KR102110187B1 - 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산 및 키메라 항원 수용체 단백질을 발현하는 t 림프구 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인체 T세포의 표면에 발현되는 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것으로, 상기 키메라 항원 수용체 단백질은 순서적으로 연결된 세포외 결합 영역, 막 관통 영역과 세포내 신호 영역을 포함하고, 상기 세포외 결합 영역은 상피성 성장 인자 수용체(epithelial growth factor receptor, EGFR)의 제 287~302 부위 아미노산 에피토프(epitope)를 특이성 인식하는 단일 사슬 항체(Single chain antibody fragmen, scFv)를 포함한다.

Description

키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산 및 키메라 항원 수용체 단백질을 발현하는 T 림프구{NUCLEIC ACID FOR CODING CHIMERIC ANTIGEN FECEPTOR PROTEIN AND T LYMPHOCYTE FOR EXPRESSION OF CHIMERIC ANTIGEN RECEPROF PROREIN}
본 발명은 종양 세포 치료 분야에 관한 것으로, 구체적으로 상피성 성장 인자 수용체 vⅢ형 돌연 변이체(EGFRvⅢ)를 발현하거나 또는 EGFR을 고발현하는, 상피에서 유래되는 종양의 유전자 변형 T림프구 치료 분야에 관한 것이다.
상피성 성장 인자 수용체(epithelial growth factor receptor, EGFR)는 하나의 막 관통 당단백질(Transmembrane glycoprotein)이고, 분자량은 170KD이며, 원암유전자(protooncogene) C-erbB-1(HER-1)의 발현 산물로서 인체 각 조직의 세포막에 광범위하게 분포되었다[Alan Wells, Molecules in focus EGF receptor. Int J Biochem Cell Biol, 1999, 31: 637-643.]. 이는 대부분의 종양에서(비소세포 폐암, 방광암, 난소암, 유선암, 두경부 편평세포암, 신경교교증(neurogliomatosis), 췌장암, 식도암, 위암, 전립선암 등과 같은 종양) 과발현과(또는) 돌연변이하였으며, 종양의 발생과 발전, 악성 변이, 전이 및 예후와 밀접히 관련된다[Jose B. Why the epidermal growth factor receptor? The rational for cancer therapy [J]. Oncologist, 2002, 7 (4): 2-8.]. 따라서, EGFR는 종양 치료의 하나의 중요한 타겟이다. 이 외에, 연구 결과는 EGFR287-302 에피토프는 EGFRvⅢ 또는 EGFR을 과발현하는 종양에서만 노출되며, 정상적인 조직에서 상기 에피토프는 은닉하다는 것을 보여주었다[Gan HK, et. al. Targeting of a conformationally exposed, tumor-specic epitope of EGFR as a strategy for cancer therapy. Cancer Res, 2012, 72(12):2924-2930.]. EGFR287-302 에피토프는 EGFR를 타게팅(targetting)하는 종양 치료에 관한 하나의 이상적인 부위임을 제시한다.
EGFR287-302 에피토프에 대한 항체는 이미 개발되었는 바, 이는 우수한 종양 특이성 살상 작용을 나타냈다. 하지만 항체 치료에 있어서, 항체가 체내 혈핵순환에서 반감기의 제한이 있으며, 일반적으로, 반감기는 대부분 23일 이내이다. 따라서, 종양 치료에서 지속적인 약물 투여 및/또는 투여 제조량의 증가를 요구하는데, 이는 환자의 치료 경비의 증가를 야기하고, 어떤 상황에서는 심지어 치료를 어쩔 수 없이 종결해야 한다. 이 외에, 치료성 항체는 이종 단백질(heterologous protein)로서, 체내에서 알레르기 반응 및 상기 치료성 항체의 중화성 항체에 대해 위험을 일으킬 수 있다.
종양의 면역 응답에서의 T 림프구의 작용이 나날이 중시되고 있다. T 림프구에 기반한 양자면역요법(adoptive immunotherapy)은 일부 종양에서 일정한 효과를 획득하였고, 상기 종류의 면역 치료 방법은 항체 치료의 상술한 결함을 극복할 수 있지만, 대부분의 종양 치료 효과는 만족스럽지 못하다[Grupp SA, et. al. Adoptive cellular therapy. Curr Top Microbiol Immunol. 2011, 344:149-72.]. 근래, 세포 독성에 따른 T 림프구가 타겟 세포에 대한 인식 특이성이 T 세포 수용체(T Cell Receptor, TCR)에 의존하는 것의 발견으로, 종양 세포의 관련 항원의 항체의 단일 사슬 항체(Single―chain antibody fragmen, scFv)와 T 세포 수용체의 CD3ζ 또는 FcεRIγ 등에 대한 세포내 신호 활성 모티브는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)로 융합하고, 이를 지연성 바이러스 감염 등과 같은 방식을 통하여 T 세포 표면에 유전 수식한다. 이러한 CAR T 세포는 주조직적합성복합체(Major Histocompatibility Complex, MHC)의 비제한적인 방식으로 선택적으로 T 림프구를 종양 세포에 다시 정향시키고 특이적으로 종양을 살상할 수 있다. CAR T 세포는 종양 면역 분야의 하나의 새로운 면역 치료 책략이다[Schmitz M, et. al. Chimeric antigen receptor-engineered T cells for iImmunotherapy of Cancer. J Biomed Biotechnol, 2010, doi:10.1155/2010/956304.].
키메라 항원 수용체는 세포외 결합 영역, 막 관통 영역과 세포내 신호 영역을 포함한다. 통상적으로, 세포외 영역은 종양에 관련한 항원을 인식할 수 있는 scFv를 포함하고, 막 관통 영역은 CD8, CD28 등 분자의 막 관통 영역을 사용하며, 세포내 신호 영역은 CD3ζ(즉 CD3 zeta, Z라고 약칭함) 또는 FcεRIγ 및 공동 자극 신호 분자 CD28，CD137，CD134 등과 같은 타이로신 기반 면역 수용체 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)의 세포내 신호 영역을 사용한다.
세포내 신호 영역은 ITAM의 제1세대 CAR T 세포만 포함하고, 여기서 키메라 항원 수용체의 각 부분은 하기의 형식으로 연결되는 바, 즉, scFv-TM-CD3ζ 형식으로 연결된다. 해당 종류의 CAR T 세포는 항 종양 세포 독성 효과를 유발할 수 있지만, 사이토카인의 분비가 비교적 적고, 체내에서 꾸준한 항 종양 효과를 유발할 수 없다[Zhang T. et. al. Chimeric NKG2D-modied T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways, Cancer Res 2007, 67(22):11029-11036.].
뒤이어 발전한 제2세대 CAR T 세포를 CD28 또는 CD137(4-1BB라고도 한다)의 세포내 신호 영역에 넣고, 여기서 키메라 항원 수용체의 각 부분은 하기의 형식으로 연결되는 바, 즉, scFv-TM-CD28 -ITAM 또는 scFv-TM-/CD137-ITAM 형식으로 연결된다. 세포내 신호 영역에서 발생한 B7/CD28 또는 4-1BBL/CD137 공동자극 작용은 T 세포의 지속적인 증식을 야기하고, T 세포가 IL-2와 IFN-γ 등 사이토카인 분비 수준을 향상시키는 동시에, 체내에서 CAR T 세포의 생존 주기와 항 종양 효과도 향상시킨다[Dotti G. et.al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients. J Clin Invest, 2011, 121(5):1822-1826.].
근래 발전한 제3세대 CAR T 세포에 있어서, 키메라 항원 수용체의 각 부분은 하기의 형식으로 연결되는 바, 즉, scFv-TM-CD28-CD137-ITAM 또는 scFv-TM-CD28-CD134-ITAM 형식으로 연결된다. 이는 체내에서 CAR T 세포의 생존 주기와 이의 항 종양 효과를 더욱 향상시켰다[Carpenito C., et al. Control of large established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains. PNAS, 2009, 106(9): 3360-3365].
비록 CAR T 세포가 종양 치료에서 매혹적인 전망을 가지고 있지만, 일부 잠재적인 위험 또한 고려할 필요가 있다. 예를 들면, 일부/종의 정상적인 조직이 특이성 항원이 CAR을 저발현하는 과정에서 인식할 수 있는 특이성 항원은 CAR T 세포가 관련 항원을 발현하는 정상적인 조직을 손상시킬 수 있다. 예를 들면, 신장 세포암 환자의 종양 세포에 발현된 항원 탄산탈수효소IX(Carbonic anhydrase IX, CAIX)는 임상의 CAR T 세포 양자 치료(Adoptive treatment)를 위한 첫 번째 사례이며, CAR 세포의 오프타겟 효과(Off-Target Effect)를 처음으로 보도한 사례이기도 하다. 환자가 CAR T 세포를 여러 번 인가한 후 2~4급의 간독성이 나타났다. 원인 분석 결과, 간담도 상피 세포는 CAIX을 저발현하는 것으로, 원래의 임상 시험이 중단되는 동시에, 환자의 치료 효과에 대한 어떠한 평가도 배제하였다. [Stoter G. et al. Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX: first clinical experience. J clin oncol, 2006, 24（13）: e20-e22.; Ngo MC., et al. Ex vivo gene transfer for improved adoptive immunotherapy of cancer. Human Molecular Genetics, 2011, R1-R7]. 이 외에, 유전자가 수식한 T 세포가 낮은 수준의 항원 또는 항원에 의해 촉발되지 않는 조건하에서도 활성화될 수 있도록, CAR 중의 과다한 공동 자극 신호는 주효 세포(effector cell)의 활성에 필효한 임계값을 감소시킴으로써, 대량의 사이토카인의 방출을 야기하여, 소위 말하는 "사이토카인 폭풍(cytokine storm)"의 유발을 일으킬 수 있다. 이러한 신호 누설(singnal leakage)은 오프타켓 세포의 독성을 야기할 수 있음으로써, 비특이성 조직 손상이 발생된다. 예를 들면, Her2에 대한 제3세대 CAR으로 간과 폐에 전이된 말기 결장암 환자를 임상 치료하는 과정에서, 정상적인 폐조직에서 Her2 을 저발현하기 때문에 소위 말하는 "사이토카인 폭풍"의 유발로 인하여 환자가 급사하게 된다[Morgan RA., et al. Report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing Erbb2. Molecular Therapy, 2010, 18 (4): 843-851.].
