WO2019177151A1 - 遺伝子改変細胞及びその作製方法 - Google Patents

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cell
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gmr
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洋三 中沢
藍子 長谷川
美幸 田中
中野　茂
翔伍 成松
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キッセイ薬品工業株式会社
国立大学法人信州大学
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Definitions

  • the present invention relates to a genetically modified cell that expresses a chimeric antigen receptor and a method for producing the same that are useful in the field of adoptive immunotherapy.
  • the present invention introduces a polynucleotide encoding a human chimeric granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor-specific mutant chimeric antigen receptor having excellent target cytotoxicity.
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • the present invention relates to genetically modified cells, production methods thereof, pharmaceutical uses, and the like.
  • CAR-T T-cells
  • CAR chimeric antigen receptor
  • CD19 expressed on B cells is not expressed on hematopoietic stem cells but expressed on B-lineage tumor cells, making it an ideal target for adoptive immunotherapy. Therefore, the development of CAR for the treatment of B-cell tumors is progressing, and it has shown remarkable effects in clinical trials and has attracted high attention.
  • JMML juvenile myelomonocytic leukemia
  • AML acute myeloid leukemia
  • Non-Patent Documents 1 and 2 The body (hereinafter referred to as GMR.CAR) has been reported (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • CAR-T therapy for AML has not yet been found to be clinically effective, and has not been sufficiently effective even in animal experiments in which tumor cells are engrafted in a living body (Non-patent Document 3). 4).
  • the reason why CAR-T therapy for JMML or AML has not been developed is, for example, that it is difficult to select a target antigen.
  • CAR-T technology targeting myeloid antigens is still under development, and it is desired to develop a CAR that is highly safe and has excellent effects in vivo.
  • a GM-CSF receptor-specific mutation using, as a target binding domain, a mutant GM-CSF in which the glutamic acid at the 21st amino acid residue of the GM-CSF polypeptide is substituted with another amino acid as a target binding domain T-cells (hereinafter referred to as “mutant GMR.CAR-T cells”) into which a chimeric chimeric receptor (hereinafter referred to as “mutant GMR.CAR”) is introduced are excellent in the treatment of AML and the like. It has been found that it has both cytotoxic activity and safety.
  • the modified cell which is a mutant polypeptide.
  • the extracellular spacer domain comprises a human IgG1 hinge, CH2, and / or CH3 region or a part thereof, and / or an artificial spacer sequence.
  • the target binding domain is a mutant polypeptide having a sequence in which the 21st glutamic acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with arginine or lysine Or the cell described.
  • a method for producing a CAR protein-expressing cell comprising introducing a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (CAR) protein that specifically binds to a human GM-CSF receptor into a cell using a vector.
  • the protein comprises an amino acid sequence in which the 21st glutamic acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid.
  • a vector comprising a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (CAR) protein that specifically binds to the human GM-CSF receptor, wherein the protein is the 21st amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the above vector comprising an amino acid sequence in which the second glutamic acid is substituted with another amino acid.
  • a therapeutic agent for a disease involving GM-CSF receptor-expressing cells comprising the cell according to any one of [1] to [7] above.
  • a pharmaceutical composition comprising the therapeutic agent according to the above [10] and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • JMML juvenile myelomonocytic leukemia
  • AML acute myeloid leukemia
  • glioma glioma
  • neuroblastoma glioblastoma
  • the therapeutic agent according to the above [10] or the composition according to the above [11] selected from a brain tumor, a colorectal adenocarcinoma, a prostate cancer, a kidney cancer, a melanoma and a small cell lung cancer.
  • This specification includes the disclosure of Japanese Patent Application No. 2018-050266, which is the basis of the priority of the present application.
  • the GMR.CAR-T cell of the present invention is safe in adoptive immunotherapy targeting various cells expressing GM-CSF receptor on the cell surface, including acute myeloid leukemia (AML). It exhibits excellent tumor cell cytotoxicity.
  • AML acute myeloid leukemia
  • the vector map of CAR001 is shown.
  • An example of a vector map of GMR.CAR (CH2CH3 partial deletion, GMR.CAR dCH2CH3) with a modified spacer domain is shown.
  • An example of a vector map of GMR.CAR (CH2CH3 partial deletion- (G4S) 3 insert, GMR.CAR dCH2CH3 + (G4S) 3) with a modified spacer domain is shown.
  • An example of a vector map of (E21R) GMR.CAR (CH2CH3 partial deletion, E21RGMR.CAR dCH2CH3) with a modified spacer domain is shown.
  • An example of a vector map of (E21K) GMR.CAR (CH2CH3 partial deletion, E21KGMR.CAR dCH2CH3) with a modified spacer domain is shown.
  • An example of a vector map of (E21R) GMR.CAR (CH2CH3 partial deletion- (G4S) 3 insert, E21RGMR.CAR dCH2CH3 + (G4S) 3) with a modified spacer domain is shown.
  • An example of a vector map of (E21K) GMR.CAR (CH2CH3 partial deletion- (G4S) 3 insert, E21KGMR.CAR dCH2CH3 + (G4S) 3) with a modified spacer domain is shown.
  • the number of tumor cells in the wells in FIGS. 13-16 is shown.
  • the results of GM-CSF expression analysis on day 14 of CAR-T cells (CAR-T 001-B and CAR-T 009-B to CAR-T 014-B) introduced with a polynucleotide encoding CAR are shown.
  • the relative ratio of tumor viable cells to MV4-11 cells and the relative ratio of viable cells to peripheral blood cells at E: T ratios 1: 1 and 1:10 is shown.
  • the sigmoid curve drawn from the point plotted by each E: T ratio with respect to a healthy person origin bone marrow cell is shown.
  • the sigmoid curve drawn from the point plotted by each E: T ratio with respect to MV4-11 cell is shown.
  • the safety range calculated based on the IC50 value calculated from FIG. 20 and the EC50 value calculated from FIG. 21 is shown.
  • the results of GM-CSF expression analysis on day 14 of CAR-T cells (CAR-T 009-C, CAR-T 011-C and CAR-T 012-C) introduced with a polynucleotide encoding CAR are shown.
  • mouth model of CAR-T 009-C, CAR-T 011-C, and CAR-T 012-C is shown.
  • the result of GM-CSF expression analysis on day 14 of CAR-T cells (CAR-T 009-D to CAR-T 014-D) into which a polynucleotide encoding CAR is introduced is shown.
  • the experimental result in the MV4-11 cancer-bearing mouse model of CAR-T09009-D, CAR-T 011-D and CAR-T 012-D is shown.
  • the experimental result in the MV4-11 cancer bearing mouse model of CAR-T-010-D, CAR-T 013-D and CAR-T 014-D is shown.
  • the results of quantitative PCR of tumors in peripheral blood on day 52 from CAR-T 009-D to CAR-T 014-D are shown.
  • chimeric antigen receptor refers to a target specificity of T cells (eg, naive T cells, stem cell memory T cells, central memory T cells, effector memory T cells, or combinations thereof). It refers to a modified receptor that can be transplanted into cells such as T cells). CAR is also known as an artificial T cell receptor, a chimeric T cell receptor, or a chimeric immune receptor.
  • domain refers to a region in a polypeptide that is folded into a specific structure independently of other regions.
  • polynucleotide includes natural or synthetic DNA and RNA, such as genomic DNA, cDNA (complementary DNA), mRNA (messenger RNA), rRNA (ribosomal RNA), shRNA (small hairpin). RNA), snRNA (nuclear small RNA), snoRNA (nuclear small RNA), miRNA (microRNA), and / or tRNA, but are not limited thereto.
  • encoding means that a predetermined nucleotide sequence encodes amino acid sequence information of a predetermined protein or (poly) peptide, as commonly used in the art. In the text, both sense and antisense strands are used in the context of “encoding”.
  • the present invention provides a chimeric antigen receptor having a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain.
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • CAR body
  • “having a sequence” includes a case where a sequence other than the described sequence is included, and also includes a case where only the described sequence is included (ie, “consisting of a sequence”).
  • the CAR protein of the present invention contains a “target binding domain” that specifically binds to the human GM-CSF receptor.
  • Target (GM-CSF receptor) binding domain shows specific binding to GM-CSF receptor and specific immune response against target cells expressing GM-CSF receptor on the cell surface Enable.
  • GM-CSF receptor binding domain glutamic acid at the 21st amino acid residue of GM-CSF, which is a cytokine that binds to the GM-CSF receptor having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, was substituted with another amino acid.
  • Polypeptides can be used.
  • a mutant in which other amino acid residue part is substituted can also be used.
  • a fragment of these polypeptides, that is, a binding fragment may be used as long as it retains the binding ability to the GM-CSF receptor.
  • the polypeptide in which the amino acid residue 21st amino acid residue of GM-CSF is substituted with another amino acid is not particularly limited as long as it retains the binding activity to the GM-CSF receptor.
  • arginine Substitution amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • substitution to lysine amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • substitution to histidine amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • substitution to aspartic acid amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • Substitution with serine amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
  • substitution with alanine amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • substitution with phenylalanine amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and the like.
  • a polypeptide in which the 21st amino acid residue of GM-CSF is substituted with arginine, lysine or histidine, which is a basic amino acid can be used.
  • a polypeptide in which the 21st amino acid residue of GM-CSF is substituted with arginine or lysine can be used.
  • “having the ability to bind to human GM-CSF receptor” means that the binding constant to human GM-CSF receptor is, for example, 1 to 1000 ⁇ M or less. This binding ability may be a relatively weak binding compared to the binding ability between the antigen and the antibody.
  • the target binding domain can be used in place of the above polypeptide as long as it retains the binding ability to the human GM-CSF receptor.
  • a single chain antibody which is a single chain polypeptide derived from an antibody that retains the ability to bind to the GM-CSF receptor, can be used, and an immunoglobulin heavy chain (H chain) and light chain (L chain) fragment
  • An antibody polypeptide linked to the Fv region of can be used as a target binding domain.
  • ligands that specifically bind to receptor proteins expressed on target cells such as affibodies, ligand binding domains derived from natural receptors, soluble proteins / peptides of receptors (eg on tumor cells) Ligand, peptide, vaccines for promoting immune response, etc. may be used.
  • the CAR protein herein can optionally include an “extracellular spacer domain”.
  • the extracellular spacer domain is preferably a sequence that promotes the binding of CAR to an antigen and enhances signal transduction into the cell.
  • antibody Fc fragments, or fragments or derivatives thereof, antibody hinge regions, or fragments or derivatives thereof, antibody CH2 regions, antibody CH3 regions, artificial spacer sequences, or combinations thereof can be used.
  • IgG4 hinge As an extracellular spacer domain, (i) IgG4 hinge, CH2 and CH3 regions, (ii) IgG4 hinge region, (iii) IgG4 hinge and CH2, (iv) CD8a hinge region , (V) IgG1 hinge, CH2 and CH3 regions, (vi) IgG1 hinge region, or (vii) IgG1 hinge and CH2, or combinations thereof.
  • an IgG1 hinge region having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 can be preferably used, but is not limited thereto.
  • the IgG2 CH2 region has an amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11, and the CH3 region has an amino acid sequence (SEQ ID NO: 13) encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • SEQ ID NO: 12 amino acid sequence
  • CH3 region has an amino acid sequence (SEQ ID NO: 13) encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • Those having 14) can be preferably used.
  • the extracellular spacer domain can be the hinge, CH2, and CH3 regions of human IgG1 or a part thereof.
  • the extracellular spacer domain comprises (i) the human IgG1 hinge region alone (SEQ ID NO: 10), (ii) the human IgG1 hinge region (SEQ ID NO: 10) and CH2 region (SEQ ID NO: 12) and CH3.
  • a combination of regions SEQ ID NO: 14
  • a combination of human IgG1 hinge region SEQ ID NO: 10
  • CH3 region SEQ ID NO: 14
  • a CH3 region alone SEQ ID NO: 14
  • a spacer sequence represented by the formula (G4S) n can be used as an artificial spacer sequence used for an extracellular spacer domain.
  • one having SEQ ID NO: 15 can be preferably used.
  • a spacer having such a spacer sequence is sometimes called a peptide linker.
  • Peptide linkers preferably used in the art can be used as appropriate in the present invention. In this case, an appropriate peptide linker configuration and chain length can be selected as long as the function of the obtained CAR protein is not impaired.
  • the extracellular spacer domain can be a combination of the hinge region (SEQ ID NO: 10) of human IgG1 and the spacer sequence (SEQ ID NO: 15) of (G4S) 3.
  • the extracellular spacer domain can be appropriately selected from those exemplified above or further modified based on the common general technical knowledge in the art and used for the present invention.
  • the extracellular spacer domain is inserted into the vector by linking the base sequence encoding the amino acid sequence of each domain so that it can exist between the target binding domain and the transmembrane domain, and expressed in the host cell. Can do.
  • the extracellular spacer domain can be modified using a polynucleotide encoding a previously prepared plasmid CAR protein as a template.
  • the modification of the extracellular spacer domain can be achieved by, for example, improving the CAR gene expression rate in a host cell of a CAR-T cell into which a polynucleotide encoding CAR is introduced, signal transduction, cell aging, tumor distribution, antigen recognition or in This is useful when considering the effect on in vivo activity.
  • the CAR protein of the present invention is present on the cell membrane and comprises an extracellular domain comprising a target binding domain and optionally an extracellular spacer domain, a transmembrane domain, an intracellular signaling domain and optionally a costimulatory domain. Including domains.
  • a “transmembrane domain” is a domain having an affinity for the lipid bilayer constituting the cell membrane, whereas both the extracellular domain and the intracellular domain are hydrophilic domains. is there.
  • the transmembrane domain in GMR.CAR of the present invention is not particularly limited as long as the CAR protein can be present on the cell membrane and does not impair the functions of the target binding domain and the intracellular signal transduction domain. In some cases, a polypeptide derived from the same protein may serve as a transmembrane domain.
  • transmembrane domain for example, a transmembrane domain such as CD28, CD3 ⁇ , CD8 ⁇ , CD3, CD4, or 4-1BB can be used.
  • human CD28 (Uniprot No. IV: P10747 (153-179)) can be used as the transmembrane domain.
  • the one having the amino acid sequence (SEQ ID NO: 17) encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 (NCBI Accession No .: NM_006139.3 (679-759)) is preferably used as the transmembrane domain. be able to.
  • the CAR protein of the present invention can optionally contain a “costimulatory domain”.
  • Costimulatory domains specifically bind to costimulatory ligands, thereby causing costimulatory responses by cells such as, but not limited to, CAR-T cell proliferation, cytokine production, functional differentiation, and target cell death Is mediated.
  • the costimulatory domain is, for example, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), CD134 (OX40), Dap10, CD27, CD2, CD5, CD30, CD40, PD-1, ICAM-1, LFA-1 (CD11a / CD18), TNFR-1, TNFR-II, Fas, and Lck can be used.
  • human CD28 (Uniprot No .: P10747 (180-220)) or 4-1BB (GenBank: U03397.1) can be used as the costimulatory domain.
  • 4-1BB GenBank: U03397.1
  • the one having the amino acid sequence (SEQ ID NO: 19) encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 18 (NCBI Accession No .: NM_006139.3 (760-882)) is preferably used as the costimulatory domain. be able to.
  • the CAR protein of the present invention contains an “intracellular signaling domain”.
  • the intracellular signal transduction domain transmits signals necessary for exerting effector functions of immune cells.
  • intracellular signaling domains include, for example, human CD3 ⁇ chain, Fc ⁇ RIII, Fc ⁇ RI, cytoplasmic terminal of Fc receptor, cytoplasmic receptor having immunoreceptor tyrosine activation motif (ITAM) or their Combinations can be used.
  • ITAM immunoreceptor tyrosine activation motif
  • human CD3 ⁇ chain for example, nucleotides 299-637 of NCBI Accession No. NM_000734.3
  • intracellular signaling domain for example, nucleotides 299-637 of NCBI Accession No. NM_000734.3
  • one having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 21) encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20 can be suitably used as the intracellular signal transduction domain.
  • the target polynucleotide can be easily prepared according to a conventional method. It is possible to obtain a base sequence encoding an amino acid sequence from NCBI RefSeq ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ID indicating the amino acid sequence of each domain or GenBank Accession number, and the present invention using standard molecular biological and / or chemical procedures. Of polynucleotides can be made. For example, nucleic acids can be synthesized based on these base sequences, and the polynucleotide of the present invention can be prepared by combining DNA fragments obtained from a cDNA library using the polymerase chain reaction (PCR). be able to.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the polynucleotide encoding GMR.CAR of the present invention can be prepared by ligating polynucleotides encoding the respective domains described above, and GMR.CAR is introduced by introducing this polynucleotide into an appropriate cell. -T cells can be generated. GMR.CAR can also be produced by recombining the target binding domain in accordance with a conventional method using a polynucleotide encoding an existing CAR protein having the same component other than the target binding domain as a template.
  • one or more domains such as an extracellular spacer domain can be modified using an inverse PCR (iPCR) method or the like using a polynucleotide encoding an existing CAR protein as a template.
  • iPCR inverse PCR
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • a genetically modified cell into which a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (CAR) protein having an intracellular signaling domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 has been introduced can be used.
  • a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, and A chimeric antigen receptor having an extracellular spacer domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a transmembrane domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and an intracellular signaling domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • the above-mentioned “including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 and / or SEQ ID NO: 15” means the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15. Among them, it is meant to include any one or a combination of two or more. The same applies hereinafter.
  • Examples of the cells into which the polynucleotide is introduced include cells derived from mammals such as human-derived cells or T cells derived from non-human mammals such as monkeys, mice, rats, pigs, cows, and dogs. Can be used. For example, cells collected, isolated, purified and induced by blood (peripheral blood, umbilical cord blood, etc.), body fluid such as bone marrow, tissue or organ can be used.
  • mammals such as human-derived cells or T cells derived from non-human mammals such as monkeys, mice, rats, pigs, cows, and dogs.
  • blood peripheral blood, umbilical cord blood, etc.
  • body fluid such as bone marrow, tissue or organ can be used.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • immune cells dendritic cells, B cells, hematopoietic stem cells, macrophages, monocytes, NK cells or blood cells (neutrophils, basophils)
  • cord blood mononuclear cells Fibroblasts, preadipocytes, stem cells, skin keratinocytes, mesenchymal cells, fatty liver cells, various cancer cell lines or neural stem cells can be used.
