JP2012531885A - Ｉｌ６免疫治療剤 - Google Patents

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Abstract

ＩＬ６／ＩＬ６受容体複合体を認識する結合ドメインポリペプチドおよびその融合タンパク質、ならびにそれらの組成物および使用方法。本開示は、結合性のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸分子、ならびにそのような分子を組換えにより産生するためのベクターおよび宿主細胞、ならびに過剰増殖疾患（例えば、骨髄腫）、自己免疫疾患または炎症性疾患（例えば、関節リウマチ）などの疾患または障害の少なくとも１つの症状の治療および改善を含めて、多様な診断および治療の適用において、本開示の結合性ポリペプチドまたは融合タンパク質を使用するための組成物および方法も提供する。

Description

インターロイキン６（「ＩＬ６」）は、宿主免疫応答、炎症、造血および腫瘍形成を調節する多面発現性サイトカインである。ＩＬ６の生物学は、重複するが、同一ではない細胞集団に対して作動する２つの明確に異なるシグナル伝達機序を有する複数成分の分子系によって媒介される。これらは、シス−シグナル伝達（「古典的」シグナル伝達としても公知である）、およびトランス−シグナル伝達と呼ばれている。
シス−シグナル伝達においては、ＩＬ６は、細胞表面のＩＬ６受容体、すなわち、ＩＬ６ＲαまたはＣＤ１２６（以前は、ｇｐ８０と呼ばれていた）と呼ばれている、ＩＬ６Ｒのリガンド結合部分に結合する。それに続いて、細胞に結合しているＩＬ６／ＩＬ６Ｒα複合体が、リガンド結合性ではないが、シグナル伝達性である膜タンパク質ｇｐ１３０（ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ６ＲβまたはＣＤ１３０としても公知である）に結合し、これによって、ｇｐ１３０の二量体化およびシグナル伝達の開始が誘導される。したがって、シス−シグナル伝達は、細胞表面ＩＬ６Ｒαを発現するサブセットの細胞型に制限され、こうした細胞型は一般に、例えば、マイトジェンにより活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞のサブセット、末梢単核球および特定の腫瘍に限定される。細胞表面に生じた三元複合体は、ＩＬ６：ＩＬ６Ｒα：ｇｐ１３０＝２：２：２の比で非常に安定な六量体に集合する（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒら（２００３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００巻：２１０１頁）。
トランス−シグナル伝達においては、可溶性ＩＬ６Ｒα（「ｓＩＬ６Ｒα」）が、ＩＬ６と複合体を形成し、生じた循環ｓＩＬ６ｘＲ複合体が、任意のｇｐ１３０発現細胞（しかし、ＩＬ６Ｒαも発現している細胞ではない、Ｔａｇａら（１９８９年）Ｃｅｌｌ ５８巻：５７３頁）に結合し、これを活性化することができる。ヒト身体の多く、おそらく全てまたはほとんど全ての細胞が、ｇｐ１３０を発現する。ｇｐ１３０が偏在性であることから、トランス−シグナル伝達は、多くの細胞型に影響を及ぼし、それによって、時には疾患を引き起こす恐れがある。
また、膜タンパク質ｇｐ１３０は、可溶性の形態（「ｓｇｐ１３０」）をとっても存在し、これは、循環中のｓＩＬ６ｘＲ複合体に結合することができる。しかし、ｓＩＬ６ｘＲ複合体は、膜および可溶性のｇｐ１３０に等しく結合する（Ｊｏｎｅｓら、（２００５年）Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ． ２５巻：２４１頁を参照されたい）。したがって、モル過剰量のｓｇｐ１３０は、（利用可能な循環中のｓＩＬ６ｘＲ複合体の量を低下させることによって）トランス−シグナル伝達を阻害することができる。このモル過剰量のｓｇｐ１３０が、シス−シグナル伝達に顕著な影響を及ぼすことはない。これは、細胞に結合しているＩＬ６／ＩＬ６Ｒα複合体に対しては、ｓｇｐ１３０の親和性が、細胞表面のｇｐ１３０と比較して数桁低いからである（例えば、Ｊｏｓｔｏｃｋら（２００１年）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６８巻：１６０頁を参照されたい）。したがって、ｓｐｇ１３０は、ＩＬ６の活性を阻害するのに有用であり得ることが示唆されている（例えば、Ｊｏｓｔｏｃｋら（２００１年）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６８巻：１６０頁を参照されたい）。しかし、ＩＬ６に加えて、ｇｐ１３０は、ｇｐ１３０サイトカインファミリーに対する一般的なシグナル伝達タンパク質である。これらには、白血病抑制因子（ＬＩＥ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロポイエチン（ＮＰ）、カルジオトロフィン（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｉｎ）様サイトカイン（ＣＬＣ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１およびカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）が含まれる。したがって、ｓｇｐ１３０は、トランス−シグナル伝達を阻害することができるが、そのような化合物の患者への投与は、いくつかの意図しない有害作用を生じる恐れがある。
ＩＬ６産生の増加が、アルツハイマー病、自己免疫（例えば、関節リウマチ、ＳＬＥ）、炎症、心筋梗塞、パジェット病、骨粗鬆症、固形腫瘍（例えば、結腸癌、ＲＣＣ、前立腺癌および膀胱癌）、特定の神経学的癌、ならびにキャッスルマン病、いくつかのリンパ腫サブタイプ、ＣＬＬおよび特に多発性骨髄腫などのＢ細胞悪性疾患を含めた、種々の疾患プロセスに関係付けられている。場合によっては、ＩＬ−６は、増殖経路に関係付けられている。これは、ＩＬ−６が、ヘパリン結合性の上皮増殖因子および肝細胞増殖因子などのその他の因子と共に作用することによる。
いくつかのＩＬ６およびＩＬ６Ｒαの抗体アンタゴニストが公知である。例えば、ＩＬ６については、Ｗａｙら（特許文献１）が、ＩＬ６またはｓＩＬ６ｘＲ複合体のｇｐ１３０への結合を立体的に遮断する、ＩＬ６に対する抗体を開示している（また、特許文献２も参照されたい）。例えば、ＩＬ６Ｒαについては、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ（特許文献３）が、ＩＬ６の活性を阻害する、ＩＬ６Ｒαに対する抗体を開示している。
米国特許出願公開第２００７／０１７８０９８号明細書 米国特許第７，２９１，７２１号明細書 米国特許第５，６７０，３７３号明細書
図１Ａ〜Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性（Ｘｃｅｐｔｏｒ（商標））融合タンパク質が、ハイパーＩＬ６と特異的に結合し、これら多重特異性融合タンパク質が、ＩＬ６およびＩＬ６Ｒ単独よりもハイパーＩＬ６と優先的に結合することを示す図である。試験した２種の融合タンパク質だけがＩＬ６と結合し、ｓＩＬ６Ｒとは１つも結合しなかった。 図１Ａ〜Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性（Ｘｃｅｐｔｏｒ（商標））融合タンパク質が、ハイパーＩＬ６と特異的に結合し、これら多重特異性融合タンパク質が、ＩＬ６およびＩＬ６Ｒ単独よりもハイパーＩＬ６と優先的に結合することを示す図である。試験した２種の融合タンパク質だけがＩＬ６と結合し、ｓＩＬ６Ｒとは１つも結合しなかった。 図１Ａ〜Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性（Ｘｃｅｐｔｏｒ（商標））融合タンパク質が、ハイパーＩＬ６と特異的に結合し、これら多重特異性融合タンパク質が、ＩＬ６およびＩＬ６Ｒ単独よりもハイパーＩＬ６と優先的に結合することを示す図である。試験した２種の融合タンパク質だけがＩＬ６と結合し、ｓＩＬ６Ｒとは１つも結合しなかった。 図２は、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質が、ＴＮＦ−αと結合することを示す図である。 図３は、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性融合タンパク質が、ハイパーＩＬ６およびＴＮＦ−αと同時に結合できることを示す図である。 図４は、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性融合タンパク質が、ｇｐ１３０をハイパーＩＬ６との結合からブロックすることを示す図である。 図５Ａおよび５Ｂは、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性融合タンパク質が、ＴＦ−１細胞の、（Ａ）ＩＬ６誘導性増殖または（Ｂ）ハイパーＩＬ６誘導性増殖をブロックすることを示す図である。 図５Ａおよび５Ｂは、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性融合タンパク質が、ＴＦ−１細胞の、（Ａ）ＩＬ６誘導性増殖または（Ｂ）ハイパーＩＬ６誘導性増殖をブロックすることを示す図である。 図６は、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性融合タンパク質が、ＴＮＦ−αをＴＮＦＲとの結合からブロックすることを示す図である。 図７は、様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質が、Ｌ９２９細胞のＴＮＦ−α誘導性死滅をブロックすることを示す図である。 図８は、ＥＬＩＳＡにより測定した、様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメイン（ＴＲＵ（Ｓ６）−１００４、１００７、１００８、１０１３、１０１８、１０１９、１０２９および１０３８と称される）の１つを含有する小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ（商標））融合タンパク質が、ハイパーＩＬ６と結合することを示す図である。 図９は、ＥＬＩＳＡにより測定した、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０６３−ＴＲＵ（Ｓ６）−１０６６と称されるＳＭＩＰ融合タンパク質が、ハイパーＩＬ６と結合することを示す図である。 図１０は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）により測定した、ＳＭＩＰ融合タンパク質ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２が、ＩＬ６：ｓＩＬ６Ｒ複合体と結合することを示す図である。 図１１ＡおよびＢは、本明細書に開示した、抗ＩＬ６結合ドメインの結合部位に関する研究の結果を示す図である。 図１２は、ＩＬ６結合ドメインと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質が、ＨｅｐＧ２細胞と結合しなかったことを示す図である。 図１３は、ＩＬ６結合ドメインと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質が、マウスにおけるＨＩＬ６−誘導性ＳＡＡ応答をブロックしたことを示す図である。 図１４は、ＩＬ６結合ドメインと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質が、マウスにおけるＨＩＬ６誘導性ｓｇｐ１３０応答をブロックしたことを示す図である。 図１５ＡおよびＢは、ＩＬ６結合ドメインと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質の、それぞれ投与２時間後および２４時間後の、マウスにおけるＴＮＦα誘導性ＳＡＡ応答をブロックする能力に関する研究の結果を示す図である。
本開示は一般に、膜または可溶性のＩＬ６受容体（ＩＬ６Ｒα）とのＩＬ６の複合体に特異的な結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する（本明細書では、この複合体を、膜ＩＬ６Ｒαまたは可溶性ＩＬ６Ｒα（ｓＩＬ６Ｒα）のいずれかに言及する場合には、ＩＬ６ｘＲと呼び、ｓＩＬ６ＲαとのＩＬ６の複合体のみを指す場合には、ｓＩＬ６ｘＲを使用する）。この結合領域または結合ドメインは、例えば、ｓＩＬ６ｘＲとの結合について膜ｇｐ１３０と競合するか、ｓＩＬ６ｘＲとの可溶性ｇｐ１３０の結合を増大させるか、ＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒα単独のいずれかに対するよりも高い親和性をＩＬ６ｘＲ複合体に対して示すか、またはこれらの特性の任意の組合せを示すことによって、ＩＬ６のシス−シグナル伝達よりも、ＩＬ６のトランス−シグナル伝達を優先的に阻害する。また、ＩＬ６ｘＲに特異的な結合ドメインは、特定の実施形態では、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。その他の実施形態では、ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（ＳＭＩＰ（商標））タンパク質またはリバースＳＭＩＰ分子（本明細書では、ＰＩＭＳ分子と呼ぶ）などにおいて見出されるように、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的なそのようなポリペプチド結合ドメインはさらに、融合タンパク質の一部であってもよく、この場合、このポリペプチド結合ドメインは、二量体化ドメイン（例えば、免疫グロブリン定常領域またはそのサブ領域、例として、ＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）のアミノ末端またはカルボキシ末端と融合している。また、本開示は、単一特異性である（かつ多価である）かまたは多重特異性である複数の結合ドメインを有する融合タンパク質も提供する。例えば、単一特異性の多価の融合タンパク質は、同じ標的、例として、本明細書に記載するＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な、少なくとも２つの結合ドメインを有することができる。本明細書に記載するＩＬ６ｘＲに特異的な結合ドメインを有する例示的な多重特異性融合タンパク質は、ＩＬ６ｘＲ以外の標的、例として、ＴＮＦαまたはＴＧＦβに特異的な、少なくとも１つの追加の結合領域または結合ドメインを含有することができる。
さらに、本開示は、そのような結合性のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸分子、ならびにそのような分子を組換えにより産生するためのベクターおよび宿主細胞、ならびに過剰増殖疾患（例えば、骨髄腫）、自己免疫疾患または炎症性疾患（例えば、関節リウマチ）などの疾患または障害の少なくとも１つの症状の治療および改善を含めて、多様な診断および治療の適用において、本開示の結合性ポリペプチドまたは融合タンパク質を使用するための組成物および方法も提供する。また、本開示の化合物および組成物は、ＩＬ６および関連分子の生物学的活性を研究するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよび細胞に基づくアッセイのための研究ツールとしても有用である。
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書において使用しようとする特定の用語の定義を提供することによって、本開示の理解を助けることができる。追加の定義も、本開示の全体を通して記載する。
本記載においては、任意の濃度の範囲、パーセントの範囲、割合の範囲、または整数の範囲は、別段の記載がない限り、列挙する範囲に属する任意の整数値、および適宜、その分数（例として、ある整数の１０分の１および１００分の１）を含むと理解されたい。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなどの任意の物理的特性に関する、本明細書に列挙する任意の数の範囲は、別段の記載がない限り、列挙する範囲に属する任意の整数を含むと理解されたい。本明細書で使用する場合、「約（ａｂｏｕｔ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、別段の記載がない限り、表示する範囲、値または構造の±２０％を意味する。本明細書で使用する場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」と「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」とは、同義語として使用する。本明細書で使用する場合、用語「ａ」および「ａｎ」は、列挙する構成成分のうちの「１つまたは複数」を指すと理解されるべきである。選択肢（例えば、「または（ｏｒ）」）の使用は、選択肢のうちの１つ、両方、またはそれらの任意の組合せのうちのいずれかを意味すると理解されるべきである。さらに、本明細書に記載する構造および置換基の種々の組合せから得られる個々の化合物または化合物群は、それぞれの化合物または化合物群が、個々に記載されているのと同じ程度で本出願によって開示されると理解されるべきである。したがって、特定の構造または特定の置換基の選択は、本発明の範囲に属する。
本開示に従う「結合ドメイン」または「結合領域」は、例えば、生物学的分子（例えば、ＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒ）、あるいは安定であっても一過性であっても、２つ以上の同じまたは異なる分子の複合体、または集合体もしくは凝集体（例えば、ＩＬ６ｘＲ複合体）を特異的に認識し、それに結合する能力を有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドまたはペプチドであってよい。そのような生物学的分子として、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、アミノ酸、もしくはそれらの誘導体、脂質、脂肪酸、もしくはそれらの誘導体；炭水化物、糖類、もしくはそれらの誘導体；ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチド核酸、核酸分子、もしくはそれらの誘導体；糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、リポタンパク質、プロテオリピド、もしくはそれらの誘導体；例えば、生物学的試料に存在し得るその他の生物学的分子；またはそれらの任意の組合せが挙げられる。結合領域は、生物学的分子にかまたはその他の目的の標的に対しての、任意の天然に存在する、合成の、半合成の、または組換えにより産生された結合パートナーを含む。ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）解析を含めて、特定の標的と特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための多様なアッセイが公知である。
抗体技術に関して当業者によって理解されている用語はそれぞれ、本明細書において明確に定義しない限り、当技術分野で与えられている意味を有する。例えば、用語「ＶＬ」および「ＶＨ」はそれぞれ、抗体の軽鎖および重鎖に由来する可変結合領域を指す。可変結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として知られている個別の明確に定義されたサブ領域から構成される。用語「ＣＬ」および「ＣＨ」はそれぞれ、「免疫グロブリン定常領域」、すなわち、抗体の軽鎖および重鎖に由来する定常領域を指し、後者の領域は、その領域が由来する抗体のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）に応じて、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４の定常領域ドメインにさらに分割可能であると理解されている。定常領域ドメインの一部がＦｃ領域（「結晶化可能なフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）」領域）を構成し、この領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性）、ＡＤＣＰ（抗体依存性細胞媒介型食作用）、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）、および補体結合、Ｆｃ受容体に対する結合、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、Ｆｃ領域を欠くポリペプチドと比べてより長い半減期、プロテインＡ結合性、ならびに正におそらく胎盤移行（Ｃａｐｏｎら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３３７巻：５２５頁を参照されたい）などの免疫グロブリンのエフェクター機能に関与するドメインを含有する。さらに、Ｆｃ領域を含有するポリペプチドは、ポリペプチドの二量体化または多量体化も可能にする。「ヒンジ領域」は、本明細書においては「リンカー」とも呼び、抗体の単鎖の可変結合領域と定常領域との間に挿入され、それらを接続するアミノ酸配列であり、これは、ヒンジの形態をとって、抗体、または抗体様分子に可動性をもたらすことが当技術分野では公知である。
抗原結合ドメインおよびエフェクター機能を付与するドメインは、免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスの間で交換することができることから、免疫グロブリンのドメイン構造は工学的に作製しやすい。免疫グロブリンの構造および機能が、例えば、Ｈａｒｌｏｗら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｈａｐｔｅｒ １４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８８年）に概説されている。広範な序論、および組換え抗体技術の全ての態様に関する詳細な情報を、教科書Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９９年）に見出すことができる。詳細な抗体工学の実験室プロトコールの包括的なコレクションを、Ｒ． ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＳ． Ｄｕｅｂｅｌ編、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００年）に見出すことができる。
本明細書で使用する場合、「誘導体」は、化合物の化学的または生物学的に改変した別形（ｖｅｒｓｉｏｎ）であって、親化合物に構造的に類似し、その親化合物から（実際または理論的に）誘導可能である別形を指す。一般に、親化合物は、「誘導体」を生成するための出発材料であり得、一方、「類似体」を生成するためには、親化合物を出発材料として必ずしも使用するとは限らない場合がある点で、「誘導体」は、「類似体」とは異なる。誘導体は、親化合物とは異なる化学的または物理的な特性を示す場合がある。例えば、誘導体は、親化合物と比較して、より親水性である場合もあり、または変化した反応性を示す場合（例えば、標的に対する親和性を変化させるアミノ酸の変化を有するＣＤＲ）もある。
用語「生物学的試料」は、被験体もしくは生物学的供給源に由来する血液試料、生検検体、組織外植片、器官培養物、生物学的液体、または任意のその他の組織、細胞もしくはその他の標本を含む。被験体または生物学的供給源は、例えば、ヒトまたは非ヒト動物、初代細胞培養物、または染色体に組み込まれたもしくはエピソーム性の組換え核酸配列を含有し得る遺伝子操作された細胞系、体細胞ハイブリッド細胞系、不死化したもしくは不死化可能な細胞系、分化したもしくは分化可能な細胞系、形質転換細胞系などを含めた、培養馴化細胞系（ｃｕｌｔｕｒｅ ａｄａｐｔｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であってよい。本開示のさらなる実施形態では、被験体または生物学的供給源は、悪性の疾患、障害もしくは状態またはＢ細胞の障害を含めた、疾患、障害または状態を有することが疑われる場合、あるいはそうしたリスクを有する場合がある。特定の実施形態では、被験体または生物学的供給源は、過剰増殖疾患、炎症性疾患もしくは自己免疫疾患を有することが疑われる場合、またはそうしたリスクを有する場合があり、本開示の特定のその他の実施形態では、被験体または生物学的供給源は、そのような疾患、障害または状態のリスクも、その存在も有さないことが知られている場合がある。
ＩＬ６アンタゴニスト
上記のように、本開示は、以下の特性の１つまたは複数を有するＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な結合領域または結合ドメインを含有する、ポリペプチドを提供する：（１）ＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒα単独と比較してＩＬ６ｘＲ複合体により大きな親和性、（２）ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合について膜ｇｐ１３０もしくは可溶性ｇｐ１３０と競合する、（３）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害する、または（４）ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。特定の実施形態では、本開示によるＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な結合ドメインは、以下の特性を有する：（１）ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれに対するよりもＩＬ６ｘＲ複合体に対してより大きな親和性、（２）ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合について膜ｇｐ１３０と競合する、（３）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害する、および（４）ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。例えば、ＩＬ６ｘＲに特異的な結合領域または結合ドメインは、免疫グロブリンの可変結合ドメインまたはその誘導体、例えば抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどであることができる。この開示との関連で、ＩＬ６ｘＲに特異的な結合領域または結合ドメインは、本明細書に記載のｇｐ１３０でないことを理解すべきである。
本明細書で用いるように、「ＩＬ６ｘＲ複合体」または「ＩＬ６ｘＲ」は、ＩＬ６受容体とのＩＬ６の複合体を指し、そこにおいて、ＩＬ６受容体（例えばＩＬ６Ｒα、ＩＬ６ＲＡ、ＩＬ６Ｒ１およびＣＤ１２６としても公知である）は膜タンパク質（本明細書でｍＩＬ６ＲまたはｍＩＬ６Ｒαと称する）または可溶性の形態（本明細書でｓＩＬ６ＲまたはｓＩＬ６Ｒαと称する）である。用語「ＩＬ６Ｒ」は、ｍＩＬ６ＲαおよびｓＩＬ６Ｒαの両方を包含する。一実施形態では、ＩＬ６ｘＲは、ＩＬ６およびｓＩＬ６Ｒαの複合体を含む。特定の実施形態では、ＩＬ６ｘＲ複合体は、１つまたは複数の共有結合を通して一緒に保持される。例えば、ＩＬ６Ｒのカルボキシ末端は、ハイパーＩＬ６として公知である複合体を提供するために、ペプチドリンカーを通してＩＬ６のアミノ末端に融合させることができる（例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒら（１９９７年）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５巻：１４２頁を参照されたい）。ハイパーＩＬ６リンカーは、架橋化合物、１〜５０個のアミノ酸配列、またはその組合せで構成することができる。ハイパーＩＬ６は、二量体化ドメイン、例えば免疫グロブリンＦｃドメインまたは免疫グロブリン定常ドメインサブ領域をさらに含むことができる。特定の実施形態では、ＩＬ６ｘＲ複合体は、非共有結合的相互作用を通して、例えば水素結合、静電的相互作用、ファンデルワールス力、塩橋、疎水性相互作用など、またはそれらの任意の組合せによって一緒に保持される。例えば、ＩＬ６およびＩＬ６Ｒは、非共有結合で無理なく結合することができ（例えば、天然に見られるように、または合成もしくは組換えタンパク質として）、または各々は、複合体の安定性をさらに高めるために、免疫グロブリンＦｃドメインなどの二量体化ドメインに融合させることができる。
本明細書で用いるように、「ｇｐ１３０」は、ＩＬ６ｘＲ複合体に結合するシグナル伝達タンパク質を指す。ｇｐ１３０タンパク質は、膜形態（ｍｇｐ１３０）、可溶性形態（ｓｇｐ１３０）または任意の他の機能的形態であることができる。例示的なｇｐ１３０タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２１７５．２に記載の配列またはその任意の可溶性もしくは誘導体の形態を有する（例えば、Ｎａｒａｚａｋｉら（１９９３年）Ｂｌｏｏｄ ８２巻：１１２０頁またはＤｉａｍａｎｔら（１９９７年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１２巻：３７９頁を参照されたい）。例示のために、および理論によって縛られることを望まないが、ｍｇｐ１３０タンパク質は、ＩＬ６／ｍＩＬＲまたはＩＬ６／ｓＩＬＲ複合体のいずれかに結合することができるが、ｓｇｐ１３０は主にＩＬ６／ｓＩＬＲ複合体に結合する（Ｓｃｈｅｌｌｅｒら（２００６年）Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６３巻：３２１頁を参照されたい）。したがって、本開示の結合ドメイン、またはその融合タンパク質の特定の実施形態は、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれかよりも高い親和性でＩＬ６ｘＲに結合することによって、およびｇｐ１３０、好ましくはｍｇｐ１３０への結合に対してｓＩＬ６ｘＲ複合体と競合することによって、あるいはｓＩＬ６ｘＲ複合体とのｓｇｐ１３０の結合を増強または強化することによって、ＩＬ６ｘＲ複合体トランス−シグナル伝達を阻害することができる。本開示の結合ドメインは、（１）結合ドメインまたはその融合タンパク質が、ｓＩＬ６ｘＲへのｇｐ１３０の結合を阻止し、そして結合ドメインが、ｓＩＬ６ｘＲとのｇｐ１３０の結合と比較して、同等以上の親和性でｓＩＬ６ｘＲに結合するか、あるいは（２）結合ドメインまたはその融合タンパク質がｓＩＬ６ｘＲ複合体へのｓｇｐ１３０の結合を強化、増強または促進し、それによってｍｇｐ１３０との結合のためにｓＩＬ６ｘＲ複合体が利用可能である時間を減少させる場合に、ｓＩＬ６ｘＲに対するｇｐ１３０の結合と「競合する」。
本開示の結合ドメインおよびその融合タンパク質は、それらが、例えば約１０５Ｍ−１、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１または１０１３Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位による特定の結合相互作用の平衡結合定数）で標的分子に結合する場合、「免疫特異性」であることができるかまたは所望の程度に結合することができ、例えば、試験試料に存在する他の成分に実質的に結合せずに標的に「特異的または選択的に結合する」ことを含む。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、またはそれを超えるＫａを有する結合ドメインを指す。あるいは、親和性は、Ｍの単位（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）と定義してもよい。本開示による結合ドメインポリペプチドおよび融合タンパク質の親和性は、従来の技術を用いて容易に決定することができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（１９４９年）Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１巻：６６０頁、および米国特許第５，２８３，１７３号、第５，４６８，６１４号、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析、または同等物を参照されたい）。
