CN109265565A

CN109265565A - 一种携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞和应用

Info

Publication number: CN109265565A
Application number: CN201811176437.5A
Authority: CN
Inventors: 储剑虹; 吴德沛; 蒋东鹏
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Chongqing Tianyimei Life Science Co ltd
Priority date: 2018-10-10
Filing date: 2018-10-10
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2038-10-10
Also published as: CN109265565B

Abstract

本发明涉及一种携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞和应用，所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体包括抗CD79b嵌合抗原受体和连接在所述的抗CD79b嵌合抗原受体上的分子开关，所述的抗CD79b嵌合抗原受体包括信号肽(Leader)、能够和肿瘤表面抗原CD79b结合的抗原结合区结构域、铰链区(hinge)、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域。本发明的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体和免疫细胞结构稳定性高，可以用于治疗表达CD79b表面抗原的恶性肿瘤，同时还能防止因脱靶效应或细胞因子释放综合征对患者造成的伤害，安全性较高。

Description

一种携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞和应用

技术领域

本发明属于生物基因领域，具体涉及一种携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞和应用。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)介导的T细胞(CAR-T)疗法因具有众多的优点成为目前的肿瘤治疗领域的研究热点。CAR-T治疗的原理是使用基因工程的手段将嵌合抗原受体导入T细胞内，从而赋予T细胞MHC非依赖性的识别和杀伤能力。所获得的CAR-T细胞在其表面表达的scFv识别了肿瘤细胞表面相应靶点后，胞内一系列信号转导途径被激活，最终使得T细胞发生活化从而发挥靶点特异性的抗肿瘤效应。相比于传统的放疗和化疗产生的免疫功能下降，病情易复发，以及肿瘤细胞易产生耐药等缺点，这种方法毒副作用小且抗肿瘤疗效更持久。CAR-T疗法已经被应用于临床治疗恶性肿瘤并且已经取得了令人瞩目的临床疗效，其中以靶向CD19的CAR-T治疗B细胞性白血病和淋巴瘤最为突出。

虽然靶向CD19的CAR-T在B细胞恶性肿瘤患者体内可以发挥快速而显著的抗肿瘤效应从而有效缓解病情，但其中有不少患者在后期却因发生CD19抗原表达下降或者丢失引起的免疫逃逸而导致肿瘤复发，因而探寻靶向其他抗原的CAR-T疗法以应对CD19抗原丢失引起的免疫逃逸和复发已成为当务之急。CD79b是携带免疫受体酪氨酸激活基序的免疫球糖蛋白超家族成员，由229个氨基酸组成，与CD79a结合参与组成B细胞受体(BCR)复合体进行信号转导，是BCR发挥功能和B细胞发育过程中必不可少的蛋白。CD79b在B细胞恶性肿瘤细胞表面高表达，与CD19类似，它除了在B细胞表面部分表达外，在其他正常细胞包括血液系统细胞表面均不表达。所有这些提示CD79b可以成为CAR-T疗法治疗B细胞恶性肿瘤的一个潜在的分子靶点。尽管靶向CD79b的单克隆抗体自身不具有抗肿瘤效应，但将靶向CD79b的单克隆抗体与一些细胞毒性药物或者细胞毒素偶联在一起形成的抗体偶联药物则在临床前研究和临床试验中对B细胞性肿瘤表现出一定的抗肿瘤效应且具有较好的安全性，这些也从侧面支持了CD79b可以作为B细胞性肿瘤免疫治疗的靶标。同治疗性抗体一样，抗体偶联药物的主要缺陷在于其在体内只能存在较短的时间因而无法发挥持续的抗肿瘤效应。另外，抗体偶联药物在进入体内后，其中一部分药物或者毒素可能会因为发生药物代谢而直接释放至血液循环中造成系统性的损害。相比较而言，CAR-T能在体内长期存续及扩增从而发挥持久的抗肿瘤效应，而且目前的技术能较好控制CAR-T引起的不良反应如细胞因子释放综合征等，因而采用CAR-T的手段靶向CD79b更有前景。

