CN110628621B - 一种获得肿瘤特异性t细胞的设备和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种获得肿瘤特异性T细胞的设备，所述设备包括第一培养装置和第二培养装置，所述第一培养装置和所述第二培养装置分别独立地通过管道与第一阀门和第二阀门相连，所述第一阀门与第一微流控装置相连，所述第二阀门与第二微流控装置相连。所述设备和方法基于微流控系统的细胞培养体系，使得T细胞能充分与肿瘤抗原接触从而提高肿瘤特异性T细胞的活化，同时利用液体流控避免T细胞与肿瘤长时间接触而受到免疫抑制，从而使肿瘤特异性T细胞更好的扩增；此技术无需使用患者的原代APC细胞，能有效降低成本，提高重复性和培养的标准化。

Description

一种获得肿瘤特异性T细胞的设备和方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种扩增T细胞的设备，尤其涉及一种获得肿瘤特异性T细胞的设备和方法。
背景技术
T细胞活化需要两个信号的刺激。其中，T细胞活化的第一信号由T细胞表面TCR-CD3复合体与抗原提呈细胞(APC)表面抗原肽-MHC分子复合物结合而组成。活化后的T细胞能特异识别具有相同表面抗原肽-MHC分子复合物的靶细胞，发挥杀伤作用。但肿瘤细胞可以通过下调表达MHC分子，使得T细胞无法充分活化，从而达到免疫逃逸的目的。同时，肿瘤组织具有高度的异质性，不同肿瘤患者、同一肿瘤患者不同病灶、乃至同一病灶不同肿瘤细胞均可能具有不同的分子特征。针对单一靶点的肿瘤特异性T细胞在遇到异质性肿瘤细胞群后，针对不同靶点的T细胞难以接受足够的刺激，启动对肿瘤的杀伤。
而T细胞活化的第二信号，由T细胞表面的共刺激分子(如CD28、CD137、CD134等)与抗原提呈细胞相应配体(如B7、CD137L、CD134L等)结合来提供，能增强T细胞的增殖与存活能力。然而，肿瘤细胞一般不能提供T细胞第二信号的刺激源，而在肿瘤部位具有正常功能的抗原提呈细胞的数量又有限，所以T细胞第二信号的刺激源整体匮乏。同时，肿瘤细胞及其基质细胞还能通过分泌一些抑制免疫的因子(如TGFβ、VEGF、IDO)形成免疫抑制的环境或通过直接接触(如上调肿瘤表面PDL-1，结合到T细胞表面PD-1上，诱导T细胞凋亡)，使T细胞失活。对肿瘤内部的肿瘤特异性T细胞发挥功能造成障碍。
目前扩增T细胞的方法主要依靠MHC配对的抗原提呈细胞(APC)和外源性生长因子，如白介素2(IL-2)联合CD3抗体用于刺激T细胞的增殖，扩增的T细胞主要是CD8阳性T细胞亚群。但使用传统方法获得临床治疗量的抗原特异性T细胞往往需要在培养过程中多次活化和扩增，这一过程中APC的来源无法很好地保证，需投入大量人力，既耗时，成本又高，且重复性差，无法标准化培养。
目前体外培养产生有肿瘤治疗效果的抗原特异性T细胞技术还远未成熟。因此，改进抗原特异性T细胞克隆的扩增方法是非常必要的。在改善抗原特异T细胞的抗肿瘤功能的同时简化抗原特异性T细胞的产出程序无论是提高临床治疗的效果还是细胞产出的标准化都具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种获得肿瘤特异性T细胞的设备和方法，所述设备和方法基于微流控系统的细胞培养体系，使得T细胞能充分与肿瘤抗原接触从而提高肿瘤特异性T细胞的活化，同时利用液体流控避免T细胞与肿瘤长时间接触而受到免疫抑制，从而使肿瘤特异性T细胞更好的扩增；此技术无需使用患者的原代APC细胞，能有效降低成本，提高重复性和培养的标准化。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明目的之一在于提供一种获得肿瘤特异性T细胞的设备，所述设备包括第一培养装置和第二培养装置，所述第一培养装置和所述第二培养装置分别独立地通过管道与第一阀门和第二阀门相连，所述第一阀门与第一微流控装置相连，所述第二阀门与第二微流控装置相连。