一態様では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独の何れかに対するよりも少なくとも２倍〜１０００倍高いｓＩＬ６ｘＲ複合体との親和性を有する。ｓＩＬ６ｘＲ複合体に結合することによって、本開示の結合ドメインは、ＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害する。特定の実施形態では、ｓＩＬ６ｘＲ複合体に対する結合ドメインの親和性は、ｓＩＬ６ｘＲ複合体に対するｇｐ１３０の親和性とほぼ同じであり、ここで「ほぼ同じ」は、同等のまたは最高約２倍まで高い親和性を意味する。特定の実施形態では、ｓＩＬ６ｘＲ複合体に対する結合ドメインの親和性は、ｓＩＬ６ｘＲ複合体に対するｇｐ１３０の親和性より少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍またはそれを超えて高い。例えば、ｓＩＬ６ｘＲ複合体に対するｇｐ１３０の親和性が約２ｎＭ（例えば、Ｇａｉｌｌａｒｄら（１９９９年）Ｅｕｒ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ． １０巻：３３７頁を参照されたい）である場合、ｓＩＬ６ｘＲ複合体に対して少なくとも１０倍高い親和性を有する結合ドメインは約０．２ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有するであろう。
さらなる実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、（ａ）ｓＩＬ６ｘＲ複合体に、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独より少なくとも２倍〜１０００倍高い親和性で結合し、（ｂ）ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合についてｇｐ１３０と競合するか、またはｓＩＬ６ｘＲ複合体とのｇｐ１３０の結合を強化する、ポリペプチド配列を含む。さらなる実施形態では、ｓＩＬ６ｘＲ複合体に、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれかに対するより少なくとも２倍〜１０００倍高い親和性で結合する本開示のポリペプチド結合ドメインは、（ｉ）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達をより顕著にまたは優先的に阻害すること、（ｉｉ）ＩＬ６以外のｇｐ１３０サイトカインファミリーメンバーのシグナル伝達を阻害しないこと、（ｉｉｉ）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害し、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を検出可能に阻害しないこともでき、（ｉｖ）これらの特性の２つ以上を有することができ、または（ｖ）これらの特性の全てを有することができる。
特定の実施形態では、本開示のポリペプチドＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、ｓＩＬ６ｘＲ複合体に、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれかに対するより少なくとも２倍〜１０００倍高い親和性で結合し、ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達をより顕著にまたは優先的に阻害する。「ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害する」ことは、ｓＩＬ６ｘＲ活性は測定可能に低減されるが、ＩＬ６シス−シグナル伝達の減少は実質的に変更されない程度にトランス−シグナル伝達を変化させることを指す（すなわち、阻害が最小限であるか、存在しないかまたは測定可能ではないことを意味する）。例えば、ｓＩＬ６ｘＲ活性（例えば、ＨｅｐＧ２細胞でのアンチキモトリプシン（ＡＣＴ）の急性相発現）のバイオマーカーを測定して、トランス−シグナル伝達阻害を測定することができる。代表的なアッセイは、Ｊｏｓｔｏｃｋら（Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００１年）によって記載されている。簡潔には、ＨｅｐＧ２細胞を、ｓＩＬ６ｘＲ（トランス−シグナル伝達）またはＩＬ６（シス−シグナル伝達）の存在下でＡＣＴを過剰発現させるために刺激することができるが、ｓｐｇ１３０を加えることは、ＩＬ６によって誘導される発現に実質的に影響せずに、ｓＩＬ６ｘＲによって誘導されるＡＣＴの過剰発現を阻害する。同様に、ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害する本開示のポリペプチド結合ドメインは、ｓＩＬ６ｘＲによって誘導されるＡＣＴの過剰発現を阻害する（すなわち、トランス−シグナル伝達を阻害する）が、ＩＬ６によって誘導される発現に実質的に影響しない（すなわち、シス−シグナル伝達を測定可能に減少させない）。このアッセイおよび当技術分野で公知である他のアッセイを用いて、ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達の優先的阻害を測定することができる（例えば、Ｓｐｏｒｒｉら（１９９９年）Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１巻：１０５３頁、Ｍｉｈａｒａら（１９９５年）Ｂｒ． Ｊ． Ｒｈｅｕｍ． ３４巻：３２１頁、Ｃｈｅｎら（２００４年）Ｉｍｍｕｎ． ２０巻：５９頁に記載の他のバイオマーカーを参照されたい）。
さらなる実施形態では、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインによるシグナル伝達は、本開示の結合ドメインポリペプチドまたはその融合タンパク質によって実質的に阻害されない。例えば、ｇｐ１３０を経るＩＬ６ｘＲ複合体によるトランス−シグナル伝達は阻害されるが、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、線毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経ポイエチン（ＮＰ）、カルジオトロフィン（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｉｎ）様サイトカイン（ＣＬＣ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）またはそれらの任意の組合せを経るシグナル伝達など、１つまたは複数の他のｇｐ１３０ファミリーサイトカインによるシグナル伝達は、最小限に影響されるかまたは影響を受けない。
さらに、標的分子との結合ドメインの相互作用は、その相互作用の動態学的結合または解離の測定として提供することができる。本明細書でｋＯＮとも呼ばれる動態学的結合（ｋａ）は、結合相互作用が起こる速度の尺度である。一実施形態では、ｋＯＮは、未結合の分子が、それが結合することができる細胞表面領域に存在する平均時間が与えられた場合、およびこの領域の細胞表面の未結合分子の濃度が与えられた場合の、未結合の結合ドメインが標的分子に結合する可能性の尺度であってもよい。ｋａ（ｋＯＮ）は、１／Ｍ・秒の単位を有する。特定の実施形態では、ｋＯＮ値は、約１０３／Ｍ・秒、約１０４／Ｍ・秒、約１０５／Ｍ・秒、約１０６／Ｍ・秒、約１０７／Ｍ・秒、約１０８／Ｍ・秒、約１０９／Ｍ・秒、約１０１０／Ｍ・秒またはそれを超えてもよい。結合ドメインがｓｃＦｖである場合、ｋＯＮは、約１０４／Ｍ・秒未満〜約１０７／Ｍ・秒の範囲であることができる（Ｕｌｒｉｋら（２０００年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０巻：６４３４頁、ＸａｖｉｅｒおよびＷｉｌｌｓｏｎ（１９９８年）Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７４巻：２０３６頁）。結合ドメインのｋＯＮは、表面プラズモン共鳴などの、当技術分野で公知である方法を用いて測定することができる（Ｌｅｏｎａｒｄら（２００７年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２３巻：１７２頁）。
本明細書でｋＯＦＦとも呼ばれる動態学的解離（ｋｄ）は、複合体の解離速度の尺度そして、したがって本開示のポリペプチド結合ドメインが結合する標的分子の「滞留時間」の尺度である。ｋｄ（ｋＯＦＦ）は、１／秒の単位を有する。本開示の結合ドメインの好ましいｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、数日または数週間のオーダーであるが、ＩＬ６およびｓＩＬ６の生成は両者とも疾患状態で非常に上昇することがあるので、結合ドメイン濃度は低くてもよいが、標的は豊富であってよいことを、当業者は理解しよう（例えば、Ｌｕら（１９９３年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ５巻：５７８頁を参照されたい）。したがって、特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、約１０−５／秒（例えば、約１日）以下のｋＯＦＦを有する。特定の実施形態では、ｋＯＦＦは、約１０−１／秒、約１０−２／秒、約１０−３／秒、約１０−４／秒、約１０−５／秒、約１０−６／秒、約１０−７／秒、約１０−８／秒、約１０−９／秒、約１０−１０／秒、またはそれ未満の範囲であってもよい（Ｇｒａｆｆら（２００４年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ． １７巻：２９３頁を参照されたい）。
本開示の結合ドメインは、本明細書に記載のように、または当技術分野で公知である様々な方法によって生成することができる（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号、第６，２９１，１５８号を参照されたい）。原料には、ヒト、ラクダ科の動物（ラクダ、ヒトコブラクダまたはラマから、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６頁およびＮｇｕｙｅｎら（１９９８年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２７５巻：４１３頁）、サメ（Ｒｏｕｘら（１９９８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５巻：１１８０４頁）、魚類（Ｎｇｕｙｅｎら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５４巻：３９頁）、齧歯動物、トリ、ヒツジを含む様々な種からの抗体遺伝子配列（それらは、ファージライブラリーなどで、抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖまたはＦａｂとしてフォーマットすることができる）、ランダムペプチドライブラリーをコードする配列、またはフィブリノーゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０巻：１３８８頁を参照されたい）、クニッツドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８号を参照されたい）、リポカリンドメイン（例えば、国際公開第２００６／０９５１６４号を参照されたい）、Ｖ様ドメイン（例えば、米国特許出願公開第２００７／００６５４３１号を参照されたい）、Ｃ型レクチンドメイン（ＺｅｌｅｎｓｋｙおよびＧｒｅａｄｙ（２００５年）ＦＥＢＳ Ｊ． ２７２巻：６１７９頁）、ｍＡｂ２またはＦｃａｂ（商標）（例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００７／０９８９３４号、ＷＯ２００６／０７２６２０号を参照されたい）などの、代替の非抗体骨格のループ領域の工学的に作製された多様なアミノ酸をコードする配列が含まれる。さらに、都合のよい系（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）、ＴＣマウス（商標）、ＫＭマウス（登録商標）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギ、その他）で、免疫原として合成単鎖ＩＬ６ｘＲ複合体、例えばヒトＩＬ６ｘＲ複合体またはハイパーＩＬ６を用いるハイブリドーマ開発のための従来の戦略を、本開示の結合ドメインを開発するために用いることができる。
例示的な実施例では、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な本開示の結合ドメインは、合成ＩＬ６ｘＲ複合体への結合についてスクリーニングすることによってＦａｂファージの断片ライブラリーで同定された（Ｈｏｅｔら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３巻：３４４頁を参照されたい）。このスクリーニングのために用いられる合成ＩＬ６ｘＲ複合体は、Ｎ−ＩＬ６Ｒα（ｆｒａｇ）−Ｌ１−ＩＬ６（ｆｒａｇ）−Ｌ２−ＩＤ−Ｃの構造を含み、式中、Ｎはアミノ末端であり、Ｃはカルボキシ末端であり、ＩＬ６Ｒα（ｆｒａｇ）は完全長ＩＬ６Ｒαの断片であり、ＩＬ６（ｆｒａｇ）はＩＬ６の断片であり、Ｌ１およびＬ２はリンカーであり、ＩＤは免疫グロブリンＦｃドメインなどの介在ドメインまたは二量体化ドメインである。
より具体的には、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な結合ドメインを同定するために用いられるＩＬ６ｘＲ（ハイパーＩＬ６の形態）は、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の通りの構造を有する：（ａ）完全長タンパク質の最初の１１０個のアミノ酸および、カルボキシ末端部分（用いるアイソフォームに依存する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５５６．１、アイソフォーム１またはＮＰ＿８５２００４．１、アイソフォーム２を参照されたい））を欠くＩＬ６Ｒαからの２１２個のアミノ酸の中央断片を、（２）Ｇ３Ｓのリンカーに融合し、次にそれを、（３）ＩＬ６の１７５個のアミノ酸のカルボキシ末端断片（すなわち、完全長タンパク質ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５９１．１の最初の２７個のアミノ酸を欠く）に融合し、次にそれを、（４）配列番号５８９に記載のＩｇＧ２Ａヒンジであるリンカーに融合し、それを最後に、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）Ｆｃドメインからなる二量体化ドメインに融合する。特定の実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインからなる二量体化ドメインは、以下のアミノ酸の１つまたは複数が変異している（すなわち、その位置に異なるアミノ酸を有する）：位置２３４のロイシン（Ｌ２３４）、位置２３５のロイシン（Ｌ２３５）、位置２３７のグリシン（Ｇ２３７）、位置３１８のグルタミン酸（Ｅ３１８）、位置３２０のリシン（Ｋ３２０）、位置３２２のリシン（Ｋ３２２）、またはそれらの任意の組合せ（ＥＵ番号付け）。例えば、これらのアミノ酸のいずれか１つを、アラニンに変換する（変異する）ことができる。さらなる実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２（ＥＵ番号付けによる）の各々がアラニンに突然変異している（すなわち、それぞれＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ）。
一実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインを同定するために用いられるＩＬ６ｘＲ複合体は、配列番号６０６に記載のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な結合ドメインを含むポリペプチドであって、ＩＬ６ｘＲがｓＩＬ６ｘＲであり、配列番号６０６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドが提供される。さらなる実施形態では、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な結合ドメインを含むポリペプチドは、（１）ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれかに対するよりも高い親和性をｓＩＬ６ｘＲ複合体に対して示し、ｓＩＬ６ｘＲは配列番号６０６に記載のアミノ酸配列を有し、（２）配列番号６０６に記載のアミノ酸配列を有するｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合について膜ｇｐ１３０または可溶性ｇｐ１３０と競合し、（３）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達をより優先的に阻害し、（４）ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害せず、（５）特性（１）〜（４）の任意の組合せを有するか、あるいは、（６）（１）〜（４）の全ての特性を有する。本開示の結合ドメインを同定するために用いることができるか、または前記結合特性のいずれかを測定するための参照複合体として用いることができる他の例示的なＩＬ６ｘＲ複合体が、例えば、米国特許出願公開第２００７／０１７２４５８号、第２００７／００３１３７６号、および米国特許第７，１９８，７８１号、第５，９１９，７６３号に記載されている。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、本明細書に記載のＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６ｘＲ複合体、好ましくはヒトＩＬ６、ヒトＩＬ６ＲまたはヒトＩＬ６ｘＲ複合体に特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、齧歯動物（例えば、マウス、ラット）のもの、ヒト化されたものまたはヒトのものである。そのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例を、それぞれ配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０、および３７３〜４３４および７９９〜８０４に記載する。さらなる実施形態では、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれかよりも大きい親和性でＩＬ６ｘＲに結合し、そしてｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合についてｍｇｐ１３０と競合するか、またはｓＩＬ６ｘＲへのｓｇｐ１３０結合を強化する、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的なポリペプチド結合ドメインが提供され、そこにおいて、それぞれ配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４、および４３５〜４９６および８０５〜８１０に記載のように、結合ドメインは、１つまたは複数の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列に、または１つまたは複数の重鎖可変領域（ＶＨ）に、またはその両方に、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、各ＣＤＲは、最高３つのアミノ酸変化を有する（すなわち、変化の多くはフレームワーク領域内にある）。
さらなる実施形態では、本開示の結合ドメインは、それぞれ配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０、および３７３〜４３４および７９９〜８０４に記載の、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、またはＩＬ６ｘＲ複合体に特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含み、それらは、そのようなＶＨドメイン、ＶＬドメイン、または両方のアミノ酸配列に少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であり、各ＣＤＲは、０〜３個のアミノ酸変化を有する。例えば、本開示のＶＨドメイン、ＶＬドメインまたは両方のアミノ酸配列は、ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２に見出される例示的な結合ドメイン（配列番号６０８を参照されたい）からの、それぞれＶＨドメイン（例えば、アミノ酸５１２〜６３１）、ＶＬドメイン（例えば、アミノ酸６４９〜７５８）、または両方のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であることができ、そこにおいて、各ＣＤＲは、０〜３個のアミノ酸変化を有する。
２つ以上のポリペプチドまたは核酸分子配列との関連で、用語「同一の」または「同一性割合」は、例えば手動整列によるか、または目視検査による配列比較アルゴリズムなどの、当技術分野で公知である方法を用いて測定して、比較ウインドウまたは指定された領域にわたる最大の一致について比較し、整列させた場合に、同じであるか、または指定された領域が同じである指定された割合のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性）、２つ以上の配列またはサブ配列を意味する。例えば、配列同一性割合および配列類似性を決定するのに適する好ましいアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５巻：３３８９頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５巻：４０３頁にそれぞれ記載されている。
本明細書に記載のこれらのまたは他の実施形態のいずれかでは、ＶＬおよびＶＨドメインは、いずれの向きにも配置することができ、本明細書に開示される最大約３０個のアミノ酸リンカーで、または２個のサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能を提供することができる他の任意のアミノ酸配列で分離されてもよい。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインを結合するリンカーは、リンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）などの、配列番号４９７〜６０４および８２３〜８２８に記載のアミノ酸配列を含む。多重特異性結合ドメインは、ラクダ科の動物の抗体構成への類似により、少なくとも２つの特異的下位結合（ｓｕｂ−ｂｉｎｄｉｎｇ）ドメインを、または対のＶＨおよびＶＬ鎖のより一般的な哺乳動物の抗体構成への類似により、少なくとも４つの特異的下位結合ドメインを有する。
さらなる実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニストに特異的な結合ドメインは、抗ＩＬ６、抗ＩＬ６Ｒまたは抗ＩＬ６ｘＲ複合体のｓｃＦｖまたはＦａｂ断片の可変領域から、あるいはその重鎖または軽鎖可変領域から得られたか、誘導されたかまたは設計された、１つ（好ましくはＣＤＲ３）または複数の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、または１つまたは複数のそのようなＣＤＲの複数のコピーを含むことができる。
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭおよび接触による定義（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）を含め、当技術分野の様々な方式で定義される。Ｋａｂａｔ定義は配列変動性に基づき、ＣＤＲ領域を予測するための最も一般に用いられる定義である（Ｊｏｈｎｓｏｎら（２０００年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８巻：２１４頁）。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造的なループ領域の位置に基づく（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８６年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６巻：９０１頁、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４２巻：８７７頁）。ＡｂＭ定義はＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ定義の間の折衷型であり、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐによって作成された抗体構造モデル化のためのプログラムの統合セットである（Ｍａｒｔｉｎら（１９８９年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６巻：９２６８頁、Ｒｅｅｓら、ＡＢＭＴＭ、抗体可変領域のモデル化のためのコンピュータプログラム、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄ．）。接触による定義として公知である追加の定義は最近導入され（ＭａｃＣａｌｌｕｍら（１９９６年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５巻：７３２頁を参照されたい）、それは利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。
慣例によって、重鎖のＣＤＲドメインは、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３と呼ばれ、それらはアミノ末端からカルボキシ末端に向かって順番に連続して番号付けられている。ＣＤＲ−Ｈ１は長さが約１０〜１２残基であり、ＣｈｏｔｈｉａおよびＡｂＭ定義によるとＣｙｓの４つ後の残基から開始し、Ｋａｂａｔ定義によると５つ後の残基から開始する。Ｈ１には、Ｔｒｐ、Ｔｒｐ−Ｖａｌ、Ｔｒｐ−ＩｌｅまたはＴｒｐ−Ａｌａが続くことができる。Ｈ１の長さはＡｂＭ定義によると約１０〜１２残基であるが、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は最後の４つの残基を除外する。ＫａｂａｔおよびＡｂＭ定義によるとＣＤＲ−Ｈ２はＨ１の末端の１５残基後から開始し、それは一般に配列Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙの後に続き（しかし、いくつかの変形形態が公知である）、一般に配列Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａの前にくる。Ｋａｂａｔ定義によると、Ｈ２の長さは約１６〜１９残基であるが、ＡｂＭ定義は長さが９〜１２残基であると予測する。ＣＤＲ−Ｈ３は、Ｈ２の末端の３３残基後で通常開始され、一般にアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇの後に続き、アミノ酸Ｇｌｙの前にあり、３〜約２５残基の範囲の長さを有する。
慣例によって、軽鎖のＣＤＲ領域は、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３と呼ばれ、それらはアミノ末端からカルボキシ末端に向かって順番に連続して番号付けられている。ＣＤＲ−Ｌ１は、一般に約残基２４から開始し、一般にＣｙｓの後に続く。ＣＤＲ−Ｌ１の後の残基は常にＴｒｐであり、それは以下の配列の１つを開始する：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＧｌｎまたはＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ。ＣＤＲ−Ｌ１の長さは、約１０〜１７残基である。ＣＤＲ−Ｌ２はＬ１の末端の約１６残基後に開始し、一般に残基Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−ＬｙｓまたはＩｌｅ−Ｐｈｅの後に続く。ＣＤＲ−Ｌ２は、長さが約７残基である。ＣＤＲ−Ｌ３は、Ｌ２の末端の３３残基後で通常開始され、一般にＣｙｓの後に続き、その後に、一般に配列Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙが続き、約７〜１１残基の長さを有する。
したがって、本開示の結合ドメインは、抗ＩＬ６、抗ＩＬ６Ｒ、抗ＩＬ６ｘＲの可変領域からの単一のＣＤＲ３を含むことができ、またはそれは、同じであってもまたは異なってもよい複数のＣＤＲを含むことができる。特定の実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、フレームワーク領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含むＶＨおよびＶＬドメインを含み、そこにおいて、（ａ）ＶＨドメインは、配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０のいずれか１つで見られる重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｂ）ＶＬドメインは、配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４のいずれか１つで見られる軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｃ）結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、あるいは結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、そこにおいて、ＶＨおよびＶＬは同じ参照配列で見られる。さらなる実施形態では、本開示の結合ドメインは、フレームワーク領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含むＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６ｘＲ複合体に特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含み、そこにおいて、（ａ）ＶＨドメインは、配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０のいずれか１つで見られる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｂ）ＶＬドメインは、配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４のいずれか１つで見られる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｃ）結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、あるいは結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、そこにおいて、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は同じ参照配列に由来する。例示的なＩＬ６アンタゴニストの軽鎖および重鎖可変ドメインＣＤＲを、それぞれ配列番号１〜１８６および７８７〜７９２、ならびに１８７〜３７２および７９３〜７９８に提供する。ＩＬ６アンタゴニストの軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４、ならびに４３５〜４９６および８０５〜８１０に提供する。
