CN101602808B - 特异性结合蛋白及其使用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及特异性结合蛋白及其使用。具体地，本发明提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体可与表皮生长因子受体突变体III(EGFRvIII)有效结合或与细胞过量表达的表皮生长因子受体(EGFR)部分结合，但与细胞正常表达的EGFR没有结合作用。此外，本发明抗体对表达EGFRvIII的肿瘤细胞系有明显的治疗作用。本发明还提供了所述单克隆抗体的制备方法以及含有所述单克隆抗体的药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域。更具体地，本发明涉及抗表皮生长因子受体突变体III(EGFRvIII)的特异性单克隆抗体及其应用。本发明的抗体可与EGFRvIII有效结合或与细胞过量表达的表皮生长因子受体(EGFR)部分结合，该抗体与细胞正常表达的EGFR没有结合作用。本发明抗体可用于治疗表达EGFRvIII的肿瘤细胞系。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因c-erb B的170千道尔顿(Kilodalton)膜糖蛋白产物(1)。EGFR基因是最初在鸟类红细胞增多症病毒中识别的erb B致癌基因的细胞同系物(1，2)。已在各种人类肿瘤中观察到这种致癌基因通过基因放大的活化(3-6)。
已有文献表明，EGFR在多种类型的人类实体瘤中过表达(7)。这些肿瘤包括肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌和前列腺癌(7)。v-erbB致癌基因和正常EGFR基因之间的一个主要区别在于病毒致癌基因是正常受体截断氨基的变型；它们缺少大部分细胞质外结构域，但保留了跨膜和酪氨酸激酶结构域(8-11)。这导致了它不能结合表皮生长因子(EGF)，但仍可以磷酸化其它蛋白质(14-15)。
各种基因变化都可以发生于病毒性erb B致癌基因中，例如，基因的羧基末端中发生氨基酸的取代和缺失。其中氨基端缺失对于致癌作用尤为关键。氨基端缺失是大多v-erb B致癌基因的一个特征，包括由启动子的插入或逆转录病毒转导引起的那些氨基端缺失(13，16)。相反，羧基末端缺失似乎只与逆转录病毒转导引起的肿瘤有关，而且似乎决定于宿主范围和肿瘤类型的特异性(11，15)。以氨基端缺失的鸟类c-erb B基因或人EGF受体的转染实验表明该缺失可以使细胞转化(16-17)。
EGFR基因的放大发生于40％的恶性人类神经胶质瘤中(3，7)，受体基因的重排在许多具有基因放大的肿瘤中较为明显。重排似乎更多地影响基因的氨基末端(6，18)。
迄今已发现至少有八种EGFR变体(图5)：1)EGFRvI缺少EGFR的大部分细胞外结构域。2)EGFRvII由EGFR的细胞外结构域中的83aa框内缺失组成。3)EGFRvIII由EGFR的细胞外结构域中的267aa框内缺失组成。4)EGFRvIV含有EGFR的细胞质结构域中的缺失。5)EGFRvV含有EGFR的细胞质结构域中的缺失。6)EGFR.TDM/2-7含有EGFR的细胞外结构域中的外显子2-7的重复。7)EGFR.TDM/18-26含有EGFR的细胞外结构域中的外显子18-26的重复。8)另外，存在第二种更为罕见的具有在外显子11和14之间的连接点引入新颖组氨酸残基的缺失的EGFRvIII突变体(EGFRvIII/Δ12-13)(24)。
EGFRvIII是在人类癌症中表皮生长因子(EGF)受体最常见发生的变体(24)。在基因放大的过程中，在胞外区发生267个氨基酸缺失，产生新的连接点(甘氨酸)。已知EGFRvIII未表达于任何正常组织(19，20)。然而，EGFRvIII在许多肿瘤细胞中有表达，例如，27-76％乳腺癌活检组织检查表达EGFRvIII(21)，50-70％神经胶质瘤表达EGFRvIII(19，22)，16％非小细胞肺癌表达EGFRvIII(23)，75％卵巢癌表达EGFRvIII(22)。
一种治疗过量表达EGFRvIII的癌症的方法涉及使用特异性靶向至未分离正常EGFR的变体受体的肿瘤特异性核酶。发现核酶在无胸腺裸鼠中显著抑制乳腺癌生长(25)。
此外，缺失267个氨基酸并替换为甘氨酸所产生的独特连接可以用于制备抗EGFRvIII的特异性单抗。此外，鉴于EGFRvIII在某些肿瘤中的表达及其在正常组织中的表达缺乏，EGFRvIII是肿瘤药物的理想靶点。具体地说，EGFRvIII可作为肿瘤免疫偶联物治疗的理想候选物。抗EGFRvIII的单克隆抗体(或其与抗肿瘤剂或毒素偶联的形成的偶联物)在体内能够导致抗体依赖性地溶胞或杀细胞作用，从而清除表达EGFRvIII的肿瘤细胞。
目前，虽然国内外已经获得了多种抗EGFR抗原的抗体，但是这些抗体往往不够理想，例如无或较低的针对EGFRvIII的特异性。
因此，本领域还迫切需要研制识别EGFRvIII的特异性更高且不识别野生型EGFR的、以及具有其他优良特性的抗EGFRvIII单克降抗体，从而开发出治疗效果更显著的药物。
发明内容
本发明的目的提供一种特异性抗EGFRvIII单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供一种所述特异性抗EGFRvIII单克隆抗体的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种含所述抗EGFRvIII单克隆抗体的药物组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种单克隆抗体VH链，所述重链的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：5所示的CDR1，
SEQ ID NO：6所示的CDR2，
