CN111566124A - 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本披露提供了制备表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法，以及包含所述表达CAR的免疫效应细胞的组合物和反应混合物。本披露进一步提供了使用所述表达CAR的免疫效应细胞的方法。

Description

制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
技术领域
本发明总体上涉及制备表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法，以及包含所述表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞的组合物和反应混合物。
背景技术
使用自体T细胞(尤其是用嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞)的过继性细胞转移(ACT)疗法在若干个血液癌症试验中显示出前景。
目前，自体基因修饰的T细胞的制造是一个复杂的过程，首先要从患者的材料(例如，从白细胞单采术(leukapheresis)中获得的材料)起始，从这种材料中衍生出表达CAR的工程化治疗T细胞。患者白细胞单采材料可以具有高水平的细胞组分变异性。在不同患者之间以及在一种疾病状态下，所述起始材料的细胞组成可以有很大差异。细胞杂质可包括粒细胞、单核细胞、红细胞、循环母细胞和血小板。自体细胞疗法产品的制造过程还必须与患者的不同治疗史、疾病状态等相匹敌，这将进一步影响起始材料的细胞含量(Burger等人,2014，Kaiser等人,2015，Ramos等人,2009)。此外，来自起始材料的此类杂质会对制造过程、最终产品质量和所述产品的治疗功效产生负面影响。
因此，需要有更一致地生产表达CAR的细胞疗法产品，从而简化制造过程，改进产品质量，并最大化产品的治疗功效的方法和过程。
发明内容
本披露涉及制备表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的方法，以及包含所述表达CAR的免疫效应细胞的组合物和反应混合物。在一些实施例中，制备方法包括使免疫效应细胞群体与(i)Stat3激活剂(例如，如本文所述)、(ii)糖酵解抑制剂(例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG))或(i)和(ii)两者接触。在一些方面，本披露还提供评价、预测、选择或监测将要接受、正要接受、已经接受或正在接受用表达CAR的细胞进行的治疗性治疗的受试者的方法。本文还描述了评价或预测患有癌症(例如，本文所述的癌症)的受试者对用表达CAR的细胞进行的治疗性治疗的反应性的方法。
在一些方面，本文公开了一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体的方法，所述方法包括
a)提供免疫效应细胞群体，例如T细胞群体；
b)使所述免疫效应细胞群体与编码CAR多肽的核酸接触；
c)使所述免疫效应细胞群体与Stat3激活剂接触；
以及
d)将所述细胞维持在允许所述CAR多肽表达的条件下，
由此制备表达CAR的免疫效应细胞群体。
在一些实施例中，所述Stat3激活剂选自以下项中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或全部或者以下项的任何组合：
i)gp130激活剂，例如，与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体，或IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子、OSM分子；
ii)可溶性IL-6受体(sIL-6R)，例如，如本文所述；
iii)IL-6/IL-6R复合物，例如二聚体，例如，如本文所述；
iv)IL-6家族细胞因子(例如，IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、IL-31分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子或OSM分子)；
v)CCL20分子；
vi)IL-10R2受体(IL-10R2)激活剂，例如，IL-10分子、IL-22分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子、IL-29分子，或与IL-10R2结合的抗体分子，例如，如本文所述；
vii)IL-10家族细胞因子(例如，IL-10分子、IL-19分子、IL-20分子、IL-22分子、IL-24分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子或IL-29分子)；
viii)IL-17家族细胞因子(例如，IL17A分子、IL17B分子、IL17C分子、IL17D分子、IL17E分子或IL17F分子)；或者
ix)IL-23分子。
在一些实施例中，所述Stat3激活剂是gp130激活剂，例如，与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体。
在一些实施例中，本文的方法包括添加IL-21分子，或者本文的反应混合物包含IL-21分子，例如，IL-21。在一些实施例中，本文的反应混合物不包含IL-21分子，或者本文的方法不包括添加IL-21分子，例如，IL-21。在一些实施例中，本文的方法包括添加IL-30分子，或者本文的反应混合物包含IL-30分子。在一些实施例中，本文的方法包括添加IL-6Rα激活剂，或者本文的反应混合物包含IL-6Rα激活剂，例如，与IL-6Rα结合的抗体分子。
在一些实施例中，所述IL-6家族细胞因子不包含IL-6分子。
在一些实施例中，所述方法进一步包括将以下分子引入免疫效应细胞群体中的至少一种细胞中：
gp130分子，例如，通过在允许所述gp130分子翻译的条件下，将编码所述gp130分子的核酸引入所述免疫效应细胞群体的至少一种细胞中；或者
Stat3分子(例如，组成型活性Stat3分子(STAT3C))，例如，通过在允许所述Stat3分子翻译的条件下，将编码所述Stat3分子的核酸引入所述免疫效应细胞群体的至少一种细胞中。
在一些方面，本文公开了一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体的方法，所述方法包括
a)提供免疫效应细胞群体，例如T细胞群体；
b)使所述免疫效应细胞群体与编码CAR多肽的核酸接触；
c)将以下分子引入所述免疫效应细胞群体中的至少一种细胞中：
gp130分子，例如，通过在允许所述gp130分子翻译的条件下，将编码所述gp130分子的核酸引入所述免疫效应细胞群体的至少一种细胞中；或者
Stat3分子(例如，组成型活性Stat3分子(STAT3C))，例如，通过在允许所述Stat3分子翻译的条件下，将编码所述Stat3分子的核酸引入所述免疫效应细胞群体的至少一种细胞中；以及
d)将所述细胞维持在允许所述CAR多肽、gp130分子或Stat3分子表达的条件下，
由此制备表达CAR的免疫效应细胞群体。
在一些实施例中，所述方法进一步包括使免疫效应细胞群体与Stat3激活剂接触，所述Stat3激活剂选自以下项中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或全部或者以下项的任何组合：
i)gp130激活剂，例如，与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体，或IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子、OSM分子；
ii)可溶性IL-6受体(sIL-6R)，例如，如本文所述；
iii)IL-6/IL-6R复合物，例如二聚体，例如，如本文所述；
iv)IL-6家族细胞因子(例如，IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、IL-31分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子或OSM分子)；
v)CCL20分子；
vi)IL-10R2受体(IL-10R2)激活剂，例如，IL-10分子、IL-22分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子、IL-29分子，或与IL-10R2结合的抗体分子，例如，如本文所述；
vii)IL-10家族细胞因子(例如，IL-10分子、IL-19分子、IL-20分子、IL-22分子、IL-24分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子或IL-29分子)；
viii)IL-17家族细胞因子(例如，IL17A分子、IL17B分子、IL17C分子、IL17D分子、IL17E分子或IL17F分子)；或者
ix)IL-23分子。
在一些实施例中，所述Stat3激活剂是gp130激活剂，例如，与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体。
在一个实施例中，所述IL-6家族细胞因子不包含IL-6分子。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，所述gp130分子或所述Stat3分子的表达是瞬时表达(例如，可诱导的或不可诱导的)或组成型表达。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，在使免疫效应细胞群体与以下接触之前、同时或之后，将所述gp130分子或所述Stat3分子引入免疫效应细胞群体中：
编码CAR多肽的核酸；或者
Stat3激活剂，例如，如本文所述。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，包含编码Stat3分子(例如，组成型活性Stat3(STAT3C))的核苷酸的所述核酸进一步包含编码CAR(例如，CD19 CAR)的核苷酸序列。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，所述Stat3激活剂是与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体。在一些实施例中，所述方法产生T细胞(例如，CD4+或CD8+T细胞)的群体，所述T细胞群体富集(例如，具有升高的水平)例如早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞。在一些实施例中，所述方法导致CD4+或CD8+早期记忆T细胞(例如，如本文所述)的富集。在一些实施例中，早期记忆T细胞具有以下特征之一或全部：CD27+和/或CD45ROdim/neg，例如，CD27+CD45ROdim/neg。在一些实施例中，所述方法导致CD4+或CD8+未耗尽的早期记忆T细胞(例如，如本文所述)的富集。在一些实施例中，未耗尽的早期记忆T细胞具有以下特征中的一个或多个(例如，全部)：(i)PD-1阴性；(ii)CD27hi；(iii)CCR7hi；或(iv)CD45ROdim/neg。在一些实施例中，未耗尽的早期记忆T细胞是PD-1阴性CD27hi CCR7hiCD45ROdim/neg。在一些实施例中，富集的T细胞(例如早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞)群体，例如，具有增加水平的早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞，例如，多至少5％-90％(例如，多至少5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-50％、50％-70％或70％-90％，或多5％-90％、10％-85％、15％-80％、20％-75％、25％-70％、30％-70％、35％-65％、40％-60％或45％-55％)。在一些实施例中，富集的T细胞(例如，早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞)群体具有增加水平的早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞(例如，多至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％)。在一些实施例中，增加水平的早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞是与未与Stat3激活剂接触的T细胞的在其他方面类似的群体进行比较，例如，如实例2中所述。在一些实施例中，未与Stat3激活剂接触的T细胞的在其他方面相似的群体是例如，上面进行富集的T细胞的相同群体，例如，预富集群体，例如，起始群体，例如，如实例2中所述。在一些实施例中，未与Stat3激活剂接触的T细胞的在其他方面类似的群体是T细胞的不同群体，例如，上面未进行富集的群体。
在一些实施例中，CD4+T细胞(例如，早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞)的富集群体与未与Stat3激活剂接触的T细胞的在其他方面类似的群体相比，具有增加水平的早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞，例如，多至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％(例如，至少8％)。
在一些实施例中，CD8+T细胞(例如，早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞)的富集群体与未与Stat3激活剂接触的T细胞的在其他方面类似的群体相比，具有增加水平的早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞，例如，多至少15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％(例如，至少20％)。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，所述Stat3激活剂包括以下中的一种、两种、三种或全部：IL-6分子、IL-17分子、IL-22分子或CCL20分子。在一个实施例中，所述Stat3激活剂是天然存在的分子、重组分子或纯化分子。在一个实施例中，所述Stat3激活剂不存在于血清中，例如，不以足以激活Stat3，例如磷酸化例如酪氨酸705(Y705)上的Stat3的量存在，例如，如通过实例2的测定所测量的
在本文披露的制造方法的一些实施例中，所述Stat3激活剂是可溶的(例如，不与底物结合)，并且在一些实施例中，所述Stat3激活剂位于，例如，固定在底物(例如，珠或细胞)上。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，所述Stat3激活剂位于，例如，固定在底物(例如，珠或细胞)上。在一个实施例中，所述Stat3激活剂位于Stat3激活细胞(例如，人工抗原呈递细胞(APC)，例如，如本文所述)上。
在一些实施例中，人工APC包括以下一种、两种或全部：
(i)MHC分子(例如，在其表面表达MHC分子)；
(ii)共刺激蛋白(例如，在其表面表达共刺激蛋白，或共刺激蛋白与之缀合)；和/或
(iii)抗原，例如，如本文所述，例如，表达CAR的细胞(例如，本文所述的表达CAR的细胞)所识别的抗原。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，所述Stat3激活剂由所述Stat3激活细胞表达或缀合至所述Stat3激活细胞的表面。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，提供的Stat3激活剂(例如，如本文所述)的量足以激活Stat3，例如磷酸化例如酪氨酸705(Y705)上的Stat3，例如，如通过实例2的测定所测量的。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，与在相似条件下培养但未与Stat3激活剂接触的细胞的在其他方面相似的群体相比，提供的Stat3激活剂(例如，如本文所述)的量足以使免疫效应细胞群体在12天的培养期后扩增至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9倍或更多倍，例如，如通过实例2的测定所测量的。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，与在相似条件下培养但未与Stat3激活剂接触的细胞的在其他方面相似的群体相比，提供的Stat3激活剂(例如，如本文所述)的量以足以使免疫效应细胞群体中CD27+PD-1-细胞的百分比增加，例如，至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5倍或更多倍。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，与在相似条件下培养但未与Stat3激活剂接触的细胞的在其他方面相似的群体相比，提供的Stat3激活剂(例如，如本文所述)的量足以使免疫效应细胞群体中gp130的表达水平增加至少1.5、2、3、4、5、10倍或更多倍，例如，如通过实例2的测定所测量的。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，所述Stat3激活剂(例如，如本文所述)为选自以下的一种、两种、三种、四种或全部(例如，五种)：IL-6分子、IL-17分子、IL-22分子、IL31分子和CCL20分子。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，所述Stat3激活剂(例如，如本文所述)包括IL-6分子，例如，重组IL-6。在一个实施例中，以至少1、5、10、15、20或30ng/ml或在1-20、1-15或5-15ng/ml的范围内例如至少10ng/ml的量提供IL-6分子，例如重组IL-6。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，所述抗gp130抗体分子选自B-S12或B-P8或者是具有选自B-S12或B-P8的1、2、3、4、5或6个CDR的抗体分子。在一个实施例中，所述方法包括使免疫效应细胞群体与B-S12和B-P8两者接触。在一个实施例中，抗gp130抗体分子的总量为0.1-1000、0.5-500或1-100ug/ml。在一个实施例中，所述抗gp130抗体分子以至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2ug/ml(例如，约1ug/ml)的量提供。
在一些实施例中，所述抗gp130抗体：
诱导gp130介导的信号传导，如通过STAT3的磷酸化所测量的；或者
诱导二聚化，例如，gp130的同源二聚化，或gp130的异源二聚化，例如与LIF、OSM或CNTF。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，与在相似条件下培养但未与所述Stat3激活剂接触的细胞的在其他方面相似的群体相比，在例如如本文所述的Stat3激活剂的存在下培养的细胞群体，例如，如本文所述，表现出：
Stat3的激活，例如Stat3(例如，在酪氨酸705(Y705)上)的磷酸化，例如，如通过实施例2的测定所测量的；
在12天的培养期后，所述免疫效应细胞群体扩增至少了1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9倍或更多倍，例如，如通过实例2的测定所测量的；
所述免疫效应细胞群体中CD27+PD-1-细胞的百分比增加例如至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5倍或更多倍；
所述免疫效应细胞群体中gp130的表达水平增加至少1.5、2、3、4、5或10倍或更多倍，例如，如通过实施例2的测定所测量的。
在一些实施例中，CCL20分子包含全长天然存在的CCL20(例如，哺乳动物CCL20，例如，人CCL20)，CCL20的活性片段，或者与天然存在的CCL20野生型多肽具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的活性变体或其片段。
在一些实施例中，可溶性IL-6受体包含全长天然存在的IL-6受体(例如，哺乳动物IL-6受体，例如，人IL-6受体)，IL-6受体的活性片段，或者与天然存在的IL-6受体野生型多肽具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的活性变体或其片段。
在一些实施例中，IL-10R2受体激活剂包含激活IL-10R2信号传导途径的分子。在一些实施例中，所述IL-10R2受体激活剂包含，例如，多肽或小分子。
在一些实施例中，IL-6/IL-6R复合物包含IL-6分子和IL-6受体(IL-6R)分子之间的复合物。在一些实施例中，IL-6R分子包含全长天然存在的IL-6受体(例如，哺乳动物IL-6受体，例如，人IL-6受体)，IL-6受体的活性片段，或者与天然存在的IL-6受体野生型多肽具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的活性变体或其片段。
在一些实施例中，本文披露的制造方法包括，例如，扩增所述群体至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，或1-7、7-14或14-21天。
在一些实施例中，本文披露的制造方法进一步包括通过测量Stat3转录靶(例如，c-Myc、c-Fos、Sox2、Bcl-2、或RORC)的水平或活性来测定免疫效应细胞群体中的Stat3途径激活，以确定Stat3途径激活的值。在一个实施例中，所述方法包括将Stat3途径激活值与参考值进行比较，其中所述参考值获得自在类似条件下培养但未与Stat3激活剂(例如，如本文所述)接触的免疫效应细胞的在其他方面类似的群体。
在一些实施例中，响应于Stat3途径激活值与参考值的比较，进行以下一项或多项：
将所述群体分类为适合或不适合用作治疗剂；
配制或封装所述群体或其等分试样以用于治疗用途；或者
改变培养参数，例如，i)改变培养时长或ii)增加或降低例如如本文所述的Stat3激活剂的浓度。
在本文披露的制造方法的一些实施例中，(b)在(c)之前进行，(c)在(b)之前进行，或者(b)和(c)同时进行。
在一些实施例中，所述核酸是DNA或RNA。
在一些实施例中，(b)包括进行慢病毒转导以将所述核酸递送至免疫效应细胞。
在一些实施例中，所述方法进一步包括使免疫效应细胞群体与表达结合CAR的抗原(例如，CD19)的细胞群体接触。
在一些实施例中，所述方法进一步包括使免疫效应细胞群体与刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激细胞表面上的共刺激分子的配体接触，例如，其中所述试剂为与抗CD3抗体或其片段和/或抗CD28抗体或其片段缀合的珠。
在一些实施例中，所述CAR多肽是CD19 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR或CD33 CAR。在一个实施例中，所述CAR是CD19 CAR，例如，包含SEQ ID NO:39-51的scFv氨基酸序列的CAR或包含SEQ ID NO:77-89的氨基酸序列的CAR。
在一些实施例中，所述CAR包含抗体分子，所述抗体分子包含抗CD19结合结构域、跨膜结构域和包含刺激性结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述抗CD19结合结构域包含表3B中列出的任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个，以及表3A中列出的任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个。
在一些实施例中，所述抗CD19结合结构域包含SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:51的序列。
在一些实施例中，所述CAR包含具有SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:89的序列的多肽。
在一个方面，本文公开了一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体的方法，该方法包括：
a)提供免疫效应细胞群体，例如T细胞群体；
b)使所述免疫效应细胞群体与编码CAR多肽的核酸接触；
c)使所述免疫效应细胞群体与糖酵解抑制剂(例如，糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG))接触，以及
d)将所述细胞维持在允许所述CAR多肽表达的条件下，
由此制备表达CAR的免疫效应细胞群体。
在一个实施例中，(b)在(c)之前进行，(c)在(b)之前进行，或者(b)和(c)同时进行。
在一个实施例中，所述核酸是DNA或RNA。
在一个实施例中，(b)包括进行慢病毒转导以将所述核酸递送至免疫效应细胞。
在一个实施例中，添加一定量的所述糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-DG，所述量足以使得与在类似条件下培养但未用所述糖酵解抑制剂处理的细胞的在其他方面类似的群体相比：
所述免疫效应细胞群体增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更多；或者
所述免疫效应细胞群体中具有中枢记忆表型的细胞例如CD45RO+CCR7+细胞的百分比增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更高。
在一个实施例中，以至少0.5、1、1.5、2或2.5mM，0.5-2.5mM或1-2mM的浓度添加糖酵解抑制剂，例如2-DG。
在一个实施例中，与在类似条件下培养但未用糖酵解抑制剂处理的细胞的在其他方面类似的群体相比，在所述糖酵解抑制剂存在下培养的所述细胞群体表现出：
使所述免疫效应细胞群体增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更多；或者
使所述免疫效应细胞群体中具有中枢记忆表型的细胞例如，CD45RO+CCR7+细胞的百分比增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更高。
在一个实施例中，所述方法包括：
扩增所述群体，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天或1-7、7-14或14-21天；或者
扩增所述群体，例如，细胞数量变化至少1.5、2、2.5、3、4、5、5、7、8、9、10、20、30、40、50倍或更多，例如，最多约40或50倍，例如，在实例1的生长条件下。
在一个实施例中，所述方法进一步包括，例如，使用2-NBDG摄取测定(例如，实施例1的测定)来测定免疫效应细胞群体中的葡萄糖代谢，以确定葡萄糖代谢值。
在一个实施例中，所述方法进一步包括将葡萄糖代谢值与参考值进行比较。
在一个实施例中，所述方法进一步包括，响应于葡萄糖代谢值与参考值的比较，进行以下一项或多项：
将所述群体分类为适合或不适合用作治疗剂；
配制或封装所述群体或其等分试样以用于治疗用途；或者
改变培养参数，例如，i)改变培养时长或ii)增加或降低糖酵解抑制剂(例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG))的浓度。
在一个实施例中，所述方法进一步包括使免疫效应细胞群体与表达结合CAR的抗原(例如，CD19)的细胞群体接触。
在一个实施例中，所述方法进一步包括使所述免疫效应细胞群体与刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激所述细胞表面上的共刺激分子的配体接触，例如，其中所述试剂为与抗CD3抗体或其片段和/或抗CD28抗体或其片段缀合的珠。
在一个实施例中，所述CAR是CD19 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR或CD33 CAR。在一个实施例中，所述CAR是CD19 CAR，例如，包含SEQ ID NO:39-51的scFv氨基酸序列的CAR或包含SEQ ID NO:77-89的氨基酸序列的CAR。
在一个实施例中，所述CAR包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含抗CD19结合结构域、跨膜结构域和包含刺激性结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述抗CD19结合结构域包含表3中列出的任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个，以及表3中列出的任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个。
在一个实施例中，所述CAR包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含抗CD19结合结构域、跨膜结构域和包含刺激性结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述抗CD19结合结构域包含表3B中列出的任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个，以及表3A中列出的任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个。
在一个实施例中，所述抗CD19结合结构域包含SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:51的序列。
在一个实施例中，所述CAR包含具有SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:89的序列的多肽。
在一些方面，本文公开了一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体的方法，该方法包括：
a)提供免疫效应细胞群体，例如T细胞群体；
b)使所述免疫效应细胞群体与编码CAR多肽的核酸接触；
c)使免疫效应细胞群体与以下接触：
c-i)Stat3激活剂，例如，如本文所述；和
c-iii)糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)，以及
d)将所述细胞维持在允许所述CAR多肽表达的条件下，
由此制备表达CAR的免疫效应细胞群体。
在一些实施例中，所述Stat3激活剂选自以下项中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或全部或者以下项的任何组合：
i)gp130激活剂，例如，与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体，或IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子、OSM分子；
ii)可溶性IL-6受体(sIL-6R)，例如，如本文所述；
iii)IL-6/IL-6R复合物，例如二聚体，例如，如本文所述；
iv)IL-6家族细胞因子(例如，IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、IL-31分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子或OSM分子)；
v)CCL20分子；
vi)IL-10R2受体(IL-10R2)激活剂，例如，IL-10分子、IL-22分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子、IL-29分子，或与IL-10R2结合的抗体分子，例如，如本文所述；
vii)IL-10家族细胞因子(例如，IL-10分子、IL-19分子、IL-20分子、IL-22分子、IL-24分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子或IL-29分子)；
viii)IL-17家族细胞因子(例如，IL17A分子、IL17B分子、IL17C分子、IL17D分子、IL17E分子或IL17F分子)；或者
ix)IL-23分子。
在一些方面，本文公开了一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体的方法，所述方法包括
a)提供免疫效应细胞群体，例如T细胞群体；
b)使所述免疫效应细胞群体与编码CAR多肽的核酸接触；
c)使免疫效应细胞群体与以下接触：
c-i)糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)，和
c-ii)gp130分子，例如，通过在允许所述gp130分子翻译的条件下，将编码所述gp130分子的核酸引入免疫效应细胞群体的至少一种细胞中；或Stat3分子(例如，组成型活性Stat3分子(STAT3C))，例如，通过在允许所述Stat3分子翻译的条件下，将编码所述Stat3分子的核酸引入免疫效应细胞群体的至少一种细胞中；以及
d)将所述细胞维持在允许所述CAR多肽、gp130分子或Stat3分子表达的条件下，
由此制备表达CAR的免疫效应细胞群体。
在一些实施例中，包含Stat3激活剂或包含gp130分子或Stat3分子的细胞群体的制造方法，所述方法进一步包括使免疫效应细胞群体与糖酵解抑制剂(例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG))接触。
在一些实施例中，包含糖酵解抑制剂的制造方法，例如，如本文所述，进一步包括使免疫效应细胞群体与Stat3激活剂或包含gp130分子或Stat3分子的细胞群体接触。
在一些方面，本文披露的反应混合物包含：
a)(i)表达CAR的免疫效应细胞(例如，本文所述的表达CAR的细胞，例如，表达CD19CAR的细胞)群体或(ii)免疫效应细胞和编码CAR(例如，本文所述的CAR，例如，CD19 CAR)的核酸；以及
b)选自以下的试剂：
(i)Stat3激活剂；
(ii)表达gp130分子或Stat3分子的细胞或细胞群体；或者
(iii)gp130分子或Stat3分子或编码它们的核酸。
在本文披露的反应混合物的一个实施例中，所述Stat3激活剂选自：
b-i-i)gp130激活剂，例如，与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体，或IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子、OSM分子；
b-i-ii)可溶性IL-6受体(sIL-6R)，例如，如本文所述；
b-i-iii)IL-6/IL-6R复合物，例如二聚体，例如，如本文所述；
b-i-iv)IL-6家族细胞因子(例如，IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、IL-31分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子或OSM分子)；
b-i-v)CCL20分子；
b-i-vi)IL-10R2受体(IL-10R2)激活剂，例如，IL-10分子、IL-22分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子、IL-29分子，或与IL-10R2结合的抗体分子，例如，如本文所述；
b-i-vii)IL-10家族细胞因子(例如，IL-10分子、IL-19分子、IL-20分子、IL-22分子、IL-24分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子或IL-29分子)；或者
b-i-viii)IL-17家族细胞因子(例如，IL17A分子、IL17B分子、IL17C分子、IL17D分子、IL17E分子或IL17F分子)。
在一些实施例中，本文披露的反应混合物包含(a)(i)表达CAR的免疫效应细胞群体。
在一些实施例中，本文披露的反应混合物包含(a)(ii)编码CAR(例如，本文所述的CAR，例如，CD19 CAR)的核酸。
在一些实施例中，本文披露的反应混合物包含(b)(i)Stat3激活剂，例如，如本文所述。
在一些实施例中，本文披露的反应混合物包含(b)(ii)包含gp130分子或Stat3分子的细胞或细胞群体。
在一些实施例中，本文披露的反应混合物包含(b)(iii)gp130分子或Stat3分子，或编码它们的核酸。
在一些实施例中，本文披露的反应混合物包含：(a)(i)表达CAR的免疫效应细胞群体；(b)(i)Stat3激活剂，例如，如本文所述。
在一些实施例中，本文披露的反应混合物包含：(a)(i)表达CAR的免疫效应细胞群体；(b)(ii)包含gp130分子或Stat3分子的细胞或细胞群体。
在一些实施例中，本文披露的反应混合物包含：(a)(i)表达CAR的免疫效应细胞群体；(b)(iii)gp130分子或Stat3分子或编码所述分子的核酸。
在一些实施例中，本文披露的反应混合物包含：(a)(ii)编码CAR的核酸；(b)(i)Stat3激活剂，例如，如本文所述。
在一些实施例中，本文披露的反应混合物包含：(a)(ii)编码CAR的核酸；(b)(ii)包含gp130分子或Stat3分子的细胞或细胞群体。
在一些实施例中，本文披露的反应混合物包含：(a)(ii)编码CAR的核酸；(b)(iii)gp130分子或Stat3分子或编码所述分子的核酸。
在一些实施例中，本文披露的反应混合物包含以下一种或多种：
(a)(i)和b-i-i)；(a)(i)和b-i-ii)；(a)(i)和b-i-iii)；(a)(i)和b-i-iv)；(a)(i)和b-i-v)；(a)(i)和b-i-vi)；(a)(i)和b-i-vii)；(a)(i)和b-i-viii)；(a)(ii)和b-i-i)；(a)(ii)和b-i-ii)；(a)(ii)和b-i-iii)；(a)(ii)和b-i-iv)；(a)(ii)和b-i-v)；(a)(ii)和b-i-vi)；(a)(ii)和b-i-vii)；(a)(ii)和b-i-viii)。
在一个方面，本文披露的反应混合物包含：
a)表达CAR的免疫效应细胞例如本文所述的表达CAR的细胞例如表达CD19 CAR的细胞的群体，以及
b)糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)。
在另一个方面，本文披露的反应混合物包含：
a)免疫效应细胞群体，
b)编码CAR(例如，本文所述的CAR，例如CD19 CAR)的核酸，和
c)糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)。
在某些方面，本文披露的反应混合物包含：
(i)Stat3激活剂；
(ii)表达gp130分子或Stat3分子的细胞或细胞群体；
(iii)gp130分子或Stat3分子或编码它们的核酸；以及
(iv)糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)。
在一个实施例中，本文披露的反应混合物进一步包含慢病毒，
例如，其中编码CAR的核酸封装在慢病毒中。
在本文披露的反应混合物的一个实施例中，所述核酸是DNA或RNA。
在一个实施例中，本文披露的反应混合物进一步包含表达结合CAR的抗原(例如，CD19)的细胞群体。
在本文披露的反应混合物的一个实施例中，所述糖酵解抑制剂，例如2-DG，以至少0.5、1、1.5、2、2.5mM，0.5-2.5mM或1-2mM的浓度存在。
在一些方面，本披露提供了一种评价或预测患有癌症(例如，本文所述的癌症)的受试者对用表达CAR的细胞进行的治疗性治疗(例如，在施用表达CAR的细胞之前)的反应性的方法，所述方法包括评价来自所述受试者的免疫效应细胞中：
i)葡萄糖代谢水平，其中：
低于葡萄糖代谢参考值的葡萄糖代谢水平指示所述受试者可能对表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，表现出完全反应或部分反应，并且
高于葡萄糖代谢参考值的葡萄糖代谢水平指示所述受试者不太可能对所述表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，未表现出完全反应或部分反应；或者
ii)Stat3激活水平，如通过例如Stat3(例如，在酪氨酸705(Y705)上)的磷酸化或Stat3转录靶(例如，c-Myc、c-Fos、Sox2、Bcl-2或RORC)的水平或活性测量的，其中：
高于Stat3激活参考值的Stat3激活水平表示所述受试者可能对表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，表现出完全反应或部分反应，并且
低于Stat3激活参考值的Stat3激活水平表示所述受试者不太可能对所述表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，没有表现出完全反应或部分反应，
从而评价所述受试者，或预测所述受试者对所述表达CAR的细胞的反应性。
在一些实施例中，所述免疫效应细胞尚未与编码CAR的核酸接触。
在一些实施例中，所述免疫效应细胞已经与编码CAR的核酸接触，例如，表达CAR多肽。
在一些实施例中，所述免疫效应细胞已经与以下接触：
i)Stat3激活剂，例如，如本文所述；
ii)包含gp130分子或Stat3分子的细胞或细胞群体；
iii)gp130分子或Stat3分子或编码它们的核酸；或者
iv)糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)，浓度为至少0.5、1、1.5、2或2.5mM。
在一些实施例中，所述方法进一步包括确定细胞数量(例如，表达CAR的细胞的数量)的倍数变化。
在一些实施例中，不太可能对表达CAR的细胞的治疗有反应的受试者预测会表现出无反应(NR)或部分反应(PR)。
在一些实施例中，响应于确定：
i)所述葡萄糖代谢水平低于所述葡萄糖代谢参考值；或者
ii)所述Stat3激活水平高于所述Stat3激活参考值，
选择所述受试者以施用表达CAR的疗法或向所述受试者施用表达CAR的疗法。
在一些实施例中，响应于确定：
i)所述葡萄糖代谢水平高于所述葡萄糖代谢参考值；或者
ii)所述Stat3激活水平低于所述Stat3激活参考值，
选择所述受试者以施用除表达CAR的疗法以外的疗法或向所述受试者施用除表达CAR的疗法以外的疗法。
在一些实施例中，所述葡萄糖代谢参考值是完全反应受试者的细胞的葡萄糖代谢值，例如，如实例1中所述，例如，其中使所述细胞(例如，包含所述细胞的样品)与模拟物刺激接触，例如，用除CAR抗原以外的抗原刺激，例如，如实例1所述。
在一些实施例中，所述Stat3激活参考值是无反应受试者的细胞的Stat3激活值，例如，如实例2中所述。
在一个方面，本披露提供了一种评价或预测患有癌症(例如，本文所述的癌症)的受试者对用表达CAR的细胞进行的治疗性治疗(例如，在施用表达CAR的细胞之前)的反应性的方法，所述方法包括
评价来自所述受试者的免疫效应细胞中葡萄糖代谢的水平，其中：
低于参考值的葡萄糖代谢水平指示所述受试者可能对表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，表现出完全反应或部分反应，并且
高于参考值的葡萄糖代谢水平指示所述受试者不太可能对表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，未表现出完全反应或部分反应，
从而评价所述受试者，或预测所述受试者对所述表达CAR的细胞的反应性。
在一个实施例中，所述免疫效应细胞尚未与编码CAR的核酸接触。
在一个实施例中，所述免疫效应细胞已经与编码CAR的核酸接触，例如，表达CAR多肽。
在一个实施例中，所述免疫效应细胞已经与糖酵解抑制剂(例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)，浓度为至少0.5、1、1.5、2或2.5mM)接触。
在一个实施例中，所述方法进一步包括确定细胞数量的倍数变化。
在一个实施例中，不太可能对表达CAR的细胞的治疗有反应的受试者预测会表现出无反应(NR)或部分反应(PR)。
在一个实施例中，响应于确定葡萄糖代谢水平低于参考值，选择所述受试者以施用表达CAR的疗法或向所述受试者施用表达CAR的疗法。
在一个实施例中，响应于确定葡萄糖代谢水平高于参考值，选择所述受试者以施用除表达CAR的疗法以外的疗法或向所述受试者施用除表达CAR的疗法以外的疗法。
在一个实施例中，所述参考值是完全反应受试者的细胞的葡萄糖代谢值，例如，如实例1中所述，例如，其中使所述细胞(例如，包含所述细胞的样品)与模拟物刺激接触，例如，用除CAR抗原以外的抗原刺激，例如，如实例1所述。
在一些方面，本文披露了一种评价或预测患有癌症(例如，本文所述的癌症)的受试者的反应性的方法，其中所述受试者已经用表达CAR的细胞治疗，所述方法包括评价来自所述受试者的表达CAR的细胞中：
i)葡萄糖代谢水平，其中：
低于葡萄糖代谢参考值的葡萄糖代谢水平指示所述受试者可能对表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，表现出完全反应或部分反应，并且
高于葡萄糖代谢参考值的葡萄糖代谢水平指示所述受试者不太可能对所述表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，未表现出完全反应或部分反应；或者
ii)Stat3激活水平，如通过例如Stat3(例如，在酪氨酸705(Y705)上)的磷酸化或Stat3转录靶(例如，c-Myc、c-Fos、Sox2、Bcl-2或RORC)的水平或活性测量的，其中：
高于Stat3激活参考值的Stat3激活水平表示所述受试者可能对表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，表现出完全反应或部分反应，并且
低于Stat3激活参考值的Stat3激活水平表示所述受试者不太可能对所述表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，没有表现出完全反应或部分反应，
从而评价所述受试者，或预测所述受试者对所述表达CAR的细胞的反应性。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在评价表达CAR的细胞中葡萄糖代谢水平或Stat3激活水平之前从受试者中获得表达CAR的细胞。
在一些实施例中，不太可能对表达CAR的细胞的治疗有反应的受试者预测会表现出NR或PR。
在一些实施例中，响应于确定：
i)所述葡萄糖代谢水平低于所述葡萄糖代谢参考值；或者
ii)所述Stat3激活水平高于所述Stat3激活参考值，
选择所述受试者以施用一个或多个额外剂量的表达CAR的疗法或向所述受试者施用一个或多个额外剂量的表达CAR的疗法。
在一些实施例中，响应于确定：
i)所述葡萄糖代谢水平高于所述葡萄糖代谢参考值；或者
ii)所述Stat3激活水平低于所述Stat3激活参考值，
选择所述受试者以施用除表达CAR的疗法以外的疗法或向所述受试者施用除表达CAR的疗法以外的疗法。
在一些实施例中，所述葡萄糖代谢参考值是如实例1中所述的完全反应受试者的细胞的葡萄糖代谢值，例如，其中使所述细胞(例如，包含所述细胞的样品)与模拟物刺激接触，例如，用除CAR抗原以外的抗原刺激，例如，如实例1所述。
在一些实施例中，所述Stat3激活参考值是无反应受试者的细胞的Stat3激活值，例如，如实例2中所述。
在一个方面，本文披露了一种评价或预测患有癌症(例如，本文所述的癌症)的受试者的反应性的方法，其中所述受试者已经用表达CAR的细胞治疗，包括：
评价来自所述受试者的表达CAR的细胞中的葡萄糖代谢水平，其中：
低于参考值的葡萄糖代谢水平指示所述受试者可能对表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，表现出完全反应或部分反应(例如，PRTD)，并且
高于参考值的葡萄糖代谢水平指示所述受试者不太可能对表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，未表现出完全反应或部分反应，例如，PRTD，
从而评价所述受试者，或预测所述受试者对所述表达CAR的细胞的反应性。
在一个实施例中，所述方法进一步包括在评价表达CAR的细胞中葡萄糖代谢水平之前从受试者中获得表达CAR的细胞。
在一个实施例中，不太可能对表达CAR的细胞的治疗有反应的受试者预测会表现出NR或PR。
在一个实施例中，响应于确定葡萄糖代谢水平低于参考值，选择所述受试者以施用一个或多个额外剂量的表达CAR的疗法或向所述受试者施用一个或多个额外剂量的表达CAR的疗法。
在一个实施例中，响应于确定葡萄糖代谢水平高于参考值，选择所述受试者以施用除表达CAR的疗法以外的疗法或向所述受试者施用除表达CAR的疗法以外的疗法。
在一个实施例中，所述参考值是完全反应受试者的细胞的葡萄糖代谢值，例如，如实例1中所述，例如，其中使所述细胞(例如，包含所述细胞的样品)与模拟物刺激接触，例如，用除CAR抗原以外的抗原刺激，例如，如实例1所述。
在一些方面，本披露提供了一种评价表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞(例如，CTL019))的方法，所述方法包括评价来自受试者的样品中的表达CAR的细胞中：
i)葡萄糖代谢水平，其中：
低于葡萄糖代谢参考值的葡萄糖代谢水平指示所述样品适合于治疗，并且
高于葡萄糖代谢参考值的葡萄糖代谢水平指示所述样品不太适合于治疗；或者
ii)Stat3激活水平，其中：
高于Stat3激活参考值的Stat3激活水平指示所述样品适合于治疗，并且
低于Stat3激活参考值的Stat3激活水平指示所述样品不太适合于治疗，
从而评价所述表达CAR的细胞。
在一些实施例中，所述方法进一步包括选择一个细胞或富集多个细胞，所述一个细胞或多个细胞适合于治疗。在一些实施例中，所述方法进一步包括去除一个细胞或使多个细胞去富集，所述一个细胞或多个细胞不太适合于治疗。
在一些实施例中，所述方法进一步包括选择一个细胞，或富集多个细胞，其中：
所述葡萄糖代谢水平低于葡萄糖代谢参考值；或者
高于Stat3激活参考值的Stat3激活水平。
在一些实施例中，所述方法进一步包括将所述多个细胞中的细胞施用于受试者。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在评价表达CAR的细胞中葡萄糖代谢水平或Stat3激活之前从受试者中获得表达CAR的细胞。
在一些实施例中，响应于确定：
i)所述葡萄糖代谢水平低于所述葡萄糖代谢参考值；或者
ii)所述Stat3激活水平高于所述Stat3激活参考值，
选择所述样品以施用于所述受试者或将所述样品施用于所述受试者。
在一些实施例中，响应于确定：
i)所述葡萄糖代谢水平高于所述葡萄糖代谢参考值，
ii)所述Stat3激活水平低于所述Stat3激活参考值，
未选择所述样品以施用于所述受试者或未将所述样品施用于所述受试者。
在一些实施例中，所述葡萄糖代谢参考值是如实例1中所述的完全反应受试者的细胞的葡萄糖代谢值，例如，其中使所述细胞(例如，包含所述细胞的样品)与模拟物刺激接触，例如，用除CAR抗原以外的抗原刺激，例如，如实例1所述。
在一些实施例中，所述Stat3激活参考值是无反应受试者的细胞的Stat3激活值，例如，如实例2中所述。
在一个方面，本披露提供了一种评价表达CAR的细胞(例如，CAR19表达细胞(例如，CTL019))的方法，所述方法包括：
评价来自受试者的样品中所述表达CAR的细胞中葡萄糖代谢的水平，其中：
低于参考值的葡萄糖代谢水平指示所述样品适合于治疗，并且
高于参考值的葡萄糖代谢水平指示所述样品不太适合于治疗，
从而评价所述表达CAR的细胞。
在一个实施例中，所述方法进一步包括在评价表达CAR的细胞中葡萄糖代谢水平之前从受试者中获得表达CAR的细胞。
在一个实施例中，响应于确定葡萄糖代谢水平低于参考值，选择所述样品以施用于所述受试者或将所述样品施用于所述受试者。
在一个实施例中，响应于确定葡萄糖代谢水平高于参考值，未选择所述样品以施用于所述受试者或未将所述样品施用于所述受试者。
在一个实施例中，所述参考值是完全反应受试者的细胞的葡萄糖代谢值，例如，如实例1中所述，例如，其中使所述细胞(例如，包含所述细胞的样品)与模拟物刺激接触，例如，用除CAR抗原以外的抗原刺激，例如，如实例1所述。
在本文的任何方面，例如，以上的免疫效应细胞组合物和方法，可以与本文的一个或多个实施例(例如，以下的实施例)组合。
在一个实施例中，本文的方法包括制备或富集可经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞)群体，其中所述方法包括进行淘洗。所述方法可以包括提供包含免疫效应细胞的冷冻输入样品，解冻所述冷冻输入样品以产生解冻的样品，对解冻的样品进行淘洗并收集免疫效应细胞，从而产生包含免疫效应细胞的输出样品，所述免疫效应细胞适合于表达CAR。
在一个实施例中，所述冷冻的输入样品是血浆单采样品。
在一个实施例中，所述方法进一步包括以下的一项、两项、三项或全部：
i)在流动条件下耗减CD19+细胞；
ii)使用包含碘克沙醇的培养基，例如，在水中60％的碘克沙醇(例如，Optiprep培养基)和/或密度大于Ficoll(例如，大于1.077g/ml，例如，约1.32g/ml)的培养基进行密度离心；
iii)用含有右旋糖和/或氯化钠的缓冲液(例如，D5 1/2NS培养基(5％右旋糖和0.45％氯化钠))进行洗涤步骤(例如，对解冻的样品)，例如，其中使用细胞处理装置(例如，细胞洗涤装置或用于密度梯度离心的装置，例如，CS5(CellSaver5+)仪器)进行所述洗涤步骤；以及
iv)在流动条件下对CD3/CD28+细胞进行阳性选择。
在一个实施例中，所述方法进一步包括调节解冻样品的粘度的步骤，例如，通过将等渗溶液(例如，PBS)添加到解冻样品中。
在一个实施例中，使用约30-82mL/min或50-80mL/min的流速进行淘洗和/或每个级分收集量为约250-1250mL或300-1000mL。在一个实施例中，使用约30、40、50、60、70、72或82mL/min(例如，约70或72mL/min)的流速进行淘洗。在一个实施例中，使用约30-40、40-50、50-60、60-70、70-72、70-82、72-82mL/min的流速进行淘洗。在一个实施例中，使用约250、400、500、900或975mL(例如，约400或975mL)的收集量进行淘洗。在一个实施例中，使用约250-400、400-500、500-900、900-1000或1000-1259mL的收集量进行淘洗。在一个实施例中，以约2400rpm进行淘洗。在一个实施例中，以约2000-2800、2200-2600或2300-2500rpm进行淘洗。
在一个实施例中，所述输入样品包含至少10％、15％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、35％或40％的单核细胞。在一个实施例中，所述输入样品包含少于60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的T细胞。在一个实施例中，所述输入样品包含至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的B细胞。
在一个实施例中，所述输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的单核细胞。在一个实施例中，所述输出样品包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞。在一个实施例中，所述输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的B细胞。在一个实施例中，所述输出样品包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％的CD4+CD25+细胞。在一个实施例中，所述输出样品包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％的CD8+CD25+细胞。
在一个实施例中，所述方法导致至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％T细胞的T细胞产量回收率。
在一个实施例中，使所述输出样品与编码CAR的核酸接触。在一个实施例中，在使所述输出样品与编码CAR的核酸接触之后，所述输出样品包含至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的CAR+细胞。在这样的实施例中，所述输出样品包含至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的CAR+CD4+中枢记忆细胞。在这样的实施例中，所述输出样品包含至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的CAR+CD8+中枢记忆细胞。
在一个实施例中，在使输出样品与编码CAR的核酸接触后，输出样品每个表达CAR的细胞(例如，转导的细胞)产生少于1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1pg的IFN-γ(IFN-gamma/IFN-γ)。本文(例如，实例中)描述了IFN-γ(IFN-gamma/IFN-γ)释放测定。在一个实施例中，在使所述输出样品与编码CAR的核酸接触之后，所述输出样品包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30的细胞毒性水平(例如，EC50rec)。本文(例如，实例中)描述了细胞毒性测定。
在一个实施例中，本文的方法包括制备或富集可以经工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)群体，其中所述方法包括进行密度梯度离心(在本文中也称为密度离心)。所述方法可包括提供包含免疫效应细胞的输入样品，并使用包含碘克沙醇的培养基(例如，在水中60％的碘克沙醇)(例如，Optiprep培养基)和/或具有大于Ficoll的密度(例如，大于1.077g/ml，例如，约1.32g/ml)进行密度离心步骤，从而产生包含适合于表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。
在一个实施例中，本文所述的密度梯度离心方法进一步包括进行以下一项、两项、三项或全部：
i)在流动条件下耗减CD19+细胞；
ii)对输入样品进行淘洗，其中所述输入样品任选地是解冻的输入样品；
iii)用包含葡萄糖和/或氯化钠的缓冲液(例如，D5 1/2NS培养基(5％右旋糖和0.45％氯化钠))进行洗涤步骤(例如，在密度离心之前)，例如，其中所述洗涤步骤使用CS5(CellSaver5+)仪器进行；并且在流动条件下对CD3/CD28+细胞进行阳性选择。
在一个实施例中，本文所述的密度梯度离心方法不包括以下一项或多项：使用包含乙二醇的溶液，例如，Ficoll溶液；或在包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液(例如，D5 1/2NS培养基)中进行洗涤步骤，其中所述洗涤步骤使用CS5仪器进行；或进行阳性选择步骤。
在一个实施例中，使用细胞分离装置(例如，Sepax2装置)进行密度离心。
在一个实施例中，所述输入样品包含少于60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％或15％的T细胞。在一个实施例中，所述输入样品包含至少10％、15％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的单核细胞。在一个实施例中，所述输入样品包含至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的B细胞。
