CN114891123B - 一种基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

一种基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体及其应用。本发明涉及一种基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括依次串联的抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域和自毁结构域；其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原CD79b，所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原CD79b的人源化设计的单链抗体，所述自毁结构域为胱天蛋白酶9结构域。本发明的嵌合抗原受体实际应用于表达肿瘤特异靶点CD79b的肿瘤病人中，有更小的临床副作用与更高的安全性，可有效杀伤肿瘤细胞，并于病人体内长期监测到CAR‑T的存在，有效延长病人整体生存率。

Description

一种基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体(4SCAR-79b)及其应用，具体涉及以肿瘤特异靶点CD79b为基础的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。
背景技术
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。通常，CAR包含抗体的单链片段可变(Single chain fragmentvariable，scFv)区或对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与T细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与T细胞效应物功能触发(例如CD3ζ)部分串联的T细胞共刺激结构域。CAR介导的过继性免疫疗法允许CAR-移植的T细胞以非HLA限制性方式直接识别靶肿瘤细胞上的TAA。
B细胞淋巴瘤是B细胞发生的实体肿瘤。包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。其分型众多，经典霍奇金淋巴瘤和结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤，现在被认为是起源于B细胞的肿瘤。弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)5种B细胞非霍奇金淋巴瘤最为常见，占非霍奇金淋巴瘤的四分之三。
根据临床表现的不同，B细胞淋巴瘤分为惰性淋巴瘤和侵袭性淋巴瘤。惰性淋巴瘤通常发展缓慢，可保持多年疾病稳定及长期生存，但无法治愈。侵袭性淋巴瘤通常需要较强烈的治疗方法，但有治愈的可能。B细胞淋巴瘤的预后和治疗取决于淋巴瘤的具体类型以及分期分级。治疗这些患者的一种方法是通过CAR的表达，对T细胞进行遗传修饰以靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。CAR是经设计以人的白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)非依赖性方式识别细胞表面抗原的抗原受体。尝试使用表达CAR的遗传修饰细胞来治疗这些类型的患者，这种治疗方式已经取得了有前景的成功。
CD79b是B细胞受体(BCR)信号复合物的一部分，是成功发育和维持成熟B细胞的关键细胞表面受体。CD79b的表达一般仅限于B细胞系，并且在大多数非霍奇金淋巴瘤亚型上保持高表达，因此是免疫治疗靶向B细胞相关肿瘤理想的肿瘤抗原之一，目前在B细胞肿瘤的免疫治疗中，发展较为成熟的有针对CD19的抗体治疗，此方式在临床上取得初步的成功，但抗体治疗的问题在于，抗体施打后存在于外围血当中较难精准地进入肿瘤组织或肿瘤微小残留的部位，且抗体施打后无法长期存在体内，而此抗CD19抗体为人源-鼠源嵌合的抗体结构，人体可能对其产生抗性，增加了再治疗的困难性。
因此，制备一种完全人源化的嵌合抗原受体，靶向除了CD19以外的B细胞表面抗原，如CD79b的CAR-T细胞，除了具有抗体靶向治疗的优点，且因为T细胞本身的特性与肿瘤表面抗原的高表达，可精准地进入肿瘤组织，并长期的存在于体内，必能提供一种针对复发难治的B细胞肿瘤的更有效的治疗选择。
发明内容
针对目前CAR-T技术治疗肿瘤中靶向抗原仍然不多，以及肿瘤微环境影响CAR-T技术治疗效果的情况，本发明的目的在于提供一种基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体及其应用，本发明制备的嵌合抗原受体(4SCAR-79b)通过将人源化的CD79b抗体基因修改的CAR-T细胞进行优化改造，从而提高了抗原靶点的免疫长效性与安全性，增强了CAR-T细胞的治疗效果。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体(4SCAR-79b)，所述嵌合抗原受体包括依次串联的抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域和自毁结构域；
所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原CD79b的单链抗体，所述肿瘤表面抗原CD79b的单链抗体的氨基酸序列选自：
如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或者如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合CD79b和诱导T细胞信号传导功能的氨基酸序列。
本发明中，所述氨基酸取代可以是一个或多个。
本发明中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原为CD79b。通过对抗原结合结构域的单链抗体与CAR的特殊设计基因结构进行改造，从而使得基因修改过后的CAR-T细胞能够特异地结合在肿瘤的表面抗原上，获得相对比较适度的信号刺激，发挥有效的杀伤作用，同时缓慢释放免疫因子，降低免疫因子风暴危险，相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果与安全性。
所述针对肿瘤表面抗原CD79b的单链抗体氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下：
QVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSLSNYAVSWVRQPPGKGLEWLGIIYIETGTTWYANWAKGRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASEPYEPYDDSNIYYGMDPWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSSEGSTKGEIVMTQTPATLSVSAGERVTITCQASQSVVSGNYLAWYQQKPGQAPRLLIYSASTLASGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCLGEFSCSSHDCNAFGQGTKLEIK。
本发明中，所述针对肿瘤表面抗原CD79b的CAR信号结构进行了特异性改造，也能快速针对不同的CD79b单链抗体进行改造，使得改造后的4SCAR-79b表达出来的免疫刺激力更强。