  • cells that release cytotoxic proteins can be used.
  • T cells T cell progenitor cells (hematopoietic stem cells, lymphocyte progenitor cells, etc.), NK cells, NK-T cells, or cell populations containing these can be used.
  • various stem cells such as ES cells and iPS cells are included as cells that can differentiate into these cells.
  • T cells include CD8 positive T cells, CD4 positive T cells, regulatory T cells, cytotoxic T cells, or tumor infiltrating lymphocytes.
  • Cell populations containing T cells and T cell progenitor cells include PBMC.
  • the cells may be collected from a living body, expanded and cultured, or established as a cell line.
  • a cell expressing the produced CAR or a cell differentiated from the cell into a living body it is desirable to introduce a nucleic acid into the living body itself or a cell collected from the same kind of living body.
  • T cells into which polynucleotides are introduced for the genetically modified cells of the present invention and used for adoptive immunotherapy T cells that are expected to have a sustained antitumor effect, such as stem cell memory T cells, should be used. Can do. Analysis of stem cell memory T cells can be easily confirmed according to a conventional method, for example, according to the description of (Yang Xu, et al. Blood. 2014; 123: 3750-3759).
  • cells in which T cells transduced with a CAR expression plasmid are CD45R0 ⁇ , CD62L +, CD45RA + and CCR7 + can be used as cells into which the above polynucleotide is introduced.
  • At least 50% or more of the cells that are CD8 +, CD45RA +, CCR7 +, and CD62L + can be used as the cells into which the polynucleotide is introduced.
  • the method for introducing a polynucleotide for producing a genetically modified cell is not particularly limited as long as it is a commonly used method.
  • the vector that can be used is not particularly limited, and examples thereof include a lentivirus vector, a retrovirus vector, a foamy virus vector, and an adeno-associated virus vector.
  • a plasmid transposon can be used, such as sleeping beauty transposon system (for example, Huang X, Guo H, et al. Mol Ther. 2008; 16: 580-9; Singh H, Manuri PR, et al. Cancer Res. 2008; 68: 2961-71; Deniger DC, Yu J, et al.
  • a non-viral embodiment particularly a piggybac transposon system can be used. Specific examples are shown in the Examples.
  • a signal is transmitted into the cell and activated by inducing a receptor-specific immune response to the target cell expressing the GM-CSF receptor on the surface.
  • the activation of CAR-expressing cells varies depending on the type of host cell and the intracellular domain of the CAR, but can be confirmed using, for example, cytokine release, improved cell proliferation rate, changes in cell surface molecules, etc. as indicators . Release of cytotoxic proteins (perforin, granzyme, etc.) results in the destruction of cells expressing the receptor.
  • the present invention further provides a vector comprising a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (CAR) protein that specifically binds to human GM-CSF receptor.
  • the vector of the present invention can be suitably used for producing the above-described genetically modified cells of the present invention.
  • the cell expressing GMR.CAR of the present invention is desirably a cell having excellent safety. Although it is not particularly limited to be a cell having excellent safety, for example, it is desirable to allow a specific immune response against a target cell, for example, while not affecting normal hematopoietic stem cells. . In diseases involving bone marrow-related antigens, for example, myelosuppression is known as a serious side effect.
  • the cells that express GMR.CAR of the present invention are preferably cells that do not completely destroy bone marrow cells at doses at which cells expressing GMR.CAR kill target cells.
  • a cell expressing GMR.CAR that does not affect normal cells can be suitably used as the cell expressing GMR.CAR of the present invention.
  • the safety index is not particularly limited. For example, when the killing ability against the peripheral cells and / or bone marrow cells that are affected and the killing ability against tumor cells are compared with IC50 values, the ratio is sufficiently large. Can be confirmed as an indicator
  • the cell expressing GMR.CAR of the present invention can be used as a therapeutic agent for diseases. Therefore, the present invention provides a therapeutic agent for a disease involving GM-CSF receptor-expressing cells, comprising the above-described cells of the present invention.
  • the therapeutic agent contains cells expressing CAR protein as an active ingredient, and may further contain a suitable excipient.
  • the disease that is expected to be treated with the therapeutic agent of the present invention is not particularly limited as long as it is a disease that is sensitive to the cell. For example, a cell that expresses a GM-CSF receptor, particularly, a highly-expressed cell is related.
  • glioma glioma
  • neuroblastoma glioblastoma
  • brain tumor colorectal adenocarcinoma
  • kidney cancer melanoma
  • small cell lung cancer glioma
  • JMML juvenile myelomonocytic leukemia
  • AML acute myeloid leukemia
  • solid cancer is mentioned, for example, glioma (glioma), neuroblastoma, glioblastoma, brain tumor, colorectal adenocarcinoma, prostate cancer, kidney cancer, melanoma And small cell lung cancer.
  • the above-mentioned therapeutic agent when applied to solid cancer, it includes diseases in which GM-CSF receptor is expressed in cells forming the microenvironment of target cells, such as bone marrow-derived immunosuppressive cells (MDSCs) .
  • MDSCs bone marrow-derived immunosuppressive cells
  • the GM-CSF receptor is not expressed in the target cell, it can be used in combination with other therapeutic agents, for example, for the purpose of enhancing tumor cytotoxic activity.
  • “express GM-CSF receptor, especially highly expressed” means that the expression intensity is high (for example, the average fluorescence intensity (MFI) is high) and the expression rate (positive rate) May be intended to be high.
  • a cell having a high expression rate for example, it means a cell having a CD33 / CD116 expression rate (positive rate) of at least 40% or more. From the viewpoint of being uniformly expressed in tumor cells, cells with an expression rate of 80% or more are preferred. More preferably, it means a cell having an expression rate of 90% or more.
  • One embodiment of the therapeutic agent of the present invention is an anticancer agent against tumor cells that express the GM-CSF receptor.
  • the therapeutic agent or anticancer agent of the present invention can be used alone or in combination with drugs and / or treatments of different mechanisms.
  • the therapeutic agent of the present invention can be in the form of a pharmaceutical composition alone or in combination with other active ingredients.
  • the therapeutic agent or pharmaceutical composition of the present invention can be administered locally or systemically, and the dosage form is not limited.
  • the pharmaceutical composition may contain carriers, excipients, buffers, stabilizers and the like that are commonly used in the art depending on the dosage form. it can.
  • the dose of the therapeutic agent of the present invention varies depending on the patient's body weight, age, severity of disease, etc., and is not particularly limited.
  • the dose is 1 in the range of 0.0001 to 1 mg / kg body weight. It can be administered once to several times a day, every two days, every third day, every week, every two weeks, every month, every two months, or every three months.
  • One aspect of the therapeutic agent of the present invention relates to a method for conditioning a patient prior to cell transplantation, comprising administering to the patient an effective amount of cells containing CAR protein, which is a genetically modified cell of the present invention.
  • the cell transplant is a stem cell transplant.
  • stem cell transplantation hematopoietic stem cell transplantation (bone marrow transplantation, umbilical cord blood transplantation, peripheral blood stem cell transplantation) is preferably used.
  • One aspect of the therapeutic agent of the present invention includes reducing the number of GM-CSF receptor-expressing cells in a patient as conditioning the patient before cell transplantation.
  • the GM-CSF receptor-expressing cell in the patient is a GM-CSF receptor-expressing normal cell or a GM-CSF receptor-expressing cancer cell.
  • the conditioning in the patient may reduce both normal GM-CSF receptor expression and cancer cells before cell transplantation.
  • the pSL1190-CD19.CAR vector was prepared by ligating the fragment of anti-CD19 scFv (FMC63; Zola H. et al. Immunol Cell Biol. 1991; 69 (Pt6): 411-412) -CD28-CD3zeta.
  • the pSL1190-CD19.CAR vector was double digested with EcoRI and BamHI, and then the above-extracted human GM-CSF and IgG1 hinge sequences were ligated using a compatible site to prepare a pSL1190-GMR.CAR vector.
  • pIRII-CD19.CAR vector Human et al. Mol Ther 2011; 19 (12): 2239-2248
  • the GMR.CAR expression plasmid was obtained by ligating the fragment obtained by double digesting the vector with EcoRI and NotI (CAR 001).
  • FIG. 1 shows a vector map of CAR 001 produced.
  • mutant GMR.CAR expression plasmid (E21R, E21H, E21S, E21A)
  • a mutant GMR.CAR expression plasmid was prepared by inverse-PCR using CAR 001 as a template.
  • the 5 'PCR primer used for Inverse-PCR is the 21st glutamic acid (E) of GM-CSF polypeptide (SEQ ID NO: 1) arginine (R), histidine (H), serine (S) or alanine (A). And synthesized to be substituted (SEQ ID NOs: 23 to 26, consigned to Eurofin Genomics Co., Ltd.).
  • the 3 ′ primer was synthesized (SEQ ID NO: 27) having a design common to all mutants (consigned to Eurofin Genomics Co., Ltd.).
  • CAR-001 was adjusted to 50 ⁇ ng / ⁇ L and used as a template, and each PCR primer was adjusted so that its concentration in the reaction solution was 0.2 or 0.3 ⁇ M.
  • KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.) was used, and the reaction composition followed the protocol attached to the kit.
  • the reaction conditions were (i) 94 ° C. for 2 minutes, (ii) 98 ° C. for 10 seconds, (iii) 68 ° C. for 7 minutes, and (ii) and (iii) were repeated 10 cycles.
  • Each plasmid was purified from the cultured Escherichia coli culture solution using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) to confirm the base sequence, and the plasmids for which the substitution of the target base sequence was confirmed were CAR 002 (E21R GMR.CAR), CAR-004 (E21H-GMR.CAR), CAR-006- (E21S-GMR.CAR)-or CAR-008- (E21A-GMR.CAR).
  • Example 3 Construction of mutant GMR.CAR expression plasmid (E21K, E21D, E21F)
  • E21K, E21D, E21F 21st glutamic acid
  • SEQ ID NO: 1 21st glutamic acid (E) of the GM-CSF polypeptide (SEQ ID NO: 1) was substituted with lysine (K), aspartic acid (D) or phenylalanine (F)
  • E 21st glutamic acid
  • K lysine
  • D aspartic acid
  • F phenylalanine
  • XhoI-secretory signal sequence-GM-CSF variant-hinge sequence-DraIII with 5'-side cleaved by restriction enzyme XhoI and 3'-side cleaved by restriction enzyme DraIII Fragments were artificially synthesized (consigned to Eurofin Genomics).
  • This fragment was combined with a fragment obtained by treating CAR 001 with XhoI and DraIII to obtain CAR 003 (E21K GMR.CAR), CAR 005 (E21D GMR.CAR), or CAR 007 (E21F GMR.CAR).
  • mutant spacer modified GMR.CAR expression plasmid The mutant-type spacer-modified GMR.CAR expression plasmid was prepared by preparing a spacer-modified GMR.CAR expression plasmid and then incorporating the mutation using them as a template.
  • a GMR.CAR expression plasmid in which the extracellular spacer domain portion was modified using CAR 001 as a template was prepared by the inverse-PCR method. Specifically, CH2CH3 partial deletions (FIG. 2) and CH2CH3 partial deletions and (G4S) 3 insertions (FIG. 3), respectively, having vector maps shown in FIGS.
  • PCR primers used for Inverse-PCR are primers for CH2CH3 partial deletion (SEQ ID NOs: 28 and 29) and primers for CH2CH3 partial deletion and (G4S) 3 insertion (SEQ ID NOs: 30 and 31). ) Were designed and synthesized (consigned to Eurofin Genomics Co., Ltd.).
  • CAR-001 was adjusted to 50 ⁇ ng / ⁇ L and used as a template, and each PCR primer was adjusted so that its concentration in the reaction solution was 0.2 or 0.3 ⁇ M.
  • KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.) was used, and the reaction composition followed the protocol attached to the kit.
  • the reaction conditions were (i) 94 ° C. for 2 minutes, (ii) 98 ° C. for 10 seconds, (iii) 68 ° C. for 7 minutes, and (ii) and (iii) were repeated 10 cycles.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ (Toyobo Co., Ltd.) was transformed with each of the obtained circular plasmids and cultured on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin for about 16 hours.
  • Each plasmid was purified from the cultured E. coli culture solution using QIAprep (Spin Miniprep Kit (Qiagen) to confirm the nucleotide sequence, and the modified spacer-modified GMR.CAR expression plasmid in which the modification of the target nucleotide sequence was confirmed: CAR 009 (GMR.CAR dCH2CH3) and CAR 010 (GMR.CAR dCH2CH3 + (G4S) 3) were obtained.
  • FIGS. CH2CH3 partial deletion in which GM-CSF polypeptide (SEQ ID NO: 1) 21st E is replaced with R (FIG. 4), CH2CH3 partial deletion in which 21st E is replaced with K (FIG. 5), 21 CH2CH3 partial deletion with the E replaced with R and an insert of (G4S) 3 (Fig. 6) and CH2CH3 partial deletion with the 21st E replaced with K and an insertion of (G4S) 3 (Fig. 7) Was made.
  • PCR primers used for Inverse-PCR in this example were as follows: a primer for substituting E for R (SEQ ID NOs: 32 and 33) and a primer for substituting E for K (SEQ ID NOs: 34 and 33). Each was designed and synthesized (consigned to Eurofin Genomics Co., Ltd.).
  • CAR 009 and CAR 010 were adjusted to 50 ng / ⁇ L and used as a template, and each PCR primer was adjusted so that the concentration in the reaction solution was 0.2 or 0.3 ⁇ M.
  • KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.) was used, and the reaction composition followed the protocol attached to the kit.
  • the reaction conditions were (i) 94 ° C. for 2 minutes, (ii) 98 ° C. for 10 seconds, (iii) 68 ° C. for 7 minutes, and (ii) and (iii) were repeated 10 cycles.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ (Toyobo Co., Ltd.) was transformed with each of the obtained circular plasmids and cultured on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin for about 16 hours.
  • Each plasmid was purified from the cultured E. coli culture solution using QIAprep (Spin Miniprep Kit (Qiagen), the nucleotide sequence was confirmed, and the modified spacer modified GMR.CAR expression plasmid in which the modification of the target nucleotide sequence was confirmed: CAR 011 (E21R GMR.CAR dCH2CH3), CAR 012 (E21KGMR.CAR E dCH2CH3), CAR 013 (E21RGMR.CAR dCH2CH3 + (G4S) 3) and CAR 014 (E21KGMR.CAR dCH2CH3 + (G4S) 3+ (G4S) 3 acquired)
  • QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)
  • Example 5 Culture and amplification of GMR.CAR-T cells
  • ⁇ PBMC separation and non-specific stimulation OKT 3 blast production (Day 0)> Collect peripheral blood from healthy adult donors, dilute it twice with D-PBS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), overlay the diluted peripheral blood on Ficoll-Paque PLUS, and centrifuge at 400 xg for 30 minutes. And PBMCs were collected. The sorted PBMCs were washed twice with D-PBS and isolated by centrifugation. The isolated PBMC was suspended in TexMACS medium containing 5 ng / mL IL-15 so as to be 2 to 4 ⁇ 10 6 cells / well / 2 mL.
  • an antibody solid phase plate for restimulation of OKT3 Blast was prepared. Specifically, Anti-human CD3 antibody and Anti-human CD28 antibody prepared to 1- ⁇ g / mL with D-PBS are added to the flat bottom of a 24-well non-treatment plate at 500 ⁇ L / well and incubated at 4 ° C overnight. Thus, the antibody was solid-phased on the plate.
  • OKT3® blast that had been stimulated from Day 0 was temporarily not stimulated by transferring the antibody to a flat-bottom multi-well plate for 24-well cell culture without solid phase.
  • the supernatant was removed from the plate solid-phased on Day 4 and the OKT3 blast was added to initiate restimulation of the OKT3 blast with Anti-Human CD3 antibody and Anti-Human CD28 antibody. Re-stimulation was carried out until Day 7. During the period, medium exchange and addition of IL-15 were appropriately performed.
  • ⁇ Virus peptide pulse of PBMC (Day 0)> The isolated PBMC were stimulated with a viral peptide using a peptivator peptide pool (registered trademark, Miltenyi Biotech). Specifically, PBMC was suspended in a peptide pool supplemented with 0.05 ⁇ g / ⁇ L of AdV5 Hexon, CMV pp65, EBV BZLF1 and EBV EBNA-1 in 50 ⁇ L of D-PBS, respectively, and virus peptide stimulation was performed at 37 ° C. for 30 minutes. gave. After 30 minutes, an appropriate amount of D-PBS was added to PBMC for suspension, followed by UV irradiation for 4 minutes.
  • a peptivator peptide pool registered trademark, Miltenyi Biotech
  • TexMACS medium containing 10 ng / mL IL-7 and 5 ng / mL IL-15 to 0.5-6 x 10 6 cells / well / 2 mL And transferred to a 24-well treatment culture plate as feeder cells.
  • GMR.CAR expression vector (Day 0)> Mutant GMR.CAR expression plasmid CAR 002 (E21R GMR.CAR), CAR 003 (E21K GMR.CAR), CAR 004 (E21H GMR.CAR), CAR 005 (E21D GMR.CAR), CAR 006 (E21S GMR.CAR) ), CAR 007 (E21F GMR.CAR) or CAR 008 (E21A GMR.CAR) for introduction into PBMC, 5 ⁇ g of each CAR, 5 ⁇ g of pCMV-piggyBac plasmid, P3 Primary Cell 4D-Nucleofector TM X Kit (Lonza) 100 ⁇ L of P3 Primary Cell solution attached to Japan Co., Ltd. was mixed and added to 10 ⁇ 10 6 PBMCs.
  • ⁇ Amplification of CAR-T cells (Day 7)> Feeder cells 2 x peptide suspension and UV irradiation of OKT 3 blast prepared above in 30 mL of TexMACS medium containing 10 ng / mL IL-7 and 5 ng / mL IL-15 10 transferred 6 to G-Rex 10 filled with, was amplified GMR.CAR-T cells to Day 14. The expression rate of GMR.CAR-T cells amplified until Day 14 was measured by the following method.