虽然CAR-T的抗原识别功能域主要来源于特异性靶向靶标抗原的单克隆抗体的scFv(由重链可变区VH和轻链可变区VL的编码序列通过Linker连接起来)，并不是任何一个识别靶标抗原的单克隆抗体的scFv都可以用来构建CAR的表达载体。CAR只能识别肿瘤表面抗原，因而首先要求选用的单克隆抗体的scFv必须能识别肿瘤抗原的细胞外区域。另一方面，即使单克隆抗体的scFv识别的是靶标抗原的细胞外区域，它也不一定就适用于构成CAR的抗原识别部分，这是因为还有其他的多个因素，包括对靶标抗原识别的特异性、亲和力以及所识别的抗原表位与细胞膜的距离等等会产生影响。引入一些不恰当的scFv作为CAR的表面抗原识别区域会导致CAR-T的抗肿瘤效应严重受损甚至丧失。鉴于我们无法直接推断出某一单克隆抗体来源的scFv是否可以用作CAR的识别区域，我们必须通过实验的手段去测试引入的scFv所得到的CAR-T是否具有抗肿瘤功效，从而筛选出针对某一靶标抗原的合适的scFv。

CAR-T过继性免疫疗法治疗恶性肿瘤时，会针对特异性靶点产生强烈的杀伤作用，但有时会因为部分正常的细胞表面也表达有一定水平的肿瘤相关抗原而产生误攻击或产生细胞因子释放综合征，严重时会导致患者的死亡。之前已有使用CAR-T治疗肿瘤时产生严重的毒副作用而导致患者死亡的报道(针对HER2引起的肺部积水导致患者死亡和针对CD19特异性识别CAIX抗原引起的肝中毒现象)。为了解决这一安全隐患，目前常会引入一个自杀基因作为分子开关，让它和CAR共同表达，在患者产生严重的毒副反应时可以加入二聚体诱导物促使CAR-T在短时间内发生凋亡，通过这种途径可以很大程度提升该疗法的安全性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种安全且能够靶向CD79b的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞和应用。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体，所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体包括抗CD79b嵌合抗原受体和连接在所述的抗CD79b嵌合抗原受体上的分子开关，所述的抗CD79b嵌合抗原受体包括信号肽(Leader)、能够和肿瘤表面抗原CD79b结合的抗原结合区结构域、铰链区(hinge)、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域。

优选地，所述的信号肽为能够指导嵌合抗原受体跨膜转移的信号肽，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规的信号肽，所述信号肽可以为任何一个分泌蛋白基因或者膜蛋白的信号肽。本发明优选采用的信号肽为CD8α分子的信号肽，所述CD8α分子信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

优选地，所述的抗原结合区结构域为单链抗体scFv，所述的单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或者如SEQ ID NO.2所示，或者为与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2至少具有80％同源性的氨基酸序列。

进一步优选地，所述的单链抗体scFv为与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2至少具有85％同源性的氨基酸序列，更优选为至少具有90％同源性的氨基酸序列，再优选为至少具有95％同源性的氨基酸序列，最优选为如SEQ ID NO.1或者如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

优选地，所述的铰链区本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，本发明优选采用的铰链区为CD8α分子的铰链区。

优选地，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，在一些具体实施方案中，可以通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域，本发明优选采用CD28跨膜结构域。

优选地，所述共刺激信号传导区为CD28、CD137/4-1BB、CD27、CD134/OX40、ICOS信号传导结构域中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为CD28信号传导结构域。

优选地，所述分子开关为FK506结合蛋白12-二聚化化学诱导子系统诱导的caspase9自杀基因安全开关，所述FK506结合蛋白12-二聚化化学诱导子系统包括人工构建的融合基因以及化学诱导物。

进一步优选地，所述的分子开关为所述caspase9自杀基因与FKBP12-F36V的融合结构域。

本发明中的FKBP12-F36V是指FKBP12结构域的第36个氨基酸残基位点上的Phe被Val替代，本发明中的FKBP12-F36V可以采用本领域的已有方法合成得到。

