JP5680087B2 - 特異的結合タンパク質およびその使用 - Google Patents
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Description
SEQ ID NO:5で示されるCDR1、
SEQ ID NO:6で示されるCDR2、および
SEQ ID NO:7で示されるCDR3。
他の好ましい例において、前述のVH鎖はSEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列を有する。
SEQ ID NO:8で示されるCDR1、
SEQ ID NO:9で示されるCDR2、および
SEQ ID NO:10で示されるCDR3。
他の好ましい例において、前述のVL鎖はSEQ ID NO:4で示されるアミノ酸配列を有する。
本発明の第一に記載のモノクローナル抗体のVH鎖、
本発明の第二に記載のモノクローナル抗体のVL鎖、
本発明の第三に記載のモノクローナル抗体。
他の好ましい例において、前述の核酸分子はSEQ ID NO:1、3、11或いは13から選ばれるDNA配列を有する。
他の好ましい例において、前述モノクローナル抗体は、VH鎖がSEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列を有し、かつVL鎖がSEQ ID NO:4で示されるアミノ酸配列を有する。
他の好ましい例において、前述の細胞は、腫瘍細胞、例えば、肝癌細胞、肺癌細胞である。
よって、本発明の高親和力、高特異性のモノクローナル抗体は臨床では重要な価値がある。
(a)本発明のモノクローナル抗体の特異性および生理活性が顕著に向上する。このモノクローナル抗体は、EGFRvIIIと効率的に結合し、かつ細胞が過剰発現したEGFRと部分的に結合するが、細胞が正常に発現したEGFRとの結合作用がない。
(b)本発明のモノクローナル抗体の親和力、腫瘍抑制率はいずれも既存の抗体(例えばCH806抗体)よりも高く、かつ抗体のアミノ酸配列の構成(特にCDR領域)も違う。
よって、本発明の高親和力、高特異性のモノクローナル抗体は臨床では重要な価値がある。
1.1 EGFRvIIIタンパク質の細胞外ドメインの原核発現および精製
1.1.1 ベクターの構築および同定
pLNRNL(コード全長EGFRvIII、Ludwig Instituteから購入, San Diego, CA)を鋳型とし、PCR法で両末端にBamHIおよびSalIの切断部位を有するEGFRvIIIex増幅産物を得、BamHIおよびSalIで同時切断し、目的の断片を得た。BglIIとSalIで市販のベクターpET28a(Novagen社から購入)を切断し、アガロースゲル電気泳動後、目的の断片を回収し、T4リガーゼの作用によって連結し、ベクターpET28a-EGFRvIIIexを形成した。さらに市販の大腸菌TOP10(Invitrogenから購入)に導入し、カナマイシン耐性でスクリーンし、BglII和SalIによる切断により、挿入断片を含有する陽性クローンと同定された。
正確と同定された組換えプラスミドでそれぞれ通常の大腸菌Bl21(DE3)、Bl21(DE3)-RP、 HMS174(DE3) (Novagen社から購入)に形質転換を行い、且つカナマイシン耐性プレートに塗布して37℃で一晩倒立培養を行った。モノクローンを選択してODが0.6〜0.8になるまで振とう培養し、最終濃度が1mMになるようにIPTGを入れ、30℃で4時間誘導した後、菌液を収集し、遠心分離して沈殿物を取って、SDS-PAGE電気泳動でタンパク質の発現量を解析した。
目的遺伝子の原核細胞における発現を向上させるため、いくつかの発現誘導条件を試験で探った。
(1)誘導時間:細菌をLB培地に接種し、37℃でODが0.6〜0.8になるまで振とう培養し、最終濃度が1mMになるようにIPTGを入れ、30℃で振とう培養し、それぞれ1、2、3、4、5、6時間の時に菌液を収集した。