  • the cells were washed with an appropriate amount of D-PBS, the cells were precipitated by centrifugation, the supernatant was removed, and the sample resuspended to an appropriate amount of D-PBS was then used with FACSCalibur (Becton Dickinson) Analysis was performed, and the expression rate of GMR.CAR was measured using IgG1 / CD3 positive or GM-CSF / CD3 positive as an index.
  • GMR.CAR-T cells obtained by electrical introduction into PBMC and culture / amplification of T cells using GMR.CAR expression plasmid (CAR 001) were designated as CAR-T 001.
  • CAR 002 E21R GMR.CAR
  • CAR 003 E21K GMR.CAR
  • CAR 004 E21H GMR.CAR
  • CAR 005 E21D GMR.CAR
  • CAR 006 E21S GMR.CAR
  • CAR 007 E21F GMR.CAR
  • GMR.CAR-T cells obtained by manipulation using the CAR 008 (E21A GMR.CAR) plasmid are respectively CAR-T 002 (E21R), CAR-T 003 (E21K), CAR-T 004 (E21H), CAR-T 005 (E21D), CAR-T 006 (E21S), CAR-T 007 (E21F),
  • Fig. 8 shows the expression analysis results on day 14 of CAR-T 001-008.
  • the GMR.CAR expression rate in each cell group is CAR-T 001: 20.89%, CAR-T-002 (E21R): 16.68%, CAR-T 003 (E21K): 15.94%, CAR-T 004 (E21H): 17.89%, CAR-T 005 (E21D): 19.83%, CAR-T 006 (E21S): 21.00%, CAR-T 007 (E21F): 20.47%, CAR-T 008 (E21A): 20.01%, Mock -The expression rate in T cells (5.66%) was high in all cases, and the mutant GMR.CAR-expressing T cells were successfully produced.
  • Example 6 Antitumor cell activity of GMR.CAR-T
  • THP-1 cells American Type Culture Collection (ATCC)
  • RPMI 1640 medium containing 10% FBS target (T)
  • T tumor cytotoxic activity
  • E effector
  • E: T ratio 1: 5
  • GMR.CAR-T cells were prepared at 1 ⁇ 10 5 cells / mL, and 500 ⁇ L / well was added to a 48-well treatment culture plate seeded with tumor cells. Added.
  • E: T ratio 1: 50
  • 1: 100 GMR.CAR-T cells were prepared to be 0.1 ⁇ 10 5 cells / mL or 0.05 ⁇ 10 5 cells / mL, respectively, and tumors The cells were added to a 48-well treatment culture plate seeded with cells at 500 ⁇ L / well.
  • the co-culture test was conducted for 5 days.
  • a similar co-culture test was performed for Mock-T cells, and a group in which only tumor cells were cultured at the same number of cells was set as a control group (CAR-T non-added group).
  • the sample added with 50 ⁇ L was analyzed using FACSCanto II (Becton Dickinson) and FLOWJO (Becton Dickinson), and the number of CD33 positive cells was calculated based on the counting beads.
  • the antitumor cell activity% of CAR-T 001 to CAR-T 008 and Mock-T cells was calculated by the following calculation formula.
  • Antitumor cell activity% 100 ⁇ (number of CD33 positive cells in the CAR-T added group) / (number of CD33 positive cells in the CAR-T non-added group) ⁇ 100
  • FIG. 9 shows the results of% anti-tumor cell activity of CAR-T 001 to CAR-T 008 against THP-1 cells.
  • CAR-T-002 to CAR-T 008 all showed anti-tumor cell activity against THP-1 cells equivalent to or higher than CAR-T 001.
  • Example 7 Culture and amplification of mutant spacer-modified GMR.CAR-T cells ⁇ PBMC separation and non-specific stimulation OKT 3 blast production (Day 0)> Collect peripheral blood from healthy adult donors, dilute it twice with D-PBS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), overlay the diluted peripheral blood on Ficoll-Paque PLUS, and centrifuge at 400 xg for 30 minutes. And PBMCs were collected. The sorted PBMCs were washed twice with D-PBS and isolated by centrifugation. The isolated PBMC was suspended in TexMACS medium containing 5 ng / mL IL-15 so as to be 2 to 4 ⁇ 10 6 cells / well / 2 mL.
  • an antibody solid phase plate for restimulation of OKT3 blast was prepared. Specifically, Anti-human CD3 antibody and Anti-human CD28 antibody prepared to 1 ⁇ g / mL with D-PBS are added to a flat bottom of a 24-well non-treatment plate at 500 ⁇ L / well and incubated at 4 ° C. overnight. Thus, the antibody was solid-phased on the plate. On the other hand, the OKT3 blast that had been stimulated from Day 0 was temporarily not stimulated by transferring the antibody to a flat-bottom multiwell plate for 24-well cell culture without solid phase.
  • the supernatant was removed from the plate solid-phased on Day 4 and the OKT3 blast was added to initiate restimulation of the OKT3 blast with Anti-Human CD3 antibody and Anti-Human CD28 antibody. Re-stimulation was carried out until Day 7. During the period, medium exchange and addition of IL-15 were appropriately performed.
  • ⁇ Virus peptide pulse of PBMC (Day 0)> The isolated PBMC were stimulated with a viral peptide using a peptivator peptide pool (registered trademark, Miltenyi Biotech). Specifically, PBMC was suspended in a peptide pool supplemented with 0.05 ⁇ g / ⁇ L of AdV5 Hexon, CMV pp65, EBV BZLF1 and EBV EBNA-1 in 50 ⁇ L of D-PBS, respectively, and virus peptide stimulation was performed at 37 ° C. for 30 minutes. gave. After 30 minutes, an appropriate amount of D-PBS was added to PBMC for suspension, followed by UV irradiation for 4 minutes.
  • a peptivator peptide pool registered trademark, Miltenyi Biotech
  • TexMACS medium containing 10 ng / mL IL-7 and 5 ng / mL IL-15 to 0.5-6 x 10 6 cells / well / 2 mL And transferred to a 24-well treatment culture plate as feeder cells.
  • ⁇ Amplification of CAR-T cells (Day 7)> The total amount of the cell suspension was obtained from feeder cells 2 to which OKT 3 blast prepared above was subjected to peptide pulse and UV irradiation in 30 mL of TexMACS medium containing 10 ng / mL IL-7 and 5 ng / mL IL-15. The cells were transferred to G-Rex 10 packed with 10 ⁇ 10 6 cells, and GMR.CAR-T cells were amplified until Day 14. The expression rate of GMR.CAR-T cells amplified until Day 14 was measured by the following method.
  • the cells were washed with an appropriate amount of D-PBS, the cells were precipitated by centrifugation, the supernatant was removed, and the samples resuspended in an appropriate amount of D-PBS were analyzed using FACSCantoII (Becton Dickinson Co., Ltd.) and FLOWJO ( And the expression rate of GMR.CAR was measured using GM-CSF / CD3 positive as an index.
  • FACSCantoII Becton Dickinson Co., Ltd.
  • FLOWJO And the expression rate of GMR.CAR was measured using GM-CSF / CD3 positive as an index.
  • GMR.CAR-T cells obtained by electrical introduction into PBMC and T cell culture / amplification using expression plasmids (CAR 001 and CAR 009 to CAR 014) -A, CAR-T 009, CAR-T 010, CAR-T 011, CAR-T 012, CAR-T 013, and CAR-T 014.
  • Fig. 10 shows the expression analysis results of CAR-T 001-A and CAR-T 099 to CAR-T 014 on day 14.
  • GMR.CAR expression rates were CAR-T 001-A: 28.0%, CAR-T 009: 31.7%, CAR-T 010: 31.0%, CAR-T 011: 30.1%, CAR-T 012: 31.7%, CAR-T 013: 35.4%, CAR-T 014: 30.7%, both of which are higher than the expression rate of 0.54% in Mock-T cells, and successfully produced GMR.CAR-expressing T cells with different spacer sites .
  • the produced GMR.CAR-expressing T cells were diluted with Mock-T cells, so that the expression rate was adjusted to 28.0%. Antitumor cell activity and safety were evaluated in the following examples.
  • Example 8 Antitumor cell activity of mutant spacer modified GMR.CAR-T
  • THP-1 cells American Type Culture Collection (ATCC)
  • RPMI 1640 containing 10% FBS so that the THP-1 cells [target (T)] are 4 ⁇ 10 5 cells / mL. It was prepared in a medium (Thermo Fisher Scientific) and seeded on a 48-well treatment culture plate at 500 ⁇ L / well (the number of cells in the well is 2.0 ⁇ 10 5 cells).
  • CAR-T 001-A and CAR-T 009 to CAR-T 014 [Effector (E)] were diluted with RPMI 1640 medium containing 10% FBS so that E: T ratios were 1:25 and 1: 125. That is, when the E: T ratio was 1:25, CAR-T was prepared to be 0.16 ⁇ 10 5 cells / mL and added to a 48-well treatment culture plate seeded with tumor cells at 500 ⁇ L / well ( The number of CAR-T cells in the well is 0.08 ⁇ 10 5 ).
  • T ratio of 1: 125 it was prepared to be 0.032 x 10 5 cells / mL and added to a 48-well treatment culture plate seeded with tumor cells at 500 ⁇ L / well (in the wells).
  • the number of CAR-T cells is 0.016 x 10 5 ).
  • FIG. 11 shows the results of% anti-tumor cell activity of CAR-T 001-A, CAR-T 009 to CAR-T 014 and Mock-T cells against THP-1 cells.
  • CAR-T 009 to CAR-T 014 all showed an antitumor cell activity against THP-1 cells that was equal to or higher than that of CAR-T 001-A.
  • Example 9 Sustainability evaluation of mutant spacer modified GMR.CAR-T antitumor cell activity
  • CAR-T cells that are expected to be effective in adoptive immunotherapy are required to have sustained cytotoxic activity. Therefore, the following experiment was conducted to evaluate the persistence of anti-tumor cell activity of GMR.CAR-T.
  • GMR.CAR expression rates were CAR-T 010-A: 26.2%, CAR-T 011-A: 27.6%, CAR-T 012-A: 18.5%, CAR-T 013-A: 29.8%, CAR-T T014-A: 26.9%, which is higher than the expression rate (0.50%) in Mock-T cells, and successfully produced GMR.CAR-expressing T cells with different spacer sites.
  • the prepared GMR.CAR-expressing T cells were diluted with Mock-T cells, and the expression rate was adjusted to 18.5%, and continuous antitumor cell activity was evaluated.
  • THP-1, MV4-11, Kasumi-1 cells (American Type Culture Collection (ATCC)) and shinAML-1 cells (cell lines established from AML patients at Shinshu University Hospital) Prepare tumor cells [Target (T)] in RPMI 1640 medium (Thermo Fisher Scientific) containing 10% FBS to 5 x 10 5 cells / mL, and seed them in a 48-well treatment culture plate at 500 ⁇ L / well (The number of tumor cells in the well is 2.5 ⁇ 10 5 ).
  • CAR-T 010-A to 014-A [Effector (E)] was diluted with RPMI 1640 medium containing 10% FBS so that the E: T ratio was 1: 1. That is, CAR-T was prepared at 5 ⁇ 10 5 cells / mL and added to a 48-well treatment culture plate in which each tumor cell was seeded at 500 ⁇ L / well (the number of CAR-T cells in the well was 2.5 x 10 will be 5 ). Prepare two wells for each group. One well is for “analysis” at FACSCanto II (Becton Dickinson Co., Ltd.), and the other well is for “continuation” for addition to new tumor cells in the next term. Using.
  • the co-culture test as Term 1 was conducted for 4 days. A similar co-culture test was performed on Mock-T cells into which no gene was introduced, and a group in which only tumor cells were cultured at the same number of cells was also set as a control group (CAR-T non-added group).
  • the next term 2 was advanced. Specifically, 2 wells of tumor cells previously seeded at 2.5 ⁇ 10 5 cells / 500 ⁇ L / well were prepared, and the culture solution co-cultured as “continuation” with Term 1 was added to 500 ⁇ L / well. Wells were added in equal aliquots and further co-cultured for 4 days. This operation was repeated with a culture period of 4 days or 3 days. In addition, it was decided not to proceed to the next term for the group in which the number of tumor cells increased compared to the time when co-culture was started.
  • FIGS. 13 to 17 show the results of antitumor cell activity evaluation on the 4th, 8th, 12th, 15th, 19th and 22nd days, respectively, when targeting each tumor cell. It was confirmed that CAR-T 010-A to CAR-T ⁇ ⁇ 014-A have a continuous killing effect against any tumor cell line.
  • GMR.CAR-T cells (CAR-T 001-B and CAR-T 009-B to CAR-T 014-B) used in this example were newly prepared by the following method.
  • the total amount of cells was transferred to Nucleocuvette, and electrical gene transfer was performed by 4D-Nucleofection (Program No: FI-115).
  • Cells subjected to electrical gene transfer are allowed to stand at room temperature for 10 minutes, coated with D-PBS containing anti-CD28 antibody at 37 ° C for 2 hours, and then added to a 24-well non-treat culture plate containing feeder cells. The culture was started. As Mock-T cells not subjected to gene transfer operation, 1 to 20 ⁇ 10 6 cells were cultured in the same manner. On Day 3, the cells were transferred from the 24-well non-treatment plate to the 24-well treatment culture plate, and the culture was continued.
  • TexMACS ⁇ medium containing double volume that is, 20 ng / mL IL-7 and 10 ng / mL IL-15.
  • Mock-T cells were continuously cultured on a 24-well treatment culture plate, and medium exchange and amplification were performed depending on the degree of cell proliferation.
  • GMR.CAR expression rates were CAR-T 001-B: 45.9%, CAR-T 009-B: 37.2%, CAR-T 010-B: 42.4%, CAR-T 011-B: 46.4%, CAR-T T 012-B: 41.1%, CAR-T 013-B: 48.3%, CAR-T 014-B: 51.2%, both higher than the expression rate of 0.56% in Mock-T cells, GMR.CAR We succeeded in producing expressed T cells.
  • PMN polymorphonuclear leukocytes
  • PBMC peripheral blood from a healthy adult donor, dilute it twice with D-PBS, overlay the diluted peripheral blood on polymorph prep (AXS), centrifuge at 450 xg for 35 minutes, and add PMN and PBMC. Sorted. The collected PMN and PBMC were washed twice with D-PBS and isolated by centrifugation.
  • a co-culture test with isolated PMN, PBMC, and tumor cell line MV4-11 was performed.
  • PMN, PBMC, and MV4-11 [Target (T)] were prepared in RPMI 1640 medium (Thermo Fisher Scientific) containing 10% FBS so that the concentration would be 2 x 10 5 cells / mL.
  • Treatment culture plates were seeded at 500 ⁇ L / well (the number of cells in the well is 1 ⁇ 10 5 cells).
  • CAR-T is prepared to be 0.2 ⁇ 10 5 cells / mL, and 500 ⁇ L is added to a 48-well treatment culture plate seeded with PMN, PBMC, or MV4-11. (The number of CAR-T cells in the well was 0.1 ⁇ 10 5 cells).
  • ⁇ Co-culture test with PMN> The co-culture test was conducted for 3 days. A similar co-culture test was performed for Mock-T cells, and a group in which PMN was cultured with the same number of cells was also set as a control group (CAR-T non-added group). On the third day of the co-culture test, the cells in each well were collected, and the centrifuged cells were FITC Anti-Human CD3 antibody (Biolegend) 0.1 ⁇ L, PE Anti-Human GM-CSF antibody (Miltenyi Biotech) 5 ⁇ L, APC Anti-Human CD11b antibody (biolegend) 0.1 ⁇ L was added and suspended, followed by antibody labeling reaction at 4 ° C. for 20 minutes in the dark.
  • the cells in each well were collected and centrifuged into 0.1 ⁇ L FITC Anti-Human CD3 antibody, 5 ⁇ L PE Anti-Human GM-CSF antibody, 0.1 ⁇ L APC Anti-Human CD11b antibody Pacific blue Anti- Human CD16 antibody (biolegend) 0.1 ⁇ L and APC-cy7 Anti-Humn CD19 antibody (biolegend) 0.1 ⁇ L were added and suspended, followed by antibody labeling reaction at 4 ° C. for 20 minutes in the dark.
  • ⁇ Co-culture test with MV4-11> The co-culture test was conducted for 3 days. A similar co-culture test was performed for Mock-T cells, and a group in which MV4-11 was cultured at the same number of cells was also set as a control group (CAR-T non-added group). On day 3 of the co-culture test, the cells in each well were collected, suspended in 5 ⁇ L of APC Anti-Human CD33, FITC Anti-Human CD3 0.2 ⁇ L, and PE Anti-Human GM-CSF in the centrifuged cells. The antibody labeling reaction was carried out at 20 ° C. for 20 minutes in the dark.
  • FIG. 19 shows the relative ratio of the number of viable tumor cells when targeting MV4-11 at an E: T ratio of 1: 1 and 1:10, and the relative ratio of viable cells when targeting peripheral blood cells PMN and PBMC.
  • CAR-T 001-B and CAR-T009-B to CAR-T014-B both kill almost all tumors with an E: T ratio of 1: 1, while B cells, NK cells, and neutrophils ( It did not affect peripheral blood cells such as neutrophil.
  • E: T ratio of 1:10 neither CAR-T 001-B nor CAR-T 009-B to CAR-T 014-B killed tumors or peripheral blood cells.
  • CAR-T 001-B and CAR-T 009-B to CAR-T 014-B have an effect on peripheral blood cells such as B cells, NK cells, and neutrophils in terms of the number of tumor killing cells. Not shown.
  • Example 11 Effect of GMR.CAR-T on bone marrow cells
  • CD34 positive fraction (Veritas) target (T)] of bone marrow cells derived from healthy subjects is 10% FBS, 20 ng / mL IL-3, SCF so that the target is 1 x 10 4 cells / mL And TPO-containing RPMI 1640 medium (Thermo Fisher Scientific).
  • RPMI 1640 medium containing 10% FBS, 20 ng / mL IL-3, SCF and TPO (Thermo Fisher Scientific) so that MV4-11 [Target (T)] is 6 x 10 3 cells / mL. It was prepared with.
  • the prepared target cells were seeded in a 96-well round bottom plate at 50 ⁇ L / well.
  • CAR-T 001-A and CAR-T 009 to CAR-T 014 [effector (E)] were added to the CD34-positive fraction of bone marrow cells derived from healthy individuals.