在一个实施例中，所述输出样品包含至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞。在一个实施例中，所述输出样品包含少于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的单核细胞。在一个实施例中，所述输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％或0.01％的B细胞。
在一个实施例中，本文所述的密度梯度离心方法导致至少为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％T细胞的T细胞产量回收率。
在一个实施例中，本文的方法包括制备可经工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)群体，其中所述方法包括阴性选择步骤以去除癌症相关的抗原表达细胞，例如，表达CD19(CD19+)的细胞。所述方法可包括提供包含免疫效应细胞的输入样品，以及在流动条件下(例如，使用流通装置，例如，本文所述的细胞处理系统)从输入样品中移除CD19+细胞，从而产生包含适合于CAR表达的免疫效应细胞的输出样品。在一个实施例中，所述CD19+细胞包含B细胞。在一个实施例中，所述CD19+细胞包含淋巴母细胞。
在一个实施例中，本文所述的阴性选择方法进一步包括进行以下一项、两项、三项或全部：
i)对输入样品进行淘洗，其中所述输入样品任选地是解冻的输入样品；
ii)使用包含碘克沙醇的培养基，例如，在水中60％的碘克沙醇(例如，Optiprep培养基)和/或密度大于Ficoll(例如，大于1.077g/ml，例如，约1.32g/ml)的培养基进行的密度离心步骤；
iii)用包含葡萄糖和/或氯化钠的缓冲液(例如，D5 1/2NS培养基(5％右旋糖和0.45％氯化钠))进行洗涤步骤(例如，在移除CD19+细胞之前和/或输入样品解冻后)，例如，其中所述洗涤步骤使用CS5(CellSaver5+)仪器进行；以及
iv)在流动条件下对CD3/CD28+细胞进行阳性选择。
在一个实施例中，本文所述的阴性选择方法不包括进行淘洗或密度离心。
在一个实施例中，通过磁性分离从输入样品中除去CD19+细胞。在一个实施例中，磁性分离包括使这些细胞与分离试剂接触。在一个实施例中，所述分离试剂包括磁性或顺磁性元件和CD19结合元件。在一个实施例中，所述磁性分离包括流式细胞术或FACS。在一个实施例中，通过FACS除去这些CD19+细胞。在一个实施例中，所述磁性分离包括使用磁性细胞分离装置，例如，CliniMACs装置。在一个实施例中，通过CliniMACs装置除去CD19+细胞。在一个实施例中，通过如本文所述的流通装置(例如，如本文所述的细胞处理系统)除去CD19+细胞。
在一个实施例中，所述输入样品包含至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的CD19+细胞。在一个实施例中，所述输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％或0.01％的CD19+细胞。在一个实施例中，所述输出样品与输入样品相比包含少于50％、45％、40％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、2％、2％或1％的CD19+细胞百分比。
在一个实施例中，所述输入样品包含至少10％、15％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、35％或40％的单核细胞。在一个实施例中，所述输入样品包含少于60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的T细胞。在一个实施例中，所述输入样品(例如，洗涤后的输入样品)包含至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的B细胞。
在一个实施例中，所述输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的单核细胞。在一个实施例中，所述输出样品包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞。在一个实施例中，所述输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％或0.01％的B细胞。
在一个实施例中，本文所述的阴性选择方法导致至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％T细胞的T细胞产量回收率。
在一个实施例中，本文的方法包括制备可以经工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)群体，其中所述方法包括阳性选择。所述方法可以包括提供包含免疫效应细胞的输入样品，以及在流动条件下从所述输入样品中进行CD3+/CD28+细胞的阳性选择，从而产生包含适合于表达CAR的免疫效应细胞的输出样品，例如，其中阳性选择是在流动条件下进行的。
在一个实施例中，本文所述的阳性选择方法进一步包括进行以下一项、两项、三项或全部：
i)耗减CD19+细胞，例如，在流动条件下；对输入样品进行淘洗，其中所述输入样品任选地是解冻的输入样品；
ii)使用包含碘克沙醇的培养基，例如，在水中60％的碘克沙醇(例如，Optiprep培养基)和/或密度大于Ficoll(例如，大于1.077g/ml，例如，约1.32g/ml)的培养基进行密度离心；以及
iii)用包含葡萄糖和/或氯化钠的缓冲液(例如，D5 1/2NS培养基(5％右旋糖和0.45％氯化钠))进行洗涤步骤(例如，在移除CD19+细胞之前和/或输入样品解冻后)，例如，其中所述洗涤步骤使用CS5(CellSaver5+)仪器进行。
在一个实施例中，本文所述的阳性选择方法进一步包括对输入样品进行淘洗(例如，其中所述输入样品为解冻的输入样品)。任选地，淘洗与耗减CD19+细胞(例如，如以上(i)中所述)、进行密度离心(例如，如(ii)中所述)以及进行洗涤步骤(例如，如以上(iii)中所述)中的一项或多项(例如，1项、2项或全部)一起进行。
在一个实施例中，本文所述的阳性选择方法进一步包括在进行阳性选择之前进行淘洗、洗涤步骤(任选地)和密度离心(例如，使用Ficoll或OptiPrep培养基)。在一个实施例中，本文所述的阳性选择方法进一步包括在进行阳性选择之前进行洗涤步骤(任选地)和密度离心(例如，使用Ficoll或OptiPrep培养基)。在一个实施例中，本文所述的阳性选择方法不包括进行淘洗。在一个实施例中，本文所述的阳性选择方法进一步包括例如使用CS5+仪器用包含葡萄糖和/或氯化钠的缓冲液(例如，D5 1/2NS缓冲液)进行洗涤。
在一个实施例中，所述阳性选择包括使输入样品与分离试剂接触，所述分离试剂包括磁性或顺磁性元件以及CD3和/或CD28结合元件。在一个实施例中，对CD3+/CD28+细胞的阳性选择包括将输入样品与分离试剂一起孵育约10至90分钟、约10至60分钟、约10至45分钟、约12至90分钟、约12至60分钟、约12至45分钟、约15至90分钟、约15至60分钟、约15至45分钟，例如约30分钟或约20分钟。在一个实施例中，所述分离试剂包含与抗CD3和/或抗CD28抗体偶联(例如，共价或非共价偶联)的珠。在一个实施例中，所述阳性选择使用约3:1比率的磁性分离元件(例如，珠)与T细胞。
在一个实施例中，所述阳性选择包括使包含这些免疫效应细胞和磁性分离元件的流体在发生磁性分离的封闭系统(例如，腔或袋)内流动。在一个实施例中，所述流动以一定的速度进行，以使这些元件(任选地与免疫效应细胞结合)发生磁性分离。在一个实施例中，对CD3+/CD28+细胞的阳性选择包括少于或等于约6、5、6、3、2或1分钟，或少于约50、40、30、20、10、5、4、3、2或1秒的分离或停留时间。
在一个实施例中，通过磁性装置进行阳性选择，例如，Dynamag CTS，一种包含如本文所述的磁性元件的流通装置，或磁性元件的其他布置。
在一个实施例中，使用包括至少一个细胞悬液模块的装置进行阳性选择；至少一个流通式磁性分离/脱珠模块；至少一个非磁性输出模块；至少一个磁性输出模块；任选地，在磁性分离/脱珠模块外部的至少一个磁性部件，所述磁性部件产生磁力和/或梯度；以及任选地，至少一个缓冲模块。在一个实施例中，所述装置进一步包括在磁性分离/脱珠模块外部的至少一个磁性部件，所述磁性部件产生磁力和/或梯度。在一个实施例中，所述装置进一步包括至少一个缓冲模块。在一个实施例中，所述磁性分离/脱珠模块包括由壁限定且具有x方向、y方向和z方向的腔室；布置在所述腔室的相对两端上的入口和出口，例如，在x方向、y方向或z方向上；邻近或接近于所述腔室壁并且布置成在所述腔室内在入口和出口之间建立零梯度线的至少两个磁体。在一个实施例中，这些免疫效应细胞流过所述腔室，其中腔室中的每个点在磁体的2cm之内。
在一个实施例中，阳性选择方法包括(例如，在步骤a)和b)之间)，使这些免疫效应细胞与包含葡萄糖和/或氯化钠的溶液，例如D5 1/2NS培养基(5％葡萄糖和0.45％氯化钠)接触，任选地，其中所述溶液处于环境温度下，例如，在约20℃-25℃下。在一个实施例中，这些免疫效应细胞存在于柔性容器(例如，袋子)中，例如，在步骤a)和b)期间。在一个实施例中，所述方法包括(例如在步骤a)和b)之间)，例如，在使这些免疫效应细胞与盐溶液接触之后，将袋子放置在隔热材料(例如多层含纸层，例如纸巾或抹布)上。在一个实施例中，所述方法包括(例如，在步骤b)之后)，将这些细胞在约37℃下孵育约10分钟。在一个实施例中，所述方法包括(例如，在步骤b)之后)，将这些细胞在约36℃-38℃、35℃-39℃或34℃-40℃下孵育，例如，约10分钟。在一个实施例中，所述孵育步骤持续约8-12、5-15或5-20分钟。在一个实施例中，所述孵育在Plasmatherm装置中进行。
在阳性选择方法的一个实施例中，包含免疫效应细胞的输入样品包含至少20％的单核细胞。在一个实施例中，所述包含免疫效应细胞的输入样品包含至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％的单核细胞。
在一个实施例中，所述阳性选择方法包括例如，按以下顺序所列的一项或多项(例如，2、3、4项或全部)：
a)解冻包含来自患有血液恶性肿瘤的患者的免疫效应细胞的冷冻输入样品(例如，白细胞单采样品)，任选地其中所述样品包含>20％的淋巴母细胞；
b)在例如20℃-25℃的环境温度下，在洗涤溶液(例如，X-VIVO15培养基(龙沙公司(Lonza))，称为‘改良培养基’(MM))中洗涤这些免疫效应细胞。
c)使所述输入样品与分离试剂接触，所述分离试剂包括磁性或顺磁性元件以及CD3和/或CD28结合元件；
d)将所述输入样品和分离试剂在旋转器上旋转，例如以2-6rpm，例如4rpm旋转，其中所述旋转持续，例如10-30分钟，例如20分钟；以及
e)进行阳性选择以富集与所述分离试剂结合的细胞，例如，持续30秒钟至2分钟，例如，持续1分钟。
在一个实施例中，所述阳性选择方法包括，例如，按以下顺序所列的一项或多项(例如，2、3、4、5、6或全部)：
a)解冻包含来自患有血液恶性肿瘤的患者的免疫效应细胞的冷冻输入样品(例如，白细胞单采样品)，任选地其中所述样品包含>20％的单核细胞；
b)在洗涤溶液(例如，包含约5％葡萄糖和0.45％氯化钠，例如D51/2NS)中，例如在环境温度(例如20℃-25℃)下，洗涤这些免疫效应细胞；
c)将包含这些细胞的柔性容器放置在隔热材料(例如多层含纸层，例如纸巾或抹布)上；
d)使所述输入样品与分离试剂接触，所述分离试剂包括磁性或顺磁性元件以及CD3和/或CD28结合元件；
e)将所述输入样品和分离试剂在例如37℃下孵育5-15分钟，例如10分钟；
f)将所述输入样品和分离试剂在旋转器上旋转，例如以2-6rpm，例如4rpm旋转，其中所述旋转持续，例如10-30分钟，例如20分钟；以及
g)进行阳性选择以富集与所述分离试剂结合的细胞，例如，持续30秒钟至2分钟，例如，持续1分钟。
在一个实施例中，所述样品，例如输入样品，来自患有血液系统恶性肿瘤(例如，本文所述的血液系统恶性肿瘤，例如，ALL或DLBCL)的患者。
在一个实施例中，所述输入样品包含约1x 105个有核细胞/ml、2x105个有核细胞/ml、5x 105个有核细胞/ml、7x 105个有核细胞/ml、1x 106个有核细胞/ml、2x 106个有核细胞/ml、5x 106个有核细胞/ml、7x 106个有核细胞/ml、1x 107个有核细胞/ml、2x 107个有核细胞/ml、5x 107个有核细胞/ml、7x 107个有核细胞/ml、1x 107个有核细胞/ml、2x 108个有核细胞/ml、5x 108个有核细胞/ml和7x 108个有核细胞/ml。在一个实施例中，所述输入样品包含约1-1.5x 107个T细胞。
在一个实施例中，所述输入样品包含至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的单核细胞。在一个实施例中，所述输入样品包含至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的肿瘤细胞，例如，淋巴母细胞。在一个实施例中，所述输入样品包含少于60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的免疫效应细胞，例如，T细胞。在一个实施例中，所述输入样品包含至少约5％、10％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的B细胞，例如，CD45+CD19+B细胞。在一个实施例中，所述输入样品包含至少约5％、10％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的B细胞，例如，CD45-CD19+B细胞。
在一个实施例中，所述输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的单核细胞。在一个实施例中，所述输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的肿瘤细胞。在一个实施例中，所述输出样品包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或99.9％的免疫效应细胞，例如，T细胞。在一个实施例中，所述输出样品包含至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的T细胞，例如，CD3+CD45+T细胞。在一个实施例中，所述输出样品包含少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的B细胞，例如，CD45+CD19+B细胞。在一个实施例中，所述输出样品包含少于约10％e、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的B细胞，例如，CD45-CD19+B细胞。在一个实施例中，所述输出样品包含至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或20％的T细胞。
在一个实施例中，本文的方法包括制备可经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞)群体，其中所述方法包括：
i)提供输入样品，例如，包含免疫效应细胞的冷冻输入样品或新鲜输入样品；任选地，其中所述输入样品是冷冻的输入样品时，将冷冻的输入样品解冻以产生解冻的样品；
ii)进行富集步骤，其中所述富集步骤包括：对输入样品进行淘洗，其中所述输入样品任选地是解冻的输入样品；或使用包含碘克沙醇的培养基，例如，在水中60％的碘克沙醇(例如，Optiprep培养基)和/或密度大于Ficoll(例如，大于1.077g/ml，例如，约1.32g/ml)的培养基进行密度离心步骤；以及
iii)进行选择步骤，其中所述选择是阳性选择，例如，对CD3/CD28+细胞的阳性选择，或者是阴性选择，例如，对CD19+、CD25+或CD14+细胞的阴性选择；
从而产生包含适合于表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。
在一个实施例中，本文的方法包括制备可经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞)群体，所述方法包括：
i)提供输入样品，例如，包含免疫效应细胞的冷冻输入样品或新鲜输入样品；
ii)任选地，其中所述输入样品是冷冻的输入样品时，将冷冻的输入样品解冻以产生解冻的样品；
iii)进行富集步骤，其中所述富集步骤包括：
1)对输入样品进行淘洗，其中所述输入样品任选地是解冻的输入样品；或者
2)使用包含碘克沙醇的培养基，例如，在水中60％的碘克沙醇(例如，Optiprep培养基)和/或密度大于Ficoll(例如，大于1.077g/ml，例如，约1.32g/ml)的培养基进行密度离心步骤；以及
iv)进行选择步骤，其中所述选择是阳性选择，例如，对CD3/CD28+细胞的阳性选择，或者是阴性选择，例如，对CD19+、CD25+或CD14+细胞的阴性选择；
从而产生包含适合于表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。
在一个实施例中，本文的方法包括制备可经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞)群体，其中所述方法包括：
i)提供输入样品，例如，包含免疫效应细胞的冷冻输入样品或新鲜输入样品；
ii)进行富集步骤，其中所述富集步骤包括：进行淘洗或密度离心(例如，使用Ficoll或Optiprep培养基)；
iii)进行选择步骤，其中所述选择是阳性选择，例如，对CD3/CD28+细胞的阳性选择，或者是阴性选择，例如，对CD19+、CD25+或CD14+细胞的阴性选择；
从而产生包含适合于表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。在一个实施例中，所述选择步骤是在流动条件下进行的，例如，通过使用流通装置。
本文所述的任何方法或组合物的另外特征或实施例包括以下中的一种或多种：
本文描述的任何方法的任何实施例中的输入样品是来自受试者的生物样品，所述样品包含免疫效应细胞，例如，T细胞和/或NK细胞。在一个实施例中，所述输入样品是血液样品，例如，全血样品。在一个实施例中，所述输入样品是单采样品，例如，白细胞单采样品。在一个实施例中，所述输入样品是新鲜样品，其中所述样品已经从受试者获得并且在从受试者获得的1天、2天、5天或7天内使用本文所述的任何方法进行处理。在一个实施例中，所述输入样品是冷冻或冷冻保存的样品，例如，在-20℃下或在液氮中冷冻，或以每分钟1°的速度冷冻至-80℃，并存储在液氮储罐的气相中。
在本文描述的任何方法的实施例中，所述输入样品包含至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的单核细胞(以及任选地多达40％、70％或95％的单核细胞)。在本文描述的任何方法的实施例中，所述输入样品包含至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的肿瘤细胞，例如，淋巴母细胞(以及任选地多达50％或95％的单核细胞)。在本文描述的任何方法的实施例中，所述输入样品包含少于60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的免疫效应细胞，例如，T细胞(以及任选地大于20％的T细胞)。
在本文描述的任何方法的实施例中，所述输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的单核细胞(以及任选地大于1％或0.1％的单核细胞)。在本文描述的任何方法的实施例中，所述输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的肿瘤细胞(以及任选地大于1％或0.1％的肿瘤细胞)。在本文描述的任何方法的实施例中，所述输出样品包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或99.9％的免疫效应细胞，例如，T细胞(以及任选地多达60％或95％的T细胞)。
在本文描述的任何方法的实施例中，所述输出样品与输入样品相比包含少于50％、45％、40％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、2％、2％或1％的单核细胞的百分比。在本文描述的任何方法的实施例中，所述输出样品与输入样品相比包含少于50％、45％、40％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、2％、2％或1％的肿瘤细胞的百分比。在本文描述的任何方法的实施例中，所述输出样品与输入样品相比包含至少50％、45％、40％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、2％、2％或1％的免疫效应细胞(例如，T细胞)的百分比。
在本文描述的任何方法的实施例中，所述方法进一步包括，例如，通过转导将编码CAR的核酸引入输出样品中的一个或多个免疫效应细胞中。本文描述了用于引入编码CAR的核酸的其他方法。
在本文描述的任何方法的实施例中，所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，例如，包括初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。
在本文描述的任何方法的实施例中，这些方法进一步包括测定转导效率的步骤。在本文描述的任何方法的实施例中，所述转导导致至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的转导效率。
在本文描述的任何方法的实施例中，这些方法进一步包括，例如，使用CS5+仪器，用包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液，例如D5培养基，对输入样品进行洗涤步骤。
在本文描述的任何方法的实施例中，这些免疫效应细胞是人免疫效应细胞。
在本文描述的任何方法的实施例中，所述输出样品包含CD8+T细胞。在本文描述的任何方法的实施例中，所述输出样品包含CD4+T细胞。
在本文所述的任何方法的实施例中，所述输入样品来自患有与肿瘤抗原(例如，本文描述的肿瘤抗原，例如，CD19)相关的疾病的患者，所述疾病选自增生性疾病，如癌症或恶性肿瘤，或癌前病症如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期，或是与本文描述的肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应症。在一个实施例中，所述疾病是本文描述的癌症，例如本文描述为与本文描述的靶标相关的癌症。在一个实施例中，所述血液癌症是白血病。在一个实施例中，所述癌症选自下组，该组由以下组成：一种或多种急性白血病，包括但不限于B细胞急性淋巴细胞性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；其他血液癌症或血液病症，包括但不限于B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、华氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症、和为由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)联合在一起的各种血液病症集合的“白血病前期”；以及与本文描述的肿瘤抗原的表达相关的疾病，包括但不限于表达如本文描述的肿瘤抗原的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或增生性疾病；以及它们的任何组合。在另一个实施例中，与本文所述的肿瘤抗原相关的疾病是实体瘤，例如本文所述的实体瘤，例如前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌或肺癌。
在本文描述的任何方法的实施例中，所述输入样品来自患有癌症的患者，所述癌症选自下组，该组由以下组成：一种或多种急性白血病，包括但不限于B细胞急性淋巴细胞性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(TALL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；其他血液学癌症或血液学病症，包括但不限于B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、白血病前期、非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或增生性疾病及其任何组合。
在本文描述的任何方法的实施例中，所述输入样品来自患有ALL的患者。
在本文描述的任何方法的实施例中，所述方法进一步包括测定输出样品中细胞上的一种或多种细胞表面标记物(例如，CD45、CD19、CD3、CD28、CD25或CD14)的步骤。
在本文描述的任何方法的实施例中，所述方法进一步包括用刺激免疫效应细胞增殖(例如，刺激CD3/TCR复合物相关信号)的试剂和/或在T细胞的表面上刺激共刺激分子的配体(例如，抗CD3抗体和抗CD28抗体)刺激所述输出样品。
在本文描述的任何方法的实施例中，所述方法进一步包括，例如，通过转导、转染或电穿孔引入编码CAR的核酸。
在另一个方面，本披露的特征在于通过本文披露的方法(例如，以上披露的方法)产生的反应混合物。
在另一个实施例中，本文的反应混合物包含至少80％、85％、90％或95％的T细胞和少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的单核细胞，其中所述反应混合物中的细胞总数加起来为100％。在一个实施例中，所述反应混合物总共包含至少1x 106、2x106、5x 106、1x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108或5x 108个细胞。在一个实施例中，所述反应混合物包含少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的B细胞。在一个实施例中，所述反应混合物包含少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的癌细胞，例如，淋巴母细胞。
在本文所述的任何反应混合物中，一个或多个T细胞表达CAR，例如，本文所述的任何CAR。
在本文所述的任何反应混合物中，所述反应混合物进一步包含编码CAR的核酸，例如，其中所述核酸位于T细胞内部或T细胞外部。
虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是以下描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考(例如，序列数据库参考号)通过引用以其全文并入。例如，本文提及的所有GenBank、Unigene和Entrez序列(例如，在本文的任一表中)均通过引用并入。除非另有说明，否则本文指定的序列登录号(包括本文的任何表中的)均指截至2017年10月25日的现有数据库条目。当一个基因或蛋白质参考多个序列登录号时，涵盖所有的序列变体。
此外，材料、方法和实例仅是说明性的而不旨在限制。标题、小标题或编号或字母元素，例如，(a)、(b)、(i)等仅为了便于阅读而呈现。在本文件中使用标题或编号或字母元素不要求步骤或元素以字母顺序执行，或者步骤或元素必须彼此离散。根据说明书和附图并且如权利要求书，本发明的其他特征、目标和优点将是清楚的。
附图说明
图1A至1D示出了CAR T细胞产物的转录图谱，所述图谱揭示了与临床反应有关的T细胞固有质量属性。每个点代表个体患者细胞产物样品中这些签名的相对富集，并且条形图反映了最小值到最大值。每个基因集的标准化富集得分绘制在y轴上(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，通过双尾韦尔奇t检验)。图1A示出了早期记忆-后期记忆基因集的相对富集。图1B示出了记忆效应基因集的相对富集。图1C示出了高糖酵解-低糖酵解基因集的相对富集。图1D示出了高耗竭-低耗竭基因集的相对富集。
图2示出了通过流式细胞术评价的模拟物或CAR刺激的回溯患者CTL019细胞中荧光葡萄糖类似物2-NBDG的摄取(**P<0.01，配对的双尾t检验)。
图3示出了有反应者(CR，n＝4；PRTD，n＝2；PR，n＝2)和无反应者(NR，n＝6)的CTL019样品之间2-NBDG摄取的比较(**P<0.01，未配对的双尾t检验；NS，不显著)。
图4示出了代表性的流式细胞术，描绘了在不存在(对照)或存在抑制糖酵解的2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)的情况下培养9天后CD8+CAR T细胞的分化表型。
图5示出了在存在或不存在2-DG的情况下培养后CD8+和CD4+CAR T细胞内T细胞亚群的频率(％)(**P<0.01，*P<0.05，配对的双尾t检验)。示出了以下T细胞亚群：幼稚样T细胞(CCR7+CD45RO-)；中枢记忆T细胞(CCR7+CD45RO+)；效应记忆T细胞(CCR7-CD45RO+)；和效应T细胞(CCR7-CD45RO-)。
图6示出了在2-DG存在或不存在下制造的CTL019细胞的增殖能力。如箭头所示，在培养的第0、7和12天，用经工程化以表达CD19或间皮素(无关靶抗原)的K562细胞对CAR T细胞进行连续再刺激。示出了来自两名代表性受试者的数据。
图7A-7D示出了CAR T细胞中IL-6/STAT3途径的富集。图7A示出了每种反应类别的可评价患者样品中，CAR刺激的CTL019细胞产生的可溶性细胞因子水平高于由匹配的、未刺激的对照详细说明的基线水平(CR，n＝6；PRTD，n＝3；PR，n＝5；NR，n＝21；*P<0.05；**P<0.01，通过双尾曼-惠特尼检验)。图表示出平均值与s.e.m。图7B示出了来自每个反应组患者的CAR刺激的CTL019细胞中IL-6/STAT3途径的单样品富集分析(*P<0.05，使用未配对的双尾t检验)。条形代表平均值和s.e.m。图7C示出了代表性的流式细胞术绘图，这些绘图示出了用同种型对照抗体包被的珠(模拟物刺激的)或包被有针对CAR19的抗独特型抗体的珠(CAR19刺激的)刺激过夜后，来自CR和NR患者的输注前CTL019细胞中pSTAT3的水平(左图)。来自高功能性(CR，n＝3；PRTD，n＝2)与低功能性(PR，n＝3；NR，n＝11)CAR T细胞患者的汇总数据示出在框图(右图)中。晶须代表最小值到最大值；方框代表25至75百分位数值；中间线表示中位数。通过从未刺激的细胞中的pSTAT3的MFI减去刺激的细胞中的情况来计算荧光强度(MFI)的变化。图7D示出了过继转移的CAR T细胞的最大体内增殖能力与血清IL-6(在CTL019输注后28天之内；左图)或患者匹配的CAR刺激(如上)的CTL019细胞(右图)中IL-6/STAT3基因富集的峰值水平之间的斯皮尔曼ρ相关性。
图8A-8C示出了CAR T细胞中STAT3途径的抑制。图8A示出了代表性的流式细胞术绘图，描绘了用同种型对照珠(模拟物)或包被有针对CAR19的抗独特型抗体的珠刺激过夜的CTL019细胞中pSTAT3的水平。在存在或不存在5μM Stattic(STAT3激活的小分子抑制剂)的情况下，进行CAR特异性刺激。图8B示出了在存在或不存在5μM Stattic或相当量的DMSO(对照)的情况下制造的CTL019细胞的扩增能力。然后，如箭头所示，在培养的第0、7和12天用经工程化以表达CD19的K562细胞对来自所述代表性受试者的CAR T细胞进行连续再刺激。CAR T细胞数相对于基线的倍数变化以实线(左y轴)示出，同时细胞存活力以虚线(右y轴)示出。图8C示出了来自n＝8个不同受试者的CTL019细胞的细胞增殖和存活力数据的汇总，所述细胞在再刺激之前在有或没有5μM Static的情况下扩增。
图9示出了描绘在存在或不存在重组IL-6或相当量的DMSO(对照)的情况下制造的CTL019细胞的扩增能力的图。然后，如箭头所示，在培养的第0、7和12天用经工程化以表达CD19的K562细胞或间皮素(阴性对照)对来自所述代表性受试者的CTL019细胞进行连续再刺激。
图10示出了基于具有不同表型的CAR T细胞的总剂量(细胞/kg)的受者操作特性(ROC)曲线，所述CAR T细胞被输注到反应(n＝14)患者和无反应(n＝21)患者中。
图11A至11B示出了响应于IL-6的CD27+PD-1-CD8 T细胞中pSTAT3的水平。图11A示出了代表性直方图(左图)，显示了通过荧光激活细胞分选纯化并用重组IL-6(10ng/ml)刺激的CD8+T细胞群体中pSTAT3的水平。右图示出了由来自n＝4个不同受试者的CD27和PD-1表达所定义的CD8+T细胞亚群中IL-6诱导的pSTAT3水平的汇总。通过从匹配的、未刺激的细胞中pSTAT3的MFI中减去经IL-6处理的细胞的相同参数，确定平均荧光强度(ΔMFI)的变化。图11B示出了代表性的流式细胞术(左图)和来自n＝7个不同受试者的合并数据(右图)，显示了由CD27和PD-1表达定义的CD8+T细胞群体中白介素6受体亚基β(CD130)的水平。
图12示出了描绘CD8+T细胞亚群上的gp130表达(左图)或表达gp130的CD8+T细胞亚群的频率(右图)的图。CD8+T细胞亚群分组为：CD27+CD45RO-、CD27+CD45RO+、CD27-CD45RO+和CD27-CD45RO-细胞。
图13示出了包含组成型活性STAT3(STAT3C)构建体的载体。
图14A-14B示出了gp130在T细胞上的表达以及用gp130对T细胞的选择。图14A示出了gp130在CD4+T细胞(上排)或CD8+T细胞(下排)中的表达。点阵图示出了流式细胞术数据，x轴为gp130，y轴为CCR7、CD27、PD1或CD45RO。图14B示出了基于gp130的CD4+T细胞(上排)或CD8+T细胞(下排)的阳性选择。左图示出了在选择之前T细胞中CD27和CD45RO的表达，右图示出了用gp130选择后相同标记物的表达。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
术语“一个/种(a/an)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。
当指可测量的值如量、时距等时，术语“约”意在涵盖与规定值±20％或在一些情况下±10％、或在一些情况下±5％、或在一些情况下±1％、或在一些情况下±0.1％的变化，因为此类变化适于执行所披露的方法。
术语“葡萄糖代谢”是指一种过程，例如，一种或多种生物化学过程，涉及活生物体中葡萄糖的形成、分解或相互转化。如本文所用，“葡萄糖代谢值”是指葡萄糖代谢的一种量度，例如，通过基于葡萄糖摄取细胞的具有2-NBDG的试剂盒(荧光标记的脱氧葡萄糖类似物)或葡萄糖比色测定试剂盒来测定。
术语“嵌合抗原受体”或替代性地“CAR”是指一组多肽，在最简单的实施例中典型地是两种多肽，当在免疫效应细胞中时，它为该细胞提供针对靶细胞(典型地针对癌细胞)的特异性，并且提供细胞内信号生成。在一些实施例中，CAR至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，该细胞质信号传导结构域包含衍生自如下定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，所述多肽组在同一多肽链中(例如，包含嵌合融合蛋白)。在一些实施例中，该组多肽彼此不连续，例如在不同的多肽链中。在一些实施例中，组多肽包括二聚化开关，该二聚化开关在存在二聚化分子时可以将多肽彼此偶联，例如，可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，所述CAR的刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一个方面，胞质信号传导结构域包含初级信号传导结构域(例如CD3-ζ的初级信号传导结构域)。在一个实施例中，所述胞质信号传导结构域进一步包含如下定义的至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一个实施例中，所述共刺激分子是本文所述的共刺激分子，例如，4-1BB(即，CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一个实施例中，所述CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，所述CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域以及包含共刺激分子的功能性信号传导结构域和刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，所述CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域以及包含一个或多个共刺激分子的两个功能性信号传导结构域和刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，所述CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域以及包含一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，所述CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-端)处的任选前导序列。在一个实施例中，所述CAR在细胞外抗原结合结构域的N-末端进一步包含前导序列，其中所述前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜的过程中从抗原结合结构域(例如，scFv)切割。
包含靶向特定肿瘤抗原X的抗原结合结构域(例如，scFv或TCR)的CAR(如本文描述的那些)也被称为XCAR。例如，包含靶向CD19的抗原结合结构域的CAR被称为CD19CAR。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分，其通过在细胞内传递信息以通过产生第二信使或通过响应于此类信使而用作效应子，经由定义的信号传导途径调控细胞活性起作用。
如本文所用，术语“抗体”是指衍生自与抗原特异性地结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整免疫球蛋白，并且可以衍生自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”是指抗体的至少一部分，所述至少一部分保留与抗原表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域、由抗体片段(如包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体、和分离的CDR、或抗体的其他表位结合片段。抗原结合片段还可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、纳米抗体、细胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和双-scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。还可以将抗原结合片段移植到基于多肽例如纤连蛋白III型(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。
术语“scFv”是指融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中所述轻链可变区和重链可变区例如通过合成接头(例如短柔性多肽接头)是连续连接的并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留了衍生它的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用，scFv可以例如相对于多肽的N末端和C末端以任何顺序具有VL和VH可变区，所述scFv可以包含VL-接头-VH或者可以包含VH-接头-VL。
包含抗体或其抗体片段的CAR的部分可以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链(包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)和人源化抗体)的一部分(Harlow等人,1999,于：Using Antibodies:A Laboratory Manual[使用抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],NY[纽约]；Harlow等人,1989,于：Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold SpringHarbor[冷泉港],New York[纽约]；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426)。在一个实施例中，CAR的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一个实施例中，所述CAR包含含有scFv的抗体片段。
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一个实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中该多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且该多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
包含抗体或其抗体片段的本发明CAR部分可以按多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，该连续多肽链包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体、或双特异性抗体(Harlow等人,1999:Using Antibodies:ALaboratory Manual[使用抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约；Harlow等人,1989:Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426)。在一个方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一个方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。
术语“抗体重链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种，并且通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较小的一种。κ(kappa)和λ(lambda)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内的氨基酸序列。例如，一般来说，每个重链可变区中存在三个CDR(例如HCDR1、HCDR2、和HCDR3)，并且每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、和LCDR3)。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，这些方案包括由以下文献描述的那些：Kabat等人(1991),"Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest"[具有免疫学重要性的蛋白序列]，第5版，美国国立卫生研究院，公共卫生事业部，马里兰州贝塞斯达市(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)、或其组合。在Kabat编号方案下，在一些实施例中，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia编号方案下，在一些实施例中，将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且将VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。在组合的Kabat和Chothia编号方案中，在一些实施例中，CDR对应于为Kabat CDR、Chothia CDR或两者的一部分的氨基酸残基。例如，在一些实施例中，这些CDR对应于VH(例如，哺乳动物VH，例如，人VH)中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)、和95-102(HCDR3)；以及VL(例如，哺乳动物VL，例如，人VL)中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)、和89-97(LCDR3)。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如像由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子和表达抗体蛋白的DNA分子或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中该DNA或氨基酸序列已经使用本领域可得和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫反应的分子。免疫反应可以涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的激活或两者。技术人员将理解实际上包括所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。技术人员将理解包含编码引发免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此编码“抗原”(当该术语在本文中使用时)。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所希望的免疫反应的多肽。另外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或可以衍生自生物样品，或者可以是除多肽外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。
术语“自体的”是指衍生自与后来将其重新引入个体中的同一个体的任何材料。
术语“同种异体的”是指衍生自与引入材料的个体相同的物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座处的基因不相同时，称两个或更多个个体彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体材料可以在遗传上充分不同以抗原性地相互作用
术语“异种的”是指衍生自不同物种的动物的任何材料。
术语“癌症”是指特征在于异常细胞不受控制生长的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的实例，并且包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语包括实体和液体瘤，例如，弥散或循环肿瘤。如本文所用，所述术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。
“衍生自”(当该术语在本文中使用时)表示第一分子和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并不暗示或包括对衍生自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，在衍生自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，使得其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它没有暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它并不意指为了提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并删除不需要的序列，或强加突变，以到达细胞内信号传导结构域。
短语“与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的疾病”包括但不限于与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的疾病或与表达如本文描述的肿瘤抗原的细胞相关的病症，包括例如增生性疾病(如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)；或与表达如本文描述的肿瘤抗原的细胞相关的非癌症相关适应症。在一个实施例中，与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的癌症是血液癌症。在一个实施例中，与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的癌症是实体癌。与如本文所述的肿瘤抗原的表达相关的其他疾病包括但不限于例如，非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的增生性疾病。与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如，自身免疫性疾病(例如，狼疮)、炎性障碍(过敏症和哮喘)和移植。在一些实施例中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施例中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施例中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
短语“与CD19表达相关的疾病”包括但不限于与CD19表达相关的疾病或与表达CD19的细胞相关的病症，包括例如，增殖性疾病(例如，癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(例如，骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)；或与表达CD19的细胞相关的非癌症相关适应症。在一个方面，与CD19表达相关的癌症是血液学癌症。在一个方面，该血液癌症是白血病或淋巴瘤。在一个方面，与CD19表达相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于：例如，一种或多种急性白血病，包括但不限于，例如，急性髓性白血病(AML)、B细胞急性淋巴性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴性白血病(TALL)、急性淋巴性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。与CD19表达相关的其他癌症或血液学病症包括但不限于例如B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、骨髓增生性肿瘤；组织细胞性障碍(例如肥大细胞障碍或母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤)；肥大细胞障碍，例如，系统性肥大细胞增多症或肥大细胞白血病；B细胞幼淋巴细胞性白血病、浆细胞骨髓瘤和为由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)联合在一起的多种血液病症集合的“白血病前期”等。此外，与CD19表达相关的疾病包括但不限于例如，与CD19表达相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或增生性疾病。与CD19表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如，自身免疫疾病(例如，狼疮)、炎性障碍(过敏和哮喘)和移植。在一些实施例中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施例中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施例中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。在其他实施例中，所述疾病是CD19阴性癌症，例如，CD19阴性复发癌症。在一些实施例中，表达肿瘤抗原(例如，CD19)的细胞表达或曾在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施例中，表达肿瘤抗原(例如，CD19)的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如，野生型或突变型)，并且肿瘤抗原蛋白可以正常水平或降低的水平存在。在一个实施例中，表达肿瘤抗原(例如，CD19)的细胞在某一点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
短语“与B细胞抗原表达相关的疾病”包括但不限于与CD19、CD20、CD22或ROR1中的一种或多种的表达相关的疾病，或与表达或在任何时间表达CD19、CD20、CD22或ROR1中的一种或多种的细胞相关的病症，包括例如增殖性疾病(例如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(例如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)；或与表达CD19、CD20、CD22或ROR1中的一种或多种的细胞相关的非癌症相关适应症。为避免疑义，与B细胞抗原表达相关的疾病可包括与目前不表达B细胞抗原(例如，因为比如由于用靶向B细胞抗原的分子例如，靶向B细胞的CAR进行治疗导致抗原表达已被下调)但曾经表达所述抗原的细胞相关的病症。短语“与B细胞抗原表达相关的疾病”包括与CD19表达相关的疾病，如本文所述。在实施例中，这些表达CAR的细胞用于治疗与B细胞抗原相关的疾病。在实施例中，通过本文的方法产生的CAR包含靶向B细胞抗原的抗原结合结构域。
如本文所使用的术语“复发”是指疾病(例如，癌症)在最初的反应期(例如，完全反应或部分反应)之后(例如在先前的治疗(例如，癌症治疗)之后)的再现。反应初始期可能涉及癌细胞水平降低至低于某一阈值，例如低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。再现可能涉及癌细胞水平升高超过某一阈值，例如，高于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。例如，如在B-ALL的上下文中，再现可能涉及例如在完全反应之后血液、骨髓(>5％)或任何髓外位点中的母细胞再现。在本上下文中，完全反应可能涉及<5％BM母细胞。更通常地，在一个实施例中，反应(例如，完全反应或部分反应)可能涉及不存在可检测的MRD(最小残留疾病)。在一个实施例中，初始反应期持续至少1、2、3、4、5、或6天；至少1、2、3、或4周；至少1、2、3、4、6、8、10、或12个月；或至少1、2、3、4、或5年。
如本文所用的“难治性”是指对治疗无反应的疾病，例如癌症。在实施例中，难治性癌症可以在治疗开始之前或治疗开始时对治疗具有抗性。在其他实施例中，难治性癌症可能在治疗期间变得有抗性。难治性癌症也称为抗性癌症。
术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本发明的抗体或抗体片段中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本文所述CAR内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换，并且可以使用本文描述的功能测定法测试改变的CAR。
术语“刺激”是指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物或CAR)与其同源配体(或在CAR情况下的肿瘤抗原)的结合诱导的初级反应，从而介导信号转导事件，如但不限于，通过TCR/CD3复合物的信号转导或通过适当的NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达。
术语“刺激分子”是指由免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，其提供以针对免疫细胞信号传导途径的至少一些方面的刺激方式调节免疫细胞激活的一个或多个细胞质信号传导序列。在一个方面，信号是初级信号，该初级信号通过例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合而启动，并且导致了介导T细胞反应，包括但不限于增殖、激活、分化等。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。在本发明中特别有用的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。在本发明的特定CAR中，本发明的任何一种或多种CAR中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是提供为SEQ ID NO:9的序列(突变型CD3ζ)，或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是SEQID NO:10中提供的序列(野生型人CD3ζ)，或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指免疫系统细胞如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)，该免疫系统细胞在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外源抗原。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将它们呈递给T细胞。
如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域可产生信号，所述信号促进含有CAR的细胞(例如，CART细胞)的免疫效应子功能。免疫效应子功能的实例，例如在CART细胞中，包括细胞溶解活性和辅助活性(包括分泌细胞因子)。在实施例中，所述细胞内信号传导结构域是指蛋白质的转导效应子功能信号并指导细胞进行特化功能的部分。虽然可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，可以使用这种截短部分代替完整链，只要截短部分可转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
在一个实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包含衍生自负责初级刺激、或抗原依赖性模拟的分子的那些。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包含衍生自负责共刺激信号、或抗原非依赖性刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包括来自共受体或共刺激分子的胞质序列。