따라서, 본 분야에서 상술한 결함을 극복하는 CAR T 세포 종양 치료 방안을 강렬히 수요한다.
본 발명의 제1양태는 인체 T림프구의 표면에 발현되는 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것으로, 상기 키메라 항원 수용체 단백질은 순서적으로 연결된 세포외 결합 영역, 막 관통 영역과 세포내 신호 영역을 포함하고, 상기 세포외 결합 영역은 인체 EGFR의 제 287~302 부위 아미노산 에피토프를 특이성 인식하는 scFv를 포함한다. 상기 키메라 항원 수용체 단백질의 세포외 결합 영역은 CD8 힌지 영역을 통하여 CD8 또는 CD28의 막 관통 영역과 연결되고, 관통 영역 후에 잇달아 세포내 신호 영역이 연결된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 형식이거나 RNA 형식일 수 있다. DNA 형식에는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인공 합성한 DNA를 포함한다. DNA는 단일 사슬이거나 2중 사슬일 수 있다. DNA는 암호 사슬이거나 비암호 사슬일 수 있다. 본 발명의 키메라 항원 수용체 단백질 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 코돈(codon)은 축중(degeneracy)될 수 있는 바, 즉, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 여러가지 축중 핵산 서열은 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 대응되는 아미노산을 코딩하는 축중 핵산 코돈은 본 분야에서 공지된 것이다. 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 더 관한 것으로, 이는 본 발명과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편, 유사물과 유도체이다. 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 천연적으로 발생된 대립 변이체거나 비천연적으로 발생된 변이체일 수 있다. 이러한 뉴클레오시드 변이체는 치환 변이체, 결여 변이체와 삽입 변이체를 포함한다. 본 분야에서 공지된 대립 변이체는 하나의 폴리뉴클레오티드의 대체 형식인데, 이는 하나 또는 여러개의 뉴클레오시드의 치환, 결여 또는 삽입일 수 있지만, 이의 의해 코딩된 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변화하지 않을 것이다.
본 발명은 또한 상기 서열과 교잡하고 두 서열 사이에 적어도 50% 동일성, 비교적 바람직하게는 적어도 70% 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 구비하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄격한 조건하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 교잡할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, "엄격한 조건"은, (1) 0.2xSSC, 0.1%의 SDS, 60→와 같은 비교적 낮은 이온 강도와 비교적 높은 온도에서의 교잡과 용리; 또는 (2) 교잡할 때 50%(v/v)의 포름아마이드, 0.1%의 송아지 혈청/0.1%의 피콜(Ficoll), 42℃ 등과 같은 변성제를 넣거나; 또는 (3) 두 서열 사이의 동일성이 적어도 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상에서만 교잡이 발생하는 것을 의미한다. 또한, 교잡할 수 있는 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드와 SEQ ID NO: 2로 표시되는 성숙된 폴리펩티드는 동일한 생물학 기능과 활성이 있다.
인체 상피성 성장 인자 수용체 EGFR의 제 287~302 부위의 아미노산 부위를 특이성 인식하는 단일 클론 항체는 중국 특허 문헌 CN102405235과 CN101602808B에서 공개되었고, 상기 에피토프를 특이성 인식하는 기타 이미 알고 있는 것과 미래에 알 수 있는 단일 클론 항체를 본 발명의 핵산이 코딩하는 키메라 항원 수용체 단백질 중의 단일 사슬 항체에 사용할 수 있다. 단일 사슬 항체는 상기 문헌에서 공개한 서열을 통해 유전자 공학 방법 또는 화학 합성 방법으로 제조 가능하다. 본 발명에서 사용한 "단일 사슬 항체(scFv) 단편" 용어는 하기의 정의를 통한 항체 단편을 의미하는 것으로, 이는 연결기(linker)를 통해 연결된 중사슬 가변영역(VH)와 경사슬 가변영역(VL)의 재조합 단백질을 포함하고, 연결기는 이 두 개 구조 영역을 서로 연관시키도록 하여 최종적으로 항원 결합 부위를 형성한다. scFv의 크기는 일반적으로 하나의 완전한 항체의 1/6이다. 단일 사슬 항체는 한 가닥의 뉴클레오시드 사슬에 의해 코딩된 한 가닥의 아미노산 사슬 서열인 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용한 단일 사슬 항체는 본 분야에서 익히 알려져 있는 통상적인 기술을 단독 또는 연합하여 사용할 수 있는 바, 예를 들면, 아미노산 결여, 삽입, 치환, 증가, 및/또는 재조합 및/또는 기타 수식 방법으로 추가적으로 수식한다. 본 분야의 통상의 기술자에게 있어서, 하나의 항체의 아미노산 서열에 따라 이의 DNA 서열에 이러한 수식 방법을 인입하는 것은 주지된 것인 바, 예를 들면, Sambrook, 분자 클론: 실험 수첩, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.를 참조 바란다. 여기서 수식은 핵산 수준에서 진행하는 것이 바람직하다. 상기 단일 사슬은 이의 유도체를 더 포함할 수 있다. 상기 단일 사슬 유도체는 WO 89/09622에서 기술한 키메라 항원의 생산 방법, EP-A10239400과 WO90/07861에서 기술한 인간화 항체 생산 방법, WO91/10741, WO94/02602와 WO96/33735에서 기술한, 마우스 중의 인체 항체와 같은 이종 항체의 생산 방법과 같은 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 "특이성 인식" 용어의 뜻은 본 발명의 2중 특이성 항체는 표적 항체 이외의 어떠한 폴리펩티드와도 교차 반응을 진행하지 않거나 기본상 진행하지 않는다는 것이다. 이의 특이성 정도는 면역학 기술을 통하여 판단할 수 있고, 면역블러팅법(immunoblotting), 면역친화크로마토그래피(Immunoaffinity Chromatography), 유속세포분석법(flow cytometry) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서, 특이성 인식은 유속세포분석법을 통하여 확정하는 것이 바람직하고, 구체적인 경우의 특이성 인식의 표준은 본 분야의 통상의 기술자들이 장악한 본 분야의 상식으로 판단할 수 있다.
막 관통 영역은 CD8 또는 CD28 등 단백질의 막 관통 영역으로부터 선택될 수 있다. CD8 또는 CD28는 T 세포 표면의 천연적인 표지물이다. 인체 CD8 단백질은 헤테로다이머(heterodimer)이고, αβ 또는 γδ 두 사슬로 이루어지며, 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 막 관통 영역은 CD8α 또는 CD28로부터 선택된다. 이 외에, CD8α 힌지 영역은 하나의 플랙서블한 영역이므로, CD8 또는 CD28과 막 관통 영역과 힌지 영역은 키메라 항원 수용체 CAR의 타겟을 연결하여 구조 영역 scFv와 세포내 신호 영역을 식별할 수 있다.
세포내 신호 영역은 CD3ζ, FcεRIγ, CD28，CD137，CD134 단백질의 세포내 신호 영역 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. CD3 분자는 다섯 개의 서브유닛으로 이루어지고, 여기서 CD3ζ 서브유닛(CD3 zeta라고도 하고, Z라고 약칭함)은 세 개의 ITAM 모티프를 함유하며, 상기 모티프는 TCR-CD3 복합체 중의 중요한 형질 도입 영역이다. CD3δZ는 돌연변이된 것으로 ITAM 모티프의 CD3ζ 서열을 구비하지 않으며, 본 발명의 실시에서 일반적으로 음성 대조의 구축으로 한다. FcεRIγ은 주로 비만 세포와 호염기성 과립구 표면에 분포되고, 이는 하나의 ITAM 모티프를 함유하며, 구조, 분포 및 기능에서 CD3ζ과 유사하다. 이 외에 상술한 바와 같이, CD28，CD137，CD134는 공동 자극 신호 분자이고, 각자의 리간드와 결합한 후 이의 세포내 신호 영역에서 생산한 공동 자극 작용으로 T 세포의 지속적인 증식을 일으키며, T 세포가 IL-2와 IFN-γ 등 사이토카인 분비 수준을 향상시키는 동시에, 체내에서 CAR T 세포의 생존 주기와 항 종양 효과도 향상시킨다.
