TWI726870B - 具有高親和性、結合性及專一性之結合轉形生長因子-β１的ｓｃＦｖ-Ｆｃ二聚體 - Google Patents
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Abstract
scFv-Fc二聚體選擇性地以高親和性和親合力結合並中和TGFβ1。scFv區可以包含與美替木單抗(metelimumab)相同的VH和VL域或CDR區。scFv-Fc二聚體較小的尺寸、針對TGFβ1的高選擇性、效力以及長的體內半衰期的獨特組合使其成為用於治療應用的理想候選物。
Description
抗原結合的二聚體具有兩個多肽單體，其各自包含單鏈片段可變分子(scFv)、鉸鏈、和Fc分子，所述抗原結合的二聚體展現出對於轉形生長因子-β1(TGFβ1)的高親和性和親合力，但對於TGFβ2或TGFβ3則無。還提供了包含所述抗原結合的二聚體的組合物和使用該組合物來治療涉及TGFβ1活性的疾病的方法。
許多嚴重疾病與TGFβ誘導的信號傳輸途徑機能障礙有關。例如，TGFβ的增加的組織含量被認為是特發性肺纖維化和心肌纖維化進展中的因素。此外，TGFβ的高局部組織含量可以允許一些類型的癌細胞的維持和進展。因此，TGFβ信號傳輸的下調可以降低此類腫瘤細胞的存活力。
TGFβ同種型是~25kDa同型二聚體分子，其具有相似的結構框架，其中兩個單體經二硫橋共價地連接。哺乳動物同種型(isoform)具有70-82%的序列同一性，但在血管發育和免疫細胞功能調控中具有不重疊的活性。在人中已報道了三個TGFβ同種型：TGFβ1、TGFβ2、和TGFβ3(Swiss Prot登錄號分別為P01137、P08112、和P10600)。TGFβ1和TGFβ3在結合至兩個跨膜受體(稱為TGFβ受體I型和II型)的胞外結構域時觸發細胞信號傳輸級
聯反應。TGFβ2可以結合至TGFβ受體I型和II型以及TGFβ受體III型。
已針對臨床使用測試能結合人TGFβ1、TGFβ2、和TGFβ3的抗體。例如，Grütter等公開了GC1008(一種人IgG4單株抗體(Mab；即GC1008))在臨床開發中用於治療惡性腫瘤和纖維化疾病。Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 105(51)：20251-56(2008)。GC1008是“泛特異性的”TGFβ中和抗體，因為其能中和所有三種人TGFβ同種型。選擇性中和TGFβ1的抗體被揭示於例如在美國專利第6,492,497號和美國專利第7,151,169號中，其在此以參考方式併入本文。美替木單抗(metelimumab)，又稱CAT192(IgG4)，是一種選擇性中和TGF-β1的人IgG4單株抗體。參見例如美國專利第6,492,497號。測試美替木單抗用於治療彌散性皮膚系統性硬化病(diffuse cutaneous systemic sclerosis)，又稱硬皮病(scleroderma)，但證明其功效不足。
本發明提供結合TGFβ1的scFv-Fc二聚體，其能選擇性地中和人TGFβ1。在一個具體實例中，所述scFv-Fc二聚體形式為scFv-Fc融合蛋白，其包含兩個多肽單體，每個單體包含單鏈Fv區(scFv)、鉸鏈、和Fc區。scFv-Fc二聚體的VH和VL域展現出對TGFβ1較高的親和性(affinity)和親合力(avidity)，且比以IgG1或IgG4形式使用時更有效地中和TGFβ1。
在一個具體實例中，scFv組分可由與美替木單抗的VH和VL域相同的VH和VL域組成。scFv組分中的可變域可經由連接子，例如[G4S]3-型連接子連接在一起。scFv-Fc二聚體的scFv組分的每一個可以經鉸鏈區(例如人IgG1或IgG4鉸鏈區)融合至Fc區。二聚體的單體可以經由鉸鏈區中半胱胺酸殘基之間的二硫鍵共價地連接。在另一個具體實例中，scFv-Fc二聚體可以具有相對於美替木單抗結構上的相異處，最顯著的是缺乏CH1和CL域和存在VH和VL域之間的連接子。有利的是，scFv-Fc二聚體在A549細胞效