根据一个具体且优选地实施方式，所述caspase9自杀基因与FKBP12-F36V的融合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在同型二聚体AP1903的作用下，FKBP12-F36V发生二聚化，进而引起所述caspase9自杀基因的二聚化激活相关的调亡信号途径，诱导T细胞的快速凋亡或者死亡，从而起到安全开关的作用，进而降低或避免毒副作用。

进一步优选地，所述的分子开关通过T2A序列与所述的抗CD79b嵌合抗原受体相连接。

更优选为，所述caspase9自杀基因与FKBP12-F36V的融合结构域通过所述的T2A序列与所述的CD3ζ信号传导结构域相连接。

所述T2A序列会使所述可诱导自杀融合结构域表达的蛋白与所述嵌合抗原受体蛋白断裂开，从而使得所述嵌合抗原受体能够发挥作用，而在同型二聚体AP1903的作用下，FKBP12-F36V发生二聚化，进而引起caspase9自杀基因的二聚化激活相关的调亡信号途径，诱导表达嵌合抗原受体的细胞发生快速死亡。

优选地，所述的分子开关位于所述的抗CD79b嵌合抗原受体的N端或C端。

优选地，所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体由所述的信号肽、所述的抗原结合区结构域、所述的铰链区、所述的跨膜结构域、所述的共刺激信号传导区、所述的CD3ζ信号传导结构域、T2A序列、所述的分子开关串联而成。

进一步优选地，所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体由CD8α信号肽、CD79b抗原结合区结构域、CD8α铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激信号传导区、所述的CD3ζ信号传导结构域、T2A序列、所述caspase9自杀基因与FKBP12-F36V的融合结构域串联而成。

具体地，所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO.3或者如SEQ ID NO.4所示，或者为与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4至少具有80％同源性的氨基酸序列。

优选地，所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体为与SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4至少具有85％同源性的氨基酸序列；更优选为与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4至少具有90％同源性的氨基酸序列；进一步优选为与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4至少具有95％同源性的氨基酸序列；最优选为如SEQ ID NO.3或者如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

本发明中，所述的SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

本发明中，所述的SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

本发明的另一个目的是提供一种由所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。

优选地，所述的免疫细胞为自体的、异体的或转基因的T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、中性粒细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞、调节T细胞、记忆性T细胞、双特异性T细胞、CIK细胞其中的一种，本发明优选采用T淋巴细胞。

本发明的第三个目的是提供一种治疗癌症的药物，所述的药物包括所述的免疫细胞。

本发明的第四个目的是提供所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体或所述的免疫细胞用于制备治疗恶性癌症的药物中的应用。

优选地，所述的恶性癌症为B细胞恶性肿瘤或其他表面表达CD79b抗原的恶性肿瘤。

本发明筛选到两个可作为靶向CD79b的CAR-T的抗原识别区域的scFv片段，这是开发CD79b CAR-T治疗B细胞恶性肿瘤的重要前提。

本发明中靶向CD79b的CAR-T既可以直接应用于未接受过任何CAR-T治疗的B细胞恶性肿瘤患者，也可以应用于治疗靶向其他靶标如CD19的CAR-T治疗后无效或者因发生抗原丢失导致复发的病例，还可以与靶向CD19的CAR-T一起联合应用以避免抗原逃逸的发生，从而为CAR-T疗法治疗B细胞恶性肿瘤提供了新的思路和策略。

本发明在第二代CAR-T技术的基础上进行技术改造，加入了FKBP12-F36V诱导的caspase9自杀基因区域，这样既可以保障CAR-T对B细胞恶性肿瘤细胞的杀伤效果，又可及时控制或终止因脱靶效应或细胞因子风暴为患者带来的安全隐患。

本发明所述的FKBP12-F36V诱导的caspase9自杀基因系统添加了自裂解多肽T2A与CAR结构相连接，导入T细胞内后，T2A通过自剪切的功能使得同一个T细胞既高度表达该特异性CAR基因，又同时表达分子开关。两者功能相互独立，互不干扰，并且两者的表达水平一致。

