CN112625901B - 一种微流控装置及其在嵌合抗原受体t细胞感染中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微流控装置及其在嵌合抗原受体T细胞感染中的应用。本发明的微流控装置包括进样部、培养部和出样部；所述培养部包括上固定板、下固定板和培养板，所述培养板内部设置有镂空的蛇形培养通道；所述进样部包括注射器、进样管和进样口；所述出样部包括出样口、出样管和阀门。本发明将微流控装置应用于嵌合抗原受体T细胞的感染，关键在于将CD3+T细胞与慢病毒的混合液置于培养通道中进行共培养，培养通道的高度为50‑200μm，T细胞与慢病毒的活动空间减小，同时减小了T细胞和慢病毒之间的距离，增加了T细胞与慢病毒之间的有效接触，提高了T细胞的感染效率，T细胞的感染率达到70％以上。

Description

一种微流控装置及其在嵌合抗原受体T细胞感染中的应用
技术领域
本发明涉及一种微流控装置及其在嵌合抗原受体T细胞感染中的应用，属于细胞免疫治疗和微流控技术领域。
背景技术
在众多临床治疗案例中，嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法是抗肿瘤治疗的方法之一，对于化疗无效的患者，嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法是一种潜在的治疗选择。目前嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法已经显示出对B细胞恶性肿瘤的治疗前景。
嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法的原理是，抗肿瘤相关性抗原的单链可变区片段(scfv)与T细胞激活区域融合，表达于T细胞表面，形成嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigen Receptor T-Cell，CAR-T细胞)，能够特异性识别肿瘤细胞表面的特异性抗原。CD19是大多数B细胞恶性肿瘤表面的标志物，因此可作为CAR-T细胞治疗的有效靶标，现已显示抗CD19嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法(以前称为CTL019)具有较好的治疗效果，可以有效治疗CD19阳性B细胞恶性肿瘤，例如B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在2a期复发或难治性弥漫大B淋巴瘤(DLBCL)成年患者中也观察到了较高的有效率(3个月时缓解率为50％，其中43％的患者在6个月时完全缓解)。
在现有技术中已有优化制备嵌合抗原受体T细胞的方法。中国专利文献CN110499291A(申请号201810467017.6)公开了一种无血清培养制备嵌合抗原受体T细胞的方法，具体地包括步骤(a)提供PBMC细胞；(b)对PBMC细胞进行负分选处理获得经分选的PBMC细胞；(c)对经分选的PBMC细胞进行活化处理得到经活化的T细胞；(d)对经活化的T细胞，用表达嵌合抗原受体的病毒载体进行感染，从而获得经感染的T细胞；(e)对所述经感染的T细胞，进行去除病毒处理，从而获得去除病毒的T细胞；和(f)将去除病毒的T细胞进行扩增培养，从而获得嵌合抗原受体T细胞，在该发明的所有制备步骤中均使用无血清培养基，该发明的无血清培养方法，避免带入与细胞有毒副作用的物质，大大提升了嵌合抗原受体T细胞的培养成功率和安全性。中国专利文献CN107287164A(申请号201710548509.3)公开了一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞、制备方法及应用，该发明的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞，表面表达靶向CD19的嵌合抗原受体基因，靶向CD19的嵌合抗原受体基因中CD19的单链抗体CD19ScFvCD19序列由鼠抗人CD19抗体克隆FMC63的重链和轻链可变区序列经过密码子优化得到，与CAR-T细胞的杀伤效果密切相关，显著提高了CAR-T细胞对靶标为CD19的肿瘤细胞的杀伤能力，并且制备方法经过步骤的优化，使得制备的CAR-T细胞的活化能力强，CD3的比例高，CAR-T细胞的慢病毒感染效率高。