(2)誘導濃度:発現菌株を0.6〜0.8になるまで培養し、それぞれ最終濃度が0.2、0.5、0.8、1mMになるようにIPTGを入れ、30℃で4時間振とう培養し、細菌を収集した。
(3)誘導温度:発現菌株を0.6〜0.8になるまで振とう培養し、最終濃度が1mMになるようにIPTGを入れ、それぞれ37℃、30℃、25℃で4時間誘導した後、細菌を収集した。
上述条件で大量に誘導した後、沈殿物を収集して1/10体積の緩衝液A(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM Imidozole(イミダゾール)、pH8.0)で再懸濁させ、PMSF(最終濃度が1mM)を入れて氷の上で超音波処理(超音波3秒、間隔10秒、1サークル99回、計4サークル)を行った後、遠心分離(4℃、12000g)し、上清と沈殿物をそれぞれ収集し、12%SDS-PAGE電気泳動を行い、0.25%クマシーブルーで3時間染色した後、脱色をして観察した。
超音波による崩壊、遠心分離を経た沈殿物を十分に洗浄液I(100mM NaH2PO4、10mM Tris.Cl、2M 尿素(urea)、pH8.0)に再懸濁させ、4℃で30分間撹拌した後、15分間遠心分離(4℃、12000g)して沈殿物を収集し、洗浄液II(100mM NaH2PO4,10mM Tris.Cl,2M GuHCl,pH8.0)を入れ、上述操作を繰り返して、精製された封入体を得た。最後、封入体を8M尿素含有溶液(100mM NaH2PO4、10mM Tris.Cl、8M 尿素、pH8.0)に再懸濁させ、氷の上で超音波処理し、15分間遠心分離(4℃、12000g)し、沈殿物を捨て、上清を残した。
上清をNi-NTA アガロースと4℃で1時間(一晩)均一に混合し、親和クロマトグラフィーにかけて流出液を収集し、4mlの緩衝液C(100mM NaH2PO4、10mM Tris.Cl、2M 尿素、pH6.3)で3回洗浄し、さらに0.5mlの緩衝液D(100mM NaH2PO4、10mM Tris.Cl、2M 尿素、pH15.9)で4回洗浄し、最後に0.5mlの緩衝液E (100mM NaH2PO4、10mM Tris.Cl、2M 尿素、pH4.5)で4回洗浄した。それぞれの脱離液を収集して12%SDS-PAGEで純度を分析し、A280でその含有量を検出した。
精製されたタンパク質を一滴ずつ10倍体積の冷やしておいたアニーリング緩衝液(25mM Tris-Cl、0.1M NaCl、10%グリセリン、1.0M 尿素、0.01M アルギニン、1mM還元性グルタチオン、0.5mM 酸化性グルタチオン、pH8.0)を入れ、4℃で24時間インキュベートした後、透析袋に入れて、それぞれ0.5M、0.25M、0.125M尿素を含有する緩衝液(PBS、pH7.4)にて4℃で4時間以上透析し、最後に大量のPBSに4℃で24時間透析し、遠心分離して上清を取った。
Bl21(DE3)-RP菌における全タンパク質を陰性対照とし、アニーリング後の融合タンパク質に12%SDS-PAGEを行い、且つNC膜に転写した。1:1000のモノクローンのウサギ抗DGFRvIII(Zymed社から購入)(4℃で一晩インキュベートし、PBSTで膜を3回、毎回10分間洗浄したもの)および1:5000のHRPマウス抗ウサギIgG(37℃で1時間インキュベートし、膜洗浄は上述と同様なもの)滴下した。最後、ECL化学発光キットの試薬で現像し、且つ暗室でXフィルムを用いて露光した。
1.pET28a-EGFRvIIIex組換え発現プラスミドの同定
プラスミドpET28a-EGFRvIIIexはBglII及びSalIの酵素切断後1292bp、5147bpの電気泳動バンド(図1を参照)が現れ、予想の大きさと一致し、ベクターの構築が正しいことが証明された。
図2に示すように、精製されたEGFRvIIIの細胞外領域のタンパク質を得た。
図3及び4に示すように、EGFRvIIIの細胞外領域のタンパク質の純度が非常に高いことがわかった。
2.1 免疫
(1)組換えタンパク質による免疫:
