CN115354025A - 微流体装置中t淋巴细胞的选择和克隆 - Google Patents

Abstract

提供了微流体装置中T淋巴细胞的选择和克隆。具体而言，提供了在微流体装置中扩增T淋巴细胞的方法，其包括将一个或多个T淋巴细胞引入到微流体装置中；使所述细胞与活化剂接触；及通过微流体装置灌注培养基达一段时间足以使一个或多个T淋巴细胞经历至少一轮有丝细胞分裂的时间。扩增可以是非特异性的或抗原特异性的。

Description

微流体装置中T淋巴细胞的选择和克隆

本申请是申请号为2017800242591，申请日为2017年3月16日，发明名称为“微流体装置中T淋巴细胞的选择和克隆”的中国专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请基于35 U.S.C.§119要求2016年3月17日提交的美国专利申请号62/309,454、2016年4月22日提交的美国专利申请号62/326,667、2016年10月24日提交的美国专利申请号62/412,212以及2017年3月13日提交的美国专利申请号62/470,744的权益，其每一个的全部内容均通过引用并入本文。

领域

本领域一般性地涉及用于在微流体环境中选择和扩增T淋巴细胞的方法、系统和装置。

发明背景

免疫疗法是使用患者的免疫系统帮助对抗疾病的迅速发展的领域。已经评估了多种对抗癌症的免疫疗法策略，包括刺激患者自身的免疫系统以攻击癌细胞和从外部来源施用免疫系统组分。例如，被设计用于体内攻击癌细胞的单克隆抗体已经单独或在基因工程构建体中施用。此外，已经研究了各种T细胞疗法。自体同源T细胞疗法涉及从受试者获得T细胞、离体扩增T细胞和将扩增的T细胞重新引入到受试者体内。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法涉及将T细胞基因工程化，以在其表面上表达含有嵌合抗体的融合蛋白，其靶向所讨论的癌症并允许T细胞杀死癌细胞。两种类型的T细胞疗法都具有优势。然而，疗法仍需要进一步改进。

自体同源T细胞疗法和CAR-T疗法二者中的关键问题之一是缺乏以选择性扩增具有最高肿瘤杀灭潜力的T细胞的方式离体扩增T细胞的方法。本公开内容提供了离体选择性扩增T细胞的解决方案。本公开还提供了使用根据本文公开的方法离体扩增的T细胞来治疗患有癌症的受试者的改进的方法。

发明内容

公开了在微流体装置(或“芯片”)中扩增T淋巴细胞的方法。微流体装置可以包括微流体通道和与通道流体连接的隔离坞(sequestration pen)，其中隔离坞被配置为支持T淋巴细胞的培养和扩增。在某些实施方案中，微流体装置可以是纳米流体装置。隔离坞可以具有例如约0.5×10⁶至约5.0×10⁶立方微米或约0.5×10⁶至约2.0×10⁶立方微米的体积。此外，微流体装置可以具有超过一个微流体通道和与每个微流体通道流体连接的多个隔离坞，其中多个隔离坞中的每一个被配置为支持T淋巴细胞的培养和扩增。可以调节隔离坞的一个或多个表面。

扩增T淋巴细胞的方法可以包括：将一个或多个T淋巴细胞引入到微流体装置中的隔离坞中；以及使一个或多个T淋巴细胞与活化剂接触。在一些实施方案中，将20个或更少、10个或更少、6至10个、5个或更少、约5个、约4个、约3个、约2个或1个T淋巴细胞引入到隔离坞中。如果微流体装置包括多个隔离坞，则可以将一个或多个T淋巴细胞(例如，20个或更少、10个或更少、6至10个、5个或更少、约5个、约4个、约3个、约2个或1个T细胞)引入到一个或多个隔离坞中的每一个中。扩增T淋巴细胞的方法可以进一步包括通过微流体装置的微流体通道灌注培养基。灌注可以是连续的或间歇的，并且可以持续达一段时间足以使引入到隔离坞(或多个隔离坞)中的一个或多个T淋巴细胞经历至少一轮有丝细胞分裂。

在某些实施方案中，一个或多个T淋巴细胞来自由受试者的外周血分离的T淋巴细胞群。在其他实施方案中，一个或多个T淋巴细胞来自由受试者的实体瘤样品分离的T淋巴细胞群。实体瘤样品可以是细针抽吸物(FNA)或肿瘤活组织检查样本(例如，核心活组织检查样本)。实体瘤可以是乳腺癌、泌尿生殖系统癌症(例如，源自泌尿道(例如肾脏(例如，肾细胞癌))、输尿管、膀胱或尿道的癌症)；男性生殖道的癌症(例如，睾丸癌、前列腺癌，或者精囊、精管或阴茎的癌症)；或女性生殖道的癌症(例如，卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、阴道癌或输卵管癌))、神经系统的癌症(例如，神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤)、肠癌(例如，结肠直肠癌)、肺癌、黑素瘤或其他类型的癌症。在具体的实施方案中，实体瘤可以是髓样乳腺癌、间皮瘤或黑素瘤。

在一些实施方案中，T淋巴细胞群富含CD3⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群富含CD3⁺CD4⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群富含CD3⁺CD8⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群富含CD45RA⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群富含CD45RO⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群富含CCR7⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群富含CD62L⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群富含CD45RA⁺/CD7⁺/CD62L⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群富含CD45RO⁺/CD7⁺/CD62L⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群富含PD-1⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群富含CD137⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群富含PD-1⁺/CD137⁺ T淋巴细胞。

在一些实施方案中，T淋巴细胞群缺失CD4⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群缺失CD8⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群缺失CD45RO⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群缺失CD45RA⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群缺失CCR7⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群缺失CD62L⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群缺失CD45RO⁺/CD7⁺/CD62L⁺T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群缺失CD45RA⁺/CD7⁺/CD62L⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群缺失PD-1⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群缺失CD137⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞群缺失PD-1⁺/CD137⁺ T淋巴细胞。

在一些实施方案中，T淋巴细胞群中的主要细胞类型是初始

T细胞

记忆T细胞，例如中枢记忆T细胞(T_CM)或效应记忆T细胞(T_EM)或效应T细胞(T_EFF)。

在一些实施方案中，该方法包括预处理含有T淋巴细胞的样品以富集初始T淋巴细胞、记忆T淋巴细胞(例如，T_CM细胞和/或T_EM细胞)、T_EFF淋巴细胞或其任何组合。处理可以包括从样品中去除碎片和/或非淋巴细胞类型。替代地或另外地，处理可以包括耗尽样品中的初始T淋巴细胞、记忆T淋巴细胞(例如T_CM和/或T_EM淋巴细胞)、T_EFF淋巴细胞或其组合。

样品可以来自受试者，例如患有癌症(例如，本文所述的或本领域已知的任何类型的癌症)的受试者。样品可以是外周血样品或其衍生物(例如，PBMC样品)。或者，样品可以是实体瘤活组织检查样本或FNA。在一些实施方案中，处理外周血样品以富集初始T淋巴细胞。在其他实施方案中，处理肿瘤样品以富集记忆T淋巴细胞，特别是T_CM淋巴细胞，尽管可以富集T_EF淋巴细胞。在其他实施方案中，处理肿瘤样品以富集T_EFF淋巴细胞。为了富集所需的T淋巴细胞细胞类型，可以使用与一种或多种细胞表面抗原特异性结合的结合剂(例如，抗体等)。由结合剂结合的细胞表面抗原可以是本文所述的任何一种细胞表面抗原，包括CD4、CD8、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD62L、PD-1和CD137T，或其组合。处理可以包括使样品与一种或多种荧光标记的结合剂接触并进行FACS以选择被标记的细胞(例如，如果基于由一种或多种结合剂特异性结合的细胞表面抗原进行富集)或去除被标记的细胞(例如，如果基于由一种或多种结合剂特异性结合的细胞表面抗原进行消耗)。替代地或另外地，处理可以包括使样品与一种或多种与固体支持物连接的结合剂接触，并除去与固体支持物结合的细胞(例如，如果基于由一种或多种结合剂特异性结合的细胞表面抗原进行消耗)或除去未与固体支持物结合的细胞(例如，如果基于由一种或多种结合剂特异性结合的细胞表面抗原进行富集)。固体支持物可以是例如一个或多个珠子(例如，多个珠子，其可以是磁性的)。如果使用磁珠，则可以对样品施加磁力，使得磁珠形成沉淀(pellet)，这允许将得到的上清液与沉淀分离。

在某些实施方案中，将一个或多个T淋巴细胞引入到隔离坞中包括使含有一个或多个T淋巴细胞的流体流入到微流体装置的微流体通道中。将一个或多个T淋巴细胞引入到隔离坞中可以进一步包括使用介电电泳(DEP)来选择位于微流体通道中的至少一个T淋巴细胞并将其移动到隔离坞中。可以基于标志物的细胞表面表达来选择至少一个T淋巴细胞，该标志物例如是CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD62L、PD-1、CD137T或其任何组合。或者，将一个或多个T淋巴细胞引入到隔离坞中可以进一步包括使微流体芯片倾斜，使得重力将至少一个T淋巴细胞拉入隔离坞中。在其他替代方案中，将一个或多个T淋巴细胞引入到隔离坞中可以进一步包括将微流体装置离心，使得离心力将至少一个T淋巴细胞拉入隔离坞中。

在一些实施方案中，选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面是CD4⁺或CD3⁺CD4⁺。在一些实施方案中，选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面是CD8⁺或CD3⁺CD8⁺。在一些实施方案中，选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面是CD45RA⁺(例如，CD45RA⁺CD45RO-)。在一些实施方案中，选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面是CD45RA-(例如，CD45RA^-CD45RO⁺)。在一些实施方案中，选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面是CCR7⁺和/或CD62L⁺。在一些实施方案中，选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面是CCR7^-和/或CD62L^-。在一些实施方案中，选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面是CD45RA⁺、CD45RO^-、CD45RA⁺CCR7⁺、CD45RO^-CCR7⁺、CD45RA⁺CD45RO^-CCR7⁺、CD45RA⁺CD62L⁺、CD45RO^-CD62L⁺、CD45RA⁺CD45RO^-CD62L⁺、CD45RA⁺CCR7⁺CD62L⁺、CD45RO^-CCR7⁺CD62L⁺或CD45RA⁺CD45RO^-CCR7⁺CD62L⁺。在一些实施方案中，选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面是CD45RO⁺、CD45RA^-、CD45RO⁺CCR7⁺、CD45RA^-CCR7⁺、CD45RO⁺CD45RA^-CCR7⁺、CD45RO⁺CD62L⁺、CD45RA^-CD62L⁺、CD45RO⁺CD45RA^-CD62L⁺、CD45RO⁺CCR7⁺CD62L⁺、CD45RA^-CCR7⁺CD62L⁺或CD45RO⁺CD45RA^-CCR7⁺CD62L⁺。在一些实施方案中，选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面是CD45RO⁺CCR7^-、CD45RA^-CCR7^-、CD45RO⁺CD45RA^-CCR7^-、CD45RO⁺CD62L^-、CD45RA-CD62L^-、CD45RO⁺CD45RA^-CD62L^-、CD45RO⁺CCR7^-CD62L^-、CD45RA-CCR7^-CD62L^-、CD45RO⁺CD45RA^-CCR7^-CD62L-。在一些实施方案中，选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面是CD69^-。在一些实施方案中，选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面是PD-1⁺和/或CD137⁺。在一些实施方案中，选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面是PD-1-和/或CD137^-。

在一些实施方案中，选择步骤包括基于一种或多种结合剂与至少一个T淋巴细胞之间结合的存在(或不存在)，使至少一个T淋巴细胞与一种或多种结合剂(例如，抗体、肽结合的MHC复合物的四聚体等)接触并将至少一个T淋巴细胞移动到隔离坞中。在一些实施方案中，一种或多种结合剂中的每一种包含标记物，例如荧光团。

在某些实施方案中，将一个或多个T淋巴细胞引入到隔离坞中进一步包括将活化剂引入到隔离坞中。在引入到隔离坞中之前，可以使一个或多个T淋巴细胞与活化剂接触。例如，在引入到微流体装置中之前，可以将T淋巴细胞与活化剂一起孵育至少一小时(例如，至少2、3、4、5或更多小时)。或者，一个或多个T淋巴细胞可以在被引入到隔离坞中之后与活化剂接触。

在某些实施方案中，活化剂可以包括CD3和CD28激动剂。CD3和/或CD28激动剂可以是抗体。在一些实施方案中，抗CD3激动剂(例如，抗体)与固体支持物连接。在一些实施方案中，抗CD28激动剂(例如，抗体)与固体支持物连接。在一些实施方案中，抗CD28激动剂(例如，抗体)是水溶液中的溶质。因此，例如，活化剂可以包含与抗CD3和抗CD28激动剂抗体连接的一个或多个珠子。或者，活化剂可以包含与抗CD3激动剂抗体连接的一个或多个珠子以及可溶性抗CD28激动剂抗体的溶液。在其他替代方案中，CD3和/或CD28激动剂可以(共价或非共价)连接到隔离坞的一个或多个表面。可以以促进CD3和/或CD28激动剂与表面连接的方式调节隔离坞的表面。

在某些实施方案中，活化剂可以包含树突细胞(DC)。在与一个或多个T淋巴细胞接触之前，可以用感兴趣的抗原(例如，癌症相关的抗原、感染性疾病相关的抗原或与一些其他类型的病症相关的抗原)脉冲(pulse)树突细胞。癌症相关的抗原(其可以是众所周知的抗原或新抗原)可以通过得自肿瘤活组织检查样本的肿瘤细胞的基因组分析来识别。

在某些实施方案中，活化剂可以包含肽抗原和MHC分子之间的复合物。这种复合物可以连接，如在肽-MHC四聚体复合物的情况中。肽-MHC复合物可以与固体支持物连接。在一些实施方案中，固体支持物可以是一个或多个珠子。在其他实施方案中，固体支持物可以是隔离坞的一个或多个表面。因此，可以以促进肽-MHC复合物与表面连接的方式调节隔离坞的表面。

在某些实施方案中，通过微流体装置的微流体通道灌注培养基至少24小时(例如，至少48、72、96、110或更多小时，或其间的任何数值)。在某些实施方案中，培养基包括哺乳动物血清，其可以是人血清(例如，人AB血清)，任选地与牛血清(例如，胎牛血清或小牛血清)组合。在某些实施方案中，培养基进一步包含白细胞介素2(IL2)、白细胞介素7(IL7)、白细胞介素21(IL21)、白细胞介素15(IL15)或其任何组合。在一些实施方案中，培养基包含约50U/ml的IL2(例如，约1U/ml至约10U/ml的IL2)。在一些实施方案中，培养基包含约5ng/ml的IL7(例如，约1ng/ml至约10ng/ml的IL7)。在一些实施方案中，培养基包含约30ng/ml的IL21(例如，约10ng/ml至约50ng/ml的IL21)。

在一些实施方案中，该方法包括测定一个或多个T淋巴细胞的坞内增殖速率。在一些实施方案中，该方法包括测定隔离坞中的一个或多个T淋巴细胞对一种或多种细胞因子(例如，INFγ、TNFα、IL2或其组合)的表达。在一些实施方案中，该方法包括测定隔离坞中的一个或多个T淋巴细胞对一种或多种调节性T细胞标志物(例如CTLA4)的表达。

在一些实施方案中，例如在扩增后将T淋巴细胞从微流体装置输出。输出可以是选择性的，例如，至少部分地基于增殖速率、细胞因子表达、调节性T细胞标志物的表达或其组合。在一些实施方案中，输出的T淋巴细胞样品是经基因组概况分析的。

在某些实施方案中，公开了治疗受试者的癌症的方法。受试者可以是哺乳动物，例如人。癌症可以是乳腺癌、泌尿生殖系统癌症(例如，源自泌尿道(例如肾脏(例如，肾细胞癌))、输尿管、膀胱或尿道的癌症)；男性生殖道的癌症(例如，睾丸癌、前列腺癌，或者精囊、精管或阴茎的癌症；或女性生殖道的按照(例如，卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、阴道癌或输卵管癌))、神经系统的癌症(例如，神经母细胞瘤)、肠癌(例如，结肠直肠癌)、肺癌、黑素瘤或其他类型的癌症。在具体的实施方案中，癌症可以是髓样乳腺癌、间皮瘤或黑素瘤。

治疗癌症的方法可以包括：从得自受试者的组织样品中分离T淋巴细胞；根据本文公开的任何方法，在微流体装置中扩增分离的T淋巴细胞；从微流体装置输出扩增的T淋巴细胞；以及将扩增的T淋巴细胞重新引入到受试者体内。

在某些实施方案中，组织样品是外周血样品。在某些实施方案中，组织样品来自实体瘤。例如，组织样品可以是来自实体瘤的FNA或活组织检查样本(例如，核心活组织检查样本)。实体瘤样品可以来自上文讨论的任何癌症。

在某些实施方案中，从组织样品中分离T淋巴细胞包括对组织样品中的CD3⁺细胞进行选择。在一些实施方案中，选择可以基于标志物CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CCR7、CD62L、PD-1、PD-L1和CD137中的一种或多种，如上文和本文其他地方所述。选择可包括使用珠子，例如磁珠，其上附接有CD3结合剂(或其他标志物结合剂)。在某些实施方案中，从组织样品中分离T淋巴细胞进一步包括在对肿瘤样品中的CD3⁺(或其他标志物阳性)细胞进行选择之前解离组织样品。

在某些实施方案中，将分离的T淋巴细胞引入到微流体装置中。微流体装置可以是纳米流体装置。在某些实施方案中，扩增分离的T淋巴细胞包括将一个或多个分离的T淋巴细胞引入到微流体(或纳米流体)装置的隔离坞中。隔离坞可以例如具有约0.5×10⁶至约5×10⁶立方微米或约0.5×10⁶至约2.0×10⁶立方微米的体积。

在某些实施方案中，扩增分离的T淋巴细胞包括使分离的T淋巴细胞与活化剂接触。在一些实施方案中，活化剂包含CD3和/或CD28激动剂。CD3和/或CD28激动剂可以是抗体。在一些实施方案中，抗CD3激动剂与固体支持物连接。在一些实施方案中，抗CD28激动剂与固体支持物连接。因此，活化剂可以包含例如一种或多种固体支持物(例如，一个或多个珠子)，每种固体支持物可以与抗CD3和/或抗CD28激动剂抗体连接。在一些实施方案中，作为水溶液中的溶质提供抗CD28激动剂(例如，抗体)。在其他实施方案中，活化剂包括树突细胞(DC)。DC可以得自被治疗的受试者和/或可以在与分离的T淋巴细胞接触之前用肿瘤抗原脉冲。可以通过对从受试者获得的癌细胞的核酸分子(例如，gDNA、mRNA等)进行测序来识别肿瘤抗原。在其他实施方案中，活化剂可以是肽-MHC复合物或复合物(例如肽-MHC四聚体复合物)的簇，其可以与固体支持物连接，所述固体支持物例如是一个或多个珠子或者隔离坞的一个或多个表面(例如，经调节的表面)。

在某些实施方案中，在将T淋巴细胞引入到微流体装置中之前，将其与活化剂一起孵育至少一小时(例如，至少2、3、4、5或更多个小时)。在某些实施方案中，将分离的T淋巴细胞引入到隔离坞中进一步包括将活化剂引入到隔离坞中。

在某些实施方案中，响应于被活化剂接触而发生扩增的分离的T淋巴细胞表现出至少100倍(例如，至少200倍、至少500倍、至少1000倍等)的扩增。在某些实施方案中，扩增的T淋巴细胞在从微流体装置输出后但在重新引入到受试者中之前进一步“芯片外”扩增。

可以使用微流体装置来实施本文所述的任何方法，所述微流体装置具有已经调节或涂覆的一个或多个内表面(例如，衬底表面、盖表面和/或管路材料的表面)，以提供有机和/或亲水分子的层，其提供微流体装置和其中生长的T细胞之间的主要界面。例如，流动路径和隔离坞可以用涂覆溶液处理，所述涂覆溶液与一个或多个内表面结合并且呈现分子的有机和/或亲水层。因此，涂覆溶液可以包含与一个或多个内表面结合的涂覆剂，例如血清、血清白蛋白(例如，BSA)、聚合物、洗涤剂、酶或其任何组合。

在某些实施方案中，微流体装置可以包括包含涂层材料的内衬底表面(和/或内部盖表面和/或管路材料的内表面)。在一些实施方案中，涂层材料包括具有连接基团和烷基部分的分子。连接基团可以共价键合到内衬底表面，并且可以是例如甲硅烷氧基连接基团。烷基部分可以是例如未取代的烷基部分或取代的烷基部分，例如氟烷基部分或全氟烷基部分。烷基部分可以包括含有至少10个碳原子(例如，至少12、14、16、18、20、22或更多个碳原子)的直链碳链。涂层材料的分子可以形成致密堆积的单层结构，其共价地结合到内衬底表面(和/或内部盖表面和/或管路材料的内表面)。

在一些实施方案中，涂层材料包含具有连接基团和阳离子部分和/或阴离子部分的分子，其中连接基团共价键合到内衬底表面(和/或内部盖表面和/或管路材料的内表面)。阳离子部分可以包括季铵基团。阴离子部分可以包括膦酸、羧酸或磺酸。在一些相关的实施方案中，涂层材料可以包含具有连接基团和两性离子部分的分子，其中连接基团共价键合到内衬底表面(和/或内部盖表面和/或管路材料的内表面)。两性离子部分选自羧基甜菜碱、磺基甜菜碱、氨基磺酸和氨基酸。在一些实施方案中，阳离子、阴离子或两性离子部分能够与封闭剂离子键合。

在一些实施方案中，涂层材料包含含有亚烷基醚部分(moiety)、糖部分或氨基酸部分的聚合物。例如，涂层材料可以包含葡聚糖或聚乙二醇(PEG)。替代地或另外地，涂层材料可以包含蛋白质聚合物(例如，促进T细胞活化的蛋白质)。

还提供了根据本文公开的方法产生的T淋巴细胞。还提供了一种微流体装置，其包含根据本文公开的方法(例如，在微流体装置的一个或多个隔离坞中)产生的一个或多个，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个T淋巴细胞。还提供了药物组合物，其包含根据本文公开的方法产生的T淋巴细胞和任选的药学上可接受的载体。

另外的目的和优点将部分地在下文的描述中给出，并且部分地将从描述中显而易见，或者可以通过实践来学习。通过在所附权利要求中特别指出的要素和组合将实现和获得这些目的和优点。