SEQ ID NO：7所示的CDR3。
在另一优选例中，所述的VH链具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种单克隆抗体VH链，所述轻链的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：8所示的CDR1，
SEQ ID NO：9所示的CDR2，
SEQ ID NO：10所示的CDR3。
在另一优选例中，所述的VL链具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种单克隆抗体或其偶联物，所述抗体的VH链具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，且其VL链分别具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体结合于人表皮生长因子受体突变体(EGFRvIII)、并与细胞过量表达的EGFR部分结合，但该抗体与细胞正常表达的EGFR没有结合作用。
更佳地，所述的抗体结合于A431细胞和U87-EGFRvIII细胞，但不结合于U87细胞。
在另一优选例中，所述的抗体是鼠源抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。
在另一优选例中，所述的偶联物是抗体与抗肿瘤剂或毒素(如白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素)的偶联物。
在本发明的第四方面，提供了一种核酸分子(如DNA分子)，所述分子编码选自下组的蛋白质：
本发明第一方面中所述的单克隆抗体VH链；
本发明第二方面中所述的单克隆抗体VL链；
本发明第三方面中所述的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的核酸分子具有选自下组的DNA序列：SEQ IDNO：1、3、11或13。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它含有单克隆抗体和药学上可接受的载体，所述单克隆抗体的VH链和VL链分别具有SEQ ID NO：5-7和SEQ ID NO：8-10所示的互补决定区。
在另一优选例中，所述单克隆抗体的VH链具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，且其VL链分别具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
在本发明的第六方面，提供了一种本发明所述的单克隆抗体或其偶联物的用途，其中它们被用于制备组合物，所述的组合物用于：(a)抑制或杀灭表达表皮生长因子受体突变体III的细胞的生长；或(b)抑制与过量表达表皮生长因子受体的细胞生长。
在另一优选例中，所述的细胞是肿瘤细胞，如肝癌细胞、肺癌细胞。
附图说明
图1显示了重组质粒pET28a-EGFRvIIIex经BglII和SalI酶切鉴定。其中各泳道如下：1-4为质粒双酶切；M：DNA分子量标准λHindIII。
图2显示了EGFRvIII胞外区蛋白的纯化结果。其中各泳道如下：1，11：蛋白分子量标准；2：未诱导的细菌沉淀；3：流出液；4-6：缓冲液C的洗涤液；7-10：缓冲液D的洗脱液；12-16：缓冲液E的洗脱液。
图3显示了复性蛋白的SDS-PAGE图。其中，各泳道如下：1：蛋白分子量标准；2：复性蛋白。
图4显示了复性蛋白的Western印迹。其中，各泳道如下：1：复性蛋白；2：BL21(DE3)-RP菌液总蛋白。
图5显示了野生型EGFR及其各种突变体。
图6显示了12H23抗体亚型的ELISA分析。
图7显示了本发明抗体1 2H23和对照抗体C225分别与A431细胞(过量表达EGFR)、U87-EGFRvIII细胞(稳定高表达EGFRvIII)和U87细胞(正常表达EGFR)的流式细胞分析图。其中，各图如下：
A：C225与A431细胞的结合图；
B：12H23与A431细胞的结合图；
C：C225与U87-EGFRvIII细胞系的结合图；
D：12H23与U87-EGFRvIII细胞系的结合图；
E：C225与U87细胞的结合图；
F：12H23与U87细胞的结合图。
图8显示了12H23与抗原rEGFRvIIIex蛋白的亲和力测定。
图9显示了各重组蛋白的序列结构示意图。
图10显示了重组蛋白的SDS-PAGE分析。其中，各泳道如下：M：蛋白质标准品；1：rN12-S1；2：rN12-S2；3：rEGFRvIIIex；4：rN12-VK21。
图11显示了ElISA法测定12H23结合表位的结果。其中，S1：rN12-S1；S2：rN12-S2；EGFRvIII：重组的EGFRvIII胞外蛋白；VK21：rN12-VK21 Neg：空白对照。
图12显示了12H23单抗对裸小鼠种植瘤的抑制作用。
图13显示了12H23单抗重链的核苷酸编码序列和氨基酸序列(下划线为CDR)。
图14显示了12H23单抗轻链的核苷酸编码序列和氨基酸序列(下划线为CDR)。
图15显示质粒pH和pK的示意图。
图16显示了人鼠嵌合抗体CH12与重组的EGFRvIII胞外蛋白的结合。图中，1-5分别表示表达CH12的各个细胞克隆株。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，成功获得了对EGFRvIII高特异性的单克隆抗体，该单克隆抗体可与EGFRvIII有效结合或与细胞过量表达的EGFR部分结合，但与细胞正常表达的EGFR没有结合作用。此外，本发明抗体对表达EGFRvIII的肿瘤细胞系有明显的治疗作用。在此基础上完成了本发明。
本发明提供了一种重组抗EGFRvIII单克隆抗体。所述的抗体可以是鼠源的、人源的或嵌合的。例如，人源化的抗体可包括人源恒区(如人源恒区IgG1-Fc)，本发明的重链可变区和轻链可变区。