初级细胞内信号传导结构域可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(“ICOS”)、FcεRI以及CD66d、CD32、DAP10和DAP12的那些。
术语“ζ”或替代性地“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”定义为作为GenBank登录号BAG36664.1、或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基提供的蛋白质，并且“ζ刺激结构域”或替代性地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”定义为来自ζ链足以在功能上传输T细胞激活所必需的初始信号的细胞质结构域的氨基酸残基。在一个方面，ζ的细胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至164或是其功能性直向同源物的来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基。在一个方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是作为SEQ ID NO:9提供的序列。在一个方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是作为SEQ ID NO:10提供的序列。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，该同源结合配偶体与共刺激配体特异性地结合，从而介导T细胞的共刺激反应，如但不限于增殖。共刺激分子是有效免疫反应所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。
共刺激细胞内信号传导结构域是指共刺激分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域可以包含其来源的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段。
细胞内信号传导结构域可以包含其来源的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段。
术语“4-1BB”是指具有作为GenBank登录号AAA62478.2，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基提供的氨基酸序列的TNFR超家族的成员；并且“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”是作为SEQ IDNO:7或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基提供的序列。
当该术语在本文中使用时，“免疫效应细胞”是指参与免疫反应(例如促进免疫效应子反应)的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、和骨髓衍生的吞噬细胞。
当该术语在本文中使用时，“免疫效应子功能或免疫效应子反应”是指例如免疫效应细胞的增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或反应。例如，免疫效应子功能或反应是指促进靶细胞的杀伤或抑制生长或增殖的T或NK细胞的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或反应的实例。
术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。
术语“耗减(deplete)”或“耗减(depleting)”在本文中可互换使用，是指在进行例如，选择步骤(例如，阴性选择)的过程之后，样品中细胞、蛋白质或大分子的水平或量的降低或减少。耗减可以是细胞、蛋白质或大分子的完全或部分耗减。在一个实施例中，耗减为与进行该过程之前样品中的细胞、蛋白质或大分子的水平或量相比细胞、蛋白质或大分子的水平或量的降低或减少至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。
术语“富集的(enriched)”或“富集(enrichment)”在本文中可互换使用，是指在进行例如，选择步骤(例如，阳性选择)的过程之后，样品中细胞、蛋白质或大分子的水平或量的上升。富集可以是细胞、蛋白质或大分子的完全或部分富集。在一个实施例中，富集为与参考样品中细胞、蛋白质或大分子的水平或量相比，所述细胞、蛋白质或大分子的水平或量上升至少1％，例如，至少1％-200％，例如，至少1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-50％、50％-70％、70％-90％、90％-110％、110％-130％、130％-150％、150％-170％或170％-200％。在一些实施例中，富集为与参考样品中细胞、蛋白质或大分子的水平或量相比，所述细胞、蛋白质或大分子的水平或量上升至少5％，例如，至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％，22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，富集为与参考样品中细胞、蛋白质或大分子的水平或量相比，所述细胞、蛋白质或大分子的水平或量上升至少1.1倍，例如，1.1-200倍，例如，1.1-10、10-20、20-30、30-50、50-70、70-90或90-100倍。在一些实施例中，所述参考样品可以是相同样品，例如，在进行所述过程之前的样品。在一些实施例中，所述相同样品是指随后对其进行富集的样品，例如，富集前的群体，例如，起始群体。在一些实施例中，所述参考样品可以是不同的样品，例如，不对其进行处理的样品。
术语“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列用作在生物过程中用于合成具有确定核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码蛋白质或者该基因或cDNA的其他产物。
除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包含内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可以在某些形式中含有一个或多个内含子。
术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何材料。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何材料。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可用于向细胞内部递送该分离的核酸的物质组合物。许多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒、以及病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应当解释为进一步包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与有待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法中的一种。HIV、SIV、和FIV都是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”是指衍生自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如下提供的自灭活慢病毒载体：Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。可以在临床中使用的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自牛津生物医药公司(Oxford BioMedica)的
Figure BDA0002462996200000631
基因递送技术、来自Lentigen公司的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可得的并且是本领域技术人员已知的。
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在所述位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配位置或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被具有所希望的特异性、亲和力、和能力的来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应非人残基置换。此外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有如下项：至少一个(典型地两个)可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，且FR区的所有或显著一部分是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。有关进一步的细节，参见Jones等人,Nature[自然],321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature[自然],332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学现状],2:593-596,1992。
“完全人”是指如下免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，其中整个分子是人起源或由与抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”意指从天然状态改变的或去除的。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质能以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如像宿主细胞)中。
在本发明的上下文中，使用以下对常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。
术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列和异源核酸序列之间的导致后者的表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列有功能关系时，该第一核酸序列与该第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列可操作地连接。可操作地连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们处于同一阅读框中。
术语“肠胃外”施用免疫原性组合物包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或其DNA或RNA的组合，及其聚合物。术语“核酸”包括基因、cDNA或mRNA。在一个实施例中，所述核酸分子是合成的(例如，化学合成的)或重组的。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的类似物或衍生物的核酸，这些核酸具有与参考核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其经保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指明的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res[核酸研究].19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem[生物化学杂志].260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包含由肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语是指短链，例如其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体；并且还是指较长的链，其在本领域中通常称为蛋白质，所述蛋白质存在有很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”是指启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器所识别的DNA序列。
术语“启动子/调控序列”是指表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列还可以包含增强子序列和表达基因产物所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或全部生理条件下致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子是指当与编码或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换地指，与正常细胞相比，在癌细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)优先表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其可用于优先将药理学药剂靶向癌细胞。在一些实施例中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标记物，例如，谱系标记物，例如，B细胞上的CD19。在某些方面，本发明的肿瘤抗原衍生自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌(如乳腺癌、前列腺癌症)、卵巢癌、胰腺癌等。在一些实施例中，癌症相关抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达(例如与正常细胞相比1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多)的细胞表面分子。在一些实施例中，癌症相关抗原是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施例中，癌症相关抗原将仅在癌细胞的细胞表面上完全或作为片段(例如MHC/肽)表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施例中，本发明的CAR包括包含结合MHC呈递的肽的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)的CAR。通常，衍生自内源性蛋白质的肽填充主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋，并且被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表用于免疫疗法的独特类别的细胞表面靶标。已经描述了在人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的上下文中靶向衍生自病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见，例如，Sastry等人,JVirol.[病毒学杂志]2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood[血液],2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol[免疫学杂志]2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,Gene Ther[基因治疗]2001 8(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med[科学·转化医学]2013 5(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]2012 19(2):84-100)。例如，可以从筛选文库(如人scFv噬菌体展示文库)鉴定TCR样抗体。
如在scFv的情况下中使用的术语“柔性多肽接头”或“接头”是指由单独或组合使用的氨基酸(如甘氨酸和/或丝氨酸)残基组成的肽接头，以将可变重链和可变轻链区连接在一起。在一个实施例中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:15)，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5，n＝6，n＝7，n＝8，n＝9，以及n＝10。在一个实施例中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO:28)。在另一个实施例中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:29)的多个重复。WO 2012/138475中描述的接头也被包括在本发明的范围内，将该文献通过引用并入本文。
如本文所用，5'帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是已经在转录开始后不久添加到真核信使RNA的“前”端或5'端的经修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽由与第一转录核苷酸连接的末端基团组成。它的存在对于被核糖体识别和被保护免于RNA酶至关重要。帽添加与转录偶联，并且共转录地发生，使得每个都影响另一个。在转录开始后不久，合成的mRNA的5'端被与RNA聚合酶相关的帽合成复合物结合。这种酶复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成作为多步生物化学反应进行。可以修饰加帽部分以调制mRNA的功能，如其稳定性或翻译效率。
如本文所用，“体外转录的RNA”是指已在体外合成的RNA，例如，mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
如本文所用，“聚(A)”是通过聚腺苷酸化与mRNA附接的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的一些实施例中，所述聚A为50个至5000个之间(SEQ ID NO:30)(例如，大于64个，例如，大于100个，例如，大于300个或400个)聚(A)序列可以经化学修饰或酶促修饰以调制mRNA功能，如定位、稳定性或翻译效率。
如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酰基部分或其经修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端被聚腺苷酸化。3'聚(A)尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加到前mRNA上的腺嘌呤核苷酸(通常数百个)的长序列。在高等真核生物中，将聚(A)尾添加到含有特定序列(聚腺苷酸化信号)的转录物上。聚(A)尾和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、从细胞核输出mRNA以及翻译也是重要的。聚腺苷酸化在DNA转录成RNA后立即在细胞核中发生，但另外也可稍后在胞质中发生。在转录已经终止后，通过与RNA聚合酶缔合的核酸内切酶复合物的作用切割mRNA链。切割位点通常被表征为切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA被切割后，腺苷残基被添加到切割位点处的游离3'端上。
如本文所用，“瞬时”是指非整合转基因的持续数小时、数天或数周的表达，其中表达的时间段小于在整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子内的情况下基因的表达的时间段。
单采术是从个体中抽取全血，分离成选定组分，然后将其余血液恢复至循环中的过程。通常，有两种分离血液组分的方法：离心法和非离心法。白细胞单采术可以主动选择和去除患者的白细胞。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善增殖性障碍的进展、严重程度和/或持续时间，或者改善增殖性障碍的一种或多种症状(例如，一种或多种可辨别的症状)，这由施用一种或多种疗法(例如，一种或多种治疗剂，如本披露的CAR)引起。在具体的实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指改善增殖性障碍的至少一种可测量的物理参数，如肿瘤的生长，这不一定是患者可辨别的。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指通过例如稳定可辨别的症状来物理地，或通过例如稳定物理参数来生理地，或通过两者，抑制增殖性障碍的进展。在其他实施例中，所述术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。
术语“信号转导途径”是指在多种信号转导分子之间的生物化学关系，这些信号转导分子在信号从细胞的部分传递至细胞的另一部分中发挥作用。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并且传递信号跨过细胞膜的分子以及分子复合物。
术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物、人)。
术语“基本上纯化的”细胞是指本质上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下正常相关的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群体是指同质的细胞群体。在其他情况下，该术语仅指已经与其天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在一些方面，在体外培养细胞。在其他方面，不在体外培养细胞。
在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性障碍抗原”或“与过度增殖性障碍相关的抗原”是指特异性过度增殖性障碍常见的抗原。在某些方面，所述肿瘤抗原衍生自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌(如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等)。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主体细胞及其子代。
术语“特异性结合”是指识别样品中存在的同族结合配偶体蛋白并与其结合的抗体或配体，但所述抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。
范围：贯穿本公开内容，能以范围形式呈现本发明的各个方面。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便以及简洁，不应该被理解为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为是具有确切披露的所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围如从1至6的描述应当被认为是具有确切披露的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围如95％-99％同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且包括如96％-99％、96％-98％、96％-97％、97％-99％、97％-98％和98％-99％同一性的子范围。无论范围的宽度如何，这都适用。
如本文所用，术语“Stat3激活剂”是指如下的分子，其激活Stat3途径，例如，引起Stat3(例如，在酪氨酸705(Y705)上)的磷酸化增加，或增加Stat3激活的基因的转录，或通过减少Stat3抑制基因的转录。所述Stat3激活剂可包含，例如，多肽或小分子。在一些实施例中，所述Stat3激活剂在Stat3的上游起作用，例如，通过结合gp130。在一些实施例中，所述Stat3激活剂结合Stat3。Stat3激活剂，包括但不限于：IL-6家族细胞因子；IL-10家族细胞因子；IL-17家族细胞因子；CCL20分子；gp130激活剂；IL-10R2受体激活剂；可溶性IL-6受体；以及IL-6/IL-6R复合物。在一些实施例中，Stat3激活剂可导致CAR T细胞扩增，例如，体外或体内扩增。
如本文所用的术语“Stat3激活细胞”是指包含(例如，表达)Stat3激活剂(例如，作为可溶性蛋白或在细胞表面)的细胞，或与Stat3激活剂缀合的细胞，例如，位于细胞表面。
如本文所用，术语“IL-6家族细胞因子”是指IL-6细胞因子家族中的分子，并且是指全长天然存在的IL-6细胞因子家族成员、其活性片段或其活性变体。在实施例中，所述IL-6家族细胞因子选自IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、IL-31分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子或OSM分子。在一些实施例中，IL-6家族细胞因子结合受体，例如，α受体(例如，IL-6Rα、IL-11Rα或CNTFRα)。在一些实施例中，与α受体结合的IL-6家族细胞因子导致形成复合物，例如，包含α受体和信号转导β受体的复合物，例如，gp130。在实施例中，IL-6家族细胞因子通过信号转导β受体(例如，gp130)发出信号。在一些实施例中，IL-6家族细胞因子激活Stat3途径，例如，使酪氨酸705磷酸化；或增加Stat3激活基因的转录，或减少Stat3抑制基因的转录。在一些实施例中，IL-6家族细胞因子导致CAR T细胞扩增，例如，体外或体内扩增。
如本文所用，术语“IL-6分子”是指全长天然存在的IL-6(例如，哺乳动物IL-6，例如，人IL-6，例如，GenBank登录号CAA68278.1)、IL-6的活性片段，或与IL-6的天然存在的野生型多肽或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的活性变体。在一些实施例中，所述变体(例如，活性变体)是野生型多肽或编码所述多肽的核酸的衍生物，例如，突变体。在一些实施例中，所述IL-6变体(例如，IL-6的活性变体)具有野生型IL-6多肽的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性，例如，如通过实例2的测定所测量的。在一些实施例中，IL-6分子通过gp130受体发出信号。在一些实施例中，IL-6分子激活Stat3途径，例如，使酪氨酸705磷酸化；或增加Stat3激活基因的转录，或减少Stat3抑制基因的转录。在一些实施例中，所述IL-6分子包含一种或多种翻译后修饰。
如本文所用，细胞因子分子的“活性变体”是指具有野生型细胞因子的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性的细胞因子变体，例如，如通过本领域公认的测定所测量的。
如本文所用，术语“IL-10家族细胞因子”是指IL-10细胞因子家族中的分子，并且是指全长天然存在的IL-10细胞因子家族成员、其活性片段或其活性变体。在实施例中，所述IL-10家族细胞因子选自IL-10分子、IL-19分子、IL-20分子、IL-22分子、IL-24分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子或IL-29分子。在一些实施例中，IL-10家族细胞因子通过IL-10R2受体发出信号。在一些实施例中，IL-10家族细胞因子导致CAR T细胞扩增，例如，体外或体内扩增。
如本文所用，术语“IL-17家族细胞因子”是指IL-17细胞因子家族中的分子，并且是指全长天然存在的IL-17细胞因子家族成员、其活性片段或其活性变体。在实施例中，所述IL-17家族细胞因子选自IL17A分子、IL17B分子、IL17C分子、IL17D分子、IL17E分子或IL17F分子。在一些实施例中，IL-17家族细胞因子导致CAR T细胞扩增，例如，体外或体内扩增。
如本文所用，术语“gp130激活剂”是指激活gp130(例如，引起二聚，例如gp130的均聚，或gp130的异二聚，例如与LIF、OSM或CNTF)的分子。在一些实施例中，所述gp130激活剂选自IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子、OSM分子或与gp130结合的抗体分子，例如，抗gp130抗体分子。在一些实施例中，gp130激活剂导致经由gp130的信号传导。在一些实施例中，gp130激活剂激活Stat3途径，例如，使酪氨酸705磷酸化；或增加Stat3激活基因的转录，或减少Stat3抑制基因的转录。在一些实施例中，gp130激活剂导致CAR T细胞扩增，例如，体外或体内扩增。
术语“gp130分子”是指全长天然存在的gp130(例如，哺乳动物gp130，例如，人gp130，例如，GenBank登录号AAI17403)、gp130的活性片段，或与gp130的天然存在的野生型多肽或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的活性变体。在一些实施例中，所述变体是野生型多肽或编码所述多肽的核酸的衍生物，例如，突变体。在一些实施例中，所述gp130变体，例如，gp130的活性变体，具有野生型gp130多肽的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性。在一些实施例中，gp130分子激活Stat3途径，例如，使酪氨酸705磷酸化；或增加Stat3激活基因的转录，或减少Stat3抑制基因的转录。在一些实施例中，gp130激活剂导致CAR T细胞扩增，例如，体外或体内扩增。gp130也称为CD130或IL-6受体亚基β(IL-6RB)。
如本文所用，术语“Stat3分子”是指如下的分子，其激活Stat3途径，例如，引起Stat3(例如，在酪氨酸705(Y705)上)的磷酸化增加，或通过增加Stat3激活的基因的转录，或通过减少Stat3抑制基因的转录。术语“Stat3分子”是指全长天然存在的Stat3(例如，哺乳动物Stat3，例如，人Stat3，例如，GenBank登录号AAS66986.1)、Stat3的活性片段，或与Stat3的天然存在的野生型多肽或编码所述多肽的核酸具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的活性变体。在一些实施例中，所述变体是野生型多肽或编码所述多肽的核酸的衍生物，例如，突变体。在一些实施例中，所述Stat3变体(例如，Stat3的活性变体)具有野生型Stat3多肽的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性，例如，如通过实例2的测定所测量的。在一些实施例中，Stat3分子导致CAR T细胞扩增，例如，体外或体内扩增。
描述
本披露除其他方面外，提供了改进的制备方法，例如，制造表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)的方法。本披露还提供了组合物和包含所述组合物的反应混合物。在一些实施例中，制备方法包括使免疫效应细胞群体与(i)Stat3激活剂(例如，如本文所述)、(ii)糖酵解抑制剂(例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG))或(i)和(ii)两者接触。在一些方面，本披露还提供评价、预测、选择或监测将要接受、正要接受、已经接受或正在接受用表达CAR的细胞进行的治疗性治疗的受试者的方法。本文还描述了评价或预测患有癌症(例如，本文所述的癌症)的受试者对用表达CAR的细胞进行的治疗性治疗的反应性的方法。
在一个方面，本披露提供了改进的制造表达CAR的细胞的方法。如本文实例1中所述，降低葡萄糖代谢可导致表达CAR的细胞的功效改进。因此，可以基于较低的葡萄糖代谢来选择免疫效应细胞用于CAR疗法，或者可以将葡萄糖代谢的抑制剂添加到制造过程中，以改进表达CAR的细胞的功效。此外，本文的实例2描述了Stat3途径激活作为改进表达CAR的细胞的功效的方式。
本披露还描述了制造可以用CAR(例如，本文所述的CAR)工程化的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的方法，以及包含此类细胞的反应混合物和组合物。本文提供的方法改进了适合于表达CAR的细胞的产量和质量，例如，纯度。不希望受理论束缚，据信可进行工程化以表达CAR的细胞的产量和质量的改进使引入编码CAR的核酸的效率改进，并使所得表达CAR的细胞的扩增改进。因此，本文所述的方法和组合物提供了用于治疗受试者疾病的改进的表达CAR的细胞产物。
本披露还描述了去除不需要的材料、非靶细胞或可以负面影响CAR的表达或表达CAR的细胞的治疗功效的方法。例如，本文介绍的方法可用于除去或耗减以下任何一种或多种：单核细胞、粒细胞、红细胞、血小板、B细胞、癌细胞，例如，淋巴母细胞、冷冻保护剂(来自冷冻样品)、血红蛋白或细胞碎片。例如，本文介绍的方法可用于富集或增加以下任何一种或多种的数量：T细胞(CD4+和/或CD8+T细胞)、NK细胞、树突细胞。单独实施本文描述的每种方法或与本文描述的每种或所有方法的任何组合的实施方式产生了适合于工程化以表达CAR的改良的起始材料。
新鲜的单采材料通常用于制造适合于表达CAR的细胞。使用冷冻的，例如，冷冻保存的，单采材料提供了易于运输的优点，从而消除了对患者与表达CAR的细胞产物的制造设施的位置距离的任何限制，并且使表达CAR的细胞的制造过程产业化，且使需要的患者更容易获得治疗产品。当前用于制造表达CAR的细胞的方法已经过优化，可用于处理新鲜的单采材料，不能用于从冷冻的单采样品中获得相似质量或产量的适合于CAR表达的细胞。相反，本文所述的方法可用于从冷冻的例如冷冻保存的单采样品中加工和制备适合于CAR表达的细胞。在起始材料为冷冻(例如，冷冻保存)的实施例中，本文所述的方法任选地包括解冻步骤，在所述解冻步骤中，使冷冻的细胞在例如不受操作员或用以加速解冻过程的装置干预的情况下解冻，或者使冷冻的细胞经受加速解冻过程的装置或过程(例如通过使用解冻装置，例如PlasmaTherm)。在这样的实施例中，解冻的材料具有与周围环境相同的温度，例如，与房间的环境温度相同的温度或与将解冻的材料添加至其中、用其洗涤或用其孵育的缓冲液的温度相同的温度。本文描述的方法对于从冷冻或解冻的输入样品(例如，冷冻或解冻的单采样品)中产生或富集免疫效应细胞群体特别有用，所述免疫效应细胞群体可以经工程化以表达CAR。
如本文所指，过程B是用于富集经工程化以表达当前使用的CAR的免疫效应细胞的标准方案。过程B包括使用Ficoll进行密度梯度纯化，以及使用CD3/CD28 Dynabeads进行阳性选择，其中所述输入样品是新鲜的单采材料。本文描述的方法提供了适合于表达CAR的所希望的免疫效应细胞的更大的富集、改进的质量和产量。
在另一个方面，本披露的特征在于免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，例如，通过本文所述的任何制造方法制备，经工程化以表达CAR，其中经工程化的免疫效应细胞表现出抗肿瘤特性。在一个实施例中，所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域。一种示例性抗原是本文所述的癌症相关抗原(即，肿瘤抗原)。在一个方面，用CAR转化细胞，并在细胞表面上表达CAR。在一些实施例中，用编码CAR的病毒载体转导细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在一些实施例中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施例中，病毒载体是慢病毒载体。在一些此类实施例中，细胞可以稳定地表达CAR。在另一个实施例中，用编码CAR的核酸(例如，mRNA、cDNA、DNA)转染细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在一些此类实施例中，细胞可以瞬时表达CAR。
此外，本披露提供表达CAR细胞组合物及其在治疗(在其他疾病中)癌症或任何恶性肿瘤或涉及表达如本文所述的肿瘤抗原的细胞或组织的自身免疫疾病等的药物或方法中的用途。
淘洗
在一个方面，本文描述的方法的特征在于淘洗方法，其去除不需要的细胞，例如，单核细胞和母细胞，从而导致适合CAR表达的所希望的免疫效应细胞的富集改进。在一个实施例中，本文所述的淘洗方法针对从先前冷冻的样品(例如，解冻的样品)富集适合CAR表达的所希望的免疫效应细胞进行了优化。在一个实施例中，与从本领域已知的淘洗方案收集的细胞制剂相比，本文所述的淘洗方法提供了具有改进的纯度的细胞制剂。
为了促进制造物流(远程样品收集、运输、存储和生产单位调度)，细胞原材料典型地是冷冻保存的全血或单采材料，在开始制造之前需要将其解冻。但是，先前解冻的材料解冻后的细胞密度和大小与新鲜材料完全不同。因此，通常用以分离用于工程化表达CAR的细胞的标准淘洗方案在很大程度上不能从冷冻保存和解冻的全血或单采材料中除去单核细胞、粒细胞或任何更大尺寸的细胞。这种情况会对后续CART制造步骤的结果产生负面影响，从而导致较差的产量、产品质量问题以及不合规格的过程偏差。尽管淘洗可以去除单核细胞，但去除母细胞效率不高，因为母细胞的密度和大小与T淋巴细胞相似。
在一个实施例中，本文所述的淘洗方法包括使用起始样品(例如，细胞样品，例如，解冻的细胞样品)优化的粘度，通过用某些等渗溶液(例如，PBS)稀释，并使用流速的优化组合并通过淘洗装置收集的每个级分的收集量。实例1中描述了修改后的淘洗程序的示例。
表4提供了用于从单核细胞中分离淋巴细胞(例如，T细胞)的淘选设置的示例性范围。表4的“实例”列中还提供了示例性淘洗程序的流速、离心转速和容积设置。
表4.淘洗设置范围
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在一个实施例中，从淘洗步骤中收集一、二、三、四、五、六、七、八、九或十种或更多种级分。在一个实施例中，从淘洗步骤中收集了五种级分。在收集五个级分的实施例中，第三级分(F3)或第四级分(F4)，或第三级分和第四级分的组合，包含所希望的淋巴细胞群体以及极少量的单核细胞、粒细胞和其他非淋巴细胞的细胞。在一个实施例中，使用不同的流速收集每种级分。在一个实施例中，对于每种级分，流速在收集先前级分使用的流速的基础上增加。在一个实施例中，使用不同的收集量收集一种或多种级分。
在一个实施例中，使用约20-90mL/min、约30-90mL/min、约40-90mL/min、约50-90mL/min、约60-90mL/min、约70-90mL/min、约40-85mL/min、约50-82mL/min、约60-82mL/min、约70-82mL/min、约50-80mL/min、约60-80mL/min、约70-80mL/min的流速进行淘洗。在一个实施例中，使用约30-82mL/min或约50-80mL/min的流速进行淘洗。在一个实施例中，使用约30、40、50、60、70、72、80或82mL/min的流速进行淘洗。在一个实施例中，使用约70mL/min或72mL/min的流速进行淘洗。
在一个实施例中，包含所希望的淋巴细胞群体以及最小量的单核细胞、粒细胞、其他非淋巴细胞的细胞和其他不希望的组分的一种或多种级分的流速为约20-90mL/min、约30-90mL/min、约40-90mL/min、约50-90mL/min、约60-90mL/min、约70-90mL/min、约40-85mL/min、约50-82mL/min、约60-82mL/min、约70-82mL/min、约50-80mL/min、约60-80mL/min、约70-80mL/min。在一个实施例中，包含所希望的淋巴细胞群体的一种或多种级分的流速为约50-82mL/min、约50-80mL/min、约60-82mL/min、约60-80mL/min、约70-82mL/min、约70-80mL/min、约70-75mL/min、约70-72mL/min。在一个实施例中，包含所希望的淋巴细胞群体的一种或多种级分的流速为约70mL/min或72mL/min。
在一个实施例中，使用约250-1250mL、约250-1000mL、约300-1000mL、约400-1000mL、约500-1000mL、约600-1000mL、约700-1000mL、约800-1000mL、约900-1000mL、约250-975mL、约300-975mL、约400-975mL、约500-975mL、约600-975mL、约700-975mL、约800-975ml、约300-900mL、约300-800mL、约300-700mL、约300-600mL、约300-500mL或约300-400mL的收集量进行淘洗。在一个实施例中，使用约250、400、500、900或975mL的收集量进行淘洗。在一个实施例中，使用约400mL或约975mL的收集量进行淘洗。
在一个实施例中，包含所希望的淋巴细胞群体以及最小量的单核细胞、粒细胞、其他非淋巴细胞的细胞和其他不希望的组分的一种或多种级分的收集量为约250-1250mL、约250-1000mL、约300-1000mL、约400-1000mL、约500-1000mL、约600-1000mL、约700-1000mL、约800-1000mL、约900-1000mL、约250-975mL、约300-975mL、约400-975mL、约500-975mL、约600-975mL、约700-975mL、约800-975ml、约300-900mL、约300-800mL、约300-700mL、约300-600mL、约300-500mL或约300-400mL。在一个实施例中，包含所希望的淋巴细胞群体的一种或多种级分的收集量为约250、400、500、900或975mL。在一个实施例中，包含所希望的淋巴细胞群体的一种或多种级分的收集量为约400mL或约975mL。
在一个实施例中，本文所述的淘洗方法由淘洗装置进行。例如，所述淘洗装置是Caridian BCT ElutraTM细胞分离系统(Terumo BCT 71800型)。Caridian BCT ElutraTM细胞分离系统(Terumo BCT 71800型)是一个封闭系统，所述系统利用连续逆流淘洗技术主要根据大小、其次根据比重进行细胞分离。培养基流入分离室所产生的反作用力以及离心力所产生的沉降速度会导致细胞在分离室内按大小和密度进行排列，在此将它们自动虹吸到收集袋中。定制的Elutra设置旨在允许淋巴细胞和单核细胞与粒细胞组合分布在不同级分中。Elutra可根据制造商的说明进行操作。
密度梯度离心
过继性细胞治疗产品的制造需要处理所希望的细胞(例如，免疫效应细胞)，使其远离外周血单采起始材料中存在的血细胞和血液成分的复杂混合物。通过Ficoll溶液使用密度梯度离心成功分离了外周血衍生的淋巴细胞样品。然而，Ficoll不是用于分离治疗用细胞的优选试剂，因为Ficoll不适合临床使用。此外，Ficoll含有乙二醇，它对细胞有潜在毒性。此外，冷冻保存后解冻的单采血产物的Ficoll密度梯度离心产生次优的T细胞产物，例如，如本文实例中所述。例如，在通过Ficoll溶液的密度梯度离心分离的细胞制剂中观察到最终产物中T细胞的损失，伴随非T细胞的相对增加，尤其是不希望的B细胞、胚细胞和单核细胞。
不希望受理论束缚，据信免疫效应细胞(例如，T细胞)在冷冻保存期间脱水，变得比新鲜细胞更稠密。不希望受理论束缚，还据信免疫效应细胞(例如，T细胞)比其他血细胞保持密集更久，因此与其他细胞相比，在Ficoll密度梯度分离期间更容易丢失。因此，不希望受理论束缚，与Ficoll或具有与Ficoll相同密度(例如，1.077g/mL)的其他培养基相比，认为密度大于Ficoll的培养基提供了所希望的免疫效应细胞的改进的分离。
在一个实施例中，本文所述的密度梯度离心方法包括使用包含碘克沙醇的密度梯度培养基。在一个实施例中，密度梯度培养基包含在水中约60％的碘克沙醇的溶液。
在一个实施例中，本文所述的密度梯度离心方法包括使用具有密度大于Ficoll的密度梯度培养基。在一个实施例中，本文所述的密度梯度离心方法包括使用密度梯度培养基，其具有大于1.077g/mL，例如，大于1.077g/mL、大于1.1g/mL、大于1.15g/mL、大于1.2g/mL、大于1.25g/mL、大于1.3g/mL、大于1.31g/mL的密度。在一个实施例中，所述密度梯度培养基具有约1.32g/mL的密度。
在一个实施例中，本文所述的密度梯度离心方法包括使用包含碘克沙醇的密度梯度培养基，例如，在水中约60％的碘克沙醇，并且密度大于Ficoll，例如，大于1.077g/mL，例如，约1.32g/mL。在一个实施例中，本文所述的密度梯度离心方法包括使用包含碘克沙醇的密度梯度培养基OptiPrepTM(西格玛公司(Sigma))。OptiPrepTM是一种60％(重量/体积)碘克沙醇的无菌且经过内毒素测试的现成溶液，密度为1.320±0.001g/ml。相反，Ficoll密度梯度溶液的密度仅为1.077g/ml。与Ficoll相比，OptiPrepTM的另一个优势是OptiPrepTM具有GMP等级，并且因此符合治疗用途。
不希望受理论的束缚，据信例如对解冻的单采材料利用OptiPrep密度梯度离心步骤不太可能保留不良的B细胞和单核细胞，因此据信可以进一步改进所希望的靶免疫效应细胞(例如，T细胞)的收集，用于后续的激活和转导步骤。因此，不希望受理论的束缚，据信与Ficoll相比，OptiPrep的更大密度既可以增强所希望的免疫效应细胞(例如，T细胞)的纯化和回收，又可以同时去除不需要的非T细胞类型，这些非T细胞类型如不去除则会干扰表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)产物制造的持续成功结果。
在一个实施例中，使用细胞分离装置进行密度梯度离心。细胞分离装置的实例包括Sepax2(Biosafe)。在实施例中，例如，在密度梯度离心步骤之前或之后执行如本文所述的改进的洗涤步骤时，可以使用与密度梯度离心步骤中使用的相同的装置来进行所述洗涤步骤。
通过选择富集
本文提供了选择特定细胞以改进适合CAR表达的所希望的免疫效应细胞富集的方法。在一个实施例中，所述选择包括阳性选择，例如，选择所希望的免疫效应细胞。在另一个实施例中，所述选择包括阴性选择，例如，对不需要的细胞的选择，例如，去除不需要的细胞。在实施例中，本文所述的阳性或阴性选择方法在流动条件下进行，例如，通过使用流通装置，例如，本文所述的流通装置。
当前的选择方法，例如，阳性选择，例如，使用
Figure BDA0002462996200000811
CTSTM的阳性选择，可以进一步优化以进行富集。首先，在选择过程中使用的Dynabeads的量通常不是基于密度梯度离心(例如，Sepax Ficoll)后样品中存在的CD45+/3+细胞(例如，CD45+/3+细胞)的百分比，而是基于原始患者材料中存在的细胞(例如，CD45+/3+细胞)的百分比。考虑到密度梯度离心步骤(例如，Sepax Ficoll分离程序)引起的成分显著变化，这种计算典型地会导致T细胞百分比降低和单核细胞含量增加。其次，两小时的孵育时间为
Figure BDA0002462996200000812
与非靶细胞(即，非CD3和/或非CD28细胞)的非特异性结合以及非靶细胞通过内吞作用(例如，单核细胞)的珠摄取提供了充足的机会，这是可能会损害阳性选择产物中T细胞产量和纯度的问题。最后，用于选择的磁性设备和操作可能不是最佳的。当前，磁性分离在大量流体(200ml)中进行，这又导致经磁性标记的细胞与磁性表面之间的距离较大。这限制了可用于分离的磁力，因此降低了分离灵敏度并且需要更长的分离时间。另外，目前在统计学上进行磁性分离，将样品放在磁性表面顶部5分钟之后去除阴性级分。这种延长的分离时间对细胞有害，在所述过程中，由于“堆积”效应，细胞的存活力常常受到负面影响，并为非靶细胞结合或内化珠提供进一步的机会。
与当前的选择方法相反，本文描述的选择方法包括，例如，在流动条件下“动态地”发生的分离，这与当前的“静态”分离过程相反。在一个实施例中，在流动条件下的分离包括磁性分离试剂(例如，选择性结合靶抗原的磁珠)、输入样品和磁体，其中所述磁性分离试剂和输入样品通过(例如，流过)磁铁上方。在某些实施例中，所述磁性分离试剂和输入样品连续地通过(例如，流过)磁铁上方。不受理论的束缚，这种动态技术能够缩短孵育时间(即使样品与分离试剂接触)和分离时间，从而最大程度地减少对靶细胞的负面影响，并显著降低非特异性结合和/或非靶群体对珠的摄取。另外，本文描述的选择方法不需要对选择试剂(
Figure BDA0002462996200000821
CD3/CD28 CTSTM)或用于选择的试剂的量(3比1的珠与T细胞比率)进行任何修改。
在一个实施例中，如本文所述，在流动条件下的分离或选择包括基于流通抗体的选择技术(FAST)方案。表12概述了当前选择技术和FAST方案之间不同的参数。
表12：当前阳性选择与FAST阳性选择之间的比较
Figure BDA0002462996200000822
Figure BDA0002462996200000831
在一个实施例中，本文描述的选择方法包括比分离试剂和输入样品的当前标准方案更短的孵育时间，随后进行磁性分离。在一个实施例中，孵育时间少于2小时，例如，少于110分钟、少于100分钟、少于90分钟、少于80分钟、少于70分钟、少于60分钟、少于50分钟、少于40分钟、少于30分钟、少于25分钟、少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟或少于5分钟。在一个实施例中，孵育在温和旋转下进行。
用于选择的示例性试剂盒描述于，例如，国际申请WO2017/117112中，所述申请通过引用以其整体并入本文。例如，在一个实施例中，所述试剂盒包括三个袋的组件，这三个袋可以通过钉或通过无菌焊接连接到另外的样品/缓冲液袋。此外，在分离过程中使用了改良的DynaMag盖，将分离过程中的最大容积限制为较小的容积，例如，小于100mL、小于90mL、小于80mL、小于70mL、小于60mL、小于50mL、小于40ml，例如，约50ml。不希望受到理论的束缚，据信在分离过程中使用的低容积可优化在分离过程中作用的磁力并最小化分离时间。改良的DynaMag盖还限制了珠:细胞缀合物因磁体移位的最大距离，并标准化位置选择期间经历的磁性。
在一个实施例中，本文所述的试剂盒的袋中一个或多个袋是三角形袋。在一个实施例中，所述选择袋是三角形袋，并且由于所述袋在选择袋的相对端提供了端口，因此能够以“流通”模式进行磁性分离。在这样的实施例中，细胞可以连续地流过磁性元件(例如，诸如DynaMag的磁性板)，从而使得能够实时分离磁性标记的颗粒，而未标记的细胞将不会被磁场吸引，并将会向外流出。这种流通配置使系统特别适合于自动化。改良的分离袋包括改良的盖以容纳额外的端口。
在一个实施例中，所述选择袋不是三角形袋。在选择袋不是三角形袋的实施例中，孵育时间少于2小时，例如，少于110分钟、少于100分钟、少于90分钟、少于80分钟、少于70分钟、少于60分钟、少于50分钟、少于40分钟、少于30分钟、少于25分钟、少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟或少于5分钟。
阳性选择
在实施例中，本文所述的阳性选择方法包括选择(例如，富集)所希望的免疫效应细胞。在一个实施例中，本文所述的阳性选择方法包括选择CD3+/CD28+细胞。在其他实施例中，本文所述的阳性选择方法包括选择以下一项或多项：CD3+细胞、CD28+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞或CD45+细胞。
本文所述的选择方法中使用的分离试剂包括磁性或顺磁性元件以及抗原结合元件。在一个实施例中，所述分离试剂包含珠，例如，具有磁性或顺磁性的珠，所述珠与抗原结合元件偶联(例如，共价或非共价地偶联)。在一个实施例中，所述抗原结合元件是抗体或其抗体片段。在一个实施例中，用于CD3+/CD28+细胞的阳性选择的分离试剂包含与CD3和/或CD28结合元件(例如，抗CD3和/或抗CD28抗体或抗体片段)偶联(例如，共价或非共价地偶联)的珠。
阴性选择
本文还提供了阴性选择方法，用于阴性选择或耗减输入样品中不需要的细胞(例如，单核细胞、粒细胞、红细胞、血小板和B细胞)，从而富集所得的输出样品中的所希望的免疫效应细胞(例如，T细胞)。在一个实施例中，本文所述的阴性选择方法在流动条件下进行，例如，使用流通装置，例如，本文所述的流通装置。
在一个实施例中，本文所述的阴性选择方法包括阴性选择单核细胞、粒细胞、红细胞、血小板、B细胞或癌细胞(例如，淋巴母细胞)中的一种或多种。
在需要耗减或去除单核细胞、粒细胞、红细胞、血小板或B细胞中的一种或多种的实施例中，所述阴性选择方法选择表达以下一项或多项的细胞：
CD19、CD25、CD14或其他表面标记物或由单核细胞、粒细胞、红细胞、血小板或B细胞表达的蛋白质。
在受试者患有血液癌症的实施例中，单采样品中可能存在癌细胞，并且可能需要除去癌细胞。在一个实施例中，本文所述的阴性选择方法包括阴性选择CD19+细胞，例如，淋巴母细胞。在另一个实施例中，本文所述的阴性选择方法包括阴性选择表达以下一项或多项的癌细胞：CD19、CD33、CD123、CLL-1、BCMA、ROR1或FLT3。
本文所述的选择方法中使用的分离试剂包括磁性或顺磁性元件以及抗原结合元件。在一个实施例中，所述分离试剂包含珠，例如，具有磁性或顺磁性的珠，所述珠与抗原结合元件偶联(例如，共价或非共价地偶联)。在一个实施例中，所述抗原结合元件是抗体或其抗体片段。在一个实施例中，用于CD19+细胞的阴性选择的分离试剂包含与CD19结合元件(例如，抗CD19抗体或抗体片段)偶联(例如，共价或非共价地偶联)的珠。在一个实施例中，用于CD14+细胞的阴性选择的分离试剂包含与CD14结合元件(例如，抗CD14抗体或抗体片段)偶联(例如，共价或非共价地偶联)的珠。在一个实施例中，用于CD25+细胞的阴性选择的分离试剂包含与CD25结合元件(例如，抗CD25抗体或抗体片段)偶联(例如，共价或非共价地偶联)的珠。
在一些实施例中，选择方法可以在流动条件下进行，例如，通过使用流通装置。在2016年12月27日提交的国际申请WO 2017/117112的第57-86页描述了示例性流通装置，所述申请通过引用明确地并入本文。
改进的洗涤步骤
单采(例如，白细胞单采)产物的细胞组成因患者而异。已将粒细胞(例如，中性粒细胞)百分比较高的白细胞单采产物与使用过程B的CAR T细胞制造期间细胞凝集的升高的情况相关联。不希望受到理论的束缚，据信这种不可逆的凝集会减少可用细胞数量并通过干扰富集过程(例如，阳性选择)对细胞产量产生负面影响，这会导致细胞数量和纯度的总体下降。另外，在不希望受理论束缚的情况下，细胞纯度和产量的降低直接影响随后的过程性能(例如，转导效率和扩增)以及最终产物细胞的数量和质量。这样的最终结果降低了在处理周期结束时制造能够满足剂量规格的产品的能力。因此，不希望受到理论的束缚，据信防止凝集可以减少细胞损失并改进T细胞纯度，这可以为随后的加工步骤产生更好质量和数量的起始材料，并得到总体上改进的治疗性产品。
在本领域当前的制造过程(例如，过程B)中，将患者的细胞白血球单采材料解冻在Plasmatherm(捷恩斯公司(Genesis))上，使用CellSaver 5+仪器(血液技术)洗涤，然后重悬于基于X-VIVO15培养基(龙沙公司，称为‘改良培养基’)的细胞扩增培养基，或放入等渗的缓冲盐溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS))中，用于随后的Ficoll淋巴细胞筛选。根据实例2中提供的方案制备改良培养基。然而，如实例2中所述，将解冻的细胞转移至改良培养基或PBS溶液中可导致细胞凝集。
因此，本文还提供了用于洗涤细胞以防止凝集的改进方法，这些方法与随后的制造步骤相容，例如，通过刺激，例如，用抗CD3/CD28 CTS Dynabeads(赛默飞世尔)进行阳性选择。另外，本文所述的改进的洗涤步骤，例如，在解冻的细胞上进行，以除去亚细胞碎片，游离的血红蛋白和冷冻保护剂，以实现容积减小，并使得随后的密度梯度分离成为可能。在一个实施例中，用替代的细胞重悬浮缓冲液对改良培养基或PBS溶液进行洗涤步骤。在一个实施例中，所述洗涤步骤用包含葡萄糖和/或氯化钠的缓冲液进行。在一个实施例中，所述缓冲液包含约5％和约0.45％的氯化钠，例如，D5 1/2NS培养基。在一个实施例中，所述缓冲液稳定细胞悬浮液并防止凝集，例如，持续至少30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时或6小时。
在一个实施例中，本文所述的改进的洗涤步骤是使用例如细胞分离装置，例如与用于密度梯度离心的相同的装置进行的。例如，使用Sepax 2RM装置(生物安全)进行改进的洗涤步骤。
在一个实施例中，本文披露的洗涤步骤可以用于新鲜的单采样品或先前冷冻的(例如，解冻的)单采样品。在实施例中，本文披露的洗涤步骤可以在本文所述的淘洗、密度梯度离心或选择方法中的任一项之前或之后使用。在另一个实施例中，本文披露的洗涤步骤在密度梯度离心步骤(例如，使用OptiPrep培养基的密度梯度离心)之后进行。
改进的制造过程
本文提供了比现有技术中当前使用的方法更大程度地改进适合于表达CAR的免疫效应细胞的质量和产量的方法。在一个实施例中，前述部分中所述的淘洗、密度梯度离心、在流动条件下的阳性和阴性选择以及改进的洗涤步骤可以彼此任意组合或与本领域目前使用或本文所述的其他方法结合使用，以分离或富集适合于表达CAR的所希望的免疫效应细胞。
通常，用于生成或富集可以经工程化以表达CAR的免疫效应细胞群体的方法包括：提供输入样品，进行富集步骤，并进行选择步骤，从而产生包含适合于CAR表达的免疫效应细胞的输出样品。用于产生表达CAR的免疫效应细胞群体的方法包括用于产生或富集可以经工程化以表达CAR的免疫效应细胞群体的方法，并且进一步包括刺激步骤，例如，其中这些细胞被刺激而增殖或持续存在，并且进一步包括引入编码CAR的核酸。在以下部分中进一步描述了关于CAR的刺激和引入/表达的其他披露。
在一个实施例中，所述输入样品是从受试者获得的新鲜样品，例如，新鲜单采样品、白细胞单采样品或全血样品。在另一个实施例中，所述输入样品是冷冻样品。在输入样品是冷冻样品(例如，冷冻或冷冻保存的单采样品、白细胞单采样品或全血样品)的实施例中，所述方法包括解冻冷冻样品或提供解冻的样品。冷冻的(例如，冷冻保存的)样品可以通过被动或主动方式解冻。通过被动方式解冻包括允许样品解冻，例如，达到周围环境的温度，例如，达到室温或达到样品在其中转移或混合的缓冲液或溶液的温度。通过主动方式解冻包括使用解冻样品的装置，例如，与通过被动方式解冻相比，使样品更快达到周围环境的温度。
在一个实施例中，所述富集步骤包括进行淘洗或密度梯度离心。可以使用本领域已知的淘洗条件或本文所述的用于冷冻或先前冷冻的样品的淘选的改进设置来进行淘洗。密度梯度离心可以使用Ficoll或包含碘克沙醇的培养基进行，例如，在水中约60％的碘克沙醇，例如，OptiPrepTM。
在本文描述的任何方法中，选择步骤包括进行阳性选择步骤和/或阴性选择步骤。阳性选择步骤可以包括选择CD3+/CD28+细胞，例如，使用分离剂，例如，在静态或流动条件下(例如，使用a)与到抗CD3和/或抗CD28抗体的珠。阴性选择步骤可包括对CD19+B细胞或CD19+淋巴母细胞进行阴性选择，例如，使用分离剂，例如，与抗CD19抗体偶联的珠。