应当理解，前文的一般性描述和下文的详细描述都只是示例性和说明性的，并不是对权利要求的限制。

包含在本说明书中并构成其一部分的附图示出了一个(几个)实施方案，并与说明书一起用于解释本文所述的原理。

附图的简要说明

图1A示出了根据本公开的一些实施方案的与微流体装置和相关控制设备一起使用的系统的示例。

图1B和1C示出了根据本公开的一些实施方案的微流体装置。

图2A和2B示出了根据本公开的一些实施方案的分离坞。

图2C示出了根据本公开的一些实施方案的详细的隔离坞。

图2D-2F示出了根据本公开的一些其他实施方案的隔离坞。

图2G示出了根据本公开的实施方案的微流体装置。

图2H示出了根据本公开的实施方案的微流体装置的经涂覆的表面。

图3A示出了根据本公开的一些实施方案的与微流体装置和相关控制设备一起使用的系统的具体示例。

图3B示出了根据本公开的一些实施方案的成像装置。

图4提供了纳米流体芯片中的单个纳米孔的一系列延时图像，所述纳米流体芯片含有用抗CD3/抗CD28 T细胞活化的珠子培养的人T淋巴细胞。图像显示培养0、24、48、72和96小时的纳米孔。

图5A提供了纳米流体芯片中的单个纳米孔的一系列延时图像，所述纳米流体芯片含有用同种异体树突细胞(DC)培养的人T淋巴细胞。图像显示培养0、24、48、72和96小时的纳米孔。

图5B提供了纳米流体芯片中的单个纳米孔的一系列延时图像，所述纳米流体芯片含有用已经用破伤风毒素和爱泼斯坦巴尔(Epstein bar)病毒抗原脉冲的树突细胞(DC)培养的人T淋巴细胞。图像显示培养0、24、48、72、96和110小时的纳米孔。

图6A提供了显示在图6A的纳米孔中的T细胞中掺入EdU(荧光信号)的图像。对于96小时培养时间点显示EdU掺入(红色)，并且其覆盖在选择性扩增的T细胞的亮视场图像上。

图6B提供了显示在图6B的纳米孔中的T细胞中掺入EdU(荧光信号)的图像。对于110小时培养时间点显示EdU掺入(红色)，并且其覆盖在选择性扩增的T细胞的亮视场图像上。

图7A和7B是在具有至少一个经调节的表面的微流体装置中培养T细胞的实施方案的照片表示。

图8A示出了用于从样品中获得T淋巴细胞并将它们引入到微流体装置中的隔离坞中从而提供被隔离的细胞的示例性工作流程。

图8B示出了用于扩增被隔离的T淋巴细胞(例如根据如图8A所示的工作流程所隔离的T淋巴细胞)的示例性工作流程。

图8C示出了用于输出扩增的T淋巴细胞(例如根据如图8B所示的工作流程所扩增的T淋巴细胞)的示例性工作流程。

实施方案的详细描述

本说明书描述了本公开的示例性实施方案和应用。然而，本公开不限于这些示例性实施方案和应用，也不限于示例性实施方案和应用在本文中操作或描述的方式。此外，附图可以示出简化或局部视图，并且附图中的要素的尺寸可能被夸大或者不成比例。另外，由于本文使用术语“在......上”、“附接到”、“连接到”、“耦合到”或类似的词，一个要素(例如，材料、层、衬底等)可以“在另一要素上”、“附接到另一要素”、“连接到另一要素”或“耦合到另一要素”，而不论该一个要素是直接在该另一要素上、附接到该另一要素、连接到该另一要素或耦合到该另一要素，还是在该一个要素和该另一元素之间有一个或多个间隔要素。此外，除非上下文另有规定，否则如果提供方向(例如，上方、下方、顶部、底部、侧面、上、下、在……下、在……上、上部、下部、水平、垂直、“x”、“y”、“z”等)的话，它们是相对的并且仅作为示例提供，并且为了便于说明和讨论而不是作为限制。另外，在提及要素列表(例如，要素a、b、c)的情况下，这样的提及旨在包括所列要素本身中的任何一个、少于所有列出的要素的任何组合和/或所有列出的要素的组合。说明书中的章节划分仅为了便于审查，并不限制所讨论要素的任何组合。

在微流体特征的尺寸被描述为具有宽度或面积的情况下，通常相对于x轴和/或y轴尺寸来描述该尺寸，这两个尺寸都位于与微流体装置的衬底和/或盖平行的平面内。可以相对于z轴方向描述微流体特征的高度，该z轴方向垂直于平行于微流体装置的衬底和/或盖的平面。在一些情况下，微流体特征(例如通道或通路)的横截面积可以参考x轴/z轴、y轴/z轴或x轴/y轴面积。

如本文所用，“基本上”意指足以用于预期目的。因此，术语“基本上”允许由绝对或完美状态、尺寸、测量、结果等的微小的、无关紧要的变化，例如本领域普通技术人员所预期但不明显影响整体性能的变化。当与数值或者可以表示为数值的参数或特性相关地使用时，“基本上”意味着在百分之十之内。

术语“一”意味着不止一个。

如本文所用，术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。

如本文所用，术语“置于”在其含义内包括“位于”。

如本文所用，“微流体装置”或“微流体设备”是这样的装置：其包括一个或多个分离的微流体管路，所述微流体管路被配置为容纳流体，每个微流体管路包括流体互连的管路元件，包括但不限于区域、流动路径、通道、腔室和/或坞；以及至少一个端口，所述端口被配置为允许流体(以及任选地悬浮在流体中的微物体)流入和/或流出微流体装置。通常，微流体装置的微流体管路将包括流动路径(该流动路径可以包括微流体通道)和至少一个腔室，并且将容纳小于约1mL(例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2μL)的流体体积。在某些实施方案中，微流体管路容纳约1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300μL。微流体管路可以被配置为具有与微流体装置中的第一端口(例如，入口)流体连接的第一端和与微流体装置中的第二端口(例如，出口)流体连接的第二端。

如本文所用，“纳米流体装置”或“纳米流体设备”是一种具有微流体管路的微流体装置，所述微流体管路含有至少一个管路元件，所述管路元件被配置为容纳小于约1μL的流体体积，例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1nL或更少。纳米流体装置可以包括多个管路元件(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多)。在某些实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳约100pL至1nL、100pL至2nL、100pL至5nL、250pL至2nL、250pL至5nL、250pL至10nL、500pL至5nL、500pL至10nL、500pL至15nL、750pL至10nL、750pL至15nL、750pL至20nL、1至10nL、1至15nL、1至20nL、1至25nL或1至50nL的流体体积。在其他实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳约20nL至200nL、100至200nL、100至300nL、100至400nL、100至500nL、200至300nL、200至400nL、200至500nL、200至600nL、200至700nL、250至400nL、250至500nL、250至600nL、或250至750nL的流体体积。

如本文所用的“微流体通道”或“流动通道”是指微流体装置的流动路径，其长度显著长于水平和垂直尺寸。例如，流动通道可以是水平或垂直尺寸的长度的至少5倍，例如，长度的至少10倍、长度的至少25倍、长度的至少100倍、长度的至少200倍、长度的至少500倍、长度的至少1,000倍、长度的至少5,000倍，或更长。在一些实施方案中，流动通道的长度在约100,000微米至约500,000微米的范围内，包括其间的任何范围。在一些实施方案中，水平尺寸在约100微米至约1000微米(例如，约150至约500微米)的范围内，并且垂直尺寸在约25微米至约200微米的范围内，例如，约40到约150微米。应当注意，流动通道可以在微流体装置中具有各种不同的空间配置，因此不限于完美线性的元件。例如，流动通道可以是或包括具有以下配置的一个或多个部分：曲线、弯曲、螺旋、倾斜、下降，叉状(例如，多个不同的流动路径)，及其任何组合。另外，流动通道沿其路径可以具有不同的横截面积，加宽和收缩以在其中提供所需的流体流动。流动通道可以包括阀，并且阀可以是微流体领域中已知的任何类型。包括阀的微流体通道的实例公开在美国专利6,408,878和9,227,200中，其每一篇均通过引用整体并入本文。

如本文所用，术语“障碍物”通常是指凸起或类似类型的结构，其足够大以便部分地(但不完全地)阻碍目标微物体在微流体装置中的两个不同区域或管路元件之间的移动。两个不同的区域/管路元件可以是例如微流体隔离坞的连接区域和分离区域。

如本文所用，术语“收缩”通常是指微流体装置中的管路元件(或两个管路元件之间的界面)的宽度变窄。收缩可以位于例如本公开的微流体隔离坞的分离区域和连接区域之间的界面处。

如本文所用，术语“透明”是指允许可见光通过而在通过时基本上不改变光的材料。

如本文所用，术语“微物体”通常是指可以根据本公开分离和/或处理的任何微观物体。微物体的非限制性实例包括：无生命的微物体，例如微粒；微珠(例如，聚苯乙烯珠、Luminex^TM珠等)；磁珠；微米棒；微丝；量子点等；生物微物体，例如细胞；生物细胞器；囊泡或复合物；合成囊泡；脂质体(例如，合成的或衍生自膜制品)；脂质纳米筏(nanoraft)等；或无生命微物体和生物微物体的组合(例如，附接于细胞的微珠、脂质体涂覆的微珠、脂质体涂覆的磁珠等)。珠子可以包括共价或非共价附接的部分/分子，例如荧光标志物、蛋白质、碳水化合物、抗原、小分子信号传导部分或能够用于测定的其他化学/生物物质。脂质纳米筏已经被描述在例如Ritchie等人(2009)“Reconstitution of Membrane Proteins inPhospholipid Bilayer Nanodiscs,”Methods Enzymol.,464:211-231中。

如本文所用，术语“细胞”可以与术语“生物细胞”互换使用。“生物细胞的非限制性实例包括真核细胞；植物细胞；动物细胞，例如哺乳动物细胞、爬行动物细胞、禽类细胞、鱼细胞等；原核细胞；细菌细胞；真菌细胞；原生动物细胞等；从组织(例如肌肉、软骨、脂肪、皮肤、肝脏、肺、神经组织等)解离的细胞；免疫细胞，例如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等；胚胎(例如，受精卵)；卵母细胞；卵子；精子细胞；杂交瘤；培养的细胞；来自细胞系的细胞；癌细胞；感染的细胞；转染和/或转化的细胞；报告细胞等。哺乳动物细胞可以是例如人、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、牛、灵长类动物等。

如果集落中能够繁殖的所有活细胞是衍生自单亲细胞的子细胞，则生物细胞的集落是“克隆的”。在某些实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单亲细胞不超过10次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单亲细胞不超过14次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均来自单亲细胞不超过17次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单亲细胞不超过20次分裂。术语“克隆细胞”是指同一克隆集落的细胞。

如本文所用，生物细胞的“集落”是指2个或更多个细胞(例如约2至约20、约4至约40、约6至约60、约8至约80、约10至约100、约20至约200、约40至约400、约60至约600、约80至约800、约100至约1000或大于1000个细胞)。

如本文所用，术语“维持(一个或多个)细胞”是指提供包含流体和气体组分以及任选的表面的环境，其提供保持细胞存活和/或扩增所必需的条件。

如本文所用，术语“扩增”在提及细胞时指的是细胞数目的增加。

流体介质的“组分”是介质中存在的任何化学或生物化学分子，包括溶剂分子、离子、小分子、抗生素、核苷酸和核苷、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、脂质、脂肪酸、胆固醇、代谢物等。

如本文所用，“捕获部分”是为微物体提供识别位点的化学或生物物质、功能或基序。所选类型的微物体可以识别原位产生的捕获部分，并且可以与原位产生的捕获部分结合或与其具有亲和力。非限制性实例包括抗原、抗体和细胞表面结合基序。

如本文所用，“可流动聚合物”是可溶于或可分散于流体介质中的聚合物单体或大分子单体(例如，预聚物溶液)。可流动聚合物可以被输入到微流体流动路径中，在其中它可以与其中的流体介质的其他组分一起流动。

如本文所用，“光引发聚合物”是指这样的聚合物(或可用于产生聚合物的单体分子)：其在暴露于光时能够共价交联，形成特定的共价键，改变固定化化学基序周围的区域选择性化学，或者形成导致物理状态变化的离子对，从而形成聚合物网络。在一些情况下，光引发聚合物可以包括这样的聚合物区段：其与一个或多个能够共价交联的化学部分结合，形成特定的共价键，改变固定化化学基序周围的区域选择性化学，或形成导致物理状态变化的离子对。在一些情况下，光引发聚合物可能需要可光活化的自由基引发剂以引发聚合物网络的形成(例如，通过聚合物的聚合)。

如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)，且包括多克隆和单克隆抗体两者；灵长类化的(primatized)(例如，人化的)；鼠类；小鼠-人；小鼠-灵长类；和嵌合的；并且可以是完整分子、其片段(例如scFv、Fv、Fd、Fab、Fab'和F(ab)'2片段)或者完整分子和/或片段的多聚体或聚集体；并且可以天然存在或者例如通过免疫、合成或基因工程产生。如本文所用，“抗体片段”是指衍生自抗体或与抗体相关的片段，其与抗原结合并且在一些实施方案中可以被衍生化以表现出通过例如掺入半乳糖残留物而促进清除和摄取的结构特征。这包括例如F(ab)、F(ab)'2、scFv、轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)及其组合。

如本文关于流体介质所用，“扩散(diffuse)”和“扩散(diffusion)”是指流体介质的组分沿着浓度梯度向下的热力学运动。

短语“介质的流动”意味着流体介质主要是由于除扩散之外的任何机制的整体移动。例如，介质的流动可以包括流体介质由于点之间的压力差而从一个点移动到另一个点。这样的流动可以包括液体的连续、脉冲、周期性、随机、间歇或往复流动，或其任何组合。当一种流体介质流入另一种流体介质时，可能导致介质的湍流和混合。

短语“基本上没有流动”是指流体介质的流速，其随时间平均小于材料的组分(例如，感兴趣的分析物)扩散到流体介质中或在流体介质内扩散的速率。这样的材料的组分的扩散速率可以取决于例如温度、组分的尺寸以及组分和流体介质之间的相互作用的强度。

如本文关于微流体装置内的不同区域所用，短语“流体连接”是指当不同区域基本上充满流体(例如流体介质)时，每个区域中的流体被连接以形成单一的液体。这并不意味着不同区域中的流体(或流体介质)在组成上必然相同。相反，微流体装置的不同流体连接的区域中的流体可以具有不同的组成(例如，不同浓度的溶质，例如蛋白质、碳水化合物、离子或其他分子)，当溶质沿着其各自的浓度梯度向下移动和/或流体流过微流体装置时，这些组成处于变化中。

如本文所用，“流动路径”或“流动区域”是指一个或多个流体连接的管路元件(例如，通道、区域、腔室等)，其限定介质流动的轨迹并受介质流动的轨迹影响。因此，流动路径是微流体装置的扫描(swept)区域的示例。其他管路元件(例如，未扫描(unswept)区域)可以与包括流动路径的管路元件流体连接，而不受流动路径中的介质流动的影响。

如本文所用，“分离微物体”将微物体限制在微流体装置内的限定区域。微物体可能仍然能够在原位产生的捕获结构内运动。

微流体(或纳米流体)装置可以包括“扫描”区域和“未扫描”区域。如本文所用，“扫描”区域包括微流体管路的一个或多个流体互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件经历介质的流。扫描区域的管路元件可以包括例如区域、通道以及全部或部分腔室。如本文所用，“未扫描”区域包括微流体管路的一个或多个流体互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件基本上不经历流体的流动。未扫描区域可以流体连接到扫描区域，条件是流体连接被构造成在扫描区域和未扫描区域之间能够实现扩散但基本上没有介质流动。因此，微流体装置可以被构造成基本上将未扫描区域与扫描区域中的介质流分离，同时在扫描区域和未扫描区域之间基本上仅能够实现扩散性流体连通。例如，微流体装置的流动通道是扫描区域的示例，而微流体装置的分离区域(下文进一步详细描述)是未扫描区域的示例。

如本文所用，“富集”意指相对于其他组分(例如其他细胞类型)增加组合物或群中的组分(例如感兴趣的细胞类型)的浓度。富集可以是降低组合物或群中其他组分(例如，其他细胞类型)的浓度的结果。例如，如本文所用，样品中T淋巴细胞的某些亚群的“富集”意指增加亚群相对于样品中细胞总数的比例。

如本文所用，“耗尽”是指相对于其他组分(例如一种或多种所需的细胞类型)降低组合物或群中组分(例如不需要的细胞类型)的浓度。耗尽可以是增加一种或多种其他组分的浓度的结果。例如，如本文所用，“耗尽”样品中T淋巴细胞的某些亚群意味着减少亚群相对于样品中细胞总数的比例。

可以在这种微流体装置中测定生物微物体(例如，生物细胞)产生特定生物材料(例如，蛋白质，例如抗体)的能力。在测定的一个特定实施方案中，可以将包含待测定用于产生感兴趣的分析物的生物微物体(例如，细胞)的样品材料加载到微流体装置的扫描区域中。可以选择具有特定特征的那些生物微物体(例如，哺乳动物细胞，例如人细胞)并将其置于未扫描区域中。然后，可以使剩余的样品材料从扫描区域流出，并使测定材料流入到扫描区域中。因为所选择的生物微物体处于未扫描区域中，所以所选择的生物微物体基本上不受剩余样品材料的流出或测定材料的流入的影响。可以允许所选择的生物微物体产生感兴趣的分析物，其可以从未扫描区域扩散到扫描区域中，在其中感兴趣的分析物可以与测定材料反应以产生局部的可检测的反应，每个反应可以与特定的未扫描区域相关联。可以分析与检测到的反应相关的任何未扫描区域，以确定未扫描区域中的哪些生物微物体(如果有的话)是足够的感兴趣的分析物的生产者。

在微流体/纳米流体装置中培养、选择和扩增T淋巴细胞。可以在本文所述的微流体和纳米流体装置中培养、选择和扩增T淋巴细胞。除了本节中的讨论之外，培养、选择和扩增的方法描述于发明内容(上文)、实施例(下文)和所附权利要求中。示例性工作流程在图8A-8C中示出。在本文公开的微流体装置中扩增生物细胞(包括T细胞)的方法也已经被描述在2016年4月22日提交的美国专利申请号15/135,707中，其全部内容通过引用并入本文。

可以通过已知方法获得T淋巴细胞的群。在一些实施方案中，从血液样品(例如全血样品)中分离包含T淋巴细胞的外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，从实体瘤样品(例如，细针抽吸物或活组织检查样本)中分离T淋巴细胞。分离的T淋巴细胞群可以富集所需的细胞类型或耗尽不需要的细胞类型。富集和消耗可以使用例如流式细胞术、T细胞富集柱、抗体连接的珠子(例如，磁珠)等来进行，并且可以使用阳性或阴性选择，例如分别从群中分离所需的细胞或从群中去除不需要的细胞。例如，与CD45RO抗体连接的磁珠可以用于从群中耗尽CD45RO⁺细胞。作为另一实例，与CD45RA抗体连接的磁珠可以用于从群中耗尽CD45RA⁺细胞。

在一些实施方案中，T淋巴细胞富含CD3⁺ T淋巴细胞。在一些实施方案中，一个或多个T淋巴细胞来自从外周血样品或实体瘤样品中分离的CD3⁺ T淋巴细胞群。在一些实施方案中，T淋巴细胞富含CD3⁺CD4⁺细胞(例如，辅助T细胞)。在一些实施方案中，T淋巴细胞富含CD3⁺CD8⁺细胞(例如，细胞毒性T细胞)。在一些实施方案中，T淋巴细胞富含CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺细胞这两者。在一些实施方案中，T淋巴细胞富含CCR7⁺细胞，例如CD3⁺CCR7⁺、CD3⁺CD4⁺CCR7⁺或CD3⁺CD8⁺CCR7⁺细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞富含CD45RA⁺细胞，例如CD3⁺CD45RA⁺、CD3⁺CD4⁺CD45RA⁺或CD3⁺CD8⁺CD45RA⁺细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞富含CD45RO⁺细胞，例如CD3⁺CD45RO⁺、CD3⁺CD4⁺CD45RO⁺或CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺细胞。

在一些实施方案中，T淋巴细胞被耗尽CD45RO⁺、CD45RO⁺CCR7⁺、CD45RO⁺CD62L⁺或CD45RO⁺CCR7⁺CD62L⁺细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞被耗尽CD45RA⁺、CD45RA⁺CCR7⁺、CD45RA⁺CD62L⁺或CD45RA⁺CCR7⁺CD62L⁺细胞。

可替代地或除了上文所述的富集或消耗之外，还可以基于所需或不需要的标志物的存在或不存在来选择微流体装置中的T淋巴细胞。介电电泳可以用于将位于微流体通道中的T淋巴细胞移动到隔离坞中。例如，可以选择T淋巴细胞，至少部分地用于放置在微流体装置的隔离坞中，因为细胞表面是CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺或其任何组合，例如，CD3⁺CD4⁺或CD3⁺CD8⁺。选择可以包括用抗体(例如，荧光抗体)标记并将与抗体相关的T淋巴细胞移动到隔离坞中。

在一些实施方案中，可以选择T淋巴细胞，至少部分地用于放置在微流体装置的隔离坞中，因为细胞表面是CD45RA⁺、CCR7⁺和/或CD62L⁺，或两者。CD45RA⁺被认为是初始T淋巴细胞(

细胞)的标志物，而CCR7⁺和CD62L⁺被认为是符合

状态的标志物(取决于是否也存在CD45RA⁺)。在一些实施方案中，选择T淋巴细胞，至少部分地用于放置在微流体装置的隔离坞中，因为细胞表面缺少至少一个不符合

状态的标志物。例如，可以选择T淋巴细胞，其缺失CD45RO⁺、PD-1⁺、PD-L1⁺、CD137⁺或CD69⁺细胞表面，或其任何组合。在一些实施方案中，还选择T淋巴细胞，其具有CD4⁺细胞表面。在一些实施方案中，还选择T淋巴细胞，其具有CD8⁺细胞表面。