本发明还提供了抗EGFRvIII单克隆抗体的氨基酸序列及其其可变区链，以及具有这些链的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为超变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
此外，最近还发现由轻链可变区构成的相关结构，与相应的重链可变区相比，其结合的动力学比较小，分离的重链可变区域自身具有抗原结合活性。
此处鉴定的V链的超变区或互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。本发明的单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞； CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的单克隆抗体或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中， 其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于预防和治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克降抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的突出优点在于：
(a)本发明的单克隆抗体的特异性和生理活性有显著的提高。该单克隆抗体可与EGFRvIII有效结合，并且与细胞过量表达的EGFR部分结合，但与细胞正常表达的EGFR没有结合作用。
(b)本发明的单抗的亲和力高于现有的抗体(如CH806抗体)并且抗体氨基酸序列组成也不一样。
因此，本发明的高亲和力、高特异性的单克降抗体在临床上具有重要的价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗原的制备
1.1 EGFRvIII蛋白胞外区的原核表达及纯化
1.1.1载体构建及鉴定
以pLNRNL(编码全长EGFRvIII，购自Ludwig Institute，San Diego，CA)为模板，用PCR方法获得两端带有酶切位点BamHI和SalI的EGFRvIIIex扩增产物，用BamHI和SalI双酶切，得到目的片断。用BglII和SalI酶切市售的载体pET28a(可购自Novagen公司)，琼脂糖凝胶电泳后回收目的片断，在T4连接酶的作用下连接，形成载体pET28a-EGFRvIIIex，然后转化市售的大肠杆菌TOP10(可购自Invitrogen公司)，经卡那抗性进行筛选，经BglII和SalI酶切鉴定含插入片断的阳性克隆。
1.1.2表达细菌的筛选
用鉴定正确的重组质粒分别转化常规的大肠杆菌B121(DE3)、B121(DE3)-RP、HMS174(DE3)(可购自Novagen公司)，并平铺于卡那抗性的平皿上37℃倒置培养过夜，挑取单克隆后振荡培养至OD为0.6-0.8，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导4h后收集菌液，离心取沉淀行SDS-PAGE电泳分析蛋白的表达量。
1.1.3融合蛋白诱导条件的分析
为了提高目的基因原核表达水平，试验摸索了一系列表达诱导条件。(1)诱导时间：将菌种接种于LB培养基中，37℃振荡培养至OD为0.6-0.8，加入终浓度为1mMIPTG，30℃振荡培养，分别在1、2、3、4、5、6h时间点收集菌液。(2)诱导浓度：将表达菌株培养至OD0.6-0.8，分别加入终浓度为0.2、0.5、0.8、1mM的IPTG，30℃振摇4h，收获细菌。(3)诱导温度：振荡培养表达细菌至OD0.6-0.8时，加入终浓度为1mM IPTG，分别在37℃、30℃、25℃下诱导4小时，收集细菌。。
1.1.4融合蛋白的表达形式
按上述条件大量诱导后，收集沉淀加入1/10体积的缓冲液A(50mMNaH2PO4，300mM NaCl，10mM Imidozole(咪唑)，pH 8.0))重悬，加PMSF(终浓度为1mM)置冰上超声(超声3秒，间隔10秒，一轮99次，共4轮)，离心(4℃，12000g)15min，分别收集上清和沉淀，进行12％SDS-PAGE电泳，0.25％考马斯亮蓝染色3小时后脱色观察。
1.1.5 包涵体的洗涤和变性
经超声裂解、离心后的沉淀充分重悬于洗液I(100mM NaH2PO4，10mMTris.Cl，2M尿素(urea)，pH 8.0)，4℃搅拌30min后，离心(4℃，12000g)15分钟收集沉淀；加入洗液II(100mM NaH2PO4，10mM Tris.Cl，2M GuHCl，pH 8.0)，重复上次操作，获得纯化的包涵体沉淀。最后将包涵体用含8M的尿素溶液(100mM NaH2PO4，10mM Tris.Cl，8M尿素，pH 8.0)重悬，冰上超声，离心(4℃，12000g)15min，弃沉淀，保留上清。
1.1.6融合蛋白的纯化
上清与Ni-NTA Agarose 4℃混匀1小时(或过夜)，上亲和色谱柱收集流出液，用4ml缓冲液C(100mM NaH2PO4，10mM Tris.Cl，2M尿素，pH 6.3)洗涤3次，接着用0.5ml缓冲液D(100mM NaH2PO4，10mM Tris.Cl，2M尿素，pH 15.9)洗脱4次，最后用0.5ml缓冲液E(100mM NaH2PO4，10mM Tris.Cl，2M尿素，pH4.5)洗脱4次；分别收集洗脱液并行12％SDS-PAGE分析纯度，测A280检测其含量。
1.1.7融合蛋白的复性
将纯化后的蛋白逐滴加入10倍体积预冷的复性缓冲液(25mM Tris-cl，0.1MNaCl，10％甘油，1.0M尿素，0.01M精氨酸，1mM还原性谷胱甘肽，0.5mM氧化性谷胱甘肽pH 8.0)，4℃孵育24h后；加到透析袋中，分别在含行0.5M、0.25M、0.125M尿素缓冲液(PBS，pH 7.4)中4℃透析4h以上；最后在大体积的PBS中4℃透析24h，离心，取上清。
