DE112014006656B4 - Nukleinsäure zur Kodierung eines chimären Antigen-Rezeptor-Proteins und T-Lymphozyt zur Expression eines chimären Antigen-Rezeptor-Proteins - Google Patents

Nukleinsäure zur Kodierung eines chimären Antigen-Rezeptor-Proteins und T-Lymphozyt zur Expression eines chimären Antigen-Rezeptor-Proteins Download PDF

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Abstract

Nukleinsäure kodierend ein auf der Oberfläche eines humanen T-Lymphozyten exprimiertes, chimäres Antigen-Rezeptor-Protein, wobei das chimäre Antigen-Rezeptor-Proteineine extrazelluläre Bindedomäne, eine Transmembrandomäne und eine intrazelluläre Signaldomäne enthält, die sequentiell verbunden sind, unddie extrazelluläre Bindedomäne einen scFv Einzelketten-Antikörper zur spezifischen Erkennung des Epitops der 287ten bis 302ten Aminosäure von humanem epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) enthält.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Tumorbehandlung durch Zelltherapie, und insbesondere auf die Behandlung von Tumoren epithelialen Ursprungs, die eine Expression von EGFRvIII oder hohe Expression von EGFR zeigen, über eine transgene Therapie mit T-Lymphozyten.
  • Hintergrund
  • Der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) ist ein transmembranes Glykoprotein dessen Molekulargewicht 170 kDa beträgt. Es ist ein Expressionsprodukt des Onkogens C-erb-1 (HER-1) und auf Zellmembranen von humanem Gewebe weit verbreitet [Alan Wells. Molecules in focus EGF receptor. Int J Biochem Cell Biol, 1999, 31: 637-643]. Es wird in den meisten Tumoren überexprimiert und (oder) ist dort mutiert (zum Beispiel nicht-kleinzelliges Lugenkarzinom, Blasenkrebs, Eierstockkrebs, Brustkrebs, Plattenepithelzellkarzinom des Kopf-Hals-Bereichs, Glioblastom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Speiseröhrenkrebs, Magenkrebs, Prostatakrebs, etc.) und ist eng mit dem Auftreten und der Entwicklung von Tumor, bösartiger Transformation, Metastase und Prognose verbunden [Jose B Why the epidermal growth factor receptor? The rational for cancer therapy [J] oncologist, 2002, 7 (4) : 2-8]. Folglich ist EGFR ein wichtiges Ziel der Tumorbehandlung. Ferner haben Studien gezeigt, dass das EGFR 287-302 Epitop nur in Tumoren exponiert wird, die EGFRvIII exprimieren oder EGFR überexprimieren, während es in normalen Geweben verborgen ist [Gan HK, et. al. Targeting of a conformationally exposed, tumor-specific epitope of EGFR as a strategy for cancer therapy. Cancer Res, 2012, 72 (12): 2924-2930]. Es wird behauptet, dass das EGFR 287-302-Epitop eine ideale Stelle ist, die EGFR-relevante Tumortherapie anzuvisieren.
  • Antikörper gegen das EGFR 287-302-Epitop, die gute Tumor-spezifische Tötungswirkungen zeigen, sind entwickelt worden. Die Antikörpertherapie ist jedoch limitiert durch die Halbwertszeit von Antikörper in der Blutzirkulation in vivo. Im Allgemeinen ist die Halbwertszeit nicht mehr als 23 Tage. Folglich ist bei der Antikörpertherapie von Tumor eine dauerhafte Verabreichung und/oder eine Erhöhung der Dosierung notwendig, was ein Anwachsen der Kosten für die Patienten entstehen lässt und in einigen Fällen sogar in dem Abbruch der Behandlung resultiert. Darüberhinaus birgt der therapeutische Antikörper als ein heterologes Protein das Risiko, allergische Reaktionen und neutralisierende Antikörper gegen die therapeutischen Antikörper in vivo zu produzieren.
  • Immer mehr Beachtung wird T-Lymphozyten in der Tumorimmunantwort geschenkt. Bestimmte Wirkungen werden durch T-Lymphozyt-basierte adaptive Immuntherapie in einigen Tumoren erzielt und eine solche Immuntherapie kann die oben genannten Nachteile der Antikörperbehandlung überwinden. In den meisten Tumoren ist die Wirksamkeit jedoch immer noch unbefriedigend [Grupp SA, et al. Adoptive cellular therapy. Curr Top Microbiol Immunol. 2011, 344: 149-72]. In den letzten Jahren wurde gemäß der Entdeckung, dass die Spezifität von zytotoxischen T-Lymphozyten, Zielzellen zu erkennen, von dem T-Zellrezeptor (TCR) abhängt, scFv des Antikörpers gegen das Tumorzellassoziierte Antigen mit intrazellulären Signalaktivierungsmotiven des T-Zellrezeptors, wie z.B. CD3ζ oder FcεRIy, fusioniert, um einen chimären Antigenrezeptor (CAR) zu bilden, der auf der Oberfläche der T-Zelloberfläche über bestimmte Mittel, wie zum Beispiel lentivirale Infektion, genetisch verändert ist. Solche CAR T-Zellen sind fähig, T-Lymphozyten selektiv zu Tumorzellen umzuleiten und Tumorzellen in einer Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) und nicht-limitierenden Art und Weise zu töten. CAR T-Zelle ist eine neue immunotherapeutische Strategie auf dem Gebiet der Tumor-Immuntherapie [Schmitz M, et. al. Chimeric antigen receptor-engineered T cells for ilmmunotherapy of Cancer. J Biomed Biotechnol, 2010, doi:10.1155/2010/956304.]
  • Chimärer Antigen-Rezeptor enthält eine extrazelluläre Bindedomäne, eine Transmembrandomäne und eine intrazelluläre Signaldomäne. Im Allgemeinen enthält die extrazelluläre Domäne scFv, das fähig ist, Tumor-assoziiertes Antigen zu erkennen, wobei die Transmembrandomäne die von Molekülen wie beispielsweise CD8, CD28 ist, und das Immunorezeptor-Tyrosin-basierte Aktivierungsmotif (ITAM), wie beispielsweise CD3 ζ (d.h., CD3 zeta, abgekürzt als Z) oder FcsRly und die intrazelluläre Signaldomäne von einem costimulierenden Signalmolekül, wie beispielsweise CD28, CD137, CD134, in der intrazellulären Signaldomäne Verwendung finden.
  • Die erste Generation von CAR T-Zellen enthält nur ITAM in der intrazellulären Signaldomäne, wobei jeder Teil des chimären Antigen-Rezeptors wie folgt verbunden ist: scFv-TM-CD3 ζ. Diese Art von CAR T-Zellen kann zytotoxische anti-Tumor Wirkungen stimulieren, aber die Sekretion von Cytokin ist relativ niedrig und lang anhaltende anti-Tumor Wirkungen können im Körper nicht stimuliert werden [Zhang T. et. al. Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines und cytotoxic pathways, Cancer Res 2007, 67(22): 11029-11036].
  • In der zweiten Generation von CAR T-Zellen, die später entwickelt wurden, wurde die intrazelluläre Signaldomäne von CD28 oder CD137 (auch bekannt als 4-1BB) hinzugefügt, wobei jeder Teil des chimären Antigen-Rezeptors wie folgt verbunden ist: scFv-TM-CD28-ITAM oder scFv-TM-/CD137-ITAM. Costimulierende Wirkungen von B7/CD28 oder 4-1BBL/CD137, die in der intrazellulären Signaldomäne auftraten, führten zu der anhaltenden Proliferation von T-Zellen und verbesserten den Pegel von Cytokinen, wie das von T-Zellen sekretierte IL-2 und IFN-γ, bei einer Verbesserung des Überlebens und der anti-Tumor Wirkungen von CAR T in vivo [Dotti G. et.al. CD28 costimulation improves expansion und persistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients. J Clin Invest, 2011, 121(5):1822-1826.].
  • In den vergangenen Jahren wurde die dritte Generation von CAR T-Zellen entwickelt, wobei jeder Teil des chimären Antigen-Rezeptors wie folgt verbunden ist: scFv-TM-CD28-CD137-ITAM oder scFv-TM-CD28-CD134-ITAM, wodurch sich das Überleben und die anti-Tumor Wirkungen von CAR T in vivo weiter verbesserten [Carpenito C., et al. Control of large established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 und CD137 domains. PNAS, 2009, 106(9): 3360-3365].
