计算系统和/或包括后台组件(back-endcomponent)(例如数据服务器)，或包括中间组件(例如应用服务器)，或包括前台组件(例如具有图形用户界面或Web浏览器的客户计算机，用户可通过其与本文所述的主题的实施进行交互)，或这些后台、中间或前台组件任何组合的装置中实施。系统的组件可以通过任何形式或媒介的数字数据通讯(例如通讯网络)相互连接。通讯网络的实例包括局域网(LAN)、广域网(WAN)和互联网。
因此，根据上述一些实施方案的计算系统可以包括客户和服务器。客户和服务器一般地彼此距离遥远，并通常通过通讯网络交互。客户和服务器的关系通过在各计算机上运行并且彼此具有客户-服务器关系的计算机程序发生。例如，“在手头”没有控制器的患者可以通过互联网施用和控制本文所述的多种方法、系统和装置实施方案的某些功能。其他的实施方案包括如下的方法、系统和装置，其包括医生或医护工作者，其位置远离患者(和系统/装置)但仍然能够通过互联网或数据服务器监测、操作和从装置接收数据，例如身在美国的医生能够与位于海外的装置和患者通讯。
任何和全部对于出版物或其他文献的提及包括但不仅限于本申请中提供的专利、专利申请、文章、网页、书籍等通过提述以它们的整体并入本文。
尽管上文详细描述了许多实施方案，但是其他的实施方案和对所公开实施方案的修改是可能的。例如，附图中所示的和本文描述的逻辑流程并不需要所示的特定顺序或者次序以实现期望的结果。
值得注意的是，多种公开的实施方案中的任何和全部特点和任何和全部功能性可在各种实施方案之间进行混合和匹配以提供其他的实施方案，其可在所附权利要求的一个或另一个的范围内，和/或在随后在本专利申请中提供的和/或随后在相关申请中提交的权利要求的范围内。因此，应当理解，本文描述的实施方案和实施例只是出于举例说明的目的，并提示本领域的技术人员进行多种和许多修改，并包含在本申请的公开范围内。尽管至少一些公开的实施方案包含在所附权利要求的范围内，但是申请人还在本申请和要求本申请的利益的后续申请之一或两者中保留为本公开要求其他权利要求的权利。这些权利要求可包括与所附权利要求相似的权利要求，包括目前要求保护的这些实施方案的更广的方面，以及由本公开公开的、教导的和/或以其他方式支持的其他任何和全部方面、实施方案和发明。

Claims (36)

1.一种用于从还至少含有白细胞的体液中捕获CTC的分离装置，该装置包括滤器，其经配置以捕获体液中含有的大多数CTC并使大多数白细胞通过该滤器，其中基本上所有通过的白细胞仍保留活力。
2.权利要求1的装置，其中所述滤器包括膜，其具有一定的厚度和多个排列在所述膜上并穿过所述膜的开孔。
3.权利要求2的装置，其中所述膜的厚度和开孔的宽度被配置成使体液中的大多数白细胞通过并保留活力。
4.权利要求1的装置，其中捕获的CTC和通过的白细胞中至少一种的大多数选自下组：大于约75%、大于约80%、大于约85%、大于约90%、大于约95%、大于约99%、和大于约99.9%。
5.权利要求2的装置，其中所述开孔的宽度为约3μm-约5μm。
6.权利要求2的装置，其中所述开孔的宽度为约5μm-约8μm。
7.权利要求2的装置，其中所述膜的厚度为开孔宽度的约5%-约25%。
8.权利要求1的装置，其中所述滤器允许体液中存在的红细胞通过，而溶血小于约1%。
9.权利要求1的装置，其中所述滤器允许超过约99%的白细胞通过并且基本上所有通过的白细胞均保持活力。
10.权利要求1的装置，其中所述滤器允许超过约99.99%的白细胞通过并且基本上所有通过的白细胞均保持活力。
11.权利要求2的装置，其中所述膜进一步包括血相容性或生物相容性涂层。
12.权利要求11的装置，其中所述涂层的厚度小于约500纳米。
13.权利要求11的装置，其中所述涂层包括无机材料。
14.权利要求13的装置，其中所述无机材料选自下组：钛、氮化钛、二氧化钛，及其组合。
15.权利要求11的装置，其中所述涂层包括有机材料。
16.权利要求15的装置，其中所述有机材料选自下组：聚硅氧烷、PTFE(聚四氟乙烯)、pHEMA(聚-2-甲基丙烯酸羟乙酯)及其组合。
17.权利要求15的装置，其中有机材料涂层与膜表面共价附接。
18.权利要求11的装置，其中所述涂层选自下组：具有或者没有两性离子基团的聚(丙烯酸酯)、聚(丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚苯乙烯、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)。
19.权利要求18的装置，其中所述两性离子基团选自下组：磷酸胆碱、磺基甜菜碱、羧基甜菜碱、胺-N-氧化物亚群(sub group)及其组合。
20.权利要求1的装置，其中所述滤器上提供有受体分子。
21.权利要求2的装置，其中所述膜包括两性离子涂层，并且在所述涂层上提供有受体分子以避免非选择性吸附其他物质。
22.权利要求1的装置，其中所述滤器的过流能力(flow capacity)对于粘度为约5毫帕-秒的体液在约100帕斯卡的压力下为大于约1ml/min每cm2滤器面积。
23.权利要求1的装置，其中所述滤器的过流能力对于粘度为约5毫帕-秒的体液在约4托的压力下为大于约40ml/小时每9cm2滤器面积并且滤器中开孔的宽度为小于或等于5微米。
24.权利要求1的装置，其中所述滤器的过流能力对于粘度为约5毫帕-秒的体液在约12托的压力下为大于约5ml/小时每9cm2滤器面积并且滤器中开孔的宽度为小于或等于3.5微米。
25.权利要求18的装置，其中所述两性离子基团包括通过将单体与两性离子前体官能团聚合产生的两性离子聚合物。
26.权利要求2的装置，其中所述开孔的合并面积相对于膜的总面积为至少约25%。
27.权利要求2的装置，其中在膜的至少一部分上的两个开孔之间的最近距离小于开孔宽度的约2倍。
28.权利要求2的装置，其中所述膜包括无机材料，其具有如下至少之一：杨氏模量大于约10GPa和受控的内应力。
29.权利要求2的装置，其中基本上所有捕获的CTC不会被捕集在膜的开孔中。
30.权利要求2的装置，其中基本上所有捕获的CTC沿膜的表面保留。
31.权利要求2的装置，其中所述膜包括涂层(和/或具有受体分子)并且其中CTC沿涂层的表面保留。
32.权利要求2的装置，其中所述膜包括具有受控的内应力的富硅氮化硅(silicon rich silicon nitride)。
33.权利要求2的装置，其中所述膜包括金刚石样碳材料(DLC)。
34.权利要求2的装置，其中所述膜包括具有大于约10GPa的杨氏模量和大于约1GPa的屈服强度的材料。
35.一种用于从体液分离CTC同时保留体液中含有的白细胞的方法，该方法包括：
提供具有一定过流能力的滤器；
使包含至少多个CTC和多个白细胞的体液流过所述滤器；
通过所述滤器捕获体液中含有的大多数CTC；和
使大多数白细胞通过所述滤器，其中基本上所有通过的白细胞均保持活力。
36.权利要求35的方法，其中捕获的CTC和通过的白细胞中至少一种的大多数选自下组：大于约75%、大于约80%、大于约85%、大于约90%、大于约95%、大于约99%、和大于约99.9%。
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