JP2022043195A - マイクロ流体デバイスにおけるtリンパ球の選択及びクローニング - Google Patents
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Abstract
【課題】マイクロ流体デバイスにおいてTリンパ球を増殖させる方法が提供される。【解決手段】本方法は、1個以上のTリンパ球をマイクロ流体デバイスに導入することと、1個以上のTリンパ球と活性化剤とを接触させることと、1個以上のTリンパ球が少なくとも1ラウンドの有糸細胞分裂を行うことを可能にするのに十分な時間の期間にわたり、マイクロ流体デバイスを通して培養培地をかん流させることとを含み得る。増殖は、非特異的又は抗原特異的であり得る。開示された方法に従って産生されたTリンパ球も、対象における癌を治療する方法と共に提供される。癌を治療する方法は、対象から得られた組織サンプルからTリンパ球を分離することと、分離されたTリンパ球をマイクロ流体デバイスにおいて増殖させることと、増殖されたTリンパ球をマイクロ流体デバイスから搬出することと、増殖されたTリンパ球を対象に再導入することとを含み得る。【選択図】図1A
Description
関連出願の相互参照
本出願は、米国法典第35編第119条の下、2016年3月17日出願の米国特許出願第62/309,454号、2016年4月22日出願の米国特許出願第62/326,667号、2016年10月24日出願の米国特許出願第62/412,212号及び2017年3月13日出願の米国特許出願第62/470,744号(それらのそれぞれの開示全体が参照により本明細書に援用される)の利益を主張する。
本出願は、米国法典第35編第119条の下、2016年3月17日出願の米国特許出願第62/309,454号、2016年4月22日出願の米国特許出願第62/326,667号、2016年10月24日出願の米国特許出願第62/412,212号及び2017年3月13日出願の米国特許出願第62/470,744号(それらのそれぞれの開示全体が参照により本明細書に援用される)の利益を主張する。
分野
本分野は、概して、マイクロ流体環境内でTリンパ球を選択し且つ増殖させるための方法、システム及びデバイスに関する。
本分野は、概して、マイクロ流体環境内でTリンパ球を選択し且つ増殖させるための方法、システム及びデバイスに関する。
発明の背景
免疫療法は、患者の免疫系を用いて疾患への対処を支援する急成長中の分野である。患者自身の免疫系の刺激による癌細胞の攻撃及び外部源からの免疫系成分の投与をはじめとする様々な免疫療法ストラテジーが、癌に対処するために評価されてきた。例えば、生体内で癌細胞を攻撃するように設計されたモノクローナル抗体は、単独で又は遺伝子工学操作構築物として投与されてきた。加えて、種々のT細胞療法が研究されてきた。自己T細胞療法は、対象からT細胞を得ることと、エクスビボでT細胞を増殖させることと、増殖されたT細胞を対象に再導入することとを含む。キメラ抗原受容体T細胞(CAR-T)療法は、対象の癌を標的とするキメラ抗体含有融合タンパク質をその表面上に発現させて、T細胞によって癌細胞を死滅させるようにT細胞を遺伝子工学操作することを含む。いずれのタイプのT細胞療法も利点を提供する。しかし、これらの療法は、依然として更なる改良を必要とする。
免疫療法は、患者の免疫系を用いて疾患への対処を支援する急成長中の分野である。患者自身の免疫系の刺激による癌細胞の攻撃及び外部源からの免疫系成分の投与をはじめとする様々な免疫療法ストラテジーが、癌に対処するために評価されてきた。例えば、生体内で癌細胞を攻撃するように設計されたモノクローナル抗体は、単独で又は遺伝子工学操作構築物として投与されてきた。加えて、種々のT細胞療法が研究されてきた。自己T細胞療法は、対象からT細胞を得ることと、エクスビボでT細胞を増殖させることと、増殖されたT細胞を対象に再導入することとを含む。キメラ抗原受容体T細胞(CAR-T)療法は、対象の癌を標的とするキメラ抗体含有融合タンパク質をその表面上に発現させて、T細胞によって癌細胞を死滅させるようにT細胞を遺伝子工学操作することを含む。いずれのタイプのT細胞療法も利点を提供する。しかし、これらの療法は、依然として更なる改良を必要とする。
自己T細胞療法及びCAR-T療法の両方の主要な問題の1つは、最も高い腫瘍死滅能を有するT細胞を選択的に増殖させるようにT細胞をエクスビボで増殖させる方法が欠如していることである。本開示は、T細胞をエクスビボで選択的に増殖させるための解決策を提供する。本開示はまた、本明細書に開示される方法に従ってエクスビボで増殖されたT細胞を用いて、癌に罹患している対象を治療するための改善された方法を提供する。
概要
マイクロ流体デバイス(又は「チップ」)においてTリンパ球を増殖させる方法が開示される。マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体チャネルと、チャネルに流体接続された隔離ペンとを含み得、隔離ペンは、Tリンパ球の培養及び増殖を支援するように構成される。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、ナノ流体デバイスであり得る。隔離ペンは、例えば、約0.5×106から約5.0×106立方ミクロン又は約0.5×106から約2.0×106立方ミクロンの体積を有し得る。さらに、マイクロ流体デバイスは、2つ以上のマイクロ流体チャネルと、各マイクロ流体チャネルに流体接続された複数の隔離ペンとを有し得、複数のそれぞれの隔離ペンは、Tリンパ球の培養及び増殖を支援するように構成される。隔離ペンの表面の1つ以上は調整され得る。
マイクロ流体デバイス(又は「チップ」)においてTリンパ球を増殖させる方法が開示される。マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体チャネルと、チャネルに流体接続された隔離ペンとを含み得、隔離ペンは、Tリンパ球の培養及び増殖を支援するように構成される。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、ナノ流体デバイスであり得る。隔離ペンは、例えば、約0.5×106から約5.0×106立方ミクロン又は約0.5×106から約2.0×106立方ミクロンの体積を有し得る。さらに、マイクロ流体デバイスは、2つ以上のマイクロ流体チャネルと、各マイクロ流体チャネルに流体接続された複数の隔離ペンとを有し得、複数のそれぞれの隔離ペンは、Tリンパ球の培養及び増殖を支援するように構成される。隔離ペンの表面の1つ以上は調整され得る。
Tリンパ球を増殖させる方法は、1個以上のTリンパ球をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することと、1個以上のTリンパ球と活性化剤とを接触させることとを含み得
る。幾つかの実施形態では、20個以下、10個以下、6から10個、5個以下、約5個、約4個、約3個、約2個又は1個のTリンパ球が隔離ペンに導入される。マイクロ流体デバイスが複数の隔離ペンを含む場合、1つ以上の隔離ペンのそれぞれに1個以上のTリンパ球(例えば、20個以下、10個以下、6から10個、5個以下、約5個、約4個、約3個、約2個又は1個のTリンパ球)を導入し得る。Tリンパ球を増殖させる方法は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルを通して培養培地をかん流させることをさらに含み得る。かん流は、連続的また間欠的であり得、且つ1つの隔離ペン(又は複数の隔離ペン)に導入された1個以上のTリンパ球が少なくとも1ラウンドの有糸細胞分裂を行うことを可能にするのに十分な時間の期間にわたって継続し得る。
る。幾つかの実施形態では、20個以下、10個以下、6から10個、5個以下、約5個、約4個、約3個、約2個又は1個のTリンパ球が隔離ペンに導入される。マイクロ流体デバイスが複数の隔離ペンを含む場合、1つ以上の隔離ペンのそれぞれに1個以上のTリンパ球(例えば、20個以下、10個以下、6から10個、5個以下、約5個、約4個、約3個、約2個又は1個のTリンパ球)を導入し得る。Tリンパ球を増殖させる方法は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルを通して培養培地をかん流させることをさらに含み得る。かん流は、連続的また間欠的であり得、且つ1つの隔離ペン(又は複数の隔離ペン)に導入された1個以上のTリンパ球が少なくとも1ラウンドの有糸細胞分裂を行うことを可能にするのに十分な時間の期間にわたって継続し得る。
特定の実施形態では、1個以上のTリンパ球は、対象の末梢血から分離されたTリンパ球の集団に由来する。他の実施形態では、1個以上のTリンパ球は、対象の固形腫瘍サンプルから分離されたTリンパ球の集団に由来する。固形腫瘍サンプルは、細針吸引物(FNA)又は腫瘍生検物(例えば、コア生検物)であり得る。固形腫瘍は、乳癌、泌尿生殖器癌(例えば、腎臓(例えば、腎細胞癌)、尿管、膀胱、尿道等の尿路に発生する癌、男性生殖管の癌(例えば、精巣癌、前立腺癌、又は精嚢、精管若しくは陰茎の癌)、又は女性生殖管の癌(例えば、卵巣癌、子宮癌、頸癌、腟癌若しくは卵管癌))、神経系癌(例えば、神経芽腫、網膜芽腫)、腸癌(例えば、結腸直腸癌)、肺癌、黒色腫、或いは他のタイプの癌であり得る。具体的な実施形態では、固形腫瘍は、髄様乳癌、中皮腫又は黒色腫であり得る。
幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD3+Tリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD3+CD4+Tリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD3+CD8+Tリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD45RA+Tリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD45RO+Tリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CCR7+Tリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD62L+Tリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD45RA+/CD7+/CD62L+Tリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD45RO+/CD7+/CD62L+Tリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、PD-1+Tリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD137+Tリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、PD-1+/CD137+Tリンパ球が富化される。
幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD4+Tリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD8+Tリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD45RO+Tリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD45RA+Tリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CCR7+Tリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD62L+Tリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD45RO+/CD7+/CD62L+Tリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD45RA+/CD7+/CD62L+Tリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、PD-1+Tリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、CD137+Tリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団は、PD-1+/CD137+Tリンパ球が枯渇される。
幾つかの実施形態では、Tリンパ球の集団の主な細胞型は、ナイーブT細胞(Tnaive)、セントラルメモリT細胞(TCM)若しくはエフェクタメモリT細胞(TEM)
等のメモリT細胞又はエフェクタT細胞(TEFF)である。
等のメモリT細胞又はエフェクタT細胞(TEFF)である。
幾つかの実施形態では、本方法は、Tリンパ球を含有するサンプルを前処理して、ナイーブTリンパ球、メモリTリンパ球(例えば、TCM細胞及び/又はTEM細胞)、TEFFリンパ球又はそれらの任意の組合せを富化することを含む。処理は、デブリ及び/又は非リンパ球細胞型をサンプルから除去することを含み得る。代替的又は追加的に、ナイーブTリンパ球、メモリTリンパ球(例えば、TCM及び/又はTEMリンパ球)、TEFFリンパ球又はそれらの組合せをサンプルから枯渇させる処理を含み得る。
サンプルは、癌(例えば、本明細書に記載の又は当技術分野で公知の任意のタイプの癌)に罹患している対象等の対象に由来し得る。サンプルは、末梢血サンプル又はその派生物(例えば、PBMCサンプル)であり得る。代替的に、サンプルは、固形腫瘍生検物又はFNAであり得る。幾つかの実施形態では、末梢血サンプルは、ナイーブTリンパ球を富化するように処理される。他の実施形態では、腫瘍サンプルは、メモリTリンパ球、特にTCMリンパ球を富化するように処理されるが、TEFリンパ球を富化してもよい。さらに他の実施形態では、腫瘍サンプルは、TEFFリンパ球を富化するように処理される。所望のTリンパ球細胞型を富化するために、1つ以上の細胞表面抗原に特異的に結合する結合剤(例えば、抗体等)が利用され得る。結合剤が結合する細胞表面抗原は、CD4、CD8、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD62L、PD-1及びCD137Tをはじめとする本明細書に記載の細胞表面抗原のいずれか1つ又はそれらの組合せであり得る。処理は、サンプルと1つ以上の蛍光標識結合剤とを接触させることと、標識細胞を選択するために(例えば、1つ以上の結合剤が特異的に結合した細胞表面抗原に基づいて富化する場合)又は標識細胞を除去するために(例えば、1つ以上の結合剤が特異的に結合した細胞表面抗原に基づいて枯渇させる場合)FACSを行うこととを含み得る。代替的又は追加的に、処理は、サンプルと、固体担体に結合された1つ以上の結合剤とを接触させることと、固体担体に結合された細胞を除去することと(例えば、1つ以上の結合剤が特異的に結合した細胞表面抗原に基づいて枯渇させる場合)又は固体担体に結合されなかった細胞を除去することと(例えば、1つ以上の結合剤が特異的に結合した細胞表面抗原に基づいて富化する場合)を含み得る。固体担体は、例えば、1つ以上のビーズ(例えば、磁気を有し得るビーズの集団)であり得る。磁気ビーズを使用する場合、磁気ビーズがペレットを形成するようにサンプルに磁力を適用し、得られた上澄み液がペレットから分離されることを可能にする。
特定の実施形態では、1個以上のTリンパ球を隔離ペンに導入することは、1個以上のTリンパ球を含有する流体をマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルに流入させることを含む。1個以上のTリンパ球を隔離ペンに導入することは、誘電泳動(DEP)を用いて、マイクロ流体チャネルに位置する少なくとも1個のTリンパ球を選択し、且つそれを隔離ペン内に移動させることをさらに含み得る。少なくとも1個のTリンパ球は、CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD62L、PD-1、CD137T等のマーカー又はそれらの任意の組合せの細胞表面発現に基づいて選択され得る。代替的に、1個以上のTリンパ球を隔離ペンに導入することは、重力によって少なくとも1個のTリンパ球を隔離ペンに引き入れるようにマイクロ流体チップを傾斜させることをさらに含み得る。他の代替形態では、1個以上のTリンパ球を隔離ペンに導入することは、遠心力によって少なくとも1個のTリンパ球を隔離ペンに引き入れるようにマイクロ流体デバイスを遠心することをさらに含み得る。
幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD4+又はCD3+CD4+であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD8+又はCD3+CD8+であるために選択される。幾つかの実施形態で
は、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD45RA+(例えば、CD45RA+CD45RO-)であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD45RA-(例えば、CD45RA-CD45RO+)であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCCR7+及び/又はCD62L+であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCCR7-及び/又はCD62L-であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD45RA+、CD45RO-、CD45RA+CCR7+、CD45RO-CCR7+、CD45RA+CD45RO-CCR7+、CD45RA+CD62L+、CD45RO-CD62L+、CD45RA+CD45RO-CD62L+、CD45RA+CCR7+CD62L+、CD45RO-CCR7+CD62L+又はCD45RA+CD45RO-CCR7+CD62L+であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD45RO+、CD45RA-、CD45RO+CCR7+、CD45RA-CCR7+、CD45RO+CD45RA-CCR7+、CD45RO+CD62L+、CD45RA-CD62L+、CD45RO+CD45RA-CD62L+、CD45RO+CCR7+CD62L+、CD45RA-CCR7+CD62L+又はCD45RO+CD45RA-CCR7+CD62L+であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD45RO+CCR7-、CD45RA-CCR7-、CD45RO+CD45RA-CCR7-、CD45RO+CD62L-、CD45RA-CD62L-、CD45RO+CD45RA-CD62L-、CD45RO+CCR7-CD62L-、CD45RA-CCR7-CD62L-、CD45RO+CD45RA-CCR7-CD62L-であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD69-であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がPD-1+及び/又はCD137+であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がPD-1-及び/又はCD137-であるために選択される。
は、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD45RA+(例えば、CD45RA+CD45RO-)であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD45RA-(例えば、CD45RA-CD45RO+)であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCCR7+及び/又はCD62L+であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCCR7-及び/又はCD62L-であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD45RA+、CD45RO-、CD45RA+CCR7+、CD45RO-CCR7+、CD45RA+CD45RO-CCR7+、CD45RA+CD62L+、CD45RO-CD62L+、CD45RA+CD45RO-CD62L+、CD45RA+CCR7+CD62L+、CD45RO-CCR7+CD62L+又はCD45RA+CD45RO-CCR7+CD62L+であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD45RO+、CD45RA-、CD45RO+CCR7+、CD45RA-CCR7+、CD45RO+CD45RA-CCR7+、CD45RO+CD62L+、CD45RA-CD62L+、CD45RO+CD45RA-CD62L+、CD45RO+CCR7+CD62L+、CD45RA-CCR7+CD62L+又はCD45RO+CD45RA-CCR7+CD62L+であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD45RO+CCR7-、CD45RA-CCR7-、CD45RO+CD45RA-CCR7-、CD45RO+CD62L-、CD45RA-CD62L-、CD45RO+CD45RA-CD62L-、CD45RO+CCR7-CD62L-、CD45RA-CCR7-CD62L-、CD45RO+CD45RA-CCR7-CD62L-であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD69-であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がPD-1+及び/又はCD137+であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がPD-1-及び/又はCD137-であるために選択される。
幾つかの実施形態では、選択するステップは、少なくとも1個のTリンパ球と、1つ以上の結合剤(例えば、抗体、ペプチド結合MHC複合体テトラマー等)とを接触させることと、1つ以上の結合剤と少なくとも1個のTリンパ球との間の結合の存在(又は不在)に基づいて少なくとも1個のTリンパ球を隔離ペン内に移動させることとを含む。幾つかの実施形態では、1つ以上の結合剤のそれぞれは、フルオロフォア等の標識を含む。
特定の実施形態では、1個以上のTリンパ球を隔離ペンに導入することは、活性化剤を隔離ペンに導入することをさらに含む。1個以上のTリンパ球は、隔離ペンに導入される前に活性化剤と接触され得る。例えば、Tリンパ球は、マイクロ流体デバイスに導入される前に少なくとも1時間(例えば、少なくとも2、3、4、5時間又はそれを超える時間)の期間にわたり活性化剤と共にインキュベートされ得る。代替的に、1個以上のTリンパ球は、隔離ペンに導入された後に活性化剤に接触され得る。
特定の実施形態では、活性化剤は、CD3及びCD28アゴニストを含み得る。CD3及び/又はCD28アゴニストは、抗体であり得る。幾つかの実施形態では、抗CD3アゴニスト(例えば、抗体)は、固体担体にコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、抗CD28アゴニスト(例えば、抗体)は、固体担体にコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、抗CD28アゴニスト(例えば、抗体)は、水性溶液中の溶質である。
そのため、例えば、活性化剤は、抗CD3及び抗CD28アゴニスト抗体にコンジュゲートされた1個以上のビーズを含み得る。代替的に、活性化剤は、抗CD3アゴニスト抗体にコンジュゲートされた1個以上のビーズと、可溶性抗CD28アゴニスト抗体の溶液とを含み得る。さらに他の代替形態では、CD3及び/又はCD28アゴニストは、隔離ペンの1つ以上の表面に(共有結合又は非共有結合で)結合され得る。隔離ペンの表面は、表面へのCD3及び/又はCD28アゴニストの結合を促進するように調整され得る。
そのため、例えば、活性化剤は、抗CD3及び抗CD28アゴニスト抗体にコンジュゲートされた1個以上のビーズを含み得る。代替的に、活性化剤は、抗CD3アゴニスト抗体にコンジュゲートされた1個以上のビーズと、可溶性抗CD28アゴニスト抗体の溶液とを含み得る。さらに他の代替形態では、CD3及び/又はCD28アゴニストは、隔離ペンの1つ以上の表面に(共有結合又は非共有結合で)結合され得る。隔離ペンの表面は、表面へのCD3及び/又はCD28アゴニストの結合を促進するように調整され得る。
特定の実施形態では、活性化剤は、樹状細胞(DC)を含み得る。樹状細胞は、1個以上のTリンパ球を接触させる前に対象の抗原(例えば、癌関連抗原、感染性疾患関連抗原又は幾つかの他のタイプの病態に関連する抗原)でパルスされ得る。周知の抗原又は新抗原であり得る癌関連抗原は、腫瘍生検物から得られる腫瘍細胞のゲノム解析を通して同定され得る。
特定の実施形態では、活性化剤は、ペプチド抗原とMHC分子との間の複合体を含み得る。かかる複合体は、ペプチド-MHCテトラマー複合体の場合のように結合され得る。ペプチド-MHC複合体は、固体担体にコンジュゲートされ得る。幾つかの実施形態では、固体担体は、1個以上のビーズであり得る。他の実施形態では、固体担体は、隔離ペンの1つ以上の表面であり得る。そのため、隔離ペンの表面は、表面へのペプチド-MHC複合体の結合を促進するように調整され得る。
特定の実施形態では、培養培地は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルを通して少なくとも24時間(例えば、少なくとも48、72、96、110時間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間)の期間にわたってかん流される。特定の実施形態では、培養培地は、ウシ血清(例えば、ウシ胎児血清又は仔ウシ血清)と任意選択的に組み合わせたヒト血清(例えば、ヒトAB血清)であり得る哺乳動物血清を含む。特定の実施形態では、培養培地は、インターロイキン2(IL2)、インターロイキン7(IL7)、インターロイキン21(IL21)、インターロイキン15(IL15)又はそれらの任意の組合せをさらに含む。幾つかの実施形態では、培養培地は、約50U/mlのIL2(例えば、約1U/mlから約10U/mlのIL2)を含む。幾つかの実施形態では、培養培地は、約5ng/mlのIL7(例えば、約1ng/mlから約10ng/mlのIL7)を含む。幾つかの実施形態では、培養培地は、約30ng/mlのIL21(例えば、約10ng/mlから約50ng/mlのIL21)を含む。
幾つかの実施形態では、本方法は、1個以上のTリンパ球のペン内増殖速度をアッセイすることを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、隔離ペン内の1個以上のTリンパ球による1種以上のサイトカイン、例えばINFγ、TNFα、IL2又はそれらの組合せの発現をアッセイすることを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、隔離ペン内の1個以上のTリンパ球によるCTLA4等の1種以上の調節性T細胞マーカーの発現をアッセイすることを含む。
幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、例えば、増殖後、マイクロ流体デバイスから搬出される。搬出は、例えば、増殖速度、サイトカイン発現、調節性T細胞マーカー発現又はそれらの組合せに少なくとも部分的に基づいて選択的であり得る。幾つかの実施形態では、搬出されたTリンパ球のサンプルは、ゲノムプロファイリングされる。
特定の実施形態では、対象において癌を治療する方法が開示される。対象は、ヒト等の哺乳動物であり得る。癌は、乳癌、泌尿生殖器癌(例えば、腎臓(例えば、腎細胞癌)、尿管、膀胱、尿道等の尿路に発生する癌、男性生殖管の癌(例えば、精巣癌、前立腺癌、又は精嚢、精管若しくは陰茎の癌)、又は女性生殖管の癌(例えば、卵巣癌、子宮癌、頸癌、腟癌若しくは卵管癌))、神経系癌(例えば、神経芽腫)、腸癌(例えば、結腸直腸
癌)、肺癌、黒色腫、或いは他のタイプの癌であり得る。特定の実施形態では、癌は、髄様乳癌、中皮腫又は黒色腫であり得る。
癌)、肺癌、黒色腫、或いは他のタイプの癌であり得る。特定の実施形態では、癌は、髄様乳癌、中皮腫又は黒色腫であり得る。
癌を治療する方法は、対象から得られた組織サンプルからTリンパ球を分離することと、分離されたTリンパ球を、本明細書に開示される方法のいずれかに従ってマイクロ流体デバイスにおいて増殖させることと、増殖されたTリンパ球をマイクロ流体デバイスから搬出することと、増殖されたTリンパ球を対象に再導入することとを含み得る。
特定の実施形態では、組織サンプルは、末梢血サンプルである。特定の実施形態では、組織サンプルは、固形腫瘍に由来する。組織サンプルは、例えば、固形腫瘍に由来するFNA又は生検物(例えば、コア生検物)であり得る。固形腫瘍サンプルは、以上で考察した癌のいずれかに由来し得る。
特定の実施形態では、組織サンプルからTリンパ球を分離することは、組織サンプルでCD3+細胞の選択を行うことを含む。幾つかの実施形態では、選択は、以上に及び本明細書の他の箇所に記載されるマーカーCD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CCR7、CD62L、PD-1、PD-L1及びCD137の1つ以上に基づき得る。選択は、CD3結合剤(又は他のマーカー結合剤)が結合された磁気ビーズ等のビーズを使用することを含み得る。特定の実施形態では、組織サンプルからTリンパ球を分離することは、腫瘍サンプルでCD3+(又は他のマーカー陽性)細胞の選択を行う前に組織サンプルを解離させることをさらに含む。
特定の実施形態では、分離されたTリンパ球は、マイクロ流体デバイスに導入される。マイクロ流体デバイスは、ナノ流体デバイスであり得る。特定の実施形態では、分離されたTリンパ球を増殖させることは、マイクロ流体(又はナノ流体)デバイスの隔離ペンに1個以上の分離されたTリンパ球を導入することを含む。隔離ペンは、例えば、約0.5×106から約5×106立方ミクロン又は約0.5×106から約2.0×106立方ミクロンの体積を有し得る。
特定の実施形態では、分離されたTリンパ球を増殖させることは、分離されたTリンパ球と活性化剤とを接触させることを含む。幾つかの実施形態では、活性化剤は、CD3及び/又はCD28アゴニストを含む。CD3及び/又はCD28アゴニストは、抗体であり得る。幾つかの実施形態では、抗CD3アゴニストは、固体担体にコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、抗CD28アゴニストは、固体担体にコンジュゲートされる。そのため、活性化剤は、例えば、それぞれ抗CD3及び/又は抗CD28アゴニスト抗体にコンジュゲートされ得る1つ以上の固体担体(例えば、1個以上のビーズ)を含み得る。幾つかの実施形態では、抗CD28アゴニスト(例えば、抗体)は、溶質として水性溶液中に提供される。他の実施形態では、活性化剤は、樹状細胞(DC)を含む。DCは、治療される対象から得られ得、及び/又は分離されたTリンパ球を接触させる前に腫瘍抗原でパルスされ得る。腫瘍抗原は、対象から得られた癌細胞に由来する核酸分子(例えば、gDNA、mRNA等)のシーケンシングによって同定され得る。さらに他の実施形態では、活性化剤は、1個以上のビーズ又は隔離ペンの1つ以上の表面(例えば、調整された表面)等の固体担体に結合され得るペプチド-MHC複合体又は複合体クラスター(例えば、ペプチド-MHCテトラマー複合体)であり得る。
特定の実施形態では、Tリンパ球は、マイクロ流体デバイスに導入される前に少なくとも1時間(例えば、少なくとも2、3、4、5時間又はそれを超える時間)の期間にわたり活性化剤と共にインキュベートされる。特定の実施形態では、分離されたTリンパ球を隔離ペンに導入することは、活性化剤を隔離ペンに導入することをさらに含む。
特定の実施形態では、活性化剤との接触に反応して増殖を行う分離されたTリンパ球は、少なくとも100倍(例えば、少なくとも200倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍等)の増殖を呈する。特定の実施形態では、増殖されたTリンパ球は、マイクロ流体デバイスから搬出された後であるが、対象に再導入される前に「オフチップ」でさらに増殖される。
本明細書に記載の方法はいずれも、マイクロ流体デバイスと、その中で成長されるT細胞との間の主要なインターフェースを提供する有機分子及び/又は親水性分子の層を提示するように調整又はコーティングされた1つ以上の内面(例えば、基板表面、カバー表面及び/又は回路材料表面)を有するマイクロ流体デバイスを用いて行われ得る。例えば、流路及び隔離ペンは、1つ以上の内面に結合し、且つ分子の有機層及び/又は親水性層を提示するコーティング溶液で処理され得る。そのため、コーティング溶液は、1つ以上の内面に結合するコーティング剤、例えば血清、血清中アルブミン(例えば、BSA)、ポリマー、界面活性剤、酵素又はそれらの任意の組合せを含み得る。
特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、コーティング材料を含む内側基板表面(及び/又は内側カバー表面、及び/又は内側回路材料表面)を含み得る。幾つかの実施形態では、コーティング材料は、結合基とアルキル部分とを有する分子を含む。結合基は、内側基板表面に共有結合で結合され得、且つ例えばシロキシ結合基であり得る。アルキル部分は、例えば、非置換アルキル部分又は置換アルキル部分、例えばフルオロアルキル部分又はペルフロウロアルキル部分であり得る。アルキル部分は、少なくとも10個の炭素原子(例えば、少なくとも12、14、16、18、20、22個又はそれを超える炭素原子)を含む炭素直鎖を含み得る。コーティング材料の分子は、内側基板表面(及び/又は内側カバー表面、及び/又は内側回路材料表面)に共有結合で結合された密充填単層構造を形成し得る。
幾つかの実施形態では、コーティング材料は、結合基とカチオン部分及び/又はアニオン部分とを有する分子を含み、結合基は、内側基板表面(及び/又は内側カバー表面、及び/又は内側回路材料表面)に共有結合で結合される。カチオン部分は、第4級アンモニウム基を含み得る。アニオン部分は、ホスホン酸、カルボン酸又はスルホン酸を含み得る。幾つかの関連する実施形態では、コーティング材料は、結合基と双性イオン部分とを有する分子を含み得、結合基は、内側基板表面(及び/又は内側カバー表面及び/又は内側回路材料表面)に共有結合で結合される。双性イオン部分は、カルボキシベタイン、スルホベタイン、スルファミン酸及びアミノ酸から選択される。幾つかの実施形態では、カチオン部分、アニオン部分又は双性イオン部分は、ブロック剤とイオン結合可能である。
幾つかの実施形態では、コーティング材料は、アルキレンエーテル部分、糖部分又はアミノ酸部分を含むポリマーを含む。例えば、コーティング材料は、デキストラン又はポリエチレングリコール(PEG)を含み得る。代替的又は追加的に、コーティング材料は、タンパク質ポリマー(例えば、T細胞活性化を促進するタンパク質)を含み得る。
また、本明細書に開示される方法に従って生成されたTリンパ球も提供される。また、本明細書に開示される方法に従って、例えば、マイクロ流体デバイスの1つ以上の隔離ペン内で生成された1個以上、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個又はそれを超えるTリンパ球を含むマイクロ流体デバイスも提供される。また、本明細書に開示される方法に従って生成されたTリンパ球と、任意選択的に薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供される。
追加的な目的及び利点は、部分的に以下の説明に示され且つ部分的にその説明から明ら
かになり、又は実施することで分かり得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で特に指定された要素及び組合せによって実現及び達成されるであろう。
かになり、又は実施することで分かり得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で特に指定された要素及び組合せによって実現及び達成されるであろう。
以上の概要及び以下の詳細な説明の両方は、例示的且つ解説的なものにすぎず、特許請求の範囲を限定しないことを理解すべきである。
本明細書に組み込まれ且つその一部を構成する添付の図面は、1つ(幾つか)の実施形態を例示し、本記載内容と合わせて本明細書に記載の原理を説明する役割を果たす。
実施形態の詳細な説明
本明細書には、本開示の例示的な実施形態及び適用が記載されている。しかし、本開示は、これらの例示的な実施形態及び適用、例示的な実施形態及び適用を行う方式、又はそれについて本明細書に記載される方式に限定されない。さらに、図は、簡略図又は部分図を示し得、図中の要素の寸法は、誇張されるか又は他に比例していないことがあり得る。加えて、「上」、「付着される」、「接続される」、「結合される」という用語又は類似語が本明細書で使用される場合、一方の要素が直接他方の要素上にあるか、それに付着されるか、それに接続されるか、若しくはそれに結合されるか、又は一方の要素と他方の要素との間に1つ以上の介在要素があるかにかかわらず、一方の要素(例えば、材料、層、基板等)は、他方の要素「上」にあるか、それに「付着される」か、それに「接続される」か、又はそれに「結合される」。また、文脈上特に規定されない限り、方向(例えば、上、下、頂、底、側、上向き、下向き、下方、上方、上側、下側、水平、垂直、「x」、「y」、「z」等)は、提供された場合、相対的なものであり、単なる例として説明及び考察が容易になるように提供され、限定を目的としたものではない。加えて、要素のリスト(例えば、要素a、b、c)が参照される場合、かかる参照は、列挙された要素のいずれか1つのみ、列挙された要素の全てに満たない任意の組合せ、及び/又は列挙された要素の全ての組合せを含むことが意図される。本明細書でのセクション分割は、概説を容易にすることのみを目的とし、考察される要素のいずれの組合せにも限定されない。