力生物測定中對於TGFβ1表現出明顯的親和性，比包含相同VH和VL域的scFv(CAT191(scFv)，示於SEQ ID NO：12中)的親和性高接近兩個數量級。進一步地，scFv-Fc二聚體在A549細胞生物測定中表現出對TGFβ1的明顯親和性，比IgG形式化的包含相同VH和VL域的抗體(例如CAT192)的親和性高超出3個數量級。scFv-Fc二聚體還表現出想要的穩定性和藥物動力學特性。由於它們相對小的尺寸和在血清中延長的半衰期，scFv-Fc二聚體對於治療應用是尤其有用的。
因此，本發明關於分離的結合蛋白，其包含能結合TGFβ1的可變域，其中如藉由表面等離子體共振測得，所述結合蛋白展現出的針對人TGFβ1的Kd比同一結合蛋白針對人TGFβ2的Kd低至少約兩倍。
在另一個具體實例中，本發明關於分離的結合蛋白，其包含能結合TGFβ1的可變域，其中如藉由表面等離子體共振測得，所述結合蛋白展現出的針對人TGFβ1的Kd比同一結合蛋白針對人TGFβ3的Kd低至少約兩倍。
在進一步的具體實例中，本發明關於分離的結合蛋白，其包含能結合TGFβ1的可變域，其中如藉由表面等離子體共振測得，所述結合蛋白展現出的針對人TGFβ1的Kd比同一結合蛋白針對人TGFβ2的Kd低至少約兩倍且比同一結合蛋白針對人TGFβ3的Kd低至少約兩倍。
在進一步的具體實例中，本發明關於結合TGFβ1的分離的結合蛋白，其中所述結合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一和第二多肽鏈各具有下式：(VD1)-(連接子1)n-(VD2)-(連接子2)m-(鉸鏈)p-(Fc區)，其中VD1包含選自下列組成之群組的第一可變域：分離自能結合TGFβ1的抗體的VL域和分離自能結合TGFβ1的抗體的VH域，而VD2包含選自下列
組成之群組的第二可變域：分離自能結合TGFβ1的抗體的VL域，和分離自能結合TGFβ1的抗體的VH域；且其中，n是0或1，m是0或1，且p是0或1。
在一個具體實例中，本發明關於一種結合TGFβ1的scFv-Fc二聚體，其選擇性地結合TGFβ1。該scFv-Fc二聚體可包含兩個多肽單體，其各自從N末端至C末端具有下式：(VH域)-(連接子)-(VL域)-(鉸鏈)-(Fc區)。在另一個具體實例中，揭示結合TGFβ1的分離的結合蛋白，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈。所述第一和第二多肽鏈均從N末端至C末端具有下式：(VH域)-(連接子1)n-(VL域)-(連接子2)m-(鉸鏈)p-(Fc區)。P可以是0或1，n可以是0或1，且m可以是0或1。在一個方面，所述第一和第二多肽鏈可以是相同的且可以形成二聚體。
在另一個具體實例中，所揭示的TGFβ1結合蛋白可包含多肽鏈，所述多肽鏈從N末端至C末端具有下式：(VH域)-(連接子1)n-(VL域)-(連接子2)m-(鉸鏈)p-(Fc區)，其中p可以是0或1，n可以是0或1，且m可以是0或1。
所揭示的結合蛋白的VH結構域可包含可變重鏈互補決定區1(HCDR1)、可變重鏈互補決定區2(HCDR2)、及可變重鏈互補決定區3(HCDR3)。在一個方面，所述HCDR1可具有SEQ ID NO：22的胺基酸序列，HCDR2可具有SEQ ID NO：23的胺基酸序列，且HCDR3可具有選自下列組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、和SEQ ID NO：30。
VH域的框架區可選自可變重鏈種系(germline)序列。例如，VH域可選自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所示的人VH域序列，或其在多至4個胺基酸中具有修飾的變體。
