CN113563482B

CN113563482B - Cd19靶向性的嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN113563482B
Application number: CN202110886715.1A
Authority: CN
Inventors: 张海龙
Original assignee: Anbei Biomedical Yixing Co ltd
Current assignee: Beijing Anbei Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2021-08-03
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2041-08-03
Also published as: CN113563482A

Abstract

本发明提供CD19靶向性的嵌合抗原受体，含有依次连接的CD19scFv、CD8的铰链区、CD8的跨膜区、4‑1BB共刺激因子和CD3ζ的胞内信号结构域。本发明还提供相应的CAR‑T细胞在制备治疗或辅助治疗肿瘤的产品或在制备杀伤肿瘤细胞的产品中的应用。本申请人在针对CD19的二代CAR的基础上，通过缺失突变，去除掉CD8铰链区的两个甘氨酸，以降低其柔韧性，将这样的CAR‑T细胞命名为2nd‑GG，将经典的CAR‑T细胞命名为2nd。实验发现降低CAR铰链区柔韧性的2nd‑GG细胞相比2nd细胞能更加有效的控制肿瘤负荷，且分泌更少的促炎因子，这有可能会降低CAR‑T细胞在实际使用过程中的不良反应。

Description

CD19靶向性的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于用于肿瘤治疗的生物制品技术领域，具体地，涉及CD19靶向性的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

CD19是B细胞表面的跨膜蛋白(Clusterofdifferentiation19protein，CD19)，它与B细胞活化、信号传导及生长调节密切相关，是B淋巴细胞表面的一种功能受体分子，在B细胞抗原受体(BCR)识别抗原时构成B细胞双重抗原结合模型，参与B细胞内Ca²⁺的转运，调节B细胞的活化与增殖。CD19是正常和恶性B淋巴细胞特异性表面蛋白，在B细胞的发育、增殖和分化以及恶性转化中发挥重要作用。因CD19在B淋巴细胞表达的特异性和恶性肿瘤表达的广泛性，使其成为一个颇具潜力的B淋巴细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点。

CAR-T细胞中CAR的基本结构从胞外到胞内通常包括以下五部分，识别抗原的单链可变区，铰链区，跨膜区，共刺激分子和CD3ζ链。通常将含有一个共刺激分子的CAR-T细胞称为二代CAR-T细胞，含有两个共刺激分子的CAR-T细胞称为三代CAR-T细胞，在二代或者三代CAR的结构基础上继续修饰CAR的结构使其能够自分泌促进自身增殖的细胞因子或者表达增强CAR-T细胞功能的受体结构的CAR称为武装的CAR(Armed CAR)。目前虽然有很多CAR的结构，但是临床应用最广泛的还是二代CAR的结构，其中已经有两个针对CD19的CAR-T细胞已经通过了美国和欧盟的FDA，用以治疗急性B淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤。

其在治疗B细胞恶性肿瘤上取得了突破性的进展，尤其是针对急性B淋巴细胞白血病和B细胞的淋巴瘤。但是其在治疗的过程中也面临着巨大的挑战，其一就是CAR-T在治疗急性B淋巴细胞白血病时经常会引起细胞因子释放综合症(CRS-Cytokine releasesyndrome)，其伴随着CAR-T细胞回输到患者体内的快速扩增，释放大量的细胞因子，同时激活体内的单核巨噬系统，对患者的身体会造成全身性的损害。其典型的症状包括：恶心，发力，发热，肌痛，心动过速，低血压，毛细血管渗漏，心功能不全，和多功能脏器衰竭，发展到后期甚至会引起神经中枢系统的症状。因此如何针对CAR-T的结构进行改进以提高其在临床使用过程中的安全性，以降低CRS发生的频率或者降低CRS的严重程度就显得非常有必要。

同时有一部分患者在接受anti-CD19的CAR-T细胞的治疗经常会出现无效的情况，其中的原因比较复杂，经常认为这和患者具有较大的肿瘤负荷，以及患者的T淋巴细胞功能不全以及患者的复杂的免疫抑制微环境有关。而是不是可以通过优化CAR的结构来提高CAR-T的有效性这也是CAR-T细胞研究的一个重要课题。