본 발명의 핵산이 코딩하는 키메라 항원 수용체 단백질은 순서적으로 연결된 세포외 결합 영역, 막 관통 영역과 세포내 신호 영역을 포함하는 하기 키메라 항원 수용체 단백질로써, scFv(EGFR)-CD8-CD3ζ, scFv(EGFR)-CD8-CD137-CD3ζ, scFv(EGFR)-CD28-CD28-CD3ζ, scFv(EGFR)-CD28-CD28-CD137-CD3ζ, 또는 이들의 조합을 포함하고, 상기 키메라 항원 수용체 단백질 중의 첫 번째 CD28은 상기 단백질의 막 관통 영역을 대표하고, 두 번째 CD28은 상기 단백질의 세포내 신호 영역을 대표한다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:1~4과 같은 서열을 구비한다. 본 발명의 다른 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO: 31~34 중 하나의 서열을 구비하는 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산을 구비한다.
본 발명의 제2양태는 상기 T세포의 표면에 발현되는 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용한 벡터는 렌티바이러스 플라스미드 벡터 pWPT-eGFP이다. 상기 플라스미드는 제3세대 자멸활성 렌티바이러스 벡터 시스템에 속하고, 상기 시스템에는 세 개의 플라스미드, 즉, 단백질 Gag/Pol을 코딩하는 패킹 플라스미드(Packaging plasmid) psPAX2, Rev 단백질을 코딩하는 패킹 플라스미드 psPAX2; VSV-G 단백질을 코딩하는 엔빌로프 플라스미드(Envelope plasmid) PMD2.G; 및 빈 벡터 pPWT-eGFP가 있고, 이는 재조합이 인입되는 목적 핵산 서열에 사용될 수 있는 바, 즉, CAR의 핵산 서열을 코딩한다. 빈 벡터 pPWT-eGFP(이 자체는 후속 시험 중의 mock이다.) 중에서 신장인자-1α(elongation factor-1α, EF-1α) 프로모터로 강화형 녹색형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, eGFP)의 발현을 제어한다. 하지만, CAR를 코딩하는 목적 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 pWPT-eGFP는 구제역 바이러스(food and mouthvires disease, FMDV)에서 유래되는 리보솜 스키핑 서열(ribosomal skipping sequence 2A)(F2A이라고 약칭함)을 통하여 eGFP와 CAR의 공동 발현을 실현한다.
본 발명의 제3양태는 상기 벡터를 포함하는 바이러스를 포함한다. 본 발명의 바이러스는 패킹 후의 감염성이 있는 바이러스를 포함하고, 감염성이 있는 바이러스가 필요로 하는 성분을 포함하는 패킹 대기 바이러스도 포함한다. 본 분야에서 익히 알려진 기타 트렌스셕션 T 세포의 바이러스 및 이에 대응되는 플라스미드 벡터도 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 바이러스는 상기 pWPT-eGFP-F2A-CAR 재조합 벡터(즉 scFv(EGFR)-CAR을 함유한)의 렌티바이러스를 포함한다.
본 발명의 제4양태는 유전자 변형 T림프구를 포함하고, 이에 본 발명의 핵산이 형질 도입되거나 본 발명의 상기 핵산을 함유하는 재조합 플라스미드 또는 상기 플라스미드를 포함하는 바이러스 시스템이 형질 도입된다. 본 분야의 통상적인 핵산 형질 도입 방법으로, 비 바이러스(Non-virus)와 바이러스를 포함하는 형질 도입 방법은 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 비 바이러스에 기반한 형질 도입 방법에는 전기천공법과 트랜스포존법을 포함한다. 근래 Amaxa 회사에서 연구 개발한nucleofector 핵트랜스펙션기는 외인성 유전자를 직접 세포핵에 도입하여 목적 유전자를 얻을 수 있는 고 효율적 형질 도입이다. 이 외에, 슬리핑 뷰티 트랜스포존(Sleeping Beauty system) 또는 PiggyBac 트랜스포존 등 시스템에 기반한 형질 도입 효율은 통상의 전기천공보다 많이 향상되었고, nucleofector 핵트랜스펙션기와 SB 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템의 연합 응용은 이미 보도되었으며[Davies JK., et al. Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res, 2010, 70(10): OF1-10.], 상기 방법은 높은 형질 도입 효율을 가질 수 있을 뿐만 아니라 지정된 지점에서의 목적 유전자 통합도 실현할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 키메라 항원 수용체의 수식을 실현하는 T 림프구의 형질 도입 방법은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스와 같은 바이러스에 기반한 형질 도입 방법이다. 상기 방법은 형질 도입 효율이 높고, 외인성 유전자가 안정적으로 발현될 수 있으며, 체외에서 T 림프구가 임상급 수량에 도달하는 배양 시간을 단축할 수 있는 등 장점이 있다. 상기 유전자 변형 T림프구 표면에서, 형질 도입된 핵산은 전사, 번역을 통하여 이의 표면에 발현된다. 상이하게 배양한 각종 종양 세포에 대하여 체외 세포 독성 실험을 진행하는 것을 통하여, 본 발명의, 표면에 키메라 항원 수용체가 발현된 유전자 변형 T림프구가 고도의 특이성 종양 세포 살상 효과가 있음을 증명한다(세포 독성이라고도 함). 따라서, 본 발명의 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 플라스미드, 상기 플라스미드를 포함하는 바이러스와 트랜스펙션(transfection)된 상기 핵산, 플라스미드 또는 바이러스에 감염된 유전자 변형 T림프구는 종양의 면역치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
도1은 예시로서 본 발명의 CAR 서열을 코딩하는 렌티바이러스 벡터 pWPT-eGFP-F2A-CAR를 포함하는 구조를 나타내는 모식도이다.
도2는 예시로서 렌티바이러스 벡터에 포함되는 본 발명의 CAR의 상이한 영역 사이의 연결 관계를 나타내는 모식도이고, 여기서 리보솜 스키핑 서열 F2A로 연결된 eGFP과 svFv(EGFR)의 특이성 키메라 항원 수용체이다.
도3은 MluI과 SalI 이중 효소 절단으로 실시예1의 렌티바이러스 프라스미드의 핵산을 감정하는 것을 나타내는 전기 영동도이다. 여기서 M1은 DS2000 분자량의 표지물이며(광저우 둥성 바이오테크 코,.엘티디); M2는 Hind III의 표지물이다(광저우 둥성 바이오테크 코,.엘티디). 레인1~6은 각각, 1은 pWPT-eGFP이고; 2는 pWPT-eGFP-F2A-806-δZ이며; 3은 pWPT-eGFP-F2A-806-Z이고; 4는 pWPT-eGFP-F2A-806-BB이며; 5는 pWPT-eGFP-F2A-806-28Z이고; 6은 pWPT-eGFP-F2A-806-28BBZ이다.
도4는 본 발명의 실시예2의 바이러스가 CD8＋ T 림프구를 감염한 후 세포가 발현되는 eGFP의 유속세포분석법 측정 결과를 나타낸다.
도5는 본 발명의 실시예2의 상이한 키메라 항원 수용체(CAR＋)를 발현하는 CD8＋ T 림프구의 체외 생장을 나타낸 것이다. 도에서 바이러스 감염 후 제 14번째 날의 상이한 키메라 항원 수용체를 발현하는 CD8＋ T는 체외에서 35~50배 증폭된 것을 나타낸다.
도6은 본 발명의 실시예3에 사용되는 각종 종양 세포계 표면 EGFR287~302 에피토프에 발현된 정황의 유속세포분석법 측정 결과를 나타낸다.
아래 구체적인 실시예에 결부하여 본 발명을 설명할 것이다. 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이지 본 발명을 제한하는 것으로 이해하여서는 아니된다. 아래 실시예에서 구체적인 조건을 밝히지 않은 실험 방법에 있어서, Sambrook 등, "분자 클론, 실험 수첩(Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989)"에 기재된 조건과 같은 통상적인 조건에 따라 진행하고, 실시예에서 명확한 시약 회사 설명서가 있는 것으로 설명되면, 설명서의 건의에 따라 진행한다.
실시예1. 본 발명의 키메라 항원 수용체를 발현하는 렌티바이러스의 구축
표1은 본 발명이 예시한 키메라 항원 수용체의 각 부분의 연결 순서를 설명하였고, 상시 연결은 도2를 참조 바람.