所揭示的結合蛋白的VL域可包含可變輕鏈互補決定區1(LCDR1)、可變輕鏈互補決定區2(LCDR2)、及可變輕鏈互補決定區3
(LCDR3)。在一個方面，所述LCDR1可具有SEQ ID NO：27的胺基酸序列，LCDR2可具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列，且LCDR3可具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列。
VL域的框架區可選自相同的可變λ或κ種系序列。例如，VL域可選自例如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中所示的人Vκ域序列，或其具有多至4個胺基酸的修飾的變體。在一個具體實例中，二聚體的各個多肽可包含SEQ ID NO：1中所示的VH域和SEQ ID NO：5中所示的Vκ域，其分別是美替木單抗中存在的VH和VL域。
在一個具體實例中，scFv組分中的可變域可經由長度約15個胺基酸的柔性連接子連接。此語境中的“約”意指連接子的長度能變化在多至±4個胺基酸。對於最佳柔性而言，連接子主要由甘胺酸和絲胺酸殘基組成。例如，所述連接子可以是[G4S]3-型連接子。連接子可具有胺基酸序列SGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：3)、胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：4)，或其具有多至4個胺基酸修飾的變體。就本發明而言，“具有多至x個胺基酸修飾”意指本領域技術人員可以將多至x數目個胺基酸變更為不同的胺基酸，而不顯著改變該多核苷酸的結構和功能。
在另一個具體實例中，p是1且scFv組分係經由鉸鏈與Fc區連接。所述鉸鏈可以包含源自人IgG1或IgG4鉸鏈區的胺基酸序列。例如，鉸鏈可包含胺基酸序列PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO：7)，或其具有多至4個胺基酸修飾的變體。在另一個具體實例中，鉸鏈長度可以在3-15個胺基酸變化。當鉸鏈來自人IgG1時，其可包含胺基酸序列CPPCP(SEQ ID NO：21)。進一步地，SEQ ID NO：7的鉸鏈的變體(其也是人IgG1鉸鏈)可以包含胺基酸序列CPPCP(SEQ ID NO：21)。
在另一個具體實例中，m是1且scFv組分和鉸鏈之間存在連接子2。在一個方面，連接子2可包含胺基酸序列GGSG(SEQ ID NO：20)，或其具有多至2個胺基酸修飾的變體。
Fc區可包含兩個或三個恒定域，例如CH2域和CH3域。例如，Fc區可以獲取自人IgG1、人IgG4、或人IgG1或IgG4的具有多至10個胺基酸修飾的變體。在一個具體實例中，二聚體的各多肽具有SEQ ID NO：9中所示的序列。SEQ ID NO：9的scFv-Fc二聚體的結構示於圖2中。所述scFv-Fc二聚體可以選擇性結合TGFβ1。該scFv-Fc二聚體可顯示出低於1nM的或甚至低於0.1nM的表觀離解參數(apparent dissociation constant)。例如，所述表觀離解參數可以藉由A549生物測定法或藉由表面等離子體共振來測量。
在另一個具體實例中，揭示分離的多核苷酸，其可包含編碼所述scFv-Fc二聚體的核苷酸序列。該分離的多核苷酸可以是cDNA、重組DNA或合成的DNA。宿主細胞可包含該分離的核酸。所述宿主細胞可以是人細胞，例如人胚腎293(HEK293)細胞及由其衍生的細胞系，或其可以是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。製備所述scFv-Fc二聚體的方法可以包括在適於產生該scFv-Fc二聚體的條件下培養宿主細胞。可以對所述scFv-Fc二聚體進行純化。純度可以是90%、95%、99%、99.5%或更高。