目前对于CAR结构元件的的优化主要集中在对于CAR的信号区域元件，即：抗原的识别部位和活化信号区域部位。通过调整CAR的抗原识别区域scFv(single-chainfragment variable)对靶蛋白的亲和力来使其只能识别肿瘤细胞的抗原蛋白，但是避免和正常细胞所表达的肿瘤相关抗原(tumor associated antigen-TAA)结合发生脱靶效应(ontarget offtumor effect)；有很多研究发现具有不同共刺激分子的CAR-T细胞具有不同的生物学效应，相比较CD28作为共刺激分子的CAR-T细胞而言，含有4-1BB的CAR-T细胞其和肿瘤细胞相互作用时激活程度更低一些，释放的细胞因子更少，且在体内的扩增更加慢和持久；还有研究者将CD3ζ的3个免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor TyrosinebasedActivation Motifs-ITAM)进行优化，发现突变一个之后的CAR-T细胞可以通过避免过度活化所导致的死亡(Activation Induced Cell Death-AICD)具有更强的抗肿瘤活性。

但是目前对于CAR的非信号区对CAR-T细胞功能的研究却非常少。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了CD19靶向性的嵌合抗原受体及其应用。本申请人在针对CD19的二代CAR的基础上，通过缺失突变，去除掉CD8铰链区的两个甘氨酸(gly)，以降低其柔韧性，将这样的CAR-T细胞命名为2nd-GG,将经典的CAR-T细胞命名为2nd。通过体内外实验发现降低CAR铰链区柔韧性的2nd-GG细胞相比2nd细胞能更加有效的控制肿瘤负荷，且分泌更少的促炎因子，这有可能会降低CAR-T细胞在实际使用过程中的不良反应。

本发明的第一方面，提供了一种CD19靶向性的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体含有依次连接的识别CD19抗原的多肽(CD19scFv，asingle-chain variable fragment)、CD8的铰链区(hinge)、CD8的跨膜区(transmembrance)、4-1BB(即CD137)共刺激因子和CD3ζ的胞内信号结构域；所述CD8铰链区的氨基酸序列为SEQ ID NO.1中第243-285位氨基酸。

在另一优选例中，

所述CD19scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO.1中第1-242位氨基酸；和/或

所述CD8跨膜区的氨基酸序列为SEQ ID NO.1中第286-309位氨基酸；和/或

所述4-1BB共刺激因子的氨基酸序列为SEQ ID NO.1中第310-351位氨基酸；和/或

所述CD3ζ的氨基酸序列为SEQ ID NO.1中第352-463位氨基酸。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体含有依次连接的信号肽、CD19scFv、CD8的铰链区、CD8的跨膜区、4-1BB共刺激因子和CD3ζ的胞内信号结构域。

所述信号肽可以使用人体内的各种蛋白质的信号肽，如体内分泌的细胞因子蛋白、白细胞分化抗原(CD4/8分子)的信号肽。

在另一优选例中，所述CD19靶向性的嵌合抗原受体的氨基酸序列如下(序列表中SEQ ID NO.1)：

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly AspArg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp TyrGln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu HisSer Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu ThrIle Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn ThrLeu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly SerGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly ProGly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val SerLeu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu TrpLeu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser ArgLeu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser LeuGln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly SerTyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr ThrPro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser LeuArg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe AlaCys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu SerLeu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe LysGln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys ArgPhe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser AlaAsp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu GlyArg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met GlyGly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys AspLys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly LysGly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp ThrTyr Asp AlaLeu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg。

上述任一所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明的第二方面，与上述的嵌合抗原受体相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码上述的嵌合抗原受体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系；