本明細書には、本開示の例示的な実施形態及び適用が記載されている。しかし、本開示は、これらの例示的な実施形態及び適用、例示的な実施形態及び適用を行う方式、又はそれについて本明細書に記載される方式に限定されない。さらに、図は、簡略図又は部分図を示し得、図中の要素の寸法は、誇張されるか又は他に比例していないことがあり得る。加えて、「上」、「付着される」、「接続される」、「結合される」という用語又は類似語が本明細書で使用される場合、一方の要素が直接他方の要素上にあるか、それに付着されるか、それに接続されるか、若しくはそれに結合されるか、又は一方の要素と他方の要素との間に1つ以上の介在要素があるかにかかわらず、一方の要素(例えば、材料、層、基板等)は、他方の要素「上」にあるか、それに「付着される」か、それに「接続される」か、又はそれに「結合される」。また、文脈上特に規定されない限り、方向(例えば、上、下、頂、底、側、上向き、下向き、下方、上方、上側、下側、水平、垂直、「x」、「y」、「z」等)は、提供された場合、相対的なものであり、単なる例として説明及び考察が容易になるように提供され、限定を目的としたものではない。加えて、要素のリスト(例えば、要素a、b、c)が参照される場合、かかる参照は、列挙された要素のいずれか1つのみ、列挙された要素の全てに満たない任意の組合せ、及び/又は列挙された要素の全ての組合せを含むことが意図される。本明細書でのセクション分割は、概説を容易にすることのみを目的とし、考察される要素のいずれの組合せにも限定されない。
マイクロ流体フィーチャの寸法が幅又は面積を有するものとして記載されている場合、寸法は、典型的には、マイクロ流体デバイスの基板及び/又はカバーに平行な平面内にいずれも位置するx軸方向及び/又はy軸方向の寸法に対して記載されている。マイクロ流体フィーチャの高さは、マイクロ流体デバイスの基板及び/又はカバーに平行な平面に垂直なz軸方向に対して記載されている。幾つかの場合、チャネル又は通路等のマイクロ流体フィーチャの断面積は、x軸方向/z軸方向、y軸方向/z軸方向、又はx軸方向/y軸方向の面積に対するものである。
本明細書で使用される場合、「実質的に」は、意図された目的で機能するのに十分であることを意味する。そのため、「実質的に」という用語は、当業者によって予想されるような、ただし全体性能にそれほど影響を及ぼさない、絶対的又は完全な状態、寸法、測定、結果等からのわずかな有意でない変動を許容する。数値又は数値として表現され得るパラメータ若しくは特性に対して用いられる場合、「実質的に」は、10パーセント以内を意味する。
「1つ」という用語は、2つ以上を意味する。
本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれを超え得る。
本明細書で使用される場合、「配置される」という用語は、その意味内において「位置する」を包含する。
本明細書で使用される場合、「マイクロ流体デバイス」又は「マイクロ流体装置」は、流体を保持するように構成された1つ以上の離散マイクロ流体回路(各マイクロ流体回路は、限定されるものではないが、領域、流路、チャネル、チャンバ及び/又はペンをはじめとする流体相互接続回路要素を含む)と、マイクロ流体デバイスに対して流体(及び任
意選択的に流体中に懸濁された微小物体)の流入及び/又は流出を可能にするように構成された少なくとも1つのポートとを含むデバイスである。典型的には、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路は、マイクロ流体チャネルと少なくとも1つチャンバとを含み、約1mL未満、例えば約750μL未満、約500μL未満、約250μL未満、約200μL未満、約150μL未満、約100μL未満、約75μL未満、約50μL未満、約25μL未満、約20μL未満、約15μL未満、約10μL未満、約9μL未満、約8μL未満、約7μL未満、約6μL未満、約5μL未満、約4μL未満、約3μL未満又は約2μL未満の体積の流体を保持するであろう。特定の実施形態では、マイクロ流体回路は、約1~2μL、約1~3μL、約1~4μL、約1~5μL、約2~5μL、約2~8μL、約2~10μL、約2~12μL、約2~15μL、約2~20μL、約5~20μL、約5~30μL、約5~40μL、約5~50μL、約10~50μL、約10~75μL、約10~100μL、約20~100μL、約20~150μL、約20~200μL、約50~200μL、約50~250μL又は約50~300μLを保持する。マイクロ流体回路は、マイクロ流体デバイスの第1のポート(例えば、流入口)に流体接続された第1の端と、マイクロ流体デバイスの第2のポート(例えば、流流出口)に流体接続された第2の端とを有するように構成され得る。
意選択的に流体中に懸濁された微小物体)の流入及び/又は流出を可能にするように構成された少なくとも1つのポートとを含むデバイスである。典型的には、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路は、マイクロ流体チャネルと少なくとも1つチャンバとを含み、約1mL未満、例えば約750μL未満、約500μL未満、約250μL未満、約200μL未満、約150μL未満、約100μL未満、約75μL未満、約50μL未満、約25μL未満、約20μL未満、約15μL未満、約10μL未満、約9μL未満、約8μL未満、約7μL未満、約6μL未満、約5μL未満、約4μL未満、約3μL未満又は約2μL未満の体積の流体を保持するであろう。特定の実施形態では、マイクロ流体回路は、約1~2μL、約1~3μL、約1~4μL、約1~5μL、約2~5μL、約2~8μL、約2~10μL、約2~12μL、約2~15μL、約2~20μL、約5~20μL、約5~30μL、約5~40μL、約5~50μL、約10~50μL、約10~75μL、約10~100μL、約20~100μL、約20~150μL、約20~200μL、約50~200μL、約50~250μL又は約50~300μLを保持する。マイクロ流体回路は、マイクロ流体デバイスの第1のポート(例えば、流入口)に流体接続された第1の端と、マイクロ流体デバイスの第2のポート(例えば、流流出口)に流体接続された第2の端とを有するように構成され得る。
本明細書で使用される場合、「ナノ流体デバイス」又は「ナノ流体装置」は、約1μL未満、例えば約750nL未満、約500nL未満、約250nL未満、約200nL未満、約150nL未満、約100nL未満、約75nL未満、約50nL未満、約25nL未満、約20nL未満、約15nL未満、約10nL未満、約9nL未満、約8nL未満、約7nL未満、約6nL未満、約5nL未満、約4nL未満、約3nL未満、約2nL未満、約1nL以下の体積の流体を保持するように構成された少なくとも1つの回路要素を含有するマイクロ流体回路を有するタイプのマイクロ流体デバイスである。ナノ流体デバイスは、複数の回路要素(例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000個又はそれを超える)を含み得る。特定の実施形態では、少なくとも1つの回路要素の1つ以上(例えば、全て)は、約100pLから1nL、約100pLから2nL、約100pLから5nL、約250pLから2nL、約250pLから5nL、約250pLから10nL、約500pLから5nL、約500pLから10nL、約500pLから15nL、約750pLから10nL、約750pLから15nL、約750pLから20nL、約1から10nL、約1から15nL、約1から20nL、約1から25nL又は約1から50nLの体積の流体を保持するように構成される。他の実施形態では、少なくとも1つの回路要素の1つ以上(例えば、全て)は、約20nLから200nL、約100から200nL、約100から300nL、約100から400nL、約100から500nL、約200から300nL、約200から400nL、約200から500nL、約200から600nL、約200から700nL、約250から400nL、約250から500nL、約250から600nL又は約250から750nLの体積の流体を保持するように構成される。
本明細書で使用される「マイクロ流体チャネル」又は「フローチャネル」は、水平寸法及び垂直寸法の両寸法よりも有意に長い長さを有するマイクロ流体デバイスの流路を意味する。例えば、フローチャネルは、水平寸法又は垂直寸法のいずれかの長さの少なくとも5倍、例えばその長さの少なくとも10倍、その長さの少なくとも25倍、その長さの少なくとも100倍、その長さの少なくとも200倍、その長さの少なくとも500倍、その長さの少なくとも1,000倍、その長さの少なくとも5,000倍であり得る。幾つかの実施形態では、フローチャネルの長さは、介在する任意の範囲を含めて約100,000ミクロンから約500,000ミクロンの範囲内である。幾つかの実施形態では、水
平寸法は、約100ミクロンから約1000ミクロン(例えば、約150から約500ミクロン)の範囲内であり、及び垂直寸法は、約25ミクロンから約200ミクロン、例えば約40から約150ミクロンの範囲内である。フローチャネルは、マイクロ流体デバイス内で多様な空間構成を有し得るため、完全に線状の要素に制限されないことに留意されたい。例えば、フローチャネルは、以下の構成:カーブ、ベンド、スパイラル、傾斜、下降、フォーク(例えば、複数の異なる流路)及びそれらの任意の組合せを有する1つ以上のセクションであり得るか又はそれらを含み得る。加えて、フローチャネルは、その中に所望の流体フローを提供するように、その通路に沿って異なる断面積、拡幅及び狭窄を有し得る。フローチャネルは、バルブを含み得、バルブは、マイクロフルイディクス技術分野で公知の任意のタイプであり得る。バルブを含むマイクロ流体チャネルの例は、米国特許第6,408,878号及び同第9,227,200号(それぞれその全体が参照により本明細書に援用される)に開示されている。
平寸法は、約100ミクロンから約1000ミクロン(例えば、約150から約500ミクロン)の範囲内であり、及び垂直寸法は、約25ミクロンから約200ミクロン、例えば約40から約150ミクロンの範囲内である。フローチャネルは、マイクロ流体デバイス内で多様な空間構成を有し得るため、完全に線状の要素に制限されないことに留意されたい。例えば、フローチャネルは、以下の構成:カーブ、ベンド、スパイラル、傾斜、下降、フォーク(例えば、複数の異なる流路)及びそれらの任意の組合せを有する1つ以上のセクションであり得るか又はそれらを含み得る。加えて、フローチャネルは、その中に所望の流体フローを提供するように、その通路に沿って異なる断面積、拡幅及び狭窄を有し得る。フローチャネルは、バルブを含み得、バルブは、マイクロフルイディクス技術分野で公知の任意のタイプであり得る。バルブを含むマイクロ流体チャネルの例は、米国特許第6,408,878号及び同第9,227,200号(それぞれその全体が参照により本明細書に援用される)に開示されている。
本明細書で使用される場合、「障害物」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスの2つの異なる領域間又は回路要素間の標的微小物体の移動を部分的に(完全にではなく)妨げるのに十分な大きさのバンプ又は類似のタイプの構造物を意味する。2つの異なる領域/回路要素は、例えば、マイクロ流体隔離ペンの接続領域及び分離領域であり得る。
本明細書で使用される場合、「狭窄」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスの回路要素(又は2つの回路要素間のインターフェース)の幅の狭小化を意味する。狭窄は、例えば、本開示のマイクロ流体隔離ペンの分離領域と接続領域との間のインターフェースに位置し得る。
本明細書で使用される場合、「透明」という用語は、光が通過する際に光を実質的に変化させることなく可視光を透過させる材料を意味する。
本明細書で使用される場合、「微小物体」という用語は、一般に、本開示に従って分離及び/又は操作され得る任意の微視的物体を意味する。限定されるものではないが、微小物体の例としては、無生物微小物体、例えばマイクロ粒子、マイクロビーズ(例えば、ポリスチレンビーズ、Luminex(商標)ビーズ等)、磁気ビーズ、マイクロロッド、マイク
ロワイヤ、量子ドット等、生物学的微小物体、例えば細胞、生物オルガネラ、ベシクル又は複合体、合成ベシクル、リポソーム(例えば、合成又は膜調製物由来)、脂質ナノラフト等、又は無生物微小物体と生物学的微小物体との組合せ(例えば、細胞付着マイクロビーズ、リポソームコーティングマイクロビーズ、リポソームコーティング磁気ビーズ等)が挙げられる。ビーズは、共有結合又は非共有結合で結合された部分/分子、例えば蛍光標識、タンパク質、炭水化物、抗原、低分子シグナリング部分又はアッセイで使用可能な他の化学的/生物学的種を含み得る。脂質ナノラフトは、例えば、Ritchie et al.(2009)
“Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs,” Methods Enzymol., 464:211-231に記載されている。
ロワイヤ、量子ドット等、生物学的微小物体、例えば細胞、生物オルガネラ、ベシクル又は複合体、合成ベシクル、リポソーム(例えば、合成又は膜調製物由来)、脂質ナノラフト等、又は無生物微小物体と生物学的微小物体との組合せ(例えば、細胞付着マイクロビーズ、リポソームコーティングマイクロビーズ、リポソームコーティング磁気ビーズ等)が挙げられる。ビーズは、共有結合又は非共有結合で結合された部分/分子、例えば蛍光標識、タンパク質、炭水化物、抗原、低分子シグナリング部分又はアッセイで使用可能な他の化学的/生物学的種を含み得る。脂質ナノラフトは、例えば、Ritchie et al.(2009)
“Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs,” Methods Enzymol., 464:211-231に記載されている。
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、「生体細胞」という用語と同義的に使用される。限定されるものではないが、生体細胞の例としては、真核細胞、植物細胞、動物細胞、例えば哺乳動物細胞、爬虫動物細胞、トリ細胞、サカナ細胞等、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、原生動物細胞等、組織、例えば筋肉、軟骨、脂肪、皮膚、肝臓、肺、神経の組織等から解離させた細胞、免疫細胞、例えばT細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ等、胚(例えば、接合体)、卵母細胞、卵子、精子細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、細胞系細胞、癌細胞、感染細胞、トランスフェクト及び/又はトランスフォーム細胞、レポーター細胞等が挙げられる。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、霊長動物等に由来し得る。
コロニー中の複製可能な生細胞の全てが単一の親細胞に由来する娘細胞である場合、生体細胞のコロニーは、「クローン」である。特定の実施形態では、クローンコロニーの全ての娘細胞は、10回以下の分裂によって単一の親細胞から派生される。他の実施形態では、クローンコロニーの全ての娘細胞は、14回以下の分裂によって単一の親細胞から派生される。他の実施形態では、クローンコロニーの全ての娘細胞は、17回以下の分裂によって単一の親細胞から派生される。他の実施形態では、クローンコロニーの全ての娘細胞は、20回以下の分裂によって単一の親細胞から派生される。「クローン細胞」という用語は、同一のクローンコロニーの細胞を意味する。
本明細書で使用される場合、生体細胞の「コロニー」は、2細胞以上(例えば、約2から約20、約4から約40、約6から約60、約8から約80、約10から約100、約20から約200、約40から約400、約60から約600、約80から約800、約100から約1000細胞又は1000細胞超)を意味する。
本明細書で使用される場合、「細胞を維持する」という用語は、細胞の生存及び/又は増殖を続けるのに必要な条件を提供する、流体及び気体の両方の成分と任意選択的に表面とを含む環境を提供することを意味する。
本明細書で使用される場合、細胞を参照するときの「増殖させる」という用語は、細胞数が増加することを意味する。
流体培地の「成分」は、溶媒分子、イオン、低分子、抗生物質、ヌクレオチド及びヌクレオシド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、脂肪酸、コレステロール、代謝物等をはじめとする培地中に存在する任意の化学分子又は生化学分子である。
本明細書で使用される場合、「捕捉部分」は、微小物体に対する認識部位を提供する化学的若しくは生物学的種、官能基又はモチーフである。所定のクラスの微小物体は、インサイチューで生成された捕捉部分を認識し得、インサイチューで生成された捕捉部分に結合し得るか又はそれに対して親和性を有し得る。限定されるものではないが、例としては、抗原、抗体及び細胞表面結合モチーフが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「流動性ポリマー」は、流体培地(例えば、プレポリマー溶液)に溶解可能又は分散可能なポリマーモノマー又はマクロマーである。流動性ポリマーは、マイクロ流体流路に進入し得、その中の流体培地の他の成分と共に流動し得る。
本明細書で使用される場合、「光開始ポリマー」は、光に暴露されると、共有結合による架橋、特異的共有結合の形成、剛性化化学モチーフの周りの位置化学の変化又は物理的状態の変化を引き起こすイオン対の形成が可能であり、それによりポリマーネットワークを形成するポリマー(又はポリマーを生成するために使用され得るモノマー分子)を意味する。幾つかの場合、光開始ポリマーは、共有結合による架橋、特異的共有結合の形成、剛性化化学モチーフの周りの位置化学の変化又は物理的状態の変化を引き起こすイオン対の形成が可能な1つ以上の化学部分に結合されたポリマーセグメントを含み得る。幾つかの場合、光開始ポリマーは、ポリマーネットワークの形成を開始(例えば、ポリマーの重合により)するために光活性ラジカル開始剤を必要とし得る。
本明細書で使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン(Ig)を意味し、これは、霊長動物化(例えば、ヒト化)、ネズミ、マウス-ヒト、マウス-霊長動物、並びにキメラのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を含み、且つインタクト分子、そのフラグメント(例えば、scFv、Fv、Fd、ファブ、Fab’及びF(ab)’2
フラグメント)、或いはインタクト分子及び/又はフラグメントのマルチマー若しくはアグリゲートであり得、天然に存在し得るか、又は免疫化、合成、遺伝子工学等によって生成され得る。「抗体フラグメント」は、本明細書で使用される場合、抗原に結合し、且つ幾つかの実施形態ではガラクトース残基の導入等によってクリアランス及び取込みを促進する構造特徴部を呈するように誘導体化され得る、抗体に由来する又は関連するフラグメントを意味する。これは、例えば、F(ab)、F(ab)’2、scFv、軽鎖可変領域(VL)、重鎖可変領域(VH)及びそれらの組合せを含む。
フラグメント)、或いはインタクト分子及び/又はフラグメントのマルチマー若しくはアグリゲートであり得、天然に存在し得るか、又は免疫化、合成、遺伝子工学等によって生成され得る。「抗体フラグメント」は、本明細書で使用される場合、抗原に結合し、且つ幾つかの実施形態ではガラクトース残基の導入等によってクリアランス及び取込みを促進する構造特徴部を呈するように誘導体化され得る、抗体に由来する又は関連するフラグメントを意味する。これは、例えば、F(ab)、F(ab)’2、scFv、軽鎖可変領域(VL)、重鎖可変領域(VH)及びそれらの組合せを含む。
流体培地を参照して本明細書で使用される場合、「拡散する」又は「拡散」は、流体培地の成分が濃度勾配の下方に熱力学的に移動することを意味する。
「培地のフロー」という語句は、拡散以外の任意の機構に主に起因する流体培地のバルク移動を意味する。例えば、培地のフローは、点間の圧力差に起因する一方の点から他方の点への流体培地の移動を含み得る。かかるフローは、液体の連続フロー、パルスフロー、周期フロー、ランダムフロー、間欠フロー若しくは往復フロー又はそれらの任意の組合せを含み得る。一方の流体培地が他方の流体培地に流入する場合、培地の乱流及び混合を生じ得る。
「実質的にフローなし」という語句は、時間平均で流体培地中への又は流体培地中での材料の成分(例えば、対象のアナライト)の拡散速度未満の流体培地の流速を意味する。かかる材料の成分の拡散速度は、例えば、温度、成分のサイズ及び成分と流体培地との間の相互作用の強度に依存し得る。
マイクロ流体デバイス内の異なる領域を参照して本明細書で使用される場合、「流体接続される」という語句は、異なる領域が流体培地等の流体で実質的に充填されたときに各領域内の流体が単一体の流体を形成するように接続されることを意味する。これは、異なる領域内の流体(又は流体培地)が必ずしも同一の組成であることを意味するものではない。より正確には、マイクロ流体デバイスの異なる流体接続領域内の流体は、溶質がそのそれぞれの濃度勾配の下方に移動するとき及び/又はマイクロ流体デバイスを貫流するときに流束内で異なる組成(例えば、タンパク質、炭水化物、イオン、他の分子等の溶質の濃度が異なる)を有し得る。
本明細書で使用される場合、「流路」又は「フロー領域」は、培地のフローのトラジェクトリーを規定し且つその対象となる1つ以上の流体接続回路要素(例えば、チャネル、領域、チャンバ等)を意味する。そのため、流路は、マイクロ流体デバイスの掃引領域の例である。他の回路要素(例えば、非掃引領域)は、流路の培地のフローの対象とならない流路を含む回路要素に流体接続され得る。
本明細書で使用される場合、「微小物体を分離する」は、マイクロ流体デバイス内の画定領域に微小物体を閉じ込めることである。微小物体は、インサイチューで生成された捕捉構造内で依然として運動が可能であり得る。
マイクロ流体(又はナノ流体)デバイスは、「掃引」領域と「非掃引」領域とを含み得る。本明細書で使用される場合、「掃引」領域は、流体がマイクロ流体回路を貫流するときに培地のフローにそれぞれ遭遇するマイクロ流体回路の1つ以上の流体相互接続回路要素を含む。掃引領域の回路要素は、例えば、領域、チャネル及びチャンバの全部又は一部を含み得る。本明細書で使用される場合、「非掃引」領域は、流体がマイクロ流体回路を貫流するときに実質的に流体のフラックスなしにそれぞれ遭遇するマイクロ流体回路の1つ以上の流体相互接続回路要素を含む。拡散を可能とするが、掃引領域と非掃引領域との間で培地が実質的にフローなしとなるように流体接続が構造化される限り、非掃引領域は
、掃引領域に流体接続され得る。そのため、マイクロ流体デバイスは、掃引領域と非掃引領域との間で実質的に拡散流体連通のみを可能にしつつ、掃引領域内の培地のフローから非掃引領域を実質的に分離するように構造化され得る。例えば、マイクロ流体デバイスのフローチャネルは、掃引領域の例であり、一方、マイクロ流体デバイスの分離領域(以下にさらに詳細に記載される)は、非掃引領域の例である。
、掃引領域に流体接続され得る。そのため、マイクロ流体デバイスは、掃引領域と非掃引領域との間で実質的に拡散流体連通のみを可能にしつつ、掃引領域内の培地のフローから非掃引領域を実質的に分離するように構造化され得る。例えば、マイクロ流体デバイスのフローチャネルは、掃引領域の例であり、一方、マイクロ流体デバイスの分離領域(以下にさらに詳細に記載される)は、非掃引領域の例である。
本明細書で使用される場合、「富化する」は、組成物又は集団で対象の細胞型等の成分の濃度を他の細胞型等の他の成分と比べて増加させることを意味する。富化は、組成物又は集団で他の成分(例えば、他の細胞型)の濃度を低減させた結果であり得る。例えば、本明細書で使用される場合、サンプル中のTリンパ球の特定のサブ集団を「富化する」は、サンプル中の全細胞数と比べてサブ集団の割合を増加させることを意味する。
本明細書で使用される場合、「枯渇させる」は、組成物又は集団で望ましくない細胞型等の成分の濃度を1つ以上の所望の細胞型等の他の成分と比べて減少させることを意味する。枯渇は、1つ以上の他の成分の濃度を増加させた結果であり得る。例えば、本明細書で使用される場合、Tリンパ球の特定のサブ集団をサンプルから「枯渇させる」は、サンプル中の全細胞数と比べてサブ集団の割合を減少させることを意味する。
特定の生体物質(例えば、抗体等のタンパク質)を産生する生物学的微小物体(例えば、生体細胞)の能力は、かかるマイクロ流体デバイスでアッセイされ得る。アッセイの具体的な実施形態では、対象のアナライトを産生するためにアッセイされる生物学的微小物体(例えば、細胞)を含むサンプル材料は、マイクロ流体デバイスの掃引領域に装填され得る。生物学的微小物体(例えば、ヒト細胞等の哺乳動物細胞)のうち、特定の特徴のものを選択して非掃引領域に配置することができる。次いで、残留サンプル材料を掃引領域から流出させ、アッセイ材料を掃引領域に流入させることができる。選択された生物学的微小物体は、非掃引領域内にあるため、選択された生物学的微小物体は、残留サンプル材料の流出又はアッセイ材料の流入の影響を実質的に受けない。選択された生物学的微小物体は、対象のアナライトの産生を可能にし得る。この場合、対象のアナライトは、非掃引領域から掃引領域内に拡散し得、掃引領域では、対象のアナライトは、アッセイ材料と反応して、局在化された検出可能な反応を引き起こすことができ、各反応は、特定の非掃引領域に関連付けられ得る。検出された反応に関連付けられる任意の非掃引領域を分析して、非掃引領域内のいずれの生物学的微小物体(存在する場合)が対象のアナライトの十分なプロデューサーであるかを決定することができる。
マイクロ流体/ナノ流体デバイスにおけるTリンパ球の培養、選択及び増殖。
Tリンパ球は、本明細書に記載のマイクロ流体デバイス及びナノ流体デバイスにおいて培養、選択及び増殖され得る。この節での考察に加えて、培養、選択及び増殖の方法は、発明の概要(以上)、実施例(以下)及び本明細書に添付された特許請求の範囲に記載されている。例示的なワークフローは、図8A~Cに例示される。本開示のマイクロ流体デバイス内でT細胞をはじめとする生体細胞を増殖させる方法は、2016年4月22日出願の米国特許出願公開第15/135,707号(その全内容が参照により本明細書に援用される)にも記載されている。
Tリンパ球は、本明細書に記載のマイクロ流体デバイス及びナノ流体デバイスにおいて培養、選択及び増殖され得る。この節での考察に加えて、培養、選択及び増殖の方法は、発明の概要(以上)、実施例(以下)及び本明細書に添付された特許請求の範囲に記載されている。例示的なワークフローは、図8A~Cに例示される。本開示のマイクロ流体デバイス内でT細胞をはじめとする生体細胞を増殖させる方法は、2016年4月22日出願の米国特許出願公開第15/135,707号(その全内容が参照により本明細書に援用される)にも記載されている。
Tリンパ球の集団は、公知の方法によって得ることができる。幾つかの実施形態では、Tリンパ球を含む末梢血単核細胞(PBMC)が全血サンプル等の血液サンプルから分離される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、細針吸引物又は生検物等の固形腫瘍サンプルから分離される。分離されたTリンパ球の集団は、所望の細胞型を富化され得るか又は望ましくない細胞型を枯渇され得る。富化及び枯渇は、例えば、フローサイトメトリー、T細胞富化カラム、抗体コンジュゲートビーズ(例えば、磁気ビーズ)等を用いて行われ得、所望の細胞を集団から分離すること又は望ましくない細胞を集団から除去すること
等のポジティブ選択又はネガティブ選択をそれぞれ使用し得る。例えば、CD45ROに対する抗体にコンジュゲートされた磁気ビーズを用いて、集団からCD45RO+細胞を枯渇させることができる。他の例として、CD45RAに対する抗体にコンジュゲートされた磁気ビーズを用いて、集団からCD45RA+細胞を枯渇させることができる。
等のポジティブ選択又はネガティブ選択をそれぞれ使用し得る。例えば、CD45ROに対する抗体にコンジュゲートされた磁気ビーズを用いて、集団からCD45RO+細胞を枯渇させることができる。他の例として、CD45RAに対する抗体にコンジュゲートされた磁気ビーズを用いて、集団からCD45RA+細胞を枯渇させることができる。
幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、CD3+Tリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、1個以上のTリンパ球は、末梢血サンプル又は固形腫瘍サンプルから分離されたCD3+Tリンパ球の集団に由来する。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、CD3+CD4+細胞(例えば、ヘルパーT細胞)が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、CD3+CD8+細胞(例えば、細胞傷害性T細胞)が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、CD3+CD4+細胞及びCD3+CD8+細胞の両方が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、CCR7+細胞、例えばCD3+CCR7+細胞、CD3+CD4+CCR7+細胞又はCD3+CD8+CCR7+細胞が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、CD45RA+細胞、例えばCD3+CD45RA+細胞、CD3+CD4+CD45RA+細胞又はCD3+CD8+CD45RA+細胞が富化される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、CD45RO+細胞、例えばCD3+CD45RO+細胞、CD3+CD4+CD45RO+細胞又はCD3+CD8+CD45RO+細胞が富化される。
幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、CD45RO+細胞、CD45RO+CCR7+細胞、CD45RO+CD62L+細胞又はCD45RO+CCR7+CD62L+細胞が枯渇される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、CD45RA+細胞、CD45RA+CCR7+細胞、CD45RA+CD62L+細胞又はCD45RA+CCR7+CD62L+細胞が枯渇される。
マイクロ流体デバイス内のTリンパ球はまた、以上で考察した富化又は枯渇の代わりに又はそれに加えて、所望の又は望ましくないマーカーの存在又は不在に基づいて選択され得る。マイクロ流体チャネルに位置するTリンパ球を隔離ペン内に移動させるために誘電泳動を使用することができる。例えば、Tリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面がCD3+、CD4+、CD8+又はそれらの任意の組合せ(例えば、CD3+CD4+又はCD3+CD8+)であるために選択され得る。選択は、抗体(例えば、蛍光抗体)で標識することと、抗体を伴うTリンパ球を隔離ペン内に移動させることとを含み得る。
幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面がCD45RA+、CCR7+及び/若しくはCD62L+又はそれらの全部であるために選択され得る。CD45RA+は、ナイーブTリンパ球(Tnaive細胞)のマーカーとみなされ、一方、CCR7+及びCD62L+は、Tnaive状態(CD45RA+も存在するかどうかに依存する)に合致するマーカーとみなされる。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面が、Tnaive状態に合致しない少なくとも1つのマーカーを欠いているために選択され得る。例えば、CD45RO+、PD-1+、PD-L1+、CD137+若しくはCD69+の細胞表面又はそれらの任意の組合せを欠いているTリンパ球を選択することができる。幾つかの実施形態では、CD4+細胞表面を有するTリンパ球も選択される。幾つかの実施形態では、CD8+細胞表面を有するTリンパ球も選択される。
幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面がCD45RO+、CCR7+及び/若しくはCD62L+又はそれらの全部であるために選択され得る。CD45RO+マーカーとCC
R7+及び/又はCD62L+マーカーとの組合せは、メモリTリンパ球(例えば、TCM細胞)に合致するとみなされる。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面が、メモリTリンパ球状態に合致しない少なくとも1つのマーカーを欠いているために選択され得る。例えば、CD45RA+、PD-1+、PD-L1+、CD137+若しくはCD69+の細胞表面又はそれらの任意の組合せを欠いているTリンパ球を選択することができる。幾つかの実施形態では、CD4+細胞表面を有するTリンパ球も選択される。幾つかの実施形態では、CD8+細胞表面を有するTリンパ球も選択される。
R7+及び/又はCD62L+マーカーとの組合せは、メモリTリンパ球(例えば、TCM細胞)に合致するとみなされる。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面が、メモリTリンパ球状態に合致しない少なくとも1つのマーカーを欠いているために選択され得る。例えば、CD45RA+、PD-1+、PD-L1+、CD137+若しくはCD69+の細胞表面又はそれらの任意の組合せを欠いているTリンパ球を選択することができる。幾つかの実施形態では、CD4+細胞表面を有するTリンパ球も選択される。幾つかの実施形態では、CD8+細胞表面を有するTリンパ球も選択される。
幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面がCD45RO+、PD-1+及び/若しくはPD-L1+、CD137+又はそれらの組合せであるために選択され得る。PD-1、PD-L1及び/又はCD137マーカーと組み合わされたCD45ROの存在は、エフェクタTリンパ球(TEFF細胞)に合致するとみなされる。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面が、TEFF状態に合致しない少なくとも1つのマーカーを欠いているために選択され得る。例えば、Tリンパ球は、CD45RA、CCR7、CD62L又はそれらの任意の組合せに対する抗体で標識され得、及びCD45RA、CCR7、CD62L又はそれらの組合せに対する抗体を伴わないTリンパ球を(例えば、マイクロ流体チャネルから)マイクロ流体デバイスの隔離ペンに(例えば、誘電泳動を用いて)移動させることができる。
幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面が、Tnaiveに合致しない少なくとも1つ、少なくとも2つ又は少なくとも3つのマーカーを欠いているために選択され得る。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面が、メモリTリンパ球(例えば、TCM又はTEM)状態に合致しない少なくとも1つ、少なくとも2つ又は少なくとも3つのマーカーを欠いているために選択され得る。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面が、TEFF状態に合致しない少なくとも1つ、少なくとも2つ又は少なくとも3つのマーカーを欠いているために選択され得る。
したがって、本明細書に開示される方法は、CD3+CD45RA+CCR7+CD62L+CD45RO-の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ又は全て、例えばCD3+CD45RA+CCR7+CD62L+、CD3+CD45RA+CCR7+CD45RO-、CD3+CD45RA+CD62L+CD45RO-、CD45RA+CCR7+CD62L+CD45RO-、CD3+CCR7+CD62L+CD45RO-、CD3+CD45RA+CCR7+、CD3+CD45RA+CD62L+、CD45RA+CCR7+CD62L+、CD3+CCR7+CD45RO-、CD3+CD62L+CD45RO-、CCR7+CD62L+CD45RO-、CD45RA+CCR7+、CD45RA+CD62L+、CCR7+CD45RO-、CD62L+CD45RO-であるTリンパ球を隔離ペンにさせることを含み得る。上記のタイプのTリンパ球はいずれも、さらに、CD4+若しくはCD8+及び/又はCD69-PD-1-PD-L1-CD137-の少なくとも1つ、2つ、3つ若しくは全て、例えばCD69-PD-L1-PD-1-、CD69-PD-1-CD137-、CD69-PD-L1-CD137-、PD-1-PD-L1-CD137-、CD69-PD-1-、CD69-PD-L1-、CD69-CD137-、PD-1-PD-L1-、PD-1-CD137-、PD-L1-CD137-、CD69-、PD-1-、PD-L1-若しくはCD137-であり得る。
本明細書に開示される方法は、CD3+CD45RA-CCR7+CD62L+CD45RO+の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ又は全て、例えばCD3+CD45RA-CCR7+CD62L+、CD3+CD45RA-CCR7+CD45RO+、CD3+CD45RA-CD62L+CD45RO+、CD3+CCR7+CD62L+CD45RO+、CD45RA-CCR7+CD62L+CD45RO+、CD3+CD45RA-CCR7+、CD3+CD45RA-CD62L+、CD45RA-CCR7+CD62L+、CD3+CCR7+CD45RO+、CD3+CD62L+CD45RO+、CCR7+CD62L+CD45RO+、CD45RA-CCR7+、CD45RA-CD62L+、CCR7+CD45RO+、CD62L+CD45RO+であるTリンパ球を隔離ペン内に移動させることを含み得る。上記のタイプのTリンパ球はいずれも、さらに、CD4+若しくはCD8+及び/又はCD69-PD-1-PD-L1-CD137-の少なくとも1つ、2つ、3つ若しくは全て、例えばCD69-PD-L1-PD-1-、CD69-PD-1-CD137-、CD69-PD-L1-CD137-、PD-1-PD-L1-CD137-、CD69-PD-1-、CD69-PD-L1-、CD69-CD137-、PD-1-PD-L1-、PD-1-CD137-、PD-L1-CD137-、CD69-、PD-1-、PD-L1-若しくはCD137-であり得る。