本發明的scFv-Fc二聚體可以是組合物的組件。所述組合物可以是醫藥組合物。所述醫藥組合物可以包含治療有效量的scFv-Fc二聚體。組合物還可包含一個或多個生物活性組分、賦形劑、或稀釋劑。
在人中治療由TGFβ1活性直接或間接導致的疾病或病況的方法可包括投予醫藥組合物，所述醫藥組合物包含治療有效量的scFv-Fc二聚體。所述疾病或病況可以選自下列組成之群組：纖維化疾病、癌症、免疫介導的疾病，例如彌散性皮膚系統性硬化病(diffuse cutaneous systemic
sclerosis)、骨重塑疾病、腎病和/或其組合。scFv-Fc二聚體可用於製造用於治療選自下列組成之群組的疾病或病況的藥物中：纖維化疾病、癌症、免疫介導的疾病，例如彌散性皮膚系統性硬化病、骨重塑疾病、腎病和/或其組合。所述疾病或病況的治療可以包括中和TGFβ1或抑制TGFβ1信號傳輸。所述疾病或病況的治療可以包括抑制TGFβ1介導的纖連蛋白產生、血管內皮生長因子(VEGF)產生、上皮細胞增殖、內皮細胞增殖、平滑肌細胞增殖、或免疫抑制。所述疾病或病況的治療可以包括增加自然殺傷細胞活性。
scFv-Fc二聚體以高親和性和親合力選擇性地結合並中和TGFβ1。scFv區可以由與美替木單抗中相同的VH和VL域組成。scFv-Fc二聚體有利地顯示出比所述可變域以其他形式使用時更大的中和TGFβ1的效力。由於其相對小的尺寸和在血清中延長的半衰期，本scFv-Fc二聚體是理想的用於治療應用的候選物。
如本文所用的，第一組件“和/或”第二組件意指具體揭示分別的第一或第二組件，或所述第一和第二組件的組合。除上下文另有明確說明外，單數形式“一”、“一個”和“該”包括複數指稱。
“分離的”多核苷酸(或核酸)或蛋白是使用遺傳工程技術自其天然形式移出和改變的。“純化的”核酸或蛋白可以是基本純的，例如至少90%純，或是同質形式的。
“選擇性結合”或“選擇性地結合”至人TGFβ1，意指結合蛋白(例如scFv-Fc二聚體)能夠以比結合至人TGFβ2或人TGFβ3更高的親和性結合人TGFβ1，例如其與人TGFβ1的離解常數比其與TGFβ2或人TGFβ3的離解常數低至少兩倍，如藉由表面等離子體共振測得。
在一個具體實例中，本scFv-Fc二聚體可變域包含來自美國專利第6,492,497號揭示的CDR的互補決定區(CDR)(例如美國專利第6,492,497號的SEQ ID NOs：11-19)，其以參考方式併入本文。CDR區列於下文：
HCDR1 SYGMH SEQ ID No.22
HCDR2 VISYDGSIKYYADSVKG SEQ ID No.23
HCDR3 TGEYSGYDTSGVEL SEQ ID No.24
TGEYSGYDTDPQYS SEQ ID No.25
TGFYSGYDTPASPD SEQ ID No.26
LCDR1 RASQGIGDDLG SEQ ID No.27
LCDR2 GTSTLQS SEQ ID No.28
LCDR3 LQDSNYPLT SEQ ID No.29
令人驚奇地揭示了共有的(consensus)HCDR3結合基序，其具有如下序列：
HCDR3 TGX1YSGYDTX2X3X4X5X6 SEQ ID No.30
其中X1可以是任意胺基酸(較佳為E或F)，或缺失，X2可以是任意胺基酸(較佳為S、D或P)，或缺失，X3可以是任意胺基酸(較佳為G、P或A)，或缺失，X4可以是任意胺基酸(較佳為V、Q或S)，或缺失，X5可以是任意胺基酸(較佳為E、Y或P)，或缺失，X6可以是任意胺基酸(較佳為L、S或D)，或缺失。
VH域包含SEQ ID No.22的HCDR1、SEQ ID No.23的HCDR2，以及選自下列組成之群組的HCDR3之一：SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、和SEQ ID No.30。CDR序列可以在任何位置被1至