B6)含有B2)所述表达盒的细胞系；

B7)含有B3)所述重组载体的细胞系；

B8)含有B4)所述重组载体的细胞系。

在另一优选例中，B1)中，编码上述的嵌合抗原受体的核酸分子依次包括CD19scFv的编码基因序列、CD8的铰链区的编码基因序列、CD8的跨膜区的编码基因序列、4-1BB共刺激因子的编码基因序列和CD3ζ的胞内信号结构域的编码基因序列。

在另一优选例中，B1)中编码上述的嵌合抗原受体的核酸分子依次包括信号肽的编码基因序列、CD19scFv的编码基因序列、CD8的铰链区的编码基因序列、CD8的跨膜区的编码基因序列、4-1BB共刺激因子的编码基因序列和CD3ζ的胞内信号结构域的编码基因序列。

在另一优选例中，所述编码信号肽的核酸序列为SEQ ID No.2中第1-63位碱基。

在另一优选例中，所述编码CD19scfv的核酸序列为SEQ ID No.2中第64-789位碱基。

在另一优选例中，所述编码CD8-GG的铰链区的核酸序列为SEQ ID No.2中第790-918位碱基。

在另一优选例中，所述编码CD8的跨膜区的核酸序列为SEQ ID No.2中第919-990位碱基。

在另一优选例中，所述编码4-1BB的核酸序列为SEQ ID No.2中第991-1116位碱基。

在另一优选例中，所述编码CD3ζ的核酸序列为SEQ ID No.2中第1117-1452位碱基。

在另一优选例中，上述B1)中，所述核酸分子为SEQ ID No.2所示的DNA分子：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGTAA(SEQ ID No.2)。

在SEQ ID No.2中，第1-63位碱基为编码信号肽的核酸序列，第64-789位碱基为编码CD19scfv的核酸序列，第790-918位碱基为编码CD8-GG的铰链区的核酸序列，第919-990位碱基为编码CD8的跨膜区的核酸序列，第991-1116位碱基为编码4-1BB的核酸序列，第1117-1452位碱基为编码CD3ζ的核酸序列。

上述B2)中，所述表达盒依次由启动子、编码上述嵌合抗原受体的核酸分子和终止子组成。

上述B3)或B4)中，所述载体可为病毒载体。进一步的，所述病毒载体可为逆转录病毒载体或慢病毒载体。

上述B5)或B6)或B7)或B8)中，所述细胞系可为用于病毒包装的细胞系或用于病毒传代培养的细胞系。所述用于病毒包装的细胞系具体可以为393T细胞，所述用于病毒传代培养的细胞系具体可以为293T细胞。

本发明的第三方面，提供一种CAR-T细胞的制备方法，包括如下步骤：将上述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达，得到CAR-T细胞。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的编码基因通过慢病毒表达系统或逆转录病毒表达系统导入T细胞中；

或，将上述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达的方法为方法(一)或方法(二)：

所述方法(一)包括如下步骤：用逆转录病毒感染T细胞；所述逆转录病毒是将重组逆转录病毒载体转染逆转录病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述重组逆转录病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入逆转录病毒载体中得到的；

所述方法(二)包括如下步骤：用慢病毒感染T细胞；所述慢病毒是将重组慢病毒载体转染慢病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述重组慢病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入慢病毒载体中得到的。

在获得嵌合抗原受体的编码基因后，采用本领域的常用制备方法进行CAR-T的制备即可，比如嵌合抗原受体的编码基因通过慢病毒表达系统或逆转录病毒表达系统导入T细胞中并使所述编码基因得到表达。

本发明的第四方面，提供按照上述的方法制备得到的CAR-T细胞；

或，制备得到的上述的逆转录病毒；

或，制备得到的上述的重组逆转录病毒载体；

或，制备得到的上述的慢病毒；

或，制备得到的上述的重组慢病毒载体。

本发明的第五方面，提供上述的嵌合抗原受体，或生物材料，或CAR-T细胞或逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体在制备治疗或辅助治疗肿瘤的产品或在制备杀伤肿瘤细胞的产品中的应用；