特異的ＣＤＲを含む本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、ＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、（ｉ）配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０のいずれか１つで見られるＶＨドメインのアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメインであって、各ＣＤＲは、０〜３個のアミノ酸変化を有するＶＨドメイン、または（ｉｉ）配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４のいずれか１つで見られるＶＬドメインのアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメインであって、各ＣＤＲは、０〜３個のアミノ酸変化を有するＶＬドメイン、または（ｉｉｉ）（ｉ）のＶＨドメインおよび（ｉｉ）のＶＬドメインの両方、あるいはＶＨおよびＶＬが同じ参照配列に由来する（ｉ）のＶＨドメインおよび（ｉｉ）のＶＬドメインの両方を含むことができる。
特定の実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、免疫グロブリン骨格などの免疫グロブリン様ドメインであってもよい。本開示で意図される免疫グロブリン骨格には、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ドメイン抗体または重鎖のみの抗体が含まれる。さらなる実施形態では、抗ＩＬ６もしくは抗ＩＬ６ｘＲ抗体（例えば、マウスまたはラットなどのヒト以外、キメラ、ヒト化、ヒトの抗体）、またはそれぞれ配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０ならびに３７３〜４３４および７９９〜８０４のいずれか１つに記載のＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＦａｂ断片もしくはｓｃＦｖ断片が提供され、それらは以下の特性の１つまたは複数を有することもできる：（１）ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれかに対するよりも高いＩＬ６ｘＲ複合体に対する親和性、（２）ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合について膜ｇｐ１３０もしくは可溶性ｇｐ１３０と競合するか、またはｓＩＬ６ｘＲ複合体とのｇｐ１３０の結合を増強する、（３）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害する、あるいは（４）ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。そのような抗体、ＦａｂまたはｓｃＦｖは、本明細書に記載の方法のいずれかで用いることができる。特定の実施形態では、本開示は、ＩＬ６アンタゴニスト（すなわち、ＩＬ６シス−およびトランス−シグナル伝達を阻害することができる）である結合ドメインを含むポリペプチドを提供する。さらなる実施形態では、本開示によるＩＬ６アンタゴニストは、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。例示的なＩＬ６アンタゴニストには、ＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６ｘＲに特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインまたはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）が含まれる。
あるいは、本開示の結合ドメインは、免疫グロブリン以外の骨格の一部であってもよい。意図される他の骨格には、Ａドメイン分子、フィブロネクチンＩＩＩドメイン、アンチカリン、アンキリン反復を工学的に作製した結合分子、アドネクチン、クニッツドメインまたはプロテインＡのＺドメインアフィボディが含まれる。
本明細書に記すように、本明細書に記載する、軽鎖および重鎖可変領域およびＣＤＲなどの結合ドメインの変異体および誘導体が意図される。一例では、１つまたは複数のアミノ酸残基が特異的結合剤のアミノ酸配列を補う挿入変異体を提供する。挿入はタンパク質の一末端または両末端に位置してよく、または特異的結合剤のアミノ酸配列の内部領域内に位置してよい。本開示の変異体生成物は、成熟状態の特異的結合剤の生成物、すなわちリーダー配列またはシグナル配列が除去され、生成するタンパク質が追加のアミノ末端残基を有する特異的結合剤の生成物も含む。追加のアミノ末端残基は別のタンパク質に由来してよく、または特異的タンパク質に由来するとして同定可能ではない１つまたは複数の残基を含むことができる。位置−２および−１に追加のメチオニン残基およびリシン残基を有する本開示のポリペプチドと同様に、位置−１に追加のメチオニン残基を有するポリペプチドを意図する。追加のＭｅｔ、Ｍｅｔ−ＬｙｓまたはＬｙｓ残基（または一般に１つまたは複数の塩基性残基）を有する変異体は、細菌宿主細胞での高い組換えタンパク質産生に特に有用である。
本明細書で使用する「アミノ酸」は、天然アミノ酸（自然界に存在するアミノ酸）、置換された天然アミノ酸、非天然アミノ酸、置換された非天然アミノ酸、またはこれらの任意の組合せを指す。天然アミノ酸に関する指定は、本明細書では標準一文字または三文字コードのいずれかとして記述する。天然極性アミノ酸は、アスパラギン（ＡｓｐまたはＮ）およびグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、およびアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、およびこれらの誘導体などの塩基性アミノ酸、ならびにアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、およびこれらの誘導体などの酸性アミノ酸を含む。天然疎水性アミノ酸は、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、およびこれらの誘導体、ならびにグリシン（ＧｌｙまたはＧ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、およびこれらの誘導体などの他の非極性アミノ酸を含む。中程度の極性の天然アミノ酸は、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、およびこれらの誘導体を含む。他に指定しない限り、本明細書に記載する任意のアミノ酸はＤ−またはＬ−形状（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）のいずれかであってよい。
置換変異体は、アミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基が除去され代わりの残基に置換されている融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、置換は現実には保存性であるが、しかしながら、本開示は非保存的である置換も包含する。物理的性質および二次および三次タンパク質構造に対する寄与に従って、アミノ酸を分類することができる。保存的置換は、類似した性質を有する別のアミノ酸に代えて１つのアミノ酸の置換として、当技術分野で理解されている。例示的な保存的置換は、すぐ下の表１に述べる（１９９７年３月１３日に公開されたＷＯ９７／０９４３３、１０頁を参照されたい）。
あるいは、保存的アミノ酸は、すぐ下の表２に記載するように、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ． ＮＹ：ＮＹ（１９７５年）、７１〜７７頁）に記載されたのと同様に分類することができる。
変異体または誘導体は、特異的発現系の使用から生じる追加のアミノ酸残基を有することもできる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合生成物の一部として所望のポリペプチドを発現する市販のベクターの使用は、該所望のポリペプチドからのＧＳＴ成分の切断後に位置−１に追加のグリシン残基を有する、該所望のポリペプチドを提供する。ヒスチジンタグが、アミノ酸配列、一般に配列のカルボキシ末端および／またはアミノ末端に取り込まれている変異体を含めた、他のベクター系での発現から生じる変異体も意図される。
本開示の結合ドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸残基が除去されている、欠失変異体も意図される。欠失は融合タンパク質の一末端もしくは両末端で、またはアミノ酸配列内の１つもしくは複数の残基の除去から影響を受ける可能性がある。
ＩＬ６アンタゴニスト結合ドメイン融合タンパク質
本明細書に言及するように、本開示のポリペプチド結合ドメインはさらに、介在ドメイン（例えば、免疫グロブリン定常領域またはそのサブ領域）のアミノ末端、カルボキシ末端、または両末端と融合した、融合タンパク質の一部分であってよい。本開示の例示的な融合タンパク質には、ＳＭＩＰタンパク質、ＰＩＭＳタンパク質、単一特異性の多価結合ドメイン融合タンパク質、多重特異性結合ドメイン融合タンパク質などが含まれる。１つまたは複数の結合ドメインを、当技術分野で公知であるかまたは本明細書に記載するリンカーによって、介在ドメインに接合させることが可能である。
本明細書で使用する「介在ドメイン」は、単に１つまたは複数の結合ドメインの足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）として機能するアミノ酸配列を指し、したがって融合タンパク質は、組成物に単鎖ポリペプチドとして、主に（例えば、５０％以上の融合タンパク質集団）または実質的に（例えば、９０％以上の融合タンパク質集団）存在する。例えば、特定の介在ドメインは、構造機能（例えば、スペーシング、柔軟性、剛性）または生物機能（例えば、ヒト血液中などの血漿中の半減期増加）を有し得る。血漿中の本開示の融合タンパク質の半減期を増大することができる例示的な介在ドメインには、アルブミン、トランスフェリン、血清タンパク質と結合する足場ドメインなど、またはこれらの断片が含まれる。
好ましい実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質の介在ドメインは、水素結合、静電的相互作用、ファンデルワース力、ジスルフィド結合、塩架橋、疎水性相互作用など、またはこれらの任意の組合せなどによる、非共有結合相互作用または共有結合相互作用による、少なくとも２つの単鎖ポリペプチドまたはタンパク質の結合を促進することができるアミノ酸配列を指す「二量体化ドメイン」である。例示的な二量体化ドメインは免疫グロブリン重鎖定常領域またはサブ領域（例えば、ＣＨ２ＣＨ３）を含む。二量体化ドメインが、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、セプタマー、オクタマーなどを含めた高次多量体複合体の形成も促進することができることは理解されるはずである。
「定常サブ領域」は、全ての定常領域ドメインが供給源抗体で見られるわけではないが、１つまたは複数の免疫グロブリン定常領域ドメインの一部または全部に相当するかまたはそれらに由来する、好ましいペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列を指すために、本明細書で定義する用語である。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質の定常領域ドメインは、いくつかのＦｃ受容体と結合する能力を保持し（ＦｃＲｎ結合など）、かつｉｎ ｖｉｖｏでの比較的長い半減期を保持しながら、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、または補体活性化および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の最小エフェクター機能を欠く、または有する。特定の実施形態では、本開示の結合ドメインをヒトＩｇＧ１定常領域またはサブ領域と融合させ、ここで、ＩｇＧ１定常領域またはサブ領域は、以下の突然変異した１つまたは複数のアミノ酸を有する：位置２３４のロイシン（Ｌ２３４）、位置２３５のロイシン（Ｌ２３５）、位置２３７のグリシン（Ｇ２３７）、位置３１８のグルタミン酸（Ｅ３１８）、位置３２０のリシン（Ｋ３２０）、位置３２２のリシン（Ｋ３２２）、またはこれらの任意の組合せ（ＥＵナンバリング）。
Ｆｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＦｃεＲｌ、ＦｃＲｎ）と、または補体成分Ｃ１ｑ（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；Ｐｒｅｓｔａ（２００２年）Ｃｕｒｒ． Ｐｈａｒｍａ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３巻：２３７頁を参照されたい）とＦｃとの相互作用を変えることができる突然変異を、Ｆｃドメインの内側または外側に作製するための方法は、当技術分野で公知である。本開示の特定の実施形態は、ＦｃＲｎおよびプロテインＡとの結合が保たれ、Ｆｃドメインが他のＦｃ受容体またはＣ１ｑともはや相互作用しないかまたは最小限で相互作用する、ヒトＩｇＧ由来の定常領域またはサブ領域を有する免疫グロブリンまたは融合タンパク質を含む組成物を含む。例えば、本開示の結合ドメインは、位置２９７のアスパラギン（ＥＵナンバリングの下でＮ２９７）が別のアミノ酸に突然変異して、この位置におけるグリコシル化を低下または消失し、したがってＦｃγＲおよびＣ１ｑへの有効なＦｃの結合を無効にする、ヒトＩｇＧ１定常領域またはサブ領域と融合することができる。別の例示的な突然変異は、Ｃ１ｑの結合はノックアウトするがＦｃの結合には影響を与えないＰ３３１Ｓである。
さらなる実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン参照配列と比較して改変型グリコシル化パターンを有する場合がある。例えば、様々な遺伝的技法のいずれかを利用して、グリコシル化部位を形成する１つまたは複数の特定のアミノ酸残基を変えることができる（Ｃｏら、（１９９３年）Ｍｏｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３０巻：１３６１頁；Ｊａｃｑｕｅｍｏｎら、（２００６年）Ｊ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ４巻：１０４７頁；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、（２００５年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６５巻：７９３４頁；Ｗａｒｎｏｃｋら、（２００５年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ９２巻：８３１頁を参照されたい）。あるいは、本開示の融合タンパク質が産生される宿主細胞を工学的に作製して（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、改変型グリコシル化パターンを生み出すことができる。当技術分野で公知である１つの方法は、例えば、ＡＤＣＣを増大する両断型、非フコシル化変異体の形態の改変型グリコシル化をもたらす。これらの変異体は、オリゴ糖修飾酵素を含有する宿主細胞での発現から生じる。あるいは、ＢｉｏＷａ／Ｋｙｏｗａ ＨａｋｋｏのＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ技術は、本発明によるグリコシル化分子のフコース含有量を減らすことが意図される。公知である１つの方法では、ＧＤＰ−フコースの産生によって免疫グロブリンＦｃ領域のグリコシル化パターンを修飾する、組換え免疫グロブリン産生用のＣＨＯ宿主細胞を提供する。
あるいは、化学的技法を使用して本開示の融合タンパク質のグリコシル化パターンを改変する。例えば、様々なグリコシダーゼ阻害剤および／またはマンノシダーゼ阻害剤は、ＡＤＣＣ活性の増大、Ｆｃ受容体結合の増大、およびグリコシル化パターンの改変の、１つまたは複数の所望の効果をもたらす。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現する細胞を、前記宿主細胞によって産生される免疫糖タンパク質分子のＡＤＣＣを増大させる濃度で炭水化物修飾物質を含み、前記炭水化物修飾物質が８００μＭ未満の濃度で存在する培養培地で増殖する。好ましい実施形態では、これらの多重特異性融合タンパク質を発現する細胞を、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、または８００μＭなど１００〜８００μＭの濃度で、カスタノスペルミンまたはキフネンシン、より好ましくはカスタノスペルミンを含む培養培地で増殖させる。カスタノスペルミンなどの炭水化物修飾物質を用いてグリコシル化を改変するための方法は、米国特許出願公開第２００９／００４１７５６号またはＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／０５２０３０に提供されている。
別の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、エフェクター細胞Ｆｃ受容体との結合に影響を与えるアミノ酸修飾を有する場合がある。これらの修飾は、Ｐｒｅｓｔａら（２００１年）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ． ３０巻：４８７頁に開示された手法などの、当技術分野で公知である任意の技法を使用して作製することができる。別の手法では、Ｘｅｎｃｏｒ ＸｍＡｂ技術を利用して、Ｆｃドメインに相当する定常サブ領域を操作して、細胞殺傷エフェクター機能を高めることが可能である（Ｌａｚａｒら、（２００６年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０３巻：４００５頁を参照されたい）。この手法を使用して、例えば、ＦＣγＲに対する改善された特異性および結合性を有する定常サブ領域を作製し、それによって細胞殺傷エフェクター機能を高めることができる。
他のさらなる実施形態では、定常領域またはサブ領域は、このような介在ドメインを欠く相当する融合タンパク質と比較して、血漿半減期または胎盤通過を場合によっては増大することができる。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質の延長した血漿半減期は、ヒトにおいて、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２４、少なくとも３０、少なくとも３６、少なくとも４０、少なくとも４８時間、少なくとも数日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも数週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも数カ月以上である。
定常サブ領域は、以下のドメイン：ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭ）、およびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥまたはＩｇＭ）のいずれかの一部または全部を含むことができる。したがって、本明細書で定義する定常サブ領域は、免疫グロブリン定常領域の一部分に相当するポリペプチドを指す。定常サブ領域は、同じ、または異なる、免疫グロブリン、抗体アイソタイプ、または（例えば、両方がＩｇＧ１である、または一方がＩｇＧ１であり、他方がＩｇＧ２である）対立遺伝子変異体由来のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは切断型であり、その配列を参照によって本明細書に組み込む、配列番号３６６〜３７１としてＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／１４６９６８に挙げられたカルボキシ末端配列を含む。特定の実施形態では、定常サブ領域は、アミノ末端リンカー、カルボキシ末端リンカー、または両末端のリンカーを場合によっては有することができる、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。
「リンカー」は、約２〜約１５０アミノ酸のリンカーなどの、他のペプチドまたはポリペプチドと接合または連結するペプチドである。本開示の融合タンパク質において、リンカーは介在ドメイン（例えば、免疫グロブリン由来定常サブ領域）と結合ドメインを接合することができ、またはリンカーは結合ドメインの２つの可変領域を接合することができる。例えばリンカーは、抗体ヒンジ領域配列から得られる、由来する、または設計されるアミノ酸配列、結合ドメインと受容体を連結する配列、または結合ドメインと細胞表面膜貫通領域または膜アンカーを連結する配列であってよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、生理的条件または他の標準的ペプチド条件（例えば、ペプチド精製条件、ペプチド保存に関する条件）下で少なくとも１つのジスルフィド結合に関与することができる、少なくとも１つのシステインを有することができる。特定の実施形態では、免疫グロブリンヒンジペプチドに相当するかまたはそれに類似するリンカーは、そのヒンジのアミノ末端に向けて位置するヒンジシステインに相当するシステインを保持する。さらなる実施形態では、リンカーはＩｇＧ１ヒンジに由来し、ヒンジシステインに相当する１つのシステインまたは２つのシステインを有する。特定の実施形態では、１つまたは複数のジスルフィド結合は介在ドメイン間の鎖間ジスルフィド結合として形成される。他の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、結合ドメインと直接融合した介在ドメインを有することができる（すなわち、リンカーまたはヒンジなし）。いくつかの実施形態では、介在ドメインは二量体化ドメインである。
さらに、結合ドメインはＶＨおよびＶＬドメインを含むことができ、これらの可変領域ドメインはリンカーによって組み合わせることができる。例示的な可変領域結合ドメインリンカーには、ｎが１〜５の整数である、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎなどの（ＧｌｙｎＳｅｒ）ファミリーに属するリンカーが含まれる（例えば、それぞれ配列番号５１８、５２５、５４２、５８５、５８６および６０３に相当するリンカー２２、２９、４６、８９、９０および１１６を参照されたい）。好ましい実施形態では、これらの（ＧｌｙｎＳｅｒ）ベースのリンカーは可変ドメインを結合させるために使用し、結合ドメインと介在ドメインを結合させるためには使用しない。
本開示の融合タンパク質の介在ドメインまたは二量体化ドメインを、ペプチドリンカーによって１つまたは複数の遠位または末端結合ドメインと結合させることが可能である。スペーシング機能を与える以外に、リンカーは、融合タンパク質内と、融合タンパク質とそれらの標的（複数可）間またはそれらの中の両方で、融合タンパク質の１つまたは複数の結合ドメインを正確に配向するのに適した、柔軟性または剛性を与えることができる。さらにリンカーは、ヒトなどの、投与の必要性のある被験体への投与後、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で完全長融合タンパク質の発現および精製タンパク質の安定性を補助することができ、これらの同じ被験体において非免疫原性であるかまたは免疫原性が低いことが好ましい。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質の二量体化ドメインのリンカーは、ヒト免疫グロブリンヒンジの一部または全部を含むことができる。
介在ドメイン（例えば、免疫グロブリン由来定常サブ領域）と結合ドメインを接合するため、または結合ドメインの２つの可変領域を接合するために使用することができる例示的なリンカーは、配列番号４９７〜６０４および８２３〜８２８で列挙する。
本開示で意図するリンカーには、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの任意のドメイン間領域（例えば、抗体ヒンジ領域）由来の、またはＩＩ型膜タンパク質のファミリーである、Ｃ型レクチンの茎部領域由来のペプチドが含まれる。これらのリンカーは、約２〜約１５０アミノ酸、または約２〜約４０アミノ酸、または約８〜約２０アミノ酸、好ましくは約１０〜約６０アミノ酸、より好ましくは約１０〜約３０アミノ酸、および最も好ましくは約１５〜約２５アミノ酸の長さ範囲である。例えば、リンカー１（配列番号４９７）は２アミノ酸長であり、リンカー１１６（配列番号６０３）は３６アミノ酸長である。
一般的な長さの考慮事項を超えて、本開示の融合タンパク質における使用に適したリンカーには、ＩｇＧヒンジ、ＩｇＡヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＩｇＥヒンジ、またはそれらの変異体から選択される抗体ヒンジ領域が含まれる。特定の実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、またはそれらの断片もしくは変異体から選択される抗体ヒンジ領域（上部およびコア領域）であってよい。本明細書で使用するように、「免疫グロブリンヒンジ領域」であるリンカーは、ＣＨ１のカルボキシ末端と（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤに関して）ＣＨ２のアミノ末端または（ＩｇＥおよびＩｇＭに関して）ＣＨ３のアミノ末端の間に見られるアミノ酸を指す。本明細書で使用する「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」は、抗体の重鎖に見られる、（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤに関して）ＣＨ１領域とＣＨ２領域の間に介入しそれらを結び付ける、または（ＩｇＥおよびＩｇＭに関して）ＣＨ２領域とＣＨ３領域の間に介入しそれらを結び付ける、天然に存在するアミノ酸配列を指す。好ましい実施形態では、野生型免疫グロブリンヒンジ領域配列はヒトである。
結晶学的研究によれば、ＩｇＧヒンジドメインは、機能上および構造上３つの領域：上部ヒンジ領域、コアまたは中央ヒンジ領域、および底部ヒンジ領域、に分割することができる（Ｓｈｉｎら、（１９９２年）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ １３０巻：８７頁）。例示的な上部ヒンジ領域には、ＩｇＧ１で見られるＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号８３０）、ＩｇＧ２で見られるＥＲＫＣＣＶＥ（配列番号８３１）、ＩｇＧ３で見られるＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号８３２）またはＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ（配列番号８３３）、およびＩｇＧ４で見られるＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号８３４）が含まれる。例示的な中央ヒンジ領域には、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２で見られるＣＰＰＣＰ（配列番号８３５）、ＩｇＧ３で見られるＣＰＲＣＰ（配列番号８３６）、およびＩｇＧ４で見られるＣＰＳＣＰ（配列番号８３７）が含まれる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４抗体はそれぞれ１つの上部および中央ヒンジを有するようであり、一方ＩｇＧ３は、４つ（１つのＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号８３８）および３つのＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ（配列番号８３９））をタンデムで有する。
ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体はＩｇＧ様コア領域を欠くようであり、ＩｇＤは２つの上部ヒンジ領域をタンデムで有するようである（配列番号８４０および８４１を参照されたい）。ＩｇＡ１およびＩｇＡ２抗体で見られる例示的な野生型上部ヒンジ領域は、配列番号８４２および８４３において述べる。
ＩｇＥおよびＩｇＭ抗体は、対照的に、典型的なヒンジ領域の代わりに、ヒンジ様の性質を有するＣＨ２領域を有する。ＩｇＥおよびＩｇＭの例示的な野生型ＣＨ２上部ヒンジ様配列は、それぞれ配列番号８４４
および配列番号８４５
において述べる。
「改変野生型免疫グロブリンヒンジ領域」または「改変型免疫グロブリンヒンジ領域」は、（ａ）最大３０％のアミノ酸が変化した（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失の）野生型免疫グロブリンヒンジ領域、（ｂ）最大３０％のアミノ酸が変化した（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失の）少なくとも１０アミノ酸長（例えば、少なくとも１２、１３、１４または１５アミノ酸長）である野生型免疫グロブリンヒンジ領域の一部分、または（ｃ）コアヒンジ領域を含む野生型免疫グロブリンヒンジ領域の一部分（その一部分は４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸長、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸長であってよい）を指す。特定の実施形態では、上部およびコア領域を含むＩｇＧ１ヒンジなどの、野生型免疫グロブリンヒンジ領域の１つまたは複数のシステイン残基を、１つまたは複数の他のアミノ酸残基（例えば、１つまたは複数のセリン残基）によって置換することができる。改変型免疫グロブリンヒンジ領域は、別のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）によって置換された、上部およびコア領域を含むＩｇＧ１ヒンジなどの野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基を、代替的または追加的に有することができる。
結合領域（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）として使用することができる代わりのヒンジ配列およびリンカー配列は、ＩｇＶ様またはＩｇＣ様ドメインを結合させる細胞表面受容体の一部分から作製することができる。細胞表面受容体が複数のＩｇＶ様ドメインをタンデムで含有するＩｇＶ様ドメイン間の領域、および細胞表面受容体が複数のタンデムＩｇＣ様領域を含有するＩｇＣ様ドメイン間の領域も、結合領域またはリンカーペプチドとして使用することができる可能性がある。特定の実施形態では、ヒンジ配列およびリンカー配列は５〜６０アミノ酸長であり、主として柔軟性である場合があるが、さらなる剛性特性を与える場合もあり、最小のβ−シート構造を有してα−らせん構造を主として含有し得る。配列は血漿および血清で安定であり、タンパク質分解的切断に耐性があることが好ましい。いくつかの実施形態では配列は、１つのジスルフィド結合または複数のジスルフィド結合を形成して分子のＣ末端を安定化する能力を与える、ＣＰＰＣなどの天然に存在するモチーフまたは加えられたモチーフを含有してもよい。他の実施形態では、配列は１つまたは複数のグリコシル化部位を含有し得る。ヒンジおよびリンカー配列の例には、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ６６、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９６、ＣＤ１５０、ＣＤ１６６、およびＣＤ２４４の、ＩｇＶ様とＩｇＣ様ドメインの間またはＩｇＣ様またはＩｇＶ様ドメインの間のドメイン間領域が含まれる。代わりのヒンジは、ＣＤ６９、ＣＤ７２およびＣＤ１６１などの非免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー由来の、ＩＩ型受容体のジスルフィド含有領域から作製することもできる。