  • Obwohl T-Zellen eine attraktive Perspektive in der Tumorimmuntherapie haben sind jedoch auch einige potentielle Risiken zu berücksichtigen. Beispielsweise, da einige normale Gewebe spezifische Antigene in einem kleinen Pegel exprimieren können, der durch CAR erkannt werden kann, können CAR T-Zellen die normalen Gewebe, die das korrespondierende Antigen exprimieren, schädigen. Der erste Fall klinisch angewandter adaptiver Therapie mit CAR T-Zellen bezog sich auf das Antigen Carbonische Anhydrase IX (CAIX), das auf Tumorzellen von Patienten mit Nierenzellkarzinom exprimiert wurde, was auch der erste berichtete Fall von Off-Target-Wirkungen CAR-enthaltender Zellen ist. Nach einer mehrmaligen Infusion mit CAR T-Zellen kommt es in Patienten zu 2-4-gradiger Hepatotoxizität. Der Grund ist, dass Epithelzellen des Gallengangs CAIX in niedrigen Pegeln exprimieren. Und ein originäre klinische Studie wurde unterbrochen während jede Evaluierung der Wirksamkeit auf Patienten ausgeschlossen wurde [Stoter G. et al. Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX: first clinical experience. J clin oncol, 2006, 24(13): e20-e22.; Ngo MC., et al. Ex vivo gene transfer for improved adoptive immunotherapy of cancer. Human Molecular Genetics, 2011, R1-R7]. Zudem werden exzessive costimulierende Signale in CAR den Grenzwert zur Aktivierung von Effektorzellen reduzieren, sodas die genmodifizierte T-Zelle mit einem niedrigen Pegel an Antigen oder ohne Antigen-auslösende Bedingungen auch aktiviert werden können, wobei dadurch eine Freisetzung einer großen Anzahl an Zytokinen bewirkt wird und zu dem sog. „Zytokin-Sturm“ führt. Ein solcher Signalausbruch wird in einer Off-Target Zytotoxizität resultieren, wodurch unspezifischer Schaden an Geweben entsteht. Beispielsweise bewirkte der sogenannte „Zytokin-Sturm“, der durch die niedrige Expression von Her2 in normalem Lungengewebe ausgelöst wurde, in dem klinischen Verfahren der Behandlung eines Patienten mit fortgeschrittenem Dickdarmkrebs mit Leber- und Lungenmetastasen durch Verwendung der dritten Generation von CARanvisierenden Her-2 den plötzlichen Tod des Patienten [Morgan RA., et al. Report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing Erbb2. Molecular Therapy, 2010, 18 (4): 843-851].
  • Folglich gibt e seine starke Nachfrage im Stand der Technik der CAR-T-Lymphozyten verwendenden Tumortherapie die oben genannten Nachteile zu überwinden.
  • Zusammenfassung
  • In dem ersten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Nukleinsäure, die ein chimäres Antigen-Rezeptor-Protein kodiert, das auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert wird. Das chimäre Antigen-Rezeptor-Protein enthält eine sequenziell verbundene, extrazelluläre Bindedomäne, eine Transmembrandomäne und eine intrazelluläre Signaldomäne, wobei die extrazelluläre Bindedomäne einen Einzelketten-Antikörper scFv zur spezifischen Erkennung des Epitops der 287ten bis 302ten Aminosäure (EGFR287-302) von humanem epithelialen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR). Die extrazelluläre Bindedomäne des chimären Antigen-Rezeptor-Proteins ist mit der Transmembrandomäne von CD8 oder CD28 über eine CD8-Gelenkregion verbunden, und die intrazelluläre Signaldomäne ist unmittelbar nach der Transmembrandomäne verbunden. Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können in der Form einer DNS oder RNS vorliegen. Die DNS-Form umfasst cDNS, genomische DNS, oder synthetische DNS. DNS kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. DNS kann ein kodierender oder nicht-codierender Strang sein. Die Nukleinsäurecodons der vorliegenden Erfindung, welche die Aminosäuresequenz eines chimären Antigen-Rezeptor-Proteins kodieren, können degeneriert sein, das bedeutet, dass verschiedene degenerierte Nukleinsäuresequenzen, welche die selbe Aminosäuresequenz kodieren, von dem Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst sind. Degenerierte Nukleinsäurecodons, welche korrespondierende Aminosäuren kodieren, sind im Stand der Technik bekannt. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Varianten der oben genannten Polynukleotide, die Polypeptide mit derselben Aminosäuresequenz wie die vorliegende Erfindung oder Fragmente, Analoge oder Derivate von den Polypeptiden, kodieren. Solche Varianten der Polynukleotide können in der Natur vorkommende allelische Varianten oder nicht in der Natur vorkommende Varianten sein. Solche Nukleotidvarianten umfassen Substitutionsvarianten, Deletionsvarianten, und Insertionsvarianten. Wie im Stand der Technik bekannt ist eine allelische Variante eine alternative Form eines Polynukleotids, welche eine Substitution, Deletion oder Insertion einer oder mehrerer Nukleotide sein kann während sich die Funktion des kodierten Polypeptids nicht wesentlich verändern wird.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Polynukleotide, die an die oben beschriebenen Sequenzen hybridisieren und zumindest 50%, bevorzugt zumindest 70%, stärker bevorzugt zumindest 80%, am bevorzugtesten zumindest 90%, oder zumindest 95%, Identität zwischen den Sequenzen. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Polynukleotide, die mit den Polynukleotiden der Erfindung unter stringenten Bedingungen hybridisieren. In der vorliegenden Erfindung bedeutet „stringente Bedingungen“: (1) Hybridisierung und Elution bei niedrigerer lonenstärke und höherer Temperatur, wie beispielsweise 0,2 x SSC, 0,2% SDS, 60°C; oder (2) Zugabe eines Denaturierungsmittels bei der Hybridisierung, wie beispielsweise 50% (v/v) Formamid, 0,1% fetales Kalbserum / 0,1% Ficoll, 42 °C; oder (3) die Hybridisierung erfolgt nur unter der Bedingung, dass zumindest eine 90%ige oder höhere, bevorzugt eine zumindest 95%ige oder höhere, Identität zwischen zwei Sequenzen vorliegt. Und das hybridisierbare Polynukleotid kodiert ein Polypeptid, das die gleiche biologische Funktion und Aktivität wie das reife Polypeptid der SEQ ID NO: 2 hat.
  • Monoklonale Antikörper, die spezifisch das Aminosäureepitop bei der Position 287 bis 302 des humanen epithelialen Wachstumsfaktorrezeptor EGFR erkennen wurden in CN 102405235 und CN 101602808B offenbart, und andere monoklonale Antikörper, die spezifisch das Epitop erkennen und bekannt sind oder werden können auch verwendet werden, um einen Einzelketten-Antikörper in einem von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodierten chimärem Antigen-Rezeptor-Protein zu erzeugen. Einzelketten-Antikörper kann durch gentechnische Verfahren oder chemische Syntheseverfahren nach Verfahrenschritten erzeugt werden, wie sie in den oben erwähnten Dokumenten offenbart werden. Der hier benutzte Begriff „Einzelketten-Antikörper-(scFv)-Fragment“ bezieht sich auf ein Antikörperfragment, das ein rekombinantes Protein ist und eine variable Region der schweren Kette (VH) enthält, die mit einer variablen Region der leichten Kette (VL) über einen Linker verbunden ist, und der Linker die beiden Domänen dergestalt assoziiert, dass sie eine Antigen-Bindestelle bilden. Im Allgemeinen hat scFv 1/6 der Größe eines vollständigen Antikörpers. Ein Einzelketten-Antikörper ist bevorzugt eine Aminosäurekettensequenz, die durch eine Nukleotidkette kodiert ist. Einzelketten-Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können weiter über im Stand der Technik bekannte Routinetechniken modifiziert werden, wie beispielsweise Deletion, Insertion, Substitution, Addition von Aminosäuren und/oder andere Modifizierungsverfahren, und solche Techniken können allein oder in Kombination verwendet werden. Verfahren zur Einführung solcher Modifikationen in die DNS-Sequenzen gemäß der Aminosäuresequenz eines Antikörpers sind dem Fachmann bekannt (siehe zum Beispiel Sambrook, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.). Die Modifikation wird bevorzugt auf der Nukleinsäureebene ausgeführt. Der oben genannte Einzelketten-Antikörper kann ferner davon enthalten. Verfahren zur Herstellung der Einzelketten-Antikörper-Derivate umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf, ein Verfahren zur Herstellung von chimärem Antikörper wie in der WO 89/39622 beschrieben, ein Verfahren zur Herstellung von humanisiertem Antikörper wie in der EP-A10239400 und WO 90/37861 beschrieben, ein Verfahren zur Herstellung von heterogenem Antikörper, wie beispielsweise humanem Antikörper in einer Maus, wie in der WO 91/10741 , WO 94/32602 und WO 96/33735 beschrieben. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff „spezifische Erkennung“ bedeutet, dass der erfindungsgemäße bispezifische Antikörper nicht oder im Wesentlichen nicht mit einem Polypeptid kreuzreagiert, das anders ist als das Zielantigen. Der Grad an Spezifität kann über immunologische Techniken, umfassend, aber nicht beschränkt auf, Immunoblotting, Immunoaffinitätschromatographie, Flusszytometrie, und ähnliches, ermittelt werden. In der vorliegenden Erfindung wird die spezifische Erkennung bevorzugt über Flusszytometrie ermittelt, und insbesondere können die Kriterien für die spezifische Erkennung durch einen Fachmann im Lichte seines Fachwissens ermittelt werden.