现有技术中，通过改善培养基成分或优化嵌合抗原受体基因序列，来提高CAR-T细胞的成功率和杀伤能力，但是CAR-T细胞的感染效率也是影响CAR-T细胞制备效率的重要因素之一，改善CAR-T细胞的感染效率能够增加CAR-T细胞疗法在临床应用中的潜力。目前CAR-T细胞制备中T细胞感染是将带有目标基因的慢病毒颗粒和T细胞混合孵育，使带有目标基因的嵌合抗原受体在T细胞表面表达。但此种感染方法的缺点在于，感染时T细胞与慢病毒颗粒的有效接触少(由于重力因素，T细胞大多沉于培养基底部，慢病毒悬浮于培养基之中)，所以要使用大量慢病毒，才能使得T细胞得到较高的感染效率，但制备大量的慢病毒无疑会增加CAR-T细胞疗法的经济成本。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种微流控装置及其在嵌合抗原受体T细胞感染中的应用，本发明应用微流控装置共同孵育T细胞和嵌合抗原受体相应慢病毒来增加T细胞的有效感染效率，克服了CAR-T细胞有效感染效率不高的问题，减少了所使用慢病毒的数量，从而减少了CAR-T细胞疗法的经济成本。
本发明的技术方案如下：
一种微流控装置，包括进样部、培养部和出样部；所述培养部包括上固定板(1)、下固定板(2)和培养板(10)，上固定板(1)和下固定板(2)通过螺孔(9)采用螺栓连接，将培养板(10)固定于上固定板(1)和下固定板(2)之间，所述培养板(10)内部设置有镂空的培养通道(11)；所述进样部包括注射器(3)、进样管(4)和进样口(5)，进样管(4)分别与注射器(3)和进样口(5)密封连通，进样口(5)贯穿上固定板(1)并与培养通道(11)的一个端点连通；所述出样部包括出样口(6)、出样管(7)和阀门(8)，出样管(7)分别与出样口(6)和阀门(8)密封连通，所述出样口(6)贯穿上固定板(1)并与培养通道(11)的另一个端点连通。
根据本发明优选的，所述上固定板(1)和下固定板(2)的长度为80-150mm，宽度为40-100mm，厚度为0.5-5mm。
根据本发明优选的，所述培养板(10)的长度为70-140mm，宽度为30-90mm，厚度为0.5-10mm，且培养板(10)的长度和宽度小于等于上固定板(1)或下固定板(2)的长度和宽度。
根据本发明优选的，所述培养通道(11)的高度为50-200μm。本发明中的培养通道用于T细胞与慢病毒的共培养，增加T细胞与慢病毒之间的有效接触，对于培养通道的形状不做具体限定，可以为直线形、U形、W形等，对于培养通道的截面形状也不做具体限定，可以是矩形、圆形、椭圆形等。
根据本发明优选的，所述进样口(5)和出样口(6)为圆柱形，直径为1-3mm。
根据本发明优选的，所述进样口(5)和出样口(6)与培养通道(11)所在平面相互垂直。
根据本发明优选的，所述阀门(8)为二通阀、三通阀或者四通阀。
本发明的微流控装置中培养板(10)的材料为聚二甲基硅氧烷，上固定板(1)、下固定板(2)的材料为丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物。
上述微流控装置在嵌合抗原受体T细胞感染中的应用，包括步骤如下：
将待感染的CD3+T细胞与慢病毒混合得混合液，装入注射器(3)，利用注射器(3)将混合液注射后经过进样管(4)和进样口(5)进入到培养板(10)的培养通道(11)中，使得培养通道(11)中充满混合液，关闭阀门(8)，将微流控装置置于培养箱中进行培养；培养结束后打开阀门(8)，再次利用注射器(3)以完全培养基将培养通道(11)中的培养液沿出样口(6)和出样管(7)从阀门(8)冲出，收集培养液，离心去上清，得到嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。
本发明中的微流控装置在使用之前要进行灭菌消毒，本发明优选的灭菌消毒的操作方法为：先将微流控装置紫外照射0.5-1h；将注射器(3)内充满75％乙醇，经过进样管(4)和进样口(5)注射入培养通道(11)中，至阀门(8)有液体流出，关闭阀门(8)，再将微流控装置紫外照射0.5h；打开阀门(8)，将注射器(3)内充满无菌PBS缓冲液，经过进样管(4)和进样口(5)注射入培养通道(11)中，将75％乙醇冲出。
根据本发明优选的，所述CD3+T细胞在混合液中的浓度为5.0×106～5×109个/mL；进一步优选为5.0×107～5×108个/mL。
根据本发明优选的，所述慢病毒和CD3+T细胞的数量比为(5-100):1；进一步优选为(5-50):1。