在一些实施方案中，可以选择T淋巴细胞，至少部分地用于放置在微流体装置的隔离坞中，因为细胞表面是CD45RO⁺、CCR7⁺和/或CD62L⁺，或两者。CD45RO⁺与CCR7⁺和/或CD62L⁺标志物的组合被认为符合记忆T淋巴细胞(例如T_CM细胞)。在一些实施方案中，选择T淋巴细胞，至少部分地用于放置在微流体装置的隔离坞中，因为细胞表面缺少至少一种不符合记忆T淋巴细胞状态的标志物。例如，可以选择T淋巴细胞，其缺失CD45RA⁺、PD-1⁺、PD-L1⁺、CD137⁺或CD69⁺细胞表面，或其任何组合。在一些实施方案中，还选择T淋巴细胞，其具有CD4⁺细胞表面。在一些实施方案中，还选择T淋巴细胞，其具有CD8⁺细胞表面。

在一些实施方案中，可以选择T淋巴细胞，至少部分地用于放置在微流体装置的隔离坞中，因为细胞表面是CD45RO⁺、PD-1⁺和/或PD-L1⁺、CD137⁺，或其组合。CD45RO连同PD-1、PD-L1和/或CD137标志物的存在被认为符合效应T淋巴细胞(T_EFF细胞)。在一些实施方案中，至少部分地选择T淋巴细胞，用于放置在微流体装置的隔离坞中，因为细胞表面缺少至少一个不符合T_EFF状态的标志物。例如，T淋巴细胞可以用CD45RA、CCR7、CD62L的抗体或其任何组合标记，并且可以将与CD45RA、CCR7、CD62L的抗体或其组合不相关的T淋巴细胞移动(例如，使用介电电泳)到微流体装置的隔离坞中(例如，从微流体通道)。

在一些实施方案中，选择T淋巴细胞，至少部分地用于放置在微流体装置的隔离坞中，因为细胞表面缺少至少一种、至少两种或至少三种不符合

的标志物。在一些实施方案中，选择T淋巴细胞，至少部分地用于放置在微流体装置的隔离坞中，因为细胞表面缺少至少一种、至少两种或至少三种不符合记忆T淋巴细胞(例如，T_CM或T_EM)状态的标志物。在一些实施方案中，选择T淋巴细胞，至少部分地用于放置在微流体装置的隔离坞中，因为细胞表面缺少至少一种、至少两种或至少三种不符合T_EFF状态的标记物。

因此，本文公开的方法可以包括将T淋巴细胞移动到隔离坞中，其是CD3⁺CD45RA⁺CCR7⁺CD62L⁺CD45RO^-中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或全部，例如，CD3⁺CD45RA⁺CCR7⁺CD62L⁺；CD3⁺CD45RA⁺CCR7⁺CD45RO^-；CD3⁺CD45RA⁺CD62L⁺CD45RO^-；CD45RA⁺CCR7⁺CD62L⁺CD45RO^-；CD3⁺CCR7⁺CD62L⁺CD45RO^-；CD3⁺CD45RA⁺CCR7⁺；CD3⁺CD45RA⁺CD62L⁺；CD45RA⁺CCR7⁺CD62L⁺；CD3⁺CCR7⁺CD45RO^-、CD3⁺CD62L⁺CD45RO^-、CCR7⁺CD62L⁺CD45RO^-、CD45RA⁺CCR7⁺；CD45RA⁺CD62L⁺；CCR7⁺CD45RO^-；CD62L⁺CD45RO^-。任何前述类型的T淋巴细胞可以另外为CD4⁺或CD8⁺和/或CD69^-PD-1^-PD-L1^-CD137^-中的至少一种、两种、三种或全部，例如，CD69^-PD-L1^-PD-1^-、CD69^-PD-1^-CD137^-、CD69^-PD-L1^-CD137^-、PD-1^-PD-L1^-CD137^-、CD69^-PD-1^-、CD69^-PD-L1^-、CD69^-CD137^-、PD-1^-PD-L1^-、PD-1^-CD137^-、PD-L1^-CD137^-、CD69^-、PD-1^-、PD-L1^-或CD137^-。

本文公开的方法可以包括将T淋巴细胞移动到隔离坞中，其是CD3⁺CD45RA^-CCR7⁺CD62L⁺CD45RO⁺中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或全部，例如，CD3⁺CD45RA^-CCR7⁺CD62L⁺；CD3⁺CD45RA^-CCR7⁺CD45RO⁺；CD3⁺CD45RA^-CD62L⁺CD45RO⁺；CD3⁺CCR7⁺CD62L⁺CD45RO⁺；CD45RA^-CCR7⁺CD62L⁺CD45RO⁺；CD3⁺CD45RA^-CCR7⁺；CD3⁺CD45RA^-CD62L⁺；CD45RA^-CCR7⁺CD62L⁺；CD3⁺CCR7⁺CD45RO⁺、CD3⁺CD62L⁺CD45RO⁺、CCR7⁺CD62L⁺CD45RO⁺、CD45RA^-CCR7⁺；CD45RA^-CD62L⁺；CCR7⁺CD45RO⁺；CD62L⁺CD45RO⁺。任何前述类型的T淋巴细胞还可以是CD4⁺或CD8⁺和/或CD69^-PD-1^-PD-L1^-CD137^-中的至少一种、两种、三种或全部，例如，CD69^-PD-L1^-PD-1^-、CD69^-PD-1^-CD137^-、CD69^-PD-L1^-CD137^-、PD-1^-PD-L1^-CD137^-、CD69^-PD-1^-、CD69^-PD-L1^-、CD69^-CD137^-、PD-1^-PD-L1^-、PD-1^-CD137^-、PD-L1^-CD137^-、CD69^-、PD-1^-、PD-L1^-或CD137^-。

本文公开的方法可以包括将T淋巴细胞移动到隔离坞中，其是CD3⁺CD45RA^-PD-1⁺CD137⁺CD45RO⁺的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或全部，例如，CD3⁺CD45RA^-PD-1⁺CD137⁺；CD3⁺CD45RA^-PD-1⁺CD45RO⁺；CD3⁺CD45RA^-CD137⁺CD45RO⁺；CD3⁺PD-1⁺CD137⁺CD45RO⁺；CD45RA^-PD-1⁺CD137⁺CD45RO⁺；CD3⁺CD45RA^-PD-1⁺；CD3⁺CD45RA^-CD137⁺；CD3⁺PD-1⁺CD137⁺；CD45RA^-PD-1⁺CD137⁺；CD3⁺CD45RA^-CD45RO⁺；CD3⁺PD-1⁺CD45RO⁺；CD45RA^-PD-1⁺CD45RO⁺；CD3⁺CD137⁺CD45RO⁺；CD45RA^-CD137⁺CD45RO⁺；PD-1⁺CD137⁺CD45RO⁺；CD45RA^-PD-1⁺；CD45RA^-CD137⁺；CD137⁺CD45RO⁺；或PD-1⁺CD45RO⁺。任何前述类型的T淋巴细胞还可以是CD4⁺或CD8⁺和/或CD69⁺PD-L1⁺CCR7^-CD62L^-中的至少一种、两种、三种或全部，例如，CD69⁺PD-L1⁺CCR7^-；CD69⁺PD-L1⁺CD62L^-；CD69⁺CCR7^-CD62L^-；PD-L1⁺CCR7^-CD62L^-；CD69⁺PD-L1⁺；CD69⁺CCR7^-；PD-L1⁺CCR7^-；CD69⁺CD62L^-；PD-L1⁺CD62L^-；CCR7^-CD62L^-；CD69⁺；PD-L1⁺；CCR7^-；或CD62L^-。

本文公开的方法可以包括将T淋巴细胞引入到微流体装置的隔离坞中，例如通过介电电泳、通过重力(例如倾斜微流体装置，使得重力将一个或多个T淋巴细胞拉到隔离坞中)、通过离心力或通过局部流动。

在一些实施方案中，该方法包括使一个或多个T淋巴细胞与活化剂接触。这样的接触可以例如在将T淋巴细胞引入到微流体装置中之前发生，例如在引入到装置中之前接触至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时，或者接触0.5至2、2至4、4至6、6至8或8至10小时的时间。可以将活化剂与T淋巴细胞一起引入到隔离坞中。替代地或另外地，当T淋巴细胞在隔离坞中时，可发生接触(例如，添加活化剂)。在一些实施方案中，使用抗CD3抗体或激动剂来接触淋巴细胞。在一些实施方案中，使用抗CD28抗体或激动剂来接触淋巴细胞，例如与抗CD3抗体或激动剂组合。活化剂可以以可溶形式提供或附接在珠子上。例如，具有附接的抗CD3抗体或激动剂的珠子可以与可溶性抗CD28抗体或激动剂组合使用。或者，可以使用抗CD3抗体或激动剂和抗CD28抗体或激动剂，其中两者都附接到珠子上(例如，两种抗体可以附接于相同的珠子，或者一些珠子可以附接于抗CD3抗体而其他珠子可以附接于抗CD28抗体)。在一些实施方案中，至少一种活化剂(例如，抗体)附接于隔离坞的表面，例如抗CD3抗体，使得当T淋巴细胞在坞中时发生刺激。在一些实施方案中，抗CD3抗体和抗CD28抗体都附接于隔离坞的表面。在一些实施方案中，抗-CD3抗体附接于隔离坞的表面，并且当在隔离坞中时，至少一个T淋巴细胞也与可溶性抗CD28抗体接触。通常，当用作活化剂时，抗CD3和抗CD28抗体将是激动剂抗体。

在一些实施方案中，响应于被活化剂接触而经历扩增的分离的T淋巴细胞表现出至少100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍扩增或更多。

在一些实施方案中，用树突细胞(例如自体同源树突细胞)来刺激T淋巴细胞。在一些实施方案中，树突细胞由一种或多种抗原(例如，癌症衍生的肽，例如从与T淋巴细胞自体同源的癌细胞分离的抗原或肽)加载(例如，脉冲)。参见例如下文的实施例3。树突细胞也可以与T淋巴细胞自体同源。或者，树突细胞可以用合成抗原加载(例如，脉冲)。

在一些实施方案中，用抗原刺激T淋巴细胞，所述抗原可以与MHC分子结合以形成肽-MHC复合物。肽-MHC复合物可以以MHC四聚体结构的方式连接在一起。抗原(或抗原复合物)可以附接于固体支持物，例如一个或多个珠子。或者，固体支持物可以是隔离坞的至少一个表面，并且抗原可以与至少一个表面共价结合或非共价结合(例如，通过生物素-链霉亲和素结合相互作用)。

在一些实施方案中，通过微流体装置的微流体通道灌注培养基。灌注可以是间歇性的，例如，在包含具有不同灌注速率的两个或三个阶段的循环中。在一些实施方案中，灌注包括灌注速率为约0.002-0.1μl/sec的第一阶段和灌注为约0.5-10μl/sec的第二阶段的一个或多个循环。该循环可以进一步包括第三阶段，例如，其中灌注的速率小于约0.01μl/sec，例如基本上停止。在较高灌注速率下的阶段的长度可以是例如约1-10分钟，例如1-2分钟。在较低灌注速率下的阶段的长度可以是例如约0.5分钟至约3小时，例如约1分钟至约2小时。当存在时，灌注速率小于约0.01μl/sec的阶段的长度可以是例如约2-30或2-20分钟，或约5-10分钟。培养基可以通过微流体装置的流动路径灌注至少24、48、72、96、120或更多小时的时间，或0.5至10天的时间长度，例如0.5至1、1至2、2至3、3至4、4至5、5至7、6至8、7至9或8至10天。

在一些实施方案中，培养基补充有细胞因子，例如IL7、IL15、IL21或其组合，例如IL15和IL21。在一些实施方案中，培养基包含IL2。灌注(其可以包括在将培养基引入到隔离坞中的主动灌注之后的孵育期)可以持续达一段时间足以使一个或多个T淋巴细胞经历扩增，例如，至少一轮、两轮、三轮或更多轮的有丝细胞分裂。在一些实施方案中，培养基包含血清，例如人AB血清，其任选地与FBS或小牛血清组合。

在一些实施方案中，将20个或更少、10个或更少、6-10个、5个或更少、约5个、约4个、约3个、约2个或1个T淋巴细胞引入到微流体装置中的隔离坞中。在一些实施方案中，将20个或更少、10个或更少、6-10个、5个或更少、约5个、约4个、约3个、约2个或1个T淋巴细胞引入到微流体装置中的多个隔离坞中。

隔离坞可以包括涂层，例如，使得坞中的T淋巴细胞不与硬表面直接接触。在一些实施方案中，坞表面涂覆有葡聚糖或聚乙二醇。在一些实施方案中，隔离坞具有约5×10⁵至约5×10⁶立方微米的体积。

在一些实施方案中，监测一个或多个T淋巴细胞的增殖速率。例如，这可以在灌注期间通过观察给定的隔离坞中的细胞分裂的频率，例如通过周期性地观察坞中的细胞数目来完成。

在一些实施方案中，监测T淋巴细胞对一种或多种细胞因子(例如，INFγ、TNFα、IL2或其组合)的表达。在一些实施方案中，监测一种或多种调节性T细胞标志物(例如CTLA4)的表达。

如上文所述的监测可以例如在隔离坞中T淋巴细胞的扩增之后进行。例如，可以针对调节性T细胞标志物和/或细胞因子的表达，使用芯片上表达测定来表征扩增的T淋巴细胞样品，其已经被描述在例如美国专利申请公开号2015/0151298和2015/0165436和美国专利申请序列号15/372,094(2016年12月7日提交)中，其各自的内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，在扩增后，从微流体装置输出T淋巴细胞。在一些实施方案中，从微流体装置输出扩增的T淋巴细胞样品用于基因组概况分析，例如基因组序列分析和/或表达分析(例如，RNA-Seq)。在一些实施方案中，基于基因组概况分析结果(例如，不存在功能丧失突变、细胞因子表达等)选择T淋巴细胞用于下游用途，例如癌症治疗。在一些实施方案中，至少部分地基于具有大于或等于预定阈值的增殖速率(例如，已显示至少增殖的阈值水平，例如在小于或等于约一周的时期内经历至少100倍的扩增)来选择性地输出T淋巴细胞。替代地或另外地，选择性输出可以至少部分地基于一种或多种细胞因子(例如INFγ、TNFα、IL2或其组合)的表达。替代地或另外地，选择性输出可以至少部分地基于一种或多种调节性T细胞标志物(例如CTLA4等)的表达。

在一些实施方案中，从微流体装置输出的T淋巴细胞用于治疗癌症，例如，通过将它们引入到受试者(例如由其获得T淋巴细胞的受试者)中。受试者可以是哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。

微流体装置和用于操作和观察这种装置的系统。图1A示出了可以用于选择、激活、扩增和/或克隆T淋巴细胞的微流体装置100和系统150的实例。示出了微流体装置100的透视图，其盖110被部分切除以提供微流体装置100中的局部视图。微流体装置100通常包括具有流动路径106的微流体管路120，流体介质180可以任选地携带一个或多个微物体(未示出)经过流动路径106流入和/或流过微流体管路120。虽然在图1A中示出了单个微流体管路120，但合适的微流体装置可以包括多个(例如，2或3个)这样的微流体管路。无论如何，微流体装置100可以被配置为纳米流体装置。如图1A所示，微流体管路120可以包括多个微流体隔离坞124、126、128和130，其中每个隔离坞可以具有与流动路径106流体连通的一个或多个开口。在图1A的装置的一些实施方案中，隔离坞可以仅具有与流动路径106流体连通的单个开口。如下文进一步讨论的，微流体隔离坞包括已被优化用于即使当介质180流过流动路径106时，仍然将微物体保留在微流体装置(例如微流体装置100)中的各种特征和结构。然而，在描述上述之前，提供了对微流体装置100和系统150的简要说明。

如图1A中大体示出的，微流体管路120由外壳102来限定。尽管外壳102可以被物理地构造成不同的配置，但是在图1A所示的实例中，外壳102被描绘为包括支撑结构104(例如，基部)、微流体管路结构108和盖110。支撑结构104、微流体管路结构108和盖110可以彼此附接。例如，微流体管路结构108可以被布置在支撑结构104的内表面109上，并且盖110可以被布置在微流体管路结构108上方。微流体管路结构108与支撑结构104和盖110一起可以限定微流体管路120的元件。

如图1A所示，支撑结构104可以位于微流体管路120的底部，盖110可以位于微流体管路120的顶部。或者，支撑结构104和盖110可以以其他取向来配置。例如，支撑结构104可以位于微流体管路120的顶部，盖110可以位于微流体管路120的底部。无论如何，可以存在一个或多个端口107，每个端口107均包括进入或离开外壳102的通路。通路的实例包括阀、门、通孔等。如图所示，端口107是由微流体管路结构108中的间隙产生的通孔。然而，端口107可以位于外壳102的其他组件(例如盖110)中。图1A中仅示出了一个端口107，但微流体管路120可以具有两个或更多个端口107。例如，可以存在第一端口107，其用作流体进入微流体管路120的入口，并且可以存在第二端口107，其用作流体离开微流体管路120的出口。端口107是用作入口还是出口可以取决于流体流过流动路径106的方向。

支撑结构104可以包括一个或多个电极(未示出)和衬底或多个互连的衬底。例如，支撑结构104可以包括一个或多个半导体衬底，每个半导体衬底电连接到电极(例如，半导体衬底的全部或一部分可以电连接到单个电极)。支撑结构104可以进一步包括印刷电路板组件(“PCBA”)。例如，半导体衬底可以安装在PCBA上。

微流体管路结构108可以限定微流体管路120的管路元件。当微流体管路120填充有流体时，这样的管路元件可以包括可以流体互连的空间或区域，例如流动路径(其可以包括或者是一个或多个流动通道)、腔室、坞、阱(trap)等。在图1A所示的微流体管路120中，微流体管路结构108包括框架114和微流体管路材料116。框架114可以部分地或完全地包围微流体管路材料116。框架114可以是例如基本上包围微流体管路材料116的相对刚性的结构。例如，框架114可以包括金属材料。

微流体管路材料116可以用空腔等进行图案化，以限定微流体管路120的管路元件和互连。微流体管路材料116可以包括柔性材料，例如柔性聚合物(例如橡胶、塑料、弹性体、硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)等)，其可以是透气性的。可以构成微流体管路材料116的材料的其他实例包括模制玻璃；可蚀刻材料，例如硅氧烷(例如，可光图案化的硅氧烷或“PPS”)、光致抗蚀剂(例如，SU8)等。在一些实施方案中，此类材料(以及因此微流体管路材料116)可以是刚性的和/或基本上不透气的。无论如何，微流体管路材料116可以被布置在支撑结构104上和框架114内。

盖110可以是框架114和/或微流体管路材料116的集成(integral)部件。或者，盖110可以是结构上不同的元件，如图1A所示。盖110可以包括与框架114和/或微流体管路材料116相同或不同的材料。类似地，支撑结构104可以是与框架114或微流体管路材料116分开的结构(如图所示)，或者是框架114或微流体管路材料116的集成部件。同样地，框架114和微流体管路材料116可以是如图1A所示的分离结构或同一结构的集成部件。

在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有类似性质的材料。在一些实施方案中，盖110可以包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，例如PDMS。在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料和可变形材料两者。例如，盖110的一个或多个部分(例如，位于隔离坞124、126、128、130上方的一个或多个部分)可以包括与盖110的刚性材料交界的可变形材料。在一些实施方案中，盖110可以进一步包括一个或多个电极。该一个或多个电极可以包括导电氧化物，例如氧化铟锡(ITO)，其可以涂覆在玻璃或类似的绝缘材料上。或者，该一个或多个电极可以是柔性电极，例如嵌入在可变形材料例如聚合物(例如PDMS)中的单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合。已经在例如US 2012/0325665(Chiou等人)中描述了可以用于微流体装置中的柔性电极，其内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，可以修饰盖110(例如，通过调节向内朝向微流体管路120的表面的全部或一部分)以支持细胞粘附、活力和/或生长。该修饰可以包括合成或天然聚合物的涂层。在一些实施方案中，盖110和/或支撑结构104可以是透光的。盖110还可包括至少一种可透气的材料(例如，PDMS或PPS)。

图1A还示出了用于操作和控制微流体装置(例如微流体装置100)的系统150。系统150包括电源192、成像装置194(结合在成像模块164内，其中装置194未在图1A本身中示出)以及倾斜装置190(倾斜模块166的一部分，其中装置190未在图1A中示出)。

电源192可以向微流体装置100和/或倾斜装置190提供电力，根据需要提供偏置电压或电流。电源192可以例如包括一个或多个交流(AC)和/或直流(DC)电压或电流源。成像装置194(成像模块164的一部分，如下文所讨论的)可以包括用于捕捉微流体管路120内的图像的装置，例如数码相机。在一些情况下，成像装置194进一步包括具有快速帧速率和/或高灵敏度(例如，用于低光应用)的检测器。成像装置194还可以包括用于将刺激性辐射和/或光束引导到微流体管路120中并收集从微流体管路120(或其中包含的微物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。所发射的光束可以在可见光谱中，并且可以例如包括荧光发射。所反射的光束可以包括源自LED或诸如汞灯(例如高压汞灯)或氙弧灯的宽光谱灯的反射的发射。如关于图3B所讨论的，成像装置194可以进一步包括显微镜(或光具组)，其可以包括或不包括目镜。

系统150进一步包括倾斜装置190(倾斜模块166的一部分，如下文所讨论的)，其被配置为使微流体装置100围绕一个或多个旋转轴旋转。在一些实施方案中，倾斜装置190被配置为围绕至少一个轴来支撑和/或保持包括微流体管路120的外壳102，使得微流体装置100(以及因此微流体管路120)可以保持在水平取向(即，相对于x轴和y轴为0°)、垂直取向(即，相对于x轴和/或y轴为90°)或其间的任何取向。微流体装置100(和微流体管路120)相对于轴的取向在本文中被称为微流体装置100(和微流体管路120)的“倾斜”。例如，倾斜装置190可以使微流体装置100相对于x轴倾斜0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或其间的任何角度。水平取向(以及因此x轴和y轴)被定义为垂直于由重力限定的垂直轴。倾斜装置还可以使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴和/或y轴倾斜任何大于90°的程度，或者使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴或y轴倾斜180°，以完全反转微流体装置100(和微流体管路120)。类似地，在一些实施方案中，倾斜装置190使微流体装置100(和微流体管路120)围绕由流动路径106或微流体管路120的一些其他部分限定的旋转轴倾斜。

在一些情况下，将微流体装置100倾斜成垂直取向，使得流动路径106位于一个或多个隔离坞的上方或下方。如本文所用的术语“上方”表示流动路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上高于一个或多个隔离坞(即，在流动路径106上方的隔离坞中的物体会具有比流动路径中的物体更高的重力势能)。如本文所用的术语“下方”表示流动路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上低于一个或多个隔离坞(即，在流动路径106下方的隔离坞中的物体会具有比流动路径中的物体更低的重力势能)。