  • the effector and the target were co-cultured in a 96-well round bottom plate in RPMI-1640 medium containing 100 ⁇ L / well, 10% FBS, 10 ⁇ ng / mL IL-3, SCF and TPO at the above E: T ratio. .
  • Co-culture was performed for 2 days. The same co-culture test was performed on Mock-T cells that had not undergone gene transfer, and as a control group, only the CD34 positive fraction of normal bone marrow cells or only MV4-11 were cultured at the same number of cells. A group was also set (CAR-T non-added group).
  • FIG. 20 shows a sigmoid curve drawn from the points plotted at each E: T ratio when targeting a CD34 positive fraction of bone marrow cells derived from a healthy person.
  • the plots were plotted using 3 well average values except for the control group, and 6 well average values for the control group.
  • FIG. 22 shows the IC50 value calculated from FIG. 20, the EC50 value calculated from FIG. 21, and the safety range calculated from them. As a result, it was CAR-T 014 that had the greatest safety margin against the highly affected myeloid system.
  • Example 12 Effect 1 of GMR.CAR-T in vivo
  • an electrical introduction operation into PBMC and a T cell culture / amplification operation were carried out to newly produce GMR.CAR-T cells.
  • Prepared (CAR-T 009-C, CAR-T 011-C and CAR-T 012-C).
  • the expression analysis results on day 14 of CAR-T 009-C, CAR-T 011-C and CAR-T 012-C used in this example are shown in FIG.
  • the GMR.CAR expression rates were CAR-T 009-C: 25.7%, CAR-T 011-C: 32.1%, and CAR-T 012-C: 25.2%, respectively.
  • mice were 7-week-old female NSG mice NOD.Cg-Prkdc ⁇ scid> Il2rg ⁇ tm1Wjl> / SzJ (Nippon Charles River), delivered at 6 weeks of age, and acclimated for 6 days before use.
  • the THP-1 cell line was suspended in 150 ⁇ L of D-PBS at 1 ⁇ 10 6 cells / mouse and administered to the NSG mice via the jugular vein under isoflurane anesthesia.
  • CAR-T cells on day 16 of culture were suspended in 150 ⁇ L of D-PBS so that total T cells were 5 ⁇ 10 6 cells / mouse, and were administered to NSG mice from the jugular vein under isoflurane anesthesia.
  • mice were observed every 1-2 days until day 148, Kaplan-Meier analysis was performed, and statistical analysis was performed using Log-rank (Cochran-Mantel-Haenszel) tests. In addition, the state of the mouse was observed, and the mouse judged to have reached the humanitarian endpoint set below was euthanized and killed. Humanitarian endpoints: ⁇ Drag the lower limb ⁇ The diameter of the mass becomes 20 mm ⁇ Weight will decrease by 25% or more in 7 days.
  • Example 13 Effect 2 of GMR.CAR-T in vivo
  • the expression plasmid CAR 009 to CAR 014
  • electrical introduction into PBMC and T cell culture / amplification were performed to newly produce GMR.CAR-T cells ( CAR-T 009-D to CAR-T 014-D).
  • the expression analysis results on day 14 of CAR-T 009-D to CAR-T 014-D used in this example are shown in FIG.
  • GMR.CAR expression rates were CAR-T 009-D: 33.3%, CAR-T 010-D: 39.6%, CAR-T 011-D: 35.1%, CAR-T 012-D: 37.4%, CAR-T T013-D: 43.0%, CAR-T 014-D: 40.9%.
  • the number of CAR positive cells was calculated from the obtained expression rate and the number of cells, so that 1.2 ⁇ 10 6 CAR positive cells were administered to each group.
  • the following in vivo experiment was conducted as in Example 12. Using 8-week-old female NSG mice, they were acclimatized for 13 days after delivery at the age of 6 weeks, and then used for experiments.
  • the MV4-11 cell line was suspended in 150 ⁇ L of D-PBS at 1 ⁇ 10 6 cells / mouse and administered to the NSG mice via the jugular vein under isoflurane anesthesia.
  • the CAR-T cells cultured on the 16th day were suspended in 150 ⁇ L of D-PBS so that CAR positive cells were 1.2 ⁇ 10 6 cells / mouse, and were administered to NSG mice from the jugular vein under isoflurane anesthesia.
  • mice were observed every 1-2 days until day 116, Kaplan-Meier analysis was performed, and statistical analysis was performed using Log-rank (Cochran-Mantel-Haenszel) tests. In addition, the state of the mouse was observed, and the mouse judged to have reached the humane endpoint as in Example 12 was euthanized and died. In addition, using a hematocrit capillary tube (Tokyo Glass Instruments) coated with EDTA-2K on Day 52, blood is collected at about 100 ⁇ L, and quantitative PCR (MLL-AF4 chimeric mRNA quantification (SRL)) by consignment work is performed to measure tumor cells in the blood. The remaining amount was quantified.
  • MLL-AF4 chimeric mRNA quantification SRL
  • Example 14 Effect 3 of GMR.CAR-T in vivo
  • electrical introduction into PBMC and T cell culture / amplification were performed using expression plasmids (CAR 001 and CAR 014) to newly produce GMR.CAR-T cells ( CAR-T 001-C and CAR-T 014-F) were newly produced.
  • CD19.CAR-T was obtained using the CH2CH3-free CD19.CAR plasmid described in Morita.et.al.Molecular Therapy: Methods & Clinical Development Vol. 8 March 2018. It produced similarly.
  • the expression analysis results on day 14 of CAR-T 001-C and CAR-T 014-F used in this example are shown in FIG.
  • the GMR.CAR expression rates were CAR-T 001-C: 32.3% and CAR-T 014-F: 14.1%, respectively.
  • the number of CAR positive cells was calculated from the obtained expression rate and the number of cells so that the number of CAR positive cells administered to each group was 0.7 ⁇ 10 6 .
  • the following in vivo experiment was conducted as in Example 12. Using 7-week-old female NSG mice, they were acclimatized for 6 days after delivery at the age of 6 weeks, and then used for experiments.
  • the MV4-11 cell line was suspended in 150 ⁇ L of D-PBS at 1 ⁇ 10 6 cells / mouse and administered to the NSG mice via the tail vein without anesthesia.
  • CAR-T cells on day 16 of culture were suspended in 150 ⁇ L of D-PBS so that CAR positive cells were 0.7 ⁇ 10 6 cells / mouse and administered to the NSG mice via the tail vein without anesthesia.
  • Kaplan-Meier analysis was performed by observing the condition of mice every day or day until day 105, and statistical analysis was performed by Log-rank (Cochoran-Mantel-Haenszel) tests. In addition, the state of the mouse was observed, and the mouse judged to have reached the humane endpoint as in Example 12 was euthanized and died.
  • Example 15 Expression analysis of GMR ⁇ (CD116) on tumor cell surface
  • the expression rate of GMR ⁇ (CD116) on the cell surface of the tumor cell line used for antitumor cell activity evaluation in the above Examples was analyzed by flow cytometry.
  • AML Acute myeloid leukemia
  • THP-1 Acute myeloid leukemia
  • Kasumi-1 Kasumi-1
  • shinAML-1 acute myeloid leukemia
  • MV4-11 were analyzed. Specifically, 1 to 2 ⁇ 10 5 cells were collected, suspended by adding 5 ⁇ L of APC Anti-Human CD116 antibody (Miltenyi Biotech) and 5 ⁇ L of PE Anti-Human CD33 antibody (Miltenyi Biotech), The antibody labeling reaction was performed for 20 minutes at 4 ° C. in the dark.
  • the cells were washed with an appropriate amount of D-PBS, the cells were precipitated by centrifugation, the supernatant was removed, and the samples resuspended in an appropriate amount of D-PBS were analyzed using FACSCalibur, and the CD33 / CD116 The expression rate was measured.
  • Table 1 shows the expression rate of CD33 / CD116 on the surface of each tumor cell.
  • CD33 / CD116 positive rate was 90% or more in all of THP-1, Kasumi-1, shinAML-1, and MV4-11.
  • Example 16 Phenotype analysis of T cells expressing GMR.CAR
  • GMR.CAR-T cells were newly prepared by carrying out electrical introduction into PBMC and culture / amplification of T cells using expression plasmid CAR 014 (CAR-T 014- E).
  • CAR-T 014- E expression plasmid CAR 014
  • the expression analysis result of CAR-T 014-E on day 14 is shown in FIG.
  • the GMR.CAR expression rate was 9.75%, which was higher than the expression rate in Mock-T cells (1.75%), and GMR.CAR-expressing T cells were successfully produced.
  • the number of GMR.CAR-expressing T cells prepared was counted, and the phenotype of GMR.CAR-T cells was evaluated by flow cytometric analysis of 1 ⁇ 10 6 cells.
  • Fc receptor blocking treatment was performed, and then BB515 Mouse AntiHuman CD197 antibody (Becton Dickinson Corporation), PE Mouse Aniti-Human CD27 Antibody (Becton Dickinson Corporation), APC Mouse Anti-Human CD62L Antibody (Becton Dickinson Corporation), APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RO Antibody (Becton Dickinson Corporation) ), Brilliant Violet421 Mouse Anti-Human CD56 Antibody (Becton Dickinson), BV510 Mouse Anti-Human CD8 Antibody (Becton Dickinson), BV605 Mouse Anti-Human CD45RA Antibody (Becton Dickinson),
  • the cells were washed with an appropriate amount of 3% FBS-containing D-PBS, and the cells were precipitated by centrifugation, the supernatant was removed, and then the sample was resuspended in an appropriate amount of 3% FBS-containing D-PBS.
  • -Dickinson Co., Ltd. and FLOWJO (Becton Dickinson Co., Ltd.), and the phenotype of GMR.CAR was analyzed using CD3 positive and CD45RA / CD62L positive or CD3 positive and CD45RA / CD197 positive as indicators.
  • more than 60% of the prepared GMR.CAR-expressing T cells were stem cell memory T cells.
  • the present invention provides CAR-T cells that specifically bind human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) receptor to target cells that express on the cell surface and impart excellent cytotoxic activity. Is done.
  • the cells of the present invention can be used for adoptive immunotherapy for diseases such as AML. All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

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Abstract

優れた標的細胞傷害性を有する変異型キメラ抗原受容体（CAR）発現細胞の作製。　ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞であって、前記標的結合ドメインが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換された変異体である、上記改変細胞を提供する。

Description

遺伝子改変細胞及びその作製方法
　本発明は、養子免疫療法の分野において有用な、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変細胞及びその作製方法に関する。
　さらに詳しく述べれば、本発明は、優れた標的細胞傷害性を有する、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体特異的な変異型キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞及びこれらの作製方法及び医薬用途等に関する。
　腫瘍関連抗原を標的とするキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor : CAR）を発現させたT細胞（CAR-T）を使用した養子免疫療法は抗腫瘍効果が強力であることが報告され、近年開発が急速に進んでいる。特にB細胞上に発現しているCD19は造血幹細胞に発現せず、B系列腫瘍細胞に発現しているため、養子免疫療法の理想的な標的である。そのため、B細胞腫瘍への治療を目的としたCARの開発が進んでおり、臨床試験においても著効を示し、高い注目を集めている。
　一方、他の腫瘍細胞へのCAR-T療法の開発は途上である。例えば、若年性骨髄単球性白血病（JMML）あるいは急性骨髄性白血病（AML）は、予後不良な白血病として知られており、CAR-T療法の開発が期待される。これまでにCD33, CD123等を標的として臨床試験が行われている。また、若年性骨髄単球性白血病（JMML）あるいは急性骨髄性白血病（AML）の腫瘍細胞表面にGM-CSF受容体が高発現していることに着目したGM-CSF受容体特異的キメラ抗原受容体（以下、GMR.CAR）が報告されている（非特許文献１、２）。しかしながら、AMLに対するCAR-T療法は、臨床的に有効なものは未だ見出されておらず、腫瘍細胞を生体に生着した動物実験においても十分な効果は認められていない（非特許文献３、４）。JMMLあるいはAMLに対するCAR-T療法の開発が進まない理由として、例えば、標的抗原の選択が困難である点が挙げられる。
　骨髄系抗原をCAR-T療法の標的抗原とする場合、腫瘍細胞だけでなく、正常な骨髄球系細胞や樹状細胞などにも発現しており、on-target/off-tumor反応による問題が生じ得ることが知られている（非特許文献３、４、５）。そのため、前記疾患に対する新規標的抗原の探索と安全かつ生体内で優れた効果を有するCARの提供が求められている。
Journal of Hematology & Oncology, 2016, 9:27, DOI 10.1186/s13045-016-0256-3 The 22nd Annual Meeting JSGCT2016: Japan Society of Gene and Cell Therapy Program and Abstracts, 2016. 07. 13, P0-70 Journal of Hematology & Oncology, 2017, 10:151, DOI 10.1186/s13045-017-0519-7 Blood, 2013, 122(18), 3138-3148 Blood Cancer Journal, 2016, 6, e458; doi: 10.1038/bcj.2016.61
　上記の通り、骨髄系抗原等を標的とするCAR-T技術は未だ開発途上であり、安全性が高く、生体内での優れた効果を奏するCARの開発が望まれている。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した。その結果、標的結合ドメインとしてGM-CSFポリペプチドのアミノ酸残基第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換された変異型GM-CSFを標的結合ドメインとして用いたGM-CSF受容体特異的な変異型キメラ抗原受容体（以下、「変異型GMR.CAR」と記載する）を遺伝子導入したT細胞（以下、「変異型GMR.CAR-T細胞」と記載する）が、AML等の治療において優れた細胞傷害活性と安全性を兼ね備えていることを見出した。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］　ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞であって、前記標的結合ドメインが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換された配列を有する変異体ポリペプチドである、上記改変細胞。