在本文描述的任何方法中，可以在样品收集之后、样品解冻之后、富集步骤之前、富集步骤之后、选择步骤之前或选择步骤之后，或其任何组合中进行洗涤步骤。
本文进一步描述了产生或富集可经工程化以表达CAR的免疫效应细胞群体的示例性方法，所述方法包括淘洗、密度梯度离心、阳性或阴性选择(例如，在流动条件下)或改进的洗涤步骤中的一项或多项。
在一个实施例中，一种用于产生或富集可以经工程化以表达CAR的免疫效应细胞群体的方法包括提供包含免疫效应细胞的冷冻输入样品；将冷冻的输入样品解冻，以产生解冻的样品；进行富集步骤，其中所述富集步骤包括对输入样品进行淘洗，其中所述输入样品任选地是解冻的输入样品；以及进行选择步骤，其中所述选择是阳性选择，例如，对CD3/CD28+细胞的阳性选择，或者是阴性选择，例如，对CD19+、CD25+或CD14+细胞的阴性选择。
在另一个实施例中，一种用于产生或富集可以经工程化以表达CAR的免疫效应细胞群体的方法包括提供包含免疫效应细胞的冷冻输入样品；并且任选地，其中所述输入样品是冷冻的输入样品时，将冷冻的输入样品解冻以产生解冻的样品；进行富集步骤，其中所述富集步骤包括使用包含碘克沙醇的培养基，例如，在水中60％的碘克沙醇(例如，OptiPrep培养基)和/或密度大于Ficoll(例如，大于1.077g/ml，例如，约1.32g/ml)的培养基进行密度离心步骤；以及进行选择步骤，其中所述选择是阳性选择，例如，对CD3/CD28+细胞的阳性选择，或者是阴性选择，例如，对CD19+、CD25+或CD14+细胞的阴性选择。
在另一个实施例中，一种用于产生或富集可以经工程化以表达CAR的免疫效应细胞群体的方法包括提供包含免疫效应细胞的冷冻输入样品；进行富集步骤，其中所述富集步骤包括进行淘洗或密度离心(例如，使用Ficoll或Optiprep培养基)；并在流动条件下进行阳性选择步骤(例如，对CD3/CD28+细胞)。
在另一个实施例中，一种用于产生或富集可以经工程化以表达CAR的免疫效应细胞群体的方法包括提供包含免疫效应细胞的冷冻输入样品；进行富集步骤，其中所述富集步骤包括进行淘洗或密度离心(例如，使用Ficoll或Optiprep培养基)；并在流动条件下进行阴性选择步骤(例如，对CD19+、CD25+或CD14+细胞)；
在本文描述的任何方法中，可以在样品收集之后、样品解冻之后、富集步骤之前、富集步骤之后、选择步骤之前或选择步骤之后，或其任何组合中进行洗涤步骤。
可定义控制限度，所述限度识别输入样品的特性的范围或阈值，或在本文所述方法中的一个或多个步骤之后，并指示或确定下一步骤，以优化所希望的免疫效应细胞的富集，并确保制造成功和产品质量。在实施例中，所述控制限度可以取决于从其获得输入样品的受试者的癌症类型而不同。举例来说，从患有ALL或DLBCL的受试者获得的输入样品中单核细胞的存在的控制限度如下：如果单核细胞>输入样品(例如，白细胞单采全血细胞)的20％，则最佳方法包括在流动条件下淘洗和/或CD3/CD28阳性选择；或如果单核细胞<输入样品的20％，则洗涤输入样品，并根据原始含量确定最佳方法。在另一个实例中，从患有ALL或DLBCL的受试者获得的输入样品中母细胞存在的控制限度如下：如果原始细胞≥进入白细胞单采WBC的20％，则应进行淘洗(去除单核细胞、粒细胞和细胞碎片)和/或改良的CD19阴性选择(去除母细胞)，或采用其他技术耗减母细胞；或如果原始细胞<进入白细胞单采的20％，则将洗涤白细胞单采材料，并根据单核细胞含量确定过程。
在一个实施例中，在富集适合于表达CAR的免疫效应细胞之后，使用本领域已知或本文描述的任何方法刺激(例如，增殖)免疫效应细胞，例如，如标题为“免疫效应细胞的激活和扩增”的部分中所述。
在富集适合于表达CAR的免疫效应细胞之后，以及任选地，在如本文所述的刺激和/或扩增之后，可以将编码CAR(例如，本文所述的CAR)的核酸引入免疫效应细胞中。用于引入核酸(例如，编码CAR的核酸)的方法是本领域众所周知的，并且在本文中进行了描述，例如，如标题为“编码CAR的核酸构建体”、“RNA转染”和“非病毒递送方法”的部分中所述。
免疫效应细胞的来源
所述部分提供了另外的方法或步骤，用于获得包含所希望的免疫效应细胞的输入样品；分离和加工所希望的免疫效应细胞(例如T细胞)；并去除不需要的材料(例如不需要的细胞)。可以将在该部分中描述的另外的方法或步骤与以下各项中的任何一种组合使用：淘洗、密度梯度离心、流动条件下的选择、或在前述部分中描述的经改进的洗涤步骤。
可以从受试者中获得细胞(例如T细胞或天然杀伤(NK)细胞)来源。受试者的实例包括人、猴、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织、和肿瘤。
在本披露的某些方面，可以使用任何数量的本领域技术人员已知的技术，和本文披露的任何方法，按其步骤的任何组合，从自受试者收集的血液单位获得免疫效应细胞(例如T细胞)。在一个方面，通过单采术获得来自个体的循环血液的细胞。单采产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞、和血小板。在一个方面，可以洗涤通过单采术收集的细胞以除去血浆部分并且任选地将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续加工步骤。在本发明的一个实施例中，使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤这些细胞。在替代性实施例中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。在另一个实施例中，使用本文所述的经改进的洗涤步骤洗涤细胞。
在不存在钙的情况下的初始激活步骤可以导致放大的激活。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如通过根据制造商说明书使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver5)。在洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如像无Ca、无Mg的PBS、勃脈力-A(PlasmaLyte A)、或者含有或不含缓冲液的其他盐溶液。替代性地，可以除去单采样品中不希望的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在一个方面，通过例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘洗来裂解红细胞和耗减单核细胞，从外周血淋巴细胞中分离所希望的免疫效应细胞(例如，T细胞)。
本文所述的方法可以包括，例如使用例如(例如本文所述的)阴性选择技术选择免疫效应细胞(例如T细胞)的特定亚群，所述亚群是调节性T细胞耗减的群体，CD25+耗减的细胞。在一些实施例中，调节性T耗减的细胞群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
在一个实施例中，使用抗CD25抗体或其片段、或CD25结合配体IL-2从所述群体除去调节性T细胞(例如CD25+T细胞)。在一个实施例中，将抗CD25抗体或其片段、或CD25结合配体与底物(例如珠)缀合、或以其他方式包被在底物(例如珠)上。在一个实施例中，将抗CD25抗体或其片段与如本文所述的底物缀合。
在一个实施例中，使用来自MiltenyiTM的CD25耗减药剂从所述群体除去调节性T细胞(例如CD25+T细胞)。在一个实施例中，细胞与CD25耗减药剂的比率是1e7个细胞至20uL、或1e7个细胞至15uL、或1e7个细胞至10uL、或1e7个细胞至5uL、或1e7个细胞至2.5uL、或1e7个细胞至1.25uL。在一个实施例中，例如对于调节性T细胞(例如CD25+)耗减，使用大于5亿个细胞/ml。在另外的方面，使用6、7、8、或9亿个细胞/ml的细胞浓度。
在一个实施例中，有待耗减的免疫效应细胞群体包括约6x 109个CD25+T细胞。在其他方面，有待耗减的免疫效应细胞群体包括约1x 109至1x 1010个CD25+T细胞，以及其间的任何整数值。在一个实施例中，所得群体调节性T耗减的细胞具有2x 109个调节性T细胞(例如，CD25+细胞)或更少(例如，1x 109个、5x 108个、1x 108个、5x 107个、1x107个或更少的CD25+细胞)。
在一个实施例中，使用具有耗减管组(例如，像管162-01)的CliniMAC系统从所述群体除去调节性T细胞(例如，CD25+细胞)。在一个实施例中，将CliniMAC系统在耗减设置(例如像DEPLETION2.1)上运行。
不希望受特定理论的束缚，在单采术之前或在制造表达CAR的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞的阴性调节剂水平(例如，减少不需要的免疫细胞(例如，TREG细胞)的数量)显著降低受试者复发的风险。例如，耗减TREG细胞的方法是本领域已知的。减少TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、CD25耗减、mTOR抑制剂及其组合。
在一些实施例中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前降低例如，耗减)TREG细胞的数量。例如，制造方法包括使样品(例如单采样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触，例如以在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物之前耗减TREG细胞。
不希望受特定理论的束缚，在单采术之前或在制造表达CAR的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞的阴性调节剂水平(例如，减少不需要的免疫细胞(例如，TREG细胞)的数量)可降低受试者复发的风险。在一个实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用一种或多种减少TREG细胞的疗法预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一个实施例中，减少TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种。在一个实施例中，减少TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、mTOR抑制剂中的一种或多种，或其组合。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间或之后发生。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、mTOR抑制剂中的一种或多种或其组合可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间或之后发生。
在一些实施例中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前降低例如，耗减)TREG细胞的数量。例如，制造方法包括使样品(例如单采样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触，例如以在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物之前耗减TREG细胞。
在一个实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用环磷酰胺预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗(例如，CTL019治疗)复发的风险。在一个实施例中，在收集用于表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)产物制造的细胞之前，用抗GITR抗体预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。
在一个实施例中，在制造表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)产物(例如，CTL019产物)之前，修饰表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)制造过程以耗减TREG细胞。在一个实施例中，在制造表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)产物(例如，CTL019产物)之前，将CD25耗减用于耗减TREG细胞。
在一个实施例中，有待除去的细胞群体既不是调节性T细胞、或肿瘤细胞，也不是以其他方式对CART细胞的扩增和/或功能产生负面影响的细胞(例如表达CD14、CD11b、CD33、CD15、或由潜在免疫抑制细胞表达的其他标记物的细胞)。在一个实施例中，设想将此类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞并行除去、或者在所述耗减之后、或以另一种顺序除去。
本文所述的方法可以包括多于一个的选择步骤，例如多于一个的耗减步骤。可以例如用针对阴性选择的细胞特有的表面标记物的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群体。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。
本文所述的方法可以进一步包括从表达肿瘤抗原(例如，不包含CD25的肿瘤抗原，例如，CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群体除去细胞，从而提供调节性T耗减的(例如，CD25+耗减的)和肿瘤抗原耗减的细胞群体，所述细胞群体适合于表达CAR(例如，本文所述的CAR)。在一个实施例中，将表达肿瘤抗原的细胞与调节性T例如CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞、或抗CD25抗体或其片段、或抗肿瘤抗原抗体或其片段的同一底物(例如珠)，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，调节性T细胞(例如，CD25+细胞)的除去和表达肿瘤抗原的细胞的除去是连续的，并且可以例如，以任何顺序发生。
还提供了包括以下的方法：从表达检查点抑制剂(例如，本文所述的检查点抑制剂)的群体除去细胞(例如，PD1+细胞、LAG3+细胞、和TIM3+细胞中的一种或多种)，从而提供调节性T耗减的(例如，CD25+耗减的)细胞和检查点抑制剂耗减的细胞(例如，PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗减的细胞)的群体。例如，如本文所述示例性检查点抑制剂包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGF(例如，TGFβ)。在一个实施例中，将表达检查点抑制剂的细胞与调节性T例如CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞或抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段的同一珠，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，调节性T细胞(例如，CD25+细胞)的除去和表达检查点抑制剂的细胞的除去是连续的，并且可以例如，以任何顺序发生。
本文描述的方法可以包括阳性选择步骤。例如，可以通过与抗CD3/抗CD28(例如3x28)缀合的珠(如
Figure BDA0002462996200000951
M-450CD3/CD28 T)孵育足以阳性选择所希望的T细胞的时间段来分离T细胞。在一个实施例中，所述时间段是约30分钟。在另外的实施例中，所述时间段的范围为从30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在另外的实施例中，所述时间段是至少1、2、3、4、5、或6小时。在又另一个实施例中，所述时间段是10至24小时，例如24小时。与其他细胞类型相比，在存在较少T细胞的任何情况下，如从肿瘤组织或免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+T细胞捕获的效率。因此，通过简单地缩短或延长使T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养起始时或在该过程期间的其他时间点优先地选择或针对T细胞亚群。另外，通过增加或减少抗CD3和/或抗CD28抗体在珠或其他表面上的比率，可以在培养起始时或在其他所希望的时间点优先地选择或针对T细胞亚群。
在一个实施例中，可以选择表达以下中的一种或多种的T细胞群体：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒酶B、和穿孔素、或其他适当的分子(例如其他细胞因子)。用于筛选细胞表达的方法可以通过例如PCT公开号：WO 2013/126712中所述的方法确定。
为了通过阳性或阴性选择分离希望的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如颗粒(如珠))的浓度。在某些方面，可能希望显著减小其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个方面，使用100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml、或50亿/ml的浓度。在一个方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在又一个方面，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的方面，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。
使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞激活、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)、或来自存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病的血、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群体可能具有治疗价值，并且是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在相关方面，可能希望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面的混合物(例如颗粒(如珠))，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量有待结合颗粒的所希望抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地捕获。在一个方面，所使用的细胞的浓度是5x 106/ml。在其他方面，所使用的浓度可以是从约1x 105/ml至1x 106/ml，以及其间的任何整数值。
在其他方面，可以将这些细胞在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或室温下孵育不同的时间长度。
在一个实施例中，所述群体的多个免疫效应细胞不表达甘油二酯激酶(DGK)，例如，是DGK缺陷型。在一个实施例中，所述群体的多个免疫效应细胞不表达Ikaros(例如，是Ikaros缺陷型)。在一个实施例中，所述群体的多个免疫效应细胞不表达DGK和Ikaros，例如，是DGK和Ikaros缺陷型。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过在细胞群体中去除粒细胞及在一定程度上去除单核细胞提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在这种情况下将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他适合的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他控制冷冻的方法以及在-20℃或液氮中立即不受控制的冷冻。
在某些方面，将冷冻保存的细胞如本文所描述进行解冻和洗涤，并允许在使用本发明的方法激活之前在室温静置1小时。
在本发明的上下文中还考虑了在可能需要如本文描述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并且分离和冷冻所希望的细胞(如T细胞)以便后续用于免疫效应细胞疗法中，以用于将受益于免疫效应细胞疗法的任意数目的疾病或病症，如本文所述的那些。在一个方面，血液样品或单采取自基本健康的受试者。在某些方面，血液样品或单采取自基本健康的受试者，该受试者处于发展疾病的风险中，但尚未患发展疾病，并且将感兴趣的细胞分离并冷冻供以后使用。在某些方面，T细胞可以扩增、冷冻，并在以后使用。在某些方面，在诊断如本文所述的特定疾病之后但在任何治疗之前不久从患者收集样品。在另外的方面，在任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采分离细胞，这些相关治疗方式包括但不限于用以下进行治疗：药剂(如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗、抗病毒剂)、化疗、放射、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)、和照射。
在本发明的另一个方面，在治疗后直接从患者获得T细胞使得受试者具有功能性T细胞。在这点上，已观察到在某些癌症治疗(特别是使用破坏免疫系统的药物的治疗)之后，在患者通常将从治疗恢复期间治疗后不久，所获得的T细胞的质量因其离体扩增的能力可能是最佳或经改进的。同样地，在使用本文描述的方法进行离体操作之后，这些细胞可以处于优选的状态以增强植入和体内扩增。因此，在本发明的上下文中，预期在该恢复期期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些方面，动员(例如，用GM-CSF动员)和调整方案可以用于在受试者中产生病症，其中特定细胞类型的再增殖、再循环、再生、和/或扩增是有利的，尤其是在治疗后确定的时间窗口。例证性细胞类型包括免疫系统的T细胞、B细胞、树突细胞、和其他细胞。
在一个实施例中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的免疫效应细胞获自已接受低免疫增强剂量的mTOR抑制剂的受试者。在一个实施例中，在足够的时间后(或在足够剂量的低免疫增强剂量的mTOR抑制剂后)收获经工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)的群体，使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)的水平、或PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率已经至少是短暂的增加了。
在其他实施例中，已经被、或将经工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)的群体可以通过接触一定量的mTOR抑制剂离体进行处理，所述mTOR抑制剂增加PD1阴性免疫效应子细胞(例如，T细胞)的数量、或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率。
应当认识到，本申请的方法可利用包含5％或更少(例如2％)的人AB血清的培养基条件，并使用已知的培养基条件和组合物，例如描述于以下的那些：Smith等人,“Ex vivoexpansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement[使用新型无Xeno CTS免疫细胞血清替代物进行过继免疫治疗的人T细胞的离体扩增]”Clinical&Translational Immunology[临床和移植免疫学](2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31。
在一个实施例中，本申请的方法可利用包含无血清培养基的培养基条件。在一个实施例中，无血清培养基是OpTmizer CTS(美国生达医药集团(LifeTech))、Immunocult XF(干细胞技术公司(Stemcell technologies))、CellGro(CellGenix)、TexMacs(美天旎公司(Miltenyi))、Stemline(西格玛公司(Sigma))、Xvivo15(瑞士龙沙公司(Lonza))、PrimeXV(欧文科技公司(Irvine Scientific))、或StemXVivo(R&D系统公司(RandD systems))。无血清培养基可以补充有血清置换物，例如来自美国生达医药集团(LifeTech)的ICSR(免疫细胞血清替代物)。血清置换物(例如ICSR)的水平可以是，例如，多达5％，例如约1％、2％、3％、4％、或5％。
在一个实施例中，T细胞群体是二酰基甘油激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质，或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。DGK缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如，施用RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)以降低或预防DGK表达。替代性地，可以通过用本文描述的DGK抑制剂处理产生DGK缺陷型细胞。
在一个实施例中，T细胞群体是Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型细胞包括不表达Ikaros RNA、或蛋白质、或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞，Ikaros缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如，施用RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)以减少或预防Ikaros表达。替代性地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如，来那度胺(lenalidomide))处理产生Ikaros缺陷型细胞。
在实施例中，T细胞群体是DGK缺陷型且Ikaros缺陷型的，例如不表达DGK和Ikaros、或者具有降低、或抑制的DGK和Ikaros活性。可以通过本文描述的任何方法产生此类DGK和Ikaros缺陷型细胞。
在一个实施例中，从受试者获得NK细胞。在另一个实施例中，NK细胞是NK细胞系，例如NK-92细胞系(Conkwest公司)。
同种异体表达CAR的细胞
在本文描述的实施例中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如，所述细胞可以是同种异体T细胞，例如，缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如，HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异体T细胞。
缺乏功能性TCR的T细胞可以例如被工程化以使其在其表面上不表达任何功能性TCR、工程化使得其不表达包含功能性TCR的一个或多个亚基(例如，工程化使得其不表达(或表现出降低的表达)TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或TCRζ)、或工程化以使其在其表面上产生非常少的功能性TCR。替代性地，T细胞可以例如通过表达TCR的一个或多个亚基的突变或截短形式表达严重受损的TCR。术语“严重受损的TCR”意指该TCR将不在宿主中引发不利的免疫反应。
本文描述的T细胞可以例如被工程化，使得它在其表面上不表达功能性HLA。例如，可以工程化本文描述的T细胞，使得其细胞表面HLA(例如HLA 1类和/或HLA II类)表达被下调。在一些实施例中，可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)的表达来实现HLA的下调。
在一些实施例中，T细胞可以缺少功能性TCR和功能性HLA(例如HLA I类和/或HLAII类)。
缺少功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞可以通过任何适合的方式获得，包括敲除或敲低TCR或HLA的一个或多个亚基。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN)敲低TCR和/或HLA。
在一些实施例中，同种异体细胞可以是例如通过本文描述的任何方法不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞。例如，该细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，该抑制性分子例如可以降低表达CAR的细胞产生免疫效应子反应的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGF(例如，TGFβ)。抑制性分子的抑制(例如通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制)可以优化表达CAR的细胞的性能。在实施例中，可以使用例如，如本文描述的抑制性核酸，例如，抑制性核酸，例如，dsRNA，例如，siRNA或shRNA、成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)。
抑制TCR或HLA的siRNA和shRNA
在一些实施例中，在细胞(例如，T细胞)中，可以使用靶向编码TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA，和/或本文所述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)来抑制TCR表达和/或HLA表达。
siRNA和shRNA的表达系统以及示例性shRNA描述于例如，2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第649和650段中，所述申请通过引用以其全文并入。
抑制TCR或HLA的CRISPR
如本文所用，“CRISPR”或“针对TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指一组规律间隔成簇短回文重复序列，或包含这组重复序列的系统。如本文所用，“Cas”是指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统是指衍生自CRISPR和Cas的系统，其可以用于在细胞(例如，T细胞)中沉默或突变TCR和/或HLA基因，和/或本文所述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)。
CRISPR/Cas系统及其用途描述于例如，2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第651-658段中，所述申请通过引用以其全文并入。
抑制TCR和/或HLA的TALEN
“TALEN”或“针对HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的TALEN”是指转录激活因子样效应核酸酶，一种可以用于在细胞(例如，T细胞)中编辑HLA和/或TCR基因和/或本文所述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)的人工核酸酶。
TALEN及其用途描述于例如，2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第659-665段中，所述申请通过引用以其全文并入。
抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“针对HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”是指锌指核酸酶，一种可以用于在细胞(例如，T细胞)中编辑HLA和/或TCR基因和/或本文所述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)的人工核酸酶。
ZFN及其用途描述于例如，2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第666-671段中，所述申请通过引用以其全文并入。
端粒酶表达
端粒在体细胞持久性中起关键作用，其长度由端粒酶(TERT)维持。CLL细胞中的端粒长度可能非常短(Roth等人,“Significantly shorter telomeres in T-cells ofpatients with ZAP-70+/CD38 chronic lymphocytic leukaemia[患有ZAP-70+/CD38慢性淋巴细胞白血病的患者T细胞中显著更短的端粒]”British Journal of Haematology[英国血液学杂志],143,383-386.,2008年8月28日)，并且在制造的表达CAR的细胞(例如，CART19细胞)中可能甚至更短，限制了它们在过继转移至患者后其扩增的可能性。端粒酶表达可以从复制耗竭中拯救表达CAR的细胞。
尽管不希望受任何特定理论的束缚，但在一些实施例中，由于T细胞中的端粒缩短，治疗性T细胞在患者中具有短期持久性；因此，用端粒酶基因转染可以延长T细胞的端粒并改善患者体内T细胞的持久性。参见Carl June,“Adoptive T cell therapy for cancerin the clinic[临床上用于癌症的过继性T细胞疗法]”,Journal of ClinicalInvestigation[临床研究杂志],117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施例中，免疫效应细胞(例如，T细胞)异位表达端粒酶亚基，例如，端粒酶的催化亚基，例如，TERT，例如，hTERT。在一些方面，本披露提供了产生表达CAR的细胞的方法，所述方法包括使细胞与编码端粒酶亚基(例如，端粒酶的催化亚基，例如，TERT，例如，hTERT)的核酸接触。可以使细胞在与编码CAR的构建体接触之前、同时或之后与该核酸接触。
端粒酶表达可以是稳定的(例如，核酸可以整合到细胞的基因组中)或瞬时的(例如，核酸不整合，并且表达在一段时间后降低，例如，几天)。通过用编码端粒酶亚基和选择性标记的DNA转染或转导细胞，并针对稳定的整合子进行选择，可以实现稳定的表达。替代性地或组合地，例如，使用Cre/Lox或FLP/FRT系统可以通过位点特异性重组来完成稳定表达。
瞬时表达可以涉及用核酸(例如，DNA或RNA，如mRNA)转染或转导。在一些实施例中，瞬时mRNA转染避免了有时与TERT稳定转染相关联的遗传不稳定性。外源端粒酶活性的瞬时表达描述于例如，国际申请WO 2014/130909中，所述申请通过引用以其全文并入。在实施例中，根据由现代化疗法公司(Moderna Therapeutics)商业化的信使RNATherapeuticsTM平台进行端粒酶亚基的基于mRNA的转染。例如，PLAC
8664194或8680069。
在一个实施例中，hTERT具有GenBank蛋白ID AAC51724.1的氨基酸序列(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization[推定的人端粒酶催化亚基基因hEST2在肿瘤细胞中且在永生化期间上调]”Cell[细胞]第90卷,第4期,1997年8月22日,第785-795页)：
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDP
AAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFA
LLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFV
LVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPA
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(SEQ ID NO:108)
在一个实施例中，hTERT具有与SEQ ID NO:108的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。在一个实施例中，hTERT具有SEQ ID NO:108的序列。在一个实施例中，hTERT在N末端、C末端或两者处包含缺失(例如不多于5、10、15、20、或30个氨基酸)。在一个实施例中，hTERT在N末端、C末端或两者处包含转基因氨基酸序列(例如不多于5、10、15、20、或30个氨基酸)。
在一个实施例中，hTERT由GenBank登录号AF018167的核酸序列编码(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization[hEST2，推定的人端粒酶催化亚基基因，在肿瘤细胞和永生化过程中上调]”Cell[细胞]第90卷,第4期,1997年8月22日,第785-795页)：
Figure BDA0002462996200001061
Figure BDA0002462996200001071
Figure BDA0002462996200001081
在一个实施例中，hTERT由具有与SEQ ID NO:23的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列的核酸编码。在一个实施例中，hTERT由SEQ IDNO:23的核酸编码。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明提供了免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，这些免疫效应细胞被工程化为含有一种或多种CAR，该一种或多种CAR将免疫效应细胞引导至癌症。这通过CAR上的抗原结合结构域实现，该抗原结合结构域对癌症相关抗原具有特异性。本文所述的CAR可以靶向两类癌症相关抗原(肿瘤抗原)：(1)在癌细胞表面表达的癌症相关抗原；(2)本身是细胞内的癌症相关抗原，但是，这种抗原(肽)的片段通过MHC(主要组织相容性复合物)呈递在癌细胞表面。
因此，例如，通过本文所述的方法获得的免疫效应细胞可以经工程化以含有靶向以下癌症相关抗原之一(肿瘤抗原)的CAR：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、PRSS21、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、Legumain、HPV E6、E7、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶以及mut hsp70-2。
双特异性CAR
在一个实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施例中，第一和第二表位在相同的抗原(例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基))上。在一个实施例中，第一表位和第二表位重叠。在一个实施例中，第一表位和第二表位不重叠。在一个实施例中，第一表位和第二表位在不同的抗原，例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一个实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在某些实施例中，抗体分子是多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体分子。用于产生双特异性或异二聚体抗体分子的方案和双特异性抗体分子的各种构型描述于例如，2015年3月13日提交的WO2015/142675的第455-458段中，其通过引用以其整体并入。
在一个方面，双特异性抗体分子的特征在于第一免疫球蛋白可变结构域序列(例如，scFv，所述scFv对CD19具有结合特异性，例如，包含如本文所述的scFv，或包含来自本文所述的scFv的轻链CDR和/或重链CDR)和第二免疫球蛋白可变结构域序列(所述第二免疫球蛋白可变结构域序列对不同抗原上的第二表位具有结合特异性)。
嵌合TCR
在一个方面，本发明的抗体和抗体片段(例如，CD19抗体及片段)可以接枝到T细胞受体(“TCR”)链(例如，TCRα或TCRβ链)的一个或多个恒定结构域，以产生嵌合TCR。不受理论的束缚，据信嵌合TCR在抗原结合时将通过TCR复合物发出信号。例如，如本文所披露的scFv可以接枝到TCR链(例如，TCRα链和/或TCRβ链)的恒定结构域(例如，细胞外恒定结构域的至少一部分)、跨膜结构域和胞质结构域。作为另一个实例，抗体片段(例如，本文所述的VL结构域)可以接枝到TCRα链的恒定结构域，并且抗体片段(例如，本文所述的VH结构域)可以接枝到TCRβ链的恒定结构域(或者，VL结构域可以接枝到TCRβ链的恒定结构域，VH结构域可以接枝到TCRα链)。作为另一个实例，可以将抗体或抗体片段的CDR移植到TCRα和/或β链中以产生嵌合TCR。例如，本文披露的LCDR可以接枝到TCRα链的可变结构域中，并且本文披露的HCDR可以接枝到TCRβ链的可变结构域，或反之亦然。此类嵌合TCR可以通过本领域已知的方法产生(例如，Willemsen RA等人,Gene Therapy[基因疗法]2000；7:1369-1377；Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]2004；11:487-496；Aggen等人,Gene Ther.[基因疗法]2012年4月；19(4):365-74)。
非抗体支架
在实施例中，抗原结合结构域包含非抗体支架，例如，纤连蛋白、锚蛋白、结构域抗体、脂质运载蛋白、小模块免疫药物、大抗体(maxybody)、蛋白A或阿菲林(affilin)。非抗体支架具有与细胞上的靶抗原结合的能力。在实施例中，抗原结合结构域是在细胞上表达的天然存在的蛋白质的多肽或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包含非抗体支架。可以使用多种非抗体支架，只要所得多肽包含至少一个特异性结合靶细胞上的靶抗原的结合区即可。
非抗体支架包括：纤连蛋白(诺华公司(Novartis)，马萨诸塞州)、锚蛋白(分子配偶体公司(Molecular Partners AG，苏黎世，瑞士)、结构域抗体(Domantis公司，坎布里奇，马萨诸塞州，和Ablynx nv，津维纳拉德，比利时)、脂质运载蛋白(Pieris Proteolab AG，弗赖辛，德国)、小型模块化免疫药物(Trubion制药公司，西雅图，华盛顿州)、大抗体(Avidia公司，山景城，加利福尼亚州)、蛋白质A(亲合体公司(Affibody AG)，瑞典)和阿菲林(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH，哈雷，德国)。
在一个实施例中，抗原结合结构域包含结合靶细胞表面上的相反配体的分子的细胞外结构域、或其相反配体结合片段。
免疫效应细胞可包含重组DNA构建体，其包含编码CAR的序列，其中CAR包含与肿瘤抗原(例如，本文描述的肿瘤抗原)特异性结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段，TCR或TCR片段)，和细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域可以包含共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域，例如ζ链。如其他地方所述，本文所述的方法可包括用编码CAR的核酸(例如，本文所述的CAR)转导来自例如，调节性T细胞耗减的细胞群体的细胞。
在特定方面，CAR包含scFv结构域，其中scFv前面可以是任选的前导序列(如SEQID NO:1中提供的)、并且后面是任选的铰链序列(如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:36或SEQ IDNO:38中提供的)、跨膜区(如SEQ ID NO:6中提供的)、包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:16的细胞内信号传导结构域和包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的CD3ζ序列，例如，其中这些结构域是连续的并在相同的阅读框中以形成单一融合蛋白。
在一个方面，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、细胞外抗原结合结构域(例如，本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、和细胞内刺激结构域(例如，本文所述的细胞内刺激结构域)。在一个方面，示例性CAR构建体包含任选前导序列(例如，本文所述的前导序列)、细胞外抗原结合结构域(例如，本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、细胞内共刺激信号传导结构域(例如，本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或细胞内初级信号传导结构域(例如，本文所述的初级信号传导结构域)。
示例性前导序列提供为SEQ ID NO:1。示例性铰链/间隔子序列提供为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38。示例性跨膜结构域序列如SEQ ID NO:6所提供。4-1BB蛋白的细胞内信号传导结构域的示例性序列如SEQ ID NO:7所提供。CD27的细胞内信号传导结构域的示例性序列被提供为SEQ ID NO:16。示例性CD3ζ结构域序列提供为SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
在一个方面，免疫效应细胞包括重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含编码CAR的核酸分子，其中核酸分子包含编码抗原结合结构域的核酸序列，其中所述序列与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列是连续的并在相同的阅读框中。可用于CAR中的示例性细胞内信号传导结构域包括但不限于例如CD3-ζ、CD28、CD27、4-1BB等的一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些情况下，CAR可以包含CD3-ζ、CD28、4-1BB等的任何组合。
编码所希望分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达核酸分子的细胞中筛选文库，通过从已知包含该核酸分子的载体中获得核酸分子，或通过使用标准技术直接从含有该基因的细胞和组织分离。替代性地，感兴趣的核酸可以合成产生，而不是克隆。
可以使用例如，逆转录病毒或慢病毒载体构建体将编码CAR的核酸引入免疫效应细胞中。
也可以使用例如，可以直接转染到细胞中的RNA构建体将编码CAR的核酸引入免疫效应细胞中。用于产生用于转染的mRNA的方法涉及用特别设计的引物对模板进行体外转录(IVT)、随后添加聚A以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)(例如，本文描述的3’和/或5’UTR)、5’帽(例如，本文描述的5’帽)和/或内部核糖体进入位点(IRES)(例如，本文描述的IRES)、待表达的核酸和聚A尾的构建体，典型地长度为50-2000个碱基(例如，实例中所述，例如，SEQ ID NO:35)。这样产生的RNA可以有效转染不同种类的细胞。在一个实施例中，模板包含针对CAR的序列。在一个实施例中，通过电穿孔将RNA CAR载体转导到细胞(例如，T细胞)中。
抗原结合结构域
在一个方面，多个免疫效应细胞，例如，调节性T细胞耗减的细胞群体，包括编码CAR的核酸，所述CAR包含靶特异性结合元件，否则称为抗原结合结构域。结合元件的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可以选择抗原结合结构域以识别在与特定疾病状态相关的靶细胞上充当细胞表面标记物的配体。因此，可以作为本文所述的CAR中的抗原结合结构域的配体的细胞表面标记物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。
在一个方面，包含抗原结合结构域的CAR的一部分包含靶向肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)的抗原结合结构域。
抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体(如骆驼来源的纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)、和可变结构域(VHH))，以及本领域已知的用作抗原结合结构域的可替代支架(如重组纤连蛋白结构域等)、T细胞受体(TCR)或其片段(例如，单链TCR)等。在一些情况下，抗原结合结构域衍生自其中最终将使用CAR的相同物种是有益的。例如，对于在人中使用，CAR的抗原结合结构域包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基可以是有益的。
在一个实施例中，抗原结合结构域包含抗CD19抗体或其片段(例如scFv)。例如，所述抗原结合结构域包含表1中列出的可变重链和可变轻链。连接可变重链和可变轻链的接头序列可以是例如，本文描述的接头序列中的任一项，或者替代性地可以是GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:104)。
表1：抗CD19抗体结合结构域
Figure BDA0002462996200001141
Figure BDA0002462996200001151
表2：另外的抗CD19抗体结合结构域
Figure BDA0002462996200001152
表2A：另外的鼠抗CD19抗体结合结构域和CAR
Figure BDA0002462996200001161
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表1中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、和HC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域进一步包含LC CDR1、LCCDR2、和LC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域包含表1中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表1中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个、两个或全部，以及表1中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个、两个或全部。
可以根据本披露使用任何CD19 CAR，例如任何已知的CD19 CAR的CD19抗原结合结构域。例如，LG-740；CD19 CAR描述于以下中：美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人,Leuk Lymphoma.[白血病淋巴瘤]2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人,Blood[血液]122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人,Blood,[血液]118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人,Blood[血液]116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人,Blood[血液]122(25):4129-39(2013)；以及美国基因与细胞治疗学会第16届年会(ASGCT)(五月15-18日，盐湖城)2013,Abst[摘要]10。
可以使用表达CAR的细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于CD19、CD123、EGFRvIII、间皮素等，例如，如WO 2014/130635、WO 2014/130657和WO 2015/090230所述，其每一个均通过引用以其整体并入本文。
在一个实施例中，特异性结合CD19的CAR T细胞具有USAN名称TISAGENLECLEUCEL-T。CTL019通过T细胞的基因修饰来制备，所述CTL019通过用在EF-1α启动子控制下含有CTL019转基因的自身失活、复制缺陷型慢病毒(LV)运载体的转导进行稳定插入来介导。CTL019可以是转基因阳性和阴性T细胞的混合物，其基于转基因阳性T细胞百分比递送至受试者。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合人CD19，例如，可以包括根据通过引用并入本文的WO2014/153270的表3的CAR分子或抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如，可以包括根据通过引用并入本文的WO 2014/130635的表1-2的CAR分子(例如，CAR1至CAR8中的任一个)或抗原结合结构域。
在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的CD123 CAR，例如描述于US 2014/0322212 A1或US 2016/0068601 A1中的CD123 CAR，两者均通过引用并入本文。在实施例中，CD123 CAR包含氨基酸，或具有US 2014/0322212 A1或US 2016/0068601 A1中所示的核苷酸序列，两者均通过引用并入本文。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合EGFRvIII，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2014/130657的表2或SEQ ID NO:11的CAR分子或抗原结合结构域。
在一个实施例中，CAR分子包含本文描述的EGFRvIII CAR分子，例如描述于通过引用并入本文的US2014/0322275A1中的EGFRvIII CAR。在实施例中，EGFRvIII CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US 2014/0322275A1中所示的核苷酸序列。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合间皮素，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2015/090230的表2-3的CAR分子或抗原结合结构域。
在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的间皮素CAR，例如描述于通过引用并入本文的WO 2015/090230中的间皮素CAR。在实施例中，间皮素CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的WO 2015/090230中所示的核苷酸序列。
在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的BCMA CAR分子，例如描述于US-2016-0046724-A1中的BCMA CAR。在实施例中，BCMA CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US-2016-0046724-A1中所示的核苷酸序列。
在一个实施例中，CAR分子包含本文描述的CLL1 CAR，例如描述于通过引用并入本文的US2016/0051651A1中的CLL1 CAR。在实施例中，CLL1 CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US 2016/0051651A1中所示的核苷酸序列。
在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的CD33 CAR，例如描述于通过引用并入本文的US 2016/0096892A1中的CD33 CAR。在实施例中，CD33 CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US 2016/0096892A1中所示的核苷酸序列。
根据本文所述的任何方法或组合物，在实施例中，CAR分子包含本文所述的CD123CAR，例如描述于US2014/0322212A1或US2016/0068601A1中的CD123 CAR，两者均通过引用并入本文。在实施例中，CD123 CAR包含氨基酸，或具有US 2014/0322212 A1或US 2016/0068601 A1中所示的核苷酸序列，两者均通过引用并入本文。在其他实施例中，CAR分子包含本文所述的CD19 CAR分子，例如，描述于US-2015-0283178-A1中的CD19 CAR分子，例如，CTL019。在实施例中，CD19 CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US-2015-0283178-A1中所示的核苷酸序列。在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的BCMA CAR分子，例如描述于US-2016-0046724-A1中的BCMA CAR。在实施例中，BCMA CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US-2016-0046724-A1中所示的核苷酸序列。在一个实施例中，CAR分子包含本文描述的CLL1 CAR，例如描述于通过引用并入本文的US2016/0051651A1中的CLL1 CAR。在实施例中，CLL1 CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US 2016/0051651 A1中所示的核苷酸序列。在一个实施例中，CAR分子包含本文描述的CD33 CAR，例如描述于通过引用并入本文的US2016/0096892A1中的CD33 CAR。在实施例中，CD33 CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US 2016/0096892 A1中所示的核苷酸序列。在一个实施例中，CAR分子包含本文描述的EGFRvIII CAR分子，例如描述于通过引用并入本文的US2014/0322275A1中的EGFRvIII CAR。在实施例中，EGFRvIII CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US2014/0322275A1中所示的核苷酸序列。在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的间皮素CAR，例如描述于通过引用并入本文的WO 2015/090230中的间皮素CAR。在实施例中，间皮素CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的WO 2015/090230中所示的核苷酸序列。