本明細書に開示される方法は、CD3+CD45RA-PD-1+CD137+CD45RO+の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ又は全て、例えばCD3+CD45RA-PD-1+CD137+、CD3+CD45RA-PD-1+CD45RO+、CD3+CD45RA-CD137+CD45RO+、CD3+PD-1+CD137+CD45RO+、CD45RA-PD-1+CD137+CD45RO+、CD3+CD45RA-PD-1+、CD3+CD45RA-CD137+、CD3+PD-1+CD137+、CD45RA-PD-1+CD137+、CD3+CD45RA-CD45RO+、CD3+PD-1+CD45RO+、CD45RA-PD-1+CD45RO+、CD3+CD137+CD45RO+、CD45RA-CD137+CD45RO+、PD-1+CD137+CD45RO+、CD45RA-PD-1+、CD45RA-CD137+、CD137+CD45RO+又はPD-1+CD45RO+であるTリンパ球を隔離ペン内に移動させることを含み得る。上記のタイプのTリンパ球はいずれも、さらに、CD4+若しくはCD8+及び/又はCD69+PD-L1+CCR7-CD62L-の少なくとも1つ、2つ、3つ若しくは全て、例えばCD69+PD-L1+CCR7-、CD69+PD-L1+CD62L-、CD69+CCR7-CD62L-、PD-L1+CCR7-CD62L-、CD69+PD-L1+、CD69+CCR7-、PD-L1+CCR7-、CD69+CD62L-、PD-L1+CD62L-、CCR7-CD62L-、CD69+、PD-L1+、CCR7-又はCD62L-であり得る。
本明細書に開示される方法は、例えば、誘電泳動により、重力により(例えば、重力によって1個以上のTリンパ球が隔離ペンに引き込まれるようにマイクロ流体デバイスを傾斜させることにより)、遠心力により、又は局在化フローにより、Tリンパ球をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することを含み得る。
幾つかの実施形態では、本方法は、1個以上のTリンパ球と活性化剤とを接触させることを含む。かかる接触は、例えば、Tリンパ球をマイクロ流体デバイスに導入する前に、例えばデバイスへの導入の少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10時間前に又は0.5から2、2から4、4から6、6から8又は8から10時間の期間わたって行われ得る。活性化剤は、Tリンパ球と共に隔離ペンに導入され得る。代替的又は追加的に、接触(例えば、活性化剤の添加)は、Tリンパ球が隔離ペン内にあるときに
行われ得る。幾つかの実施形態では、抗CD3抗体又はアゴニストがリンパ球との接触に使用される。幾つかの実施形態では、抗CD28抗体又はアゴニストは、例えば、抗CD3抗体又はアゴニストと組み合わせてリンパ球との接触に使用される。活性化剤は、溶解可能な形態で提供され得るか、又はビーズに付着され得る。例えば、抗CD3抗体又はアゴニストが付着されたビーズは、可溶性抗CD28抗体又はアゴニストと組み合わせて使用され得る。代替的に、抗CD3抗体又はアゴニスト及び抗CD28抗体又はアゴニストは、両方ともビーズに付着して使用され得る(例えば、両方の抗体を同一のビーズに付着させるか、又は幾つかのビーズを抗CD3抗体に付着可させ、且つ他のビーズを抗CD28抗体に付着させることができる)。幾つかの実施形態では、少なくとも1つの活性化剤(例えば、抗体)、例えば抗CD3抗体は、Tリンパ球がペン内にあるときに刺激が行われるように隔離ペンの表面に付着される。幾つかの実施形態では、抗CD3抗体及び抗CD28抗体の両方は、隔離ペンの表面に付着される。幾つかの実施形態では、抗CD3抗体は、隔離ペンの表面に付着され、及び少なくとも1つのTリンパ球は、隔離ペン内にあるときに可溶性抗CD28抗体にも接触される。典型的には、抗CD3抗体及び抗CD28抗体は、活性化剤として使用する場合、アゴニスト抗体であろう。
行われ得る。幾つかの実施形態では、抗CD3抗体又はアゴニストがリンパ球との接触に使用される。幾つかの実施形態では、抗CD28抗体又はアゴニストは、例えば、抗CD3抗体又はアゴニストと組み合わせてリンパ球との接触に使用される。活性化剤は、溶解可能な形態で提供され得るか、又はビーズに付着され得る。例えば、抗CD3抗体又はアゴニストが付着されたビーズは、可溶性抗CD28抗体又はアゴニストと組み合わせて使用され得る。代替的に、抗CD3抗体又はアゴニスト及び抗CD28抗体又はアゴニストは、両方ともビーズに付着して使用され得る(例えば、両方の抗体を同一のビーズに付着させるか、又は幾つかのビーズを抗CD3抗体に付着可させ、且つ他のビーズを抗CD28抗体に付着させることができる)。幾つかの実施形態では、少なくとも1つの活性化剤(例えば、抗体)、例えば抗CD3抗体は、Tリンパ球がペン内にあるときに刺激が行われるように隔離ペンの表面に付着される。幾つかの実施形態では、抗CD3抗体及び抗CD28抗体の両方は、隔離ペンの表面に付着される。幾つかの実施形態では、抗CD3抗体は、隔離ペンの表面に付着され、及び少なくとも1つのTリンパ球は、隔離ペン内にあるときに可溶性抗CD28抗体にも接触される。典型的には、抗CD3抗体及び抗CD28抗体は、活性化剤として使用する場合、アゴニスト抗体であろう。
幾つかの実施形態では、活性化剤との接触に反応して増殖を行う分離されたTリンパ球は、少なくとも100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍又はそれを超える増殖を呈する。
幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、樹状細胞、例えば自己樹状細胞で刺激される。幾つかの実施形態では、樹状細胞は、1つ以上の抗原、例えば癌由来ペプチド、例えばTリンパ球と同系の癌細胞から分離された抗原又はペプチドで装填(例えば、パルス)される。例えば、以下の実施例3を参照されたい。樹状細胞はまた、Tリンパ球と同系であり得る。代替的に、樹状細胞は、合成抗原で装填(例えば、パルス)され得る。
幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、MHC分子に結合されてペプチド-MHC複合体を形成し得る抗原で刺激される。ペプチド-MHC複合体は、MHCテトラマー構造のように一体に連結され得る。抗原(又は抗原複合体)は、固体担体、例えば1個以上のビーズに付着され得る。代替的に、固体担体は、隔離ペンの少なくとも1つの表面であり得、抗原は、共有結合又は非共有結合で少なくとも1つの表面に結合され得る(例えば、ビオチン-ストレプトアビジン結合相互作用により)。
幾つかの実施形態では、培養培地は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルを通してかん流される。かん流は、例えば、様々なかん流速度における2相又は3相を含むサイクルで間欠的であり得る。幾つかの実施形態では、かん流は、約0.002~0.1μl/secのかん流速度の第1の相と、約0.5~10μl/secのかん流の第2の相との1サイクル以上を含む。サイクルは、例えば、かん流が約0.01μl/sec未満の速度であり、例えば、実質的に停止される第3の相をさらに含み得る。より高いかん流速度の相の長さは、例えば、約1~10分間、例えば1~2分間であり得る。より低いかん流速度の相の長さは、例えば、約0.5分間から約3時間、例えば約1分間から約2時間であり得る。存在する場合、かん流が約0.01μl/sec未満の速度である相の長さは、例えば、約2~30若しくは2~20分間又は約5~10分間であり得る。培養培地は、少なくとも24、48、72、96、120時間若しくはそれを超える時間の期間、又は0.5から10日間、例えば0.5から1、1から2、2から3、3から4、4から5、5から7、6から8、7から9若しくは8から10日間の時間長さにわたってマイクロ流体デバイスの流路を通してかん流され得る。
幾つかの実施形態では、培養培地は、サイトカイン、例えばIL7、IL15、IL21又はそれらの組合せ、例えばIL15及びIL21が追加される。幾つかの実施形態で
は、培養培地は、IL2を含む。かん流(培地が隔離ペンに導入されるアクティブかん流に続くインキュベーションの時間を含み得る)は、例えば、少なくとも1、2、3ラウンド又はそれを超える有糸細胞分裂で1個以上のTリンパ球の増殖を行うのに十分な時間の期間であり得る。幾つかの実施形態では、培養培地は、FBS又は仔ウシ血清と任意選択的に組み合わせたヒトAB血清等の血清を含む。
は、培養培地は、IL2を含む。かん流(培地が隔離ペンに導入されるアクティブかん流に続くインキュベーションの時間を含み得る)は、例えば、少なくとも1、2、3ラウンド又はそれを超える有糸細胞分裂で1個以上のTリンパ球の増殖を行うのに十分な時間の期間であり得る。幾つかの実施形態では、培養培地は、FBS又は仔ウシ血清と任意選択的に組み合わせたヒトAB血清等の血清を含む。
幾つかの実施形態では、20個以下、10個以下、6~10個、5個以下、約5個、約4個、約3個、約2個又は1個のTリンパ球がマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入される。幾つかの実施形態では、20個以下、10個以下、6~10個、5個以下、約5個、約4個、約3個、約2個又は1個のTリンパ球がマイクロ流体デバイスの複数の隔離ペンに導入される。
隔離ペンは、ペン内のTリンパ球が硬質表面に直接接触しないように例えばコーティングを含み得る。幾つかの実施形態では、ペン表面は、デキストラン又はポリエチレングリコールでコーティングされる。幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約5×105から約5×106立方ミクロンの体積を有する。
幾つかの実施形態では、1個以上のTリンパ球の増殖速度が監視される。例えば、これは、所与の隔離ペン内の細胞分裂の頻度を観測することにより、例えばペン内の細胞数を周期的に観測することにより、かん流中に行われ得る。
幾つかの実施形態では、Tリンパ球による1種以上のサイトカイン(例えば、INFγ、TNFα、IL2又はそれらの組合せ)の発現が監視される。幾つかの実施形態では、1種以上の調節性T細胞マーカー、例えばCTLA4の発現が監視される。
以上に記載の監視は、例えば、隔離ペン内のTリンパ球の増殖後に行われ得る。例えば、増殖されたTリンパ球のサンプルは、オンチップ発現アッセイを用いて調節性T細胞マーカー及び/又はサイトカインの発現に関して特徴付けられ得、これについては、例えば米国特許出願公開第2015/0151298号及び同第2015/0165436号並びに米国特許出願公開第15/372,094号(2016年12月7日出願)(そのそれぞれの内容が参照により本明細書に援用される)に記載されている。
幾つかの実施形態では、増殖後、Tリンパ球は、マイクロ流体デバイスから搬出される。幾つかの実施形態では、増殖されたTリンパ球のサンプルは、ゲノムプロファイリング、例えばゲノムシーケンス解析及び/又は発現解析(例えば、RNA-Seq)のためにマイクロ流体デバイスから搬出される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、ゲノムプロファイリング結果、例えば機能喪失突然変異の不在、サイトカイン発現等に基づいて、癌治療等の下流使用のために選択される。幾つかの実施形態では、Tリンパ球は、所定の閾値以上の増殖速度を有すること、例えば少なくとも閾値レベルの増殖を示したこと、例えば約1週間以下の期間にわたって少なくとも100倍の増殖を起こしたことに少なくとも部分的に基づいて選択的に搬出される。選択的搬出は、代替的又は追加的に、1種以上のサイトカイン、例えばINFγ、TNFα、IL2又はそれらの組合せの発現に少なくとも部分的に基づき得る。選択的搬出は、代替的又は追加的に、1種以上の調節性T細胞マーカー、例えばCTLA4等の発現に少なくとも部分的に基づき得る。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスから搬出されたTリンパ球は、例えば、それをTリンパ球が得られた対象等の対象に導入することにより、癌を治療するために使用される。対象は、哺乳動物、例えばヒト又は非ヒト哺乳動物であり得る。
マイクロ流体デバイス及びそのようなデバイスを操作し観測するシステム
図1Aは、Tリンパ球の選択、活性化、拡大、及び/又はクローニングに使用することができるマイクロ流体デバイス100及びシステム150の例を示す。カバー110を一部切り欠き、マイクロ流体デバイス100内の部分図を提供するマイクロ流体デバイス100の斜視図を示す。マイクロ流体デバイス100は、一般に、流路106を含むマイクロ流体回路120を含み、流路106を通って流体培地180が流れることができ、任意選択的に1つ又は複数の微小物体(図示せず)をマイクロ流体回路120内及び/又はマイクロ流体回路120を通して搬送する。1つのマイクロ流体回路120が図1Aに示されているが、適するマイクロ流体デバイスは、複数(例えば、2又は3個)のそのようなマイクロ流体回路を含むことができる。それに関係なく、マイクロ流体デバイス100はナノ流体デバイスであるように構成され得る。図1Aに示されるように、マイクロ流体回路120は、複数のマイクロ流体隔離ペン124、126、128、及び130を含み得、ここで、各隔離ペンは、流路106に流体接続する1つ又は複数の開口部を有し得る。図1Aのデバイスの幾つかの実施形態では、隔離ペンは、流路106と流通する1つのみの開口部を有し得る。さらに以下で考察するように、マイクロ流体隔離ペンは、培地180が流路106を通って流れているときであっても、マイクロ流体デバイス100等のマイクロ流体デバイスに微小物体を保持するように最適化された様々な特徴及び構造を含む。しかし、上記を参照する前に、マイクロ流体デバイス100及びシステム150の概説を提供する。
図1Aは、Tリンパ球の選択、活性化、拡大、及び/又はクローニングに使用することができるマイクロ流体デバイス100及びシステム150の例を示す。カバー110を一部切り欠き、マイクロ流体デバイス100内の部分図を提供するマイクロ流体デバイス100の斜視図を示す。マイクロ流体デバイス100は、一般に、流路106を含むマイクロ流体回路120を含み、流路106を通って流体培地180が流れることができ、任意選択的に1つ又は複数の微小物体(図示せず)をマイクロ流体回路120内及び/又はマイクロ流体回路120を通して搬送する。1つのマイクロ流体回路120が図1Aに示されているが、適するマイクロ流体デバイスは、複数(例えば、2又は3個)のそのようなマイクロ流体回路を含むことができる。それに関係なく、マイクロ流体デバイス100はナノ流体デバイスであるように構成され得る。図1Aに示されるように、マイクロ流体回路120は、複数のマイクロ流体隔離ペン124、126、128、及び130を含み得、ここで、各隔離ペンは、流路106に流体接続する1つ又は複数の開口部を有し得る。図1Aのデバイスの幾つかの実施形態では、隔離ペンは、流路106と流通する1つのみの開口部を有し得る。さらに以下で考察するように、マイクロ流体隔離ペンは、培地180が流路106を通って流れているときであっても、マイクロ流体デバイス100等のマイクロ流体デバイスに微小物体を保持するように最適化された様々な特徴及び構造を含む。しかし、上記を参照する前に、マイクロ流体デバイス100及びシステム150の概説を提供する。
図1Aに概して示されるように、マイクロ流体回路120はエンクロージャ102により画定される。エンクロージャ102は異なる構成で物理的に構造化することができるが、図1Aに示される例では、エンクロージャ102は、支持構造体104(例えば、基部)、マイクロ流体回路構造108、及びカバー110を含むものとして示されている。支持構造体104、マイクロ流体回路構造108、及びカバー110は、互いに取り付けることができる。例えば、マイクロ流体回路構造108は、支持構造体104の内面109に配置することができ、カバー110は、マイクロ流体回路構造108を覆って配置することができる。支持構造体104及びカバー110と一緒に、マイクロ流体回路構造108は、マイクロ流体回路120の要素を画定することができる。
図1Aに示されるように、支持構造体104は、マイクロ流体回路120の下部にあり得、カバー110はマイクロ流体回路120の上部にあり得る。代替的に、支持構造体104及びカバー110は、他の向きで構成され得る。例えば、支持構造体104は、マイクロ流体回路120の上部にあり得、カバー110はマイクロ流体回路120の下部にあり得る。それに関係なく、それぞれがエンクロージャ102内又は外への通路を含む1つ又は複数のポート107があり得る。通路の例としては、弁、ゲート、貫通孔等が挙げられる。示されるように、ポート107は、マイクロ流体回路構造108のギャップにより作られる貫通孔である。しかし、ポート107は、カバー110等のエンクロージャ102の他の構成要素に配置することができる。1つのみのポート107が図1Aに示されているが、マイクロ流体回路120は2つ以上のポート107を有することができる。例えば、流体がマイクロ流体回路120に入るための流入口として機能する第1のポート107があり得、流体がマイクロ流体回路120を出るための流出口として機能する第2のポート107があり得る。ポート107が流入口として機能するか、それとも流出口として機能するかは、流体が流路106を通って流れる方向に依存し得る。
支持構造体104は、1つ又は複数の電極(図示せず)と、基板又は複数の相互接続された基板を含むことができる。例えば、支持構造体104は、1つ又は複数の半導体基板を含むことができ、各半導体基板は電極に電気的に接続される(例えば、半導体基板の全て又はサブセットは、1つの電極に電気的に接続することができる)。支持構造体104は、プリント回路基板組立体(「PCBA」)をさらに含むことができる。例えば、半導体基板はPCBA上に搭載することができる。
マイクロ流体回路構造108は、マイクロ流体回路120の回路要素を画定することができる。そのような回路要素は、マイクロ流体回路120に流体が充填される場合、流体的に相互接続することができる、流路(1つ又は複数のフローチャネルを含み得る)、チャンバ、ペン、トラップ等の空間又は領域を含むことができる。図1Aに示されるマイクロ流体回路120では、マイクロ流体回路108は、枠114及びマイクロ流体回路材料116を含む。枠114は、マイクロ流体回路材料116を部分的又は完全に囲むことができる。枠114は、例えば、マイクロ流体回路材料116を実質的に囲む比較的剛性の構造であり得る。例えば、枠114は金属材料を含むことができる。
マイクロ流体回路材料116には、キャビティ等をパターニングして、マイクロ流体回路120の回路要素及び相互接続を画定することができる。マイクロ流体回路材料116は、ガス透過可能であり得る可撓性ポリマー(例えば、ゴム、プラスチック、エラストマー、シリコーン、ポリジメチルシロキサン(「PDMS」)等)等の可撓性材料を含むことができる。マイクロ流体回路材料116を構成することができる材料の他の例としては、成形ガラス、シリコーン(フォトパターニング可能シリコーン又は「PPS」)等のエッチング可能材料、フォトレジスト(例えば、SU8)等が挙げられる。幾つかの実施形態では、そのような材料 - したがって、マイクロ流体回路材料116 - は、剛性及び/又はガスを実質的に不透過であり得る。それに関係なく、マイクロ流体回路材料116は、支持構造体104上及び枠114内部に配置することができる。
カバー110は、枠114及び/又はマイクロ流体回路材料116の一体部分であり得る。代替的に、カバー110は、図1Aに示されるように、構造的に別個の要素であり得る。カバー110は、枠114及び/又はマイクロ流体回路材料116と同じ又は異なる材料を含むことができる。同様に、支持構造体104は、示されるように枠114若しくはマイクロ流体回路材料116とは別個の構造であってもよく、又は枠114若しくはマイクロ流体回路材料116の一体部分であってもよい。同様に、枠114及びマイクロ流体回路材料116は、図1Aに示されるように別個の構造であってもよく、又は同じ構造の一体部分であってもよい。
幾つかの実施形態では、カバー110は剛性材料を含むことができる。剛性材料は、ガラス又は同様との特性を有する材料であり得る。幾つかの実施形態では、カバー110は変形可能材料を含むことができる。変形可能材料は、PDMS等のポリマーであり得る。幾つかの実施形態では、カバー110は、剛性材料及び変形可能材料の両方を含むことができる。例えば、カバー110の1つ又は複数の部分(例えば、隔離ペン124、126、128、130上に位置する1つ又は複数の部分)は、カバー110の剛性材料と界面を接する変形可能材料を含むことができる。幾つかの実施形態では、カバー110は1つ又は複数の電極をさらに含むことができる。1つ又は複数の電極は、ガラス又は同様の絶縁材料でコーティングし得る、インジウム-錫-酸化物(ITO)等の導電性酸化物を含むことができる。代替的に、1つ又は複数の電極は、ポリマー(例えば、PDMS)等の変形可能ポリマーに埋め込まれた単層ナノチューブ、多層ナノチューブ、ナノワイヤ、導電性ナノ粒子のクラスタ、又はそれらの組合せ等の可撓性電極であり得る。マイクロ流体デバイスで使用することができる可撓性電極は、例えば、米国特許出願公開第2012/0325665号(Chiouら)に記載されており、この内容は参照により本明細書に援用
される。幾つかの実施形態では、カバー110は、細胞の接着、生存、及び/又は成長を支持するように変更することができる(例えば、マイクロ流体回路120に向かって内側に面する表面の全て又は部分を調整することにより)。変更は、合成ポリマー又は天然ポリマーのコーティングを含み得る。幾つかの実施形態では、カバー110及び/又は支持構造体104は、光を透過することができる。カバー110は、ガス透過可能な少なくとも1つの材料(例えば、PDMS又はPPS)を含むこともできる。
される。幾つかの実施形態では、カバー110は、細胞の接着、生存、及び/又は成長を支持するように変更することができる(例えば、マイクロ流体回路120に向かって内側に面する表面の全て又は部分を調整することにより)。変更は、合成ポリマー又は天然ポリマーのコーティングを含み得る。幾つかの実施形態では、カバー110及び/又は支持構造体104は、光を透過することができる。カバー110は、ガス透過可能な少なくとも1つの材料(例えば、PDMS又はPPS)を含むこともできる。
図1Aは、マイクロ流体デバイス100等のマイクロ流体デバイスを動作させ制御するシステム150も示す。システム150は、電源192、撮像デバイス194(撮像モジュール164内に組み込まれ、デバイス194自体は図1Aに示されていない)、及び傾斜デバイス190(傾斜モジュール166の部分であり、デバイス190は図1Aに示されていない)を含む。
電源192は、電力をマイクロ流体デバイス100及び/又は傾斜デバイス190に提供し、バイアス電圧又は電流を必要に応じて提供することができる。電源192は、例えば、1つ又は複数の交流(AC)及び/又は直流(DC)電圧源又は電流源を含むことができる。撮像デバイス194(以下で述べられる撮像モジュール164の一部)は、マイクロ流体回路120内部の画像を捕捉する、デジタルカメラ等のデバイスを含むことができる。幾つかの場合、撮像デバイス194は、高速フレームレート及び/又は高感度(例えば、低光用途用)を有する検出器をさらに含む。撮像デバイス194は、刺激放射線及び/又は光線をマイクロ流体回路120内に向け、マイクロ流体回路120(又はマイクロ流体回路120内に含まれる微小物体)から反射されるか、又は発せられる放射線及び/又は光線を収集する機構を含むこともできる。発せられる光線は可視スペクトル内であり得、例えば、蛍光放射を含み得る。反射光線は、LED又は水銀灯(例えば、高圧水銀灯)若しくはキセノンアーク灯等の広域スペクトル灯から発せられた反射放射を含み得る。図3Bに関して考察するように、撮像デバイス194は顕微鏡(又は光学縦列)をさらに含み得、これは接眼レンズを含んでもよく、又は含まなくてもよい。
システム150は、1つ又は複数の回転軸の周りでマイクロ流体デバイス100を回転させるように構成される傾斜デバイス190(以下で述べられる傾斜モジュール166の一部)をさらに含む。幾つかの実施形態では、傾斜デバイス190は、マイクロ流体デバイス100(したがって、マイクロ流体回路120)を水平向き(すなわち、x軸及びy軸に相対して0°)、垂直向き(すなわち、x軸及び/又はy軸に相対して90°)、又はそれらの間の任意の向きで保持することができるように、少なくとも1つの軸の周りでマイクロ流体回路120を含むエンクロージャ102を支持及び/又は保持するように構成される。軸に相対するマイクロ流体デバイス100(及びマイクロ流体回路120)の向きは、本明細書では、マイクロ流体デバイス100(及びマイクロ流体回路120)の「傾斜」と呼ばれる。例えば、傾斜デバイス190は、x軸に相対して0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°、又はそれらの間の任意の度数でマイクロ流体デバイス100を傾斜させることができる。水平向き(したがって、x軸及びy軸)は、重力により定義される垂直軸に垂直なものとして定義される。傾斜デバイスは、マイクロ流体デバイス100(及びマイクロ流体回路120)をx軸及び/又はy軸に相対して90°よりも大きい任意の角度に傾斜させるか、又はマイクロ流体デバイス100(及びマイクロ流体回路120)をx軸若しくはy軸に相対して180°に傾斜させて、マイクロ流体デバイス100(及びマイクロ流体回路120)を真逆にすることもできる。同様に、幾つかの実施形態では、傾斜デバイス190は、流路106又はマイクロ流体回路120の何らかの他の部分により定義される回転軸の周りでマイクロ流体デバイス100(及びマイクロ流体回路120)を傾斜させる。
幾つかの場合、マイクロ流体デバイス100は、流路106が1つ又は複数の隔離ペンの上方又は下方に位置するように、垂直向きに傾斜する。「上方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路106が、重力により定義される垂直軸上で1つ又は複数の隔離ペンよりも高く位置する(すなわち、流路106の上方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも高い重力位置エネルギーを有する)ことを示す。「下方」という用語は、本明
細書で使用される場合、流路106が、重力により定義される垂直軸上で1つ又は複数の隔離ペンよりも下に位置する(すなわち、流路106の下方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも低い重力位置エネルギーを有する)ことを示す。
細書で使用される場合、流路106が、重力により定義される垂直軸上で1つ又は複数の隔離ペンよりも下に位置する(すなわち、流路106の下方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも低い重力位置エネルギーを有する)ことを示す。
幾つかの場合、傾斜デバイス190は、流路106と平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス100を傾斜させる。さらに、マイクロ流体デバイス100は、流路106が、隔離ペンの真上又は真下に配置されずに、1つ又は複数の隔離ペンの上方又は下方に配置されるように、90°未満の角度に傾斜することができる。他の場合、傾斜デバイス190は、流路106に直交する軸の周りでマイクロ流体デバイス100を傾斜させる。さらに他の場合、傾斜デバイス190は、流路106に平行でもなく直交もしない軸の周りでマイクロ流体デバイス100を傾斜させる。
システム150は培地源178をさらに含むことができる。培地源178(例えば、容器、リザーバ等)は、それぞれが異なる流体培地180を保持する複数のセクション又は容器を含むことができる。したがって、培地源178は、図1Aに示されるように、マイクロ流体デバイス100の外部にある、マイクロ流体デバイス100とは別個のデバイスであり得る。代替的に、培地源178は、全体的又は部分的に、マイクロ流体デバイス100のエンクロージャ102内部に配置することができる。例えば、培地源178は、マイクロ流体デバイス100の部分であるリザーバを含むことができる。
図1Aは、システム150の一部を構成し、マイクロ流体デバイス100と併せて利用することができる制御及び監視機器152の例の簡易ブロック図表現も示す。示されるように、そのような制御及び監視機器152の例は、培地源178を制御する培地モジュール160と、マイクロ流体回路120での微小物体(図示せず)及び/又は培地(例えば、培地の液滴)の移動及び/又は選択を制御する原動モジュール162と、画像(例えば、デジタル画像)を捕捉する撮像デバイス194(例えば、カメラ、顕微鏡、光源、又はそれらの任意の組合せ)を制御する撮像モジュール164と、傾斜デバイス190を制御する傾斜モジュール166とを含むマスタコントローラ154を含む。制御機器152は、マイクロ流体デバイス100に関する他の機能を制御、監視、又は実行する他のモジュール168を含むこともできる。示されるように、機器152は、表示デバイス170及び入/出力デバイス172をさらに含むことができる。
マスタコントローラ154は、制御モジュール156及びデジタルメモリ158を含むことができる。制御モジュール156は、例えば、メモリ158内に非一時的データ又は信号として記憶される機械実行可能命令(例えば、ソフトウェア、ファームウェア、ソースコード等)に従って動作するように構成されるデジタルプロセッサを含むことができる。代替的に又は追加として、制御モジュール156は、ハードワイヤードデジタル回路及び/又はアナログ回路を含むことができる。培地モジュール160、原動モジュール162、撮像モジュール164、傾斜モジュール166、及び/又は他のモジュール168は、同様に構成され得る。したがって、マイクロ流体デバイス100又は任意の他のマイクロ流体装置に関して実行されるものとして本明細書で考察される機能、プロセス、行動、動作、又はプロセスのステップは、上述したように構成されるマスタコントローラ154、培地モジュール160、原動モジュール162、撮像モジュール164、傾斜モジュール166、及び/又は他のモジュール168の任意の1つ又は複数により実行され得る。同様に、マスタコントローラ154、培地モジュール160、原動モジュール162、撮像モジュール164、傾斜モジュール166、及び/又は他のモジュール168は、通信可能に結合されて、本明細書において考察される任意の機能、プロセス、行動、動作、又はステップで使用されるデータを送受信し得る。
培地モジュール160は培地源178を制御する。例えば、培地モジュール160は、
培地源178を制御して、選択された流体培地180をエンクロージャ102に入れる(例えば、流入口107を介して)ことができる。培地モジュール160は、エンクロージャ102からの培地の取り出し(例えば、流出口(図示せず)を通して)を制御することもできる。したがって、1つ又は複数の培地を選択的にマイクロ流体回路120に入れ、マイクロ流体回路120から搬出することができる。培地モジュール160は、マイクロ流体回路120内部の流路106での流体培地180のフローを制御することもできる。例えば、幾つかの実施形態では、培地モジュール160は、傾斜モジュール166が傾斜デバイス190に所望の傾斜角までマイクロ流体デバイス100を傾斜させる前に、流路106内及びエンクロージャ102を通る培地180のフローを停止させる。
培地源178を制御して、選択された流体培地180をエンクロージャ102に入れる(例えば、流入口107を介して)ことができる。培地モジュール160は、エンクロージャ102からの培地の取り出し(例えば、流出口(図示せず)を通して)を制御することもできる。したがって、1つ又は複数の培地を選択的にマイクロ流体回路120に入れ、マイクロ流体回路120から搬出することができる。培地モジュール160は、マイクロ流体回路120内部の流路106での流体培地180のフローを制御することもできる。例えば、幾つかの実施形態では、培地モジュール160は、傾斜モジュール166が傾斜デバイス190に所望の傾斜角までマイクロ流体デバイス100を傾斜させる前に、流路106内及びエンクロージャ102を通る培地180のフローを停止させる。
原動モジュール162は、マイクロ流体回路120での微小物体(図示せず)の選択、捕捉、及び移動を制御するように構成され得る。図1B及び図1Cに関して後述するように、エンクロージャ102は、誘電泳動(DEP)構成、光電子ピンセット(OET)構成、及び/又は光電子ウェッティング(OEW)構成(図1Aに示されず)を含むことができ、原動モジュール162は、電極及び/又はトランジスタ(例えば、フォトトランジスタ)のアクティブ化を制御して、流路106及び/又は隔離ペン124、126、128、130で微小物体(図示せず)及び/又は培地の液滴(図示せず)を選択し移動させることができる。
撮像モジュール164は撮像デバイス194を制御することができる。例えば、撮像モジュール164は、撮像デバイス194から画像データを受信し、処理することができる。撮像デバイス194からの画像データは、撮像デバイス194により捕捉された任意のタイプの情報を含むことができる(例えば、微小物体、培地の液滴、蛍光標識等の標識の蓄積の有無等)。撮像デバイス194により捕捉された情報を使用して、撮像モジュール164は、物体(例えば、微小物体、培地の液滴)の位置及び/又はマイクロ流体デバイス100内のそのような物体の移動速度をさらに計算することができる。
傾斜モジュール166は、傾斜デバイス190の傾斜移動を制御することができる。代替的に又は追加として、傾斜モジュール166は、重力を介して1つ又は複数の隔離ペンへの微小物体の移送を最適化するように、傾斜率及びタイミングを制御することができる。傾斜モジュール166は、撮像モジュール164と通信可能に結合されて、マイクロ流体回路120での微小物体及び/又は培地の液滴の移動を記述するデータを受信する。このデータを使用して、傾斜モジュール166は、マイクロ流体回路120の傾斜を調整して、マイクロ流体回路120内で微小物体及び/又は培地の液滴が移動する率を調整し得る。傾斜モジュール166は、このデータを使用して、マイクロ流体回路120内での微小物体及び/又は培地の液滴の位置を繰り返し調整することもできる。
図1Aに示される例では、マイクロ流体回路120は、マイクロ流体チャネル122及び隔離ペン124、126、128、130を含むものとして示されている。各ペンは、チャネル122への開口部を含むが、ペンがペン内部の微小物体を流体培地180及び/又はチャネル122の流路106又は他のペン内の微小物体から実質的に分離することができるように、その他では閉じられている。隔離ペンの壁は、ベースの内面109からカバー110の内面まで延び、エンクロージャを提供する。マイクロ流体チャネル122へのペンの開口部は、フロー106がペン内に向けられないように、フロー106に対して傾斜して向けられる。フローは、ペンの開口部の平面に対して接線方向にあり得るか又は直交し得る。幾つかの場合、ペン124、126、128、130は、1つ又は複数の微小物体をマイクロ流体回路120内に物理的に囲い入れるように構成される。本開示による隔離ペンは、以下に詳細に考察し示すように、DEP、OET、OEW、流体フロー、重力、及び/又は遠心力との併用に最適化された様々な形状、表面、及び特徴を含むことができる。
マイクロ流体回路120は、任意の数のマイクロ流体隔離ペンを含み得る。5つの隔離ペンが示されているが、マイクロ流体回路120は、より少数又はより多数の隔離ペンを有し得る。示されるように、マイクロ流体回路120のマイクロ流体隔離ペン124、126、128、及び130は、生物学的微小物体を維持、単離、アッセイ、刺激(例えば、活性化)又は培養するために有用な1つ又は複数の利点を提供し得る異なる特徴及び形状をそれぞれ含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路120は、複数の同一のマイクロ流体隔離ペンを含む。
図1Aに示される実施形態では、1つのチャネル122及び流路106が示される。しかし、他の実施形態は、それぞれが流路106を含むように構成される複数のチャネル122を含み得る。マイクロ流体回路120は、流路106及び流体培地180と流体連通する流入弁又はポート107をさらに含み、それにより、流体培地180は、流入口107を介してチャネル122にアクセスすることができる。幾つかの場合、流路106は1つの経路を含む。幾つかの場合、1つの経路はジグザグパターンで配置され、それにより、流路106は、交互になった方向で2回以上にわたってマイクロ流体デバイス100にわたり移動する。
幾つかの場合、マイクロ流体回路120は、複数の平行チャネル122及び流路106を含み、各流路106内の流体培地180は同じ方向に流れる。幾つかの場合、各流路106内の流体培地は、順方向又は逆方向の少なくとも一方で流れる。幾つかの場合、複数の隔離ペンは、隔離ペンが標的微小物体と並列に配置されることができるように構成される(例えば、チャネル122に相対して)。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路120は、1つ又は複数の微小物体トラップ132をさらに含む。トラップ132は、一般に、チャネル122の境界を形成する壁に形成され、マイクロ流体隔離ペン124、126、128、130の1つ又は複数の開口部の逆に位置し得る。幾つかの実施形態では、トラップ132は、流路106から1つの微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの実施形態では、トラップ132は、流路106から複数の微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの場合、トラップ132は、1つの標的微小物体の容積に概ね等しい容積を含む。
トラップ132は、標的微小物体のトラップ132へのフローを支援するように構成される開口部をさらに含み得る。幾つかの場合、トラップ132は、1つの標的微小物体の寸法に概ね等しい高さ及び幅を有する開口部を含み、それにより、より大きい微小物体が微小物体トラップに入らないようにされる。トラップ132は、トラップ132内への標的微小物体の保持を支援するように構成される他の特徴をさらに含み得る。幾つかの場合、トラップ132は、微小流体隔離ペンの開口部と位置合わせされ、微小流体隔離ペンの開口部に関してチャネル122の逆側に配置され、それにより、マイクロ流体チャネル122に平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス100を傾斜されると、捕捉された微小物体は、微小物体を隔離ペンの開口部に落とす軌道でトラップ132を出る。幾つかの場合、トラップ132は、標的微小物体よりも小さく、トラップ132を通るフローを促進し、それによりトラップ132内への微小物体の捕捉確率を増大させるサイド通路134を含む。
幾つかの実施形態では、誘電泳動(DEP)力は、1つ又は複数の電極(図示せず)を介して流体培地180にわたり適用されて(例えば、流路及び/又は隔離ペンにおいて)、内部に配置された微小物体の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、DEP力は、マイクロ流体回路120の1つ又は複数の部分に適用されて、1つの微小物体を流路106から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実
施形態では、DEP力を使用して、隔離ペン(例えば、隔離ペン124、126、128、又は130)内の微小物体が隔離ペンから変位しないようにする。さらに、幾つかの実施形態では、DEP力を使用して、本開示の形態により前に収集された微小物体を隔離ペンから選択的に取り出す。幾つかの実施形態では、DEP力は、光電子ピンセット(OET)力を含む。