키메라 항원 수용체 세포외 결합 영역-막 관통 영역-세포내 신호 영역1-세포내 신호 영역2 설명
806-δZ scFv(EGFR)-CD8-CD3δzeta 음성 대조
806-Z scFv(EGFR)-CD8-CD3 zeta 제1세대
806-BBZ scFv(EGFR)-CD8-CD137-CD3 zeta 제2세대
806-28Z scFv(EGFR)-CD28-CD28-CD3 zeta 제2세대
806-28BBZ scFv(EGFR)-CD28-CD28-CD137-CD3 zeta 제3세대
1. 핵산 단편의 증폭
(1) scFv(EGFR) 서열의 증폭
scFv(EGFR) 서열의 증폭은 본 실험실에서 구축한 단일 사슬 이중 기능 항체 뉴클레오시드 806/CD3 또는 hu7B3/CD3을 템플릿으로 하고, 템플릿의 서열은 중국 특허 출원 201210094008.x 중의 SEQ ID NO: 10과 SEQ ID NO: 11을 참조하기 바란다. 증폭에 사용되는 프라이머 쌍은, 806 scFv(EGFR)을 증폭하기 위한 포워드 프라이머 5'-gacatcctgatgacccaatctccatcctc-3'(SEQ ID NO: 5)와 리버스 프라이머 5'- tgcagagacagtgaccagagtcccttgg-3'(SEQ ID NO: 6); hu7B3 scFv(EGFR)을 증폭하기 위한 포워드 프라이머 5'-gatattcagatgacccagagcccg-3'(SEQ ID NO: 7)와 리버스 프라이머 5'-gctgctcacggtcaccagggtg-3'(SEQ ID NO: 8)이다. 이 두 가지 경우, 목적 증폭 밴딩(banding) 크기는 모두 720bp이다. PCR 증폭 조건은 84℃에서 4분간 전변성(Pre denaturation)시키고; 94℃에서 40초 동안 변성시키며; 58℃에서 40초 동안 어닐링(annealing)시키고; 68℃에서 40초 동안 연신시키며; 25개의 순환을 진행한 후, 68℃에서 10분간 전체적으로 연신시키는 것이다. PCR 증폭 밴딩는 아가로오스 젤 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 통하여 예상한 단편의 크기에 부합되는 것을 확인하였다.
음성 대조 scFv(CD19)의 서열은 GenBank의 FMC63-28Z(HM852952.1) 서열에 따라 확정하고, 서열은 상하이 예경 바이오테크 코,.엘티디에서 전체 유전자의 합성을 통하여 얻는다.
(2) 키메라 항원 수용체 기타 부분의 핵산 서열
키메라 항원 수용체 단백질의 기타 부분 및 이 부분을 연결하는 힌지 영역의 증폭은 하기와 같다. 1ml의 Trizol(Invitrogen회사)를 1x107의 건강한 인간의 말초 단핵 혈액 세포(상하이 혈액 센터에서 제공함)에 넣어 세포를 분해한 후, 페놀-클로로폼 추출법(phenol-chloroform extraction)을 사용하여 총 RNA를 추출하고, ImProm-II™ 역전사 키트(promaga회사)를 사용하여 역전자로 cDNA를 제조한다. 이상에서 제조한 cDNA를 템플릿으로 하여, 각각 하기와 같이 진행한다.
(a) 포워드 프라이머 5'-cactgtctctgcaaccacgacgccagcg-3'(SEQ ID NO: 9)와 리버스 프라이머 5'- gaggtcgacctacgcgggggcgtctgcgctcctgctgaacttcactctggtgataaccagtg-3'(SEQ ID NO: 10)로 증폭하여 CD8α 힌지 영역-막 관통 영역을 얻으며, PCR 증폭 조건은 94℃에서 4분간 전변성시키고; 94℃에서 30초 동안 변성시키며; 58℃에서 30초 동안 어닐링시키고; 68℃에서 30초 동안 연신시키며; 25개의 순환을 진행한 후, 68℃에서 10분간 전체적으로 연신시키는 것이다. 밴딩의 이론 크기는 198bp이고, 증폭 산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과 이론 크기와 일치하였다.
(b) 포워드 프라이머 5'-cactgtctctgcaaccacgacgccagcg-3'(SEQ ID NO: 11)와 리버스 프라이머 5'- gaggtcgacctacgcgggggcgtctgcgctcctgctgaacttcactctggtgataaccagtg-3'(SEQ ID NO: 12)로 증폭하여 CD8α 힌지 영역-막 관통 영역-delta Z(δZ)를 얻으며, PCR 증폭 조건은 상술한 바와 같다. 밴딩의 이론 크기는 234bp이고, 증폭 산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과 이론 크기와 일치하였다.
(c) 포워드 프라이머 5'-cactgtctctgcaaccacgacgccagcg-3'(SEQ ID NO: 13)와 리버스 프라이머 5'- gaggtcgacctacgcgggggcgtctgcgctcctgctgaacttcactctggtgataaccagtg-3'(SEQ ID NO: 14)로 증폭하여 CD28 막 관통 영역-세포내 신호 영역 단편을 얻으며, PCR 증폭 조건은 상술한 바와 같다. 밴딩의 이론 크기는 465bp이고, 증폭 산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과 이론 크기와 일치하였다.
(d) 포워드 프라이머 5'-aaacggggcagaaagaaactc-3'(SEQ ID NO: 15)와 리버스 프라이머 5'-cagttcacatcctccttc-3'(SEQ ID NO: 16)로 증폭하여 CD137 세포내 영역을 얻으며, PCR 증폭 조건은 상술한 바와 같다. 밴딩의 이론 크기는 126bp이고, 증폭 산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과 이론 크기와 일치하였다.
(e) 포워드 프라이머 5'-cactggttatcaccagagtgaagttcagcaggagc-3'(SEQ ID NO: 17)와 리버스 프라이머 5'- cgaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3'(SEQ ID NO: 18)로 증폭하여 CD3 zeta 신호 영역을 얻으며, PCR 증폭 조건은 상술한 바와 같다. 밴딩의 이론 크기는 339bp이고, 증폭 산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과 이론 크기와 일치하였다.
2. 핵산 단편의 조립
(a) 포워드 프라이머 5'-accacgacgccagcgccg-3'(SEQ ID NO: 19)와 리버스 프라이머 5'-cacccagaaaataataaag-3'(SEQ ID NO: 20)로 조립하여 CD8α 힌지 영역-CD28 막 관통 영역을 얻으며, 조립 조건은, CD8α 힌지 영역(50ng)＋CD28 막 관통 영역(50ng), 94℃에서 4분간 전변성시키고; 94℃에서 30초 동안 변성시키며; 60℃에서 30초 동안 어닐링시키고; 68℃에서 30초 동안 연신시키며, 5개의 순환을 진행한 후, 68℃에서 10분간 전체적으로 연신시키고, DNA 폴리메라아제 및 포워드 리버스 프라이머를 보충한 후, PCR을 25개의 순환으로 증폭하며, 증폭 조건은 94℃에서 4분간 전변성시키고; 94℃에서 30초 동안 변성시키며; 60℃에서 30초 동안 어닐링시키고; 68℃에서 30초 동안 연신시키며; 25개의 순환을 진행한 후, 68℃에서 10분간 전체적으로 연신시키는 것이다. 이론 크기는 216bp이다. 증폭 산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과 이론 크기와 일치하였다.
(b) 포워드 프라이머 5'-agagtgaagttcagcaggagcgcag-3'(SEQ ID NO: 21)와 리버스 프라이머 5'- cgaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3'(SEQ ID NO: 18)로 조립 증폭하여 4-1BB 세포내 신호 영역과 CD3 zeta을 얻는 바，즉 BBZ이며, 조립과 PCR 증폭 조건은 상술한 바와 같다. 밴딩의 이론 크기는 465bp이고, 증폭 산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과 이론 크기와 일치하였다.
(c) 포워드 프라이머 5'-cactgtctctgcaaccacgacgccagcg-3'(SEQ ID NO: 22)와 리버스 프라이머 5'- cgaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3'(SEQ ID NO: 18)로 등몰(equimolar)의 CD8α 힌지 영역-막 관통 영역과 CD3 zeta(약50ng)를 조립 및 PCR하여 CD8- CD3 zeta(즉 CD8-Z)를 얻으며, 조립과 PCR 증폭 조건은 상술한 바와 같다. 밴딩의 이론 크기는 537bp이고, 증폭 산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과 이론 크기와 일치하였다.
(d) 포워드 프라이머 5'-cactgtctctgcaaccacgacgccagcg-3'(SEQ ID NO: 23)와 리버스 프라이머 5'- cgaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3'(SEQ ID NO: 18)로 CD8α 힌지 영역-막 관통 영역과 BB를 조립 및 PCR하여 목적 단편인 CD8-CD137-CD3 zeta(즉 CD8-BBZ)를 얻으며, 조립과 PCR 증폭 조건은 상술한 바와 같다. 밴딩의 이론 크기는 663bp이고, 증폭 산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과 이론 크기와 일치하였다.
(e) 포워드 프라이머 5'-accacgacgccagcgccg-3'(SEQ ID NO: 24)와 리버스 프라이머 5'- cgaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3'(SEQ ID NO: 18)로 CD8 힌지 영역-CD28 막 관통 영역과 Z를 상술한 바와 같은 조립과 PCR 증폭하여 목적 단편인 CD8 힌지 영역-CD28 막 관통 영역-28Z 세포내 영역을 얻으며, 조립과 PCR 증폭 조건은 상술한 바와 같다. 밴딩의 이론 크기는 678bp이고, 증폭 산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과 이론 크기와 일치하였다.
(f) 워드 프라이머 5'-accacgacgccagcgccg-3'(SEQ ID NO: 19)와 리버스 프라이머 5'- cgaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3'(SEQ ID NO: 18)로 CD8 힌지 영역과 PCR로 얻은 CD28 막 관통 영역-세포내 신호 영역 단편과 BBZ를 조립하여 목적 단편인 CD8 힌지 영역-CD28TM- 28BBZ를 얻으며, 이의 이론 크기는 804bp이고, 증폭 산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과 이론 크기와 일치하였다.