EGFRvIIIの細胞外領域の組換えタンパク質と等量の完全フロイントアジュバント(Sigma)と充分に乳化混合して6週齢のBALB/cマウスに1匹100μgずつ皮膚下免疫した。4週後組換え抗原を不完全フロイントアジュバントと充分に乳化混合し、免疫マウスに1匹50μgずつ腹腔注射し、その後2週間おきに腹腔強化免疫を続けた。4回目の強化免疫の1週間後、組換え抗原で被覆し、ELISA法でマウスの抗血清力価を検出したところ、>105であった。
最後の強化の3週間後、20μgの組換え抗原で脾臓内免疫した。
マウスの脾臓内強化免疫の4日後、無菌の条件で脾臓を採取し、100メッシュのフィルターでリンパ細胞を分離し、骨髄腫瘍細胞系SP2/0と融合させた。ピポキサンチン-アミノプテリン-チミジン(hypoxathine, aminopterin and thymidine、HAT)で選択培養を3日行った後、HT培地を追加し、1週間培養を続けた。組換え抗原で被覆し、ELISAで陽性クローンを選択し、限界希釈法でサブクローニングし、2ヵ月培養を続けて、最後に安定したハイブリドーマ細胞系を得た。
その結果、陽性クローンを複数得たが、中でも12H23の活性が一番高かった。
2.3.1 オクタン酸/硫酸アンモニウム沈殿法による粗精製
腹水100mlを2倍体積の0.06MのpH 4.0の酢酸ナトリウム緩衝液で希釈し、4%オクタン酸をゆっくり滴下しながら、撹拌した。30分間撹拌した後、混濁液を10000gで30分間遠心分離した。沈殿物を捨て、上清液を0.01MのpH7.4のリン酸緩衝液で一晩透析した。透析液を取り、等体積の飽和硫酸アンモニウム液をゆっくり入れ、2時間置いた。混濁液を10000gで10分間遠心分離した。上清液を捨て、0.01M、pH7.4のPBSで溶解させた。溶解した溶液を0.01M、pH7.4のPBSで透析し、その期間で液を2回入れ替え、2回の入れ替えの間隔が5時間以上であった。透析溶液を10000gで10分間遠心分離し、沈殿物を捨て、上清液を収集した。
プロテインG親和性カラムを室温に戻し、5倍のカラム体積のPBSでバランスを取った。上述モノクローナル抗体溶液をカラムにかけ、5倍のカラム体積のPBSで洗った。pH2.3の0.1Mグリシン塩酸溶液で脱離させ、脱離液を1/10体積の1Mリン酸水素二ナトリウム溶液(pH9.0)で中和した。溶液を0.01M、pH7.4のPBSで透析し、その期間で液を2回入れ替え、2回の入れ替えの間隔が5時間以上であった。透析溶液を10000gで10分間遠心分離し、上清を0.22μmろ過膜でろ過してモノクローナル抗体溶液として保存した。上述の精製で、純度>95%の抗体を得た。
rEGFRvIIIexを被覆緩衝液(NaHCO3pH9.6)で1.0mg/Lに希釈し、ELISAマイクロプレートに各孔50μLずつ入れた。4℃で24時間被覆した。5%脱脂粉乳を含有するPBS 350μLを入れて一晩ブロックした。PBSで2回洗浄した。初期濃度が1mg/Lの12H23モノクローナル抗体50μLを入れ、37℃で1時間結合させた。PBSで3回洗浄し、それぞれヒツジ抗マウス亜型ポリクローナル抗体(1:1000希釈)100μLを入れ、37℃で1時間結合させた。PBSで3回洗浄した。HRP標識のロバ抗ヒツジのポリクローナル抗体、37℃で1/2時間結合させ、PBSで5回洗浄した。ABTS基質を入れて15分間発色させ、マイクロプレートリーダーで405nmの吸収係数の値を測定した。
結果は図6に示すように、この抗体12H23の亜型はIgG1型であった。
3.1 12H23の受容体結合特異性のFACS解析
ベクターの構築:
細胞:U87細胞(脳膠腫細胞系、EGFRが正常発現、ATCC細胞バンクから購入)、U87-EGFRvIII細胞(pLERNLベクターをトランスフェクションしたU87細胞系)およびA431細胞(人扁平上皮癌、EGFRが過剰発現、ATCC細胞バンクから購入)
抗体:実施例2で調製した抗体12H23、及び市販のC225モノクローナル抗体(対照として)。抗体濃度はいずれも2mg/mLで、1:100で希釈した。