［２］　GM-CSF受容体に結合するCARタンパク質を細胞膜上に発現する、上記［１］記載の細胞。
［３］　CARタンパク質が、更に共刺激ドメイン及び／又は細胞外スペーサードメインを含む、上記［１］又は［２］に記載の細胞。
［４］　細胞内シグナル伝達ドメインがヒトCD3ζである、上記［１］～［３］のいずれか記載の細胞。
［５］　共刺激ドメインがヒトCD28又はヒト4-1BBである、上記［３］又は［４］記載の細胞。
［６］　細胞外スペーサードメインがヒトIgG1のヒンジ、CH2、及び／又はCH3領域若しくはその一部、及び／又は人工スペーサー配列を含む、上記［３］～［５］のいずれか記載の細胞。
［７］　標的結合ドメインが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸がアルギニン又はリシンに置換された配列を有する変異体ポリペプチドである、上記［１］～［６］のいずれか記載の細胞。
［８］　ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターを用いて細胞に導入することを含む、CARタンパク質発現細胞の作製方法であって、前記タンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、上記方法。
［９］　ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記タンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、上記ベクター。
［１０］　上記［１］～［７］のいずれか記載の細胞を含む、GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患に対する治療剤。
［１１］　上記［１０］記載の治療剤と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
［１２］　GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患が、若年性骨髄単球性白血病（JMML）、急性骨髄性白血病（AML）、神経膠腫（グリオーマ）、神経芽細胞腫、膠芽腫、脳腫瘍、直腸結腸腺がん、前立腺がん、腎臓がん、メラノーマ及び肺小細胞がんから選択される、上記［１０］記載の治療剤又は上記［１１］記載の組成物。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-050266号の開示内容を包含する。
　本発明のGMR.CAR-T細胞は、急性骨髄性白血病（AML）を始めとする、GM-CSF受容体を細胞表面に発現している種々の細胞を標的とした養子免疫療法において、安全性に優れ、かつ強力な腫瘍細胞傷害作用を示す。
CAR001のベクターマップを示す。 スペーサードメインを改変したGMR.CAR(CH2CH3部分欠失体、GMR.CAR dCH2CH3)のベクターマップの例を示す。 スペーサードメインを改変したGMR.CAR(CH2CH3部分欠失-(G4S)3挿入体、GMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)のベクターマップの例を示す。 スペーサードメインを改変した(E21R)GMR.CAR(CH2CH3部分欠失体、E21RGMR.CAR dCH2CH3)のベクターマップの例を示す。 スペーサードメインを改変した(E21K)GMR.CAR(CH2CH3部分欠失体、E21KGMR.CAR dCH2CH3)のベクターマップの例を示す。 スペーサードメインを改変した(E21R)GMR.CAR(CH2CH3部分欠失-(G4S)3挿入体、E21RGMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)のベクターマップの例を示す。 スペーサードメインを改変した(E21K)GMR.CAR(CH2CH3部分欠失-(G4S)3挿入体、E21KGMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)のベクターマップの例を示す。 CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 001～CAR-T 008)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。 CAR-T 001～CAR-T 008のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性％を示す。 CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 001-A、CAR-T 009～CAR-T 014)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。 CAR-T 001-A及びCAR-T 009～CAR-T 014のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性％を示す。 CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 010-A～CAR-T 014-A)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。 CAR-T 010-A～CAR-T 014-AのTHP-1細胞に対するE:T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 010-A～CAR-T 014-AのMV4-11細胞に対するE:T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 010-A～CAR-T 014-AのKasumi-1細胞に対するE:T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 010-A～CAR-T 014-AのshinAML-1細胞に対するE:T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 図１３～１６におけるウェル内の腫瘍細胞数を示す。 CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 001-B及びCAR-T 009-B～CAR-T 014-B)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。 E:T比1:1及び1:10におけるMV4-11細胞に対する腫瘍生存細胞数相対比と末梢血細胞に対する生存細胞数相対比を示す。 健常人由来骨髄細胞に対する各E:T比でプロットした点から描いたシグモイド曲線を示す。 MV4-11細胞に対する各E:T比でプロットした点から描いたシグモイド曲線を示す。 図２０より算出したIC50値、図２１より算出したEC50値を基に算出した安全域を示す。 CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 009-C、CAR-T 011-C及びCAR-T 012-C)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。 CAR-T 009-C、CAR-T 011-C及びCAR-T 012-CのTHP-1担癌マウスモデルにおける実験結果を示す。 CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 009-D～CAR-T 014-D)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。 CAR-T 009-D、CAR-T 011-D及びCAR-T 012-DのMV4-11担癌マウスモデルにおける実験結果を示す。 CAR-T 010-D、CAR-T 013-D及びCAR-T 014-DのMV4-11担癌マウスモデルにおける実験結果を示す。 CAR-T 009-D～CAR-T 014-Dのday52の末梢血中腫瘍の定量PCRの結果を示す。（NDは検出不能を示す） CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 001-C、CAR-T 014-F、及び比較対照のCD19 T cell)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。 CAR-T 001-C及びCAR-T 014-FのMV4-11担癌マウスモデルにおける実験結果を示す。 CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 014-E)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。
　本発明の実施の形態について、以下に詳細に説明する。
　本明細書において「キメラ抗原受容体（CAR）」とは、標的特異性をT細胞（例えば、ナイーブT細胞、ステムセルメモリーT細胞、セントラルメモリーT細胞、エフェクターメモリーT細胞、又はそれらの組み合わせ等のT細胞）等の細胞に移植することができる改変受容体を指す。CARはまた、人工T細胞受容体、キメラT細胞受容体、又はキメラ免疫受容体としても知られる。
　本明細書において「ドメイン」とは、ポリペプチド内の領域であって、他の領域とは独立して特定の構造に折りたたまれる領域を示す。
　本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」には、天然又は合成のDNA及びRNA、例えばゲノムDNA、cDNA（相補DNA）、mRNA（メッセンジャーRNA）、rRNA（リボソームRNA）、shRNA（小ヘアピンRNA）、snRNA（核内低分子RNA）、snoRNA（核小体低分子RNA）、miRNA（マイクロRNA）、及び／又はtRNAが含まれるが、これらに限定されない。
　本明細書において「コードする」とは、当分野において通常使用されているように、所定のヌクレオチド配列が所定のタンパク質又は（ポリ）ペプチドのアミノ酸配列情報を暗号化していることをいい、本明細書において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を「コードする」との文脈において使用する。
　上記の通り、本発明は、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞であって、前記標的結合ドメインが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換された配列を有する変異体ポリペプチドである、上記改変細胞を提供する。
　本明細書において、「～配列を有する」とは、記載された配列以外の配列を含む場合も包含し、また記載された配列のみを含む場合（すなわち「～配列からなる」）も包含し得る。
　本発明のCARタンパク質はヒトGM-CSF受容体に特異的に結合する「標的結合ドメイン」を含む。標的（GM-CSF受容体）結合ドメインは、GM-CSF受容体に特異的な結合性を示し、GM-CSF受容体を細胞表面上に発現している標的細胞に対し、特異的な免疫応答を可能にする。
　従って、GM-CSF受容体結合ドメインとして、配列番号１のアミノ酸配列を有するGM-CSF受容体に結合するサイトカインであるGM-CSFのアミノ酸残基第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチドが使用できる。あるいは、GM-CSF受容体に対する結合能を保持している限り、他のアミノ酸残基部分にも置換がされた変異体も使用できる。更に、GM-CSF受容体に対する結合能を保持している限り、これらのポリペプチドの断片、すなわち結合性断片を使用しても良い。
　GM-CSFのアミノ酸残基第２１番目のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換されたポリペプチドとしては、GM-CSF受容体への結合活性が保持されるものであれば特に限定されないが、例えば、アルギニンへの置換（配列番号２のアミノ酸配列）、リシンへの置換（配列番号３のアミノ酸配列）、ヒスチジンへの置換（配列番号４のアミノ酸配列）、アスパラギン酸への置換（配列番号５のアミノ酸配列）、セリンへの置換（配列番号６のアミノ酸配列）、アラニンへの置換（配列番号７のアミノ酸配列）、フェニルアラニンへの置換（配列番号８のアミノ酸配列）等を使用することができる。
　好ましい態様として、GM-CSFのアミノ酸残基第２１番目のアミノ酸が塩基性アミノ酸であるアルギニン、リシン、又はヒスチジンへ置換されたポリペプチドを使用することができる。
　より好ましい態様として、GM-CSFのアミノ酸残基第２１番目のアミノ酸がアルギニン又はリシンへ置換されたポリペプチドを使用することができる。
　ここで、「ヒトGM-CSF受容体に対する結合能」を有するとは、ヒトGM-CSF受容体に対する結合定数が例えば1 - 1000 nM以下であることを意図する。この結合能は、抗原と抗体との結合能と比較して相対的に弱い結合であって良い。
　なお、標的結合ドメインは、ヒトGM-CSF受容体に対する結合能を保持しているものであれば、上記ポリペプチドに替えて使用することができる。例えば、GM-CSF受容体との結合能力を保持した抗体由来の一本鎖ポリペプチドである単鎖抗体（scFv）が使用でき、免疫グロブリン重鎖（H鎖）及び軽鎖（L鎖）フラグメントのFv領域を連結した抗体ポリペプチドを標的結合ドメインとして使用できる。
　さらには、標的細胞上に発現する受容体タンパク質に特異的に結合するリガンド、例えばアフィボディ、天然型受容体由来のリガンド結合ドメイン、（例えば、腫瘍細胞上の）受容体の溶解性タンパク質/ペプチドリガンド、ペプチド、及び免疫応答を促すためのワクチン等を使用しても良い。
　本明細書のCARタンパク質は、場合によって「細胞外スペーサードメイン」を含むことができる。細胞外スペーサードメインは、CARと抗原の結合を促進し、細胞内へのシグナル伝達を亢進する配列であることが望ましい。例えば、抗体のFcフラグメント、又はそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、又はそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のCH2領域、抗体のCH3領域、人工スペーサー配列、又はそれらの組み合わせを用いることができる。
　本発明の一態様として、細胞外スペーサードメインとして、（i）IgG4のヒンジ、CH2、及びCH3領域、（ii）IgG4のヒンジ領域、(iii)IgG4のヒンジ及びCH2、(iv)CD8aのヒンジ領域、（v）IgG1のヒンジ、CH2、及びCH3領域、（vi）IgG1のヒンジ領域、もしくは(vii)IgG1のヒンジ及びCH2、又はそれらの組み合わせを使用することができる。例えば、IgG1のヒンジ領域として、配列番号９に示すヌクレオチド配列によってコードされる以下のアミノ酸配列（配列番号１０）を有するものを好適に使用することができるが、これに限定されるものではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　また、IgG1のCH2領域として、配列番号１１に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１２）を有するもの、CH3領域として、配列番号１３に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１４）を有するものをそれぞれ好適に使用することができる。
　好ましい態様として、細胞外スペーサードメインはヒトIgG1のヒンジ、CH2、及びCH3領域又はその一部を使用することができる。
　また、好ましい態様として、細胞外スペーサードメインは、（i）ヒトIgG1のヒンジ領域単独（配列番号１０）、（ii）ヒトIgG1のヒンジ領域（配列番号１０）及びCH２領域（配列番号１２）及びCH3領域（配列番号１４）の組み合わせ、（iii）ヒトIgG1のヒンジ領域（配列番号１０）及びCH3領域（配列番号１４）の組み合わせ、（iv）CH3領域単独（配列番号１４）、で使用することができる。
　本発明の一態様として、細胞外スペーサードメインに用いる人工スペーサー配列として、式(G4S)nで表されるスペーサー配列を使用することができる。式中、ｎは、１～１０であり、好ましくはｎ＝３である。例えば、配列番号１５を有するものを好適に使用することができる。このようなスペーサー配列を有するスペーサーは、ペプチドリンカーと呼ばれることもある。当分野において好適に使用されるペプチドリンカーを、本発明において適宜使用することができる。この場合、ペプチドリンカーの構成及び鎖長は、得られるCARタンパク質の機能を損なわない範囲で適切なものを選択することができる。
　更に好ましい態様として、細胞外スペーサードメインは、ヒトIgG1のヒンジ領域（配列番号１０）及び(G4S)3のスペーサー配列（配列番号１５）の組み合わせを使用することができる。
　細胞外スペーサードメインは、上記に例示したものから適宜選択して、又は当分野における技術常識に基づいて更に改変して、本発明のために使用することができる。
　細胞外スペーサードメインは、標的結合ドメインと、膜貫通ドメインとの間に存在し得るように、それぞれのドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列を連結してベクターに挿入し、宿主細胞において発現させることができる。あるいはまた、細胞外スペーサードメインは、予め作製したプラスミドCARタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型として改変することもできる。
　細胞外スペーサードメインの改変は、例えば、CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞の宿主細胞におけるCAR遺伝子発現率の向上、シグナル伝達、細胞の老化、腫瘍への分布、抗原認識又はin vivo活性への影響を考慮した場合に有用である。
　本発明のCARタンパク質は、細胞膜上に存在し、標的結合ドメイン及び任意に細胞外スペーサードメインを含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン及び任意に共刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。当分野において周知であるように、「膜貫通ドメイン」は、細胞外ドメイン及び細胞内ドメインがいずれも親水性ドメインであるのに対して、細胞膜を構成する脂質二重層に対する親和性を有するドメインである。本発明のGMR.CARにおける膜貫通ドメインは、CARタンパク質が細胞膜上に存在でき、標的結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインの機能を損なわない限り、特に限定するものではないが、後述する共刺激ドメインと同じタンパク質由来のポリペプチドが膜貫通ドメインとしての機能を果たす場合もあり得る。
　本発明の一態様として、膜貫通ドメインは、例えば、CD28、CD3ε、CD8α、CD3、CD4又は4-1BBなどの膜貫通ドメインを用いることができる。
　好ましい態様として、膜貫通ドメインは、ヒトCD28（Uniprot No. ：P10747（153‐179））を使用することができる。具体的には、配列番号１６に示すヌクレオチド配列（NCBI Accession No.: NM_006139.3 (679-759)）によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１７）を有するものを膜貫通ドメインとして好適に使用することができる。
　本発明のCARタンパク質は、場合によって「共刺激ドメイン」を含むことができる。共刺激ドメインは共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これらに限定されないが、CAR-T細胞の増殖、サイトカイン産生、機能分化、標的細胞の細胞死のような、細胞による共刺激応答が媒介される。
　本発明の一態様として、共刺激ドメインは、例えば、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、CD134 (OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、CD30、CD40、PD-1、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、TNFR-1、TNFR-II、Fas、Lckを用いることができる。
　好ましい態様として、共刺激ドメインは、ヒトCD28（Uniprot No. ：P10747（180‐220））又は4-1BB（GenBank：U03397.1）等を使用することができる。具体的には、配列番号１８に示すヌクレオチド配列（NCBI Accession No.: NM_006139.3 (760-882)）によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１９）を有するものを共刺激ドメインとして好適に使用することができる。
　本発明のCARタンパク質は「細胞内シグナル伝達ドメイン」を含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞のエフェクター機能の発揮に必要なシグナルを伝達する。
　本発明の一態様として、細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、ヒトCD3ζ鎖、FcγRIII、FcεRI、Fc受容体の細胞質末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)を有する細胞質受容体又はそれらの組み合わせを用いることができる。
　好ましい態様として、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ζ鎖（例えばNCBI Accession No. NM＿000734.3のヌクレオチド299-637）を使用することができる。具体的には配列番号２０に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２１）を有するものを細胞内シグナル伝達ドメインとして好適に使用することができる。
　目的とするポリヌクレオチドは常法に従い、容易に作製することができる。各ドメインのアミノ酸配列を示すNCBI RefSeq IDやGenBankのAccession番号からアミノ酸配列をコードする塩基配列を取得することが可能であり、標準的な分子生物学的及び/又は化学的手順を用いて本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、これらの塩基配列をもとに、核酸を合成することができ、また、cDNAライブラリーよりポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して得られるDNA断片を組み合わせて本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。
　従って、本発明のGMR.CARをコードするポリヌクレオチドは、上記のそれぞれのドメインをコードするポリヌクレオチドを連結して作製することができ、このポリヌクレオチドを適切な細胞に導入することによってGMR.CAR-T細胞を作製することができる。また、GMR.CARは、標的結合ドメイン以外の構成成分が同一である既存のCARタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型として、常法に従い、標的結合ドメインを組み替えることによっても作製することができる。
　更に、目的に応じて、既存のCARタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型として、1以上のドメイン、例えば細胞外スペーサードメインを、inverse PCR（iPCR）法等を使用して、改変することができる。細胞外スペーサードメインの改変技術については、例えばOncoimmunology, 2016, Vol.5, No.12, e1253656等に記載されている。
　本発明の一実施形態としては、
　配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含むヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、配列番号１７のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　本発明の一実施形態としては、
　配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含むヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４及び／又は配列番号１５のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１７のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　尚、前記、「配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４及び／又は配列番号１５のアミノ酸配列を含む」とは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４及び配列番号１５のアミノ酸配列のうち、任意の1又は２以上の組み合わせのいずれかを含むことを意味する。以下、本明細書において同様である。