在另一优选例中，所述肿瘤的细胞或组织能够表达CD19；

在另一优选例中，所述肿瘤包括急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性B-淋巴细胞白血病(B-CLL)，B细胞霍奇金氏淋巴瘤(B-HL)和非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)。

本发明的第六方面，提供一种治疗或辅助治疗肿瘤的产品，其活性成分为上述的CAR-T细胞或逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体。

本申请人在针对CD19的二代CAR的基础上，通过缺失突变，去除掉CD8铰链区的两个甘氨酸(gly)，以降低其柔韧性，将这样的CAR-T细胞命名为2nd-GG，将经典的CAR-T细胞命名为2nd。通过体内外实验发现降低CAR铰链区柔韧性的2nd-GG细胞相比2nd细胞能加有效的控制肿瘤负荷，且分泌更少的促炎因子，这有可能会降低CAR-T细胞在实际使用过程中的不良反应。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明的嵌合抗原受体的结构示意图。

图2为本发明的CD8α-GG铰链区和原CD8α铰链区的柔韧性比较。

图3为CART细胞的制备流程。

图4为不同结构的CART细胞CAR的表达效率。

图5为荧光显微镜下观察不同结构的CAR-T细胞对786o-CD19-GFP肿瘤细胞的杀伤效果。

图6为不同结构的CAR-T细胞对于K562和NALM-6的杀伤效率。

图7为不同结构的CAR-T细胞分别与K562和NALM-6孵育24小时之后的细胞因子分泌量。

图8为不同结构的CAR-T细胞回输给NALM-6-luc高肿瘤负荷的NSG小鼠的流程图。

图9为不同结构的CAR-T细胞回输给NALM-6-luc高肿瘤负荷的NSG小鼠的活体成像。其中，图中的“X”表示NSG小鼠死亡。

图10为不同结构的CAR-T细胞回输给NALM-6-luc高肿瘤负荷的NSG小鼠的肿瘤负荷荧光值变化以及生存曲线。

图11为不同CAR-T细胞回输的小鼠在第9天和第12天外周血，骨髓和脾脏的肿瘤负荷的流式检测。

图12为不同结构的CAR-T细胞回输给NALM-6低肿瘤负荷的NSG小鼠的流程图。

图13为不同结构的CAR-T细胞回输给NALM-6-luc低肿瘤负荷的NSG小鼠的活体成像。

图14为不同结构的CAR-T细胞回输给NALM-6-luc低肿瘤负荷的NSG小鼠的肿瘤负荷荧光值变化以及生存曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。“wt％”表示重量百分比。

1.标本采集：实验所用的人外周单个核淋巴细胞来源于健康供者，用以制备CART细胞。

2.实验用试剂：CD3，CD28分选并活化T细胞磁珠(美国，Gibco公司)，IL-2(中国，双鹭)，X-VIVO-15(美国，公司lonza)，胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)，Ficoll淋巴细胞分离液(美国GE医疗集团)，FITC-CD19(20-291)(美国，Acro)。

实施例1 CAR-T细胞的制备

一、嵌合抗原受体基因序列的设计与合成

本发明的嵌合抗原受体的结构如附图1所示。

图1为本发明的嵌合抗原受体的结构示意图。

本申请人在针对CD19的原二代CAR的基础上，通过缺失突变，去除掉CD8铰链区的两个甘氨酸(gly)，记为CD8α-GG铰链区，以降低其柔韧性，获得本发明的嵌合抗原受体，本发明的嵌合抗原受体的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

上述核苷酸序列可以委托基因公司直接合成。

1、原二代CAR的CD8铰链区的核苷酸序列为(序列表SEQ ID NO.3)：ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGAT

其中，加粗并下划线的碱基为本发明缺失突变去除的碱基。

2.本发明的二代CAR的CD8铰链区的核苷酸序列为(序列表SEQ ID NO.4)：ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGAT

图2为本发明的CD8α-GG铰链区和原CD8α铰链区的柔韧性比较。

本发明的CAR-T细胞是在CD19的原二代CAR的基础上，去除掉CD8铰链区的两个甘氨酸(gly)得到的，故在本发明中，将其命名为2nd-GG，而将优化前的CAR-T细胞(即未去除掉CD8铰链区的两个甘氨酸)命名为2nd。

二、慢病毒载体的构建、慢病毒载体的包装和制备

慢病毒的制备为本领域的成熟技术，本申请人在设计了CAR的结构后，对应的慢病毒由上海吉凯基因公司负责构建。

三、CAR-T细胞的制备，其制备流程图见图3。

图3为CART细胞的制备流程。

1、第0天，分选PBMC细胞

(1)取一支15ml离心管，加入与血液样本等量的Ficoll淋巴细胞分离液；

(2)用吸管吸取血液样本小心加与分离液面之上，500g/min，离心30min；

(3)离心后，此时离心管中由上至下分为四层，第一层为血浆层，第二层为淋巴细胞层，第三层为分离液层，第四层为红细胞层；

(4)用吸管小心吸取第二层淋巴细胞层到另外的15ml离心管中，向所得的离心管中加入10mlPBS，混匀细胞；

(5)300g/min，离心5min；

(6)弃去上清液，再次加入10mlPBS，重悬细胞；

(7)300g/min，离心5min；

(8)剩下的细胞即为分选的PBMC(Peripheralbloodmononuclearcell)细胞。

2、第0天，采用磁珠法从PBMC中分选CD3⁺T细胞

(1)将步骤1分选的PBMC细胞，用细胞培养液进行重悬，然后放到细胞计数板上进行计数；细胞培养液配方为X-VVO15(商业化的培养基，购买厂家为：LONZA)；

(2)用CD3-precp流式抗体对其表达效率进行检测；

(3)根据细胞总数和CD3⁺的比例计算出分选6×10⁶个CD3⁺的T细胞所需要的PBMC的细胞总数；

(4)将获得的PBMC细胞进行离心，弃去上清，再加入1ml新鲜培养基，使得细胞悬液的体积为1ml；培养基配方为X-VIVO-15；

(5)然后按照1∶1的比例加入等量的分选CD3⁺T细胞的磁珠，并进行充分混匀；

(6)然后手工进行摇动30min，避免细胞悬液沉落在管底；

(7)30min以后，将细胞和磁珠的悬液的离心管放在相应的磁力管架上，1min后，吸取管底的液体；

(8)然后用6ml细胞完全培养液(X-VIVO15,100IU/ml-IL2，streptomycin-100μg/ml，和BSA-0.2wt％)对分选出的细胞进行充分混匀；

(9)然后将细胞悬液加入到底面积为25cm²的培养瓶中，放入CO₂浓度为5％，37℃的恒温培养箱中进行培养，得到分选CD3⁺T细胞。

3、转染慢病毒

(1)第0天，轻轻吹打步骤2得到的CD3⁺T细胞，收集细胞到15ml离心管，室温300g离心3min，用细胞完全培养液重悬细胞至15ml离心管。然后再加入细胞完全培养基6ml，充分进行混匀；细胞完全培养液配方为(X-VIVO15,100IU/ml-IL2)；

(2)将retronectin加入六孔板中，放置过夜，然后将retronectin从六孔板中取出，每孔加入1ml封闭液PBS-2％BSA，室温下放置30min，用移液器取出液体；

(3)然后每孔再加入1mlPBS进行洗涤一遍；

(4)然后对CD3⁺T细胞进行计数，每孔中加入10⁶个CD3⁺T细胞到用retronectin处理完毕的六孔板中；

(5)在六孔板中每个孔加入相应的病毒，按照MO＝10加入病毒；

(6)将六孔板放入二氧化碳培养箱进行培养(5％CO₂，37℃)。

(7)每天对细胞进行观察，每2day对细胞进行传代换液，让CART细胞的密度处于0.5-1×10⁶/ml；换液时，使用的T细胞培养液为(X-VIVO15,100IU/ml-IL2)。

