CN105693861A - 异二聚体结合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过免疫球蛋白CH1区和免疫球蛋白轻链恒定区(CL)的自然异二聚化，在两个不同单链融合多肽之间形成的多肽异二聚体。多肽异二聚体包含两个或多个特异结合一个或多个靶标(如受体)的结合域。另外，异二聚体的两个链还包含Fc区部分。本发明也提供核酸、载体、宿主细胞和制备多肽异二聚体的方法，和使用所述异二聚体的方法，例如指导T细胞活化，抑制实体肿瘤生长和治疗自体免疫或炎症病症。

Description

异二聚体结合蛋白及其应用
相关申请的交叉参考
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2009年12月29日提交的美国临时专利申请号61/290,840和2010年7月16日提交的美国临时专利申请号61/365,266的优先权；其全文各自通过引用纳入本文。
关于序列表的声明
本申请的相关序列表以文本格式代替纸件副本提供，由此通过引用纳入说明书。包含序列表的文本名称为910180_422PC_SEQUENCE_LISTING.txt。所述文本文件为839KB，创建于2010年12月29日，通过EFS-Web以电子方式提交，与说明书一并提交申请。
背景
技术领域
本发明一般提供多肽异二聚体、其合成物、以及制备和使用所述多肽异二聚体的方法。更具体而言，本文提供的多肽异二聚体部分通过在免疫球蛋白CH1区和免疫球蛋白轻链恒定区(CL)之间的自然异二聚化形成。另外，本文提供的多肽异二聚体包含能特异结合一个或多个靶标的两个或多个结合域。再者，本文提供的多肽异二聚体的单链多肽，每个包括Fc区部分(即免疫球蛋白CH2和CH3域)。
背景技术
信号转导过程经常涉及有胞外域、跨膜域和胞内域的受体蛋白。配体结合中，细胞表面受体分子经常寡聚化或多聚化(也称为“交联”)以有效传递信号到细胞的胞内部分。对所述受体和配体相互作用或随后受体寡聚化或多聚化的刺激或阻止对多种疾病有重要治疗应用。
用于调节受体和配体结合的示例分子包括抗体和从抗体衍生的分子。例如，抗体或其衍生物作为细胞表面结合受体的受体拮抗剂并且通过阻止与活性配体的结合位点或抑制活性所需的受体寡聚化或多聚化使其失活。其他某些示例下，抗体或其衍生物作为激动剂，通过结合或交联多个膜受体，模仿天然配体功能。另一个示例是双特异性抗体衍生物，可用于指导细胞毒性试剂或免疫效应细胞至靶位点，如肿瘤。
双特异性抗体是基于抗体的分子，能同时结合两个分离的并不同的抗原(或相同抗原的不同表位)。双特异性抗体的一个用途是重新引导细胞毒性免疫效应细胞，通过抗体依赖细胞毒性(ADCC)以增强对肿瘤细胞的杀伤。本文中，双特异性抗体的一个臂结合肿瘤细胞的抗原，并且另一个臂结合效应细胞表达的决定簇。通过交联肿瘤和效应细胞，所述双特异性抗体不仅在肿瘤细胞周围引入效应细胞，而且也同时引起其活化，造成有效杀死肿瘤细胞。双特异性抗体已经用于在肿瘤组织富集化学或放射治疗试剂以最小化对正常组织的有害作用。这种情况下，双特异性抗体的一个臂与要破坏的靶向细胞所表达的抗原相结合，另一个臂运输化疗药物、放射性同位素或毒素。
通常开发双特异性抗体的一个主要障碍是难于为临床前和临床研究生产足质足量的材料。起初，双特异性抗体生产的主要途径是通过在单个细胞中共表达不同特异性的两个亲代抗体的两个轻链和两个重链。然而，具有所需结合能力的双特异性抗体产量较少，并且非常难以从其它产品中纯化。另一个双特异性抗体生产的传统方法是将不同特异性的两个抗体或其片段进行化学连接。然而，该方法也复杂，并且化学修饰过程可以使抗体失活或促进聚集。因为难以从不需要的产物中进行纯化，所得双特异性抗体的低产率和差质量使得所述过程不适合作为临床开发所需的大规模生产。
近期，多种异二聚化技术已经用于提高双特异性抗体的生产。然而，单个异二聚体域如Jun/Fos卷曲螺旋到scFv域的融合造成同或异二聚体的混合和需要重新折叠组装(deKruif和Logtenberg，J.Biol.Chem.271:7630-4，1996)。scFv片段到全抗体的融合也用作二聚化设备(Coloma和Morrison，Nat.Biotechnol.15:159-63，1997)。然而，所述融合得到的大分子实体组织穿透能力差。两个scFv片段一起的融合已经用于产生双特异性蛋白(如马里兰州贝塞斯达Micromet公司的抗体，美国专利号7,635,472)。然而，所述蛋白不含Fc区，并且因此无法通过Fc区进行活性操作。另外，所述蛋白小(～55kDa)并且因此在血清中的半衰期相对短。
至今，免疫球蛋白融合技术没有提供市售可得异二聚蛋白或生产方法。因此，本领域仍需要其它多特异异二聚蛋白以及有效的生产方法。
发明内容
本发明提供通过免疫球蛋白CH1区和免疫球蛋白轻链恒定区(CL)的自然异二聚化在两个不同单链多肽之间形成的多肽异二聚体。本发明也提供核酸、载体、宿主细胞和制备多肽异二聚体的方法，和使用所述异二聚体的方法，例如在指导T细胞活化，抑制实体肿瘤生长，治疗自体免疫或感染病症或治疗B细胞相关紊乱或疾病。
一方面，本发明提供多肽异二聚体，所述多肽异二聚体包括(a)第一个单链多肽(SCP-I)，包含1-4个特异结合1-4个靶标的结合域，铰链(H-I)，免疫球蛋白异二聚化域(HD-I)和Fc区部分(FRP-I)；和(b)第二个单链多肽(SCP-II)，包含0-4个特异结合0-4个靶标的结合域(SCP-II)，铰链(H-II)，免疫球蛋白异二聚化域(HD-II)和Fc区部分(FRP-II)；其中(i)免疫球蛋白HD-I和免疫球蛋白HD-II优选互相结合以形成包含SCP-I和SCP-II的多肽异二聚体，和(1)第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚体域(HD-I)包含第一免疫球蛋白CH1域，和第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚体域(HD-II)包含第一免疫球蛋白CL域，或(2)第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚体域(HD-I)包括第一免疫球蛋白CL域，和第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚体域(HD-II)包含第一免疫球蛋白CH1域；和(ii)SCP-I的Fc区部分和SCP-II的Fc区部分包含第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚体域(HD-II)包括第一免疫球蛋白包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD或其任意组合的免疫球蛋白CH2和CH3域；IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM或其任意组合的一个或两个免疫球蛋白CH3域；或IgE、IgM或其任意组合的免疫球蛋白CH3和CH4域，前提是多肽异二聚体包含至少特异结合靶标(如至少两个不同靶标)的两个结合域。
某些实施方式中，多肽异二聚体的结合域是单链Fv(scFv)多肽。
某些实施方式中，多肽异二聚体包括两个结合域(BD1和BD2)。一个实施方式中，两个结合域(BD1和BD2)都在第一单链多肽(SCP-I)上，并且其中HD-I和FRP-I位于BD1和BD2之间。另一个实施方式中，第一结合域(BD1)在第一单链多肽(SCP-I)上并且第二结合域(BD2)在第二单链多肽(SCP-II)上。例如，第一结合域(BD1)可在第一单链多肽的Fc区部分(FRP-I)的氨基末端，第二结合域(BD2)可在第二单链多肽的Fc区部分(FRP-II)的氨基末端。或者，第一结合域(BD1)可在第一单链多肽的Fc区部分(FRP-I)的氨基末端，和第二结合域(BD2)可在第二单链多肽的Fc区部分(FRP-II)的羧基末端。再者，第一结合域(BD1)可在第一单链多肽的Fc区部分(FRP-I)的羧基末端，和第二结合域(BD2)可在第二单链多肽的Fc区部分(FRP-II)的羧基末端。
某些实施方式中，多肽异二聚体包括三个结合域(BD1、BD2和BD3)。一个实施方式中，HD-I和FRP-I设置在BD1和BD2之间，而第三结合域(BD3)在第二单链多肽的Fc区部分(FRP-II)的氨基末端。另一个实施方式中，HD-I和FRP-I设置在BD1和BD2之间，而第三结合域(BD3)在第二单链多肽的Fc区部分(FRP-II)的羧基末端。
某些实施方式中，多肽异二聚体包括四个结合域(BD1、BD2、BD3和BD4)。例如，HD-I和FRP-I位于BD1和BD2之间，而HD-II和FRP-II位于BD3和BD4之间。
某些实施方式中，多肽异二聚体包括五至八个结合域(即，5、6、7或8个结合域)。
某些实施方式中，本文提供的多肽异二聚体的至少一个结合域特异与下列结合或是其拮抗剂：TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD28、CD79b、超级IL-6、单IL-、CD86、CD20、PSMA、CD19、HLA-DR、Ron、c-Met、CEACAM-6、LIGHT、GITRL、CD40、PDL1、PDL2、HVEM、LTBR、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、EphA2、PDGFR、VEGFR1-4、促血管生成素2、CD64、CD32A、CD16、CD71、TNFR1、TNFR2、TWEAKR、TACI、BAFF-R、BCMA、FAS、CD32B、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD70、TNFα、IL-6、超级IL-6、IL-2、IL-1、IL-7、IL-8、IL-17A/C、IP-10、IFNγ、IFNα、RANKL、FASL、TGFβ、IL10、IL17A/F、CSF2、IGF1、IGF2、BLyS/APRIL、HGF、MSP、EGF(包括epiregulin、herregulin、β-regulin、神经调节蛋白)、HIF-1α、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、TNFα、Wnt、sHH、TGFβ、PDGF、TWEAK、EpCAM、CEA、PCTA-1、STEAP-1、PSCA、ALCAM(CD166)、EphA2、CD151、CA-125、MUC-1、MAGE-1、TROP2、CCR5、HER-3、HER-4、EGFR、CEA、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5b、MUC7、βhCG、Lewis-Y、神经节苷脂GD3、9-O-乙酰基-GD3、GM2、GloboH、岩藻糖GM1、聚SA、GD2、碳脱水酶IX(MN/CAIX)、CD44v6、SonicHedgehog(Shh)、Wue-1、血浆细胞抗原、(膜结合)IgE、黑色素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、CCR8、TNFα前提、STEAP、间皮素、A33抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、Ly-6；桥粒核心糖蛋白4、E-钙粘蛋白新表位、胎儿乙酰基胆碱受体、CD25、CA19-9标记、CA-125标记和缪勒管激素抑制因子(MuellerianInhibitorySubstance(MIS))受体II、sTn(唾酸化Tn抗原；TAG-72)、FAP(成纤维细胞活化)、內皮唾酸蛋白、EGFRvIII、LG、SAS、CD63、IGF1R、CD151、TGFBR2、GHRHR、GHR、IL-6R、gp130、TNFR2、OSMRβ、Patched-1、卷曲蛋白(Frizzled)、Robo1、CD80、CD81、CD86、OX40、CD40、CD137、LIFRβ、TLR7或TLR9。
某些其他实施方式中，多肽异二聚体的至少一个结合域是IL-10、HLA-G、HGF、IL-35、PD-1、BTLA、TNFR1、TNFR2、DR4、DR5、TWEAKR或FAS的激动剂。
本文提供的某些多肽异二聚体中，至少一个结合域特异结合TCR复合物或其组分，并且至少另一个结合域特异结合PSMA、CD79b、CD19、HLA-DR、CD20、RON、c-Met或CEACAM-6。
本文提供的某些其他多肽异二聚体中，至少一个结合域特异结合CD28，并且至少另一个结合域特异结合下列，或是其拮抗剂：CD79b、超级IL-6、PDL2、单IL-10、CD86、LIGHT、GITRL、CD40、PDL1、HVEM或LTBR。
本文提供的某些其他多肽异二聚体中，至少一个结合域特异结合CD28，并且至少另一个结合域是IL-10、HLA-G、HGF、IL-35、PD-1或BTLA的激动剂。
某些实施方式中，第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-I)包含第一免疫球蛋白CH1区，并且第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-II)包含第一免疫球蛋白CL区。一个实施方式中，第一CH1区是第一单链多肽的Fc区部分的氨基末端，而第一CL区是第二单链多肽的Fc区部分的氨基末端。另一个实施方式中，第一CH1区是第一单链多肽的Fc区部分的羧基末端，而第一CL区是第二单链多肽的Fc区部分的羧基末端。
第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-I)包含第一免疫球蛋白CH1区并且第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-II)包含第一免疫球蛋白CL区的某些实施方式中，第一单链多肽还包含第二CH1区且第二单链多肽还包含第二CL区，并且第一单链多肽的第二CH1区和第二单链多肽的第二CL区在多肽异二聚体中互相结合。例如，第一单链多肽的Fc区部分可以布置在第一和第二CH1区之间，并且第二单链多肽的Fc区部分可以布置在第一和第二CL区之间。或者，第一和第二CH1区都可以在第一单链多肽的Fc区部分的氨基末端，第一和第二CL区都可以在第二单链多肽的Fc区部分的氨基末端。再者，第一和第二CH1区都可以在第一单链多肽的Fc区部分的羧基末端，和第一和第二CL区都可以在第二单链多肽的Fc区部分的羧基末端。
第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-I)包含第一免疫球蛋白CH1区并且第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-II)包含第一免疫球蛋白CL区的某些其他实施方式中，第一单链多肽还包含第二CL区且第二单链多肽还包含第二CH1区，并且第一单链多肽的第二CL区和第二单链多肽的第二CH1区在多肽异二聚体中互相结合。例如，一个实施方式中，在第一单链多肽上，第一CH1区在Fc区部分的氨基末端并且第二CL区在Fc区部分的羧基末端；和在第二单链多肽上，第一CL区在Fc区部分的氨基末端并且第二CH1区在Fc区部分的羧基末端。另一个实施方式中，在第一单链多肽上，第一CH1区在Fc区部分的羧基末端并且第二CL区在Fc区部分的氨基末端；在第二单链多肽上，第一CL区在Fc区部分的羧基末端并且第二CH1区在Fc区部分的氨基末端。另一个实施方式中，在第一单链多肽上，第一CH1区和第二CL区都在Fc区部分的氨基末端，而第一CH1区在第二CL区的氨基末端；并且在第二单链多肽上，第一CL区和第二CH1区都在Fc区部分的氨基末端，而第一CL区在第二CH1区的氨基末端。另一个实施方式中，在第一单链多肽上，第一CH1区和第二CL区都在Fc区部分的氨基末端，而第二CL区在第一CH1区的氨基末端；并且在第二单链多肽上，第一CL区和第二CH1区都在Fc区部分的氨基末端，而第二CH1区在第一CL区的氨基末端。在进一步实施方式中，在第一单链多肽上，第一CH1区和第二CL区都在Fc区部分的羧基末端，而第一CH1区在第二CL区的氨基末端；并且在第二单链多肽上，第一CL区和第二CH1区都在Fc区部分的羧基末端，而第一CL区在第二CH1区的氨基末端。另一个实施方式中，在第一单链多肽上，第一CH1区和第二CL区都在Fc区部分的羧基末端，而第二CL区在第一CH1区的氨基末端；并且在第二单链多肽上，第一CL区和第二CH1区都在Fc区部分的羧基末端，而第二CH1区在第一CL区的氨基末端。
某些实施方式中，第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-I)包含第一免疫球蛋白CL区，并且第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-II)包含第一免疫球蛋白CH1区。一个实施方式中，第一CL区是第一单链多肽的Fc区部分的氨基末端，而第一CH1区是第二单链多肽的Fc区部分的氨基末端。另一个实施方式中，第一CL区是第一单链多肽的Fc区部分的羧基末端，而第一CH1区是第二单链多肽的Fc区部分的羧基末端。另一个实施方式中，第一单链多肽还包含第二CL区而第二单链多肽还包括第二CH1区，并且第一单链多肽的第二CL区和第二单链多肽的第二CH1区在多肽异二聚体中互相结合。例如，第一单链多肽的Fc区部分可以布置在第一和第二CL区之间，并且第二单链多肽的Fc区部分可以布置在第一和第二CH1区之间。或者，第一和第二CL区都可以在第一单链多肽的Fc区部分的氨基末端，第一和第二CH1区都可以在第二单链多肽的Fc区部分的氨基末端。也或者，第一和第二CL区都可以在第一单链多肽的Fc区部分的羧基末端，和第一和第二CH1区都可以在第二单链多肽的Fc区部分的羧基末端。
某些实施方式中，第一CL区是Cκ区。另一些实施方式中，第一CL区是Cλ区。
某些实施方式中，第二CL区是Cκ区。另一些实施方式中，第二CL区是Cλ区。
某些实施方式中，Cκ区是野生型人免疫球蛋白Cκ区。另一些实施方式中，Cκ区是野生型人Cκ区在N29、N30、Q52、V55、T56、T56、S68或T70发生一个或多个氨基酸替换的改变了的人免疫球蛋白Cκ区。例如，所述一个或多个氨基酸替换可以选自Ala(A)、Arg(R)、Trp(W)、Tyr(Y)、Glu(E)、Gln(Q)、Lys(K)、Asp(D)、Met(M)、Ser(S)和Phe(F)。
某些实施方式中，CH1区是包含68位Val(V)替换为Lys(K)、Arg(R)或His(H)的氨基酸替换的改变了的人免疫球蛋白CH1区，其中，Ck区是包含在27位Leu(L)替换为Asp(D)或Glu(E)的氨基酸替换的改变了的人免疫球蛋白Ck区。另一些实施方式中，CH1区是包含68位Val(V)改变为Asp(D)或Glu(E)的氨基酸替换的改变了的人免疫球蛋白CH1区，其中，Ck区是包含在27位Leu(L)改变为Lys(K)、Arg(R)或His(H)的氨基酸替换的改变了的人免疫球蛋白Ck区。
某些实施方式中，Cλ区是野生型人免疫球蛋白Cλ区。
某些实施方式中，当出现所述第一CH1区或第二CH1区时，是野生型人免疫球蛋白CH1区，例如野生型人IgG1CH1区。
某些实施方式中，当出现所述第一CH1区或第二CH1区时，是改变了的人免疫球蛋白CH1区，例如改变了的人IgG1CH1区，有与野生型人免疫球蛋白CL区参与形成二硫键的野生型人免疫球蛋白CH1区的半胱氨酸的缺失或替换。
某些实施方式中，Cκ区是改变了的人免疫球蛋白Ck区，例如有与野生型人免疫球蛋白CH1区参与形成二硫键的野生型人免疫球蛋白Cκ区的半胱氨酸残基的缺失或替换。
某些实施方式中，Cλ区是改变了的人免疫球蛋白Cλ区，有与野生型人免疫球蛋白CH1区参与形成二硫键的野生型人免疫球蛋白Cλ区的半胱氨酸残基的缺失或替换。
某些实施方式中，当出现所述第一CH1区和第二CH1区时，是包含SEQIDNO:114、844或845的多肽。
某些实施方式中，当出现所述Ck区时，是选自包含SEQIDNO:141-178、202和838-843的多肽的任何一个。
某些实施方式中，当出现所述Cλ区时，是包含SEQIDNO:140的多肽。
某些实施方式中，第一单链多肽的Fc区部分(FRP-I)和第二单链多肽的Fc区部分(FRP-II)，每个包含免疫球蛋白CH2域，例如IgG1CH2域或IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgDCH2域。
某些实施方式中，第一单链多肽的Fc区部分(FRP-I)和第二单链多肽的Fc区部分(FRP-II)，每个包含免疫球蛋白CH3域，例如IgG1CH3域或IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgMCH3域。
某些实施方式中，第一单链多肽的Fc区部分(FRP-I)和第二单链多肽的Fc区部分(FRP-II)，每个包含免疫球蛋白CH2域和免疫球蛋白CH3域，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgDCH2和CH3域。
Fc区部分包含直接在免疫球蛋白异二聚体域(如CH1域或Ck域)氨基末端的免疫球蛋白CH3域的某些实施方式中，免疫球蛋白CH3域与直接在单链多肽的免疫球蛋白CH3域的羧基末端的CH1域通过包括SEQIDNO:846、847、848或849的肽连接；并且免疫球蛋白CH3域与直接在另一个单链多肽的免疫球蛋白CH3域的羧基末端的Ck域通过包括SEQIDNO:846、850、951或852的肽连接。
某些实施方式中，第一单链多肽的Fc区部分(FRP-I)和第二单链多肽的Fc区部分(FRP-II)包含IgM或IgECH3和CH4域。
Fc区部分包含免疫球蛋白CH2域的某些实施方式中，CH2域可以是改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH2域。改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH2域的示例包含含(a)297位氨基酸替换和234-238位的至少一个其它替换或缺失；(b)234-238位的一个或多个氨基酸突变和253、310、318、320、322或331位的至少一个替换；或(c)297位的天冬酰胺的氨基酸替换，234-238位的一个或多个替换或缺失，和253、310、318、320、322或331位的至少一个替换。另一个CH2域示例是包含L234、L235、G237、E318、K320和K322位的氨基酸替换的改变了的人IgG1CH2域。
某些实施方式中，第一单链多肽的CH3域是包含T366W的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，并且第二单链多肽的CH3域是包含Y407A替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域。另一些实施方式中，第一单链多肽的CH3域是包含T366Y替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，并且第二单链多肽的CH3域是包含Y407T替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域。另一些实施方式中，第一单链多肽的CH3域是包含T366W替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，并且第二单链多肽的CH3域是包含T366S、L368A和Y407V替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域。另一些实施方式中，第一单链多肽的CH3域是包括Y407A替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，并且第二单链多肽的CH3域是包括T366W替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域。另一些实施方式中，第一单链多肽的CH3域是包括Y407T替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，并且第二单链多肽的CH3域是包括T366Y替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域。另一些实施方式中，第一单链多肽的CH3域是包括T366S、L368A和Y407W替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，并且第二单链多肽的CH3域是包括T366W替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域。某些实施方式中，第一和第二单链多肽的绞链都是免疫球蛋白绞链区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD或IgE绞链。某些实施方式中，免疫球蛋白绞链是野生型免疫球蛋白绞链。另一些实施方式中，免疫球蛋白绞链是选自SEQIDNO:232、234、240、664-673、675和676的改变了的免疫球蛋白绞链。
某些实施方式中，绞链区是(a)Fc区部分的氨基末端，(b)位于结合域和免疫球蛋白异二聚化域之间，(c)位于免疫球蛋白异二聚化域和Fc区部分之间，(d)在第一和第二单链多肽的氨基末端，(e)位于Fc区部分和结合域之间，或(f)在第一和第二单链多肽的羧基末端。
某些实施方式中，至少一个第一和第二单链多肽的绞链区是C型凝集素绞链区，例如NKg2A或NKg2D肽或其衍生物。
某些实施方式中，第一和第二单链多肽的绞链相同。某些实施方式中，第一和第二单链多肽的绞链不同。
某些实施方式中，第一单链多肽包含特异结合TCR复合物或其成分的结合域并且第二单链多肽包含特异结合CD19、CD79b、HLA-DR或CD20的结合域。
某些实施方式中，第一单链多肽包含特异结合CD28的结合域，并且第二单链多肽包含(a)特异结合CD79b、超级IL-6或CD86或(b)包含PDL胞外域或单IL-10的结合域。
某些实施方式中，第一单链多肽包含特异结合c-Met的结合域，并且第二单链多肽包含特异结合RON的结合域。
某些实施方式中，第一和第二单链多肽包含SEQIDNO：SEQIDNO:2和4，SEQIDNO:6和8，SEQIDNO:10和12,SEQIDNO:14和16,SEQIDNO:18和20,SEQIDNO:20和22,SEQIDNO:20和24,SEQIDNO:30和32,SEQIDNO:29和31,SEQIDNO:29和32,SEQIDNO:30和72,SEQIDNO:53和72,SEQIDNO:54和72,SEQIDNO:55和72,SEQIDNO:70和72,SEQIDNO:71和72,SEQIDNO:63和56,SEQIDNO:64和57,SEQIDNO:65和60,SEQIDNO:66和58,SEQIDNO:67和59,SEQIDNO:68和61,SEQIDNO:69和62,SEQIDNO:54和811,SEQIDNO:54和812,SEQIDNO:54和813,SEQIDNO:814和818,SEQIDNO:815和818,SEQIDNO:816和818,SEQIDNO:817和818,SEQIDNO:814和820,SEQIDNO:814和821,SEQIDNO:54和819,SEQIDNO:814和826,SEQIDNO:814和822,SEQIDNO:814和823,SEQIDNO:814和824,SEQIDNO:859和862,SEQIDNO:860和863,SEQIDNO:861和864,SEQIDNO:874和825,SEQIDNO:875和879,SEQIDNO:876和880,SEQIDNO:877和881或SEQIDNO:878和882。
另一方面，本发明提供了包含本文提供的多肽异二聚体和药学接受赋形剂的组合物。
另一方面，本发明提供能表达本文提供多肽异二聚体的表达载体，包含编码第一单链多肽的第一多核苷酸和编码第二单链多肽的第二多核苷酸。
另一方面，本发明提供包含上述表达载体的宿主细胞。
另一方面，本发明提供包含能分别表达本文提供多肽异二聚体的第一和第二单链多肽的第一和第二表达载体的宿主细胞。
另一方面，本发明提供包含生产多肽异二聚体的方法，包括(a)在合适条件下培育本文提供的宿主细胞以表达第一和第二单链多肽，和(b)从培育第一和第二单链多肽中选择分离或纯化异二聚体。
另一方面，本发明提供指导T细胞活化的方法，包含给予所需患者有效剂量的多肽异二聚体，其中包含特异结合TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε或其组合的结合域，和特异结合不同靶标的第二结合域，所述靶标例如在需要T细胞活化的位点或细胞选择的癌症特异抗原或其他抗原。
另一方面，本发明提供抑制生长、转移或肿瘤转移生长的方法，包含给予所需患者有效剂量的多肽异二聚体，所述多肽异二聚体包含特异结合TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、c-Met、RON或其组合的结合域。某些实施方式中，方法还包含给予所需患者化疗试剂或电离辐射。
另一方面，本发明提供治疗自身免疫或感染病症的方法，包含给予所需患者有效剂量的多肽异二聚体，所述多肽异二聚体包含特异结合TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD28的结合域。
另一方面，本发明提供治疗B细胞相关紊乱或疾病的方法，包含给予所需患者有效剂量的多肽异二聚体，所述多肽异二聚体包含特异结合TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ或CD3ε的结合域和特异结合CD19、CD20、CD79b或HLA-DR的第二结合域。
某些实施方式中，使用本文提供的多肽异二聚体的方法可以还包含给予所需患者第二活性试剂，例如第二多肽异二聚体，单克隆抗体或免疫球蛋白衍生融合蛋白。
附图说明
图1是二价抗CD28多肽异二聚体X0172(左)和X0172的SDS-PAGE分析(右)的图示。“NR”表示“未还原”和“Red”表示“还原”。
图2显示单价(X0124)和二价(X0172)抗CD28多肽异二聚体二者在与刺激纯化人T细胞的PMA次优浓度协同加强，当与抗CD28scFv(2E12scFv)比较时，但是小于二价抗CD28SMIP蛋白(2E12SMIP)。
图3显示二价多肽异二聚体X0172结合CD4+T细胞好于2E12scFv和单价多肽异二聚体X0124。
图4显示多肽异二聚体X0251、X0252和X0253的阳离子交换色谱(左)和在未还原(NR)和还原(Red)情况下相同多肽异二聚体的SDS-PAGE电泳分析(右)。
图5显示多肽异二聚体X0252的质谱分析，显示异二聚体是主导种类。
图6显示多肽异二聚体X0283和X0284在未还原(NR)和还原(Red)情况下SDS-PAGE电泳分析(左)和多肽异二聚体X0283的阳离子交换色谱。
图7显示通过多肽异二聚体X0283与CD86直接连接，通过分析检测，用反应单位(Ru)对时间作图(左)，和X0283的图示。
图8A和8B显示双特异性抗RON和抗CD3构建物(多肽异二聚体S0268和蝎(Scorpion)蛋白S0266)结合MDA-MB-453细胞(A)以及结合分离的T细胞(B)。
图9A和9B显示通过有抗CD19和抗CD3结合域(TSC020)或有抗CD20和抗CD3结合域(TSC021)的双特异性异二聚体，与(A)Rec1(CD19+，CD20+)细胞或(B)Jurkat(CD3+)特异结合。
图10A-10D显示对双特异性多肽异二聚体TSC054、TSC078、TSC079和bsc19x3(TSC036)反应的CD4+和CD8+T细胞增殖，与(A和B)道迪(Daudi)(CD19+)细胞或(C和D)MDA-MB-453(CD19-)细胞。
图11A和11B显示(A)道迪(RON-，CD19+)细胞或(B)BxPC-3(RON+，CD19-)细胞的铬(51Cr)释放试验中双特异性多肽异二聚体TSC054、TSC078、TSC079和S0268所诱导T细胞指引的细胞毒性。
图12显示使用双特异性多肽异二聚体TSC165、TSC166、TSC167、TSC168和TSC100在浓度0.1pM-10000pM的CD19+细胞系(道迪)诱导的靶标依赖T细胞增殖。
图13显示使用双特异性多肽异二聚体TSC127和TS165与bsc19x3BiTE作为对照在浓度0.001pM-10000pM的CD19+细胞系(道迪)诱导的靶标依赖T细胞增殖。
图14显示在CD19+细胞系(道迪)使用双特异性多肽异二聚体TSC100、TSC165、TC166、TSC167和TSC168的靶标依赖重指导T细胞细胞毒性。
发明详述
本发明提供通过免疫球蛋白CH1区和免疫球蛋白轻链恒定区(CL)的自然异二聚化形成两个不同单链多肽之间形成的多肽异二聚体。多肽异二聚体有两个或多个特异结合一个或多个靶标(如抗原、受体或配体)的结合域。另外，异二聚体的两个链，每个还包括Fc区部分(如免疫球蛋白CH2和/或CH3域)。本发明也提供核酸、载体、宿主细胞和生产多肽异二聚体的方法。
本文所述异二聚化技术有一个或多个优点：(1)多肽异二聚体的最小免疫原性潜能，因为二聚体通过免疫球蛋白CH1区和免疫球蛋白CL区的自然异二聚化形成；(2)通过两个不同单链多肽的共表达可能有效生产和纯化本发明多肽异二聚体，如实施例显示；(3)调节Fc效应功能(如CDC、ADCC、ADCP)，能通过突变上调或下调，和更长血清半衰期的能力，因为根据本发明，多肽异二聚体的每个链有Fc区部分(如免疫球蛋白CH2和CH3域)；和(4)本发明的多肽异二聚体的大小通常小于抗体分子，能使更好组织穿透，例如进入实体肿瘤。
本文提供多肽异二聚体用于指导治疗试剂或免疫效应细胞至靶细胞。例如，某些实施方式中，多肽异二聚体可以包括特异结合TCR复合物或其组分(如TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ和CD3ε)的结合域和特异结合不同靶标，例如肿瘤靶标(如c-Met、RON、CEACAM-6和PSMA)或B细胞靶标(如CD19、CD79b、HLA-DR和CD20)的另一个结合域。特异对第二个不同靶标的结合域对其靶标的亲和性可以比对TCR复合物或其组分如CD3的结合域亲和性更高。所述多肽异二聚体优选首先结合肿瘤靶标或B细胞靶标并且随后引入T细胞到表达肿瘤靶标或B细胞靶标的肿瘤或癌症细胞，并且用于抑制生长、转移或肿瘤(包括B细胞癌症)转移生长。本文提供多肽异二聚体的其它用途包括指导T细胞活化和治疗自体免疫或感染病症。
本文所用章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述客体。本文引用的包括但不限于专利、专利申请、文章、书本和条约在内的所有文件或文件的部分，在此通过引用将其全文明确纳入用于任何目的。当一份或多份所纳入文件或文件的部分定义的术语与本申请中该术语的定义冲突时，以本申请中出现的定义为准。
在本说明书中，任何浓度范围、百分数范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值，适当时也包括其分数值(如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。除非另有说明，本文所用的“约”指所述范围、数值、序列或结构的±20％。应理解，除非另有说明或上下文注明，本文所用术语“一个”和“一种”指“一个或多个”所列举的组分。替代物的使用(例如“或”)应理解为所述替代物中的一个、两个或其任何组合。本文所用术语“包括”和“包含”可作为同义词使用。此外，应理解本文所述衍生自本文所述结构和取代基(如域，区，铰链和接头)的各种组合的单个单链多肽或异二聚体就好像各单链多肽或异二聚体单独列出那样相同的程度。因此，特定组件形成单个单链多肽或异二聚体的选择属于本发明范围内。