  • Die Transmembrandomäne kann ausgewählt sein aus der Transmembrandomäne eines Proteins wie beispielsweise CD8 oder CD28. CD8 oder CD28 ist ein natürlicher Marker auf der Oberfläche von T-Zellen. Humanes CD8-Protein ist ein Heterodimer bestehend aus αβ- oder γδ-Ketten. In einer Ausgestaltungsform der vorliegenden Erfindung ist die Transmembrandomäne ausgewählt aus der Transmembrandomäne von CD8a oder CD28. Außerdem ist die CD8-Gelenkregion eine flexible Region, sodass die Transmembrandomäne und Gelenkregion von CD8 oder CD28 verwendet werden kann, um die Zielerkennungsdomäne scFv und intrazelluläre Signaldomäne des chimären Antigen-Rezeptors CAR zu verbinden.
  • Die intrazelluläre Signaldomäne kann ausgewählt sein aus der intrazellulären Signaldomäne von CD3ζ, FcεRIy, CD28, CD137, CD134 Proteinen, und Kombinationen hiervon. Das CD3-Molekül besteht aus fünf Untereinheiten, in welchen die CD3ζ-Untereinheit (auch bekannt als CD3 zeta, abgekürzt als Z) drei ITAM-Motive enthält, welche eine wichtige Signaltransduktionsregion in dem TCR-CD3-Komplex ist. CD3ÖZ ist eine mutierte CD3ζ-Sequenz ohne ITAM-Motiv und wird im Allgemeinen verwendet, um eine Negativkontrolle im Rahmen der Umsetzung der vorliegenden Erfindung zu konstruieren. FcεRIy ist hauptsächlich auf der Oberfläche von den meisten Mastzellen und Basophilen verteilt, welches ein ITAM-Motiv enthält und in der Struktur, Verteilung und Funktion ähnlich zu CD3ζ ist. Außerdem sind CD28, CD137 und CD134 costimulierende Signalmoleküle und nach der Bindung an die jeweiligen Liganden bewirkt die costimulierende Wirkung der intrazellulären Signalregion dieser Moleküle eine kontinuierliche Proliferation von T-Zellen und erhöht den Pegel von IL-2 und IFN-y, die von T-Zellen sekretiert weden, während sich das Überleben und die anti-Tumor Wirkung von CAR T-Zellen in vivo verbessert.
  • Das chimäre Antigen-Rezeptor-Protein, das von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert wird, könnte eine sequenziell verbundene extrazelluläre Bindedomäne, eine Transmembrandomäne und eine intrazelluläre Signaldomäne enthalten, zum Beispiel ein chimäres Antigen-Rezeptor-Protein ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
    • scFv(EGFR)-CD8-CD3ζ,
    • scFv(EGFR)-CD8-CD137-CD3ζ,
    • scFv(EGFR)-CD28-CD28-CD3ζ,
    • scFv(EGFR)-CD28-CD28-CD137-CD3ζ,
    oder Kombinationen hiervon, wobei in dem chimären Antigen-Rezeptor-Protein das erste CD28 eine Transmembrandomäne darstellt und das zweite CD28 eine intrazelluläre Signaldomäne des Proteins darstellt.
  • In einer Ausgestaltungsform der vorliegenden Erfindung hat eine erfindungsgemäße Nukleinsäure eine Sequenz der SEQ ID NOs: 1-4. In einer anderen Ausgestaltungsform der vorliegenden Erfindung ist eine erfindungsgemäße Nukleinsäure eine Nukleinsäure, die ein chimäres Antigen-Rezeptor-Protein mit einer von SEQ ID NOs: 31-34 kodiert.
  • Der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst einen Vektor enthaltend die Nukleinsäure, die ein chimäres Antigen-Rezeptor-Protein kodiert, das auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert wird. In einer spezifischen Ausgestaltungsform ist der in der Erfindung verwendete Vektor ein lentiviraler Plasmidvektor pPWT-eGFP. Das Plasmid gehört zu der dritten Generation eines selbstinaktivierenden lentiviralen Vektorsystems. Das System besteht aus drei Plasmiden, das heißt ein Gag/Pol-Protein-kodierendes Verpackungsplasmid psPAX2, Rev Protein, VSV-G-Protein kodierendes Hüllenplasmid PMD2.G, und pPWT-eGFP-Leervektor, der dazu verwendet werden kann, eine im Interesse liegende Nukleinsäuresequenz, z.B. eine CAR-kodierende Nukleinsäuresequenz, über Rekombination einzuführen. In dem Leervektor pPTeGFP (der Vektor selbst ist eine Leerprobe in den nachfolgenden Experimenten) wurde die Expression von verbessertem grünem fluoreszierendem Protein (eGFP) durch einenElongationsfaktor-1α-Promotor (EF-1α) reguliert. Und in dem rekombinaten Expressionsvektor pWPT-eGFP, der eine Zielnukleinsäuresequenz kodierend für CAR enthält wird die Co-Expression von eGFP und CAR durch eine ribosomale Sprungsequenz 2A des (abgekürzt als F2A) des Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV) erreicht.
  • Der dritte Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst einen Virus enthaltend den oben beschriebenen Vektor. Der erfindungsgemäße Virus umfasst infektiöse Viren nach deren Verpackung und umfasst auch zu verpackende Viren, die Komponenten enthalten, die wichtig sind für die Verpackung von infektiösen Viren. Andere Viren, die T-Zellen transfizieren können und ihre korrespondierenden im Stand der Technik bekannten Plasmidvektoren können in der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden.
  • In einer Ausgestaltungsform der Erfindung ist der Virus ein Lentivirus enthaltend den oben beschreibenen rekombinanten Vektor pWPT-eGFP-F2A-CAR (d.h. enthaltend scFv (EGFR)-CAR).
  • Der vierte Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst eine transgene T-Lymphozyte, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder mit dem oben genannten rekombinanten Plasmid enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einem viralen System enthaltend das Plasmid transduziert ist. Konventionelle Nukleinsäure-Transduktionsverfahren im Stand der Technik, einschließlich nicht-virale und virale Transduktionsverfahren, können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Nicht-virale Transduktionsverfahren umfassen Elektroporation und Transposon-Verfahren. Kürzlich kann das von Amaxa entwickelte „Nukleofector“-Nukleartransfektionsinstrument fremde Gene direkt in den Nukleus einbringen, um eine hocheffiziente Transduktion von Zielgenen zu erreichen. Außerdem war die Transduktionseffizienz des Transposonsystems basierend auf dem „Sleeping Beauty“-System oder dem „PiggyBac“-Transposon verglichen mit konventioneller Elektroporation signifikant verbessert. Die Kombination des „Nukleofector“-Nukleartransfektionsinstruments und des „SB Sleeping Beauty“-Transposonsystems ist berichtet worden [Davies JK., et al. Combining CD19 redirection und alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res, 2010, 70(10): OF1-10.], und durch dieses Verfahren eine hohe Transduktionseffizienz und ortsspezifische Integration von Zielgenen erreicht werden kann. In einer Ausgestaltungsform der Erfindung ist das Transduktionsverfahren von einem T-Lymphozyt, der mit einem chimären Antigen-Rezeptor-Gen modifiziert ist, ein Transduktionsverfahren, das auf einem Virus, wie beispielsweise einem Retrovirus oder einem Lentivirus, basiert. Das Verfahren hat die Vorteile einer hohen Transduktionseffizienz und einer stabilen Expression des exogenen Gens, und die Zeit für die T-Lymphozyten-Kultivierung in vivo bis zur klinischen Ebene kann abgekürzt werden. Die transduzierte Nukleinsäure ist auf der Oberfläche der transgenen T-Lymphozyten über Transkription, Translation exprimiert. Ein In-vitro-Zytotoxizitätsassay, der mit verschiedenen kultivierten Tumorzellen durchgeführt wurde, zeigte, dass die erfindungsgemäßen transgenen T-Lymphozyten, die chimäre Antigen-Rezeptoren auf der Oberfläche exprimieren, hochspezifische Tumor-abtötende Wirkungen haben (auch bekannt als Zytotoxizität). Folglich können die erfindungsgemäße Nukleinsäure, die ein chimäres Antigen-Rezeptor-Protein kodiert, ein Plasmid enthaltend diese Nukleinsäure, ein Virus enthaltend das Plasmid und eine transgene T-Lymphozyte, die mit der oben beschriebenen Nukleinsäure, dem oben beschriebenen Plasmid, oder dem oben beschriebenen Virus transfiziert sind, effektiv in der Tumorimmuntherapie verwendet werden.
  • Figurenliste
    • 1 zeigt, beispielhaft, ein schematisches Diagramm der Struktur des erfindungsgemäßen lentiviralen Vektors pPWT-eGFP-F2A-CAR enthaltend eine CAR-kodierende Sequenz.
    • 2 zeigt, beispielhaft, ein schematisches Diagramm von den Verbindungen zwischen verschiedenen Domänen von CAR der vorliegenden Erfindung, die in einem lentiviralen Vektor enthalten sind, in dem eGFP und die svFv (EGFR)-spezifischen chimären Antigen-Rezeptoren über die Ribosom-springende Sequenz F2A verbunden sind.