いくつかの実施形態では、ヒンジリンカーは、鎖間ジスルフィド結合を形成するための単一のシステイン残基を有する。他の実施形態では、リンカーは、鎖間ジスルフィド結合を形成するための２つのシステイン残基を有する。さらなる実施形態では、ヒンジリンカーは、免疫グロブリンドメイン間領域（例えば、抗体ヒンジ領域）に由来するか、またはＩＩ型Ｃ型レクチンの茎部領域に由来する（ＩＩ型膜タンパク質由来、例えば、ＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ２００７／１４６９６８からの配列番号１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８７、２８９、２９７、３０５、３０７、３０９〜３１１、３１３〜３３１、３４６、３７３〜３７７、３８０、または３８１（それらの配列を参照によって本明細書に組み込む）などの、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００７／１４６９６８に記載する例示的なレクチンの茎部領域配列を参照されたい）。
一態様では、本開示の融合タンパク質は、ＳＭＩＰタンパク質の型である、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、またはＩＬ６ｘＲに特異的な結合ドメインを含む。ＳＭＩＰタンパク質を作製するための方法は本明細書に記載されており、当技術分野で公知である（米国特許出願公開第２００３／０１３３９３９号、同第２００３／０１１８５９２号、および同第２００５／０１３６０４９号を参照されたい）。特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれかよりも高い親和性でＩＬ６ｘＲに結合し、ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合に関してｇｐ１３０と競合し、またはｓＩＬ６ｘＲとのｇｐ１３０の結合を高めるＩＬ６ｘＲ複合体に特異的なポリペプチド結合ドメインを有し、ここでアミノ末端からカルボキシ末端に、（ａ）ポリペプチド結合ドメインが第１のリンカーと融合しており、（ｂ）免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域またはサブ領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合しており、そして（ｃ）免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域またはサブ領域ポリペプチドがＣＨ２定常領域またはサブ領域ポリペプチドと融合している。あるいは、ＳＭＩＰタンパク質構造は、Ｎが融合タンパク質のアミノ末端であり、ＢＤが抗ＩＬ６ｘＲ複合体結合ドメインまたはｓｃＦｖであり、Ｌ１がリンカーであり、ＣＨ２およびＣＨ３が免疫グロブリン定常重鎖領域２および３であり、Ｃが融合タンパク質のカルボキシ末端である、以下の：Ｎ−ＢＤ−Ｌ１−ＣＨ２ＣＨ３−Ｃとして例示することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、４６（配列番号５４２）などのｎが１〜６の整数である（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎであり、またはリンカーは、リンカー４７（配列番号５４３）、またはリンカー８０（配列番号５７６）などの、ＩｇＧ１，ＩｇＡまたはＩｇＥヒンジ領域、０、１、または２個のシステイン残基を有する突然変異ＩｇＧ１ヒンジ領域である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、リンカーによってまたはリンカー以外によって、免疫グロブリン定常領域またはサブ領域以外のドメインと融合し、したがって融合タンパク質は、組成物に単鎖ポリペプチドとして主にまたは実質的に存在する。
さらなる実施形態では、本開示のＳＭＩＰ融合タンパク質は、それぞれのＣＤＲが０〜３個のアミノ酸変化を有する、それぞれ配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４のいずれか１つに記載の少なくとも１つの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とそれぞれ少なくとも８０％〜１００％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含有する軽鎖可変領域を含み、それぞれのＣＤＲが０〜３個のアミノ酸変化を有する、それぞれ配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０のいずれか１つに記載の少なくとも１つの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とそれぞれ少なくとも８０％〜１００％同一であるＣＤＲ１，ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含有する重鎖可変領域を含む結合ドメインを有する。なおさらなる実施形態では、本開示のＳＭＩＰ融合タンパク質は、配列番号６７１〜６９４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有し、リーダーペプチド配列は有するか、または有さない。
さらに他の実施形態では、ＳＭＩＰポリペプチドは、ＩＬ６シスおよびトランスシグナル伝達が測定可能に阻害されるＩＬ６アンタゴニストである、結合領域またはドメインを有することができる。特定の実施形態では、本開示によるＩＬ６アンタゴニストは、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。
さらなる実施形態では、本開示の融合タンパク質は、結合ドメインが融合タンパク質のカルボキシ末端に位置するＰＩＭＳタンパク質の形態でＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインを含む。ＰＩＭＳタンパク質を作製するための構築物および方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／０２３３８６に記載される。一般にＰＩＭＳ分子は、アミノ末端からカルボキシ末端方向に、介在ドメイン（例えば、同じ（好ましい）または異なる動物種、免疫グロブリンアイソタイプおよび／または免疫グロブリンサブクラス由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むもの由来の免疫グロブリン定常サブ領域）、リンカーペプチド（例えば、免疫グロブリンヒンジ領域）、および特異的結合ドメインを含む単鎖ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＰＩＭＳ分子はアミノ末端に位置する免疫グロブリンヒンジ領域をさらに含有し、アミノ末端のヒンジ領域は、二量体化ドメインと結合ドメインの間に見られるリンカーと同じであるか、または異なってよい。いくつかの実施形態では、アミノ末端に位置するリンカーは、天然に存在するかまたは加えられたモチーフ（ＣＰＰＣなど）を含有し、少なくとも１つのジスルフィド結合の形成を促進して、多量体分子のアミノ末端を安定する。したがって、いくつかのＰＩＭＳ分子の例示的な構造編成は、Ｎ−二量体化ドメイン−リンカー−結合ドメイン−ＣまたはＮ−ヒンジリンカー−二量体化ドメイン−リンカー−結合ドメイン−Ｃを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は介在ドメインを有し、ここで融合タンパク質は組成物に単鎖ポリペプチドとして主にまたは実質的に存在し、または組成物に二量体として主にまたは実質的に見られる。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれかよりもＩＬ６ｘＲ複合体と高い親和性で結合し、ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合に関してｇｐ１３０と競合し、またはｓＩＬ６ｘＲ複合体とのｇｐ１３０の結合を高める、ＩＬ６アンタゴニストポリペプチド結合ドメインを有し、ここでカルボキシ末端からアミノ末端に、（ａ）ポリペプチド結合ドメインが第１のリンカーと融合しており、（ｂ）第１のリンカーが免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域またはサブ領域ポリペプチドと融合しており、そして（ｃ）ＣＨ３定常領域またはサブ領域ポリペプチドが免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域またはサブ領域ポリペプチドと融合しており、そして（ｄ）ＣＨ２定常領域またはサブ領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合している。さらなる実施形態では、本開示のＰＩＭＳ融合タンパク質は、それぞれのＣＤＲが０〜３個のアミノ酸変化を有する、それぞれ配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４のいずれか１つに記載の少なくとも１つの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とそれぞれ少なくとも８０％〜１００％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含有する軽鎖可変領域を含み、それぞれのＣＤＲが０〜３個のアミノ酸変化を有する、それぞれ配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０のいずれか１つに記載の少なくとも１つの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とそれぞれ少なくとも８０％〜１００％同一であるＣＤＲ１，ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含有する重鎖可変領域を含む結合ドメインを有する。
他の態様では、本開示の融合タンパク質は、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）タンパク質などの多機能性結合タンパク質の形態で、ＩＬ６またはＩＬ６ｘＲに特異的な結合ドメインを含む。ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）タンパク質を作製するための方法は本明細書に記載されており、当技術分野で公知である（ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００７／１４６９６８を参照されたい）。他の例示的な多機能性融合タンパク質に関しては、例えば、米国特許出願公開第２００６／００５１８４４号および米国特許第７，１６６，７０７号を参照。特定の実施形態では、単一特異性の多価融合タンパク質は、第１および第２の結合ドメイン、第１および第２のリンカー、ならびに二量体化ドメインを含み、二量体化ドメインは、本明細書に記載するように、ＩＬ６ｘＲに対してそれぞれ特異的である、免疫グロブリン可変領域結合ドメイン、またはその誘導体と、リンカーによってそれぞれの末端で融合している。あるいは、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）タンパク質の構造は、ＢＤ１が第１の結合ドメインであり、ＩＤが介在ドメインであり、そしてＢＤ２が第２の結合ドメインである、以下のＮ−ＢＤ１−ＩＤ−ＢＤ２−Ｃとして例示することができる。いくつかのこのような構築物では、ＩＤは第１と第２の結合ドメインの間に配置された免疫グロブリン定常領域またはサブ領域を含む。さらなる実施形態では、融合タンパク質は介在ドメインを有し、かつ融合タンパク質は組成物に単鎖ポリペプチドとして主にまたは実質的に存在する。いくつかの構築物では、ＩＤは二量体化ドメインである。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれかよりも高い親和性でＩＬ６ｘＲに結合し、ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合に関してｇｐ１３０と競合し、またはｓＩＬ６ｘＲ複合体とのｇｐ１３０の結合を高める、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な少なくとも２つのポリペプチド結合ドメインを有し、ここでアミノ末端からカルボキシ末端に、（ａ）第１のポリペプチド結合ドメインが第１のリンカーと融合しており、（ｂ）第１のリンカーが免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域またはサブ領域ポリペプチドと融合しており、（ｃ）ＣＨ２定常領域またはサブ領域ポリペプチドが免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域またはサブ領域ポリペプチドと融合しており、（ｄ）ＣＨ３定常領域またはサブ領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合しており、そして（ｅ）第２のリンカーが第２のポリペプチド結合ドメインと融合している。なおさらなる実施形態では、本開示のＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）融合タンパク質は、それぞれのＣＤＲが０〜３個のアミノ酸変化を有する、それぞれ配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４のいずれか１つに記載の少なくとも１つの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とそれぞれ少なくとも８０％〜１００％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含有する軽鎖可変領域を独立して含み、それぞれのＣＤＲが０〜３個のアミノ酸変化を有する、それぞれ配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０のいずれか１つに記載の少なくとも１つの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とそれぞれ少なくとも８０％〜１００％同一であるＣＤＲ１，ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含有する重鎖可変領域を含む少なくとも２つの結合ドメインを有する。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、リンカー４６（配列番号５４２）などの、ｎが１〜５の整数である（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーである。他の実施形態では、第１または第２のリンカーは、配列番号４９７〜６０４および８２３〜８２８で見られる任意のリンカーなどの、ＩｇＧ１，ＩｇＡまたはＩｇＥヒンジ領域、または０、１、または２個のシステイン残基を有する突然変異ＩｇＧ１ヒンジ領域である。
さらに別の態様では、本明細書に記載するＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインを有する例示的な多重特異性融合タンパク質は、ＩＬ６アンタゴニストではない少なくとも１つの追加の結合領域または結合ドメインを含有することができる。特定の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、第１および第２の結合ドメイン、第１および第２のリンカー、ならびに介在ドメインを含み、ここで介在ドメインの一末端はＩＬ６ｘＲに特異的な免疫グロブリン可変領域由来の第１の結合ドメインとリンカーによって融合しており、他の末端はインターロイキン受容体外部ドメイン、増殖因子受容体外部ドメイン（例えば、ＴＧＦＲ）、または腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体（ＴＮＦＳＦＲ）外部ドメインなどの、受容体のリガンド結合外部ドメインである第２の結合ドメインとリンカーによって融合している。いくつかの実施形態では、外部ドメインの全体未満を利用する。具体的には、リガンド結合をもたらす外部ドメイン内のドメインを利用する。例えば、ＴＮＦ−αアンタゴニストドメインが融合タンパク質のアミノ末端に存在し、ＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインが融合タンパク質のカルボキシ末端に存在し得、またはＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインがアミノ末端に存在し、ＴＮＦ−αアンタゴニストがカルボキシ末端に存在し得ることが意図される。本明細書に言及するように、本開示の結合ドメインは、介在ドメイン（例えば、免疫グロブリン定常領域またはそのサブ領域（ＩｇＧ１のＣＨ２ＣＨ３など））のそれぞれの末端と融合することができる。さらに、２つ以上の結合ドメインを、当技術分野で公知であるかまたは本明細書に記載する同じまたは異なるリンカーによって、介在ドメインにそれぞれ接合させることが可能である。
本明細書でＸｃｅｐｔｏｒ分子と呼ぶ、このような多重特異性融合タンパク質の例示的な構造には、ＢＤが免疫グロブリン様または免疫グロブリン可変領域結合ドメインであり、ＩＤが介在ドメインであり、ＥＤが、例えば受容体外部ドメイン、セマフォリンドメインなどの、リガンド結合ドメインである、Ｎ−ＢＤ−ＩＤ−ＥＤ−Ｃ、Ｎ−ＬＤ−ＩＤ−ＢＤ−Ｃ、Ｎ−ＥＤ１−ＩＤ−ＬＤ２−Ｃが含まれる。いくつかの構築物では、ＩＤは二量体化ドメインである。いくつかの構築物では、ＩＤは第１と第２の結合ドメインの間に配置された免疫グロブリン定常領域またはサブ領域を含むことができる。なおさらなる実施形態では、融合タンパク質は介在ドメインを有し、ここで融合タンパク質は組成物に単鎖ポリペプチドとして主にまたは実質的に存在する。
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、ＴＮＦＲＳＦ外部ドメインまたはＴＮＦＲＳＦ外部ドメインのサブドメイン、例えばシステインに富むドメイン（ＣＲＤ）１、ＣＲＤ２、ＣＲＤ３、５０のＴＮＦ結合ループ、９０のＴＮＦ結合ループ、またはこれらの任意の組合せを含むＴＮＦ−αアンタゴニストを有する。例えば、ＴＮＦ−αアンタゴニストは、配列番号６９６に記載のＴＮＦＲＳＦ１Ａ（この配列に含まれる天然リーダーペプチド配列有りまたは無し）の外部ドメイン、または配列番号６９５に記載のＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（この配列に含まれる天然リーダーペプチド配列有りまたは無し）の外部ドメインを含むことができる。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、（ａ）ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれかよりも高い親和性でＩＬ６ｘＲに結合し、ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合に関してｇｐ１３０と競合し、またはｓＩＬ６ｘＲ複合体とのｇｐ１３０の結合を高める、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的なポリペプチド結合ドメイン、および（ｂ）ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインを含むポリペプチド結合ドメインを有し、ここでアミノ末端からカルボキシ末端またはカルボキシ末端からアミノ末端で、（ａ）抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメインまたはＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインが第１のリンカーと融合しており、（ｂ）第１のリンカーが免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域またはサブ領域ポリペプチドと融合しており、（ｃ）ＣＨ２定常領域またはサブ領域ポリペプチドが免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域またはサブ領域ポリペプチドと融合しており、（ｄ）ＣＨ３定常領域またはサブ領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合しており、そして（ｅ）第２のリンカーが抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメインまたはＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインと融合している。特定の実施形態では、本開示の多重特異性Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、それぞれのＣＤＲが０〜３個のアミノ酸変化を有する、それぞれ配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４のいずれか１つに記載の少なくとも１つの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とそれぞれ少なくとも８０％〜１００％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含有する軽鎖可変領域を含み、それぞれのＣＤＲが０〜３個のアミノ酸変化を有する、それぞれ配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０のいずれか１つに記載の少なくとも１つの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とそれぞれ少なくとも８０％〜１００％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含有する重鎖可変領域を含む、ＩＬ６ｘＲ結合ドメインを有する。関連実施形態では、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインは、天然リーダーペプチド配列が含まれないという条件で、配列番号６９５に記載のアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態では、本開示のＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、配列番号６０７〜６６８のいずれか１つに記載の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有し、リーダーペプチド配列を有するかまたは有さず、それぞれのＣＤＲは０〜３個のアミノ酸変化を有する。
一般に、このような構築物は、本開示の多重特異性融合タンパク質のアミノ末端にＩ型受容体外部ドメインを有するかまたはカルボキシ末端にＩＩ型受容体外部ドメインを有する。Ｉ型受容体外部ドメインを有する構築物の一例は、アミノ末端にＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）外部ドメインを有し、そしてカルボキシ末端にＩＬ６ｘＲ複合体結合ドメインを有する構築物である。予想外に、カルボキシ末端にＴＮＦＲＳＦ外部ドメインを有するＩ型受容体外部ドメイン構築物も働いた（配列番号６６９および６７０を参照されたい）。
複数の結合ドメイン、例えば結合ドメイン１（ＢＤ１）および結合ドメイン２（ＢＤ２）を有する本開示のポリペプチドの場合、その１つは例えば抗ＩＬ６ｘＲであり、低いｋＯＦＦ値は阻害活性および、完全価数（ｆｕｌｌ ｖａｌｅｎｃｙ）で結合した本開示のポリペプチドまたは融合タンパク質の濃度を最大にし、したがって投薬の範囲は、ＢＤ１またはＢＤ２単独で相互作用する型のポリペプチドまたは融合タンパク質に広がる（Ｐｅｒｅｌｓｏｎ（１９８０年）Ｍａｔｈ． Ｂｉｏｓｃｉ． ４９巻：８７頁を参照されたい）。高いｋＯＦＦ値を有する結合ドメインを選択することも重要な場合がある。例えば、所望のシグナル伝達表現型を誘導するためには複合体中の短い滞留時間が好ましい受容体において、高いｋＯＦＦが所望される場合がある（Ｍａｔｓｕｉら、（１９９４年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１巻：１２８６２頁；Ｌｙｏｎｓら、（１９９６年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５巻：５３頁を参照されたい）。２つの結合ドメインを含む組成物、例えば本明細書に記載するＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）分子についてのＢＤ１およびＢＤ２に対して、ｋＯＦＦを独立に制御することができることは当業者に理解されよう。さらなる非制限的な例に関して、結合ドメインの１つが非常に低いｋＯＦＦを有し、もう１つの結合ドメインが比較的高いｋＯＦＦを有することが所望の場合がある。これによって、多重特異性結合ポリペプチドは、高いｋＯＦＦのＢＤに対応する標的分子連続的に関与しながら、低いｋＯＦＦのＢＤに対応する標的分子と細胞表面で結合して長い滞留時間を有することができる。これにより、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）タンパク質の濃度が低いとき、シグナル伝達を増強する効果を有することができる（Ｋａｌｅｒｇｉｓら、（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２巻：２２９頁を参照されたい）。結合ドメインを工学的に作製することによって、または所望の力学的特性を有する結合ドメインをスクリーニングすることによって、ｋＯＦＦを改変することができることは当業者によって理解されよう（Ｓｕら、（２００７年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２２巻：９４頁；Ｓｔｅｕｋｅｒｓら、（２００６年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１０巻：１２６頁；Ｊｅｒｍｕｔｕｓら、（２００１年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９８巻：７５頁を参照されたい）。
本明細書に記載する任意の結合ドメインポリペプチドまたは融合タンパク質を効率よく産生するために、リーダーペプチドを使用して発現されるポリペプチドおよび融合タンパク質の分泌を容易にする。任意の従来のリーダーペプチド（シグナル配列）の使用は、新たに（ｎａｓｃｅｎｔｌｙ）発現されたポリペプチドまたは融合タンパク質を分泌経路に誘導し、リーダーペプチドとポリペプチドまたは融合タンパク質の間の接合部またはその近辺での成熟ポリペプチドまたは融合タンパク質からのリーダーペプチドの切断をもたらすと予想される。特定のリーダーペプチドは、分子操作を容易にするためのリーダーペプチドのコード配列の開始点または終点における制限エンドヌクレアーゼ切断部位の容易な含有を可能にする、ポリヌクレオチドによってコードされる配列の使用など、当技術分野で公知である考慮事項に基づいて選択される。ただし、このような導入配列は、新たに発現されたタンパク質からのリーダーペプチドのいかなる所望のプロセシングにも許容されない形で干渉しない、またはリーダーペプチドがポリペプチドまたは融合タンパク質の成熟の間に切断されない場合、ポリペプチドまたは融合タンパク質分子のいかなる所望の機能にも許容されない形で干渉しない、アミノ酸を指定するものとする。本開示の例示的なリーダーペプチドには、天然リーダー配列、またはＸが任意のアミノ酸でありｎが０〜３であるＨ３Ｎ−ＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧ（Ｘ）ｎ−ＣＯ２Ｈ（配列番号７８５）またはＨ３Ｎ−ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ−ＣＯ２Ｈ（配列番号７８６）などの他の配列が含まれる。
特定の例示的実施形態では、このようなタンパク質はグリコシル化されており、グリコシル化のパターンは、（組換え宿主細胞で調製される場合）その中でタンパク質が発現される宿主細胞、および培養条件を含めた様々な要因に依存する。
本開示は、本開示の結合ドメインまたはこのような結合ドメインを含む融合タンパク質の誘導体も提供する。誘導体は、アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の修飾を有する特異的結合剤のポリペプチドを含む。好ましくは、修飾は現実には共有結合性であり、例えば、ポリマー、脂質、他の有機および無機成分との化学結合を含む。本開示の誘導体を調製して特異的結合剤のポリペプチドの循環半減期を増大することができ、またはこれらを設計して、所望の細胞、組織もしくは器官に対するポリペプチドの標的化能力を改善することができる。
特定の実施形態では、本開示の結合ドメインポリペプチドまたはその融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、巨大分子の半減期を増大するための当技術分野で公知である方法を使用して増大することができる。例えば、本開示は、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールなどの１つまたは複数の水溶性ポリマー結合を含むよう、共有結合により修飾されるかまたは誘導体化される、融合タンパク質を包含する（例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、同第４，１７９，３３７号を参照されたい）。当技術分野で公知であるさらに他の有用なポリマーには、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースおよび他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレート化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、およびこれらのポリマーの混合物が挙げられる。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体化タンパク質である。水溶性ポリマーは特定の位置、例えば本開示によるタンパク質およびポリペプチドのアミノ末端で結合することができ、またはポリペプチドの１つもしくは複数の側鎖とランダムに結合することができる。治療能力を改善するためのＰＥＧの使用は米国特許第６，１３３，４２６号に記載される。
このような方法は、結合ドメイン単独のそれよりも長い半減期を結合ドメイン融合タンパク質にもたらすタンパク質と結合ドメインとが融合している、融合タンパク質の作製も含む。このような融合タンパク質は、長い半減期を有するタンパク質（例えば、免疫グロブリン、免疫グロブリンＦｃドメイン、トランスフェリン、連鎖球菌Ｇタンパク質、またはアルブミン）とそれ自体が結合するタンパク質を含むことができる。結合ドメインと安定血漿タンパク質のこのような融合は、例えば、米国特許第５，４２８，１３０号、同第５，１１６，９６４号に開示される。
本開示の特定の実施形態は免疫グロブリンまたはＦｃ融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、特にＦｃドメインが、新生児Ｆｃ受容体であるＦｃＲｎと相互作用することができる場合、長い半減期、例えば数時間、１日以上、またはさらに１週間以上を有することができる。ＦｃドメインにおけるＦｃＲｎに対する結合部位は、細菌プロテインＡおよびプロテインＧが結合する部位でもある。これらのタンパク質間の強い結合は、例えば、タンパク質精製の間にプロテインＡまたはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーを利用することによって、本開示の抗体または融合タンパク質を精製するための手段として使用することができる。
タンパク質の精製技法は当業者には周知である。これらの技法は、１レベルでの、ポリペプチドおよび非ポリペプチド画分の粗製物分画を含む。部分的または完全精製（または均質までの精製）を達成するためにクロマトグラフィーおよび電気泳動技法を使用する、さらなる精製がしばしば所望される。純粋融合タンパク質の調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に有効な方法は、迅速タンパク質液体クロマトグラフィーおよびＨＰＬＣである。