由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体和免疫细胞结构稳定性高，可以用于治疗表达CD79b表面抗原的恶性肿瘤，同时还能防止因脱靶效应或细胞因子释放综合征对患者造成的伤害，安全性较高。

附图说明

图1为本发明的嵌合抗原受体的合成基因序列图谱；

图2为两种具有不同CD79b抗原结合结构域的CD79b CAR-T细胞对CD79b阳性的Daudi细胞的体外杀伤活性统计图；

图3为具有较强体外杀伤活性的CD79b CAR-T细胞对CD79b阳性的Daudi细胞的体内杀伤效应统计图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可从商业途径获得。

实施例1：携带分子开关的CD79b特异性CAR表达载体的构建

通过人工合成两个DNA长片段，分别如SEQ ID NO.5(记为片段1)和SEQ ID NO.6(记为片段2)所示。这两个片段均依次编码CD8α信号肽、CD79b抗原结合结构域、CD8α铰链区、CD28跨膜结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域、T2A短肽和FKBP12-F36V.caspase9融合结构域，如图1所示，即CD8αLeader-scFv(CD79b)-CD8αhinge-CD28-CD3ζ-T2A-FKBP12-F36V.caspase9，其中的CD28包含CD28跨膜结构域和CD28信号传导结构域两者。

将上述片段1和片段2分别导入到慢病毒表达载体PCDH-EF1α-IRES-EGFP的EF-1α启动子的下游，转化到One Shot Stbl3感受态细胞，挑取克隆提取质粒后进行测序验证，从而得到两种不同的CD79b特异性CAR表达质粒，将包含片段1的质粒记为质粒1，包含片段2的质粒记为质粒2。

实施例2：慢病毒包装及携带分子开关的CD79b CAR-T细胞的制备

将慢病毒包装细胞系293T细胞接种于10cm细胞培养皿中，37℃5％CO₂培养条件下，汇合率为70％-80％时进行转染。将实施例1中制得的CD79b特异性CAR表达质粒(质粒1和质粒2)以及空载质粒(PCDH-EF1α-IRES-EGFP)分别与辅助质粒psPax2和pMD2.G按4：3：1的质量比采用磷酸钙转染法共转染至293T细胞内，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养12小时后，换新鲜培养基继续培养48小时后收集上清，过滤去除细胞碎片，收获病毒上清后置于-80℃低温冰箱保存或者直接用于T细胞的感染。

用淋巴细胞分离液从正常人外周血中分离得到外周血单个核细胞(PBMC)。PBMC经OKT-3抗体活化2天后，取出1×10⁶个细胞，加入上述新鲜或者解冻的病毒液和终浓度为6μg/mL的polybrene后混匀，于32℃，1800rpm离心1小时，然后放入培养箱，培养8小时后换含500IU/mL IL-2的新鲜培养基继续培养，再过72小时后用流式分选仪分别分选出GFP阳性的空载慢病毒感染T细胞(Mock-T)和两种携带分子开关的CD79b CAR-T细胞(感染质粒1病毒所得到的CD79b CAR-T记为CD79b CAR-T#A；感染质粒2病毒所得到的CD79b CAR-T记为CD79b CAR-T#B)，扩增后用于功能性实验。

实施例3：具有分子开关的CD79b CAR-T细胞体外对肿瘤细胞的杀伤检测

使用慢病毒感染的方式将萤火虫荧光素酶导入高表达CD79b的B系淋巴瘤细胞株Daudi，所获得的Daudi-FFL细胞作为靶细胞；以本发明制备的CD79b CAR-T#A、CD79b CAR-T#B以及Mock-T细胞作为效应细胞进行杀伤活性测定。按照不同的效应细胞与靶细胞数目比(20：1、10:1、5:1和2.5:1)接种于96孔板中，37℃5％CO₂培养6小时后，裂解混合培养的细胞，加入萤火虫荧光素酶的底物读取发光值，依据每组中发光值的读数同靶细胞的单独对照的读数比较计算剩余的活细胞比例计算杀伤的靶细胞比例。在不同的效应细胞/靶细胞比例(E/T)情况下，与Mock-T细胞相比，CD79b CAR-T#A和CD79b CAR-T#B均对Daudi-FFL细胞表现出明显增强的体外杀伤效应，且CD79b CAR-T#A的杀伤效应稍强于CD79b CAR-T#B(图2)；这说明本发明成功制备出能在体外有效杀伤CD79b阳性肿瘤细胞的CD79b CAR-T细胞。