    • 3 zeigt eine Nukleinsäure-Elektrophoresekarte des lentiviralen Plasmids von Beispiel 1, identifiziert durch Doppelverdau mit Mlul und Sall. Wobei M1 ein DS2000 molekularer Marker ist (Guangzhou Dongsheng Biotechnology Co., Ltd.); und M2 ein Hindlll-Marker ist (Guangzhou Dongsheng Biotechnology Co., Ltd.). Spuren 1-6 sind jeweils 1: pWPT-eGFP; 2: pWPT-eGFP-F2A-806-δZ; 3: pWPT-eGFP-F2A-806-Z; 4: pWPT-eGFP-F2A-806-BBZ; 5: pWPT-eGFP-F2A-806-28Z; 6: pWPT-eGFP-F2A-806-28BBZ.
    • 4 zeigt das Ergebnis einer Flusszytometrie von eGFP, das in CD8+ T-Lymphozyten, die mit dem Virus aus Beispiel 2 infiziert sind, exprimiert wird.
    • 5 zeigt das In-vitro-Wachstum von CD8+ T-Lymphozyten, die verschiedene chimäre Antigen-Rezeptoren (CAR+) gemäß Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung exprimieren.
    • 6 zeigt die Ergebnisse der Flusszytometrie der Expression des EGFR287-302-Epitops auf der Oberfläche verschiedener, in dem erfindungsgemäßen Beispiel 3 verwendeten, Tumorzelllinien.
  • Arten, die Erfindung auszuführen
  • Die Erfindung wird ferner mit Verweis auf die folgenden spezifischen Beispiele veranschaulichen. Es ist so zu verstehen, dass diese Beispiele nur dazu dienen, die Erfindung zu veranschaulichen, aber nicht den Geltungsbereich der Erfindung zu beschränken. Die experimentellen Verfahren in den folgenden Beispielen ohne besondere Bedingungen werden unter Routinebedingungen durchgeführt, beispielsweise Bedingungen wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, beschrieben oder wie vom Hersteller angewiesen, wenn die Beschreibung des Reagenz-Unternehmens spezifisch in den Beispielen genannt wird.
  • Beispiel 1. Konstruktion eines lentiviralen Plasmids, das erfindungsgemäßen chimären Antigen-Rezeptor exprimiert
  • Die Verbindungsreihenfolge von jedem Teil in dem beispielhaften erfindungsgemäßen chimären Antigen-Rezeptor ist in der folgenden Tabelle 1 dargestellt, die auch in 2 gezeigt wird. Tabelle 1
    Chimärer Antigen-Rezeptor Extrazelluläre Bindedomäne-Transmembrandomäneintrazelluläre Signaldomäne 1-intrazelluläre Signaldomäne 2 Beschreibung
    806-δZ scFv(EGFR)-CD8-CD3δzeta Negativkontrolle
    806-Z scFv(EGFR)-CD8-CD3 zeta Die 1. Generation
    806-BBZ scFv(EGFR)-CD8-CD137-CD3 zeta Die 2. Generation
    806-28Z scFv(EGFR)-CD28-CD28-CD3 zeta Die 2. Generation
    806-28BBZ scFv(EGFR)-CD28-CD28-CD137-CD3 zeta Die 3. Generation
  • Amplifiktion von Nukleinsäurefragmenten
  • Amplifikation der scFv(EGFR)-Sequenz
  • Die Sequenz der scFv(EGFR)-Sequenz wurde durch Verwendung eines in unserem Labor konstruierten Nukleotids eines einzelsträngigen, bifunktionalen Antikörpers 806/CD3 oder hu7B3/CD3 amplifiziert. Die Sequenz des Templates ist in der chinesischen Patentanmeldung 201210094008.x als SEQ ID NO: 10 bzw. 11 dargestellt. Und die Primer, die zur Amplifikation verwendet wurden sind:
    • „upstream“-Primer 5'-gacatcctgatgacccaatctccatcctc-3' (SEQ ID NO: 5) und „downstream“-Primer 5'-tgcagagacagtgaccagagtcccttgg-3' (SEQ ID NO: 6), verwendet, um 806 scFv (EGFR) zu amplifizieren;
    • und „upstream“-Primer 5'-gatattcagatgacccagagcccg-3' (SEQ ID NO: 7) und „downstream“-Primer 5'-gctgctcacggtcaccagggtg-3' (SEQ ID NO: 8), um hu7B3 scFv (EGFR) zu amplifizieren.
  • In beiden Situationen war die Größe der amplifizierten Zielbande 720 bp. PCR Amplifikationsbedingungen waren: Vordenaturierung bei 94 °C für 4 Min.; Denaturierung bei 94 °C für 40 Sek.; Annealing bei 58 °C für 40 Sek.; Verlängerung bei 68 °C für 40 Sek.; 25 Zyklen; gefolgt von einer Gesamtverlängerung bei 68 °C für 10 Min. PCR-amplifizierte Bande wurden über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der vorhergesagten Fragmentgröße zu entsprechen.
  • Die Sequenz der Negativkontrolle scFv (CD19) wurde gemäß der Sequenz von FMC63-28Z (HM852952.1) aus der GenBank ermittelt und die Sequenz wurde durch die Shanghai Ruijin Biotechnology Co. über Komplettgen-Synthese erhalten.
  • (2) Nukleinsäuresequenz von anderen Teilen des chimären Antigen-Rezeptors Andere Teile des chimären Antigen-Rezeptor-Proteins und der Gelenkregion, welche diese Teile verbindet, wurden wie folgt amplifiziert: 1 ml Trizol (Invitrogen) wurde zu 1 × 107 gesunden humanen peripheren mononuklearen Blutzellen gegeben (bereitgestellt von Shanghai Blood Center), um die Zellen zu lysieren; anschließend wurde die Gesamt-RNS über das Phenol-Chloroform-Verfahren extrahiert; und cDNAs wurden durch reverse Transkription über Verwendung des ImProm-II ™ Reverse Transcription Kit (Promaga) erzeugt. Die oben präparierten cDNAs wurden als Template verwendet in:
    1. (a) Amplifikation, um eine CD8α-Gelenkregion-Transmembrandomäne zu erhalten, unter Verwendung von „upstream“-primer 5'-cactgtctctgcaaccacgacgccagcg-3' (SEQ ID NO: 9) und „downstream“-Primer 5'-ggtgataaccagtgacaggag-3' (SEQ ID NO: 10); und die PCR-Amplifikationsbedingungen waren: Vordenaturierung bei 94 °C für 4 Min.; Denaturierung bei 94 °C für 30 Sek.; Annealing bei 58 °C für 30 Sek.; Verlängerung bei 68 °C für 30 Sek.; 25 Zyklen; gefolgt von einer Gesamtverlängerung bei 68 °C für 10 Min. Das amplifizierte Produkt wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der theoretischen Größe von 198 bp zu entsprechen.
    2. (b) Amplifikation, um eine CD8α-Gelenkregion-Transmembrandomäne-deltaZ(δZ) zu erhalten, unter Verwendung von „upstream“-Primer 5'-cactgtctctgcaaccacgacgccagcg-3' (SEQ ID NO: 11) und „downstream“-Primer 5'-gaggtcgacctacgcgggggcgtctgcgctcctgctgaacttcactctggtgataaccagtg-3' (SEQ ID NO: 12); und die PCR-Amplifikationsbedingungen dieselben wie oben waren. Das amplifizierte Produkt wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der theorethischen Größe von 234 bp zu entsprechen.
    3. (c) Amplifikation, um ein CD28-Transmembrandomäne-intrazelluläre Signaldomäne Fragment zu erhalten, unter Verwendung von „upstream“-Primer 5'-ttttgggtgctggtggtggttgg-3' (SEQ ID NO: 13) und „downstream“-Primer 5'-gctgaacttcactctggagcgataggctgcgaag-3' (SEQ ID NO: 14); und die PCT-Amplifikationsbedingungen dieselben wie oben waren. Das amplifizierte Produkt wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der theorethischen Größe von 465 bp zu entsprechen.
    4. (d) Amplifikation, um eine CD137 intrazelluläre Domäne zu erhalten, unter Verwendung von „upstream“-Primer 5'-aaacggggcagaaagaaactc-3' (SEQ ID NO: 15) und „downstream“-Primer 5'-cagttcacatcctccttc-3' (SEQ ID NO: 16); und die PCT-Amplifikationsbedingungen dieselben wie oben waren. Das amplifizierte Produkt wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der theorethischen Größe von 126 bp zu entsprechen.
    5. (e) Amplifikation, um eine CD3 zeta Signaldomäne zu erhalten, unter Verwendung von „upstream“-Primer 5'-cactggttatcaccagagtgaagttcagcaggagc-3' (SEQ ID NO: 17) und „downstream“-Primer 5'-cgaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3' (SEQ ID NO: 18); und die PCT-Amplifikationsbedingungen dieselben wie oben waren. Das amplifizierte Produkt wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der theorethischen Größe von 339 bp zu entsprechen.