示例性的CD19 CAR包括本文所述的CD19 CAR，例如，在本文所述的一个或多个表格中，或Xu等人,Blood[血液]123.24(2014):3750-9、Kochenderfer等人,Blood[血液]122.25(2013):4129-39、Cruz等人,Blood[血液]122.17(2013):2965-73、NCT00586391、NCT01087294、NCT02456350、NCT00840853、NCT02659943、NCT02650999、NCT02640209、NCT01747486、NCT02546739、NCT02656147、NCT02772198、NCT00709033、NCT02081937、NCT00924326、NCT02735083、NCT02794246、NCT02746952、NCT01593696、NCT02134262、NCT01853631、NCT02443831、NCT02277522、NCT02348216、NCT02614066、NCT02030834、NCT02624258、NCT02625480、NCT02030847、NCT02644655、NCT02349698、NCT02813837、NCT02050347、NCT01683279、NCT02529813、NCT02537977、NCT02799550、NCT02672501、NCT02819583、NCT02028455、NCT01840566、NCT01318317、NCT01864889、NCT02706405、NCT01475058、NCT01430390、NCT02146924、NCT02051257、NCT02431988、NCT01815749、NCT02153580、NCT01865617、NCT02208362、NCT02685670、NCT02535364、NCT02631044、NCT02728882、NCT02735291、NCT01860937、NCT02822326、NCT02737085、NCT02465983、NCT02132624、NCT02782351、NCT01493453、NCT02652910、NCT02247609、NCT01029366、NCT01626495、NCT02721407、NCT01044069、NCT00422383、NCT01680991、NCT02794961或NCT02456207中描述的抗CD19 CAR，这些文献每个通过引用以其全文并入本文。
在一个实施例中，抗原结合结构域包含一个、两个、三个(例如，全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，这些重链CDR来自本文所述的抗体(例如，描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230中的抗体)，和/或一个、两个、三个(例如，全部三个)轻链CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，这些轻链CDR来自本文所述的抗体(例如，描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230中的抗体)。在一个实施例中，所述抗原结合结构域包含上文列出抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在实施例中，抗原结合结构域是描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230中的抗原结合结构域。
在实施例中，抗原结合结构域靶向BCMA并且描述于US-2016-0046724-A1中。
在实施例中，抗原结合结构域靶向CD19并且描述于US-2015-0283178-A1中。
在实施例中，抗原结合结构域靶向CD123并且描述于US 2014/0322212 A1、US2016/0068601 A1中。
在实施例中，抗原结合结构域靶向CLL1并且描述于US 2016/0051651 A1中。
在实施例中，抗原结合结构域靶向CD33并且描述于US 2016/0096892 A1中。
可以使用表达CAR的细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA、和GFRα-4等，如例如WO 2014/153270、WO 2014/130635、WO2016/028896、WO 2014/130657、WO 2016/014576、WO 2015/090230、WO 2016/014565、WO2016/014535、和WO 2016/025880中所述，这些文献各自通过引用以其全文并入本文。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合人源化CD19，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2014/153270的表3的CAR分子或抗原结合结构域(例如人源化抗原结合结构域)。在WO 2014/153270中详细说明了编码CD19 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2014/130635的表1-2的CAR分子(例如CAR1至CAR8中的任一个)或抗原结合结构域。在WO 2014/130635中详细说明了编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/028896的表2、表6、和表9的CAR分子(例如CAR123-1至CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32中的任一个)或抗原结合结构域。在WO 2016/028896中详细说明了编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合EGFRvIII，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2014/130657的表2或SEQ ID NO:11的CAR分子或抗原结合结构域。在WO 2014/130657中详细说明了编码EGFRvIII CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD33，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/014576的表2或表9的CAR分子(例如CAR33-1至CAR-33-9中的任一个)或抗原结合结构域。在WO 2016/014576中详细说明了编码CD33 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合间皮素，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2015/090230的表2-3的CAR分子或抗原结合结构域。在WO 2015/090230中详细说明了编码间皮素CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合BCMA，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/014565的表1或表16、SEQ ID NO:271或SEQ ID NO:273的CAR分子或抗原结合结构域。在WO 2016/014565中详细说明了编码BCMA CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CLL-1，例如，可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/014535的表2的CAR分子或抗原结合结构域。在WO 2016/014535中详细说明了编码CLL-1 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合GFR α-4，例如，可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/025880的表2的CAR分子或抗原结合结构域。在WO 2016/025880中详细说明了编码GFR α-4 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列。
在一个实施例中，本文所述的任何CAR分子(例如，CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA、和GFRα-4中的任一个)的抗原结合结构域包含来自上文列出抗体的一个、两个、三个(例如，全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或来自上文列出抗原结合结构域的一个、两个、三个(例如，全部三个)轻链CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一个实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一个实施例中，所述抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如，全部三个)重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)，和/或来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如，全部三个)轻链CDR(LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一个实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一些实施例中，肿瘤抗原是2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675中描述的肿瘤抗原，该国际申请通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，所述肿瘤抗原选自以下中的一种或多种：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Rα)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面缔合(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；采购前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-1受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；癌基因融合蛋白，由断点簇区域(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)(bcr-abl)组成；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸化的路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记物7相关(TEM7R)；紧密连接蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)；X染色体可读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿路斑块蛋白2(uroplakin 2，UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ可选阅读框蛋白(TARP)；Wilms肿瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于12p染色体上的ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤睾丸抗原2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺素；存活素；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝素8)，T细胞1识别的黑色素瘤抗原(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白(Brother of the Regulator of Imprinted Sites))，T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；高级糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(renal ubiquitous 1，RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；豆荚蛋白；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(muthsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体(FCAR或CD89)的Fc片段；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块的类粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
在一个实施例中，所述抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如，全部三个)重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)，和/或来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如，全部三个)轻链CDR(LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一个实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一个方面，所述抗肿瘤抗原结合结构域是一个片段，例如，单链可变片段(scFv)。在一个方面，如本文所述的抗a癌症相关抗原结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如，双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]17,105(1987))。在一个方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合如本文描述的癌症相关抗原蛋白。
在一些情况下，可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生ScFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果采用短多肽接头(例如，5-10个氨基酸)，则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人,1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448；美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794；以及PCT公开号WO 2006/020258和WO2007/024715，所述文献通过引用并入本文中。
scFv可以在其VL与VH区之间包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施例中，接头序列包含多组甘氨酸和丝氨酸重复序列，如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:25)。在一个实施例中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:28)。接头长度的变化可以保留或增强活性，从而在活性研究中产生优异的功效。
在另一个方面，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段，例如单链TCR(scTCR)。用于制备此类TCR的方法是本领域中已知的。参见，例如，Willemsen RA等人,GeneTherapy[基因疗法]7:1369-1377(2000)；Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]11:487-496(2004)；Aggen等人,Gene Ther.[基因疗法]19(4):365-74(2012)(将参考文献以其整体并入本文)。例如，scTCR可以工程化为含有来自通过接头(例如柔性肽)连接的T细胞克隆的Vα和Vβ基因。此途径对于本身在细胞内的癌症相关靶标非常有用，然而，这种抗原(肽)的片段通过MHC呈递在癌细胞的表面上。
其他示例性抗原结合结构域
在一个实施例中，针对CD22的抗原结合结构域包含，例如，Haso等人,Blood[血液],121(7):1165-1174(2013)；Wayne等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]16(6):1894-1903(2010)；Kato等人,Leuk Res[白血病研究]37(1):83-88(2013)；Creative BioMart[创意生物市场](creativebiomart.net):MOM-18047-S(P)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施例中，针对CS-1的抗原结合结构域包含埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)(BMS)的抗原结合部分(例如，CDR)，参见例如，Tai等人,2008,Blood[血液]112(4):1329-37；Tai等人,2007,Blood.[血液]110(5):1656-63。
在一个实施例中，针对GD2的抗原结合结构域包含，例如，Mujoo等人,Cancer Res.[癌症研究]47(4):1098-1104(1987)；Cheung等人,Cancer Res[癌症研究]45(6):2642-2649(1985),Cheung等人,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]5(9):1430-1440(1987),Cheung等人,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]16(9):3053-3060(1998),Handgretinger等人,Cancer Immunol Immunother[癌症免疫学免疫疗法]35(3):199-204(1992)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。在一些实施例中，针对GD2的抗原结合结构域是选自以下的抗体的抗原结合部分：mAb 14.18、14G2a、ch14.18、hu14.18、3F8、hu3F8、3G6、8B6、60C3、10B8、ME36.1、和8H9，参见例如WO 2012033885、WO 2013040371、WO 2013192294、WO 2013061273、WO 2013123061、WO 2013074916、和WO 201385552。在一些实施例中，针对GD2的抗原结合结构域是描述于以下中的抗体的抗原结合部分，美国公开号：20100150910或PCT公开号：WO2011160119。
在一个实施例中，针对Tn抗原的抗原结合结构域包含描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：US8,440,798；Brooks等人,PNAS[美国国家科学院院刊]107(22):10056-10061(2010)；以及Stone等人,OncoImmunology[肿瘤免疫学]1(6):863-873(2012)。
在一个实施例中，针对PSMA的抗原结合结构域包含描述于例如Parker等人,Protein Expr Purif[蛋白质表达和纯化]89(2):136-145(2013)；US 20110268656(J591ScFv)；Frigerio等人,European J Cancer[欧洲癌症杂志]49(9):2223-2232(2013)(scFvD2B)；WO 2006125481(mAb 3/A12、3/E7和3/F11)中的抗体以及单链抗体片段(scFvA5和D7)的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对ROR1的抗原结合结构域包含描述于例如，以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Hudecek等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]19(12):3153-3164(2013)；WO 2011159847；和US 20130101607。
在一个实施例中，针对FLT3的抗原结合结构域包含描述于例如，WO 2011076922、US 5777084、EP 0754230、US 20090297529中的抗体以及若干种商业目录抗体(R&D公司、电子生物科学公司、艾博抗公司)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对TAG72的抗原结合结构域包含以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：描述于例如，Hombach等人,Gastroenterology[肠胃病学]113(4):1163-1170(1997)中的抗体；和Abcam ab691。
在一个实施例中，针对FAP的抗原结合结构域包含以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：描述于例如，Ostermann等人,Clinical Cancer Research[临床癌症研究]14:4584-4592(2008)(FAP5)，美国专利公开号2009/0304718中的抗体；西罗珠单抗(参见，例如，Hofheinz等人,Oncology Research and Treatment[肿瘤研究与治疗]26(1),2003)；和Tran等人,J Exp Med[实验医学杂志]210(6):1125-1135(2013)。
在一个实施例中，针对CD38的抗原结合结构域包含以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：达雷木单抗(daratumumab)(参见例如，Groen等人,Blood[血液]116(21):1261-1262(2010)；MOR202(参见例如，US 8,263,746)；或描述于US 8,362,211中的抗体。
在一个实施例中，针对CD44v6的抗原结合结构域包含描述于例如，Casucci等人,Blood[血液]122(20):3461-3472(2013)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CEA的抗原结合结构域包含描述于例如，Chmielewski等人,Gastoenterology[肠胃病学]143(4):1095-1107(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对EPCAM的抗原结合结构域包含选自以下的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：MT110、EpCAM-CD3双特异性Ab(参见例如，clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596)；依决洛单抗；3622W94；ING-1；和阿德木单抗(MT201)。
在一个实施例中，针对PRSS21的抗原结合结构域包含描述于以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：美国专利号：8,080,650。
在一个实施例中，针对B7H3的抗原结合结构域包含抗体MGA271(宏观基因公司(Macrogenics))的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对KIT的抗原结合结构域包含描述于例如，US 7915391、US20120288506中的抗体和几种商业目录抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对IL-13Ra2的抗原结合结构域包含描述于例如，WO 2008/146911、WO 2004087758中的抗体、若干种商业目录抗体和WO 2004087758中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CD30的抗原结合结构域包含描述于例如，US 7090843B1和EP 0805871中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对GD3的抗原结合结构域包含描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US 7253263；US 8,207,308；US 20120276046；EP1013761；WO2005035577；以及US 6437098。
在一个实施例中，针对CD171的抗原结合结构域包含描述于例如，Hong等人,JImmunother[免疫疗法杂志]37(2):93-104(2014)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对IL-11Ra的抗原结合结构域包含可从艾博抗公司(目录号ab55262)或罗福斯生物制剂公司(Novus Biologicals)(目录号EPR5446)获得的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。在另一个实施例中，针对IL-11Ra的抗原结合结构域是肽，参见例如Huang等人,Cancer Res[癌症研究]72(1):271-281(2012)。
在一个实施例中，针对PSCA的抗原结合结构域包含描述于例如，Morgenroth等人,Prostate[前列腺]67(10):1121-1131(2007)(scFv 7F5)、Nejatollahi等人,J ofOncology[肿瘤学杂志]2013(2013),文章ID 839831(scFv C5-II)；和美国专利公开号20090311181。
在一个实施例中，针对VEGFR2的抗原结合结构域包含描述于例如，Chinnasamy等人,J Clin Invest[临床研究杂志]120(11):3953-3968(2010)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对LewisY的抗原结合结构域包含描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：Kelly等人,Cancer Biother Radiopharm[癌症生物治疗和放射性药物]23(4):411-423(2008)(hu3S193Ab(scFvs))；Dolezal等人,Protein Engineering[蛋白质工程]16(1):47-56(2003)(NC10 scFv)。
在一个实施例中，针对CD24的抗原结合结构域包含描述于例如，Maliar等人,Gastroenterology[肠胃病学]143(5):1375-1384(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对PDGFR-β的抗原结合结构域包含抗体Abcam ab32570的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对SSEA-4的抗原结合结构域包含抗体MC813(Cell Signaling公司)或其他市售抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CD20的抗原结合结构域包含抗体利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗、维妥珠单抗、或GA101的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对叶酸受体α的抗原结合结构域包含抗体IMGN853或描述于以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US20120009181；US4851332；LK26：US5952484。
在一个实施例中，针对ERBB2(Her2/neu)的抗原结合结构域包含抗体曲妥珠单抗、或帕妥珠单抗的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对MUC1的抗原结合结构域包含抗体SAR566658的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对EGFR的抗原结合结构域包含抗体西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、或马妥珠单抗的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对NCAM的抗原结合结构域包含以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体克隆2-2B：MAB5324(EMD密理博公司(EMD Millipore))
在一个实施例中，针对肝配蛋白B2的抗原结合结构域包含描述于例如，Abengozar等人,Blood[血液]119(19):4565-4576(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对IGF-I受体的抗原结合结构域包含描述于例如，以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US 8344112B2；EP2322550A1；WO 2006/138315、或PCT/US2006/022995。
在一个实施例中，针对CAIX的抗原结合结构域包含抗体克隆303123(R&D系统公司(R&D Systems)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对LMP2的抗原结合结构域包含描述于例如，US 7,410,640、或US 20050129701中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对gp100的抗原结合结构域包含抗体HMB45、NKIβB、或描述于WO 2013165940或US 20130295007中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)
在一个实施例中，针对酪氨酸酶的抗原结合结构域包含描述于例如，以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US 5843674；或US 19950504048。
在一个实施例中，针对EphA2的抗原结合结构域包含描述于例如，Yu等人,MolTher[分子疗法]22(1):102-111(2014)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对GD3的抗原结合结构域包含描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US 7253263；US 8,207,308；US 20120276046；EP1013761 A3；20120276046；WO 2005035577；或US 6437098。
在一个实施例中，针对岩藻糖基GM1的抗原结合结构域包含描述于例如，以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US 20100297138；或WO 2007/067992。
在一个实施例中，针对sLe的抗原结合结构域包含抗体G193(对于lewis Y)的抗原结合部分(例如，CDR)，参见Scott AM等人,Cancer Res[癌症研究]60:3254-61(2000)，也如Neeson等人,J Immunol[免疫学杂志]2013年5月190(会议摘要补充)177.10中所述的。
在一个实施例中，针对GM3的抗原结合结构域包含抗体CA2523449(mAb 14F7)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对HMWMAA的抗原结合结构域包含描述于例如，以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Kmiecik等人,Oncoimmunology[肿瘤免疫学]3(1):e27185(2014)(PMID:24575382)(mAb9.2.27)；US6528481；WO 2010033866；或US 20140004124。
在一个实施例中，针对o-乙酰基-GD2的抗原结合结构域包含抗体8B6的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对TEM1/CD248的抗原结合结构域包含描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：Marty等人,Cancer Lett[癌症快报]235(2):298-308(2006)；Zhao等人,J Immunol Methods[免疫方法杂志]363(2):221-232(2011)。
在一个实施例中，针对CLDN6的抗原结合结构域包含抗体IMAB027(咖尼米德制药公司(Ganymed Pharmaceuticals))的抗原结合部分(例如，CDR)，参见例如，clinicaltrial.gov/show/NCT02054351。
在一个实施例中，针对TSHR的抗原结合结构域包含描述于例如，以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US 8,603,466；US 8,501,415；或US 8,309,693。
在一个实施例中，针对GPRC5D的抗原结合结构域包含抗体FAB6300A(R&D系统公司)；或LS-A4180(莱仕邦生物科技公司(Lifespan Biosciences))的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CD97的抗原结合结构域包含以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：描述于例如US 6,846,911；de Groot等人,J Immunol[免疫学杂志]183(6):4127-4134(2009)中的抗体；或来自R&D公司的抗体：MAB3734。
在一个实施例中，针对ALK的抗原结合结构域包含描述于例如，Mino-Kenudson等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]16(5):1561-1571(2010)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对聚唾液酸的抗原结合结构域包含描述于例如，Nagae等人,JBiol Chem[生物化学杂志]288(47):33784-33796(2013)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对PLAC1的抗原结合结构域包含描述于例如，Ghods等人,Biotechnol Appl Biochem[生物化学生物技术应用]2013 doi:10.1002/bab.1177中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对GloboH的抗原结合结构域包含以下抗体的抗原结合部分：抗体VK9；或描述于例如Kudryashov V等人,Glycoconj J.[糖缀合物杂志]15(3):243-9(1998)，Lou等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]111(7):2482-2487(2014)中的抗体；MBr1：Bremer E-G等人J Biol Chem[生物化学杂志]259:14773-14777(1984)。
在一个实施例中，针对NY-BR-1的抗原结合结构域包含描述于例如，Jager等人,Appl Immunohistochem Mol Morphol[应用免疫组织化学分子形态学]15(1):77-83(2007)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对WT-1的抗原结合结构域包含描述于以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：例如，Dao等人,Sci Transl Med[科学转化医学]5(176):176ra33(2013)；或WO 2012/135854。
在一个实施例中，针对MAGE-A1的抗原结合结构域包含描述于例如，Willemsen等人,J Immunol[免疫学杂志]174(12):7853-7858(2005)(TCR样scFv)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对精子蛋白17的抗原结合结构域包含描述于例如，Song等人,Target Oncol[靶标肿瘤学]2013年8月14日(PMID:23943313)；Song等人,Med Oncol[医学肿瘤学]29(4):2923-2931(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对Tie 2的抗原结合结构域包含抗体AB33(细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology))的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对MAD-CT-2的抗原结合结构域包含描述于例如PMID:2450952；US7635753中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对Fos相关抗原1的抗原结合结构域包含抗体12F9(罗福斯生物制剂公司)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对MelanA/MART1的抗原结合结构域包含描述于以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：EP 2514766A2；或US 7,749,719。
在一个实施例中，针对肉瘤易位断点的抗原结合结构域包含描述于例如，Luo等人,EMBO Mol.Med.[EMBO分子医学]4(6):453-461(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对TRP-2的抗原结合结构域包含描述于例如，Wang等人,J ExpMed.[实验医学杂志]184(6):2207-16(1996)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CYP1B1的抗原结合结构域包含描述于例如，Maecker等人,Blood[血液]102(9):3287-3294(2003)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对RAGE-1的抗原结合结构域包含抗体MAB5328(EMD密理博公司)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对人端粒酶逆转录酶的抗原结合结构域包含以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体目录号：LS-B95-100(莱仕邦生物科技公司)
在一个实施例中，针对肠道羧基酯酶的抗原结合结构域包含以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体4F12：目录号：LS-B6190-50(莱仕邦生物科技公司))。
在一个实施例中，针对mut hsp70-2的抗原结合结构域包含抗体(莱仕邦生物科技：单克隆：目录号：LS-C133261-100(莱仕邦生物科技公司))的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CD79a的抗原结合结构域包含以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：可从艾博抗公司获得的抗体抗CD79a抗体[HM47/A9](ab3121)；可从细胞信号传导技术公司获得的抗体CD79A抗体号3351；或产生自兔的、可从西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)获得的抗体HPA017748-抗CD79A抗体。
在一个实施例中，针对CD79b的抗原结合结构域包含以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体维汀-珀拉妥珠单抗(polatuzumab vedotin)(抗CD79b)(描述于Dornan等人,“Therapeutic potential of an anti-CD79b antibody-drug conjugate,anti-CD79b-vc-MMAE,for the treatment of non-Hodgkin lymphoma[抗CD79b抗体-药物偶联物抗CD79b-vc-MMAE用于治疗非霍奇金淋巴瘤的治疗潜力]”Blood.[血液]2009年9月24日；114(13):2721-9.doi:10.1182/blood-2009-02-205500.Epub 2009年7月24日中)，或双特异性抗体抗CD79b/CD3(描述于“4507Pre-Clinical Characterization of T Cell-DependentBispecific Antibody Anti-CD79b/CD3As a Potential Therapy for B CellMalignancies[4507T细胞依赖性双特异性抗体抗CD79b/CD3的临床前表征作为B细胞恶性肿瘤的潜在疗法]”Abstracts of 56th ASH Annual Meeting and Exposition[第56届ASH年会和博览会摘要],加利福尼亚州旧金山2014年12月6日至9日中)。
在一个实施例中，针对CD72的抗原结合结构域包含以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体J3-109(描述于Myers和Uckun,“An anti-CD72 immunotoxin againsttherapy-refractory B-lineage acute lymphoblastic leukemia[抗CD72免疫毒素抗治疗难治性B谱系急性淋巴细胞白血病]”Leuk Lymphoma.[白血病淋巴瘤]1995年6月；18(1-2):119-22中)或抗CD72(10D6.8.1，mIgG1)(描述于Polson等人,“Antibody-DrugConjugates for the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma:Target and Linker-DrugSelection[用于治疗非霍奇金淋巴瘤的抗体-药物缀合物：靶标和接头-药物选择]”CancerRes[癌症研究]2009年3月15日69；2358中)。
在一个实施例中，针对LAIR1的抗原结合结构域包含以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：可从ProSpec公司获得的抗体ANT-301 LAIR1抗体；或可从百进公司(BioLegend)获得的抗人CD305(LAIR1)抗体。
在一个实施例中，针对FCAR的抗原结合结构域包含可从Sino Biological公司获得的抗体CD89/FCAR抗体(目录号10414-H08H)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对LILRA2的抗原结合结构域包含可从亚诺法公司(Abnova)获得的抗体LILRA2单克隆抗体(M17)(克隆3C7)，或可从莱仕邦生物科技公司获得的小鼠抗LILRA2抗体(单克隆(2D7))的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CD300LF的抗原结合结构域包含可从百进公司获得的抗体小鼠抗CMRF35样分子1抗体(单克隆[UP-D2])；或可从R&D系统公司获得的大鼠抗CMRF35样分子1抗体(单克隆[234903])的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CLEC12A的抗原结合结构域包含以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体双特异性T细胞衔接器(BiTE)scFv-抗体和ADC(描述于Noordhuis等人,“Targeting of CLEC12A In Acute Myeloid Leukemia by Antibody-Drug-Conjugatesand Bispecific CLL-1xCD3 BiTE Antibody[通过抗体-药物-偶联物和双特异性CLL-1xCD3 BiTE抗体靶向急性骨髓性白血病中的CLEC12A]”53rd ASH Annual Meeting andExposition[第53届ASH年会和博览会],2011年12月10日至13日中)，以及MCLA-117(梅鲁斯公司(Merus))。
在一个实施例中，针对BST2(也称为CD317)的抗原结合结构域包含可从抗体在线(Antibodies-Online)获得的抗体小鼠抗CD317抗体(单克隆[3H4])或可从R&D系统公司获得的小鼠抗CD317抗体(单克隆[696739])的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对EMR2(也称为CD312)的抗原结合结构域包含可从莱仕邦生物科技公司获得的抗体小鼠抗CD312抗体(单克隆[LS-B8033])或可从R&D系统公司获得的小鼠抗CD312抗体(单克隆[494025])的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对LY75的抗原结合结构域包含可从EMD密理博公司获得的抗体小鼠抗淋巴细胞抗原75抗体(单克隆[HD30])或可从生命技术公司(Life Technologies)获得的小鼠抗淋巴细胞抗原75抗体(单克隆[A15797])的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对GPC3的抗原结合结构域包含以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体hGC33(描述于Nakano K,Ishiguro T,Konishi H等人Generation of ahumanized anti-glypican 3antibody by CDR grafting and stability optimization.[通过CDR移植和稳定性优化产生人源化抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体]Anticancer Drugs.[抗癌药物]2010年11月；21(10):907-916)或MDX-1414、HN3或YP7(在Feng等人的“Glypican-3antibodies:a new therapeutic target for liver cancer.[Glypican-3抗体：肝癌的新治疗靶标]FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]2014年1月21日；588(2):377-82”中对这三种方法进行了描述)。
在一个实施例中，针对FCRL5的抗原结合结构域包含描述于以下中的抗FcRL5抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Elkins等人,“FcRL5 as a target of antibody-drugconjugates for the treatment of multiple myeloma[FcRL5作为抗体-药物偶联物的靶标用于治疗多发性骨髓瘤]”Mol Cancer Ther.[分子癌症治疗学]2012年10月；11(10):2222-32。
在一个实施例中，针对IGLL1的抗原结合结构域包含以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：可从莱仕邦生物科技公司获得的抗体小鼠抗免疫球蛋白λ样多肽1(单克隆[AT1G4])，可从百进生物科技公司获得的小鼠抗免疫球蛋白λ样多肽1抗体(单克隆[HSL11])。
跨膜结构域
关于跨膜结构域，在各种实施例中，CAR可以设计为包含附接至CAR的细胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如，与跨膜衍生的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如，所述细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)和/或与跨膜蛋白衍生的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如，所述细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域包含与所用的CAR的其他结构域之一相关的跨膜结构域。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免此类域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一个方面，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞的细胞表面上的另一种CAR同源二聚化。在一个不同的方面，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便最小化与存在于相同CART中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以衍生自天然来源或来自重组来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。在一个方面，每当CAR结合靶标时，跨膜结构域能够将信号传导至一个或多个细胞内结构域。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以至少包括例如T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的一个或多个跨膜区。在一些实施例中，跨膜结构域可至少包括例如，KIR2DS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C或CD19的一个或多个跨膜区。
在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)附接到CAR的细胞外区域(例如，CAR的抗原结合结构域)。例如，在一个实施例中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如IgG4铰链)或CD8a铰链。在一个实施例中，铰链或间隔子包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列(例如，由其组成)。在一个方面，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的跨膜结构域(例如，由其组成)。
在一个方面，铰链或间隔子包含IgG4铰链。例如，在一个实例中，铰链或间隔子包含氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(SEQ ID NO:36)的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔子包含由GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(SEQ ID NO:37)的核苷酸序列编码的铰链。
在一个方面，铰链或间隔子包含IgD铰链。例如，在一个实例中，铰链或间隔子包含氨基酸序列RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(SEQ ID NO:38)的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔子包含由AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(SEQ ID NO:103)的核苷酸序列编码的铰链。
在一个方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下其将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，可以在重组跨膜结构域的每个末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地，长度在2与10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与胞质区域之间形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别适合的接头。例如，在一个方面，接头包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列。在一些实施例中，接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:8)的核苷酸序列编码。
在一个方面，铰链或间隔子包含KIR2DS2铰链。
胞质结构域
CAR的细胞质结构域或区包含细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域通常负责激活已引入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。
用于在本文所述CAR中使用的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列(它们协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导)以及这些序列的任何衍生物或变体和任何具有相同功能能力的重组序列。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，并且还需要次级和/或共刺激信号。因此，可认为T细胞激活是由两种不同类别的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级细胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质结构域，例如共刺激结构域)。
初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。
在本发明中特别有用的含有ITAM的初级胞质信号传导结构域的实例包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、DAP10、DAP12、和CD66d。在一个实施例中，本发明的CAR包含细胞内信号传导结构域，例如，CD3-ζ(例如，本文所述的CD3-ζ序列)的初级信号传导结构域。
在一个实施例中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如，与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增加或减少的)活性的突变ITAM结构域。在一个实施例中，初级信号传导结构域包含含有修饰的ITAM的初级细胞内信号传导结构域，例如含有优化的和/或截短的ITAM的初级细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
共刺激信号传导结构域
CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3-ζ信号传导结构域本身，或者它可以与在本发明的CAR的背景中使用的任何其他所希望的细胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指CAR的包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。在一个实施例中，所述细胞内结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，所述细胞内结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。
共刺激分子可以是除了抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，包含淋巴细胞对抗原的有效反应所必需的。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性地结合CD83的配体等。例如，已证明CD27共刺激可增强体外人CART细胞的扩增、效应子功能、和存活，并增加体内人T细胞持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.[血液]2012；119(3):696-706)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、NKG2D、NKG2C以及PAG/Cbp。
所述CAR的胞质部分内的细胞内信号传导序列可以按随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如，长度在2和10个氨基酸之间(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)，可以形成细胞内信号传导序列之间的连接。在一个实施例中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作适合的接头。在一个实施例中，单个氨基酸(例如丙氨酸、甘氨酸)可以用作适合的接头。
在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域。在一个实施例中，两个或更多个(例如，2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域通过接头分子(例如，本文描述的接头分子)分开。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施例中，接头是丙氨酸残基。