根据本发明优选的，所述培养是在37℃、5％CO2条件下静置培养10-20h；优选为37℃、5％CO2条件下静置培养12h。
根据本发明优选的，所述离心为300-500rcf离心3-10min。
本发明中，CD3+T细胞的分离筛选和慢病毒的制备以及其他未详细说明的实验步骤均按照本领域常规方法操作。
有益效果：
1、T细胞在培养感染时，由于重力作用，大多沉于培养基底部，慢病毒悬浮于培养基之中，导致了T细胞与慢病毒的有效接触少，T细胞的感染效率低。本发明提供了一种微流控装置，微流控装置的关键在于，将CD3+T细胞与慢病毒的混合液置于培养通道中进行共培养，培养通道的高度为50-200μm，T细胞与慢病毒的活动空间减小，同时减小了T细胞和慢病毒之间的距离，增加了T细胞与慢病毒之间的有效接触，提高了T细胞的感染效率，T细胞的感染率达到70％以上。
2、本发明采用微流控装置对嵌合抗原受体T细胞的制备方法进行优化，可以有效减少慢病毒的使用量，通过减少慢病毒的使用量，可以有效减少嵌合抗原受体T细胞疗法的治疗成本，进一步减少患者的治疗费用。
附图说明
图1为实施例1微流控装置的示意图；
图2为实施例1微流控装置中培养板和下固定板的示意图；
图3为实施例1微流控装置中培养板水平方向的横截面俯视示意图；
图4为实施例1微流控装置中培养板垂直方向的横截面示意图；
其中：1、上固定板，2、下固定板，3、注射器，4、进样管，5、进样口，6、出样口，7、出样管，8、阀门，9、螺孔，10、培养板，11、培养通道；
图5为不同规格的微流控装置中CD3+T细胞的感染率柱状图；
图6为不同CD3+T细胞浓度在微流控装置中的感染率柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例中涉及的实验方法，若无特殊说明，均为本领域常规操作；实施例中涉及的材料及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。
实施例中所述室温具有本领域公认的含义，一般是指25±2℃。
实施例1
一种微流控装置，其结构示意图如图1-4所示，包括进样部、培养部和出样部；
所述培养部包括上固定板(1)、下固定板(2)和培养板(10)，上固定板(1)和下固定板(2)通过螺孔(9)采用螺栓连接，将培养板(10)固定于上固定板(1)和下固定板(2)之间，所述培养板(10)内部设置有镂空的培养通道(11)；培养通道(11)的形状为连续U形，U形圆弧部分的内直径为8.5mm；培养通道(11)的截面为矩形，培养通道(11)的长度为400mm，宽度为1.5mm，高度为50μm；所述上固定板(1)和下固定板(2)的长度为100mm，宽度为50mm，厚度为1mm；所述培养板(10)的长度为90mm，宽度为40mm，厚度为4mm；
所述进样部包括注射器(3)、进样管(4)和进样口(5)，进样管(4)分别与注射器(3)和进样口(5)密封连通，进样口(5)贯穿上固定板(1)并与培养通道(11)的一个端点连通；
所述出样部包括出样口(6)、出样管(7)和阀门(8)，出样管(7)分别与出样口(6)和阀门(8)密封连通，所述出样口(6)贯穿上固定板(1)并与培养通道(11)的另一个端点连通；所述阀门(8)为三通阀；
所述进样口(5)和出样口(6)为圆柱形，直径为2mm，与培养通道(11)所在平面相互垂直。
上述微流控装置由浙江扬清公司制作，培养板(10)的材料为聚二甲基硅氧烷，上固定板(1)、下固定板(2)的材料为丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物。
按照上述微流控装置的参数，再制作两种不同规格的微流控装置，不同之处在于，培养通道(11)的高度分别为100μm、200μm。
实施例2
实施例1中三种不同规格的微流控装置在嵌合抗原受体T细胞感染中的应用，包括步骤如下：
1.pLVX-CD19CAR质粒构建：
全基因合成CD19-CAR质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，上述核苷酸序列中含有IgK leader、avidin、CD28跨膜区、T2A序列及绿色荧光蛋白序列(GFP)，同时设计上下游酶切位点分别为XhoI和BamHI；用XhoI和BamHI双酶切上述CD19-CAR质粒和pLVX-IRES-Puro质粒；切胶回收，连接，得到pLVX-CD19CAR质粒；