  • Spleißen der Nukleinsäurefragmente
    1. (a) „upstream“-Primer 5'-accacgacgccagcgccg-3' (SEQ ID NO: 19) und „downstream“-Primer 5'-cacccagaaaataataaag-3' (SEQ ID NO: 20) wurden beim Spleißen verwendet, um eine CD8α-Gelenkregion-CD28-Transmembrandomäne zu erhalten; und die Spleißbedingungen waren: Vordenaturierung der CD8α-Gelenkregion (50 ng) + CD28-Transmembrandomäne (50 ng) bei 94 °C für 4 Min.; Denaturierung bei 94 °C für 30 Sek.; Annealing bei 60 °C für 30 Sek.; Verlängerung bei 68 °C für 30 Sek.; 5 Zyklen; gefolgt von einer Gesamtverlängerung bei 68 °C für 10 Min.; DNS-Polymerase und „upstream“- und „downstream“-Primer wurden ergänzt, und anschließend wurde die PCR-Amplifikation über 25 Zyklen durchgeführt; und PCR-Amplifikationsbedingungen waren: Vordenaturierung bei 94 °C für 4 Min.; Denaturierung bei 94 °C für 30 Sek.; Annealing bei 60 °C für 30 Sek.; Verlängerung bei 68 °C für 30 Sek.; 25 Zyklen; gefolgt von einer Gesamtverlängerung bei 68 °C für 10 Min. Das amplifizierte Produkt wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der theoretischen Größe von 216 bp zu entsprechen.
    2. (b) „upstream“-Primer 5'- agagtgaagttcagcaggagcgcag-3' (SEQ ID NO:21) und „downstream“-Primer 5'- cgaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3' (SEQ ID NO:18 wurden beim Spleißen verwendet, um eine 4-1BB intrazelluläre Signaldomäne und eine CD3 zeta d.h., BBZ, zu erhalten; und die Spleißbedingungen und PCR-Amplifikationsbedingungen waren dieselben wie oben. Das amplifizierte Produkt wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der theoretischen Größe von 465 bp zu entsprechen.
    3. (c) „upstream“-Primer 5'-cactgtctctgcaaccacgacgccagcg-3' (SEQ ID NO: 22) und „downstream“-Primer 5'-cgaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3' (SEQ ID NO: 18) wurden verwendet, um äquimolare CD8α-Gelenkregion-Transmembrandomäne und CD3 zeta (ca. 50 ng) zu spleißen, und CD8-CD3 zeta (d.h., CD8-Z) wurde über PCR-Amplifikation erhalten; und die Spleißbedingungen und PCR-Amplifikationsbedingungen waren dieselben wie oben. Das amplifizierte Produkt wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der theoretischen Größe von 537 bp zu entsprechen.
    4. (d) „upstream“-Primer 5'-cactgtctctgcaaccacgacgccagcg-3' (SEQ ID NO: 23) und „downstream“-Primer 5'-cgaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3' (SEQ ID NO: 18) wurden verwendet, um die CD8α-Gelenkregion-Transmembrandomäne und BBZ zu spleißen und das Fragment, CD8-CD137-CD3 zeta (i.e., CD8-BBZ) wurde über PCR-Amplifikation erhalten; und die Spleißbedingungen und PCR-Amplifikationsbedingungen waren dieselben wie oben. Das amplifizierte Produkt wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der theoretischen Größe von 663 bp zu entsprechen.
    5. (e) „upstream“-Primer 5'-accacgacgccagcgccg-3' (SEQ ID NO: 24) und „downstream“-Primer 5'-cgaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg -3' (SEQ ID NO: 18) wurden verwendet, um die CD8α-Gelenkregion-CD28-Transmembrandomäne und Z zu spleißen, und das Zielfragment, CD8-Gelenkregion-CD28-Transmembrandomäne-28-Z-intrazelluzläre Domäne, wurde über PCR-Amplifikation erhalten; und die Spleißbedingungen und PCR-Amplifikationsbedingungen waren dieselben wie oben. Das amplifizierte Produkt wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der theoretischen Größe von 678 bp zu entsprechen.
    6. (f) „upstream“-Primer 5'-accacgacgccagcgccg-3' (SEQ ID NO: 19) und „downstream“-Primer 5'-cgaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3' (SEQ ID NO: 18) wurden verwendet, um das CD8-Gelenkregion, CD28-Transmembrandomäne-intrazellulare Signaldomäne Fragment, das durch PCR und BBZ erhalten wurde, zu spleißen, um das Zielfragment, CD8-Gelenkregion-CD28TM-28BBZ, zu erhalten. Das amplifizierte Produkt wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der theoretischen Größe von 804 bp zu entsprechen
    7. (g) δZ, Z und 28BBZ Nukleinsäurefragmente enthaltend Gelenkregion und die Transmembranregion jeweils erhalten durch äquimolare Amplifikation wurden mit äquimolarer Einzelketten-Antikörper Nukleinsäuresequenz scFv806 oder scFvCD19 (ca. 50 ng) gespleißt, und amplifiziert durch PCR, Nukleinsäuresequenzen kodierend für chimäre Antikörper 806-δZ, 806-Z, 806-BBZ, 806-28Z und 806-28BBZ wurden erhalten durch Spleißen in dem in 2 dargestellten, und Spleißbedingungen und PCR-Amplifikationsbedingungen waren dieselben wie oben.
  • Konstruktion des Plasmidvektors
  • Das in diesem Beispiel verwendete Vektorsystem gehört zu der dritten Generation selbstinaktivierender lentiviraler Vektorsysteme. Das System besteht aus drei Plasmiden, nämlich einem Verpackungsplasmid psPAX2 kodierend für Gag/Pol-Protein, Rev-Protein; Hüllenplasmid PMD2.G kodierend für VSV-G Protein; und einem rekombinanten Expressionsvektor basierend auf dem Leervektor pPWT-eGFP und kodierend für das Zielgen CAR.
  • In den Leervektor pPT-eGFP wurde die Expression von dem verstärkt grün fluorezierenden Protein (eGFP) reguliert durch den Promoter des Elongationsfaktors-1α (EF-1α). Und in dem rekombinanten Expressionsvektor, der für das Zielgen CAR kodiert, wurde die Coexpression von eGFP und dem Zielgen CAR durch eine ribosomale Sprungsequenz 2A des Maul- und Klauenseuche-Virus (FMDV, F2A) erreicht. F2A ist eine Kernsequenz von 2A (oder „selbstschneidendes Polypeptid 2A“) des Maul- und Klauenseuche-Virus, welche die „Selbstschneide“-Funktion von 2A besitzt und die Coexpression von „upstream“- und „downstream“-Genen ermöglicht. 2A stellt aufgrund der Vorteile einer hohen Schneideeffizienz, einer hohen Expressionsbalance von „upstream“- und „downstream“-Genen, und einer kurzen Sequenz eine effektive und praktikable Strategie dar, um multicistronische Vektoren der Gentherapie zu konstruieren. Speziell in der Immuntherapie von chimären Antigen-Rezeptor genmodifizierten T-Lymphozyten wird die Coexpression von Zielgen und GFP oder eGFP im Allgemeinen durch die Verwendung dieser Sequenz erreicht, und die Expression von CAR kann individuell durch die Detektion von GFP oder eGFP detektiert werden.
  • In diesem Beispiel wurde ein lentiviraler Expressionsvektor konstruiert, der eGFP und spezifisch mit F2A verknüpftes CAR coexprimiert und kollektiv als pWPT-eGFP-F2A-CAR bezeichnet wird. Die Schritte des Spleißens von jedem Teil von eGFP-F2A-CAR sind wie folgt:
  • Fragment des F2A-(66bp)-CD8α-Signalpeptids (63bp) und eine kleine Nukleinsäuresequenz (ca. 18 bp) fusioniert mit „upstream“ eGFP und „downstream“ CAR wurde durch Primer-Spleißen erhalten, wobei dessen theoretische Größe davon 165 bp war. Und die Primer waren:
    • 5'-attcaaagtctgtttcacgctactagctagtccg-3' (SEQ ID NO: 25)
    • 5'-gtgaaacagactttgaattttgaccttctgaagttggcaggagacgttgagtccaac-3' (SEQ ID NO: 26)
    • 5'-agcggcaggagcaaggcggtcactggtaaggccatgggcccagggttggactcaacgtc-3' (SEQ ID NO: 27)
    • 5'-ctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatcctgatgacccaatc-3' (SEQ ID NO: 28)
  • Spleißbedingungen für die primer waren:
    Vordenaturierung bei 94 °C für 4 Min.; Denaturierung bei 94 °C für 20 Sek.; Annealing bei 50 °C für 20 Sek.; Verlängerung bei 68 °C für 30 Sek.; 25 Zyklen; gefolgt von einer Gesamtverlängerung bei 68 °C für 10 Min. Das amplifizierte Produkt wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der theoretischen Größe zu entsprechen.