2)次の日、10mMのEDTAで消化した細胞を使用し、5000rpm×3分間で遠心分離し、細胞を2mLのエッペンドルフチューブに収集した。
3)0.5〜1mlのPBSで細胞を再懸濁させ、4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、37℃で10分間インキュベートした。
4)細胞を氷の上に置いて1分間冷却した。
6)細胞を氷冷した90%メタノールに再懸濁させ、氷の上に30分間置いた。
7)5000rpm×3分間で遠心分離し、上清を捨てた。
8)0.5%BSA(PBSで調製)を入れて細胞を再懸濁させ、5000rpm×3分間で遠心分離し、3回洗浄した。
10)各管に0.5%BSA(PBSで調製)を入れ、室温で10分間ブロックした。
11)5000rpm×3分間で遠心分離し、ブロック液を捨てた。
13)遠心分離し、第一抗体インキュベート液を捨てた。
14)0.5%BSA(PBSで調製)を入れて細胞を再懸濁させ、5000rpm×3分間で遠心分離し、3回洗浄した。
16)遠心分離し、第二抗体インキュベート液を捨てた。
18)最後に、0.5〜1mLのPBSで細胞を再懸濁させ、フローサイトメトリー専用試験管に移した。
19)フローサイトメーターで解析した。
図7A〜7Fに示すように、抗体12H23はEGFRvIIIを高発現する細胞系と効率的に結合することができ、EGFRを過剰発現するA431細胞とも一部結合したが、EGFRを正常発現する細胞系U87だけでほとんど結合しなかった。一方、製品化の抗体C225(Erbitux)はEGFRvIIIを高発現する細胞系だけでなく、EGFRを正常発現する細胞系U87とも結合できた。本発明の抗体12H23がより優れた特異性を有することがわかった。
rEGFRvIIIexを被覆緩衝液(NaHCO3pH9.6)で5.0mg/L、2.5mg/L、1.25mg/Lおよび0.625mg/Lに希釈し、ELISAマイクロプレートに各孔100μLずつ入れた。4℃で24時間被覆した。被覆液を捨て、PBSで1回洗浄し、5%脱脂粉乳を含有するPBS 350μLを入れて一晩ブロックした。PBSで2回洗浄した。異なる濃度の抗原を被覆したマイクロプレートに、初期濃度が1mg/Lの12H23モノクローナル抗体を入れ、勾配希釈(希釈液が5%脱脂粉乳を含有するPBS)で12級に希釈した。37℃で1時間結合させ、PBSで3回洗浄し、ヒツジ抗マウスの第二抗体100μLを入れ、37℃で1時間結合させた、PBSで5回洗浄し、ABTS基質を入れて15分間発色させ、マイクロプレートリーダーで405nmの吸収係数の値を測定した。吸収係数の結果によって結合反応曲線を作り、作図法でその最高のOD値の半分(すなわち、OD:50%)の時の抗体濃度を得た。
図8に示すように、12H23は、5.0mg/L被覆曲線では、OD50%抗体濃度が3μg/L(2×10-11mol/L)で、2.5mg/L被覆曲線では、OD50%抗体濃度が2.5μg/L(1.7×10-11mol/L)で、1.25mg/L被覆曲線では、OD50%抗体濃度が2.3μg/L(1.5×10-11mol/L)で、0.625mg/L被覆曲線では、OD50%抗体濃度が2μg/L(1.5×10-11mol/L)であった。(式)K=(n−1)/2(nAb′-Ab)によって親和定数を算出した。ここで、Ab′とAbはそれぞれ抗原濃度がAg′とAgの時OD50%抗体濃度になることを表し、n=Ag/Ag′である。そして、それぞれ比較すると、6つのK値を算出し、6つのK値の平均を最終の結果とした。算出した12H23の親和定数が3.8×10-10mol/Lで、解離定数Kd値が2.6×10-11mol/Lであった。
4.1 組換えタンパク質の調製:
通常の方法で、それぞれEGFRの細胞外領域のS1ドメイン、S2ドメインおよびS1ドメインにおけるVK21ポリペプチドとM13ファージのpIIIタンパクのN12タンパクドメインが融合したもの(1.1の方法と同じ方法で)を構築し、EGFRvIIIの細胞外領域の組換えタンパク質を陽性対照とした(図9)。