施形態では、DEP力を使用して、隔離ペン(例えば、隔離ペン124、126、128、又は130)内の微小物体が隔離ペンから変位しないようにする。さらに、幾つかの実施形態では、DEP力を使用して、本開示の形態により前に収集された微小物体を隔離ペンから選択的に取り出す。幾つかの実施形態では、DEP力は、光電子ピンセット(OET)力を含む。
他の実施形態では、光電子ウェッティング(OEW)力が、1つ又は複数の電極(図示せず)を介してマイクロ流体デバイス100の支持構造体104(及び/又はカバー110)での1つ又は複数の位置(例えば、流路及び/又は隔離ペンの画定に役立つ位置)に適用されて、マイクロ流体回路120に配置された液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、OEW力は支持構造体104(及び/又はカバー110)の1つ又は複数の位置に適用されて、1つの液滴を流路106から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実施形態では、OEW力を使用して、隔離ペン(例えば、隔離ペン124、126、128、又は130)内の液滴が隔離ペンから変位しないようにする。さらに、幾つかの実施形態では、OEW力を使用して、本開示の形態により前に収集された液滴を隔離ペンから選択的に取り出す。
幾つかの実施形態では、DEP力及び/又はOEW力は、フロー及び/又は重力等の他の力と組み合わせられて、マイクロ流体回路120内の微小物体及び/又は液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、エンクロージャ102は傾斜して(例えば、傾斜デバイス190により)、流路106及び流路106内に配置された微小物体をマイクロ流体隔離ペンの上に位置決めすることができ、重力は、微小物体及び/又は液滴をペン内に輸送することができる。幾つかの実施形態では、DEP力及び/又はOEW力は、他の力の前に適用することができる。他の実施形態では、DEP力及び/又はOEW力は、他の力の後に適用することができる。さらに他の場合、DEP力及び/又はOEW力は、他の力と同時に又は他の力と交互に適用することができる。
図1B、図1C及び図2A~図2Hは、本開示の形態に使用することができるマイクロ流体デバイスの様々な実施形態を示す。図1Bは、マイクロ流体デバイス200が光学作動動電学的デバイスとして構成される実施形態を示す。光電子ピンセット(OET)構成を有するデバイス及び光電子ウェッティング(OEW)構成を有するデバイスを含め、様々な光学作動動電学的デバイスが当技術分野で既知である。適するOET構成の例は、以下の米国特許文献に示されており、各文献は全体的に参照により本明細書に援用される:米国特許第RE44,711号(Wuら)(元々は米国特許第7,612,355号として発行された);及び米国特許第7,956,339号(Ohtaら)。OEW構成の例は、米国特許第6,958,132号(Chiouら)及び米国特許出願公開第2012/0024
708号(Chiouら)に示されており、これらは両方とも全体的に参照により本明細書に
援用される。光学作動動電的デバイスのさらに別の例は、OET/OEW結合構成を含み、その例は、米国特許出願公開第20150306598号(Khandrosら)及び同第20150306599号(Khandrosら)並びにそれらの対応するPCT公報である国際公開第2015/164846号及び国際公開第2015/164847号に示されており、これらは全て全体的に参照により本明細書に援用される。
708号(Chiouら)に示されており、これらは両方とも全体的に参照により本明細書に
援用される。光学作動動電的デバイスのさらに別の例は、OET/OEW結合構成を含み、その例は、米国特許出願公開第20150306598号(Khandrosら)及び同第20150306599号(Khandrosら)並びにそれらの対応するPCT公報である国際公開第2015/164846号及び国際公開第2015/164847号に示されており、これらは全て全体的に参照により本明細書に援用される。
生物学的微小物体を配置し、培養し、及び/又は監視することができる隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第2014/0116881号(出願番号14/060,117、2013年10月22日出願)、米国特許出願公開第2015/0151298号(出願番号14/520,568、2014年10月22日出願)、及び米国特許出願公開第2015/0165436号(出願番号14/521,447、2014年10月22日出願)に記載されており、これらはそれぞれ全体的に参照により援用される。米国特許出願公開第14/520,568号及び同第14/52
1,447号は、マイクロ流体デバイスで培養された細胞の分泌物を分析する例示的な方法についても記載している。上記の各出願は、光電子ツイーザ(OET)等の誘電泳動(DEP)力を生成するように構成されるか、又は光電子ウェッティング(OEW)を提供するように構成されるマイクロ流体デバイスをさらに記載している。例えば、米国特許出願公開第2014/0116881号の図2に示される光電子ツイーザデバイスは、本開示の実施形態で利用して、個々の生物学的微小物体又は生物学的微小物体のグループを選択し移動させることができるデバイスの例である。
1,447号は、マイクロ流体デバイスで培養された細胞の分泌物を分析する例示的な方法についても記載している。上記の各出願は、光電子ツイーザ(OET)等の誘電泳動(DEP)力を生成するように構成されるか、又は光電子ウェッティング(OEW)を提供するように構成されるマイクロ流体デバイスをさらに記載している。例えば、米国特許出願公開第2014/0116881号の図2に示される光電子ツイーザデバイスは、本開示の実施形態で利用して、個々の生物学的微小物体又は生物学的微小物体のグループを選択し移動させることができるデバイスの例である。
原動マイクロ流体デバイス構成
上述したように、システムの制御及び監視機器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路において微小物体又は液滴等の物体を選択し移動させる原動モジュールを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、移動される物体のタイプ及び他の考慮事項に応じて様々な原動構成を有することができる。例えば、誘電泳動(DEP)構成を利用して、マイクロ流体回路において微小物体を選択し移動させることができる。したがって、マイクロ流体デバイス100の支持構造体104及び/又はカバー110は、マイクロ流体回路120内の流体培地180内の微小物体に対してDEP力を選択的に誘導し、それにより個々の微小物体又は微小物体群の選択、捕捉、及び/又は移動を行うDEP構成を含むことができる。代替的に、マイクロ流体デバイス100の支持構造体104及び/又はカバー110は、マイクロ流体回路120内の流体培地180内の液滴に対して電子ウェッティング(EW)力を選択的に誘導し、それにより個々の液滴又は液滴群の選択、捕捉、及び/又は移動を行う電子ウェッティング(EW)構成を含むことができる。
上述したように、システムの制御及び監視機器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路において微小物体又は液滴等の物体を選択し移動させる原動モジュールを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、移動される物体のタイプ及び他の考慮事項に応じて様々な原動構成を有することができる。例えば、誘電泳動(DEP)構成を利用して、マイクロ流体回路において微小物体を選択し移動させることができる。したがって、マイクロ流体デバイス100の支持構造体104及び/又はカバー110は、マイクロ流体回路120内の流体培地180内の微小物体に対してDEP力を選択的に誘導し、それにより個々の微小物体又は微小物体群の選択、捕捉、及び/又は移動を行うDEP構成を含むことができる。代替的に、マイクロ流体デバイス100の支持構造体104及び/又はカバー110は、マイクロ流体回路120内の流体培地180内の液滴に対して電子ウェッティング(EW)力を選択的に誘導し、それにより個々の液滴又は液滴群の選択、捕捉、及び/又は移動を行う電子ウェッティング(EW)構成を含むことができる。
DEP構成を含むマイクロ流体デバイス200の一例を図1B及び図1Cに示す。簡潔にするために、図1B及び図1Cは、領域/チャンバ202を有するマイクロ流体デバイス200のエンクロージャ102の部分の側面断面図及び上面断面図をそれぞれ示すが、領域/チャンバ202が、成長チャンバ、隔離ペン、流路、又はフローチャネル等のより詳細な構造を有する流体回路要素の部分であり得ることを理解されたい。さらに、マイクロ流体デバイス200は他の流体回路要素を含み得る。例えば、マイクロ流体デバイス200は、マイクロ流体デバイス100に関して本明細書に記載される等の複数の成長チャンバ、或いは隔離ペン及び/又は1つ若しくは複数のフロー領域又はフローチャネルを含むことができる。DEP構成は、マイクロ流体デバイス200の任意のそのような流体回路要素に組み込み得るか、又はその部分を選択し得る。上記又は下記の任意のマイクロ流体デバイス構成要素及びシステム構成要素がマイクロ流体デバイス200内に組みこまれ得、及び/又はマイクロ流体デバイス200と組み合わせて使用し得ることをさらに理解されたい。例えば、培地モジュール160、原動モジュール162、撮像モジュール164、傾斜モジュール166、及び他のモジュール168の1つ又は複数を含む上述した制御及び監視機器152を含むシステム150は、マイクロ流体デバイス200と併用し得る。
図1Bにおいて見られるように、マイクロ流体デバイス200は、下部電極204及び下部電極204に重なる電極活性化基板206を有する支持構造体104と、上部電極210を有するカバー110とを含み、上部電極210は下部電極204から離間される。上部電極210及び電極活性化基板206は、領域/チャンバ202の両面を画定する。したがって、領域/チャンバ202に含まれる培地180は、上部電極210と電極活性化基板206との間に抵抗接続を提供する。下部電極204と上部電極210との間に接続され、領域/チャンバ202でのDEP力の生成のために必要に応じて電極間にバイアス電圧を生成するように構成される電源212も示されている。電源212は、例えば、交流(AC)電源であり得る。
特定の実施形態では、図1B及び図1Cに示されるマイクロ流体デバイス200は、光
学作動DEP構成を有することができる。したがって、原動モジュール162により制御し得る光源216からの光218の変更パターンは、電極活性化基板206の内面208の領域214においてDEP電極の変更パターンを選択的に活性化又は非活性化することができる。(以下ではDEP構成を有するマイクロ流体デバイスの領域214を「DEP電極領域」と呼ぶ)。図1Cに示されるように、電極活性化基板206の内面208に向けられる光パターン218は、正方形等のパターンで、選択されたDEP電極領域214a(白色で示される)を照明することができる。照明されないDEP電極領域214(斜線が付される)を以下では「暗」DEP電極領域214と呼ぶ。DEP電極活性化基板206を通る相対電気インピーダンス(すなわち、下部電極204から、流路106において培地180と界面を接する電極活性化基板206の内面208まで)は、各暗DEP電極領域214での領域/チャンバ202において培地180を通る(すなわち、電極活性化基板206の内面208からカバー110の上部電極210まで)相対電気インピーダンスよりも大きい。しかし、照明DEP電極領域214aは、各照明DEP電極領域214aでの領域/チャンバ202での培地180を通る相対インピーダンス未満である電極活性化基板206を通る相対インピーダンスの低減を示す。
学作動DEP構成を有することができる。したがって、原動モジュール162により制御し得る光源216からの光218の変更パターンは、電極活性化基板206の内面208の領域214においてDEP電極の変更パターンを選択的に活性化又は非活性化することができる。(以下ではDEP構成を有するマイクロ流体デバイスの領域214を「DEP電極領域」と呼ぶ)。図1Cに示されるように、電極活性化基板206の内面208に向けられる光パターン218は、正方形等のパターンで、選択されたDEP電極領域214a(白色で示される)を照明することができる。照明されないDEP電極領域214(斜線が付される)を以下では「暗」DEP電極領域214と呼ぶ。DEP電極活性化基板206を通る相対電気インピーダンス(すなわち、下部電極204から、流路106において培地180と界面を接する電極活性化基板206の内面208まで)は、各暗DEP電極領域214での領域/チャンバ202において培地180を通る(すなわち、電極活性化基板206の内面208からカバー110の上部電極210まで)相対電気インピーダンスよりも大きい。しかし、照明DEP電極領域214aは、各照明DEP電極領域214aでの領域/チャンバ202での培地180を通る相対インピーダンス未満である電極活性化基板206を通る相対インピーダンスの低減を示す。
電源212が活性化されている場合、上記のDEP構成は、照明DEP電極領域214aと隣接する暗DEP電極領域214との間に流体培地180内で電場勾配を生じさせ、次に、電場勾配は、流体培地180内の付近の微小物体(図示せず)を引き寄せるか、又は排斥する局所DEP力を生成する。したがって、流体培地180内の微小物体を引き寄せるか、又は排斥するDEP電極は、光源216からマイクロ流体デバイス200に投射される光パターン218を変更することにより、領域/チャンバ202の内面208での多くの異なるそのようなDEP電極領域214において選択的に活性化及び非活性化することができる。DEP力が付近の微小物体を引き寄せるか、それとも排斥するかは、電源212の周波数並びに培地180及び/又は微小物体(図示せず)の誘電特性等のパラメータに依存し得る。
図1Cに示される照明DEP電極領域214aの正方形パターン220は単なる例である。マイクロ流体デバイス200に投射される光パターン218により、任意のパターンのDEP電極領域214を照明する(それにより活性化する)ことができ、照明/活性化されるDEP電極領域214のパターンは、光パターン218を変更又は移動させることにより繰り返し変更することができる。
幾つかの実施形態では、電極活性化基板206は、光伝導性材料を含むか、又は光導電性材料からなることができる。そのような実施形態では、電極活性化基板206の内面208は、特徴を有さないことができる。例えば、電極活性化基板206は、水素化非晶質シリコン(a-Si:H)の層を含むか、又はa-Si:Hの層からなることができる。a-Si:Hは、例えば、約8%~40%の水素を含むことができる(水素原子の数/水素及びケイ素原子の総数に100を掛けたものとして計算)。a-Si:Hの層は厚さ約500nm~約2.0μmを有することができる。そのような実施形態では、DEP電極領域214は、光パターン218により、電極活性化基板206の内面208上の任意の場所に任意のパターンで作成することができる。したがって、DEP電極領域214の数及びパターンは、固定される必要がなく、光パターン218に対応することができる。上述したような光伝導層を含むDEP構成を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第RE44,711号(Wuら)(元々は米国特許第7,612,355号として発行された)に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に援用される。
他の実施形態では、電極活性化基板206は、半導体分野で既知等の半導体集積回路を形成する複数のドープ層、絶縁層(又は領域)、及び導電層を含む基板を含むことができる。例えば、電極活性化基板206は、例えば、横型バイポーラフォトトランジスタを含
む複数のフォトトランジスタを含むことができ、各フォトトランジスタはDEP電極領域214に対応する。代替的に、電極活性化基板206は、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極(例えば、導電性金属電極)を含むことができ、そのような各電極はDEP電極領域214に対応する。電極活性化基板206は、パターンになったそのようなフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極を含むことができる。パターンは、例えば、図2Bに示される等、行列に配置された実質的に正方形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する実質的に六角形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、電気回路素子は、電極活性化基板206の内面208におけるDEP電極領域214と下部電極210との間に電気接続を形成することができ、それらの電気接続(すなわち、フォトトランジスタ又は電極)は、光パターン218により選択的に活性化又は非活性化することができる。活性化されない場合、各電気接続は、電極活性化基板206を通る(すなわち、下部電極204から、領域/チャンバ202内の培地180と界面を接する電極活性化電極206の内面208まで)相対インピーダンスが、対応するDEP電極領域214における培地180を通る(すなわち、電極活性化基板206の内面208からカバー110の上部電極210まで)相対インピーダンスよりも大きいような高いインピーダンスを有することができる。しかし、光パターン218内の光により活性化される場合、電極活性化基板206を通る相対インピーダンスは、各照明DEP電極領域214での培地180を通る相対インピーダンス未満であり、それにより、上述したように、対応するDEP電極領域214でのDEP電極を活性化する。したがって、培地180内の微小物体(図示せず)を引き寄せるか、又は排斥するDEP電極は、光パターン218により決まるように、領域/チャンバ202での電極活性化基板206の内面208での多くの異なるDEP電極領域214において選択的に活性化及び非活性化することができる。
む複数のフォトトランジスタを含むことができ、各フォトトランジスタはDEP電極領域214に対応する。代替的に、電極活性化基板206は、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極(例えば、導電性金属電極)を含むことができ、そのような各電極はDEP電極領域214に対応する。電極活性化基板206は、パターンになったそのようなフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極を含むことができる。パターンは、例えば、図2Bに示される等、行列に配置された実質的に正方形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する実質的に六角形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、電気回路素子は、電極活性化基板206の内面208におけるDEP電極領域214と下部電極210との間に電気接続を形成することができ、それらの電気接続(すなわち、フォトトランジスタ又は電極)は、光パターン218により選択的に活性化又は非活性化することができる。活性化されない場合、各電気接続は、電極活性化基板206を通る(すなわち、下部電極204から、領域/チャンバ202内の培地180と界面を接する電極活性化電極206の内面208まで)相対インピーダンスが、対応するDEP電極領域214における培地180を通る(すなわち、電極活性化基板206の内面208からカバー110の上部電極210まで)相対インピーダンスよりも大きいような高いインピーダンスを有することができる。しかし、光パターン218内の光により活性化される場合、電極活性化基板206を通る相対インピーダンスは、各照明DEP電極領域214での培地180を通る相対インピーダンス未満であり、それにより、上述したように、対応するDEP電極領域214でのDEP電極を活性化する。したがって、培地180内の微小物体(図示せず)を引き寄せるか、又は排斥するDEP電極は、光パターン218により決まるように、領域/チャンバ202での電極活性化基板206の内面208での多くの異なるDEP電極領域214において選択的に活性化及び非活性化することができる。
フォトトランジスタを含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第7,956,339号(Ohtaら)(例えば、図21及び図22に示されるデバイス300並びにその説明を参照されたい)、及び米国特許出願公開第2016/0184821号明細書(Hobbsら)(例えば、図面にわたって描かれているdevices 200, 502, 504, 600, 及び700、及びその記述を参照されたい)に記載されており、それぞれの内容全体は参照により本明細書に援用される。フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第2014/0124370号(Shortら)に記載されており(例えば、図面全体を通して示されるデバイス200、400
、500、600、及び900並びにその説明を参照されたい)、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
、500、600、及び900並びにその説明を参照されたい)、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
DEP構成のマイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態では、上部電極210はエンクロージャ102の第1の壁(又はカバー110)の一部であり、電極活性化基板206及び下部電極204は、エンクロージャ102の第2の壁(又は支持構造体104)の一部である。領域/チャンバ202は、第1の壁と第2の壁との間にあり得る。他の実施形態では、電極210は第2の壁(又は支持構造体104)の一部であり、電極活性化基板206及び/又は電極210の一方又は両方は、第1の壁(又はカバー110)の一部である。さらに、光源216は代替的に、下からエンクロージャ102を照明するのに使用することができる。
DEP構成を有する図1B及び図1Cのマイクロ流体デバイス200を用いて、原動モジュール162は、光パターン218をマイクロ流体デバイス200に投射して、微小物体を囲み捕捉するパターン(例えば、正方形パターン220)で電極活性化基板206の内面208のDEP電極領域214aでの第1の組の1つ又は複数のDEP電極を活性化
することにより、領域/チャンバ202での培地180内の微小物体(図示せず)を選択することができる。次に、原動モジュール162は、光パターン218をマイクロ流体デバイス200に相対して移動させて、DEP電極領域214での第2の組の1つ又は複数のDEP電極を活性化することにより、インサイチューで生成され捕捉された微小物体を移動させることができる。代替的に、マイクロ流体デバイス200を光パターン218に相対して移動させることができる。
することにより、領域/チャンバ202での培地180内の微小物体(図示せず)を選択することができる。次に、原動モジュール162は、光パターン218をマイクロ流体デバイス200に相対して移動させて、DEP電極領域214での第2の組の1つ又は複数のDEP電極を活性化することにより、インサイチューで生成され捕捉された微小物体を移動させることができる。代替的に、マイクロ流体デバイス200を光パターン218に相対して移動させることができる。
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス200は、電極活性化基板206の内面208でのDEP電極の光活性化に依存しないDEP構成を有することができる。例えば、電極活性化基板206は、少なくとも1つの電極を含む表面(例えば、カバー110)とは逆に位置する、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。スイッチ(例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ)を選択的に開閉して、DEP電極領域214でのDEP電極を活性化又は非活性化し得、それにより、活性化されたDEP電極の近傍での領域/チャンバ202内の微小物体(図示せず)に対する正味DEP力を生成する。電源212の周波数及び培地(図示せず)及び/又は領域/チャンバ202内の微小物体の誘電特性等の特徴に応じて、DEP力は、付近の微小物体を引き寄せるか、又は排斥することができる。DEP電極の組(例えば、正方形パターン220を形成するDEP電極領域214の組における)を選択的に活性化又は非活性化することにより、領域/チャンバ202における1つ又は複数の微小物体を捕捉し、領域/チャンバ202内で移動させることができる。図1Aの原動モジュール162は、そのようなスイッチを制御し、したがって、DEP電極の個々の電極を活性化及び非活性化して、領域/チャンバ202の周囲の特定の微小物体(図示せず)を選択、捕捉、及び移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むDEP構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第6,294,063号(Beckerら)及び同第6,942,776号(Medoro)に記載されており、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
更なる別例として、マイクロ流体デバイス200は電子ウェッティング(EW)構成を有することができ、EW構成は、DEP構成の代わりであってもよく、又はDEP構成を有する部分とは別個のマイクロ流体デバイス200の部分に配置されてもよい。EW構成は、光電子ウェッティング構成又は誘電体上の電子ウェッティング(EWOD)構成であり得、これらは両方とも当技術分野で既知である。幾つかのEW構成では、支持構造体104は、以下に記載するように、誘電層(図示せず)と下部電極204との間に挟まれた電極活性化基板206を有する。誘電層は、疎水性材料を含むことができ、及び/又は疎水性材料でコーティングすることができる。EW構成を有するマイクロ流体デバイス200の場合、支持構造体104の内面208は、誘電層の内面又はその疎水性コーティングである。
誘電層(図示せず)は、1つ又は複数の酸化物層を含むことができ、厚さ約50nm~約250nm(例えば、約125nm~約175nm)を有することができる。特定の実施形態では、誘電層は、金属酸化物(例えば、酸化アルミニウム又は酸化ハフニウム)等の酸化物の層を含むことができる。特定の実施形態では、誘電層は、酸化ケイ素又は窒化物等の金属酸化物以外の誘電材料を含むことができる。厳密な組成及び厚さに関係なく、誘電層は約10kオーム~約50kオームのインピーダンスを有することができる。
幾つかの実施形態では、領域/チャンバ202に向かって内側に面した誘電層の表面は、疎水性材料でコーティングされる。疎水性材料は、例えば、フッ素化炭素分子を含むことができる。フッ素化炭素分子の例としては、ポリテトラフルオロエチレン(例えば、TEFLON(登録商標)又はポリ(2,3-ジフルオロメチレニル-ペルフルオロテトラヒドロフラン)(例えば、CYTOP(商標))などのパーフルオロポリマーが挙げられる。疎水性
材料を構成する分子は、誘電層の表面に共有結合され得る。例えば、疎水性材料の分子は、シロキサン基、ホスホン酸基、又はチオール基等のリンカーにより、誘電層の表面に共有結合され得る。したがって、幾つかの実施形態では、疎水性材料は、アルキル末端シロキサン、アルキル末端ホスホン酸、又はアルキル末端チオールを含むことができる。アルキル基は長鎖炭化水素(例えば、少なくとも10個の炭素又は少なくとも16個、18個、20個、22個、若しくはそれを超える個数の炭素の鎖を有する)であり得る。代替的に、フッ素化(又はパーフルオロ化)炭素鎖をアルキル基の代わりに使用することができる。したがって、例えば、疎水性材料は、フルオロアルキル末端シロキサン、フルオロアルキル末端ホスホン酸、又はフルオロアルキル末端チオールを含むことができる。幾つかの実施形態では、疎水性コーティングは約10nm~約50nmの厚さを有する。他の実施形態では、疎水性コーティングは厚さ10nm未満(例えば、5nm未満又は約1.5~3.0nm)を有する。
材料を構成する分子は、誘電層の表面に共有結合され得る。例えば、疎水性材料の分子は、シロキサン基、ホスホン酸基、又はチオール基等のリンカーにより、誘電層の表面に共有結合され得る。したがって、幾つかの実施形態では、疎水性材料は、アルキル末端シロキサン、アルキル末端ホスホン酸、又はアルキル末端チオールを含むことができる。アルキル基は長鎖炭化水素(例えば、少なくとも10個の炭素又は少なくとも16個、18個、20個、22個、若しくはそれを超える個数の炭素の鎖を有する)であり得る。代替的に、フッ素化(又はパーフルオロ化)炭素鎖をアルキル基の代わりに使用することができる。したがって、例えば、疎水性材料は、フルオロアルキル末端シロキサン、フルオロアルキル末端ホスホン酸、又はフルオロアルキル末端チオールを含むことができる。幾つかの実施形態では、疎水性コーティングは約10nm~約50nmの厚さを有する。他の実施形態では、疎水性コーティングは厚さ10nm未満(例えば、5nm未満又は約1.5~3.0nm)を有する。
幾つかの実施形態では、電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイス200のカバー110も同様に疎水性材料(図示せず)でコーティングされる。疎水性材料は、支持構造体104の誘電層のコーティングに使用されるものと同じ疎水性材料であり得、疎水性コーティングは、支持構造体104の誘電層の疎水性コーティングの厚さと略同じである厚さを有することができる。さらに、カバー110は、支持構造体104の様式で、誘電層と上部電極210との間に挟まれた電極活性化基板206を含むことができる。電極活性化基板206及びカバー110の誘電層は、電極活性化基板206及び支持構造体104の誘電層と同じ組成及び/又は寸法を有することができる。したがって、マイクロ流体デバイス200は2つの電子ウェッティング表面を有することができる。
幾つかの実施形態では、電子活性化基板206は、上述した光伝導性材料等の光伝導性材料を含むことができる。したがって、特定の実施形態では、電極活性化基板206は、水素化非晶質シリコン(a-Si:H)の層を含むか、又はa-Si:Hの層からなることができる。a-Si:Hは、例えば、約8%~40%の水素を含むことができる(水素原子の総数及びケイ素原子の総数/水素原子の総数に100を掛けたものとして計算)。a-Si:Hの層は厚さ約500nm~約2.0μmを有することができる。代替的に、電子活性化基板206は、上述したように、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極(例えば、導電性金属電極)を含むことができる。光電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイスは当技術分野で既知であり、及び/又は当技術分野で既知の電極活性化基板を用いて構築することができる。例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第6,958,132号(Chiouら)には、a-Si:H等の光伝導
性材料を有する光電子ウェッティング構成が開示されており、一方、上記で引用した米国特許出願公開第2014/0124370号(Shortら)には、フォトトランジスタスイ
ッチにより制御される電極を有する電極活性化基板が開示されている。
性材料を有する光電子ウェッティング構成が開示されており、一方、上記で引用した米国特許出願公開第2014/0124370号(Shortら)には、フォトトランジスタスイ
ッチにより制御される電極を有する電極活性化基板が開示されている。
したがって、マイクロ流体デバイス200は光電子ウェッティング構成を有することができ、光パターン218を使用して、電極活性化基板206での光応答性EW領域又は光応答性EW電極を活性化することができる。電極活性化基板206のそのような活性化されたEW領域又はEW電極は、支持構造体104の内面208(すなわち、重なった誘電層の内面又はその疎水性コーティング)において電子ウェッティング力を生成することができる。電子活性化基板206に入射する光パターン218を変更する(又は光源216に相対してマイクロ流体デバイス200を移動させる)ことにより、支持構造体104の内面208に接触する液滴(例えば、水性培地、水溶液又は水性溶媒を含む)は、領域/チャンバ202内に存在する不混和流体(例えば、油媒体)を通って移動することができる。
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス200は、EWOD構成を有することができ
、電極活性化基板206は、活性化のために光に依存しない、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。したがって、電極活性化基板206は、パターンになったそのような電子ウェッティング(EW)電極を含むことができる。パターンは、例えば、図2Bに示される等の行列に配置された略正方形のEW電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する略六角形のEW電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、EW電極は、電気スイッチ(例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ)により選択的に活性化(又は非活性化)することができる。電極活性化基板206でのEW電極を選択的に活性化及び非活性化することにより、重なった誘電層の内面208又はその疎水性コーティングに接触する液滴(図示せず)は、領域/チャンバ202内で移動することができる。図1Aの原動モジュール162は、そのようなスイッチを制御することができ、したがって、個々のEW電極を活性化及び非活性化して、領域/チャンバ202の周囲で特定の液滴を選択し移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を有するEWOD構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第8,685,344号(Sundarsanら)に記載されており、この内容全体は参照により本明細書に援用される。
、電極活性化基板206は、活性化のために光に依存しない、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。したがって、電極活性化基板206は、パターンになったそのような電子ウェッティング(EW)電極を含むことができる。パターンは、例えば、図2Bに示される等の行列に配置された略正方形のEW電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する略六角形のEW電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、EW電極は、電気スイッチ(例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ)により選択的に活性化(又は非活性化)することができる。電極活性化基板206でのEW電極を選択的に活性化及び非活性化することにより、重なった誘電層の内面208又はその疎水性コーティングに接触する液滴(図示せず)は、領域/チャンバ202内で移動することができる。図1Aの原動モジュール162は、そのようなスイッチを制御することができ、したがって、個々のEW電極を活性化及び非活性化して、領域/チャンバ202の周囲で特定の液滴を選択し移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を有するEWOD構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第8,685,344号(Sundarsanら)に記載されており、この内容全体は参照により本明細書に援用される。
マイクロ流体デバイス200の構成に関係なく、電源212を使用して、マイクロ流体デバイス200の電気回路に給電する電位(例えば、AC電源電位)を提供することができる。電源212は、図1で参照される電源192と同じ又は電源192の構成要素であり得る。電源212は、上部電極210及び下部電極204にAC電圧及び/又は電流を提供するように構成され得る。AC電圧の場合、電源212は、上述したように、領域/チャンバ202内の個々の微小物体(図示せず)を捕捉して移動させ、及び/又はこれらも上述したように、領域/チャンバ202内の支持構造体104の内面208(すなわち、誘電層及び/又は誘電層上の疎水性コーティング)のウェッティング特性を変更するのに十分に強い正味DEP力(又は電子ウェッティング力)を生成するのに十分な周波数範囲及び平均又はピーク電力(例えば、電圧又は電流)を提供することができる。そのような周波数範囲及び平均又はピーク電力範囲は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許第6,958,132号(Chiouら)、米国特許第RE44,711号(Wuら)(元々
は米国特許第7,612,355号として発行された)、並びに米国特許出願公開第2014/0124370号(Shortら)、同第2015/0306598号(Khandrosら)
、及び同第2015/0306599号(Khandrosら)を参照されたい。
は米国特許第7,612,355号として発行された)、並びに米国特許出願公開第2014/0124370号(Shortら)、同第2015/0306598号(Khandrosら)
、及び同第2015/0306599号(Khandrosら)を参照されたい。
隔離ペン。
一般的な隔離ペン224、226、及び228の非限定的な例は、図2A~図2Cに示されるマイクロ流体デバイス230内に示されている。各隔離ペン224、226、及び228は、分離領域240と、分離領域240をチャネル122に流体接続する接続領域236とを画定する分離構造体232を含むことができる。接続領域236は、マイクロ流体チャネル122への基端開口部234及び分離領域240への先端開口部238を含むことができる。接続領域236は、マイクロ流体チャネル122から隔離ペン224、226、228内に流れる流体培地(図示せず)のフローの最大侵入深さが分離領域240内に及ばないように構成され得る。したがって、接続領域236に起因して、隔離ペン224、226、228の分離領域240内に配置された微小物体(図示せず)又は他の材料(図示せず)は、チャネル122内の培地180のフローから分離され、マイクロ流体チャネル122内の培地180のフローにより実質的に影響されないことができる。