实施例4：具有分子开关的CD79b CAR-T细胞在体内对肿瘤细胞的杀伤效应

选取NOD/SCID鼠于动物房饲养(室温23±2℃，湿度50％±10％)，收集处于对数生长期的B系淋巴瘤细胞株Daudi 5×10⁶个重悬于100μl的磷酸盐缓冲液中，以微量注射器注入小鼠背部的皮下组织。每两天以游标卡尺测量一次肿瘤的长径L和短径W，按公式V＝LW²/2计算出肿瘤的体积。待10天后小鼠皮下出现体积约为100mm³的组织块时将小鼠随机分为四组：A组为生理盐水处理组，B组为实施例3制备的转入空载体的T细胞治疗组，C组为实施例3制备的CD79b CAR-T#A细胞治疗组，D组为实施例3制备的CD79b CAR-T#A细胞治疗同时加AP1903(100mg/kg)注射组。生理盐水和T细胞均经尾静脉途径注射，给予的T细胞数目均为10⁷个，AP1903经腹腔注射。之后每7天以游标卡尺测量一次肿瘤的长径L和短径W，按公式V＝LW²/2计算出肿瘤的体积并绘制肿瘤生长曲线。

由肿瘤生长曲线结果(图3)可知：A组小鼠随着时间推移肿瘤逐渐增大，B组小鼠与A组小鼠差异不大。C组小鼠相比AB组肿瘤明显较小，说明CD79b CAR-T细胞对肿瘤细胞的生长有显著的抑制作用；D组的肿瘤生长情况与AB组相类似，说明AP1903通过消除CD79b CAR-T细胞抑制了后者对肿瘤细胞的清除作用，从而也能在必要时抑制CAR-T细胞对正常组织或者器官的损伤从而减少副作用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 一种携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Ile Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Val Pro Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

130 135 140

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

145 150 155 160

Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Phe Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

180 185 190

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu

225 230 235 240

Glu Leu Lys Arg

<210> 2

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn His Ile Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Tyr Leu Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser

100 105 110

Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

130 135 140

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

145 150 155 160

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

165 170 175

Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

180 185 190

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

195 200 205

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Cys Cys Trp Gln Gly

210 215 220

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235 240

Arg

<210> 3

<211> 905

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Ile Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Val Pro Val Tyr Phe Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser

145 150 155 160

Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys

165 170 175

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp

180 185 190

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Phe Ile Tyr Ala Ala

195 200 205

Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala

225 230 235 240

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly

245 250 255

Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

275 280 285

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

290 295 300

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

305 310 315 320

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

325 330 335

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

340 345 350

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

355 360 365

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser

485 490 495

Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Val

500 505 510

Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg

515 520 525

Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys

530 535 540

Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu

545 550 555 560

Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met

565 570 575

Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr

580 585 590

Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val

595 600 605

Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

610 615 620

Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu

625 630 635 640

Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile Asn

645 650 655

Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser

660 665 670

Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His Phe

675 680 685

Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu Ala

690 695 700

Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val

705 710 715 720

Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe Pro

725 730 735

Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys Ile

740 745 750

Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro

755 760 765

Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His Gly

770 775 780

Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn

785 790 795 800

Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp

805 810 815

Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val

820 825 830

Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser

835 840 845

Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala

850 855 860

His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala Val

865 870 875 880

Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu

885 890 895

Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser

900 905

<210> 4

<211> 902

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 4

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His

65 70 75 80

Tyr Asn His Ile Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Tyr Leu Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Ser Val Thr Val Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu

145 150 155 160

Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln

165 170 175

Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln

180 185 190

Arg Pro Gly Gln Ser Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu

195 200 205

Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr

225 230 235 240

Cys Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

275 280 285

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

290 295 300

Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys

305 310 315 320

Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser

325 330 335

Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg

340 345 350

Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg

355 360 365

Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr

485 490 495

Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Val Gln Val Glu

500 505 510

Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr

515 520 525

Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp

530 535 540

Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln

545 550 555 560

Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly

565 570 575

Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr

580 585 590

Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val

595 600 605

Glu Leu Leu Lys Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Phe Gly Asp

610 615 620

Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile

625 630 635 640

Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn

645 650 655

Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp

660 665 670

Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu

675 680 685

Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu

690 695 700

Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile

705 710 715 720

Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val

725 730 735

Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile

740 745 750

Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe

755 760 765

Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val

770 775 780

Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro

785 790 795 800

Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp

805 810 815

Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser

820 825 830

Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp

835 840 845

Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu

850 855 860

Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys

865 870 875 880

Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys

885 890 895

Leu Phe Phe Lys Thr Ser

900

<210> 5

<211> 2718

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 5

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggaggtgc agctgcagca gagcggcgcc gagctgatga agcccggcgc cagcgtgaag 120

atcagctgca aggccaccgg ctacaccttc agcagctact ggatcgagtg ggtgaagcag 180

cgccccggcc acggcctgga gtggatcggc gagatcctgc ccggcggcgg cgacaccaac 240

tacaacgaga tcttcaaggg caaggccacc ttcaccgccg acaccagcag caacaccgcc 300

tacatgcagc tgagcagcct gaccagcgag gacagcgccg tgtactactg cacccgccgc 360

gtgcccgtgt acttcgacta ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgag cagcggcggt 420

ggcggttctg gtggcggtgg ctccggcggt ggcggttctg acatcgtgct gacccagagc 480

cccgccagcc tggccgtgag cctgggccag cgcgccacca tcagctgcaa ggccagccag 540

agcgtggact acgacggcga cagcttcctg aactggtacc agcagaagcc cggccagccc 600

cccaagctgt tcatctacgc cgccagcaac ctggagagcg gcatccccgc ccgcttcagc 660

ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg aacatccacc ccgtggagga ggaggacgcc 720

gccacctact actgccagca gagcaacgag gaccccctga ccttcggcgc cggcaccgag 780

ctggagctga agcgcaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 840

gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 900

cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc 960

ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag 1020

aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc 1080

cgcaagcatt accagcccta tgccccacca cgcgacttcg cagcctatcg ctccagagtg 1140

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1200

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc gccgagggca gaggaagtct tctaacatgc 1500