优选地，所述如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过氨基酸的取代、添加或缺失而形成的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，优选为具有至少95％同一性的氨基酸序列，例如可以是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％等。
本发明中，所述改造后的氨基酸序列仍然能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合CD79b和诱导T细胞信号传导功能。
优选地，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域。
本发明中，所述CD28跨膜结构域包括CD28细胞膜外和CD28细胞膜传导结构域。
在一些具体实施方案中，可以通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域。
优选地，所述共刺激信号传导结构域为CD28信号传导结构域和CD27信号传导结构域的组合。
本发明中，所述CD28信号传导结构域包括细胞外、细胞膜和细胞内传导结构域组合成CD28全信号传导结构域，所述CD28全信号传导结构域和CD27信号传导结构域的排列，本领域技术人员可以根据需要进行调整，CD28全信号传导结构域和CD27信号传导结构域不同的排列不会对所述嵌合抗原受体产生影响，本申请采用CD28-CD27的顺序组合。
优选地，所述共刺激信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2的具体序列如下：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSASGGGGSGGGGSQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP。
在本发明中，所述共刺激信号传导结构域中还包括linker序列，其中linker序列为两个或是多个GGGGS或是相关区域linker序列的重复序列。
在本发明中，所述CD28全信号传导结构域包括CD28细胞外信号、CD28细胞膜信号和CD28细胞内信号；
所述CD28细胞外信号的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP。
所述CD28细胞膜信号的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV。
所述CD28细胞内信号的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体如下：
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS。
所述CD27信号传导结构域包括CD27细胞内信号，所述CD27细胞内信号的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体如下：
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP。
优选地，所述自毁结构域包含胱天蛋白酶9结构域。
优选地，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO.7)如下：
MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS。
优选地，所述自毁结构域通过2A序列与CD3ζ信号传导结构域相串联。
本发明中，所述2A序列会使所述自毁结构域表达的蛋白与所述嵌合抗原受体蛋白断裂开，从而使得所述嵌合抗原受体能够发挥作用，而通过注入激活剂，从而使得自毁结构域激活，从而导致嵌合抗原受体失去作用。
在本发明中，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，能够指导嵌合抗原受体跨膜转移的信号肽都是可行的，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规的信号肽，所述信号肽为Secretory信号肽，所述Secretory信号肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8或SEQ IDNO.9。
SEQ ID NO.8：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP。
SEQ ID NO.9：MALPVTALLLPLALLLHAARP。
本发明中，所述嵌合抗原受体还可以包括铰链区，所述铰链区本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不做特殊限定，铰链区的存在不会对本发明的嵌合抗原受体的性能产生影响。
本发明中，所述嵌合抗原受体还包括启动子，所述启动子可以为EFla或任何一种高表达的启动子，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不做特殊限定，启动子的存在不会对本发明的嵌合抗原受体的性能产生影响。
优选地，所述嵌合抗原受体包括依次串联的信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和自毁结构域。
优选地，所述嵌合抗原受体为Secretory信号肽、CD79b抗原结合结构域、CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域、CD28信号传导结构域、CD27信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成。
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明中，所述嵌合抗原受体的组成为Secretory signal-CD79b scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9，所述Secretory signal-CD79b scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9命名为4SCAR-79b嵌合抗原受体，所述4SCAR-79b嵌合抗原受体为Secretory信号肽、人源化单链CD79b抗原结合结构域、CD28跨膜结构域、CD28全信号传导结构域、CD27信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成，具体排列如下：
Secretory signal-CD79bscFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9。
在本发明中，所述嵌合抗原受体(4SCAR-79b)Secretory signal-CD79b scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示：
SEQ ID NO.10：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSLSNYAVSWVRQPPGKGLEWLGIIYIETGTTWYANWAKGRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASEPYEPYDDSNIYYGMDPWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSSEGSTKGEIVMTQTPATLSVSAGERVTITCQASQSVVSGNYLAWYQQKPGQAPRLLIYSASTLASGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCLGEFSCSSHDCNAFGQGTKLEIKAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSASGGGGSGGGGSQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPGGGGSGGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS。