一般的な隔離ペン224、226、及び228の非限定的な例は、図2A~図2Cに示されるマイクロ流体デバイス230内に示されている。各隔離ペン224、226、及び228は、分離領域240と、分離領域240をチャネル122に流体接続する接続領域236とを画定する分離構造体232を含むことができる。接続領域236は、マイクロ流体チャネル122への基端開口部234及び分離領域240への先端開口部238を含むことができる。接続領域236は、マイクロ流体チャネル122から隔離ペン224、226、228内に流れる流体培地(図示せず)のフローの最大侵入深さが分離領域240内に及ばないように構成され得る。したがって、接続領域236に起因して、隔離ペン224、226、228の分離領域240内に配置された微小物体(図示せず)又は他の材料(図示せず)は、チャネル122内の培地180のフローから分離され、マイクロ流体チャネル122内の培地180のフローにより実質的に影響されないことができる。
図2A~図2Cの隔離ペン224、226、及び228は、マイクロ流体チャネル122に対して直接開く単一の開口部をそれぞれ有する。隔離ペンの開口部は、マイクロ流体チャネル122から横に開く。電極活性化基板206がマイクロ流体チャネル122及び隔離ペン224、226、及び228の両方の下にある。隔離ペンのフロアを形成する、隔離ペンのエンクロージャ内の電極活性化基板206の上面は、マイクロ流体デバイスの
フローチャネル(又はそれぞれ流路)のフロアを形成する、マイクロ流体チャネル122(又はチャネルが存在しない場合、流路)内の電極活性化基板206の上面と同じ高さ又は略同じ高さに配置される。電極活性化基板206は、特徴を有さなくてもよく、又は約3μm未満、約2.5μm未満、約2μm未満、約1.5μm未満、約1μm未満、約0.9μm未満、約0.5μm未満、約0.4μm未満、約0.2μm未満、約0.1μm未満、又はそれを下回って最高隆起部から最低陥没部まで変化する不規則又はパターン化表面を有してもよい。マイクロ流体チャネル122(又は流路)及び隔離ペンの両方にわたる基板の上面の隆起の変動は、隔離ペンの壁の高さ又はマイクロ流体デバイスの壁の高さの約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.9%未満、約0.8%未満、約0.5%未満、約0.3%未満、又は約0.1%未満であり得る。マイクロ流体デバイス200について詳細に説明したが、これは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイス100、230、250、280、290、320、400、450、500、700にも当てはまる。
フローチャネル(又はそれぞれ流路)のフロアを形成する、マイクロ流体チャネル122(又はチャネルが存在しない場合、流路)内の電極活性化基板206の上面と同じ高さ又は略同じ高さに配置される。電極活性化基板206は、特徴を有さなくてもよく、又は約3μm未満、約2.5μm未満、約2μm未満、約1.5μm未満、約1μm未満、約0.9μm未満、約0.5μm未満、約0.4μm未満、約0.2μm未満、約0.1μm未満、又はそれを下回って最高隆起部から最低陥没部まで変化する不規則又はパターン化表面を有してもよい。マイクロ流体チャネル122(又は流路)及び隔離ペンの両方にわたる基板の上面の隆起の変動は、隔離ペンの壁の高さ又はマイクロ流体デバイスの壁の高さの約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.9%未満、約0.8%未満、約0.5%未満、約0.3%未満、又は約0.1%未満であり得る。マイクロ流体デバイス200について詳細に説明したが、これは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイス100、230、250、280、290、320、400、450、500、700にも当てはまる。
したがって、マイクロ流体チャネル122は掃引領域の例であり得、隔離ペン224、226、228の分離領域240は非掃引領域の例であり得る。述べたように、マイクロ流体チャネル122及び隔離ペン224、226、228は、1つ又は複数の流体培地180を含むように構成され得る。図2A~図2Bに示される例では、ポート222はマイクロ流体チャネル122に接続され、流体培地180がマイクロ流体デバイス230内に導入又は外に取り出せるようにすることができる。流体培地180を導入する前に、マイクロ流体デバイスは、二酸化炭素ガス等のガスでプライミングし得る。マイクロ流体デバイス230が流体培地180を含むと、マイクロ流体チャネル122内の流体培地180のフロー242は選択的に生成及び停止させることができる。例えば、示されるように、ポート222はマイクロ流体チャネル122の異なる位置(例えば、両端部)に配置することができ、流入口として機能するあるポート222から流出口として機能する別のポート222への培地のフロー242を生成することができる。
図2Cは、本開示による隔離ペン224の例の詳細図を示す。微小物体246の例も示されている。
既知のように、隔離ペン224の基端開口部234を越えたマイクロ流体チャネル122内の流体培地180のフロー242は、隔離ペン224内及び/又は外への培地180の2次フロー244を生じさせることができる。隔離ペン224の分離領域240内の微小物体246を2次フロー244から分離するために、隔離ペン224の接続領域236の長さLcon(すなわち、基端開口部234から先端開口部238まで)は、接続領域236への2次フロー244の侵入深さDpよりも大きい値であるはずである。2次フロー244の侵入深さDpは、マイクロ流体チャネル122内を流れる流体培地180の速度並びにマイクロ流体チャネル122及びマイクロ流体チャネル122への接続領域236の基端開口部234の構成に関連する様々なパラメータに依存する。所与のマイクロ流体デバイスでは、マイクロ流体チャネル122及び開口部234の構成は固定され、一方、マイクロ流体チャネル122内の流体培地180のフロー242の速度は可変である。したがって、隔離ペン224毎に、2次フロー244の侵入深さDpが接続領域236の長さLconを超えないことを保証するチャネル122内の流体培地180のフロー242の最高速度Vmaxを識別することができる。マイクロ流体チャネル122内の流体培地180のフロー242の流量が最大速度Vmaxを超えない限り、結果として生成される、マイクロ流体チャネル122及び接続領域236への2次フロー244を制限することができ、分離領域240に入らないようにすることができる。したがって、マイクロ流体チャネル122内の培地180のフロー242は、微小物体246を分離領域240外に引き込まない。むしろ、分離領域240内に配置された微小物体246は、マイクロ流体チャネル122内の流体培地180のフロー242に関係なく、分離領域240内に留
まる。
まる。
さらに、マイクロ流体チャネル122内の培地180のフロー242の流量がVmaxを超えない限り、マイクロ流体チャネル122内の流体培地180のフロー242は、様々な粒子(例えば、微粒子及び/又はナノ粒子)をマイクロ流体チャネル122から隔離ペン224の分離領域240内に移動させない。したがって、接続領域236の長さLconを2次フロー244の最大侵入深さDpよりも大きくすることで、ある隔離ペン224の、マイクロ流体チャネル122又は別の隔離ペン(例えば、図2Dの隔離ペン226、228)からの様々な粒子による汚染を回避することができる。
マイクロ流体チャネル122及び隔離ペン224、226、228の接続領域236は、マイクロ流体チャネル122内の培地180のフロー242により影響を及ぼすことができるため、マイクロ流体チャネル122及び接続領域236は、マイクロ流体デバイス230の掃引(又はフロー)領域と見なすことができる。他方、隔離ペン224、226、228の分離領域240は、非掃引(又は非フロー)領域と見なすことができる。例えば、マイクロ流体チャネル122内の第1の流体培地180中の成分(図示せず)は、実質的に、マイクロ流体チャネル122から接続領域236を通り分離領域240内の第2の流体培地248への第1の培地180の成分の拡散によってのみ、分離領域240内の第2の流体培地248と混合することができる。同様に、分離領域240内の第2の培地248の成分(図示せず)は、実質的に、分離領域240から接続領域236を通り、マイクロ流体チャネル122内の第1の培地180への第2の培地248の成分の拡散によってのみ、マイクロ流体チャネル122内の第1の培地180と混合することができる。幾つかの実施形態では、拡散による隔離ペンの分離領域と流路との間での流体媒体交換の程度は、流体交換の約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%よりも高い割合である。第1の培地180は、第2の培地248と同じ培地であってもよく、又は異なる培地であってもよい。さらに、第1の培地180及び第2の培地248は、同じ培地として開始され、異なるようになることができる(例えば、分離領域240内の1つ又は複数の細胞により又はマイクロ流体チャネル122を通って流れる培地180を変更することにより、第2の培地248を調整することを通して)。
マイクロ流体チャネル122内の流体培地180のフロー242により生じる2次フロー244の最大侵入深さDpは、上述したように、幾つかのパラメータに依存し得る。そのようなパラメータの例としては、マイクロ流体チャネル122の形状(例えば、チャネルは、培地を接続領域236に向けることができ、接続領域236から培地を逸らすことができ、又はマイクロ流体チャネル122への接続領域236の基端開口部234に実質的に直交する方向に培地を向けることができる)、基端開口部234でのマイクロ流体チャネル122の幅Wch(又は断面積)及び基端開口部234での接続領域236の幅Wcon(又は断面積)、マイクロ流体チャネル122内の流体培地180のフロー242の速度V、第1の培地180及び/又は第2の培地248の粘度等が挙げられる。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体チャネル122及び隔離ペン224、226、228の寸法は、マイクロ流体チャネル122内の流体培地180のフロー242のベクトルに対して以下のように向けることができる:マイクロ流体チャネル幅Wch(又はマイクロ流体チャネル122の断面積)は、培地180のフロー242に略直交することができ、開口部234での接続領域236の幅Wcon(又は断面積)は、マイクロ流体チャネル122内の培地180のフロー242に略平行であり得、及び/又は接続領域の長さLconは、マイクロ流体チャネル122内の培地180のフロー242に略直交することができる。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル122及び隔離ペン224、226、228の相対位置は、互いに対して他の向きであり得る。
図2Cに示されるように、接続領域236の幅Wconは、基端開口部234から先端開口部238まで均一であり得る。したがって、先端開口部238での接続領域236の幅Wconは、基端開口部234での接続領域236の幅Wconについて本明細書において識別された任意の範囲内にあり得る。代替的に、先端開口部238での接続領域236の幅Wconは、基端開口部234での接続領域236の幅Wconよりも大きい値であり得る。
図2Cに示されるように、先端開口部238での分離領域240の幅は、基端開口部234での基端領域236の幅Wconと略同じであり得る。したがって、先端開口部238での分離領域240の幅は、基端開口部234での接続領域236の幅Wconについて本明細書において識別された任意の範囲内であり得る。代替的に、先端開口部238での分離領域240の幅は、基端開口部234での接続領域236の幅Wconよりも大きくてもよく、又は小さくてもよい。さらに、先端開口部238は基端開口部234よりも小さくてよく、接続領域236の幅Wconは、基端開口部234と先端開口部238との間で狭め得る。例えば、接続領域236は、様々な異なるジオメトリ(例えば、接続領域を面取りする、接続領域に勾配を付ける)を使用して基端開口部と先端開口部との間で狭め得る。さらに、接続領域236の任意の部分又はサブ部分を狭め得る(例えば、基端開口部234に隣接する接続領域の部分)。
図2D~図2Fは、図1Aの各マイクロ流体デバイス100、回路132、及びチャネル134の変形形態であるマイクロ流体回路262及びフローチャネル264を含むマイクロ流体デバイス250の別の例示的な実施形態を示す。マイクロ流体デバイス250は、上述した隔離ペン124、126、128、130、224、226、又は228の追加の変形形態である複数の隔離ペン266も有する。特に、図2D~図2Fに示されるデバイス250の隔離ペン266をデバイス100、200、230、280、290、300での上述した隔離ペン124、126、128、130、224、226、又は228のいずれかで置換可能なことを理解されたい。同様に、マイクロ流体デバイス250は、マイクロ流体デバイス100の別の変形形態であり、上述したマイクロ流体デバイス100、200、230、280、290、300と同じ又は異なるDEP構成及び本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体システム構成要素を有することもできる。
図2D~図2Fのマイクロ流体デバイス250は、支持構造体(図2D~図2Fでは見えないが、図1Aに示されるデバイス100の支持構造体104と同じ又は概して同様であり得る)、マイクロ流体回路構造256、及びカバー(図2F~図2Fでは見えないが、図1Aに示されるデバイス100のカバー122と同じ又は概して同様であり得る)を含む。マイクロ流体回路構造256は枠252及びマイクロ流体回路材料260を含み、これらは図1Aに示されるデバイス100の枠114及びマイクロ流体回路材料116と同じ又は概して同様であり得る。図2Dに示されるように、マイクロ流体回路材料260により画定されるマイクロ流体回路262は複数のチャネル264(2つが示されるが、より多くのチャネルがあり得る)を含むことができ、チャネル264に複数の隔離ペン266が流体接続される。
各隔離ペン266は、分離構造272、分離構造272内の分離領域270、及び接続領域268を含むことができる。マイクロ流体チャネル264の基端開口部274から分離構造272での先端開口部276まで、接続領域268はマイクロ流体チャネル264を分離領域270に流体接続する。一般に、図2B及び図2Cの上記考察によれば、チャネル264内の第1の流体培地254のフロー278は、マイクロ流体チャネル264から隔離ペン266の各接続領域268内及び/又は外への第1の培地254の2次フロー282をもたらすことができる。
図2Eに示されるように、各隔離ペン266の接続領域268は、一般に、チャネル264の基端開口部274と分離構造272の先端開口部276との間に延びるエリアを含む。接続領域268の長さLconは、2次フロー282の最大侵入深さDpよりも大きい値であり得、その場合、2次フロー282は、分離領域270に向かってリダイレクトされずに接続領域268内に延びる(図2Dに示されるように)。代替的に、図2Fに示されるように、接続領域268は、最大侵入深さDpよりも小さい長さLconを有することができ、その場合、2次フロー282は、接続領域268を通って延び、分離領域270に向かってリダイレクトされる。この後者の状況では、接続領域268の長さLc1及びLc2との和は最大侵入深さDpよりも大きく、したがって、2次フロー282は分離領域270内に延びない。接続領域268の長さLconが侵入深さDpよりも大きいか否か又は接続領域268の長さLc1及びLc2の和が侵入深さDpよりも大きいか否かに関係なく、最大速度Vmaxを超えないチャネル264内の第1の培地254のフロー278は、侵入深さDpを有する2次フローをもたらし、隔離ペン266の分離領域270内の微小物体(示されていないが、図2Cに示される微小物体246と同じ又は概して同様であり得る)は、チャネル264内の第1の培地254のフロー278により分離領域270外に引き出されない。チャネル264内のフロー278は、様々な材料(図示せず)もチャネル264から隔離ペン266の分離領域270内に引き込まない。したがって、マイクロ流体チャネル264内の第1の培地254内の成分をマイクロ流体チャネル264から隔離ペン266の分離領域270内の第2の培地258内に移動させることができる唯一の機構は、拡散である。同様に、隔離ペン266の分離領域270内の第2の培地258内の成分を分離領域270からマイクロ流体チャネル264内の第1の培地254内に移動させることができる唯一の機構も拡散である。第1の培地254は、第2の培地258と同じ培地であり得、又は第1の培地254は、第2の培地258と異なる培地であり得る。代替的に、第1の培地254及び第2の培地258は、同じ培地から始まり、例えば、分離領域270内の1つ又は複数の細胞により又はマイクロ流体チャネル264を通って流れる培地を変更することにより、第2の培地を調整することを通して異なるようになることができる。
図2Eに示されるように、マイクロ流体チャネル264内のマイクロ流体チャネル264の幅Wch(すなわち、図2Dにおいて矢印278で示されるマイクロ流体チャネルを通る流体培地フローの方向を横断してとられる)は、基端開口部274の幅Wcon1に略直交することができ、したがって、先端開口部276の幅Wcon2に略平行であり得る。しかし、基端開口部274の幅con1及び先端開口部276の幅Wcon2は、互いに略直交する必要はない。例えば、基端開口部274の幅Wcon1が向けられる軸(図示せず)と、先端開口部276の幅Wcon2が向けられる別の軸との間の角度は、直交以外であり得、したがって、90°以外であり得る。代替的に向けられる角度の例としては、以下の任意の範囲内の角度を含む:約30°~約90°、約45°~約90°、約60°~約90°等。
隔離ペンの様々な実施形態(例えば、124、126、128、130、224、226、228、又は266)では、分離領域(例えば、240又は270)は、複数の微小物体を含むように構成される。他の実施形態では、分離領域は、1つのみ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は同様の相対的に少数の微小物体を含むように構成され得る。したがって、分離領域の容積は、例えば、少なくとも2×105立方μm、少なくとも4×105立方μm、少なくとも8×105立方μm、少なくとも1×106立方μm、少なくとも2×106立方μm、少なくとも4×106立方μm、少なくとも8×106立方μm、又はこれを超える大きさであり得る。
隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部(例えば、234)でのマイクロ流体チャ
ネル(例えば、122)の幅Wchは、以下の任意の範囲内であり得る:約50~1000μm、約50~500μm、約50~400μm、約50~300μm、約50~250μm、約50~200μm、約50~150μm、約50~100μm、約70~500μm、約70~400μm、約70~300μm、約70~250μm、約70~200μm、約70~150μm、約90~400μm、90~300μm、約90~250μm、約90~200μm、約90~150μm、約100~300μm、約100~250μm、約100~200μm、約100~150μm、及び約100~120μm。幾つかの他の実施形態では、基端開口部(例えば、234)におけるマイクロ流体チャネル(例えば、122)の幅Wchは、約200~800μm、約200~700μm、又は約200~600μmの範囲であり得る。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル122の幅Wchは、他の範囲(例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲)であってもよい。さらに、マイクロ流体チャネル122の幅Wchは、隔離ペンの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域において、これらの任意の範囲であるように選択することができる。
ネル(例えば、122)の幅Wchは、以下の任意の範囲内であり得る:約50~1000μm、約50~500μm、約50~400μm、約50~300μm、約50~250μm、約50~200μm、約50~150μm、約50~100μm、約70~500μm、約70~400μm、約70~300μm、約70~250μm、約70~200μm、約70~150μm、約90~400μm、90~300μm、約90~250μm、約90~200μm、約90~150μm、約100~300μm、約100~250μm、約100~200μm、約100~150μm、及び約100~120μm。幾つかの他の実施形態では、基端開口部(例えば、234)におけるマイクロ流体チャネル(例えば、122)の幅Wchは、約200~800μm、約200~700μm、又は約200~600μmの範囲であり得る。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル122の幅Wchは、他の範囲(例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲)であってもよい。さらに、マイクロ流体チャネル122の幅Wchは、隔離ペンの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域において、これらの任意の範囲であるように選択することができる。
幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約30~約200μm又は約50~約150μmの高さを有する。幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約1×104~約3×106平方μm、約2×104~約2×106平方μm、約4×104~約1×106平方μm、約2×104~約5×105平方μm、約2×104~約1×105平方μm、又は約2×105~約2×106平方μmの断面積を有する。
隔離ペンの様々な実施形態において、基端開口部(例えば、234)におけるマイクロ流体チャネル(例えば、122)の高さHchは、以下の任意の範囲内であり得る:20~100μm、20~90μm、20~80μm、20~70μm、20~60μm、20~50μm、30~100μm、30~90μm、30~80μm、30~70μm、30~60μm、30~50μm、40~100μm、40~90μm、40~80μm、40~70μm、40~60μm、又は40~50μm。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル(例えば、122)の高さHchは、他の範囲(例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲)であってもよい。マイクロ流体チャネル122の高さHchは、隔離ペンの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域において、これらの任意の範囲であるように選択することができる。
隔離ペンの様々な実施形態において、基端開口部(例えば、234)におけるマイクロ流体チャネル(例えば、122)の断面積は、以下の任意の範囲内であり得る:500~50,000平方μm、500~40,000平方μm、500~30,000平方μm、500~25,000平方μm、500~20,000平方μm、500~15,000平方μm、500~10,000平方μm、500~7,500平方μm、500~5,000平方μm、1,000~25,000平方μm、1,000~20,000平方μm、1,000~15,000平方μm、1,000~10,000平方μm、1,000~7,500平方μm、1,000~5,000平方μm、2,000~20,000平方μm、2,000~15,000平方μm、2,000~10,000平方μm、2,000~7,500平方μm、2,000~6,000平方μm、3,000~20,000平方μm、3,000~15,000平方μm、3,000~10,000平方μm、3,000~7,500平方μm、又は3,000~6,000平方μm。上記は単なる例であり、基端開口部(例えば、234)におけるマイクロ流体チャネル(例えば、122)の断面積は、他の範囲(例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲)であってもよい。
隔離ペンの様々な実施形態では、接続領域(例えば、236)の長さLconは、以下の任意の範囲内であり得る:約1~600μm、5~550μm、10~500μm、1
5~400μm、20~300μm、20~500μm、40~400μm、60~300μm、80~200μm、又は約100~150μm。上記は単なる例であり、接続領域(例えば、236)の長さLconは、上記例と異なる範囲(例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲)内であることもできる。
5~400μm、20~300μm、20~500μm、40~400μm、60~300μm、80~200μm、又は約100~150μm。上記は単なる例であり、接続領域(例えば、236)の長さLconは、上記例と異なる範囲(例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲)内であることもできる。
隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部(例えば、234)での接続領域(例えば、236)の幅Wconは、以下の任意の範囲内であり得る:20~500μm、20~400μm、20~300μm、20~200μm、20~150μm、20~100μm、20~80μm、20~60μm、30~400μm、30~300μm、30~200μm、30~150μm、30~100μm、30~80μm、30~60μm、40~300μm、40~200μm、40~150μm、40~100μm、40~80μm、40~60μm、50~250μm、50~200μm、50~150μm、50~100μm、50~80μm、60~200μm、60~150μm、60~100μm、60~80μm、70~150μm、70~100μm、及び80~100μm。上記は単なる例であり、基端開口部(例えば、234)の接続領域(例えば、236)の幅Wconは、上記例と異なることができる(例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲)。
隔離ペンの様々な実施形態において、基端開口部(例えば、234)における接続領域(例えば、236)の幅Wconは、隔離ペンが意図される微小物体(例えば、活性化されたT細胞のような生体細胞)の最大寸法と少なくとも同じ大きさであり得る。上記は単なる例であり、基端開口部(例えば、234)における接続領域(例えば、236)の幅Wconは、上記例と異なってもよい(例えば、上記列挙される任意の端点により定義される範囲)。
隔離ペンの様々な実施形態において、接続領域(例えば、236)の長さLconと基端開口部234における接続領域(例えば、236)の幅Wconとの比率は、以下の任意の比率以上であり得る:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、又はこれを超える比率。上記は単なる例であり、接続領域236の長さLconと基端開口部234における接続領域236の幅Wconとの比率は、上記例と異なってもよい。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態100、200、23、250、280、290、300において、Vmaxは、約0.1マイクロリッター/秒、約0.2マイクロリッター/秒、約0.3マイクロリッター/秒、約0.4マイクロリッター/秒、約0.5マイクロリッター/秒、約0.6マイクロリッター/秒、約0.7マイクロリッター/秒、約0.8マイクロリッター/秒、約0.9マイクロリッター/秒、約1.0マイクロリッター/秒、約1.1マイクロリッター/秒、約1.2マイクロリッター/秒、約1.3マイクロリッター/秒、約1.5マイクロリッター/秒、約2.0マイクロリッター/秒、約2.5マイクロリッター/秒、約3.0マイクロリッター/秒、約3.5マイクロリッター/秒、約4.0マイクロリッター/秒、約4.5マイクロリッター/秒、約5.0マイクロリッター/秒、約5.5マイクロリッター/秒、約6.0マイクロリッター/秒、約6.7マイクロリッター/秒、約7.0マイクロリッター/秒、約7.5マイクロリッター/秒、約8.0マイクロリッター/秒、約8.5マイクロリッター/秒、約9.0マイクロリッター/秒、約10マイクロリッター/秒、約11マイクロリッター/秒、約12マイクロリッター/秒、約13マイクロリッター/秒、約14マイクロリッター/秒、約15マイクロリッター/秒、又はそれ以上に設定することができる。
隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、隔離ペンの分離領域(例えば、240)の容積は、例えば、少なくとも1×105立方μm、少なくとも2
×105立方μm、少なくとも4×105立方μm、少なくとも8×105立方μm、少なくとも1×106立方μm、少なくとも2×106立方μm、少なくとも4×106立方μm、少なくとも6×106立方μm、少なくとも8×106立方μm、少なくとも1×107立方μm、少なくとも5×107立方μm、少なくとも1×108立方μm、少なくとも5×108立方μm、少なくとも8×108立方μm、又はそれを超える容積であり得る。隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、隔離ペンの容積は、約2×105立方μm、約5×105立方μm、約8×105立方μm、約1×106立方μm、約2×106立方μm、約4×106立方μm、約8×106立方μm、約1×107立方μm、約3×107立方μm、約5×107立方μm、又は約8×107立方μm、又はそれを超える容積であり得る。幾つかの他の実施形態では、隔離ペンの容積は、約0.1ナノリットル~約50ナノリットル、0.2ナノリットル~約25ナノリットル、0.5ナノリットル~約20ナノリットル、約0.8ナノリットル~約15ナノリットル、又は約1ナノリットル~約10ナノリットルであり得る。
×105立方μm、少なくとも4×105立方μm、少なくとも8×105立方μm、少なくとも1×106立方μm、少なくとも2×106立方μm、少なくとも4×106立方μm、少なくとも6×106立方μm、少なくとも8×106立方μm、少なくとも1×107立方μm、少なくとも5×107立方μm、少なくとも1×108立方μm、少なくとも5×108立方μm、少なくとも8×108立方μm、又はそれを超える容積であり得る。隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、隔離ペンの容積は、約2×105立方μm、約5×105立方μm、約8×105立方μm、約1×106立方μm、約2×106立方μm、約4×106立方μm、約8×106立方μm、約1×107立方μm、約3×107立方μm、約5×107立方μm、又は約8×107立方μm、又はそれを超える容積であり得る。幾つかの他の実施形態では、隔離ペンの容積は、約0.1ナノリットル~約50ナノリットル、0.2ナノリットル~約25ナノリットル、0.5ナノリットル~約20ナノリットル、約0.8ナノリットル~約15ナノリットル、又は約1ナノリットル~約10ナノリットルであり得る。
様々な実施形態において、マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意の実施形態でのように構成された隔離ペンを有し、その場合、マイクロ流体デバイスは、約5~約10個の隔離ペン、約10~約50個の隔離ペン、約100~約500個の隔離ペン、約200~約1000個の隔離ペン、約500~約1500個の隔離ペン、約1000~約2000個の隔離ペン、約1500~約3000個の隔離ペン、約2000~約4000個の隔離ペン、約2500~約5000個の隔離ペン、約3000~約6000個の隔離ペン、約3500~約7000個の隔離ペン、約4000~約8000個の隔離ペン、約4500~約9000個の隔離ペン、又は約5000~約10000個の隔離ペンを有する。隔離ペンは、全て同じサイズである必要はなく、様々な構成(例えば、異なる幅、隔離ペン内の異なる特徴)を含み得る。
図2Gは、一実施形態によるマイクロ流体デバイス280を示す。マイクロ流体デバイス280は図2Gに示され、マイクロ流体デバイス100の定型化された図である。実際には、マイクロ流体デバイス280及びその構成回路要素(例えば、チャネル122及び隔離ペン128)は本明細書で考察された寸法を有する。図2Gに示されるマイクロ流体回路120は、2つのポート107、4つの別個のチャネル122、及び4つの別個の流路106を有する。マイクロ流体デバイス280は、各チャネル122に通じる複数の隔離ペンをさらに含む。図2Gに示されるマイクロ流体デバイスでは、隔離ペンは、図2Cに示されるペンと同様のジオメトリを有し、したがって、接続領域及び分離領域の両方を有する。したがって、マイクロ流体回路120は、掃引領域(例えば、チャネル122及び2次フロー244の最大侵入深さDp内の接続領域236の部分)及び非掃引領域(例えば、分離領域240及び2次フロー244の最大侵入深さDp内にない接続領域236の部分)の両方を含む。
図3A~図3Bは、本開示によるマイクロ流体デバイス(例えば、100、200、230、250、280、290、300)を動作させるため及び観測のために使用することができるシステム150の様々な実施形態を示す。図3Aに示されるように、システム150は、マイクロ流体デバイス100(図示せず)又は本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体デバイスを保持するように構成された構造体(「ネスト」)300を含むことができる。ネスト300は、マイクロ流体デバイス320(例えば、光学的に作動される動電学的デバイス100)と界面を接することができ、電源192からマイクロ流体デバイス320への電気接続を提供することができるソケット302を含むことができる。ネスト300は、一体型電気信号生成サブシステム304をさらに含むことができる。電気信号生成サブシステム304は、マイクロ流体デバイス320がソケット302により保持されているとき、バイアス電圧がマイクロ流体デバイス320内の電極の対にわたり印加されるように、バイアス電圧をソケット302に供給するように構成され得る。し
たがって、電気信号生成サブシステム304は電源192の部分であり得る。バイアス電圧をマイクロ流体デバイス320に印加する能力は、マイクロ流体デバイス320がソケット302により保持されている場合には常にバイアス電圧が印加されることを意味しない。むしろ、大半の場合、バイアス電圧は、断続的に、例えば、マイクロ流体デバイス320内での電気泳動又は電子ウェッティング等の動電力の生成を促進するために必要な場合にのみ印加される。
たがって、電気信号生成サブシステム304は電源192の部分であり得る。バイアス電圧をマイクロ流体デバイス320に印加する能力は、マイクロ流体デバイス320がソケット302により保持されている場合には常にバイアス電圧が印加されることを意味しない。むしろ、大半の場合、バイアス電圧は、断続的に、例えば、マイクロ流体デバイス320内での電気泳動又は電子ウェッティング等の動電力の生成を促進するために必要な場合にのみ印加される。
図3Aに示されるように、ネスト300は、プリント回路基板組立体(PCBA)322を含むことができる。電気信号生成サブシステム304は、PCBA322に搭載され、PCBA322に電気的に集積することができる。例示的な支持体は、同様にPCBA322に搭載されるソケット302も含む。
通常、電気信号生成サブシステム304は波形生成器(図示せず)を含む。電気信号生成サブシステム304は、波形生成器から受信される波形を増幅するように構成されたオシロスコープ(図示せず)及び/又は波形増幅回路(図示せず)をさらに含むことができる。オシロスコープは、存在する場合、ソケット302により保持されるマイクロ流体デバイス320に供給される波形を測定するように構成され得る。特定の実施形態では、オシロスコープは、マイクロ流体デバイス320の基端位置(及び波形生成器の先端位置)において波形を測定し、それにより、デバイスに実際に印加されている波形を測定するに当たりより大きい精度を保証する。オシロスコープ測定から得られるデータは、例えば、フィードバックとして波形生成器に提供され得、波形生成器は、そのようなフィードバックに基づいて出力を調整するように構成され得る。適する結合された波形生成器及びオシロスコープの例は、Red Pitaya(商標)である。
特定の実施形態では、ネスト300は、電気信号生成サブシステム304の検知及び/又は制御に使用される、マイクロプロセッサ等のコントローラ308をさらに含む。適するマイクロプロセッサの例としては、Arduino Nano(商標)等のArduino(商標)マイク
ロ
プロセッサが挙げられる。コントローラ308を使用して機能及び分析を実行し、又は外部マスタコントローラ154(図1Aに示される)と通信して機能及び分析を実行し得る。図3Aに示される実施形態では、コントローラ308は、インタフェース310(例えば、プラグ又はコネクタ)を通してマスタコントローラ154と通信する。
ロ
プロセッサが挙げられる。コントローラ308を使用して機能及び分析を実行し、又は外部マスタコントローラ154(図1Aに示される)と通信して機能及び分析を実行し得る。図3Aに示される実施形態では、コントローラ308は、インタフェース310(例えば、プラグ又はコネクタ)を通してマスタコントローラ154と通信する。
幾つかの実施形態では、ネスト300は、Red Pitaya(商標)波形生成器/オシロスコープユニット(「Red Pitayaユニット」)を含む電気信号生成サブシステム304と、Red Pitayaユニットにより生成された波形を増幅し、増幅電圧をマイクロ流体デバイス100に渡す波形増幅回路とを含むことができる。幾つかの実施形態では、Red Pitayaユニットは、マイクロ流体デバイス320での増幅電圧を測定し、次に、マイクロ流体デバイス320での測定電圧が所望の値であるように、必要に応じてそれ自体の出力電圧を調整するように構成される。幾つかの実施形態では、波形増幅回路は、PCBA322に搭載されるDC-DCコンバータの対により生成される+6.5V~-6.5V電源を有することができ、その結果、マイクロ流体デバイス100において13Vppまでの信号が生成される。
図3Aに示されるように、支持構造体300(例えば、ネスト)は、熱制御サブシステム306をさらに含むことができる。熱制御サブシステム306は、支持構造体300により保持されるマイクロ流体デバイス320の温度を調整するように構成され得る。例えば、熱制御サブシステム306は、ペルチェ熱電デバイス(図示せず)及び冷却ユニット(図示せず)を含むことができる。ペルチェ熱電デバイスは、マイクロ流体デバイス320の少なくとも1つの表面と界面を接するように構成された第1の表面を有することがで