2.质粒大提：将步骤1得到的pLVX-CD19CAR质粒转化stbl3感受态细胞(品牌：全式金)，挑取单克隆至200mL LB培养基，过夜培养，利用质粒大提试剂盒提取质粒(品牌：天根)，测得质粒浓度大于1000ng/μL；
3.制备慢病毒
(1)293FT细胞培养
在培养皿中培养293FT细胞，待细胞铺满后，使用胰酶消化2min，吹打混匀，800rpm离心10min，去掉上清，使用完全培养基使293FT细胞悬浮，计数，传代3个10cm培养皿(约3.0×107个细胞/皿)，培养24h，待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；转染前2h更换新的完全培养基；
完全培养基：高糖DMEM(含丙酮酸钠、谷氨酰胺)，10％胎牛血清(FBS)，GlutaMAX，1％抗生素；
(2)细胞转染
①使用50mL离心管，配制下列溶液：
A液：依次加入下列试剂，涡旋混匀，
Opti-MEM 1.0mL/皿
Lipo3000 30μL/皿
B液：依次加入下列试剂，涡旋混匀，
Opti-MEM 1.0mL/皿
提取的pLVX-CD19CAR质粒 20μg/皿
psPAX2质粒 10μg/皿
PMD2G质粒 5μg/皿
P3000 10μL/皿
②将A液逐滴加入到B液，涡旋混匀，室温静置20min；
③将上述A液和B液的混悬液逐滴加入到步骤(1)293FT细胞培养皿中进行转染，5％CO2，37℃培养48h；
(3)2000rpm离心10min，收集病毒上清，使用0.45μm滤膜过滤，将滤液加入到超速离心管(品牌：Beckman)中，11,0000g、20℃离心2h，弃掉上清，沉淀用500μL的PBS缓冲液吹打溶解，得慢病毒，分装50μL/管备用，放置-80℃保存；
4.原代T细胞的分离和CD3+T细胞的筛选
(1)收集血液样本中的外周血单个核细胞(PBMC)，计数板计数，并采用磷酸盐缓冲液(PH 7.2)重悬得细胞悬液；
(2)将一定剂量的CD3+T细胞分选磁珠加入细胞悬液中，每107个PBMC细胞加入15μL CD3+T细胞分选磁珠(品牌为invitrogen)，充分混合，静置10min；
(3)将分选柱放于分选架上，用0.5mL buffer(磷酸盐缓冲液+0.5％牛血清白蛋白(BSA)+0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA))冲洗分选柱；
(4)将步骤(2)中加入了CD3+T细胞分选磁珠的细胞悬液过分选柱，弃过柱液；
(5)将分选柱取下，用磷酸盐缓冲液冲洗分选柱，将分选柱中的CD3+T细胞冲入培养瓶/皿中，加入淋巴细胞完全培养基(X-vivo15)，得原代CD3+T细胞；
(6)将原代CD3+T细胞计数，配至1.0×106个/mL细胞浓度，在106个细胞中加入30μLDynabeadsCD3/CD28，于5％CO2、37℃培养箱中培养过夜；
5.T细胞的感染和CAR-T细胞的制备
(1)微流控装置消毒：先将微流控装置紫外照射1h；将注射器(3)内充满75％乙醇，经过进样管(4)和进样口(5)注射入培养通道(11)中，至阀门(8)有液体流出，关闭阀门(8)，再将微流控装置紫外照射0.5h；打开阀门(8)，将注射器(3)内充满无菌PBS缓冲液，经过进样管(4)和进样口(5)注射入培养通道(11)中，将75％乙醇冲出；
(2)CAR-T细胞制备：取1.0×107个步骤4得到的CD3+T细胞，300rcf离心5min，去除上清，加入100μL淋巴细胞完全培养基重悬，加入步骤3中所得的慢病毒10μL(慢病毒滴度为108)，混匀得混合液，作为实验组；取1.0×107个步骤4得到的CD3+T细胞，300rcf离心5min，去除上清，加入100μL淋巴细胞完全培养基重悬，混匀得CD3+T细胞重悬液，作为对照组；将实验组CD3+T细胞和慢病毒的混合液装入注射器(3)，利用注射器(3)将混合液注射后经过进样管(4)和进样口(5)进入到微流控装置的培养板(10)的培养通道(11)中，使得培养通道(11)中充满混合液，关闭阀门(8)，将微流控装置放于37℃、5％CO2培养箱中静置培养12h，培养结束后将微流控装置放至已经灭菌的超净工作台内，打开阀门(8)，再次利用注射器(3)以淋巴细胞完全培养基将培养通道(11)中的培养液沿出样口(6)和出样管(7)从阀门(8)冲出，收集培养液，300rcf离心5min，去上清，用4mL淋巴细胞完全培养基重悬得到CD19CAR-T细胞；对照组的CD3+T细胞重悬液按照上述步骤进行操作。