在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一个方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:7的信号传导结构域。在一个方面，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:9的信号传导结构域。
在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一个方面，CD27的信号传导结构域包含QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。在一个方面，CD27的信号传导结构域由AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:14)的核酸序列编码。
在一个方面，本文描述的表达CAR的细胞可以进一步包含第二CAR，例如包括不同的抗原结合结构域(例如，针对相同的靶标或不同的靶标(例如，除本文描述的癌症相关抗原或本文描述的不同癌症相关抗原的靶标，例如，CD19、CD33、CLL-1、CD34、FLT3，或叶酸受体β))的第二CAR。在一个实施例中，第二CAR包含针对在与癌症相关抗原相同的癌细胞类型上表达的靶标的抗原结合结构域。在一个实施例中，表达CAR的细胞包含靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR，以及靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。虽然不希望受理论束缚，但包含将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、ICOS、CD27或OX-40)置于第一CAR上，并将初级信号传导结构域(例如，CD3ζ)置于第二CAR上可以将CAR活性限制于表达两种靶标的细胞。在一个实施例中，表达CAR的细胞包含第一癌症相关抗原CAR，该第一癌症相关抗原CAR包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域；和第二CAR，该第二CAR靶向不同靶抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施例中，表达CAR的细胞包含第一CAR，该第一CAR包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和第二CAR，该第二CAR靶向除第一靶抗原以外的抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对该抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在另一个方面，本披露的特征是表达CAR的细胞(例如，CART细胞)的群体。在一些实施例中，表达CAR的细胞群体包含表达不同CAR的细胞的混合物。
例如，在一个实施例中，CART细胞群体可包括表达CAR(所述CAR具有本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域)的第一细胞和表达具有不同抗原结合结构域(例如，本文所述的不同癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如，不同于由第一细胞表达的CAR的抗原结合结构域所结合的癌症相关抗原的本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域))的CAR的第二细胞。
作为另一个实例，表达CAR的细胞群体可包括表达CAR(该CAR包括本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域)的第一细胞和表达CAR(该CAR包括除如本文所述的癌症相关抗原以外的靶标的抗原结合结构域)的第二细胞。在一个实施例中，表达CAR的细胞群体包括，例如表达包含初级细胞内信号传导结构域的CAR的第一细胞，和表达包含次级信号传导结构域的CAR的第二细胞。
在另一个方面，本披露的特征是一个细胞群体，其中所述群体中的至少一种细胞表达具有本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域的CAR；和表达另一种药剂(例如，增强表达CAR的细胞的活性的药剂)的第二细胞。例如，在一个实施例中，药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂。在一些实施例中，抑制性分子(例如，PD-1)可降低表达CAR的细胞产生免疫效应子反应的能力。抑制性分子的实例包括PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGF(例如，TGFβ)。在一个实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与向细胞提供正信号的第二多肽例如本文所述的细胞内信号传导结构域缔合。在一个实施例中，所述药剂包含例如，抑制性分子(如PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFβ、或这些中的任一者的片段)的第一多肽，和第二多肽，所述第二多肽包含本文描述的细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27、OX40或CD28，例如，如本文描述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施例中，所述药剂包含PD-1的第一多肽或其片段和本文所述的细胞内信号传导结构域(例如本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
本文表1中提供了抗CD19结合结构域的序列。可以使用表1中所述的含有以下提供的一种或多种其他CAR组分的任何抗原结合结构域来生成完整的CAR构建体。
·前导序列(氨基酸序列)(SEQ ID NO:1)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
·前导序列(核酸序列)(SEQ ID NO:12)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
·前导序列(核酸序列2)(SEQ ID NO:127)
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC
·前导序列(核酸序列3)(SEQ ID NO:128)
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG
·CD8铰链(氨基酸序列)(SEQ ID NO:2)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
·CD8铰链(核酸序列)(SEQ ID NO:13)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
·CD8铰链(核酸序列2)(SEQ ID NO:129)
ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGAT
·CD8跨膜(氨基酸序列)(SEQ ID NO:6)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
·跨膜(核酸序列)(SEQ ID NO:17)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
·跨膜(核酸序列2)(SEQ ID NO:130)
ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT
·4-1BB细胞内结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:7)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
·4-1BB细胞内结构域(核酸序列)(SEQ ID NO:18)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
·4-1BB细胞内结构域(核酸序列2)(SEQ ID NO:131)
AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG
·CD3ζ结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:9)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
·CD3ζ(核酸序列)(SEQ ID NO:20)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
·CD3ζ(核酸序列2)(SEQ ID NO:132)
CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
·CD3ζ结构域(氨基酸序列；NCBI参考序列NM_000734.3)(SEQ ID NO:10)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
·CD3ζ(核酸序列；NCBI参考序列NM_000734.3)；(SEQ ID NO:21)
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
·IgG4铰链(氨基酸序列)(SEQ ID NO:36)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
·IgG4铰链(核苷酸序列)(SEQ ID NO:37)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATGEF1α启动子
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA(SEQ ID NO:11)。
Gly/Ser(SEQ ID NO:25)
GGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:26)：所述序列可包含1-6个“Gly Gly Gly Gly Ser”重复单元
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:27)
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:28)
GGGGSGGGGS GGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:29)
GGGS
聚A(SEQ ID NO:30)：A5000
聚A(SEQ ID NO:31)：A100
聚T(SEQ ID NO:32)：T5000
聚A(SEQ ID NO:33)：A5000
聚A(SEQ ID NO:34)：A400
聚A(SEQ ID NO:35)”A2000
·Gly/Ser(SEQ ID NO:15)：所述序列可包含1-10个“Gly Gly Gly Ser”重复单元
GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
表3中示出了可用于本文所述方法的示例性CD19 CAR构建体：
表3：CD19 CAR构建体
Figure BDA0002462996200001541
Figure BDA0002462996200001551
Figure BDA0002462996200001561
Figure BDA0002462996200001571
Figure BDA0002462996200001581
Figure BDA0002462996200001591
Figure BDA0002462996200001601
Figure BDA0002462996200001611
Figure BDA0002462996200001621
Figure BDA0002462996200001631
Figure BDA0002462996200001641
Figure BDA0002462996200001651
Figure BDA0002462996200001661
Figure BDA0002462996200001671
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表3中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、和HC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域进一步包含LC CDR1、LCCDR2、和LC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域包含表3中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表3中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个、两个或全部，以及表3中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个、两个或全部。
在一些实施例中，根据Kabat编号方案、Chothia编号方案、或其组合定义CDR。
对于scFv结构域的人源化CDR序列的序列，其重链可变结构域显示在表3A中，并且其轻链可变结构域显示在表3B中。“ID”代表每个CDR的相应SEQ ID NO。
表3A.重链可变结构域CDR(Kabat)
候选物 FW HCDR1 ID HCDR2 ID HCDR3 ID
鼠_CART19 DYGVS 133 VIWGSETTYYNSALKS 134 HYYYGGSYAMDY 138
人源化_CART19a VH4 DYGVS 133 VIWGSETTYYSSSLKS 135 HYYYGGSYAMDY 138
人源化_CART19b VH4 DYGVS 133 VIWGSETTYYQSSLKS 136 HYYYGGSYAMDY 138
人源化_CART19c VH4 DYGVS 133 VIWGSETTYYNSSLKS 137 HYYYGGSYAMDY 138
表3B轻链可变结构域CDR
Figure BDA0002462996200001672
Figure BDA0002462996200001681
CAR与其他分子或药剂的共表达
第二CAR的共表达
在一个方面，本文所述的表达CAR的细胞可以进一步包含第二CAR，例如包括不同的抗原结合结构域(例如，针对相同的靶标(例如，CD19)或不同的靶标(例如，除CD19以外的靶标，例如，本文所述的靶标))的第二CAR。在一个实施例中，表达CAR的细胞包含靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR，以及靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、CD27、OX-40或ICOS)置于第一CAR上，并且将初级信号传导结构域(例如，CD3ζ)置于第二CAR上可以限制CAR对表达两个靶标的细胞的活性。在一个实施例中，表达CAR的细胞包含第一CAR(其包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域)、以及第二CAR(其靶向其他抗原，并包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域)。在另一个实施例中，表达CAR的细胞包含第一CAR(其包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域)、以及第二CAR(其靶向其他抗原，并包括针对抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域)。
在一个实施例中，表达CAR的细胞包含本文所述的XCAR和抑制性CAR。在一个实施例中，抑制性CAR包含结合在正常细胞而非癌细胞(例如，也表达X的正常细胞)上发现的抗原的抗原结合结构域。在一个实施例中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR的细胞内结构域可以包含PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGF(例如，TGFβ)的细胞内结构域。
在一个实施例中，当表达CAR的细胞包含两种或更多种不同的CAR时，不同CAR的抗原结合结构域可以使得抗原结合结构域不相互作用。例如，表达第一CAR和第二CAR的细胞可以具有第一CAR的抗原结合结构域(例如，作为片段，例如，scFv)，所述抗原结合结构域不与第二CAR的抗原结合结构域形成缔合，例如，第二CAR的抗原结合结构域包含VHH。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含单结构域抗原结合(SDAB)分子，包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的分子。实例包括但不限于重链可变结构域、天然缺乏轻链的结合分子、衍生自常规4-链抗体的单结构域、工程化结构域、和除抗体衍生的那些以外的单结构域支架。SDAB分子可以是任何现有技术的、或任何未来的单结构域分子。SDAB分子可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。该术语还包括来自除骆驼科和鲨鱼外的物种的天然存在的单结构域抗体分子。
在一个方面，SDAB分子可以衍生自在鱼中发现的免疫球蛋白的可变区，例如像衍生自在鲨鱼血清中发现的称为新颖抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型的可变区。WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.[蛋白质科学]14:2901-2909中描述了产生衍生自NAR可变区的单结构域分子(“IgNAR”)的方法。
根据另一个方面，SDAB分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，称为缺乏轻链的重链。在例如WO 9404678和Hamers-Casterman,C.等人(1993)Nature[自然]363:446-448中披露了此类单结构域分子。出于清楚的原因，衍生自天然缺乏轻链的重链分子的这种可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这种VHH分子可以衍生自骆驼科物种，例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和原驼。除骆驼科外的其他物种可产生天然缺乏轻链的重链分子；此类VHH在本发明的范围内。
SDAB分子可以是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外产生的(例如通过噬菌体展示选择的)。
还发现，具有多个嵌合膜嵌入受体(这些嵌合膜嵌入受体包含抗原结合结构域，受体的抗原结合结构域之间具有相互作用)的细胞可能是不希望的，例如，因为它抑制一个或多个抗原结合结构域结合其同源抗原的能力。因此，本文披露了具有第一非天然存在的嵌合膜嵌入受体和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体的细胞，该嵌合膜嵌入受体包含使这种相互作用最小化的抗原结合结构域。本文还披露了编码包含最小化这种相互作用的抗原结合结构域的第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体的核酸，以及制备和使用此类细胞和核酸的方法。在一个实施例中，第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含单VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼、或七鳃鳗单VH结构域、或衍生自人或小鼠序列的单VH结构域。
在一些实施例中，本文的组合物包含第一和第二CAR，其中第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域不包含可变轻结构域和可变重结构域。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域是scFv，并且另一个不是scFv。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含单VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼、或七鳃鳗单VH结构域、或衍生自人或小鼠序列的单VH结构域。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含骆驼科动物VHH结构域。
在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含单VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼、或七鳃鳗单VH结构域、或衍生自人或小鼠序列的单VH结构域。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含纳米抗体。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含骆驼科动物VHH结构域。
在一些实施例中，当存在于细胞表面上时，第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合基本上不因第二CAR的存在而降低。在一些实施例中，存在第二CAR情况下的第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合包含不存在CAR情况下的第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％、例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些实施例中，当存在于细胞表面上时，第一和第二CAR的抗原结合结构域彼此的相关联小于两者都是scFv抗原结合结构域的情况。在一些实施例中，第一和第二CAR的抗原结合结构域彼此的相关联小于两者都包含scFv抗原结合结构域的情况的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％、例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
增强CAR活性的药剂的共表达
在另一个方面，本文所述的表达CAR的细胞可以进一步表达另一种药剂，例如增强表达CAR的细胞的活性或适合性的药剂。
例如，在一个实施例中，所述药剂可以是抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子的药剂。在一些实施例中，调制或调节T细胞功能的分子是抑制性分子。在一些实施例中，抑制性分子(例如，PD1)可降低表达CAR的细胞产生免疫效应子反应的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、或TGFβ。
在实施例中，试剂，例如，抑制性核酸，例如，dsRNA，例如，siRNA或shRNA；或例如，抑制性蛋白质或系统(例如，聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN)，例如，如本文所述的)可以用于在表达CAR的细胞中抑制调制或调节(例如，抑制)T细胞功能的分子的表达。在一个实施例中，该药剂是shRNA，例如本文所述的shRNA。在一个实施例中，调制或调节(例如抑制)T细胞功能的药剂在表达CAR的细胞内被抑制。例如，将抑制调制或调节(例如，抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子与编码CAR组分(例如，所有组分)的核酸连接。
在一个实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与向细胞提供正信号的第二多肽例如本文所述的细胞内信号传导结构域缔合。在一个实施例中，所述药剂包含例如，抑制性分子(如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、或TGFβ、或这些中的任一个的片段(例如，这些中的任一个的细胞外结构域的至少一部分))的第一多肽，和为本文所述的细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27或CD28，例如，如本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在一个实施例中，所述药剂包含PD1的第一多肽或其片段(例如，PD1的细胞外结构域的至少一部分)和本文所述的细胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。PD1是受体的CD28家族的抑制性成员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在激活的B细胞、T细胞和髓系细胞上表达(Agata等人1996Int.Immunol[国际免疫学]8:765-75)。已经显示PD1的两种配体PD-L1和PD-L2在与PD1结合后下调T细胞激活(Freeman等人2000J Exp Med[实验医学杂志]192:1027-34；Latchman等人2001Nat Immunol[自然免疫学]2:261-8；Carter等人2002 Eur JImmunol[欧洲免疫学杂志]32:634-43)。PD-L1在人类癌症中是丰富的(Dong等人2003 JMol Med[分子医学杂志]81:281-7；Blank等人2005 Cancer Immunol.Immunother[癌症免疫学和免疫疗法]54:307-314；Konishi等人2004 Clin Cancer Res[临床癌症研究]10:5094)。通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制。
在一个实施例中，所述药剂包含抑制性分子(例如，程序性死亡1(PD1))的细胞外结构域(ECD)，可以与跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(如41BB和CD3ζ)融合(在本文中也称为PD1 CAR)。在一个实施例中，PD1 CAR与本文所述的XCAR组合使用时，改进了T细胞的持久性。在一个实施例中，CAR是PD1 CAR，其包含PD1的细胞外结构域，如SEQ ID NO:105中加下划线所指示的。在一个实施例中，PD1 CAR包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列。
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnw yrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelr vterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:105)。
在一个实施例中，PD1 CAR包含以下提供的氨基酸序列(SEQ ID NO:106)。
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsq pgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpag qfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:106)。
在一个实施例中，所述药剂包含编码PD1 CAR(例如，本文所述的PD1 CAR)的核酸序列。在一个实施例中，PD1 CAR的核酸序列如下所示，其中在下面的SEQ ID NO:107中PD1ECD标有下划线
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccgg atggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggc gataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgt caaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgac tcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgc ggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagag ctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc(SEQ ID NO:107)。
在另一个实例中，在一个实施例中，增强表达CAR的细胞活性的药剂可以是共刺激分子或共刺激分子配体。共刺激分子的实例包括MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、和4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、以及与CD83特异性结合的配体，例如，如本文所述。共刺激分子配体的实例包括CD80、CD86、CD40L、ICOSL、CD70、OX40L、4-1BBL、GITRL、和LIGHT。在实施例中，共刺激分子配体是不同于CAR的共刺激分子结构域的共刺激分子的配体。在实施例中，共刺激分子配体是与CAR的共刺激分子结构域相同的共刺激分子的配体。在一个实施例中，共刺激分子配体是4-1BBL。在一个实施例中，共刺激配体是CD80或CD86。在一个实施例中，共刺激分子配体是CD70。在实施例中，可以进一步工程化本文所述的表达CAR的免疫效应细胞以表达一种或多种另外的共刺激分子或共刺激分子配体。
CAR与趋化因子受体的共表达
在实施例中，本文所述的表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)进一步包含趋化因子受体分子。T细胞中趋化因子受体CCR2b或CXCR2的转基因表达增强了向分泌CCL2或CXCL1的实体瘤(包括黑色素瘤和神经母细胞瘤)的运输(Craddock等人,J Immunother.[免疫疗法杂志]2010年10月；33(8):780-8和Kershaw等人,Hum Gene Ther.[人基因疗法]2002年11月1日；13(16):1971-80)。因此，不希望受理论的约束，据信在识别由肿瘤(例如实体瘤)分泌的趋化因子的表达CAR的细胞中表达的趋化因子受体可以改进表达CAR的细胞向肿瘤的归巢，促进表达CAR的细胞向肿瘤的浸润，并增强表达CAR的细胞的抗肿瘤功效。趋化因子受体分子可以包含天然存在或重组趋化因子受体或其趋化因子结合片段。适合于在本文所述的表达CAR的细胞(例如，CAR-Tx)中表达的趋化因子受体分子包括CXC趋化因子受体(例如，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、或CXCR7)、CC趋化因子受体(例如，CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、或CCR11)、CX3C趋化因子受体(例如，CX3CR1)、XC趋化因子受体(例如，XCR1)、或其趋化因子结合片段。在一个实施例中，基于由肿瘤分泌的一种或多种趋化因子选择有待用本文所述CAR表达的趋化因子受体分子。在一个实施例中，本文所述的表达CAR的细胞进一步包含(例如表达)CCR2b受体或CXCR2受体。在一个实施例中，本文所述的CAR和趋化因子受体分子在同一载体或在两个不同载体上。在其中本文所述CAR和趋化因子受体分子在同一载体上的实施例中，CAR和趋化因子受体分子各自处于两个不同启动子的控制下或处于同一启动子的控制下。
编码CAR的核酸构建体
本发明还提供免疫效应细胞，例如，通过本文所述的方法制备的免疫效应细胞，其包括编码本文所述的一种或多种CAR构建体的核酸分子。在一个方面，核酸分子以信使RNA转录物提供。在一个方面，核酸分子以DNA构建体提供。
本文描述的核酸分子可以是DNA分子、RNA分子或其组合。在一个实施例中，核酸分子包含编码如本文所述的CAR多肽的mRNA。在其他实施例中，核酸分子是包括任何前述核酸分子的载体。
在一个方面，本发明的CAR的抗原结合结构域(例如，scFv)由核酸分子编码，该核酸分子的序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在一个方面，本发明的整个CAR构建体由核酸分子编码，该核酸分子的整个序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。密码子优化是指如下发现：在编码DNA中同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)的出现频率在不同物种中有偏差。此种密码子简并性允许相同的多肽由多种核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域中已知的，并且包括例如在至少美国专利号5,786,464和6,114,148中披露的方法。
因此，在一个方面，免疫效应细胞，例如，利用本文所述方法制备的免疫效应细胞，包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中CAR包含结合本文所述肿瘤抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、和细胞内信号传导结构域(例如，本文所述的细胞内信号传导结构域)(包含刺激结构域，例如，共刺激信号传导结构域(例如，本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的初级信号传导结构域，例如，本文所述的ζ链))。
本发明还提供了载体，其中插入了编码CAR的核酸分子，例如，本文所述的核酸分子。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于衍生自肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。逆转录病毒载体还可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包括例如，启动子、封装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如，两个)长末端重复(LTR)、和感兴趣的转基因(例如，编码CAR的基因)。γ逆转录病毒载体可能缺少病毒结构基因(例如gag、pol、和env)。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、形成脾脏病灶病毒(SFFV)、和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如Tobias Maetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application[γ逆转录病毒载体：生物学/技术和应用]”Viruses.[病毒]2011年6月；3(6):677-713)。
在另一个实施例中，包含编码所希望CAR的核酸的载体包含腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施例中，编码CAR的核酸的表达可以使用转座子如睡美人系统、crisper、CAS9和锌指核酸酶完成。见下文June等人2009Nature Reviews Immunology[自然免疫学综述]9.10:704-716，该文献通过引用并入本文。
简而言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达典型地是通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子可操作地连接、并将构建体并入到表达载体中来实现。载体可以适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节所希望核酸序列表达的启动子。
可以将核酸克隆至许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，该载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，可以将表达载体以病毒载体的形式提供至细胞。病毒载体技术在本领域中是熟知的，并且例如描述于Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL[分子克隆：实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社],纽约中，以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中具有复制功能的起点、启动子序列、便利的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择性标记物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入到载体中并且封装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用了腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施例中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。典型地，这些位于起始位点上游30-110bp的区中，但是已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔常常是灵活的，使得当元件彼此相对发生颠倒或移动时启动子功能可以得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到相隔50bp。取决于启动子，显现单独的元件可以协同或独立地起作用以激活转录。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C、或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
能够在哺乳动物T细胞中表达编码CAR的核酸分子的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基的表达，该复合物负责将氨酰tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已经广泛用于哺乳动物表达质粒，并且已经显示出可有效地从克隆到慢病毒载体中的核酸分子驱动CAR表达。参见例如，Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。在一个方面，所述EF1a启动子包含实例中提供的序列。
启动子的另一个实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB(Epstein-Barr)病毒即刻早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子、和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，所述分子开关能够当需要所述启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达时启动这种表达，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
启动子的另一个实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在实施例中，截短的PGK启动子(例如，当与野生型PGK启动子序列相比时，具有一个或多个(例如，1、2、5、10、100、200、300、或400个)核苷酸缺失的PGK启动子)可能包含希望的。
以下提供了示例性PGK启动子的核苷酸序列。
WT PGK启动子：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT(SEQID NO:109)
示例性截短的PGK启动子：
PGK100：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG(SEQ ID NO:110)
PGK200：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG(SEQ ID NO:111)
PGK300：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG(SEQ ID NO:112)
PGK400：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG(SEQ ID NO:113)
载体还可以包括例如，促进分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如，来自牛生长激素(BGH)基因)、允许在原核生物中游离型复制和复制的元件(例如，SV40起源和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如，氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标记物)。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入到细胞中的表达载体还可含有选择性标记基因或报告基因或两者，以便于从旨在通过病毒载体经转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择性标记物可以在单独的DNA片段上携带并用于共转染程序。选择性标记物和报告基因二者都可以侧接适当的调控序列以实现在宿主细胞中的表达。有用的选择性标记物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因用于鉴定可能经转染的细胞和用于评价调控序列的功能。通常，报告基因是如下基因，该基因不存在于受体生物体或组织中或由其表达并且编码多肽，该多肽的表达通过一些可易于检测的特性(例如，酶活性)表现出来。在将DNA引入到受体细胞中后的适当时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS快报479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，并且可以使用已知技术制备或商业获得。通常，显示报告基因的最高表达水平的具有最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接，并用于评价药剂调制启动子驱动的转录的能力。
在实施例中，载体可包含两种或多种编码CAR的核酸序列，例如，本文所述的CAR，例如，CD19 CAR，和第二CAR，例如，抑制性CAR或特异性结合CD19以外的抗原的CAR。在此类实施例中，编码CAR的两种或更多种核酸序列由相同框中的单个核酸分子编码并且作为单个多肽链。在这方面，两种或更多种CAR可以例如，被一个或多个肽切割位点分开。(例如，细胞内蛋白酶的自动切割位点或底物)。肽切割位点的实例包括T2A、P2A、E2A或F2A位点。
将基因引入到细胞中并将其在细胞中表达的方法在本领域中是已知的。在表达载体的背景下，可以通过任何方法(例如，本领域已知的一种)将载体容易地引入到宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如，Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL[分子克隆：实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港实验出版社],纽约)。将多核苷酸引入到宿主细胞中的适合的方法是磷酸钙转染。
用于将感兴趣的多核苷酸引入到宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内的递送运载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人造膜囊泡)。可获得现有技术的靶向递送核酸(如用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸)的其他方法。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送运载体是脂质体。考虑使用脂质制剂以将核酸引入到宿主细胞(体外、离体或体内)中。在另一个方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质结合的核酸可以被包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸二者相关的连接分子附接至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，以悬浮液形式包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，这些脂肪物质可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的化合物类。
适用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从密苏里州圣路易斯的西格玛公司获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可从K&K实验室(纽约州普莱恩维尤)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring公司获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从阿万蒂极性脂质有限公司(亚拉巴马州伯明翰)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质运载体。脂质体可以表征为具有囊泡结构，这些囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。它们是在磷脂悬浮在过量的水性溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology[糖生物学]5:505-10)。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。
无论用于将外源性核酸引入对宿主细胞中的方法还是以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂，为了证实重组核酸序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定以鉴定落入本发明范围内的药剂。
自然杀伤细胞受体(NKR)CAR
在一个实施例中，本文所述的CAR分子包含天然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，从而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自任一以下自然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1、和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM)家族，例如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME、和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如CD16和CD64；和Ly49受体，例如LY49A、LY49C。本文所述的NKR-CAR分子可以与衔接分子或细胞内信号传导结构域(例如DAP12)相互作用。包含NKR组分的CAR分子的示例性构型和序列描述于国际公布号WO2014/145252中，该专利的内容特此通过引用并入。
分离的CAR
在一些实施例中，表达CAR的细胞使用分离的CAR。分离的CAR方法更详细地描述于公开WO2014/055442和WO2014/055657中。简言之，分离的CAR系统包含表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如，41BB)的第一CAR的细胞，并且所述细胞还表达具有第二抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)的第二CAR。当该细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被激活，并且细胞增殖。当该细胞遇到第二抗原时，细胞内信号传导结构域被激活并开始细胞杀伤活性。因此，该表达CAR的细胞仅在两种抗原都存在下完全激活。
调节嵌合抗原受体的策略
在一些实施例中，希望CAR活性可控制的可调节CAR(RCAR)以优化CAR疗法的安全性和功效。可以通过多种方式调节CAR活性。例如，使用例如，与二聚化结构域融合的半胱天冬酶的诱导型细胞凋亡(参见,例如，Di Stasa等人,N Egnl.J.Med.[新英格兰医学杂志]2011年11月3日；365(18):1673-1683)可用作本发明的CAR疗法中的安全开关。在一个实施例中，本发明的表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)进一步包含诱导型细胞凋亡开关，其中将人半胱天冬酶(例如，半胱天冬酶9)或修饰形式与允许条件二聚化的修饰的人FKB蛋白融合。在小分子，如雷帕霉素类似物(rapalog)(例如，AP 1903、AP20187))存在下，诱导型半胱天冬酶(例如，半胱天冬酶9)被激活并导致本披露的表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)的快速凋亡和死亡。基于半胱天冬酶的诱导型细胞凋亡开关(或这种开关的一个或多个方面)的实例已描述于，例如，US2004040047；US20110286980；US20140255360；WO1997031899；WO 2014151960；WO 2014164348；WO 2014197638；WO 2014197638；所有这些文献通过引用并入本文。
在另一个实例中，表达CAR的细胞还可以表达诱导型半胱天冬酶-9(iCaspase-9)分子，其在施用二聚物药物(例如利米度塞(rimiducid)(也称为AP1903(BellicumPharmaceuticals)或AP20187(Ariad))时导致激活细胞的半胱天冬酶-9和细胞凋亡。诱导型半胱天冬酶-9分子含有二聚化化学诱导物(CID)结合结构域，其在CID的存在下介导二聚化。这导致表达CAR的细胞的诱导性和选择性耗减。在一些情况下，诱导型半胱天冬酶-9分子由与一种或多种CAR编码载体分开的核酸分子编码。在一些情况下，诱导型半胱天冬酶-9分子由与CAR编码载体相同的核酸分子编码。诱导型半胱天冬酶-9可以提供安全性开关，以避免表达CAR的细胞的任何毒性。参见例如，Song等人Cancer Gene Ther.[癌症基因疗法]2008；15(10):667-75；临床试验标识号NCT02107963；和Di Stasi等人N.Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]2011；365:1673-83。
用于调节本发明的CAR疗法的可替代策略包括利用使CAR活性失活或关闭的小分子或抗体，例如，通过使表达CAR的细胞缺失，例如，通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达被能够诱导细胞死亡(例如ADCC或补体诱导的细胞死亡)的分子识别的抗原。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的受体。此类受体的实例包括EpCAM、VEGFR、整联蛋白(例如，整联蛋白αvβ3、α4、αΙ3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受体超家族成员(例如，TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD1 1、CD1 1a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7、和EGFR及其截短形式(例如，保留一个或多个细胞外表位但缺少在胞质结构域内的一个或多个区的形式)。
例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达截短的表皮生长因子受体(EGFR)，其缺乏信号传导能力但保留被能够诱导ADCC的分子识别的表位，例如，西妥昔单抗
Figure BDA0002462996200001871
使得施用西妥昔单抗诱导ADCC并随后耗减表达CAR的细胞(参见例如，WO 2011/056894，和Jonnalagadda等人,Gene Ther.[基因疗法]2013；20(8):853-860)。另一种策略包括表达高度紧密的标记/自杀基因，其将来自本文所述的表达CAR的细胞中的CD32和CD20抗原的靶表位组合，其结合利妥昔单抗(rituximab)，这导致表达CAR的细胞的选择性耗减，例如，通过ADCC(参见例如，Philip等人,Blood.[血液]2014；124(8):1277-1287)。用于耗减本文所述的表达CAR的细胞的其他方法包括施用CAMPATH，它包含一种单克隆抗CD52抗体，其选择性地结合并靶向成熟淋巴细胞，例如，表达CAR的细胞，以便例如，通过诱导ADCC进行破坏。在其他实施例中，可以使用CAR配体(例如抗独特型抗体)选择性地靶向表达CAR的细胞。在一些实施例中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如，ADCC或ADC活性，从而减少表达CAR的细胞的数量。在其他实施例中，CAR配体，例如，抗独特型抗体，可以与诱导细胞杀伤的药剂(例如，毒素)偶联，从而减少表达CAR的细胞的数量。替代性地，CAR分子本身可以被配置成使得活性可以被调节，例如打开和关闭，如下所述。
在其他实施例中，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达由T细胞耗减剂识别的靶蛋白。在一个实施例中，靶蛋白是CD20，并且T细胞耗减剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。在这种实施例中，一旦需要减少或消除表达CAR的细胞，就施用T细胞耗减剂，例如以减轻CAR诱导的毒性。在其他实施例中，T细胞耗减剂是抗CD52抗体，例如阿仑单抗，如本文实例中所述。
在其他实施例中，RCAR包含一组多肽，典型地在最简单的实施例中有两个，其中本文所述的标准CAR的组分(例如，抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域)在单独的多肽或成员上分配。在一些实施例中，组多肽包括二聚化开关，所述二聚化开关在存在二聚化分子时可以将多肽彼此偶联，例如，可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，本发明的CAR利用二聚化开关，如例如，WO 2014127261中所述的那些，所述文献通过引用并入本文。本文和例如，2015年3月13日提交的国际公开号WO 2015/090229的段落527-551中提供了此类可调节性CAR的另外的描述和示例性构型，将所述文献通过引用以其整体特此并入。在一些实施例中，RCAR涉及开关结构域，例如，FKBP开关结构域(如SEQID NO:114所示)，或包含具有与FRB结合的能力的FKBP片段(例如，如SEQ ID NO:115所示)。在一些实施例中，RCAR涉及包含FRB序列(例如，如SEQ ID NO:116所示)或突变型FRB序列(例如，如SEQ ID No.117-122中任一序列)的开关结构域。
DVPDYASLGGPSSPKKKRKVSRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETSY(SEQ ID NO:114)
VQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETS(SEQ ID NO:115)
ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISK(SEQ ID NO:116)
表13.示例性突变体FRB对二聚化分子具有增加的亲和力。
Figure BDA0002462996200001881
Figure BDA0002462996200001891
RNA转染
本文披露了用于产生体外转录的RNA CAR的方法。RNA CAR及其使用方法描述于例如，2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第553-570段中，所述文献通过引用以其全文并入本文。
免疫效应细胞可包括由信使RNA(mRNA)编码的CAR。在一个方面，将编码本文所述CAR的mRNA引入免疫效应细胞(例如，通过本文所述的方法制备的)中，以产生表达CAR的细胞。
在一个实施例中，体外转录的RNA CAR可以作为瞬时转染的形式引入细胞。使用聚合酶链反应(PCR)产生的模板通过体外转录产生RNA。可以将来自任何来源的感兴趣的DNA直接通过PCR转化为模板，以使用适当的引物和RNA聚合酶体外合成mRNA。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他合适的DNA来源。用于体外转录的所希望的模板是本文所述的CAR。例如，RNA CAR的模板可以包含含有对本文所述的肿瘤相关抗原的抗体的单链可变结构域的细胞外区；铰链区(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域，例如，CD8a的跨膜结构域)；以及细胞质区域，其包括细胞内信号传导结构域，例如，本文所述的细胞内信号传导结构域，例如，包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。
在一个实施例中，待用于PCR的DNA含有可读框。DNA可以来自生物体基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施例中，核酸可以包括5'和/或3'非翻译区(UTR)中的一些或全部。核酸可以包括外显子和内含子。在一个实施例中，用于PCR的DNA是人核酸序列。在另一个实施例中，用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人核酸序列。替代性地，DNA可以是通常不在天然存在的生物体中表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有基因部分的序列，这些基因部分连接在一起以形成编码融合蛋白的可读框。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或来自多于一个的生物体。