作为本发明优选的技术方案，所述第一培养装置与所述第二阀门间的管道入口设置有第一过滤组件。
作为本发明优选的技术方案，所述第一培养装置与所述第二阀门间的管道入口设置有第二过滤组件。
作为本发明优选的技术方案，所述第二培养装置包括搅拌组件。
作为本发明优选的技术方案，所述第一阀门和所述第二阀门分别独立地为电磁阀。
作为本发明优选的技术方案，所述第一阀门通过管道与第一微流控装置相连，所述第二阀门与第二微流控装置相连。
作为本发明优选的技术方案，所述设备包括控制装置，所述控制装置与所述第一阀门、所述第二阀门、所述第一微流控装置以及所述第二微流控装置电连接。
作为本发明优选的技术方案，所述第一微流控装置和所述第二微流控装置分别独立地为多通道恒压泵或单通道注射泵。
优选地，所述多通道恒压泵包括精密调压阀、按键式开关、气压数显示表、显示屏、通道工作显示LED、气源接口、电源接口、网络串口、设备开关以及气流通道。
优选地，所述多通道恒压泵的通道数量为15个。
优选地，所述多通道恒压泵的工作温度为5～70℃，工作湿度为20～80％，工作压力为0～0.7MPa，压力精度为0.001MPa。
本发明中，使用的多通道恒压泵主要用于对气体压力的控制，通过调压阀可以独立控制15个通道的开关以及内部气体的气压，并且通过气体压力控制液体的流量或者流速。调压阀的控制方式有两种：(1)手动方式，通过调压阀的旋钮控制；(2)自动控制，调用程序文件控制电磁阀门。以上两种控制方法均可以调节通道内气体的压强。该产品与汶颢自主研发的电脑软件控制系统联用，可以实现对各类实验进样环节的实时监控及远程控制。用户可根据需要在图形界面中嵌入新的功能键或菜单目录，以实现恒压泵与其他设备的统一管理。该产品使复杂的微流体操控变得方便易行，是各类流体控制设备中的最佳选择。本发明在使用多通道恒压泵时可将第一阀门和/或第二阀门集成至多通道恒压泵中，通过多通道恒压泵外部连接的计算机对第一阀门和/或第二阀门的开合时间以及开合间隔进行程序化控制。
优选地，所述单通道注射泵包括丝杆轴支撑块、丝杆、显示屏、薄膜按键、紧固旋钮、注射器推块、注射器尾部压板、注射器、注射器挡板、注射器支撑块、注射器压块、电源开关以及电源插口。
优选地，所述单通道注射泵的流量单位包括mL/s、mL/min、mL/h、μL/s、μL/min以及μL/h。
优选地，所述单通道注射泵的工作温度为5～40℃，工作湿度为不大于80％，注射器体积为50μL～200mL，最大线速度为65mm/min，最小线速度为1mm/min。
本发明中，使用的单通道注射泵使用方便，操作简单，流体控制的参数设置、修改和查看可在开机主界面中完成，参数输入过程中可直接从列表中选取注射器的型号与内径，也可手动输入，然后再输入其他参数(流量、液量、输液类型)即可，工作过程中可随时暂停任务，且可重新设置各项参数并立即执行。本发明在使用单通道注射泵时可以使用第一阀门和/或第二阀门，可以通过对单通道注射泵本身参数的设定实现输入时间的长短的控制，以及每次输入间隔的控制。
本发明目的之二在于提供一种使用上述设备获得肿瘤特异性T细胞的方法，所述方法包括：
在第一培养装置内放置含有已激活T细胞的培养液，在第二培养装置内壁贴附肿瘤细胞，通过控制所述第一阀门、所述第二阀门、所述第一微流控装置以及所述第二微流控实现T细胞在第一培养装置和第二培养装置间的循环流动，得到所述肿瘤特异性T细胞。