在一些情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕平行于流动路径106的轴倾斜。此外，微流体装置100可以被倾斜至小于90°的角度，使得流动路径106位于一个或多个隔离坞的上方或下方，而不是位于隔离坞的正上方或正下方。在其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕垂直于流动路径106的轴倾斜。在另外其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕既不平行也不垂直于流动路径106的轴倾斜。

系统150可以进一步包括介质源178。介质源178(例如，容器、贮液器等)可以包括多个部分或容器，每个部分或容器用于容纳不同的流体介质180。因此，介质源178可以是在微流体装置100外部并与之分离的装置，如图1A所示。或者，介质源178可以整体或部分地位于微流体装置100的外壳102内部。例如，介质源178可以包括作为微流体装置100的一部分的贮液器。

图1A还示出了描绘构成系统150的一部分并且可以与微流体装置100结合使用的控制和监测设备152的实例的简化框图。如图所示，这种控制和监视设备152的实例包括主控制器154，其包括介质模块160，用于控制介质源178；运动模块162，用于控制微流体管路120中的微物体(未示出)和/或介质(例如，介质液滴)的移动和/或选择；成像模块164，用于控制成像装置194(例如，相机、显微镜、光源或其任何组合)以捕捉图像(例如，数字图像)；以及倾斜模块166，用于控制倾斜装置190。控制设备152还可以包括其他模块168，用于控制、监测或执行关于微流体装置100的其他功能。如图所示，设备152可以进一步包括显示装置170和输入/输出设备172。

主控制器154可以包括控制模块156和数字存储器158。控制模块156可以包括例如数字处理器，该数字处理器被配置为根据被存储为存储器158中的非暂态数据或信号的机器可执行指令(例如，软件、固件、源代码等)进行操作。替代地或另外地，控制模块156可以包括硬连线数字电路和/或模拟电路。可以类似地配置介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168。因此，可以由如上文所讨论地配置的主控制器154、基质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168中的任意一个或多个来实施本文所讨论的针对微流体装置100或任何其他微流体设备所执行的功能、过程、动作、行动或过程的步骤。类似地，主控制器154、介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168可以通信地耦接，以发送和接收本文所讨论的任何功能、过程、动作、行动或步骤中使用的数据。

介质模块160控制介质源178。例如，介质模块160可以控制介质源178以将选定的流体介质180输入到外壳102中(例如，通过入口端口107)。介质模块160还可以控制从外壳102中移除介质(例如，通过出口端口(未示出))。因此，可以将一种或多种介质选择性地输入到微流体管路120中以及从其中移除。介质模块160还可以控制微流体管路120内的流动路径106中的流体介质180的流动。例如，在一些实施方案中，在倾斜模块166使倾斜装置190将微流体装置100倾斜到期望的倾斜角度之前，介质模块160停止介质180在流动路径106中和通过外壳102的流动。

运动模块162可以被配置为控制微流体管路120中的微物体(未示出)的选择、捕集和移动。如下文参考图1B和1C所讨论的，外壳102可以包括介电电泳(DEP)、光电镊子(OET)和/或光电润湿(OEW)配置(图1A中未示出)，并且运动模块162可以控制电极和/或晶体管(例如，光电晶体管)的激活，以选择和移动流动路径106和/或隔离坞124、126、128、130中的微物体(未示出)和/或介质液滴(未示出)。

成像模块164可以控制成像装置194。例如，成像模块164可以接收和处理来自成像装置194的图像数据。来自成像装置194的图像数据可以包括由成像装置194捕捉的任何类型的信息(例如，存在或不存在微物体、介质液滴、标记物(例如荧光标记物)的累积等)。使用由成像装置194捕捉的信息，成像模块164可以进一步计算微流体装置100内物体(例如，微物体、介质液滴)的位置和/或这些物体的运动速率。

倾斜模块166可以控制倾斜装置190的倾斜运动。替代地或另外地，倾斜模块166可以控制倾斜速率和时机，以优化微物体经由重力向一个或多个隔离坞的转移。倾斜模块166与成像模块164通信地耦接，以接收描述微流体管路120中的微物体和/或介质液滴的运动的数据。使用该数据，倾斜模块166可以调节微流体管路120的倾斜，以便调节微物体和/或介质液滴在微流体管路120中移动的速率。倾斜模块166还可以使用该数据来迭代地调节微流体管路120中的微物体和/或介质液滴的位置。

在图1A所示的实例中，微流体管路120被示为包括微流体通道122和隔离坞124、126、128、130。每个坞均包括通向通道122的开口，但是其他部分被包围，使得坞可以将坞内的微物体与通道122的流动路径106或其他坞中的流体介质180和/或微物体基本上分离。隔离坞的壁从底座的内表面109延伸到盖110的内表面，以提供外壳。坞到微流体通道122的开口被取向为与流体介质180的流动106成一角度，使得流106不被引导到坞中。流动可以与坞的开口的平面相切或垂直。在一些情况下，坞124、126、128、130被配置为物理地围住微流体管路120内的一个或多个微物体。根据本公开的隔离坞可以包括各种形状、表面和特征，如下文将详细讨论和示出的，其被优化为与DEP、OET、OEW、流体流动、重力和/或离心力一起使用。

微流体管路120可以包括任何数目的微流体隔离坞。尽管示出了五个隔离坞，但微流体管路120可以具有更少或更多的隔离坞。如图所示，微流体管路120的微流体隔离坞124、126、128和130各自包括不同的特征和形状，这些特征和形状可以提供用于保持、分离、测定、刺激(例如，激活)或培养生物微物体的一个或多个益处。在一些实施方案中，微流体管路120包括多个相同的微流体隔离坞。

在图1A所示的实施方案中，示出了单个通道122和流动路径106。然而，其他实施方案可以含有多个通道122，每个通道均被配置为包括流动路径106。微流体管路120进一步包括与流动路径106和流体介质180流体连通的入口阀或端口107，由此流体介质180可以经由入口端口107进入通道122。在一些情况下，流动路径106包括单个路径。在一些情况下，单个路径被布置为Z字形图案，由此流动路径106以交替的方向穿过微流体装置100两次或更多次。

在一些情况下，微流体管路120包括多个平行的通道122和流动路径106，其中每个流动路径106内的流体介质180沿相同的方向流动。在一些情况下，每个流动路径106内的流体介质沿正向或反向中的至少一个方向流动。在一些情况下，配置多个隔离坞(例如，相对于通道122)，使得隔离坞可以平行地加载目标微物体。

在一些实施方案中，微流体管路120进一步包括一个或多个微物体阱132。阱132通常形成在形成通道122的边界的壁中，并且可以与微流体隔离坞124、126、128、130中的一个或多个的开口相对地设置。在一些实施例中，阱132被配置为成从流动路径106接收或捕获单个微物体。在一些实施方案中，阱132被配置为从流动路径106接收或捕获多个微物体。在一些情况下，阱132包括大约等于单个目标微物体的体积的体积。

阱132还可以包括开口，其被配置为帮助目标微物体流入阱132。在一些情况下，阱132包括开口，该开口的高度和宽度近似地等于单个目标微物体的尺寸，由此防止更大的微物体进入微物体阱。阱132可以进一步包括被配置为帮助将目标微物体保留在阱132内的其他特征。在一些情况下，阱132相对于微流体隔离坞的开口对准并且位于通道122的相对侧上，使得当微流体装置100围绕平行于微流体通道122的轴倾斜时，被捕集的微物体按照使得微物体落入隔离坞的开口中的轨迹离开阱132。在一些情况下，阱132包括小于目标微物体的侧通道134，以便有助于穿过阱132的流，从而增加在阱132中捕获微物体的可能性。

在一些实施方案中，经由一个或多个电极(未示出)将介电电泳(DEP)力施加在流体介质180(例如，在流动路径中和/或在隔离坞中)上，以操纵、运输、分离和分类位于其中的微物体。例如，在一些实施方案中，将DEP力施加到微流体管路120的一个或多个部分，以便将单个微物体从流动路径106转移到期望的微流体隔离坞中。在一些实施方案中，使用DEP力来防止隔离坞(例如，隔离坞124、126、128或130)内的微物体从其中被替换。此外，在一些实施方案中，使用DEP力来从隔离坞中选择性地移除先前根据本公开的实施方案收集的微物体。在一些实施方案中，DEP力包括光电镊子(OET)力。

在其他实施方案中，通过一个或多个电极(未示出)将光电润湿(OEW)力施加到微流体装置100的支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置(例如，有助于限定流动路径和/或多个隔离坞的位置)，以操纵、运输、分离和分类位于微流体管路120中的液滴。例如，在一些实施方案中，将OEW力施加到支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置，以将单个液滴从流动路径106转移到期望的微流体隔离坞中。在一些实施方案中，使用OEW力来防止隔离坞(例如，隔离坞124、126、128或130)内的液滴从其中被替换。此外，在一些实施方案中，使用OEW力来从隔离坞中选择性地去除先前根据本公开的实施方案收集的液滴。

在一些实施方案中，将DEP和/或OEW力与其他力(例如流动和/或重力)组合，以便操纵、运输、分离和分类微流体管路120内的微物体和/或液滴。例如，可以将外壳102倾斜(例如，通过倾斜装置190)，以将流动路径106和位于其中的微物体定位在微流体隔离坞的上方，并且重力可以将微物体和/或液滴运输到坞中。在一些实施方案中，可以在施加其他力之前施加DEP和/或OEW力。在其他实施方案中，可以在施加其他力之后施加DEP和/或OEW力。在其他情况下，可以在施加其他力的同时或者以与其他力交替的方式施加DEP和/或OEW力。

图1B、1C和2A-2H示出了可以用于实施本公开的实施方案的微流体装置的各种实施方案。图1B描述了其中微流体装置200被配置为光致动的电动力学装置的实施方案。本领域已知多种光致动的电动力学装置，包括具有光电镊子(OET)配置的装置和具有光电润湿(OEW)配置的装置。在以下美国专利文献中示出了合适的OET配置的实例，其均通过引用整体并入本文：美国专利号RE 44,711(Wu等人)(最初以美国专利号7,612,355颁发)；和美国专利号7,956,339(Ohta等人)。美国专利号6,958,132(Chiou等人)和美国专利申请公开号2012/0024708(Chiou等人)中示出了OEW配置的实例，上述两者都通过引用整体并入本文。光致动的电动力学装置的另一个实例包括组合的OET/OEW配置，在美国专利公开号20150306598(Khandros等人)和20150306599(Khandros等人)以及其对应的PCT公开WO2015/164846和WO2015/164847中示出其实例，其均通过引用整体并入本文。

已经在例如US 2014/0116881(申请号14/060,117，2013年10月22日提交)、US2015/0151298(申请号14/520,568，2014年10月22日提交)和US 2015/0165436(申请号14/521,447，2014年10月22日提交)中描述了具有坞的微流体装置的实例，其中可以放置、培养和/或监测生物微物体，这些申请中的每一个都通过引用整体并入本文。美国申请号14/520,568和14/521,447也描述了分析在微流体装置中培养的细胞的分泌的示例性方法。前述申请中的每一个进一步描述了微流体装置，其被配置为产生介电电泳(DEP)力，例如光电镊子(OET)，或被配置为提供光电润湿(OEW)。例如，US 2014/0116881的图2中所示的光电镊子装置是可以在本公开的实施方案中用于选择和移动单个生物微物体或一组生物微物体的装置的实例。

微流体装置运动配置。如上文所述，系统的控制和监测设备可以包括运动模块，用于选择和移动微流体装置的微流体管路中的物体，例如微物体或液滴。微流体装置可以具有各种运动配置，这取决于被移动物体的类型和其他考虑因素。例如，可以使用介电电泳(DEP)配置来选择和移动微流体管路中的微物体。因此，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括DEP配置，其用于在微流体管路120中的流体介质180中的微物体上选择性地诱导DEP力，从而选择、捕获和/或移动单个微物体或微物体组。或者，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括电润湿(EW)配置，其用于在微流体管路120中的流体介质180中的液滴上选择性地诱导EW力，从而选择、捕获和/或移动单个液滴或液滴组。

图1B和1C中示出了包含DEP配置的微流体装置200的一个实例。虽然为了简化的目的，图1B和1C分别示出了具有区域/腔室202的微流体装置200的外壳102的一部分的侧截面图和顶截面图，但应当理解，区域/腔室202可以是具有更详细结构的流体管路元件的一部分，例如生长室、隔离坞、流动路径或流动通道。此外，微流体装置200可以包括其他流体管路元件。例如，微流体装置200可以包括多个生长室或隔离坞和/或一个或多个流动区域或流动通道，例如本文关于微流体装置100所描述的那些。DEP配置可以被结合到微流体装置200的任何这种流体管路元件中，或者其选择的部分中。还应当理解，上文或下文描述的微流体装置组件和系统组件中的任一个可以被结合到微流体装置200中和/或与微流体装置200组合使用。例如，上述包括控制和监测设备152的系统150可以与微流体装置200一起使用，该微流体装置200包括介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和其他模块168中的一个或多个。

如图1B所示，微流体装置200包括具有底部电极204和覆盖底部电极204的电极活化衬底206的支撑结构104，以及具有顶部电极210的盖110，顶部电极210与底部电极204间隔开。顶部电极210和电极活化衬底206限定区域/腔室202的相对表面。因此，包含在区域/腔室202中的介质180在顶部电极210和电极活化衬底206之间提供电阻连接(resistiveconnection)。还示出了电源212，其被配置为连接到底部电极204和顶部电极210并且在这些电极之间产生偏置电压，如在区域/腔室202中产生DEP力所需要的。电源212可以是例如交流(AC)电源。

在某些实施方案中，图1B和1C中所示的微流体装置200可以具有光致动的DEP配置。因此，改变来自光源216的光218的图案(其可以由运动模块162控制)可以选择性地激活和去激活电极活化衬底206的内表面208的区域214处的DEP电极的变化图案。(下文中，具有DEP配置的微流体装置的区域214被称为“DEP电极区域”。)如图1C所示，指向电极活化衬底206的内表面208的光图案218可以以诸如正方形的图案照亮选择的DEP电极区域214a(以白色示出)。在下文中将未被照亮的DEP电极区域214(交叉阴影线)称为“暗”DEP电极区域214。通过DEP电极活化衬底206(即，从底部电极204直到与流动路径106中的介质180相交界的电极活化衬底206的内表面208)的相对电阻抗大于在每个暗DEP电极区域214处通过区域/腔室202中的介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对电阻抗。然而，被照亮的DEP电极区域214a表现出通过电极活化衬底206的减小的相对阻抗，其小于在每个被照亮的DEP电极区域214a处通过区域/腔室202中的介质180的相对阻抗。

在电源212被激活的情况下，前述DEP配置在照射的DEP电极区域214a和相邻的暗DEP电极区域214之间的流体介质180中产生电场梯度，这又产生了吸引或排斥流体介质180中附近微物体(未示出)的局部DEP力。因此，通过改变从光源216投射到微流体装置200中的光图案218，可以在区域/腔室202的内表面208处的许多不同的此类DEP电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥流体介质180中微物体的DEP电极。DEP力是吸引还是排斥附近的微物体可以取决于诸如电源212的频率和介质180和/或微物体(未示出)的介电特性之类的参数。

图1C中所示的被照亮的DEP电极区域214a的方形图案220仅是一个实例。可以通过投射到微流体装置200中的光图案218照亮(并由此激活)DEP电极区域214的任何图案，并且可以通过改变或移动光图案218来重复地改变被照亮/激活的DEP电极区域214的图案。

在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料或由其组成。在这样的实施方案中，电极活化衬底206的内表面208可以是无特征的。例如，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅(a-Si:H)层或由其组成。a-Si:H可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-Si:H层可以具有约500nm至约2.0

的厚度。在这样的实施方案中，根据光图案218，可以在电极活化衬底206的内表面208上的任何地方以任何图案形成DEP电极区域214。因此，无需固定DEP电极区域214的数目和图案，但是可以将其对应于光图案218。已经在例如美国专利号RE 44,711(Wu等人)(最初颁布为美国专利号7,612,355)中描述了具有包括光电导层(例如上文所述的光电导层)的DEP配置的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。

在其他实施方案中，电极活化衬底206可以包括衬底，该衬底包括多个掺杂层、电绝缘层(或区域)和形成半导体集成电路的导电层，例如在半导体领域中已知的。例如，电极活化衬底206可以包括多个光电晶体管，包括例如横向双极光电晶体管，每个光电晶体管均对应于DEP电极区域214。或者，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)，其中每个这样的电极均对应于DEP电极区域214。电极活化衬底206可以包括此类光电晶体管或光电晶体管控制的电极的图案。例如，该图案可以是排列成行和列的基本上为正方形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列，如图2B所示。或者，图案可以是形成六边点格(hexagonal lattice)的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列。无论图案如何，电路元件都可以在电极活化衬底206的内表面208处的DEP电极区域214与底部电极210之间形成电连接，并且可以由光图案218选择性地激活和去激活那些电连接(即，光电晶体管或电极)。当未被激活时，每个电连接都可以具有高阻抗，使得通过电极活化衬底206的相对阻抗(即，从底部电极204到与区域/腔室202中的介质180相交界的电极活化衬底206的内表面208)大于在相应的DEP电极区214处通过介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对阻抗。然而，当被光图案218中的光激活时，通过电极活化衬底206的相对阻抗小于在每个被照亮的DEP电极区域214处通过介质180的相对阻抗，从而在相应DEP电极区域214处激活DEP电极，如上所述。因此，以光图案218所确定的方式，可以在区域/腔室202中的电极活化衬底206的内表面208处的许多不同的DEP电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥介质180中的微物体(未示出)的DEP电极。

已经在例如美国专利号7,956,339(Ohta等人)(参见例如图21和22中所示的装置300及其描述)和美国专利公开号2016/0184821(Hobbs等人)(参见例如整个附图中所示的装置200、502、504、600和700及其描述)中描述了具有包含光电晶体管的电极活化衬底的微流体装置的实例，每一个的全部内容均通过引用并入本文。已经在例如美国专利公开号2014/0124370(Short等人)(参见例如整个附图中所示的装置200、400、500、600和900及其描述)中描述了具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。

在DEP配置的微流体装置的一些实施方案中，顶部电极210是外壳102的第一壁(或盖110)的一部分，并且电极活化衬底206和底部电极204是外壳102的第二壁(或支撑结构104)的一部分。区域/腔室202可以位于第一壁和第二壁之间。在其他实施方案中，电极210是第二壁(或支撑结构104)的一部分，并且电极活化衬底206和/或电极210中的一个或两个是第一壁(或盖110)的一部分。此外，光源216可以替代地用于从下方照亮外壳102。

利用具有DEP构造的图1B-1C的微流体装置200，通过将光图案218投射到微流体装置200中，以便以围绕并捕获微物体的图案(例如，正方形图案220)来激活电极活化衬底206的内表面208的DEP电极区域214a处的第一组一个或多个DEP电极，运动模块162可以选择区域/腔室202中的介质180中的微物体(未示出)。然后，通过相对于微流体装置200移动光图案218以激活DEP电极区域214处的第二组一个或多个DEP电极，运动模块162可以移动原位产生的捕获的微物体。或者，可以相对于光图案218来移动微流体装置200。

在其他实施方案中，微流体装置200可以具有不依赖于电极活化衬底206的内表面208处的DEP电极的光激活的DEP配置。例如，电极活化衬底206可以包括位于与包括至少一个电极的表面(例如，盖110)相对的位置的选择性可寻址且可激发的电极。可以选择性地打开和闭合开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)以激活或去激活DEP电极区域214处的DEP电极，从而在激活的DEP电极附近的区域/腔室202中的微物体(未示出)上产生净DEP力。取决于诸如电源212的频率和区域/腔室202中的介质(未示出)和/或微物体的介电性质的特征，DEP力可以吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和去激活一组DEP电极(例如，在形成正方形图案220的一组DEP电极区域214处)，可以在区域/腔室202中捕获和移动区域/腔室202中的一个或多个微物体。图1A中的运动模块162可以控制这类开关，从而激活和去激活各个DEP电极，以选择、捕集和移动区域/腔室202周围的特定微物体(未示出)。具有包括选择性可寻址且可激发的电极的DEP配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经被描述在例如美国专利号6,294,063(Becker等人)和6,942,776(Medoro)中，其全部内容通过引用并入本文。

作为又一个示例，微流体装置200可以具有电润湿(EW)配置，其可以代替DEP配置，或者可以位于微流体装置200与具有DEP配置的部分分离的部分中。EW配置可以是光电润湿配置或电介质上的电润湿(EWOD)配置，两者都是本领域已知的。在一些EW配置中，支撑结构104具有夹在介电层(未示出)和底部电极204之间的电极活化衬底206。介电层可以包括疏水材料和/或可涂覆有疏水材料，如下文所述。对于具有EW配置的微流体装置200，支撑结构104的内表面208是介电层或其疏水涂层的内表面。

介电层(未示出)可以包括一个或多个氧化物层，并且可以具有约50nm至约250nm(例如，约125nm至约175nm)的厚度。在某些实施方案中，介电层可以包括氧化物层，例如金属氧化物(例如，氧化铝或氧化铪)层。在某些实施方案中，介电层可以包括除金属氧化物之外的介电材料，例如硅氧化物或氮化物。无论确切的组成和厚度如何，介电层可以具有约10kOhms至约50kOhms的阻抗。

在一些实施方案中，介电层的向内朝向区域/腔室202的表面涂覆有疏水材料。疏水材料可以包括例如氟化碳分子。氟化碳分子的实例包括全氟聚合物，例如聚四氟乙烯(例如，

)或聚(2,3-二氟亚甲基-全氟四氢呋喃)(例如，CYTOP^TM)。构成疏水材料的分子可以共价键合到介电层的表面。例如，疏水材料的分子可以借助于诸如硅氧烷基团、膦酸基团或硫醇基团的连接基团共价结合到介电层的表面。因此，在一些实施方案中，疏水材料可以包含烷基封端的硅氧烷、烷基封端的膦酸或烷基封端的硫醇。烷基可以是长链烃(例如，具有至少10个碳或至少16、18、20、22或更多个碳的链)。或者，可以使用氟化(或全氟化)碳链代替烷基。因此，例如，疏水材料可以包括氟代烷基封端的硅氧烷、氟代烷基封端的膦酸或氟代烷基封端的硫醇。在一些实施方案中，疏水涂层的厚度为约10nm至约50nm。在其他实施方案中，疏水涂层的厚度小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)。