如本文所用，若某蛋白质除数个结构域外的其它部分(例如，在氨基或羧基末段或两个结构域之间的氨基酸)组合起来最多占该多肽或蛋白长度的20％(例如，最多15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)且对不同结构域的活性(例如，结合域的靶结合亲和力，Fc区部分的活性，和免疫球蛋白异二聚体结构域在促进异二聚体化中的能力)无显著影响(即，不使该活性降低超过50％，例如超过40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)，则该多肽或蛋白质“基本组成为”该数个结构域(例如，特异性结合靶标的结合域、铰链、免疫球蛋白异二聚体结构域，Fc区恒定结构域部分)。在某些实施方式中，蛋白(例如，单链多肽)基本组成为能特异性结合靶标的结合域，免疫球蛋白异二聚体结构域，铰链，和Fc区部分，并可包含在该蛋白的氨基-和/或羧基-末段或在两个不同结构域之间(例如，结合域与免疫球蛋白异二聚体结构域之间，免疫球蛋白异二聚体结构域与铰链之间，和/或铰链与Fc区部分之间)的接头氨基酸。
本文使用“多肽异二聚体”或“异二聚体”涉及从不同单链多肽形成的二聚体。所述术语不包括从四个单链多肽(即两轻链和两重链)形成的抗体。“二聚体”涉及包括两个亚基通过一种或多种分子内力，包括共价键(如二硫键)和其他互相作用(如静电互相作用、盐桥、氢键和疏水互相作用)，互相结合的生物实体，并且在合适情况下(如在生理情况下，在适合表达、纯化和/或存储重组蛋白的合适水溶液下，或非变性和/或非还原电泳情况下)稳定。
“单链多肽”是单独、线形和毗连排列的共价连接的氨基酸。其不包括两个以非线形方式连接一起的多肽链，例如通过链间二硫键(如半个免疫球蛋白分子中，通过二硫键连接轻链和重链)。某些实施方式中，单链多肽可以有或形成一个或多个链间二硫键。
本文使用“免疫球蛋白异二聚体域”，指优选与另一个单链多肽的不同免疫球蛋白域作用或结合的单链多肽的免疫球蛋白域，其中不同异二聚体域的互相作用实质贡献或有效提高第一和第二单链多肽的异二聚化(如在不同单链多肽之间形成二聚体，也称为“异二聚体”)。异二聚体域之间的互相作用“实质贡献或有效提高”第一和第二单链多肽的异二聚化，如果在没有第一单链多肽的异二聚体域(HD-I)和/或第二单链多肽的异二聚体域情况下，第一和第二单链多肽之间的二聚化统计学明显降低。某些实施方式中，当第一和第二单链多肽共表达时，至少60％，至少约60％-约70％，至少约70％-约80％，至少约80％-约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％，和至少约90％-约92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％的第一和第二单链多肽互相形成异二聚体。本发明的代表性免疫球蛋白异二聚体域包括本文提供的免疫球蛋白CH1区，免疫球蛋白CL区(如Cκ或Cλ同种型)，或其衍生物，包括野生型免疫球蛋白CH1和CL区和改变(突变)的免疫球蛋白CH1和CL区。
本文所用“结合域”或“结合区”指具有特异性识别并结合靶标(如CD3、TCR、CD28、c-Met、RON)的能力的蛋白质、多肽、寡肽或肽。结构域包括生物分子或另一感兴趣靶标的任何天然产生、合成、半合成或重组产生的结合伙伴。示例性结合域包括单链抗体可变区(例如，域抗体、sFv、scFv、Fab)，受体胞外域(例如，c-Met、RON)或者配体(例如，细胞因子、趋化因子)。已知鉴定特异性结合特定靶标的本发明结合域的各种实验方法，包括蛋白质印迹、ELISA或Biacore分析。
若结合域和其融合蛋白结合靶标的亲和力或Ka(即，特定结合相互作用以1/M为单位的平衡结合常数)等于或大于105M-1，而不显著结合测试样品中存在的其它组分，则其“特异性结合”该靶标。结合域(或其融合蛋白)可以分类成“高亲和”结合域(或其融合蛋白)和“低亲和”结合域(或其融合蛋白)。“高亲和力”结合域指Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1或至少1013M-1的结合域。“低亲和性”结合域指Ka为至多107M-1、至多106M-1、至多105M-1的结合域。或者，亲合力可定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)，单位是M(如10-5M-10-13M)。本发明所述结合域多肽和单链多肽的亲和力可采用常规技术很容易地测定(参见例如，Scatchard等(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；和美国专利号5,283,173，5,468,614，或等效物)。
“T细胞受体”(TCR)与CD3在T细胞表面发现的分子，通常负责抗原与主要组织相容复合物(MHC)分子结合。大部分T细胞中包括高度可变α和β链的二硫键连接的异二聚体。其他T细胞中，表达由可变γ和δ链构成的其他受体。TCR的每个链是免疫球蛋白超级家族的成员，并且有一个N末端免疫球蛋白可变域，一个免疫球蛋白恒定区，穿膜区和C末端短的胞质尾(见Abbas和Lichtman，CellularandMolecularImmunology(细胞和分子免疫学)(第5版)，编者：Saunders，费城，2003；Janeway等，Immunobiology:TheImmuneSysteminHealthandDisease(免疫生物学：健康和疾病中的免疫系统)，第4版，当前生物学出版社(CurrentBiologyPublications)，第148、149和172页，1999)。用于本文的TCR可以从多个动物种类，包括人，小鼠，鼠或其他哺乳动物。
本领域中“CD3”已知为六链的多蛋白复合物(见Abbas和Lichtman，2003；Janeway等，第172和178页，1999)。哺乳动物中，复合物包括CD3γ链，CD3δ链，两个CD3ε链，和CD3ζ链的同源二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是免疫球蛋白超级家族的高度相关细胞表面蛋白，包含单个免疫球蛋白域。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的穿膜区带负电，特征为使所述链结合正电荷的T细胞受体链。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的胞内尾每个包含单个保守基序，已知为酪氨酸免疫受体活性基序或ITAM，其中每个CD3ζ有三个。认为ITAM对TCR复合物的信号能力重要。用于本文的CD3可以从多个动物种类，包括人，小鼠，鼠或其他哺乳动物。
本文使用的“TCR复合物”涉及TCR与CD3结合形成的复合物。例如，TCR复合物能由CD3γ链，CD3δ链，两个CD3ε链，CD3ζ链同源二聚体，TCRα链和TCRβ链。或者，TCR复合物能由CD3γ链，CD3δ链，两个CD3ε链，CD3ζ链同源二聚体，TCRα链和TCRβ链组成。
本文使用的“TCR复合物的成分”，涉及TCR链(如TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ)，CD3链(如CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ)，或由两个或多个TCR链或CD3链形成的复合物(如TCRα和TCRβ复合物，TCRγ和TCRδ复合物，CD3ε和CD3δ复合物，CD3γ和CD3ε复合物，或TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ和两个CD3ε链的亚TCR复合物)。
抗体技术领域技术人员理解的术语各自具有所述领域获得的含义，除非本文作明确的不同定义。已知抗体具有可变区、铰链区和恒定区。有关免疫球蛋白结构和功能的综述参见例如Harlow等编，Antibodies:ALaboratoryManual(抗体：实验室手册)，第14章(冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratory)，冷泉港(ColdSpringHarbor)，1988)。
例如，术语“VL”和“VH”分别指来自抗体轻链和重链的可变结合区。可变结合区由离散的良好限定的亚区构成，所述区称为“互补决定区”(CDR)和“框架区”(FR)。术语“CL”指“免疫球蛋白轻链恒定区”或“轻链恒定区”，即来自抗体轻重链的恒定区。术语“CH”指“免疫球蛋白重链恒定区”或“重链恒定区”，其可进一步根据抗体同种型细分入CH1、CH2和CH3(IgA、IgD、IgG)或CH1、CH2、CH3和CH4结构域(IgE、IgM)。"Fab"(片段抗原结合)是抗体结合抗原的部分，包括可变区和经链间二硫键与轻链连接的重链CH1。
本文所用"Fc区恒定结构域部分"或"Fc区部分"指抗体Fc片段("可结晶片段"区或Fc区)的重链恒定区区段，其可包括一个或多个恒定结构域，例如CH2、CH3、CH4或其任意组合。作为背景，Fc区负责免疫球蛋白的效应物功能如ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性)、ADCP(抗体依赖的细胞吞噬作用)、CDC(补体依赖性细胞毒性)和补体结合、结合Fc受体(例如，CD16、CD32、FcRn)、体内半衰期比缺少Fc区的多肽更长、蛋白A结合、可能甚至负责胎盘转移(参见Capon等Nature，337:525(1989))。
此外，抗体具有铰链序列，其通常位于Fab和Fc区之间(但该铰链的下部可包括Fc区的氨基末端部分)。作为背景，免疫球蛋白铰链作为柔性间隔物，允许Fab部分在空间内自由移动。与恒定区相反，铰链在结构上不同，其序列和长度在免疫球蛋白类别甚至在亚类之间都有变化。例如，人IgG1铰链区为自由柔性，允许Fab片段绕其对称轴转动并在以两个重链间二硫桥中第一个为中性的球内移动。作为对比，人IgG2铰链相对短且含有由四个重链间二硫桥稳定的刚性多脯氨酸双螺旋，二硫桥限制挠性。人IgG3铰链与其它亚类的区别在于其独特的延展铰链区(约IgG1铰链的四倍长)，含62个氨基酸(包括21个脯氨酸和11个半胱氨酸)，形成非挠性多脯氨酸双螺旋并提供更大的柔性，因为Fab片段相对远离Fc片段。人IgG4的铰链短于IgG1，但与IgG2长度相同，且其柔性介于IgG1和IgG2。
根据结晶图象研究，可按照功能和结构将IgG绞链结构域再分成以下三个区：上部、核心或中部和下部铰链区(Shin等，ImmunologicalReviews130:87(1992))。示范性上部绞链区包括IgG1中发现的EPKSCDKTHT(SEQIDNO：227)、IgG2中发现的ERKCCVE(SEQIDNO：211)、IgG3中发现的ELKTPLGDTTHT(SEQIDNO：245)或EPKSCDTPPP(SEQIDNO：246)、以及IgG4中发现的ESKYGPP(SEQIDNO：247)。示例性中部或核心铰链区包括如IgG1和IgG2中所见CPPCP(SEQIDNO:228)、如IgG3中所见CPRCP(SEQIDNO:248)和如IgG4中所见CPSCP(SEQIDNO:249)。尽管IgG1、IgG2和IgG4抗体各显示具有单个上部和中部铰链，IgG3具有串联的4个铰链——1个ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQIDNO:250)和3个EPKSCDTPPPCPRCP(SEQIDNO:251)。
IgA和IgD抗体看来缺少IgG-样核心区，IgD看来具有两个串联的上部绞链区(参见SEQIDNO：222和252)。SEQIDNO：215和216中列出了IgA1和IgA2抗体中发现的示范性野生型上部铰链区。
相反，IgE和IgM抗体包含具有铰链样性质的CH2域而非典型铰链区。SEQIDNO:253(VCSRDFTPPTVKILQSSSDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCA)和SEQIDNO:254(VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVP)分别列出IgE和IgM的示例性野生型CH2上部铰链样序列。
本文所用“铰链区”或“铰链”指(a)免疫球蛋白铰链区(例如，由上部和核心区构成)或其功能变体，包括野生型和经改变的免疫球蛋白铰链，(b)凝集素结构域间区或其功能变体，(c)分化群(CD)分子杆区或其功能变体，或(d)连接免疫球蛋白V样或免疫球蛋白C样结构域的细胞表面受体(结构域间区)的部分。
本文所用“野生型免疫球蛋白铰链区”指在抗体重链中发现的位于CH1和CH2结构域之间并连接这两个域(就IgG、IgA和IgD而言)或位于CH1和CH3结构域之间并连接这两个域(就IgE和IgM而言)的天然产生的上部和中部铰链氨基酸序列。在某些实施方式中，野生型免疫球蛋白铰链区序列是人序列，且可以包含人IgG铰链区。SEQIDNO:215(IgA1铰链)、216(IgA2铰链)、217(IgD铰链)、667(IgG1铰链)、219(IgG2铰链)、220(IgG3铰链)和221(IgG4铰链)给出了示例性人野生型免疫球蛋白铰链区。
“改变的野生型免疫球蛋白铰链区”或“改变的免疫球蛋白铰链区”指(a)有至多30％氨基酸改变(例如，至多25％、20％、15％、10％或5％氨基酸取代或缺失)的野生型免疫球蛋白铰链区，或(b)长度约5个氨基酸(例如，约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸)直至约120个氨基酸(例如，长度为约10-约40个氨基酸或约15-约30个氨基酸或约15-约20个氨基酸或约20-约25个氨基酸)并有至多约30％氨基酸改变(例如，至多约25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％氨基酸取代或缺失或其组合)的野生型免疫球蛋白铰链区的部分，且具有SEQIDNO:228、248或249中所示IgG核心铰链区。
“肽接头”指连接重链可变区与轻链可变区并提供与两个亚接合结构域间相互作用相容的间隔物功能的氨基酸序列，从而所得多肽保留含同一轻链和重链可变区的抗体对同一靶分子的特异性结合亲和性。某些实施方式中，接头由5-约35个氨基酸构成，例如，约15-约25个氨基酸。
“连接氨基酸”或“连接氨基酸残基”指在两个相邻区或单链多肽的结构域之间的一个或多个(如约2-10个)氨基酸残基，例如在铰链和相邻Fc区部分之间或铰链和相邻结合域之间或连接两个免疫球蛋白可变域的肽接头和相邻免疫球蛋白可变域之间。连接氨基酸可以来源于单链多肽的构建设计(如在编码单链多肽的核酸分子结构的限制性酶位点使用得到的氨基酸残基)。
“CH3和CH1或CL之间的接头”涉及CH3域(如野生型CH3或突变CH3)的C末端和CH1域或CL域(如Ck)的N末端之间的一个或多个(如约2-12)氨基酸残基。
“野生型免疫球蛋白区”或“野生型免疫球蛋白结构域”指来自各种免疫球蛋白类别或亚类(包含例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM)和来自各种物种(包含例如人、绵羊、小鼠、大鼠和其它哺乳动物)的天然产生的免疫球蛋白区或结构域(例如，天然产生的VL、VH、铰链、CL、CH1、CH2、CH3或CH4)。示例野生型人CH1区显示在SEQIDNO:114、186-192和194，野生型人Cκ区在SEQIDNO:112，野生型人Cλ区在SEQIDNO:113和224-226，野生型人CH2域在SEQIDNO:115、195-201和203，野生型人CH3域在SEQIDNO:116、204-210和212，和野生型人CH4域在SEQIDNO:213和214。
“改变的免疫球蛋白区”或“改变的免疫球蛋白结构域”“突变的免疫球蛋白结构域”等，指与野生型免疫球蛋白区或结构域(例如，野生型VL、VH、铰链、CL、CH1、CH2、CH3或CH4)的序列相同性至少为75％(例如，80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％)的免疫球蛋白区或域。例如，“改变的免疫球蛋白CH1区”或“改变的CH1区”指与野生型免疫球蛋白CH1区(例如，人CH1)的序列相同性为至少75％(例如，80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％)的CH1区。类似地，“改变的免疫球蛋白CH2结构域”或“改变的CH2结构域”指与野生型免疫球蛋白CH1区(例如，人CH2)的序列相同性为至少75％(例如，80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％)的CH2结构域。
本文所用"序列相同性"指对准并在必要时引入缺口以实现最大百分序列相同性后，一个序列中氨基酸残基与与另一参比多肽内氨基酸残基相同的百分数，且任何保守取代均不视为序列相同性的百分。百分数序列相同性数值是由NCBIBLAST2.0软件产生，如Altschul等，(1997)"GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms(缺口BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白数据库检索程序)"，NucleicAcidsRes.25:3389-3402中所定义，参数设定为默认值。
在某些实施方式中，改变的免疫球蛋白结构域仅含有野生型免疫球蛋白结构域的保守氨基酸取代。在某些其它实施方式中，改变的免疫球蛋白结构域仅含有野生型免疫球蛋白结构域的非保守氨基酸取代。在另一些实施方式中，改变的免疫球蛋白结构域含有保守和非保守的氨基酸取代。
本领域将“保守取代”认定为将某氨基酸用具有类似性质的另一氨基酸取代。本领域熟知示例性保守取代(参见例如WO97/09433，第10页，1997年3月13日公开；Lehninger，Biochemistry(生物化学)，第2版，沃斯出版公司(WorthPublishers,Inc.)，纽约州纽约市(1975)，第71-77页；Lewin,GenesIV(基因IV)，纽约的牛津大学出版社和马萨诸塞州剑桥的细胞出版社(CellPress)(1990)，第8页)。在某些实施方式中，保守取代包括亮氨酸取代为丝氨酸。
本文所用术语"衍生(物)"指将肽的一个或多个氨基酸残基通过化学或生物手段用或不用酶来修饰，例如通过糖基化、烷基化、酰基化、酯形成或酰胺形成。通常，"衍生物"不同于"类似物"，母体多肽可以是产生"衍生物"的起始材料，但母体多肽不一定用作产生"类似物"的起始材料。衍生物可具有与母体多肽不同的化学、生物或物理特性。例如，与母体多肽相比，衍生物可能亲水性更高或反应性改变(例如具有改变其靶点亲和力的氨基酸变化的CDR)。
如本文所用，除非另有提出，免疫球蛋白分子的可变区中氨基酸残基位置的编号按Kabat编号惯例(Kabat，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白质序列)，第5版，马里兰州贝塞斯达：公共健康服务部(PublicHealthServices)，国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)(1991))，且免疫球蛋白分子恒定区中氨基酸残基位置的编号按照EU命名法(Ward等，1995Therap.Immunol.2:77-94)。
“受体”是存在于细胞的质膜或细胞质中的蛋白质分子，信号分子(即配体，如激素、神经递质、毒素、细胞因子)可与其结合。信号分子与受体的结合导致受体的构象改变，这通常启动细胞应答。但是，一些配体只是阻断受体而不引起任何应答(例如拮抗剂)。一些受体蛋白是外周膜蛋白。很多激素和神经递质受体为嵌入细胞膜磷脂双层中的跨膜蛋白，而另一类主要受体是胞内蛋白例如甾体和胞内分泌肽激素受体。
“B细胞相关紊乱或疾病”或“异常B细胞活性相关紊乱或疾病”指(如造成或从中产生)与异常B细胞活性或偏离正常、合适或期望过程活性的相关紊乱或疾病例如，B细胞相关紊乱或疾病可以包括有损害的或缺陷的DNA或其他细胞成分的B细胞的不合适增殖。异常B细胞活性可以包括细胞增殖，特征为不合适高水平的B细胞分裂，不合适低水平的B细胞凋亡，或两者皆具。例如，所述疾病可以有单个或多个B细胞，B细胞组或组织的局部异常增殖，不管癌症或非癌症，良性或恶性。B细胞相关紊乱或疾病也可包括异常抗体生产，例如自身抗体生产，或当需要产生正常水平抗体时而过量生产。本文还包括可以发生在某些B细胞亚群而不在其他亚群发生的异常B细胞活性，或可以包括T细胞的不合适刺激，例如通过不合适的至T细胞的抗原递呈或通过其他B细胞通路。B细胞相关紊乱或疾病的示例包括B细胞肿瘤或B细胞癌症(如B细胞淋巴瘤，B细胞白血病或B细胞骨髓瘤)，其特征为产生自身抗体(如自体免疫疾病)或炎症，或其特征为由于递呈至T细胞的不合适B细胞抗原对T细胞的不合适的刺激，或由其他B细胞相关的通路所引起。
“治疗”，“处理”或“缓解”指治疗性处理或防范性/预防性处理。若接受处理的个体中的至少一种疾病症状有改善或者处理可延迟个体中进行性疾病的恶化或防止其它相关疾病的发生，则处理为治疗性。
特定结合分子或化合物的“治疗有效量(或剂量)”或“有效量(或剂量)”指该化合物的量足以导致所治疗疾病的一种或多种症状以统计学限制性方式得以缓解。在涉及单独给予单个活性组分时，治疗有效剂量仅涉及该组分。涉及组合物时，治疗有效剂量指依序或同时(在同一制剂中或是在不同制剂中同时)给予的活性组分能导致治疗效果的总量。
术语“药学上可接受的”指用本领域熟知途径给予时不产生过敏性或其它延展不良反应的分子实体和组合物。
“有需要的患者”指有风险罹患或正患有某个能用本文所述多肽异二聚体或其组合物治疗或缓解的疾病、失调或病症的患者。
本文所用“免疫球蛋白衍生的融合蛋白”指包含至少一个免疫球蛋白区如VL、VH、CL、CH1、CH2、CH3和CH4结构域的融合蛋白。该免疫球蛋白区可以是野生型免疫球蛋白区或经改变的免疫球蛋白区。示例性免疫球蛋白衍生的融合蛋白包括单链可变抗体片段(scFv)(参见例如，Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-83,1988)，SMIPTM蛋白(参见美国专利公布号2003/0133939、2003/0118592和2005/0136049)，PIMS蛋白(参见PCT专利申请公布号WO2009/023386)，和多功能结合蛋白(例如SCORPIONTM和Xceptor融合蛋白)(参见，PCT专利申请公布号WO2007/146968，美国专利申请公布号2006/0051844和美国专利号7,166,707)。
其它定义贯穿本说明书全文。
多肽异二聚体
一方面，本发明提供由不同单链多肽结合形成的多肽异二聚体。第一单链多肽(SCP-I)包括，基本包括或包括，特异结合从一个到四个靶标的一个或四个结合域，铰链(H-I)，免疫球蛋白异二聚体域(HD-I)和Fc区部分(FRP-I)，而第二单链多肽(SCP-II)基本包括或包括，特异结合从一个到四个靶标的一个或四个结合域，铰链(H-II)，免疫球蛋白异二聚体域(HD-II)和Fc区部分(FRP-II)，前提是多肽异二聚体包括至少两个特异结合一个或多个靶标，例如至少两个不同靶标，的结合域。H-I和H-II可以有相同序列，但可以不同。HD-I可包括免疫球蛋白CH1区，和HD-II可包括免疫球蛋白CL区。或者，HD-I可包括免疫球蛋白CL区，和HD-II可包括免疫球蛋白CH1区.FRP-I和FRP-II可以有相同序列，但可以不同。本发明的多肽异二聚体的单个成分在本文细节描述。
结合域
如上述，本发明的多肽异二聚体包括两个单链多肽。一个单链多肽包括特异结合一个或四个靶标的一个或四个结合域，和多肽异二聚体的另一个单链多肽包括特异结合一个或四个靶标的一个或四个结合域。多肽异二聚体的结合域总数范围约2-8个，并且结合域结合的不同靶标的总数范围约1-8个，例如2-8个，2-4个，2-3个或2个。
如果多肽异二聚体的单链多肽包括单个结合域，结合域可以定位在单链多肽的Fc区部分的氨基或羧基末端。例如，包括两个结合域的单链多肽可以一个定位在单链多肽的Fc区部分的氨基末端而另一个在羧基末端，或两个结合物可以都在Fc区部分的氨基末端或羧基末端。另一个实施例中，单链多肽可以包括三个结合域，其中(a)两个结合域在SCP-I或SCP-II的不同单链蛋白的氨基末端，而第三个结合域在Fc区部分的羧基末端，(b)两个结合域在SCP-I或SCP-II的不同单链蛋白的羧基末端，而第三个结合域在Fc区部分的氨基末端。还在进一步实施例中，多肽异二聚体可以包括四个结合域，其中两个结合域定位在不同链的Fc区部分的氨基末端，而其他两个结合域定位在不同链的Fc区部分羧基末端。或者，任何所述实施方式中，两个结合域可以互相串联连接，并且定位在SCP-I或SCP-II或两者上，取决于出现结合域的数目-使用串联堆叠，当5-8个结合域结合出现在SCP-I和SCP-II。
通过结合域结合靶标调节靶标(如受体或配体)或其他分子之间的互相作用。某些实施方式中，通过结合域结合靶标(如受体)刺激靶标的某些功能(如信号转导)或使不同靶标为生物效果而更接近(如指导T细胞到肿瘤以激活T细胞)。某些其他实施方式中，通过结合域结合靶标阻止靶标和其他分子之间的互相作用并且因此干扰、降低或消除某些靶标功能。
可以在感兴趣细胞上(“靶标细胞”)发现本发明多肽异二聚体所含结合域特异性结合的靶标分子，或与感兴趣细胞相关。示例靶标细胞包括癌症细胞，与自体免疫疾病或紊乱或感染疾病或紊乱相关的细胞，B细胞和T细胞。靶标分子也可不跟细胞结合。不跟细胞结合的示例靶标分子包括可溶蛋白，分泌蛋白，沉淀蛋白和胞外结构(基质)蛋白。
某些实施方式中，本发明的多肽异二聚体特异结合选自T细胞靶标、肿瘤抗原、B细胞靶标、促干扰细胞因子或趋化因子、促肿瘤细胞因子或生长因子，血管原性试剂、Fc受体、转铁蛋白受体、受体酪氨酸激酶(RTK)、TNFSFR或其任意组合的靶标。例如，本发明的多肽异二聚体特异结合T细胞靶标和肿瘤靶标。
某些实施方式中，本发明的多肽异二聚体特异结合T细胞靶标，例如TCR复合物或其成分(如TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、和CD3ε)，CD28，PD-1，HVEM，BTLA，CD80，CD86，GITR和TGFBR。
某些实施方式中，本发明的多肽异二聚体特异结合TCR复合物或其成分。例如，某些实施方式中，结合域特异结合单独人CD3链(如人CD3γ链，人CD3δ链和人CD3ε链)或单独人CD3链的两个或多个组合(如人CD3γ和人CD3ε的复合物或人CD3δ和人CD3ε的复合物)。某些实施方式中，结合域特异结合人CD3ε链。其他某些实施方式中，结合域特异结合一个或多个人TCRα、人TCRβ或从人TCRα和TCRβ形成异二聚体。其他某些实施方式中，本发明的结合域结合一个或多个人CD3链与一个或多个人TCR链形成的复合物，例如从人CD3γ链，人CD3δ链或人CD3ε链与人TCRα链或人TCRβ链形成的复合物。所述任何实施方式中，本发明的多肽异二聚体也可以结合肿瘤靶标。
某些实施方式中，一个或多个本发明的多肽异二聚体的结合域特异结合肿瘤靶标，包括RON、c-Met、CEACAM-6、PSMA、EpCAM、CEA、PCTA-1、STEAP-1、PSCA、ALCAM(CD166)、EphA2、CD151、CA-125、MUC-1、MAGE-1、TROP2、IGF1R、CD44v6、CD151、TGFBR2、GHRHR、GHR、IL-6R、gp130、TNFR2、OSMRβ、Patched-1、卷曲蛋白(Frizzled)、Robo1、LTβT、CD80、CD81、CD86、CCR5、HER-3、HER-4、EGFR、CEA、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5b、MUC7、βhCG、Lewis-Y、CD33、CD30、神经节苷脂GD3、9-O-乙酰基-GD3、GM2、GloboH、岩藻糖GM1、聚SA、GD2、碳脱水酶IX(MN/CAIX)、CD44v6、SonicHedgehog(Shh)、Wue-1、血浆细胞抗原、(膜结合)IgE、黑色素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、CCR8、TNFα前提、STEAP-2、间皮素、A33抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、Ly-6；桥粒核心糖蛋白4、E-钙粘蛋白新表位、胎儿乙酰基胆碱受体、CD25、CA19-9标记、CA-125标记和缪勒管激素抑制因子(MuellerianInhibitorySubstance(MIS))受体II、sTn(唾酸化Tn抗原；TAG-72)、FAP(成纤维细胞活化)、內皮唾酸蛋白、EGFRvIII、LG、SAS、CD63、B7-H3或其任意组合。
某些实施方式中，一个或多个本发明的多肽异二聚体的结合域特异结合B细胞靶标，例如CD19、CD20、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD70、CD79b、HLA-DR或其任意组合。
某些实施方式中，一个或多个本发明的多肽异二聚体的结合域特异结合促干扰细胞因子或趋化因子，例如TNFα、IL-6、超级IL-6、IL-2、IL-1、IL-8、IP-10、IFNγ、IFNα、RANKL、FASL、TGFβ、IL7、IL10、IL17A/F、TWEAK、CSF2、IGF1、IGF2或BLyS/APRIL或其任意组合。
某些实施方式中，一个或多个本发明的多肽异二聚体的结合域特异结合促肿瘤细胞因子或生长因子，例如HGF、MSP、EGF(包括epiregulin、herregulin、β-regulin、神经调节蛋白)、HIF-1α、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、TNFα、IL-6、超级IL-6、IL-8、Wnt、sHH、TGFβ、PDGF或其任意组合。
某些实施方式中，一个或多个本发明的多肽异二聚体的结合域特异结合血管发生试剂，例如PDGFR、VEGFR1-4、NRP1、促血管生成素2、c-Met或其任意组合。
某些实施方式中，一个或多个本发明的多肽异二聚体的结合域特异结合Fc受体，例如CD64、CD32A、CD32B、CD16、FcRn或其任意组合。
某些实施方式中，本发明的多肽异二聚体特异结合转铁蛋白受体，例如CD71。
某些实施方式中，一个或多个本发明的多肽异二聚体的结合域特异结合受体酪氨酸激酶，例如EGFR、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、EphA2、c-Met、RON或其任意组合。
某些实施方式中，一个或多个本发明的多肽异二聚体的结合域特异结合TNFSFR，例如TNFR1、TNFR2、TWEAKR、TACI、BAFF-R、BCMA、FAS、OX40、GITR、4-1-BB、LtbetaR、HVEM、RANK或其任意组合。
某些实施方式中，一个或多个本发明的多肽异二聚体的结合域特异结合超级IL-6、IL-10、LIGHT、CD40、PDL1、PDL2或其任意组合。
某些实施方式中，一个或多个本发明的多肽异二聚体的结合域是下述一个分子的激动剂：IL-10、HLA-G、HGF、IL-35、PD-1、BTLA、TNFR1、TNFR2、DR4、DR5、TWEAKR、FAS或其任意组合。
结合域可以是特异性结合感兴趣靶标的任意肽。结合域的来源包括来自人、啮齿类、禽类和羊类在内的不同物种的抗体可变区(其形式可为抗体、sFv、scFv、Fab、或可溶VH结构域或结构域抗体)。结合域的其它来源包括来自其它物种的抗体可变区，这些物种如羊驼(来自骆驼、单峰骆驼或美洲驼；Ghahroudi等(1997)FEBSLetters414(3):521-526；Vincke等(2009)JournalofBiologicalChemistry(2009)284:3273-3284；Hamers-Casterman等(1993)Nature，363:446和Nguyen等(1998)J.Mol.Biol.，275:413)，铰口鲨(Roux等(1998)Proc.Nat'l.Acad.Sci.(USA)95:11804)，科氏兔银鲛(spottedratfish)(Nguyen等(2002)Immunogenetics，54:39)，或七鳃鳗(Herrin等，(2008)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)105:2040-2045和Alder等，(2008)NatureImmunology9:319-327)。这些抗体显然可以仅用重链可变区形成抗原结合区，即这些功能抗体是仅有重链的同二聚体(称作“重链抗体”)(Jespers等(2004)NatureBiotechnology22:1161-1165；Cortez-Retamozo等，(2004)CancerResearch64:2853-2857；Baral等(2006)NatureMedicine12:580-584和Barthelemy等(2008)JournalofBiologicalChemistry283:3639-3654)。
本发明的结合域的示例抗CD3抗体可以衍生自包括Cris-7单克隆抗体(Reinherz,E.L.等(编)，LeukocytetypingII.(II型白细胞)，普林格出版社(SpringerVerlag)，纽约(1986))，BC3单克隆抗体(Anasetti等(1990)J.Exp.Med.172:1691)，OKT3(奥索(Ortho)多中心移植研究组(1985)N.Engl.J.Med.313:337)和其衍生物，例如OKT3ala-ala(Herold等(2003)J.Clin.Invest.11:409)，visilizumab(Carpenter等(2002)Blood99:2712)，和145-2C11单克隆抗体(Hirsch等(1988)J.Immunol.140:3766)。示例抗TCR抗体是H57单克隆抗体(Lavasani等(2007)ScandinavianJournalofImmunology65:39-47)。