　上記のポリヌクレオチドが導入される細胞としては、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞又はサル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物由来のT細胞又はT細胞を含む細胞集団が使用できる。例えば、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄などの体液、組織又は器官により採取、単離、精製、誘導された細胞を使用することができる。末梢血単核細胞（PBMC）、免疫細胞[樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球、NK細胞又は血球系細胞（好中球、好塩基球）]、臍帯血単核球、繊維芽細胞、前駆脂肪細胞、幹細胞、皮膚角化細胞、間葉系細胞、脂肪肝細胞、各種がん細胞株又は神経幹細胞を使用することができる。
　本発明の好ましい実施態様の一つとしては、例えば、細胞傷害性タンパク質（パーフォリン、グランザイム等）を放出する細胞を用いることができる。具体的には、例えばT細胞、T細胞の前駆細胞（造血幹細胞、リンパ球前駆細胞等）、NK細胞、NK-T細胞又はこれらを含有する細胞集団を使用することができる。さらに、これらの細胞に分化し得る細胞としてES細胞、iPS細胞等の各種幹細胞が含まれる。T細胞には、CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞、制御性T細胞、細胞傷害性T細胞、又は腫瘍浸潤リンパ球が含まれる。T細胞及びT細胞の前駆細胞を含有する細胞集団には、PBMCが含まれる。前記の細胞は生体より採取されたもの、それを拡大培養したもの又は細胞株として樹立されたもののいずれでもよい。製造されたCARを発現する細胞又は当該細胞より分化させた細胞を生体に移植する場合には、その生体自身又は同種の生体から採取された細胞に核酸を導入することが望ましい。
　本発明の遺伝子改変細胞のためにポリヌクレオチドが導入され、養子免疫療法に使用されるT細胞としては、持続的な抗腫瘍効果が期待されるT細胞、例えば、ステムセルメモリーT細胞を使用することができる。ステムセルメモリーT細胞の解析は、常法に従い、例えば、（Yang Xu, et al. blood. 2014; 123:3750-3759）等の記載に従って容易に確認することができる。
　本発明の実施態様の一つとしては、CAR発現プラスミドで形質導入されたT細胞がCD45R0-、CD62L+、CD45RA+及びCCR7+である細胞が上記のポリヌクレオチドが導入される細胞として使用できる。
　本発明のより好ましい実施態様の一つとしてはCD8+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+である細胞が少なくとも５０％以上の細胞が上記のポリヌクレオチドが導入される細胞として使用できる。
　遺伝子改変細胞を作製するためのポリヌクレオチドの導入方法は、通常使用されているものであればいずれでも良く、特に限定されるものではない。ベクターを用いて導入する場合、使用され得るベクターとしては、特に限定するものではないが、例えばレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等が挙げられる。また、非ウイルス性の態様として、プラスミドトランスポゾンを使用することができ、sleeping beautyトランスポゾンシステム（例えばHuang X, Guo H, et al. Mol Ther. 2008; 16: 580-9；Singh H, Manuri PR, et al. Cancer Res. 2008; 68: 2961-71；Deniger DC, Yu J, et al. PLoS One. 2015; 10: e0128151；Singh H, Moyes JS, et al. Cancer Gene Ther. 2015; 22: 95-100；Hou X, Du Y, et al. Cancer Biol Ther. 2015; 16: 8-16；Singh H, Huls H, et al. Immunol Rev. 2014; 257: 181-90；及びMaiti SN, Huls H, et al. J Immunother. 2013; 36: 112-23に記載）又はpiggybacトランスポゾンシステム（Nakazawa Y, Huye LE, et al. J Immunother. 2009; 32: 826-36；Galvan DL, Nakazawa Y, et al. J Immunother. 2009; 32: 837-44；Nakazawa Y, Huye LE, et al. Mol Ther. 2011; 19: 2133-43；Huye LE, Nakazawa Y, et al. Mol Ther. 2011; 19: 2239-48；Saha S, Nakazawa Y, et al. J Vis Exp. 2012; (69): e4235；Nakazawa Y, Saha S, et al. J Immunother. 2013; 36: 3-10；及びSaito S, Nakazawa Y, et al. Cytotherapy. 2014; 16: 1257-69に記載）が好適に使用できる。
　本発明の好ましい態様の一つとしては、非ウイルス性の態様、特にpiggybacトランスポゾンシステムを使用することができる。具体例は実施例に示す。
　本発明の細胞は、GM-CSF受容体を表面に発現している標的細胞に対して、受容体特異的免疫応答を引き起こすことによって、細胞内にシグナルが伝達され、活性化される。CARを発現する細胞の活性化は、宿主細胞の種類やCARの細胞内ドメインによって異なるが、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖率の向上、細胞表面分子の変化等を指標として確認することができる。細胞傷害性タンパク質の放出（パーフォリン、グランザイムなど）は、受容体を発現している細胞の破壊をもたらす。
　本発明は更に、ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明のベクターは、上記の本発明の遺伝子改変細胞を作製するために好適に使用することができる。
　本発明のGMR.CARを発現する細胞は、安全性に優れた細胞であることが望ましい。安全性に優れた細胞であるためには、特に限定されないが、例えば、標的細胞に対し特異的な免疫応答を可能にする一方で、例えば、正常な造血幹細胞には影響を与えないことが望ましい。骨髄関連抗原が関与する疾患においては、重篤な副作用として、例えば、骨髄抑制が知られている。
　従って、本発明のGMR.CARを発現する細胞としては、GMR.CARを発現する細胞が標的細胞を殺傷する投与量において、骨髄細胞を完全に駆逐しない細胞が望ましい。
　本発明の一態様としては、本発明のGMR.CARを発現する細胞として、正常細胞に影響を与えないGMR.CARを発現する細胞を好適に使用できる。安全性の指標としては、特に限定されないが、例えば、影響を及ぼす末梢細胞及び／又は骨髄細胞に対する殺傷能と腫瘍細胞への殺傷能をIC50値で比較した場合に当該比が十分に大きいことを指標として確認することができる
　本発明のGMR.CARを発現する細胞は、疾患の治療剤として使用することができる。従って、本発明は、上記の本発明の細胞を含む、GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患に対する治療剤を提供する。該治療剤は、CARタンパク質を発現する細胞を活性成分として含み、さらに、適当な賦形剤を含んでいても良い。本発明の治療剤による治療が期待される疾患としては、当該細胞に感受性を示す疾患であれば良く、限定されないが、例えば、GM-CSF受容体を発現する、特に高発現する細胞が関連する疾患、例えば血液がん（白血病）が挙げられ、具体的には、例えば若年性骨髄単球性白血病（JMML）、急性骨髄性白血病（AML）が挙げられる。さらには、固形がんが挙げられ、具体的には、例えば、神経膠腫（グリオーマ）、神経芽細胞腫、膠芽腫、脳腫瘍、直腸結腸腺がん、前立腺がん、腎臓がん、メラノーマ及び肺小細胞がん等が挙げられる。
　固形がんに上記治療剤が適用される場合、GM-CSF受容体が標的細胞の微小環境を形成している細胞、例えば骨髄由来免疫抑制細胞（MDSCs）等に発現している疾患が含まれる。該疾患にあっては、標的細胞にGM-CSF受容体が発現していない場合であっても、例えば、腫瘍細胞傷害活性を高める目的で、他の治療剤と併用して用いることができる。
　ここで、「GM-CSF受容体を発現する、特に高発現する」とは、発現強度が高い（例えば、平均蛍光強度（MFI）が高い）ことを意図する場合と、発現率（陽性率）が高いことを意図する場合があり得る。発現率が高い細胞を意図する場合、例えば、CD33/CD116発現率（陽性率）が少なくとも40％以上である細胞を意味する。腫瘍細胞に均質に発現しているという観点からは該発現率が80％以上の細胞が好ましい。より好ましくは、該発現率が90%以上の細胞を意味する。
　本発明の治療剤の一態様は、GM-CSF受容体を発現する腫瘍細胞に対する抗癌剤である。本発明の治療剤又は抗癌剤は、単独で使用することもできるが、異なるメカニズムの薬剤及び／又は治療と組み合わせて使用することができる。
　従って、本発明の治療剤は、単独又は他の有効成分と組み合わせて、医薬組成物の形態とすることができる。本発明の治療剤又は医薬組成物は、局所投与又は全身投与することができ、投与形態を限定するものではないが、例えば白血病の治療の場合には、静脈内投与とすることが好ましい。医薬組成物には、本発明の治療剤及び他の有効成分の他に、投与形態に応じて、当分野で通常使用される担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤等を含めることができる。本発明の治療剤の投与量は、患者の体重、年齢、疾患の重篤度等に応じて変動するものであり、特に限定するものではないが、例えば0.0001～1mg/kg体重の範囲で１日１回～数回、２日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎に投与することが可能である。
　本発明の治療剤の一態様は、患者に有効量の本発明の遺伝子改変細胞であるCARタンパク質を含む細胞を投与することを含む、細胞移植前に患者をコンディショニングする方法に関する。ある態様において、細胞移植は幹細胞移植である。幹細胞移植は造血幹細胞移植（骨髄移植、臍帯血移植、末梢血幹細胞移植）が好適に使用される。
　本発明の治療剤の一態様は、細胞移植前の患者のコンディショニングとして患者におけるGM-CSF受容体発現細胞の数を減らすことが含まれる。患者におけるGM-CSF受容体発現細胞はGM-CSF受容体発現正常細胞又はGM-CSF受容体発現がん細胞である。前記患者におけるコンディショニングは、細胞移植前にGM-CSF受容体発現正常及びがん細胞の両者を減らすものであっても良い。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
［実施例１　GMR.CAR発現プラスミド（CAR 001）の作製］
　ヒトGM-CSF（NCBI Accession No.: NM_000758の翻訳領域（配列番号２２、33～464塩基：終始コドン前）の5’側にEcoRIサイト、3’側にIgG1のヒンジをコードする塩基配列及びBclIサイトをつけたPCR産物をpTA2クローニングベクター（TOYOBO）にサブクローニングした。ヒトGM-CSFとIgG1のヒンジ配列をサブクローニングしたpTA2クローニングベクターをEcoRIとBclIダブルダイジェストし、ヒトGM-CSFとIgG1のヒンジ配列を切り出した。一方、pSL1190ベクター（Amersham社）に、SFG-CD19.CAR（Savoldo et al. J Clin Invest 2011;121(5):1822-1826）をNcoIとSphIでダブルダイジェストすることで得られたanti-CD19 scFv (FMC63; Zola H. et al. Immunol Cell Biol. 1991;69(Pt6):411-412)-CD28-CD3zetaの断片をライゲーションすることでpSL1190-CD19.CARベクターを作製した。
　pSL1190-CD19.CARベクターをEcoRIとBamHIでダブルダイジェストした後、前述の切り出したヒトGM-CSFとIgG1のヒンジ配列をcompatible siteを使用してライゲーションすることでpSL1190-GMR.CARベクターを作製した。さらに、pIRII-CD19.CARベクター（Huye et al. Mol Ther 2011;19(12):2239-2248）をEcoRIとNotIでダブルダイジェストすることでCD19.CAR断片を除き、代わりにpSL1190-GMR.CARベクターをEcoRIとNotIでダブルダイジェストすることで得られた断片をライゲーションすることでGMR.CAR発現プラスミドを取得した（CAR 001）。図１に作製されたCAR 001のベクターマップを示す。
［実施例２　変異型GMR.CAR発現プラスミドの作製（E21R, E21H, E21S, E21A）］
　CAR 001を鋳型として、inverse-PCR法により変異型GMR.CARの発現プラスミドを作製した。
　Inverse-PCRに用いる5’側PCRプライマーは、GM-CSFポリペプチド（配列番号１）の21番目のグルタミン酸（E）をアルギニン（R）、ヒスチジン（H）、セリン（S）又はアラニン（A）にそれぞれ置換するようデザインして合成した（配列番号２３～２６、ユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。３’側プライマーはすべての変異型に共通のデザインのもの（配列番号２７）を合成した（ユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。
E21R作製用フォワードプライマー：AGAGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTA（配列番号２３）
E21H作製用フォワードプライマー：CACGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTA（配列番号２４）
E21S作製用フォワードプライマー：AGCGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTA（配列番号２５）
E21A作製用フォワードプライマー：GCCGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGA（配列番号２６）
リバースプライマー：CTGGATGGCATTCACATCGAGGGTC（配列番号２７）
　CAR 001を50 ng/μLに調整して鋳型として用い、各PCRプライマーは反応液中濃度が0.2又は0.3μMになるように調整した。Inverse-PCRはKOD -Plus- Mutagenesis Kit（東洋紡績株式会社）を用い、反応組成はキット添付のプロトコールに従った。反応条件は、(i)94℃ 2分、(ii)98℃ 10秒、(iii)68℃ 7分で、(ii)及び(iii)を10サイクル行った。
　PCR反応後のサンプルの一部を1～1.2%アガロースゲル電気泳動にて分離し、目的サイズの直鎖状のプラスミドの生成を確認した。残りのPCR反応後のサンプルをキット添付のプロトコールに従ってDpn I処理により、メチル化された鋳型プラスミドCAR 001を切断し排除する反応を行った。その後、直鎖状プラスミドをキット添付のT4 Polynucleotide Kinaseによりセルフライゲーションさせ、環状プラスミドとした。その後、環状プラスミドにより大腸菌DH5α（東洋紡績株式会社）を形質転換し、50μg/mLアンピシリン含有LB寒天培地上で約16時間培養した。
　出現したコロニーをさらに50μg/mLアンピシリン含有LB液体培地中で約16時間培養した。培養した大腸菌培養液からQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン）を用いて各プラスミドを精製して塩基配列確認を行い、目的の塩基配列の置換が確認されたプラスミドをそれぞれCAR 002 (E21R GMR.CAR)、CAR 004 (E21H GMR.CAR)、CAR 006 (E21S GMR.CAR) 又はCAR 008 (E21A GMR.CAR)とした。
[実施例３　変異型GMR.CAR発現プラスミドの作製（E21K, E21D, E21F）］
　実施例２と同様にして、GM-CSFポリペプチド（配列番号１）の21番目のグルタミン酸（E）がリシン（K）、アスパラギン酸（D）又はフェニルアラニン（F）に置換されたプラスミドを作製した。具体的には、5’側に制限酵素XhoIで切断される配列と3’側に制限酵素DraIIIによって切断される配列を付加したXhoI - 分泌シグナル配列 - GM-CSF変異体 - ヒンジ配列- DraIIIの断片を人工合成した（ユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。この断片とCAR 001をXhoIとDraIIIで処理した断片とを結合させ、それぞれCAR 003(E21K GMR.CAR)、CAR 005 (E21D GMR.CAR)又はCAR 007 (E21F GMR.CAR)とした。
［実施例４　変異型スペーサー改変GMR.CAR発現プラスミドの作製］
　変異型スペーサー改変GMR.CAR発現プラスミドは、スペーサー改変GMR.CAR発現プラスミドを作製したのちに、それらを鋳型にして変異を組み込むことで作製した。
　CAR 001を鋳型として、細胞外スペーサードメイン部分を改変したGMR.CAR発現プラスミドをinverse-PCR法により作製した。具体的には、図２～３にベクターマップをそれぞれ示す、CH2CH3部分欠失体（図２）及びCH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体（図３）を作製した。
　Inverse-PCRに用いるPCRプライマーは、以下に示すように、CH2CH3部分欠失体用プライマー（配列番号２８及び２９）及びCH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体用プライマー（配列番号３０及び３１）をそれぞれデザインし、合成した（ユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。
＜CH2CH3部分欠失体用プライマー＞
　　フォワードプライマー：5'- TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTC -3'（配列番号２８）
　　リバースプライマー：5'- TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGAGAT -3'（配列番号２９）
＜CH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体用プライマー＞
　　フォワードプライマー：
5'-GGTGGTGGTGGATCCGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGG -3'（配列番号３０）
　　リバースプライマー：5'- TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGAGATTTGGGC -3'（配列番号３１）
　CAR 001を50 ng/μLに調整して鋳型として用い、各PCRプライマーは反応液中濃度が0.2又は0.3μMになるように調整した。Inverse-PCRはKOD -Plus- Mutagenesis Kit（東洋紡績株式会社）を用い、反応組成はキット添付のプロトコールに従った。反応条件は、(i)94℃ 2分、(ii)98℃ 10秒、(iii)68℃ 7分で、(ii)及び(iii)を10サイクル行った。
　PCR反応後のサンプルの一部を1～1.2%アガロースゲル電気泳動にて分離し、目的のサイズの直鎖状のプラスミドの生成を確認した。次いで、残りのPCR反応後のサンプルをキット添付のプロトコールに従ってDpn I処理により、メチル化された鋳型プラスミドCAR 001を切断して排除する反応を行った。その後、直鎖状プラスミドをキット添付のT4 Polynucleotide Kinaseによりセルフライゲーションさせて環状プラスミドとした。得られた各環状プラスミドにより大腸菌DH5α（東洋紡績株式会社）を形質転換し、50μg/mLアンピシリン含有LB寒天培地上で約16時間培養した。
　出現したコロニーをさらに50μg/mLアンピシリン含有LB液体培地中で約16時間培養した。培養した大腸菌培養液からQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン）を用いて各プラスミドを精製して塩基配列確認を行い、目的の塩基配列の改変が確認された変異型スペーサー改変GMR.CAR発現プラスミド：CAR 009(GMR.CAR dCH2CH3)及びCAR 010 (GMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)を取得した。
　作製したCAR 009及びCAR 010を鋳型として、変異型スペーサー改変GMR.CAR発現プラスミドをinverse-PCR法により作製した。作製したプラスミドのベクターマップを図４～７にそれぞれ示す。GM-CSFポリペプチド（配列番号１）の21番目のEをRに置換したCH2CH3部分欠失体（図４）、21番目のEをKに置換したCH2CH3部分欠失体（図５）、21番目のEをRに置換したCH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体（図６）及び21番目のEをKに置換したCH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体（図７）を作製した。
　本実施例においてInverse-PCRに用いたPCRプライマーは、以下に示すように、EをRに置換するプライマー（配列番号３２及び３３）及びEをKに置換するプライマー（配列番号３４及び３３）をそれぞれデザインし、合成した（ユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。
＜EをRに置換するプライマー＞
　　フォワードプライマー：5'- AGAGCCCGGCGTCTCCTGAACCTG -3'（配列番号３２）
　　リバースプライマー：5'- CTGGATGGCATTCACATGCTCCCAGGG -3'（配列番号３３）
＜EをKに置換するプライマー＞
　　フォワードプライマー：5'- AAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTG -3'（配列番号３４）
　　リバースプライマー：5'- CTGGATGGCATTCACATGCTCCCAGGG -3'（配列番号３３）
　CAR 009及びCAR 010を50 ng/μLに調整して鋳型として用い、各PCRプライマーは反応液中濃度が0.2又は0.3μMになるように調整した。Inverse-PCRはKOD -Plus- Mutagenesis Kit（東洋紡績株式会社）を用い、反応組成はキット添付のプロトコールに従った。反応条件は、(i)94℃ 2分、(ii)98℃ 10秒、(iii)68℃ 7分で、(ii)及び(iii)を10サイクル行った。
　PCR反応後のサンプルの一部を1～1.2%アガロースゲル電気泳動にて分離し、目的のサイズの直鎖状のプラスミドの生成を確認した。次いで、残りのPCR反応後のサンプルをキット添付のプロトコールに従ってDpn I処理により、メチル化された鋳型プラスミドを切断して排除する反応を行った。その後、直鎖状プラスミドをキット添付のT4 Polynucleotide Kinaseによりセルフライゲーションさせて環状プラスミドとした。得られた各環状プラスミドにより大腸菌DH5α（東洋紡績株式会社）を形質転換し、50μg/mLアンピシリン含有LB寒天培地上で約16時間培養した。
　出現したコロニーをさらに50μg/mLアンピシリン含有LB液体培地中で約16時間培養した。培養した大腸菌培養液からQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン）を用いて各プラスミドを精製して塩基配列確認を行い、目的の塩基配列の改変が確認された変異型スペーサー改変GMR.CAR発現プラスミド：CAR 011 (E21R GMR.CAR　dCH2CH3)、CAR 012 (E21KGMR.CAR E dCH2CH3)、CAR 013 (E21RGMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)及びCAR 014 (E21KGMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)を取得した。
［実施例５　GMR.CAR-T細胞の培養・増幅］
＜PBMCの分離と非特異的刺激OKT 3 blastの作製（Day 0）＞
　健康成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBS（和光純薬工業株式会社）で2倍に希釈した後、Ficoll-Paque PLUSに希釈末梢血を重層し、400 x g、30分の遠心分離を行い、PBMCを分取した。分取したPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。単離したPBMCを2～4 x 106個/well/2 mLとなるように5 ng/mL IL-15含有TexMACS mediumに懸濁した。Anti-Human CD3抗体及びAnti-Human CD28抗体を含有するD-PBSで24ウェルノントリートメント培養プレートを37℃、2時間で抗体コーティングしたプレートを用意し、細胞懸濁液を2 mL/wellで播きT細胞の特異的刺激を行い、OKT3 blastの作製を開始した。
Day 3にOKT3 blastの再刺激用の抗体固相プレートを作製した。具体的には、D-PBSで1 μg/mLに調製したAnti-human CD3抗体及びAnti-human CD28抗体を24ウェルノントリートメントプレート平底に500 μL/well添加し、4℃、オーバーナイトでインキュベートすることで、抗体をプレートに固相した。
　一方、Day 0から刺激をしていたOKT3 blastは抗体を固相していない24ウェル細胞培養用平底マルチウェルプレートに移すことで、一時的に刺激を行わなかった。