1.3.8复性蛋白的Western印迹鉴定
以Bl21(DE3)-RP菌中总蛋白为阴性对照，对复性后的融合蛋白进行12％SDS-PAGE，并转移至NC膜上。依次滴加1：1000的单克隆的兔抗EGFRvIII(可购自Zymed公司)(4℃孵育过夜，PBST洗膜3次，每次10min)及1：5000的HRP标记的鼠抗兔IgG(37℃孵育1h，洗膜同上)。最后用ECL化学发光试剂盒的试剂显影，并在暗室用X光片感光。
结果：
1.pET28a-EGFRvIIIex重组表达质粒的鉴定
质粒pET28a-EGFRvIIIex经经BglII和SalI酶切后分别出现1292bp、5147bp的电泳条带(见图1)，与预期大小相符，说明载体构建正确。
2.EGFRvIII胞外区蛋白的纯化
如图2所示，获得了纯化的EGFRvIII胞外区蛋白。
3.EGFRvIII蛋白复性后的鉴定
如图3和图4所示，结果表明EGFRvIII胞外区蛋白纯度非常高。
实施例2.抗原免疫及杂交瘤筛选
2.1免疫
(1)重组蛋白免疫：
EGFRvIII胞外区重组蛋白与等量完全弗氏佐剂(Sigma)充分乳化混合皮下免疫6周龄BALB/c小鼠，100μg每只小鼠。4周后重组抗原与不完全弗氏佐剂乳化混合，腹腔注射免疫小鼠，50μg每只小鼠，其后间隔2周，继续腹腔加强免疫。在第4次加强免疫1周后，以重组抗原包被，ELISA法检测小鼠抗血清效价＞105。
(3)脾内注射加强免疫：
最后一次加强3周后，脾内免疫20μg重组抗原。
2.2杂交瘤细胞株建立
小鼠经脾内加强免疫后4天，在无菌情况下取脾，用100目滤网滤过分离淋巴细胞，与骨髓瘤细胞系SP2/0融合，经次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷(hypoxathine，aminop terin and thymidine，HAT)选择性培养3天后，补加HT培养基，继续培养1周。以重组抗原包被，EL ISA筛选阳性克隆，以有限稀释法进行3次亚克隆，继续连续培养2个月，最后获得稳定杂交瘤细胞系。
结果，获得了多个阳性克隆，其中活性最高为12H23。
2.3抗体的纯化
2.3.1辛酸/硫酸铵沉淀方法初步纯化
取腹水100ml用2倍体积的0.06M pH 4.0的乙酸钠缓冲液稀释，缓慢滴入4％辛酸，边滴边搅拌。搅拌30min然后将混浊液于10000g下离心30min。弃去沉淀，上清液0.01M，pH 7.4的磷酸缓冲液透析过夜。取出透析液，缓慢加入等体积的饱和硫铵，静置2小时。将混浊液于10000g离心10min。弃上清液，用0.01M，pH7.4的PBS溶解。将溶解后的溶液用0.01M，pH7.4的PBS透析，其间换液两次，两次换液时间不得少于5小时。将透析溶液于10000g离心10min，弃去沉淀，收集上清液。
2.3.2蛋白G亲和纯化
取出蛋白G亲和柱回复室温，用PBS平衡5个柱体积。将上述单抗溶液上柱，PBS洗5个柱体积。以pH2.3，0.1M甘氨酸盐酸溶液洗脱，洗脱液加入1/10体积1M磷酸氢二钠溶液pH9.0中和。将溶液用0.01M，pH7.4的PBS透析，其间换液两次，两次换液时间大于5小时。将透析溶液于10000g离心10min，上清0.22um滤膜过滤保存，即为单抗溶液。
经过上次纯化从而获得了纯度＞95％的抗体。
2.4 12H23单克降抗体亚型鉴定
rEGFRvIIIex以包被缓冲液(NaHCO3 pH 9.6)稀释为1.0mg/L，加入ELISA微孔板中，每孔50μL。4℃包被24小时；加入含5％脱脂奶粉PBS350μL封闭过夜；PBS洗2次；加入初始浓度为1mg/L的12H23单抗50μL，37℃结合1小时；PBS洗3次，分别加入羊抗鼠亚型多抗(1∶1000稀释)100μL，37℃结合1小时；PBS洗3次；加HRP标记的驴抗羊多抗，37℃结合1/2小时，PBS洗5次；加ABTS底物显色15分钟，酶标仪测定405nm吸光度值。
结果如图6所示，表明该抗体12H23的亚型为IgG1型。
实施例3单克隆抗体的结合能力检测
3.1 12H23的受体结合特异性FACS分析
载体构建：
细胞：U87细胞(脑胶质瘤细胞系，正常表达EGFR，可购自ATCC细胞库)、U87-EGFRvIII细胞(转染了pLERNL载体的U87细胞系)和A431细胞(人表皮鳞状细胞癌，过量表达EGFR，可购自ATCC细胞库)
抗体：实施例2中准备的抗体12H23，以及市售的C225单克隆抗体(作为对照)。抗体浓度均为2mg/ml，按1∶100稀释。
1)取对数生长期的细胞接种到6孔板内，接种细胞密度约为90％，37℃孵箱过夜培养。
2)次日，使用10mM的EDTA消化细胞，5000rpm×3min，离心收集细胞于2ml Eppendorf管中。
3)0.5～1ml PBS重悬细胞，4％多聚甲醛固定细胞，37℃孵育10min。
4)将细胞置于冰上，冷却1min。
5)5000rpm×3min，离心，弃上清。
6)将细胞重悬于预冰冷的90％甲醇中，冰上放置30min。
7)5000rpm×3min，离心，弃上清。
8)加入0.5％BSA(PBS配制)重悬细胞，5000rpm×3min离心，洗三次。
9)分装细胞于各EP管中，0.5～1×106细胞/管(每个细胞共分为8管，其中一管为空白细胞，其余2管只加二抗)
10)每管加入0.5％BSA(PBS配制)，室温封闭10min。
11)离5000rpm×3min心，弃去封闭液。
12)加100μl相应的一抗于各细胞中，室温孵育30～60min。
13)离心，弃掉一抗孵育液。
14)加入0.5％BSA(PBS配制)重悬细胞，5000rpm×3min离心，洗三次。
15)加100μl FITC标记的羊抗鼠二抗(12H23)或驴抗人二抗(C225)于各细胞中，室温孵育30min。
16)离心，弃掉二抗孵育液。