本発明の特定の態様は、精製に関するもので、そして特定の実施形態では、本開示のポリペプチドの実質的精製に関する。本明細書で使用する用語「精製」は他の成分から単離可能な組成物を指すものとし、ここで融合タンパク質は、その自然に得ることができる状態に対して任意の程度まで精製する。したがって精製タンパク質は、それが本来存在する環境から単離したそのようなタンパク質も指す。
一般に「精製された」は、様々な他の成分を除去するための分画を施したポリペプチドの組成物を指し、その組成物はその発現される生物活性を実質的に保持する。用語「実質的に精製された」を使用する場合、この表示は、例えば、組成物において約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９重量％以上をタンパク質が構成するなどの、タンパク質が組成物の主成分を形成する、結合ドメインタンパク質組成物を指す。
精製度を定量化するための様々な方法は、本開示に照らすと当業者には公知である。これらは例えば、活性画分の特異的結合活性の決定、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析による画分中のタンパク質の量の評価を含む。タンパク質画分の純度を評価するのに好ましい方法は、画分の結合活性を計算し、それを初期抽出物の結合活性と比較し、したがって「精製倍数」によって評価する本明細書の精製度を計算することである。結合活性の量を表すために使用する実際の単位は、当然ながら、精製を追跡するために選択する個々のアッセイ技法、および発現されるタンパク質が検出可能な結合活性を示すかどうかに依存する。
タンパク質精製において使用するのに適した様々な技法は、当業者には周知である。これらは例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などを用いた沈殿、または熱変性、次に遠心分離；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイトおよび親和性クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；およびこれらの技法と他の技法の組合せを含む。当技術分野で一般に公知であるように、これらの様々な精製工程を実施する順序は変えることができる、または特定の工程を省略して、実質的に精製されたタンパク質の調製に適した方法をさらにもたらすことができる。
ポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
本開示は、本開示の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（単離または精製または純粋ポリヌクレオチド）、このようなポリヌクレオチドを含むベクター（クローニングベクターおよび発現ベクターを含む）、および本開示によるポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換またはトランスフェクトした細胞（例えば、宿主細胞）を提供する。
特定の実施形態では、本開示の結合ドメイン、または１つまたは複数のこのような結合ドメインを含有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意図する。ＳＭＩＰおよびＸｃｅｐｔｏｒ構築物をコードする発現カセットは、添付の実施例において与える。
本発明は、本開示のポリヌクレオチドを含むベクター、および特に、組換え発現構築物にも関する。一実施形態では、本開示は、本開示の結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、またはこのような結合ドメインを含むポリペプチド、例えばＳＭＩＰ、ＰＩＭＳ、ＳＣＯＲＰＩＯＮ、Ｘｃｅｐｔｏｒまたは他の単一、二重または多重機能性融合タンパク質、ならびにこのような結合ドメインコード配列の転写、翻訳およびプロセシングを引き起こすかまたは容易にする他のポリヌクレオチド配列を含むベクターを意図する。
原核生物および真核生物宿主と共に使用するのに適したクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、（１９８９年）に記載される。例示的なクローニング／発現ベクターには、クローニングベクター、シャトルベクターおよび、プラスミド、ファージミド、ファスミド、コスミド、ウイルス、人工染色体に基づいてよい発現構築物、またはその中に含有されるポリヌクレオチドの増幅、移動および／または発現に適していることが当技術分野で公知である任意の核酸媒体（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｖｅｈｉｃｌｅ）が含まれる。
本明細書で使用する「ベクター」は、連結した別の核酸を運ぶことができる核酸分子を意味する。例示的なベクターには、プラスミド、酵母人工染色体およびウイルスゲノムが含まれる。特定のベクターは宿主細胞で自己複製することができるが、一方他のベクターは宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼び、これらは発現制御配列と作動可能に連結し、したがってこれらの配列の発現を誘導することができる核酸配列を含有する。
特定の実施形態では、発現構築物はプラスミドベクターに由来する。例示的な構築物には、アンピシリン耐性遺伝子、ポリアデニル化シグナルおよびＴ７プロモーター部位をコードする核酸配列を有する修飾ｐＮＡＳＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ＣＨＥＦ１プロモーターを有するｐＤＥＦ３８およびｐＮＥＦ３８（ＣＭＣ ＩＣＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、およびＣＭＶプロモーターを有するｐＤ１８（Ｌｏｎｚａ）が含まれる。他の適切な哺乳動物発現ベクターが周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５年；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲を参照；例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪからのカタログも参照されたい）。適切な選択剤（例えば、メトトレキセート）の施用後の遺伝子増幅に起因する、融合タンパク質の高い産生レベルを促進するのに適した調節制御下で、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）コード配列を含む、有用な構築物を調製することができる。
一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択マーカー、および前記したような下流の構造配列の転写を誘導するための高発現遺伝子由来のプロモーターを含み得る。本開示によるポリヌクレオチドと作動可能に連結したベクターは、クローニング構築物または発現構築物をもたらす。例示的なクローニング／発現構築物は、少なくとも１つの発現制御エレメント、例えば本開示のポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーターを含有する。本開示によるベクターおよびクローニング／発現構築物における、エンハンサー、因子特異的結合部位、ターミネーターおよびリボソーム結合部位などの、追加の発現制御エレメントも意図される。本開示によるポリヌクレオチドの異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列とともに適切な段階で構築する。したがって、例えば、本明細書で提供する融合タンパク質コード核酸は、宿主細胞でこのようなタンパク質を発現させるための組換え発現構築物としての、様々な発現ベクター構築物のいずれか１つに含ませることができる。
適切なＤＮＡ配列（複数可）を、様々な手順によって例えばベクターに挿入することができる。一般に、当技術分野で公知である手順によって、適切な制限エンドヌクレアーゼ切断部位（複数可）にＤＮＡ配列を挿入する。クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製のための標準的技法、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含めた酵素反応のための標準的技法、および様々な分離技法が意図される。いくつかの標準的技法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９３年 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ． Ｉｎｃ．＆ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９年 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８２年 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ）；Ｇｌｏｖｅｒ（Ｅｄ．）（１９８５年 ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（Ｅｄｓ．）（１９８５年 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）；およびその他において記載される。
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、少なくとも１つの適切な発現制御配列（例えば、構成的プロモーターまたは制御的プロモーター（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ））と作動可能に連結して、ｍＲＮＡ合成を誘導する。このような発現制御配列の代表例には、前記したような真核生物細胞またはそれらのウイルスのプロモーターが含まれる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは他のベクターを選択マーカーとともに使用して、任意の所望の遺伝子から選択することができる。真核生物プロモーターには、ＣＭＶ即時初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は十分に当業者のレベルの範囲内であり、本開示によるタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸と作動可能に連結した少なくとも１つのプロモーターまたは制御的プロモーターを含む、特定の特に好ましい組換え発現構築物の調製は、本明細書に記載する。
本開示のポリヌクレオチドの変異体も意図する。変異体ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する定義された配列のポリヌクレオチドの１つと少なくとも９０％、および好ましくは９５％、９９％、または９９．９％同一であり、または約６５〜６８℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または約４２℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミドのストリンジェントハイブリダイゼーション条件下において、定義された配列のこれらのポリヌクレオチドの１つとハイブリダイズする。ポリヌクレオチド変異体は、結合ドメイン、またはその融合タンパク質をコードする能力を保持し、本明細書に記載する機能を有する。
用語「ストリンジェント」を使用して、ストリンジェントとして当技術分野で一般に理解されている条件を指す。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関するストリンジェント条件の例は、約６５〜６８℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または約４２℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミドである（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ． １９８９年参照されたい）。
よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高濃度のホルムアミドまたは他の変性剤など）も使用することはできるが、しかしながら、ハイブリダイゼーションの割合は影響を受ける可能性がある。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する場合、さらなる例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、３７℃（１４塩基オリゴヌクレオチド用）、４８℃（１７塩基オリゴヌクレオチド用）、５５℃（２０塩基オリゴヌクレオチド用）、および６０℃（２３塩基オリゴヌクレオチド用）における６×ＳＳＣ、０．０５％のピロリン酸ナトリウム中での洗浄を含む。
本開示のさらなる態様は、本開示のポリヌクレオチドまたはベクター／発現構築物のいずれかを用いて形質転換またはトランスフェクトした、または他方法でそれらを含有する宿主細胞を提供する。本開示のポリヌクレオチドまたはクローニング／発現構築物は、形質転換、トランスフェクション、および形質導入を含めた、当技術分野で公知である任意の方法を使用して適切な細胞に導入する。宿主細胞は、例えばｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療を含めたｅｘ ｖｉｖｏ細胞治療を受けた被験体の細胞を含む。本開示によるポリヌクレオチド、ベクター、またはタンパク質を有するとき本開示の一態様として意図する真核生物宿主細胞には、被験体自身の細胞（例えば、ヒト患者自身の細胞）に加えて、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（発現される多価結合分子のグリコシル化パターンを修飾することができる修飾型ＣＨＯ細胞を含む、米国特許出願公開Ｎｏ．２００３／０１１５６１４を参照されたい）、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７など）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｎ細胞、３Ｔ３細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、および本開示によるタンパク質またはペプチドの発現、そして場合によっては単離において有用であることが当技術分野で公知である任意の他の真核生物細胞が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ、または本開示によるタンパク質またはペプチドの発現、そして場合によっては単離に適していることが当技術分野で公知である任意の原核生物細胞を含めた、原核生物細胞も意図される。原核生物細胞からタンパク質またはペプチドを単離する際に、特に、封入体からタンパク質を抽出するための当技術分野で公知である技法を、使用することができることが意図される。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲内にある。本開示の融合タンパク質をグリコシル化する宿主細胞が意図される。
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターを含有する細胞を指す。このような用語は、特定の被験体細胞だけでなく、このような細胞の子孫を指すことを目的とすることは理解されるはずである。特定の修飾は突然変異または環境の影響のいずれかによって後の世代で起こる可能性があるので、このような子孫は、実際は、親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用する用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
組換え宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、または特定遺伝子の増幅に適するように改変した従来の栄養培地で培養することができる。例えば温度、ｐＨなどの、発現用に選択した特定宿主細胞のための培養条件は、当業者には容易に明らかであろう。様々な哺乳動物細胞培養系を利用して、組換えタンパク質を発現させることも可能である。哺乳動物発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１年）Ｃｅｌｌ ２３巻：１７５頁によって記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合ベクターを発現することができる他の細胞系、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、例えば、多価結合タンパク質発現構築物の調製に関して本明細書に記載するように、複製起点、適切なプロモーター、そして場合によってはエンハンサー、およびさらに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５’隣接非転写配列を含む。ＳＶ４０スプライス、およびポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を使用して、必要とされる非転写遺伝子エレメントを与えることができる。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーション（Ｄａｖｉｓら、（１９８６年）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）を含めた、当業者が精通している様々な方法によって実施することができる。
一実施形態では、本開示によるタンパク質またはポリペプチドの発現を誘導する組換えウイルス構築物を、宿主細胞に形質導入する。形質導入した宿主細胞は、ウイルス出芽の間にウイルス粒子によって取り込まれた宿主細胞膜の一部分由来の、発現タンパク質またはポリペプチドを含有するウイルス粒子を生成する。
組成物および使用法
ＩＬ−６トランスシグナル伝達と関係がある疾患状態に罹患したヒトまたは非ヒト哺乳動物を治療するために、本開示の結合ドメインは典型的には、前に論じたようにより大きな（ｌａｒｇｅｒ）タンパク質の一部分で構成され、そして次に、１回または複数回の投与過程後に疾患状態の症状を改善するのに有効である量で被験体に投与する。ポリペプチドであるので、本開示のタンパク質は、以下でより十分に論じるように、注射または注入による静脈内投与に使用することができる、他の薬学的に許容される賦形剤の安定剤を場合によっては含む、薬学的に許容される希釈剤に縣濁または溶解することができる。
薬学的に有効な用量は、疾患状態の発生を予防、阻害する、または疾患状態を治療する（症状をある程度、好ましくは症状全てを改善する）のに必要とされる用量である。薬学的に有効な用量は、治療薬、併用薬剤、および医学分野の当業者が認識している他の要因の考慮下での、疾患の型、使用する組成物、投与の経路、治療する被験体の型、特定被験体の身体特性に依存する。例えば、０．１ｍｇ／体重１ｋｇ〜１００ｍｇ／体重１ｋｇの量（一回用量として、１日に１回、１週間１回、１カ月に１回、または任意の適切な間隔で投与することができる）の活性成分を、本開示の結合ドメインポリペプチドまたは融合タンパク質の効力に応じて投与することができる。
特定の実施形態では、ＩＬ６のシスシグナル伝達は最低限阻害されるかまたは全く阻害されない、すなわち、シスシグナル伝達のいかなる阻害も実質的ではなく、阻害が存在しない、無症状、または検出可能ではないことを意味する。ＩＬ６トランスシグナル伝達の阻害の程度は変わり得るが、しかしながら一般にトランスシグナル伝達は、このようなシグナル伝達により媒介されるかまたはそれに関連する疾患状態の症状に対してプラスの効果を有する程度に変わる。特定の実施形態では、本開示の結合ドメインポリペプチドまたはその融合タンパク質によるＩＬ６のトランスシグナル伝達に対する阻害は、疾患の進行を遅延、停止、または逆行させることが可能である。
本開示の組成物を使用して、ＩＬ６シグナル伝達によって媒介されるヒトおよび非ヒト哺乳動物における疾患状態を治療することができる。ＩＬ−６の生成の増大、したがってＩＬ−６シグナル伝達の生成の増大は、アルツハイマー病、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、ＳＬＥ）、炎症、心筋梗塞、ページェット病、骨粗しょう症、固形腫瘍（例えば、結腸癌、ＲＣＣ、前立腺癌および膀胱癌）、特定の神経癌、Ｂ細胞悪性疾患（例えば、キャッスルマン病、いくつかのリンパ腫亜型、慢性リンパ性白血病、および特に、悪性メラノーマ）を含めた、様々な疾患のプロセスと関連している。いくつかの場合、ＩＬ−６は増殖経路と関連がある。それは、ヘパリン結合性上皮増殖因子および肝細胞増殖因子などの他の因子とともに作用するからである（例えば、Ｇｒａｎｔら、（２００２年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１巻：４６０頁；Ｂａｄａｃｈｅ ａｎｄ Ｈｙｎｅｓ（２００１年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１巻：３８３頁；Ｗａｎｇら、（２００２年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１巻：２５８４頁を参照されたい）。したがってＩＬ−６シグナル伝達の阻害は、多くの病状において有益であり得る。ＩＬ−６トランスシグナル伝達は、結腸癌、炎症性腸疾患、および関節リウマチを含めた、悪性疾患、および自己免疫状態または炎症状態に関与している。ＩＬ−６シスシグナル伝達は、前述に加え乳癌を含めた、悪性疾患と自己免疫状態の両方に関与している。一般に、トランスシグナル伝達は自己免疫状態または炎症状態とより関係がある可能性があり、かつシスシグナル伝達は悪性疾患状態とより関係があり得ると考えられている（例えば、Ｒａｂｅら、（２００８年）Ｂｌｏｏｄ １１１巻：１０２１頁）；Ｓａｎｓｏｎｅら、（２００７年）Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １１７巻：３９８８頁を参照されたい）。
したがって、本開示の結合ドメインを含む薬剤は、関節リウマチを含む自己免疫疾患、シェーグレン症候群、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、橋本病、およびキャッスルマン病、急性および慢性炎症、および骨粗しょう症および、骨量の消失と関係がある他の障害、ならびにホルモン非依存性前立腺癌、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞増殖障害、および腎臓、乳房、結腸、肺、脳、および他の組織の癌を含む癌を治療するのに有用である。
別の態様では、融合タンパク質の組成物を本開示によって提供する。本開示の医薬組成物は一般に、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と組み合わせて１つまたは複数の型の結合ドメインまたは融合タンパク質を含む。このような担体は、利用する用量および濃度でレシピエントに無毒である。治療用途の薬学的に許容される担体は薬剤分野では周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ （Ｅｄ．） １９８５年）に記載されている。例えば、生理的ｐＨで滅菌生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水を使用することができる。防腐剤、安定剤、色素などを医薬組成物において提供することができる。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、またはｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを防腐剤として加えることができる。上記文献１４４９頁。さらに、抗酸化剤および懸濁剤を使用することができる。上記文献。本発明の化合物は遊離塩基または塩の形態のいずれかで使用することができ、両方の形態が本発明の範囲内に存在すると考えられる。
医薬組成物は、バッファーなどの希釈剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、またはデキストリン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオンおよび他の安定剤および賦形剤も含有することができる。中性緩衝生理食塩水、または非特異的血清アルブミンと混合した食塩水は、例示的な適切な希釈剤である。生成物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を使用して、凍結乾燥品として製剤することが好ましい。
第２の薬剤と併せた、本開示の多重特異性融合タンパク質組成物の投与も意図される。第２の薬剤は、炎症、自己免疫、および癌などの特定の疾患状態用の標準的治療剤として、当技術分野で認められている薬剤であってよい。意図される例示的な第２の薬剤には、サイトカイン、増殖因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、化学療法剤、放射線療法剤、または他の活性薬剤および補助薬剤、またはこれらの任意の組合せが含まれる。
「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され、そして親化合物の所望の薬理活性を有する、本開示の結合ドメインポリペプチドまたは融合タンパク質の塩を指す。このような塩には、以下の（１）例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸で形成される酸付加塩、または例えば酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプタン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などの有機酸で形成される酸付加塩、または（２）親化合物に存在する酸性プロトンが金属イオン、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、またはアルミニウムイオンによって置換されるか、または例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミンなどの有機塩基と配位結合するかのいずれかのときに形成される塩が挙げられる。
特定の例示的実施形態では、本開示のポリペプチドまたは融合タンパク質を、例えばボーラス注射または注入によって静脈内投与する。静脈内に加えての投与の経路には、経口、局所、非経口（例えば、舌下または口腔）、舌下、直腸、膣、および鼻腔内が含まれる。本明細書で使用する用語非経口は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内、海綿内、鞘内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、道内（ｉｎｔｒａｍｅａｔａｌ）、尿道内注射または注入技法を含む。患者への組成物の投与によりその中に含有される活性成分に生物学的利用能を与えることができるように、医薬組成物を製剤化する。患者に投与される組成物は１つまたは複数の投薬単位（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ）の形態をとり、例えば錠剤は単一の投薬単位であってよく、かつエアロゾル形での本開示の１つまたは複数の化合物の容器は複数の投薬単位を保持することができる。
経口投与用に、スクロース、カオリン、グリセリン、スターチ デキストラン、シクロデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、およびエチルセルロースなどの、賦形剤および／または結合剤が存在してよい。甘味剤、防腐剤、色素／着色剤、香味増進剤、またはこれらの任意の組合せが、場合によっては存在してよい。コーティングシェルも場合によっては利用することができる。
注射により投与することを目的とする組成物において、１つまたは複数の界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、バッファー、安定剤、等張化剤、またはこれらの任意の組合せを、場合によっては含めることができる。
核酸ベースの製剤に関して、または本開示による発現産物を含む製剤に関して、約０．０１μｇ／体重１ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重１ｋｇを、例えば、皮内、皮下、筋肉内、または静脈内経路によって、または所与の環境の状況下に適した当技術分野で公知である任意の経路によって投与する。好ましい用量は、例えば約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、約５μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇが特に好ましい。投与の回数および頻度は宿主の応答に依存することは、当業者には明らかであろう。
本開示の医薬組成物は、例えば固体、液体、または気体（エアロゾル）の形態などの、患者への投与を可能にする任意の形態であってよい。組成物は液体の形態、例えばエリキシル剤、シロップ、溶液、乳濁液または懸濁液であってよい。２つの例として、液体は経口投与用、または注射による送達用であってよい。
本明細書で使用する液状医薬組成物は、溶液、懸濁液の形態、または他の同様の形態であれ、以下の構成成分：注射用水、食塩水溶液、好ましくは生理食塩水溶液、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液、溶媒または懸濁媒体として働くことができる合成モノまたはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン４酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのバッファー、およびナトリウム、塩化物、またはデキストロースなどの張性を調節するための薬剤の１つまたは複数を含むことができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックでできたアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入することができる。生理食塩水溶液は好ましい添加剤である。注射用医薬組成物は滅菌状態であることが好ましい。
調製物において、アルミニウム塩、油中水型エマルジョン、生分解性油性ビヒクル、水中油型エマルジョン、生分解性マイクロカプセル、およびリポソームを含めた送達ビヒクルなどの、他の構成成分を含めることも所望される場合がある。このようなビヒクルにおいて使用するためのアジュバントの例には、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、グルカン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、γ−インターフェロン、およびＩＬ−１５が含まれる。
当業者に公知である任意の適切な担体を本開示の医薬組成物において利用することができるが、担体の型は投与の形式、および徐放が所望されるかどうかに応じて変わる。非経口投与用に、担体は水、食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、バッファー、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。経口投与用に、前記の担体、または、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム、またはこれらの任意の組合せなどの固形担体のいずれかを利用することができる。
本開示は、本開示の医薬組成物を含む投薬単位を意図する。このような投薬単位には、例えば、２区画バイアルまたはシリンジを含めた単回用量または複数用量バイアルまたはシリンジ、凍結乾燥形態で本開示の医薬組成物および他の再構成用希釈剤を含むバイアルまたはシリンジが含まれる。複数用量投薬単位は、例えば静脈内注入デバイスと結び付けるためのバッグまたはチューブであってもよい。
本開示は、単位用量または複数用量容器、例えばバイアル中の本開示の医薬組成物、および上に記載した障害などの障害に罹患する患者に該組成物を投与するための説明書セットを含むキットも意図する。