第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面述的基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体。
第三方面，本发明提供一种病毒载体，所述病毒载体包括至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。
优选地，所述病毒载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体，优选为慢病毒载体。
第四方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒是由包括如下步骤的制备方法制得的：将第三方面所述的病毒载体与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSVG共转染哺乳动物细胞得到所述重组慢病毒。
优选地，所述哺乳动物细胞包括293细胞、293T细胞或TE671细胞。
第五方面，本发明提供一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞是由包括如下步骤的制备方法制得的：将第四方面所述的重组慢病毒转染到T细胞中表达，得到所述嵌合抗原受体T细胞。
本发明中，所述T细胞具有良好的靶向杀伤作用，同时能够释放低剂量免疫因子，具备低毒性高免疫杀伤反应性质。
第六方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括第一方面所述的基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体、第四方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的嵌合抗原受体T细胞中任意一种或至少两种的组合。
第七方面，本发明提供第一方面所述的基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体、第四方面所述的重组慢病毒、第五方面所述的T细胞或第六方面所述的组合物中任意一种或至少两种的组合在制备肿瘤治疗药物中的应用。
优选地，所述肿瘤为CD79b特异抗原表达的肿瘤疾病。
优选地，所述CD79b特异抗原表达的肿瘤疾病为B细胞肿瘤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的嵌合抗原受体通过对所述针对肿瘤表面抗原CD79b的嵌合抗原受体的T细胞内共刺激信号传导结构域进行特定的基因改造，改造后的嵌合抗原受体在专一性地与CD79b结合后有更好的反应效果，使得CAR-T细胞对肿瘤产生更强的免疫反应；
(2)本发明实际应用于人体后，相较于其他靶向CD79b的嵌合抗原受体T细胞，具有更高的安全性，即使发生了不良反应，由于具有诱导凋亡机制信号，也能透过诱导CAR-T细胞凋亡的药物将其撤除；
(3)本发明的4SCAR-79b嵌合抗原受体在进行CAR-T细胞输注后，可于体内长期监测到CAR-T的存在，证明其具有长效性，能使病人达到长期缓解的效用。
附图说明
图1为实施例1中嵌合抗原受体T细胞的作用机理的示意图；
图2为实施例1中4SCAR-79b嵌合抗原受体的结构示意图；
图3为实施例1中慢病毒载体的骨架载体pTYF的质粒图谱；
图4A为实施例5中24h与48h时不同类型的T细胞对CD79b阳性肿瘤细胞株的体外杀伤图片(放大倍数为50×)；
图4B为实施例5中24h与48h时不同类型的T细胞对CD79b阳性肿瘤细胞株杀伤后的流式细胞仪定量剩余靶细胞的统计结果图片；
图4C为实施例5中24h时不同类型的T细胞对CD79b阳性肿瘤细胞株杀伤后靶细胞死亡比例的统计结果图片；
图5为实施例6中4SCAR-79b-CAR-T治疗B细胞肿瘤的流程示意图；
图6为实施例6中DLBCL患者的肿瘤切片免疫组化染色结果图(放大倍数为20×)；
图7为实施例6中DLBCL患者4SCAR-79b-CAR-T输注后体内CAR拷贝数侦测曲线图；
图8为实施例6中DLBCL患者4SCAR-79b-CAR-T输注前后右边脸部肿瘤的变化图片。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1：嵌合抗原受体的构建
嵌合抗原受体T细胞的作用机理的示意图如图1所示。通过全基因合成Secretory信号肽、人源化单链CD79b scFv抗原结合结构域、CD28细胞膜外和CD28细胞膜传导结构域、CD28信号传导结构域和CD27信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域。得到所述嵌合抗原受体Secretory signal-CD79b scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9，记为4SCAR-79b嵌合抗原受体，所述4SCAR-79b嵌合抗原受体的结构示意图如图2所示。
所述嵌合抗原受体的氨基酸序列SEQ ID NO.10如下：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSLSNYAVSWVRQPPGKGLEWLGIIYIETGTTWYANWAKGRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASEPYEPYDDSNIYYGMDPWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSSEGSTKGEIVMTQTPATLSVSAGERVTITCQASQSVVSGNYLAWYQQKPGQAPRLLIYSASTLASGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCLGEFSCSSHDCNAFGQGTKLEIKAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSASGGGGSGGGGSQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPGGGGSGGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS。
将编码4SCAR-79b嵌合抗原受体的核苷酸序列与慢病毒载体的骨架载体pTYF连接得到pTYF DNA载体，慢病毒载体的骨架载体pTYF的质粒图谱如图3所示。
实施例2：慢病毒包装
(1)培养293T细胞17-18h；
(2)加入新鲜的DMEM，内含10％的FBS；
(3)在无菌离心管中加入以下试剂：每孔取DMEM加入helper DNA mix(pNHP，pHEF-VSV-G和GFP reporter plasmid)以及pTYF DNA载体，漩涡振荡；
(4)从每孔板中央吸取Superfect或类似转导基因材料加至离心管中吹打5次，室温静置7-10分钟；
(5)将离心管中的DNA-Superfect混合液逐滴加入至每个培养孔中，漩涡打匀；
(6)37℃、CO2培养箱里培养4-5h；
(7)用1.5mL新鲜培养基冲洗细胞，并加入培养基继续培养；
(8)将培养基放回培养箱中培养过夜，第二天早上用荧光显微镜观察GFP表达评估转染效率。
实施例3：慢病毒的纯化和浓缩
1)病毒纯化
通过离心(1000g)除去细胞碎片，得到病毒上清液，用一个低蛋白结合过滤器将病毒上清液过滤，病毒被分装成小份，储存在-80℃；
通常情况下，在每毫升的培养基中，转染细胞可以产生107转导单位滴度的慢病毒载体。
2)用过滤器浓缩慢病毒载体