本发明所述结合域的替代来源包括编码随机肽文库的序列或编码其它非抗体支架的环区中工程改造的多种氨基酸的序列，例如血纤蛋白原结构域(参见例如，Weisel等(1985)Science230:1388)、Kunitz结构域(参见例如，美国专利号6,423,498)、锚蛋白重复结构域(Binz等(2003)JournalofMolecularBiology332:489-503和Binz等(2004)NatureBiotechnology22(5):575-582)，纤连蛋白结合域(Richards等(2003)JournalofMolecularBiology326:1475-1488；Parker等(2005)ProteinEngineeringDesignandSelection18(9):435-444和Hackel等(2008)JournalofMolecularBiology381:1238-1252)，胱氨酸结小蛋白(Vita等(1995)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)92:6404-6408；Martin等(2002)NatureBiotechnology21:71-76和Huang等(2005)Structure13:755-768)，三角形四肽重复结构域(Main等(2003)Structure11:497-508和Cortajarena等(2008)ACSChemicalBiology3:161-166)，富亮氨酸重复结构域(Stumpp等(2003)JournalofMolecularBiology332:471-487)，脂质运载蛋白结构域(参见例如，WO2006/095164，Beste等(1999)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)96:1898-1903和等(2009)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)106:8198-8203)，V样结构域(参见例如，美国专利申请公布号2007/0065431),C-型凝集素结构域(Zelensky和Gready(2005)FEBSJ.272:6179；Beavil等(1992)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)89:753-757和Sato等(2003)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)100:7779-7784)，mAb2或FcabTM(参见例如，PCT专利申请公布号WO2007/098934；WO2006/072620)，等等(Nord等(1995)ProteinEngineering8(6):601-608；Nord等(1997)NatureBiotechnology15:772-777；Nord等(2001)EuropeanJournalofBiochemistry268(15):4269-4277和Binz等(2005)NatureBiotechnology23:1257-1268)。
可根据本文所述方法或本领域已知的各种方法产生本发明结合域(参见例如，美国专利6,291,161和6,291,158)。例如，可通过从Fab噬菌体文库筛选能特异性结合感兴趣靶标的Fab片段(参见Hoet等(2005)NatureBiotechnol.23:344)鉴定出本发明的结合域。此外，可采用在方便系统(例如，小鼠、HuMAbTC小鼠TM、美洲驼、鸡、大鼠、仓鼠、家兔等)中以感兴趣靶标作为免疫原的传统杂交瘤开发策略来开发本发明的结合域。
在某些实施方式中，多肽异二聚体包括CD86结合域，例如CTLA4胞外结构域、CD28胞外结构域或具有CD86特异性的免疫球蛋白可变区结合域(如scFv)(例如来自单克隆抗体3D1或FUN1)。在一些实施方式中，采用小于完整胞外结构域的部分。例如，可采用CTLA4胞外结构域内与CD86结合并防止CD86与CD28结合的结构域。CD86结合域可阻断CD86结合CD28，由此下调T细胞激活作用。
某些实施方式中，受体异二聚体包括IL-10激动剂，例如IL-10、单IL-10或其结构区。“单IL-10”指有分开分子的两个亚结构域以至于所述亚结构域能形成分子内二聚体的短接头(GGGSGG,SEQIDNO:760)的IL-10分子。
在其它实施方式中，多肽异二聚体包括HLA-G激动剂，例如HLA-G5、HLA-G1、HLA-G突变蛋白或其功能区；HLA-G5、HLA-G1或HLA-G突变蛋白的胞外结构域；或具有ILT2、ILT4或KIR2DL4特异性的免疫球蛋白可变区结合域(如scFv)。
在某些实施方式中，多肽异二聚体包括HGF激动剂，如HGF或其亚结构域。
在某些实施方式中，多肽结构域包括IL35激动剂，如具有IL35R、IL35或其功能区特异性的免疫球蛋白可变区结合域(如scFv)。
在某些实施方式中，多肽异二聚体包括LIGHT拮抗剂，如具有LIGHT、或HVEM胞外域或其功能区特异性的免疫球蛋白可变区结合域(如scFv)。
在某些实施方式中，多肽异二聚体包括PD-1激动剂，例如具有PD-1、PD-1配体(例如，PD-L1或PD-L2)或其功能区特异性的免疫球蛋白可变区结合域(如scFv)。
在某些实施方式中，多肽异二聚体包括BTLA激动剂，如具有BTLA、或HVEM胞外域或其功能区特异性的免疫球蛋白样可变区结合域(如scFv)。
在某些实施方式中，多肽异二聚体包括GITRL拮抗剂，如具有GITRL、或GITR胞外域、可溶GITR或其功能区特异性的免疫球蛋白样可变区结合域(如scFv)。
在某些实施方式中，多肽异二聚体包括CD40拮抗剂，例如具有CD40特异性的免疫球蛋白样可变区结合域(如scFv)。
在一些实施方式中，结合域是单链Fv片段(scFv)，其含有对感兴趣靶标特异性的VH和VL区。在某些实施方式中，所述VH和VL结构域是人结构域。示例VH区包括2E12(抗CD28)scFv的VH区，如显示在SEQIDNO:106，P2C2(抗CD79b)scFv的VH区，如显示在SEQIDNO:184，5D5(抗c-Met)scFv的VH区，如显示在SEQIDNO:258，A2(抗超级IL-6)scFv的VH区，如显示在SEQIDNO:80，3D1(抗CD86)scFv的VH区，如显示在SEQIDNO:92，MET021(抗c-Met)scFv的VH区，如显示在SEQIDNO:100，G19-4(抗CD3)scFv的VH区，如显示在SEQIDNO:103，HD37(抗CD19)scFv的VH区，如显示在SEQIDNO:117，M0042(抗HLA-DR)scFv的VH区，如显示在SEQIDNO:121，BMA031(抗TCR)scFv的VH区，如显示在SEQIDNO:828，OKT3-M(抗CD3)scFv的VH区，如显示在SEQIDNO:831和HuM291(抗CD3)scFv的VH区，如显示在SEQIDNO:835。编码A2(抗超级IL-6)和3D1(抗CD86)scFv的VH区的核酸序列分别显示在SEQIDNO:79和91。
示例VL域包括2E12(抗CD28)scFv的VL区，如显示在SEQIDNO:107，P2C2(抗CD79b)scFv的VL区，如显示在SEQIDNO:182，5D5(抗c-Met)scFv的VL区，如显示在SEQIDNO:259，A2(抗超级IL-6)scFv的VL区，如显示在SEQIDNO:84，3D1(抗CD86)scFv的VL区，如显示在SEQIDNO:96，MET021(抗c-Met)scFv的VL区，如显示在SEQIDNO:101，G19-4(抗CD3)scFv的VL区，如显示在SEQIDNO:104，HD37(抗CD19)scFv的VL区，如显示在SEQIDNO:119，M0042(抗HLA-DR)scFv的VL区，如显示在SEQIDNO:122，BMA031(抗TCR)scFv的VL区，如显示在SEQIDNO:829，OKT3-M(抗CD3)scFv的VL区，如显示在SEQIDNO:833和HuM291(抗CD3)scFv的VL区，如显示在SEQIDNO:836。编码A2(抗超级IL-6)和3D1(抗CD86)scFv的VL区的核酸序列分别显示在SEQIDNO:83和95。
在一些实施方式中，结合域是单链Fv片段(scFv)，其含有对TCR复合物或其成分特异的VH和VL域。在某些实施方式中VH和VL域是人或人化VH和VL域。示例VH域包括BC3(抗CD3)VH，OKT3(抗CD3)VH，H57(抗TCR)VH和2C11(抗CD3)VH域，如分别显示在SEQIDNO:301、303、313和317。进一步示例VH域包括Cris-7(抗CD3)VH域，例如那些显示在SEQIDNO:327和331-333。示例VL域包括BC3(抗CD3)VL，OKT3(抗CD3)VL，H57(抗TCR)VH和2C11(抗CD3)VL域，如分别显示在SEQIDNO:302、304、315和318。进一步示例VL域包括Cris-7(抗CD3)VL域，例如那些显示在SEQIDNO:328、329和330。
某些实施方式中，结合域包括或是域轻链可变区(VL)或重链可变区(VH)或两者至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％,至少99.5％或100％一致的序列，其中每个CDR包括从特异结合感兴趣靶标(如c-Met、RON、CD28、CD79b、CD3ε、TCRα、TCRβ、超级IL-6、CD86、CD19和HLA-DR)并且所述突变或衍生物仍然结合其靶标的单克隆抗体或片段或其衍生物的0个变化，或至多1、2或3个变化。
在某些实施方式中，本发明所述结合域中的VH或VL区可衍生自已知单克隆抗体的VH或VL或基于此，并在与已知单克隆抗体的VH或VL比较时，含有1个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)插入，1个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失，1个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)，或上述改变的组合。所述插入、缺失或取代可以在VH区的任意位置，包括在该区的氨基或羧基末端或两端，前提是各CDR不含或包含至多1、2或3个变化且提供含经修饰VH或VL区的结合域仍能以与野生型结合域相似的亲和力特异性结合其靶标。
所述VH和VL结构域可以任意取向安置(即，从氨基末端到羧基末端，VH-VL或VL-VH)，并可由能提供间隔物功能使得两个亚结合域能相互作用形成功能性结合域的氨基酸序列(如长度为约5-约35个氨基酸)连接。在某些实施方式中，连接VH和VL结构域的氨基酸序列(本文中也称作"接头")包括属于(GlynSer)家族的那些，例如(Gly3Ser)n(Gly4Ser)1、(Gly3Ser)1(Gly4Ser)n、(Gly3Ser)n(Gly4Ser)n或(Gly4Ser)n，其中n是1-5的整数。在某些实施方式中，该接头是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO:183)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO:108)。另一个示例接头是GGGGSGGGGSGGGGAS(SEQIDNO:739)。在某些实施方式中，这些(GlynSer)基接头用来连接结合域中的VH和VL结构域，但不用来连接结合域与免疫球蛋白异二聚化结构域或Fc区部分。
对CD28特异性的示例性结合域包括2E12scFv，如示于SEQIDNO:109，对CD79b特异性的示例性结合域包括P2C2scFv，如示于SEQIDNO:185；对c-Met特异性的示例性结合域包括5D5scFv，如示于SEQIDNO:257；对RON特异性的示例性结合域包括4C04scFv，如示于SEQIDNO:261和11H09scFv，如示于SEQIDNO:265；对超级IL-6特异性的示例性结合域包括A2scFv，如示于SEQIDNO:86；对CD86特异性的示例性结合域包括3D1scFv，如示于SEQIDNO:98；对HLA-DR特异性的示例性结合域包括M0042scFv，如示于SEQIDNO:120；对CD3特异性的示例性结合域包括G19-4scFv，如示于SEQIDNO:102，OKT3-MscFv，如示于SEQIDNO:834，和HuM291scFv，如示于SEQIDNO:837；对c-Met特异性的示例性结合域包括MET021scFv，如示于SEQIDNO:120(有轻链CDR1、CDR2、CDR3和重链CDR1、CDR2和CDR3，如分别示于SEQIDNO:296-298和464-466)。编码A2(抗超级IL-6)和3D1(抗CD86)scFv的核酸序列分别显示在SEQIDNO:85和97。结合TCR复合物或其成分的示例结合域包括BMA031scFv，如示于SEQIDNO:830和其他scFv，如示于SEQIDNO:310,311,312,319和334-340。
另一个示例结合域包括PDL2胞外域，如示于SEQIDNO:88和单IL-10，如示于SEQIDNO:90。编码PDL2胞外域和单IL-10的核算序列分别示于SEQIDNO:87和89。
SEQIDNO:602中列出4C04(抗RON)scFv的轻链氨基酸序列，SEQIDNO:604-606中分别列出其CDR1、CDR2和CDR3序列。SEQIDNO:603中列出4C04(抗RON)scFv的重链氨基酸序列，SEQIDNO:607-609中分别列出其CDR1、CDR2和CDR3序列。
SEQIDNO:610中列出11H09(抗RON)scFv的轻链氨基酸序列，SEQIDNO:612-614中分别列出其CDR1、CDR2和CDR3序列。SEQIDNO:611中列出11H09(抗RON)scFv的重链氨基酸序列，SEQIDNO:615-617中分别列出其CDR1、CDR2和CDR3序列。
结合域可以定位在本发明的单链多肽的Fc区部分的氨基末端或羧基末端。某些实施方式中，Fc定位在单链多肽的氨基末端。其他某些实施方式中，Fc定位在单链多肽的羧基末端。其他某些实施方式中，Fc定位在单链多肽的氨基末端和羧基末端。
异二聚化结构域
如上述，本发明的多肽异二聚体包括每个多肽链的免疫球蛋白异二聚化结构域。多肽异二聚体的两个单链多肽的免疫球蛋白异二聚化结构域彼此不同，因此可以被差异修饰以促进两条链的异二聚化并使各链的均二聚化降至最小。如实施例所示，本文提供的免疫球蛋白异二聚化结构域使不同多肽之间充分异二聚化，并且有利于所得多肽异二聚化的纯化。
如本文所提供，能用于促进本发明所述两种不同单链多肽(例如，一短一长)免疫球蛋白异二聚化的异二聚化结构域包括免疫球蛋白CH1和CL结构域，例如，人CH1和CL结构域。在某些实施方式中，免疫球蛋白异二聚化结构域是野生型CH1区，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2IgD、IgE或IgMCH1区。在进一步的实施方式中，免疫球蛋白异二聚化结构域是SEQIDNO:114，186-192和194中分别列出的野生型人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgMCH1区。在某些实施方式中，免疫球蛋白异二聚化结构域是SEQIDNO:114中所示的野生型人IgG1CH1结构域。
在进一步实施方式中，免疫球蛋白异二聚化结构域是经改变的免疫球蛋白CH1区，例如经改变的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2IgD、IgE或IgMCH1区。在某些实施方式中，免疫球蛋白异二聚化结构域是经改变的人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgMCH1区。在更进一步实施方式中，所述经改变的免疫球蛋白CH1区中，野生型CH1区(例如，人CH1)中参与和野生型免疫球蛋白CL结构域(例如，人CL)形成二硫键的半胱氨酸残基缺失或被取代，使得所述经改变CH1区和野生型CL结构域间不形成二硫键。
在某些实施方式中，免疫球蛋白异二聚化结构域是野生型CL结构域，例如野生型Cκ结构域或野生型Cλ结构域或。在具体的实施方式中，免疫球蛋白异二聚化结构域是SEQIDNO:112和113中分别列出的野生型人Cκ或人Cλ结构域。在进一步实施方式中，免疫球蛋白异二聚化结构域是经改变的免疫球蛋白CL结构域，例如经改变的Cκ或Cλ结构域，例如经改变的人Cκ或人Cλ结构域。
在某些实施方式中，所述经改变的免疫球蛋白CL结构域中，野生型CL结构域(例如，人CL)中参与和野生型免疫球蛋白CH1区(例如人CH1)形成二硫键的半胱氨酸残基缺失或被取代。此类经改变的CL结构域可进一步包含其氨基末端的氨基酸缺失。SEQIDNO:141中给出示例性Cκ结构域，其中缺失野生型人Ck结构域的首个精氨酸和最后一个半胱氨酸。在某些实施方式中，只有野生型人Ck结构域的最后一个半胱氨酸在改变的Ck结构域中被删除，因为在野生型人Ck结构域中敲除的第一个精氨酸可以用有羧基末端精氨酸的接头提供，并且链接改变Ck结构域和其他结构域(例如Fc区部分)。SEQIDNO:140中给出示例性Cλ结构域，其中缺失野生型人Cλ结构域的首个精氨酸且参与和CH1区中半胱氨酸形成二硫键的半胱氨酸被丝氨酸取代。
在进一步实施方式中，免疫球蛋白异二聚化结构域是经改变的Cκ结构域，和野生型Cκ结构域相比，其在可能参与形成Cκ-Cκ界面处链间氢键网络的位置处含有一个或多个氨基酸取代。例如，在某些实施方式中，免疫球蛋白异二聚化结构域是在N29、N30、Q52、V55、T56、S68或T70处有一个或多个氨基酸被不同的氨基酸取代的经改变的人Cκ结构域。氨基酸的变化是基于其在SEQIDNO:141中所列经改变的人Cκ序列中的位置。在某些实施方式中，免疫球蛋白异二聚化结构域是在N29、N30、V55或T70处有1、2、3或4个氨基酸取代的经改变的人Cκ结构域。用于在上述位置取代的氨基酸可以是丙氨酸，或是具有大侧链部分的氨基酸残基例如精氨酸、色氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸。另外可以用于替换野生型人Cκ结构域的上述位点(即N30)的氨基酸残基的氨基酸残基包括天冬氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。SEQIDNO:142-178中给出示例性的经改变的人Cκ结构域。经改变的人Cκ结构域可促进与CH1区的异二聚化，但使与另一Cκ结构域的同二聚化降至最低。代表性的经改变人Cκ结构域参见：SEQIDNO:160(N29WV55AT70A)、161(N29YV55AT70A)、202(T70EN29AN30AV55A)、167(N30RV55AT70A)、168(N30KV55AT70A)、170(N30EV55AT70A)、172(V55RN29AN30A)、175(N29WN30YV55AT70E)、176(N29YN30YV55AT70E)、177(N30EV55AT70E)和178(N30YV55AT70E)、838(N30DV55AT70E)、839(N30MV55AT70E)、840(N30SV55AT70E)和841(N30FV55AT70E)。
在某些实施方式中，补充或替代本文上述Ck结构域的突变，多肽异二聚体的免疫球蛋白异二聚化结构域(即，免疫球蛋白CH1和CL结构域)具有突变从而所得免疫球蛋白异二聚化结构域在突变位点处的氨基酸之间形成盐桥(即，离子相互作用)。例如，多肽异二聚体的异二聚化结构域可以是经突变的CH1结构域联合经突变的Ck结构域。在上述经突变的CH1结构域中，野生型人CH1结构域的68位缬氨酸(V68)被带负电的氨基酸残基(例如，天冬氨酸或谷氨酸)取代，而缺失首个精氨酸和最后一个半胱氨酸的经突变人Ck结构域中27位的亮氨酸(L27)被带正电氨基酸残基(例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代。所得经突变CH1结构域的带负电氨基酸残基与所得经突变Ck结构域的带正电氨基酸残基之间的电荷-电荷相互作用形成盐桥，稳定经突变CH1和Ck结构域间的异二聚体界面。或者，野生型CH1的V68可被带正电的氨基酸残基取代，而缺失首个精氨酸和最后一个半胱氨酸的经突变人Ck结构域的L27可被带负电的氨基酸残基取代。V68被负电荷或正电荷的氨基酸取代的示例的突变CH1序列示于SEQIDNO:844和845。L27被负电荷或正电荷的氨基酸取代的示例的突变Ck序列示于SEQIDNO:842和843。
可用带相反电荷的氨基酸取代人CH1结构域的V68和人Ck结构域的L27以外的位置来产生氨基酸之间的离子相互作用以补充或替代CH1结构域的V68和Ck结构域的L27处的突变。此类位置可由任何适当方法鉴定，包括随机诱变，用以鉴定CH1-Ck界面处氨基酸残基的CH1-Ck对晶体结构分析，并用某组标准(例如，参与离子相互作用的倾向性，离潜在伙伴残基的接近度，等等)进一步鉴定CH1-Ck界面处氨基酸残基之间的合适位置。
某些实施方式中，本发明的多肽异二聚体包括只有一对免疫球蛋白异二聚化结构域。例如，多肽异二聚体的第一链可包含CH1区作为免疫球蛋白异二聚化结构域，而第二链可包含CL结构域(例如，Cκ或Cλ)作为免疫球蛋白异二聚化结构域。或者，第一链可包含CL结构域(例如，Cκ或Cλ)作为免疫球蛋白异二聚化结构域，而第二链可包含CH1区作为免疫球蛋白异二聚化结构域。如本文所述，所述第一链和第二链的免疫球蛋白异二聚化结构域能结合形成本发明的多肽异二聚体。
其他某些实施方式中，本发明的多肽异二聚体包括两对免疫球蛋白异二聚化结构域。例如，多肽异二聚体的第一链可包含两个CH1区，而第二链可具有与所述第一链中的两个CH1区结合的两个CL结构域。或者，第一链可包含两个CL结构域，而第二链可具有与所述第一链中的两个CL结构域结合的两个CH1区。在某些实施方式中，第一链多肽包含CH1区和CL结构域，而第二链多肽包含分别结合所述第一链多肽的CH1区和CL结构域的CL结构域和CH1区。
在多肽异二聚体仅包含一个异二聚体对(即，各链中一个免疫球蛋白异二聚化结构域)的实施方式中，各链的免疫球蛋白异二聚化结构域可以位于该链Fc区部分的氨基末端。或者，各链中的免疫球蛋白异二聚化结构域可位于该链Fc区部分的羧基末端。
在多肽异二聚体包含两个异二聚体对(即，各链中两个免疫球蛋白异二聚化结构域)的实施方式中，各链的免疫球蛋白异二聚化结构域可以位于该链Fc区部分的氨基末端。或者，各链中的两个免疫球蛋白异二聚化结构域可位于该链Fc区部分的羧基末端。在进一步实施方式中，各链中的一个免疫球蛋白异二聚化结构域可位于该链Fc区部分的氨基末端，而各链的另一免疫球蛋白异二聚化结构域可位于该链Fc区部分的羧基末端。换言之，在这些实施方式中，Fc区部分介于各链的两个免疫球蛋白异二聚化结构域之间。
Fc区部分
如本文所述，本发明的多肽异二聚体包含每个多肽链的Fc区恒定结构域部分(也称为Fc区部分)。包合Fc区部分减缓异二聚体在给予对象后循环中的清除。如本领域所知和本文所述，通过突变或其它改变，Fc区部分还使得能相对简单的调整异二聚体多肽效应功能(例如，ADCC、ADCP、CDC、补体固定并结合Fc受体)，这些功能可取决于所治疗的疾病而被提高或降低。在某些实施方式中，本发明多肽异二聚体的Fc区部分将能介导这些效应功能中的一种或多种。
形成本发明多肽异二聚体部分的单链多肽中的Fc区部分可包含CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或其任意组合。例如，Fc区部分可包含CH2结构域、CH3结构域、CH2和CH3结构域，CH3和CH4结构域，两个CH3结构域，CH4结构域，或两个CH4结构域。
能形成本发明公开的异二聚体的单链多肽的Fc区部分的CH2结构域可以是来自某些免疫球蛋白分类或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD)和来自不同物种(包括人、小鼠、大鼠和其它哺乳动物)的野生型免疫球蛋白CH2结构域或其经改变的免疫球蛋白CH2结构域。
在某些实施方式中，CH2结构域是野生型人免疫球蛋白CH2结构域，例如SEQIDNO:115、199-201和195-197中分别列出的人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD的野生型CH2结构域。在某些实施方式中，CH2结构域是SEQIDNO:115中所示野生型人IgG1CH2结构域。
在某些实施方式中，CH2结构域是包含297位天冬酰胺处的氨基酸取代(例如，天冬酰胺取代为丙氨酸)的经改变免疫球蛋白CH2区(例如，经改变的人IgG1CH2结构域)。这样的氨基酸取代降低或消除该位点的糖基化并取消Fc对FcγR和C1q的有效结合。含297位Asn至Ala取代的经改变的人IgG1CH2结构域的序列见SEQIDNO:324。
在某些实施方式中，CH2结构域是在234-238位包含至少一个取代或缺失的经改变免疫球蛋白CH2区(例如，经改变的人IgG1CH2结构域)。例如，免疫球蛋白CH2区可包含234、235、236、237或238位某位置，234和235位，234和236位，234和237位，234和238位，234-236位，234、235和237位，234、236和238位，234、235、237和238位，236-238位，或234-238位的2、3、4或5个氨基酸的任意其它组合的取代。补充或替代地，经改变的CH2区可包含234-238位的一个或多个(例如，2、3、4或5个)氨基酸缺失，例如其一在236位或237位而另一位置为取代。上述突变降低或消除含所示经改变CH2结构域的多肽异二聚体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性或Fc受体结合能力。在某些实施方式中，234-238位中一个或多个位置处的氨基酸残基被一个或多个丙氨酸残基替换。在进一步实施方式中，在234-238位置仅有一个氨基酸残基缺失，而另有234-238位的一个或多个其余氨基酸被另一氨基酸取代(例如，丙氨酸或丝氨酸)。
在某些其它实施方式中，CH2结构域是在253、310、318、320、322和331位包含一个或多个氨基酸取代的经改变免疫球蛋白CH2区(例如，经改变的人IgG1CH2结构域)。例如，免疫球蛋白CH2区可包含在253、310、318、320、322或331某位置、318和320位，318和322位，318、320和322位，或253、310、318、320、322和331位的2、3、4、5或6个氨基酸位置处的取代。上述突变降低或消除含所述经改变CH2结构域的多肽异二聚体的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在某些其它实施方式中，除297位的氨基酸取代外，经改变的CH2区(例如，经改变的人IgG1CH2结构域)还可在234-238位包含一个或多个(例如，2、3、4或5个)额外的取代。例如，免疫球蛋白CH2区可在234和297位，234、235和297位，234、236和297位，234-236和297位，234、235、237和297位，234、236、238和297位，234、235、237、238和297位，236-238和237位，或者在234-238位的2、3、4或5个氨基酸的任意组合附加297位处包含取代。补充或替代地，经改变的CH2区可包含234-238位的一个或多个(例如，2、3、4或5个)氨基酸缺失，例如在236位或237位。其它突变降低或消除含所述经改变CH2结构域的多肽异二聚体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性或Fc受体结合能力。在某些实施方式中，234-238位中一个或多个位置处的氨基酸残基被一个或多个丙氨酸残基替换。在进一步实施方式中，在234-238位置仅有一个氨基酸残基缺失，而另有234-238位的一个或多个其余氨基酸被另一氨基酸(例如，丙氨酸或丝氨酸)取代。
在某些实施方式中，除234-238位的一个或多个(例如，2、3、4或5个)氨基酸取代以外，本发明所述融合蛋白中经突变的CH2区(例如，经改变的人IgG1CH2结构域)可在参与补体结合的一处或多处位置(例如，在I253、H310、E318、K320、K322或P331位)包含一个或多个(例如，2、3、4、5或6个)额外的氨基酸取代。经突变免疫球蛋白CH2区的示例包括在234、235、237(若有)、318、320和322位有丙氨酸取代的人IgG1、IgG2、IgG4和小鼠IgG2aCH2区。一种示例性经突变免疫球蛋白CH2区是在L234、L235、G237、E318、K320和K322处有丙氨酸取代的小鼠IGHG2cCH2区(SEQIDNO:314)。
在其它实施方式中，除297位的氨基酸取代和234-238位的额外单个或多个缺失或取代外，经改变的CH2区(例如，经改变的人IgG1CH2结构域)还可在253、310、318、320、322和331位包含一个或多个(例如，2、3、4、5或6个)额外的取代。例如，免疫球蛋白CH2区可包含(1)297位的取代，(2)234-238位的一处或多处取代或缺失或其组合，以及I253、H310、E318、K320、K322和P331位的一处或多处(例如，2、3、4、5或6处)氨基酸取代，例如在E318、K320和K322处的1、2、3处取代。上述位点的氨基酸可以被丙氨酸或丝氨酸取代。
在某些实施方式中，免疫球蛋白CH2区多肽包含：(i)在297位天冬酰胺的氨基酸取代和234、235、236或237位的一个氨基酸取代；(ii)在297位天冬酰胺的氨基酸取代和234-237位的2个氨基酸取代；(iii)在297位天冬酰胺的氨基酸取代和234-237位的3个氨基酸取代；(iv)在297位天冬酰胺的氨基酸取代和234、235和237位的氨基酸取代，和236位的氨基酸缺失；(v)在234-237位的3处氨基酸取代和在318、320和322位的氨基酸取代；或(vi)在234-237位的3处氨基酸取代，在236位的氨基酸缺失，和在318、320和322位的氨基酸取代。
在297位天冬酰胺处有氨基酸取代的示例性的经改变免疫球蛋白CH2区包括：在L234、L235、G237与N297处有丙氨酸取代并缺失G236的人IgG1CH2区(SEQIDNO:325)，在V234、G236与N297处有丙氨酸取代的人IgG2CH2区(SEQIDNO:326)，在F234、L235、G237与N297处有丙氨酸取代并缺失G236的人IgG4CH2区(SEQIDNO:322)，在F234与N297处有丙氨酸取代的人IgG4CH2区(SEQIDNO:343)，在L235与N297处有丙氨酸取代的人IgG4CH2区(SEQIDNO:344)，在G236与N297处有丙氨酸取代的人IgG4CH2区(SEQIDNO:345)，和在G237与N297处有丙氨酸取代的人IgG4CH2区(SEQIDNO:346)。
在某些实施方式中，除上述氨基酸取代以外，经改变的CH2区(例如，经改变的人IgG1CH2结构域)可含有上述位置以外一处或多处位置的一个或多个额外的氨基酸取代。此类氨基酸取代可以是保守或非保守的氨基酸取代。例如，在某些实施方式中，经改变的IgG2CH2区(例如，SEQIDNO:326)中P233可变为E233。补充或替代地，在某些实施方式中，所述经改变的CH2区可含有一个或多个氨基酸插入、缺失或两者兼有。所述一个或多个插入、缺失或取代恪守在免疫球蛋白CH2区的任意位置，例如在野生型免疫球蛋白CH2区的N-或C-末端，导致所述CH2区经铰链连接另一区(例如，结构域或免疫球蛋白异二聚化结构域)。
在某些实施方式中，本发明所述多肽异二聚体中的经改变CH2区是与野生型免疫球蛋白CH2区，例如野生型的人IgG1、IgG2或IgG4或者小鼠IgG2a(如IGHG2c)的CH2区的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列，或包含这样的序列。
本发明所述多肽异二聚体的经改变免疫球蛋白CH2区可衍生自不同物种(包括人、小鼠、大鼠和其它哺乳动物)的不同免疫球蛋白同种型的CH2区，所述同种型如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2和IgD。在某些实施方式中，本发明所述融合蛋白的免疫球蛋白CH2区可衍生自人IgG1、IgG2或IgG4或者小鼠IgG2a(如IGHG2c)的CH2区，其序列如SEQIDNO:115、199、201和320所示。
在某些实施方式中，经改变的CH2结构域是在235、318、320与322位有丙氨酸取代的人IgG1CH2结构域(即，带有L235A、E318A、K320A和K322A取代的人IgG1CH2结构域)(SEQIDNO:595)，并可选有N297突变(例如，变为丙氨酸)。在某些其它实施方式中，经改变的CH2结构域是在235、235、237、318、320与322位有丙氨酸取代的人IgG1CH2结构域(即，带有L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A取代的人IgG1CH2结构域)(SEQIDNO:596)，并可选有N297突变(例如，变为丙氨酸)。
在某些实施方式中，经改变的CH2结构域是带有本领域已知能改善免疫活性如ADCC、ADCP、CDC、补体结合、Fc受体结合或其任意组合的突变的经改变人IgG1CH2结构域。
能形成本发明公开的异二聚体的单链多肽的Fc区部分的CH3结构域可以是来自某些免疫球蛋白分类或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM)和来自不同物种(包括人、小鼠、大鼠和其它哺乳动物)的野生型免疫球蛋白CH3结构域或其经改变的免疫球蛋白CH3结构域。在某些实施方式中，CH3结构域是野生型人免疫球蛋白CH3结构域，例如SEQIDNO:116、208-210、204-207和212中分别列出的人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM的野生型CH3结构域。在某些实施方式中，CH3结构域是SEQIDNO:116中所示野生型人IgG1CH3结构域。在某些实施方式中，CH3结构域是经改变的人免疫球蛋白CH3结构域，例如基于或衍生自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体的野生型CH3结构域的经改变CH3结构域。例如，经改变的CH3结构域可以是在H433与N434处(位置按EU编号法编号)有一个或两个突变的IgG1CH3结构域。这些位置处的突变可参与补体结合。在某些其它实施方式中，经改变的CH3结构域可以是人IgG1CH3结构域，但带有F405或Y407位的1或2个氨基酸取代。在这些位置处的氨基酸参与和另一CH3结构域的相互作用。在某些实施方式中，经改变的CH3结构域可以是缺失末位赖氨酸的经改变人IgG1CH3结构域。这一经改变CH3结构域的序列如SEQIDNO:761所示。
在某些实施方式中，异二聚体的多肽包含含有称作“旋钮入孔(knobs-into-holes)”突变的CH3对(参见Marvin和Zhu，ActaPharmacologicaSinica26:649-58,200；Ridgway等，ProteinEngineering9:617-21,1966)。更具体地，可在两个CH3结构域中各自引入突变使得CH3/CH3结合所需的空间互补性迫使这两个CH3结构域彼此结对。例如，多肽异二聚体中一条单链多肽的CH3结构域可含有T366W突变(“钮”突变，用较大氨基酸取代小氨基酸)，而该多肽异二聚体中另一单链多肽的CH3结构域可含有Y407A突变(“孔”突变，用较小氨基酸取代大的氨基酸)。其它示例性旋钮入孔的突变包括(1)一个CH3结构域中的T366Y突变和另一CH3结构域中的Y407T，和(2)一个CH3结构域中的T366W突变和另一CH3结构域中的T366S、L368A和Y407V突变。
本发明的异二聚体的单链多肽Fc区部分的CH4结构域可以是来自IgE或IgM分子的野生型免疫球蛋白CH4结构域或其经改变的免疫球蛋白CH4结构域。在某些实施方式中，CH4结构域是野生型人免疫球蛋白CH4结构域，例如SEQIDNO:213和214分别列出的人IgE和IgM分子的野生型CH4结构域。在某些实施方式中，CH4结构域是经改变的人免疫球蛋白CH4结构域，例如基于或衍生自人IgE或IgM分子的CH4结构域的经改变CH4结构域，其具有提高或降低已知与IgE或IgMFc区相关的免疫活性的突变。