使用PCR以产生用于体外转录mRNA的模板，该mRNA用于转染。用于进行PCR的方法在本领域中是熟知的。用于PCR的引物被设计成具有与有待用作PCR模板的DNA区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”是指其中引物序列中的大多数或所有碱基是互补的，或者一个或多个碱基是非互补的或错配的核苷酸序列。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期的DNA靶标退火或杂交。可以将引物设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，可以将引物设计为扩增通常在细胞中转录的核酸的一部分(可读框)，包括5'和3’UTR。还可以设计引物以扩增编码特定感兴趣的结构域的核酸的一部分。在一个实施例中，设计引物以扩增人cDNA的编码区，包括5'和3'UTR的全部或部分。可用于PCR的引物可以通过本领域熟知的合成方法产生。“正向引物”是含有核苷酸区域的引物，这些核苷酸与DNA模板上的位于待扩增DNA序列上游的核苷酸基本上互补。“上游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的5'位置。“反向引物”是含有核苷酸区域的引物，该核苷酸区域与待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补。“下游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的3'位置。
可用于PCR的任何DNA聚合酶均可用于本文披露的方法中。试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。
也可以使用能够促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。实施例中的RNA具有5'和3’UTR。在一个实施例中，5'UTR的长度在1个与3000个核苷酸之间。待添加到编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同方法改变，这些方法包括但不限于设计与UTR的不同区退火的PCR引物。使用该途径，本领域普通技术人员可以改变所需的5'和3'UTR长度，以在经转录RNA的转染后实现最佳翻译效率。
5'和3'UTR可以是感兴趣的核酸的天然存在的内源性5'和3'UTR。替代性地，可以通过将对感兴趣的核酸不是内源的UTR序列并入到正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰来添加这些UTR序列。使用对感兴趣的核酸是内源的UTR序列可用于改良RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以选择或设计3'UTR，以基于本领域熟知的UTR的特性来增加经转录的RNA的稳定性。
在一个实施例中，5'UTR可以含有内源性核酸的科扎克(Kozak)序列。替代性地，当如上所述通过PCR添加对感兴趣的核酸不是内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有科扎克序列。科扎克序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎不是所有RNA实现高效翻译所需要的。对许多mRNA的科扎克序列的要求在本领域中是已知的。在其他实施例中，5'UTR可以是RNA病毒的5'UTR，该RNA病毒的RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施例中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物来阻止mRNA的外切核酸酶降解。
为了在无需基因克隆的情况下实现从DNA模板合成RNA，转录启动子应附接到待转录序列上游的DNA模板上。当将发挥RNA聚合酶启动子功能的序列添加至正向引物的5'端时，该RNA聚合酶启动子将并入到PCR产物中位于待转录的可读框上游。在一个实施例中，启动子包含T7聚合酶启动子，如本文其他地方所述。其他可用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一个实施例中，mRNA具有5'端帽和3'聚(A)尾，它们决定核糖体结合、翻译起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板例如质粒DNA上，RNA聚合酶产生长的多联产物，该多联产物不适于在真核细胞中表达。转录在3'UTR端线性化的质粒DNA产生正常大小的mRNA，该mRNA即使在转录后进行了多腺苷酸化，在真核转染中也是无效的。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以使转录物的3'端延伸超出模板的最后一个碱基(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.[核酸研究],13:6223-36(1985)；Nacheva和berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],270:1485-65(2003))。
将聚A/T伸展段整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的聚A/T序列可导致质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常被缺失和其他畸变高度污染的原因。这使得克隆程序不仅费力且耗时，而且通常是不可靠的。这就是为什么非常期望允许在不进行克隆的情况下构建具有聚A/T 3'伸展段的DNA模板的方法。
转录DNA模板的聚A/T区段可以在PCR期间通过使用含有聚胸腺嘧啶尾(例如100T尾)(SEQ ID NO:123)(大小可以是50-5000T(SEQ ID NO:32))的反向引物产生，或在PCR后通过任何其他方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)产生。聚(A)尾也为RNA提供稳定性并降低其降解。通常，聚(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性呈正相关。在一个实施例中，聚(A)尾在100和5000个腺苷之间(例如，SEQ ID NO:33)。
在使用聚(A)聚合酶(如大肠杆菌聚A聚合酶(E-PAP))进行体外转录后，可以进一步延伸RNA的聚(A)尾。在一个实施例中，将聚(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300到400个核苷酸(SEQ ID NO:34)，导致RNA的翻译效率增加约两倍。另外，不同化学基团与3'端的附接可以增加mRNA稳定性。这种附接可以含有经修饰的/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，可以使用聚(A)聚合酶将ATP类似物并入到聚(A)尾中。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。
5'帽也为RNA分子提供稳定性。在一个实施例中，通过本文披露的方法产生的RNA包括5'帽。5’帽可以使用本领域已知和本文所述的技术提供(Cougot等人,Trends inBiochem.Sci.[生化科学趋势],29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.[生物化学和生物物理研究通讯],330:958-966(2005))。
通过本文披露的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，该序列启动与帽无关的核糖体与mRNA的结合并促进翻译的起始。可以包括适用于细胞电穿孔的任何溶质，这些溶质可以含有促进细胞通透性和存活力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用许多不同方法中的任一种将RNA引入到靶细胞中，这些不同方法例如可商购的方法，包括但不限于：电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(德国科隆的艾玛科萨生物系统公司(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))，(ECM 830(BTX)(马萨诸塞州波士顿的哈佛仪器公司(Harvard Instruments,Boston,Mass.))或Gene Pulser II(科罗拉多州丹佛的伯乐公司(BioRad,Denver,Colo.))，Multiporator(德国汉堡的艾本德公司(Eppendort,Hamburg Germany))；阳离子脂质体介导的转染(使用脂质转染)；聚合物包封；肽介导的转染；或生物射弹颗粒递送系统如“基因枪”(参见，例如Nishikawa等人Hum Gene Ther.[人类基因疗法],12(8):861-70(2001))。
非病毒递送方法
在一些方面，可以使用非病毒方法将编码本文所述的CAR的核酸递送至细胞或组织或受试者中。
在一些实施例中，非病毒方法包括使用转座子(也称为转座元件)。在一些实施例中，转座子是可以将自身插入基因组中一位置的一条DNA，例如，能够自我复制并将其拷贝插入基因组的一条DNA，或者是可以从较长的核酸中剪接出并插入基因组中的另一个位置的一条DNA。例如，转座子包含由侧接基因的用于转座的反向重复序列构成的DNA序列。
使用转座子的核酸递送的示例性方法包括睡美人转座子系统(SBTS)和piggyBac(PB)转座子系统。参见例如，Aronovich等人Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]20.R1(2011):R14-20；Singh等人,Cancer Res.[癌症研究]15(2008):2961-2971；Huang等人,Mol.Ther.[分子治疗]16(2008):580-589；Grabundzija等人,Mol.Ther.[分子治疗]18(2010):1200-1209；Kebriaei等人,Blood.[血液]122.21(2013):166；Williams.MolecularTherapy[分子治疗]16.9(2008):1515-16；Bell等人,Nat.Protoc.[自然实验手册]2.12(2007):3153-65；以及Ding等人,Cell.[细胞]122.3(2005):473-83，所有这些文献均通过引用并入本文。
SBTS包括两个组分：1)含有转基因的转座子和2)转座酶的来源。转座酶可以将转座子从运载体质粒(或其他供体DNA)转移到靶DNA，如宿主细胞染色体/基因组。例如，转座酶与运载体质粒/供体DNA结合，从质粒中切出转座子(包括一个或多个转基因)，并将它插入到宿主细胞的基因组中。参见例如Aronovich等人，见上文。
示例性转座子包括基于pT2的转座子。参见，例如，Grabundzija等人,NucleicAcids Res.[核酸研究]41.3(2013):1829-47；和Singh等人,Cancer Res.[癌症研究]68.8(2008):2961-2971，所有文献均通过引用并入本文。示例性的转座酶包括Tc1/海员型转座酶(mariner-type transposase)，例如，SB10转座酶或SB11转座酶(可以例如，从巨细胞病毒启动子表达的过度活跃的转座酶)。参见例如，Aronovich等人；Kebriaei等人；和Grabundzija等人，所有这些文献均通过引用并入本文。
SBTS的使用允许转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的高效整合和表达。本文提供了产生细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法，所述细胞例如，使用转座子系统(如，SBTS)稳定地表达本文所述的CAR。
根据本文所述的方法，在一些实施例中，将含有SBTS组分的一种或多种核酸(例如，质粒)递送至细胞(例如，T或NK细胞)。例如，通过核酸(例如，质粒DNA)递送的标准方法递送一种或多种核酸，这些标准方法例如，本文所述的方法，例如，电穿孔、转染或脂质转染。在一些实施例中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的转座子。在一些实施例中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)以及编码转座酶的核酸序列的转座子。在其他实施例中，提供了具有两种核酸的系统，例如，双质粒系统，例如，其中第一质粒含有包含转基因的转座子，而第二质粒含有编码转座酶的核酸序列。例如，将第一核酸和第二核酸共同递送至宿主细胞中。
在一些实施例中，通过使用基因插入(使用SBTS)和基因编辑(使用核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、或工程化大范围核酸酶重新工程化的归巢内切核酸酶))的组合产生表达本文所述的CAR的细胞，例如，T细胞或NK细胞。
在一些实施例中，使用非病毒递送方法允许细胞例如T细胞或NK细胞的重编程，并且将这些细胞直接输注到受试者体内。非病毒载体的优点包括但不限于容易且相对低成本地产生满足患者群体所需的足够量、储存期间的稳定性和缺乏免疫原性。
制造/生产方法
在一些实施例中，本文披露的方法进一步包括在用细胞处理后施用T细胞耗减剂(例如，如本文所述的免疫效应细胞)，从而减少(例如，耗减)表达CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)。此类T细胞耗减剂可用于有效耗减表达CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)以减轻毒性。在一些实施例中，表达CAR的细胞根据本文的方法制造，例如，根据本文的方法测定(例如，在转染或转导之前或之后)。
在一些实施例中，在施用细胞后一周、两周、三周、四周或五周施用T细胞耗减剂，例如，本文所述的免疫效应细胞群体。
在一个实施例中，T细胞耗减剂包含耗减表达CAR的细胞的药剂，例如，通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体诱导的细胞死亡。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达被能够诱导细胞死亡(例如，ADCC或补体诱导的细胞死亡)的分子识别的抗原(例如，靶抗原)。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的靶蛋白(例如，受体)。此类靶蛋白的实例包括但不限于EpCAM、VEGFR、整联蛋白(例如，整联蛋白αvβ3、α4、αΙ3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受体超家族成员(例如，TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7、和EGFR及其截短形式(例如，保留一个或多个细胞外表位但缺少在胞质结构域内的一个或多个区的形式)。
在一些实施例中，表达CAR的细胞共表达CAR和靶蛋白，例如，天然表达靶蛋白或经工程化以表达靶蛋白。例如，所述细胞，例如，免疫效应细胞群体，可包括含有CAR核酸(例如，如本文所述的CAR核酸)的核酸(例如，载体)和编码靶蛋白的核酸。
在一个实施例中，T细胞耗减剂是CD52抑制剂，例如，抗CD52抗体分子，例如，阿仑妥珠单抗。
在其他实施例中，所述细胞，例如，免疫效应细胞群体，表达如本文所述的CAR分子(例如，CD19CAR)和由T细胞耗减剂识别的靶蛋白。在一个实施例中，所述靶蛋白是CD20。在靶蛋白是CD20的实施例中，所述T细胞耗减剂是抗CD20抗体，例如，利妥昔单抗。
在任何上述方法的进一步的实施例中，所述方法进一步包括将细胞，例如，造血干细胞或骨髓移植到哺乳动物中。
在另一个方面，本发明的特征在于一种在细胞移植前调节哺乳动物的方法。所述方法包括给哺乳动物施用有效量的包含CAR核酸或多肽的细胞，例如，CD19 CAR核酸或多肽。在一些实施例中，细胞移植包含干细胞移植，例如，造血干细胞移植，或骨髓移植。在其他实施例中，在细胞移植前调节受试者，包括减少受试者中表达靶细胞的数量，例如，表达CD19的正常细胞或表达CD19的癌细胞。
免疫效应细胞(例如，T细胞)的激活和扩增
通过本文所述的方法产生或富集的免疫效应细胞(例如T细胞)通常可以使用如例如在美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005中所述的方法来活化和扩增。
通常，免疫效应细胞(例如，调节性T细胞耗减的细胞)群体可以通过与已附着有药剂和配体的表面接触而扩增，所述药剂刺激CD3/TCR复合物相关信号并且所述配体刺激T细胞表面上的共刺激分子。具体地，可以如本文所描述刺激T细胞群体，如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗CD2抗体接触，或通过与结合有钙离子载体的蛋白激酶C激活因子(例如苔藓抑素)接触。对于T细胞表面上辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，
Figure BDA0002462996200001971
法国)，可以如本领域公知的其他方法来使用(Berg等人,Transplant Proc.[移植进展]30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.[免疫学方法杂志]227(1-2):53-63,1999)。
在某些方面，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，药剂可以偶联到同一表面(即，为“顺式”形成)或偶联到分离表面(即，为“反式”形成)。替代性地，可以将一种药剂偶联到表面并且使另一种药剂在溶液中。在一个方面，将提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，并且使提供初级激活信号的药剂在溶液中或偶联到表面。在某些方面，两种药剂都可以在溶液中。在一个方面，这些试剂可以为可溶形式，并且然后交联到表面，如表达Fc受体的细胞或将与这些药剂结合的抗体或其他结合剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其预期用于激活和扩增本发明中的T细胞。
在一个方面，将两种药剂固定在珠上，或者在同一珠上，即“顺式”，或者在分离的珠上，即“反式”。通过举例，提供初级激活信号的药剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且将两种药剂以等效分子量共固定到同一珠。在一个方面，使用与珠结合的每种抗体的1:1比率用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面，使用如下比率的与珠结合的抗CD3:CD28抗体，使得与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个特定方面，与使用1:1比率观察到的扩增相比，观察到从约1倍至约3倍的增加。在一个方面，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为从100:1至1:100以及其间的所有整数值。在一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比率小于1。在某些方面，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个特定方面，使用1:100CD3:CD28比率的与珠结合的抗体。在一个方面，使用1:75CD3:CD28比率的与珠结合的抗体。在另一个方面，使用1:50CD3:CD28比率的与珠结合的抗体。在一个方面，使用1:30CD3:CD28比率的与珠结合的抗体。在一个方面，使用1:10CD3:CD28比率的与珠结合的抗体。在一个方面，使用1:3CD3:CD28比率的与珠结合的抗体。在又一个方面，使用3:1CD3:CD28比率的与珠结合的抗体。
颗粒与细胞的比率为从1:500至500:1以及其间的任何整数值可以用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒度。例如，小尺寸的珠仅可以结合少量细胞，而较大的珠可以结合许多细胞。在某些方面范围从1:100至100:1以及其间的任何整数值的细胞与颗粒的比率和在另外的方面包括1:9至9:1的比率以及其间的任何整数值也可以用于刺激T细胞。如以上所指出，导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比率可以变化，然而某些适合的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、和15:1，其中一个适合的比率是每个T细胞至少1:1个颗粒。在一个方面，使用1:1或更小的颗粒与细胞比率。在一个特定方面，合适的颗粒:细胞的比率为1:5。在另外的方面，颗粒与细胞的比率可以根据刺激日而变化。例如，在一个方面，颗粒与细胞的比率在第一天为从1:1至10:1，并且将另外颗粒在之后每天或每隔一天添加到细胞中持续最长10天，最终比率为从1:1至1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一个特定方面，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为1:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:5。在一个方面，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:5，每天或每隔一天添加颗粒。在一个方面，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为2:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:10。在一个方面，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:10，每天或每隔一天添加颗粒。本领域技术人员将理解，各种其他比率可适用于本发明。具体地，比率将根据粒度和细胞大小和类型而变化。在一个方面，在第一天用于使用的最典型比率是1:1、2:1和3:1附近。
在另外的方面，将细胞(如T细胞)与药剂包被的珠组合，随后将这些珠和这些细胞分离，并且然后培养细胞。在可替代方面，在培养之前，不将药剂包被的珠和细胞分开而是一起培养。在另一个方面，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标记物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
通过举例，可以通过使抗CD3和抗CD28所附接的顺磁珠(3x28个珠)接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一个方面，将细胞(例如，104至109个T细胞)和珠(例如，比率为1:1的
Figure BDA0002462996200002001
M-450CD3/CD28 T顺磁珠)在缓冲液(例如PBS(不含二价阳离子(如钙和镁))中组合。同样，本领域的普通技术人员可易于理解可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可以非常稀少，仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可以包含感兴趣的靶标细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的上下文内。在某些方面，可能希望显著减小其中颗粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个方面，使用约100亿个细胞/ml、90亿个细胞/ml、80亿个细胞/ml、70亿个细胞/ml、60亿个细胞/ml、50亿个细胞/ml、或20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个方面，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个方面，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的方面，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞激活、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。此类细胞群体可能具有治疗价值，并且在某些方面是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个实施例中，对用编码CAR(例如，本文描述的CAR，例如，本文描述的CD19CAR)的核酸转导的细胞进行扩增，例如，通过本文描述的方法扩增。在一个实施例中，使细胞在培养物中扩增数小时(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)的一段时间。在一个实施例中，使细胞扩增4至9天的一段时间。在一个实施例中，使细胞扩增8天或更少(例如7、6或5天)的一段时间。在一个实施例中，使细胞在培养物中扩增5天，并且所得细胞比在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效。效力可以例如，通过各种T细胞功能来定义，例如，增殖、靶细胞杀伤、细胞因子产生、激活、迁移、或其组合。在一个实施例中，与在相同的培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如，本文所述的CD19 CAR细胞)显示抗原刺激后细胞倍增方面至少一倍、两倍、三倍或四倍的增加。在一个实施例中，使细胞(例如，本文所述的表达CD19 CAR的细胞)在培养物中扩增5天，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，所得的细胞表现出更高的促炎细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)。在一个实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如，本文所述的CD19CAR的细胞)示出促炎细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)以pg/ml计增加至少一倍、二倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多倍。
还可能希望进行几个刺激循环，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适合于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，Minimal Essential Media或RPMI Media 1640或X-vivo 15(龙沙公司))，所述培养基可以含有增殖和存活力所必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、和TNF-α或本领域技术人员已知用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白制品、和还原剂(如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15、和X-Vivo 20、优化剂，其中添加氨基酸、丙酮酸钠、和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素、和/或足以使T细胞生长和扩增的一定量细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包含在实验培养物中，而不包含在有待输注到受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加5％CO2)。
在一个实施例中，使细胞在包括一种或多种白介素的适当培养基(例如，本文描述的培养基)中扩增，所述白介素导致在14天的扩增期间细胞增加至少200倍(例如，200倍、250倍、300倍、350倍)，例如，如通过本文描述的方法(如流式细胞术)测量。在一个实施例中，将细胞在IL-15和/或IL-7(例如，IL-15和IL-7)存在下扩增。
在实施例中，本文描述的方法(例如，表达CAR的细胞制造方法)包括例如，使用抗CD25抗体或其片段，或CD25结合配体IL-2从细胞群体除去调节性T细胞(例如，CD25+T细胞)。本文描述了从细胞群体除去调节性T细胞(例如CD25+T细胞)的方法。在实施例中，这些方法(例如，制造方法)进一步包括使细胞群体(例如，其中调节性T细胞，如CD25+T细胞已经被耗减的细胞群体；或先前已接触抗CD25抗体其片段，或CD25-结合配体的细胞群体)与IL-15和/或IL-7接触。例如，使细胞群体(例如先前已接触抗CD25抗体、其片段，或CD25-结合配体)在IL-15和/或IL-7存在下扩增。
在一些实施例中，在例如，离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽，或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。
在一个实施例中，在离体扩增过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。在一个实施例中，在离体扩增过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在一个实施例中，在离体扩增过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合物接触。在一个实施例中，该接触导致淋巴细胞亚群(例如CD8+T细胞)的存活和增殖。
已暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或外周血单核细胞产物具有辅助T细胞群体(TH，CD4+)，其大于细胞毒性或抑制性T细胞群体(TC，CD8+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生T细胞群体，该T细胞群体在约8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约8-9天之后，该T细胞群体包含越来越多的TC细胞群体。因此，取决于治疗目的，向受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群体可能是有利的。类似地，如果已分离了TC细胞的抗原特异性亚群，则将该亚群扩增到更大程度可能是有益的。
此外，在细胞扩增过程中，除CD4和CD8标记之外，其他表型标记物显著地，但在很大程度上，可重复地变化。因此，这种可重复性使得能够针对特定目的定制激活的T细胞产物。
一旦构建本文描述的CAR，可以使用各种测定来评价分子的活性，如但不限于在抗原刺激后扩增T细胞、在不存在再刺激的情况下维持T细胞扩增的能力，以及在适当的体外和动物模型中的抗癌活性。用于评价本发明的CAR的作用的测定进一步详细描述于下文
可以将初始T细胞中CAR表达的蛋白质印迹分析用于检测单体和二聚体的存在，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第695段，所述申请通过引用以其全文并入本文。
可以通过流式细胞术测量抗原刺激后CAR+T细胞的体外扩增。例如将CD4+和CD8+T细胞的混合物用αCD3/αCD28 aAPC刺激，随后用在待分析的启动子的控制下表达GFP的慢病毒载体转导。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C、或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。通过流式细胞术，在培养的第6天在CD4+和/或CD8+T细胞亚群中评估GFP荧光。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。替代性地，在第0天将CD4+和CD8+T细胞的混合物用被αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，并在第1天使用表达CAR连同eGFP(使用2A核糖体跳跃序列)的双顺反子慢病毒载体转导。在洗涤后在抗CD3和抗CD28抗体(K562-BBL-3/28)存在下，将培养基用如本文描述的癌症相关抗原+K562细胞(表达如本文描述的癌症相关抗原的K562)、野生型K562细胞(K562野生型)或表达hCD32和4-1BBL的K562细胞再刺激。每隔一天以100IU/ml向培养基中添加外源IL-2。使用基于珠的计数通过流式细胞术计算GFP+T细胞。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。
还可以测量在没有再刺激的情况下持续的CAR+T细胞扩增。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，以及在第1天用指示的CAR转导后，使用Coulter Multisizer III粒子计数器、Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter在培养的第8天测量平均T细胞体积(fl)。
还可以将动物模型用于测量表达CAR的细胞活性，例如，如描述于2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第698段，所述申请通过引用以其全文并入本文。
例如，如在2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第699段所描述，可以评价剂量依赖性CAR治疗反应，所述文申请通过引用以其全文并入。
先前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，如描述于2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第700段中，该申请通过引用以其全文并入本文。
通过标准51Cr释放测定可以评价细胞毒性，例如，如在2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第701段所述，所述申请通过引用以其全文并入本文。
例如，使用xCELLigence实时细胞分析仪(RTCA)，还可以通过测量贴壁细胞的电阻抗中的变化来评价细胞毒性。在一些实施例中，在多个时间点处测量细胞毒性。
在携带肿瘤的动物模型中可以将成像技术用于评价CAR的特定运输和增殖，例如，如在2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第702段所述，所述申请通过引用以其全文并入本文。
其他测定，包括本文实例部分中描述的那些测定以及本领域中已知的那些测定也可以用于评价本文描述的CAR。
替代性地，或者与本文披露的方法组合的，披露了用于以下的一种或多种的方法和组合物：表达CAR的细胞的检测和/或定量(例如，体外或体内(例如，临床监测))；免疫细胞扩增和/或激活；和/或涉及使用CAR配体的CAR特异性选择。在一个示例性实施例中，CAR配体是结合CAR分子的抗体，例如结合CAR的细胞外抗原结合结构域(例如，结合抗原结合结构域的抗体，例如抗独特型抗体；或与细胞外结合结构域的恒定区结合的抗体)。在其他实施例中，CAR配体是CAR抗原分子(例如，如本文所述的CAR抗原分子)。
在一个方面，披露了用于检测和/或定量表达CAR的细胞的方法。例如，CAR配体可用于体外或体内检测和/或定量表达CAR的细胞(例如，临床监测患者中的表达CAR的细胞，或给患者给药)。该方法包括：
提供CAR配体(任选地，标记的CAR配体，例如包含标签、珠、放射性或荧光标记的CAR配体)；
采集表达CAR的细胞(例如，获得含有表达CAR的细胞的样品，如制造样品或临床样品)；
在发生结合的条件下使表达CAR的细胞与CAR配体接触，从而检测存在的表达CAR的细胞的水平(例如，量)。可以使用标准技术如FACS、ELISA等检测表达CAR的细胞与CAR配体的结合。
在另一个方面，披露了扩增和/或激活细胞(例如，免疫效应细胞)的方法。该方法包括：
提供表达CAR的细胞(例如，表达第一CAR的细胞或瞬时表达CAR的细胞)；
在发生免疫细胞扩增和/或增殖的条件下，使所述表达CAR的细胞与CAR配体(例如，如本文所述的CAR配体)接触，从而产生激活的和/或扩增的细胞群。
在某些实施例中，CAR配体存在于底物(例如，固定或附接至底物上，如非天然存在的底物)上。在一些实施例中，底物是非细胞底物。非细胞底物可以是选自例如，板(例如，微量滴定板)、膜(例如，硝酸纤维素膜)、基质、芯片或珠的固体支持物。在实施例中，CAR配体存在于底物中(例如，在底物表面上)。CAR配体可以与底物共价或非共价(例如，交联)固定、附接、或缔合。在一个实施例中，CAR配体与珠附接(例如，共价附接)。在前述实施例中，免疫细胞群体可以在体外或离体扩增。该方法可以进一步包括在CAR分子的配体存在下培养免疫细胞的群，例如，使用本文所述的任何方法。
在其他实施例中，扩增和/或激活细胞的方法进一步包括添加第二刺激分子，例如CD28。例如，CAR配体和第二刺激分子可以固定在底物(例如一个或多个珠)上，从而提供增加的细胞扩增和/或激活。
在另一个方面，提供了用于选择或富集表达CAR的细胞的方法。该方法包括使表达CAR的细胞与如本文所述的CAR配体接触；以及根据CAR配体的结合选择细胞。
在其他实施例中，提供了用于耗减、减少和/或杀伤表达CAR的细胞的方法。该方法包括使表达CAR的细胞与如本文所述的CAR配体接触；并且基于CAR配体的结合靶向细胞，从而减少表达CAR的细胞的数量和/或杀伤表达CAR的细胞。在一个实施例中，CAR配体与毒性剂(例如，毒素或细胞消融药物)偶联。在另一个实施例中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性。
可用于本文披露的方法的示例性抗CAR抗体描述于例如WO 2014/190273和Jena等人,“Chimeric Antigen Receptor(CAR)-Specific Monoclonal Antibody to DetectCD19-Specific T cells in Clinical Trials[嵌合抗原受体(CAR)特异性单克隆抗体检测临床试验中CD19特异性T细胞]”,PLOS[公共科学图书馆综合]2013年3月8:3e57838中，该文献的内容通过引用并入。
在一些方面和实施例中，本文的组合物和方法针对特定T细胞亚群体进行了优化，例如，如2015年7月31日提交的美国序列号PCT/US2015/043219中所述，所述专利的内容通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，与对照T细胞(例如，表达相同构建体的不同类型的T细胞(例如，CD8+或CD4+))相比，优化的T细胞亚群体示出了增强的持久性。
在一些实施例中，CD4+T细胞包含本文所述的CAR，所述CAR包含适合于(例如，优化，例如，导致增强的持久性)CD4+T细胞(例如，ICOS域)的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CD8+T细胞包含本文所述的CAR，所述CAR包含适合于(例如，优化，例如，导致增强的持久性)CD8+T细胞(例如，4-1BB域、CD28域，或ICOS域以外的其他共刺激结构域)的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，本文所述的CAR包含本文所述的抗原结合结构域，例如，包含抗原结合结构域的CAR。
在一个方面，本文描述了治疗受试者(例如患有癌症的受试者)的方法。该方法包括向所述受试者施用有效量的：
1)包含CAR(CARCD4+)的CD4+T细胞，该CAR包含：
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
细胞内信号传导结构域，例如，第一共刺激结构域，例如，ICOS域；以及
2)包含CAR(CARCD8+)的CD8+T细胞，该CAR包含：
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
细胞内信号传导结构域，例如，第二共刺激结构域，例如，4-1BB域、CD28域、或除ICOS域以外的另一种共刺激结构域；
其中CARCD4+和CARCD8+彼此不同。
任选地，该方法进一步包括施用：
3)包含CAR(第二CARCD8+)的第二CD8+T细胞，该CAR包含：
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
细胞内信号传导结构域，其中第二CARCD8+包含细胞内信号传导结构域，例如，共刺激信号传导结构域，不存在于CARCD8+上，并且任选地不包含ICOS信号传导结构域。
生物聚合物递送方法
在一些实施例中，如本文所公开的一种或多种表达CAR的细胞可以经由生物聚合物支架(例如，生物聚合物植入物)施用或递送至受试者。生物聚合物支架可以支持或增强本文所述的表达CAR的细胞的递送、扩增和/或分散。生物聚合物支架包含可以是天然存在的或合成的生物相容的(例如，基本上不诱导炎性或免疫反应)和/或可生物降解的聚合物。示例性生物聚合物描述于例如，2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第1004-1006段中，所述申请通过引用以其全文并入本文。
药物组合物和治疗
在一些方面，本披露提供了治疗患者的方法，所述方法包括施用如本文所述产生的表达CAR的细胞，任选地与一种或多种其他的疗法组合。在一些方面，本披露提供了治疗患者的方法，所述方法包括施用包含如本文所述的表达CAR的细胞的反应混合物，任选地与一种或多种其他的疗法组合。在一些方面，本披露提供了运送或接收反应混合物的方法，所述反应混合物包含如本文所述的表达CAR的细胞。在一些方面，本披露提供了治疗患者的方法，该方法包括接收如本文所述产生的表达CAR的细胞，并且进一步包括向患者施用表达CAR的细胞，任选地与一种或多种其他的疗法组合。在一些方面，本披露提供了治疗患者的方法，该方法包括产生如本文所述的表达CAR的细胞，并且进一步包括向患者施用表达CAR的细胞，任选地与一种或多种其他的疗法组合。其他的疗法可以是，例如，癌症疗法(例如，化疗)。
在一个实施例中，与降低Treg细胞群体的分子组合向受试者施用表达本文所述CAR的细胞。减少(例如，耗减)Treg细胞数量的方法是本领域已知的，并且包括例如，CD25耗减、环磷酰胺施用、调制GITR功能。不希望受理论的束缚，据信在单采术之前或施用本文所述的表达CAR的细胞之前减少受试者中的Treg细胞数量减少了肿瘤微环境中不需要的免疫细胞(例如，Treg)的数量，并降低受试者的复发风险。
在一个实施例中，将本文所述的疗法(例如，表达CAR的细胞)与靶向GITR和/或调整GITR功能的分子组合施用受试者，如耗减调节性T细胞(Treg)的GITR激动剂和/或GITR抗体。在实施例中，将表达本文所述CAR的细胞与环磷酰胺组合施用于受试者。在一个实施例中，GITR结合分子和/或调制GITR功能的分子(例如，GITR激动剂和/或耗减Treg的GITR抗体)在表达CAR的细胞之前施用。例如，在一个实施例中，GITR激动剂可以在细胞的单采术之前施用。在实施例中，在施用(例如，输注或再输注)表达CAR的细胞之前或在细胞的采集之前，将环磷酰胺施用于受试者。在实施例中，在施用(例如，输注或再输注)表达CAR的细胞之前或在细胞的采集之前，将环磷酰胺和抗GITR抗体施用于受试者。在一个实施例中，受试者患有癌症(例如，实体癌或血液学癌症，如ALL或CLL)。在一个实施例中，受试者患有CLL。在实施例中，受试者患有ALL。在实施例中，受试者患有实体癌，例如本文所述的实体癌。示例性GITR激动剂包括例如，GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如，二价抗GITR抗体)，例如，像描述于以下中的GITR融合蛋白，美国专利号：6,111,090、欧洲专利号：090505B1、欧洲专利号：8,586,023、PCT公开号：WO 2010/003118和2011/090754，或描述于例如以下的抗GITR抗体：美国专利号：7,025,962、欧洲专利号：1947183B1、美国专利号：7,812,135、美国专利号：8,388,967、美国专利号：8,591,886、欧洲专利号：EP 1866339、PCT公开号：WO 2011/028683、PCT公开号：WO 2013/039954、PCT公开号：WO 2005/007190、PCT公开号：WO 2007/133822、PCT公开号：WO 2005/055808、PCT公开号：WO 99/40196、PCT公开号：WO 2001/03720、PCT公开号：WO 99/20758、PCT公开号：WO 2006/083289、PCT公开号：WO 2005/115451、美国专利号：7,618,632、和PCT公开号：WO 2011/051726中。
在一个实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与GITR激动剂(例如，本文所述的GITR激动剂)组合施用于受试者。在一个实施例中，在表达CAR的细胞之前施用GITR激动剂。例如，在一个实施例中，GITR激动剂可以在细胞的单采术之前施用。在一个实施例中，受试者患有CLL。
本文所述的方法可以进一步包括在药物组合物中配制表达CAR的细胞。药物组合物可以包含表达CAR的细胞(例如，如本文所述的多个表达CAR的细胞)，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。可以配制组合物，例如，用于静脉内施用。
在一个实施例中，药物组合物基本上不含，例如不存在可检测水平的例如选自下组的污染物，该组由以下组成：内毒素、支原体、复制型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体封装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施例中，细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、以及酿脓链球菌A组。
当指示“免疫有效量”、“抗癌症有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医生可以考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定待施用的本发明组合物的精确量。通常可以说，可以将包含本文描述的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的药物组合物以104至109个细胞/kg体重、在一些情况下105至106个细胞/kg体重(包括那些范围内的所有整数值)的剂量施用。还可以将T细胞组合物以这些剂量多次施用。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.[新英格兰医学杂志]319:1676,1988)。
在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包括约1x 106、1.1x 106、2x 106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、或5x 108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包括至少约1x 106、1.1x106、2x 106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、或5x 108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19CAR细胞)的剂量包括多达约1x 106、1.1x106、2x 106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、或5x 108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)的剂量包含约1.1x 106-1.8x 107个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包括高达约1x107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、5x 108、1x 109、2x 109、或5x 109个细胞。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包括至少约1x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x108、5x 108、1x 109、2x 109、或5x 109个细胞。在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)的剂量包括多达约1x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、5x 108、1x 109、2x 109、或5x109个细胞。
在某些方面，可能希望向受试者施用激活的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并且然后随后重抽血液(或进行单采术)，从其激活免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并用这些激活和扩增的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)回输患者。该过程可以每隔几周进行多次。在某些方面，可以将来自从10cc至400cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)激活。在某些方面，将来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)激活。
可以按任何方便的方式进行受试者组合物的施用。可以向患者经动脉、皮下、真皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或者腹膜内(例如，通过皮内或皮下注射)施用本文描述的组合物。可以将免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。
例如，在2016年12月27日提交的国际申请WO 2007/117112(通过引用明确地并入本文)的第204-219页的实施例1-10中描述了本文披露的实施例的示例，包括与所述实例相关联的图和图例。
示例性糖酵解抑制剂
在一些实施例中，可用糖酵解抑制剂(例如，本文所述的糖酵解小分子抑制剂)抑制(例如，遏抑)糖酵解。在一些实施例中，糖酵解抑制剂选自：己糖激酶(HK)抑制剂、线粒体己糖激酶2(HK2)抑制剂、磷酸果糖激酶2(PFK2)抑制剂、磷酸甘油酸突变酶(PGAM1)抑制剂和丙酮酸激酶2(PKM2)抑制剂、丙酮酸抑制剂脱氢酶激酶(PDK)、乳酸脱氢酶A(LDHA)的抑制剂、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)抑制剂、转酮醇酶样蛋白1(TKTL1)抑制剂或表5中披露的抑制剂。
在一些实施例中，糖酵解抑制剂(例如，糖酵解小分子抑制剂)选自：2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)、3-溴丙酮酸(3-BP)、氯尼达明、(2E)-3-(3-吡啶基)-1-(4-吡啶基)-2-丙烯-1-酮(3PO)、N4A、YZ9、PGMI-004A、MJE3、TT-23、紫草素/紫草红、FX11、喹啉3-磺酰胺、二氯乙酸酯(DCA)、6-氨基烟酰胺(6-AN)或氧代乙胺
在一些实施例中，所述糖酵解抑制剂是2-DG。2-DG，也称为2-脱氧-D-甘露糖，或2-脱氧-D-阿拉伯糖-己糖，是一种葡萄糖类似物，并且例如，作为葡萄糖代谢的竞争性抑制剂起作用。2-DG具有化学名称：(4R,5S,6R)-6-(羟甲基)噁烷-2,4,5-三醇，以及以下化学结构：
Figure BDA0002462996200002131
表5：糖酵解抑制剂
Figure BDA0002462996200002132
示例性的糖酵解抑制剂披露于Qian Y等人，(2014)World J Transl Med[世界转化医学杂志]；3(2)：37-57，其全部内容通过引用并入本文。
在实施例中，本文披露的方法、反应混合物或组合物包含浓度范围为0.5-20mM、1-10mM或1.5-2.5mM的2-DG。在一些实施例中，2-DG的浓度为至少0.5、1.0、1.5、2.0或2.5mM。在其他实施例中，2-DG的浓度为2mM。
在本文披露的任何方法、反应混合物或组合物的实施例中，使表达CAR的免疫效应细胞群体与2-DG(例如，1mM的2-DG)接触至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、44、48、52、60、70、80、90、100小时或更长时间(例如，长达约2或3周)。在一些实施例中，使表达CAR的免疫效应细胞群体与2-DG(例如，2mM的2-DG)接触至少48小时。
例如，Huang CC等人,(2015)Disease Models&Mechanisms[疾病模型与机制]8:1247-1254中披露了2-DG对糖酵解的抑制作用，其全部内容通过引用并入本文。
Stat3激活剂和Stat3分子
在本文披露的任何方法、用途或反应混合物的实施例中，Stat3激活剂包括：
i)gp130激活剂，例如，与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体，或IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子、OSM分子；
ii)可溶性IL-6受体(sIL-6R)，例如，如本文所述；
iii)IL-6/IL-6R复合物，例如二聚体，例如，如本文所述；
iv)IL-6家族细胞因子(例如，IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、IL-31分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子或OSM分子)；
v)CCL20分子；
vi)IL-10R2受体(IL-10R2)激活剂，例如，IL-10分子、IL-22分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子、IL-29分子，或与IL-10R2结合的抗体分子，例如，如本文所述；
vii)IL-10家族细胞因子(例如，IL-10分子、IL-19分子、IL-20分子、IL-22分子、IL-24分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子或IL-29分子)；
viii)IL-17家族细胞因子(例如，IL17A分子、IL17B分子、IL17C分子、IL17D分子、IL17E分子或IL17F分子)；或者
ix)IL-23分子。
在一些实施例中，所述Stat3激活剂是gp130激活剂，例如，与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体。
在一些实施例中，所述Stat3激活剂是可溶性IL-6受体(sIL-6R)，例如，如本文所述。
在一些实施例中，所述Stat3激活剂是IL-6/IL-6R复合物，例如，二聚体，例如，如本文所述。
在一些实施例中，所述Stat3激活剂是IL-6家族细胞因子(例如，IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、IL-31分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子或OSM分子)。
在一些实施例中，所述Stat3激活剂是CCL20分子。
在一些实施例中，所述Stat3激活剂是IL-10R2受体(IL-10R2)激活剂，例如，IL-10分子、IL-22分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子、IL-29分子或与IL-10R2结合的抗体分子，例如，如本文所述。
在一些实施例中，所述Stat3激活剂是IL-17家族细胞因子(例如，IL17A分子、IL17B分子、IL17C分子、IL17D分子、IL17E分子或IL17F分子)。
在一些实施例中，所述Stat3激活剂是IL-23分子。
在本文披露的任何方法、用途或反应混合物的实施例中，Stat3分子包含与SEQ IDNO:1000的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性氨基酸序列。在一些实施例中，所述Stat3分子包含SEQ ID NO:1000的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文披露的Stat3分子由与SEQ ID NO:1001的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述Stat3分子由SEQ ID NO:1001的核苷酸序列或SEQ ID NO:1001的核苷酸241至2553编码。
在一些实施例中，本文所述的细胞(例如，表达CAR的细胞)包含核酸序列，例如转基因，其包含SEQ ID NO:1001的序列，或SEQ ID NO:1001的核苷酸241至2553。
Stat3氨基酸序列：NCBI参考序列NP_644805.1(SEQ ID NO:1000)
Figure BDA0002462996200002161
Stat3核苷酸序列；NCBI参考序列：NM_139276.2(SEQ ID NO:1001)
Figure BDA0002462996200002162
Figure BDA0002462996200002171
Figure BDA0002462996200002181
Figure BDA0002462996200002191
在一些实施例中，本文披露的Stat3分子是Stat3多肽，例如，野生型Stat3或组成型活性Stat3多肽，例如，STAT3C。Stat3的组成型形式由Stat3基因的Stat3-C突变形式编码。在Stat3-C中，Stat3的SH2结构域的C末端环内两个半胱氨酸残基的取代产生了一个分子，所述分子自发二聚化，结合DNA并激活转录，从而产生了组成型活性分子(Bromberg等人,(1999)Cell[细胞]98:295-303)。
在本文披露的任何方法、用途或反应混合物的实施例中，IL-6分子包含与SEQ IDNO:1002的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性氨基酸序列。在一些实施例中，所述IL-6分子包含SEQ ID NO:1002的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文披露的IL-6分子由与SEQ ID NO:1003的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述IL-6分子由SEQ IDNO:1003的核苷酸序列或SEQ ID NO:1003的核苷酸122至760编码。
在一些实施例中，本文所述的细胞(例如，表达CAR的细胞)包含核酸序列，例如转基因，其包含SEQ ID NO:1003的序列，或SEQ ID NO:1003的核苷酸122至760。
IL-6氨基酸序列；GenBank登录号CAA68278.1(SEQ ID NO:1002)