将上述经微流控装置培养得到的细胞置于25cm2培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱中培养8天，隔天补液，使细胞在体外大量增殖。
感染效率测定：培养8天后，取在三种不同规格的微流控装置中培养的实验组和对照组细胞，各取1.0×105个，进行流式细胞术，于FITC通道观察绿色荧光蛋白(GFP)荧光强度的变化，结果发现，在三种不同规格的微流控装置中培养的对照组细胞均检测不到荧光强度，排除了其他因素对荧光强度的影响，而实验组细胞均检测出了荧光强度，计算得到T细胞的感染效率，结果如图5所示，其中，在培养通道高度为50μm、100μm、200μm的微流控装置中培养的CD3+T细胞，感染效率分别为93.78％、90.54％、70.56％，说明了随通道高度的增加，CD3+T细胞和慢病毒的有效接触减少，感染率降低，但是三组实验组的慢病毒感染率均在70％以上，培养通道高度为50μm和100μm的两组实验组的感染率没有明显差异，且感染率更高，达到了90％以上，说明本发明的微流控装置能够使得更多的CD3+T细胞被慢病毒感染，提高了T细胞的感染效率。但100μm的装置一次可以感染更多数量的CD3+T细胞，因此在随后的实验中选择培养通道高度为100μm的微流控装置。
实施例3
本实施例使用实施例1中培养通道高度为100μm的微流控装置进行相关实验。
本实施例中微流控装置在嵌合抗原受体T细胞感染中的应用，实施步骤与实施例2基本相同，不同之处在于，步骤5中T细胞的感染和CAR-T细胞的制备。
本实施例中T细胞的感染和CAR-T细胞的制备，步骤如下：
(1)微流控装置消毒：先将微流控装置紫外照射1h；将注射器(3)内充满75％乙醇，经过进样管(4)和进样口(5)注射入培养通道(11)中，至阀门(8)有液体流出，关闭阀门(8)，再将微流控装置紫外照射0.5h；打开阀门(8)，将注射器(3)内充满无菌PBS缓冲液，经过进样管(4)和进样口(5)注射入培养通道(11)中，将75％乙醇冲出；
(2)CAR-T细胞制备：分别取2.0×107个，2.0×107个，1.0×107个，5×106个步骤4得到的CD3+T细胞，分别置于4个1.5mLEP管中，300rcf离心5min，去除上清，分别加入50μL淋巴细胞完全培养基重悬，第一个50μL重悬液中不加慢病毒，作为对照组，其余三个EP管各加入步骤3中所得的慢病毒10μL(慢病毒滴度为108)，混匀得混合液，作为实验组；将实验组CD3+T细胞和慢病毒的混合液装入注射器(3)，利用注射器(3)将混合液注射后经过进样管(4)和进样口(5)分别进入到微流控装置的培养板(10)的培养通道(11)中，使得培养通道(11)中充满混合液，关闭阀门(8)，将微流控装置放于37℃、5％CO2培养箱中静置培养12h，培养结束后将微流控装置放至已经灭菌的超净工作台内，打开阀门(8)，再次利用注射器(3)以淋巴细胞完全培养基将培养通道(11)中的培养液沿出样口(6)和出样管(7)从阀门(8)冲出，收集培养液，300rcf离心5min，去上清，分别用4mL淋巴细胞完全培养基重悬得到CD19CAR-T细胞；对照组的重悬液按照上述步骤进行操作。
将上述经微流控装置培养得到的细胞置于25cm2培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱中培养8天，隔天加液，使细胞在体外大量增殖。
感染效率测定：培养8天后，各取实验组细胞和对照组细胞1.0×105个，进行流式细胞术，于FITC通道观察绿色荧光蛋白(GFP)荧光强度的变化，结果发现，对照组细胞检测不到荧光强度，排除了其他因素对荧光强度的影响，而实验组不同浓度的CD3+T细胞均检测出了荧光强度，计算CD3+T细胞的感染效率，结果如图6所示，其中，CD3+T细胞为2.0×107个、1.0×107个、5×106个的实验组，感染率分别为78.61％、88.61％、90.26％，说明采用本发明的微流控装置，在慢病毒含量一定的情况下，CAR-T细胞的感染效率较佳，其中CD3+T细胞为2.0×107个和1.0×107个的实验组之间感染率有统计学差异(P＝0.009，T检验)，但CD3+T细胞为1.0×107个和5×106个CD3+T的实验组之间感染率并没有统计学差异(P＝0.626，T检验)。虽然CD3+T细胞为5×106个的实验组感染效率很高，但实际总的CAR-T细胞数量要比另外两组实验组CAR-T细胞数量少。
对比例1
对比例1不采用微流控装置，按照常规方法进行T细胞感染、制备嵌合抗原受体T细胞，实施步骤与实施例2基本相同，不同之处在于，步骤5中T细胞的感染和CAR-T细胞的制备。