4、第5-6天，进行CART细胞的表达效率的检测

(1)取出大约1×10⁶个的细胞，然后用PBS(1％BSA)洗剂一遍，加上100ul，10ug/mlFITC标记的hCD19蛋白(ACROBiosystem,Cat.No.CD19-HF2H2)，室温孵育40min；

(2)用含2％BSA的PBS缓冲液洗涤细胞三次；

(3)转移细胞至流式管进行分析。

实施例2本发明的CART细胞的性能实验(一)实验分组：

实验组，即本发明的CART细胞，其结构为：

CD19scfv-linker-PD1EM-CD8TM-4-1BB-CD3ζ(以下简称2nd-GG组)

对照组，其CART细胞的结构分别为：

1.未进行修饰的T细胞(简称MockT)，

2.CD19scfv-CD8hinge+TM-4-1BB-CD3ζ(简称2nd，制备方法参照实施例1，与实验组相比，仅CD8铰链区的核苷酸序列不同，其CD8铰链区的核苷酸序列为序列表SEQ IDNO.3)。

(二)在转染慢病毒后第5-6天检测不同结构CART细胞的CAR的表达效率(检测荧光耦合蛋白：CD19-FITC可以特异性的和CD19scfv进行结合)：

采用BDC6流式检测仪，取培养后细胞悬液每50ul均分为1管，每管各加入CD19-FITC(1ug)流式蛋白，各管涡旋震荡后室温下避光孵育60min，加入适量PBS(含1wt％BSA)，400×g室温水平离心3min，弃上清液——再进行两遍清洗，加入PBS100μl上机测定。结果见附图4所示。

图4为不同结构的CART细胞CAR的表达效率。

实验结果：2nd和2nd-GG细胞的CAR的表达效率均为60-80％，且无统计学差异。

(三)CART细胞对786o-CD19-GFP细胞的杀伤(荧光显微镜观察结果)：

1.将靶细胞786o-CD19-GFP和效应细胞(Mock-T，2nd，2nd-GG)进行计数；

2.按照效靶比为1:1，即：10⁵：10⁵个细胞的比例将效应细胞和靶细胞分别进行充分混合；

3.之后将六孔板放置在CO₂培养箱于5％浓度、37℃进行共孵育，24h之后在显微镜下观察细胞的状态。

实验结果：2nd和2nd-GG细胞对786o-CD19细胞产生了特异性的杀伤效果，但是Mock-T细胞并未出现特异性的杀伤，其结果见附图5。

(三)CART细胞和表达不同抗原的细胞孵育进行杀伤实验的实验方法：

具体实验流程如下所示：

1.用CSFE荧光染料将靶细胞进行染色，靶细胞为K562细胞(CD19阴性)和NALM-6细胞，其中，NALM-6细胞能够表达CD19抗原；

2.分别将靶细胞和效应细胞按1:1(Mock-T，2nd，2nd-GG)在EP管中进行混合，37℃进行共孵育12-16小时；

3.300g，3min离心。倒出上清，并加入1mlPBS，然后继续离心，到处上清；

4.在每管中加入结合缓冲液Bindingbuffer200ul,7AAD5ul,Annexin-V-APC5ul，充分混匀后，避光室温孵育15分钟；

5.一个小时内将所有样本上流式细胞仪检测完毕，FITC⁺且7AAD⁺或者Annexin-Ⅴ⁺的细胞为凋亡的细胞。

其中，靶细胞染色的具体方法如下：

(1)将靶细胞取出用PBS进行洗涤一遍，然后计数；

(2)按照1ul细胞染料：10⁶个细胞的比例将细胞和染料进行充分混合；

(3)然后避光孵育15min，之后加入适量的1640培养基(带10wt％FBS)将细胞密度调整到10⁶个/ml即可使用。

实验结果：2nd-GG细胞和2nd细胞可以对表达CD19的细胞产生杀伤效应，其结果见附图6。

图6为不同结构的CAR-T细胞对于K562和NALM-6的杀伤效率。

(四)不同的CART细胞和相应的靶细胞进行共孵育其IFN-γ，TNF-α，IL-2分泌的情况：

1.实验方法：

将不同的CART细胞和相应的靶细胞(靶细胞为K562细胞和NALM-6细胞)按照1:1至2×10⁴：2×10⁴个细胞比例进行充分混合，其培养基为1640(含10wt％FBS)，然后在二氧化碳培养箱中5％浓度、37℃孵育24小时后用ELSA试剂盒进行检测其细胞上清中细胞因子的分泌量。