在某些实施方式中，本发明公开的异二聚体的Fc区恒定结构域部分包含CH2、CH3或CH4结构域的组合(即选自CH2、CH3和CH4的超过1个恒定亚结构域)。例如，Fc区部分可包含CH2与CH3结构域或CH3与CH4结构域。在某些其它实施方式中，Fc区部分可包含2个CH3结构域而无CH2或CH4结构域(即，仅2个或更多个CH3)。形成Fc区部分的多个恒定亚结构域可以基于或衍生自同一免疫球蛋白分子，或者同一类别或亚类的免疫球蛋白分子。在某些实施方式中，Fc区部分是IgGCH2CH3(例如，IgG1CH2CH3、IgG2CH2CH3和IgG4CH2CH3)且可以是人的(例如，人IgG1、IgG2和IgG4)CH2CH3。例如，在某些实施方式中，Fc区部分包含(1)野生型人IgG1CH2与CH3结构域，(2)含N297A取代的人IgG1CH2(即，CH2(N297A))和野生型人IgG1CH3，或(3)人IgG1CH2(N297A)和缺失末位赖氨酸的经改变人IgG1CH3。
或者，多个恒定亚结构域可以基于或衍生自不同的免疫球蛋白分子，或者不同类别或亚类的免疫球蛋白分子。例如，在某些实施方式中，Fc区部分同时包含人IgMCH3结构域和人IgG1CH3结构域。形成Fc区部分的多个恒定亚结构域可以直接相连或可通过一个或多个(例如，约2-10个)氨基酸相连。
示例性Fc区部分如SEQIDNO:305-309、321、323、341、342和762所示。
某些实施方式中，多肽异二聚体的两个单链多肽的Fc区部分彼此相同。在某些其它实施方式中，多肽异二聚体中一条单链多肽的Fc区部分不同于该异二聚体中另一单链多肽的Fc区部分。例如，一个Fc区部分可含有带“钮”突变的CH3结构域，而另一Fc区部分可含有带“孔”突变的CH3结构域。
绞链
根据本发明的披露，所含在多肽异二聚体的单链多肽的铰链区可位于(a)紧邻Fc区部分的氨基末端(例如，根据具体的同种型，当Fc区部分是CH2CH3时位于CH2结构域的氨基末端，或当Fc区部分是CH3CH4时位于CH3结构域的氨基末端)，(b)间插在结合域(例如，scFv)和免疫球蛋白异二聚化结构域之间并连接这两个结构域，(c)间插在免疫球蛋白异二聚化结构域和Fc区部分(例如，根据具体的同种型或多种同种型，所述Fc区部分是CH2CH3或CH3CH4)之间并连接这两个结构域，(d)间插在Fc区部分和结合域之间并连接这两个结构域，(e)所述单链多肽的氨基末端，或(f)所述单链多肽的羧基末端。如本文所述，包含铰链区的单链多肽能与不同单链融合多肽结合形成本文提供的多肽异二聚体，并且所形成不同单链融合多肽会包含保持其靶标特异性或特异靶标结合亲和性的结合域。
某些实施方式中，单链多肽中出现的、与另一个单链多肽形成多肽异二聚体的铰链可以是免疫球蛋白铰链区，例如野生型免疫球蛋白铰链区或其改变的免疫球蛋白铰链区。
在某些实施方式中，铰链是野生型人免疫球蛋白铰链区(例如，SEQIDNO:215-221中所示的人免疫球蛋白铰链区)。在某些其它实施方式中，可在野生型免疫球蛋白铰链区的氨基或羧基末端添加一个或多个氨基酸残基作为融合蛋白构建物设计的部分。例如，额外的接合氨基酸残基在铰链氨基末端时可以是"RT"、"RSS"、"TG"或"T"，或在铰链羧基末端时可以是"SG"，或者铰链的缺失可结合添加，例如ΔP与羧基末端的"SG"添加。
在某些实施方式中，铰链是经改变的免疫球蛋白铰链，其中野生型免疫球蛋白铰链区的一个或多个半胱氨酸残基取代为一种或多种其它氨基酸残基(例如，丝氨酸或丙氨酸)。例如，铰链可以是基于或衍生自SEQIDNO:667所示野生型人IgG1铰链的经改变免疫球蛋白铰链，其自氨基末端至羧基末端含有上部铰链区(EPKSCDKTHT,SEQIDNO:227)和核心铰链区(CPPCP,SEQIDNO:228)。示例性的经改变免疫球蛋白铰链包括将野生型人IgG1铰链中所见的1、2或3个半胱氨酸残基取代以1、2或3个另外的氨基酸残基(例如丝氨酸或丙氨酸)的免疫球蛋白人IgG1铰链区。经改变的免疫球蛋白铰链可额外将脯氨酸取代为另一氨基酸(例如，丝氨酸或丙氨酸)。例如，上述经改变的人IgG1铰链可额外将位于野生型人IgG1铰链区3个半胱氨酸的羧基末端的脯氨酸取代以另一氨基酸残基(例如，丝氨酸、丙氨酸)。在一种实施方式中，核心铰链区的脯氨酸未被取代。示例性改变的免疫球蛋白铰链如SEQIDNO:229-240、255、664-677和748-759所示。一个改变的IgG1铰链是经改变的人IgG1铰链，其中首个半胱氨酸被丝氨酸取代。该经改变IgG1铰链的序列见SEQIDNO:664所示，并称作“人IgG1SCC-P铰链”或“SCC-P铰链”。在某些实施方式中，可在突变的免疫球蛋白铰链区的氨基或羧基末端添加一个或多个氨基酸残基(例如，"RT"、"RSS"或"T")作为融合蛋白构建物设计的部分。
在某些实施方式中，铰链多肽是与野生型免疫球蛋白铰链区，例如野生型人IgG1铰链，野生型人IgG2铰链或野生型人IgG4铰链至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或包含这样的序列。
在进一步的实施方式中，与另一个单链多肽形成多肽异二聚体的单链多肽中出现的铰链可以使不基于或从免疫球蛋白铰链衍生的铰链(即，不是野生型免疫球蛋白铰链或改变的免疫球蛋白铰链)。所述非免疫球蛋白急于铰链的类型可以用在形成多肽异二聚体的单链多肽的羧基末端或其附近(即，定位在Fc区部分的羧基末端)。所述铰链的示例包含II型C凝集素或CD分子的结构域间或杆区的约5-约150氨基酸的肽，例如，约8-25氨基酸的肽和约7-18氨基酸的肽，和其衍生物。
II型C凝集素或CD分子的“结构域间或杆区”涉及II型C凝集素或CD分子的胞外结构域部分，定位在C型凝集素样结构域(CTLD；即于自然杀伤细胞受体的CTLD类似)和夸膜结构域之间。例如，人体CD94分子(GenBank登录号AAC50291.1，PRI，1995年11月30日)，胞外域对应氨基酸残基34-179，而CTLD对应氨基酸残基61-176。因此，人体CD94分子的结构域间或杆区包含氨基酸残基34-60，在膜和CTLD之间发现(参见Boyington等，Immunity10:75,1999；描述其他杆区，参见Beavil等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA89:753，1992；和Figdor等，NatureRev.Immunol.2:77，2002)。所述II型C凝集素或CD分子也可以在杆区和夸膜区或CTLD之间有6-10连接氨基酸。另一个实施例中，233氨基酸人NKG2A蛋白(GenBank登录号P26715.1，PRI，2010年6月15日)有氨基酸范围71-93的夸膜区和氨基酸范围94-233的胞外结构域。CTLD由氨基酸119-231构成，并且杆区包含氨基酸99-116，两侧由五和二氨基酸链接。其他II型C凝集素或CD分子，和其胞外配体结合域，结构域间或杆区，和CTLD为本领域所知(参见，例如，分别针对人CD23、CD69、CD72、NKG2A和NKG2D和其描述，GenBank登录号NP_001993.2；AAH07037.1，PRI，2006年7月15日；NP_001773.1,PRI，2010年6月20日；AAL65234.1,PRI，2002年1月17日和CAA04925.1,PRI，2006年11月14日)。
II型C凝集素或CD分子的结构域间或杆区或其片段的“衍生物”包含约8-约150氨基酸序列，其中野生型II型C凝集素或CD分子的杆区一个、两个或三个氨基酸有敲除、插入、替换或其任意组合，例如，一个或多个改变被替换或一个或多个突变包含只有一个敲除。进一步的实施方式中，结构域间或杆区衍生物比野生型结构域间或杆区序列对蛋白水解剪切更有抗性，例如所述衍生自NKG2A、NKG2D、CD23、CD64、CD72或CD94的约8-约20氨基酸。
某些实施方式中，结构域间或杆区铰链有7-18氨基酸并能形成α螺旋卷曲结构。某些实施方式中，结构域间或杆区铰链包含0、1、2、3或4半胱氨酸。示例结构域间或杆区铰链是结构域间或杆区的肽片段，例如CD69、CD72、CD94、NKG2A和NKG2D的杆区的10-150氨基酸片段，如SEQIDNO:241-244、716和601所示。另一个示例杆区或结构域间包含于SEQIDNO:78、734-737、742-747和766-790所示。
可用于多肽异二聚体的单链多肽的替代铰链是来自细胞表面受体的部分(结构域间区)，其连接免疫球蛋白V-样或免疫球蛋白C-样结构域。当细胞表面受体含有多个串联的IgV样结构域时在IgV样结构域之间的区，以及当细胞表面受体含有多个串联的IgC样区时在IgC样结构域之间的区也考虑为可用作多肽异二聚体的单链多肽中的铰链。在某些实施方式中，含有细胞表面受体结构域间区的铰链序列还可含有天然存在或添加的基序，例如能提供一对或多对二硫键以稳定所示多肽异二聚体形成的IgG核心铰链序列。铰链的示例包括CD2、CD4、CD22、CD33、CD48、CD58、CD66、CD80、CD86、CD150、CD166和CD244的IgV样和IgC样区之间的结构域间区。
在某些实施方式中，铰链序列具有约5-150个氨基酸，5-10个氨基酸，10-20个氨基酸，20-30个氨基酸，30-40个氨基酸，40-50个氨基酸，50-60个氨基酸，5-60个氨基酸，5-40个氨基酸，例如，8-20个氨基酸或10-15个氨基酸。铰链可以主要是挠性的，但也可提供更为刚性的特性或可主要含α-螺旋结构而β-片层结构尽可能少。铰链的长度或序列可影响该铰链直接或间接(经另一区或结构域，例如免疫球蛋白异二聚化结构域)所连接的结合域的结合亲和性，以及该铰链直接或间接连接的Fc区部分的一种或多种活性(见实施例9和10)。
在某些实施方式中，铰链序列在血浆和血清中具有稳定性，并能耐受蛋白水解切割。IgG1上部铰链区的第一个赖氨酸可以突变以最小化蛋白水解剪切，例如赖氨酸可以用甲硫氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸替换或被敲除(参见，例如SEQIDNO:379-434，可以在氨基末端包含连接氨基酸，例如RT)。
在一些实施方式中，铰链序列可含有能形成一个或多个二硫键以稳定分子羧基末端的天然产生的或添加的基序，如免疫球蛋白铰链核心结构CPPCP(SEQIDNO:228)。在其它实施方式中，铰链序列可含有一个或多个糖基化位点。
示例性的铰链，包括经改变的免疫球蛋白铰链见SEQIDNO:379-434、618-749和763-791中所示。
某些实施方式中，根据本发明的多肽异二聚体的单链多肽包含多余一个铰链。例如，具有两个结合域的单链多肽可有两个铰链，这两个结合域一个在氨基末端另一个在羧基末端。一个铰链可直接或间接(例如，经免疫球蛋白异二聚化结构域)连接在氨基末端或该端附近的结合域，而另一铰链可连接(例如，直接连接)羧基末端或该端附近的另一结合域。在某些实施方式中，即使是仅有一个结合域的单链多肽仍可在其氨基或羧基末端具有超过一个铰链。所述铰链可以与异二聚体其他链的相应铰链相互作用，例如形成一个或多个链间二硫键，以帮助或增强两个链的异二聚化。当多肽异二聚体SCP-I的铰链(H-I)和异二聚体SCP-II的铰链(H-II)位于其相应的单链多肽Fc区部分的相同末端时，H-I“对应于”H-II。例如，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：第一链多肽从氨基到羧基末端包含第一结合域、CH1、铰链、CH2和CH3，而第二链多肽从氨基到羧基末端包含CK、第一铰链、CH2、CH3、第二铰链和第二结合域。第一链的铰链可视为"对应于"第二链的第一铰链，因为两者都在所连Fc区部分的氨基末端。
多肽异二聚体的单链多肽在羧基末端或其附近包含结合域的某些实施方式中，可以出现铰链来与单链多肽的另一部分的结合域连接(例如，Fc区部分或免疫球蛋白异二聚体结构域)。在一个实施方式中，此类铰链是非免疫球蛋白铰链(即，铰链并非基于或衍生自野生型免疫球蛋白铰链)且可以是CD分子或II型C-凝集素的杆区，连接细胞表面受体的IgV-样或IgC-样结构域的结构域间区，或其衍生物或功能性变体。示例性羧基末端铰链有时称作"后端"铰链，包括SEQIDNO:78、734-737、742-747和766-790中所示的那些。
某些实施方式中，多肽异二聚体的一个单链多肽的铰链与异二聚体的另一个单链多肽的相应铰链相同。其他某些实施方式中，一个链的铰链与另一个链(在其长度或序列上)不同。不同链的不同铰链使得连接铰链的结合域的结合亲和性有不同操作，以至于异二聚体能相对于另一个结合域靶标优选结合一个结合域的靶标。例如，某些实施方式中，多肽异二聚体在一个链有CD3或TCR结合域并且在另一个链有癌症抗原结合域。在两个链上有两个不同铰链可以使得异二聚体第一结合癌症抗原，然后第二结合CD3或TCR分子。因此，异二聚体可以引入CD3+T细胞到有癌症抗原的癌症细胞，然后可以损伤或破坏癌症细胞。
其它组件或修饰
某些实施方式中，与另一个单链多肽形成异二聚体的单链多肽可以包含一个或多个附加域或区。此类额外区可以是在氨基末端用于分泌所表达单链多肽的前导序列(也称作“信号肽”)。本发明的示例性前导肽包括天然的前导序列或其它，例如SEQIDNO:110和111所示序列。
额外的区还可以是在羧基末端用于简单或纯化单链多肽(例如，用于检测或纯化的表位标签，例如组氨酸标签、生物素、表位，或其任意组合)。
进一步可选的区可以是长1-约10个氨基酸(例如，约2-5个氨基酸)的额外氨基酸残基(称作“接合氨基酸”或“接合氨基酸残基”)，其可由就本发明所述多肽的特定表达系统或构建物设计的应用而产生。此类额外氨基酸残基(例如，1、2、3、4或5个额外氨基酸)可存在于单链多肽的氨基或羧基末端或者在不同区或结构域之间，例如在结合域与免疫球蛋白异二聚化结构域之间，在免疫球蛋白异二聚化结构域与铰链之间，在铰链与Fc区部分之间，在Fc区部分的结构域之间(例如，在CH2与CH3结构域或在2个CH3结构域之间)，在结合域与铰链之间，在Fc区和免疫球蛋白异二聚体结构域之间，或在可变区和接头之间。在铰链氨基末端的示例性接合氨基酸包括RDQ(SEQIDNO:598)、RT、SS、SASS(SEQIDNO:599)和SSS(SEQIDNO:600)。铰链羧基末端的示例性接合氨基酸包括氨基酸SG。附属示例接合氨基酸包括SR。
在某些实施方式中，接合氨基酸存在于含CH2和CH3的Fc区部分和免疫球蛋白异二聚化结构域(CH1或CL)之间。若存在于CH3的C末端与CH1或CL的N末端之间时，这些接合氨基酸也称作“CH3与CH1或CL间的接头”。此类接头可以长约2-12个氨基酸。在某些实施方式中，Fc区部分包含人IgG1CH2和CH3结构域，其中缺失人IgG1CH3的C-末端赖氨酸残基。CH3和CH1间的示例性接头包括SEQIDNO:847-849中所示。CH3和Ck的示例性接头包括SEQIDNO:850-852中所示(其中接头内羧基末端精氨酸或者可视为Ck的第一位精氨酸)。在某些实施方式中，此类接头或接头对的存在(例如，SEQIDNO:847在异二聚体的一条单链多肽中作为CH3-CH1接头而SEQIDNO:850在该异二聚体的另一单链多肽中作为CH3-Ck接头；SEQIDNO:848作为CH3-CH1接头而SEQIDNO:851作为CH3-Ck接头；和SEQIDNO:849作为CH3-CH1接头而SEQIDNO:852作为CH3-Ck接头)相对异二聚体两条单链多肽中参比接头如SEQIDNO:846(其中包含CH3的最后一个赖氨酸作为接头部分)能改善异二聚体的生成。
在某些实施方式中，本发明多肽异二聚体的免疫球蛋白Fc区(例如，CH2、CH3和/或CH4区)可能相对于免疫球蛋白参比序列具有改变的糖基化模式。例如，可采用各种遗传技术来改变构成糖基化位点的一个或多个特定氨基酸残基(参见Co等(1993)Mol.Immunol.30:1361；Jacquemon等(2006)J.Thromb.Haemost.4:1047；Schuster等(2005)CancerRes.65:7934；Warnock等(2005)Biotechnol.Bioeng.92:831)，如CH2结构域的N297(EU编号)。或者，可工程改造产生本发明多肽异二聚体的宿主细胞，以产生改变的糖基化模式。例如，本领域已知的一种方法提供改变的糖基化模式，采用增加ADCC的平分的非岩藻糖基化变体形式。所述变体由含有寡糖修饰酶的宿主细胞表达产生。或者，也考虑用BioWa/KyowaHakko的技术来降低本发明糖基化分子的岩藻糖含量。在一种已知方法中，提供了用于产生重组免疫球蛋白的CHO宿主细胞，其通过产生GDP-岩藻糖改变免疫球蛋白Fc区的糖基化模式。
或者，用化学技术改变本发明的多肽异二聚体的糖基化模式。例如，多种糖苷酶和/或甘露糖苷酶抑制剂提供一种或多种所需效果：提高ADCC活性、提高Fc受体结合和改变糖基化模式。在某些实施方式中，在含有糖修饰物的培养基中培养表达本发明多肽异二聚体的细胞，其中所述糖修饰物的浓度能提高所述宿主细胞产生的免疫糖蛋白分子的ADCC，并且低于800μM。在一种实施方式中，表达这些多肽异二聚体的细胞生长于含有澳粟精胺或几夫碱，例如浓度为100-800μM，如100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM或800μM的澳粟精胺的培养基中。美国专利号7,846,434或PCT公布号WO2008/052030中提供了用糖修饰物如澳粟精胺改变糖基化的方法。
结构安排和示例异二聚体
根据本发明形成多肽异二聚体，设计两个单链多肽，以至于第一个单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域被合适对齐，并且与第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚体域相互作用。某些实施方式中，异二聚体可以包含第二免疫球蛋白异二聚化域对以帮助或增强两个链的异二聚化。某些实施方式中，除了与两个免疫球蛋白异二聚化域结合外，第一链的Fc区部分(即CH3域)可以与第二链的Fc区相互作用，以增强异二聚化(例如，通过两个野生型CH3域之间或CH3域对与“旋钮入孔”(knobs-into-holes)突变之间的相互作用)。另外，某些实施方式中，第一链的铰链(即用两个半胱氨酸残基改变的人IgG1铰链，示于SEQIDNO:664)可以与第二链铰链相互作用(即，相同改变的人IgG1铰链，示于SEQIDNO:664)形成，例如二硫键，可以进一步加强第一和第二单链多肽的相互作用以形成本发明的多肽异二聚体。另外，某些实施方式中，第一和第二链可以包含第二铰链对(例如，在两个链的羧基末端)以进一步增强两个链之间的相互作用。
某些实施方式中，本发明的多肽异二聚体包含两个结合域(BD1和BD2)，其中结合域结合两个不同靶标分子。某些实施方式中，两个结合域(BD1和BD2)与免疫球蛋白异二聚化域(HD-I)都在SCP-I上，并且Fc区部分(FRP-1)在BD1和BD2之间。其他某些实施方式中，第一结合域(BD1)在SCP-I并且第二结合域(BD2)在SCP-II。某些实施方式中，BD1和BD2分别是SCP-I和SCP-II的Fc区部分的氨基末端。某些其他实施方式中，BD1是SCP-I的Fc区部分的氨基末端，并且BD2是SCP-II的Fc区部分的羧基末端。其他某些实施方式中，BD1是SCP-I的Fc区部分的羧基末端，并且BD2是SCP-II的Fc区部分的氨基末端。其他某些实施方式中，BD1和BD2分别是SCP-I和SCP-II的Fc区部分的羧基末端。
某些实施方式中，本发明的多肽异二聚体包含三个结合域(BD1、BD2和BD3)，其中结合域结合两个或三个不同靶标分子。例如，BD1、BD2和BD3每个结合不同靶标，或者BD1和BD2结合第一靶标，而BD3结合第二靶标，或者BD1和BD3结合第一靶标，而BD2结合第二靶标，或者BD2和BD3结合第一靶标，而BD1结合第二靶标。某些实施方式中，免疫球蛋白异二聚化结构域和Fc区部分在SCP-I上BD1和BD2之间，和BD3在SCP-II的Fc区部分的氨基末端。进一步的实施方式中，免疫球蛋白异二聚化结构域和Fc区部分在SCP-II上BD1和BD2之间，和BD3在SCP-I的Fc区部分的羧基末端。
某些实施方式中，本发明的多肽异二聚体包含四个结合域(BD1、BD2、BD3和BD4)，其中结合域结合两个到四个不同靶标分子。某些实施方式中，SCP-I的免疫球蛋白异二聚体结构域和Fc区部分在BD1和BD2之间，并且SCP-II的免疫球蛋白异二聚体结构域和Fc区部分在BD3和BD4之间。
某些实施方式中，多肽异二聚体包含五个结合域(BD1、BD2、BD3、BD4和BD5)，其中结合域结合两个到四个不同靶标分子。某些实施方式中，SCP-I包含三个结合域(BD1、BD2和BD3)，并且SCP-II包含两个结合域(BD4和BD5)。进一步的实施方式中，BD1和BD2可以，例如，以串联方式互相连接(或者直接或者通过2-8个氨基酸的肽接头)在SCP-I的氨基(或羧基)末端，与BD3定位在SCP-I或SCP-II的羧基(或氨基)末端，其中，如果BD3在SCP-I上，BD4和BD5在SCP-II上，或如果BD3在SCP-I上，BD4和BD5在SCP-II上。
仍然在进一步实施方式中，多肽异二聚体包括六个结合域(BD1-BD6)。某些实施方式中，SCP-I和SCP-II每个包含三个结合域(即SCP-I上的BD1-BD3，和SCP-II上的BD4-BD6)。所述实施方式中，例如，BD1和BD2可以以串联方式连接并且定位在SCP-I的氨基(或羧基)末端，并且BD3可以定位在SCP-I的羧基(或氨基)末端。类似地，BD4和BD5可以以串联方式连接并且定位在SCP-II的氨基(或羧基)末端，并且BD6可以定位在SCP-II的羧基(或氨基)末端。其他某些实施方式中，第一单链多肽(SCP-I)包含四个结合域(BD1-BD4)，和第二单链多肽(SCP-II)包含两个结合域(BD5和BD6)。所述实施方式中，BD1和BD2可以以串联方式连接并且定位在SCP-I的氨基末端或其附近，BD3和BD4可以以串联方式连接并且定位在SCP-I的羧基末端或其附近，并且BD5和BD6可以分别定位在SCP-II的氨基和羧基末端或其附近。
某些实施方式中，多肽异二聚体包括七个结合域(BD1-BD7)。所述实施方式中，SCP-I可以包含四个结合域(BD1-BD4)，SCP-II可以包含其他三个结合域(BD5-BD7)。例如，BD1和BD2可以以串联方式连接并且定位在SCP-I的氨基末端或其附近，并且BD3和BD4可以以串联方式连接并且定位在SCP-II的羧基末端或其附近。BD5和BD6可以以串联方式连接并且定位在SCP-II的氨基(或羧基)末端或其附近，并且BD7可以定位在SCP-II的羧基(或氨基)末端或其附近。
某些实施方式中，多肽异二聚体包括八个结合域(BD1-BD8)。某些实施方式中，第一和第二单链多肽可以每个包含四个结合域。每个链，两个结合域可以定位在氨基末端或其附近，并且另外两个结合域定位在羧基末端或其附近。
为了简单描述能排列的多个成分如何产生第一和第二单链多肽，形成本发明的多肽异二聚体，下面提供示例性实施方式(1)-(50)的安排，其中每个实施方式中只含有两个结合域。
实施方式(1)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CH1区，铰链和Fc区部分；并且第二单链多肽包含第二结合域，CL区(即Cκ，Cλ)，铰链和Fc区部分。
实施方式(2)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，铰链，Fc区部分和CH1区；并且第二单链多肽包含第二结合域，铰链，Fc区部分和CL区。
实施方式(3)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CH1区，铰链，Fc区部分和第二CH1区；并且第二单链多肽包含第二结合域，CL区，铰链，Fc区部分和第二CL区。
实施方式(4)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CH1区，第二CH1区，铰链和Fc区部分；并且第二单链多肽包含第二结合域，CL区，第二CL区，铰链和Fc区部分。
实施方式(5)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，铰链，Fc区部分，CH1区和第二CH1区；并且第二单链多肽包含第二结合域，铰链，Fc区部分，CL区和第二CL区。
实施方式(6)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含CH1区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含CL区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第二结合域。
实施方式(7)中，多肽异二聚体可从下列两条单链多肽形成：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含铰链，Fc区部分，CH1区，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含铰链，Fc区部分，CL区，第二铰链和第二结合域。
实施方式(8)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含CH1区，铰链，Fc区部分，第二CH1区，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含CL区，铰链，Fc区部分，第二CL区，第二铰链和第二结合域。
实施方式(9)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含CH1区，第二CH1区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含CL区，第二CL区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第二结合域。
实施方式(10)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含铰链，Fc区部分，CH1区，第二CH1区，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含铰链，Fc区部分，CL区，第二CL区，第二铰链和第二结合域。
实施方式(11)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CL区，铰链和Fc区部分；并且第二单链多肽包含第二结合域，CH1区，铰链和Fc区部分。
实施方式(12)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，铰链，Fc区部分和CL区；并且第二单链多肽包含第二结合域，铰链，Fc区部分和CH1区。
实施方式(13)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CL区，铰链，Fc区部分和第二CL区；并且第二单链多肽包含第二结合域，CH1区，铰链，Fc区部分和第二CH1区。
实施方式(14)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CL区，第二CL区，铰链和Fc区部分；并且第二单链多肽包含第二结合域，CH1区，第二CH1区，铰链和Fc区部分。
实施方式(15)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，铰链，Fc区部分，CL区和第二CL区；并且第二单链多肽包含第二结合域，铰链，Fc区部分，CH1区和第二CH1区。
实施方式(16)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含CL区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含CH1区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第二结合域。
实施方式(17)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含铰链，Fc区部分，CL区，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含铰链，Fc区部分，CH1区，第二铰链和第二结合域。
实施方式(18)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含CL区，铰链，Fc区部分，第二CL区，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含CH1区，铰链，Fc区部分，第二CH1区，第二铰链和第二结合域。
实施方式(19)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含CL区，第二CL区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含CH1区，第二CH1区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第二结合域。
实施方式(20)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含铰链，Fc区部分，CL区，第二CL区，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含铰链，Fc区部分，CH1区，第二CH1区，第二铰链和第二结合域。
实施方式(21)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CH1区，铰链，Fc区部分和CL区；并且第二单链多肽包含第二结合域，CL区，铰链，Fc区部分和CH1区。
实施方式(22)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CL区，铰链，Fc区部分和CH1区；并且第二单链多肽包含第二结合域，CH1区，铰链，Fc区部分和CL区。
实施方式(23)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CH1区，CL区，铰链和Fc区部分；并且第二单链多肽包含第二结合域，CL区，CH1区，铰链和Fc区部分。
实施方式(24)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CL区，CH1区，铰链和Fc区部分；并且第二单链多肽包含第二结合域，CH1区，CL区，铰链和Fc区部分。
实施方式(25)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，铰链，Fc区部分，CH1区和CL区；并且第二单链多肽包含第二结合域，铰链，Fc区部分，CL区和CH1区。
实施方式(26)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，铰链，Fc区部分，CL区和CH1区；并且第二单链多肽包含第二结合域，铰链，Fc区部分，CH1区和CL区。
实施方式(27)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含CH1区，铰链，Fc区部分，CL区，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含CL区，铰链，Fc区部分，CH1区，第二铰链和第二结合域。
实施方式(28)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含CL区，铰链，Fc区部分，CH1区，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含CH1区，铰链，Fc区部分，CL区，第二铰链和第二结合域。
实施方式(29)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含CH1区，CL区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含CL区，CH1区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第二结合域。
实施方式(30)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含CL区，CH1区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含CH1区，CL区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第二结合域。
实施方式(31)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含铰链，Fc区部分，CH1区，CL区，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含铰链，Fc区部分，CL区，CH1区，第二铰链和第二结合域。
实施方式(32)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基末端到羧基末端，第一单链多肽包含铰链，Fc区部分，CL区，CH1区，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含铰链，Fc区部分，CH1区，CL区，第二铰链和第二结合域。
实施方式(33)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CH1区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第二结合域；并且第二单链多肽包含CL区，铰链和Fc区部分。
实施方式(34)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CL区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第二结合域；并且第二单链多肽包含CH1区，铰链和Fc区部分。
实施方式(35)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CH1区，铰链和Fc区部分；并且第二单链多肽包含CL区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第二结合域。
实施方式(36)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含CH1区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含第二结合域，CL区，铰链和Fc区部分。
实施方式(37)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CH1区，铰链，Fc区部分和第二铰链；并且第二单链多肽包含第二结合域，CL区，铰链，Fc区部分和第二铰链。
实施方式(38)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，铰链，Fc区部分，CH1区，第二铰链和第二结合域；并且第二单链多肽包含铰链，Fc区部分和CL区。
实施方式(39)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含铰链，Fc区部分和CH1区；并且第二单链多肽包含第一结合域，铰链，Fc区部分，CL区，第二铰链和第二结合域。
实施方式(40)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，铰链，Fc区部分和CH1区；并且第二单链多肽包含铰链，Fc区部分，CL区，第二铰链和第二结合域。