在一些实施方案中，具有电润湿配置的微流体装置200的盖110也涂覆有疏水材料(未示出)。疏水材料可以是用于涂覆支撑结构104的介电层的相同疏水材料，并且疏水涂层可以具有与支撑结构104的介电层上的疏水涂层的厚度基本相同的厚度。此外，盖110可以包括以支撑结构104的方式夹在介电层和顶部电极210之间的电极活化衬底206。电极活化衬底206和盖110的介电层可以具有与电极活化衬底206和支撑结构104的介电层相同的组成和/或尺寸。因此，微流体装置200可以具有两个电润湿表面。

在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料，例如如上文所述的那些。因此，在某些实施方案中，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅层(a-Si:H)或由其组成。a-Si:H可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-Si:H层可以具有约500nm至约2.0

的厚度。或者，如上文所述，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)。具有光电润湿配置的微流体装置在本领域中是已知的和/或可以用本领域已知的电极活化衬底来构建。例如，美国专利号6,958,132(Chiou等人)(其全部内容通过引用并入本文)公开了具有诸如a-Si:H的光电导材料的光电润湿配置，而上文引用的美国专利公开号2014/0124370(Short等人)公开了具有由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底。

因此，微流体装置200可以具有光电润湿配置，并且光图案218可以用于激活电极活化衬底206中的光电导EW区域或光响应EW电极。电极活化衬底206的这类激活的EW区域或EW电极可以在支撑结构104的内表面208(即，覆盖介电层或其疏水涂层的内表面)处产生电润湿力。通过改变入射在电极活化衬底206上的光图案218(或相对于光源216移动微流体装置200)，可以移动与支撑结构104的内表面208接触的液滴(例如，包含水性介质、溶液或溶剂)穿过区域/腔室202中存在的不混溶流体(例如，油介质)。

在其他实施方案中，微流体装置200可以具有EWOD配置，并且电极活化衬底206可以包括不依赖于光来激活的选择性可寻址且可激发的电极。因此，电极活化衬底206可以包括这类电润湿(EW)电极的图案。例如，图案可以是排列成行和列的基本上正方形的EW电极的阵列，如图2B所示。或者，图案可以是形成六边点格的基本上六边形EW电极的阵列。无论图案如何，都可以通过电开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)选择性地激活(或去激活)EW电极。通过选择性地激活和去激活电极活化衬底206中的EW电极，可以在区域/腔室202内移动与经覆盖的介电层或其疏水涂层的内表面208接触的液滴(未示出)。图1A中的运动模块162可以控制此类开关，从而激活和去激活各个EW电极，以选择和移动区域/腔室202周围的特定液滴。具有有选择性可寻址且可激发的电极的EWOD配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经描述在例如美国专利号8,685,344(Sundarsan等人)中，其全部内容通过引用并入本文。

无论微流体装置200的配置如何，电源212可以用于提供为微流体装置200的电路供电的电势(例如，AC电压电势)。电源212可以与图1中参引的电源192相同或者是其组件。电源212可以被配置为向顶部电极210和底部电极204提供AC电压和/或电流。对于AC电压，电源212可以提供这样的频率范围和平均或峰值功率(例如，电压或电流)范围：其如上文所述，足以产生足够强的净DEP力(或电润湿力)以在区域/腔室202中捕集和移动各个微物体(未示出)，和/或还如上文所述，足以改变区域/腔室202中支撑结构104的内表面208(即，介电层和/或介电层上的疏水涂层)的润湿性质。这样的频率范围和平均或峰值功率范围在本领域中是已知的。参见，例如，美国专利号6,958,132(Chiou等人)、美国专利号RE44,711(Wu等人)(最初作为美国专利号7,612,355颁布)和美国专利申请公开号US2014/0124370(Short等人)、US2015/0306598(Khandros等人)和US2015/0306599(Khandros等人)。

隔离坞。在图2A-2C中描绘的微流体装置230内示出了一般隔离坞224、226和228的非限制性实例。每个隔离坞224、226和228可以包括分离结构232，其限定了分离区域240和将分离区域240流体连接到通道122的连接区236。连接区域236可以包括通向微流体通道122的近端开口234和通向分离区域240的远端开口238。连接区域236可以被配置为使得从微流体通道122流入隔离坞224、226、228的流体介质(未示出)的流动的最大穿透深度不延伸到分离区域240中。因此，由于连接区域236，布置在隔离坞224、226、228的分离区域240中的微物体(未示出)或其他材料(未示出)可以与微流体通道122中的介质180的流动分离且基本上不受其影响。

图2A-2C的隔离坞224、226和228各自具有单个开口，该开口直接通向微流体通道122。隔离坞的开口从微流体通道122侧向开放。电极活化衬底206在微流体通道122和隔离坞224、226和228二者的下方。隔离坞的外壳内的电极活化衬底206的上表面(形成隔离坞的底板)被设置在与微流体通道122(或者，如果不存在通道，则为流动路径)内的电极活化衬底206的上表面(形成微流体装置的流动通道(或流动路径)的底板)相同水平面上或基本相同的水平面上。电极活化衬底206可以是无特征的，或者可以具有不规则或图案化的表面，其从其最高凸起到其最低凹陷变化小于约3微米、2.5微米、2微米、1.5微米、1微米、0.9微米、0.5微米、0.4微米、0.2微米、0.1微米或更小。跨越微流体通道122(或流动路径)和隔离坞的衬底的上表面中的高度变化可以小于隔离坞的壁或微流体装置的壁的高度的约3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.5％、0.3％或0.1％。虽然详细描述了微流体装置200，但这也适用于本文所述的微流体装置100、230、250、280、290、320、400、450、500、700中的任一个。

因此，微流体通道122可以是扫描区域的示例，并且隔离坞224、226、228的分离区域240可以是未扫描区域的实例。应当注意，微流体通道122和隔离物224、226、228可以被配置为包含一种或多种流体介质180。在图2A-2B所示的实例中，端口222被连接到微流体通道122，并允许将流体介质180引入到微流体装置230中或从其中移除。在引入流体介质180之前，微流体装置可以装填有气体，如二氧化碳气体。一旦微流体装置230包含流体介质180，就可以选择性地产生和停止微流体通道122中的流体介质180的流242。例如，如图所示，端口222可以被布置在微流体通道122的不同位置处(例如，相对端)，并且可以从用作入口的一个端口222到用作出口的另一个端口222形成介质的流242。

图2C示出了根据本公开的隔离坞224的实例的详细视图。还示出了微物体246的实例。

已知的是，微流体通道122中的流体介质180的流242经过隔离坞224的近端开口234可以使介质180的二次流244进入和/或离开隔离坞224。为了将隔离坞224的分离区域240中的微物体246与二次流244分离，隔离坞224的连接区域236的长度L_con(即，从近端开口234到远端开口238)应当大于二次流244进入连接区域236的穿透深度D_p。二次流244的穿透深度D_p取决于在微流体通道122中流动的流体介质180的速度以及与微流体通道122的配置有关的各种参数以及到微流体通道122的连接区域236的近端开口234。对于给定的微流体装置，微流体通道122和开口234的配置将是固定的，而微流体通道122中的流体介质180的流242的速率将是可变的。因此，对于每个隔离坞224，可以识别通道122中的流体介质180的流242的最大速度V_max，确保二次流244的穿透深度D_p不超过连接区域236的长度L_con。只要微流体通道122中的流体介质180的流242的速率不超过最大速度V_max，所得到的二次流244就可以被限制到微流体通道122和连接区域236并且保持在分离区域240之外。因此，微流体通道122中的介质180的流242将不会将微物体246拖曳出分离区域240。相反，无论微流体通道122中的流体介质180的流242如何，位于分离区域240中的微物体246将停留在分离区域240中。

此外，只要微流体通道122中的介质180的流242的速率不超过V_max，微流体通道122中的流体介质180的流242就不会把混杂的颗粒(例如，微粒和/或纳米颗粒)从微流体通道122移动到隔离坞224的分离区域240中。因此，使连接区域236的长度L_con大于二次流244的最大穿透深度D_p可以防止一个隔离坞224被来自微流体通道122或另一个隔离坞(例如，图2D中的隔离坞226、228)的混杂的颗粒污染。

因为微流体通道122和隔离坞224、226、228的连接区域236可能受到微流体通道122中的介质180的流242的影响，所以微流体通道122和连接区域236可以被认为是微流体装置230的扫描(或流动)区域。另一方面，隔离坞224、226、228的分离区域240可以被认为是未扫描(或非流动)区域。例如，微流体通道122中的第一流体介质180中的组分(未示出)可以基本上仅通过第一介质180的组分从微流体通道122扩散通过连接区域236并进入分离区域240中的第二流体介质248中而与分离区域240中的第二流体介质248混合。类似地，分离区域240中的第二介质248的组分(未示出)可以基本上仅通过第二介质248的组分从分离区域240扩散通过连接区域236并进入微流体通道122中的第一介质180中而与微流体通道122中的第一介质180混合。在一些实施方案中，隔离坞的分离区域与流动路径之间通过扩散进行的流体介质交换的程度大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大于约99％的流体交换。第一介质180可以是与第二介质248相同的介质或不同的介质。此外，第一介质180和第二介质248可以开始相同，然后变得不同(例如，通过分离区域240中的一个或多个细胞来调节第二介质248，或者通过改变流过微流体通道122的介质180)。

如上所述，由微流体通道122中的流体介质180的流242引起的二次流244的最大穿透深度D_p可以取决于多个参数。这些参数的实例包括：微流体通道122的形状(例如，微流体通道可以将介质引导到连接区域236中，将介质从连接区域236转移，或者沿着基本上垂直于通向微流体通道122的连接区域236的近端开口234的方向引导介质)；微流体通道122在近端开口234处的宽度W_ch(或横截面积)；和连接区域236在近端开口234处的宽度W_con(或横截面积)；微流体通道122中的流体介质180的流242的速度V；第一介质180和/或第二介质248的粘度，等等。

在一些实施方案中，微流体通道122和隔离坞224、226、228的尺寸可以相对于微流体通道122中的流体介质180的流242的向量如下定向：微流体通道宽度W_ch(或微流体通道122的横截面积)可以基本上垂直于介质180的流242；连接区域236在开口234处的宽度W_con(或横截面积)可以基本上平行于微流体通道122中的介质180的流242；和/或连接区域的长度L_con可以基本上垂直于微流体通道122中的介质180的流242。前述仅是示例，并且微流体通道122和隔离坞224、226、228的相对位置可以相对于彼此为其他取向。

如图2C所示，连接区域236的宽度W_con从近端开口234到远端开口238可以是均匀的。因此，连接区域236在远端开口238处的宽度W_con可以在本文中为连接区域236在近端开口234处的宽度W_con所标识的任何范围内。或者，连接区域236在远端开口238处的宽度W_con可以大于连接区域236在近端开口234处的宽度W_con。

如图2C所示，分离区域240在远端开口238处的宽度可以与连接区域236在近端开口234处的宽度W_con基本上相同。因此，分离区域240在远端开口238处的宽度可以在本文中为连接区域236在近端开口234处的宽度W_con所标识的任何范围内。或者，分离区域240在远端开口238处的宽度可以大于或小于连接区域236在近端开口234处的宽度W_con。此外，远端开口238可以小于近端开口234，并且连接区域236的宽度W_con可以在近端开口234和远端开口238之间变窄。例如，使用各种不同的几何形状(例如，斜切连接区域、使连接区域成斜面)，连接区域236可以在近端开口和远端开口之间变窄。此外，连接区域236的任何部分或子部分可以变窄(例如，连接区域与近端开口234相邻的一部分)。

图2D-2F描绘了包含微流体管路262和流动通道264的微流体装置250的另一示例性实施方案，其是图1A的相应微流体装置100、管路132和通道134的变体。微流体装置250还具有多个隔离坞266，其是上述隔离坞124、126、128、130、224、226或228的另外的变体。特别地，应当理解，图2D-2F中所示的装置250的隔离坞266可以代替装置100、200、230、280、290、300中的上述隔离坞124、126、128、130、224、226或228中任一个。类似地，微流体装置250是微流体装置100的另一变体，并且还可以具有与上述微流体装置100、200、230、280、290、300相同或不同的DEP配置，以及本文所述的其他微流体系统组件中的任一个。

图2D-2F的微流体装置250包括支撑结构(在图2D-2F中不可见，但可以与图1A中所描绘的装置100的支撑结构104相同或基本上类似)、微流体管路结构256和盖(在图2D-2F中不可见，但可以与图1A中所描绘的装置100的盖122相同或基本上类似)。微流体管路结构256包括框架252和微流体管路材料260，其可以与图1A中所描绘的装置100的框架114和微流体管路材料116相同或基本上类似。如图2D所示，由微流体管路材料260所定义的微流体管路262可以包括多个通道264(示出了两个，但可以有更多个)，多个隔离坞266与其流体连接。

每个隔离坞266可以包括分离结构272、分离结构272内的分离区域270、以及连接区域268。从微流体通道264处的近端开口274到分离结构272处的远端开口276，连接区域268将微流体通道264流体连接至分离区域270。通常，根据上文对图2B和2C的讨论，通道264中的第一流体介质254的流278可以产生从微流体通道264进入和/或离开隔离坞266的相应连接区域268的第一介质254的二次流282。

如图2E所示，每个隔离坞266的连接区域268通常包括在至通道264的近端开口274与至分离结构272的远端开口276之间延伸的区域。连接区域268的长度L_con可以大于二次流282的最大穿透深度D_p，在这种情况下，二次流282将延伸到连接区域268中而不被再引导向分离区域270(如图2D所示)。或者，如图2F所示，连接区域268可以具有小于最大穿透深度D_p的长度L_con，在这种情况下，二次流282将延伸通过连接区域268并且被再引导向分离区域270。在后一种情况下，连接区域268的长度L_c1和L_c2的和大于最大穿透深度D_p，使得二次流282不延伸到分离区域270中。无论连接区域268的长度L_con是否大于穿透深度D_p，或者连接区域268的长度L_c1和L_c2的和是否大于穿透深度D_p，通道264中的第一介质254的不超过最大速度V_max的流278会产生具有穿透深度D_p的二次流，并且隔离坞266的分离区域270中的微物体(未示出，但可以与图2C中所示的微物体246相同或基本上类似)不会被通道264中的第一介质254的流278拖曳离开分离区域270。通道264中的流278也不会将混杂的物质(未示出)从通道264拖曳到隔离坞266的分离区域270中。这样，扩散是微流体通道264中的第一介质254中的组分可以从微流体通道264移动到隔离坞266的分离区域270中的第二介质258中的唯一机制。类似地，扩散是隔离坞266的分离区域270中的第二介质258中的组分可以从分离区域270移动到微流体通道264中的第一介质254中的唯一的机制。第一介质254可以是与第二介质258相同的介质，或者第一介质254可以是与第二介质258不同的介质。或者，第一介质254和第二介质258可以在开始时相同，然后变得不同，例如，通过分离区域270中的一个或多个细胞调节第二介质，或者通过改变流过微流体通道264的介质。

如图2E所示，微流体通道264中的微流体通道264的宽度W_ch(即，横切流体介质流过微流体通道的方向，如图2D中的箭头278所示)可以基本上垂直于近端开口274的宽度W_con1，并且因此基本上平行于远端开口276的宽度W_con2。然而，近端开口274的宽度W_con1和远端开口276的宽度W_con2不需要基本上彼此垂直。例如，近端开口274的宽度W_con1定向于其上的轴(未示出)与远端开口276的宽度W_con2定向于其上的另一轴之间的角度可以不同于垂直，并因此不是90°。可选择的定向角度的实例包括以下任一范围中的角度：约30°至约90°、约45°至约90°、约60°至约90°等。

在隔离坞室(例如，124、126、128、130、224、226、228或266)的各种实施方案中，分离区域(例如240或270)被配置为包含多个微物体。在其他实施方案中，分离区域可以被配置为包含仅一个、两个、三个、四个、五个或类似的相对较少数目的微物体。因此，分离区域的体积可以是例如至少2×10⁵、4×10⁵、8×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、4×10⁶、8×10⁶立方微米或更大。

在隔离坞的各种实施方案中，微流体通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的宽度W_ch可以在以下任一范围内：约50-1000微米、50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米和100-120微米。在一些其他实施方案中，微流体通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的宽度W_ch可以在约200-800微米、200-700微米或200-600微米的范围内。以上仅是示例，并且微流体通道122的宽度W_ch可以在其他范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。此外，在微流体通道的除了隔离坞的近端开口之外的区域中，微流体通道122的W_ch可以被选择为在任何这些范围内。

在一些实施方案中，隔离坞的高度为约30至约200微米或约50至约150微米。在一些实施方案中，隔离坞的横截面积为约1×10⁴-3×10⁶平方微米、2×10⁴–2×10⁶平方微米、4×10⁴–1×10⁶平方微米、2×10⁴–5×10⁵平方微米、2×10⁴–1×10⁵平方微米或约2×10⁵–2×10⁶平方微米。

在隔离坞的各种实施方案中，微流体通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的高度H_ch可以在以下任何范围内：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。前述仅仅是示例，并且微流体通道(例如，122)的高度H_ch可以在其他范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围)。在微流体通道的除了隔离坞的近端开口之外的区域中，微流体通道122的高度H_ch可以被选择为在任何这些范围内。

在隔离坞的各种实施方案中，微流体通道(例如，122)在近端开口(例如234)处的横截面积可以在以下任何范围内：500-50,000平方微米、500-40,000平方微米、500-30,000平方微米、500-25,000平方微米、500-20,000平方微米、500-15,000平方微米、500-10,000平方微米、500-7,500平方微米、500-5,000平方微米、1,000-25,000平方微米、1,000-20,000平方微米、1,000-15,000平方微米、1,000-10,000平方微米、1,000-7,500平方微米、1,000-5,000平方微米、2,000-20,000平方微米、2,000-15,000平方微米、2,000-10,000平方微米、2,000-7,500平方微米、2,000-6,000平方微米、3,000-20,000平方微米、3,000-15,000平方微米、3,000-10,000平方微米、3,000-7,500平方微米或3,000至6,000平方微米。前述仅仅是示例，并且微流体通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的横截面积可以在其他范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。

在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)的长度L_con可以是在以下任何范围内：约1-600微米、5-550微米、10-500微米、15-400微米、20-300微米、20-500微米、40-400微米、60-300微米、80-200微米或约100-150微米。前述仅仅是示例，并且连接区域(例如，236)的长度L_con可以在与前述示例不同的范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。

在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度W_con可以在以下任何范围内：20-500微米、20-400微米、20-300微米、20-200微米、20-150微米、20-100微米、20-80微米、20-60微米、30-400微米、30-300微米、30-200微米、30-150微米、30-100微米、30-80微米、30-60微米、40-300微米、40-200微米、40-150微米、40-100微米、40-80微米、40-60微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、50-80微米、60-200微米、60-150微米、60-100微米、60-80微米、70-150微米、70-100微米和80-100微米。前述仅仅是示例，并且连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度W_con可以与前述示例不同(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。

在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度W_con可以至少与隔离坞打算用于的微物体(例如，生物细胞，例如激活的T细胞)的最大尺寸一样大。前述仅仅是示例，并且连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度W_con可以与前述示例不同(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。

在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)的长度L_con与连接区域(例如，236)在近端开口234处的宽度W_con的比可以大于或等于任何以下比值：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或更大。以上仅仅是示例，并且连接区域236的长度L_con与连接区域236在近端开口234处的宽度W_con的比可以与前述示例不同。

在微流体装置100、200、23、250、280、290、300的各种实施方案中，V_max可以被设定为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.7、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10、11、12、13、14、15微升/秒或更大。

在具有隔离坞的微流体装置的各种实施方案中，隔离坞的分离区域(例如，240)的体积可以是例如至少1×10⁵、2×10⁵、4×10⁵、8×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、4×10⁶、6×10⁶、8×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸或8×10⁸立方微米或更大。在具有隔离坞的微流体装置的各种实施方案中，隔离坞的体积可以是约2×10⁵、5×10⁵、8×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、4×10⁶、8×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、5×10⁷或约8×10⁷立方微米或更大。在一些其他实施方案中，隔离坞的体积可以是约0.1纳升至约50纳升、0.2纳升至约25纳升、0.5纳升至约20纳升、约0.8纳升至约15纳升或约1纳升至约10纳升。

在各种实施方案中，微流体装置具有如本文所讨论的任何实施方案中所配置的隔离坞，其中微流体装置具有约5至约10个隔离坞、约10至约50个隔离坞、约100至约500个隔离坞；约200至约1000个隔离坞、约500至约1500个隔离坞、约1000至约2000个隔离坞、约1500至约3000、约2000至约4000、约2500至约5000、约3000至约6000、约3500至约7000、约4000至约8000、约4500至约9000或约5000至约10,000个隔离坞。隔离坞不需要全部是相同的尺寸，并且可以包括多种配置(例如，隔离坞内不同的宽度、不同的特征)。

图2G示出了根据一个实施方案的微流体装置280。图2G中示出的微流体装置280是微流体装置100的程式化示意图。在实施中，微流体装置280及其组成管路元件(例如，通道122和隔离坞128)会具有本文所讨论的尺寸。图2G中所示的微流体管路120具有两个端口107、四个不同的通道122和四个不同的流动路径106。微流体装置280进一步包括向每个通道122开口的多个隔离坞。在图2G所示的微流体装置中，隔离坞具有与图2C中所示的坞类似的几何形状，因此具有连接区域和分离区域这两者。因此，微流体管路120包括扫描区域(例如，通道122和连接区域236在二次流244的最大穿透深度D_p内的部分)和非扫描区域(例如，分离区域240和连接区域236不在二次流244的最大穿透深度D_p内的部分)这两者。

图3A至3B示出了可用于操作和观察根据本公开的微流体装置(例如，100、200、230、250、280、290、300)的系统150的各种实施方案。如图3A所示，系统150可以包括结构(“巢”)300，其被配置为保持微流体装置100(未示出)或本文所述的任何其他微流体装置。巢300可以包括插座(socket)302，其能够与微流体装置320(例如，光致动的电动力学装置100)交界并提供从电源192到微流体装置320的电连接。巢300还可以包括集成的电信号生成子系统304。电信号生成子系统304可以被配置为向插座302提供偏置电压，使得当插座302加持微流体装置320时，在微流体装置320中的一对电极两端施加偏置电压。因此，电信号生成子系统304可以是电源192的一部分。将偏置电压施加到微流体装置320的能力并不意味着当插座302加持微流体装置320时会一直施加偏置电压。相反，在大多数情况下，将间歇地施加偏压电压，例如，仅在需要促进在微流体装置320中生成电动力(例如介电电泳或电润湿)时施加。