  • „upstream“-Primer 5'- cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3' (SEQ ID NO:29) und „downstream“-Primer 5'-gctactagctagtccggacttgtacagctcgtccatg -3' (SEQ ID NO:30) wurden verwendet, um das Zielgen eGFP durch Verwendung des Leervektors pWPT-eGFP als Templat zu amplifizieren. PCR-Amplifikationsbedingungen waren: Vordenaturierung bei 94°C für 4 Min.; Denaturierung bei 94°C für 40 Sek.; Annealing bei 56°C für 40 Sek.; Verlängerung bei 68°C für 40 Sek.; 25 Zyklen; gefolgt von einer Gesamtverlängerung bei 68 °C für 10 Min.. Das amplifizierte Produkt wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der theoretischen Größe von 735 bp zu entsprechen.
  • „upstream“-Primer 5'- cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3' (SEQ ID NO: 29) und „downstream“-Primer 5'- gaggtcgacctacgcgggggcgtctgcgctcctgctgaacttcactctggtgataaccagtg-3' (SEQ ID NO: 12) wurden verwendet, um äquimolare Mengen des oben erhaltenen F2A-CD8α-Signalpeptid-Fragments, eGFP und 806-δZ (ca. 80 ng), um eGFP-F2A-806-δZ zu erhalten. Und die Spleißbedingungen waren: Vordenaturierung bei 94°C für 4 Min.; Denaturierung bei 94°C für 40 Sek.; Annealing bei 62°C für 40 Sek.; Verlängerung bei 68°C für 140 Sek.; 5 Zyklen; danach wurden DNS-Polymerase und „upstream“- und „downstream“-Primer in einem geeigneten Volumen ergänzt und die PCR-Amplifikation wurde über 25 Zyklen durchgeführt; und die PCR-Amplifikationsbedingungen waren: Vordenaturierung bei 94°C für 4 Min.; Denaturierung bei 94°C für 30 Sek.; Annealing bei 62°C für 40 Sek.; Verlängerung bei 68°C für 140 Sek. Das amplifizierte Produkt wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der theoretischen Größe von 1861 bp zu entsprechen.
  • „upstream“-Primer 5'- cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3' (SEQ ID NO: 29) und „downstream“-Primer 5'-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatgtgaag-3' (SEQ ID NO: 18) wurden verwendet, um jeweils äquimolare Mengen der oben erhaltenen F2A- und CD8α-Signalpeptid-Fragmente, eGFP und 806-Z, 806-BBZ, CD19-BBZ, 806-28Z wie auch 806-28BBZ (ca. 80 ng) zu erhalten. Und die Spleißbedingungen waren: Vordenaturierung bei 94°C für 4 Min.; Denaturierung bei 94°C für 40 Sek.; Annealing bei 62°C für 40 Sek.; Verlängerung bei 68°C für 140 Sek.; 5 Zyklen; danach wurden DNS-Polymerase und „upstream“- und „downstream“-Primer in einem geeigneten Volumen ergänzt und die PCR-Amplifikation wurde über 25 Zyklen durchgeführt; und die PCR-Amplifikationsbedingungen waren: Vordenaturierung bei 94°C für 4 Min.; Denaturierung bei 94°C für 40 Sek.; Annealing bei 62°C für 40 Sek.; Verlängerung bei 68°C für 140 Sek. Das amplifizierte Produkt wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um der theoretischen Größe von 1861 bp zu entsprechen.
  • eGFP-F2A-806-Z, eGFP-F2A-806-BBZ, eGFP-F2A-806-28Z und eGFP-F2A-806-28BB Z wurden erhalten, deren theoretische Größe war 2164bp, 2290bp, 2305bp bzw. 2431bp und die amplifizierten Produkte wurde über Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, um den theoretischen Größen zu entsprechen, wobei Mlul- und Sall-Schnittstellen „upstream“ und „downstream“ des offenen Leserahmens eingeführt wurden. Das oben erhaltene Zielgen eGFP-F2A-CAR wurde mit Mlul und Sall verdaut und in einen pWPT-Vektor, der mit den gleichen Enzymen verdaut wurde, ligiert. Der konstruierte lentivirale Vektor, der jeden der chimären Antigen-Rezeptoren exprimiert, wurde mit Mlul und Sall verdaut (3) und die Sequenz wurde als korrekt für die Verpackung von Lentiviren bestimmt.
  • Wir vorher beschrieben wurde eGFP-F2A-CAR in mRNA transkribiert, aber in zwei Proteine, eGFP und anti-EGFR287-302-chimärer-Antigen-Rezeptor, translatiert. Unter der Wirkung von CD8α-Signalpeptid wird der anti-EGFR287-302-chimärer-Antigen-Rezeptor auf der Zellmembran lokalisiert sein.
  • 293T-Zellen wurden mit Plasmiden zur Lentivirus-Verpackung transfiziert
  • 293T Zellen (ATCC: CRL-11268) die zur 6. Bis 10. Generation kultiviert wurden, wurden in eine 10 cm Schale bei einer Dichte von 6 × 106 geimpft, und zur Transfektion über Nacht bei 37 °C, 5% CO2 inkubiert. Das Medium war DMEM (PAA) enthaltend 10% fetales Rinderserum (PAA). Am nächsten Tag wurde das Medium ca. 2 Stunden vor der Transfektion durch Serum-freies DMEM ersetzt.
  • Das Vorgehen für die Transfektion war wie folgt:
    • 4.1 20 µg Leerplasmid pWPT-GFP (Negativkontrolle) oder 20 µg von Zielgen-Plasmid pWPT-eGFP-F2A-CAR wurden mit 15 µm Verpackungsplasmid PAX2 und 6 µg Hüllenplasmid pMD2.G in 500 µl MilliQ-Wasser gemischt,
    • 4.2 62 µl 2,5 M CaCl2 (Sigma) wurde tropfenweise zugegeben und bei 1200/Min. über Vortexen gemischt,
    • 4.3 Letztlich wurden 500 µl 2 × HeBS (280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na2HPO4 • 2H2O, 12 mM Glucose, 50 mM Hepes, Sigma, pH 7.0, 0,22 µM) tropfenweise zugegeben und es wurde bei 1200 U/Min für 10 Sek. über Vortexen gemischt,
    • 4.4 Sofort tropfenweise auf die Petrischale gegeben, vorsichtig geschüttelt, gezüchtet bei 37 °C, 5% CO2 über 4 bis 6 Stunden und mit DMEM enthaltend 10% fetales Kalbserum ausgetauscht.
  • Die Transfektionseffizienz wurde am nächsten Tag auf die Transfektion beobachtet (d.h., der Anteil der Zellen mit grüner Fluoreszenz), und ~ 80% positive Transfektionseffizienz wurde als eine erfolgreiche Transfektion angesehen. 48 Stunden oder 72 Stunden nach der Transfektion wurde Virus durch Filtration mit einem 0,45 µm Filter (Millipore) und Zentrifugation bei 28000 U/Min. über 2 Stunden bei 4 °C unter Verwendung einer Beckman Optima L-100XP Ultrazentrifuge gesammelt. Der Überstand wurde verworfen und das erhaltene Pellet wurde resuspendiert in einer Quantum 007 Kulturflüssigkeit (PAA) bei 1/10 ~ 1/50 Volumen der Stammlösung, und bei -80 °C bei 100 µl/Röhrchen zur Virustitration oder Infektion von T-Lymphozyten gelagert.
  • Ermittlung des Titers von Lentivirus, der mit Leervektor gepackt ist oder der mit GFP-F2A-CAR gepackt ist
  • Am ersten Tag wurden 293T-Zellen zu 1 × 105/mL in 96-Wannen-Kulturplatten mit 100 µL/Wanne angeimpft, und bei 37 °C, 5% CO2 gezüchtet, und das Kulturmedium war DMEM enthaltend 10% fetales Rinderserum. Am nächsten Tag wurden 50 µL/Wanne an Kulturüberstand verworfen, 50 µL/Wanne an frischem Kulturmedium zugegeben, Polybren bis zu einer endgültigen Konzentration von 6 µg/mL war enthalten, und die Zellen wurden für 30 Min. bei 37 °C und 5% CO2 gezüchtet. 10 µl/Wanne an Virenstammlösung oder 1 µl/Wanne an Viruskonzentrat wurde bei einer 5-fachen Verdünnung zugegeben und 4 Gradienten, in doppelter Ausführung, und die Zellen wurden bei 37 °C, 5% CO2 gezüchtet. 48 Stunden nach der Infektion wurde eGFP durch Flusszytometrie detektiert, wobei die Anzahl der Zellen zu einer positiven Rate von 5 bis 20 % angemessen war, und der Titer (U/mL) wurde gemäß der positiven Rate × Verdünnung × 100 × 104 berechnet. Der Titer an verpacktem Virus durch das Calciumphosphat-Transfektionsverfahren war ca. 0,5 ~ 2 × 106 U/mL, und nach Konzentration wurde der Titer an Virus mit ca. 2 × 107 U/mL detektiert.