(g) 등몰의 상기 증폭으로 각각 힌지 영역과 막 관통 영역의 δZ, Z 및 28BBZ를 지닌 핵산 단편을 얻고, 각각 등몰의 단일 사슬 항체 핵산 서열 cFv806 또는 scFvCD19(질량은 약 50ng임)와 조립하고 PCR을 진행하며, 조건은 상기의 단편 조립과 PCR 증폭과 동일하고, 도2에 도시된 패턴 조립하여 키메라 항원 806-δZ, 806-Z, 806-BBZ, 806-28Z 및 806-28BBZ를 코딩하는 핵산 서열을 얻는다.
3. 플라스미드 벡터의 구축
본 실시예에서 사용한 벡터 시스템은 제3세대 자멸활성 렌티바이러스 벡터 시스템에 속하는 것으로, 상기 시스템에는 세 개의 플라스미드, 즉, 단백질 Gag/Pol을 코딩하는 패킹 플라스미드 psPAX2, Rev 단백질을 코딩하는 패킹 플라스미드 psPAX2; VSV-G 단백질을 코딩하는 엔빌로프 플라스미드 PMD2.G; 및 빈 벡터 pPWT-eGFP에 기반한 목적 유전자 CAR을 코딩하는 재조합 발현 벡터가 있다.
빈 벡터 pPWT-eGFP에서 신장인자-1α 프로모터로 강화형녹색형광 단백질의 발현을 제어한다. 하지만, 목적 유전자 CAR를 코딩하는 재조합 발현 벡터에서 pWPT-eGFP는 구제역 바이러스에서 유래되는 리보솜 스키핑 서열을 통하여 eGFP와 목적 유전자 CAR의 공동 발현을 실현한다. F2A는 구제역 바이러스에서 유래되는 2A(또는 "자기 절단 폴리펩티드2A"라고도 칭함)의 한 단의 핵심 서열로서, 2A의 "자기 절단" 기능을 구비하고, 포워드 유전자와 리버스 유전자의 공동 발현을 실현할 수 있다. 2A는 절단 효율이 높고, 포워드 유전자와 리버스 유전자의 발현 평형성이 높으며, 및 자체 서열이 짧은 장점에 의해 유전자 치료 멀티 시스트론(Multi-cistron) 벡터를 위하여 하나의 효과적이고 실행 가능한 책략을 제공한다. 특히, 키메라 항원 수용체 유전자에 기반하여 T 림프구를 수식하는 면역 치료에서 상기 서열을 자주 응용하여 목적 유전자와 GFP 또는 eGFP의 공동 발현을 실행하고, GFP 또는 eGFP의 측정을 통하여 간접적으로 CAR의 발현을 측정한다.
본 실시예는 F2A로 연결되는 eGFP와 특이성 CAR이 공동 발현하는 렌티바이러스 벡터를 구축하였고, pWPT-eGFP-F2A-CAR로 총칭한다. eGFP-F2A-CAR 각 부분을 조립하는 방법은 하기와 같다.
프라이머 조립 방법을 통하여 F2A(66bp)-CD8α 신호 펩티드(63bp) 및 포워드 eGFP와 리버스 CAR과 조립되는 적은 핵산(약18bp임) 서열을 포함하는 단편을 얻는 바, 이론 크기는 165bp이고, 프라이머는 각각 하기와 같다.
5'-attcaaagtctgtttcacgctactagctagtccg-3'(SEQ ID NO: 25)
5'-gtgaaacagactttgaattttgaccttctgaagttggcaggagacgttgagtccaac-3'(SEQ ID NO: 26)
5'-agcggcaggagcaaggcggtcactggtaaggccatgggcccagggttggactcaacgtc-3'(SEQ ID NO: 27)
5'-ctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatcctgatgacccaatc-3'(SEQ ID NO: 28)이며,
프라이머 조립 조건은 94℃에서 4분간 전변성시키고; 94℃에서 20초 동안 변성시키며; 50℃에서 20초 동안 어닐링시키고; 68℃에서 30초 동안 연신시키며; 25개의 순환을 진행한 후, 68→에서 10분간 전체적으로 연신시키는 것이다. 증폭 산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과 이론 크기와 일치하였다.
포워드 프라이머 5'-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3'(SEQ ID NO: 29)와 리버스 프라이머 5'-gctactagctagtccggacttgtacagctcgtccatg-3'(SEQ ID NO: 30)로 목적 유전자 eGFP를 증폭하고, pWPT-eGFP 빈 벡터로 템플릿으로 하며, PCR 증폭 조건은 94℃에서 4분간 전변성시키고; 94℃에서 40초 동안 변성시키며; 56℃에서 40초 동안 어닐링시키고; 68℃에서 40초 동안 연신시키며; 25개의 순환을 진행한 후, 68℃ 10분간 전체적으로 연신시키고, 이론 크기는 735bp이며, 증폭 산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과 이론 크기와 일치하였다.
포워드 프라이머 5'-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3'(SEQ ID NO: 29)와 리버스 프라이머 5'-gaggtcgacctacgcgggggcgtctgcgctcctgctgaacttcactctggtgataaccagtg-3'(SEQ ID NO: 12)로 얻은 등몰의 F2A-CD8α 신호 펩티드 단편, eGFP 및 806-δZ(약 80ng임)를 사용하여 조립하여 eGFP-F2A-806-δZ를 얻으며, 조립 조건은 94℃에서 4분간 전변성시키고; 94℃에서 40초 동안 변성시키며; 62℃에서 40초 동안 어닐링시키고; 68℃에서 140초 동안 연신시키며, 증폭을 5개 순환한 후, 적합한 체적의 DNA 폴리메라아제 및 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 보충한 후, PCR 증폭을 25개 순환하며, 증폭 조건은 94℃에서 4분간 전변성시키고; 94℃에서 40초 동안 변성시키며; 62℃에서 40초 동안 어닐링시키고; 68℃에서 140초 동안 연신한다. 이론 크기는 1861bp이고, 증폭 산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과 이론 크기와 일치하였다.
포워드 프라이머 5'-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3'(SEQ ID NO: 29)와 리버스 프라이머 5'- gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatgtgaag-3'(SEQ ID NO: 18)로 얻은 등몰의 F2A와 CD8α 신호 펩티드 단편, eGFP 및 806-Z, 806-BBZ, CD19-BBZ, 806-28Z 및 806-28BBZ(약 80ng임)을 사용하여 각각 조립한다. 조립 조건은 94℃에서 4분간 전변성시키고; 94℃에서 40초 동안 변성시키며; 62℃에서 40초 동안 어닐링시키고; 68℃에서 140초 동안 연신시키며, 증폭을 5개 순환한 후, 적합한 체적의 DNA 폴리메라아제 및 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 보충한 후, PCR 증폭을 25개 순환하며, 증폭 조건은 94℃에서 4분간 전변성시키고; 94℃에서 40초 동안 변성시키며; 62℃에서 40초 동안 어닐링시키고; 68℃에서 140초 동안 연신시키는 것이다.
얻은 eGFP-F2A-806-Z, eGFP-F2A-806-BBZ, eGFP-F2A-806-28Z와 eGFP-F2A-806-28BB Z의 이론 크기는 각각 2164bp, 2290bp, 2305bp, 2431bp인 바, 증폭 산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과 이론 크기와 일치하였다. 여기서, 오픈 리딩 프레임의 포워드 리버스로 MluI와 SalI의 효소 절단 부위를 인입한다. 상기 얻은 목적 유전자 eGFP-F2A-CAR는 MluI와 SalI 2중 효소 절단으로, 잇닿아 동일한 2중 효소 절단의 pWPT 벡터에 인입하고, 구축에 성공한 각 키메라 항원 수용체를 발현하는 렌티바이러스를 MluI와 SalI 효소 절단 감정(도3) 및 서열 정확하게 측정한 후 렌티바이러스 패킹을 진행한다.
전술한 바와 같이, eGFP-F2A-CAR은 한 가닥의 mRNA를 전사하지만, eGFP와 항EGFR287-302 키메라 항원 수용체 두 개의 단백질로 번역하므로, CD8α 신호 펩티드의 작용하에, 항EGFR287-302 키메라 항원 수용체는 세포 막에 위치 결정된다.
4. 플라스미드로 293T 패킹 렌티바이러스를 트랜스펙션
6x106의 밀도로 제6~10세대의 293 T 세포(ATCC: CRL-11268)까지 10cm 페트리 접시에서 접종 배양하고, 37℃에서 5%의 CO2로 하룻밤 배양하여 트랜스펙션을 위해 준비한다. 배지는 10%의 소 태아 혈청(PAA회사)의 DMEM(PAA회사)을 함유한 것이고, 다음날, 트랜스펙션 약 2시간 전에 배양액을 무혈청 DMEM로 바꾼다.
트랜스펙션의 단계는 하기와 같다.