如图3A所示，巢300可以包括印刷电路板组件(PCBA)322。电信号生成子系统304可以被安装在PCBA 322上并被电集成到其中。示例性支撑件也包括安装在PCBA322上的插座302。

通常，电信号生成子系统304将包括波形发生器(未示出)。电信号生成子系统304还可以包括示波器(未示出)和/或被配置为放大从波形发生器接收到的波形的波形放大电路(未示出)。示波器(如果有的话)可以被配置为测量供给至由插座302加持的微流体装置320的波形。在某些实施方案中，示波器在微流体装置320附近(并且远离波形发生器)的位置处测量波形，从而确保更精确地测量实际施加到装置的波形。从示波器测量所获得的数据可以被例如作为对波形发生器的反馈提供，并且波形发生器可以被配置为基于这样的反馈调整其输出。合适的组合式波形发生器和示波器的示例是Red Pitaya^TM。

在某些实施方案中，巢300进一步包括控制器308，例如用于检测和/或控制电信号生成子系统304的微处理器。合适的微处理器的实例包括Arduino^TM微处理器，例如ArduinoNano^TM。控制器308可以用于执行功能和分析，或者可以与外部主控制器154(图1A中所示)进行通信以执行功能和分析。在图3A所示的实施方案中，控制器308通过界面310(例如，插头或连接器)与主控制器154通信。

在一些实施方案中，巢300可以包括电信号生成子系统304，其包括Red Pitaya^TM波形发生器/示波器单元(“Red Pitaya单元”)和波形放大电路，该波形放大电路将RedPitaya单元所产生的波形放大并且将放大的电压传送给微流体装置100。在一些实施方案中，Red Pitaya单元被配置为测量微流体装置320处的放大的电压，然后根据需要调节其自身的输出电压，使得微流体装置320处测量到的电压是期望值。在一些实施方案中，波形放大电路可以具有由安装在PCBA 322上的一对DC-DC转换器产生的+6.5V至-6.5V的电源，从而在微流体装置100处产生高达13Vpp的信号。

如图3A所示，支撑结构300(例如，巢)可以进一步包括热控制子系统306。热控制子系统306可以被配置为调节由支撑结构300加持的微流体装置320的温度。例如，热控制子系统306可以包括Peltier热电装置(未示出)和冷却单元(未示出)。Peltier热电装置可以具有被配置为与微流体装置320的至少一个表面相交界的第一表面。冷却单元可以是例如冷却块(未示出)，例如液体冷却铝块。Peltier热电装置的第二表面(例如，与第一表面相对的表面)可以被配置为与这种冷却块的表面交界。冷却块可以被连接到流体路径314，流体路径314被配置为使冷却的流体循环通过冷却块。在图3A所示的实施方案中，支撑结构300包括入口316和出口318，以从外部贮液器(未示出)接收冷却的流体，将冷却的流体引入到流体路径314并通过冷却块，然后将冷却的流体返回到外部贮液器。在一些实施方案中，Peltier热电装置、冷却单元和/或流体路径314可以被安装在支撑结构300的壳体312上。在一些实施方案中，热控制子系统306被配置为调节Peltier热电装置的温度，以实现微流体装置320的目标温度。Peltier热电装置的温度调节可以例如通过热电电源实现，例如通过Pololu^TM热电电源(Pololu Robotics and Electronics Corp.)实现。热控制子系统306可以包括反馈电路，例如由模拟电路提供的温度值。或者，反馈电路可以由数字电路提供。

在一些实施方案中，巢300可以包括具有反馈电路的热控制子系统306，该反馈电路是包括电阻器(例如，具有1kOhm+/-0.1％的阻抗，+/-0.02ppm/C0的温度系数)和NTC热敏电阻(例如，具有1kOhm+/-0.01％的标称阻抗)的模拟分压器电路(未示出)。在一些情况下，热控制子系统306测量来自反馈电路的电压，然后使用计算出的温度值作为机载PID控制环路算法的输入。来自PID控制环路算法的输出可以驱动例如Pololu^TM马达驱动器(未示出)上的定向和脉冲宽度调制的信号引脚，以致动热电电源，从而控制Peltier热电装置。

巢300可以包括串行端口324，其允许控制器308的微处理器经由界面310(未示出)与外部主控制器154进行通信。另外，控制器308的微处理器可以与电信号生成子系统304和热控制子系统306进行通信(例如，经由Plink工具(未示出))。因此，经由控制器308、界面310和串行端口324的组合，电信号生成子系统304和热控制子系统306可以与外部主控制器154进行通信。以这种方式，除了其他方面之外，主控制器154还可以通过执行用于输出电压调节的定标计算(scaling calculation)来辅助电信号生成子系统304。经由耦接到外部主控制器154的显示装置170提供的图形用户界面(GUI)(未示出)可以被配置为绘制分别从热控制子系统306和电信号生成子系统304获得的温度和波形数据。替代地或另外地，GUI可以允许更新控制器308、热控制子系统306和电信号生成子系统304。

如上文所讨论的，系统150可以包括成像装置194。在一些实施方案中，成像装置194包括光调制子系统330(参见图3B)。光调制子系统330可以包括数字镜像装置(DMD)或微快门阵列系统(MSA)，其中任一个都可以被配置为接收来自光源332的光并将接收到的光的一部分发送到显微镜350的光具组中。或者，光调制子系统330可以包括产生其自身光的装置(因此无需光源332)，例如有机发光二极管显示器(OLED)、硅基液晶(LCOS)装置、铁电硅基液晶装置(FLCOS)或透射式液晶显示器(LCD)。光调制子系统330可以是例如投影仪。因此，光调制子系统330能够发射结构光和非结构光。在某些实施方案中，系统150的成像模块164和/或运动模块162可以控制光调制子系统330。

在某些实施方案中，成像装置194进一步包括显微镜350。在这样的实施方案中，巢300和光调制子系统330可以单独被配置为安装在显微镜350上。显微镜350可以是例如标准研究级别的光学显微镜或荧光显微镜。因此，巢300可以被配置为安装在显微镜350的载物台344上和/或光调制子系统330可以被配置为安装在显微镜350的端口上。在其他实施方案中，本文所述的巢300和光调制子系统330可以是显微镜350的集成部件。

在某些实施方案中，显微镜350可以进一步包括一个或多个检测器348。在一些实施方案中，检测器348由成像模块164控制。检测器348可以包括目镜、电荷耦合器件(CCD)、相机(例如，数码相机)或其任何组合。如果存在至少两个检测器348，则一个检测器可以是例如快速帧率相机，而另一个检测器可以是高灵敏度相机。此外，显微镜350可以包括光具组，其被配置为接收从微流体装置320反射和/或发射的光，并将反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到一个或多个检测器348上。显微镜的光具组还可以包括用于不同检测器的不同镜筒透镜(未示出)，使得每个检测器上的最终放大率可以是不同的。

在某些实施方案中，成像装置194被配置为使用至少两个光源。例如，可以使用第一光源332来产生结构光(例如，经由光调制子系统330)，并且可以使用第二光源334来提供非结构光。第一光源332可以产生用于光驱动的电运动和/或荧光激发的结构光，且第二光源334可以用于提供亮视场照明。在这些实施方案中，运动模块164可以用于控制第一光源332，并且成像模块164可以用于控制第二光源334。显微镜350的光具组可以被配置为(1)接收来自光调制子系统330的结构光，并且当微流体装置(例如，光致动的电动力学装置)被巢300加持时，将结构光聚焦在该装置中的至少第一区域上，以及(2)接收从微流体装置反射和/或发射的光，并将这种反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到检测器348上。光具组可以进一步被配置为接收来自第二光源的非结构光，并且当微流体装置被巢300加持时，将非结构光聚焦在微流体装置的至少第二区域上。在某些实施方案中，微流体装置的第一和第二区域可以是重叠的区域。例如，第一区域可以是第二区域的子集。在其他实施方案中，第二光源334可以另外地或替代地包括激光，其可以具有任何合适的光波长。图3B中所示的光具组的表示仅是示意性表示，并且光具组可以包括另外的滤光器、陷波滤波器、透镜等。当第二光源334包括用于亮视场和/或荧光激发的一个或多个光源以及激光照明时，光源的物理布置可以与图3B中所示的不同，并且可以在光具组内的任何合适的物理位置引入激光照明。光源432和光源402/光调制子系统404的示意性位置也可以互换。

在图3B中，第一光源332被显示为将光提供给光调制子系统330，其将结构光提供给系统355的显微镜350的光具组(未示出)。第二光源334被显示为经由分束器336将非结构光提供给光具组。来自光调制子系统330的结构光和来自第二光源334的非结构光一起从分束器336通过光具组行进到达第二分束器(或二向色滤光器338，取决于光调制子系统330提供的光)，光在此通过物镜336向下反射到样品平面342。然后，从样品平面342反射和/或发射的光向上返回通过物镜340、通过分束器和/或二向色滤光器338，并返回到二向色滤光器346。到达二向色滤光器346的光的仅仅一部分穿过并到达检测器348。

在一些实施方案中，第二光源334发射蓝光。利用适当的二向色滤光器346，从样品平面342反射的蓝光能够穿过二向色滤光器346并到达检测器348。相反，来自光调制子系统330的结构光从样品平面342反射，但不穿过二向色滤光器346。在该实例中，二向色滤光器346滤除波长长于495nm的可见光。只有从光调制子系统发射的光不包括短于495nm的任何波长时，这种滤除来自光调制子系统330的光才算完成(如图所示)。在实施中，如果来自光调制子系统330的光包括短于495nm的波长(例如，蓝色波长)，则来自光调制子系统的一些光会穿过滤光器346到达检测器348。在这样的实施方案中，滤光器346作用于改变从第一光源332和第二光源334到达检测器348的光量之间的平衡。如果第一光源332显著强于第二光源334，则这可能是有益的。在其他实施方案中，第二光源334可以发射红光，并且二向色滤光器346可以滤除除了红光之外的可见光(例如，波长短于650nm的可见光)。

涂覆溶液和涂覆剂。不希望受理论的限制，当微流体装置的至少一个或多个内表面已经被调节或涂覆以便呈现有机和/或亲水分子层(其提供微流体装置和保持在其中的生物微物体之间的主要界面)时，可以促进微流体装置(例如，DEP配置的和/或EW配置的微流体装置)内的生物微物体(例如，生物细胞)的维持(即，生物微物体在微流体装置内表现出增加的活力、更大的扩增和/或更大的可携带性)。在一些实施方案中，微流体装置的一个或多个内表面(例如，DEP配置的微流体装置的电极活化衬底的内表面、微流体装置的盖和/或管路材料的表面)可以用涂覆溶液和/或涂覆剂处理或改性，以产生所需的有机和/或亲水分子层。

涂层可以在引入生物微物体之前或之后施加，或者可以与生物微物体同时引入。在一些实施方案中，生物微物体可以在包含一种或多种涂覆剂的流体介质中输入到微流体装置中。在其他实施方案中，在将生物微物体引入到微流体装置中之前，将微流体装置(例如，DEP配置的微流体装置)的内表面用包含涂覆剂的涂覆溶液处理或“装填”。

在一些实施方案中，微流体装置的至少一个表面包括涂层材料，其提供适于维持和/或扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层(例如提供如下文所述的经调节的表面)。在一些实施方案中，微流体装置的基本上所有内表面都包括涂层材料。经涂覆的内表面可以包括流动路径(例如，通道)、腔室或隔离坞的表面，或其组合。在一些实施方案中，多个隔离坞中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在其他实施方案中，多个流动路径或通道中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在一些实施方案中，多个隔离坞中的每一个和多个通道中的每一个的至少一个内表面都涂覆有涂层材料。

涂覆剂/溶液。可以使用任何方便的涂覆剂/涂覆溶液，包括但不限于：血清或血清因子、牛血清白蛋白(BSA)、聚合物、洗涤剂、酶及其任何组合。

基于聚合物的涂层材料。至少一个内表面可以包括包含聚合物的涂层材料。聚合物可以与至少一个表面共价或非共价地结合(或可以非特异性地粘附)。聚合物可以具有多种结构基序，例如嵌段聚合物(和共聚物)、星形聚合物(星形共聚物)和接枝或梳形聚合物(接枝共聚物)中所发现的，所有这些都可以适用于本文公开的方法。

聚合物可以包括含有亚烷基醚部分的聚合物。大量的含亚烷基醚的聚合物可以适用于本文所述的微流体装置。一类非限制性示例性的含亚烷基醚的聚合物是两性非离子嵌段共聚物，其包括在聚合物链内具有不同比例和位置的聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)子单元的嵌段。

聚合物(BASF)是这类嵌段共聚物，并且在本领域中已知适合于在与活细胞接触时使用。聚合物的平均分子量M_w可以为约2000Da至约20KDa。在一些实施方案中，PEO-PPO嵌段共聚物可以具有大于约10(例如，12-18)的亲水-亲油平衡(HLB)。可用于产生经涂覆的表面的特定

聚合物包括

L44、L64、P85和F127(包括F127NF)。另一类含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG M_w<100,000Da)或可替代地，聚氧乙烯(PEO，M_w>100,000)。在一些实施方案中，PEG可以具有约1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da的M_w。

在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有羧酸部分的聚合物。羧酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚乳酸(PLA)。在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磷酸酯部分的聚合物，该磷酸酯部分在聚合物主链的末端处或者从聚合物的主链悬垂。在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磺酸部分的聚合物。磺酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚苯乙烯磺酸(PSSA)或聚茴香脑磺酸。在进一步的实施方案中，涂层材料可以包括含有胺部分的聚合物。聚氨基聚合物可以包括天然多胺聚合物或合成的多胺聚合物。天然多胺的实例包括精胺、亚精胺和腐胺。

在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有糖部分的聚合物。在一个非限制性实例中，诸如黄原胶或葡聚糖的多糖可以适合于形成可以在微流体装置中减少或防止细胞粘附的材料。例如，大小为约3kDa的葡聚糖聚合物可以用于为微流体装置内的表面提供涂层材料。

在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有核苷酸部分的聚合物，即核酸，其可以具有核糖核苷酸部分或脱氧核糖核苷酸部分，从而提供聚电解质表面。核酸可以仅含有天然核苷酸部分或者可以含有非天然核苷酸部分，其包含核碱基、核糖或磷酸酯部分类似物，例如7-脱氮腺嘌呤、戊糖、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯部分，但不限于此。

在其他实施方案中，涂料可以包括含有氨基酸部分的聚合物。含有氨基酸部分的聚合物可以包括含有天然氨基酸的聚合物或含有非天然氨基酸的聚合物，其均可以包括肽、多肽或蛋白质。在一个非限制性实例中，蛋白质可以是牛血清白蛋白(BSA)和/或包含白蛋白的血清(或多种不同血清的组合)和/或一种或多种作为涂覆剂的其他类似蛋白质。血清可以来自任何方便的来源，包括但不限于胎牛血清、绵羊血清、山羊血清、马血清等。在某些实施方案中，BSA在涂覆溶液中的存在范围为约1mg/mL至约100mg/mL，包括5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL，或更高或介于其间的任何值。在某些实施方案中，血清在涂覆溶液中的存在范围可以为约20％(v/v)至约50％v/v，包括25％、30％、35％、40％、45％，或更高或介于其间的任何值。在一些实施方案中，BSA可以作为涂覆剂以5mg/mL存在于涂覆溶液中，而在其他实施方案中，BSA可以作为涂覆剂以70mg/mL存在于涂覆溶液中。在某些实施方案中，血清作为涂覆剂以30％存在于涂覆溶液中。在一些实施方案中，可以在涂层材料内提供细胞外基质(ECM)蛋白质，用于获得优化的细胞粘附以促进细胞生长。可以包含在涂层材料中的细胞基质蛋白质可以包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、含RGD的肽(例如纤连蛋白)或层粘连蛋白。在其他实施方案中，可以在微流体装置的涂层材料内提供生长因子、细胞因子、激素或其他细胞信号传导物质。

在一些实施方案中，涂层材料可以包括含有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分或氨基酸部分中超过一种的聚合物。在其他实施方案中，经聚合物调节的表面可以包括超过一种聚合物的混合物，每种聚合物具有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分和/或氨基酸部分，其可以独立地或同时地并入到涂层材料中。

共价连接的涂层材料。在一些实施方案中，至少一个内表面包括共价连接的分子，其提供适于在微流体装置内维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层，为这些细胞提供调节的表面。

共价连接的分子包括连接基团，其中连接基团与微流体装置的一个或多个表面共价连接，如下文所述。连接基团还与被配置为提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分共价连接。

在一些实施方案中，被配置为提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括烷基或氟代烷基(其包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子表面)；磺酸盐阴离子；羧基甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。

在各种实施方案中，被配置为在微流体装置中提供适于维持/扩增的生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括非聚合部分，例如烷基部分、取代的烷基部分(例如，氟代烷基部分(包括但不限于全氟代烷基部分))、氨基酸部分、醇部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸部分、氨基磺酸部分或糖部分。或者，共价连接的部分可以包括聚合部分，其可以是上文所述的任何部分。

在一些实施方案中，共价连接的烷基部分可以包含形成直链(例如，至少10个碳或至少14、16、18、20、22或更多个碳的直链)的碳原子并且可以是无支链的烷基部分。在一些实施方案中，烷基可以包括取代的烷基(例如，烷基中的一些碳可被氟化或全氟化)。在一些实施方案中，烷基可以包括第一区段(其可以包括全氟代烷基)，其连接至第二区段(其可以包括未取代的烷基)，其中第一和第二区段可以直接或间接(例如，通过醚链接)连接在一起。烷基的第一区段可以位于连接基团的远端，并且烷基的第二区段可以位于连接基团的近端。

在其他实施方案中，共价连接的部分可以包括至少一个氨基酸，其可以包括超过一种类型的氨基酸。因此，共价连接的部分可以包括肽或蛋白质。在一些实施方案中，共价连接的部分可以包括氨基酸，其可以提供两性离子表面以支持细胞生长、活力、可携带性(portability)或其任何组合。

在其他实施方案中，共价连接的部分可以包括至少一个亚烷基氧化物部分，并且可以包括如上文所述的任何亚烷基氧化物聚合物。一类有用的含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG M_w<100,000Da)或者聚氧乙烯(PEO，M_w>100,000)。在一些实施方案中，PEG可以具有约1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da的M_w。

共价连接的部分可以包括一种或多种糖。共价连接的糖可以是单糖、二糖或多糖。可以修饰共价连接的糖，以引入反应性配对部分，其允许偶联或加工用于表面的附接。示例性的反应性配对部分可以包括醛、炔烃或卤素部分。可以以随机方式修饰多糖，其中可以修饰每种糖单体或仅修饰多糖内的一部分糖单体，以提供可以直接或间接偶联至表面的反应性配对部分。一个实例可以包括葡聚糖多糖，其可以经过非支链的连接部分间接地偶联到表面。

共价连接的部分可以包括一个或多个氨基。氨基可以是取代的胺部分、胍部分、含氮杂环部分或杂芳基部分。含氨基的部分可以具有允许对微流体装置内以及任选地对隔离坞和/或流动路径(例如，通道)内的环境进行pH修饰的结构。

提供经调节的表面的涂层材料可以仅包含一类共价连接的部分，或者可以包括超过一种不同类型的共价连接的部分。例如，经氟代烷基调节的表面(包括全氟代烷基)可以具有多个共价连接的部分，它们全部相同，例如具有相同的连接基团和与表面的共价连接、相同的总长度和相同数目的氟代亚甲基单元，包括氟代烷基部分。或者，涂层材料可以具有超过一种类型的与表面附接的共价连接部分。例如，涂层材料可以包括具有共价连接的具有指定数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基部分的分子，并且还可包括另一组分子，其具有共价连接到具有更大数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基链的带电荷部分，其可以提供在经涂覆的表面上呈现较大部分的能力。在这种情况下，具有不同的、空间要求更低的末端和更少的主链原子的第一组分子能够有助于使整个衬底表面功能化，从而防止与构成衬底本身的硅/氧化硅、氧化铪或氧化铝的不期望的粘附或接触。在另一个实例中，共价连接的部分可以提供两性离子表面，其在表面上以随机的方式呈现交替的电荷。

经调节的表面性质。除了经调节的表面的组成之外，其他因素(例如疏水材料的物理厚度)可能影响DEP力。各种因素可能改变经调节的表面的物理厚度，例如在衬底上形成经调节的表面的方式(例如，气相沉积、液相沉积、旋涂、溢流和静电涂覆)。在一些实施方案中，经调节的表面的厚度为约1nm至约10nm；约1nm至约7nm；约1nm至约5nm；或其间的任何单个值。在其他实施方案中，由共价连接的部分形成的经调节的表面可以具有约10nm至约50nm的厚度。在各种实施方案中，如本文所述制备的经调节的表面具有小于10nm的厚度。在一些实施方案中，当共价连接至微流体装置的表面(例如，DEP配置的衬底表面)时，经调节的表面的共价连接的部分可以形成单层，并且可以具有小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)的厚度。这些值与通过旋涂制备的表面的值(其厚度在约30nm的范围内)形成对比。在一些实施方案中，经调节的表面不需要完美形成的单层来适当地作用于在DEP配置的微流体装置内操作。

在各种实施方案中，提供微流体装置的经调节表面的涂层材料可以提供所需的电性质。不希望受理论的限制，影响涂覆有特定涂层材料的表面的稳健性的一个因素是固有电荷捕获。不同的涂层材料可能捕获电子，这可能导致涂层材料的破坏。涂层材料中的缺陷可能增加电荷捕获并导致涂层材料的进一步破坏。类似地，不同的涂层材料具有不同的介电强度(即导致介电击穿的最小施加电场)，这可能影响电荷捕获。在某些实施方案中，涂层材料可以具有降低或限制电荷捕获量的整体结构(例如，紧密堆积的单层结构)。

除了其电性质之外，经调节的表面还可以具有有益于与生物分子一起使用的性质。例如，相对于烷基封端的链，含有氟代(或全氟代)碳链的经调节的表面可以在减少表面结垢量方面提供益处。如本文所用，表面结垢是指沉积在微流体装置的表面上的任意物质的量，其可以包括生物材料(例如，蛋白质及其降解产物、核酸和各自的降解产物，等等)的永久性或半永久性沉积。