ggtgacgtgg aggagaatcc cggccctatg ggagtgcagg tggaaaccat ctccccagga 1560

gacgggcgca ccttccccaa gcgcggccag acctgcgtgg tgcactacac cgggatgctt 1620

gaagatggaa agaaagttga ttcctcccgg gacagaaaca agccctttaa gtttatgcta 1680

ggcaagcagg aggtgatccg aggctgggaa gaaggggttg cccagatgag tgtgggtcag 1740

agagccaaac tgactatatc tccagattat gcctatggtg ccactgggca cccaggcatc 1800

atcccaccac atgccactct cgtcttcgat gtggagcttc taaaactgga atctggcggt 1860

ggatccggag gatttggtga tgtcggtgct cttgagagtt tgaggggaaa tgcagatttg 1920

gcttacatcc tgagcatgga gccctgtggc cactgcctca ttatcaacaa tgtgaacttc 1980

tgccgtgagt ccgggctccg cacccgcact ggctccaaca tcgactgtga gaagttgcgg 2040

cgtcgcttct cctcgctgca tttcatggtg gaggtgaagg gcgacctgac tgccaagaaa 2100

atggtgctgg ctttgctgga gctggcgcag caggaccacg gtgctctgga ctgctgcgtg 2160

gtggtcattc tctctcacgg ctgtcaggcc agccacctgc agttcccagg ggctgtctac 2220

ggcacagatg gatgccctgt gtcggtcgag aagattgtga acatcttcaa tgggaccagc 2280

tgccccagcc tgggagggaa gcccaagctc tttttcatcc aggcctgtgg tggggagcag 2340

aaagaccatg ggtttgaggt ggcctccact tcccctgaag acgagtcccc tggcagtaac 2400

cccgagccag atgccacccc gttccaggaa ggtttgagga ccttcgacca gctggacgcc 2460

atatctagtt tgcccacacc cagtgacatc tttgtgtcct actctacttt cccaggtttt 2520

gtttcctgga gggaccccaa gagtggctcc tggtacgttg agaccctgga cgacatcttt 2580

gagcagtggg ctcactctga agacctgcag tccctcctgc ttagggtcgc taatgctgtt 2640

tcggtgaaag ggatttataa acagatgcct ggttgcttta atttcctccg gaaaaaactt 2700

ttctttaaaa catcatga 2718

<210> 6

<211> 2709

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 6

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgcaggtgc agctgcagca gcccggcgcc gagctggtgc gccccggcgc cagcgtgaag 120

ctgagctgca aggccagcgg ctacaccttc accagctact ggatgaactg ggtgaagcag 180

cgccccggcc agggcctgga gtggatcggc atgatcgacc ccagcgacag cgagacccac 240

tacaaccaca tcttcaagga caaggccacc ctgaccgtgg acaagagcag cagcaccgcc 300

tacctgcagc tgagcagcct gaccagcgag gacagcgccg tgtactactg cgcccgcaac 360

ctgtacctgt ggggccaggg caccagcgtg accgtgagcc tgggcggtgg cggttctggt 420

ggcggtggct ccggcggtgg cggttctgac atcgtgatga cccagacccc cctgaccctg 480

agcgtgacca tcggccagcc cgccagcatc agctgcaaga gcagccagag cctgctggac 540

agcgacggca agacctacct gaactggctg ctgcagcgcc ccggccagag ccccgagcgc 600

ctgatctacc tggtgagcaa gctggacagc ggcgtgcccg accgcttcac cggcagcggc 660

agcggcaccg acttcaccct gaagatcagc cgcgtggagg ccgaggacct gggcgtgtac 720

tgctgctggc agggcaccca cttcccctac accttcggcg gcggcaccaa ggtggagatc 780

aagcgcacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 840

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 900

gggctggact tcgcctgtga tttttgggtg ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc 960

tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg 1020

ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat 1080

taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctccagagt gaagttcagc 1140

aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1200

ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1260

gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1320

aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1380

cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1440

atgcaggccc tgccccctcg cgccgagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg 1500

gaggagaatc ccggccctat gggagtgcag gtggaaacca tctccccagg agacgggcgc 1560

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aagaaagttg attcctcccg ggacagaaac aagcccttta agtttatgct aggcaagcag 1680