4.1 20μg의 빈 플라스미드pWPT-eGFP(mock 대조) 또는 20μg의 목적 유전자 플라스미드 pWPT-eGFP-F2A-CAR을 각각 15μg의 패킹 플라스미드 PAX2와 6μg의 엔빌로프 플라스미드 pMD2.G와 함께 500μL의 MillQ 수에 용해시켜 균일하게 혼합하고,
4.2 62μL의 2.5M의 CaCl2(Sigma 회사)를 한 방울씩 적가하고, 1200rpm/분 vortex로 균일하게 혼합하며,
4.3 마지막으로 500μL의 2xHeBS(280mM의 NaCl, 10mM의 KCl, 1.5mM의 Na2HPO42H2O, 12mM의 포도당, 50mM의 Hepes(Sigma 회사), pH 7.05, 0.22μM의 여과 제균)를 한 방울씩 적가하고, 1200rpm/분 vortex로 균일하게 혼합하고,
4.4 즉시 페트리 접시에 한 방울씩 적가하여, 천천히 흔들고, 37℃, 5%의 CO2에서 4~6시간 동안 배양한 후, 10%의 소 태아 혈청을 함유한 DMEM로 바꾼다.
트랜스펙션 다음날 트랜스펙션 효율을 관찰한 바(녹색형광을 지닌 세포 비례), 80%의 양성 트랜스펙션 효율로서, 즉 트랜스펙션 실험은 성공이다. 트랜스펙션 48시간 또는 72시간 후, 0.45μm의 필터(Millipore회사)로 여과하여 바이러스를 수집한 후, Beckman Optima L-100XP 초 원심 분리기를 사용하여 28000rpm，4℃에서 2시간 동안 원심 분리하고, 원심 분리하여 상청을 버리며, 원심 분리하여 얻은 침전을 1/10~1/50 원액 체적의 Quantum 007 배양액(PAA회사)으로 재부유하고, 100μL/튜브로 나누어 담아 -80℃에 저장하여 냉장 보관하여, 바이러스가 T 림프구를 적정하거나 감염하기를 기다린다.
5. Mock 또는 eGFP-F2A-CAR 패킹되어 있는 렌티바이러스 적정 농도의 측정
첫날, 1x105/mL로 293T 세포를 96웰의 배양 평판에 이식하고, 100μL/웰으로 37℃에서 5%의 CO2로 배양하며, 배양액은 10%의 소 태아 혈청을 함유한 DMEM이다. 이튿날, 50μL/웰 배양 상청을 버리고, 50μL/웰 신선한 상기 배양액을 추가로 넣으며, 최종 농도가 6μg/mL인 폴리브렌(polybrene)을 함유하고, 37℃에서 5%의 CO2로 30분간 부화시킨다. 10μL/웰의 바이러스 원액 또는 1μL/웰의 바이러스 엑기스를 넣고 5배 희석하여 4개의 구배, 두 개의 중복 웰을 37℃에서 5%의 CO2로 배양한다. 48시간 감염한 후, 유속세포분석기로 eGFP를 측정하고, 양성율이 5~20% 세포수가 바람직한 것으로, 적정 농도(U/mL)=양성율x희석배수x100x104를 계산한다. 인산칼슘 트랜스펙션법으로 바이러스를 패킹한 적정 농도는 약 0.5~2x106U/mL이고, 농축후 측정한 바이러스 적정 농도는 약 2x107U/mL이였다.
실시예2. 재조합 렌티바이러스가 CD8+T 림프구를 감염
건강한 인간의 말초 단핵 혈액 세포에서 밀도 구배 원심 분리법을 통하여 인간의 말초 단핵 혈액 세포를 얻고(상하이 혈액 센터에서 제공함), 말초 단핵 혈액 세포는 CD8+T 림프구 자주(Stem Cell Technologies) 음성 분리 방법을 통하여 CD8+T 림프구를 얻으며, 분리된 후의 CD8+T 림프구는 유속세포측정법으로 CD8+T 림프구의 순도를 측정하고, CD8+T 림프구의 양성율 ≥95%가 바람직한 것으로 다음 단계의 조작을 진행한다. 약 1x106/mL 밀도로 Quantum 007 림프구 배양액(PAA회사)을 넣어 세포로 배양하는 바, 자주 1:1 비율로 넣는 동시에 항CD3과 CD28 항체가 팽킹되어 있는 자주(Invitrogen회사)와 최종 농도가 100U/mL인 재조합인간 IL-2(상하이 화성 바이오테크 코,.엘티디)로 24시간 동안 자극 배양한다. 다음, MOI5인 상기 재조합 렌티바이러스로 CD8+T 림프구를 감염한다. 감염 후의 세포는 하루 간격으로 5x105/mL 인 밀도를 사용하여 계대시키는 동시에, 림프구 배양액에 최종 농도가 100U/mL인 재조합인간 IL-2를 추가로 넣는다.
감염된 CD8+T 림프구는 배양 7번째 날에 유속세포를 통하여 각 상이한 키메라 항원 수용체의 발현을 측정하고, eGFP와 CAR 공동 발현으로 인하여, eGFP의 양성 세포를 측정한 것이 바로 키메라 항원 수용체를 발현하는 양성 세포이다(도4). 감염되지 않은 T 림프구를 음성 대조로 하여, 상이한 항원 수용체를 발현하는 바이스 감염 CD8+T 림프구의 양성율은 하기의 표와 같다. 상기 양성율 결과로부터 렌티바이러스를 통하여 감염하는 방법으로 일정한 양성율의 CD8+T 림프구를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
하기의 CAR이 트랜스펙션된 CD8+T 림프구 CD8+T 림프구 eGFP 양성율
806-δZ 38.8%
806-Z 62%
806-BBZ 45%
806-28Z 78%
806-28BBZ 33.8%
CD8+T 림프구는 각각 상이한 키메라 항원 수용체를 패킹되어 있는 바이러스를 감염한 후, 5x105/ml인 세포 밀도로 하루 간격으로 계대 배양하고 계수하며, 계대된 세포 배양액에 IL-2(최종 농도는 100U/ml임)를 추가로 넣어 배양하고, 제14번째 날에 약 35~55배의 증폭이 있었는 바(도5), 상이한 키메라 항원 수용체를 발현하는 CD8+T 림프구가 체외에서 일정한 수량의 증폭을 진행할 수 있어, 후속의 체외 독성 시험 및 체내 시험을 위하여 보증을 제공한다는 것을 설명한다.
실시예3. 상피에서 유래되는 종양 세포계에서의 EGFR287~302 에피토프의 노출 정황의 측정
유속세포측정법을 사용하고, 형광 활성화 세포 분류기(FACSCalibur, Becton Dickinson로부터 옴)를 통하여 여러가지 상피에서 유래되는 종양 세포 표면 EGFR287~302 에피토프의 노출 정황을 측정한다. 사용되는 재료는 하기와 같은 재료를 포함한다.
(1) 본 실험실에서 구축한 상기 부위를 인식하는 단일 클론 항체 CH12(구축 방법은 중국 특허 CN 101602808B, 실시예1~4를 참조 바람)를 일차 항체(first antibody)로 한다(최종 농도는 20μg/ml，100μL/샘플임).
(2) FITC로 표기한 양 항 인간 IgG(Sheep anti human IgG)를 이차 항체로(AOGMA회사) 한다.
에피토프 노출 정황의 구체적인 측정 방법은 하기와 같다.
1. 대수생장기(logarithmic growth phase)의 표3에 도시된 바와 같은 각 종양 세포를 취하여 6cm의 평판에 이식하고, 이식되는 세포 밀도는 약 90%이며, 37℃의 부화 박스에서 하룻밤 배양한다.
2. 10mM의EDTA 소화기 세포를 사용하고, 200gx5분 원심 분리하여 세포를 수집한다. ~1x107/mL의 농도로 1%의 소 태아 혈청을 함유한 인산염 완충 용액(1%의 NBS/PBS)에 재부유시키고, 100μl/튜브의 양으로 유속 전용 튜브에 넣는다.
3. 200gx5분으로 원심 분리하고, 상청을 버린다.
4. 실험군에 각각 측정해야 할 항체 CH12를 넣는 동시에, 하나의 대조군에 무관한 항체를 넣어 음성 대조로 하고, 다른 하나의 대조군은 항체를 넣지 않은 PBS를 공백 대조로 한다. 각 항체의 최종 농도는 모두 20μg/ml이고, 매 하나의 시험관에 100ul를 넣는다. 아이스배스(icebath)에 45분간 넣는다.
5. 매 하나의 시험관에 2ml의 1%의 NBS/PBS를 넣고, 200gx5분으로 원심 분리하며, 모두 2번 진행한다.
6. 상청을 버리고, 1:50으로 희석한 FITC로 표기한 양 항 인간 IgG를 넣으며, 매 하나의 시험관에 100ul 넣는다. 아이스배스(에 45분간 넣는다.
7. 매 하나의 시험관에 2ml의 1%의 NBS/PBS를 넣고, 100gx5분으로 원심 분리하며, 모두 2번 진행한다.
8. 상청을 버리고, 300ul의 1% NBS PBS에 재부유시키며, 유속세포기로 측정한다.
9. 유속세포기의 수치 분석 소프트웨어 WinMDI 2.9를 응용하여 수치를 분석한다.