　Day 4に前日固相したプレートから上清を除き、OKT3 blastを添加することで、OKT3 blastのAnti-Human CD3抗体及びAnti-Human CD28抗体による再刺激を開始した。再刺激はDay 7まで実施したが、その期間中、適宜培地交換及びIL-15の添加を行った。
＜PBMCのウイルスペプチドパルス（Day 0）＞
　単離したPBMCにpeptivatorペプチドプール（登録商標、ミルテニーバイオテック）によるウイルスペプチド刺激を行った。具体的には、D-PBS 50μLにそれぞれ0.05μg/μLのAdV5 Hexon、CMV pp65、EBV BZLF1及びEBV EBNA-1を添加したペプチドプールにてPBMCを懸濁し、37℃で30分間ウイルスペプチド刺激を施した。30分後、PBMCに適量のD-PBSを加えて懸濁し、その後4分間のUV照射を行った。UV照射済みPBMCを回収し、細胞数をカウントした後、0.5～6 x 106個/well/2 mLとなるように10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有TexMACS medium中に懸濁し、フィーダー細胞として24ウェルトリートメント培養プレートに移した。
＜GMR.CAR発現ベクターの電気的導入（Day 0）＞
　変異型GMR.CAR発現プラスミドCAR 002 (E21R GMR.CAR)、CAR 003 (E21K GMR.CAR)、CAR 004 (E21H GMR.CAR)、CAR 005 (E21D GMR.CAR)、CAR 006(E21S GMR.CAR)、CAR 007(E21F GMR.CAR)又はCAR 008 (E21A GMR.CAR)のPBMCへの導入のために、それぞれのCAR 5μg、pCMV-piggyBacプラスミド5μg、P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit（ロンザジャパン株式会社）に付属するP3 Primary Cell solution 100 μLを混和し、10 x 106個のPBMCに添加した。
　次いで、細胞全量をNucleocuvetteに移し、4D-Nucleofection（Program No: FI-115）により電気的遺伝子導入を行った。電気的遺伝子導入を行った細胞を10分間室温に放置し、全量をフィーダー細胞の入った24ウェルトリートメント培養プレートに加えて培養を開始した。遺伝子導入操作を施さないMock-T細胞として、1～15 x 106個の細胞を同様に培養した。培養中の培地の半量を廃棄し、2倍量すなわち20 ng/mL IL-7及び10 ng/mL IL-15含有のTexMACS mediumを半量添加する培地交換作業を適宜行った。Mock-T細胞は24ウェルトリートメント培養プレート上で培養を続け、細胞の増殖度合いにより培地交換と増幅を行った。
＜CAR-T細胞の増幅（Day 7）＞
　細胞懸濁液全量を、10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15 含有のTexMACS medium 30 mL中に上記で作製したOKT 3 blastにペプチドパルスとUV照射を行ったフィーダー細胞2 x 106個を充填したG-Rex 10に移し、Day 14までGMR.CAR-T細胞の増幅を行った。Day 14まで増幅したGMR.CAR-T細胞の発現率を以下の方法にて測定した。
＜GMR.CAR発現率の評価（Day 14）＞
　細胞数をカウントし、1～2 x 105個の細胞をフローサイトメトリー解析により、GMR.CAR-Tの発現率を評価した。1～2 x 105個の細胞を採取し、PE Rat Anti-Human GM-CSF抗体（BD Pharmingen）2.5μL及びAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック） 5μLを加えて懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCalibur（ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて解析し、IgG1/CD3陽性又はGM-CSF/CD3陽性を指標としてGMR.CARの発現率を測定した。
　GMR.CAR発現プラスミド（CAR 001）を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作によって得られたGMR.CAR-T細胞を CAR-T 001とし、同様に、CAR 002 (E21R GMR.CAR)、CAR 003 (E21K GMR.CAR)、CAR 004 (E21H GMR.CAR) 、CAR 005 (E21D GMR.CAR)、CAR 006(E21S GMR.CAR)、CAR 007(E21F GMR.CAR)又はCAR 008 (E21A GMR.CAR)プラスミドを用いた操作によって得られたGMR.CAR-T細胞をそれぞれCAR-T 002(E21R)、CAR-T 003(E21K)、CAR-T 004(E21H)、CAR-T 005(E21D)、CAR-T 006(E21S)、CAR-T 007(E21F)、及びCAR-T 008(E21A)とした。
　CAR-T 001～008のday 14における発現解析結果を図８に示す。各細胞群におけるGMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 001 : 20.89％、CAR-T 002(E21R): 16.68％、CAR-T 003(E21K): 15.94％、CAR-T 004(E21H): 17.89％、CAR-T 005(E21D): 19.83％、CAR-T 006(E21S): 21.00％、CAR-T 007(E21F): 20.47％、CAR-T 008(E21A): 20.01％であり、Mock-T細胞における発現率（5.66％）と比較していずれも高く、変異型GMR.CAR発現T細胞の作製に成功した。
[実施例６　GMR.CAR-Tの抗腫瘍細胞活性］
　実施例５で得られたCAR-T 001～008の腫瘍細胞傷害活性を評価するため、腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、THP-1細胞（American Type Culture Collection（ATCC））を使用し、腫瘍細胞［ターゲット（Ｔ）］を5 x 105個/mLとなるように10％ FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製し、48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで播種した。実施例５で取得したCAR-T 001～CAR-T 008［エフェクター（Ｅ）］は、Ｅ：Ｔ比1 : 5～1 : 100となるように10% FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。
　すなわち、E : T比＝１：５の場合、GMR.CAR-T細胞は1 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した。同様に、E : T比＝１：５０、１：１００の場合は、それぞれGMR.CAR-T細胞は0.1 x 105個/mL又は0.05 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した。共培養試験は5日間行った。Mock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、コントロール群として、腫瘍細胞のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。
　共培養試験5日目に各ウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びPE Anti-Human CD33抗体（ミルテニーバイオテック） 5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を完全に除去した後、450 μLのD-PBSで再懸濁し、さらにCountBright absolute counting beads （インビトロジェン）を50 μL添加したサンプルについて、FACSCanto II（ベクトン・ディッキンソン株式会社）及びFLOWJO（ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて解析し、CD33の陽性細胞数をカウンティングビーズをもとに算出した。以下の計算式によりCAR-T 001～CAR-T 008及びMock-T細胞の抗腫瘍細胞活性％を算出した。
＜抗腫瘍細胞活性％の算出＞
計算式：
・抗腫瘍細胞活性％＝１００－（CAR-T添加群のCD33陽性細胞数）／（CAR-T非添加群のCD33陽性細胞数）ｘ１００
　図９に、CAR-T 001～CAR-T 008のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性％の結果を示した。CAR-T 002～CAR-T 008はいずれも、CAR-T 001と比較して同等以上のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性が認められた。
［実施例７　変異型スペーサー改変GMR.CAR-T細胞の培養・増幅］
＜PBMCの分離と非特異的刺激OKT 3 blastの作製（Day 0）＞
　健康成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBS（和光純薬工業株式会社）で2倍に希釈した後、Ficoll-Paque PLUSに希釈末梢血を重層し、400 x g、30分の遠心分離を行い、PBMCを分取した。分取したPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。単離したPBMCを2～4 x 106個/well/2 mLとなるように5 ng/mL IL-15含有TexMACS mediumに懸濁した。Anti-Human CD3抗体及びAnti-Human CD28抗体を含有するD-PBSで24ウェルノントリートメント培養プレートを37℃、2時間で抗体コーティングしたプレートを用意し、細胞懸濁液を2 mL/wellで播きT細胞の特異的刺激を行い、OKT3 blastの作製を開始した。
　Day 3にOKT3 blastの再刺激用の抗体固相プレートを作製した。具体的には、D-PBSで1 μg/mLに調製したAnti-human CD3抗体及びAnti-human CD28抗体を24ウェルノントリートメントプレート平底に500 μL/well添加し、4℃、オーバーナイトでインキュベートすることで、抗体をプレートに固相した。
　一方、Day 0から刺激をしていたOKT3 blastは抗体を固相していない24ウェル細胞培養用平底マルチウェルプレートに移すことで、一時的に刺激を行わなかった。
　Day 4に前日固相したプレートから上清を除き、OKT3 blastを添加することで、OKT3 blastのAnti-Human CD3抗体及びAnti-Human CD28抗体による再刺激を開始した。再刺激はDay 7まで実施したが、その期間中、適宜培地交換及びIL-15の添加を行った。
＜PBMCのウイルスペプチドパルス（Day 0）＞
　単離したPBMCにpeptivatorペプチドプール（登録商標、ミルテニーバイオテック）によるウイルスペプチド刺激を行った。具体的には、D-PBS 50μLにそれぞれ0.05μg/μLのAdV5 Hexon、CMV pp65、EBV BZLF1及びEBV EBNA-1を添加したペプチドプールにてPBMCを懸濁し、37℃で30分間ウイルスペプチド刺激を施した。30分後、PBMCに適量のD-PBSを加えて懸濁し、その後4分間のUV照射を行った。UV照射済みPBMCを回収し、細胞数をカウントした後、0.5～6 x 106個/well/2 mLとなるように10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有TexMACS medium中に懸濁し、フィーダー細胞として24ウェルトリートメント培養プレートに移した。
＜遺伝子導入操作（Day 0）＞
　GMR.CAR発現プラスミドのPBMCへの導入のために、CAR 001及びCAR 009～CAR 014のいずれかを5μg、pCMV-piggyBacプラスミド5μg、P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit（ロンザジャパン株式会社）に付属するP3 Primary Cell solution 100μLを混和し、10～15 x 106個のPBMCに添加した。
　次いで、細胞全量をNucleocuvetteに移し、4D-Nucleofection（Program No: FI-115）により電気的遺伝子導入を行った。電気的遺伝子導入を行った細胞を10分間室温に放置し、全量をフィーダー細胞の入った24ウェルトリートメント培養プレートに加え培養を開始した。遺伝子導入操作を施さないMock-T細胞として、1～15 x 106個の細胞を同様に培養した。培養中の培地の半量を廃棄し、2倍量すなわち20 ng/mL IL-7及び10 ng/mL IL-15含有のTexMACS mediumを半量添加する培地交換作業を適宜行った。Mock-T細胞は24ウェルトリートメント培養プレート上で培養を続け、細胞の増殖度合いにより培地交換と増幅を行った。
＜CAR-T細胞の増幅（Day 7）＞
　細胞懸濁液全量を、10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有のTexMACS medium 30 mL中に上記で作製したOKT 3 blastにペプチドパルスとUV照射を行ったフィーダー細胞2～10 x 106個を充填したG-Rex 10に移し、Day 14までGMR.CAR-T細胞の増幅を行った。Day 14まで増幅したGMR.CAR-T細胞の発現率を以下の方法にて測定した。
＜GMR.CAR発現率の評価（Day 14）＞
　細胞数をカウントし、1～2 x 105個の細胞をフローサイトメトリー解析により、GMR.CAR-Tの発現率を評価した。1～2 x 105個の細胞を採取し、遠心分離した細胞にPE Rat Anti-Human GM-CSF抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びAPC mouse Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック）5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCantoII(ベクトン・ディッキンソン株式会社)及びFLOWJO（ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて解析し、GM-CSF/CD3陽性を指標としてGMR.CARの発現率を測定した。
　本実施例において発現プラスミド(CAR 001及びCAR 009～CAR 014)を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作によって得られるGMR.CAR-T細胞をそれぞれ、CAR-T 001-A、CAR-T 009、CAR-T 010、CAR-T 011、CAR-T 012、CAR-T 013及びCAR-T 014とした。
　CAR-T 001-A及びCAR-T 009～CAR-T 014のday 14における発現解析結果を図１０に示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 001-A : 28.0％、CAR-T 009: 31.7％、CAR-T 010: 31.0％、CAR-T 011: 30.1％、CAR-T 012: 31.7％、CAR-T 013: 35.4％、CAR-T 014: 30.7％であり、Mock-T細胞における発現率0.54％と比較していずれも高く、スペーサー部位の異なるGMR.CAR発現T細胞の作製に成功した。作製したGMR.CAR発現T細胞をMock-T細胞で希釈することで発現率を28.0%に揃え、以下の実施例で抗腫瘍細胞活性及び安全性を評価した。
［実施例８　変異型スペーサー改変GMR.CAR-Tの抗腫瘍細胞活性］
　実施例７で得られたCAR-T 001-A及びCAR-T 009～CAR-T 014の腫瘍細胞傷害活性を評価するため、腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、THP-1細胞（American Type Culture Collection（ATCC））を使用し、THP-1細胞［ターゲット（T）］を4 x 105個/mLとなるように10％FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製し、48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで播種した（ウェル内の細胞数は2.0 x 105個となる）。
　CAR-T 001-A及びCAR-T 009～CAR-T 014［エフェクター（E）］は、E：T比1 : 25及び1 : 125となるように10％FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。すなわち、E:T比1：25の場合、CAR-Tは0.16 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内のCAR-T細胞数は0.08 x 105個となる）。同様に、E : T比1：125の場合、0.032 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内のCAR-T細胞数は0.016 x 105個となる）。
　抗腫瘍細胞活性％の算出は、実施例６と同様にして行った。図１１に、CAR-T 001-A、CAR-T 009～CAR-T 014及びMock-T細胞のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性％の結果を示した。CAR-T 009～CAR-T 014はいずれも、CAR-T 001-Aと比較して同等以上のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性が認められた。
［実施例９　変異型スペーサー改変GMR.CAR-T抗腫瘍細胞活性持続性評価］
　養子免疫療法において効果が期待されるCAR-T細胞は、持続的な細胞傷害活性が要求される。したがって、GMR.CAR-Tの抗腫瘍細胞活性の持続性を評価するため下記の実験を行った。
　実施例７と同様にして、発現プラスミド(CAR 010～CAR 014)を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作を行い、GMR.CAR-T細胞を新たに作製した（CAR-T 010-A～CAR-T 014-A）。
　本実施例で使用したCAR-T 010-A～014-Aのday 14における発現解析結果を図１２に示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 010-A: 26.2％、CAR-T 011-A: 27.6％、CAR-T 012-A: 18.5％、CAR-T 013-A: 29.8％、CAR-T 014-A: 26.9％であり、Mock-T細胞における発現率（0.50％）と比較していずれも高く、スペーサー部位の異なるGMR.CAR発現T細胞の作製に成功した。
　次いで、作製したGMR.CAR発現T細胞をMock-T細胞で希釈することで発現率を18.5%に揃えて連続的な抗腫瘍細胞活性を評価した。
　CAR-T 010-A～CAR-T 014-Aの腫瘍細胞傷害活性の持続性を評価するため、長期間の腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、THP-1、MV4-11、Kasumi-1細胞（American Type Culture Collection（ATCC））及びshinAML-1細胞（信州大学付属病院においてAML患者から樹立した細胞株）を使用し、各腫瘍細胞［ターゲット（T）］を5 x 105個/mLとなるように10％FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製し、48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで播種した（ウェル内の腫瘍細胞数は2.5 x 105個となる）。
　CAR-T 010-A～014-A ［エフェクター（E）］は、E：T比1 : 1となるように10％FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。すなわち、CAR-T は5 x 105個/mLとなるように調製し、各腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した（ウェル内のCAR-T細胞数は2.5 x 105個となる）。なお、各群2ウェルずつ用意し、1ウェルはFACSCanto II（ベクトン・ディッキンソン株式会社）での「解析用」、もう1ウェルは次のタームで新しい腫瘍細胞へ添加するための「継続用」として用いた。
　ターム1としての共培養試験は4日間行った。遺伝子導入を行っていないMock-T細胞についても同様の共培養試験を行い、また、コントロール群として、腫瘍細胞のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。
　共培養試験4日目に「解析用」のウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びPE Anti-Human CD33抗体（ミルテニーバイオテック） 5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を完全に除去した後、450 μLのD-PBSで再懸濁し、さらにCountBright absolute counting beads （インビトロジェン）を50 μL添加したサンプルについてFACSCanto II、FLOWJO（ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて解析し、CD33の陽性細胞数をカウンティングビーズをもとに算出した。ここまでをターム1とする。
　共培養開始時と比較して腫瘍細胞が殺傷された（腫瘍細胞数が減少した）群に関しては、次のターム2へ進めた。具体的には、予め2.5 x 105個/500 μL/wellで播種された腫瘍細胞を2ウェル用意し、そこへターム1で「継続用」として共培養しておいた培養液を500 μL/wellずつ等分に添加し、さらに4日間共培養した。この作業を培養期間4日又は3日で繰り返した。なお、共培養開始時と比較して腫瘍細胞数が増加した群に関しては、次のタームへは進めないこととした。
　図１３～図１７に各腫瘍細胞をターゲットとしたときの、それぞれ4日、8日、12日、15日、19日、22日目における抗腫瘍細胞活性評価の結果を示した。CAR-T 010-A～CAR-T 014-Aはいずれの腫瘍細胞株に対しても持続的に殺傷効果を有することが確認された。
［実施例１０　GMR.CAR-Tの末梢細胞に関する作用］
　本実施例で使用したGMR.CAR-T細胞（CAR-T 001-B及びCAR-T 009-B～CAR-T 014-B）は下記の方法で新たに作製した。
＜遺伝子導入操作（Day 0）＞
　実施例７と同様にしてOKT3 blastの作製を行った後、GMR.CAR発現プラスミドのPBMCへの導入のために、CAR 001及びCAR 009～014のいずれかを5μg、pCMV-piggyBacプラスミド5μg、P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X Kit（ロンザジャパン株式会社）に付属するP3 Primary Cell solution 100μLを混和し、15～20 x 106個のPBMCに添加した。
　細胞全量をNucleocuvetteに移し、4D-Nucleofection（Program No: FI-115）により電気的遺伝子導入を行った。電気的遺伝子導入を行った細胞を10分間室温に放置し、抗CD28抗体を含有するD-PBSで37℃、2時間で抗体コーティングした後、フィーダー細胞を入れた24ウェルノントリート培養プレートに加え培養を開始した。遺伝子導入操作を施さないMock-T細胞として、1～20 x 106個の細胞を同様に培養した。Day3で細胞を24ウェルノントリートメントプレートから24wellトリートメント培養プレートに移し替え培養を続けた。
　培養中の培地の半量を廃棄し、2倍量すなわち20 ng/mL IL-7及び10 ng/mL IL-15含有のTexMACS mediumを半量添加する培地交換作業を適宜行った。Mock-T細胞は24ウェルトリートメント培養プレート上で培養を続け、細胞の増殖度合いにより培地交換と増幅を行った。
　次いで、実施例７と同様にしてCAR-T細胞の増幅及びGMR.CAR発現率の評価を行った。
　本実施例で使用したCAR-T 001-B及びCAR-T 009-B～CAR-T 014-Bのday 14における発現解析結果を図１８に示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 001-B: 45.9％、CAR-T 009-B: 37.2％、CAR-T 010-B: 42.4％、CAR-T 011-B: 46.4％、CAR-T 012-B:41.1％、CAR-T 013-B: 48.3％、CAR-T 014-B: 51.2％であり、Mock-T細胞における発現率0.56％と比較していずれも高く、GMR.CAR発現T細胞の作製に成功した。
　次に、作製したGMR.CAR発現T細胞をMock-T細胞で希釈することで発現率を37.2％に揃えて末梢血細胞に対する影響を確認した。CAR-T 001-B及びCAR-T 009-B～CAR-T 014-Bの末梢血細胞に対する影響を確認するため、末梢血細胞との共培養試験を実施した。