单一或多部分调节的表面。如下文所述的，共价连接的涂层材料可以通过已经含有被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分的分子的反应形成。或者，共价连接的涂层材料可以在两步顺序中通过将被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分偶联至表面修饰配体(它本身已经与表面共价连接)而形成。

制备共价连接的涂层材料的方法。在一些实施方案中，共价连接至微流体装置的表面(例如，包括隔离坞和/或流动路径的至少一个表面)的涂层材料具有式1或式2的结构。当将涂层材料一步引入到表面中时，它具有式1的结构，而当将涂层材料以多步法引入时，它具有式2的结构。

涂层材料可以共价连接到DEP配置或EW配置的衬底的表面的氧化物上。DEP或EW配置的衬底可以包括硅、氧化硅、氧化铝或氧化铪。氧化物可以作为衬底的初始化学结构的一部分存在，或者可以被如下所讨论地引入。

涂层材料可以经由连接基团(“LG”)与氧化物连接，该连接基团可以是由硅氧烷或膦酸基团与氧化物反应而形成的甲硅烷氧基或膦酸酯基团。被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分可以是本文所述的任何部分。连接基团LG可以直接或间接连接到被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。当连接基团LG直接连接至该部分时，不存在任选的连接部分(“L”)，且n为0。当连接基团LG间接连接至该部分时，存在连接部分L，且n为1。连接部分L可以具有线性部分，其中线性部分的主链可以包括1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何组合的非氢原子，其受本领域中已知的化学键合的限制。它可以被选自醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基、亚芳基、亚杂芳基或杂环基的一个或多个部分的任何组合所中断。在一些实施方案中，连接部分L的主链可以包括10至20个原子。在其他实施方案中，连接部分L的主链可以包括约5个原子至约200个原子；约10个原子至约80个原子；约10个原子至约50个原子；或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，主链原子均为碳原子。

在一些实施方案中，可以在多步法中向衬底的表面添加将被配置为提供适合维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分，并且该部分具有上文所示的式2的结构。该部分可以是上文所述的任何部分。

在一些实施方案中，偶联基团CG表示由反应性部分R_x和反应性配对部分R_px(即，被配置为与反应性部分R_x反应的部分)的反应所得到的基团。例如，一种典型的偶联基团CG可以包括羧酰氨基基团，其是氨基与羧酸衍生物(例如，活化的酯、酰氯等)反应的结果。其他CG可以包括亚三唑基、羧酰氨基、硫代酰氨基、肟、巯基、二硫化物、醚或烯基，或者可以在反应性部分与其相应的反应性配对部分反应时形成的任何其他合适的基团。偶联基团CG可以位于连接基团L的第二末端(即，邻近被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分的末端)，连接基团L可以包括如上文所述的元素的任何组合。在一些其他实施方案中，偶联基团CG可以中断连接基团L的主链。当偶联基团CG是亚三唑基时，它可以是由Click偶联反应产生的产物并且可以进一步被取代(例如，二苯并环辛烯基稠合的亚三唑基)。

在一些实施方案中，使用化学气相沉积将涂层材料(或表面修饰配体)沉积在微流体装置的内表面上。可任选地改进气相沉积工艺，例如，通过暴露于溶剂浴、超声处理或其组合而预清洁盖110、微流体管路材料116和/或衬底(例如，DEP配置的衬底的电极活化衬底206的内表面208，或EW配置的衬底的支撑结构104的介电层)。替代地或另外地，这种预清洁可以包括在氧等离子体清洁剂中处理盖110、微流体管路材料116和/或衬底，其可以去除各种杂质，同时引入经氧化的表面(例如，表面上的氧化物，其可以如本文所述进行共价修饰)。或者，可以使用液相处理，例如盐酸和过氧化氢的混合物或硫酸和过氧化氢的混合物(例如，食人鱼溶液，其可以具有约3:1至约7:1的硫酸与过氧化氢的比率)代替氧等离子体清洁剂。

在一些实施方案中，在微流体装置200已经被组装以形成限定微流体管路120的外壳102之后，使用气相沉积来涂覆微流体装置200的内表面。不希望受理论的限制，将这样的涂层材料沉积在完全组装的微流体管路120上可能有益于防止由微流体管路材料116和电极活化衬底206介电层和/或盖110之间变弱的结合所引起的分层。在采用两步法的实施方案中，可以通过如上文所述的气相沉积引入表面修饰配体，随后引入被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。该随后的反应可以通过在溶液中将表面修饰的微流体装置暴露于合适的偶联剂来进行。

图2H描绘了微流体装置290的横截面视图，该微流体装置290具有提供经调节的表面的示例性共价连接的涂层材料。如所示，涂层材料298(示意性地示出)可以包括与底座286(其可以是DEP衬底)的内表面294和微流体装置290的盖288的内表面292两者共价结合的紧密堆积的分子单层。涂层材料298可以被设置在邻近且向内面向微流体装置290的外壳284的基本上所有内表面294、292上，在一些实施方案中并且如上文所讨论的，包括用于定义微流体装置290内的管路元件和/或结构的微流体管路材料的表面(未示出)。在可选的实施方案中，涂层材料298可以仅被设置在微流体装置290的一个或一些内表面上。

在图2H所示的实施方案中，涂层材料298可以包括单层有机硅氧烷分子，每个分子经由甲硅烷氧基连接部分296共价键合到微流体装置290的内表面292、294。可以使用任何上文所讨论的涂层材料298(例如，烷基封端的、氟代烷基封端的部分、PEG封端的部分、葡聚糖封端的部分或含有有机硅氧基部分的正电荷或负电荷的末端部分)，其中末端部分被设置在其面向外壳的末端(即，涂层材料298的单层的未与内表面292、294结合并且邻近外壳284的部分)。

在其他实施方案中，用于涂覆微流体装置290的内表面292、294的涂层材料298可以包括阴离子、阳离子或两性离子部分，或其任何组合。不希望受理论的限制，通过在微流体管路120的外壳284的内表面上提供阳离子部分、阴离子部分和/或两性离子部分，涂层材料298可以与水分子形成强的氢键，使得所产生的水合水充当将生物微物体与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。另外，在涂层材料298与涂覆剂结合使用的实施方案中，涂层材料298的阴离子、阳离子和/或两性离子可以与存在于外壳284中的介质180(例如，涂覆溶液)中的非共价涂覆剂(例如，溶液中的蛋白质)的带电荷部分形成离子键。

在其他实施方案中，涂层材料可以包含或经化学修饰以在其面向外壳的末端提供亲水涂覆剂。在一些实施方案中，涂层材料可以包括含亚烷基醚的聚合物，例如PEG。在一些实施方案中，涂层材料可以包括多糖，例如葡聚糖。与上文所讨论的带电荷部分(例如，阴离子、阳离子和两性离子部分)一样，亲水涂覆剂可以与水分子形成强的氢键，使得所得的水合水充当将生物微物体与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。

适当的涂层处理和修饰的进一步细节可以在美国专利申请公开号US2016/0312165中找到，其通过引用整体并入。

用于在微流体装置的隔离坞内维持细胞活力的另外的系统组件。为了促进细胞群的生长和/或扩增，可以通过系统的另外的组件提供有利于维持功能细胞的环境条件。例如，此类另外的组件可以提供营养物、细胞生长信号传导物质、pH调节、气体交换、温度控制和从细胞中除去废产物。例如，在美国专利申请公开号US2016/0312165中已描述了这些类型的另外的组件。

实施例

实施例1：人T细胞在OptoSelect^TM芯片中的扩增

在OptoSelect芯片中实现T细胞扩增，该芯片是由Berkeley Lights,Inc.制造的纳米流体装置，并且由也由Berkeley Lights,Inc.制造的光学仪器控制。该仪器包括：偶联于温度控制器的芯片的安装台；泵和流体介质调节组件；以及包括照相机和适于激活芯片内的光电晶体管的结构化光源的光具组。OptoSelect^TM芯片包括采用OptoElectroPositioning(OEP^TM)技术配置的衬底，该技术提供光电晶体管激活的OET力。芯片还包括多个微流体通道，每个微流体通道具有与其流体连接的多个NanoPen^TM室(或隔离坞)。每个隔离坞的体积约为1×10⁶立方微米。

将从外周血分离的CD3⁺人T淋巴细胞与抗CD3/抗CD28磁珠(DYNABEADS^TM，ThermoFisher Scientific,Inc.)以1珠子/1细胞的比例混合。于37℃将混合物在5％CO₂培养箱中孵育5小时。孵育后，将T细胞/珠子混合物再悬浮，然后流过流体入口并进入芯片内的微流体通道中。停止流动并且通过倾斜芯片并允许重力将T细胞/珠子拉入坞中而将T细胞/珠子随机加载到隔离坞中。

在将T细胞和珠子加载到隔离坞中后，通过芯片的微流体通道灌注T细胞培养基(RPMI，10％FBS、2％人AB血清、50U/ml IL2；R&D Systems)4天的时间。在整个4天的培养期间，每30分钟对隔离坞及其中包含的任何T细胞和珠子进行成像。

图4是培养0、24、48、72和96小时的单个坞的一系列延时图像，其中按照前述方法将CD3⁺人T淋巴细胞在芯片上成功地扩增。可以看出，在时间t＝0时的少量T细胞在芯片上培养96小时后产生寡克隆T细胞群。

可选方案1：可以用无动物成分的T细胞培养基重复上述实验。例如，可以去除前述T细胞培养基中的FBS，并且可以用高级RPMI(或具有高水平磷酸盐并且包括胰岛素和铁蛋白补充剂的类似基础培养基)替换RPMI，并且得到的T细胞扩增将基本上相同。另外，T细胞培养基可以补充有IL7(例如，5ng/ml的IL7)。

可选方案2：可以重复上述实验，但不进行T细胞和珠子的5小时芯片外预孵育。相反，可以在将T细胞加载到隔离坞中之前或之后将一个或多个珠子放置在每个隔离坞中，并且所得的T细胞扩增将基本上相同。

实施例2：人T细胞在OptoSelect^TM芯片中的选择性扩增

在OptoSelect芯片(Berkeley Lights,Inc.)内实现T细胞扩增，该芯片由也由Berkeley Lights,Inc.制造的光学仪器控制，如实施例1中所述。

首先，将从外周血分离的人CD14⁺单核细胞在DC培养基(RPMI，10％FBS、2％人AB血清、100ng/ml GM-CSF、50ng/ml IL-4；R&D Systems)中培养7天，以促进树突状细胞(DC)的分化。在培养的最后2天期间内向培养基中添加250μg/ml LPS(R&D Systems)以促进DC活化。

将同种异体供体T淋巴细胞与来自前述培养物的DC以约10个T细胞/1个DC的比例混合，并于37℃在5％CO₂培养箱中孵育5小时。孵育后，将T细胞/DC混合物再悬浮，然后流过流体入口并进入芯片内的微流体通道中。停止流动并且通过倾斜芯片并允许重力将T细胞/DC拉入坞中而将T细胞/DC随机加载到隔离坞中。

在将T细胞/DC加载到隔离坞中后，通过芯片的微流体通道灌注T细胞培养基(RPMI，10％FBS、2％人AB血清、50U/ml IL2；R&D Systems)4天的时间。在整个4天的培养期间，每30分钟对隔离坞及其中包含的任何T细胞和DC进行成像。

图5A是培养0、24、48、72和96小时的单个隔离坞的一系列延时图像，其中按照前述方法将CD3⁺人T淋巴细胞在芯片上选择性地扩增。可以看出，在芯片上培养96小时后，DC刺激T细胞的显著扩增。然而，只有1％-2％的最初接种有至少一个T细胞和至少一个DC的隔离坞表现出T细胞扩增，这表明图5A中观察到的扩增是选择性的。

在4天培养期的最后16小时期间内，用于灌注芯片的培养基补充有Click-It EdU试剂(Thermo Fisher Scientific,Inc.)，允许T细胞摄取该试剂并将其并入到它们的DNA中。在培养期之后，将细胞洗涤，用3.7％甲醛固定，并用0.1％Triton-X透化。通过监测德克萨斯红通道中的荧光来检测EdU并入。图6A提供的图像显示EdU荧光信号覆盖在选择性扩增的T细胞的亮视场图像上。EdU数据显示，坞中T细胞数目的增加是由细胞生长和分裂引起的，这与最初围住(penned)的T细胞被DC激活的结论一致。

可选方案：可以用无动物成分的T细胞培养基重复上述实验。例如，可以去除前述T细胞培养基中的FBS，并且可以用高级RPMI(或具有高水平磷酸盐并且包括胰岛素和铁蛋白补充剂的类似基础培养基)替换RPMI，并且得到的T细胞扩增将基本上相同。另外，T细胞培养基可以补充有IL7(例如，5ng/ml的IL7)。

实施例3：人T细胞在OptoSelect^TM芯片中的抗原特异性扩增

在OptoSelect芯片(Berkeley Lights,Inc.)内实现T细胞扩增，该芯片由也由Berkeley Lights,Inc.制造的光学仪器控制，如实施例1中所述。

首先，将从外周血分离的人CD14⁺单核细胞在DC培养基(RPMI，10％FBS、2％人AB血清、100ng/ml GM-CSF、50ng/ml IL-4；R&D Systems)中培养7天，以促进树突状细胞(DC)的分化。在培养的最后2天期间内向培养基中添加250μg/ml LPS(R&D Systems)以促进DC活化。在添加LPS的同时，还用10μM破伤风毒素(TT)抗原(Sigma-Aldrich Co.)和10μM爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)抗原(EastCoast Bio,Inc.)脉冲DC。

将自体供体T淋巴细胞与来自前述培养物的TT和EBV脉冲的DC以约10个T细胞/1个DC的比例混合，并于37℃在5％CO₂培养箱中孵育5小时。孵育后，将T细胞/DC混合物再悬浮，然后流过流体入口并进入芯片内的微流体通道中。停止流动并且通过倾斜芯片并允许重力将T细胞/DC拉入坞中而将T细胞/DC随机加载到隔离坞中。

在将T细胞/DC加载到隔离坞中后，通过芯片的微流体通道灌注T细胞培养基(RPMI，10％FBS、2％人AB血清、50U/ml IL2；R&D Systems)5天的时间。在整个5天的培养期间，每30分钟对坞和其中包含的任何T细胞和珠子成像。

图5B是培养0、24、48、72、96和110小时的单个隔离坞的延时系列图像，其中按照前述方法将CD3⁺人T淋巴细胞在芯片上选择性地扩增。可以看出，在芯片上培养110小时后，DC刺激T细胞的显著扩增。然而，只有1％-2％的初始接种有至少一个T细胞和至少一个DC的坞表现出T细胞扩增，这表明图5B中观察到的扩增是抗原特异性的。

在5天培养期的最后16小时期间内，用于灌注芯片的培养基补充有Click-It EdU试剂(Thermo Fisher Scientific,Inc.)，允许T细胞摄取试剂并将其并入到它们的DNA中。在培养期之后，将细胞洗涤，用3.7％甲醛固定，并用0.1％Triton-X透化。通过监测德克萨斯红通道中的荧光来检测EdU并入。图6B提供的图像显示Edu荧光信号覆盖在选择性扩增的T细胞的亮视场图像上。EdU数据显示，坞中T细胞数目的增加是由细胞生长和分裂引起的，这与最初围住的T细胞被DC激活的结论一致。

可选方案：可以用无动物成分的T细胞培养基重复上述实验。例如，可以去除前述T细胞培养基中的FBS，并且可以用高级RPMI(或具有高水平磷酸盐并且包括胰岛素和铁蛋白补充剂的类似基础培养基)替换RPMI，并且得到的T细胞扩增将基本上相同。另外，T细胞培养基可以补充有IL7(例如，5ng/ml的IL7)。

实施例4：T淋巴细胞在具有经调节的表面的OptoSelect^TM芯片中的培养和输出

材料。CD3+细胞来自AllCells Inc.。抗CD3/抗CD28抗体与磁珠(

Thermofisher Scientific，产品目录号11453D)结合。培养基是RPMI-1640(GIBCO，ThermoFisher Scientific，产品目录号11875-127)，补充有10％FBS、2％人AB血清和50U/ml IL2(R&D Systems)。

系统和微流体装置。在OptoSelect芯片(Berkeley Lights,Inc.)内实现T细胞扩增，该芯片由也由Berkeley Lights,Inc.制造的光学仪器控制，基本上如实施例1中所述。然而，在该实施例中，OptoSelect芯片的内表面用共价连接的葡聚糖调节。

微流体装置装填。以12微升/秒的速率流入250微升的100％二氧化碳，然后以12微升/秒流入250微升含有0.1％

F27(Life

产品目录号P6866)的PBS，最后以12微升/秒微升流入250微升PBS。随后介绍培养基。

培养基灌注。根据以下两种方法之一，通过微流体装置灌注培养基：

1.以0.01微升/秒灌注2小时；以2微升/秒灌注64秒；并重复。

2.以0.02微升/秒灌注100秒；停止流动500秒；以2微升/秒灌注64秒；并重复。

实验：将CD3+细胞与抗CD3/抗CD28磁珠以1个珠子/细胞的比例混合。于37℃将混合物在5％CO₂培养箱中在培养基中孵育5小时，然后将T细胞/珠子混合物再悬浮使用。

通过使再悬浮液流过流体入口并进入微流体通道，将T细胞悬浮液(包括抗CD3/抗CD28珠子)引入到微流体装置中。停止流动并且通过倾斜芯片并允许重力将T细胞/珠子拉入室中而将T细胞/珠子随机加载到隔离室中。

在将T细胞/珠子加载到隔离室中后，通过纳米流体芯片的微流体通道灌注培养基4天的时间。图7A显示了T细胞在微流体装置的隔离室的经葡聚糖调节的表面上的生长。相对于类似微流体装置的非调节表面，T细胞在经葡聚糖调节的表面上的生长得到改善(数据未示出)。

然后通过倾斜微流体装置并允许重力将T细胞从室中拉出而将T细胞从隔离室中移出。图7B显示了在20分钟重力卸载后从隔离室中移出的T细胞的代表性图像。扩增的T细胞易于从经葡聚糖调节的隔离坞中输出，这是相对于使用缺少经葡聚糖调节的表面的OptoSelect芯片实现的T细胞输出程度的改进(数据未示出)。

实施例5：T淋巴细胞在具有经调节的表面的OptoSelect^TM芯片中的活化和扩增

在OptoSelect芯片(Berkeley Lights,Inc.)内实现T细胞扩增，该芯片由也由Berkeley Lights,Inc.制造的光学仪器控制，基本上如实施例1中所述。与实施例4类似，OptoSelect芯片具有经调节的表面。在该实施例中，经调节的表面包括含有链霉亲和素连接的聚乙二醇(PEG，约1kD)的聚合物，其与生物素化的抗CD3激动剂抗体结合。

将OptoSelect芯片用游离的链霉亲和素(1mg/mL，通过注射加载到出口端口中)冲洗，在室温下孵育1小时，然后用PBS淋洗(通过注射)1次。接下来，将生物素化的抗CD3抗体(5微克/mL，Miltenyi 130-093-377)流入芯片，停止流动，并于37℃将芯片加湿孵育1小时。然后通过使培养基流过该装置而淋洗芯片。

通过使T细胞培养物流过入口并进入芯片内的微流体通道中，然后停止流动，将T细胞加载到芯片(如上所述制备)中。倾斜芯片以允许T细胞重力加载到芯片中的隔离坞中。在重力加载后，将T细胞在芯片的隔离坞内培养3至4天。用于T细胞培养的培养基含有2ug/mL可溶性功能级抗CD28抗体(克隆15E8，Miltenyi130-093-375)。

通过延时成像监测如上所述在微流体装置中培养的T细胞。得到的图像显示T细胞到处移动并分开，从而证明T细胞活化的特征。

上述实验的变化方案可以包括：改变结合的抗CD3激动剂抗体的表面密度；改变PEG聚合物的长度；将抗CD28抗体与经调节的表面结合；改变抗CD3激动剂抗体与抗CD28抗体的比例；和/或用肽-MHC复合物替换抗CD3抗体。后一种修饰可以用于实现T细胞的抗原特异性激活和扩增。

实施例6：在微流体装置内引入T细胞活化表面

OptoSelect^TM芯片(Berkeley Lights,Inc.)包括形成基底的第一硅电极活化衬底、形成盖的第二ITO衬底以及形成分隔两个衬底的壁的光致图案化的硅氧烷微流体管路材料，其内表面被共价修饰以包括叠氮基部分，如美国专利申请公开号US20160312165中所述。基本上，将OptoSelect芯片使用100W功率、240mTorr压力和440sccm氧气流速在氧等离子体清洁器(Nordson Asymtek)中处理1分钟。在真空反应器中，在真空反应器底部的单独箔晶舟(foil boat)中的作为水反应物来源的七水合硫酸镁(0.5g，Acros产品目录号10034-99-8)的存在下，用真空反应器底部的箔晶舟中的3-叠氮基十一烷基三甲氧基硅烷(通过与叠氮化钠300微升反应而由11-溴十一烷基三甲氧基硅烷(Gelest产品目录号SIB1908.0)合成)处理等离子体处理的芯片。然后使用真空泵将腔室加压至750mTorr并密封。将真空反应器置于加热至110℃的烘箱中24-48小时。这导致芯片内表面的修饰，使得修饰的表面具有以下结构：

在冷却至室温并将氩气引入到真空室后，将微流体装置从反应器中取出并且其适于进一步反应。

接下来，为了用链霉亲和素使表面功能化，首先用100％二氧化碳重复冲洗OptoSelect芯片，然后加载DBCO-链霉亲和素溶液。通过将与DBCO部分(NANOCS产品目录号SV1-DB-1)共价附接的链霉亲和素的冻干粉末以1.0微摩尔浓度再悬浮于1X PBS(pH 7.4，Gibco)中来制备DBCO-链霉亲和素溶液。在孵育15-30分钟(DBCO和叠氮化物基团在这个期间偶联)之后，用1X PBS重复洗涤OptoSelect芯片以冲洗掉未结合的DBCO-链霉亲和素。虽然DBCO修饰的链霉亲和素溶液以1微摩尔浓度制备，但浓度在约0.5至约2微摩尔浓度范围内对于修饰具有叠氮基部分的OptoSelect芯片的内表面是有效的。