결과는 도6에서 도시한 바와 같이, 뇌 신결교종 세포계U87에서 EGFR287~302 에피토프의 노출을 측정해내지 못하였지만, 외인성 과발현 EGFR의 U87-EGFR(본 실험에서 직접 구축하고 보존하였으며, 구축 방법은, Wang H., et al., Identification of an Exon 4-Deletion Variant of Epidermal Growth Factor Receptor with Increased Metastasis-Promoting Capacity. Neoplasia, 2011, 13, 461 - 471.에 근거하였다.) 및 과발현 EGFRvIII의 U87-EGFRvIII(본 실험에서 직접 구축하고 보존하였으며, 구축 방법은, WO/2011/035465에 근거하였다.)에서 EGFR287~302 에피토프를 측정해낼 수 있었고, 이 외에 세 개의 암세포계 PANC-1, CFPAC-1와 BxPC-3에서 모두 EGFR287~302 에피토프의 노출을 측정해낼 수 있었다.
세포 명칭 유래 성질
U87 ATCC HTB-14 저발현 EGFR
U87-EGFRvIII 본 실험에서 직접 구축하고 보존 과발현 EGFRvIII
U87-EGFR 본 실험에서 직접 구축하고 보존 과발현 EGFR
PANC-1 ATCC CRL-1469 과발현 EGFR
CFPAC-1 ATCC CRL-1918 과발현 EGFR
BxPC-3 ATCC CRL-1687 과발현 EGFR
실시예4. 키메라 항원 수용체를 발현하는 체외 독성 효과 실험
체외 독성 실험에서 사용하는 재료는 하기와 같다.
타겟 세포는 각각 상기 표에서의 6가지의 세포이다. 주효 세포는 체외에서 12일간 배양된 FACS 측정 키메라 항원 수용체가 발현한 양성 세포를 키메라 항원 수용체 양성(CAR+)으로 표기한 CD8+T 림프구이고,
주효 타겟 비율은 경우에 따라 각각 3:1, 1:1과 3:1 또는 5:1, 2.5:1과 1:1이고, 타겟 세포 수량은 10000/웰이며, 상이한 주효 타겟 비율에 따라 주효 세포에 대응된다. 각 군에 모두 4개의 중복 웰을 설치하고, 4개의 중복 웰의 평균값을 취한다. 측정 시간은 18시간 또는 20시간이다.
여기서, 각 실험군과 각 대조군은 하기와 같다.
각 실험군: 각 타겟 세포＋상이한 키메라 항원 수용체를 발현하는 CD8+ T 림프구,
대조군1: 타겟 세포가 최대로 젖산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase, LDH)를 방출하고,
대조군2: 타겟 세포가 자발적으로 LDH를 방출하며,
대조군3: 주효 세포가 자발적으로 LDH를 방출한다.
측정 방법은, CytoTox 96 비 방사성 세포 독성 측정 키트(promaga회사)를 사용하여 진행한다. 상기 방법은 비색법에 기반한 측정 방법이고, 51Cr 방출법을 대체할 수 있다. CytoTox96®측정은 정량으로 젖산 탈수소 효소(LDH)를 측량한다. LDH는 하나의 안정적인 세포질 효소이고, 세포 분해에서 방출되어 나오며, 이의 방출 방식은 51Cr이 방사성 분석 중의 방출 방식과 기본상 동일하다. 방출된 LDH 배지 상청에서, 커플링의 효소 반응을 30분 동안 진행하는 것을 통하여 측정할 수 있고, 효소 반응에 있어서 LDH는 테라트리아졸염(INT)을 적색의 포르마잔(formazan)으로 전환시킬 수 있다. 생성된 적색의 산물의 양과 분해된 세포수는 정비례한다. 구체적인 것은 CytoTox 96 비 방사성 세포 독성 측정 키트 설명서를 참조하기 바란다.
세포 독성 계산 공식은 하기와 같다.
Figure 112016122859648-pct00001
실험 결과는 하기와 같은 것을 설명한다.
본 발명의 scFv(EGFR)-806-Z CAR+을 발현하는 CD8+T 림프구와 806-28BBZ CAR+을 발현하는 CD8+T 림프구는 종양 세포 U87-EGFRvIII에 대하여 아주 현저한 독성을 나타내는 바, 각각 높게는 55.5%와 85%에 달한다.
이 외에, 상기 본 발명의 CD8+T 림프구의 세포 독성은 고도의 종양 특이성인 것으로, EGFR287~302 에피토프를 노출하는 종양 세포U87-EGFRvIII에 대한 높은 세포 독성에 상대적인 동시에, 대조로는 EGFR287~302 에피토프를 노출하지 않는 종양 세포U87에 아주 낮은 세포 독성을 나타내기 때문에, 이 두 가지 경우 모두 2%보다 작다. 동시에, 실험 결과의 믿음직한 증거인 공백 대조의 빈 플라스미드(mock)가 트랜스펙션한 T 세포와 원시적인 T 세포내의 주효 분자의 영향을 평가하는 키메라 항원 수용체 806-δZ 유전자 변형 T 세포는 음성 대조로서, U87와 U87-EGFRvIII에 대하여서도 기본상 동일한 아주 낮은 세포 독성%을 나타낸다. 상기 실험의 주효 타겟 비율은 5:1이고, 작용 시간은 20시간일 때 측정한 것이다.
CAR+T 세포 타겟 세포에 대한 세포 독성%
U87 U87-EGFRvIII
806-Z CAR+ <2 56
806-28BBZ CAR+ <2 85
806-δZ CAR+ <2 5
mock CAR+ <2 8
이 외에, 상이한 주효 타겟 비율의 경우, 작용 시간이 18시간일 때 측정한 본 발명의 scFv(EGFR)-806-Z CAR+을 발현한 CD8+T 림프구와 806-28BBZ CAR+을 발현한 CD8+T 림프구는 EGFR287~302 에피토프를 노출한 종양 세포 U87-EGFR와 U87-EGFRvIII와 세 개의 췌장암 세포계 PANC-1, CFPAC-1와 BxPC-3의 세포 독성의 작용에 대하여 모두 주효 타겟 비율 구배의 의존성을 나타냈으며, 하기 표와 같이, 주효 타겟 비율이 높을수록 세포 독성도 높다.
세포독성% 806-28BBZ상이한 주효 타겟 비율 806-Z상이한 주효 타겟 비율 CD19-BBZ상이한 주효 타겟 비율
3:1 1:1 1:3 3:1 1:1 1:3 3:1 1:1 1:3
U87 -2 -14 -25 n/a n/a n/a n/a n/a n/a
U87-EGFR 98 49 29 n/a n/a n/a n/a n/a n/a
U87-EGFRvIII 81 41 13 n/a n/a n/a n/a n/a n/a
PANC-1 65 28 13 60 34 18 -7 -11 -8
CFPAC-1 40 22 9 43 35 12 8 8 6
BxPC-3 70 49 24 44 24 14 7 10 8
주효 타겟 비율이 3:1일 때, 키메라 항원 수용체 806-28BBZ CAR+의 CD8+T 림프구는 U87-EGFR에 대한 세포 독성이 높게는 98%에 달하고, U87-EGFRvIII에 대한 세포 독성이 높게는 81%에 달하며, 세 개의 췌장암 세포계 PANC-1, CFPAC-1와 BxPC-3에 대한 세포 독성은 각각 65%, 40%와 70%이다.
하지만 음성 대조의 비 특이성 scFv이 키메라 항원 수용체에서의 영향을 평가하는 키메라 항원 수용체 CD19-BBZ CAR+의 CD8+T 림프구는 음성 대조로서, 상기 세 개의 췌장암 세포계에 대한 세포 독성이 모두 10%보다 작고, 주효 타겟 비례 계조도의 의존성의 나타내지 않았다.