(1)在生物安全柜中，浓缩管用无菌PBS清洗；
(2)管中加入病毒上清液，然后在2500g离心到病毒体积减小50倍；
(3)振荡，然后在400g离心，收集浓缩的病毒到收集杯中，最后将所有管中的病毒集中到一个离心管中，浓缩后可产生>109转导单位滴度的慢病毒载体。
实施例4：4SCAR-79b-CAR-T细胞的制备
将活化后的T细胞接种于培养液中并且添加polybrene(聚凝胺)，培养液含有T细胞生长因子IL-2等，加入浓缩的CAR基因慢病毒，以100g离心速度，离心100分钟后培养过夜，加入培养液，培养4天后，将细胞收获并计数，进行靶细胞杀伤与安全检测，再培养1-2天后输至病人。
所述4SCAR-79b-CAR-T细胞能够有效使肿瘤缩小，且安全，具体将通过体外试验和体内试验分别验证。
实施例5：4SCAR-79b-CAR-T细胞的体外杀伤试验
(1)将CD79b阳性的肿瘤细胞株以慢病毒载体送入绿色荧光蛋白(GFP)使其稳定表达作为标志靶细胞；
(2)将非专一性的对照T细胞(不含CAR转基因的T细胞，或是靶细胞不表达的阴性抗原对照CART，如CD33-CART)或不同于CD79b scFv的阳性抗原对照CAR-T细胞(靶细胞表达的另外一个抗原靶点对照CART，如CD19-CART)，与上述肿瘤置于37℃、5％CO2培养箱共培养24-72h；
(2)以荧光显微镜观察肿瘤细胞存活的情形，死亡的肿瘤细胞会失去绿色荧光蛋白的表达，以此评估不同4SCAR-79b-CAR-T细胞的体外杀伤效率，结果如图4A、图4B和图4C所示，图中79b-CART代表4SCAR-79b-CAR-T；图4A为24h与48h时不同类型的T细胞对CD79b阳性肿瘤细胞株的体外杀伤图片(放大倍数为50×)；图4B为24h与48h时不同类型的T细胞对CD79b阳性肿瘤细胞株杀伤后的流式细胞仪定量剩余靶细胞的统计结果图片；图4C为24h时不同类型的T细胞对CD79b阳性肿瘤细胞株杀伤后靶细胞死亡比例的统计结果图片。
从图4A、图4B和图4C可以看出，相较于CART阴性对照组，4SCAR-79b-CAR-T实验组(79b-CART)对肿瘤细胞株有明显的杀伤，因此证实所述CAR载体材料可以快速筛选出有效CAR结构，并进行后续临床应用。
实施例6：人源化4SCAR-79b-CAR-T细胞的治疗效果
本实施例中患者为来自某临床实验治疗合作儿童医院。
(1)4SCAR-79b-CAR-T治疗B细胞肿瘤的流程示意图如图5所示，弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B-cell Lymphoma，DLBCL)肿瘤患者的肿瘤白片由免疫组化染色确认CD79b的阳性表达，结果如图6所示，图6为DLBCL患者的肿瘤切片免疫组化染色结果图(放大倍数为20×)，CD79b在DLBCL肿瘤组织中高表达。
(2)采集病人白血球浓厚液，以Ficoll进行密度梯度离心法分离白血球浓厚液中的外围单个核淋巴细胞，并使用CD3抗体磁珠筛选出T细胞并加入抗CD28的抗体进行T细胞活化，以1×106CAR-T细胞数/公斤体重计算进行后续4SCAR-79b-CAR-T制备；
(3)输注前病人以小剂量化疗进行预处理，预处理方案为环磷酰胺250mg/m2使用三天，氟达拉滨25mg/m2使用三天，预处理与CAR-T输注间隔24h，总共3天(化疗方案依据病人情况，此实施例仅作为参考)；
(4)以静脉注射方式输注CAR-T细胞；
(5)输注后由医生对病人进行监测与毒性反应评估；
(6)输注后定期抽取病人少量外周血，分离外周单个核淋巴细胞后抽取细胞染色体DNA(genomic DNA，gDNA)，使用专一性引物以qPCR方式定量外围血中CAR拷贝数，结果如图7所示，图7为DLBCL患者4SCAR-79b-CAR-T输注后体内CAR拷贝数侦测曲线图；从图7可观察到病人输注CAR-T后7天左右，体内CAR-T值达到高峰，并可于体内维持约60天，同时不会发生免疫因子风暴(CRS)；
(7)4SCAR-79b-CAR-T输注后，对DLBCL患者脸部肿瘤大小进行评估，结果如图8所示，图8为DLBCL患者4SCAR-79b-CAR-T输注前后右边脸部肿瘤的变化图片；从图8可以看出，病人在输注4SCAR-79b-CAR-T后19天，右边脸部肿瘤缩小，右眼功能恢复。
综上所述，本发明的4SCAR-79b嵌合抗原受体相比于其它报道的嵌合抗原受体有更好的效果，且具有安全性(无或是低CRS反应)和长效性，对于B细胞肿瘤病人确实达到比较好的疗效。
申请人声明，本申请通过上述实施例来说明本申请的详细方法，但并不局限于上述详细方法，即不意味着本申请必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本申请的任何改进，对本产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本申请的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 北京美康基免生物科技有限公司
<120> 一种基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体及其应用
<130> 2022
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Ile Glu Thr Gly Thr Thr Trp Tyr Ala Asn Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Glu Pro Tyr Glu Pro Tyr Asp Asp Ser Asn Ile Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Ala Gly
145 150 155 160
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Val Ser Gly
165 170 175
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
180 185 190
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val
210 215 220
Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Leu Gly Glu Phe Ser Cys
225 230 235 240
Ser Ser His Asp Cys Asn Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
245 250 255
Lys
<210> 2
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
65 70 75 80
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
85 90 95
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys
115 120 125
Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro
130 135 140
Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys
145 150 155 160
Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
165
<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 5
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 6
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 7