本明細書で言及する、全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、特許以外の刊行物、表、配列、ウエブページなどは、参照によってそれらの全容を本明細書に組み込む。以下の実施例は、本発明を制限するものではなく、例示することを目的とする。
ＳＭＩＰおよびＸｃｅｐｔｏｒ配列
抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメインを有する例示的ＳＭＩＰおよびＸｃｅｐｔｏｒ（配列番号２３１〜２９２）分子のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号６７１〜６９４および６０７〜６６８で提供し、融合タンパク質の対応するヌクレオチド発現カセットを、それぞれ配列番号７６１〜７８４および６９７〜７５８で提供する（成熟タンパク質は、配列番号６７１〜６９４および６０７〜６６８に見出されるシグナルペプチド配列が欠落していることに留意されたい）。
アミノ末端にＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインを、カルボキシ末端に抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメインを有するＸｃｅｐｔｏｒは、本明細書においてＴＲＵ（ＸＴ６）−１００１からＴＲＵ（ＸＴ６）−１０６２と称される。逆配向、すなわちアミノ末端に抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメイン、カルボキシ末端にＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインを有するＸｃｅｐｔｏｒは、本明細書において、ＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１００８およびＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１０１９と称される。抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメインを有するＳＭＩＰ構築体は、本明細書において、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００４、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００７、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００８、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０１１、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０１３、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０１４、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０１８、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０１９、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０２２、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０２４〜ＴＲＵ（Ｓ６）−１０２６、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０２９、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０３８、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０４０、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０４７、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０５１、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０５２、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０５４、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０５６およびＴＲＵ（Ｓ６）−１０５９〜ＴＲＵ（Ｓ６）−１０６１と称される。
Ｆａｂ結合ドメインのファージライブラリーを、基本的にＨｏｅｔら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３巻：３４４頁に記載の通りに、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な結合ドメインについてスクリーニングした。結合ドメインは、ＰＣＲ増幅によってクローニングした、簡潔に述べると、ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、および重複によってＧ４Ｓリンカーを作製する適切なプライマー、および初期アニーリングを５６℃で９サイクル、次いで６２℃でさらに２０サイクルを使用して、Ｆａｂライブラリークローン由来のＶＬおよびＶＨ領域を増幅した。ＰＣＲ産物はアガロースゲルで分離し、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）ＰＣＲ精製カラムを使用して精製した。第二ラウンドのソーイング（ｓｅｗｉｎｇ）反応は、モル当量のＶＬおよびＶＨ産物とエクスパンドバッファーおよび水の混合、９５℃で５秒間の変性、次いで室温までゆっくりと冷却することを含んでいた。増幅のために、ｄＮＴＰの混合物を拡張酵素（Ｅｘｐａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ）とともに加え、７２℃で１０秒間インキュベートした。外側プライマーを加え（５’ＶＨおよび３’ＶＬ）、混合物は６２℃のアニーリングおよび４５分の伸長反応で３５回サイクルに施した。生成した７５０塩基対の産物はゲルで精製し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、プラスミドｐＤ２８にクローニングした（さらなる詳細に関しては、米国特許出願公開第２００５／０１３６０４９号およびＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００７／１４６９６８を参照されたい）。結合活性は、Ｈｏｅｔら（２００５年）に記載されたのと同様にＥＬＩＳＡによって調べた。
本明細書に記載する様々なＳＭＩＰおよびＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質を、以下に記載するように抗ＩＬ６ｘＲ活性、抗ＴＮＦ活性、または両方の活性に関して試験した。以下の実施例で使用した略語は、以下の用語を含む：ＰＢＳ−Ｔ：ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４および０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０；作業バッファー：１％のＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ；ブロッキングバッファー：３％のＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔおよび３％のＢＳＡ。
（実施例１）
融合タンパク質の発現
２９３細胞における、本明細書に開示の融合タンパク質の特定の発現を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、製造業者の指示書に従って実施した。
個々の３０ｍｌのトランスフェクションのために、２８ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ中３×１０７細胞を使用した。トランスフェクション当日、細胞懸濁液の少量のアリコートを微小遠心管に移し、集塊をなす細胞の生存率および量を、トリパンブルー色素排除法を使用して決定した。この懸濁液を、４５秒間激しくボルテックスにかけ細胞の集塊を壊し、細胞総数をＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒまたは血球計数器を使用して決定した。細胞の生存率は９０％を上回った。所要の細胞を含有する振とうフラスコを、３７℃のインキュベーター内のオービタルシェイカーに配置した。
個々のトランスフェクション試料について、脂質−ＤＮＡ複合体を以下のように調製した。３０μｇのプラスミドＤＮＡを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉで全量１ｍｌに希釈し、緩やかに混合した。６０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉで全容量１ｍｌに希釈し、緩やかに混合し、室温において５分間インキュベートした。５分間のインキュベート後、希釈したＤＮＡを希釈した２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）に加え、全容量２ｍｌを得、緩やかに混合した。得られた溶液を、室温において２０〜３０分間インキュベートし、ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）複合体を形成させた。
ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）複合体をインキュベートする一方で、細胞懸濁液をインキュベーターから取り出し、適量の細胞懸濁液を、滅菌、使い捨ての１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振とうフラスコに入れた。３０ｍｌのトランスフェクションのために、新鮮な、あらかじめ暖めておいたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍを、全容量２８ｍｌまで加えた。
ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）複合体のインキュベーション完了後、２ｍｌのＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）複合体を、振とうフラスコに加えた。２ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉを、ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）複合体の代わりに陰性対照のフラスコに加えた。個々のフラスコは、全容量３０ｍｌを含有し、最終細胞密度はおよそ１×１０６生存細胞／ｍｌであった。この細胞を、空気中８％ＣＯ２の加湿雰囲気の３７℃のインキュベーターにおいて、１２５ｒｐｍで回転するオービタルシェイカーでインキュベートした。トランスフェクションのおよそ７日後に細胞を収穫し、組換えタンパク質の発現に関してアッセイした。
ＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインを有する融合タンパク質は、上記のように２９３細胞において発現した。
（実施例２）
ＥＬＩＳＡによる、ＸＣＥＰＴＯＲのＩＬ６およびハイパーＩＬ６への結合
ハイパーＩＬ６（ＨＩＬ６またはＩＬ６ｘＲ）、組換えヒトＩＬ６（ｒｈＩＬ６）およびヒト可溶性ＩＬ６Ｒの結合活性を、実質的に以下のように、Ｘｃｅｐｔｏｒ ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２、１０１９、１０２５、１０４２、１０５８およびＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１０１９（それぞれ、配列番号６０８、６２５、６３１、６４８、６６４および６７０）に関して試験した。
ＨＩＬ６およびＩＬ６の結合
９６ウェルプレートの個々のウェルに、ＰＢＳ（ｐＨ７．２〜７．４）中２μｇ／ｍｌ溶液のヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃において一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡまたは１０％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において２時間（または４℃において一晩）インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、３００ｎｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで３倍段階希釈したＸｃｅｐｔｏｒ ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料およびヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに１００μｌ／ウェル加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中１５０ｐＭ溶液のヒトハイパーＩＬ６または組換えヒトＩＬ６から１００μｌ／ウェルを２連のウェルに加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中１５０ｎｇ／ｍｌ溶液の抗ヒトＩＬ６−ビオチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファーで１：４，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を１００μｌ／ウェル加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（３，３，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｎｔｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を約３から５分間加え、その後、５０μｌの停止バッファー（１Ｎ Ｈ２ＳＯ４）／ウェルを用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
ｓＩＬ６Ｒの結合
９６ウェルプレートの個々のウェルに、ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中２μｇ／ｍｌ溶液のヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ、ＣＡ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃において一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡまたは１０％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において２時間（または４℃において一晩）インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、それぞれ３００ｎｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで３倍段階希釈した、１００μｌ／ウェルのＸｃｅｐｔｏｒ ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料、陽性対照の抗ヒトＩＬ−６Ｒ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）および陰性対照のヒトＩｇＧまたはヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中７５ｐＭ溶液の組換えヒトｓＩＬ６Ｒ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを２連のウェルに加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中１００ｎｇ／ｍｌ溶液の抗ヒトＩＬ６Ｒ−ビオチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファーで１：４，０００に希釈した１００μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を約３から５分間加え、その後、５０μｌの停止バッファー（１Ｎ Ｈ２ＳＯ４）／ウェルを用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
図１Ａおよび１Ｂのデータは、全Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインが融合タンパク質分子のアミノ末端にあっても、またはカルボキシ末端にあっても、ＨＩＬ６と結合できることを実証している。さらに、これらのアッセイは、Ｘｃｅｐｔｏｒのうち２種だけがｒｈＩＬ６と結合し（図１Ｂ）、ｓＩＬ６Ｒと結合するものはなかった（図１Ｃ）ので、Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がＩＬ６ｘＲ複合体に対して特異性を有することを示している。関連する研究において、ｘｃｅｐｔｏｒ ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２およびＳＭＩＰ ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２は、非ヒト霊長類のＭｕｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ由来のＩＬ６と交差反応することが見出された。
（実施例３）
ＥＬＩＳＡによる、ＸＣＥＰＴＯＲのＴＮＦ−αへの結合
ＴＮＦ−αの結合活性を、実質的に以下のように、Ｘｃｅｐｔｏｒ ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２、１０４２、１０５８、１０１９およびＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１０１９（それぞれ、配列番号６０８、６４８、６６４、６２５および６７０）に関して試験した。
９６ウェルプレートの個々のウェルに、ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中２μｇ／ｍｌ溶液のヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ、ＣＡ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃において一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファーを各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において２時間（または４℃において一晩）インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、それぞれ３００ｎｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで３倍段階希釈した、Ｘｃｅｐｔｏｒ ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料、陽性対照のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ））および組換えヒトＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）ならびに陰性対照のヒトＩｇＧまたはヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）１００μｌ／ウェルを、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２ｎｇ／ｍｌ溶液の組換えヒトＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを２連のウェルに加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２００ｎｇ／ｍｌ溶液の抗ヒトＴＮＦ−α−ビオチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファーで１：１，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を約３から５分間加え、その後、５０μｌの停止バッファー（１Ｎ Ｈ２ＳＯ４）／ウェルを用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
図２のデータは、被検全Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインが融合タンパク質のアミノ末端にあっても、またはカルボキシ末端にあっても、ＴＮＦ−αと結合できることを示している。
（実施例４）
ＥＬＩＳＡによる、ＸＣＥＰＴＯＲのデュアルリガンドの結合
ＴＮＦ−αおよびＩＬ６ｘＲ複合体への同時結合を、実質的に以下のように、Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００６（配列番号６１２）に関して試験した。
９６ウェルプレートの個々のウェルに、１００μｌのヒトＨＩＬ−６溶液（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４）を加えた。このプレートにカバーをし、４℃において一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファーを各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において２時間（または４℃において一晩）インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、３００ｎｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで３倍段階希釈したＸｃｅｐｔｏｒ ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：ＨＩＬ６試料１００μｌ／ウェルをＨＩＬ−６コーティングプレートの２連のウェルに加えた。陰性対照は、ヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）および作業バッファーのみを含んだ。このプレートにカバーをして、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２００ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＴＮＦ−α−ビオチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファーで１：１，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を３から５分間加え、その後、５０μｌの停止バッファー（１Ｎ Ｈ２ＳＯ４）／ウェルを用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
図３のデータは、Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質が、２種のリガンド（この場合、ＴＮＦ−αおよびハイパーＩＬ６）に同時に結合できることを実証している。
（実施例５）
ＥＬＩＳＡによる、ハイパーＩＬ６のＧＰ１３０への結合のＸＣＥＰＴＯＲによるブロッキング
Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００４、１００６、１００７、１００８、１０１３および１０１９（それぞれ、配列番号６１０、６１２、６１３、６１４、６１９および６２５）による、ハイパーＩＬ６（ＩＬ６ｘＲ）の可溶性ｇｐ１３０受容体への結合のブロッキングを、実質的に以下のように試験した。
９６ウェルプレートの個々のウェルに、ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中０．２５〜０．５μｇ／ｍｌ溶液のヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃において一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡまたは１０％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において２時間（または４℃において一晩）インキュベートした。以下の試料より、５０μｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで５倍段階希釈物を作製した：Ｘｃｅｐｔｏｒ ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料、陽性対照のヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗ヒトＩＬ６Ｒ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）ならびに陰性対照の抗ヒトＩＬ６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＩｇＧまたはＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）。等容量の段階希釈Ｘｃｅｐｔｏｒ試料を、ハイパーＩＬ６（最終ハイパーＩＬ６濃度が２．５ｎｇ／ｍｌ）と混合し、室温において１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、Ｘｃｅｐｔｏｒ／ＨＩＬ６混合物、ヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ、抗ヒトＩＬ６Ｒ、抗ヒトＩＬ６、ヒトＩｇＧおよびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）の段階希釈物を１００μｌ／ウェルで、ヒトｇｐ１３０−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において約１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファーで１：１０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を約５から１５分間加え、その後、５０μｌの停止バッファー（１Ｎ Ｈ２ＳＯ４）／ウェルを用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
図４のデータは、抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメインを含有するＸｃｅｐｔｏｒタンパク質は、可溶性ｇｐ１３０がＨＩＬ６と結合することをブロックできることを実証している。
（実施例６）
ＩＬ６誘導性細胞増殖およびハイパーＩＬ６誘導性細胞増殖のＸＣＥＰＴＯＲによるブロッキング
ＩＬ６誘導性ＴＦ−１細胞増殖またはハイパーＩＬ６（ＩＬ６ｘＲ）誘導性ＴＦ−１細胞増殖のブロッキングを、実質的に以下のように、Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０１１、１０１４、１０２５、１０２６、１００２およびＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１０１９（それぞれ、配列番号６１７、６２０、６３１、６３２、６０８および６７０）に関して試験した。
９６ウェル平底プレートの個々のウェルに、新鮮な成長培地（１０％のＦＢＳ−ＲＰＭＩ １６４０；２ｍＭのＬ−グルタミン；１００単位／ｍｌのペニシリン；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ；１ｍＭのピルビン酸ナトリウム；および２ｎｇ／ｍｌのＨｕ ＧＭ−ＣＳＦ）中０．３×１０６のＴＦ−１細胞（ヒト赤白血病細胞）を、増殖アッセイに使用する１日前に加えた。その後、細胞を収穫し、アッセイ培地（ＧＭ−ＣＳＦを含まないことを除いて成長培地と同じで、サイトカイン非含有）を用いて２回洗浄し、次いでアッセイ培地に１×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。ＩＬ６活性のブロッキングに関して、目的のＴＮＦＳＦＲ１Ｂ：：抗−ＨＩＬ６ Ｘｃｅｐｔｏｒまたは抗体の段階希釈物を、固定濃度の組換えヒトＩＬ６（ｒｈＩＬ６）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）またはハイパーＩＬ６（ＨＩＬ６）と一緒に、９６ウェルプレート中で、３７℃、５％ＣＯ２において１時間プレインキュベートした。使用した対照は、ヒトＩｇＧ；ヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；抗ｈＩＬ６抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；および抗−ｈＩＬ６Ｒ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含んだ。プレインキュベーション期間後、１×１０４細胞（１００μｌ中）を各ウェルに加えた。ＴＮＦＳＦＲ１Ｂ：：ＨＩＬ６、ｒｈＩＬ６またはＨＩＬ６および細胞を含有する、全容量２００μｌ／ウェルの最終アッセイ混合物を、３７℃、５％ＣＯ２において、７２時間インキュベートした。培養の最後の４から６時間の間に、３Ｈ−チミジン（アッセイ培地中２０μＣｉ／ｍｌ、２５μｌ／ウェル）を加えた。細胞をＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６ＧＦ／ｃプレートに回収し、とり込まれた３Ｈ−チミジンを、ＴｏｐＣｏｕｎｔリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して決定した。データは、３連の平均のｃｐｍ±ＳＤとして表す。ブロッキングのパーセント＝１００−（試験ｃｐｍ−対照のｃｐｍ／最大ｃｐｍ−対照のｃｐｍ）×１００。
図５Ａおよび図５Ｂのデータは、全Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインが融合タンパク質分子のアミノ末端にあっても、またはカルボキシ末端にあっても、ＩＬ６およびハイパーＩＬ６により誘導される細胞増殖を、それぞれブロックできることを実証している。
（実施例７）
ＥＬＩＳＡによる、ＴＮＦ−αのＴＮＦＲへの結合のＸＣＥＰＴＯＲによるブロッキング
Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００４、１００６、１００７、１００８、１０１３および１０１９（それぞれ、配列番号６１０、６１２、６１３、６１４、６１９および６２５）による、ＴＮＦ−αのＴＮＦ受容体への結合のブロッキングを、実質的に以下のように試験した。