实施方式(41)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含铰链，Fc区部分，CH1区，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含第二结合域，铰链，Fc区部分和CL区。
实施方式(42)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，铰链，Fc区部分，CH1区和第二铰链；并且第二单链多肽包含第二结合域，铰链，Fc区部分，CL区和第二铰链。
实施方式(43)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CH1区，铰链，Fc区部分，CL区，第二铰链和第二结合域；并且第二单链多肽包含CL区，铰链，Fc区部分和CH1区。
实施方式(44)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含CH1区，铰链，Fc区部分和CL区；并且第二单链多肽包含第一结合域，CL区，铰链，Fc区部分，CH1区，第二铰链和第二结合域。
实施方式(45)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CH1区，铰链，Fc区部分和CL区；并且第二单链多肽包含CL区，铰链，Fc区部分，CH1区，第二铰链和第二结合域。
实施方式(46)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含CH1区，铰链，Fc区部分，CL区，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含第二结合域，CL区，铰链，Fc区部分和CH1区。
实施方式(47)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CH1区，铰链，Fc区部分，第二CH1区，第二铰链和第二结合域；并且第二单链多肽包含CL区，铰链，Fc区部分和第二CL区。
实施方式(48)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含CH1区，铰链，Fc区部分，第二CH1区；并且第二单链多肽包含第一结合域，CL区，铰链，Fc区部分，第二CL区和第二结合域。
实施方式(49)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CH1区，铰链，Fc区部分和第二CH1区；并且第二单链多肽包含CL区，铰链，Fc区部分，第二CL区，第二铰链和第二结合域。
实施方式(50)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含CH1区，铰链，Fc区部分，CH1区，第二铰链和第一结合域；并且第二单链多肽包含第二结合域，CL区，铰链，Fc区部分和第二CL区。
下面也提供示例实施方式(51)-(60)，其中每个异二聚体包含3-4个结合域。附加结合域可以包含在以产生包含5-8个结合域的多肽异二聚体，根据本发明提供的普通描述的观点。
实施方式(51)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CH1区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第二结合域；并且第二单链多肽包含第三结合域，CL区，铰链和Fc区部分。
实施方式(52)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CH1区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第二结合域；并且第二单链多肽包含CL区，铰链和Fc区部分，第二铰链和第三结合域。
实施方式(53)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CL区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第二结合域；并且第二单链多肽包含第三结合域，CH1区，铰链和Fc区部分。
实施方式(54)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，CL区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第二结合域；并且第二单链多肽包含CH1区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第三结合域。
实施方式(55)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，铰链，Fc区部分，CH1区，第二铰链和第二结合域；并且第二单链多肽包含第三结合域，铰链，Fc区部分和CL区。
实施方式(56)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，铰链，Fc区部分，CH1区，第二铰链和第二结合域；并且第二单链多肽包含铰链，Fc区部分，CL区，第二铰链和第三结合域。
实施方式(57)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，铰链，Fc区部分，CL区，第二铰链和第二结合域；并且第二单链多肽包含第三结合域，铰链，Fc区部分和CH1区。
实施方式(58)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，铰链，Fc区部分，CL区，第二铰链和第二结合域；并且第二单链多肽包含铰链，Fc区部分，CH1区，第二铰链和第三结合域。
实施方式(59)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端：第一结合域，CH1区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第二结合域；并且第二单链多肽包含第三结合域，CL区，铰链，Fc区部分，第二铰链和第四结合域。
实施方式(60)中，多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：从氨基到羧基末端，第一单链多肽包含第一结合域，铰链，Fc区部分，CH1区，第二铰链和第二结合域；并且第二单链多肽包含第三结合域，铰链，Fc区部分，CL区，第二铰链和第四结合域。
实施方式(1)-(32)中，本发明的多肽异二聚体可含有下列两条单链多肽：第一单链多肽包含特异结合T细胞靶标(即TCR复合物或其成分，包括TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ和CD3ε)的第一结合域(BD1)，SCC-PIgG1铰链的铰链，野生型或改变的人IgG1CH2CH3的Fc区部分，和野生型或有N30YV55AT70E(YAE)替换的改变的人Ck区的CL区；并且第二单链多肽包含特异结合B细胞靶标(即CD19、CD79b、HLA-DR、CD37、CD20)或肿瘤或癌症抗原(即RON、c-Met、EpCAM、CEACAM-6、PSMA)的结合域(BD2)，也是SCC-PIgG1铰链的铰链，野生型或改变的人IgG1CH2CH3的Fc区部分和人CH1区的CH1区。
进一步实施方式中，实施方式(1)-(32)的多肽异二聚体还可以包含与BD1或BD2相同的第三结合域(BD3)，并且通过第二铰链(即接头H75或H68，分别示于SEQIDNO:742和78)连接到单链多肽上。仍然在进一步实施方式中，实施方式(1)-(32)的多肽异二聚体还可以包含每个与BD1或BD2相同或不同的第三和第四结合域(BD3)和(BD4)，并且通过第二铰链(即接头H75或H68，分别示于SEQIDNO:742和78)连接到单链多肽上。
某些实施方式中，可对本发明的多肽异二聚体进行工程改造，使其具有的结合域对靶标特异细胞类型有不同亲和性。例如，可以期望多肽异二聚体的结合域对TCR复合物或其成分和另一个结合域对肿瘤抗原(或B细胞靶标)特异结合有肿瘤抗原的肿瘤细胞(或有B细胞靶标的B细胞)有更高亲和性，以至于多肽异二聚体先结合肿瘤细胞(或B细胞)并且然后通过其TCR/CD3结合域引入T细胞到肿瘤位点或细胞。例如，不同结合亲和性可以通过对一个靶标选择比其他结合域对其靶标的更高结合亲和性的结合域，或者通过包括在多肽异二聚体的一个靶标的多个结合域和第二或其他靶标的单个结合域或更少结合域实现。另外，使用不同铰链(即使用不同长度铰链)可以影响多于另一个的一个域的结合，或对不同结合域使用不同铰链，以改变结合域的结合活性。
某些实施方式中，多个结合域可以需要彼此定位在合适的距离，以至于其与其靶标的相互作用会产生期望的结果。例如，某些实施方式中，在单链多肽上包含TCR复合物或其成分的结合域并且第二单链多肽包含肿瘤抗原或B细胞靶标的另一个结合域的多肽异二聚体可以都由与其相应链的氨基或羧基末端的结合域，以至于它们在多肽异二聚体上彼此物理接近。
示例异二聚体可以从本文所述的单链多肽对形成。如果本文所述序列确定数目包含信号肽序列(例如前20氨基酸)，所述信号肽序列不是形成示例多肽异二聚体的成熟单链多肽的部分，因此应该考虑排除。
示例单链多肽示于SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、29-32、53-72、74、810-826、859-864和874-882。
示例异二聚体可以从下述单链多肽对形成：SEQIDNO:2和4,SEQIDNO:6和8,SEQIDNO:10和12,SEQIDNO:14和16,SEQIDNO:18和20,SEQIDNO:20和22,SEQIDNO:20和24,SEQIDNO:30和32,SEQIDNO:29和31,SEQIDNO:29和32,SEQIDNO:30和72,SEQIDNO:53和72,SEQIDNO:54和72,SEQIDNO:55和72,SEQIDNO:70和72,SEQIDNO:71和72,SEQIDNO:63和56,SEQIDNO:64和57,SEQIDNO:65和60,SEQIDNO:66和58,SEQIDNO:67和59,SEQIDNO:68和61,SEQIDNO:69和62,SEQIDNO:54和811,SEQIDNO:54和812,SEQIDNO:54和813,SEQIDNO:814和818,SEQIDNO:815和818,SEQIDNO:816和818,SEQIDNO:817和818,SEQIDNO:814和820,SEQIDNO:814和821,SEQIDNO:54和819,SEQIDNO:814和826,SEQIDNO:814和822,SEQIDNO:814和823,SEQIDNO:814和824,SEQIDNO:859和862,SEQIDNO:860和863,SEQIDNO:861和864,SEQIDNO:874和825,SEQIDNO:875和879,SEQIDNO:876和880,SEQIDNO:877和881,或SEQIDNO:878和882。
核酸，载体，宿主细胞和生成异二聚体的方法
在相关的方面，本发明也提供本文提供的编码单链多肽的分离核酸(与“多核苷酸”互用)分子。示例核酸分子(有或没有编码信号肽序列的核酸序列)示于SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25-28、33-52和792-808。
本发明也提供包含编码本文提供的单链多肽的核酸序列。如本文所用，“载体”涉及能够运输所连接的另一核酸的核酸分子。示例性载体包括质粒、酵母人工染色体和病毒基因组。某些载体可在宿主细胞中自主复制，而另一些载体可整合到宿主细胞基因组中从而随宿主基因组一起复制。
在某些实施方式中，载体可是重组表达载体。“重组表达载体”或“表达载体”涉及包含选择连接表达对照序列(例如启动子)的核酸序列，并且因此能定向所述序列的表达。
可利用CAT(氯霉素转移酶)载体或具有选择性标记的其它载体从任何所需基因中选择本文提供的用于表达载体的启动子序列。真核启动子包括CMV即刻早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-I。在某些实施方式中，启动子是诱导型启动子。
在某些实施方式中，载体是表达包含编码本文提供多肽异二聚体的第一单链多肽核酸序列的载体。在另一些实施方式中，载体是表达包含编码本文提供多肽异二聚体的第二单链多肽核酸序列的载体。
在某些实施方式中，载体是表达包含编码多肽异二聚体的第一和第二单链多肽核酸序列的载体。编码第一单链多肽的核酸序列的启动子可以与编码第二多肽的核酸启动子相同。或者，编码第一单链多肽的核酸序列的启动子可以与编码第二多肽的核酸启动子不同，以至于第一和第二单链多肽的表达水平可以不同地调节到最大化第一和第二单链多肽的异二聚化。在某些实施方式中，编码第一和第二单链多肽的核酸的一个或两个启动子是可诱导启动子。
本发明也提供转化或转染有、或其他包含本文提供的任何核酸或载体的宿主细胞。示例宿主细胞包含VERO细胞，HeLa细胞，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系(包含修饰的能修饰表达多价结合分子的糖基化模式的CHO细胞，见美国专利应用公开号2003/0115614)，COS细胞(例如COS-7)，W138，BHK，HepG2，3T3，RIN，MDCK，A549，PC12，K562，HEK293细胞，HepG2细胞，N细胞，3T3细胞，草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞(例如Sf9细胞)，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞，大肠杆菌(Escherichiacoli)，枯草杆菌(Bacillussubtilis)，鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)或链霉菌(Streptomycete)家族成员。
在某些实施方式中，宿主细胞包含含有编码第一单链多肽的核酸的第一表达载体和含有编码第二单链多肽的核酸的第二表达载体。
在另一些实施方式中，宿主细胞包含含有编码第一和第二单链多肽的核酸的表达载体。
本发明也包含生成本文所述多肽异二聚体的方法。在某些实施方式中，方法包含培育含有编码第一和第二单链多肽的核酸，在合适情况下表达多肽的宿主细胞，并且选择分离或纯化从培育中第一和第二单链多肽形成的异二聚体。编码第一单链多肽的核酸和编码第二单链多肽的核酸可以出现在宿主细胞中的单个表达载体或宿主细胞中的两个不同的表达载体上。在后者示例中，两个表达载体的比率可以控制到最大化第一和第二单链多肽的异二聚化。
本发明提供纯化本文所述的多肽异二聚体。本文所用术语“纯化”指与其它组分分离的组分，其中多肽异二聚体相对于天然可获得状态富集至任何程度。某些实施方式中，本发明提供基本纯化本文所述的多肽异二聚体。“基本纯化”指明表示多肽组合物中，所述多肽异二聚体构成该组合物的主要成分，例如多肽占组合物中重量的至少约50％，例如至少约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％。
蛋白质纯化技术是本领域技术人员众所周知的。这些技术包括在某一水平上对多肽和非多肽组分进行粗分级。常常需要使用色谱和电泳技术进行进一步纯化，以实现部分或完全纯化(或纯化至均一)。特别适合制备纯融合蛋白的分析方法是离子交换色谱、大小排阻色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦。特别有效的纯化肽方法是快速蛋白质液相色谱和HPLC。
本领域技术人员能够从本发明中获知定量分析纯化程度的各种方法。例如，所述包含通过本文提供的实施例所示的SDS/PAGE分析和HPLC评估多肽异二聚体的量。
生成本文提供的多肽异二聚体的方法优于首先表达和分别纯化单独多肽异二聚体多肽，并且然后一起培养纯化单独单链多肽以形成多肽异二聚体的方法。例如，当单独表达某些单链多肽(例如某些只含有CH1区作为其免疫球蛋白异二聚化域的多肽)时，单链多肽不稳定。另外，分别表达和纯化单独单链多肽随后结合纯化单独单链多肽比共表达两个单链多肽随后纯化生成的多肽异二聚体需要更多步骤，并且通常效率更低。
使用异二聚体的组合物和方法
除了多肽异二聚体，本发明也提供包含多肽异二聚体的药物组合物和单位剂量形式，和使用多肽异二聚体药物组合物和单位剂量形式的方法。
本发明的多肽异二聚体的组合物通常包含本文提供的多肽异二聚体与药学上可接受赋形剂(包含药学上可接受载体和稀释剂)的结合。药学上可接受的赋形剂在所用剂量和浓度下应对接受者无毒。它们为药学领域所熟知，并描述在例如Rowe等，HandbookofPharmaceuticalExcipients:AComprehensiveGuidetoUses,Properties,andSafety(《药物赋形剂手册：应用、性质和安全性指导大全》)，第5版，2006。
用于治疗应用的药学上可接受的载体也是药学领域所熟知的，并描述在例如Remington’sPharmaceuticalSciences(《雷明顿药物科学》)，麦克出版公司(MackPublishingCo.),(A.R.Gennaro编，1985)。示例性的药学上可接受的载体包括无菌盐水和生理pH下的磷酸盐缓冲盐水。药物组合物中可提供防腐剂、稳定剂、染料等。此外，也可采用抗氧化剂和悬浮剂。
药物组合物还可含有稀释剂如缓冲液，抗氧化剂如抗坏血酸，低分子量(小于约10个残基)的多肽，蛋白质，氨基酸，糖(如葡萄糖、蔗糖、糊精)，螯合剂(如EDTA)，谷胱甘肽，以及其它稳定剂和赋形剂。示例性的稀释剂有混有非特异性血清白蛋白的盐水或中性缓冲盐水。例如，用合适赋形剂溶液(如蔗糖)为稀释剂将产物可以配制成冻干物。
例如，本发明也提供治疗与过份受体介导信号转导相关的疾病或紊乱的方法，包含对其所需患者摄入含有特异结合受体的结合域的有效剂量的多肽异二聚体，所述受体例如受体酪氨酸激酶，包含EGFR、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、c-Met、RON和EphA2。
与过度受体介导信号转导相关的示例疾病或紊乱包含癌症(如实体肿瘤和血液恶性肿瘤)，自体免疫或炎症疾病或病症，细菌感染和病毒感染造成的败血症。
在一方面，本发明提供指导T细胞活性的方法，包括给予有需要的患者有效剂量的多肽异二聚体，所述多肽异二聚体包含特异结合TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε或其组合的结合域和特异结合不同靶标，例如在需要T细胞活性的位点或细胞选择的癌症特异抗原或其他抗原的第二结合域。
在另一方面，本发明提供抑制恶性肿瘤(例如，实体肿瘤或血液恶性肿瘤)的生长、转移或转移生长的方法，包括给予有需要的患者有效量的本文所述多肽异二聚体或其组合物。
本文所述组合物与方法可用于治疗包括实体恶性肿瘤和血液恶性肿瘤在内的多种癌症。可治疗的癌症包括但不限于：乳腺、前列腺、胰腺、结肠和直肠的腺癌；所有形式的肺部支气管癌(包括鳞状细胞癌，小细胞肺癌和非小细胞肺癌)；骨髓瘤；黑色素瘤；肝细胞瘤；神经母细胞瘤；乳头状瘤；胺前体摄取脱羧细胞瘤；迷芽瘤；鳃原性瘤；恶性类癌综合征；类癌心脏症；和癌症(例如，Walker氏癌、基底细胞癌、鳞状基底细胞癌、布-皮二氏(Brown-Pearce)癌、导管癌、艾氏(Ehrlich)肿瘤、Krebs2癌、merkel细胞癌、粘蛋白癌、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、乳头癌、硬癌、细支气管癌、支气管原癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)。可治疗的其它类型癌症包括：组织细胞疾病；白血病；恶性组织细胞增多病；霍奇金病；免疫增生性小瘤；非霍奇金氏淋巴瘤；浆细胞瘤；网状内皮组织增殖；黑色素瘤；成软骨细胞瘤；软骨瘤；软骨骨瘤；纤维瘤；纤维肉瘤；巨细胞瘤；组织细胞瘤；脂肪瘤；脂肉瘤；间皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；颅咽管瘤；无性细胞瘤；错构瘤；间叶瘤；中肾瘤；肌肉瘤；成釉细胞瘤；牙骨质瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；滋养层肿瘤。此外，还考虑下列类型癌症可进行治疗：腺瘤；胆管瘤；胆脂瘤；圆柱瘤；囊腺癌；囊腺瘤；粒层细胞肿瘤；两性母细胞瘤；肝细胞瘤；汗腺腺癌；胰岛细胞癌；Leydig细胞瘤；乳头状瘤；Sertoli细胞瘤；膜细胞瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；成肌细胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；横纹肌瘤；横纹肌肉瘤；室管膜瘤；神经节瘤；胶质瘤；成神经管细胞瘤；脑脊膜瘤；神经鞘瘤；神经母细胞瘤；神经上皮瘤；神经纤维瘤；神经瘤；副神经节瘤；非嗜铬性副神经节瘤；和多形性成胶质细胞瘤。可治疗的癌症类型还包括但不限于：血管角质瘤；有嗜曙红细胞增多的血管淋巴样增生；致硬化的血管瘤；血管瘤病；血管球瘤；血管内皮瘤；血管瘤；血管外皮细胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果体瘤；癌肉瘤；软骨肉瘤；叶状柄囊性肉瘤；纤维肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白血病性肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；横纹肌肉瘤；肉瘤；瘤；神经纤维瘤病；和宫颈发育异常。
也可用本文所述组合物与方法治疗的其它示例性癌症有B细胞癌，包括B细胞淋巴癌[例如，各种形式的霍奇金氏病，非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或中枢神经系统淋巴瘤]，白血病[例如，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，毛细胞白血病和慢性成肌细胞白血病]和骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)。其它B细胞癌包括小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞前淋巴细胞性白血病，淋巴浆细胞淋巴瘤，脾缘区淋巴瘤，浆细胞性骨髓瘤，孤立性骨浆细胞瘤，骨外浆细胞瘤，粘膜相关淋巴组织(MALT)结外边缘区B细胞淋巴瘤，结边缘区B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，套膜细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤，血管内大B细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，伯奇氏淋巴瘤/白血病，不确定恶性潜能的B细胞增殖，淋巴瘤样肉芽肿病和移植后的淋巴增殖性疾病。
某些实施方式中，用于抑制实体肿瘤的生长或实体肿瘤或血液恶性肿瘤的转移或转移性生长的多肽异二聚体包含特异结合到肿瘤或癌症抗原和T细胞靶标。所述异二聚体通常设计成对肿瘤或癌症抗原比T细胞靶标有更高结合亲和性(例如至少约5、10、15、20、25、50、75或100倍更高)，以至于其优选首先结合肿瘤或癌症抗原并且随后结合T细胞靶标，接着引入并激活T细胞以损伤或破坏其表面有肿瘤或癌症抗原的肿瘤或癌症细胞。示例肿瘤或癌症抗原和T细胞靶标包含上述多肽异二聚体结合域部分所提供的那些。例如，T细胞靶标能是CD3或PSMA。
某些实施方式中，用于抑制恶性肿瘤的生长、转移或转移性生长，或通过介导T细胞激活的多肽异二聚体包含至少一个特异结合肿瘤靶标(包含肿瘤或细胞抗原，例如RON、c-Met、CEACAM-6或PSMA)的结合域，和另一个特异结合TCR复合物或其成分(例如TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ和CD3ε)的结合域。
另一些实施方式中，用于抑制恶性肿瘤的生长、转移或转移性生长的多肽异二聚体包含至少一个特异结合CD28的结合域和另一个特异结合CD79b的结合域。所述多肽异二聚体还可以包含含有PDL2胞外域，特异结合超级IL-6的结合域或两个结合域。
另一些实施方式中，用于抑制恶性肿瘤的生长、转移或转移性生长的多肽异二聚体包含至少一个特异结合RON的结合域和另一个特异结合c-Met的结合域。
另一些实施方式中，用于抑制恶性肿瘤的生长、转移或转移性生长的多肽异二聚体包含特异结合一个或多个下列受体酪氨酸激酶的结合域：c-Met、RON、EGFR、EGFRvIII、Her2、ErbB3、ErbB4和IGF1R、EphA2。某些实施方式中，异二聚体还可以包含一个或多个特异结合一个或多个下列抗血管新生试剂的结合域：PDGFR、VEGFR1-4和促血管生成素2。某些实施方式中，上述异二聚体还可以包含一个或多个特异结合一个或多个下列Fc受体的结合域以增加细胞毒性效应器功能靶标：CD64、CD32A和CD16。某些实施方式中，上述异二聚体还包含特异结合转铁蛋白受体(CD71)的结合域以能降解所述受体。
另一些实施方式中，用于抑制恶性肿瘤的生长、转移或转移性生长的多肽异二聚体包含两个或多个下列TNFSFR的激动剂的结合域：TNFR1、TNFR2、DR4、DR5、TWEAKR和FAS。
另一些实施方式中，用于抑制恶性肿瘤的生长、转移或转移性生长的多肽异二聚体包含特异结合两个或多个下列促肿瘤细胞因子或生长因子的结合域：HGF、MSP、EGF(包含epiregulin、herregulin、β-regulin、神经调节蛋白)、HIF-1α、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、TNFα、IL-6、超级IL-6、IL-8、Wnt、sHH、TGFβ或PDGF。
某些实施方式中，用于抑制恶性肿瘤的生长、转移或转移性生长的多肽异二聚体包含特异结合下列的那些多肽异二聚体，例如EGFR、ErbB3、ErbB4、c-Met、RON、EphA2、IGF1R、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、CD44v6、CD151、EpCAM、CEACAM6、TGFBR2、GHRHR、GHR、IL-6R、gp130、TNFR2、PD1、TWEAK-R、OSMRβ、Patched-1、卷曲蛋白(Frizzled)或Robo1。
用于抑制血液恶性肿瘤的转移或转移性生长的多肽异二聚体包含特异结合下列的那些多肽异二聚体，例如EGFR、ErbB3、c-Met、RON、EphA2、IGF1R、TGFBR2、IL-6R、gp130、TNFR2、PD1、OSMRβ、LTβR、CD19、CD80、CD81或CD86。
另一方面，本发明提供治疗自体免疫或炎症疾病、紊乱或病症的方法，包含给予需要患者本文提供的有效量的多肽异二聚体或其成分。
可以通过熔合蛋白和成分和其单位剂量形式的示例自体免疫或炎症疾病、紊乱或病症包括但不限于，炎性肠病(如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)、糖尿病(如I型糖尿病)、皮肌炎、多肌炎、恶性贫血、原发性胆汁性肝硬变、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、阿狄森病(Addison'sdisease)、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫肝炎、古德帕斯彻综合征(Goodpasture'ssyndrome)、格雷夫斯病(Grave’sdisease)、格-巴综合征(Guillain-Barrésyndrome)(GBS)、桥本病(Hashimoto’sdisease)、特发性血小板减少性紫癜、系统红斑狼疮、狼疮肾炎、神经精神病狼疮、多发性硬化(MS)、重症肌无力、寻常性天疱疮、哮喘、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、舍格伦综合征(syndrome)、颞动脉炎(也称为“巨细胞性动脉炎”)、自身免疫性溶血、大疱性类天疱疮、血管炎、腹部疾病、慢性阻塞性肺病、子宫内膜异位、化脓性汗腺炎、间质性膀胱炎、局限性硬皮病、硬皮病、发作性睡病、神经肌强直、白斑病和自身免疫性内耳病。
用于治疗自体免疫或炎症疾病、紊乱或病症的示例性多肽异二聚体可以包含一个或多个特异结合CD28的结合域，和一个、两个或三个下列附加结合域：包含PDL2胞外域的结合域，包含单IL-10的结合域和特异结合CD86的结合域。例如，多肽异二聚体可以包含特异结合CD28的结合域和1-3个特异结合CD86的结合域。
用于治疗自体免疫或炎症疾病、紊乱或病症的附加示例性多肽异二聚体可以包含一个或多个特异结合CD28的结合域和一个或多个是IL-10激动剂(如单IL-10)、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗剂、GITRL拮抗剂或CD40拮抗剂的结合域。或者，多肽异二聚体可包含两个或多个选自IL-10激动剂(例如单IL-10)、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗剂、GITRL拮抗剂或CD40拮抗剂的结合域。
用于治疗自体免疫或炎症疾病、紊乱或病症的附加示例性多肽异二聚体可以包含一个或多个特异结合CD32B的结合域和一个或多个是IL-10激动剂(如单IL-10)、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗剂、GITRL拮抗剂或CD40拮抗剂的结合域。
用于治疗自体免疫或炎症疾病、紊乱或病症的附加示例多肽异二聚体可以包含特异结合一个或多个下列TNFSFR的结合域：TNFR1、TNFR2、HVEW、LTβR、TWEAKR、TACI、BAFF-R、BCMA或FAS。
用于治疗自体免疫或炎症疾病、紊乱或病症的附加示例多肽异二聚体可以包含特异结合两个或多个下列促炎细胞因子/趋化因子的结合域，例如TNFα、IL-6、IL-2、IL-1、IL-8、IP-10、IFNγ、IFNα、RANKL、FASL、TGFβ、IL7、IL10、IL17A/F、TWEAK、CSF2、IGF1、IGF2或BLyS/APRIL。
用于治疗自体免疫或炎症疾病、紊乱或病症的附加示例多肽异二聚体可以包含特异结合下列的那些多肽异二聚体，例如，TGFBR2、IL-6R、gp130、TNFR1、TNFR2、PD1、HVEM、OX40、CD40、CD137、TWEAK-R、LTβR、LIFRβ、OSMRβ、CD3、TCRα、TCRβ、CD19、CD28、CD80、CD81、CD86、TLR7、TLR9或其任意组合。
另一方面，本发明提供治疗B细胞相关紊乱或疾病的方法，所述方法包含给予所需患者(如有或怀疑有B细胞相关紊乱或疾病的患者)有效量的本文提供的多肽异二聚体，例如特异结合B细胞靶标的那些。
治疗B细胞相关紊乱或疾病的多肽异二聚体可以包含特异结合一个或多个B细胞靶标的结合域，所述靶标例如CD79b、CD19、HLA-DR、CD20、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38或CD70。多肽异二聚体还可以包含特异结合T细胞靶标的结合域，所述靶标例如TCR复合物或其成分，包含TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ或CD3ε。
用于治疗B细胞相关紊乱或疾病的多肽异二聚体可包含特异结合B细胞靶标，例如CD79b、CD19、HLA-DR、CD20、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38和CD70，的结合域和特异结合CD64、CD32A或CD16的结合域以增加细胞毒素效应器功能的靶向。
本发明的多肽异二聚体或其组合物可以经口、局部、透皮、肠胃外、通过吸入喷雾、经阴道、经直肠、通过颅内注射或其任意组合来给予。在一种实施方式中，肠胃外给予多肽异二聚体或其组合物。本文所用术语“肠胃外”包括皮下注射、静脉内、肌内、脑池内注射或输注技术。还考虑通过静脉内、皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射和/或外科植入特定位点来给药。例如，发明包含通过静脉内注射给予多肽异二聚体或其组合物。
药学有效剂量取决于疾病类型、所用组合物、给药途径、所治疗对象的类型、考虑治疗的特定对象的身体特征、平行用药和医学领域技术人员应认识到的其它因素。例如，可根据本发明的多肽异二聚体的效能，给予0.01mg/kg至1000mg/kg(例如，约0.1-1mg/kg、约1-10mg/kg、约10-50mg/kg、约50-100mg/kg、约100-500mg/kg或约500-1000mg/kg)体重的活性成分(可作为一次剂量给予，或每天、每周、每月给予一次，或以任何合适间隔给予)。
还考虑联合给予多肽异二聚体或其组合物和第二试剂。第二试剂可以是本领域接受为针对特定疾病状态或病症，如癌症、炎症、自体免疫和感染的标准治疗的试剂。考虑示例第二试剂包含结合不同于第一多肽异二聚体靶标的多肽异二聚体，多克隆抗体、单克隆抗体、免疫球蛋白衍生融合蛋白、化疗、电离辐射、类固醇、NSAID、抗感染剂或其他活性和辅助试剂，或其任意组合。
在某些实施方式中，多肽异二聚体和第二试剂协同作用。换言之，这两种化合物相互作用使得化合物的组合效果优于各化合物单独给予时的个体效果之和(参见例如，Berenbaum,Pharmacol.Rev.41:93,1989)。
在另一些实施方式中，多肽异二聚体和第二试剂叠加作用。换言之，这两种化合物相互作用使得化合物的组合效果与各化合物单独给予时的个体效果之和相同。
可与本文所述多肽异二聚体或其组合物联合使用的第二药剂可以是类固醇，NSAID，mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素(西罗莫司)、坦罗莫司、得夫罗莫司、依维莫司、唑他莫司、姜黄素、法尼基硫代水杨酸)，神经贮钙蛋白抑制剂(例如，环孢菌素、他克莫司)，抗代谢物(例如，霉酚酸、麦考酚酸吗乙酯)，多克隆抗体(例如，抗胸腺细胞球蛋白)，单克隆抗体(例如，达克珠单抗、巴利昔单抗)和CTLA4-Ig融合蛋白(例如，阿巴西普或贝拉西普)。
可用于抑制实体恶性肿瘤的生长，抑制实体恶性肿瘤的转移或转移性生长，或者治疗或缓解血液恶性肿瘤的第二药剂，包括化疗剂、离子辐射和其它抗癌药物。考虑为进一步治疗剂的示例性化疗剂包括烷化剂，如氮芥类(例如，双氯乙基甲胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥和苯丁酸氮芥)；双功能化疗剂(例如苯达莫司汀)；亚硝基脲类(例如，卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(甲基-CCNU))；亚乙基氨基类和甲基蜜胺类(例如，曲他胺(TEM)、三亚乙基硫代磷酰胺(噻替派)和六甲三聚氰胺(HMM、六甲蜜胺))；烷基磺酸盐类(例如，白消安)；和三嗪类(例如，达卡巴嗪(DTIC))；抗代谢物，例如叶酸类似物(例如，甲氨蝶呤、三甲曲沙、培美曲塞(多靶抗叶酸剂))；嘧啶类似物(例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿嘧啶脱氧核苷、吉西他滨、阿糖胞苷(AraC、阿糖胞嘧啶)、5-氮杂胞苷和2,2’-双氟脱氧胞苷)；和嘌呤类似物(例如，6-巯基嘌呤、6-巯基鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2’-脱氧柯福霉素(喷司他汀)，红羟基壬基腺嘌呤(EHNA)，磷酸氟达拉滨，2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨、2-CdA))；I型拓扑异构酶抑制剂如喜树碱(CPT)、拓扑替康和伊立替康；天然产物，例如表鬼臼毒素类(例如，依托泊苷和替尼泊苷)；和长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱和长春瑞滨)；抗肿瘤抗生素如放线菌素D、多柔比星和博来霉素；放射增敏剂如5-溴脱氧尿苷、5-碘脱氧尿苷和溴脱氧胞苷；铂配位络合物如顺铂、卡铂和奥沙利铂；取代脲类如羟基脲；和甲基肼衍生物如N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼。