  • Beispiel 2. Infektion von CD8+ T-Lymphozyten durch rekombinanten Lentivirus
  • Mononukleare Zellen von humanem peripheren Blut wurden aus gesundem humanem Blut (bereitgestellt durch das Shanghai Blood Center) über Dichtegradientenzentrifugation erhalten. CD8+ T-Lymphozyten wurden aus mononuklearen Zellen aus peripherem Blut über das negative Sortierungsverfahren unter Verwendung von CD8+ T-Lymphozyten Kügelchen (Stem Cell Technologies) erhalten. Ausgewählte CD8+ T-Lymphozyten wurden auf die Reinheit der CD8+ T-Lymphozyten über Zytometrie getestet und falls die positive Rate an CD8+ T-Lymphozyten ≥ 95% ist, ist es angemessen für den nächsten Einsatz. Quantum 007 Lymphozyten Kulturmedium (PAA) wurde bei einer Dichte von ca. 1 × 106/mL zur Kultur zugegeben, magnetische Kügelchen, die mit anti-CD3- und CD28-Antikörpern (Invitrogen) beschichtet waren, wurden bei einem Verhältnis von Zelle : magnetischem Kügelchen von 1 : 1 zugegeben, und die Zellen wurden für 24 Stunden mit humanem rekombinanten IL-2 (Shanghai Huaxin Biotechnology Co., Ltd.) bei einer Endkonzentration von 100 U/mL stimuliert und gezüchtet. Und dann wurden CD8+ T-Lymphozyten durch den oben genannten rekombinanten Lentivirus bei MOI ≈ 5 infiziert. Infizierte Zellen wurden jeden zweiten Tag bei einer Dichte von 5 × 105/mL subkultiviert und rekombinantes IL-2 wurde in der Lymphozytenkultur zu einer Endkonzentration von 100 U/mL ergänzt.
  • Am 7. Tag der Züchtung wurden infizierte CD8+ T-Lymphozyten durch Flusszytometrie auf die Expression von verschiedenen chimären Antigen-Rezeptoren detektiert, wobei detektierte eGFP-positive Zellen als positive Zellen, die aufgrund der Coexpression von eGFP und CAR chimäre Antigen-Rezeptoren exprimieren, angesehen (4). Ein positives Verhältnis von durch das Virus infizierte und verschiedene chimäre Antigen-Rezeptoren exprimierende CD8+ T-lymphozyten sind in der folgenden Tabelle dargestellt, wobei uninfizierte T-Lymphozyten die Negativkontrolle darstellen. Die positive Rate zeigt, dass eine gewisse positive Rate an CAR+ T-Lymphozyten durch lentivirale Infektion erhalten werden kann. Tabelle 2
    CD8+ T-Lymphozyten, die mit den folgenden CARs transfiziert sind eGFP-positive Rate an CD8+ T-Lymphozyten
    806-δZ 38.8%
    806-Z 62%
    806-BBZ 45%
    806-28Z 78%
    806-28BBZ 33.8%
  • Nach der Infektion mit Viren, die verschiedene chimäre Antigen-Rezeptoren verpackt haben, wurden CD8+ T-Lymphozyten bei einer Zelldichte von 5 × 105/ml jeden zweiten Tag subkultiviert und gezählt. Und IL-2 (Endkonzentration von 100 U/mL) wurde zur Subkultivierung in das Zellkulturfluid ergänzt. Am 14. Tag der Züchtung kann eine ca. 35~55-fache Amplifikation beobachtet warden (siehe 5), was andeutet, dass CD8+ T-Lymphozyten, die verschiedene chimäre Antigen-Rezeptoren exprimieren, in einer gewissen Menge in vitro amplifiziert werden können, wobei anschließende in-vitro-Toxizitätstests und in-vivo-Tests garantiert werden.
  • Beispiel 3. Detektion der Bloßlegung des EGFR287-302-Epitops in aus Epithel-abgeleiteten Tumorzelllinien
  • Die Bloßlegung des EGFR287-302-Epitops auf verschiedenen Epithelabstammenden Tumorzellen wurde durch Flusszytometrie unter Verwendung von einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACSCalibur, Becton Dickinson) untersucht. Die verwendeten Materialien umfassen:
    1. (1) Monoklonalen Antikörper CH12, der von unserem Labor konstruiert wurde und diese Stelle erkennen kann (siehe CN 101602808B , Beispiele 1-4 für das Konstruktionsverfahren), wurde als Primärantikörper verwendet (endgültige Konzentration 20 µg/ml, 100 µL/Probe),
    2. (2) FITC-markierter anti-humaner Ziegen-IgG wurde als Sekundärantikörper verwendet (AOGMA).
  • Das Detektionsverfahren bezüglich der Bloßlegung des Epitops ist wie folgt:
    1. 1. Tumorzellen wie in Tabelle 3 dargestellt und in der logarithmischen Wachstumsphase wurden in 6 cm Schalen zu einer Zelldichte von ca. 90% angeimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
    2. 2. Die Zellen wurden mit 10 mM EDTA verdaut, durch Zentrifigation bei 200 g für 5 Min. gesammelt, in Phosphatpuffer enthaltend 1% fetales Rinderserum (1% NBS/PBS) zu einer Konzentration von ∼ 1 × 107/mL resuspendiert und zu 100 µl/Röhrchen in ein Flusszytometrie-Röhrchen gegeben.
    3. 3. Die Zellen wurden bei 200 g für 5 Min. zentrigugiert und der Überstand wurde verworfen.
    4. 4. In der experimentellen Gruppe wurde CH12 zugegeben wogegen in der Kontrollgruppe ein irrelevanter Antikörper als Negativkontrolle zugegeben wurde. In einer anderen Kontrollgruppe wurde PBS ohne Antikörper als Blindwert zugegeben. Die endgültige Konzentration jedes Antikörpers war 20 µg/mL und 100 µl wurden in jedes Röhrchen gegeben und für 45 Minuten in ein Eisbad platziert.
    5. 5. 2 ml 1% NBS/PBS wurde in jedes Röhrchen gegeben und zweimal bei 200 g für 5 Min. zentrifugiert.
    6. 6. Der Überstand wurde verworfen und eine 1:50-Verdünnung von FITCmarkiertem anti-humanem Ziegen-IgG zugegeben und für 45 Minuten in ein Eisbad platziert.
    7. 7. 2 ml 1% NBS/PBS wurde in jedes Röhrchen gegeben und zweimal bei 200 g für 5 Min. zentrifugiert.
    8. 8. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in 300 µl 1% NBS/PBS resuspendiert und über Flusszytometrie detektiert.
    9. 9. Die Daten wurden unter Verwendung von WinMDI 2.9, einer Datenanalysesoftware für Flusszytometrie, analysiert.
  • Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt, wobei das EGFR287-302-Epitop nicht in der Gliomzelllinie U87 detektiert wurde, wogegen in U87-EGFR, die exogenes EGFR überexprimieren (konstruiert und aufbewahrt in unserem Labor, und das Konstruktionsverfahren basiert auf Wang H., et al. , Identification of an Exon 4-Deletion Variant of Epidermal Growth Factor Receptor with Increased Metastasis-Promoting Capacity. Neoplasia, 2011, 13, 461-471) und in U87-EGFRvIII, die EGFRvIII überexprimieren (konstruiert und aufbewahrt in unserem Labor und das Konstruktionsverfahren basiert auf WO/2011/035465 ), das EGFR287-302-Epitope detektiert wurde. Außerdem kann die Bloßlegung des EGFR287-302-Epitops in den drei Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien PANC-I, CFPAC-I und BxPC-3 detektiert werden. Tabelle 3
    Name der Zelle Quelle Eigenschaft
    U87 ATCC HTB-14 niedrige Expression von EGFR
    U87-EGFRvIII konstruiert und aufbewahrt in unserem Labor Überexpression von EGFRvIII
    U87-EGFR konstruiert und aufbewahrt in unserem Labor Überexpression von EGFR
    PANC-1 ATCC CRL-1469 Überexpression von EGFR
    CFPAC-1 ATCC CRL-1918 Überexpression von EGFR
    BxPC-3 ATCC CRL-1687 Überexpression von EGFR
  • Beispiel 4. In-vitro-Experiment zur toxischen Wirksamkeit von Zellen, die chimären Antigen-Rezeptor exprimieren
  • In den In-vitro-Toxizitätsexperimenten verwendete Materialien sind wie folgt:
  • Die Zielzellen waren die in der Tabelle oben dargestellten 6 Typen von Zellen. Die Effektorzellen waren positive Zellen, die in vitro über 12 Tage gezüchtet wurden und durch FACS als Zellen detektiert wurden, die chimären Antigen-Rezeptor exprimieren und die als chimäre Antigen-Rezeptor positive (CAR+) CD8+ T-Lymphozyten markiert waren.
  • Die Effektor Zielraten waren jeweils 3:1, 1:1 und 1:3 oder 5:1, 2,5:1 und 1:1. Die Anzahl an Zielzellen war 10000/Wanne und die Anzahl an Effektorzellen korrespondierte mit verschiedenen Effektor-Zielraten. In jeder Gruppe wurden vier Wiederholungen festgelegt und das Mittel der vier Wiederholungen wurde genommen. Die Detektionszeit war 18 Stunden oder 20 Stunden.