きる。冷却ユニットは、例えば、液冷アルミニウムブロック等の冷却ブロック(図示せず)であり得る。ペルチェ熱電デバイスの第2の表面(例えば、第1の表面とは逆の表面)は、そのような冷却ブロックの表面と界面を接するように構成され得る。冷却ブロックは、冷却ブロックを通して冷却流体を循環させるように構成された流体路314に接続することができる。図3Aに示される実施形態では、支持構造体300は、流入口316及び流出口318を含む、外部リザーバ(図示せず)から冷却された流体を受け取り、冷却された流体を流体路314に導入し、冷却ブロックを通し、次に、冷却された流体を外部リザーバに戻す。幾つかの実施形態では、ペルチェ熱電デバイス、冷却ユニット、及び/又は流体路314は、支持構造体300のケース312に搭載することができる。幾つかの実施形態では、熱制御サブシステム306は、ペルチェ熱電デバイスの温度を調整して、マイクロ流体デバイス320の標的温度を達成するように構成される。ペルチェ熱電デバイスの温度調整は、例えば、Pololu(商標)熱電電源(Pololu Robotics and Electronics Corp.)等の熱電電源により達成することができる。熱制御サブシステム306は、ア
ナログ回路により提供される温度値等のフィードバック回路を含むことができる。代替的に、フィードバック回路はデジタル回路により提供され得る。
きる。冷却ユニットは、例えば、液冷アルミニウムブロック等の冷却ブロック(図示せず)であり得る。ペルチェ熱電デバイスの第2の表面(例えば、第1の表面とは逆の表面)は、そのような冷却ブロックの表面と界面を接するように構成され得る。冷却ブロックは、冷却ブロックを通して冷却流体を循環させるように構成された流体路314に接続することができる。図3Aに示される実施形態では、支持構造体300は、流入口316及び流出口318を含む、外部リザーバ(図示せず)から冷却された流体を受け取り、冷却された流体を流体路314に導入し、冷却ブロックを通し、次に、冷却された流体を外部リザーバに戻す。幾つかの実施形態では、ペルチェ熱電デバイス、冷却ユニット、及び/又は流体路314は、支持構造体300のケース312に搭載することができる。幾つかの実施形態では、熱制御サブシステム306は、ペルチェ熱電デバイスの温度を調整して、マイクロ流体デバイス320の標的温度を達成するように構成される。ペルチェ熱電デバイスの温度調整は、例えば、Pololu(商標)熱電電源(Pololu Robotics and Electronics Corp.)等の熱電電源により達成することができる。熱制御サブシステム306は、ア
ナログ回路により提供される温度値等のフィードバック回路を含むことができる。代替的に、フィードバック回路はデジタル回路により提供され得る。
幾つかの実施形態では、ネスト300は、抵抗(例えば、抵抗1kオーム+/-0.1%、温度係数+/-0.02ppm/C0)及びNTCサーミスタ(例えば、公称抵抗1kオーム+/-0.01%を有する)を含むアナログ分圧回路(図示せず)であるフィードバック回路を有する熱制御サブシステム306を含むことができる。幾つかの場合、熱制御サブシステム306は、フィードバック回路からの電圧を測定し、次に、計算された温度値をオンボードPID制御ループアルゴリズムへの入力として使用する。PID制御ループアルゴリズムからの出力は、例えば、Pololu(商標)モーター駆動デバイス(図示せず)上の方向信号及びパルス幅変調信号ピンの両方を駆動して熱電電源を作動させることができ、それにより、ペルチェ熱電デバイスを制御する。
ネスト300はシリアルポート350を含むことができ、シリアルポート324により、コントローラ308のマイクロプロセッサは、インタフェース310(図示せず)を介して外部マスタコントローラ154と通信することができる。加えて、コントローラ308のマイクロプロセッサは、電気信号生成サブシステム304及び熱制御サブシステム306と通信することができる(例えば、Plinkツール(図示せず)を介して)。したがっ
て、コントローラ308、インタフェース310、及びシリアルポート324の組合せを介して、電気信号生成サブシステム304及び熱制御サブシステム306は、外部マスタコントローラ154と通信することができる。このようにして、マスタコントローラ154は、特に、出力電圧調整のためにスケーリング計算を実行することにより電気信号生成サブシステム304を支援することができる。外部マスタコントローラ154に結合された表示デバイス170を介して提供されるグラフィカルユーザインタフェース(GUI)(図示せず)は、熱制御サブシステム306及び電気信号生成サブシステム304からそれぞれ得られる温度データ及び波形データをプロットするように構成され得る。代替的に又は追加として、GUIは、コントローラ308、熱制御サブシステム306、及び電気信号生成サブシステム304への更新を可能にすることができる。
て、コントローラ308、インタフェース310、及びシリアルポート324の組合せを介して、電気信号生成サブシステム304及び熱制御サブシステム306は、外部マスタコントローラ154と通信することができる。このようにして、マスタコントローラ154は、特に、出力電圧調整のためにスケーリング計算を実行することにより電気信号生成サブシステム304を支援することができる。外部マスタコントローラ154に結合された表示デバイス170を介して提供されるグラフィカルユーザインタフェース(GUI)(図示せず)は、熱制御サブシステム306及び電気信号生成サブシステム304からそれぞれ得られる温度データ及び波形データをプロットするように構成され得る。代替的に又は追加として、GUIは、コントローラ308、熱制御サブシステム306、及び電気信号生成サブシステム304への更新を可能にすることができる。
上述したように、システム150は撮像デバイス194を含むことができる。幾つかの実施形態では、撮像デバイス194は光変調サブシステム330(図3B参照)を含む。光変調サブシステム330は、デジタルミラーデバイス(DMD)又はマイクロシャッタアレイシステム(MSA)を含むことができ、これらのいずれかは、光源332から光を受け取り、受け取った光のサブセットを顕微鏡350の光学縦列に送るように構成され得る。代替的に、光変調サブシステム330は、有機発行ダイオードディスプレイ(OLED)、液晶オンシリコン(LCOS)デバイス、強誘電性液晶オンシリコンデバイス(FLCOS)、又は透過型液晶ディスプレイ(LCD)等のそれ自体の光を生成する(した
がって、光源332の必要性をなくす)デバイスを含むことができる。光変調サブシステム330は、例えば、プロジェクタであり得る。したがって、光変調サブシステム330は、構造化光及び非構造化光の両方を発することが可能であり得る。特定の実施形態では、システム150の撮像モジュール164及び/又は原動モジュール162は、光変調サブシステム330を制御することができる。
がって、光源332の必要性をなくす)デバイスを含むことができる。光変調サブシステム330は、例えば、プロジェクタであり得る。したがって、光変調サブシステム330は、構造化光及び非構造化光の両方を発することが可能であり得る。特定の実施形態では、システム150の撮像モジュール164及び/又は原動モジュール162は、光変調サブシステム330を制御することができる。
特定の実施形態では、撮像デバイス194は顕微鏡350をさらに含む。そのような実施形態では、ネスト300及び光変調サブシステム330は、顕微鏡350に搭載されるように個々に構成され得る。顕微鏡350は、例えば、標準の研究等級の光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡であるように構成され得る。したがって、ネスト300は、顕微鏡350のステージ344に搭載するように構成され得、及び/又は光変調サブシステム330は、顕微鏡350のポートに搭載されるように構成され得る。他の実施形態では、本明細書に記載されるネスト300及び光変調サブシステム330は、顕微鏡350の一体構成要素であり得る。
特定の実施形態では、顕微鏡350は1つ又は複数の検出器348をさらに含むことができる。幾つかの実施形態では、検出器348は撮像モジュール164により制御される。検出器348は、接眼レンズ、電荷結合素子(CCD)、カメラ(例えば、デジタルカメラ)、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。少なくとも2つの検出器348が存在する場合、1つの検出器は、例えば、高速フレームレートカメラであり得、一方、他の検出器は高感度カメラであり得る。さらに、顕微鏡350は、マイクロ流体デバイス320から反射された光及び/又は発せられた光を受け取り、反射光及び/又は放射光の少なくとも部分を1つ又は複数の検出器348に結像するように構成された光学縦列を含むことができる。顕微鏡の光学縦列は、各検出器での最終倍率が異なることができるように、異なる検出器で異なるチューブレンズ(図示せず)を含むこともできる。
特定の実施形態では、撮像デバイス194は、少なくとも2つの光源を使用するように構成される。例えば、第1の光源332は構造化光の生成(例えば、光変調サブシステム330を介した)に使用することができ、第2の光源334は非構造化光の提供に使用することができる。第1の光源332は、光学的に作動される動電学的及び/又は蛍光励起のために構造化光を生成することができ、第2の光源334は、明視野照明の提供に使用することができる。これらの実施形態では、原動モジュール164を使用して第1の光源332を制御することができ、撮像モジュール164を使用して第2の光源334を制御することができる。顕微鏡350の光学縦列は、(1)デバイスがネスト300により保持されているとき、構造化光を光変調サブシステム330から受け取り、構造化光を光学作動式動電学的デバイス等のマイクロ流体デバイス内の少なくとも第1の領域で結像し、(2)マイクロ流体デバイスから反射された光及び/又は発せられた光を受け取り、そのような反射光及び/又は放射光の少なくとも部分を検出器348上に結像するように構成され得る。光学縦列は、デバイスがネスト300により保持されているとき、非構造化光を第2の光源から受け取り、非構造化光をマイクロ流体デバイスの少なくとも第2の領域で結像するようにさらに構成され得る。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスの第1及び第2の領域は重複領域であり得る。例えば、第1の領域は、第2の領域のサブセットであり得る。他の実施形態では、第2の光源334は、光の任意の適切な波長を有し得るレーザーを追加で又は代替として含み得る。図3Bに示した光学系の描写は、単なる模式的な描写であり、光学系は、追加のフィルター、ノッチフィルター、レンズ等を含み得る。第2の光源334が一又は複数の明視野及び/又は蛍光励起用の光源を含むとき、レーザー照明のみならず、光源の物理的な配置も図3Bから変化し得るし、レーザー照明は、光学系内で任意の適切な物理的位置に誘導される。光源432及び光源402/光モジュールサブシステム404の模式的な配置は、相互に交換可能でもあり得る。
図3Bでは、光を光変調サブシステム330に供給している第1の光源332が示されており、光変調サブシステム330は構造化光をシステム355(図示せず)の顕微鏡350の光学縦列に提供する。ビームスプリッタ336を介して非構造化光を光学縦列に提供している第2の光源334が示される。光変調サブシステム330からの構造化光及びに示されるように、第2の光源334からの非構造化光は、ビームスプリッタ336から光学縦列を通って一緒に移動して、第2のビームスプリッタ(又は光変調サブシステム330によって提供される光に応じて、ダイクロイックフィルタ338)に到達し、ここで、光は反射し、対物レンズ336を通して試料面342まで下がる。次に、試料面342からの反射光及び/又は放射光は再び対物レンズ340を通って移動し、ビームスプリッタ及び/又はダイクロイックフィルタ338を通り、ダイクロイックフィルタ346に到達する。ダイクロイックフィルタ346に達する光の一部のみが透過され、検出器348に到達する。
幾つかの実施形態では、第2の光源334は青色光を発する。適切なダイクロイックフィルタ346を用いて、試料面342から反射された青色光は、ダイクロイックフィルタ346を透過し、検出器348に到達することが可能である。これとは対照的に、光変調サブシステム330から来る構造化光は、試料面342で反射されるが、ダイクロイックフィルタ346を透過しない。この例では、ダイクロイックフィルタ346は、495nmよりも長い波長を有する可視光を濾波して除外する。光変調サブシステム330からの光のそのような濾波は、光変調サブシステムから発せられる光が495nmよりも短いいかなる波長も含まない場合にのみ完了する(示されるように)。実際には、光変調サブシステム330から来る光が495nmよりも短い波長(例えば、青色波長)を含む場合、光変調サブシステムからの光の幾らかがフィルタ346を透過して検出器348に到達する。そのような実施形態では、フィルタ346は、第1の光源332から検出器348に到達する光の量と第2の光源334から検出器348に到達する光の量とのバランスを変更する役割を果たす。これは、第1の光源332が第2の光源334よりもはるかに強力な場合、有益であり得る。他の実施形態では、第2の光源334は、赤色光を発することができ、ダイクロイックフィルタ346は、赤色光以外の可視光(例えば、650nmよりも短い波長を有する可視光)を濾波して除外することができる。
被覆溶液及び被覆剤
理論による限定を意図せずに、マイクロ流体デバイス(例えば、DEP構成及び/又はEW構成マイクロ流体デバイス)内での生物学的微小物体(例えば、生体細胞)の維持は、マイクロ流体デバイスの少なくとも1つ又は複数の内面が、マイクロ流体デバイスと内部に維持される生物学的微小物体との間の主な界面を提供する有機分子及び/又は親水性分子の層を提示するように調整又は被覆される場合に促進し得る(すなわち、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイス内で生存率の増大、より大きい増殖、及び/又はより大きい可搬性を示す)。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の1つ又は複数(例えば、DEP構成マイクロ流体デバイスの電極活性化基板の内面、マイクロ流体のカバー、及び/又は回路材料の表面)は、有機分子及び/又は親水性分子の所望の層を生成するように、被覆溶液及び/又は被覆剤により処理又は修飾し得る。
理論による限定を意図せずに、マイクロ流体デバイス(例えば、DEP構成及び/又はEW構成マイクロ流体デバイス)内での生物学的微小物体(例えば、生体細胞)の維持は、マイクロ流体デバイスの少なくとも1つ又は複数の内面が、マイクロ流体デバイスと内部に維持される生物学的微小物体との間の主な界面を提供する有機分子及び/又は親水性分子の層を提示するように調整又は被覆される場合に促進し得る(すなわち、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイス内で生存率の増大、より大きい増殖、及び/又はより大きい可搬性を示す)。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の1つ又は複数(例えば、DEP構成マイクロ流体デバイスの電極活性化基板の内面、マイクロ流体のカバー、及び/又は回路材料の表面)は、有機分子及び/又は親水性分子の所望の層を生成するように、被覆溶液及び/又は被覆剤により処理又は修飾し得る。
被覆は、生物学的微小物体を導入する前又は後に塗布してもよく、又は生物学的微小物体と同時に導入してもよい。幾つかの実施形態では、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイスの1つ又は複数の被覆剤を含む流体媒体中に搬入し得る。他の実施形態では、マイクロ流体デバイス(例えば、DEP構成マイクロ流体デバイス)の内面は、生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスに導入する前に、被覆剤を含む被覆溶液を用いて処理又は「プライミング」される。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも1つの表面は、生物学的微
小物体の維持及び/又は増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供する(例えば、後述するような調整面を提供する)被覆剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの略全ての内面は被覆材料を含む。被覆された内面は、流路(例えば、チャネル)の表面、チャンバの表面、隔離ペンの表面、又はそれらの組合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも1つの内面を有する。他の実施形態では、複数の流路又はチャネルのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも1つの内面を有する。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれ及び複数のチャネルのそれぞれの少なくとも1つの内面は、被覆材料で被覆される。
小物体の維持及び/又は増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供する(例えば、後述するような調整面を提供する)被覆剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの略全ての内面は被覆材料を含む。被覆された内面は、流路(例えば、チャネル)の表面、チャンバの表面、隔離ペンの表面、又はそれらの組合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも1つの内面を有する。他の実施形態では、複数の流路又はチャネルのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも1つの内面を有する。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれ及び複数のチャネルのそれぞれの少なくとも1つの内面は、被覆材料で被覆される。
被覆剤/溶液
限定ではなく、血清又は血清因子、ウシ血清アルブミン(BSA)、ポリマー、洗剤、酵素、及びそれらの任意の組合わせを含む任意の従来の被覆剤/被覆溶液を使用することができる。
限定ではなく、血清又は血清因子、ウシ血清アルブミン(BSA)、ポリマー、洗剤、酵素、及びそれらの任意の組合わせを含む任意の従来の被覆剤/被覆溶液を使用することができる。
ポリマーベースの被覆材料
少なくとも1つの内面は、ポリマーを含む被覆材料を含み得る。ポリマーは、少なくとも1つの表面に共有結合又は非共有結合し得る(又は非特異的に付着し得る)。ポリマーは、ブロックポリマー(及びコポリマー)、星型ポリマー(星型コポリマー)、並びにグラフト又は櫛形ポリマー(グラフトコポリマー)に見られる等の多種多様な構造モチーフを有し得、これらは全て本明細書に開示される方法に適し得る。
少なくとも1つの内面は、ポリマーを含む被覆材料を含み得る。ポリマーは、少なくとも1つの表面に共有結合又は非共有結合し得る(又は非特異的に付着し得る)。ポリマーは、ブロックポリマー(及びコポリマー)、星型ポリマー(星型コポリマー)、並びにグラフト又は櫛形ポリマー(グラフトコポリマー)に見られる等の多種多様な構造モチーフを有し得、これらは全て本明細書に開示される方法に適し得る。
ポリマーは、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを含み得る。広範囲のアルキレンエーテル含有ポリマーが、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスでの使用に適し得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの非限定的で例示的な一クラスは、ポリマー鎖内で異なる比率及び異なる場所にあるポリエチレンオキシド(PEO)サブユニット及びポリプロピレンオキシド(PPO)サブユニットのブロックを含む両親媒性非イオンブロックコポリマーである。Pluronic(登録商標)ポリマー(BASF)は、このタイプのブロックコポリマーであり、生細胞と接触する場合の使用に適することが当技術分野で既知である。ポリマーは、平均分子質量MWで、約2000Da~約20KDaの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、PEO-PPOブロックコポリマーは、約10よりも大きい(例えば、12~18)の親水性親油性バランス(HLB)を有することができる。被覆された表面をもたらすのに有用な特定のPluronic(登録商標)ポリマーは、Pluronic(登録商標)L44、L64、P85、及びF127(F127NFを含む)を含む。別のクラスのアルキレンエーテル含有ポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG MW<100,000Da)又は代替的にポリエチレンオキシド(PEO、MW>100,000)である。幾つかの実施形態では、PEGは約1000Da、5000Da、10,000Da、又は20,000DaのMWを有し得る。
他の実施形態では、被覆材料は、カルボン酸部分を含むポリマーを含み得る。カルボン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリ乳酸(PLA)である。他の実施形態では、被覆材料は、ポリマー骨格の末端又はポリマー骨格からのペンダントのいずれかにリン酸部分を含むポリマーを含み得る。さらに他の実施形態では、被覆材料は、スルホン酸部分を含むポリマーを含み得る。スルホン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリスチレンスルホン酸(PSSA)又はポリアネトールスルホン酸である。更なる実施形態では、被覆材料はアミン部分を含むポリマーを含み得る。ポリアミノポリマーは、天然ポリアミンポリマー又は合成ポリアミンポリマーを含み得る。天然ポリアミンの例としては、スペルミン、スペルミジン、及びプトレッシンが挙げられる。
他の実施形態では、被覆材料は、糖類部分を含むポリマーを含み得る。非限定的な例では、キサンタンガム又はデキストラン等のポリサッカリドが、マイクロ流体デバイスにおける細胞の突き刺しを低減又は阻止し得る材料を形成するのに適し得る。例えば、約3kDaのサイズを有するデキストランポリマーを使用して、マイクロ流体デバイス内の表面に被覆材料を提供し得る。
他の実施形態では、被覆材料は、リボヌクレオチド部分又はデオキシリボヌクレオチド部分を有し、高分子電解質表面を提供し得る、ヌクレオチド部分、すなわち、核酸を含むポリマーを含み得る。核酸は、天然ヌクレオチド部分のみを含んでもよく、又は限定ではなく、7-デアザアデニン、ペントース、メチルホスホン酸、又はホスホロチオエート部分等の核酸塩基、リボース、リン酸塩部分類似物を含む非天然ヌクレオチド部分を含んでもよい。
さらに他の実施形態では、被覆材料は、アミノ酸部分を含むポリマーを含み得る。アミノ酸部分を含むポリマーは、天然アミノ酸含有ポリマー又は非天然アミノ酸含有ポリマーを含み得、これらのいずれかはペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含み得る。非限定的な一例では、被覆剤として、タンパク質は、ウシ血清アルブミン(BSA)並びに/或いはアルブミン及び/又は1つ又は複数の他の同様のタンパク質を含む血清(又は複数の異なる血清の組合わせ)であり得る。血清は、限定ではなく、ウシ胎仔血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ウマ血清等を含む任意の好都合のソースからのものであり得る。特定の実施形態では、被覆溶液中のBSAは、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約1mg/mL~約100mg/mLの範囲で存在する。特定の実施形態では、被覆溶液中の血清は、25%、30%、35%、40%、45%、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約20%(v/v)~約50%v/vの範囲で存在し得る。幾つかの実施形態では、BSAは、5mg/mLで被覆溶液中に被覆剤として存在し得、一方、他の実施形態では、BSAは、70mg/mLで被覆溶液中に被覆剤として存在し得る。特定の実施形態では、血清は、30%で被覆溶液中に被覆剤として存在する。幾つかの実施形態では、フォスター細胞成長への細胞の付着を最適化するために、細胞外基質(ECM)タンパク質を被覆材料内に提供し得る。被覆材料に包含し得る細胞基質タンパク質としては、限定ではなく、コラーゲン、エラスチン、RGD含有ペプチド(例えば、フィブロネクチン)、又はラミニンを挙げることができる。さらに他の実施形態では、成長因子、サイトカイン、ホルモン、又は他の細胞シグナリング種をマイクロ流体デバイスの被覆材料内に提供し得る。
幾つかの実施形態では、被覆材料は、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、又はアミノ酸部分の2つ以上を含むポリマーを含み得る。他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、被覆材料に独立して又は同時に組み込み得る、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、及び/又はアミノ酸部分をそれぞれ有する2つ以上のポリマーの混合物を含み得る。
共有結合される被覆材料
幾つかの実施形態では、少なくとも1つの内面は、マイクロ流体デバイス内の生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供して、そのような細胞に調整面を提供する共有結合分子を含む。
幾つかの実施形態では、少なくとも1つの内面は、マイクロ流体デバイス内の生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供して、そのような細胞に調整面を提供する共有結合分子を含む。
共有結合分子は結合基を含み、結合基は、後述するように、マイクロ流体デバイスの1
つ又は複数の表面に共有結合する。結合基は、生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分にも共有結合する。
つ又は複数の表面に共有結合する。結合基は、生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分にも共有結合する。
幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される共有結合部分は、アルキル又はフルオロアルキル(ペルフルオロアルキルを含む)部分;モノ又はポリサッカリド(デキストランを含み得るが、これに限定されない);アルコール(プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない);ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール;ポリエチレングリコールを含み得るが、これに限定されないアルキレンエーテル;高分子電解質(ポリアクリル酸又はポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない);アミノ基(アルキル化アミン、モルホルニル又はピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体);プロピオル酸(カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る)を含むが、これに限定されないカルボン酸;エチニルホスホン酸(ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る)を含むが、これに限定されないホスホン酸;スルホン酸アニオン;カルボキシベタイン;スルホベタイン;スルファミン酸;又はアミノ酸を含み得る。
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される共有結合部分は、アルキル部分、フルオロアルキル部分(ペルフルオロアルキル部分を含むが、これに限定されない)等の置換アルキル部分、アミノ酸部分、アルコール部分、アミノ部分、カルボン酸部分、ホスホン酸部分、スルホン酸部分、スルファミン酸部分、又はサッカリド部分等の非ポリマー部分を含み得る。代替的には、共有結合部分は、上述した任意の部分であり得るポリマー部分を含み得る。
幾つかの実施形態では、共有結合部分は、線状鎖(例えば、少なくとも10個の炭素又は少なくとも14、16、18、20、22、若しくはそれを超える個数の炭素の線状鎖)を形成する炭素原子を含むことができ、且つ直鎖アルキル部分であり得る。幾つかの実施形態では、アルキル基は置換アルキル基を含み得る(例えば、アルキル基の炭素の幾つかはフッ素化又はパーフルオロ化することができる)。幾つかの実施形態では、アルキル基は、非置換アルキル基を含み得る第2のセグメントに結合される、ペルフルオロアルキル基を含み得る第1のセグメントを含み得る。第1及び第2のセグメントは、直接又は間接的(例えば、エーテル結合により)に結合され得、ここで、アルキル基の第1のセグメントは、結合基の先端部に配置し得、アルキル基の第2のセグメントは、結合基の基端部に配置し得る。
他の実施形態では、共有結合部分は、2つ以上の種類のアミノ酸を含み得る少なくとも1つのアミノ酸を含み得る。したがって、共有結合部分は、ペプチド又はタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、共有結合部分は、双性イオン性表面を提供して、細胞成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持し得るアミノ酸を含み得る。
他の実施形態では、共有結合部分は、少なくとも1つのアルキレンオキシド部分を含み得、上述した任意のアルキレンオキシドポリマーを含み得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの有用な1クラスは、ポリエチレングリコール(PEG Mw<100,000Da)又は代替的にはポリエチレンオキシド(PEO、Mw>100,000)である。幾つかの実施形態では、PEGは約1000Da、約5000Da、約10,000Da、又は約20,000DaのMwを有し得る。
共有結合部分は1つ又は複数のサッカリドを含み得る。共有結合サッカリドはモノ、ジ
、又はポリサッカリドであり得る。共有結合サッカリドは、表面に付着するような結合又は加工を可能にする反応ペア部分を導入するように修飾し得る。例示的な反応ペア部分は、アルデヒド、アルキン、又はハロ部分を含み得る。ポリサッカリドは、ランダムに修飾し得、各サッカリドモノマーが修飾されてもよく、又はポリサッカリド内のサッカリドモノマーの一部のみが、表面に直接若しくは間接的に結合され得る反応ペア部分を提供するように修飾される。一例は、直鎖リンカーを介して表面に間接的に結合され得るデキストランポリサッカリドを含み得る。
、又はポリサッカリドであり得る。共有結合サッカリドは、表面に付着するような結合又は加工を可能にする反応ペア部分を導入するように修飾し得る。例示的な反応ペア部分は、アルデヒド、アルキン、又はハロ部分を含み得る。ポリサッカリドは、ランダムに修飾し得、各サッカリドモノマーが修飾されてもよく、又はポリサッカリド内のサッカリドモノマーの一部のみが、表面に直接若しくは間接的に結合され得る反応ペア部分を提供するように修飾される。一例は、直鎖リンカーを介して表面に間接的に結合され得るデキストランポリサッカリドを含み得る。
共有結合部分は1つ又は複数のアミノ基を含み得る。アミノ基は、置換アミン部分、グアニジン部分、窒素含有ヘテロ環部分又はヘテロアリール部分であり得る。アミノ含有部分は、マイクロ流体デバイス内及び任意選択的に隔離ペン及び/又は流路(例えば、チャネル)内の環境のpH変更を可能にする構造を有し得る。
調整面を提供する被覆材料は、一種のみの共有結合部分を含んでもよく、又は2つ以上の異なる種類の共有結合部分を含んでもよい。例えば、フルオロアルキル調整面(ペルフルオロアルキルを含む)は、全て同じ、例えば、表面への同じ結合基及び共有結合、同じ全体長、及びフルオロアルキル部分を含む同数のフルオロメチレン単位を有する複数の共有結合部分を有し得る。代替的には、被覆材料は、表面に付着する2種類以上の共有結合部分を有し得る。例えば、被覆材料は、指定された数のメチレン又はフルオロメチレン単位を有する共有結合アルキル又はフルオロアルキル部分を有する分子を含み得、被覆面においてより嵩張った部分を提示する能力をお提供し得る、より多数のメチレン又はフルオロメチレン単位を有するアルキル又はフルオロアルキル鎖に共有結合した荷電部分を有する更なる組の分子をさらに含み得る。この場合、異なる、立体的に要求が余り厳しくない末端及びより少数の骨格原子を有する第1の組の分子は、基板表面全体を官能化し、それにより基板自体を構成するケイ素/酸化ケイ素、酸化ハフニウム、又はアルミナへの望ましくない付着又は接触を回避するのに役立つことができる。別の例では、共有結合部分は、表面上でランダムに交流電荷を提示する両性イオン表面を提供し得る。
調整面特性
調整された表面の組成以外で、疎水性材料の物理的厚さ等の他の要因がDEP力に影響し得る。調整された表面が基板に形成される様式(例えば、蒸着、液相堆積、スピンコーティング、フラッディング、及び静電コーティング)等の様々な要因が調整された表面の物理的厚さを変更し得る。幾つかの実施形態では、調整面は、約1nm~約10nm、約1nm~約7nm、約1nm~約5nm、又はそれらの間の任意の個々の値の厚さを有する。他の実施形態では、共有結合部分により形成される調整面は、約10nm~約50nmの厚さを有し得る。様々な実施形態では、本明細書において記載されるように準備される調整面は、10nm未満の厚さを有する。幾つかの実施形態では、調整面の共有結合部分は、マイクロ流体デバイスの表面(例えば、DEP構成基板表面)に共有結合した場合、単層を形成し得、10nm未満(例えば、5nm未満又は約1.5nm~3.0nm)の厚さを有し得る。これらの値は、例えば、典型的には約30nmの範囲の厚さを有し得るスピンコーティングで用意された表面の厚さとは対照的である。幾つかの実施形態では、調整面は、DEP構成マイクロ流体デバイス内での動作に適宜機能的であるために、完全に形成された単層を必要としない。
調整された表面の組成以外で、疎水性材料の物理的厚さ等の他の要因がDEP力に影響し得る。調整された表面が基板に形成される様式(例えば、蒸着、液相堆積、スピンコーティング、フラッディング、及び静電コーティング)等の様々な要因が調整された表面の物理的厚さを変更し得る。幾つかの実施形態では、調整面は、約1nm~約10nm、約1nm~約7nm、約1nm~約5nm、又はそれらの間の任意の個々の値の厚さを有する。他の実施形態では、共有結合部分により形成される調整面は、約10nm~約50nmの厚さを有し得る。様々な実施形態では、本明細書において記載されるように準備される調整面は、10nm未満の厚さを有する。幾つかの実施形態では、調整面の共有結合部分は、マイクロ流体デバイスの表面(例えば、DEP構成基板表面)に共有結合した場合、単層を形成し得、10nm未満(例えば、5nm未満又は約1.5nm~3.0nm)の厚さを有し得る。これらの値は、例えば、典型的には約30nmの範囲の厚さを有し得るスピンコーティングで用意された表面の厚さとは対照的である。幾つかの実施形態では、調整面は、DEP構成マイクロ流体デバイス内での動作に適宜機能的であるために、完全に形成された単層を必要としない。
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの調整面を提供する被覆材料は、所望の電気特性を提供し得る。理論による限定を意図せずに、特定の被覆材料が被覆された表面の堅牢性に影響する一因子は、本質的に電荷捕獲である。異なる被覆材料は電子を捕獲し得、これは被覆材料の破壊に繋がる恐れがある。被覆材料の欠陥は、電荷捕獲を増大させ、被覆材料の更なる破壊に繋がる恐れがある。同様に、異なる被覆材料は異なる絶縁耐力(すなわち、絶縁破壊が生じる最小印加電場)を有し、これは電荷捕獲に影響を有し得る。
特定の実施形態では、被覆材料は、その電荷捕獲量を低減又は制限する全体構造(例えば、高密度単層構造)を有することができる。
特定の実施形態では、被覆材料は、その電荷捕獲量を低減又は制限する全体構造(例えば、高密度単層構造)を有することができる。
調整された表面は、その電気特性に加えて、生体分子との併用に有利な特性を有することもできる。例えば、フッ化(又はパーフルオロ化)炭素鎖を含む調整された表面は、表面ファウリング量を低減するに当たり、アルキル末端鎖と比較して利点を提供し得る。表面ファウリングは、本明細書で使用される場合、タンパク質及びその老廃物、核酸及び各老廃物等のバイオ材料の永久的又は半永久的な堆積を含み得る、マイクロ流体デバイスの表面への無差別材料堆積量を指す。
単一又は複数パートの調整面
共有結合被覆材料は、後述するように、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を既に含む分子の反応により形成し得る。代替的には、共有結合被覆材料は、生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を、それ自体が表面に共有結合した表面修飾リガンドに結合することにより、2部シーケンスで形成し得る。
共有結合被覆材料は、後述するように、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を既に含む分子の反応により形成し得る。代替的には、共有結合被覆材料は、生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を、それ自体が表面に共有結合した表面修飾リガンドに結合することにより、2部シーケンスで形成し得る。
共有結合された被覆材料を準備する方法
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの表面(例えば、隔離ペン及び/又は流路の少なくとも1つの表面を含む)に共有結合した被覆材料は、式1又は式2の構造を有する。被覆材料は、表面に1ステップで導入される場合、式1の構造を有し、一方、被覆材料は、複数ステッププロセッサで導入される場合、式2の構造を有する。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの表面(例えば、隔離ペン及び/又は流路の少なくとも1つの表面を含む)に共有結合した被覆材料は、式1又は式2の構造を有する。被覆材料は、表面に1ステップで導入される場合、式1の構造を有し、一方、被覆材料は、複数ステッププロセッサで導入される場合、式2の構造を有する。