17)加入0.5％BSA(PBS配制)重悬细胞，5000rpm×3min离心，洗三次。
18)最后用0.5～1ml PBS重悬细胞，转移至流式专用试管中。
19)流式细胞仪检测分析。
结果：如图7A-7F所示，抗体12H23可以与EGFRvIII高表达的细胞系高效结合，与过量表达EGFR的A431细胞也有部分结合，但与仅正常表达EGFR的细胞系U87几乎没有结合。与之相反，而商品化抗体C225(Erbitux)不仅能与EGFRvIII高表达的细胞系结合，与正常表达EGFR的细胞系U87也能结合。
这表明，本发明抗体12H23具有更好的特异性。
3.2非竞争法测定12H23亲和力
rEGFRvIIIex以包被缓冲液(NaHCO3 pH 9.6)稀释为5.0mg/L、2.5mg/L、1.25mg/L和0.625mg/L，依次加入ELISA微孔板中，每孔100μL。4℃包被24小时。弃包被液，PBS洗一次，加入含5％脱脂奶粉PBS 350μL封闭过夜；PBS洗2次。往包好不同浓度抗原的微孔板，加入初始浓度为1mg/L的12H23单抗，倍比稀释(含5％脱脂奶粉PBS为稀释液)到12个梯度。37℃结合1小时，PBS洗3次，加HRP标记的羊抗鼠二抗100μL，37℃结合1小时，PBS洗5次，加ABTS底物显色15分钟，酶标仪测定405nm吸光度值。根据吸光度值结果绘制结合反应曲线，通过作图法取其最大OD值一半(即OD50％)的抗体浓度。
结果：如图8所示。12H23在5.0mg/L包被曲线OD50％抗体浓度3μg/L(2×10-11mol/L)；在2.5mg/L包被曲线OD50％抗体浓度2.5μg/L(1.7×1011mol/L)；在1.25mg/L包被曲线OD50％抗体浓度2.3μg/L(1.5×10-11mol/L)；在0.625mg/L包被曲线OD50％抗体浓度2μg/L(1.5×10-11mol/L)。代入公式K＝(n-1)/2(nAb′-Ab)计算亲和常数，式中Ab′和Ab分别表示当抗原浓度为Ag′和Ag时，产生OD50％抗体浓度(mol/L)，n＝Ag/Ag′。然后两两比较，得出6个K值，计算6个K值的均数为最终结果。经计算得出12H23的亲和常数为3.8×1010L/mol，解离常数Kd值为2.6×10-11mol/L。
实施例4：单克隆抗体的结合表位分析
4.1重组蛋白制备：
用常规方法，分别构建EGFR胞外区的S1结构域，S2结构域以及S1结构域其中的VK21多肽与M13噬菌体的pIII蛋白的N12蛋白结构域融合表达(按照方法同1.1进行)，同时以EGFRvIII胞外区重组蛋白作为阳性对照(图9)。
电泳结果表明，制得了各重组蛋白rN12-S1，rN12-S2，EGFRvIIIex，rN12-VK21(图10)。
4.2 ELISA法测定12H23结合表位
重组蛋白rN12-S1，rN12-S2，EGFRvIIIex，rN12-VK21分别用包被缓冲液(NaHCO3 pH 9.6)稀释为1.0mg/L，依次加入ELISA微孔板中，每孔100μL，4℃包被24小时，弃去包被液，PBS洗一次，加入含5％脱脂奶粉PBS350μL封闭过夜，PBS洗2次；分别加入初始浓度为1mg/L的12H23单抗，37℃结合1小时，PBS洗3次，加HRP标记的羊抗鼠二抗100μL，37℃结合1小时，PBS洗5次，加ABTS底物显色15分钟，酶标仪测定405nm吸光度值。
结果：ELISA结果如图11所示。抗体12H23能够与EGFRvIII，rN12-S1及rN12-VK21结合。根据结构及序列推断，12H23结合的区域应为这些蛋白的共有区域即VK21。VK21的多肽序列为VRACGADSYEMEEDGVRKCKK(SEQ ID NO：11)。
实施例5：单克隆抗体的体内抑制肿瘤生长能力
1)将3×106个常规的Huh7 EGFRvIII肿瘤细胞(转染了pLRNL的HuH-7肝癌细胞系，Huh-7可购自美国ATCC细胞库)分别注射在18只Balb/c裸鼠右侧肩胛皮下。
2)数天后，当皮下成瘤体积约80～100mm3时，腹腔分别注射C225抗体和12H23抗体，每只裸鼠注射抗体剂量为0.5mg，同时注射PBS作为阴性对照，每组6只裸鼠。
3)之后每隔一天腹腔注射抗体一次，共持续2周。
4)注射抗体的同时，测量肿瘤体积的大小，每隔一天测量一次，抗体注射停止后继续测量肿瘤体积2周。肿瘤体积的大小按以下公式来计算：肿瘤体积＝瘤长×瘤宽2/2
5)观察肿瘤的生长情况。
结果：12H23对Huh-EGFRvIII的裸小鼠种植瘤有明显的抑制作用(达约70％，而且，其抑制率也比C225抗体强(图12)。
实施例6单克隆抗体的序列确定
用5’RACE法克隆5’序列未知的基因，其步骤简单如下(具体操作按Takara 5’-full RACE Kit说明书)：
1)用碱性磷酸酶(CIAP)对总RNA中暴露的5’磷酸基团进行去磷酸反应。总RNA用量为2μg，反应后酚氯仿抽提回收。
2)用Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)去掉mRNA的5’帽子结构，保留一个磷酸基团。
3)用T4 RNA连接酶把5’RACE Adaptor连接到mRNA上，反应后酚氯仿抽提回收。
4)用逆转录酶进行逆转录反应，所用引物为Kit提供的随机9聚体引物。
5)以逆转录产物为模板，用高保真酶扩增目的基因。所用引物为：
5’：5’RACE Outer Primer(CATGGCTACATGCTGACAGCCTA)(SEQ ID NO：12)
3’：重链：CCAGAGTTCCAGGTCACTGTCACT(SEQ ID NO：13)
轻链：ACACGACTGAGGCACCTCCA(SEQ ID NO：14)
6)以上述PCR产物为模板，进行巢式PCR。所用引物为：
5’： 5’RACE Inner Primer(CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG)(SEQ ID NO：15)