９６ウェルプレートの個々のウェルに、ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中０．２５〜０．５μｇ／ｍｌ溶液の組換えヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃において一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡまたは１０％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において２時間（または４℃において一晩）インキュベートした。以下の試料より、５０μＭ〜２５０μＭから出発して、作業バッファーで５倍段階希釈物を作製した：Ｘｃｅｐｔｏｒ ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料、陽性対照のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）および抗ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）ならびに陰性対照のヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびヒトＩｇＧ。等容量の段階希釈Ｘｃｅｐｔｏｒ試料を、ＴＮＦ−α（最終ＴＮＦ−α濃度が２．５ｎｇ／ｍｌ）と混合し、室温において１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、Ｘｃｅｐｔｏｒ／ＴＮＦ−α混合物、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦ−α、およびヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ、ヒトＩｇＧの段階希釈物を、組換えヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに１００μｌ／ウェル加え、プレートにカバーをし、室温において約１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２００ｎｇ／ｍｌ溶液の抗ヒトＴＮＦ−α−ビオチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温において１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファーで１：１，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を１００μｌ／ウェル加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を約３から５分間加え、その後、５０μｌの停止バッファー（１Ｎ Ｈ２ＳＯ４）／ウェルを用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
図６のデータは、Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質が、ＴＮＦ−αのＴＮＦ受容体への結合をブロックし、それはＴＮＦＲ−Ｆｃによるブロッキングとおよそ同等であったことを示す。
（実施例８）
ＴＮＦ−α誘導性細胞死滅のＸＣＥＰＴＯＲによるブロッキング
ＴＮＦ−α誘導性のＬ９２９細胞の死滅のブロッキングを、実質的に以下のように、Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０１１、１０１４、１０２５、１０２６、１００２およびＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１０１９（それぞれ、配列番号６１７、６２０、６３１、６３２、６０８および６７０）に関して試験した。
Ｌ９２９マウス線維芽細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）の懸濁液を、２×１０５細胞／ｍｌの密度で培養培地（１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）において調製し、次いで、１００μｌを、９６ウェル平底の黒色プレートの個々のウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２において一晩、加湿インキュベーター内でインキュベートした。アッセイ培地（２％ＦＢＳを添加したことを除いて、培養培地と同じ）で段階希釈したＸｃｅｐｔｏｒ ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料を、等容量の組換えヒトＴＮＦ−α（ｒｈＴＮＦ−α；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）と混合し、３７℃、５％ＣＯ２において１時間、加湿インキュベーター内でインキュベートした。陽性対照（すなわち、Ｌ９２９細胞のＴＮＦα誘導性死滅をブロックする試薬）は、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、ｒｈＴＮＦＲ２−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）および抗ＴＮＦ−α抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含んだ。陰性対照は、アッセイ培地単独（ＴＮＦ−αは加えず）および抗体ｈＩｇＧ（ＴＮＦ−α添加）を含んだ。ＴＮＦ−αの活性を分析するために、Ｌ９２９細胞から培養培地を取り除き、次いで個々のウェルに５０μｌのＴＮＦ−α／Ｘｃｅｐｔｏｒまたは対照混合物、および５０μｌのアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（４μｇ／ｍｌの新たに調製された作業溶液から）を加えた。その後、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２において２４時間、加湿インキュベーター内でインキュベートした。細胞生存率を測定するために、個々のウェルに、１００μｌのＡＴＰｌｉｔｅ １ Ｓｔｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を製造業者の指示書に従って加え、２分間振とうし、次いでＴｏｐＣｏｕｎｔリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して発光を測定する。
図７のデータは、全Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインが融合タンパク質分子のアミノ末端にあっても、またはカルボキシ末端にあっても、このアッセイにおいて、ＴＮＦ−α誘導性の細胞死滅をブロックできることを実証している。
（実施例９）
ＥＬＩＳＡによる、ＳＭＩＰのＩＬ６およびハイパーＩＬ６への結合
ハイパーＩＬ６（ＨＩＬ６またはＩＬ６ｘＲ）、組換えヒトＩＬ６（ｒｈＩＬ６）、およびヒト可溶性ＩＬ６Ｒの結合活性を、ＳＭＩＰ融合タンパク質ＴＲＵ（Ｓ６）−１００４、１００７、１００８、１０１３、１０１８、１０１９、１０２９および１０３８（それぞれ、配列番号６７２、６７３、６７４、６７６、６７８、６７９、６８４および６８５）に関して、Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質の代わりにＳＭＩＰタンパク質を検査したことを除いて、基本的に実施例１と同じアッセイを使用して試験した。
図８のデータは、全ＳＭＩＰタンパク質はＨＩＬ６に結合できることを実証している。
（実施例１０）
ハイパーＩＬ６に対する結合特異性および他のＧＰ１３０サイトカインに対する非結合性
ＩＬ６ならびにｇｐ１３０サイトカインのＩＬ−１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）およびカルディオトロピン−１（ＣＴ−１）によるＴＦ−１細胞増殖の誘導に関するＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質の作用を、実質的に以下のように試験した。
９６ウェル平底プレートの個々のウェルに、新鮮な成長培地（１０％のＦＢＳ−ＲＰＭＩ １６４０；２ｍＭのＬ−グルタミン；１００単位／ｍｌのペニシリン；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ；１ｍＭのピルビン酸ナトリウム；および２ｎｇ／ｍｌのＨｕ ＧＭ−ＣＳＦ）中０．３×１０６のＴＦ−１細胞（ヒト赤白血病細胞）を、増殖アッセイに使用する１日前に加えた。細胞を収穫し、アッセイ培地（ＧＭ−ＣＳＦを含まないことを除いて成長培地と同じで、サイトカイン非含有）を用いて２回洗浄し、次いでアッセイ培地に１×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。ＬＩＦ、ＯＳＭおよびＣＴ−１の活性のブロッキングを試験するために、ＴＮＦＳＦＲ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６ｘｃｅｐｔｏｒのＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２（配列番号６０８）、ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０１９（配列番号６２５）、ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０２２（配列番号６２８）およびＴＲＵ（ＸＴ６）−１０２５（配列番号６３１）の段階希釈物を、固定濃度の各ｇｐ１３０サイトカイン１つ１つと一緒に、またはハイパーＩＬ６（ＨＩＬ６）と一緒に、９６ウェルプレートにおいて、３７℃、５％ＣＯ２において１時間とプレインキュベートした。プレインキュベーション期間後、１×１０４細胞（１００μｌ中）を各ウェルに加えた。ＴＮＦＳＦＲ１Ｂ：：ＨＩＬ６、ｇｐ１３０サイトカインまたはＨＩＬ６および細胞を含有する、全容量２００μｌ／ウェルの最終アッセイ混合物を、３７℃、５％ＣＯ２において、７２時間インキュベートした。培養の最後の４から６時間の間に、３Ｈ−チミジン（アッセイ培地中２０μＣｉ／ｍｌ、２５μｌ／ウェル）を加えた。細胞をＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６ＧＦ／ｃプレートに回収し、とり込まれた３Ｈ−チミジンを、ＴｏｐＣｏｕｎｔリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して決定した。ブロッキングのパーセント＝１００−（試験ｃｐｍ−対照のｃｐｍ／最大ｃｐｍ−対照のｃｐｍ）×１００。
結果は、ｘｃｅｐｔｏｒがＩＬ６活性をブロックしたが、ＩＬ−１１、ＬＩＦ、ＯＳＭまたはＣＴ−１をブロックしなかったことを示し（データ非掲載）、したがって、ハイパーＩＬ６に結合したが、他の被検ｇｐ１３０サイトカインには結合しなかったことを示した。
（実施例１１）
ＥＬＩＳＡによる、ＳＭＩＰのハイパーＩＬ６への結合
ハイパーＩＬ６（ＨＩＬ６）結合活性を、ＴＲＵ（Ｓ６）−１０６３〜ＴＲＵ（Ｓ６）−１０６６と称されるヒト化ＳＭＩＰ融合タンパク質（それぞれ、配列番号８０１〜８０４で提供される軽鎖可変領域および配列番号８０７−８１０で提供される重鎖可変領域）に関して、実質的に以下のように試験した。
９６ウェルプレートの個々のウェルに、１００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中１μｇ／ｍｌのヒトハイパーＩＬ６（ＩＬ６Ｒ−ＩＬ６−ｍＩｇＧ）を加えた。このプレートにカバーをし、４℃において一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において２時間インキュベートした。
ＳＭＩＰ融合タンパク質および、陰性対照としてのＴＮＦＲ−Ｆｃの、３００ｎｇ／ｍｌから出発する３倍段階希釈物を、作業バッファー（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ）１００μｌで作製した。プレートにカバーをし、室温において１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、１：１，０００に希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒト−Ｆｃ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）１００μｌ／ウェルを各ウェルに加えた。プレートにカバーをして、室温で１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、１００μｌのＱｕａｎｔ−Ｂｌｕ（商標）基質（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を各ウェルに加えた。このプレートを室温において１０〜３０分間インキュベートし、蛍光を、３２５／４２０ｎｍにおいて測定した。
図９に示すデータは、全被検ＳＭＩＰ融合タンパク質がＨＩＬ６に結合できることを実証している。
（実施例１２）
様々なＩＬ６アンタゴニスト融合タンパク質の結合親和性
ハイパーＩＬ６（ＨＩＬ６；単量体または二量体）ならびにその成分であるＩＬ６およびｓＩＬ６Ｒと、ｓｃＦｖ、ＳＭＩＰ、Ｘｃｅｐｔｏｒおよび逆Ｘｃｅｐｔｏｒフォーマットの様々な抗ＨＩＬ６結合ドメインとの相互作用の結合親和性および動的速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して決定した。
抗ＨＩＬ６、ＳＭＩＰＳ、Ｘｃｅｐｔｏｒおよび逆Ｘｃｅｐｔｏｒを、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド使用して、アミンを介してカルボキシメチルデキストラン（ＣＭ４）表面に共有結合させたモノクローナルマウス抗ヒトＦｃにより捕捉した。活性化表面の非占有部位を、エタノールアミンによりブロックした。捕捉抗体（抗ｈＦｃと称される）は、全てのサブクラスに関するＩｇＧ ＦｃのＣＨ２ドメインに結合し、アッセイの過程において、捕捉されたＨＩＬ６バインダーからの認識できる解離は示さなかった。サイクルごとに、３種の異なるＨＩＬ６バインダーを、フローセル２、３および４バインダーに捕捉し、一方フローセル１は参照セルとして使用した。サイクルごとに、単一濃度の単一ＨＩＬ６関連分子を３５マイクロリットル／分で１５０秒間注入し、その後、３００秒間解離させた。サイクルの終わりに、抗ｈＦｃ捕捉抗体と結合したタンパク質を解離する３ＭのＭｇＣｌ２を使用して、表面を穏やか再生した。単量体または二量体のＨＩＬ６の結合を研究するために、０〜１００ｎＭの範囲の様々な濃度において、捕捉された３種のＨＩＬ６バインダーの個々のセットに関して複数サイクルを実施した。ＨＩＬ６バインダーは、サイクルごとにＣＶが２％を超えずに再現性よく捕捉された。実験は、２５℃において実施した。参照セルとの結合に伴うシグナルを、バルク屈折率の変化を差し引くために使用し、ブランク（バッファーのみ）の注入を、ドリフトおよび系のノイズを補正するために使用した。動的パラメーターおよび親和性を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して決定した。表面に固定したウサギポリクロナール抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体に捕捉された二量体ヒトＨＩＬ６／マウスＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を使用し、表面の上に様々な濃度のｓｃＦｖを注入して、逆配向（ｒｅｖｅｒｓｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）の抗ＨＩＬ６ ｓｃＦｖ分子を分析した。ＨＩＬ６成分のＩＬ６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４−８０６９）およびｓＩＬ６Ｒについては、単一の１００ｎＭの注入を実施し、結合の定量的評価を得た。ヒトｇｐ１３０−ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ） 融合タンパク質をさらに捕捉し、比較目的でＨＩＬ６バインダーとして照合した。表３はＳＭＩＰおよびｓｃＦｖフォーマット中の抗ＨＩＬ６バインダーに関して得られた結果を示す。
表４は、アミノ末端にＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメイン、カルボキシ末端に抗ＨＩＬ６ｘＲ結合ドメインを有するＸｃｅｐｔｏｒフォーマット（ＴＲＵ（ＸＴ６））、または逆配向のＸｃｅｐｔｏｒフォーマット（ＴＲＵ（Ｘ６Ｔ））におけるＨＩＬ６バインダーに関して得られた結果を示す。
これらのデータは、様々なフォーマットの抗ハイパーＩＬ６結合ドメインが、様々な範囲の親和性（約２ｎＭから約３０００ｎＭ）を有して単量体および二量体のハイパーＩＬ６に結合したことを示し、最も親和性の高いバインダーがハイパーＩＬ６に対するｇｐ１３０の親和性に近いことを示す。大部分の結合ドメインは、ハイパーＩＬ６に対して選択的であり、ＩＬ６またはｓＩＬ６Ｒには感知できるほどには結合しない。しかし、結合ドメインＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１０１９およびＴＲＵ（ＸＴ６）−１０２２は、ＩＬ６に固く結合でき（親和性は約０．４４ｎＭから約１２ｎＭ）、一方、結合ドメインＴＲＵ（ＸＴ６）−１０２５は受容体に結合する（定性的データのみ）。
（実施例１３）
ＩＬ６アンタゴニストの、ＩＬ６：ＳＩＬ６Ｒ複合体への結合
ヒトＩＬ６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４−８０６９）および可溶性ＩＬ６Ｒ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２２７−ＳＲ／ＣＦ）を、各々５０ｎＭでＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水において組み合わせた。本発明者らは、これらの条件下でおよそ３０ｎＭのＩＬ６：ｓＩＬ６Ｒ複合体が形成されると見積もる。この複合体を、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２（配列番号６７１）のＳＭＩＰ表面の上に注入した（ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２を、上記の実施例１２のように捕捉した）。ＩＬ６およびｓＩＬ６Ｒを、さらに５０ｎＭで単独で注入し、個別の結合を評価した。センサーグラムを図１０に示し、これは参照およびブランクを差し引いてある。
このデータは、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２が、ＩＬ６：ｓＩＬ６Ｒ複合体と強く結合し、さらに非常に高濃度において受容体に弱く結合するが、これらの条件下でＩＬ６とは、検出可能に結合しないことを実証する。
（実施例１４）
様々なフォーマットの様々なＩＬ６アンタゴニスト結合ドメイン
抗体中の抗ＩＬ６結合ドメイン、ＳＭＩＰ、ＸｃｅｐｔｏｒならびにＩＬ６およびハイパーＩＬ６ （ＨＩＬ６）に対するヒト化抗体フォーマットの結合を、下記のようにＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用して試験した。これらの研究に用いたマウスモノクローナル抗体は、ハイブリドーマＡＨ６４、ＡＨ６５、ＢＳＦ２−７７、ＣＬＢ−８、ＣＬＢ−１２、ＣＬＢ−１６、ＨＨ６１−０８およびＨＨ６１−１０から得、これらは全てＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインである。
抗ＩＬ６結合ドメインを、抗ＩＬ６抗体の場合は固定化抗マウスＦｃポリクロナール抗体、またはＳＭＩＰ、Ｘｃｅｐｔｏｒおよびヒト化ＳＭＩＰの場合は抗ヒトＦｃモノクローナル抗体を使用して捕捉した。ＩＬ６の抗ＩＬ６結合ドメインへの結合を、シングルサイクルカイネティクスを使用して研究した。最も低濃度のＩＬ６（６．４ｐＭ）から出発し、最も高濃度（４，０００ｐＭ）へと進行する、サイクル当たりＩＬ６の５回の連続注入を行った。流速は４５μＬ／分であり、ＩＬ６の各注入は７分間続いた。最も高濃度のＩＬ６の注入の終わりに、ＩＬ６を３０分間解離させた。このデータを、１対１結合のシングルサイクルカイネティクスモデルに適合させた。ＨＩＬ６の結合を、単一濃度のＨＩＬ６（６．４〜４，０００ｐＭ）／サイクルを７分間注入し、その後、結合したＨＩＬ６を、３０秒（０から８００ｐＭ）または１時間（０および４，０００ｐＭ）のどちらかで解離させることにより研究した。これらのデータを、１対１結合のモデルに適合させた。全ての分析は、ＢｌＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して実施した。動的速度定数および親和性を表５に提供する。
様々なフォーマットの抗ＩＬ６結合ドメインは、様々な親和性（約７ｐＭから約３，７３４ｐＭまで）で、全てがＩＬ６と結合した。結合ドメインの一部は、ハイパーＩＬ６ともまた結合可能であった。これらのうち、モノクローナル抗体ＡＨ６５およびＢＳＦ２−７７由来の結合ドメインを詳細に研究し、様々なフォーマットのこれらの結合ドメインのハイパーＩＬ６に対する親和性は、約１２ｐＭから約９７７ｐＭの範囲に及んだ。一般的に、ＳＭＩＰタンパク質および二重特異性ｘｃｅｐｔｏｒのフォーマットは、親モノクローナル抗体の結合親和性の１０倍以内の結合親和性を有する。
（実施例１５）
抗ＩＬ６結合ドメインの結合部位の決定
ＩＬ−６は、部位Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩと称される３つの保存エピトープを介してｇｐ１３０受容体と結合する。ｇｐ１３０を介したシグナル伝達が起こるために、六量体シグナル伝達複合体が形成されなければならない。ＩＬ−６は、部位Ｉと結合することによって、ＩＬ６Ｒａとの複合体を最初に形成する。部位ＩＩは、ＩＬ６とＩＬ６Ｒａとの二元複合体によって形成される複合エピトープであり、これはｇｐ１３０と反応する。最終的に、六量体シグナル伝達複合体が、部位ＩＩＩとｇｐ１３０との相互作用により形成される（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒら、（２００３年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００巻：２１０１頁）。抗ＩＬ６抗体のＡＨ６５およびＣＬ−１６は、部位ＩＩＩのバインダーとして作用し、一方抗ＩＬ６抗体のＣＬ−１２は部位ＩＩと相互作用することが示されている（Ｋａｌａｉら、（１９９７年）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４９巻：６９０頁）。本明細書に開示のＴＲＵ−１００２結合ドメインの結合部位を以下のように決定した。
９６ウェルプレートの個々のウェルに、ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中１μｇ／ｍｌの抗ヒトＴＮＦ−ＲＩＩ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）の１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃において一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において２時間インキュベートした。
ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー（ＷＢ；１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ）中０．５μｇ／ｍｌの濃度の１００μｌのＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２を１つのプレートの各ウェルに加えた。第２のプレートにおいて、１００μｌの０．５ｍｇ／ｍｌのＴＲＵ（ＸＴ６）−１０１９を各ウェルに加えた。このプレートを室温において２時間インキュベートした。
同時に、２つの新しいプレートを、２５０μｌのＳｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）を用いてブロックし、室温において１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、２０μｇ／ｍｌ（１００μｌ／ウェル）から出発し、作業バッファーで２倍段階希釈した以下の分子：ＭＱ２−１３Ａ５（ＬＭ−Ｅ１３）、ＡＨ６５（ＬＭ−Ａ０２）、ＣＬ−１６（ＬＭ−Ｓ０６）、ＣＬ−１２（ＬＭ−Ｓ０２）、ＣＬ−１４（ＬＭ−Ｓ０４）およびＳ６−Ａ２（ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２）を、双方のプレートに加えた。作業バッファーのみを、陰性対照として含んだ。その後、作業バッファー中２０ｎｇ／ｍｌの、等容量（１００μｌ）のヒトハイパーＩＬ６を各ウェルに加え、２００μＬを上下に３回ピペッティングすることによって混合した。プレートを、室温において１時間インキュベートした。
インキュベーション後、１つのプレートの個々のウェルの２００μｌの混合物を、ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２のプレートに移し、５回洗浄した。同様の操作をを、第２のプレートついて、ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０１９のプレート上に対して行った。これらのプレートを室温において１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、１００μｌのビオチン化抗−ＩＬ６Ｒ（１５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）を各ウェルに加え、プレートを室温において１時間インキュベートした。洗浄後、作業バッファーで１：２０，０００に希釈した１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）を各ウェルに加えた。これらのプレートを、室温において３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、１００μｌのＱｕａｎｔ−Ｂｌｕ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を各ウェルに加えた。このプレートを室温において１０〜３０分間インキュベートし、蛍光を３２５／４２０ｎｍにおいて測定した。
結果を図１１Ａおよび１１Ｂに示し、そして、その結果は、ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２が部位ＩＩＩに結合し、一方ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０１９は部位ＩＩに結合することを示している。
（実施例１６）
ＳＭＩＰおよびＸＣＥＰＴＯＲの、肝細胞のＩＬ６Ｒへの結合
ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２、ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０１９および抗ＩＬ６抗体ｈｕ−ＰＭ１の、肝臓由来ＨｅｐＧ２細胞のＩＬ６Ｒに結合する能力を以下のように試験した。
ＨｅｐＧ２細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋３％ＦＢＳ）で２×１０６細胞／ｍＬに調整した。９６ウェルプレートのウェルに、５０μＬのこの溶液を加えた（１０５細胞／ウェル）。プレートを、希釈した被検分子を加える用意ができるまで３７℃に保った。被検分子の段階希釈物をＦＡＣＳバッファーで調製し、細胞に加えるときに１×に希釈される、２×作業ストックを得た。希釈した被検分子を細胞に加え（５０μＬ／ウェル）、細胞を氷上で２０分間インキュベートした。ＩｇＧ全体（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）を対照として使用した。その後、細胞を、ＦＡＣＳバッファーを用いて２回洗浄し、フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ；ＦＡＣＳバッファーで１：２００希釈）に再懸濁した。暗所において氷上で２０分間インキュベート後、細胞を、ＦＡＣＳバッファーを用いて２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、ＬＳＲＩＩ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）において読み取った。
図１２に示すように、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２およびＴＲＵ（ＸＴ６）−１０２９は、基本的にＨｅｐＧ２（肝臓）細胞とは結合しないことを示した。
（実施例１７）
マウスにおけるＩＬ６活性およびＴＮＦの活性の、ＳＭＩＰおよびＸＣＥＰＴＯＲによるブロッキング
本明細書に開示のＳＭＩＰおよびＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質が、マウスにおける血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質のＩＬ−６誘導性産生またはＴＮＦ誘導性産生をブロックする能力について、下記のように試験した。ＳＡＡは、ヒトおよびマウスにおける主要な急性期タンパク質の１つである。血漿ＳＡＡレベルの長期的上昇が慢性炎症において見られ、肝臓、腎臓および脾臓に影響を与えるアミロイドーシスをもたらす（Ｒｉｅｎｈｏｆｆら、（１９９０年）Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ７巻：２８７頁）。ＩＬ６およびＴＮＦは双方とも、単独で投与された場合ＳＡＡの誘導を示した（Ｂｅｎｉｇｎｉら（１９９６年）Ｂｌｏｏｄ ８７巻：１８５１頁；Ｒａｍａｄｏｒｉら（１９８８年）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８巻：１２５９頁）。
（ａ）ハイパーＩＬ６活性のブロッキング
雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスに、０．２ｍｌのＰＢＳまたはＰＢＳ中のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（２００μｇ）、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２（２００μｇ）もしくはＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２（３００μｇまたは５００μｇ）を、後眼窩に注入した。１時間後、このマウスに、０．２ｍｌのＰＢＳまたはＰＢＳ中２μｇのヒトハイパーＩＬ６をＩＰ注入した。マウス血清を、ＩＰ注入の２時間後および２４時間後に採取した。ＳＡＡの血清濃度をＥＬＩＳＡにより決定し、ｓｇｐ１３０の濃度をＬｕｍｉｎｅｘに基づくマウス可溶性受容体アッセイにより決定した。
図１３および１４に示すように、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２およびＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２は、ｓｇｐ１３０およびＳＡＡ双方のハイパーｌＬ６誘導性発現をブロックした。
（ｂ）ＴＮＦ活性のブロッキング
雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスに、０．２ｍｌのＰＢＳまたはＰＢＳ中のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（２００μｇ）、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２（２００μｇ）もしくはＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２（３００μｇ）を、後眼窩に注入した。１時間後、このマウスに、０．２ｍｌのＰＢＳまたはＰＢＳ中０．５μｇのマウスＴＮＦ−αをＩＰ注入した。マウス血清を、ＩＰ注入の２時間後および２４時間後に採取した。ＳＡＡの血清濃度をＥＬＩＳＡにより決定し、ｓｇｐ１３０の濃度をＬｕｍｉｎｅｘに基づくマウス可溶性受容体アッセイにより決定した。
図１５ＡおよびＢに示すように、ｘｃｅｐｔｏｒのＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２は、ＳＡＡのＴＮＦ−α誘導性発現をブロックし、注入２時間後に観察されたＳＡＡのレベルは、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）で観察されるレベルと同様であった。
（実施例１８）
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＸＣＥＰＴＯＲの活性
本明細書に記載の融合タンパク質の治療効力を、下記に示す疾患の動物モデルにおいて試験した。
（ａ）多発性骨髄腫
融合タンパク質の活性を、２種の十分特徴付けられた多発性骨髄腫のマウスモデル、すなわち、５Ｔ２多発性骨髄腫（５Ｔ２ＭＭ）モデルおよび５Ｔ３３多発性骨髄腫（５Ｔ３３ＭＭ）モデルの少なくとも１種において試験する。５Ｔ３３モデルにおいて、マウスを、腫瘍細胞の注入のときから融合タンパク質により処置する（予防モード）。５Ｔ２ＭＭモデルにおいて、マウスを、疾患の発症から処置する（治療モード）。腫瘍の発達および新脈管形成に対する治療効果を、双方のモデルにおいて評価し、５Ｔ２ＭＭモデルにおいて、骨に関する研究もまたさらに実施する。