被覆材料は、DEP構成又はEW構成基板の表面の酸化物に供給結合し得る。DEP又はEW構成基板は、ケイ素、酸化ケイ素、アルミナ、又は酸化ハフニウムを含み得る。酸化物は、基板の元の化学構造の一部として存在してもよく、又は後述するように導入し得る。
被覆材料は、結合基(「LG」)を介して酸化物に結合し得、LGは、シロキサン基又はホスホン酸基と酸化物との反応から形成されるシロキシ又はホスホネートエステル基であり得る。マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、本明細書に記載される任意の部分であり得る。結合基LGは、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に直接又は間接的に接続し得る。結合基LGがその部分に直接接続される場合、任意選択的なリンカーLは存在せず、nは0である。結合基LGが部分に間接的に接続される場合、リンカーLが存在し、nは1である。リンカーLは、線状部の骨格が、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される1~200個の非水素原子を含み得る線状部を有し得る。それは、エーテル基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、又はリン酸基、ア
リーレン基、ヘテロアリーレン基、又はヘテロ環基からなる群から選択される1つ又は複数の部分の任意の組合せで中断され得る。幾つかの実施形態では、リンカーLの骨格は10~20個の炭素を含み得る。他の実施形態では、リンカーLの骨格は約5原子~約200原子、約10原子~約80原子、約10原子~約50原子、又は約10原子~約40原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は全て炭素原子である。
リーレン基、ヘテロアリーレン基、又はヘテロ環基からなる群から選択される1つ又は複数の部分の任意の組合せで中断され得る。幾つかの実施形態では、リンカーLの骨格は10~20個の炭素を含み得る。他の実施形態では、リンカーLの骨格は約5原子~約200原子、約10原子~約80原子、約10原子~約50原子、又は約10原子~約40原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は全て炭素原子である。
幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、複数ステッププロセスで基板の表面に追加し得、上で示された式2の構造を有する。この部分は、上述した任意の部分であり得る。
幾つかの実施形態では、結合基CGは、反応部分Rxとペアとなる反応部分Rpx(すなわち、反応部分Rxと反応するように構成される部分)との反応の結果生成される基を表す。例えば、典型的な1つの結合基CGはカルボキサミジル(carboxamidyl)基を含み得、これは、アミノ基と、活性化エステル、酸クロリド等のカルボン酸の誘導体との反応の結果である。他のCGは、トリアゾリレン(triazolylene)基、カルボキサミジル(carboxamidyl)、チオアミジル、オキシム、メルカプチル(mercaptyl)、二硫化物、エー
テル、又はアルケニル基、又は反応部分とペアとなる各反応部分との反応時に形成し得る任意の他の適する基を含み得、結合基CGは、リンカーLの第2の端部(すなわち、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に近い端部)に配置し得、これは上述した要素の任意の組合せを含み得る。幾つかの他の実施形態では、結合基CGは、リンカーLの骨格を中断し得る。結合基CGは、トリアゾリレン(triazolylene)である場合、クリック結合反応からの結果である産物であり得、さらに置換し得る(例えば、ジベンゾシクロオクチル溶融トリアゾリレン(triazolylene)基)。
テル、又はアルケニル基、又は反応部分とペアとなる各反応部分との反応時に形成し得る任意の他の適する基を含み得、結合基CGは、リンカーLの第2の端部(すなわち、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に近い端部)に配置し得、これは上述した要素の任意の組合せを含み得る。幾つかの他の実施形態では、結合基CGは、リンカーLの骨格を中断し得る。結合基CGは、トリアゾリレン(triazolylene)である場合、クリック結合反応からの結果である産物であり得、さらに置換し得る(例えば、ジベンゾシクロオクチル溶融トリアゾリレン(triazolylene)基)。
幾つかの実施形態では、被覆材料(又は表面修飾リガンド)は、化学蒸着を使用してマイクロ流体デバイスの内面に堆積する。蒸着プロセスは任意選択的に、例えば、溶媒浴への露出、超音波処理、又はそれらの組合せにより、カバー110、マイクロ流体回路材料116、及び/又は基板(例えば、DEP構成基板の電極活性化基板206の内面208又はEW構成基板の支持構造体104の誘電層)を予めクリーニングすることにより改善することができる。代替又は追加として、そのような事前クリーニングは、カバー110、マイクロ流体回路材料116、及び/又は基板を酸素プラズマクリーナにおいて処理することを含むことができ、酸素プラズマクリーナは、様々な不純物を除去することができ、それと同時に酸化表面(例えば、表面における酸化物、本明細書に記載されるように共有結合的に修飾し得る)を導入することができる。代替的には、塩酸と過酸化水素との混合物又は硫酸と過酸化水素との混合物(例えば、硫酸と過酸化水素との比率が約3:1~約7:1であり得るピラニア溶液)等の液相処理を酸素プラズマクリーナの代わりに使用することもできる。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス200が組み立てられて、マイクロ流体回路120を画定するエンクロージャ102を形成した後、蒸着を使用して、マイクロ流体デバイス200の内面を被覆し得る。理論による限定を意図せずに、そのような被覆材料を完全に組み立てられたマイクロ流体回路120に堆積させることは、マイクロ流体回路材料116と電極活性化基板206の誘電層及び/又はカバー110との結合の弱化により生じる剥離を回避するに当たり有利であり得る。2ステッププロセスが利用される実施形態では、表面修飾リガンドは、上述したように蒸着を介して導入し得、続けて、生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分が導入される。続く反応は、表面修飾マイクロ流体デバイスを溶液中の適する結合試薬に露出させることにより実行し得る。
図2Hは、調整面を提供する例示的な共有結合被覆材料を有するマイクロ流体デバイス290の断面図を示す。示されるように、被覆材料298(概略的に示される)は、DEP基板であり得る基板286の内面294と、マイクロ流体デバイス290のカバー288の内面292と、の両方に共有結合した高密度分子の単層を含むことができる。被覆材料298は、幾つかの実施形態では、上述したように、マイクロ流体デバイス290内の回路要素及び/又は構造の画定に使用されるマイクロ流体回路材料(図示せず)の表面を含む、マイクロ流体デバイス290のエンクロージャ284に近くエンクロージャ284に向かって内側に面する略全ての内面294、292に配置することができる。代替の実施形態では、被覆材料298は、マイクロ流体デバイス290の内面の1つのみ又は幾つかに配置することができる。
図2Hに示される実施形態では、被覆材料298は、オルガノシロキサン分子の単層を含むことができ、各分子は、シロキシリンカー296を介してマイクロ流体デバイス290の内面292、294に共有結合する。上記の被覆材料298のいずれかを使用することができ(例えば、アルキル末端、フルオロアルキル末端部分、PEG末端部分、デキストラン末端部分、又はオルガノシロキサン部分に正電荷又は負電荷を含む末端部分)、末端部分は、エンクロージャに面する末端に配置される(すなわち、内面292、294に結合されず、エンクロージャ284に近い被覆材料298の単層の部分)。
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス290の内面292、294の被覆に使用される被覆材料298はアニオン部分、カチオン部分、両性イオン部分、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。理論による限定を意図せずに、カチオン部分、アニオン部分、及び/又は両性イオン部分をマイクロ流体回路120のエンクロージャ284の内面に提示することにより、被覆材料298は、その結果生成される水和の水が、生物学的微小物体を非生物学的分子(例えば、基板のケイ素及び/又は酸化ケイ素)との相互作用から分離する層(又は「シールド」)として機能するような、強力な水との水素結合を形成することができる。加えて、被覆材料298が被覆剤と併用される実施形態では、被覆材料298のアニオン、カチオン、又は両性イオンは、エンクロージャ284内の媒体180(例えば、被覆溶液)中に存在する非共有結合被覆剤(例えば、溶液中のタンパク質)の荷電部分とイオン結合を形成することができる。
さらに他の実施形態では、被覆材料は、エンクロージャに面した末端において親水性被覆剤を含み得るか、又は提示するように化学的に修飾し得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、PEG等のアルキレンエーテル含有ポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、デキストラン等のポリサッカリドを含み得る。上述した荷電部分(例えば、アニオン部分、カチオン部分、及び両性イオン部分)のように、親水性被覆剤は、その結果生成される水和の水が、生物学的微小物体を非生物学的分子(例えば、基板のケイ素及び/又は酸化ケイ素)との相互作用から分離する層(又は「シールド」)として機能するような、強力な水との水素結合を形成することができる。
適切な被覆処理及び修飾の更なる詳細については、米国特許出願公開第2016/0312165号において見出し得、この特許出願は全体的に参照により本明細書に援用される。
マイクロ流体デバイスの隔離ペン内の細胞の生存性を維持する追加のシステム構成要素
細胞集団の成長及び/又は増殖を促進するために、システムの追加の構成要素により、機能的な細胞の維持を促す環境状況を提供し得る。例えば、そのような追加の構成要素は、栄養素、細胞成長シグナリング種、pH調整、ガス交換、温度制御、及び細胞からの老廃物の除去を提供することができる。これらのタイプの追加の構成要素は、例えば、米国
特許出願公開第2016/0312165号に記載されている。
細胞集団の成長及び/又は増殖を促進するために、システムの追加の構成要素により、機能的な細胞の維持を促す環境状況を提供し得る。例えば、そのような追加の構成要素は、栄養素、細胞成長シグナリング種、pH調整、ガス交換、温度制御、及び細胞からの老廃物の除去を提供することができる。これらのタイプの追加の構成要素は、例えば、米国
特許出願公開第2016/0312165号に記載されている。
実施例
実施例1:OptoSelect(商標)チップによるヒトT細胞の増殖
T細胞増殖は、Berkeley Lights, Inc.によって製造され、且つ同様にBerkeley Lights, Inc.によって製造された光学機器によって制御されたナノ流体デバイスOptoSelectチップ内で達成された。この装置は、温度コントローラに結合されたチップ用の取付けステージと、ポンプ及び流体培地調整コンポーネントと、カメラとチップ内のフォトトランジスターをアクティブにするのに好適な構造化光源とを含む光学縦列とを含んだ。OptoSelect(商標)チップは、フォトトランジスター誘起OET力を提供するOptoElectroPositioning(OEP(商標))技術を用いて構成された基板を含んだ。チップはまた、複数のNanoPen(商標)チャンバ(又は隔離ペン)がそれぞれ流体接続された複数のマイクロ流体チャネルを含んだ。各隔離ペンの容積は、約1×106立方ミクロンであった。
実施例1:OptoSelect(商標)チップによるヒトT細胞の増殖
T細胞増殖は、Berkeley Lights, Inc.によって製造され、且つ同様にBerkeley Lights, Inc.によって製造された光学機器によって制御されたナノ流体デバイスOptoSelectチップ内で達成された。この装置は、温度コントローラに結合されたチップ用の取付けステージと、ポンプ及び流体培地調整コンポーネントと、カメラとチップ内のフォトトランジスターをアクティブにするのに好適な構造化光源とを含む光学縦列とを含んだ。OptoSelect(商標)チップは、フォトトランジスター誘起OET力を提供するOptoElectroPositioning(OEP(商標))技術を用いて構成された基板を含んだ。チップはまた、複数のNanoPen(商標)チャンバ(又は隔離ペン)がそれぞれ流体接続された複数のマイクロ流体チャネルを含んだ。各隔離ペンの容積は、約1×106立方ミクロンであった。
末梢血から分離されたCD3+ヒトTリンパ球と、抗CD3/抗CD28磁気ビーズ(DYNABEADS(商標)、Thermo Fisher Scientific, Inc.)とを1ビーズ/1細胞の比で混
合した。混合物を37℃の5%CO2インキュベーターで5時間インキュベートした。インキュベーション後、T細胞/ビーズ混合物を再懸濁させ、次いで流体流入口を通してチップ内のマイクロ流体チャネルに流入させた。フローを停止し、チップを傾斜させて重力でT細胞/ビーズをペンに引き入れることにより、T細胞/ビーズを隔離ペンにランダムに装填した。
合した。混合物を37℃の5%CO2インキュベーターで5時間インキュベートした。インキュベーション後、T細胞/ビーズ混合物を再懸濁させ、次いで流体流入口を通してチップ内のマイクロ流体チャネルに流入させた。フローを停止し、チップを傾斜させて重力でT細胞/ビーズをペンに引き入れることにより、T細胞/ビーズを隔離ペンにランダムに装填した。
T細胞及びビーズを隔離ペンに装填した後、チップのマイクロ流体チャネルを通してT細胞培養培地(RPMI、10%FBS、2%ヒトAB血清、50U/ml IL2、R&D Systems)を4日間にわたってかん流させた。4日間の全培養期間にわたり、30分ご
とに隔離ペン及びその中に入っている任意のT細胞及びビーズの撮像を行った。
とに隔離ペン及びその中に入っている任意のT細胞及びビーズの撮像を行った。
図4は、上記の方法に従ってオンチップでCD3+ヒトTリンパ球の増殖に成功した0、24、48、72及び96時間の培養における単一ペンの一連のタイムラプス画像である。分かるように、時間t=0における少数のT細胞は、96時間のオンチップ培養後にT細胞のオリゴクローン集団になった。
代替形態1:上記の実験は、動物成分フリーT細胞培養培地を用いて繰り返され得る。例えば、上記のT細胞培養培地中のFBSを除去することができ、RPMIを改良RPMI(又は高レベルのホスフェートを有し且つインスリン及びフェリチンのサプリメントを含む類似の基本培地)で置き換えることができる。また、こうして得られるT細胞増殖は、実質的に同一であろう。加えて、T細胞培養培地にIL7(例えば、5ng/mlのL7)を追加することができる。
代替形態2:上記の実験は、T細胞及びビーズの5時間オフチッププレインキュベーションを行うことなく繰り返され得る。代わりに、T細胞を隔離ペンに装填する前又は装填した後のいずれかで1個以上のビーズを各隔離ペンに配置することができる。また、こうして得られるT細胞増殖は、実質的に同一であろう。
実施例2:OptoSelect(商標)チップによるヒトT細胞の選択的増殖
T細胞増殖は、実施例1に記載されるように、同様にBerkeley Lights, Inc.によって
製造された光学機器によって制御されたOptoSelectチップ(Berkeley Lights, Inc.)内
で達成された。
T細胞増殖は、実施例1に記載されるように、同様にBerkeley Lights, Inc.によって
製造された光学機器によって制御されたOptoSelectチップ(Berkeley Lights, Inc.)内
で達成された。
最初に、末梢血から分離されたヒトCD14+単球をDC培養培地(RPMI、10%FBS、2%ヒトAB血清、100ng/ml GM-CSF、50ng/ml IL-4、R&D Systems)で7日間培養して樹状細胞(DC)の分化を促進した。培養の最後の
2日間に250μg/ml LPS(R&D Systems)を培養培地に添加してDC活性化を
促進した。
2日間に250μg/ml LPS(R&D Systems)を培養培地に添加してDC活性化を
促進した。
同種異系ドナーTリンパ球と上記の培養からのDCとを約10T細胞/1DCの比で混合し、37℃の5%CO2インキュベーターで5時間インキュベートした。インキュベーション後、T細胞/DC混合物を再懸濁させ、次いで流体流入口を通してチップ内のマイクロ流体チャネルに流入させた。フローを停止し、チップを傾斜させて重力でT細胞/DCをペンに引き入れることにより、T細胞/DCを隔離ペンにランダムに装填した。
T細胞/DCを隔離ペンに装填した後、チップのマイクロ流体チャネルを通してT細胞培養培地(RPMI、10%FBS、2%ヒトAB血清、50U/ml IL2、R&D Systems)を4日間にわたってかん流させた。4日間の全培養期間にわたり、30分ごとに
隔離ペン及びその中に入っている任意のT細胞及びDCの撮像を行った。
隔離ペン及びその中に入っている任意のT細胞及びDCの撮像を行った。
図5Aは、上記の方法に従ってオンチップでCD3+ヒトTリンパ球を選択的に増殖させた0、24、48、72及び96時間の培養における単一隔離ペンの一連のタイムラプス画像である。分かるように、DCは、96時間のオンチップ培養後、T細胞の有意な増殖を刺激した。しかし、少なくとも1個のT細胞及び少なくとも1個のDCが最初に播種された隔離ペンのわずか1%~2%がT細胞増殖を呈したことから、図5Aで観測された増殖が選択的であったことが実証される。
4日間の培養期間の最後の16時間中、チップをかん流させるために使用した培養培地にClick-It EdU試薬(Thermo Fisher Scientific, Inc.)を追加することにより、T細胞が試薬を取り込んでそれをそのDNAに組み込むことを可能にした。培養期間後、細胞を洗浄し、3.7%ホルムアルデヒドで固定し、0.1%Triton-Xで透過化した。EdU導入は、テキサスレッドチャネルの蛍光を監視することによって検出した。図6Aは、選択的に増殖されたT細胞の明視野画像にオーバーレイされたEdU蛍光シグナルを示す画像を提供する。最初に閉じ込められたT細胞がDCによって活性化されたという結論に合致して、細胞の成長及び分裂によってペン内のT細胞数の増加を生じたことがEdUデータから示される。
代替形態:上記の実験は、動物成分フリーT細胞培養培地を用いて繰り返され得る。例えば、上記のT細胞培養培地中のFBSを除去することができ、RPMIを改良RPMI(又は高レベルのホスフェートを有し且つインスリン及びフェリチンのサプリメントを含む類似の基本培地)で置き換えることができる。また、こうして得られるT細胞増殖は、実質的に同一であろう。加えて、T細胞培養培地にIL7(例えば、5ng/mlのIL7)を追加することができる。
実施例3:OptoSelect(商標)チップによるヒトT細胞の抗原特異的増殖
T細胞増殖は、実施例1に記載されるように、同様にBerkeley Lights, Inc.によって
製造された光学機器によって制御されたOptoSelectチップ(Berkeley Lights, Inc.)内
で達成された。
T細胞増殖は、実施例1に記載されるように、同様にBerkeley Lights, Inc.によって
製造された光学機器によって制御されたOptoSelectチップ(Berkeley Lights, Inc.)内
で達成された。
最初に、末梢血から分離されたヒトCD14+単球をDC培養培地(RPMI、10%FBS、2%ヒトAB血清、100ng/ml GM-CSF、50ng/ml IL-4、R&D Systems)で7日間培養して樹状細胞(DC)の分化を促進した。培養の最後の
2日間に250μg/ml LPS(R&D Systems)を培養培地に添加してDC活性化を
促進した。LPSの添加と同時に、DCはまた、10μM破傷風毒素(TT)抗原(Sigma-Aldrich Co.)及び10μMエプスタインバーウイルス(EBV)抗原(EastCoast Bio, Inc.)でパルスされた。
2日間に250μg/ml LPS(R&D Systems)を培養培地に添加してDC活性化を
促進した。LPSの添加と同時に、DCはまた、10μM破傷風毒素(TT)抗原(Sigma-Aldrich Co.)及び10μMエプスタインバーウイルス(EBV)抗原(EastCoast Bio, Inc.)でパルスされた。
自己ドナーTリンパ球と上記の培養からのEBVパルスDCとを約10T細胞/1DCの比で混合し、37℃の5%CO2インキュベーターで5時間インキュベートした。インキュベーション後、T細胞/DC混合物を再懸濁させ、次いで流体流入口を通してチップ内のマイクロ流体チャネルに流入させた。フローを停止し、チップを傾斜させて重力でT細胞/DCをペンに引き入れることにより、T細胞/DCを隔離ペンにランダムに装填した。
T細胞/DCを隔離ペンに装填した後、チップのマイクロ流体チャネルを通してT細胞培養培地(RPMI、10%FBS、2%ヒトAB血清、50U/ml IL2、R&D Systems)を5日間にわたってかん流させた。5日間の全培養期間にわたり、30分ごとに
隔離ペン及びその中に入っている任意のT細胞及びビーズの撮像を行った。
隔離ペン及びその中に入っている任意のT細胞及びビーズの撮像を行った。
図5Bは、上記の方法に従ってオンチップでCD3+ヒトTリンパ球を選択的に増殖させた0、24、48、72、96及び110時間の培養における単一隔離ペンの一連のタイムラプス画像である。分かるように、DCは、110時間のオンチップ培養後、T細胞の有意な増殖を刺激した。しかし、少なくとも1個のT細胞及び少なくとも1個のDCが最初に播種されたペンのわずか1%~2%がT細胞増殖を呈したことから、図5Bで観測された増殖が抗原特異的であったことが実証される。
5日間の培養期間の最後の16時間中、チップをかん流させるために使用した培養培地にClick-It EdU試薬(Thermo Fisher Scientific, Inc.)を追加することにより、T細胞が試薬を取り込んでそれをそのDNAに組み込むことを可能にした。培養期間後、細胞を洗浄し、3.7%ホルムアルデヒドで固定し、0.1%Triton-Xで透過化した。EdU導入は、テキサスレッドチャネルの蛍光を監視することによって検出した。図6Bは、選択的に増殖されたT細胞の明視野画像にオーバーレイされたEdU蛍光シグナルを示す画像を提供する。最初に閉じ込められたT細胞がDCによって活性化されたという結論に合致して、細胞の成長及び分裂によってペン内のT細胞数の増加を生じたことがEdUデータから示される。
代替形態:上記の実験は、動物成分フリーT細胞培養培地を用いて繰り返され得る。例えば、上記のT細胞培養培地中のFBSを除去することができ、RPMIを改良RPMI(又は高レベルのホスフェートを有し且つインスリン及びフェリチンのサプリメントを含む類似の基本培地)で置き換えることができる。また、こうして得られるT細胞増殖は、実質的に同一であろう。加えて、T細胞培養培地にIL7(例えば、5ng/mlのIL7)を追加することができる。
実施例4:調整された表面を有するOptoSelect(商標)チップによるTリンパ球の培養及び搬出
材料。CD3+細胞は、AllCells Inc.製であった。抗CD3/抗CD28抗体は、磁
気ビーズ(Dynabeads(登録商標)、Thermofisher Scientific、カタログ番号11453D)に結合させた。培養培地は、10%FBS、2%ヒトAB血清及び50U/ml IL2(R&D Systems)が追加されたRPMI-1640(GIBCO(登録商標)、ThermoFisher Scientific、カタログ番号11875-127)であった。
材料。CD3+細胞は、AllCells Inc.製であった。抗CD3/抗CD28抗体は、磁
気ビーズ(Dynabeads(登録商標)、Thermofisher Scientific、カタログ番号11453D)に結合させた。培養培地は、10%FBS、2%ヒトAB血清及び50U/ml IL2(R&D Systems)が追加されたRPMI-1640(GIBCO(登録商標)、ThermoFisher Scientific、カタログ番号11875-127)であった。
システム及びマイクロ流体デバイス。T細胞増殖は、実質的に実施例1に記載されるように、同様にBerkeley Lights, Inc.によって製造された光学機器によって制御されたOpt
oSelectチップ(Berkeley Lights, Inc.)内で達成された。しかし、この実施例では、OptoSelectチップの内面を共有結合デキストランで調整した。
oSelectチップ(Berkeley Lights, Inc.)内で達成された。しかし、この実施例では、OptoSelectチップの内面を共有結合デキストランで調整した。
マイクロ流体デバイスのプライミング。250マイクロリットルの100%二酸化炭素を12マイクロリットル/秒の速度で流動させ、続いて0.1%Pluronic(登録商標)F27(Life Technologies(登録商標)カタログ番号P6866)を含有する250マイ
クロリットルのPBSを12マイクロリットル/秒で流動させ、最後に250マイクロリットルのPBSを12マイクロリットル/秒で流動させた。続いて培養培地の導入を行う。
クロリットルのPBSを12マイクロリットル/秒で流動させ、最後に250マイクロリットルのPBSを12マイクロリットル/秒で流動させた。続いて培養培地の導入を行う。
培地かん流。培地は、以下の2つの方法のいずれかによってマイクロ流体デバイスを通してかん流させた。
1.0.01マイクロリットル/秒で2時間かん流させ、2マイクロリットル/秒で64秒間かん流させ、繰り返す。
2.0.02マイクロリットル/秒で100秒間かん流させ、フローを500秒間停止し、2マイクロリットル/秒で64秒間かん流させ、繰り返す。
1.0.01マイクロリットル/秒で2時間かん流させ、2マイクロリットル/秒で64秒間かん流させ、繰り返す。
2.0.02マイクロリットル/秒で100秒間かん流させ、フローを500秒間停止し、2マイクロリットル/秒で64秒間かん流させ、繰り返す。
実験:CD3+細胞と抗CD3/抗CD28磁気ビーズとを1ビーズ/細胞の比で混合した。37℃の5%CO2インキュベーターによって培養培地で混合物を5時間インキュベートし、その後、使用のためにT細胞/ビーズ混合物を再懸濁させた。
流体流入口を通して再懸濁液をマイクロ流体チャネルに流入させることにより、T細胞懸濁液(抗CD3/抗CD28ビーズを含む)をマイクロ流体デバイスに導入した。フローを停止し、チップを傾斜させて重力でT細胞/ビーズをチャンバに引き入れることにより、T細胞/ビーズを隔離チャンバにランダムに装填した。
T細胞/ビーズを隔離チャンバに装填した後、ナノ流体チップのマイクロ流体チャネルを通して培養培地を4日間かん流させた。図7Aは、マイクロ流体デバイスの隔離チャンバのデキストランで調整された表面上におけるT細胞の成長を示した。デキストランで調整された表面上におけるT細胞の成長は、類似のマイクロ流体デバイスの調整されていない表面と比べて改善された(データは示されていない)。
次いで、マイクロ流体デバイスを傾斜させて重力でチャンバからT細胞を引き出すことにより、T細胞を隔離チャンバから取り出した。図7Bは、20分間の重力アンローディング後で隔離チャンバから取り出されたT細胞の代表的な画像を示す。増殖されたT細胞が、デキストランで調整された隔離ペンから容易に搬出されたことは、デキストランで調整された表面が欠如したOptoSelectチップを用いて達成されたT細胞搬出の度合いよりも優れた改善であった(データは示されていない)。
実施例5:調整された表面を有するOptoSelect(商標)チップによるTリンパ球の活性化及び増殖
T細胞増殖は、実質的に実施例1に記載されるように、同様にBerkeley Lights, Inc.
によって製造された光学機器によって制御されたOptoSelectチップ(Berkeley Lights, Inc.)内で達成された。実施例4と同様に、OptoSelectチップは、調整された表面を特徴
とした。この実施例では、調整された表面は、ビオチン化抗CD3アゴニスト抗体に結合されたストレプトアビジン結合ポリエチレングリコール(PEG、約1kD)含有ポリマーを含んだ。
T細胞増殖は、実質的に実施例1に記載されるように、同様にBerkeley Lights, Inc.
によって製造された光学機器によって制御されたOptoSelectチップ(Berkeley Lights, Inc.)内で達成された。実施例4と同様に、OptoSelectチップは、調整された表面を特徴
とした。この実施例では、調整された表面は、ビオチン化抗CD3アゴニスト抗体に結合されたストレプトアビジン結合ポリエチレングリコール(PEG、約1kD)含有ポリマーを含んだ。
OptoSelectチップを遊離ストレプトアビジン(1mg/mL、流出口ポートへの注入によって装填した)でフラッシュし、RTで1時間インキュベートし、次いでPBS(注入により)×1で濯いだ。次いで、ビオチン化抗CD3抗体(5マイクログラム/mL、Miltenyi 130-093-377)をチップに流入させ、フローを停止し、加湿しながらチップを37℃で1時間インキュベートした。次いで、培養培地をデバイスに流入させることによってチップを濯いだ。
流入口を通してT細胞の培養物をチップ内のマイクロ流体チャネルに流入させることによってT細胞をチップ(以上に記載されるように準備した)に装填し、次いでフローを停止した。チップを傾斜させて重力でT細胞をチップ内の隔離ペンに装填した。重力ローディング後、チップの隔離ペン内でT細胞を3から4日間培養した。T細胞培養に使用した培地は、2μg/mLの可溶性機能グレード抗CD28抗体(クローン15E8、Miltenyi 130-093-375)を含有していた。
以上に記載のマイクロ流体デバイスで培養されたT細胞をタイムラプス撮像によって監視した。得られた画像から、T細胞が動き回り分裂したことが明らかにされたため、T細胞活性化の特徴が実証された。
上記の実験の変形形態は、結合される抗CD3アゴニスト抗体の表面密度を変化させること、PEGポリマーの長さを変化させること、抗CD28抗体を調整された表面に結合させること、抗CD3アゴニスト抗体と抗CD28抗体との比を変化させること、及び/又は抗CD3抗体をペプチド-MHC複合体で置き換えることを含み得る。この最後の変更は、T細胞の抗原特異的な活性化及び増殖を達成するために使用され得る。
実施例6:マイクロ流体デバイス内へのT細胞活性化表面の導入
ベースを形成する第1のシリコン電極活性化基板と、カバーを形成する第2のITO基板と、2つの基板を分離する壁を形成する光パターン化シリコーンマイクロ流体回路材料とを含むOptoSelect(商標)チップ(Berkeley Lights, Inc.)の内面は、米国特許出願
公開第20160312165号に記載されるように、アジド部分を含むように共有結合で改質した。基本的に、100Wの電力と、240mTorrの圧力と、440sccmの酸素流量とを用いて、OptoSelectチップを酸素プラズマクリーナ(Nordson Asymtek)
で1分間処理した。真空反応器の底部の箔ボート中において、真空反応器の底部の個別箔ボート中の水反応剤源としての硫酸マグネシウム七水和物(0.5g、Acrosカタログ番
号10034-99-8)の存在下において、プラズマ処理チップを3-アジドウンデシル)トリメトキシシラン(アジ化ナトリウムとの反応によって11-ブロモウンデシルトリメトキシシラン(Gelestカタログ番号SIB1908.0)から合成、300マイクロリットル)で真空反応器内において処理した。次いで、真空ポンプを用いてチャンバを750mTorrまでポンプ吸引し、シールした。110℃に加熱されたオーブン内に真空反応器を24~48時間配置した。これにより、改質表面が、構造:
を有するようにチップの内面の改質が行われた。室温に冷却し、減圧チャンバにアルゴンを導入した後、マイクロ流体デバイスを反応器から取り出したところ、更なる反応に好適なものであった。
ベースを形成する第1のシリコン電極活性化基板と、カバーを形成する第2のITO基板と、2つの基板を分離する壁を形成する光パターン化シリコーンマイクロ流体回路材料とを含むOptoSelect(商標)チップ(Berkeley Lights, Inc.)の内面は、米国特許出願
公開第20160312165号に記載されるように、アジド部分を含むように共有結合で改質した。基本的に、100Wの電力と、240mTorrの圧力と、440sccmの酸素流量とを用いて、OptoSelectチップを酸素プラズマクリーナ(Nordson Asymtek)
で1分間処理した。真空反応器の底部の箔ボート中において、真空反応器の底部の個別箔ボート中の水反応剤源としての硫酸マグネシウム七水和物(0.5g、Acrosカタログ番
号10034-99-8)の存在下において、プラズマ処理チップを3-アジドウンデシル)トリメトキシシラン(アジ化ナトリウムとの反応によって11-ブロモウンデシルトリメトキシシラン(Gelestカタログ番号SIB1908.0)から合成、300マイクロリットル)で真空反応器内において処理した。次いで、真空ポンプを用いてチャンバを750mTorrまでポンプ吸引し、シールした。110℃に加熱されたオーブン内に真空反応器を24~48時間配置した。これにより、改質表面が、構造:
を有するようにチップの内面の改質が行われた。室温に冷却し、減圧チャンバにアルゴンを導入した後、マイクロ流体デバイスを反応器から取り出したところ、更なる反応に好適なものであった。
次いで、ストレプトアビジンで表面を官能基化するために、最初にOptoSelectチップを100%二酸化炭素で繰り返しフラッシュし、次いでDBCO-ストレプトアビジン溶液を装填した。DBCO-ストレプトアビジン溶液は、DBCO部分に共有結合で結合され
たストレプトアビジンの凍結乾燥粉末(NANOCSカタログ番号SV1-DB-1)を1.0マイクロモルの濃度になるように1×PBS(pH7.4、Gibco)中に再懸濁させることによって作製した。DBCOとアジドとをカップリングさせた15~30分間のインキュベーション後、OptoSelectチップを1×PBSで繰り返し洗浄して非結合DBCO-ストレプトアビジンを洗い流した。DBCO修飾ストレプトアビジン溶液を1マイクロモルの濃度で調製したが、約0.5から約2マイクロモルの範囲内の濃度は、アジド部分を有するOptoSelectチップの内面の改質に有効である。
たストレプトアビジンの凍結乾燥粉末(NANOCSカタログ番号SV1-DB-1)を1.0マイクロモルの濃度になるように1×PBS(pH7.4、Gibco)中に再懸濁させることによって作製した。DBCOとアジドとをカップリングさせた15~30分間のインキュベーション後、OptoSelectチップを1×PBSで繰り返し洗浄して非結合DBCO-ストレプトアビジンを洗い流した。DBCO修飾ストレプトアビジン溶液を1マイクロモルの濃度で調製したが、約0.5から約2マイクロモルの範囲内の濃度は、アジド部分を有するOptoSelectチップの内面の改質に有効である。
このストレプトアビジン官能基化表面をビオチン化抗CD3抗体(OKT3クローン、機能グレード、Miltenyiカタログ番号130-093-377)及びビオチン化抗CD28抗体(15E8クローン、機能グレード、Miltenyiカタログ番号130-093-386)でさらに改質した。これらの抗体を1:1の比で約1~10マイクログラム/mLの濃度においてPBS+2%ウシ血清アルブミン中に懸濁させた。この抗体溶液を、ストレプトアビジン官能基化表面を備えたOptoSelectチップに通してかん流させ、ビオチン-ストレプトアビジン結合相互作用によってチップの内面への抗体のコンジュゲーションを促進した。1時間のインキュベーション後、OptoSelectチップをPBSで、次いで細胞培養培地でフラッシュした。この時点で、チップは、細胞ローディングが可能な状態であった。
上記の例は、抗体によるOptoSelectチップの内面の官能基化に重点を置いているが、対象の他のバイオ分子も同様にコンジュゲートされ得る(すなわち、バイオ分子のビオチン修飾及びストレプトアビジン官能基化表面へのビオチン-ストレプトアビジン媒介結合を介して)。さらに、OptoSelectチップのアジド改質表面との反応前にビオチン化抗体(又は他のバイオ分子)とストレプトアビジンとを反応させることができる。DBCO-ストレプトアビジン及びビオチン化バイオ分子は、以下に記載されるように、0.5~2マイクロモルの範囲内の濃度でPBS溶液中に個別に調製してから任意の所望の比で混合され得る。ビオチン化バイオ分子をストレプトアビジンに少なくとも15分間コンジュゲートした後、以上に記載したように、得られた複合体を用いてアジド改質OptoSelectチップの表面を改質することができる。
2タイプ以上の抗体/バイオ分子を用いてOptoSelectチップの表面を改質する場合、DBCO-ストレプトアビジンとのコンジュゲーションステップ前に2タイプ(若しくはそれを超える)の抗体/バイオ分子の混合を行い得るか、又は幾つかの個別タイプのバイオ分子のDBCO-ストレプトアビジンコンジュゲートを調製して表面官能基化前に混合し得る。そのため、以上の実施例のバイオ分子改質表面は、抗CD3抗体と抗CD28抗体との比が1:1であったが、比は、約1:5~約5:1(例えば、約2:1~約1:2)であり得る。より一般的には、T細胞の活性化に有用なバイオ分子改質表面は、2種のT細胞活性化バイオ分子を含み得る。そのいずれかは、CD3アゴニスト、CD28アゴニスト又はMHCタンパク質(例えば、MBL Internationalカタログ番号MR01008)
であり得、2種のバイオ分子は、互いに約1:10~約10:1の範囲内で存在し得る。さらに、バイオ分子改質表面は、3、4、5種又はそれを超えるT細胞活性化バイオ分子の混合物を含み得る。
であり得、2種のバイオ分子は、互いに約1:10~約10:1の範囲内で存在し得る。さらに、バイオ分子改質表面は、3、4、5種又はそれを超えるT細胞活性化バイオ分子の混合物を含み得る。
上記の実験の更なる変形形態は、結合される抗CD3アゴニスト抗体及び/又は結合される抗CD28アゴニスト抗体の表面密度を変化させること、最初に内部チップ表面を官能基化するために使用されるアジド部分含有分子の炭化水素鎖の長さを変化させること、可溶形の抗CD28抗体を提供すること、及び/又は抗CD3抗体をペプチド-MHC複合体で置き換えることを含み得る。この最後の変更は、T細胞の抗原特異的な活性化及び増殖を達成するために使用され得る。