对比例1中T细胞的感染和CAR-T细胞的制备，步骤如下：
i)用磷酸盐缓冲液稀释RetroNectin至4μg/mL，加入24孔培养板中，0.5mL/孔，室温孵育2小时；
ii)弃去RetroNectin，每孔加0.5mL含2％牛血清白蛋白(BSA，品牌为索莱宝)的磷酸盐缓冲液，室温孵育30分钟；
iii)将步骤3得到的慢病毒按照MOI＝20加入RetroNectin包被的24孔培养板中(相当于1.0×107个细胞加入了10μL的慢病毒，慢病毒滴度为108)，3000rpm，26℃离心3小时；
iv)将步骤4得到的CD3+T细胞加入步骤iii)中已包被慢病毒的24孔培养板中，CD3+T细胞加量为5×105个/孔，3000rpm，32℃，离心2h；
v)放于培养箱(5％CO2，37℃)培养8天，隔天每孔补培养基50μL，即得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞(CD19CAR-T细胞)，用磁力分选架去除DynabeadsCD3/CD28磁珠。
感染效率测定：在培养箱中培养8天后，取1.0×105个细胞，进行流式细胞术，于FITC通道观察荧光强度的变化，计算得到慢病毒的感染效率为68.41％，低于实施例2和实施例3中相同T细胞条件的感染效率，说明微流控装置可以明显提高慢病毒感染CD3+T细胞的感染效率，在相同的感染效率下，采用本发明的微流控装置进行T细胞感染可以节省慢病毒用量，降低制作成本。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学第二医院
<120> 一种微流控装置及其在嵌合抗原受体T细胞感染中的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2497
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctcgagatgg agacagacac actcctgcta tgggtactgc tgctctgggt tccaggttcc 60
actggtgact atccatatga tgttccagat tatgctgggg cccagccggc cagatctatg 120
gcggaagcgg gtatcaccgg cacgtggtac aaccagtctg gttctacctt caccgttacc 180
gcgggtgcgg acggtaacct gaccggtcag tacgaaaacc gtgcgcaggg cactggttgc 240
cagcactctc cgtacaccct gaccggtcgt tacaacggta ccaaactgga atggcgtgtt 300
gaatggaaca actctaccga aaactgccac tctcgtaccg aatggcgtgg tcagtaccag 360
ggtggtgcgg aagcgcgtat caacacccag tggaacctga cctacgaagg tggttctggt 420
ccggcgaccg aacagggtca ggacaccttc accaaagtta aaccgtctgc ggcgtctgac 480
tacaaggacg atgacgacaa gggcgcgccg tcattcattg aagttatgta tcctcctcct 540
tacctagaca atgagaagag caatggaacc attatccatg tgaaagggaa acacctttgt 600
ccaagtcccc tatttcccgg tacaacggta ccaatttggg tgctggtggt ggttggtgga 660
gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt 720
aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 780
acccgcaagc atgaaggtag aggtagtctc ctcacatgtg gcgatgtaga agagaaccct 840
ggtccgatgg aagatgccaa aaacattaag aaaggcccag cgccattcta cccactcgaa 900
gacgggaccg ctggcgagca gaagccatga agcgctacgc cctggtgccc ggcaccatcg 960