2.检测结果见附图7：

实验结果：2nd-GG细胞和2nd细胞一样都可以对表达CD19的细胞产生特异性的细胞因子分泌；但是2nd-GG所分泌的细胞因子量远低于2nd细胞，其可能输注人体后不会引起强烈的CRS，因此安全性更强，其结果见附图7。

(五)在NSG小鼠高肿瘤负荷NALM-6-GFP-luc的模型上进行CAR-T细胞的动物实验：

其详细步骤如下：

1.取6-8weeks的NSG雌性小鼠40只，在day0天，每只老鼠回输1×10⁶个的NALM-6-GFP-luc肿瘤细胞；

2.day8天对所有小鼠进行活体成像，然后将小鼠根据肿瘤负荷平均分为4组每组10只小鼠；

3.day9将分好组的小鼠分别进行不同处理，其中第一组作为对照组：无任何处理；第二组小鼠回输和2nd组等量的MockT细胞；第三组小鼠回输2×10⁶个的2ndCAR-T细胞；第四组小鼠回输2×10⁶个的2nd-GGCAR-T细胞；

4.然后分别在day15,19,23,30天对小鼠进行活体成像，以检测其小鼠肿瘤负荷的变化；

5.用流式检测小鼠体内不同器官的肿瘤负荷的变化，由于肿瘤细胞所携带了GFP，所以本申请认为携带绿色荧光蛋白的细胞即为肿瘤细胞。

实验结果：从活体成像的结果上来看在高肿瘤负荷时，经典的二代CAR-T无法控制NSG小鼠的肿瘤负荷(附图9,10)，但是2nd-GG细胞却可以更加有效的延长小鼠的生存曲线(附图10)；从流式的结果可以看出在输注效应细胞后的3天后，也就是第12天，2nd-GG这一组的小鼠，脾脏和骨髓的肿瘤负荷更低，其对于肿瘤的控制要明显的优于MockT和2ndCART这两组细胞(附图11)。

(六)在NSG小鼠低肿瘤负荷NALM-6-GFP-luc的模型上进行CAR-T细胞的动物实验：

其详细步骤如下：

1.取6-8 weeks的NSG雌性小鼠24只，在day0天，每只老鼠回输1×10⁶的NALM-6-GFP-luc肿瘤细胞；

2.day4天对所有小鼠进行活体成像，然后将小鼠根据肿瘤负荷平均分为3组每组8只小鼠；

3.day5将分好组的小鼠分别进行不同处理，其中第一组小鼠回输Mock-T细胞，其回输的细胞总数和2nd这一组的细胞总数一致；第二组小鼠回输2×10⁶的2nd CAR-T细胞；第三组小鼠回输2×10⁶的2nd-GG CAR-T细胞；

4.然后分别在day 15，19，25天对小鼠进行活体成像，以检测其小鼠肿瘤负荷的变化(附图13)；

实验结果见附图14，由图14可以看出：

(1)2ndCAR-T细胞回输的小鼠其对于肿瘤负荷的控制要明显优于Mock-T这一组；

(2)2nd-GG细胞回输的小鼠会比接受2nd细胞回输的小鼠具有更高的生存比率。

图13为不同结构的CAR-T细胞回输给NALM-6-luc低肿瘤负荷的NSG小鼠的活体成像。由图可以看出，Mock-T组在第二十二天仅成活一只小鼠。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京安北生物医药科技有限公司