実施例7:実施形態
以下の番号付き項目は、本明細書に記載の実施形態の詳細をさらに提供するが、これらに限定されるものではない。
以下の番号付き項目は、本明細書に記載の実施形態の詳細をさらに提供するが、これらに限定されるものではない。
項目1.流路と、流路に流体接続された隔離ペンとを有するマイクロ流体デバイスにおいてTリンパ球を増殖させる方法であって、
1個以上のTリンパ球をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することと、
1個以上のTリンパ球と活性化剤とを接触させることと、
隔離ペンに導入された1個以上のTリンパ球が増殖を行うことを可能にするのに十分な時間の期間にわたり、マイクロ流体デバイスの流路を通して培養培地をかん流させることと
を含む方法。
1個以上のTリンパ球をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することと、
1個以上のTリンパ球と活性化剤とを接触させることと、
隔離ペンに導入された1個以上のTリンパ球が増殖を行うことを可能にするのに十分な時間の期間にわたり、マイクロ流体デバイスの流路を通して培養培地をかん流させることと
を含む方法。
項目2.隔離ペンは、約5×105から約5×106立方ミクロンの体積を有する、項目1に記載の方法。
項目3.隔離ペンの少なくとも1つの内面は、コーティング材料を含む、項目1又は2に記載の方法。
項目4.コーティング材料は、隔離ペンの少なくとも1つの内面に共有結合で結合され、コーティング材料は、アルキレンエーテル部分、糖部分、アミノ酸部分又はそれらの組合せを含むポリマーを含む、項目3に記載の方法。
項目5.コーティング材料は、デキストランを含む、項目4に記載の方法。
項目6.コーティング材料は、ポリエチレングリコール部分を含む、項目4に記載の方法。
項目7.コーティング材料は、1種以上のタンパク質を含む、項目4~6のいずれか1つに記載の方法。
項目8.コーティング材料は、それぞれ結合基とアルキル部分とを含む分子を含み、結合基は、隔離ペンの少なくとも1つの内面に共有結合で結合される、項目3に記載の方法。
項目9.結合基は、シロキシ結合基である、項目8に記載の方法。
項目10.アルキル部分は、少なくとも10個の炭素原子を含む炭素の直鎖を含む、項目8又は9に記載の方法。
項目11.アルキル部分は、フルオロアルキル部分である、項目8~10のいずれか1つに記載の方法。
項目12.アルキル部分は、ペルフロウロアルキル部分である、項目8~10のいずれか1つに記載の方法。
項目13.コーティング材料の分子は、内側基板表面に共有結合で結合された密充填単層構造を形成する、項目8~12のいずれか1つに記載の方法。
項目14.コーティング材料は、結合基とカチオン部分及び/又はアニオン部分とを有
する分子を含み、結合基は、内側基板表面に共有結合で結合される、項目3に記載の方法。
する分子を含み、結合基は、内側基板表面に共有結合で結合される、項目3に記載の方法。
項目15.カチオン部分は、第4級アンモニウム基を含む、項目14に記載の方法。
項目16.アニオン部分は、ホスホン酸、カルボン酸又はスルホン酸を含む、項目14又は15に記載の方法。
項目17.コーティング材料は、結合基と双性イオン部分とを有する分子を含む、項目14~16のいずれか1つに記載の方法。
項目18.双性イオン部分は、カルボキシベタイン、スルホベタイン、スルファミン酸及びアミノ酸から選択される、項目17に記載の方法。
項目19.活性化剤は、コーティング材料に共有結合で結合される、項目3~18のいずれか1つに記載の方法。
項目20.活性化剤は、コーティング材料に安定に結合される、項目3~18のいずれか1つに記載の方法。
項目21.活性化剤は、ビオチン-ストレプトアビジン結合を介してコーティング材料に安定に結合される、項目20に記載の方法。
項目22.1個以上のTリンパ球は、対象から採取された末梢血サンプルから分離される、項目1~21のいずれか1つに記載の方法。
項目23.1個以上のTリンパ球は、対象の固形腫瘍サンプルから分離される、項目1~21のいずれか1つに記載の方法。
項目24.固形腫瘍サンプルは、細針吸引物(FNA)である、項目23に記載の方法。
項目25.固形腫瘍サンプルは、生検物である、項目23に記載の方法。
項目26.固形腫瘍は、乳癌、尿路、尿管、膀胱若しくは尿道に発生する癌、腎細胞癌、精巣癌、前立腺癌、又は精嚢、精管若しくは陰茎の癌、卵巣癌、子宮癌、頸癌、腟癌、又は卵管癌、神経系癌、神経芽腫、網膜芽腫、腸癌、結腸直腸癌、肺癌、或いは黒色腫である、項目23~25のいずれか1つに記載の方法。
項目27.固形腫瘍は、髄様乳癌、中皮腫又は黒色腫である、項目23~25のいずれか1つに記載の方法。
項目28.1個以上のTリンパ球は、末梢血サンプル又は固形腫瘍サンプルから分離されたTリンパ球の集団に由来する、項目22~27のいずれか1つに記載の方法。
項目29.集団は、CD3+Tリンパ球が富化される、項目28に記載の方法。
項目30.集団は、CD3+CD4+Tリンパ球が富化される、項目28に記載の方法。
項目31.集団は、CD3+CD8+Tリンパ球が富化される、項目28に記載の方法。
項目32.集団は、CD45RA+CD45RO-Tリンパ球が富化される、項目28~31のいずれか1つに記載の方法。
項目33.集団は、CD45RA-CD45RO+Tリンパ球が富化される、項目28~31のいずれか1つに記載の方法。
項目34.集団は、CCR7+Tリンパ球が富化される、項目28~33のいずれか1つに記載の方法。
項目35.集団は、CD62L+Tリンパ球が富化される、項目28~34のいずれか1つに記載の方法。
項目36.集団は、CD69+Tリンパ球が枯渇される、項目28~35のいずれか1つに記載の方法。
項目37.集団は、PD1+及び/又はPD-L1+Tリンパ球が枯渇される、項目28~36のいずれか1つに記載の方法。
項目38.Tリンパ球と、CD45RO、CD45RA、CD69、PD-1及び/又はPD-L1に対する抗体とを接触させることにより、CD45RO+Tリンパ球、CD45RA+Tリンパ球、CD69+Tリンパ球、PD-1+Tリンパ球及びPD-L1+Tリンパ球の1つ、2つ、3つ又は4つを枯渇させることと、抗体に結合されたTリンパ球を集団から除去することとを含む、項目28~37のいずれか1つに記載の方法。
項目39.抗体は、固体担体を伴う、項目38に記載の方法。
項目40.固体担体は、磁気ビーズの集団である、項目39に記載の方法。
項目41.1個以上のTリンパ球を隔離ペンに導入することは、1個以上のTリンパ球を含有する流体をマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルに流入させることを含み、マイクロ流体チャネルは、マイクロ流体デバイスの流路の一部であり、隔離ペンは、マイクロ流体チャネルから離れて開口する、項目1~40のいずれか1つに記載の方法。
項目42.1個以上のTリンパ球を隔離ペンに導入することは、誘電泳動(DEP)を用いて、マイクロ流体チャネルに位置する少なくとも1個のTリンパ球を選択し、且つそれを隔離ペン内に移動させることをさらに含む、項目41に記載の方法。
項目43.少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がマーカーCD3+、CD4+、CD8+又はそれらの任意の組合せを含むために選択される、項目42に記載の方法。
項目44.少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がマーカーCD3+及びCD4+を含むために選択される、項目42に記載の方法。
項目45.少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がマーカーCD3+及びCD8+を含むために選択される、項目42に記載の方法
。
。
項目46.少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がマーカーCD45RA+、CD45RO+、CCR7+、CD62L+又はそれらの任意の組合せを含むために選択される、項目42~45のいずれか1つに記載の方法。
項目47.少なくとも1個のTリンパ球を選択することは、少なくとも1個のTリンパ球を含むTリンパ球の集団を、CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CCR7又はCD62Lに特異的に結合する抗体で標識することと、少なくとも1個のTリンパ球を、それが抗体を伴うことに基づいて隔離ペン内に移動させることとを含む、項目42~46のいずれか1つに記載の方法。
項目48.抗体は、フルオロフォアを含む、項目47に記載の方法。
項目49.少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD45RO+でないために選択される、項目42~48のいずれか1つに記載の方法。
項目50.1個以上のTリンパ球を隔離ペンに導入することは、CD45RO+Tリンパ球を標識することと、CD45ROの指標となる標識を伴わない1個以上のTリンパ球を隔離ペンに導入することとを含む、項目42~48に記載の方法。
項目51.少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD45RA+でないために選択される、項目42~48のいずれか1つに記載の方法。
項目52.1個以上のTリンパ球を隔離ペンに導入することは、CD45RA+Tリンパ球を標識することと、CD45RAの指標となる標識を伴わない1個以上のTリンパ球を隔離ペンに導入することとを含む、項目42~48のいずれか1つに記載の方法。
項目53.CCR7+及びCD62L+Tリンパ球を標識することと、CCR7の指標となる標識を伴う及び/又はCD62Lの指標となる標識を伴う1個以上のTリンパ球を隔離ペン内に移動させることとを含む、項目42~52のいずれか1つに記載の方法。
項目54.CCR7+及びCD62L+Tリンパ球を標識することと、CCR7の指標となる標識を伴わない及び/又はCD62Lの指標となる標識を伴わない1個以上のTリンパ球を隔離ペン内に移動させることとを含む、項目42~52のいずれか1つに記載の方法。
項目55.少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD69+でないために選択される、項目42~54のいずれか1つに記載の方法。
項目56.少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がPD-1+でないために選択される、項目42~55のいずれか1つに記載の方法。
項目57.少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がPD-L1+でないために選択される、項目42~56のいずれか1つに記載の
方法。
方法。
項目58.少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、それが蛍光標識を伴う抗原で標識されるために選択される、項目42~57のいずれか1つに記載の方法。
項目59.抗原は、MHCタンパク質で複合体化されたペプチドを含む、項目58に記載の方法。
項目60.少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、それが蛍光標識を伴う1種以上の抗体で標識されるために選択される、項目42~59のいずれか1つに記載の方法。
項目61.1種以上の抗体は、CD45RA若しくはCD45ROに対する抗体、CCR7に対する抗体、CD62Lに対する抗体又はそれらの任意の組合せを含む、項目60に記載の方法。
項目62.1種以上の抗体は、CD4に対する抗体を含む、項目60又は61に記載の方法。
項目63.1種以上の抗体は、CD8に対する抗体を含む、項目60又は61の方法。
項目64.1個以上のTリンパ球を隔離ペンに導入することは、重力で1個以上のTリンパ球が隔離ペンに引き込まれるようにマイクロ流体デバイスを傾斜させることをさらに含む、項目41に記載の方法。
項目65.1個以上のTリンパ球は、隔離ペンに導入される前に活性化剤に接触される、項目1~64のいずれか1つに記載の方法。
項目66.1個以上のTリンパ球は、マイクロ流体デバイスに導入される前に少なくとも1時間の期間にわたり活性化剤と共にインキュベートされる、項目65に記載の方法。
項目67.1個以上のTリンパ球は、マイクロ流体デバイスに導入される前に少なくとも5時間の期間にわたり活性化剤と共にインキュベートされる、項目65に記載の方法。
項目68.1個以上のTリンパ球を隔離ペンに導入することは、活性化剤を隔離ペンに導入することをさらに含む、項目65~67のいずれか1つに記載の方法。
項目69.1個以上のTリンパ球は、隔離ペンに導入された後に活性化剤に接触される、項目1~64のいずれか1つに記載の方法。
項目70.活性化剤は、抗CD3及び/又は抗CD28アゴニスト抗体を含む、項目1~69のいずれか1つに記載の方法。
項目71.活性化剤は、固体担体にコンジュゲートされる抗CD3アゴニスト抗体を含む、項目70に記載の方法。
項目72.活性化剤は、固体担体にコンジュゲートされる抗CD28アゴニスト抗体を含む、項目70又は71に記載の方法。
項目73.活性化剤は、可溶性抗CD28アゴニスト抗体を含む、項目70又は71に記載の方法。
項目74.活性化剤は、樹状細胞(DC)を含む、項目1~69のいずれか1つに記載の方法。
項目75.DCは、1個以上のTリンパ球を接触させる前に腫瘍抗原でパルスされる、項目74に記載の方法。
項目76.腫瘍抗原は、1個以上のTリンパ球と同系の腫瘍細胞から分離される、項目75に記載の方法。
項目77.腫瘍抗原は、腫瘍細胞のゲノム解析を通して同定される、項目75に記載の方法。
項目78.分析される腫瘍細胞は、1個以上のTリンパ球と同系である、項目77に記載の方法。
項目79.DC及び1個以上のTリンパ球は、自己細胞である、項目74~78のいずれか1つに記載の方法。
項目80.培養培地は、マイクロ流体デバイスの流路を通して少なくとも24時間の期間にわたってかん流される、項目1~79のいずれか1つに記載の方法。
項目81.培養培地は、マイクロ流体デバイスの流路を通して少なくとも48時間の期間にわたってかん流される、項目1~79のいずれか1つに記載の方法。
項目82.培養培地は、マイクロ流体デバイスの流路を通して少なくとも96時間の期間にわたってかん流される、項目1~79のいずれか1つに記載の方法。
項目83.培養培地は、ヒト血清とIL2とを含む、項目1~66のいずれか1つに記載の方法。
項目84.培養培地は、IL7、IL15、IL21又はそれらの任意の組合せを含む、項目1~67のいずれか1つに記載の方法。
項目85.20個以下、10個以下、6~10個、5個以下、約5個、約4個、約3個、約2個又は1個のTリンパ球は、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入される、項目1~84のいずれか1つに記載の方法。
項目86.増殖は、少なくとも3ラウンドの有糸細胞分裂を含む、項目1~85のいずれか1つに記載の方法。
項目87.増殖されたTリンパ球をマイクロ流体デバイスから搬出することを含む、項目1~86のいずれか1つに記載の方法。
項目88.マイクロ流体デバイスは、複数の隔離ペンを含み、1個以上のTリンパ球は、複数のそれぞれの隔離ペンに導入され且つ活性化剤に接触される、項目1~87のいずれか1つに記載の方法。
項目89.20個以下、10個以下、6~10個、5個以下、約5個、約4個、約3個、約2個又は1個のTリンパ球は、マイクロ流体デバイスの複数の隔離ペンのそれぞれに導入される、項目88に記載の方法。
項目90.項目1~89のいずれか1つに記載の方法に従って産生されたTリンパ球。
項目91.項目1~89のいずれか1つに記載の方法に従って産生されたTリンパ球を含むマイクロ流体デバイス。
項目92.マイクロ流体デバイスは、隔離ペンを含み、Tリンパ球は、隔離ペン内に位置する、項目91に記載のマイクロ流体デバイス。
項目93.項目1~89のいずれか1つに記載の方法に従って産生されたTリンパ球と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
項目94.対象における癌を治療する方法であって、Tリンパ球を対象に導入することを含み、Tリンパ球は、項目1~89のいずれか1つに記載の方法によって調製される、方法。
項目95.対象における癌を治療する方法であって、
対象から得られた組織サンプルからTリンパ球を分離することと、
分離されたTリンパ球を、項目1~89のいずれか1つに記載の方法に従ってマイクロ流体デバイスにおいて増殖させることと、
増殖されたTリンパ球をマイクロ流体デバイスから搬出することと、
増殖されたTリンパ球を対象に再導入することと
を含む方法。
対象から得られた組織サンプルからTリンパ球を分離することと、
分離されたTリンパ球を、項目1~89のいずれか1つに記載の方法に従ってマイクロ流体デバイスにおいて増殖させることと、
増殖されたTリンパ球をマイクロ流体デバイスから搬出することと、
増殖されたTリンパ球を対象に再導入することと
を含む方法。
項目96.対象は、哺乳動物である、項目94又は95に記載の方法。
項目97.対象は、ヒトである、項目96に記載の方法。
項目98.組織サンプルは、末梢血のサンプルである、項目95~97のいずれか1つに記載の方法。
項目99.組織サンプルは、固形腫瘍に由来する、項目95~97のいずれか1つに記載の方法。
項目100.組織サンプルは、固形腫瘍に由来するFNA又は生検物である、項目99に記載の方法。
項目101.固形腫瘍は、乳癌、尿路、尿管、膀胱若しくは尿道に発生する癌、腎細胞癌、精巣癌、前立腺癌、又は精嚢、精管若しくは陰茎の癌、卵巣癌、子宮癌、頸癌、腟癌、又は卵管癌、神経系癌、神経芽腫、網膜芽腫、腸癌、結腸直腸癌、肺癌、或いは黒色腫である、項目99又は100に記載の方法。
項目102.固形腫瘍は、髄様乳癌、中皮腫又は黒色腫である、項目99又は100に記載の方法。
項目103.組織サンプルからTリンパ球を分離することは、組織サンプル中のCD3+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞又はそれらの任意の組合せの選択を行うことを含む
、項目95~102のいずれか1つに記載の方法。
、項目95~102のいずれか1つに記載の方法。
項目104.組織サンプルからTリンパ球を分離することは、組織サンプル中のCD3+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞又はそれらの任意の組合せの選択を行う前に組織サンプルを解離することをさらに含む、項目103に記載の方法。
項目105.分離されたTリンパ球を増殖させることは、分離されたTリンパ球と活性化剤とを接触させることを含む、項目95~104のいずれか1つに記載の方法。
項目106.活性化剤は、CD3アゴニスト及び/又はCD28アゴニストを含む、項目105に記載の方法。
項目107.活性化剤は、抗CD3アゴニスト抗体を含む、項目106に記載の方法。
項目108.活性化剤は、抗CD28アゴニスト抗体を含む、項目106又は107に記載の方法。
項目109.活性化剤は、1個以上のビーズにコンジュゲートされる、項目105~108のいずれか1つに記載の方法。
項目110.マイクロ流体デバイスは、分離されたTリンパ球の増殖を支援するように構成された少なくとも1つの隔離ペンを含み、少なくとも1つの隔離ペンのそれぞれの少なくとも1つの表面は、コーティング材料を含み、活性化剤は、コーティング材料に共有結合で結合される、項目105~108のいずれか1つに記載の方法。
項目111.活性化剤は、コーティング材料に安定に結合される、項目110に記載の方法。
項目112.活性化剤は、ビオチン-ストレプトアビジン結合を介してコーティング材料に安定に結合される、項目110に記載の方法。
項目113.活性化剤は、樹状細胞(DC)を含む、項目95~112のいずれか1つに記載の方法。
項目114.DCは、癌について治療される対象から得られる、項目113に記載の方法。
項目115.DCは、分離されたTリンパ球と活性化剤とを接触させる前に腫瘍抗原でパルスされる、項目113又は114の方法。
項目116.腫瘍抗原は、対象から得られた癌細胞から分離される、項目115に記載の方法。
項目117.腫瘍抗原は、合成品である、項目115に記載の方法。
項目118.腫瘍抗原は、少なくとも部分的には、対象から得られた癌細胞に由来する核酸分子のシーケンシングによって同定される、項目115~117のいずれか1つに記載の方法。
項目119.活性化剤との接触に反応して増殖を行う分離されたTリンパ球は、少なく
とも100倍の増殖を呈する、項目95~118のいずれか1つに記載の方法。
とも100倍の増殖を呈する、項目95~118のいずれか1つに記載の方法。
項目120.活性化剤との接触に反応して増殖を行う分離されたTリンパ球は、少なくとも1000倍の増殖を呈する、項目95~118のいずれか1つに記載の方法。
項目121.増殖されたTリンパ球は、マイクロ流体デバイスから選択的に搬出される、項目95~120のいずれか1つに記載の方法。
項目122.1つ以上のペンで1個以上のTリンパ球の増殖速度をアッセイすることと、所定の閾値以上の増殖速度のTリンパ球を選択的に搬出することとを含む、項目121に記載の方法。
項目123.1つ以上のペンで1個以上のTリンパ球による1種以上のサイトカインの発現をアッセイすることと、1種以上のサイトカインを発現するTリンパ球を選択的に搬出することとを含む、項目121又は122に記載の方法。
項目124.1種以上のサイトカインは、INFγ、TNFα、IL2又はそれらの任意の組合せを含む、項目123に記載の方法。
項目125.1つ以上のペンで1個以上のTリンパ球による1種以上の調節性T細胞マーカーの発現をアッセイすることと、1種以上の調節性T細胞マーカーを発現するTリンパ球を選択的に搬出することとを含む、項目121に記載の方法。
項目126.1種以上の調節性T細胞マーカーは、CTLA4を含む、項目125に記載の方法。
項目127.搬出されたTリンパ球のサンプルをゲノムプロファイリングすることをさらに含む、項目95~126のいずれか1つに記載の方法。
項目128.増殖されたTリンパ球は、マイクロ流体デバイスから搬出された後であるが、対象に再導入される前にさらに増殖される、項目95~127のいずれか1つに記載の方法。
項目129.増殖されたTリンパ球を搬出することは、誘電泳動(DEP)力を用いて、増殖されたTリンパ球をその対応する隔離ペンから搬出することを含む、項目95~128のいずれか1つに記載の方法。
均等物
上記の本明細書は、当業者による実施形態の実施を可能にするのに十分であると考えられる。以上の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳述し、企図される最良の形態を記述する。しかし、以上の内容が本文でいかに詳細に見えても、実施形態は、多くの方法で実施され得るため、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが分かるであろう。
上記の本明細書は、当業者による実施形態の実施を可能にするのに十分であると考えられる。以上の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳述し、企図される最良の形態を記述する。しかし、以上の内容が本文でいかに詳細に見えても、実施形態は、多くの方法で実施され得るため、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが分かるであろう。
Claims (63)
- 流路と、前記流路に流体接続された隔離ペンとを有するマイクロ流体デバイスにおいてTリンパ球を増殖させる方法であって、
1個以上のTリンパ球を前記マイクロ流体デバイスの前記隔離ペンに導入することと、
前記1個以上のTリンパ球と活性化剤とを接触させることと、
前記隔離ペンに導入された前記1個以上のTリンパ球が増殖を行うことを可能にするのに十分な時間の期間にわたり、前記マイクロ流体デバイスの前記流路を通して培養培地をかん流させることと
を含む方法。 - 前記隔離ペンは、約5×105から約5×106立方ミクロンの体積を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記隔離ペンの少なくとも1つの内面は、コーティング材料を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記コーティング材料は、前記隔離ペンの前記少なくとも1つの内面に共有結合で結合され、前記コーティング材料は、アルキレンエーテル部分、糖部分、アミノ酸部分又はそれらの組合せを含むポリマーを含み、任意選択的に、前記コーティング材料は、デキストラン又はポリエチレングリコール部分を含み、任意選択的に、前記コーティング材料は、1種以上のタンパク質を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記コーティング材料は、それぞれ結合基とアルキル部分とを含む分子を含み、前記結合基は、前記隔離ペンの前記少なくとも1つの内面に共有結合で結合され、任意選択的に、前記結合基は、シロキシ結合基である、請求項3に記載の方法。
- 前記アルキル部分は、少なくとも10個の炭素原子を含む炭素の直鎖を含み、及び/又は前記アルキル部分は、フルオロアルキル部分若しくはペルフロウロアルキル部分である、請求項5に記載の方法。
- 前記コーティング材料の前記分子は、前記内側基板表面に共有結合で結合された密充填単層構造を形成する、請求項5に記載の方法。
- 前記コーティング材料は、結合基とカチオン部分及び/又はアニオン部分とを有する分子を含み、前記結合基は、前記内側基板表面に共有結合で結合される、請求項3に記載の方法。
- 前記カチオン部分は、第4級アンモニウム基を含み、又は前記アニオン部分は、ホスホン酸、カルボン酸若しくはスルホン酸を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記コーティング材料は、結合基と双性イオン部分とを有する分子を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記双性イオン部分は、カルボキシベタイン、スルホベタイン、スルファミン酸及びアミノ酸から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記活性化剤は、前記コーティング材料に共有結合で結合されるか又は安定に結合され、任意選択的に、前記活性化剤は、ビオチン-ストレプトアビジン結合を介して前記コーティング材料に安定に結合される、請求項3に記載の方法。
- 前記1個以上のTリンパ球は、対象から採取された末梢血サンプル又は対象の固形腫瘍サンプルから分離され、任意選択的に、固形腫瘍は、乳癌、尿路、尿管、膀胱若しくは尿道に発生する癌、腎細胞癌、精巣癌、前立腺癌、又は精嚢、精管若しくは陰茎の癌、卵巣癌、子宮癌、頸癌、腟癌、又は卵管癌、神経系癌、神経芽腫、網膜芽腫、腸癌、結腸直腸癌、肺癌、或いは黒色腫である、請求項1に記載の方法。
- 前記固形腫瘍サンプルは、細針吸引物(FNA)又は生検物である、請求項13に記載の方法。
- 前記固形腫瘍は、髄様乳癌、中皮腫又は黒色腫である、請求項13に記載の方法。
- 前記1個以上のTリンパ球は、前記末梢血サンプル又は前記固形腫瘍サンプルから分離されたTリンパ球の集団に由来する、請求項13に記載の方法。
- 前記集団は、CD3+Tリンパ球が富化される、請求項16に記載の方法。
- 前記集団は、CD3+CD4+Tリンパ球が富化される、請求項16に記載の方法。
- 前記集団は、CD3+CD8+Tリンパ球が富化される、請求項16に記載の方法。
- 前記集団は、CD45RA+CD45RO-Tリンパ球が富化される、請求項16に記載の方法。
- 前記集団は、CD45RA-CD45RO+Tリンパ球が富化される、請求項16に記載の方法。
- 前記集団は、CCR7+Tリンパ球又はCD62L+Tリンパ球が富化される、請求項16に記載の方法。
- 前記集団は、CD69+Tリンパ球又はPD-1+及び/若しくはPD-L1+Tリンパ球が枯渇される、請求項16に記載の方法。
- 前記Tリンパ球と、CD45RO、CD45RA、CD69、PD-1及び/又はPD-L1に対する抗体とを接触させることにより、CD45RO+Tリンパ球、CD45RA+Tリンパ球、CD69+Tリンパ球、PD-1+Tリンパ球及びPD-L1+Tリンパ球の1つ、2つ、3つ又は4つを枯渇させることと、前記抗体に結合されたTリンパ球を前記集団から除去することとを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記抗体は、固体担体を伴い、任意選択的に、前記固体担体は、磁気ビーズの集団である、請求項24に記載の方法。
- 前記1個以上のTリンパ球を前記隔離ペンに導入することは、前記1個以上のTリンパ球を含有する流体を前記マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルに流入させることを含み、前記マイクロ流体チャネルは、前記マイクロ流体デバイスの前記流路の一部であり、前記隔離ペンは、前記マイクロ流体チャネルから離れて開口し、任意選択的に、前記1個以上のTリンパ球を前記隔離ペンに導入することは、誘電泳動(DEP)を用いて、前記マイクロ流体チャネルに位置する少なくとも1個のTリンパ球を選択し、且つそれを前記隔離ペン内に移動させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がマーカーCD3+、CD4+、CD8+又はそれらの任意の組合せを含むために選択され、任意選択的に、(i)前記少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面が前記マーカーCD3+及びCD4+を含むために選択され、又は(ii)前記少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面が前記マーカーCD3+及びCD8+を含むために選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がマーカーCD45RA+、CD45RO+、CCR7+、CD62L+又はそれらの任意の組合せを含むために選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記少なくとも1個のTリンパ球を選択することは、前記少なくとも1個のTリンパ球を含むTリンパ球の集団を、CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CCR7又はCD62Lに特異的に結合する抗体で標識することと、前記少なくとも1個のTリンパ球を、それが前記抗体を伴うことに基づいて前記隔離ペン内に移動させることとを含み、任意選択的に、前記抗体は、フルオロフォアを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD45RO+でないために選択され、任意選択的に、1個以上のTリンパ球を前記隔離ペンに導入することは、CD45RO+Tリンパ球を標識することと、CD45ROの指標となる標識を伴わない1個以上のTリンパ球を前記隔離ペンに導入することとを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD45RA+でないために選択され、任意選択的に、1個以上のTリンパ球を前記隔離ペンに導入することは、CD45RA+Tリンパ球を標識することと、CD45RAの指標となる標識を伴わない1個以上のTリンパ球を前記隔離ペンに導入することとを含む、請求項26に記載の方法。
- CCR7+及びCD62L+Tリンパ球を標識することと、CCR7の指標となる標識を伴う及び/又はCD62Lの指標となる標識を伴う1個以上のTリンパ球を前記隔離ペン内に移動させることとを含む、請求項26に記載の方法。
- CCR7+及びCD62L+Tリンパ球を標識することと、CCR7の指標となる標識を伴わない及び/又はCD62Lの指標となる標識を伴わない1個以上のTリンパ球を前記隔離ペン内に移動させることとを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がCD69+でなく、PD-1+でなく、且つ/又はPD-L1+でないために選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、それが蛍光標識を伴う抗原で標識されるために選択され、任意選択的に、前記抗原は、MHCタンパク質で複合体化されるペプチドを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記少なくとも1個の選択されるTリンパ球は、少なくとも部分的には、それが蛍光標識を伴う1種以上の抗体で標識されるために選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記1種以上の抗体は、CD45RA若しくはCD45ROに対する抗体、CCR7に
対する抗体、CD62Lに対する抗体又はそれらの任意の組合せを含む、請求項36に記載の方法。 - 前記1種以上の抗体は、CD4又はCD8に対する抗体を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記1個以上のTリンパ球は、前記隔離ペンに導入される前に活性化剤に接触され、任意選択的に、前記1個以上のTリンパ球は、前記マイクロ流体デバイスに導入される前に少なくとも1時間の期間にわたり、又は前記マイクロ流体デバイスに導入される前に少なくとも5時間の期間にわたり前記活性化剤と共にインキュベートされる、請求項1に記載の方法。
- 前記1個以上のTリンパ球を前記隔離ペンに導入することは、前記活性化剤を前記隔離ペンに導入することをさらに含む、請求項39に記載の方法。
- 前記1個以上のTリンパ球は、前記隔離ペンに導入された後に前記活性化剤に接触される、請求項1に記載の方法。
- (i)前記活性化剤は、抗CD3及び/若しくは抗CD28アゴニスト抗体を含み、任意選択的に、前記活性化剤は、固体担体にコンジュゲートされる抗CD3アゴニスト抗体、固体担体にコンジュゲートされる抗CD28アゴニスト抗体若しくは可溶性抗CD28アゴニスト抗体を含み、又は(ii)前記活性化剤は、樹状細胞(DC)を含み、任意選択的に、前記DCは、前記1個以上のTリンパ球を接触させる前に腫瘍抗原でパルスされ、さらに任意選択的に、前記腫瘍抗原は、前記1個以上のTリンパ球と同系の腫瘍細胞から分離される、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍抗原は、腫瘍細胞のゲノム解析を通して同定され、任意選択的に、前記解析される腫瘍細胞は、前記1個以上のTリンパ球と同系である、請求項42に記載の方法。
- 前記DC及び前記1個以上のTリンパ球は、自己細胞である、請求項42に記載の方法。
- 前記培養培地は、前記マイクロ流体デバイスの前記流路を通して少なくとも24時間、少なくとも48時間又は少なくとも96時間の期間にわたってかん流される、請求項1に記載の方法。
- 前記培養培地は、ヒト血清とIL2とを含み、及び/又は前記培養培地は、IL7、IL15、IL21若しくはそれらの任意の組合せを含む、請求項1に記載の方法。
- 20個以下、10個以下、6~10個、5個以下、約5個、約4個、約3個、約2個又は1個のTリンパ球は、前記マイクロ流体デバイスの前記隔離ペンに導入される、請求項1に記載の方法。
- 前記増殖は、少なくとも3ラウンドの有糸細胞分裂を含み、及び/又は前記方法は、前記増殖されたTリンパ球を前記マイクロ流体デバイスから搬出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記マイクロ流体デバイスは、複数の隔離ペンを含み、1個以上のTリンパ球は、前記複数のそれぞれの隔離ペンに導入され、且つ前記活性化剤に接触される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1~49のいずれか一項に記載の方法に従って産生されたTリンパ球。
- 請求項1~49のいずれか一項に記載の方法に従って産生されたTリンパ球を含むマイクロ流体デバイスであって、任意選択的に、隔離ペンを含み、及び前記Tリンパ球は、前記隔離ペン内に位置する、マイクロ流体デバイス。
- 請求項1~49のいずれか一項に記載の方法に従って産生されたTリンパ球と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 対象における癌を治療する方法であって、Tリンパ球を前記対象に導入することを含み、前記Tリンパ球は、請求項1~49のいずれか一項に記載の方法によって調製される、方法。
- 対象における癌を治療する方法であって、
前記対象から得られた組織サンプルからTリンパ球を分離することと、
前記分離されたTリンパ球を、請求項1~49のいずれか一項に記載の方法に従ってマイクロ流体デバイスにおいて増殖させることと、
前記増殖されたTリンパ球を前記マイクロ流体デバイスから搬出することと、
前記増殖されたTリンパ球を前記対象に再導入することと
を含む方法。 - 前記対象は、哺乳動物であり、任意選択的に、前記対象は、ヒトである、請求項53に記載の方法。
- 前記組織サンプルは、末梢血のサンプルであるか又は固形腫瘍に由来し、任意選択的に、前記組織サンプルは、前記固形腫瘍に由来するFNA又は生検物であり、任意選択的に、前記固形腫瘍は、乳癌、尿路、尿管、膀胱若しくは尿道に発生する癌、腎細胞癌、精巣癌、前立腺癌、又は精嚢、精管若しくは陰茎の癌、卵巣癌、子宮癌、頸癌、腟癌、又は卵管癌、神経系癌、神経芽腫、網膜芽腫、腸癌、結腸直腸癌、肺癌、或いは黒色腫である、請求項54に記載の方法。
- 前記固形腫瘍は、髄様乳癌、中皮腫又は黒色腫である、請求項56に記載の方法。
- 前記組織サンプルからTリンパ球を分離することは、前記組織サンプル中のCD3+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞又はそれらの任意の組合せの選択を行うことを含む、請求項54に記載の方法。
- 前記分離されたTリンパ球を増殖させることは、前記分離されたTリンパ球と活性化剤とを接触させることを含む、請求項54に記載の方法。
- 前記活性化剤は、CD3アゴニスト及び/又はCD28アゴニストを含む、請求項59に記載の方法。
- 前記マイクロ流体デバイスは、前記分離されたTリンパ球の増殖を支援するように構成された少なくとも1つの隔離ペンを含み、前記少なくとも1つの隔離ペンのそれぞれの少なくとも1つの表面は、コーティング材料を含み、前記活性化剤は、前記コーティング材料に共有結合で結合される、請求項59に記載の方法。
- 前記活性化剤は、樹状細胞(DC)を含む、請求項54に記載の方法。
- 前記DCは、癌について治療される前記対象から得られ、及び/又は前記DCは、前記分離されたTリンパ球と前記活性化剤とを接触させる前に腫瘍抗原でパルスされ、任意選択的に、前記腫瘍抗原は、前記対象から得られた癌細胞から分離され、又は前記腫瘍抗原は、合成品である、請求項62に記載の方法。
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