某些实施方式中，用于抑制恶性肿瘤的生长转移或转移性生长的第二药剂包含根据本发明的结合肿瘤细胞靶标而不是结合第一多肽异二聚体靶标的多肽异二聚体。在某些其它实施方式中，可用于此类治疗的第二药剂包括能结合癌细胞靶标的多克隆抗体、单克隆抗体和免疫球蛋白衍生的融合蛋白。在描述用于上述注解治疗的多肽异二聚体的靶标的文中提供示例癌症细胞靶标。
本发明考虑的其它治疗自体免疫疾病的治疗剂被称作免疫抑制剂，其用于抑制或掩蔽被治疗个体的免疫系统。例如，免疫抑制剂包括非甾体抗炎药(NSAID)，止痛药，糖皮质激素，用于治疗关节炎的疾病改善性抗风湿性药物(DMARD)，或生物学反应修饰剂。DMARD描述中的组分也用于治疗类风湿性关节炎以外的很多其它自身免疫性疾病。
示例性NSAID选自布洛芬、甲氧萘丙酸、甲氧萘丙酸钠、Cox-2抑制剂如Vioxx和Celebrex，和唾液酸化剂。示例性止痛药选自扑热息痛、羟考酮、曲马多或盐酸丙氧芬。示例性糖皮质激素选自可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、强的松龙或氯泼尼松。示例性生物学反应修饰剂包括针对细胞表面标记物的分子(例如，CD4、CD5等)，细胞因子抑制剂如TNF拮抗物(例如依那西普(Enbrel)、阿达木单抗(Humira)和英利昔单抗(Remicade))，趋化因子抑制剂和粘着分子抑制剂。生物学反应修饰剂包括单克隆抗体以及分子的重组形式。示例性DMARD包括硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟洛米、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹、金(口服(金诺芬)和肌肉内的)和米诺环素。
用于治疗自体免疫或炎症疾病、紊乱或病症的附加第二药剂可以是多克隆或单克隆抗体、免疫球蛋白衍生融合蛋白(例如scFv、SMIPTM、PIMS、SCORPIONTM融合蛋白)或根据本发明特异结合与疾病、紊乱或病症相关靶标的多肽异二聚体。本发明用于上述注解治疗的多肽异二聚体靶标的上文提供所述靶标的示例。
本文关注分子结合组合物和所述第二活性药剂可以在同一制剂中同时给予。或者，所述第二药剂可以在单独制剂中但同时给予(即，彼此的给予相隔小于1小时)。
在某些实施方式中，可以给予所述第二活性药剂，然后给予多肽异二聚体或其组合物。在先给予指所述第二活性药剂的给予比用所述多肽异二聚体或其组合物进行治疗早至少1小时。还考虑可以在给予所述结合分子组合物以后给予所述活性药剂。在后给予是指在给予所述多肽异二聚体或其组合物至少1小时后给予。
本发明考虑到包含本发明药物组合物的剂量单位。所述剂量单位包含例如，单剂量或多剂量小瓶或注射器，包含两室小瓶或注射器，一室包含冻干形式的本发明药物组合物，另一室包含用于重建的稀释剂。多剂量的剂量单位也可以是，例如，用于连接于静脉内输注装置的(输液)袋或管。
本发明也关注在单位剂量或多剂量容器如药瓶中包含本发明药物组合物，以及有关将该组合物给予本文所述疾病的疾病患者的一组说明的药盒。
实施例
实施例1
含两对异二聚化域的二价多肽异二聚体
多肽异二聚体X0172通过共表达单链多肽X0130(2E12CH1CH2CH3Ck)和X0168(CkCH2CH3CH1H682E12)生成。单链多肽X0130从其氨基到羧基末端含有：2E12(抗CD28)scFv，人IgG1CH1，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2，人IgG1CH3和改变的人Ck(没有第一个Arg或最后一个Cys)。X130的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:1和2所示。单链多肽X0168从其氨基到羧基末端含有：改变的人Ck(没有第一个Arg或最后一个Cys)，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2，人IgG1CH3，人IgG1CH1，H68接头和2E12(抗CD28)scFv。X0168的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:3和4所示。H68接头的氨基酸序列示于SEQIDNO:78。
为了对比，多肽异二聚体X0124通过共表达单链多肽X0112(2E12CH1CH2CH3)和X0113(CkCH2CH3)生成。单链多肽X0112从其氨基到羧基末端含有：2E12(抗CD28)scFv，人IgG1CH1，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2和人IgG1CH3。X0112的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:5和6所示。单链多肽X0113从其氨基到羧基末端含有：改变的人Ck(没有第一个Arg或最后一个Cys)，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2和人IgG1CH3。X0113的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:7和8所示。
表达
转染前一日，将HEK293细胞以每毫升0.5x106个细胞的细胞浓度悬浮于在Freestyle293表达培养基中(吉布可公司(Gibco))。大型转染使用250ml细胞，但小型转染使用60ml细胞。转染当天，将320ul293fectin试剂(英杰公司)和8ml培养基混合。同时，也将对应两条链的各250ugDNA与8ml培养基混合并孵育5分钟。孵育15分钟后，将DNA-293fectin混合液加入250ml的293细胞中，并返回摇床在37℃下以120RPM速度振荡。对使用60ml细胞的较小转染，用四分之一的DNA、293fectin和培养基。
纯化
蛋白A亲和层析用于纯化。2mL填充蛋白A琼脂糖(瑞普里根公司(Repligen))加入到伯乐(Biorad)柱(Econo柱色谱柱，大小2.5x10cm)，用PBS充分洗涤(10x柱体积)和载入上清液，用PBS再洗涤并且用3柱体积的PierceIgG洗脱缓冲液洗脱。然后用PBS充分透析蛋白。然后使用Amicon离心滤膜设备浓缩蛋白到终体积约0.5mL。
第二步纯化使用蛋白L亲和层析或阳离子交换色谱。蛋白L纯化，蛋白A纯化的多肽异二聚体通过已经用PBS预平衡的蛋白L琼脂糖柱，用PBS(10x柱体积)洗涤并且然后用PierceIgG洗脱缓冲液洗脱。然后使用PBS充分透析并且使用Amicon离心滤膜设备将蛋白浓缩至终体积约0.5mL。
前面亲和纯化(蛋白A或蛋白L)多肽异二聚体结构的样品(200-300ug)透析到20mMMES，pH6.0(缓冲液A)并且以2mL/min流速载入到MonoS5/50GL阳离子交换柱(GE医疗保健公司)，使用AKTA探测器FPLC。使柱平衡5柱体积(CV)并且然后以梯度形式流入到超过20CV的50％:50％缓冲液A:缓冲液B(缓冲液B是20mMMES，1MNaCl，pH6.0)的混合物中。随后100％缓冲液B混合物流到5CV以清洗柱，并且系统流过另外5CV的100％缓冲液A以在下一次注射前重新平衡。收集峰并且用SDS-PAGE和电喷雾质谱分析。
SDS-PAGE分析
纯化蛋白使用英杰公司X细胞Surelock胶盒在10％SDS-PAGE凝胶上分析。
PMA的次优浓度的协同
通过淋巴细胞分离培养基(俄亥俄州奥罗拉的MP生物药品公司(MPBiomedicals))离心，从来自内部供体的含有肝素的全血中分离外周血单核细胞(PBMC)，并且用RPMI培养基(加利福尼亚州卡尔斯巴德的吉布可-英杰公司)洗涤两次。然后使用MACSCD4+T细胞分离试剂盒(加利福尼亚州奥本的美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotec))从PBMC中负向选择富集CD4+T细胞。富集(>95％)CD4+T细胞然后在完全RPMI/10％FCS中以每ml1x106细胞的浓度重新悬浮。检测试剂用完全RPMI/10％FCS在40ug/ml制备(产生终浓度10μg/ml)，并且每孔加入50μl到平底96孔板(加利福尼亚州圣何赛的BDFalcon公司)。完全RPMI/10％FCS中的PMA(M佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯；加利福尼亚州圣地亚哥市的A.G.科学公司)以4ng/ml每孔加入50ul(终浓度1ng/ml)。然后完全RPMI/10％FCS中的T细胞以每孔5x104细胞的浓度加入50μl体积，并且最终合适量完全RPMI/10％FCS加入到每个孔(通常50ul)以生成每孔终体积200ul。细胞用检测样品+/-PMA处理并且37℃5％CO2培养72小时。1微升的氚标记的胸苷(新泽西州Pisctaway的安玛西亚生物科学公司(AmershamBiosciences))在完全RPMI/10％FCS中1:50稀释(每孔50ul)加入到孔中培养至少6小时。平板用PackardFiltermate收集仪(马萨诸塞州波士顿的帕金埃尔默公司)收集到Unifilter-96GF/C微孔板(马萨诸塞州波士顿的帕金埃尔默公司)。数字表达为cpm和重复样品的平均值。
图2显示与2E12SMIPM0039(SEQIDNO:77)相比，多肽异二聚体X0172具有不同属性。它与PMA和SMIP没有协同作用。所述二价多肽异二聚体的属性更接近单价多肽异二聚体X0124而不是二价SMIP。
图3显示二价多肽异二聚体X0172与CD4+T细胞的结合优于2E12scFv(SEQIDNO:109)和单价多肽异二聚体X0124。
实施例2
使用单个异二聚化域对的二价、三价、四价多肽异二聚体
二价多肽异二聚体X0251通过共表达单链多肽X0244(Ck(YAE)CH2(N297A)CH3H682E12)和X0245(2E12CH1CH2(N297A)CH3)生成。单链多肽X0244从其氨基到羧基末端含有：人Ck(YAE)(例如，没有第一个Arg或最后一个Cys，但是有N30Y、V55A和T70E取代的人Ck)，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(N297A)(例如，有N297A取代的人IgG1CH2)，人IgG1CH3，H68接头和2E12(抗CD28)scFv。X0244的核酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:9和10所示。单链多肽X0245从其氨基到羧基末端含有：2E12(抗CD28)scFv，人IgG1CH1，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(N297A)和人IgG1CH3。X0245的核酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:11和12所示。
三价双特异性多肽异二聚体X0252通过共表达单链多肽X0246(P2C2Ck(YAE)CH2(N297A)CH3)和X0247(2E12CH1CH2(N297A)CH3H682E12)生成。单链多肽X0246从其氨基到羧基末端含有：P2C2(抗CD79b)scFv，人Ck(YAE)，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(N297A)和人IgG1CH3。X0246的核酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:13和14所示。单链多肽X0247从其氨基到羧基末端含有：2E12(抗CD28)scFv，人IgG1CH1，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(N297A)，人IgG1CH3，H68接头和2E12(抗CD28)scFv。X0247的核酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:15和16所示。
三价三特异性多肽异二聚体X0253通过共表达单链多肽X0248(P2C2CK(YAE)CH2(N297A)CH3H68A2)和X0249(PDL2ECDCH1CH2(N297A)CH3H682E12)生成。单链多肽X0248从其氨基到羧基末端含有：P2C2(抗CD79b)scFv，人Ck(YAE)，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(N297A)，人IgG1CH3，H68接头和A2(抗超级IL-6)scFv。X0248的核酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:17和18所示。单链多肽X0249从其氨基到羧基末端含有：PDL2ECD(例如PDL2胞外域)，人IgG1CH1，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(N297A)，人IgG1CH3，H68接头和2E12(抗CD28)scFv。X0249的核酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:19和20所示。
另一个四价四特异性多肽异二聚体X0283通过共表达单链多肽X0249(PDL2ECDCH1CH2(N297A)CH3H682E12)和X0281(单IL-10Ck(YAE)CH2(N297A)CH3H683D1)生成。单链多肽X0281从其氨基到羧基末端含有：单IL-10，人Ck(YAE)，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(N297A)，人IgG1CH3，H68接头和3D1(抗CD86)scFv。X0281的核酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:21和22所示。
作为多肽异二聚体X0283的对照，四价异二聚体，多肽异二聚体X0284通过共表达单链多肽X0249(PDL2ECDCH1CH2(N297A)CH3H682E12)和X0282(单IL-10CkCH2(N297A)CH3H683D1)生成。单链多肽X0282与X0281一致，除了其在人Ck序列中不包含N30YV55AT70E取代。因此，单链多肽X0282从其氨基到羧基末端含有：单IL-10，改变的人Ck(没有第一个Arg或最后一个Cys)，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(N297A)，人IgG1CH3，H68接头和3D1(抗CD86)scFv。X0282的核酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:23和24所示。
多肽异二聚体分子根据实施例1表达和纯化。纯化蛋白用SDS-PAGE电泳在还原和不还原情况下分析。大小排阻色谱在AKTA探测器FPLC(法玛西亚生物技术公司)使用Superdex20010/300GL柱完成。一些蛋白通过电喷雾质谱使用Agilent6120TOFES/MS分析。
采用HBS-P+(GE医疗保健公司)作为运行缓冲液在BiacoreT100SPR上进行表面等离振子共振(SPR)测定。靶标使用标准胺偶联化学(GE医疗保健公司的胺偶联试剂盒)直接固定到CM5芯片上，终固定水平800-1900Ru(共振单位)。多肽异二聚体X0283以10nM-1μM的梯度浓度在25℃或37℃以30μl/min流速注射150秒。监测解离，持续1200秒，通过注射50mMNaOH60秒进行表面再生。与表面的结合相互作用在至少60个再生循环中具有稳定性。采用Bia评价T100软件(版本2.0，GE医疗保健公司)分析数据。
SDS-PAGE电泳和阳离子交换色谱分析显示多肽异二聚体X0251、X0252和X0253表达和纯化良好(图4)。质谱分析显示X0252蛋白基本均一，含未检测量的同二聚体(图5)。另外，多肽异二聚体X0283和X0284的SDS-PAGE电泳和阳离子交换色谱分析显示相比于对照有CH1/Ck异二聚化域，也形成同源二聚体的多肽异二聚体X0284，有CH1/Ck(YAE)异二聚化域的多肽异二聚体X0283有效组装成异二聚体(图6)。Biocore分析还显示单链多肽X0281的羧基末端3D1(抗CD86)结合域单价结合到CD86(图7)。
实施例3
含抗RON和抗c-Met结合域的多肽异二聚体
制得含抗RON结合域(ORN151)的二价多肽异二聚体和含抗RON和抗c-Met结合域(ORN152和ORN153)的两个双特异性多肽异二聚体。
二价多肽异二聚体ORN151含有单链多肽ORN145(4C04CH2CH3CH1)和ORN148(11H09CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽ORN145从其氨基到羧基末端含有：4C04(抗RON)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人IgG1CH1。ORN145的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:26和30所示。单链多肽ORN148从其氨基到羧基末端含有：11H09(抗RON)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人CH2，人CH3和人Ck(YAE)。ORN148的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:28和32所示。
双特异性(c-Met,RON)多肽异二聚体ORN152含有单链多肽ORN116(MET021CH2CH3CH1)和ORN146(4C04CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽ORN116从其氨基到羧基末端含有：MET021(抗c-Met)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人IgG1CH1。ORN116的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:25和29所示。单链多肽ORN146从其氨基到羧基末端含有：4C04(抗RON)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人CH2，人CH3和人Ck(YAE)。ORN146的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:27和31所示。
双特异性(c-Met,RON)多肽异二聚体ORN153含有单链多肽ORN116(MET021CH2CH3CH1)和ORN148(4C04CH2CH3Ck(YAE))。
根据实施例1表达多肽异二聚体ORN151、ORN152和ORN153。获得如下表达水平：ORN151培养物蛋白质为1.9μg/mL，ORN152为3.1μg/mL，而ORN153为4.9μg/mL。
实施例4
有抗CD3结合域的多肽异二聚体
生成有抗CD3结合域的数个双特异性多肽异二聚体：多肽异二聚体S0268、S0269和TSC020-TSC030。多肽异二聚体S0268含有单链多肽ORN145(4C04CH2CH3CH1)和TSC019(G19-4CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC019从其氨基到羧基末端含有：G19-4(抗CD3)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人CH2，人CH3和人Ck(YAE)。TSC019的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:52和72所示。
双特异性(CD3,c-Met)的多肽异二聚体S0269含有单链多肽ORN160(5D5CH2CH3CH1)和TSC019(G19-4CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽ORN160从其氨基到羧基末端含有：5D5(抗c-Met)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人IgG1CH1。ORN160的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:33和53所示。
二价(CD19)多肽异二聚体TSC020含有单链多肽TSC001(HD37CH2CH3CH1)和TSC019(G19-4CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC001从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC001的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:34和54所示。
双特异性(CD20,CD3)多肽异二聚体TSC021含有单链多肽TSC002(2H7CH2CH3CH1)和TSC019(G19-4CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC002从其氨基到羧基末端含有：2H7(抗CD20)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC002的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:35和55所示。
双特异性(CD79b,CD3)多肽异二聚体TSC022含有单链多肽TSC017(P2C2H2CH3CH1)和TSC019(G19-4CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC017从其氨基到羧基末端含有：P2C2(抗CD19b)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC017的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:50和70所示。
双特异性(HLA-DR,CD3)多肽异二聚体TSC023含有单链多肽TSC018(M0042CH2CH3CH1)和TSC019(G19-4CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC018从其氨基到羧基末端含有：M0042(抗HLA-DR)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC018的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:51和71所示。
二价多肽异二聚体TSC024含有单链多肽TSC010(HD37-“IgA1铰链”-CH2CH3CH1)和TSC003(G19-4-“IgA1铰链”-CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC010从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，改变的人IgA1铰链(PSTPPTPSPSTPPTPSPSCPPCP,SEQIDNO:752)，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC010的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:43和63所示。单链多肽TSC003从其氨基到羧基末端含有：G19-4(抗CD3)scFv，改变的人IgA1铰链(SEQIDNO:752)，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC003的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:36和56所示。
二价多肽异二聚体TSC025含有单链多肽TSC011(HD37-“IgA1铰链”-CH2CH3CH1)和TSC004(G19-4-“IgA1铰链”-CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC011从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，改变的人IgA2铰链(PPPPPCPPCP,SEQIDNO:748)，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC011的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:44和64所示。单链多肽TSC004从其氨基到羧基末端含有：G19-4(抗CD3)scFv，改变的人IgA2铰链(SEQIDNO:748)，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC004的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:37和57所示。
二价多肽异二聚体TSC026含有单链多肽TSC012(HD37-“IgG1铰链”-CH2CH3CH1)和TSC007(G19-4-“IgG1铰链”-CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC012从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，改变的人IgG1铰链(EPKSSDKTHTSPPSPCPPCP,SEQIDNO:750)，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC012的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:45和65所示。单链多肽TSC007从其氨基到羧基末端含有：G19-4(抗CD3)scFv，改变的人IgG1铰链(SEQIDNO:750)，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC007的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:40和60所示。
二价多肽异二聚体TSC027含有单链多肽TSC013(HD37-“IgG3铰链”-CH2CH3CH1)和TSC005(G19-4-“IgG3铰链”-CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC013从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，改变的人IgG1铰链(EPKSSDTPPPSPRSPCPPCP,SEQIDNO:751)，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC013的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:46和66所示。单链多肽TSC005从其氨基到羧基末端含有：G19-4(抗CD3)scFv，改变的人IgG3铰链(SEQIDNO:751)，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC005的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:38和58所示。
二价多肽异二聚体TSC028含有单链多肽TSC014(HD37-“IgD铰链”-CH2CH3CH1)和TSC006(G19-4-“IgD铰链”-CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC014从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，改变的人IgD铰链(ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTCPPCP,SEQIDNO:754)，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC014的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:47和67所示。单链多肽TSC006从其氨基到羧基末端含有：G19-4(抗CD3)scFv，改变的人IgD铰链(SEQIDNO:754)，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC006的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:39和59所示。
二价多肽异二聚体TSC029含有单链多肽TSC015(HD37-“IgECH2铰链”-CH2CH3CH1)和TSC008(G19-4-“IgECH2铰链”-CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC015从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，改变的人IgECH2铰链(SEQIDNO:757)，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC014的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:48和68所示。单链多肽TSC008从其氨基到羧基末端含有：G19-4(抗CD3)scFv，改变的人IgECH2铰链(SEQIDNO:757)，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC008的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:41和61所示。
二价多肽异二聚体TSC030含有单链多肽TSC016(HD37-“IgMCH2铰链”-CH2CH3CH1)和TSC009(G19-4-“IgMCH2铰链”-CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC016从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，改变的人IgECH2铰链(SEQIDNO:759)，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC015的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:49和69所示。单链多肽TSC009从其氨基到羧基末端含有：G19-4(抗CD3)scFv，改变的人IgMCH2铰链(SEQIDNO:759)，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC009的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:42和62所示。
双特异性多肽异二聚体S0268(RON,CD3)和S0269(CD3,c-Met)根据实施例1表达。获得如下表达水平：S0268培养蛋白为2.2μg/mL，和S0269为2.7μg/mL。
实施例5
双特异性多肽异二聚体的细胞结合
为比较双特异性多肽异二聚体分子在靶向肿瘤细胞抗原和T细胞的有效性，抗RON(4C04结合域)x抗CD3(G19-4结合域)多肽异二聚体的细胞上(on-cell)结合特性，S0268(如实施例4所述)与有不同双特异性、含有相同结合域的支架蛋白(SCORPIONTM蛋白)S0266比较。另外，比较两个双特异性多肽异二聚体TSC020和TSC021(如实施例4所述)的细胞上(on-cell)结合特性，靶向不同B细胞抗原(TSC020的CD19和TSC021的CD20)和T细胞抗原(CD3)。SCORPION蛋白S0266的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:73和74所示。组成双特异性多肽异二聚体S0268、TSC020和TSC021的单链多肽的核酸和氨基酸序列分别示于SEQIDNO:26和52(核酸)、30和72(氨基酸)；34和52(核酸)、54和72(氨基酸)；和35和52(核酸)、55和72(氨基酸)(也见实施例4)。瞬时转染人293细胞，S0266培养物产生蛋白质6.9μg/mL；S0268培养物产生2.3μg/mL；TSC020培养物产生3.0μg/mL；而TSC021培养物产生3.2μg/mL。
MDA-MB-453(RON+)乳腺癌细胞，Rec1(CD19+,CD20+)套细胞淋巴瘤细胞和Jurkat(CD3+)T细胞白血病细胞从ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)获得，并且根据提供的方案培养。用来自美天旎生物技术公司(德国贝尔吉施格拉德巴赫)的泛T细胞分离试剂盒II从供体PBMC分离出T细胞。通过用生物素偶联的单克隆抗体和抗生物素磁性微珠间接磁性标记从PBMC分离出非T细胞。然后将这些细胞保持在有磁场环绕的柱，从而清除这些细胞。T细胞不在柱中滞留，从流出液中收集得到。
通过将5×105个T细胞或靶(MDA-MB-453、Rec1、Jurkat)细胞与梯度稀释的浓度从100nM到0.1nM的双特异性分子S0266(αRON×αCD3SCORPIONTM蛋白)或S0268(αRON×αCD3多肽异二聚体)(对MDA-MB-453细胞和分离的T细胞而言)；或TSC020(αCD19xαCD3)或TSC021(αCD20xαCD3)对Rec1和Jurkat细胞而言，一起在4℃孵育30分钟来评估结合。将细胞清洗3次，然后与羊抗人IgG-FITC(1:200稀释)在4℃再孵育30分钟。然后，细胞再次清洗3次，固定于1％多聚甲醛并在FACS-Calibur仪器上读取。