<120> CD19靶向性的嵌合抗原受体及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

195 200 205

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

245 250 255

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

260 265 270

Ala Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

275 280 285

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

290 295 300

Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

305 310 315 320

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

325 330 335

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

340 345 350

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln

355 360 365

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

370 375 380

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

385 390 395 400

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

405 410 415

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

420 425 430

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

435 440 445

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 2

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctcaa ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840

cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctgccgtgca tacccggggt 900

cttgacttcg cctgcgatat ctacatttgg gcccctctgg ctggtacttg cggggtcctg 960

ctgctttcac tcgtgatcac tctttactgt aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc 1020

tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc 1080

cggttcccag aggaggagga aggcggctgc gaactgcgcg tgaaattcag ccgcagcgca 1140

gatgctccag cctacaagca ggggcagaac cagctctaca acgaactcaa tcttggtcgg 1200

agagaggagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggacggg acccagaaat gggcgggaag 1260

ccgcgcagaa agaatcccca agagggcctg tacaacgagc tccaaaagga taagatggca 1320

gaagcctata gcgagattgg tatgaaaggg gaacgcagaa gaggcaaagg ccacgacgga 1380

ctgtaccagg gactcagcac cgccaccaag gacacctatg acgctcttca catgcaggcc 1440

ctgccgcctc ggtaa 1455

<210> 3

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60

tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120

gacttcgcct gcgat 135

<210> 4

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60

tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctgccgtgc atacccgggg tcttgacttc 120

gcctgcgat 129

Claims

1.CD19靶向性的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体含有依次连接的信号肽、CD19scFv、CD8的铰链区、CD8的跨膜区、4-1BB共刺激因子和CD3ζ的胞内信号结构域；

所述嵌合抗原受体的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.2；

所述嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；

所述CD19scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO.1中第1-242位氨基酸；

所述CD8铰链区的氨基酸序列为SEQ ID NO.1中第243-285位氨基酸；

所述CD8跨膜区的氨基酸序列为SEQ ID NO.1中第286-309位氨基酸；

所述4-1BB共刺激因子的氨基酸序列为SEQ ID NO.1中第310-351位氨基酸；

所述CD3ζ的氨基酸序列为SEQ ID NO.1中第352-463位氨基酸。

2.与权利要求1所述的嵌合抗原受体相关的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：

B1))含有嵌合抗原受体所述核酸分子的表达盒；

B2)含有嵌合抗原受体所述核酸分子的重组载体；

B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；

B4)含有嵌合抗原受体所述核酸分子的细胞系；

B5)含有B1)所述表达盒的细胞系；

B6)含有B2)所述重组载体的细胞系；

B7)含有B3)所述重组载体的细胞系。

3.一种CAR-T细胞，包括如下步骤：将权利要求1所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达，得到CAR-T细胞。

4.根据权利要求3所述的CAR-T细胞，其特征在于：所述嵌合抗原受体的编码基因通过慢病毒表达系统或逆转录病毒表达系统导入T细胞中；

或，将权利要求1所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达的方法为方法(一)或方法(二)：

5.按照权利要求4中所述的方法制备得到的逆转录病毒；

或，按照权利要求4中所述的方法制备得到的重组逆转录病毒载体；

或，按照权利要求4中所述的方法制备得到的慢病毒；

或，按照权利要求4中所述的方法制备得到的重组慢病毒载体。

6.权利要求1所述的嵌合抗原受体，或权利要求2所述的生物材料，或权利要求3或4所述的CAR-T细胞，或权利要求5所述的逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体在制备治疗或辅助治疗肿瘤的产品或在制备杀伤肿瘤细胞的产品中的应用；所述肿瘤的细胞或组织能够表达CD19。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肿瘤包括急性淋巴细胞白血病、慢性B-淋巴细胞白血病，B细胞霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。

8.一种治疗或辅助治疗肿瘤的产品，其活性成分为权利要求3或4所述的CAR-T细胞，或权利要求5所述的逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体。