  • Wobei jede experimentelle Gruppe und jede Kontrollgruppe wie folgt waren:
    • Jede experimentelle Gruppe: jedes Ziel + CD8+ T-Lymphozyten, die verschiedene chimäre Antigen-Rezeptoren exprimieren,
    • Kontrollgruppe 1: maximale Freisetzung von LDH aus den Zielzellen,
    • Kontrollgruppe 2: spontane Freisetzung von LDG aus den Zielzellen,
    • Kontrollgruppe 3: spontane Freisetzung von LDH aus den Effektorzellen.
  • Detektionsverfahren: Ein CytoTox 96 nichtradioaktiver Zytotoxizitäts-Assay-Kit (Promega) wurde verwendet, um das Verfahren durchzuführen. Das Verfahren ist ein Detektionsverfahren, das auf einem kolorimetrischen Verfahren basiert, das das 51Cr-Freisetzungsverfahren ersetzen kann. Der CytoTox 96®-Assay misst Laktatdehydrogenase (LDH) quantitativ. LDH ist ein stabiles cytoplasmatisches Enzym, das während der Zelllyse freigesetzt wird und auf die gleiche Weise wie 51CR in der radioaktiven Analyse freigesetzt wird. Der Kulturüberstand, in den LDH freigesetzt wird, kann durch eine enzymatische Reaktion von 30-minütiger Konjugation detektiert werden, in der LDH ein Tetrazoliumsalz (INT) in ein rotes Formazan umwandelt. Die Menge an gebildetem roten Produkt ist direkt proportional zu der Anzahl lysierter Zellen. Details können in der Anleitung des CytoTox 96 nichtradioaktiven Zytotoxizitäts-Testkits gefunden werden.
  • Die Formel zur Berechnung der Zytotoxizität war: Zytotoxizität ( % ) = Experimentelle Gruppe − Kontrollgruppe  2 − Kontrollgruppe  3 Kontrollgruppe  1 − Kontrollgruppe  2 × 100 %
    Figure DE112014006656B4_0001
  • Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass:
    Die erfindungsgemäßen CD8+ T-Lymphozyten, die scFv (EGFR)-806-Z CAR+ exprimieren, und die erfindungsgemäßen CD8+ T-Lymphozyten, die 806-28BBZ CAR+ exprimieren, zeigten eine sehr signifikante Zytotoxizität gegen die Tumorzellen U87-EGFRvlll, wobei diese jeweils 55,5% und 85% waren.
  • Zudem ist die oben beschriebene Zytotoxizität der erfindungsgemäßen CD8+ T-Lymphozyten hoch Tumor-spezifisch, da die CD8+ T-Lymphozyten eine hohe Zytotoxizität gegen die Tumorzellen U87-EGFRvlll zeigten, die das EGFR287-302-Epitop exponieren wogegen sie eine niedrige Zytotoxizität gegen Tumorzellen U87 zeigten, die kein EGFR287-302-Epitop exponieren, nämlich weniger als 2% in beiden Fällen. Zugleich zeigten die Attrappen-transfizierten T-Zellen, die als Blindkontrolle zum Beleg der Verlässlichkeit des Experiments verwendet wurden, und die chimären Antigen-Rezeptor 806- δZ transgenen T-Zellen, als Negativkontrolle zur Evaluierung der Wirkungen von Effektormolekülen in primitiven T-Zellen, eine ähnlich niedrige Zytotoxizität gegen U87 und U87-EGFRvIII. Das Experiment oben wurde bei einer Effektor:Ziel-Rate von 5:1 und einer Einsatzdauer von 20 Stunden durchgeführt. Tabelle 5
    CAR+ T Zellen Zytotoxizität gegen Zielzellen %
    U87 U87-EGFRvIII
    806-Z CAR+ <2 56
    806-28BBZ CAR+ <2 85
    806-δZ CAR+ <2 5
    Attrappen-CAR+ <2 8
  • Außerdem zeigte die Zytotoxizität der erfindungsgemäßen CD8+ T-Lymphozyten, die scFv (EGFR)-806-Z CAR+ exprimieren und der erfindungsgemäßen CD8+ T-Lymphozyten, die 806-28BBZ CAR+ exprimieren gegen Tumorzellen U87-EGFR und U87-EGFRvIII als auch gegen die Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien PANC-1, CFPAC-1 und BxPC-3 unter verschiedenen Effektor-Ziel-Raten eine Abhängigkeit von dem Gradient der Effektor-zu-Ziel-Rate. Wie in der folgenden Tabelle dargestellt ist die Zytotoxizität umso höher, je höher die Effektor-zu-Ziel-Rate ist.
    Zytotoxizität % 806-28BBZ 806-Z CD19-BBZ
    bei verschiedenen Effektor-zu-ZielRaten bei verschiedenen Effektor-zu-ZielRaten bei verschiedenen Effektor-zu-ZielRaten
    3:1 1:1 1:3 3:1 1:1 1:3 3:1 1:1 1:3
    U87 -2 -14 -25 n/v n/v n/v n/v n/v n/v
    U87-EGFR 98 49 29 n/v n/v n/v n/v n/v n/v
    U87-EGFRvIII 81 41 13 n/v n/v n/v n/v n/v n/v
    PANC-1 65 28 13 60 34 18 -7 -11 -8
    CFPAC-1 40 22 9 43 35 12 8 8 6
    BxPC-3 70 49 24 44 24 14 7 10 8
  • Wenn die Effektor-zu-Ziel-Rate 3:1 war, war die Zytotoxizität der CD8+ T-Lymphozyten, die 806-28BBZ CAR+ exprimieren, gegen U87-EGFR bis zu 98%, die Zytotoxizität gegen U87-EGFRvlll bis zu 81% und die Zytotoxizität gegen die Bauchspeichelkrebs-Zelllinien PANC-1, CFPAC-1 und BxPC-3 war jeweils 65%, 40% und 70%.
  • Die Zytotoxizität der CD8+ T-Lymphozyten, die den chimären Antigen-Rezeptor CD19-BBZ CAR+ als Negativkontrolle zur Evaluierung der Wirkungen von nichtspezifischem scFv in chimärem Antigen-Rezeptor exprimieren, gegen die Bauchspeichelkrebs-Zelllinien von oben ist jedoch niedriger als 10% und es wurde keine Abhängigkeit von dem Gradient der Effektor-zu-Ziel-Rate beobachtet.

Claims (11)

  1. Nukleinsäure kodierend ein auf der Oberfläche eines humanen T-Lymphozyten exprimiertes, chimäres Antigen-Rezeptor-Protein, wobei das chimäre Antigen-Rezeptor-Protein eine extrazelluläre Bindedomäne, eine Transmembrandomäne und eine intrazelluläre Signaldomäne enthält, die sequentiell verbunden sind, und die extrazelluläre Bindedomäne einen scFv Einzelketten-Antikörper zur spezifischen Erkennung des Epitops der 287ten bis 302ten Aminosäure von humanem epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) enthält.
  2. Nukleinsäure von Anspruch 1, wobei die Transmembrandomäne die Sequenz der Transmembrandomäne und Gelenkregion von CD8 oder CD28 enthält.
  3. Nukleinsäure von Anspruch 1 oder 2, wobei die intrazelluläre Signaldomäne ausgewählt ist aus der Sequenz der intrazellulären Signaldomäne von CD3ζ, FcεRIy, CD28, CD137, CD134, oder Kombinationen davon.
  4. Nukleinsäuresequenz von Anspruch 3, wobei das chimäre Antigen-Rezeptor-Protein das folgende chimäre Antigen-Rezeptor-Protein ist, das sequenziell verbunden eine extrazelluläre Bindedomäne, eine Transmembrandomäne und eine intrazelluläre Signaldomäne enthält: scFv(EGFR)-CD8-CD3ζ, scFv(EGFR)-CD8-CD 137-CD3ζ, scFv(EGFR)-CD28-CD28-CD3ζ, scFv(EGFR)-CD28-CD28-CD 137-CD3ζ, oder Kombinationen davon, wobei in dem chimären Antigen-Rezeptor-Protein das erste CD28 die Transmembrandomäne des Proteins und das zweite CD28 die intrazelluläre Signaldomäne des Proteins darstellt.
  5. Nukleinsäure von Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, die ein chimäres Antigen-Rezeptor-Protein mit einer Sequenz einer der SEQ ID NOs: 31-34 kodieren.
  6. Nukleinsäure von Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure eine Sequenz der SEQ ID NOs: 1-4 hat.
  7. Vektor enthaltend die Nukleinsäure von einem der Ansprüche 1 bis 6.
  8. Vektor von Anspruch 7, wobei der Vektor von einem pPWT-eGFP lentiviralen Plasmidvektor stammt.
  9. Virus enthaltend die Nukleinsäure von Anspruch 7 oder 8.
  10. Transgene T-Lymphozyte, die mit der Nukleinsäure von einem der Ansprüche 1 bis 6, oder dem Vektor von Anspruch 7 oder 8, oder dem Virus von Anspruch 9, transduziert ist.
  11. Transgene T-Lymphozyte, wobei ein chimärer Antigen-Rezeptor auf der Oberfläche der T-Lymphozyte exprimiert wird und der chimäre Antigen-Rezeptor durch eine Nukleinsäure von einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert wird.
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