在FlowJo7.5版(俄勒冈州艾士兰的树星公司)中对高FSC、高SSC子集的分析显示双特异性分子S0266和S0268剂量依赖性结合MDA-MB-453与分离的T细胞(图8A和8B)。出人意料地，尽管缺少亲和力(avidity)的潜力，S0268多肽异二聚体结合MDA-MB-453细胞与T细胞的亲和性(affinity)与相应的SCORPIONTM分子(S0266)相当。还观察到多肽异二聚体在两种靶细胞类型上的更高饱和度，这可以是多肽异二聚体比相应的SCORPIONTM(二价Scorpion与表面抗原潜在的1:2结合)以更高计量学(多肽异二聚体1:1结合表面抗原)时的情形。Rec1和Jurkat细胞上CD19靶向的双特异性异二聚体(TSC020；HD37和G19-4结合域)和CD20靶向的双特异性异二聚体(TSC021；2H7和G19-4结合域)的比较揭示TSC020异二聚体对Rec1细胞比TSC021异二聚体有更高的亲和性(图9A)。然而，TSC020和TSC021异二聚体都显示对CD3+Jurkat细胞相似的结合，此在意料之中，因为两个异二聚体拥有相同的抗CD3结合域(G19-4)(图9B)。
实施例6
使用单个异二聚化域对的其它二价和三价多肽异二聚体
生成其它多特异性异二聚体：TSC046、TSC047、TSC048、TSC054、TSC055、TSC056、TSC057、TSC078、TSC079、TSC080、TSC099、TSC100、TSC101和TSC102。
二价多肽异二聚体TSC046含有单链多肽TSC001(HD37CH2CH3CH1)和TSC039(BMA031CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC001从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC001的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:34和54所示。单链多肽TSC039从其氨基到羧基末端含有：BMA031(抗TCR)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC039的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:793和811所示。
二价多肽异二聚体TSC047含有单链多肽TSC001(HD37CH2CH3CH1)和TSC041(CRIS7CH2CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC041从其氨基到羧基末端含有：CRIS7(抗CD3)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC041的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:794和812所示。
二价多肽异二聚体TSC048含有单链多肽TSC001(HD37CH2CH3CH1)和TSC043(OKT3-MCH2CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC043从其氨基到羧基末端含有：OKT3-M(Micromet的抗CD3变体，也见US7,635,472)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC043的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:795和813所示。
二价多肽异二聚体TSC054含有单链多肽TSC049(HD37CH2(无ADCC/CDC)CH3CH1)和TSC053(G19-4CH2(无ADCC/CDC)CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC049从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)(即，含L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A取代的人IgG1CH2)，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC049的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:796和814所示。单链多肽TSC053从其氨基到羧基末端含有：G19-4(抗CD3)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)(即，含L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A取代的人IgG1CH2)，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC053的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:800和818所示。
二价多肽异二聚体TSC055含有单链多肽TSC050(2H7CH2(无ADCC/CDC)CH3CH1)和TSC053(G19-4CH2(无ADCC/CDC)CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC050从其氨基到羧基末端含有：2H7(抗CD20)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC050的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:797和815所示。
二价多肽异二聚体TSC056含有单链多肽TSC051(P2C2CH2(无ADCC/CDC)CH3CH1)和TSC053(G19-4CH2(无ADCC/CDC)CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC051从其氨基到羧基末端含有：P2C2(抗CD79)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC051的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:798和816所示。
二价多肽异二聚体TSC057含有单链多肽TSC052(5D5CH2(无ADCC/CDC)CH3CH1)和TSC053(G19-4CH2(无ADCC/CDC)CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC052从其氨基到羧基末端含有：5D5(抗cMet)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC052的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:799和817所示。
二价多肽异二聚体TSC078含有单链多肽TSC049(HD37CH2(无ADCC/CDC)CH3CH1)和TSC076(OKT3CH2(无ADCC/CDC)CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC076从其氨基到羧基末端含有：OKT3(抗CD3)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC076的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:802和820所示。
二价多肽异二聚体TSC079含有单链多肽TSC049(HD37CH2(无ADCC/CDC)CH3CH1)和TSC077(NuvionCH2(无ADCC/CDC)CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC077从其氨基到羧基末端含有：Nuvion(抗CD3)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC077的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:803和821所示。
三价多肽异二聚体TSC080含有单链多肽TSC001(HD37CH2CH3CH1)和TSC064(G19-4CH2CH3Ck(YAE)H75Met021)。单链多肽TSC064从其氨基到羧基末端含有：G19-4(抗CD3)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2，人IgG1CH3，人Ck(YAE)，H75接头和Met021(抗c-Met)scFv(在C末端敲除三个丝氨酸残基)。TSC064的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:801和819所示。
二价多肽异二聚体TSC099含有单链多肽TSC049(HD37CH2(无ADCC/CDC)CH3CH1)和TSC097(4C04CH2(无ADCC/CDC)CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC097从其氨基到羧基末端含有：4C04(抗RON)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC097的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:808和826所示。
二价多肽异二聚体TSC100含有单链多肽TSC049(HD37CH2(无ADCC/CDC)CH3CH1)和TSC093(CRIS7CH2(无ADCC/CDC)CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC093从其氨基到羧基末端含有：CRIS7(抗CD3)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC093的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:804和822所示。
二价多肽异二聚体TSC101含有单链多肽TSC049(HD37CH2(无ADCC/CDC)CH3CH1)和TSC094(OKT3-MCH2(无ADCC/CDC)CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC094从其氨基到羧基末端含有：OKT3-M(Micromet的抗CD3变体)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC094的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:805和823所示。
二价多肽异二聚体TSC102含有单链多肽TSC049(HD37CH2(无ADCC/CDC)CH3CH1)和TSC095(BMA031CH2(无ADCC/CDC)CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC095从其氨基到羧基末端含有：BMA031(抗TCR)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3，人Ck(YAE)。TSC095的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:806和824所示。
根据实施例1表达和纯化多肽异二聚体分子。
实施例7
通过多肽异二聚体的靶标依赖T细胞增殖
为比较不同双特异性多肽异二聚体分子在诱导靶标依赖T细胞活化和增殖的有效性，比较含有一个常见抗CD19结合域(HD37)和三个不同抗CD3结合域(TSC054的G19-4、TSC078的OKT3、TSC079的HuM291)的三个不同双特异性分子(在实施例6所述的TSC054、TSC078和TSC079)。作为阳性对照，制备双特异性T细胞接合分子(BiTE)bsc19x3(见美国专利7,635,472)。bsc19x3的核酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:809和827所示。人293细胞中的瞬时转染生成的蛋白质就TSC054而言为2.33ug/mL，TSC078为0.67ug/mL和TSC079为3.5ug/mL。
道迪伯基特淋巴瘤细胞(CD19+)和MDA-MB-453(CD19-)乳腺癌细胞获自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)，并按所提供的方案培养。用标准菲可(ficoll)梯度从人血中分离外周血单核细胞(PBMC)。所分离的细胞用缓冲盐清洗。用来自美天旎生物技术公司(德国贝尔吉施格拉德巴赫)的泛T细胞分离试剂盒II按生产商的方案(更多信息还可参见实施例5)额外分离出T细胞。
增殖通过用羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)标记分离的PBMC或T细胞群评价。CFSE标记PBMC或T细胞置于U底96孔板，每孔分别有不同的肿瘤细胞数目150,000或100,000细胞，以达到T细胞与肿瘤细胞比率为10:1-3:1。检测分子的浓度范围8nM-0.08pM加入到细胞混合物，总共每孔200ul，在配有10％人或牛血清、丙酮酸钠和非必需氨基酸的RPMI1640培养基中。平板在潮湿培养箱中37℃,5％CO2下培育。三天后，用抗体标记细胞进行流式细胞分析。细胞在其最初板内被标记和洗涤以最小化转移中的细胞损失，并且所有标记都在有0.2％牛血清白蛋白的盐水缓冲液中完成。首先，细胞用100ug/ml人IgG在室温预培育15分钟。随后，细胞用下列染料标记抗体的混合物(总体积50ul)培养40分钟：CD5-PE、CD4-APC、CD8-太平洋蓝、CD25-PE-Cy7和7-氨基-放线菌素D(此后7AAD)。平板洗涤两次，重新悬浮在80-120ul体积中，并且立刻用BDLSRII流式细胞仪达到每孔80％的体积。样品文件用FlowJo软件分析以计算经历至少一次细胞分裂的细胞的百分比和数目，根据其CFSE概况，通过依次门控激活的、活体CD4+或CD8+T细胞(分别7AAD-、CD5+CD25+CD4+或7AAD-CD5+CD25+CD8+)。平均值和标准偏差使用微软Excel软件计算。图用微软Excel或GraphpadPrism生成。
用全PBMC处理的道迪细胞或MDA-MB-453细胞的活CD4+和CD8+群的分析(图10A-10D)揭示在出现靶标CD19抗原的道迪细胞中的细胞总体数目和增殖细胞百分比显著增加(图10A,10B)，但是缺乏CD19抗原出现的MDA-MB-453细胞缺乏显著增殖(图10C,10D)。MDA-MB-453细胞和全PBMC的一些增殖在更低水平观察到，因为B细胞(CD19+)在PBMC中出现，但是在对比中总体增殖明显下降。所述选择性也在分离T细胞中观察到。用PBMC处理的道迪细胞或MDA-MB-453细胞出现中，CD8+T细胞的增殖高于CD4+T细胞(图10A-10D)，并且由TSC078(HD37xOKT3)诱导的增殖一般在所有浓度高于TSC054(HD37xG19-4)或TSC079(HD37xHuM291)诱导的反应(图10A-10D)。CD4+T细胞在对TSC054、TSC078和TSC079所有情况下的诱导增殖比BiTEbsc19x3低(图10A)，尽管TSC078和TSC079显示比BiTE分子在更低浓度(如5pM)下对CD8+细胞的增殖诱导更好(图10B)。
实施例8
由多肽异二聚体重定向T细胞细胞毒性
为比较不同双特异性多肽异二聚体分子在诱导靶标依赖性T细胞细胞毒性中的效力，在铬(51Cr)释放试验中比较了四种不同的双特异性分子。一同测试含常规抗CD19结合域(HD37)和3种不同抗CD19结合域(TSC054为G19-4，TSC078为OKT3，TSC079为HuM291)的3种不同的双特异性分子(TSC054,TSC078,TSC079，如实施例6所述)，以及含抗RON结合域(4C04)与抗CD3结合域(G19-4)的第四种双特异性分子(S0268，如实施例4所述)。瞬时转染人293细胞生成的蛋白质就TSC054而言为约2.33μg/mL，TSC078为约0.67μg/mL，TSC079为约3.5μg/mL。
道迪伯基特淋巴瘤细胞(CD19+,RON-)和BxPC-3细胞(CD19-,RON+)获自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)，并按所提供的方案培养。用标准菲可(ficoll)梯度从人血中分离外周血单核细胞(PBMC)。所分离的细胞用缓冲盐清洗。用来自美天旎生物技术公司(德国贝尔吉施格拉德巴赫)的泛T细胞分离试剂盒II按生产商的方案(更多信息还可参见实施例5)额外分离出T细胞。
通过51Cr释放试验评估细胞毒性。将约5×106个道迪或BxPC-3细胞用0.3mCi的51Cr处理并在在37℃孵育75分钟。75分钟后，将细胞用培养基(RPMI+10％FBS)清洗3次并重悬于11.5mL培养基。将该悬液以每孔50μL分入96孔U底板(每孔约20,000个细胞)。将浓度范围在10nM-0.1pM的双特异性分子添加至靶细胞(道迪,BxPC-3)，总体积为100μL/孔。在室温下培育靶细胞15分钟。然后添加100μL分离的T细胞(约200,000个)使T细胞与靶细胞的比例为10:1。含靶细胞的对照孔中添加50μL0.8％NP-40，留置15分钟，然后添加100μL培养基以提供总体裂解对照。
平板孵育4小时，1500rpm离心3分钟，从各孔将25μL上清液转移至96孔Luma样品板的对应孔中。使样品板在化学通风橱中空气干燥18小时，然后在Topcount闪烁计数器上用标准方案读取放射性。
细胞毒性数据的分析表明，抗RON定向的双特异性分子S0268在道迪(RON-)细胞上没有脱靶细胞毒性(图11A)。类似地，没有T细胞时用TSC054处理道迪细胞未见直接细胞毒性(图11A)。但是存在T细胞和抗CD19定向的双特异性分子(TSC054)时，用道迪细胞观察到强烈的T细胞定向的细胞毒性，该毒性在浓度为10到100pM之间时达到最大裂解(图11A)。类似地，用第二T细胞供体(图11B)，从CD19定向的双特异性TSC054、TSC078或TSC079，获自CD19定向的BiTEbsc19x3未见BxPC-3(CD19-)细胞的脱靶细胞毒性。抗RON定向的S0268双特异性分子在BxPC-3(RON+)细胞中诱导细胞毒性，在浓度为10到100pM之间时达到最大(图11B)。
实施例9
有改变的铰链序列的多肽异二聚体对靶标依赖T细胞增殖的调节
为比较不同的有有改变的铰链序列的双特异性多肽异二聚体分子在诱导靶标依赖性T细胞活性和增殖中的效力，比较六种不同双特异性异二聚体(有常见的抗CD19结合域(HD37)的TSC100、TSC127、TSC165、TSC166、TSC167和TSC168，常见的抗CD3结合域(Cris7)和五种不同的铰链结构(TSC100和TSC127的IgG1SCC-P铰链，TSC165的没有第一个Val残基连接到人IgG1核心铰链的IgA2铰链，TSC166的连接到人IgG1核心铰链的IgG1SSS-P铰链，TSC167的连接到IgG1核心铰链的突变的IgG3铰链部分和TSC168的没有第一个Val残基连接到IgG1核心铰链的IgMCH2域)。
更特别地，实施例6中描述了双特异性异二聚体TSC100。
双特异性异二聚体TSC127含有单链多肽TSC125(Cris7CH2(无ADCC/CDC)CH3CH1)和TSC096(HD37CH2(无ADCC/CDC)CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC125从其氨基到羧基末端含有：人源化Cris7(抗CD3)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC125的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:865和874所示。单链多肽TSC096从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC096的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:807和825所示。
双特异性异二聚体TSC165含有单链多肽TSC157(Cris7IgA2UHCH2(无ADCC/CDC)CH3CH1)和TSC161(HD37IgA2UHCH2(无ADCC/CDC)CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC157从其氨基到羧基末端含有：人源化Cris7(抗CD3)scFv，没有第一个Val连接到人IgG1核心铰链的人IgA2铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC157的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:866和875所示。单链多肽TSC161从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，没有第一个Val连接到人IgG1核心铰链的人IgA2铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC161的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:870和879所示。TSC157和TSC161铰链所用氨基酸序列示于SEQIDNO:748。
双特异性异二聚体TSC166含有单链多肽TSC158(Cris7IgG1微UHCH2(无ADCC/CDC)CH3CH1)和TSC162(HD37IgG1微UHCH2(无ADCC/CDC)CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC158从其氨基到羧基末端含有：人源化Cris7(抗CD3)scFv，连接到人IgG1核心铰链的人IgG1SSC-P铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC158的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:867和876所示。单链多肽TSC162从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，连接到人IgG1核心铰链的人IgG1SSC-P铰链，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC162的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:871和880所示。用于TSC158和TSC162的铰链的氨基酸序列示于SEQIDNO:750。
双特异性异二聚体TSC167含有单链多肽TSC159(Cris7IgG3UHCH2(无ADCC/CDC)CH3CH1)和TSC163(HD37IgG3UHCH2(无ADCC/CDC)CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC159从其氨基到羧基末端含有：人源化Cris7(抗CD3)scFv，连接到人IgG1核心铰链的突变的人IgG3铰链部分，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC159的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:868和877所示。单链多肽TSC163从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，连接到人IgG1核心铰链的突变的人IgG3铰链部分，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC163的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:872和881所示。用于TSC159和TSC163的铰链的氨基酸序列示于SEQIDNO:751。
双特异性异二聚体TSC168含有单链多肽TSC160(Cris7IgMCH2UHCH2(无ADCC/CDC)CH3CH1)和TSC164(HD37IgMCH2UHCH2(无ADCC/CDC)CH3Ck(YAE))。单链多肽TSC160从其氨基到羧基末端含有：人源化Cris7(抗CD3)scFv，没有第一个Val连接到人IgG1核心铰链的人IgMCH2，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人IgG1CH1。TSC160的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:869和878所示。单链多肽TSC163从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，没有第一个Val连接到人IgG1核心铰链的人IgMCH2，人IgG1CH2(无ADCC/CDC)，人IgG1CH3和人Ck(YAE)。TSC164的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:873和882所示。用于TSC160和TSC164的铰链的氨基酸序列示于SEQIDNO:759。
作为阳性对照，也制备已知作为bsc19x3的双特异性T细胞接合分子(BiTE)(见美国专利7,635,472)。bsc19x3的核酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:809和827所示。
瞬时转染人293细胞生成TSC100培养的蛋白为3.2ug/ml，TSC127培养为6.1ug/ml，TSC165培养为4.8ug/ml，TSC166培养为6.2ug/ml，TSC167培养为6.4ug/ml，和TSC168培养为6.4ug/ml。
道迪伯基特淋巴瘤细胞(CD19+)和C4-2(CD19-)前列腺癌细胞获自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)和MD安德森肿瘤中心(MDAndersonCancerCenter)(德克萨斯州休斯敦)，并按所提供的方案培养。用来自美天旎生物技术公司(德国贝尔吉施格拉德巴赫)的泛T细胞分离试剂盒II按生产商的方案(更多信息还可参见实施例5)分离出T细胞。
增殖通过用羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)标记分离的T细胞群评价。CFSE标记T细胞置于U底96孔板，每孔100,000细胞，有每孔10,000肿瘤细胞，以达到T细胞与肿瘤细胞比率10:1。检测分子的浓度范围5nM-0.005pM加入到细胞混合物，总共每孔200ul，在配有10％人或牛血清、丙酮酸钠和非必需氨基酸的RPMI1640培养基中。平板在潮湿培养箱中37℃,5％CO2下培育。三天后，用流式细胞术分析抗体标记的细胞。细胞在其最初板内被标记和洗涤以最小化转移中的细胞损失，并且所有标记都在有0.2％牛血清白蛋白的盐水缓冲液中完成。首先，细胞用100ug/ml人IgG在室温预培育15分钟。随后，细胞用下列染料标记抗体的混合物(总体积50ul)培养40分钟：CD5-PE、CD4-APC、CD8-太平洋蓝、CD25-PE-Cy7和7-氨基-放线菌素D(此后7AAD)。平板洗涤两次，重新悬浮在80-120ul体积中，并且立刻用BDLSRII流式细胞仪达到每孔80％的体积。样品文件用FlowJo软件分析以计算经历至少一次细胞分裂的细胞的百分比和数目，根据其CFSE概况，通过依次门控激活的、活体CD4+或CD8+T细胞(分别7AAD-、CD5+CD25+CD4+或7AAD-CD5+CD25+CD8+)。平均值和标准偏差使用微软Excel软件计算。图用微软Excel或GraphpadPrism生成。
用分离T细胞处理的道迪细胞或C4-2细胞的活CD4+和CD8+群的分析揭示在出现靶标CD19抗原的道迪细胞中的细胞总体数目和增殖细胞百分比的显著增加，但是缺乏CD19抗原出现的C4-2细胞缺乏显著增殖(图12)。CD8+细胞的增殖与有默认的IgG1铰链(TSC100)和有更长铰链(TSC166、TSC167、TSC168)的双特异性分子非常相似。在有更短IgA2上部铰链的双特异性(TSC165)观察到在低浓度下轻微更高的CD8+增殖。类似地，但是在CD4+细胞增殖中观察到更加显著的不同，其中含有更短IgA2铰链的分子(TSC165)显示在最大浓度时高于标准IgG1铰链(TSC100)的增殖，并且有更长铰链的分子(TSC166、TSC167、TSC168)显示更低增殖。
为确证IgA2铰链的不同活性，第二个增殖实验用滴定到更低蛋白浓度完成(图13)，比较IgA2铰链(TSC165)的双特异性特征与默认IgG1铰链(TSC127)和bsc19x3BiTE分子的两个不同生成点的双特异性特征。类似于前述实验，在CD8+细胞增殖中观察到更少的变化，TSC165显示可比较的或更多bsc19x3增殖的诱导，随后显示比TSC127增殖稍微更高或相似。再次，类似于前述实验，这些趋势在有CD4+细胞增殖的放大方式中重复，TSC165和bsc19x3显示相似增殖，随后比TSC127显著更多。
实施例10
有改变的铰链序列的多肽异二聚体对重定向T细胞细胞毒性的调节
为比较双特异性多肽异二聚体分子在诱导靶标依赖性T细胞细胞毒性中改变铰链位置的效力，在铬(51Cr)释放试验中比较了五种不同的双特异性分子。比较五种不同双特异性分子(TSC100、TSC165、TSC166、TSC167和TSC168，如实施例9所述)，所述双特异性分子有常见的抗CD19结合域(HD37)，常见的抗CD3结合域(Cris7)和五种不同的铰链结构(TSC100和TSC127的IgG1SCC-P铰链，TSC165的没有第一个Val残基连接到人IgG1核心铰链的IgA2铰链，TSC166的连接到人IgG1核心铰链的IgG1SSS-P铰链，TSC167的连接到IgG1核心铰链的突变的IgG3铰链部分和TSC168的没有第一个Val残基连接到IgG1核心铰链的IgMCH2域)。
道迪伯基特淋巴瘤细胞(CD19+,RON-)获自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)，并按所提供的方案培养。用来自美天旎生物技术公司(德国贝尔吉施格拉德巴赫)的泛T细胞分离试剂盒II按生产商的方案(更多信息还可参见实施例5)分离出T细胞。
通过51Cr释放试验评估细胞毒性。将约506个道迪细胞用0.3mCi的51Cr处理并在37℃孵育75分钟。75分钟后，将细胞用培养基(RPMI+10％FBS)清洗3次并重悬于11.5mL培养基。将该悬液以每孔50μL分入96孔U底板(每孔约20,000个细胞)。将浓度范围在10nM-0.1pM的双特异性分子添加至靶(道迪)细胞，总体积为每孔100μL。靶细胞在室温下培育15分钟。然后添加100μL分离的T细胞(约200,000个)使T细胞与靶细胞的比例为10:1。含靶细胞的对照孔中添加50μL0.8％NP-40，留置15分钟，然后添加100μL培养基以提供总体裂解对照。
平板孵育4小时，1500rpm离心3分钟，从各孔将25μL上清液转移至96孔Luma样品板的对应孔中。使样品板在化学安全橱中空气干燥18小时，然后在Topcount闪烁计数器上用标准方案读取放射性。
细胞毒性数据分析显示存在T细胞和抗CD19定向的双特异性分子(TSC100-TSC168)时，道迪细胞有强烈的T细胞定向的细胞毒性，该毒性在浓度为5-50pM之间时达到最大裂解(图14)。类似于实施例9中观察到的趋势，有更短IgA2上部绞链区的双特异性分子(TSC165)显示比标准IgG1上部绞链区分子(TSC100)的相似或更多的细胞毒性，而有更长上部绞链区分子(TSC166、TSC167、TSC168)在诱导细胞毒性中潜能更小。
实施例11
有CH3-CH1和CH3-CK接头变体的双特异性异二聚体
生成下面有CH3-CH1和CH3-Ck接头变体的双特异性异二聚体：
双特异性异二聚体TSC151包含单链多肽TSC145和TSC148。单链多肽TSC145从其氨基到羧基末端含有：人源化Cris7(抗CD3)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人CH2(无ADCC/CDC)，人CH3和人IgG1CH1。人CH3和人IgG1CH1通过有序列GGGSS(SEQIDNO:847)的接头连接。TSC145的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:853和859所示。单链多肽TSC148从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人CH2(无ADCC/CDC)，人CH3和人Ck(YAE)。人CH3和人Ck(YAE)通过有序列GGGSR(SEQIDNO:850)的接头连接，其中R或者可以看作人Ck(YAE)的第一个精氨酸。TSC148的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:856和862所示。
双特异性异二聚体TSC152包含单链多肽TSC146和TSC149。单链多肽TSC146从其氨基到羧基末端含有：人源化Cris7(抗CD3)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人CH2(无ADCC/CDC)，人CH3和人IgG1CH1。人CH3和人IgG1CH1通过有序列SYSPNS(SEQIDNO:848)的接头连接。TSC146的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:854和860所示。单链多肽TSC149从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人CH2(无ADCC/CDC)，人CH3和人Ck(YAE)。人CH3和人Ck(YAE)通过有序列SYSPNSR(SEQIDNO:851)的接头连接，其中R或者可以看作人Ck(YAE)的第一个精氨酸。TSC149的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:857和863所示。
双特异性异二聚体TSC153包含单链多肽TSC147和TSC150。单链多肽TSC147从其氨基到羧基末端含有：人源化Cris7(抗CD3)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人CH2(无ADCC/CDC)，人CH3和人IgG1CH1。人CH3和人IgG1CH1通过有序列SSLNTPNS(SEQIDNO:849)的接头连接。TSC147的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:855和861所示。单链多肽TSC150从其氨基到羧基末端含有：HD37(抗CD19)scFv，人IgG1SCC-P铰链，人CH2(无ADCC/CDC)，人CH3和人Ck(YAE)。人CH3和人Ck(YAE)通过有序列SSLNTPNSR(SEQIDNO:852)的接头连接，其中R或者可以看作人Ck(YAE)的第一个精氨酸。TSC150的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO:858和864所示。