cctttaccga cgcacatatc gaggtggaca ttacctacgc cgagtacttc gagatgagcg 1020
ttcggctggc agaagctatg aagcgctatg ggctgaatac aaaccatcgg atcgtggtgt 1080
gtagcgagaa tagcttgcag ttcttcatgc ccgtgttggg tgccctgttc atcggtgtgg 1140
ctgtggcccc agctaacgac atctacaacg agcgcgagct gctgaacagc atgggcatca 1200
gccagcccac cgtcgtattc gtgagcaaga aagggctgca aaagatcctc aacgtgcaaa 1260
agaagctacc gatcatacaa aagatcatca tcatggatag caagaccgac taccagggct 1320
tccaaagcat gtacaccttc gtgacttccc atttgccacc cggcttcaac gagtacgact 1380
tcgtgcccga gagcttcgac cgggacaaaa ccatcgccct gatcatgaac agtagtggca 1440
gtaccggatt gcccaagggc gtagccctac cgcaccgcac cgcttgtgtc cgattcagtc 1500
atgcccgcga ccccatcttc ggcaaccaga tcatccccga caccgctatc ctgagcgtgg 1560
tgccatttca ccacggcttc ggcatgttca ccacgcgggc tacttgatct gcggctttcg 1620
ggtcgtgctc atgtaccgct tcgaggaaga gctattcttg cgcagcttgc aagactataa 1680
gattcaatct gccctgctgg tgcccacact atttagcttc ttcgctaaga gcactctcat 1740
cgacaagtac gacctaagca acttgcacga gatcgccagc ggcggggcgc cgctcagcaa 1800
ggaggtaggt gaggccgtgg ccaaacgctt ccacctacca ggcatccgcc agggctacgg 1860
cctgacagaa acaaccagcg ccattctgat cacccccgaa ggggacgaca agcctggcgc 1920
agtaggcaag gtggtgccct tcttcgaggc taaggtggtg gacttggaca ccggtaagac 1980
actgggtgtg aaccagcgcg gcgagctgtg cgtccgtggc cccatgatca tgagcggcta 2040
cgttaacaac cccgaggcta caaacgctct catcgacaag gacggctggc tgcatagcgg 2100
cgacatcgcc tactgggacg aggacgagca cttcttcatc gtggaccggc tgaagagcct 2160
gatcaaatac aagggctacc aggtagcccc agccgaactg gagagcatcc tgctgcaaca 2220
ccccaacatc ttcgacgccg gggtcgccgg cctgcccgac gacgatgccg gcgagctgcc 2280
cgccgcagtc gtcgtgctgg aacacggtaa aaccatgacc gagaaggaga tcgtggacta 2340
tgtggccagc caggttacaa ccgccaagaa gctgcgcggt ggtgttgtgt tcgtggacga 2400
ggtgcctaaa ggactgaccg gcaagttgga cgcccgcaag atccgcgaga ttctcattaa 2460
ggccaagaag ggcggcaaga tcgccgtcta gggatcc 2497

Claims (11)