3’：重链：CCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTT(SEQ ID NO：16)
轻链：TGGATGGTGGGAAGATGGATACA(SEQ ID NO：17)
7)TA克隆，测序。
测序结果
12H23单抗重链、轻链以及各CDR的序列如图13-14以及下表所示。
表112H23单抗重链、轻链以及各CDR的序列
| 名称 | SEQ ID NO | 备注 |
| 重链(VH)编码序列 | 1 | ORF位于第54-512位 |
| 重链(VH)氨基酸序列 | 2 | |
| CDR1 | 5 |
| CDR2 | 6 | |
| CDR3 | 7 | |
| 轻链(VL)编码序列 | 3 | ORF位于第35-451位 |
| 轻链(VL)氨基酸序列 | 4 | |
| CDR1 | 8 | |
| CDR2 | 9 | |
| CDR3 | 10 |
实施例7
1.含抗体可变区编码序列的人鼠嵌合抗体表达载体的克隆
构建抗体重链表达载体pH，分别包含hCMV启动子，重链可变区克隆位点NheI和ApaI和人IgG1的重链稳定区，IRES核糖体插入位点，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)以及氨苄抗性基因(见图15A)。
构建抗体轻链表达载体pK，分别包含hCMV启动子，轻链可变区克隆位点EcoRV和BsiWI和人IgG1的轻链稳定区，IRES核糖体插入位点，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)以及氨苄抗性基因(见图15B)。
基于实施例6测定的轻链和重链序列，人工合成重链和轻链可变区编码序列，并且在重链编码序列两端添加NheI和ApaI酶切位点，在轻链编码序列的两端添加EcoRV和BsiWI酶切位点。用NheI和ApaI酶切重链可变区编码序列，用EcoRV和BsiWI酶切轻链可变区编码序列。
然后将上述重链和轻链可变区编码序列插入到表达载体pH和pK中构建嵌合抗EGFRvIII的抗体基因的表达载体。
2.CHO细胞的转染与重组克隆的筛选
上述构建的带有抗体基因的表达载体转入在大肠杆菌DH5α菌株，然后接种于100毫升LB培养基中进行扩增，用Qiagen公司的超纯质粒DNA纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提纯化质粒DNA。将上述纯化的质粒DNA采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒转染CHO细胞，操作参照厂家的说明书进行。
转化的CHO细胞在浓度逐步提高的MTX选择培养基上进行连续9周的培养，最后在96孔板上进行梯度稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。
挑出的单克隆细胞系在RPM1640培养基上进行培养，对上清进行ELISA实验，根据显色反应判断表达结合强度，经测定这些克隆也具有与rEGFRvIII抗原特异结合活性(见图16)，挑选出多个表达强的克隆作为候选细胞株，从而制备嵌合抗体，所获得抗体命名为CH12。
实施例8
偶联物的制备
将嵌合单抗CH12直接与白喉毒素(购自武汉生物制品研究所)以共价键结合。一旦向Huh7-EGFRvIII的细胞中加入结合物，便观察到特异的细胞毒性。不表达EGFRvIII的Huh7细胞仅在当暴露于非常高浓度的抗体时才被杀伤。
实施例9
注射液的制备
取实施例5制备的抗体12H23或实施例7制备嵌合单抗CH12，加入注射用生理盐水，混匀后用0.22uM的无菌过滤器除菌，将注射液分装在小瓶中(50ml/瓶)，包装好备用，其中每50ml注射溶液含单抗50mg。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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序列表
<110>上海市肿瘤研究所
<120>特异性结合蛋白及其使用
<130>083000
<160>17
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>512
<212>DNA
<213>鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(54)..(512)
<400>1
tatcgctctc actggaggct gatctctgaa gataaggagg tgtagcctaa aag atg 56
Met
1
aga gtg ctg att ctt ttg tgg ctg ttc aca gcc ttt cct ggt ttc ctg 104
Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Phe Leu
5 10 15
tct gat gtg cag ctt cag gag tcg gga cct ggc ctg gtg aag cct tct 152
Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
20 25 30
cag tct ctg tcc ctc acc tgc act gtc act gcc tac tca gtc acc agt 200
Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Ala Tyr Ser Val Thr Ser
35 40 45
gat tat gcc tgg aac tgg atc cgg cag ttt cca gga aac aaa ctg gag 248
Asp Tyr Ala Trp Ash Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu
50 55 60 65
tgg atg ggc tac ata agc tac agt ggt acc act aga tac aac cca tct 296
Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Pro Ser
70 75 80
ctc aaa agt cga atc tct atc act cga gac aca tcc aag aac cag ttc 344
Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
85 90 95
ttc ctg cag ttg aat tct atg act gct gag gac aca gcc aca tat tat 392
Phe Leu Gln Leu Asn Ser Met Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
100 105 110
tgt tca aga cag gga cgg ggg ttt cct tac tgg ggc caa ggg act ctg 440
Cys Ser Arg Gln Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
115 120 125
gtc act gtc tct gca gcc aaa acg aca ccc cca tct gtc tat cca ctg 488
Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
130 135 140 145
gcc cct gga tct gct gcc caa act 512
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr
150
<210>2
<211>153
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>2
Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Phe
1 5 10 15
Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
20 25 30
Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Ala Tyr Ser Val Thr
35 40 45
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Met Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ser Arg Gln Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr
145 150
<210>3
<211>451
<212>DNA
<213>鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(35)..(451)
<400>3
attgtcttta caatcaggac tcagcatgga catg atg gtc ctt gct cag ttt ctt 55
Met Val Leu Ala Gln Phe Leu
1 5
gca ttc ttg ttg ctt tgg ttt cca ggt gca aga tgt gac atc ctg atg 103
Ala Phe Leu Leu Leu Trp Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Leu Met
10 15 20
acc caa tct cca tcc tcc atg tct gta tct ctg gga gac aca gtc agc 151
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly Asp Thr Va1 Ser
25 30 35
atc act tgc cat gca agt cag gac att aac agt aat ata ggg tgg ttg 199
Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Asn Ile Gly Trp Leu
40 45 50 55
caa cag aaa cca ggg aaa tca ttt aag ggc ctg atc tat cat gga acc 247
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile Tyr His Gly Thr
60 65 70
aac ttg gaa gat gga gtt cca tca agg ttc agt ggc agt gga tct gga 295
Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
75 80 85
gca gat tat tct ctc acc atc agc agc ctg gaa tct gaa gat ttt gca 343
Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala
90 95 100
gac tat tac tgt gtg cag tat gct cag ttt ccg tgg acg ttc ggt gga 391
Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly
105 110 115
ggc acc aaa ctg gaa atc aaa cgg gct gat gct gca cca act gta tcc 439