根据实施例1表达上述双特异性异二聚体。获得如下表达水平：TSC151的培养蛋白为9.2μg/ml，TSC152的培养蛋白为11.2μg/ml和TSC153的培养蛋白为14.7μg/ml，为比较，对有氨基酸序列KSR(SEQIDNO:846)的CH3-CH1和CH3-Ck接头的异二聚体得到培养蛋白约6μg/ml。
可以组合上述各种实施方式以提供进一步的实施方式。本说明书引用的和/或申请数据单中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用全文纳入本文。所述实施方式的各方面可被修改，必要时可应用各种专利、申请和出版物的概念，以提供更多的实施方式。
对所述实施方式的这些和其它变化可以根据以上详述的提示作出。通常，在下列权利要求中，所用术语不应视为将所述权利要求限制于本说明书中和权利要求所公开的具体实施方式，而应视为包括所有可能的实施方式以及权利要求所确定等同方案的全部范围。因此，权利要求书不局限于具体公开。

Claims (94)

1.一种多肽异二聚体，所述多肽异二聚体包含：
(a)第一单链多肽(SCP-I)，其含有特异结合1-4个靶标的1-4个结合域，铰链(H-I)，免疫球蛋白异二聚化域(HD-I)和IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD或其任意组合的免疫球蛋白CH2和CH3结构域(CH2CH3-I)；和
(b)第二个单链多肽(SCP-II)，其含有特异结合0-4个靶标的0-4个结合域，铰链(H-II)，免疫球蛋白异二聚化域(HD-II)和IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD或其任意组合的免疫球蛋白CH2和CH3结构域(CH2CH3-II)；
其中
(i)第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-I)和第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-II)优先互相结合以形成含有第一单链多肽(SCP-I)和第二单链多肽(SCP-II)的多肽异二聚体，和
(1)第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-I)包含第一免疫球蛋白CH1区，并且第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-II)包含第一免疫球蛋白CL区，或
(2)第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-I)包含第一免疫球蛋白CL区，并且第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-II)包含第一免疫球蛋白CH1区；和
(ii)其中所述第一CL区是Cκ区，所述Cκ区是野生型人Cκ区在N29、N30、Q52、V55、T56、T56、S68或T70发生一个或多个氨基酸替换的改变了的人免疫球蛋白Cκ区，
前提是多肽异二聚体包含至少两个特异结合至少两个不同靶标的结合域BD1和BD2。
2.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述结合域是单链Fv(scFv)多肽。
3.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述两个结合域BD1和BD2都在第一单链多肽(SCP-I)上，并且其中HD-I和CH2CH3-I设置在BD1和BD2之间。
4.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一结合域(BD1)在第一单链多肽(SCP-I)上，并且所述第二结合域(BD2)在第二单链多肽(SCP-II)上。
5.如权利要求4所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一结合域(BD1)在第一单链多肽的CH2和CH3结构域(CH2CH3-I)的氨基末端，并且第二结合域(BD2)在第二单链多肽的CH2和CH3结构域(CH2CH3-II)的氨基末端。
6.如权利要求4所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一结合域(BD1)在第一单链多肽的CH2和CH3结构域(CH2CH3-I)的氨基末端，并且第二结合域(BD2)在第二单链多肽的CH2和CH3结构域(CH2CH3-II)的羧基末端。
7.如权利要求4所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一结合域(BD1)在第一单链多肽的CH2和CH3结构域(CH2CH3-I)的羧基末端，并且第二结合域(BD2)在第二单链多肽的CH2和CH3结构域(CH2CH3-II)的羧基末端。
8.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述多肽异二聚体包含三个结合域(BD1、BD2和BD3)。
9.如权利要求8所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述HD-I和CH2CH3-I设置在BD1和BD2之间，并且第三结合域(BD3)在第二单链多肽的CH2和CH3结构域(CH2CH3-II)的氨基末端。
10.如权利要求8所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述HD-I和CH2CH3-I设置在BD1和BD2之间，并且第三结合域(BD3)在第二单链多肽的CH2和CH3结构域(CH2CH3-II)的羧基末端。
11.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述多肽异二聚体包含四个结合域BD1、BD2、BD3和BD4。
12.如权利要求11所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述HD-I和CH2CH3-I设置在BD1和BD2之间，并且HD-II和CH2CH3-II设置在BD3和BD4之间。
13.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述多肽异二聚体包含5-8个结合域。
14.如权利要求1-13中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述多肽异二聚体的至少一个结合域特异结合下列分子或是其拮抗剂：TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD28、CD79b、超级IL-6、单IL-、CD86、CD20、PSMA、CD19、HLA-DR、Ron、c-Met、CEACAM-6、LIGHT、GITRL、CD40、PDL1、PDL2、HVEM、LTBR、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、EphA2、PDGFR、VEGFR1-4、促血管生成素2、CD64、CD32A、CD16、CD71、TNFR1、TNFR2、TWEAKR、TACI、BAFF-R、BCMA、FAS、CD32B、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD70、TNFα、IL-6、超级IL-6、IL-2、IL-1、IL-7、IL-8、IL-17A/C、IP-10、IFNγ、IFNα、RANKL、FASL、TGFβ、IL10、IL17A/F、CSF2、IGF1、IGF2、BLyS/APRIL、HGF、MSP、EGF、HIF-1α、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、TNFα、Wnt、sHH、TGFβ、PDGF、TWEAK、EpCAM、CEA、PCTA-1、STEAP-1、PSCA、ALCAM(CD166)、EphA2、CD151、CA-125、MUC-1、MAGE-1、TROP2、CCR5、HER-3、HER-4、EGFR、CEA、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5b、MUC7、βhCG、Lewis-Y、神经节苷脂GD3、9-O-乙酰基-GD3、GM2、GloboH、岩藻糖GM1、聚SA、GD2、碳脱水酶IX(MN/CAIX)、CD44v6、SonicHedgehog(Shh)、Wue-1、血浆细胞抗原、膜结合IgE、黑色素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、CCR8、TNFα前提、STEAP、间皮素、A33抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、Ly-6；桥粒核心糖蛋白4、E-钙粘蛋白新表位、胎儿乙酰基胆碱受体、CD25、CA19-9标记、CA-125标记和缪勒管激素抑制因子(MuellerianInhibitorySubstance(MIS))受体II、sTn即唾酸化Tn抗原也称TAG-72、FAP(成纤维细胞活化)、內皮唾酸蛋白、EGFRvIII、LG、SAS、CD63、IGF1R、CD151、TGFBR2、GHRHR、GHR、IL-6R、gp130、TNFR2、OSMRβ、Patched-1、卷曲蛋白(Frizzled)、Robo1、CD80、CD81、CD86、OX40、CD40、CD137、LIFRβ、TLR7或TLR9。
15.如权利要求1-5中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述至少一个结合域是IL-10、HLA-G、HGF、IL-35、PD-1、BTLA、TNFR1、TNFR2、DR4、DR5、TWEAKR或FAS的激动剂。
16.如权利要求1-5中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述至少一个结合域特异结合TCR复合物或其成分，并且至少另一个结合域特异结合PSMA、CD79b、CD19、HLA-DR、CD20、RON、c-Met或CEACAM-6。
17.如权利要求1-5中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述至少一个结合域特异结合CD28，并且至少另一个结合域特异结合CD79b、超级IL-6、PDL2、单IL-10、CD86、LIGHT、GITRL、CD40、PDL1、HVEM或LTBR，或是其拮抗剂。
18.如权利要求1-5中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述至少一个结合域特异结合CD28，并且至少另一个结合域是IL-10、HLA-G、HGF、IL-35、PD-1或BTLA的激动剂。
19.如权利要求1-18中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-I)包含第一免疫球蛋白CH1区，并且第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-II)包含第一免疫球蛋白CL区。
20.如权利要求19所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一CH1区是第一单链多肽的CH2和CH3结构域的氨基末端，并且第一CL区是第二单链多肽的CH2和CH3结构域的氨基末端。
21.如权利要求19所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一CH1区是第一单链多肽的CH2和CH3结构域的羧基末端，并且第一CL区是第二单链多肽的CH2和CH3结构域的羧基末端。
22.如权利要求19所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一单链多肽还包含第二CH1区且第二单链多肽还包含第二CL区，并且第一单链多肽的第二CH1区和第二单链多肽的第二CL区在多肽异二聚体中互相结合。
23.如权利要求22所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一单链多肽的CH2和CH3结构域设置在第一和第二CH1区之间，并且其中第二单链多肽的CH2和CH3结构域设置在第一和第二CL区之间。
24.如权利要求22所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一和第二CH1区都在第一单链多肽的CH2和CH3结构域的氨基末端，和第一和第二CL区都在第二单链多肽的CH2和CH3结构域的氨基末端。
25.如权利要求22所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一和第二CH1区都在第一单链多肽的CH2和CH3结构域的羧基末端，并且第一和第二CL区都在第二单链多肽的CH2和CH3结构域的羧基末端。
26.如权利要求1-18中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-I)包含第一免疫球蛋白CL区，并且第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域(HD-II)包含第一免疫球蛋白CH1区。
27.如权利要求26所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一CL区是第一单链多肽的CH2和CH3结构域的氨基末端，并且第一CH1区是第二单链多肽的CH2和CH3结构域的氨基末端。
28.如权利要求26所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一CL区是第一单链多肽的CH2和CH3结构域的羧基末端，并且第一CH1区是第二单链多肽的CH2和CH3结构域的羧基末端。
29.如权利要求26所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一单链多肽还包含第二CL区和第二单链多肽还包含第二CH1区，并且第一单链多肽的第二CL区和第二单链多肽的第二CH1区在多肽异二聚体中互相结合。
30.如权利要求29所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一单链多肽的CH2和CH3结构域设置在第一和第二CL区之间，并且其中第二单链多肽的CH2和CH3结构域设置在第一和第二CH1区之间。
31.如权利要求29所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一和第二CL区都位于第一单链多肽的CH2和CH3结构域的氨基末端，并且第一和第二CH1区都位于第二单链多肽的CH2和CH3结构域的氨基末端。
32.如权利要求29所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一和第二CL区都位于第一单链多肽的CH2和CH3结构域的羧基末端，并且第一和第二CH1区都位于第二单链多肽的CH2和CH3结构域的羧基末端。
33.如权利要求19所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一单链多肽还包含第二CL区和第二单链多肽还包含第二CH1区，并且第一单链多肽的第二CL区和第二单链多肽的第二CH1区在多肽异二聚体中互相结合。
34.如权利要求33所述的多肽异二聚体，其特征在于，
(a)第一单链多肽中，第一CH1区是CH2CH3-I的氨基末端，并且第二CL区是CH2CH3-I的羧基末端，和
(b)第二单链多肽中，第一CL区是CH2CH3-II的氨基末端，并且第二CH1区是CH2CH3-II的羧基末端。
35.如权利要求33所述的多肽异二聚体，其特征在于，
(a)第一单链多肽中，第一CH1区是CH2CH3-I的羧基末端，并且第二CL区是CH2CH3-I的氨基末端，和
(b)第二单链多肽中，第一CL区是CH2CH3-II的羧基末端，并且第二CH1区是CH2CH3-II的氨基末端。
36.如权利要求33所述的多肽异二聚体，其特征在于，
(a)第一单链多肽中，第一CH1区和第二CL区都是CH2CH3-I的氨基末端，并且第一CH1区是第二CL区的氨基末端，和
(b)第二单链多肽中，第一CL区和第二CH1区都是CH2CH3-II的氨基末端，并且第一CL区是第二CH1区的氨基末端。
37.如权利要求33所述的多肽异二聚体，其特征在于，
(a)第一单链多肽中，第一CH1区和第二CL区都是CH2CH3-I的氨基末端，并且第二CL区是第一CH1区的氨基末端，和
(b)第二单链多肽中，第一CL区和第二CH1区都是CH2CH3-II的氨基末端，并且第二CH1区是第一CL区的氨基末端。
38.如权利要求33所述的多肽异二聚体，其特征在于，
(a)第一单链多肽中，第一CH1区和第二CL区都是CH2CH3-I的羧基末端，并且第一CH1区是第二CL区的氨基末端，和
(b)第二单链多肽中，第一CL区和第二CH1区都是CH2CH3-II的羧基末端，并且第一CL区是第二CH1区的氨基末端。
39.如权利要求33所述的多肽异二聚体，其特征在于，
(a)第一单链多肽中，第一CH1区和第二CL区都是CH2CH3-I的羧基末端，并且第二CL区是第一CH1区的氨基末端，和
(b)第二单链多肽中，第一CL区和第二CH1区都是CH2CH3-II的羧基末端，并且第二CH1区是第一CL区的氨基末端。
40.如权利要求22-26和29-39中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第二CL区是Cκ区。
41.如权利要求22-25和29-39中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第二CL区是Cλ区。
42.如权利要求40所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第二CL区是野生型人免疫球蛋白Cκ区。
43.如权利要求40所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第二CL区是野生型人Cκ区在N29、N30、Q52、V55、T56、S68或T70发生一个或多个氨基酸替换的改变了的人免疫球蛋白Cκ区。
44.如权利要求1或43所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述一个或多个氨基酸替换选自Ala(A)、Arg(R)、Trp(W)、Tyr(Y)、Glu(E)、Gln(Q)、Lys(K)、Asp(D)、Met(M)、Ser(S)和Phe(F)。
45.如权利要求1或40所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述CH1区是包含68位Val(V)替换为Lys(K)、Arg(R)或His(H)的氨基酸替换的改变了的人免疫球蛋白CH1区，并且所述Cκ区是包含在27位Leu(L)替换为Asp(D)或Glu(E)的氨基酸替换的改变了的人免疫球蛋白Cκ区。
46.如权利要求1或40所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述CH1区是包含68位Val(V)改变为Asp(D)或Glu(E)的氨基酸替换的改变了的人免疫球蛋白CH1区，并且所述Cκ区是包含在27位Leu(L)改变为Lys(K)、Arg(R)或His(H)的氨基酸替换的改变了的人免疫球蛋白Cκ区。
47.如权利要求41所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第二CL区是野生型人免疫球蛋白Cλ区。
48.如权利要求1-47中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，当存在所述第一CH1区或第二CH1区时，是野生型人免疫球蛋白CH1区。
49.如权利要求1-47中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，当存在所述第一CH1区或第二CH1区时，是野生型人IgG1CH1区。
50.如权利要求1-47中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，当存在所述第一CH1区或第二CH1区时，是改变了的人免疫球蛋白CH1区，其中，野生型人免疫球蛋白CH1区中参与与野生型人免疫球蛋白CL区形成二硫键的半胱氨酸的缺失或替换。
51.如权利要求1-47中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，当所述第一CH1区或第二CH1区存在时，是改变了的人IgG1CH1区，其中，野生型人免疫球蛋白CH1区中参与与野生型人免疫球蛋白CL区形成二硫键的半胱氨酸的缺失或替换。
52.如权利要求1或40所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述Cκ区是改变了的人免疫球蛋白Cκ区，其中，野生型人Cκ区中参与与野生型人免疫球蛋白CH1区形成二硫键的半胱氨酸残基的缺失或替换。
53.如权利要求41所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述Cλ区是改变了的人免疫球蛋白Cλ区，其中，参与野生型人Cλ区中参与与野生型人免疫球蛋白CH1区形成二硫键的半胱氨酸残基的缺失或替换。
54.如权利要求50所述的多肽异二聚体，其特征在于，当所述第一CH1区和第二CH1区存在时，是包括SEQIDNO:114、844或845的多肽。
55.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述Cκ区选自包含SEQIDNO:142-178、202和838-843的任一多肽。
56.如权利要求41所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述Cλ区是含有SEQIDNO:140的多肽。
57.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述免疫球蛋白CH2域是IgG1CH2域。
58.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述免疫球蛋白CH2域是IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgDCH2域。
59.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述免疫球蛋白CH3域是IgG1CH3域。
60.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述免疫球蛋白CH3域是IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgMCH3域。
61.如权利要求1-60中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，
(i)一个单链多肽上，所述免疫球蛋白CH3域在其羧基末端通过含有SEQIDNO:846、847、848或849的肽紧接CH1域，和
(ii)另一个单链多肽上，所述免疫球蛋白CH3域在其羧基末端通过含有SEQIDNO:846、850、951或852的肽紧接Cκ域。
62.如权利要求57、58和61中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述CH2域是改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH2域，含有297位氨基酸替换和至少一个234-238位的其它替换或缺失。
63.如权利要求57、58和61中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述CH2域是改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH2域，含有一个或多个234-238位的氨基酸突变和至少一个253、310、318、320、322或331位的替换。
64.如权利要求57、58和61中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述CH2域是改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH2域，含有297位天冬酰胺的氨基酸替换，一个或多个234-238位的替换或缺失，和至少一个253、310、318、320、322或331位的替换。
65.如权利要求57、58和61中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述CH2域是改变了的人IgG1CH2域，含有L234、L235、G237、E318、K320和K322位的氨基酸替换。
66.如权利要求59-61任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，
(a)第一单链多肽的CH3域是包含T366W取代的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，并且第二单链多肽的CH3域是包含Y407A替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，
(b)第一单链多肽的CH3域是包含T366Y替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，并且第二单链多肽的CH3域是包含Y407T替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，
(c)第一单链多肽的CH3域是包含T366W替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，并且第二单链多肽的CH3域是包含T366S、L368A和Y407V替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，
(d)第一单链多肽的CH3域是包含Y407A替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，并且第二单链多肽的CH3域是包含T366W替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，
(e)第一单链多肽的CH3域是包含Y407T替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，并且第二单链多肽的CH3域是包含T366Y替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，或者
(f)第一单链多肽的CH3域是包含T366S、L368A和Y407W替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域，并且第二单链多肽的CH3域是包含T366W替换的改变了的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3域。
67.如权利要求1-66中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一和第二单链多肽的铰链都是免疫球蛋白铰链区。
68.如权利要求67所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述免疫球蛋白铰链是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD或IgE铰链。
69.如权利要求67所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述免疫球蛋白铰链是野生型免疫球蛋白铰链。
70.如权利要求67所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述免疫球蛋白绞链是选自SEQIDNO:232、234、240、664-673、675和676的改变了的免疫球蛋白绞链。
71.如权利要求67-70中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述绞链区是
(a)在CH2和CH3结构域的氨基末端，
(b)设置在结合域和免疫球蛋白异二聚化域之间，
(c)设置在免疫球蛋白异二聚化域和CH2和CH3结构域之间，或
(d)在第一或第二单链多肽的氨基末端。
72.如权利要求1-66中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述至少一个第一和第二单链多肽的铰链是C型凝集素铰链区。
73.如权利要求72所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述C型凝集素铰链区是NKg2A或NKg2D肽或其衍生物。
74.如权利要求72或73所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述铰链区设置在CH2和CH3结构域和结合域之间，或在第一或第二单链多肽的羧基末端。
75.如权利要求1-74任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一和第二单链多肽的铰链相同。
76.如权利要求1-74任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一和第二单链多肽的铰链不同。
77.如权利要求1-13和19-76任一项所述的异二聚体，其特征在于，所述第一单链多肽包含特异结合TCR复合物或其成分的结合域并且第二单链多肽包含特异结合CD19、CD79b、HLA-DR或CD20的结合域。
78.如权利要求1-13和19-76任一项所述的异二聚体，其特征在于，所述第一单链多肽包含特异结合CD28的结合域，并且第二单链多肽包含(a)特异结合CD79b、超级IL-6或CD86或(b)含有PDL胞外域或单IL-10的结合域。
79.如权利要求1-13和19-76任一项所述的异二聚体，其特征在于，所述第一单链多肽包含特异结合c-Met的结合域，并且第二单链多肽包含特异结合RON的结合域。
80.如权利要求1所述的异二聚体，其特征在于，所述第一和第二单链多肽包含：SEQIDNO:10和12,SEQIDNO:14和16,SEQIDNO:18和20,SEQIDNO:20和22,SEQIDNO:30和32,SEQIDNO:29和31,SEQIDNO:29和32,SEQIDNO:30和72,SEQIDNO:53和72,SEQIDNO:54和72,SEQIDNO:55和72,SEQIDNO:70和72,SEQIDNO:71和72,SEQIDNO:63和56,SEQIDNO:64和57,SEQIDNO:65和60,SEQIDNO:66和58,SEQIDNO:67和59,SEQIDNO:68和61,SEQIDNO:69和62,SEQIDNO:54和811,SEQIDNO:54和812,SEQIDNO:54和813,SEQIDNO:814和818,SEQIDNO:815和818,SEQIDNO:816和818,SEQIDNO:817和818,SEQIDNO:814和820,SEQIDNO:814和821,SEQIDNO:54和819,SEQIDNO:814和826,SEQIDNO:814和822,SEQIDNO:814和823,SEQIDNO:814和824,SEQIDNO:859和862,SEQIDNO:860和863,SEQIDNO:861和864,SEQIDNO:874和825,SEQIDNO:875和879,SEQIDNO:876和880,SEQIDNO:877和881或SEQIDNO:878和882。
81.如权利要求14所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述EGF选自：epiregulin、herregulin、β-regulin和神经调节蛋白。
82.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-81中任一项所述的多肽异二聚体和药学上可接受的赋形剂。
83.一种能表达如权利要求1-81中任一项所述的多肽异二聚体的表达载体，所述表达载体包含编码第一单链多肽的第一多核苷酸和编码第二单链多肽的第二多核苷酸。
84.一种包含权利要求83所述表达载体的宿主细胞。
85.一种包含第一和第二表达载体的宿主细胞，所述第一和第二表达载体分别表达如权利要求1-81任一项所述的多肽异二聚体的第一和第二单链多肽。
86.一种制备多肽异二聚体的方法，其包含：
(a)在适于表达第一和第二单链多肽的条件下培养如权利要求84或权利要求84所述的宿主细胞，和
(b)选择分离或纯化从培养的第一和第二单链多肽形成的异二聚体。
87.权利要求1-81中任一项所述的多肽异二聚体在制备指导T细胞活化的药物中的用途，所述药物给予所需患者有效量的所述多肽异二聚体，其中所述多肽异二聚体包含特异结合TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε或其组合的结合域，和特异结合不同靶标的第二结合域。
88.权利要求1-81中任一项所述的多肽异二聚体在制备抑制恶性肿瘤的生长、转移或转移性生长的药物中的用途，所述药物给予所需患者有效量的所述多肽异二聚体，其中，所述多肽异二聚体包含特异结合TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、c-Met或Ron的结合域。
89.权利要求1-81中任一项所述的多肽异二聚体在制备治疗自体免疫或炎症病症的药物中的用途，所述药物给予所需患者有效量的所述多肽异二聚体，其中，所述多肽异二聚体包含特异结合TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD28的结合域。
90.权利要求1-81中任一项所述的多肽异二聚体在制备治疗B细胞相关紊乱或疾病的药物中的用途，所述药物给予所需患者有效量的所述多肽异二聚体，其中，所述多肽异二聚体包含特异结合TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ或CD3ε的结合域，和特异结合CD19、CD20、CD79b或HLA-DR的第二结合域。
91.如权利要求88所述的用途，其特征在于，所述药物用于和化学治疗试剂或电离辐射联用。
92.如权利要求87-90任一项所述的用途，其特征在于，所述药物用于和第二活性药剂联用。
93.如权利要求92所述的用途，其特征在于，所述第二活性药剂是根据权利要求1-80中任一项所述的第二种多肽异二聚体。
94.如权利要求92所述的用途，其特征在于，所述第二活性药剂是单克隆抗体或免疫球蛋白衍生的融合蛋白。
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