＜多形核白血球（PMN）、PBMCの分離＞
　健常成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBSで2倍に希釈した後、polymorph prep（AXS)に希釈末梢血を重層し、450×g、35分の遠心分離を行い、PMN及びPBMCを分取した。分取したPMNとPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。
　CAR-T 001-B及びCAR-T 009-B～CAR-T 014-Bを用い、単離したPMN、PBMC、腫瘍細胞株MV4-11との共培養試験を行った。具体的には、PMN、PBMC、MV4-11［ターゲット（T）］を2×105個/mLとなるように10%FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック)で調製し、48ウェルトリートメント培養プレートに500μＬ/wellで播種した（ウェル内の細胞数は1×105個となる)。
　CAR-T 001-B及びCAR-T 009-B～CAR-T 014-B［エフェクター（E）］はE:T比1:1と1:10となるように10% FBS含有RPMI1640培地で希釈した。すなわちE:T比=1:1のサンプルのためのCAR-Tは2×105個/mLとなるように調製し、PMN又はPBMC、MV4-11が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μＬ/wellで添加した（ウェル内のCAR-T細胞数は1×105個)。
　同様に、E:T比=1:10の場合はCAR-Tは0.2×105個/mLとなるように調製し、PMN又はPBMC、MV4-11が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μＬ/wellで添加した（ウェル内のCAR-T細胞数は0.1×105個)。
＜PMNとの共培養試験＞
　共培養試験は3日間行った。Mock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、コントロール群として、PMNを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。
　共培養試験3日目に各ウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にFITC Anti-Human CD3抗体（バイオレジェンド)0.1μＬ、PE Anti-Human GM-CSF抗体（ミルテニーバイオテック)5μＬ、APC Anti-Human CD11b抗体（バイオレジェンド)0.1μＬを加えて懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させて上清を除去した後、D-PBS450μＬに再懸濁し、counting beads 50μＬを加えたサンプルをFACSCantoIIを用いて解析し、CD3-CD11b+を好中球として生細胞数を測定し、測定した細胞数を10倍した数値を生存細胞数として算出し、PMNのみで培養した値との相対比を算出した。
＜PBMCとの共培養試験＞
　共培養試験は3日間行った。Mock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、コントロール群として、PBMCを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群)。
　共培養試験3日目に各ウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にFITC Anti-Human CD3抗体0.1μＬ、PE Anti-Human GM-CSF抗体5μＬ、APC Anti-Human CD11b抗体0.1μＬPacific blue Anti-Human CD16抗体(バイオレジェンド)0.1μＬ、APC-cy7 Anti-Humn CD19抗体(バイオレジェンド)0.1μＬを加えて懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS450μＬに再懸濁し、counting beads 50 μＬを加えたサンプルをFACSCantoIIを用いて解析し、CD3-CD11b＋を単球、CD3-CD16＋をNK細胞、CD3-CD19＋をB細胞として生細胞数を測定し、測定した細胞数を10倍した数値を生存細胞数として算出し、PBMCのみで培養した値との相対比を算出した。
＜MV4-11との共培養試験＞
　共培養試験は3日間行った。Mock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、コントロール群として、MV4-11を同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群)。
　共培養試験3日目に各ウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD33 5μＬ、FITC Anti-Human CD3 0.2μＬ、PE Anti-Human GM-CSF 5μＬと加えて懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS 450μＬに再懸濁し、counting beads 50μＬを加えたサンプルをFACSCantoIIを用いて解析し、CD33+腫瘍生細胞を測定し、測定した細胞数を10倍した数値を腫瘍生存細胞数として算出し、MV4-11のみで培養した値との相対比を算出した。
　図１９にE:T比1:1及び1:10でMV4-11をターゲットとしたときの腫瘍生存細胞数相対比と末梢血細胞PMN、PBMCをターゲットとしたときの生存細胞数相対比を示した。CAR-T 001-B及びCAR-T009-B～CAR-T014-Bはいずれも、E:T比1:1では腫瘍をほぼすべて殺傷し、一方で、B細胞、NK細胞、好中球（neutrophil）などの末梢血細胞には影響を及ぼさなかった。E:T比1:10では、CAR-T 001-B及びCAR-T 009-B～CAR-T 014-Bはいずれも、腫瘍も末梢血細胞も殺傷しなかった。この結果からCAR-T 001-B及びCAR-T 009-B～CAR-T 014-Bは腫瘍殺傷能を持つ細胞数ではB細胞、NK細胞、好中球などの末梢血細胞には影響を及ぼさないことが示された。
［実施例１１　GMR.CAR-Tの骨髄細胞に関する作用］
　実施例７で作製したCAR-T 001-A及びCAR-T 009～CAR-T 014の正常骨髄細胞に対する影響を評価するため、骨髄細胞由来のコロニー形成試験を行った。
　具体的には、健常人由来骨髄細胞のCD34陽性分画（ベリタス）［ターゲット（T）］を1 x 104個/mLとなるように10％FBS、20 ng/mLのIL-3、SCF及びTPO含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製した。同様にMV4-11［ターゲット（T）］を6 x 103個/mLとなるように10％FBS、20 ng/mLのIL-3、SCF及びTPO含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製した。
　調製した各ターゲット細胞を96ウェル丸底プレートに50 μL/wellで播種した。そこへCAR-T 001-A及びCAR-T 009～CAR-T 014 ［エフェクター（E）］を、健常人由来骨髄細胞のCD34陽性分画に対してはE：T比20 : 1、6 : 1、2 : 1、0.6 : 1、0.2 : 1となるように、MV4-11に対してはE：T比1 : 1、0.5 : 1、0.25 : 1、0.125 : 1となるように10％FBS含有RPMI 1640培地で希釈し、50μＬ/wellで播種した。すなわち、エフェクターとターゲットを96ウェル丸底プレートで100 μＬ/well、10%FBS、10 ng/mLのIL-3、SCF及びTPOを含有したRPMI 1640培地で上記のE:T比で共培養した。
　共培養は2日間行った。遺伝子導入を行っていないMock-T細胞についても同様の共培養試験を行い、また、コントロール群として、健常人由来骨髄細胞のCD34陽性分画のみ、あるいはMV4-11のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。
　2日後、共培養液100 μＬとMethoCult Classic（ベリタス）1 mLを混合し、SmartDish 6-Well Plates（ベリタス）へ播種した。播種して7日目以降にコロニー形成されたことを確認した後にカウントした。なおCD34陽性分画の場合、複数種類のコロニーが観察され、コロニーの判別が難しい理由から、自動コロニーカウント装置のSTEMvision（ベリタス）を用いてエリスロイド系コロニーとミエロイド系コロニーを分けてカウントした。一方、MV4-11のコロニーは１種類のみであるため判別する必要がなく、顕微鏡を用いて手動でカウントした。
　図２０に、健常人由来骨髄細胞のCD34陽性分画をターゲットにした時に、各E:T比でプロットした点から描いたシグモイド曲線を示す。コントロール群以外は3ウェル平均値、コントロール群は6ウェル平均値を用いてプロットした。シグモイド曲線はGraphPad Prism 4 ver.4.03（GraphPad）を用いて出力し、パラメーターをTOP=100、BOTTOM≠0に設定した上で以下の式によりフィッティングを実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　図２１に、MV4-11をターゲットにした時に、各E:T比でプロットした点から描いたシグモイド曲線を示す。プロットには2ウェル平均値を用いた。シグモイド曲線はパラメーターをTOP=100、BOTTOM=0に設定した上で上記の式によりフィッティングを実施した。
　図２２に図２０より算出したIC50値、図２１より算出したEC50値、さらにそれらから算出される安全域を示す。その結果、影響の大きいミエロイド系に対して安全域が最も大きいのはCAR-T 014であった。
［実施例１２　GMR.CAR-Tのin vivoにおける効果１］
　実施例１０と同様にして、発現プラスミド(CAR 009、CAR 011及びCAR 012）を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作を行い、GMR.CAR-T細胞を新たに作製した（CAR-T 009-C、CAR-T 011-C及びCAR-T 012-C）。本実施例で使用したCAR-T 009-C、CAR-T 011-C及びCAR-T 012-Cのday 14における発現解析結果を図２３に示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 009-C: 25.7％、CAR-T 011-C: 32.1％、 CAR-T 012-C: 25.2％であった。
　THP-1担癌マウスモデルにおけるこれらのGMR.CAR-T細胞の効果を確認するため、下記のin vivo実験を行った。マウスは7週齢の雌性NSGマウスNOD.Cg-Prkdc＜scid ＞Il2rg＜ tm1Wjl ＞/SzJ（日本チャールズリバー）を用い、6週齢で納品後、6日間馴化を行った後に実験に使用した。
　Day0でTHP-1細胞株を1×106個/マウスとなるように150μLのD-PBSで懸濁してNSGマウスにイソフルラン麻酔下で頸静脈内投与した。
　Day3で培養16日目のCAR-T細胞をtotal T細胞5×106個/マウスとなるように150μLのD-PBSで懸濁してNSGマウスにイソフルラン麻酔下で頸静脈から投与した。
　マウスの状態を1～2日おきにday148まで観察し、カプラン・マイヤー分析を行い、Log-rank（Cochran-Mantel-Haenszel)testsにより統計解析を行った。
　またマウスの状態を観察し、以下に設定した人道的エンドポイントに達したと判断したマウスは安楽死させ、死亡とした。
人道的エンドポイント：
・下肢を引きずる
・腫瘤の直径が20mmとなる
・体重が7日間で25%以上減少する。
　その結果、図２４に示すように、CAR-T 009-C（P値＝0.0086)、CAR-T 011-C（P値=0.0011)及びCAR-T 012-C（P値=0.0011)は、PBS投与群と比較して有意にマウスの生存期間を延長することが示された。
　さらに、CAR-T 011-C及びCAR-T 012-C投与マウスとCAR-T 009-C投与マウス間の統計解析において、CAR-T 011-C（P値＝0.0042) 及びCAR-T 012-C（Ｐ値=0.0136)は、CAR-T 009-Cと比較して有意にマウスの生存期間を延長することが示された。
　これらの結果から、THP-1担癌マウスモデルにおいては、CAR-T 011-C及びCAR-T 012-Cは、CAR-T 009-Cと比較して強い抗腫瘍効果を有することが示された。
［実施例１３　GMR.CAR-Tのin vivoにおける効果２］
　実施例１０と同様にして、発現プラスミド(CAR 009～CAR 014）を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作を行い、GMR.CAR-T細胞を新たに作製した（CAR-T 009-D～CAR-T 014-D）。本実施例で使用したCAR-T 009-D～CAR-T 014-Dのday 14における発現解析結果を図２５に示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 009-D: 33.3％、CAR-T 010-D: 39.6％、CAR-T 011-D: 35.1％、CAR-T 012-D: 37.4％、CAR-T 013-D: 43.0％、CAR-T 014-D: 40.9％であった。
　得られた発現率と細胞数からCAR陽性細胞数を算出し、各群に投与するCAR陽性細胞が1.2×106個となるようにした。MV4-11担癌マウスモデルにおける効果を確認するため、実施例１２と同様に下記のin vivo実験を行った。8週齢の雌性NSGマウスを用い、6週齢で納品後13日間馴化を行った後、実験に使用した。
　Day0でMV4-11細胞株を1×106個/マウスとなるように150μLのD-PBSで懸濁してNSGマウスにイソフルラン麻酔下で頸静脈から投与した。
　Day3で培養16日目のCAR-T細胞をCAR陽性細胞1.2×106個/マウスとなるように150μLのD-PBSで懸濁してNSGマウスにイソフルラン麻酔下で頸静脈から投与した。
　マウスの状態を1～2日おきにday116まで観察しカプラン・マイヤー分析を行い、Log-rank（Cochran-Mantel-Haenszel)testsにより統計解析を行った。またマウスの状態を観察し、実施例１２と同様に人道的エンドポイントに達したと判断したマウスは安楽死させ、死亡とした。
　またDay52でEDTA-2Kが塗布されたヘマトクリット毛細管（東京硝子器械）を用いて、100μL程度採血を行い、委託業務による定量PCR（MLL-AF4キメラmRNA定量(SRL)）により血液中の腫瘍細胞の残存量を定量した。
　その結果、図２６及び２７に示すように、CAR-T 009-D（P値＝0.0042)、CAR-T 011-D（P値=0.0216)、CAR-T 012-D（P値=0.0042)）、CAR-T 010-D（P値＝0.0042)、CAR-T 013-D（P値=0.0042)及びCAR-T 014-D（P値=0.0042)は、PBS投与群と比較して有意にマウスの生存期間を延長することが示された。
　さらに、day116におけるカプランマイヤー分析、及び図２８に示すday52の末梢血中腫瘍の定量PCRの結果から、MV4-11担癌マウスモデルにおいて、CAR-T 010-D及びCAR-T 014-DがCAR-T 013-Dと比較して強い抗腫瘍効果を有することが示された。
［実施例１４　GMR.CAR-Tのin vivoにおける効果３］
　実施例１０と同様にして、発現プラスミド(CAR 001及びCAR 014）を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作を行い、GMR.CAR-T細胞を新たに作製した（CAR-T 001-C及びCAR-T 014-F）を新たに作製した。また、発現率算出のための比較対照用として、Morita.et.al.Molecular Therapy: Methods & Clinical Development Vol. 8 March 2018に記載のCH2CH3-free CD19.CAR プラスミドを用いてCD19.CAR-Tを同様に作製した。
　本実施例で使用したCAR-T 001-C及びCAR-T 014-Fのday14における発現解析結果を図２９に示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 001-C: 32.3%とCAR-T 014-F: 14.1%であった。
　得られた発現率と細胞数からCAR陽性細胞数を算出し、各群に投与するCAR陽性細胞が0.7×106個となるようにした。MV4-11担癌マウスモデルにおける効果を確認するため、実施例１２と同様に下記のin vivo実験を行った。7週齢の雌性NSGマウスを用い、6週齢で納品後6日間馴化を行った後、実験に使用した。
　Day0でMV4-11細胞株を1×106個/マウスとなるように150μLのD-PBSで懸濁してNSGマウスに無麻酔で尾静脈から投与した。
　Day3で培養16日目のCAR-T細胞をCAR陽性細胞0.7×106個/マウスとなるように150μLのD-PBSで懸濁してNSGマウスに無麻酔で尾静脈から投与した。
　マウスの状態を1～2日おきにday105まで観察してカプラン・マイヤー分析を行い、Log-rank (Cochoran-Mantel-Haenszel)testsにより統計解析を行った。またマウスの状態を観察し、実施例１２と同様に人道的エンドポイントに達したと判断したマウスは安楽死させ、死亡とした。
　その結果、図３０に示すように、CAR-T 014-F（P値＝0.0050)は、PBS投与群と比較して有意にマウスの生存期間を延長することが示され、CAR-T 014-F（P値＝0.0081)はCAR-T 001-Cと比較しても有意にマウスの生存期間を延長することが示された。
［実施例１５　腫瘍細胞表面におけるGMRα（CD116）の発現解析］
　上記実施例の抗腫瘍細胞活性評価に使用した腫瘍細胞株の細胞表面におけるGMRα（CD116）の発現率をフローサイトメトリーにより解析した。急性骨髄性白血病（AML）の細胞株であるTHP-1、Kasumi-1、shinAML-1、MV4-11株の解析を行った。具体的には、1～2 x 105個の細胞を採取し、APC Anti-Human CD116抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びPE Anti-Human CD33抗体（ミルテニーバイオテック）5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCaliburを用いて解析し、CD33/CD116の発現率を測定した。
　表１に各腫瘍細胞表面のCD33／CD116発現率を示した。THP-1、Kasumi-1、shinAML-1及びMV4-11すべてにおいてCD33／CD116陽性率は90％以上であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例１６　GMR.CAR発現T細胞のフェノタイプ解析］
　実施例７と同様にして、発現プラスミドCAR 014を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作を行い、GMR.CAR-T細胞を新たに作製した（CAR-T 014-E）。CAR-T 014-Eのday 14における発現解析結果を図３１に示す。GMR.CAR発現率は9.75%であり、Mock-T細胞における発現率（1.75%）と比較して高く、GMR.CAR発現T細胞の作製に成功した。
　作製したGMR.CAR発現T細胞の細胞数をカウントし、1x 106個の細胞をフローサイトメトリー解析により、GMR.CAR-T細胞のフェノタイプを評価した。1 x 106個の細胞を採取し、遠心分離した細胞にHuman BD Fc Block (ベクトン・ディッキンソン株式会社)を添加することでFcレセプターのブロック処理をおこなった後、BB515 Mouse AntiHuman CD197抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）、PE Mouse Aniti-Human CD27抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）、APC Mouse Anti-Human CD62L抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）、APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RO抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）、Brilliant Violet421 Mouse Anti-Human CD56抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）、BV510 Mouse Anti-Human CD8抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）、BV605 Mouse Anti-Human CD45RA抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）、BV650 Mouse Anti-Human CD3抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）及びBV786 Mouse Anti-Human CD4抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）を適量加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。
　20分後、3%FBS含有D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、3%FBS含有D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCelesta（ベクトン・ディッキンソン株式会社）及びFLOWJO（ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて解析し、CD3陽性かつCD45RA/CD62L陽性又はCD3陽性かつCD45RA/CD197陽性を指標としてGMR.CARのフェノタイプを解析した。その結果、作製したGMR.CAR発現T細胞の6割以上がステムセルメモリーT細胞であった。
　本発明により、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体を細胞表面に発現している標的細胞に特異的に結合し、優れた細胞傷害活性を付与するCAR-T細胞が提供される。本発明の細胞は、AML等の疾患に対する養子免疫治療に使用することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (12)

  1. 　ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞であって、前記標的結合ドメインが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換された配列を有する変異体ポリペプチドである、上記改変細胞。
  2. 　GM-CSF受容体に結合するCARタンパク質を細胞膜上に発現する、請求項１記載の細胞。
  3. 　CARタンパク質が、更に共刺激ドメイン及び／又は細胞外スペーサードメインを含む、請求項１又は２に記載の細胞。
  4. 　細胞内シグナル伝達ドメインがヒトCD3ζである、請求項１～３のいずれか１項記載の細胞。
  5. 　共刺激ドメインがヒトCD28又はヒト4-1BBである、請求項３又は４記載の細胞。
  6. 　細胞外スペーサードメインがヒトIgG1のヒンジ、CH2、及び／又はCH3領域若しくはその一部、及び／又は人工スペーサー配列を含む、請求項３～５のいずれか１項記載の細胞。
  7. 　標的結合ドメインが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸がアルギニン又はリシンに置換された配列を有する変異体ポリペプチドである、請求項１～６のいずれか１項記載の細胞。
  8. 　ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターを用いて細胞に導入することを含む、CARタンパク質発現細胞の作製方法であって、前記タンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、上記方法。
  9. 　ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記タンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、上記ベクター。
  10. 　請求項１～７のいずれか１項記載の細胞を含む、GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患に対する治療剤。
  11. 　請求項１０記載の治療剤と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
  12. 　GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患が、若年性骨髄単球性白血病（JMML）、急性骨髄性白血病（AML）、神経膠腫（グリオーマ）、神経芽細胞腫、膠芽腫、脳腫瘍、直腸結腸腺がん、前立腺がん、腎臓がん、メラノーマ及び肺小細胞がんから選択される、請求項１０記載の治療剤又は請求項１１記載の組成物。
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