将该链霉亲和素功能化的表面进一步用生物素化的抗CD3抗体(OKT3克隆，功能级，Miltenyi，产品目录号130-093-377)和生物素化的抗CD28抗体(15E8克隆，功能级，Miltenyi，产品目录号130-093-386)修饰。以1:1的比例将这些抗体悬浮于PBS+2％牛血清白蛋白中，浓度为约1-10微克/mL。将该抗体溶液通过具有链霉亲和素功能化表面的OptoSelect芯片灌注，促进抗体通过生物素-链霉亲和素结合相互作用连接到芯片的内表面。孵育1小时后，用PBS冲洗OptoSelect芯片，然后用细胞培养基冲洗，此时芯片已准备好加载细胞。

尽管前述实例集中于用抗体对OptoSelect芯片的内表面进行功能化，但是其他感兴趣的生物分子可以以相同的方式连接(即，通过生物分子的生物素修饰和生物素-链霉亲和素介导的与链霉亲和素功能化表面的结合)。此外，生物素化的抗体(或其他生物分子)可以在与OptoSelect芯片的叠氮基修饰的表面反应之前与链霉亲和素反应。DBCO-链霉亲和素和生物素化的生物分子可以在PBS溶液中分别以0.5-2微摩尔浓度的浓度制备，然后以任何所需的比例混合，如下文所述。在使生物素化的生物分子与链霉亲和素连接至少15分钟后，所得的复合物可以用于修饰叠氮基修饰的OptoSelect芯片的表面，如上文所述。

如果使用多于一种类型的抗体/生物分子来修饰OptoSelect芯片的表面，则可以在与DBCO-链霉亲和素的连接步骤之前混合两种(或更多种)类型的抗体/生物分子，或者可以在表面官能化之前制备和混合几种单独类型的生物分子的DBCO-链霉亲和素连接物。因此，尽管上述实施例中的生物分子修饰的表面是抗CD3和抗CD28抗体的1:1比例，但该比例可以是约1:5至约5:1(例如，约2:1至约1:2)。更一般地，用于活化T细胞的生物分子修饰的表面可以包括两种T细胞活化生物分子，其中任一种可以是CD3激动剂、CD28激动剂或MHC蛋白(例如，MBL International，产品目录号MR01008)，且两种生物分子相对于彼此可以以约1:10至约10:1的范围存在。而且，生物分子修饰的表面可以包括3、4、5或更多种T细胞活化生物分子的混合物。

上述实验的进一步变化可以包括：改变结合的抗CD3激动剂抗体和/或结合的抗CD28激动剂抗体的表面密度；改变用于初始官能化内部芯片表面的含叠氮基部分的分子中烃链的长度；提供可溶形式的抗CD28抗体；和/或用肽-MHC复合物替换抗CD3抗体。后一种修饰可以用于实现T细胞的抗原特异性激活和扩增。

实施例7：实施方案

以下编号的项目提供了关于本文描述的实施方案的进一步的非限制性细节。

项目1.一种在微流体装置中扩增T淋巴细胞的方法，所述微流体装置具有流动路径和与所述流动路径流体连接的隔离坞，所述方法包括：

将一个或多个T淋巴细胞引入到微流体装置中的隔离坞中；

使一个或多个T淋巴细胞与活化剂接触；以及

通过微流体装置的流动路径灌注培养基达一段时间足以使被引入到隔离坞中的一个或多个T淋巴细胞经历扩增。

项目2.项目1的方法，其中隔离坞具有约5×10⁵至约5×10⁶立方微米的体积。

项目3.项目1或2的方法，其中隔离坞的至少一个内表面包括涂层材料。

项目4.项目3的方法，其中涂层材料与隔离坞的至少一个内表面共价结合，并且其中涂层材料包括含有亚烷基醚部分、糖部分、氨基酸部分或其组合的聚合物。

项目5.项目4的方法，其中涂层材料包含葡聚糖。

项目6.项目4的方法，其中涂层材料包含聚乙二醇部分。

项目7.项目4至6中任一项的方法，其中涂层材料包含一种或多种蛋白质。

项目8.项目3的方法，其中涂层材料包含分子，每个分子包括连接基团和烷基部分，其中连接基团共价键合到隔离坞的至少一个内表面。

项目9.项目8的方法，其中连接基团是甲硅烷氧基连接基团。

项目10.项目8或9的方法，其中烷基部分包含含有至少10个碳原子的直链碳链。

项目11.项目8至10中任一项的方法，其中烷基部分是氟烷基部分。

项目12.项目8至10中任一项的方法，其中烷基部分是全氟烷基部分。

项目13.项目8至12中任一项的方法，其中涂层材料的分子形成与内部衬底表面共价结合的致密堆积的单层结构。

项目14.项目3的方法，其中涂层材料包含具有连接基团和阳离子部分和/或阴离子部分的分子，其中连接基团共价键合到内部衬底表面。

项目15.项目14的方法，其中阳离子部分包含季铵基团。

项目16.项目14或15的方法，其中阴离子部分包括膦酸、羧酸或磺酸。

项目17.项目14至16中任一项的方法，其中涂层材料包含具有连接基团和两性离子部分的分子。

项目18.项目17的方法，其中两性离子部分选自羧基甜菜碱、磺基甜菜碱、氨基磺酸和氨基酸。

项目19.项目3至18中任一项的方法，其中活化剂与涂层材料共价连接。

项目20.项目3至18中任一项的方法，其中活化剂与涂层材料稳定结合。

项目21.项目20的方法，其中活化剂通过生物素-链霉亲和素链接而与涂层材料稳定结合。

项目22.项目1至21中任一项的方法，其中一个或多个T淋巴细胞是从取自受试者的外周血样品中分离的。

项目23.项目1至21中任一项的方法，其中一个或多个T淋巴细胞是从受试者的实体瘤样品中分离的。

项目24.项目23的方法，其中所述实体瘤样品是细针抽吸物(FNA)。

项目25.项目23的方法，其中所述实体瘤样品是活组织检查样本。

项目26.项目23至25中任一项的方法，其中实体瘤是乳腺癌，源自泌尿道、输尿管、膀胱或尿道的癌症，肾细胞癌，睾丸癌，前列腺癌，或精囊、精管或阴茎的癌症，卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、阴道癌或输卵管癌，神经系统的癌症，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，肠癌，结肠直肠癌，肺癌或黑素瘤。

项目27.项目23至25中任一项的方法，其中实体瘤是髓样乳腺癌、间皮瘤或黑素瘤。

项目28.项目22至27中任一项的方法，其中一个或多个T淋巴细胞来自从外周血样品或实体瘤样品中分离的T淋巴细胞群。

项目29.项目28的方法，其中所述群富含CD3+ T淋巴细胞。

项目30.项目28的方法，其中所述群富含CD3+CD4+ T淋巴细胞。

项目31.项目28的方法，其中所述群富含CD3+CD8+ T淋巴细胞。

项目32.项目28至31中任一项的方法，其中所述群富含CD45RA+CD45RO-T淋巴细胞。

项目33.项目28至31中任一项的方法，其中所述群富含CD45RA-CD45RO+ T淋巴细胞。

项目34.项目28至33中任一项的方法，其中所述群富含CCR7+ T淋巴细胞。

项目35.项目28至34中任一项的方法，其中所述群富含CD62L+ T淋巴细胞。

项目36.项目28至35中任一项的方法，其中所述群缺失CD69+ T淋巴细胞。

项目37.项目28至36中任一项的方法，其中所述群缺失PD 1+和/或PD-L1+ T淋巴细胞。

项目38.项目28至37中任一项的方法，其中所述方法包括通过使T淋巴细胞与CD45RO、CD45RA、CD69、PD-1和/或PD-L1的抗体接触并从群中除去与抗体结合的T淋巴细胞而耗尽CD45RO+ T淋巴细胞、CD45RA+ T淋巴细胞、CD69+ T淋巴细胞、PD-1+ T淋巴细胞和PD-L1+ T淋巴细胞中的一种、两种、三种或四种。

项目39.项目38的方法，其中抗体与固体支持物结合。

项目40.项目39的方法，其中固体支持物是多个磁珠。

项目41.项目1至40中任一项的方法，其中将一个或多个T淋巴细胞引入到隔离坞中包括使含有一个或多个T淋巴细胞的流体流入到微流体装置的微流体通道中，其中微流体通道是微流体装置的流动路径的一部分，并且其中隔离坞通到微流体通道。

项目42.项目41的方法，其中将一个或多个T淋巴细胞引入到隔离坞中还包括使用介电电泳(DEP)选择位于微流体通道中的至少一个T淋巴细胞并将其移入到隔离坞中。

项目43.项目42的方法，其中选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面包含标志物CD3+、CD4+、CD8+或其任何组合。

项目44.项目42的方法，其中选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面包含标志物CD3+和CD4+。

项目45.项目42的方法，其中选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面包含标志物CD3+和CD8+。

项目46.项目42至45中任一项的方法，其中选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面包含标志物CD45RA+、CD45RO+、CCR7+、CD62L+或其任何组合。

项目47.项目42至46中任一项的方法，其中选择至少一个T淋巴细胞包括用与CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CCR7或CD62L特异性结合的抗体来标记包含至少一个T淋巴细胞的T淋巴细胞群，并基于其与抗体的结合将至少一个T淋巴细胞移动到隔离坞中。

项目48.项目47的方法，其中抗体包含荧光团。

项目49.项目42至48中任一项的方法，其中选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面不是CD45RO+。

项目50.项目42至48的方法，其中将一个或多个T淋巴细胞引入到隔离坞中包括标记CD45RO+ T淋巴细胞并将不与指示CD45RO的标记物结合的一个或多个T淋巴细胞引入到隔离坞中。

项目51.项目42至48中任一项的方法，其中选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面不是CD45RA+。

项目52.项目42至48中任一项的方法，其中将一个或多个T淋巴细胞引入到隔离坞中包括标记CD45RA+ T淋巴细胞并将不与指示CD45RA的标记物结合的一个或多个T淋巴细胞引入到隔离坞中。

项目53.项目42至52中任一项的方法，包括标记CCR7+和CD62L+ T淋巴细胞，并将与指示CCR7的标记物结合和/或与指示CD62L的标记物结合的一个或多个T淋巴细胞移动到隔离坞中。

项目54.项目42至52中任一项的方法，包括标记CCR7+和CD62L+ T淋巴细胞，并将不与指示CCR7的标记物结合和/或不与指示CD62L的标记物结合的一个或多个T淋巴细胞移动到隔离坞中。

项目55.项目42至54中任一项的方法，其中选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面不是CD69+。

项目56.项目42至55中任一项的方法，其中选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面不是PD-1+。

项目57.项目42至56中任一项的方法，其中选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面不是PD-L1+。

项目58.项目42至57中任一项的方法，其中选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其用与荧光标记物结合的抗原标记。

项目59.项目58的方法，其中抗原包含与MHC蛋白质复合的肽。

项目60.项目42至59中任一项的方法，其中选择至少一个所选的T淋巴细胞，至少部分地因为其用一种或多种与荧光标记物结合的抗体标记。

项目61.项目60的方法，其中一种或多种抗体包括CD45RA或CD45RO的抗体、CCR7的抗体、CD62L的抗体或其任何组合。

项目62.项目60或61的方法，其中一种或多种抗体包括CD4的抗体。

项目63.项目60或61的方法，其中一种或多种抗体包括CD8的抗体。

项目64.项目41的方法，其中将一个或多个T淋巴细胞引入到隔离坞中还包括倾斜微流体装置，使得重力将一个或多个T淋巴细胞拉到隔离坞中。

项目65.项目1至64中任一项的方法，其中一个或多个T淋巴细胞在被引入到隔离坞中之前与活化剂接触。

项目66.项目65的方法，其中在引入到微流体装置中之前，将一个或多个T淋巴细胞与活化剂一起孵育至少一小时的时间。

项目67.项目65的方法，其中在引入到微流体装置中之前，将一个或多个T淋巴细胞与活化剂一起孵育至少五小时的时间。

项目68.项目65至67中任一项的方法，其中将一个或多个T淋巴细胞引入到隔离坞中还包括将活化剂引入到隔离坞中。

项目69.项目1至64中任一项的方法，其中一个或多个T淋巴细胞在被引入到隔离坞中之后与活化剂接触。

项目70.项目1至69中任一项的方法，其中活化剂包含抗CD3和/或抗CD28激动剂抗体。

项目71.项目70的方法，其中活化剂包含与固体支持物连接的抗CD3激动剂抗体。

项目72.项目70或71的方法，其中活化剂包含与固体支持物连接的抗CD28激动剂抗体。

项目73.项目70或71的方法，其中活化剂包含可溶性抗CD28激动剂抗体。

项目74.项目1至69中任一项的方法，其中活化剂包含树突细胞(DC)。

项目75.项目74的方法，其中在与一个或多个T淋巴细胞接触之前用肿瘤抗原脉冲DC。

项目76.项目75的方法，其中肿瘤抗原是从与一个或多个T淋巴细胞自体同源的肿瘤细胞中分离的。

项目77.项目75的方法，其中通过肿瘤细胞的基因组分析来识别肿瘤抗原。

项目78.项目77的方法，其中被分析的肿瘤细胞与一个或多个T淋巴细胞是自体同源的。

项目79.项目74至78中任一项的方法，其中DC与一个或多个T淋巴细胞是自体同源细胞。

项目80.项目1至79中任一项的方法，其中通过微流体装置的流动路径灌注培养基至少24小时的时间。

项目81.项目1至79中任一项的方法，其中通过微流体装置的流动路径灌注培养基至少48小时的时间。

项目82.项目1至79中任一项的方法，其中通过微流体装置的流动路径灌注培养基至少96小时的时间。

项目83.项目1至66中任一项的方法，其中培养基包含人血清和IL2。

项目84.项目1至67中任一项的方法，其中培养基包含IL7、IL15、IL21或其任何组合。

项目85.项目1至84中任一项的方法，其中向微流体装置中的隔离坞中引入20个或更少、10个或更少、6-10个、5个或更少、约5个、约4个、约3个、约2个或1个T淋巴细胞。

项目86.项目1至85中任一项的方法，其中扩增包括至少三轮有丝细胞分裂。

项目87.项目1至86中任一项的方法，其中该方法包括从微流体装置输出扩增的T淋巴细胞。

项目88.项目1至87中任一项的方法，其中微流体装置包括多个隔离坞，并且其中将一个或多个T淋巴细胞引入到多个隔离坞中的每一个中并与活化剂接触。

项目89.项目88的方法，其中向微流体装置中的多个隔离坞中的每一个中引入20个或更少、10个或更少、6-10个、5个或更少、约5个、约4个、约3个、约2个或1个T淋巴细胞。

项目90.根据项目1至89中任一项的方法生产的T淋巴细胞。

项目91.一种微流体装置，其包括根据项目1至89中任一项的方法生产的T淋巴细胞。

项目92.项目91的微流体装置，其中微流体装置包括隔离坞，并且其中T淋巴细胞位于隔离坞中。

项目93.一种药物组合物，其包含根据项目1至89中任一项的方法生产的T淋巴细胞和药学上可接受的载体。

项目94.一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括将T淋巴细胞引入到受试者中，其中T淋巴细胞是通过项目1至89中任一项的方法制备的。

项目95.一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括：

从得自受试者的组织样品中分离T淋巴细胞；

根据项目1至89中任一项的方法在微流体装置中扩增分离的T淋巴细胞；

从微流体装置中输出扩增的T淋巴细胞；以及

将扩增的T淋巴细胞重新引入到受试者中。

项目96.项目94或95的方法，其中受试者是哺乳动物。

项目97.项目96的方法，其中受试者是人。

项目98.项目95至97中任一项的方法，其中组织样品是外周血样品。

项目99.项目95至97中任一项的方法，其中组织样品来自实体瘤。

项目100.项目99的方法，其中组织样品是来自实体瘤的FNA或活组织检查样本。

项目101.项目99或100的方法，其中实体瘤是乳腺癌，源自泌尿道、输尿管、膀胱或尿道的癌症，肾细胞癌，睾丸癌，前列腺癌，或精囊、精管或阴茎的癌症，卵巢癌，子宫癌，宫颈癌，阴道癌或输卵管癌，神经系统的癌症，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，肠癌，结肠直肠癌，肺癌或黑素瘤。

项目102.项目99或100的方法，其中实体瘤是髓样乳腺癌、间皮瘤或黑素瘤。

项目103.项目95至102中任一项的方法，其中从组织样品分离T淋巴细胞包括对组织样品中的CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞或其任何组合进行选择。

项目104.项目103的方法，其中从组织样品中分离T淋巴细胞还包括在对组织样品中的CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞或其任何组合进行选择之前解离组织样品。

项目105.项目95至104中任一项的方法，其中扩增分离的T淋巴细胞包括使分离的T淋巴细胞与活化剂接触。

项目106.项目105的方法，其中活化剂包含CD3激动剂和/或CD28激动剂。

项目107.项目106的方法，其中活化剂包含抗CD3激动剂抗体。

项目108.项目106或107的方法，其中活化剂包含抗CD28激动剂抗体。

项目109.项目105至108中任一项的方法，其中活化剂与一个或多个珠子连接。

项目110.项目105至108中任一项的方法，其中微流体装置包括至少一个隔离坞，所述至少一个隔离坞被配置为支持分离的T淋巴细胞的扩增，其中所述至少一个隔离坞中的每一个的至少一个表面包含涂层材料，并且其中活化剂与涂层材料共价连接。

项目111.项目110的方法，其中活化剂稳定地结合到涂层材料上。

项目112.项目110的方法，其中活化剂通过生物素-链霉亲和素链接稳定地结合到涂层材料上。

项目113.项目95至112中任一项的方法，其中活化剂包含树突细胞(DC)。

项目114.项目113的方法，其中DC得自正在接受癌症治疗的受试者。

项目115.项目113或114的方法，其中在使分离的T淋巴细胞与活化剂接触之前，用肿瘤抗原脉冲DC。

项目116.项目115的方法，其中从得自受试者的癌细胞中分离肿瘤抗原。

项目117.项目115的方法，其中肿瘤抗原是合成的。

项目118.项目115至117中任一项的方法，其中至少部分地通过对来自得自受试者的癌细胞的核酸分子进行测序来识别肿瘤抗原。

项目119.项目95至118中任一项的方法，其中响应于被活化剂接触而发生扩增的分离的T淋巴细胞表现出至少100倍的扩增。

项目120.项目95至118中任一项的方法，其中响应于被活化剂接触而发生扩增的分离的T淋巴细胞表现出至少1000倍的扩增。

项目121.项目95至120中任一项的方法，其中从微流体装置选择性地输出扩增的T淋巴细胞。

项目122.项目121的方法，其中该方法包括测定一个或多个坞中的一个或多个T淋巴细胞的增殖速率，并选择性地输出增殖速率大于或等于预定阈值的T淋巴细胞。

项目123.项目121或122的方法，其中该方法包括测定一个或多个坞中的一个或多个T淋巴细胞对一种或多种细胞因子的表达，并选择性地输出表达一种或多种细胞因子的T淋巴细胞。

项目124.项目123的方法，其中该一种或多种细胞因子包括INFγ、TNFα、IL2或其任何组合。

项目125.项目121的方法，其中该方法包括测定一个或多个坞中的一个或多个T淋巴细胞对一种或多种调节性T细胞标志物的表达，并选择性地输出表达一种或多种调节性T细胞标志物的T淋巴细胞。

项目126.项目125的方法，其中该一种或多种调节性T细胞标志物包括CTLA4。

项目127.项目95至126中任一项的方法，还包括对输出的T淋巴细胞样本进行基因组分析。

项目128.项目95至127中任一项的方法，其中扩增的T淋巴细胞在从微流体装置输出后但在重新引入到受试者中之前被进一步扩增。

项目129.项目95至128中任一项的方法，其中扩增的T淋巴细胞的输出包括使用介电电泳(DEP)力从其相应的隔离坞中输出扩增的T淋巴细胞。

等同

前述书面说明被认为足以使本领域技术人员能够实施这些实施方案。前面的描述和实施例详述了某些实施方案并描述了预期的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容在文本中看起来如何详细，实施方案可以以许多方式实施，并且应当根据所附权利要求及其任何等同来解释。

Claims (10)

1.一种在微流体装置中扩增T淋巴细胞的方法，所述微流体装置具有流动路径和与流动路径流体连接的隔离坞，其中所述流动路径包括微流体通道，其中所述隔离坞包括分离区域和将分离区域流体连接到通道的连接区域，并且其中隔离坞的分离区域是微流体通道的未扫描区域，所述方法包括：

将一个或多个T淋巴细胞引入到微流体装置中的隔离坞中；

使一个或多个T淋巴细胞与活化剂接触；

通过微流体装置的流动路径灌注培养基达足以使被引入到隔离坞中的一个或多个T淋巴细胞经历扩增的一段时间；以及

从微流体装置输出扩增的T淋巴细胞，

其中隔离坞的至少一个内表面包含涂层材料，其中所述涂层材料共价结合到隔离坞的至少一个内表面，并且其中涂层材料包括含有亚烷基醚部分、糖部分、氨基酸部分或其组合的聚合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中隔离坞具有约5×10⁵至约5×10⁶立方微米的体积，和/或

其中连接区域包括通向微流体通道的具有范围为约20微米至约100微米的宽度Wcon的近端开口和通向所述分离区域的远端开口，并且其中所述连接区域从近端开口到远端开口的长度Lcon是连接区域的近端开口宽度Wcon的至少1.0倍。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述连接区域从近端开口到远端开口的长度Lcon是连接区域的近端开口宽度Wcon的至少1.5倍或2.0倍。

4.如权利要求1所述的方法，其中涂层材料包含一种或多种蛋白质。

5.如权利要求1所述的方法，其中涂层材料包含分子，每个分子包括连接基团和烷基部分，其中连接基团共价键合到隔离坞的至少一个内表面，并且其中涂层材料的分子形成致密堆积的单层结构。

6.如权利要求5所述的方法，其中连接基团是甲硅烷氧基连接基团。

7.如权利要求1所述的方法，其中涂层材料包含具有连接基团和阳离子部分和/或阴离子部分的分子，其中连接基团共价键合到内部衬底表面。

8.如权利要求7所述的方法，其中阳离子部分包含季铵基团或者阴离子部分包括膦酸、羧酸或磺酸。

9.如权利要求1所述的方法，其中活化剂共价连接或稳定结合到涂层材料。

10.如权利要求9所述的方法，其中活化剂通过生物素-链霉亲和素链接而稳定结合到涂层材料。

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