1.一种微流控装置在嵌合抗原受体T细胞感染中的应用，所述微流控装置包括进样部、培养部和出样部；所述培养部包括上固定板（1）、下固定板（2）和培养板（10），上固定板（1）和下固定板（2）通过螺孔（9）采用螺栓连接，将培养板（10）固定于上固定板（1）和下固定板（2）之间，所述培养板（10）内部设置有镂空的培养通道（11）；所述进样部包括注射器（3）、进样管（4）和进样口（5），进样管（4）分别与注射器（3）和进样口（5）密封连通，进样口（5）贯穿上固定板（1）并与培养通道（11）的一个端点连通；所述出样部包括出样口（6）、出样管（7）和阀门（8），出样管（7）分别与出样口（6）和阀门（8）密封连通，所述出样口（6）贯穿上固定板（1）并与培养通道（11）的另一个端点连通；所述应用包括步骤如下：
将待感染的CD3+T细胞与慢病毒混合得混合液，装入注射器（3），利用注射器（3）将混合液注射后经过进样管（4）和进样口（5）进入到培养板（10）的培养通道（11）中，使得培养通道（11）中充满混合液，关闭阀门（8），将微流控装置置于培养箱中进行培养；培养结束后打开阀门（8），再次利用注射器（3）以完全培养基将培养通道（11）中的培养液沿出样口（6）和出样管（7）从阀门（8）冲出，收集培养液，离心去上清，得到嵌合抗原受体T细胞。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微流控装置的上固定板（1）和下固定板（2）的长度为80-150mm，宽度为40-100mm，厚度为0.5-5mm。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微流控装置的培养板（10）的长度为70-140mm，宽度为30-90mm，厚度为0.5-10mm，且培养板（10）的长度和宽度小于等于上固定板（1）或下固定板（2）的长度和宽度。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微流控装置的培养通道（11）的高度为50-200μm。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微流控装置的进样口（5）和出样口（6）为圆柱形，直径为1-3mm。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微流控装置的进样口（5）和出样口（6）与培养通道（11）所在平面相互垂直。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微流控装置的阀门（8）为二通阀、三通阀或者四通阀。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CD3+T细胞在混合液中的浓度为5.0×106~5×109个/mL。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述慢病毒和CD3+T细胞的数量比为（5-100）:1。
10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述培养是在37℃、5% CO2条件下静置培养10-20h。
11.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述离心为300-500 rcf离心3-10min。
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CN108138171B (zh) * 2015-10-08 2022-05-13 国立大学法人名古屋大学 表达嵌合抗原受体的基因修饰t细胞的制备方法
CN106520698A (zh) * 2016-01-05 2017-03-22 苏州汶颢芯片科技有限公司 一种基于微流控芯片的细胞非接触培养方法
CN108841727B (zh) * 2018-05-31 2022-03-04 东南大学 基于微流控芯片的car-t细胞自动化制备系统
US11084035B2 (en) * 2018-10-17 2021-08-10 Shenzhen Eureka biotechnology Co. Ltd Apparatus for cell preparation
CN110628621B (zh) * 2019-10-28 2023-12-22 合肥中科干细胞再生医学有限公司 一种获得肿瘤特异性t细胞的设备和方法

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