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
120 125 130 135
atc ttc cca cca 451
Ile Phe Pro Pro
<210>4
<211>139
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>4
Met Val Leu Ala Gln Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Trp Phe Pro Gly
1 5 10 15
Ala Arg Cys Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asp Ile
35 40 45
Asn Ser Asn Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys
50 55 60
Gly Leu Ile Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln
100 105 110
Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
115 120 125
Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
130 135
<210>5
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>重链CDR1
<400>5
Ala Tyr Ser Val Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5 10
<210>6
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>重链CDR2
<400>6
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>7
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>重链CDR3
<400>7
Gln Gly Arg Gly Phe Pro Tyr
1 5
<210>8
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>轻链CDR1
<400>8
His Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Asn Ile Gly
1 5 10
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>轻链CDR2
<400>9
His Gly Thr Asn Leu Glu Asp
1 5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>轻链CDR3
<400>10
Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Trp Thr
1 5
<210>11
<211>21
<212>PRT
<213>智人(Homo sapicns)
<400>11
Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val
1 5 10 15
Arg Lys Cys Lys Lys
20
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>引物
<400>12
catggctaca tgctgacagc cta 23
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>13
ccagagttcc aggtcactgt cact 24
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>14
acacgactga ggcacctcca 20
<210>15
<211>34
<212>DNA
<213>引物
<400>15
cgcggatcca cagcctactg atgatcagtc gatg 34
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>16
ccagggtcac catggagtta gttt 24
<210>17
<211>23
<212>DNA
<213>引物
<400>17
tggatggtgg gaagatggat aca 23
Claims (6)
1.一种单克隆抗体，其特征在于，其VH链的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，且其VL链的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的抗体是鼠源抗体。
3.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，编码权利要求1所述的单克隆抗体中VH链的DNA序列如SEQ ID NO：1所示；编码权利要求1所述的单克隆抗体中VL链的DNA序列如SEQ ID NO：3所示。
5.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。
6.一种权利要求1所述的单克隆抗体的用途，其特征在于，用于制备组合物，所述的组合物用于：(a)抑制或杀灭表达表皮生长因子受体突变体III的细胞的生长；或(b)抑制过量表达表皮生长因子受体的细胞生长。
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