Figure BDA0002462996200002201
IL-6核苷酸序列；NCBI参考序列NM_000600.4(SEQ ID NO:1003)
Figure BDA0002462996200002202
Figure BDA0002462996200002211
在本文披露的任何方法、用途或反应混合物的实施例中，gp130分子包含与SEQ IDNO:1004的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性氨基酸序列。在一些实施例中，所述gp130分子包含SEQ ID NO:1004的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文披露的gp130分子由与SEQ ID NO:1005的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述gp130分子由SEQ ID NO:1005的核苷酸序列或SEQ ID NO:1005的核苷酸113至2869编码。
在一些实施例中，本文所述的细胞(例如，表达CAR的细胞)包含核酸序列，例如转基因，其包含SEQ ID NO:1005的序列，或SEQ ID NO:1005的核苷酸113-2869。
gp130氨基酸序列；GenBank登录号AAI17403.1(SEQ ID NO:1004)
Figure BDA0002462996200002212
Figure BDA0002462996200002221
gp130核苷酸序列；GenBank登录号BC117402.1(SEQ ID NO:1005)
Figure BDA0002462996200002222
Figure BDA0002462996200002231
Figure BDA0002462996200002241
抗gp130抗体
在一些实施例中，所述Stat3激活剂是gp130激活剂，例如，与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体。
本文还披露了抗gp130抗体分子。例如，Gu Z.J.等人,Leukemia[白血病](2000)14:188-197中披露了抗gp130抗体分子，其全部内容通过引用并入本文。
在本文描述的任何方法、用途或反应混合物的实施例中，抗gp130抗体分子包含B-S12抗gp130抗体或B-P8抗gp130抗体，或B-S12和B-P8抗体。不希望被理论束缚，据信在一些实施例中，B-S12和/或B-P8抗体分子导致gp130的二聚化。
在一些实施例中，所述抗gp130抗体具有以下特征中的一个、两个、三个、四个或更多个(例如，全部)：
i)诱导gp130介导的信号传导，如通过STAT1、STAT3、ERK1或ERK2的磷酸化所测量的；
ii)不受IL-6抑制剂(例如，Sttatic)或本文所述的抑制剂的抑制；
iii)促进骨髓瘤细胞系的生长；
iv)支持原发性骨髓瘤细胞的存活；或者
v)诱导二聚化，例如，gp130的同源二聚化，或gp130的异源二聚化，例如与LIF、OSM或CNTF。
在一些实施例中，本文披露的gp130抗体分子包含具有来自B-S12或B-P8的至少1、2、3、4、5或6个CDR的抗体分子。在一些实施例中，根据Chothia、Kabat或其组合定义这些CDR。
在一些实施例中，gp130抗体分子包含来自B-S12的1、2、3、4、5或6个CDR。在一些实施例中，所述gp130抗体分子包含B-S12的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个。在一些实施例中，所述gp130抗体分子包含B-S12的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个。在一些实施例中，所述gp130抗体分子包含B-S12的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个以及B-S12的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个。
在一些实施例中，gp130抗体分子包含来自B-P8的1、2、3、4、5或6个CDR。在一些实施例中，所述gp130抗体分子包含B-P8的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个。在一些实施例中，所述gp130抗体分子包含B-P8的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个。在一些实施例中，所述gp130抗体分子包含B-P8的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个以及B-P8的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个。
在一些实施例中，所述抗gp130抗体分子，例如B-S12或B-P8抗体分子，以至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2ug/ml的量，任选地最多约2ug/ml(例如，约1ug/ml)的量提供。在一些实施例中，所述gp130抗体(例如，B-S12或B-P8抗体分子)以1ug/ml的量提供。
在一些实施例中，所述抗gp130抗体分子包含第一和第二抗gp130抗体分子，例如，B-S12和B-P8抗体分子。在一些实施例中，B-S12和B-P8抗体分子以约1:1的比率提供。在一些实施例中，B-S12和B-P8抗体以0.1-1000、0.5-500或1-100ug/ml的组合量提供。在一些实施例中，B-S12和B-P8抗体分子各以至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2ug/ml的量，任选地最多约2ug/ml(例如，约0.5ug/ml)的量提供。在一些实施例中，B-S12和B-P8抗体分子各以0.5ug/ml的量提供。
在一些实施例中，所述Stat3激活剂是与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体。
在一些实施例中，制备方法(例如，制造方法，例如，如本文所述的方法)产生T细胞(例如，CD4+或CD8+T细胞)群体，所述T细胞群体富集(例如，具有升高的水平)例如早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞。
在一些实施例中，所述方法导致CD4+或CD8+早期记忆T细胞(例如，如本文所述)的富集。在一些实施例中，早期记忆T细胞具有以下特征之一或全部：CD27+和/或CD45RO dim /neg，例如，CD27+CD45RO dim/neg。在一些实施例中，所述方法导致CD4+或CD8+未耗尽的早期记忆T细胞(例如，如本文所述)的富集。
在一些实施例中，所述方法导致CD4+或CD8+未耗尽的早期记忆T细胞(例如，如本文所述)的富集。在一些实施例中，未耗尽的早期记忆T细胞具有以下特征中的一个或多个(例如，全部)：(i)PD-1阴性；(ii)CD27hi；(iii)CCR7hi；或(iv)CD45ROdim/neg。在一些实施例中，未耗尽的早期记忆T细胞是PD-1阴性CD27hi CCR7hi CD45ROdim/neg。
在一些实施例中，富集的T细胞(例如，早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞)群体具有增加水平的早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞，例如，多至少5％-90％(例如，多至少5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-50％、50％-70％或70％-90％，或多至少5％-90％、10％-85％、15％-80％、20％-75％、25％-70％、30％-70％、35％-65％、40％-60％或45％-55％)。在一些实施例中，富集的T细胞(例如，早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞)群体具有增加水平的早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞(例如，多至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％)。
在一些实施例中，增加水平的早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞是与未与Stat3激活剂接触的T细胞的在其他方面类似的群体进行比较，例如，如实例2中所述。在一些实施例中，未与Stat3激活剂接触的T细胞的在其他方面相似的群体是例如，上面进行富集的T细胞的相同群体，例如，预富集群体，例如，起始群体，例如，如实例2中所述。在一些实施例中，未与Stat3激活剂接触的T细胞的在其他方面类似的群体是T细胞的不同群体，例如，上面未进行富集的群体。
在一些实施例中，CD4+T细胞(例如，早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞)的富集群体与未与Stat3激活剂接触的T细胞的在其他方面类似的群体相比，具有增加水平的早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞，例如，多至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％(例如，多至少8％)。
在一些实施例中，CD8+T细胞(例如，早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞)的富集群体与未与Stat3激活剂接触的T细胞的在其他方面类似的群体相比，具有增加水平的早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞，例如，多至少15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％(例如，多至少20％)。
实例
通过参考以下实验实例进一步详细描述本发明。提供这些实例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不应旨在是限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实例，而是应该被解释为涵盖由于本文提供的传授内容而变得明显的任何和所有变化。
实例1：CTL019细胞的糖酵解代谢
对来自接受至少一个剂量的CD19导向的CAR T细胞的41个患有晚期、预先经过大量治疗且高风险的CLL的患者的CAR T细胞样品进行了代谢变化评价。
结果
具有部分反应(PR)或无反应(NR)的患者的CAR T细胞证明糖酵解基因签名。回溯细胞输注产物样品的CAR特异性刺激增加了糖酵解和葡萄糖类似物的摄取(图2)，这提供了CLL患者T细胞可以通过合成CAR的连接进行代谢调制的证据。相对于CR/PRTD(部分反应，输血依赖)患者，来自PR/NR患者的CAR刺激T细胞表现出较高的葡萄糖类似物摄取(图3)，这与这些细胞的转录谱一致(图1A至1D)。此外，使用2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)阻断糖酵解降低了效应子分化，并导致具有中枢记忆表型的CAR T细胞的频率增加(图4和图5)。
在用表达CD19的肿瘤细胞再次刺激后，糖酵解的药理学抑制作用同时促进了具有增强的增殖能力的记忆CTL019淋巴细胞的形成(图6)。这些结果表明，CR和PRTD患者产生的T细胞显示出一种基因表达谱，所述基因表达谱可赋予持久性以及强大的抗肿瘤潜能，并且糖酵解代谢的下降可能代表可行的细胞制造改进以增强CAR T细胞能力。
本实例中描述的发现强调了通过选择具有高绝对数或高相对丰度的机械相关亚群负责介导肿瘤控制的培养物，和/或提供制造条件，使淋巴细胞群(包括CAR+T淋巴细胞群)偏向于这些亚群的更高绝对数或相对丰度，来增加过继转移T淋巴细胞治疗效果的潜在效用。通过尽可能缩短培养时间、使用替代性细胞因子和代谢工程，也可以获得具有最佳分化潜能以及效应活性的CAR-T细胞输注产物。
材料和方法
载体生产、T细胞分离和CTL019细胞生成
构建并生产了含有编码带有4-1BB/CD3ζ结构域的CD19特异性CAR的转基因的慢病毒载体(GeMCRIS0607-793)。通过白细胞单采术收集自体T细胞，并用包被有抗CD3和抗CD28单克隆抗体的临床级顺磁性聚苯乙烯珠激活，随后用上述慢病毒载体转导。对CAR转导的T细胞离体扩增9-11天。使用库尔特计数器(贝克曼库尔特公司)获得大规模CTL019细胞培养期间的绝对细胞计数。使用公式At＝A02n计算群体倍增，其中n是群体倍增数，A0是细胞的输入数量，而At是细胞总数量。
流式细胞术
如先前所述，用六参数Accuri C6流式细胞仪(BD生物科学公司)对CTL019细胞的扩增和持久性以及外周B-CLL负担进行常规的纵向测量。对于T细胞深层免疫表型分析，将PBMC或CTL019输注产物(大量T细胞或通过荧光激活细胞分选纯化的特定亚群)与水蓝死细胞排除染料(英杰公司(Invitrogen))一起预孵育，随后用市售的流式细胞术抗体进行表面染色。使用Alexa Fluor 647缀合的抗独特型单克隆抗体检测CAR19蛋白表达。本研究中使用的所有抗体均在使用前进行滴定，并为每个抗体组创建荧光减一(FMO)对照，以设置阳性事件门控。在定制的17色、19参数特殊顺序LSRFortessa(BD生物科学公司)上采集细胞。使用FlowJo软件(TreeStar)分析数据。
CLL患者CAR T细胞的葡萄糖摄取的测量
将回溯CLL患者CTL019细胞解冻，并以1×106细胞/ml的浓度置于24孔组织培养板(BD生物科学公司)中，随后用抗独特型抗体包被的珠进行过夜刺激，以概括通过同组CD19抗原触发抗CD19BBζCAR。相似缀合的同种型抗体包被的珠用作模拟物对照。根据每个患者输注产物的转导效率，以3个珠:1个细胞的比率添加珠。根据制造商(西格玛公司)的说明使用酶诊断试剂盒。使用由一定浓度范围的这种代谢产物产生的信号来构建标准曲线。收集来自模拟物和CAR刺激的T细胞的细胞上清液，并将其施用到仪器上。过夜刺激后，洗涤细胞，并用新鲜的RPMI重新补给458，并添加2-[N-(7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-D-葡萄糖(2-NBDG；西格玛奥德里奇公司)，终浓度为500μM。与2-NBDG一起孵育30分钟后，将细胞置于冰上并进行流式细胞术染色，以检测已摄取荧光标记葡萄糖类似物的CAR+T细胞。
CAR T细胞的代谢调制
在存在或不存在糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-DG；西格玛奥德里奇公司)的情况下产生抗CD19BBζCAR T细胞。培养9天后，通过流式细胞术确定这些细胞的分化表型。在FACSAria II细胞分选仪(BD生物科学公司)上对CAR+T细胞进行分选，并将其与经过工程化以表达CD19(K562-CD19)的辐照K562细胞进行1:1组合。用K562-CD19靶标将CTL019细胞重新刺激3次。在增殖测定过程中，使用Luna自动细胞计数器(Logos生物系统公司)获得绝对细胞计数。
实例2：表达CD19的嵌合抗原受体(CAR)T细胞中的STAT3途径激活
对来自接受至少一个剂量的CD19导向的CAR T细胞的患有晚期、预先经过大量治疗且高风险的CLL的患者的CAR T细胞样品进行STAT3途径激活评价。
材料和方法
患者样品
样品是从宾夕法尼亚大学机构审查委员会(IRB)批准的单药CTL019疗法临床试验招募的CLL患者中获得的。所有参与者都根据Declaration of Helsinki[赫尔辛基宣言]和International Conference on Harmonization Guidelines for Good ClinicalPractice[国际协调会议良好临床实践指南]提供了书面知情同意书。
这些研究已在ClinicalTrials.gov上注册(标识号：NCT01029366，NCT01747486和NCT02640209)。
载体生产、T细胞分离和CTL019细胞生成
构建并生产了含有编码带有4-1BB/CD3ζ结构域的CD19特异性CAR的转基因的慢病毒载体(GeMCRIS 377 0607-793)。通过白细胞单采术收集自体T细胞，并用包被有抗CD3和抗CD28单克隆抗体的临床级顺磁性聚苯乙烯珠激活，随后用上述慢病毒载体转导。对CAR转导的T细胞离体扩增9-11天。使用库尔特计数器(贝克曼库尔特公司)获得大规模CTL019细胞培养期间的绝对细胞计数。使用公式At＝A02n计算群体倍增，其中n是群体倍增数，A0是细胞的输入数量，而At是细胞总数量。
CAR T细胞中pSTAT3和STAT3阻断的测量。
将来自CLL患者输注产物的CTL019细胞解冻，并用抗独特型抗体包被的珠或模拟珠刺激。对于某些实验，用重组人IL-6(美天旎生物技术公司)以10ng/mL的终浓度刺激细胞10分钟。在细胞亚群评价实验中，在用IL-6进行急性刺激之前，对感兴趣的群体进行表面标记物染色并在FACSAria II细胞分选仪(BD生物科学公司)上进行分选。刺激后，将细胞用Phosflow Lyse/Fix Buffer(BD生物科学公司)在37℃下固定12分钟，并使用PhosflowPerm Buffer III(BD生物科学公司)在冰上透化30分钟。使用制造商建议浓度的抗STAT3(pY705)抗体(BD生物科学公司)在室温下进行细胞内染色60分钟。立即在LSRFortessa(BD生物科学公司)上采集样品。通过在存在或不存在终浓度为5μM的STAT3特异性抑制剂Stattic(Selleckchem)的情况下生成抗CD19BBζCAR T细胞来进行STAT3途径的阻断。等效量的二甲基亚砜(DMSO)用作单独阴性运载体对照。如上所述，通过Phosflow染色评价Stattic抑制STAT3信号传导的能力。如上所述，还进行了使用分选的CAR T细胞和经辐照的K562-CD19细胞的连续再刺激测定。使用Luna自动细胞计数仪(Logos生物系统公司)在CART细胞扩增过程中同时测量绝对细胞数和存活力。
细胞因子分析
如上所述，用抗独特型抗体包被的珠或同种型对照抗体包被的珠将CTL019产物培养过夜，并收集上清液。在基线时和定义的CTL019治疗后时间点通过离心从患者全血中分离血清。这些样品以一次性使用等分试样分配，并储存在-80℃下。根据制造商(生命技术公司)的说明，使用Luminex珠阵列平台对上述培养上清液和血清样品中的细胞因子进行测量。所有样品均进行三次重复分析，并使用9点标准曲线与多个内标品进行比较。数据采集在FlexMAP-3D系统(路明克斯公司)上进行，并且使用XPonent 4.0软件以及5参数逻辑回归分析进行了分析7。
流式细胞术
如先前所述，用六参数Accuri C6流式细胞仪(BD生物科学公司)对CTL019细胞的扩增435和持久性以及外周B-CLL负担进行常规的纵向测量。
对于T细胞深层免疫表型分析，将PBMC或CTL019输注产物(大量T细胞或通过荧光激活细胞分选纯化的特定亚群)与水蓝死细胞排除染料(英杰公司)一起预孵育，
随后用市售的流式细胞术抗体进行表面染色。使用Alexa Fluor 647缀合的抗独特型单克隆抗体检测CAR19蛋白表达。
本研究中使用的所有抗体均在使用前进行滴定，并为每个抗体组创建荧光减一(FMO)对照，以设置阳性事件门控。在定制的17色、19参数特殊顺序LSRFortessa(BD生物科学公司)上采集细胞。使用FlowJo软件(TreeStar)分析数据。
结果
评价了CAR刺激后从CR、PRTD、PR和NR患者输注产物衍生的CTL019细胞产生的细胞因子和趋化因子的图谱。如图7A所示，与PR和NR相比，从CR和PRTD受试者制造的CD19导向的T细胞显示出更高水平的STAT3信号传导介质和靶标，包括IL-6、IL-17、IL-22、IL-31和CCL20。这一发现与CAR刺激的可评价CR和PRTD患者CTL019细胞中的IL-6/STAT3途径上调是一致的(图7B)。这些发现表明，CAR T细胞中STAT3的激活可能参与分化程度较低的多能T淋巴细胞的产生。
然后确定磷酸化的STAT3(pSTAT3)的水平是否可以将高度有效的CR/PRTD患者CART细胞输注产物与PR/NR受试者的具有较差功能性的那些分开。与自PR/NR患者扩增的CAR T细胞相比，来自CR/PRTD患者的CTL019细胞的CAR特异性pSTAT3活性显著提高(图7C)。根据这些发现，在刺激后，输注前CTL019细胞中体内CAR T细胞扩增的最大程度与血清IL-6以及IL-6/STAT3途径基因富集之间观察到强烈的直接相关性(图7D)。因此，CTL019细胞中STAT3信号传导的药物阻断在不影响存活力的情况下，通过CD19表达的白血病细胞(图8A至8B)的连续再刺激降低了其增殖能力(图8C)。在制造CTL019细胞的过程中，通过向培养基中添加外源性IL-6来增加pSTAT3的活性，提高了用表达CD19的肿瘤靶标反复刺激后CAR T细胞的扩增能力和绝对数量(图9)。考虑到STAT3信号在记忆T细胞形成和维持中越来越重要的作用，该途径的诱导可能不仅是CAR T细胞产物中分化程度较低的细胞的分界，而且对其扩张和输注后的长期存活在功能上是重要的。
观察到对CTL019治疗有反应的可能性与输注含有高剂量CD27+PD-1-CD8+CAR T细胞的CTL019产物之间存在高度显著的相关性，如图10所示。CD27+PD-1-CD8+亚群包括响应于IL-6刺激而上调pSTAT3的群体(图11A)，这是由于其IL-6受体b链(也称为CD130或gp130)的显著高水平所致(图11B)。图12(左图)显示，与CD45RO+CD27+CD8+T细胞、CD45RO+CD27-CD8+T细胞或CD45RO-CD27-CD8+T细胞相比，CD45RO-CD27+CD8+T细胞表达更高水平的gp130。图12(右图)表明，相对于其他亚群，在CD45RO-CD27+CD8+T细胞群体中观察到更高频率的表达gp130的细胞。此外，如图14A中所示，具有PD-1阴性CD27hi CCR7hi CD45ROdim/neg未耗尽的早期记忆T细胞表型的CD4+T细胞或CD8+T细胞表达(例如，选择性表达)gp130。因此，基于gp130的CD4+T细胞或CD8+T细胞的阳性选择富集(例如，选择性地富集)早期记忆表型T细胞(图14B)。这些富集的T细胞，例如，早期记忆表型T细胞，可以具有CD27+CD45ROdim/neg的表型。如图14B所示，与富集前相比，基于gp130的CD4+T细胞和CD8+T细胞富集导致具有CD27+和CD45ROdim/neg表型的T细胞群体增加。用gp130富集后，有46％的CD4+T细胞为CD27+CD45ROdim/neg，相比之下，富集前为38.4％。用gp130富集后，有76.1％的CD8+T细胞为CD27+CD45ROdim/neg，相比之下，富集前为55.1％。
因此，这些发现表明，CAR-T细胞治疗CLL的有效性可能会增加，例如，通过过继转移含有CD27+PD-1-CD8+细胞绝对数较高的淋巴细胞的培养物。
等同物
本文引用的每一个专利、专利申请和出版物的披露内容据此通过引用以其全文并入本文。虽然已经参照具体方面公开了本发明，但是本领域其他技术人员可以在不偏离本发明的真实精神以及范围的情况下设想本发明的其他方面以及变化。所附权利要求旨在理解为包括所有这类方面以及等同变化。
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Claims (102)

1.一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体的方法，所述方法包括：
a)提供免疫效应细胞群体，例如T细胞群体；
b)使所述免疫效应细胞群体与编码CAR多肽的核酸接触；
c)使所述免疫效应细胞群体与Stat3激活剂接触；以及
d)将所述细胞维持在允许所述CAR多肽表达的条件下，
由此制备表达CAR的免疫效应细胞群体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述Stat3激活剂选自以下项中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或全部或者以下项的任何组合：
i)gp130激活剂，例如，与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体，或IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子、OSM分子；
ii)可溶性IL-6受体(sIL-6R)，例如，如本文所述；
iii)IL-6/IL-6R复合物，例如二聚体，例如，如本文所述；
iv)IL-6家族细胞因子(例如，IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、IL-31分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子或OSM分子)；
v)CCL20分子；
vi)IL-10R2受体(IL-10R2)激活剂，例如，IL-10分子、IL-22分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子、IL-29分子，或与IL-10R2结合的抗体分子，例如，如本文所述；
vii)IL-10家族细胞因子(例如，IL-10分子、IL-19分子、IL-20分子、IL-22分子、IL-24分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子或IL-29分子)；
viii)IL-17家族细胞因子(例如，IL17A分子、IL17B分子、IL17C分子、IL17D分子、IL17E分子或IL17F分子)；或者
ix)IL-23分子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法进一步包括将以下引入所述免疫效应细胞群体中的至少一种细胞中：
gp130分子，例如，通过在允许所述gp130分子翻译的条件下，将编码所述gp130分子的核酸引入所述免疫效应细胞群体的至少一种细胞中；或者
Stat3分子(例如，组成型活性Stat3分子(STAT3C))，例如，通过在允许所述Stat3分子翻译的条件下，将编码所述Stat3分子的核酸引入所述免疫效应细胞群体的至少一种细胞中。
4.一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体的方法，所述方法包括：
a)提供免疫效应细胞群体，例如T细胞群体；
b)使所述免疫效应细胞群体与编码CAR多肽的核酸接触；
c)将以下分子引入所述免疫效应细胞群体中的至少一种细胞中：
gp130分子，例如，通过在允许所述gp130分子翻译的条件下，将编码所述gp130分子的核酸引入所述免疫效应细胞群体的至少一种细胞中；或者
Stat3分子(例如，组成型活性Stat3分子(STAT3C))，例如，通过在允许所述Stat3分子翻译的条件下，将编码所述Stat3分子的核酸引入所述免疫效应细胞群体的至少一种细胞中；以及
d)将所述细胞维持在允许所述CAR多肽、gp130分子或Stat3分子表达的条件下，
由此制备表达CAR的免疫效应细胞群体。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述免疫效应细胞群体与Stat3激活剂接触，所述Stat3激活剂选自以下项中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或全部或者以下项的任何组合：
i)gp130激活剂，例如，与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体，或IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子、OSM分子；
ii)可溶性IL-6受体(sIL-6R)，例如，如本文所述；
iii)IL-6/IL-6R复合物，例如二聚体，例如，如本文所述；
iv)IL-6家族细胞因子(例如，IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、IL-31分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子或OSM分子)；
v)CCL20分子；
vi)IL-10R2受体(IL-10R2)激活剂，例如，IL-10分子、IL-22分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子、IL-29分子，或与IL-10R2结合的抗体分子，例如，如本文所述；
vii)IL-10家族细胞因子(例如，IL-10分子、IL-19分子、IL-20分子、IL-22分子、IL-24分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子或IL-29分子)；
viii)IL-17家族细胞因子(例如，IL17A分子、IL17B分子、IL17C分子、IL17D分子、IL17E分子或IL17F分子)；或者
ix)IL-23分子。
6.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述gp130分子或Stat3分子的表达是瞬时的(例如，诱导型或非诱导型)或组成型的。
7.如权利要求3-6中任一项所述的方法，其中在使所述免疫效应细胞群体与以下接触之前、同时或之后，将所述gp130分子或所述Stat3分子引入所述免疫效应细胞群体中：
编码CAR多肽的核酸；或者
例如，如本文所述的Stat3激活剂。
8.如权利要求3或4所述的方法，其中包含编码Stat3分子(例如，组成型活性Stat3(STAT3C))的核苷酸的所述核酸进一步包含编码CAR(例如，CD19 CAR)的核苷酸序列。
9.如权利要求1-3或5-8中任一项所述的方法，其中所述Stat3激活剂是与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体。
10.如权利要求9所述的方法，所述方法产生T细胞例如CD4+或CD8+T细胞的群体，所述群体富集例如早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其中早期记忆T细胞具有以下特征之一或全部：CD27+和/或CD45ROdim/neg。
12.如权利要求10所述的方法，其中未耗尽的早期记忆T细胞具有以下特征中的一个或多个，例如全部：(i)PD-1阴性；(ii)CD27hi；(iii)CCR7hi；或(iv)CD45ROdim/neg。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述T细胞例如早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞的富集群体与未与所述Stat3激活剂接触的T细胞的在其他方面类似的群体相比，例如，具有增加的水平或量的早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞，例如增加了至少5％，例如多5％-90％(例如至少多5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-50％、50％-70％或70％-90％，例如至少多5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％)。
14.如权利要求1-3或5-8中任一项所述的方法，其中所述Stat3激活剂包括以下一种、两种、三种或全部：IL-6分子、IL-17分子、IL-22分子或CCL20分子。
15.如权利要求1-3或5-9中任一项所述的方法，其中所述Stat3激活剂是天然存在的分子、重组分子或纯化分子。
16.如权利要求1-3或5-10中任一项所述的方法，其中所述Stat3激活剂不存在于血清中，例如，不以足以激活Stat3，例如磷酸化例如酪氨酸705(Y705)上的Stat3的量存在，例如，如通过实例2的测定所测量的。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述Stat3激活剂位于例如固定于底物例如珠或细胞上。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述Stat3激活剂位于Stat3激活细胞上。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述Stat3激活细胞是人工抗原呈递细胞。
20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述Stat3激活剂由所述Stat3激活细胞表达或缀合至所述Stat3激活细胞的表面。
21.如权利要求1-3、5或9-20中任一项所述的方法，其中提供的例如如本文所述的Stat3激活剂的量足以激活Stat3，例如磷酸化例如酪氨酸705(Y705)上的Stat3，例如，如通过实例2的测定所测量的。
22.如权利要求1-3、5或9-21中任一项所述的方法，其中与在相似条件下培养但未与所述Stat3激活剂接触的细胞的在其他方面相似的群体相比，提供的例如如本文所述的Stat3激活剂的量足以使所述免疫效应细胞群体在12天的培养期后扩增至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9倍或更多倍，例如，如通过实例2的测定所测量的。
23.如权利要求1-3、5或9-22中任一项所述的方法，其中与在相似条件下培养但未与所述Stat3激活剂接触的细胞的在其他方面相似的群体相比，提供的例如如本文所述的Stat3激活剂的量以足以使所述免疫效应细胞群体中CD27+PD-1-细胞的百分比增加，例如，至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5倍或更多倍。
24.如权利要求1-3、5或9-23中任一项所述的方法，其中与在相似条件下培养但未与所述Stat3激活剂接触的细胞的在其他方面相似的群体相比，提供的例如如本文所述的Stat3激活剂的量足以使所述免疫效应细胞群体中gp130的表达水平增加至少1.5、2、3、4、5、10倍或更多倍，例如，如通过实例2的测定所测量的。
25.如权利要求1-3、5或9-24中任一项所述的方法，其中例如，如本文所述的Stat3激活剂为选自以下的一种、两种、三种、四种或全部(例如，五种)：IL-6分子、IL-17分子、IL-22分子、IL31分子和CCL20分子。
26.如权利要求1-3、5或9-25中任一项所述的方法，其中例如，如本文所述的Stat3激活剂包含IL-6分子，例如重组IL-6。
27.如权利要求21所述的方法，其中以至少1、5、10、15、20或30ng/ml或在1-20、1-15或5-15ng/ml的范围内例如至少10ng/ml的量提供所述IL-6分子，例如重组IL-6。
28.如权利要求2、5、或9-13所述的方法，其中所述抗gp130抗体分子选自B-S12或B-P8或者是具有选自B-S12或B-P8的1、2、3、4、5或6个CDR的抗体分子。
29.如权利要求28所述的方法，所述方法包括使所述免疫效应细胞群体与B-S12和B-P8两者接触。
30.如权利要求28或29中任一项所述的方法，其中抗gp130抗体分子的总量为约0.1-1000、0.5-500或1-100ug/ml。
31.如权利要求28-29中任一项所述的方法，其中所述抗gp130抗体分子以至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2ug/ml，例如约1ug/ml的量提供。
32.如权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述抗gp130抗体：
诱导gp130介导的信号传导，如通过STAT3的磷酸化所测量的；或者
诱导二聚化，例如，gp130的同源二聚化，或gp130的异源二聚化，例如与LIF、OSM或CNTF。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中与在相似条件下培养但未与所述Stat3激活剂接触的细胞的在其他方面相似的群体相比，在例如如本文所述的Stat3激活剂的存在下培养的细胞群体表现出：
Stat3的激活，例如Stat3(例如，在酪氨酸705(Y705)上)的磷酸化，例如，如通过实施例2的测定所测量的；
在12天的培养期后，所述免疫效应细胞群体扩增至少了1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9倍或更多倍，例如，如通过实例2的测定所测量的；
所述免疫效应细胞群体中CD27+PD-1-细胞的百分比增加例如至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5倍或更多倍；和/或
所述免疫效应细胞群体中gp130的表达水平增加至少1.5、2、3、4、5或10倍或更多倍，例如，如通过实施例2的测定所测量的。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括扩增所述群体，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天或1-7、7-14或14-21天。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括通过测量Stat3转录靶例如c-Myc、c-Fos、Sox2、Bcl-2、或RORC的水平或活性来测定所述免疫效应细胞群体中的Stat3途径激活，以确定Stat3途径激活的值。
36.如权利要求35所述的方法，所述方法进一步包括将所述Stat3途径激活值与参考值进行比较，其中所述参考值获得自在类似条件下培养但未与例如如本文所述的Stat3激活剂接触的免疫效应细胞的在其他方面类似的群体。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括响应于所述Stat3途径激活值与参考值的比较，进行以下一项或多项：
将所述群体分类为适合或不适合用作治疗剂；
配制或封装所述群体或其等分试样以用于治疗用途；或者
改变培养参数，例如，i)改变培养时长或ii)增加或降低例如如本文所述的Stat3激活剂的浓度。
38.一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体的方法，所述方法包括：
a)提供免疫效应细胞群体，例如T细胞群体；
b)使所述免疫效应细胞群体与编码CAR多肽的核酸接触；
c)使所述免疫效应细胞群体与糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)接触，以及
d)将所述细胞维持在允许所述CAR多肽表达的条件下，由此制备表达CAR的免疫效应细胞群体。
39.如权利要求38所述的方法，其中添加一定量的所述糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-DG，所述量足以使得与在类似条件下培养但未用所述糖酵解抑制剂处理的细胞的在其他方面类似的群体相比：
所述免疫效应细胞群体增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更多；或者
所述免疫效应细胞群体中具有中枢记忆表型的细胞例如CD45RO+CCR7+细胞的百分比增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更高。
40.如权利要求38或39所述的方法，其中以至少0.5、1、1.5、2或2.5mM，0.5-2.5mM或1-2mM的浓度添加所述糖酵解抑制剂，例如，2-DG。
41.如权利要求38-40中任一项所述的方法，其中与在类似条件下培养但未用糖酵解抑制剂处理的细胞的在其他方面类似的群体相比，在所述糖酵解抑制剂存在下培养的所述细胞群体表现出：
使所述免疫效应细胞群体增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更多；或者
使所述免疫效应细胞群体中具有中枢记忆表型的细胞例如，CD45RO+CCR7+细胞的百分比增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更高。
42.如权利要求38-41中任一项所述的方法，所述方法包括：
扩增所述群体，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天或1-7、7-14或14-21天；或者
扩增所述群体，例如，细胞数量变化至少1.5、2、2.5、3、4、5、5、7、8、9、10、20、30、40、50倍或更多，例如，最多约40或50倍，例如，在实例1的生长条件下。
43.如权利要求38-42中任一项所述的方法，所述方法进一步包括例如，使用2-NBDG摄取测定，例如实施例1的测定，来测定所述免疫效应细胞群体中的葡萄糖代谢，以确定葡萄糖代谢值。
44.如权利要求38-43中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所述葡萄糖代谢值与参考值比较。
45.如权利要求38-44中任一项所述的方法，所述方法进一步包括响应于所述葡萄糖代谢值与参考值的比较，进行以下一项或多项：
将所述群体分类为适合或不适合用作治疗剂；
配制或封装所述群体或其等分试样以用于治疗用途；或者
改变培养参数，例如，i)改变培养时长或ii)增加或降低所述糖酵解抑制剂例如所述糖酵解小分子抑制剂，例如所述小分子己糖激酶抑制剂，例如所述葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)的浓度。
46.如权利要求38-45中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使所述免疫效应细胞群体与如权利要求1所述的Stat3激活剂或如权利要求3或4所述的细胞群体接触。
47.如权利要求1-37中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使所述免疫效应细胞群体与糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)接触。
48.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中(b)在(c)之前进行，(c)在(b)之前进行，或者(b)和(c)同时进行。
49.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。
50.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中(b)包括进行慢病毒转导以将所述核酸递送至所述免疫效应细胞。
51.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使所述免疫效应细胞群体与表达结合所述CAR的抗原(例如，CD19)的细胞群体接触。
52.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使所述免疫效应细胞群体与刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激所述细胞表面上的共刺激分子的配体接触，例如，其中所述试剂为与抗CD3抗体或其片段和/或抗CD28抗体或其片段缀合的珠。
53.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CAR多肽是CD19 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、BCMACAR、EGFRvIIICAR、CLL-1CAR、CD20CAR或CD33 CAR。
54.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CAR是CD19CAR，例如，包含SEQ IDNO:39-51的scFv氨基酸序列的CAR或包含SEQ ID NO:77-89的氨基酸序列的CAR。
55.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CAR包含抗体分子，所述抗体分子包含抗CD19结合结构域、跨膜结构域和包含刺激性结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述抗CD19结合结构域包含表3B中列出的任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个，以及表3A中列出的任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个。
56.如权利要求50所述的方法，其中所述抗CD19结合结构域包含SEQ ID NO:40或SEQID NO:51的序列。
57.如权利要求54-56中任一项所述的方法，其中所述CAR包含具有SEQ ID NO:78或SEQID NO:89的序列的多肽。
58.一种反应混合物，所述反应混合物包含：
a)(i)表达CAR的免疫效应细胞(例如，本文所述的表达CAR的细胞，例如，表达CD19 CAR的细胞)群体或(ii)免疫效应细胞和编码CAR(例如，本文所述的CAR，例如，CD19 CAR)的核酸；以及
b)选自以下的试剂：
(i)Stat3激活剂；
(ii)如权利要求3或4所述的细胞或细胞群体；或者
(iii)gp130分子或Stat3分子，或编码gp130分子或Stat3分子的核酸。
59.如权利要求58所述的反应混合物，其中所述Stat3激活剂选自：
b-i-i)gp130激活剂，例如，与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体，或IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子、OSM分子；
b-i-ii)可溶性IL-6受体(sIL-6R)，例如，如本文所述；
b-i-iii)IL-6/IL-6R复合物，例如二聚体，例如，如本文所述；
b-i-iv)IL-6家族细胞因子(例如，IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、IL-31分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子或OSM分子)；
b-i-v)CCL20分子；
b-i-vi)IL-10R2受体(IL-10R2)激活剂，例如，IL-10分子、IL-22分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子、IL-29分子，或与IL-10R2结合的抗体分子，例如，如本文所述；
b-i-vii)IL-10家族细胞因子(例如，IL-10分子、IL-19分子、IL-20分子、IL-22分子、IL-24分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子或IL-29分子)；
b-i-viii)IL-17家族细胞因子(例如，IL17A分子、IL17B分子、IL17C分子、IL17D分子、IL17E分子或IL17F分子)；或者
b-i-ix)IL-23分子。
60.如权利要求58或59所述的反应混合物，所述反应混合物包含(a)(i)表达CAR的免疫效应细胞群体。
61.如权利要求58或59所述的反应混合物，所述反应混合物包含(a)(ii)编码CAR(例如，本文所述的CAR，例如，CD19 CAR)的核酸。
62.如权利要求58-61中任一项所述的反应混合物，所述反应混合物包含(b)(i)如权利要求59所述的Stat3激活剂。
63.如权利要求58-61中任一项所述的反应混合物，所述反应混合物包含(b)(ii)如权利要求3或4所述的细胞或细胞群体。
64.如权利要求58-61中任一项所述的反应混合物，所述反应混合物包含(b)(iii)gp130分子或Stat3分子，或编码它们的核酸。
65.如权利要求58所述的反应混合物，所述反应混合物包含：(a)(i)表达CAR的免疫效应细胞群体；以及(b)(i)如权利要求59所述的Stat3激活剂。
66.如权利要求58所述的反应混合物，所述反应混合物包含：(a)(i)表达CAR的免疫效应细胞群体；以及(b)(ii)如权利要求3或4中所述的细胞或细胞群体。
67.如权利要求58所述的反应混合物，所述反应混合物包含：(a)(i)表达CAR的免疫效应细胞群体；以及(b)(iii)gp130分子或Stat3分子或编码所述分子的核酸。
68.如权利要求58所述的反应混合物，所述反应混合物包含：(a)(ii)编码CAR的核酸；以及(b)(i)如权利要求59所述的Stat3激活剂。
69.如权利要求58所述的反应混合物，所述反应混合物包含：(a)(ii)编码CAR的核酸；以及(b)(ii)如权利要求3或4所述的细胞或细胞群体。
70.如权利要求53所述的反应混合物，所述反应混合物包含：(a)(ii)编码CAR的核酸；以及(b)(iii)gp130分子或Stat3分子，或编码gp130分子或Stat3分子的核酸。
71.如权利要求58-62、65或68中任一项所述的反应混合物，所述反应混合物包含以下一种或多种：
(a)(i)和b-i-i)；(a)(i)和b-i-ii)；(a)(i)和b-i-iii)；(a)(i)和b-i-iv)；(a)(i)和b-i-v)；(a)(i)和b-i-vi)；(a)(i)和b-i-vii)；(a)(i)和b-i-viii)；(a)(ii)和b-i-i)；(a)(ii)和b-i-ii)；(a)(ii)和b-i-iii)；(a)(ii)和b-i-iv)；(a)(ii)和b-i-v)；(a)(ii)和b-i-vi)；(a)(ii)和b-i-vii)；(a)(ii)和b-i-viii)。
72.一种反应混合物，所述反应混合物包含：
a)表达CAR的免疫效应细胞例如本文所述的表达CAR的细胞例如表达CD19 CAR的细胞的群体，以及
b)糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)。
73.一种反应混合物，所述反应混合物包含：
a)免疫效应细胞群体，
b)编码CAR例如本文所述的CAR例如CD19 CAR的核酸，和
c)糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)。
74.如权利要求72或73所述的反应混合物，其中所述糖酵解抑制剂例如2-DG的浓度为至少0.5、1、1.5、2、2.5mM，0.5-2.5mM或1-2mM。
75.如权利要求72-74中任一项所述的反应混合物，所述反应混合物进一步包含Stat3激活剂；细胞或细胞群体；如权利要求58或59所述的gp130分子或Stat3分子，或编码gp130分子或Stat3分子的核酸。
76.如权利要求59-71中任一项所述的反应混合物，所述反应混合物进一步包含糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)。
77.如权利要求59-76中任一项所述的反应混合物，所述反应混合物进一步包含慢病毒，例如，其中所述编码CAR的核酸封装在慢病毒中。
78.如权利要求58-77中任一项所述的反应混合物，其中所述核酸是DNA或RNA。
79.如权利要求58-78中任一项所述的反应混合物，所述反应混合物进一步包含表达结合所述CAR的抗原(例如，CD19)的细胞群体。
80.一种评价或预测患有癌症(例如，本文所述的癌症)的受试者对例如在施用表达CAR的细胞之前用所述表达CAR的细胞进行的治疗性治疗的反应性的方法，所述方法包括评价来自所述受试者的免疫效应细胞中：
i)葡萄糖代谢水平，其中：
低于葡萄糖代谢参考值的葡萄糖代谢水平指示所述受试者可能对所述表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，表现出完全反应或部分反应，并且
高于葡萄糖代谢参考值的葡萄糖代谢水平指示所述受试者不太可能对所述表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，未表现出完全反应或部分反应；或者
ii)Stat3激活水平，如通过例如Stat3(例如，在酪氨酸705(Y705)上)的磷酸化或Stat3转录靶(例如，c-Myc、c-Fos、Sox2或Bcl-2)的水平或活性测量的，其中：
高于Stat3激活参考值的Stat3激活水平表示所述受试者可能对所述表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，表现出完全反应或部分反应，并且
低于Stat3激活参考值的Stat3激活水平表示所述受试者不太可能对所述表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，没有表现出完全反应或部分反应，
从而评价所述受试者，或预测所述受试者对所述表达CAR的细胞的反应性。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述免疫效应细胞尚未与编码CAR的核酸接触。
82.如权利要求80所述的方法，其中所述免疫效应细胞已经与编码CAR的核酸接触，例如，表达CAR多肽。
83.如权利要求80-82中任一项所述的方法，其中所述免疫效应细胞已经与以下接触：
i)如权利要求1所述的Stat3激活剂；
ii)如权利要求3或4所述的细胞或细胞群体；
iii)gp130分子或Stat3分子，或编码gp130分子或Stat3分子的核酸；或者
iv)糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)，浓度为至少0.5、1、1.5、2或2.5mM。
84.如权利要求80-83中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括确定细胞数量例如表达CAR的细胞的数量的倍数变化。
85.如权利要求80-84中任一项所述的方法，其中预测不太可能对所述表达CAR的细胞有反应，例如不具有完全反应(CR)或部分反应(PR)，例如为无反应者(NR)的受试者。
86.如权利要求80-85中任一项所述的方法，其中响应于确定：
i)所述葡萄糖代谢水平低于所述葡萄糖代谢参考值；或者
ii)所述Stat3激活水平高于所述Stat3激活参考值，
选择所述受试者以施用表达CAR的疗法或向所述受试者施用表达CAR的疗法。
87.如权利要求80-85中任一项所述的方法，其中响应于确定：
i)所述葡萄糖代谢水平高于所述葡萄糖代谢参考值；或者
ii)所述Stat3激活水平低于所述Stat3激活参考值，
选择所述受试者以施用除表达CAR的疗法以外的疗法或向所述受试者施用除表达CAR的疗法以外的疗法。
88.如权利要求80-87中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖代谢参考值是如实例1中所述的完全反应受试者的细胞的葡萄糖代谢值，例如，其中使所述细胞(例如，包含所述细胞的样品)与如下模拟物刺激接触，例如，用除所述CAR抗原以外的抗原刺激，例如，如实例1所述。
89.如权利要求80-87中任一项所述的方法，其中所述Stat3激活参考值是无反应受试者的细胞的Stat3激活值，例如，如实例2中所述。
90.一种评价或预测患有癌症(例如，本文所述的癌症)的受试者的反应性的方法，其中所述受试者已经用表达CAR的细胞治疗，所述方法包括评价来自所述受试者的表达CAR的细胞中：
i)葡萄糖代谢水平，其中：
低于葡萄糖代谢参考值的葡萄糖代谢水平指示所述受试者可能对所述表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，表现出完全反应或部分反应，并且
高于葡萄糖代谢参考值的葡萄糖代谢水平指示所述受试者不太可能对所述表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，未表现出完全反应或部分反应；或者
ii)Stat3激活水平，如通过例如Stat3(例如，在酪氨酸705(Y705)上)的磷酸化或Stat3转录靶(例如，c-Myc、c-Fos、Sox2或Bcl-2)的水平或活性测量的，其中：
高于Stat3激活参考值的Stat3激活水平表示所述受试者可能对所述表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，表现出完全反应或部分反应，并且
低于Stat3激活参考值的Stat3激活水平表示所述受试者不太可能对所述表达CAR的细胞的治疗有反应，例如，没有表现出完全反应或部分反应，
从而评价所述受试者，或预测所述受试者对所述表达CAR的细胞的反应性。
91.如权利要求90所述的方法，所述方法进一步包括在评价所述表达CAR的细胞中所述葡萄糖代谢水平或所述Stat3激活水平之前从所述受试者中获得所述表达CAR的细胞。
92.如权利要求90或91所述的方法，其中预测不太可能对所述表达CAR的细胞有反应，例如不具有完全反应(CR)或部分反应(PR)，例如为无反应者(NR)的受试者。
93.如权利要求90-92中任一项所述的方法，其中响应于确定：
i)所述葡萄糖代谢水平低于所述葡萄糖代谢参考值；或者
ii)所述Stat3激活水平高于所述Stat3激活参考值，
选择所述受试者以施用一个或多个额外剂量的所述表达CAR的疗法或向所述受试者施用一个或多个额外剂量的所述表达CAR的疗法。
94.如权利要求90-93中任一项所述的方法，其中响应于确定：
i)所述葡萄糖代谢水平高于所述葡萄糖代谢参考值；或者
ii)所述Stat3激活水平低于所述Stat3激活参考值，
选择所述受试者以施用除表达CAR的疗法以外的疗法或向所述受试者施用除表达CAR的疗法以外的疗法。
95.如权利要求90-94中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖代谢参考值是如实例1中所述的完全反应受试者的细胞的葡萄糖代谢值，例如，其中使所述细胞(例如，包含所述细胞的样品)与如下模拟物刺激接触，例如，用除所述CAR抗原以外的抗原刺激，例如，如实例1所述。
96.如权利要求90-95中任一项所述的方法，其中所述Stat3激活参考值是无反应受试者的细胞的Stat3激活值，例如，如实例2中所述。
97.一种评价表达CAR的细胞例如表达CAR19的细胞(例如，CTL019)的方法，所述方法包括评价来自受试者的样品中的所述表达CAR的细胞中：
i)葡萄糖代谢水平，其中：
低于葡萄糖代谢参考值的葡萄糖代谢水平指示所述样品适合于治疗，并且
高于葡萄糖代谢参考值的葡萄糖代谢水平指示所述样品不太适合于治疗；或者
ii)Stat3激活水平，其中：
高于Stat3激活参考值的Stat3激活水平指示所述样品适合于治疗，并且
低于Stat3激活参考值的Stat3激活水平指示所述样品不太适合于治疗，
从而评价所述表达CAR的细胞。
98.如权利要求97所述的方法，所述方法进一步包括在评价所述表达CAR的细胞中所述葡萄糖代谢水平或Stat3激活之前从所述受试者中获得所述表达CAR的细胞。
99.如权利要求97或98所述的方法，其中响应于确定：
i)所述葡萄糖代谢水平低于所述葡萄糖代谢参考值；或者
ii)所述Stat3激活水平高于所述Stat3激活参考值，
选择所述样品以施用于所述受试者或将所述样品施用于所述受试者。
100.如权利要求97或98所述的方法，其中响应于确定：
i)所述葡萄糖代谢水平高于所述葡萄糖代谢参考值，
ii)所述Stat3激活水平低于所述Stat3激活参考值，
未选择所述样品以施用于所述受试者或未将所述样品施用于所述受试者。
101.如权利要求97-100中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖代谢参考值是如实例1中所述的完全反应受试者的细胞的葡萄糖代谢值，例如，其中使所述细胞(例如，包含所述细胞的样品)与如下模拟物刺激接触，例如，用除所述CAR抗原以外的抗原刺激，例如，如实例1所述。
102.如权利要求97-100中任一项所述的方法，其中所述Stat3激活参考值是无反应受试者的细胞的Stat3激活值，例如，如实例2中所述。
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