<211> 401
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe
1 5 10 15
Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu
20 25 30
Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys
35 40 45
Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val
50 55 60
Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp
65 70 75 80
Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala
85 90 95
Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Met Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu
115 120 125
Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly
130 135 140
His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu
145 150 155 160
Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg
165 170 175
Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala
180 185 190
Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Arg Gln Asp His Gly
195 200 205
Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala
210 215 220
Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro
225 230 235 240
Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro
245 250 255
Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly
260 265 270
Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp
275 280 285
Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu
290 295 300
Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr
305 310 315 320
Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser
325 330 335
Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp
340 345 350
Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu
355 360 365
Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro
370 375 380
Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser Ala
385 390 395 400
Ser
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 10
<211> 996
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly
20 25 30
Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly
35 40 45
Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Ile Glu Thr Gly Thr Thr
65 70 75 80
Trp Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Glu Pro Tyr Glu Pro Tyr Asp Asp
115 120 125
Ser Asn Ile Tyr Tyr Gly Met Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser
145 150 155 160
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Thr
165 170 175
Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser
180 185 190
Gln Ser Val Val Ser Gly Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
195 200 205
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
210 215 220
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr
225 230 235 240
Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys
245 250 255
Leu Gly Glu Phe Ser Cys Ser Ser His Asp Cys Asn Ala Phe Gly Gln
260 265 270
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro
275 280 285
Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val
290 295 300
Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys
305 310 315 320
Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
325 330 335
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
340 345 350
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
355 360 365
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
370 375 380
Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
385 390 395 400
Ser Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu
405 410 415
Pro Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser
420 425 430
Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser
450 455 460
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
465 470 475 480
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
485 490 495
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
500 505 510
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
515 520 525
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
530 535 540
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
545 550 555 560
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Thr Ser Gly Ser Gly
565 570 575
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
580 585 590
Pro Gly Pro Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly
595 600 605
Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly
610 615 620
Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys
625 630 635 640
Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu
645 650 655
Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile
660 665 670
Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro
675 680 685
Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly
690 695 700
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Met Val Gly Ala Leu
705 710 715 720
Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu
725 730 735
Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu
740 745 750
Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu
755 760 765
Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp
770 775 780
Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Arg Gln
785 790 795 800
Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly
805 810 815
Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp
820 825 830
Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr
835 840 845
Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala
850 855 860
Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser
865 870 875 880
Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro
885 890 895
Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser
900 905 910
Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly
915 920 925
Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr
930 935 940
Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser
945 950 955 960
Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys
965 970 975
Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys
980 985 990
Thr Ser Ala Ser
995

Claims (10)

1.一种基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由Secretory信号肽、人源化单链CD79b scFv抗原结合结构域、CD28细胞膜外和CD28细胞膜传导结构域、CD28信号传导结构域和CD27信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成；
所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体。
3.一种病毒载体，其特征在于，所述病毒载体包括至少一个拷贝的权利要求2所述的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体。
5.根据权利要求4所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体。
6.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒是由包括如下步骤的制备方法制得的：将权利要求3-5中任一项所述的病毒载体与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSVG共转染哺乳动物细胞得到所述重组慢病毒。
7.根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征在于，所述哺乳动物细胞包括293细胞、293T细胞或TE671细胞。
8.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞是由包括如下步骤的制备方法制得的：将权利要求6或7所述的重组慢病毒转染到T细胞中表达，得到所述嵌合抗原受体T细胞。
9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体、权利要求6或7所述的重组慢病毒或权利要求8所述嵌合抗原受体T细胞中任意一种或至少两种的组合。
10.权利要求1所述的基于CD79b人源化抗体的嵌合抗原受体、权利要求6或7所述的重组慢病毒、权利要求8所述T细胞或权利要求9所述的组合物中任意一种或至少两种的组合在制备肿瘤治疗药物中的应用；所述肿瘤为CD79b特异抗原表达的肿瘤疾病；所述CD79b特异抗原表达的肿瘤疾病为B细胞肿瘤。
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