作为本发明优选的技术方案，所述T细胞循环流动的速度为2～10mL/min如3mL/min、4mL/min、5mL/min、6mL/min、7mL/min、8mL/min或9mL/min等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述T细胞循环流动的时间为48～96小时，如56小时、64小时、72小时、80小时或88小时等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述T细胞循环流动的过程中第二培养装置中搅拌组件的搅拌速率为60～120rpm，如70rpm、80rpm、90rpm、100rpm或110rpm等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明提供一种获得肿瘤特异性T细胞的设备和方法，所述设备和方法基于微流控系统的细胞培养体系，使得T细胞能充分与肿瘤抗原接触从而提高肿瘤特异性T细胞的活化，同时利用液体流控避免T细胞与肿瘤长时间接触而受到免疫抑制，从而使肿瘤特异性T细胞更好的扩增；此技术无需使用患者的原代APC细胞，能有效降低成本，提高重复性和培养的标准化。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的获得肿瘤特异性T细胞的设备的结构示意图；
图2a是本发明提供的单通道注射泵正面结构示意图；
图2b是本发明提供的单通道注射泵背面结构示意图；
图3是本发明提供的多通道恒压泵的结构示意图；
图中：1-杆轴支撑块、2-丝杆、3-显示屏、4-薄膜按键、5-紧固旋钮、6-注射器推块、7-注射器尾部压板、8-注射器、9-注射器挡板、10-注射器支撑块、11-注射器压块、12-电源开关、13-电源插口、21-精密调压阀、22-按键式开关、23-气压数显示表、24-显示屏、25-通道工作显示LED、26-气源接口、27-电源接口、28-网络串口、29-设备开关以及210-气流通道。
下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
本发明具体实施方式部分提供一种获得肿瘤特异性T细胞的设备，所述设备包括第一培养装置和第二培养装置，所述第一培养装置和所述第二培养装置分别独立地通过管道与第一阀门和第二阀门相连，所述第一阀门与第一微流控装置相连，所述第二阀门与第二微流控装置相连。
本发明中，所述第一微流控装置以及微流控装置分别独立地可以是恒压泵或注射泵等，但并不仅限于上述微流控装置，可以用于T细胞培养的微流控装置均适用于本设备。
本发明中，所述第一培养装置和第二培养装置分别独立地可以时培养皿、培养器或培养罐等，可以用于细胞培养的任意培养装置均适用于本设备，本领域技术人员可根据生产规模以及培养的肿瘤特异性T细胞的种类进行适当选择。
本发明中，所述第一培养装置与所述第二阀门间的管道入口设置有第一过滤组件，所述第一培养装置与所述第二阀门间的管道入口设置有第二过滤组件。所述过滤组件可以是过滤膜或过滤头，所述过滤装置的目的是防止贴壁的肿瘤细胞被吸入管道，因此过滤组件的孔径应满足可以使T细胞通过而肿瘤细胞不可以通过。所述过滤组件为可拆卸设计，可根据不同肿瘤特异性T细胞的生产需求更换合适的过滤组件。
本发明中，所述第二培养装置包括搅拌组件。所述搅拌组件可以是机械搅拌、磁力搅拌或超声搅拌等，第二培养装置中搅拌组件的设置是为了防止T细胞在第二培养装置中与肿瘤细胞的接触过程中发生沉降。所述搅拌组件的搅拌速率应保证T细胞不发生沉降的同时，贴壁的肿瘤细胞不发生剥离。
本发明中，所述所述第一阀门和所述第二阀门分别独立地优选为电磁阀，其目的是为了所述第一阀门和所述第二阀门可以通过电信号进行控制，从而使本发明提供的获得肿瘤特异性T细胞的设备实现自动化，保证T细胞循环流动的持续性。所述电磁阀至少包括三个通口，可以通过管道连接第一培养装置、第二培养装置以及第一微流控装置或第二微流控装置。
本发明中，所述设备可以使得T细胞在第一培养装置和第二培养装置之间循环流动，在保证T细胞与肿瘤细胞充分接触的同时减少T细胞与肿瘤细胞的接触时间。