gaggtgatcc gaggctggga agaaggggtt gcccagatga gtgtgggtca gagagccaaa 1740

ctgactatat ctccagatta tgcctatggt gccactgggc acccaggcat catcccacca 1800

catgccactc tcgtcttcga tgtggagctt ctaaaactgg aatctggcgg tggatccgga 1860

ggatttggtg atgtcggtgc tcttgagagt ttgaggggaa atgcagattt ggcttacatc 1920

ctgagcatgg agccctgtgg ccactgcctc attatcaaca atgtgaactt ctgccgtgag 1980

tccgggctcc gcacccgcac tggctccaac atcgactgtg agaagttgcg gcgtcgcttc 2040

tcctcgctgc atttcatggt ggaggtgaag ggcgacctga ctgccaagaa aatggtgctg 2100

gctttgctgg agctggcgca gcaggaccac ggtgctctgg actgctgcgt ggtggtcatt 2160

ctctctcacg gctgtcaggc cagccacctg cagttcccag gggctgtcta cggcacagat 2220

ggatgccctg tgtcggtcga gaagattgtg aacatcttca atgggaccag ctgccccagc 2280

ctgggaggga agcccaagct ctttttcatc caggcctgtg gtggggagca gaaagaccat 2340

gggtttgagg tggcctccac ttcccctgaa gacgagtccc ctggcagtaa ccccgagcca 2400

gatgccaccc cgttccagga aggtttgagg accttcgacc agctggacgc catatctagt 2460

ttgcccacac ccagtgacat ctttgtgtcc tactctactt tcccaggttt tgtttcctgg 2520

agggacccca agagtggctc ctggtacgtt gagaccctgg acgacatctt tgagcagtgg 2580

gctcactctg aagacctgca gtccctcctg cttagggtcg ctaatgctgt ttcggtgaaa 2640

gggatttata aacagatgcc tggttgcttt aatttcctcc ggaaaaaact tttctttaaa 2700

acatcatga 2709

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 7

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 8

<211> 396

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 8

Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe

1 5 10 15

Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu

20 25 30

Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys

35 40 45

Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val

50 55 60

Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp

65 70 75 80

Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala

85 90 95

Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Ser Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn

115 120 125

Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu

130 135 140

Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg

145 150 155 160

Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser

165 170 175

Leu His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met

180 185 190

Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu Asp

195 200 205

Cys Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu

210 215 220

Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val

225 230 235 240

Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly

245 250 255

Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys

260 265 270

Asp His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro

275 280 285

Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg

290 295 300

Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp

305 310 315 320

Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp

325 330 335

Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu

340 345 350

Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala

355 360 365

Asn Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe

370 375 380

Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser

385 390 395

Claims

1.一种携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体，其特征在于：所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体包括抗CD79b嵌合抗原受体和连接在所述的抗CD79b嵌合抗原受体上的分子开关，所述的抗CD79b嵌合抗原受体包括信号肽、能够和肿瘤表面抗原CD79b结合的抗原结合区结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域。

2.根据权利要求1所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体，其特征在于：所述的抗原结合区结构域为单链抗体scFv，所述的单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或者如SEQ ID NO.2所示，或者为与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2至少具有80％同源性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体，其特征在于：所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域；所述共刺激信号传导区为CD28、CD137/4-1BB、CD27、CD134/OX40、ICOS信号传导结构域中的任意一种或至少两种的组合。

4.根据权利要求1所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体，其特征在于：所述分子开关为FK506结合蛋白12-二聚化化学诱导子系统诱导的caspase9自杀基因安全开关，所述FK506结合蛋白12-二聚化化学诱导子系统包括人工构建的融合基因以及化学诱导物。

5.根据权利要求4所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体，其特征在于：所述的分子开关为所述caspase9自杀基因与FKBP12-F36V的融合结构域。

6.根据权利要求4或5所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体，其特征在于：所述的分子开关通过T2A序列与所述的抗CD79b嵌合抗原受体相连接。

7.根据权利要求1所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体，其特征在于：所述的分子开关位于所述的抗CD79b嵌合抗原受体的N端或C端。

8.根据权利要求1所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体，其特征在于：所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体由所述的信号肽、所述的抗原结合区结构域、所述的铰链区、所述的跨膜结构域、所述的共刺激信号传导区、所述的CD3ζ信号传导结构域、T2A序列、所述的分子开关串联而成。

9.根据权利要求8所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体，其特征在于：所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体由CD8α信号肽、CD79b抗原结合区结构域、CD8α铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激信号传导区、所述的CD3ζ信号传导结构域、T2A序列、所述caspase9自杀基因与FKBP12-F36V的融合结构域串联而成。

10.根据权利要求9所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体，其特征在于：所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或者如SEQ ID NO.4所示，或者为与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4至少具有80％同源性的氨基酸序列。

11.一种由权利要求1至10中任一项所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。

12.一种治疗癌症的药物，其特征在于：所述的药物包括权利要求11所述的免疫细胞。

13.权利要求1至10中任一项所述的携带分子开关的抗CD79b嵌合抗原受体或权利要求11所述的免疫细胞用于制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。