骨髄腫の５ＴＭＭネズミモデルがＲａｄｌらにより始めに開発された（Ｊ． ｌｍｍｕｎｏｌ．（１９７９年）１２２巻：６０９頁；さらにＲａｄｌら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．（１９８８年）１３２巻：５９３頁；Ｒａｄｌ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ（１９９０年）１１巻：２３４頁も参照されたい）。その臨床的特徴は、ヒトの疾患に非常に似ており、腫瘍細胞は骨髄に存在し、血清パラプロテイン濃度が疾患発達の尺度であり、新生血管形成は５Ｔ２ＭＭおよび５Ｔ３３ＭＭモデルの双方において増加し（Ｖａｎ Ｖａｌｃｋｅｎｂｏｒｇｈら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ（２００２年）８６巻：７９６頁）、特定の系において明らかな溶骨性骨疾患が発症する。５Ｔ２ＭＭモデルは、中程度の腫瘍成長および溶骨性骨病変の発達を含む。この病変は、網状骨容積の減少、骨ミネラル密度の減少、および破骨細胞数の増加を伴う（Ｃｒｏｕｃｈｅｒら、Ｂｌｏｏｄ（２００１年）９８巻：３５３４頁）。５Ｔ３３ＭＭモデルは、腫瘍の取り込みがより迅速であり、骨髄に加えて、腫瘍細胞はさらに肝臓においても成長する（Ｖａｎｄｅｒｋｅｒｋｅｎら、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ（１９９７年）７６巻：４５１頁）。
５Ｔ２および５Ｔ３３ＭＭモデルは、広範囲にわたって特徴付けられている。特定のモノクローナル抗体は、５Ｔ２および５Ｔ３３ＭＭの双方のイディオタイプに対して産生されており（ｒａｉｓｅｄ）、高い感度で、ＥＬＩＳＡによる血清パラプロテインの検出を可能にし、ならびにＦＡＣＳ分析および組織切片の免疫染色の双方による腫瘍細胞の特異的染色を可能にする（Ｖａｎｄｅｒｋｅｒｋｅｎら、１９９７年）。ＶＨ遺伝子の配列分析は、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロット分析による細胞の検出を可能にする（Ｚｈｕら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８年）９３巻：１６２頁）。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験の双方に使用できる５ＴＭＭモデルは、典型的なＭＭ疾患を生じ、様々な方法が、骨髄における腫瘍量、血清パラプロテイン濃度、（微小血管密度を測定することによる）骨髄新脈管形成および（Ｘ線撮影、密度測定および組織形態測定の組合せによる）溶骨性骨病変の評価に利用できる。これらの後者のパラメーターの調査は、前臨床設定ならびに完全な同系微小環境において骨髄腫細胞の成長および生物学的研究における５ＴＭＭモデルの使用を可能にする。ＭＭ細胞それ自体を標的にする分子および骨髄の微小環境を標的とする分子の双方が研究できる。具体的には、５Ｔ３３ＭＭモデルが微小環境およびＭＭ細胞それ自体の双方の研究に使用できるのに対して、一方、５Ｔ２ＭＭモデルは、骨疾患を伴う骨髄腫の研究にも使用できる。
本明細書に開示の融合タンパク質の予防効力を研究するために、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊマウスに、２×１０６の５Ｔ３３ＭＭ細胞および融合タンパク質を０日目に注入する。２８日目にマウスを犠牲にし、腫瘍の発達を、血清パラプロテイン濃度および（抗イディオタイプ抗体を用いたフローサイトメトリーによって、または細胞標本によって決定される）単離骨髄細胞における腫瘍細胞のパーセントを決定することによって評価する。脾臓および肝臓の重量を決定し、さらなる分析のためにこれらの器官を４％ホルムアルデヒドで固定する。骨試料は、パラフィン切片のＣＤ３１免疫染色および微小血管密度の定量を含むさらなる処理のために固定する。
本明細書に開示の融合タンパク質の治療効力を研究するために、マウスに、５Ｔ２ＭＭ細胞を０日目に注入し、融合タンパク質を、検出可能なレベルの血清パラプロテインの存在によって決定されるような疾患の発症後に投与する。融合タンパク質の投与のおよそ５週間後にマウスを犠牲にし、腫瘍の発達を、予防的研究に関する上記のように評価する。さらに、骨分析を、骨の病変の数および海綿質面積を決定するためにＸ線を使用して、ならびに破骨細胞の数を評価するためにＴＲＡＰ染色を使用して、実施する。
（ｂ）関節リウマチ
本明細書に開示の融合タンパク質の治療効力を、関節リウマチ（ＲＡ）の２種のネズミモデル、すなわちコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）およびグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｇ６ＰＩ）モデルの少なくとも１種において試験する。これらのモデルの各々は、ＲＡにおける治療薬の特定のクラスの効力の予測にとって有用であることが他者によって示されている（Ｈｏｌｍｄａｈｌ（２０００年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ． ２巻：１６９頁；Ｈｏｌｍｄａｈｌ（２００６年）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １０３巻：８６頁；Ｈｏｌｍｄａｈｌ（２００７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． １３６巻：１８５頁；ＭｃＤｅｖｉｔｔ， Ｈ．（２０００年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ． ２巻：８５頁；ＫａｍｒａｄｔおよびＳｃｈｕｂｅｒｔ（２００５年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ． Ｔｈｅｒ． ７巻：２０頁を参照されたい）。
（ｉ）ＣＩＡモデル
ＣＩＡモデルは、関節炎の発症機序および免疫学的根拠に関する、関節炎の最もよく特徴付けられたマウスモデルである。さらに、ＣＩＡモデルは、最も広範囲に使用されるＲＡのモデルであり、患者において疾患を阻害する薬剤の能力を予測するためには完全ではないが、ＲＡの潜在的な新規の治療薬を調査する場合、多数の人に選択されるモデルであると考えられる（Ｊｉｒｈｏｌｔら、（２００１年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ． ３巻：８７頁；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ（２００２年）Ｃｕｒｒ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． Ｒｅｐ． ４巻：２３２頁；Ｒｏｓｌｏｎｉｅｃ（２００３年）Ｃｏｌｌａｇｅｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ。Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ）。
ＣＩＡモデルにおいて、関節炎は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中コラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）を用いた雄ＤＢＡ／１マウスの免疫によって誘導される。具体的には、マウスに、２１日前にＣＦＡ中のＣＩＩを皮内／皮下注入し、０日目に不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中のＣＩＩを追加免疫する。マウスは、ＣＩＩ／ＩＦＡの追加免疫の数日以内に関節炎の臨床的徴候を現わす。ＣＩＩ／ＣＦＡにより免疫されたマウスのサブセット（０％から１０％）は、追加免疫をしなくても０日目の当日またはその周辺において関節炎の徴候を現わし、実験からは除外される。一部のＣＩＡ実験において追加免疫を省き、その代わりにマウスを、ＣＩＩ／ＣＦＡによる免疫後２１日から開始する、Ｘｃｅｐｔｏｒまたは対照での処置を行なう（すなわち、最初の処置の日が０日目である）。
予防計画および／または治療計画において、マウスを、融合タンパク質、ビヒクル（ＰＢＳ）または陰性対照もしくは陽性対照を用いて処置する。予防処置は０日目に開始し、対照（未処置）マウスにおける疾患のピークを通して続ける。治療処置は、大部分のマウスが関節炎の軽度の徴候を示したときに開始する。関節炎のＣＩＡモデルおよびＧ６ＰＩ誘発性モデルの双方において優れた効力を有することが示されたＥｎｂｒｅｌ（登録商標）を、陽性対照として使用する。実験毎に収集したデータは、関節炎の臨床的スコアおよび累積発現率を含む。ＣＩＡモデルにおける関節炎の臨床的徴候を、以下の表６に示すような０から４のスケールを使用して採点する。
（ｉｉ）Ｇ６ＰＩモデル
Ｇ６ＰＩモデルにおいて、関節炎は、アジュバント中のＧ６ＰＩを用いたＤＢＡ／１マウスの免疫により誘発される（ＫａｍｒａｄｔおよびＳｃｈｕｂｅｒｔ（２００５年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ． Ｔｈｅｒ． ７巻：２０頁；Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、（２００４年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７２巻：４５０３頁；Ｂｏｃｋｅｒｍａｎｎら、（２００５年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ． Ｔｈｅｒ． ７巻：Ｒ１３１６頁；Ｉｗａｎａｍｉら、（２００８年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ５８巻：７５４頁；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、（２００８年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ． Ｔｈｅｒ． １０巻：Ｒ６６頁）。Ｇ６ＰＩは、実質的に体内の全ての細胞に存在する酵素であり、免疫により関節特異的疾患が誘発される理由は公知ではない。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））および抗ＩＬ６受容体モノクローナル抗体などのいくつかの薬剤が、Ｇ６ＰＩモデルにおいて関節炎の発達を阻害することが示されている。
雄ＤＢＡ／１マウスを、関節炎を誘発するために、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中Ｇ６ＰＩを用いて免疫する。具体的には、マウスに、ＣＦＡ中Ｇ６ＰＩを０日目に皮内／皮下注入し、免疫の数日以内に関節炎の臨床的徴候が現れる。上述のＣＩＡモデルでのように、マウスを、予防計画および／または治療計画において、融合タンパク質、ビヒクル（ＰＢＳ）または陰性対照もしくは陽性対照を用いて処置する。予防処置は０日目に開始し、対照マウスにおける疾患のピークを通して続ける。治療処置は、大部分のマウスが関節炎の軽度の徴候を示したときに開始する。関節炎のＣＩＡモデルおよびＧ６ＰＩ誘導性モデルの双方において優れた効力を有することを示したＥｎｂｒｅｌ（登録商標）を、陽性対照として使用する。実験毎に収集したデータは、関節炎の臨床的スコアおよび累積発現率を含む。Ｇ６ＰＩモデルにおける関節炎の臨床的徴候を、ＣＩＡモデルに対して用いたスケールと同様のスケールを使用して採点する。
（ｃ）多発性嚢胞腎
本明細書に開示した融合タンパク質の多発性嚢胞腎の治療における効力を、Ｇａｔｔｏｎｅら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．（２００３年）９巻：１３２３頁；Ｔｏｒｒｅｓら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．（２００４年）１０巻：３６３頁； Ｗａｎｇら、Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ．（２００５年）１６巻：８４６頁；およびＷｉｌｓｏｎ（２００８年）Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ８４巻：３１１頁に記載されたような、ネズミモデルにおいて試験する。
本発明は、上に概説した特定の実施形態と併せて記載しているが、多くの改変、変更および変形が当業者に明らかであろうことは明白である。したがって、上に説明したような本開示の実施形態は例示目的であって、限定するものではない。様々な改変が、以下の特許請求の範囲に規定したような本開示の精神および範囲から逸脱することなく実施可能である。本明細書において参照した全ての出版物は、全体を説明したかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
配列番号１〜８３４は、添付の配列リストに提示する。添付の配列リストに使用した、シンボル「ｎ、」を含むヌクレオチド配列のコードは、ＷＩＰＯ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＳＴ．２５（１９９８）、付録２、表１に一致する。
いくつかのＩＬ６およびＩＬ６Ｒαの抗体アンタゴニストが公知である。例えば、ＩＬ６については、Ｗａｙら（特許文献１）が、ＩＬ６またはｓＩＬ６ｘＲ複合体のｇｐ１３０への結合を立体的に遮断する、ＩＬ６に対する抗体を開示している（また、特許文献２も参照されたい）。例えば、ＩＬ６Ｒαについては、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ（特許文献３）が、ＩＬ６の活性を阻害する、ＩＬ６Ｒαに対する抗体を開示している。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ（ＩＬ６ｘＲ）複合体に特異的な結合ドメインを含む単離ポリペプチドであって、
（ａ）ＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒα単独のいずれかよりも高い親和性で前記ＩＬ６ｘＲ複合体に結合するか、またはＩＬ６単独よりも高い親和性で前記ＩＬ６ｘＲ複合体単独および前記ＩＬ６Ｒα単独に結合し、そして
（ｂ）前記ＩＬ６ｘＲ複合体への可溶性ｇｐ１３０の結合を増大させるか、またはｓＩＬ６ｘＲ複合体への結合について膜ｇｐ１３０と競合し、ここで、
前記結合ドメインが、ＩＬ６のシス−シグナル伝達よりも、ＩＬ６のトランス−シグナル伝達を優先的に阻害し、前記ポリペプチドがｇｐ１３０ではない、単離ポリペプチド。
（項目２）
前記結合ドメインが、ＩＬ６単独よりも高い親和性で前記ＩＬ６ｘＲ複合体単独および前記ＩＬ６Ｒα単独に結合し、ｓＩＬ６ｘＲへの可溶性ｇｐ１３０の結合を増大させる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
前記結合ドメインが、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しない、項目１または２に記載のポリペプチド。
（項目４）
前記結合ドメインが、配列番号３７３〜４９６および７９９〜８１０に記載の１つもしくは複数の軽鎖可変領域と、または配列番号３７３〜４９６および７９９〜８１０に記載の１つもしくは複数の重鎖可変領域と、またはその両方と、少なくとも８０％同一である配列を含む、項目１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目５）
前記結合ドメインが、抗体もしくはその抗原結合ドメイン、ＦａｂまたはｓｃＦｖである、項目１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記結合ドメインが、配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４のそれぞれに記載の少なくとも１つの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対し、それぞれ少なくとも８０％同一であるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含有する軽鎖可変領域を含む、項目１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目７）
前記結合ドメインが、配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０のそれぞれに記載の少なくとも１つの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対し、それぞれ少なくとも８０％同一であるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含有する重鎖可変領域を含む、項目１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記結合ドメインが、配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４のそれぞれに記載の少なくとも１つの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対し、それぞれ少なくとも８０％同一であるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含有する軽鎖可変領域を含み、配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０のそれぞれに記載の少なくとも１つの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対し、それぞれ少なくとも８０％同一であるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含有する重鎖可変領域を含む、項目１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記ＩＬ６ｘＲ複合体が、配列番号６０６に記載のアミノ酸配列を有する、項目１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１０）
項目１から９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質であって、（ａ）免疫グロブリンＦｃドメインまたは免疫グロブリンＦｃドメインの１つもしくは複数のＣＨドメイン、あるいは（ｂ）血清タンパク質結合性タンパク質と融合している、融合タンパク質。
（項目１１）
前記免疫グロブリンＦｃドメインの１つまたは複数のＣＨドメインが、ＣＨ２定常領域およびＣＨ３定常領域、好ましくは、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、項目１０に記載の融合タンパク質。
（項目１２）
項目１から９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質であって、アミノ末端からカルボキシ末端までに、（ａ）ＩＬ６ｘＲに特異的な前記ポリペプチド結合ドメインがリンカーと融合しており、（ｂ）前記リンカーが免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域ポリペプチドと融合しており、（ｃ）前記ＣＨ２定常領域ポリペプチドが免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチドと融合している、融合タンパク質。
（項目１３）
項目１から９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質であって、カルボキシ末端からアミノ末端までに、（ａ）ＩＬ６ｘＲに特異的な前記ポリペプチド結合ドメインが第１のリンカーと融合しており、（ｂ）前記第１のリンカーが免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチドと融合しており、（ｃ）前記ＣＨ３定常領域ポリペプチドが免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域ポリペプチドと融合しており、（ｄ）前記ＣＨ２定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合している、融合タンパク質。
（項目１４）
前記リンカーが、免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドである、項目１２または１３に記載の融合タンパク質。
（項目１５）
前記リンカーが、配列番号４９７〜６０４および８２３〜８２８からなる群から選択される、項目１２または１３に記載の融合タンパク質。
（項目１６）
第２の結合ドメインに介在ドメインによって共有結合により連結している第１の結合ドメインを含む多重特異性単鎖結合性融合タンパク質であって、前記第１の結合ドメインまたは前記第２の結合ドメインのいずれかが、項目１から８のいずれか一項に記載のものである、多重特異性単鎖結合性融合タンパク質。
（項目１７）
前記第１の結合ドメインが、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的であり、前記第２の結合ドメインが、ＩＬ６アンタゴニストではない受容体外部ドメインである、項目１６に記載の多重特異性単鎖結合性融合タンパク質。
（項目１８）
前記介在ドメインが、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとの間に配置された免疫グロブリン定常領域または定常領域の一部を含む、項目１６または１７に記載の多重特異性単鎖結合性融合タンパク質。
（項目１９）
前記免疫グロブリン定常領域が、第１のリンカーと第２のリンカーとの間に配置される、項目１８に記載の多重特異性単鎖結合性融合タンパク質。
（項目２０）
前記介在ドメインが、二量体化ドメインである、項目１６から１９のいずれか一項に記載の多重特異性単鎖結合性融合タンパク質。
（項目２１）
項目１から２０のいずれかに記載のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目２２）
発現制御配列に作動可能に連結している項目２１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（項目２３）
項目２２に記載の発現ベクターを含有する組換え宿主細胞。
（項目２４）
項目１から２０のいずれかに記載のポリペプチドまたは融合タンパク質、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物。
（項目２５）
ＩＬ６関連疾患に罹患しているヒトまたは非ヒト哺乳動物の被験体を治療する方法であって、有効量の項目１から２１のいずれかに記載のポリペプチド、融合タンパク質または組成物を前記被験体に投与する工程を含む方法。
（項目２６）
前記疾患が、炎症性疾患または癌である、項目２５に記載の方法。

Claims (26)

  1. ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ（ＩＬ６ｘＲ）複合体に特異的な結合ドメインを含む単離ポリペプチドであって、
    （ａ）ＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒα単独のいずれかよりも高い親和性で前記ＩＬ６ｘＲ複合体に結合するか、またはＩＬ６単独よりも高い親和性で前記ＩＬ６ｘＲ複合体単独および前記ＩＬ６Ｒα単独に結合し、そして
    （ｂ）前記ＩＬ６ｘＲ複合体への可溶性ｇｐ１３０の結合を増大させるか、またはｓＩＬ６ｘＲ複合体への結合について膜ｇｐ１３０と競合し、ここで、
    前記結合ドメインが、ＩＬ６のシス−シグナル伝達よりも、ＩＬ６のトランス−シグナル伝達を優先的に阻害し、前記ポリペプチドがｇｐ１３０ではない、単離ポリペプチド。
  2. 前記結合ドメインが、ＩＬ６単独よりも高い親和性で前記ＩＬ６ｘＲ複合体単独および前記ＩＬ６Ｒα単独に結合し、ｓＩＬ６ｘＲへの可溶性ｇｐ１３０の結合を増大させる、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記結合ドメインが、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しない、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. 前記結合ドメインが、配列番号３７３〜４９６および７９９〜８１０に記載の１つもしくは複数の軽鎖可変領域と、または配列番号３７３〜４９６および７９９〜８１０に記載の１つもしくは複数の重鎖可変領域と、またはその両方と、少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. 前記結合ドメインが、抗体もしくはその抗原結合ドメイン、ＦａｂまたはｓｃＦｖである、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 前記結合ドメインが、配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４のそれぞれに記載の少なくとも１つの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対し、それぞれ少なくとも８０％同一であるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含有する軽鎖可変領域を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. 前記結合ドメインが、配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０のそれぞれに記載の少なくとも１つの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対し、それぞれ少なくとも８０％同一であるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含有する重鎖可変領域を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. 前記結合ドメインが、配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４のそれぞれに記載の少なくとも１つの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対し、それぞれ少なくとも８０％同一であるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含有する軽鎖可変領域を含み、配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０のそれぞれに記載の少なくとも１つの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対し、それぞれ少なくとも８０％同一であるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含有する重鎖可変領域を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. 前記ＩＬ６ｘＲ複合体が、配列番号６０６に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. 請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質であって、（ａ）免疫グロブリンＦｃドメインまたは免疫グロブリンＦｃドメインの１つもしくは複数のＣＨドメイン、あるいは（ｂ）血清タンパク質結合性タンパク質と融合している、融合タンパク質。
  11. 前記免疫グロブリンＦｃドメインの１つまたは複数のＣＨドメインが、ＣＨ２定常領域およびＣＨ３定常領域、好ましくは、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
  12. 請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質であって、アミノ末端からカルボキシ末端までに、（ａ）ＩＬ６ｘＲに特異的な前記ポリペプチド結合ドメインがリンカーと融合しており、（ｂ）前記リンカーが免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域ポリペプチドと融合しており、（ｃ）前記ＣＨ２定常領域ポリペプチドが免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチドと融合している、融合タンパク質。
  13. 請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質であって、カルボキシ末端からアミノ末端までに、（ａ）ＩＬ６ｘＲに特異的な前記ポリペプチド結合ドメインが第１のリンカーと融合しており、（ｂ）前記第１のリンカーが免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチドと融合しており、（ｃ）前記ＣＨ３定常領域ポリペプチドが免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域ポリペプチドと融合しており、（ｄ）前記ＣＨ２定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合している、融合タンパク質。
  14. 前記リンカーが、免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドである、請求項１２または１３に記載の融合タンパク質。
  15. 前記リンカーが、配列番号４９７〜６０４および８２３〜８２８からなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の融合タンパク質。
  16. 第２の結合ドメインに介在ドメインによって共有結合により連結している第１の結合ドメインを含む多重特異性単鎖結合性融合タンパク質であって、前記第１の結合ドメインまたは前記第２の結合ドメインのいずれかが、請求項１から８のいずれか一項に記載のものである、多重特異性単鎖結合性融合タンパク質。
  17. 前記第１の結合ドメインが、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的であり、前記第２の結合ドメインが、ＩＬ６アンタゴニストではない受容体外部ドメインである、請求項１６に記載の多重特異性単鎖結合性融合タンパク質。
  18. 前記介在ドメインが、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとの間に配置された免疫グロブリン定常領域または定常領域の一部を含む、請求項１６または１７に記載の多重特異性単鎖結合性融合タンパク質。
  19. 前記免疫グロブリン定常領域が、第１のリンカーと第２のリンカーとの間に配置される、請求項１８に記載の多重特異性単鎖結合性融合タンパク質。
  20. 前記介在ドメインが、二量体化ドメインである、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の多重特異性単鎖結合性融合タンパク質。
  21. 請求項１から２０のいずれかに記載のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  22. 発現制御配列に作動可能に連結している請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  23. 請求項２２に記載の発現ベクターを含有する組換え宿主細胞。
  24. 請求項１から２０のいずれかに記載のポリペプチドまたは融合タンパク質、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物。
  25. ＩＬ６関連疾患に罹患しているヒトまたは非ヒト哺乳動物の被験体を治療する方法であって、有効量の請求項１から２１のいずれかに記載のポリペプチド、融合タンパク質または組成物を前記被験体に投与する工程を含む方法。
  26. 前記疾患が、炎症性疾患または癌である、請求項２５に記載の方法。
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