本发明中，实现T细胞在第一培养装置和第二培养装置之间循环流动的方法为：开始阶段，首先通过对第一阀门的控制，实现第一微流控装置与第一培养装置和第二培养装置的联通，于此同时，通过对第二阀门的控制，实现对第二微流控装置与第一培养装置和第二培养装置的联通的切断，将一定量的T细胞从第一反应装置注入第二反应装置，注入完毕后，通过实现对第一阀门的控制，实现第一微流控装置与第一培养装置和第二培养装置的联通的切断，T细胞与肿瘤细胞在第二培养装置中接触，实现肿瘤特异性T细胞的培养和扩增，一定时间后通过对第二阀门的控制，实现对第二微流控装置与第一培养装置和第二培养装置的联通，将扩增的T细胞由第二培养装置注入第一培养装置，完成一个T细胞循环，该注入过程中，可同步或稍微滞后的通过对第一阀门的控制，实现第一微流控装置与第一培养装置和第二培养装置的联通，将一定量的T细胞从第一反应装置注入第二反应装置，开始第二个T细胞循环。在一种肿瘤特异性T细胞的培养和扩增过程中，每个T细胞循环的微流控装置的流速，循环时间，以及第一阀门和第二阀门打开以及关闭的时间相同。
本发明具体实施方式中，使用的T细胞为脐带血或外周血来源的CD3+细胞，初始的T细胞的量为5×106～1×10^7，肿瘤细胞为过表达特异抗原的肿瘤细胞系，肿瘤细胞的量为1×106，培养液为RMPI-1640。
本发明具体实施方式中，使用的注射泵为单通道注射泵，其结构如图2a和图2b所示，所述注射泵包括丝杆轴支撑块1、丝杆2、显示屏3、薄膜按键4、紧固旋钮5、注射器推块6、注射器尾部压板7、注射器8、注射器挡板9、注射器支撑块10、注射器压块11、电源开关12以及电源插口13。
本发明具体实施方式中，使用的恒压泵为多通道恒压泵，所述多通道恒压泵的结构如图3所示，所述多通道恒压泵包括精密调压阀21、按键式开关22、气压数显示表23、显示屏24、通道工作显示LED25、气源接口26、电源接口27、网络串口28、设备开关29以及气流通道210。
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
实施例1
本实施例提供一种获得肿瘤特异性T细胞的设备，如图1所示，所述设备包括培养皿A和培养皿B，所述培养皿A和所述培养皿B分别独立地通过PTFE管与第一三通电磁阀和第二三通电磁阀相连，所述第一三通电磁阀通过PTFE管与第一注射泵相连，所述第二三通电磁阀通过PTFE管与第二注射泵相连。培养皿A与所述第二三通电磁阀间的PTFE管入口设置有过滤膜，培养皿B与所述第一三通电磁阀间的PTFE管入口设置有过滤膜。所述第二培养皿装置包括设置于培养皿B底部的电磁搅拌装置。
使用该设备获得肿瘤特异性T细胞的方法包括：
在培养皿A内放置含有已由CD3抗体激活的T细胞的培养液，在培养皿B内壁贴附肿瘤细胞，通过控制所述第一三通电磁阀、第二三通电磁阀、所述第一注射泵以及所述第二注射泵实现T细胞在第一培养装置和第二培养装置间的循环流动，得到所述肿瘤特异性T细胞。
其中，每个T细胞循环中，所述第一注射泵以及所述第二注射泵的流速为2mL/min，第一三通电磁阀和第二三通电磁阀的开启时间为10min，T细胞与肿瘤细胞的接触时间为60min，总的培养时间为96h。
通过上述设备以及方法，最终获得的肿瘤特异性T细胞的数量为初始T细胞数量的3000％。
实施例2
本实施例提供一种获得肿瘤特异性T细胞的设备，其连接方式与实施例1相同，所述设备包括培养皿A和培养皿B，所述培养皿A和所述培养皿B分别独立地通过PTFE管与第一三通电磁阀和第二三通电磁阀相连，所述第一三通电磁阀通过PTFE管与第一恒压泵相连，所述第二三通电磁阀通过PTFE管与第二恒压泵相连。培养皿A与所述第二三通电磁阀间的PTFE管入口设置有过滤膜，培养皿B与所述第一三通电磁阀间的PTFE管入口设置有过滤膜。所述第二培养皿装置包括设置于培养皿B底部的电磁搅拌装置，搅拌装置的速率为60-120转/min。