<110> Carsgen therapeutics limited <120> Nucleic acid for coding chimeric antigen receptor protein and T lymphocyte for expression of chimeric antigen receptor protein <130> 2013 <160> 34 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1260 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 1 gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcagc 60 atcacttgcc attcaagtca ggacattaac agtaatatag ggtggttgca gcagagacca 120 gggaaatcat ttaagggcct gatctatcat ggaaccaact tggacgatga agttccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tggagccgat tattctctca ccatcagcag cctggaatct 240 gaagattttg cagactatta ctgtgtacag tatgctcagt ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa acgtggtgga ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt 360 ggcggatcgg ccgatgtgca gcttcaggag tcgggaccta gcctggtgaa accttctcag 420 tctctgtccc tcacctgcac tgtcactggc tactcaatca ccagtgattt tgcctggaac 480 tggatccggc agtttccagg aaacaagctg gagtggatgg gctacataag ttatagtggt 540 aacactaggt acaacccatc tctcaaaagt cgaatctcta tcactcgaga cacatccaag 600 aaccaattct tcctgcagtt gaattctgtg actattgagg acacagccac atattactgt 660 gtaacggcgg gacgcgggtt tccttattgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 720 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 780 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 840 gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 900 ctgtcactgg ttatcaccag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 960 cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1020 ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgcagag aaggaagaac 1080 cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1140 attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1200 agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctag 1260 <210> 2 <211> 1527 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 2 gccgatgtgc agcttcagga gtcgggacct agcctggtga aaccttctca gtctctgtcc 60 ctcacctgca ctgtcactgg ctactcaatc accagtgatt ttgcctggaa ctggatccgg 120 cagtttccag gaaacaagct ggagtggatg ggctacataa gttatagtgg taacactagg 180 tacaacccat ctctcaaaag tcgaatctct atcactcgag acacatccaa gaaccaattc 240 ttcctgcagt tgaattctgt gactattgag gacacagcca catattactg tgtaacggcg 300 ggacgcgggt ttccttattg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc aggtggaggc 360 ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc ggatcggaca tcctgatgac ccaatctcca 420 tcctccatgt ctgtatctct gggagacaca gtcagcatca cttgccattc aagtcaggac 480 attaacagta atatagggtg gttgcagcag agaccaggga aatcatttaa gggcctgatc 540 tatcatggaa ccaacttgga cgatgaagtt ccatcaaggt tcagtggcag tggatctgga 600 gccgattatt ctctcaccat cagcagcctg gaatctgaag attttgcaga ctattactgt 660 gtacagtatg ctcagtttcc gtggacgttc ggtggaggca ccaagctgga aatcaaacgt 720 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 780 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 840 gacttcgcct gtgatttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 900 ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 960 cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc caacccgcaa gcattaccag 1020 ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca aacggggcag aaagaaactc 1080 ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1140 tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1200 aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1260 ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1320 gggggaaagc cgcagagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1380 gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1440 gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1500 cacatgcagg ccctgccccc tcgctag 1527 <210> 3 <211> 1260 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 3 gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga ccgtgtgacc 60 attacctgcc atgcgagcca ggatattaac agcaacattg gctggctgca gcagaaaccg 120 ggcaaagcgt ttaaaggcct gatttatcat ggcaaaaacc tggaagatgg cgtgccgagc 180 cgttttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgcgttcag tacgcccagt tcccatatac atttggccag 300 ggcaccaaag tggaaattaa acgttcaggt ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc 360 ggtggcggat cggatgtgca gctggtggaa agcggcggcg gcctggtgca gccgggcggc 420 agcctgcgtc tgagctgcgc ggtgagcggc tatagcatta ccagcgatta tgcgtggaac 480 tggattcgtc aggcgccggg caaaggcctg gaatggctgg gctatattag ctatcgcggc 540 cgcaccagct ataacccgag cctgaaaagc cgtattagca ttacccgtga taacagcaaa 600 aacacctttt tcctgcagct gaacagcctg cgtgcggaag ataccgcggt gtattattgc 660 gcgcgcctgg gacgcggctt ccgctactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 720 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 780 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 840 gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 900 ctgtcactgg ttatcaccag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 960 cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1020 ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgcagag aaggaagaac 1080 cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1140 attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1200 agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctag 1260 <210> 4 <211> 1527 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 4 gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga ccgtgtgacc 60 attacctgcc atgcgagcca ggatattaac agcaacattg gctggctgca gcagaaaccg 120 ggcaaagcgt ttaaaggcct gatttatcat ggcaaaaacc tggaagatgg cgtgccgagc 180 cgttttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgcgttcag tacgcccagt tcccatatac atttggccag 300 ggcaccaaag tggaaattaa acgttcaggt ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc 360 ggtggcggat cggatgtgca gctggtggaa agcggcggcg gcctggtgca gccgggcggc 420 agcctgcgtc tgagctgcgc ggtgagcggc tatagcatta ccagcgatta tgcgtggaac 480 tggattcgtc aggcgccggg caaaggcctg gaatggctgg gctatattag ctatcgcggc 540 cgcaccagct ataacccgag cctgaaaagc cgtattagca ttacccgtga taacagcaaa 600 aacacctttt tcctgcagct gaacagcctg cgtgcggaag ataccgcggt gtattattgc 660 gcgcgcctgg gacgcggctt ccgctactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 720 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 780 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 840 gacttcgcct gtgatttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 900 ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 960 cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc caacccgcaa gcattaccag 1020 ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca aacggggcag aaagaaactc 1080 ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1140 tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1200 aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1260 ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1320 gggggaaagc cgcagagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1380 gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1440 gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1500 cacatgcagg ccctgccccc tcgctag 1527 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 5 gacatcctga tgacccaatc tccatcctc 29 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 6 tgcagagaca gtgaccagag tcccttgg 28 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 7 gatattcaga tgacccagag cccg 24 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 8 gctgctcacg gtcaccaggg tg 22 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 9 cactgtctct gcaaccacga cgccagcg 28 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 10 ggtgataacc agtgacagga g 21 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 11 cactgtctct gcaaccacga cgccagcg 28 <210> 12 <211> 62 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 12 gaggtcgacc tacgcggggg cgtctgcgct cctgctgaac ttcactctgg tgataaccag 60 tg 62 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 13 ttttgggtgc tggtggtggt tgg 23 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 14 gctgaacttc actctggagc gataggctgc gaag 34 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 15 aaacggggca gaaagaaact c 21 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 16 cagttcacat cctccttc 18 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 17 cactggttat caccagagtg aagttcagca ggagc 35 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 18 cgaggtcgac ctagcgaggg ggcagggcct gcatg 35 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 19 accacgacgc cagcgccg 18 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 20 cacccagaaa ataataaag 19 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> artificial <400> 21 agagtgaagt tcagcaggag cgcag 25 <210> 22 <211> 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360 365 Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg 370 375 380 Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser 385 390 395 400 Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr 405 410 415 Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys 420 425 430 Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys 435 440 445 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 450 455 460 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 465 470 475 480 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 485 490 495 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 500 505 <210> 33 <211> 419 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDS，not including signal peptide <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Asn 20 25 30 Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Ile 35 40 45 Tyr His Gly Lys Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 145 150 155 160 Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Tyr Ile 165 170 175 Ser Tyr Arg Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile 180 185 190 Ser Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Phe Phe Leu Gln Leu Asn 195 200 205 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly 210 215 220 Arg Gly Phe Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 245 250 255 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 260 265 270 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 275 280 285 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 290 295 300 Ile Thr Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 305 310 315 320 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 325 330 335 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 340 345 350 Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 355 360 365 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 370 375 380 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 385 390 395 400 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 405 410 415 Pro Pro Arg <210> 34 <211> 508 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDS，not including signal peptide <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Asn 20 25 30 Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Ile 35 40 45 Tyr His Gly Lys Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 145 150 155 160 Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Tyr Ile 165 170 175 Ser Tyr Arg Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile 180 185 190 Ser Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Phe Phe Leu Gln Leu Asn 195 200 205 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly 210 215 220 Arg Gly Phe Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 245 250 255 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 260 265 270 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val 275 280 285 Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr 290 295 300 Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu 305 310 315 320 His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg 325 330 335 Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg 340 345 350 Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe 355 360 365 Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg 370 375 380 Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser 385 390 395 400 Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr 405 410 415 Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys 420 425 430 Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys 435 440 445 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 450 455 460 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 465 470 475 480 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 485 490 495 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 500 505

Claims (11)

  1. 인체 T림프구의 표면에 발현되는 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체 단백질은 순서적으로 연결된 세포외 결합 영역, 막 관통 영역과 세포내 신호 영역을 포함하고, 상기 세포외 결합 영역은 SEQ ID NO: 31 ~ 32 중 어느 하나의 아미노산 1 ~ 240 서열과 동일한 서열을 갖는 단일 사슬 항체(single chain antibody fragment, scFv)를 포함하고, 상기 세포외 결합 영역은 인간의 상피성 성장 인자(epidermal growth factor)의 287번째 - 302번째 아미노산 에피토프에 결합하는, 인체 T림프구의 표면에 발현되는 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 막 관통 영역은 CD8 또는 CD28의 막 관통 영역과 힌지 영역(hinge region) 서열을 포함하는, 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 세포내 신호 영역은 CD3ζ, FcεRIγ, CD28，CD137，CD134의 세포내 신호 영역 서열, 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 핵산.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체 단백질은 순서적으로 연결된 세포외 결합 영역, 막 관통 영역과 세포내 신호 영역을 포함하는 하기 키메라 항원 수용체 단백질로써,
    scFv(EGFR)-CD8-CD3ζ,
    scFv(EGFR)-CD8-CD137-CD3ζ,
    scFv(EGFR)-CD28-CD28-CD3ζ,
    scFv(EGFR)-CD28-CD28-CD137-CD3ζ,
    또는 이들의 조합을 포함하고,
    상기 키메라 항원 수용체 단백질 중의 첫 번째 CD28은 상기 단백질의 막 관통 영역을 대표하고, 두 번째 CD28은 상기 단백질의 세포내 신호 영역을 대표하는, 핵산.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 SEQ ID NO: 1 및 2 중 어느 하나의 서열을 구비하는, 핵산.
  7. 제1항의 핵산을 포함하는, 벡터(vector).
  8. 제7항에 있어서,
    상기 벡터는 렌티바이러스 플라스미드 벡터 pWPT-eGFP에서 유래되는, 벡터.
  9. 제7항에서 기재한 핵산을 포함하는, 바이러스.
  10. 제1항의 핵산 또는 제7항의 벡터 또는 제9항의 바이러스가 형질 도입되는, 유전자 변형 T 림프구.
  11. 키메라 항원 수용체가 T 림프구 표면에서 발현되고, 키메라 항원 수용체가 제1항의 핵산에 의해 코딩되는, 유전자 변형(transgenic) T 림프구.
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