組換えタンパク質rN12-S1、rN12-S2、EGFRvIIIex、rN12-VK21をそれぞれ被覆緩衝液(NaHCO3 pH9.6)で1.0mg/Lに希釈し、順にELISAマイクロプレートに各孔100μLずつ入れた。4℃で24時間被覆した。被覆液を捨て、PBSで1回洗浄し、5%脱脂粉乳を含有するPBS 350μLを入れて一晩ブロックした。PBSで2回洗浄した。それぞれ初期濃度が1mg/Lの12H23モノクローナル抗体を入れ、37℃で1時間結合させ、PBSで3回洗浄した。更に、ヒツジ抗マウスの第二抗体100μLを入れ、37℃で1時間結合させた後、PBSで5回洗浄した。ABTS基質を入れて15分間発色させ、マイクロプレートリーダーで405nmの吸収係数の値を測定した。
ELISAの結果は図11に示すように、抗体12H23はEGFRvIII、rN12-S1およびrN12-VK21と結合することができた。構造および配列によれば、12H23が結合する領域はこれらのタンパク質の共有領域、すなわち、VK21であることが推測された。VK21のポリペプチド配列はVRACGADSYEMEEDGVRKCKK(SEQ ID NO:11)である。
1)3×106個の通常のHuh7-EGFRvIII腫瘍細胞(pLRNLをトランスフェクションしたHuH-7肝臓癌細胞系、Huh-7は米国ATCC細胞バンクから購入)をそれぞれ18匹のBalb/cヌードマウスの右側肩甲の皮下に注射した。
4)抗体注射と同時に、腫瘍の体積を1日おきに測定し、抗体注射が終わった後、腫瘍の体積の測定を2週間続けた。腫瘍の体積は(式)腫瘍の体積=腫瘍の長さ×腫瘍の幅2/2で算出した。
5)腫瘍の生長状況を観察した。
12H23はHuh7-EGFRvIIIのヌードマウスの播種腫瘍に顕著な抑制作用があり(約70%)、且つその抑制率もC225抗体より優れていた(図12)。
5'RACE法で5'配列が未知の遺伝子を大体以下のようにクローンした(具体的な操作はTakara 5'-full RACE Kitの説明書に従った)。
2)タバコ酸性ピロホスファターゼ(Tobacco Acid Pyrophosphatase、TAP)でmRNAの5'キャップ構造を除去し、一つのリン酸基を残した。
4)逆転写酵素で逆転写反応を行った。使用されたプライマーはキットで提供されたランダムの9量体のプライマーであった。
5':5'RACE Outer Primer(CATGGCTACATGCTGACAGCCTA) (SEQ ID NO: 12)
3':重鎖:CCAGAGTTCCAGGTCACTGTCACT (SEQ ID NO: 13)
軽鎖:ACACGACTGAGGCACCTCCA (SEQ ID NO: 14)
5':5'RACE Inner Primer(CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG) (SEQ ID NO: 15)
3':重鎖:CCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTT (SEQ ID NO: 16)
軽鎖:TGGATGGTGGGAAGATGGATACA (SEQ ID NO: 17)
7)TAクローンを行い、配列を測定した。
12H23モノクローナル抗体の重鎖、軽鎖および各CDRの配列は図13〜14および下記表1に示す。
1.抗体可変領域コード配列を含有するヒト-マウスキメラ抗体の発現ベクターのクローニング
それぞれhCMVプロモーター、重鎖可変領域のクローン部位NheIとApaIおよびヒトIgG1の重鎖定常領域、IRESリボソーム挿入部位、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子(DHFR)及びアンピシリン耐性遺伝子を含む抗体の重鎖の発現ベクターpHを構築した(図15Aを参照)。