使用该设备获得肿瘤特异性T细胞的方法包括：
在培养皿A内放置含有已由CD3抗体激活的T细胞的培养液，在培养皿B内壁贴附肿瘤细胞，通过控制所述第一三通电磁阀、第二三通电磁阀、所述第一恒压泵以及所述第二恒压泵实现T细胞在培养皿A和培养皿B间的循环流动，得到所述肿瘤特异性T细胞。
其中，每个T细胞循环中，所述第一恒压泵以及所述第二恒压泵的流速为10mL/min，第一三通电磁阀和第二三通电磁阀的开启时间为20min，T细胞与肿瘤细胞的接触时间为60min，总的培养时间为48h。
通过上述设备以及方法，最终获得的肿瘤特异性T细胞的数量为初始T细胞数量的1000％。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种获得肿瘤特异性T细胞的设备，其特征在于，所述设备包括第一培养装置和第二培养装置，所述第一培养装置和所述第二培养装置分别独立地通过管道与第一阀门和第二阀门相连，所述第一阀门通过管道与第一微流控装置相连，所述第二阀门与第二微流控装置相连，所述第一培养装置与所述第二阀门间的管道入口设置有第一过滤组件，所述第二培养装置与所述第一阀门间的管道入口设置有第二过滤组件，所述第一微流控装置和所述第二微流控装置分别独立地为多通道恒压泵或单通道注射泵；
所述第二培养装置包括搅拌组件，述第一阀门和所述第二阀门分别独立地为电磁阀，所述设备包括控制装置，所述控制装置与所述第一阀门、所述第二阀门、所述第一微流控装置以及所述第二微流控装置电连接；
所述多通道恒压泵的工作温度为5～70℃，工作湿度为20～80％，工作压力为0～0.7MPa，压力精度为0.001Mpa；
所述单通道注射泵的工作温度为5～40℃，工作湿度为不大于80％，注射器体积为50μL～200mL，最大线速度为65mm/min，最小线速度为1mm/min。
2.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述多通道恒压泵包括精密调压阀、按键式开关、气压数显示表、显示屏、通道工作显示LED、气源接口、电源接口、网络串口、设备开关以及气流通道。
3.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述多通道恒压泵的通道数量为15个。
4.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述单通道注射泵包括丝杆轴支撑块、丝杆、显示屏、薄膜按键、紧固旋钮、注射器推块、注射器尾部压板、注射器、注射器挡板、注射器支撑块、注射器压块、电源开关以及电源插口。
5.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述单通道注射泵的流量单位包括mL/s、mL/min、mL/h、μL/s、μL/min以及μL/h。
6.一种使用权利要求1-5任一项所述设备获得肿瘤特异性T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
在第一培养装置内放置含有已激活T细胞的培养液，在第二培养装置内壁贴附肿瘤细胞，通过控制所述第一阀门、所述第二阀门、所述第一微流控装置以及所述第二微流控实现T细胞在第一培养装置和第二培养装置间的循环流动，得到所述肿瘤特异性T细胞。
7.根据权利要求要求6所述的方法，其特征在于，所述T细胞循环流动的速度为2～10mL/min。
8.根据权利要求要求6所述的方法，其特征在于，所述T细胞循环流动的时间为48～96小时。
9.根据权利要求要求6所述的方法，其特征在于，所述T细胞循环流动的过程中第二培养装置中搅拌组件的搅拌速率为60～120rpm。
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