上述構築された抗体遺伝子をもつ発現ベクターを大腸菌DH5α菌株に導入し、そして100mLのLB培地に接種して増幅させ、Qiagen社の高純度プラスミドDNA精製キット(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)でプラスミドDNAを抽出、精製した。上述精製されたプラスミドDNAをInvitrogen社のリプソーム法キットでCHO細胞にトランスフェクションし、操作はメーカーの説明書を参照して行った。
抱合体の調製
キメラモノクローナル抗体CH12を直接ジフテリア毒素(武漢生物製品研究所から購入)と共役結合で結合させた。Huh7-EGFRvIIIの細胞に結合物を入れると、特異的な細胞毒性が観察される。EGFRvIIIを発現しないHuh7細胞は、非常に高濃度の抗体に曝されるときだけ殺傷される。
注射液の調製
実施例5で調製された抗体12H23或いは実施例7で調製されたキメラモノクローナル抗体CH12を注射用生理食塩水に入れ、均一に混合した後、0.22uMの無菌フィルターで除菌し、注射液を小瓶に分け(50mL/瓶)、包装して使用に供する。ここで、50mLあたりの注射液にモノクローナル抗体50mgが含有される。
キメラ抗体CH12とマウス由来のモノクローナル抗体12H23の競争結合実験
ELISA法によって、HRP標識のCH12抗体(1.0μg/mL)を固定し、さらに異なる濃度の未標識CH12抗体或いは12H23抗体(0、3、9、27、81、243、729μg/mL)を入れた。
キメラ抗体CH12の細胞免疫組織化学的検出
通常の免疫蛍光の方法によってCH12キメラ抗体とHuh-7細胞、Huh7-EGFRおよびHuh7-EGFRvIIIの結合状況を検出した。
CH12キメラ抗体の生体内における腫瘍生長を抑制する能力
1)Huh7-EGFRvIII腫瘍細胞或いはSMMC-7721肝臓癌細胞系(中科院細胞バンクから購入)をそれぞれBalb/cヌードマウスの右側肩甲の皮下に注射した。1匹あたりのマウスの播種細胞量は3×106 個であった。(注:SMMC-7721細胞が肝臓癌細胞系で、本発明者らは実験によって内因的にEGFRvIIIが存在することを証明した。)
4)抗体注射と同時に、腫瘍の体積を測定し、抗体注射が終わった後腫瘍の体積の測定を2週間続けた。腫瘍の体積は、(式)腫瘍の体積=腫瘍の長さ×腫瘍の幅2/2で算出した。
5)腫瘍の生長状況を観察した。
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- VH鎖がSEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列を有し、かつVL鎖がSEQ ID NO:4で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とするモノクローナル抗体或いはその抱合体。
- 抗体がマウス抗体またはキメラ抗体であることを特徴とする請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1に記載のモノクローナル抗体をコードすることを特徴とするDNA分子。
- SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3から選ばれたDNA配列を有することを特徴とする請求項3に記載のDNA分子。
- (a)上皮成長因子受容体変異体IIIを発現する細胞の成長の抑制又は致死、或いは(b)上皮成長因子受容体を過剰発現する細胞の成長の抑制のために用いられる医薬組成物であって、請求項1に記載のモノクローナル抗体と、薬学的に許容される単体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
- (a)上皮成長因子受容体変異体IIIを発現する細胞の致死又は成長の抑制、或いは(b)上皮成長因子受容体を過剰発現する細胞の成長の抑制のための医薬の製造に用いられることを特徴とする請求項1に記載のモノクローナル抗体或いはその抱合体の用途。
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