4個框架區分隔，以自N末端：FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3-FW4的順序。VH域的框架區可選自可變重鏈種系序列。在一個具體實例中，FW區序列可以選自相同的人可變重鏈種系序列。VL域包含SEQ ID NO：7的LCDR1、SEQ ID NO：28的LCDR2、和SEQ ID NO：29的LCDR3。VL域的框架區可選自可變λ或κ種系序列，例如選自相同的人可變λ或κ種系序列。目前，本領域已知約40個可變重鏈種系序列，如存在40個可變κ種系序列和約30個可變λ種系序列，例如VH3、Vκ1、VH 1-69、和VH 1-e。
在另一個具體實例中，可藉由使用本文揭示的CDR序列來生成複合的VH或VL域。例如，VH或VL的晶體結構可以用作引導來生產複合域，所述產生用來自一個抗體的CDR序列和用來自另一抗體的種系FW區來進行。更多細節可見於美國專利申請公開號20020099179；及Homes和Foote,J Immunol.1997 Mar 1；158(5)：2192-201，其在此以參考方式併入本文。
本scFv-Fc二聚體可以由與美替木單抗中相同VH和VL域的組成，其分別具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5中所示序列。所述VH域可以用具有SEQ ID NO：2中所示序列的VH域來替代；所述VL域可以用具有SEQ ID NO：6中所示序列的VL域來替代。這些VH和VL域揭示於美國專利第6,492,497號(例如SEQ ID NOS：4、6、8、和10)中，在此以參考方式併入本文。
“可變域”(VD)意指免疫球蛋白的高變結合域，或受體的配體結合域，其涉及抗原/配體結合，正如本領域技術人員所知的。可變域通常根據其在免疫球蛋白內的位置或來源來稱呼，例如免疫球蛋白的輕鏈可變域(VL)、例如免疫球蛋白的重鏈可變域(VH)、駱駝型免疫球蛋白的重鏈可變域(VHH)。
“變體”可變域包含與參考序列相比胺基酸添加、取代和/或
刪除。VH或VL域的“變體”可以具有多至4個此類胺基酸修飾。例如，兩個域的一個可以包含胺基酸取代，而另一個域是未修飾的，或兩個域都可以包含胺基酸取代。添加或刪除胺基酸殘基的修飾可以在VH或VL域的N末端或C末端進行。例如，可以刪除VH域的N末端殘基。
例如，可以進行多至4個胺基酸取代來將scFv-Fc二聚體去免疫化。例如，去免疫化可以根據Harding等(2010)mAbs 2：256-265的方法來進行。
例如，可以取代VH和/或VL域的框架殘基來增加scFv-Fc二聚體的穩定性和/或降低其聚集的趨勢。低穩定性能影響表現scFv-Fc的二聚體在重組表現時適當折疊的能力，導致表現的非功能性的抗體的級分。低穩定性抗體也可能易於形成潛在免疫原性的聚集體或可以具有受損的親合力或儲藏壽命。scFv多肽具體而言可能在細菌和哺乳動物表現系統二者中表現出穩定性、溶解度、表現、聚集、分解產物、和總體可製造性的問題。預期增加穩定性和/或降低VH和/或VL域的聚集趨勢的框架胺基酸取代(例如在scFv多肽中)揭示於例如WO 2007/109254中。預期本VH和VL域中的相應殘基中的取代類似地增加穩定性和/或scFv-Fc二聚體聚集的趨勢。
預期能容許的取代包括會用其他人VH或VL域種系序列中出現的相應胺基酸來代替SEQ ID NO：1、2、5、或6的胺基酸的那些。用這些種系序列的任一個中出現的胺基酸對框架胺基酸的取代是可以容許的。例如，SEQ ID NO：1的VH域的殘基可以用任何VH種系序列中對應位置中出現的胺基酸來取代，所述VH種系序列例如來自DP-10(VH 1-69)或DP-88(VH 1-e)的種系序列。這種情況中的對應位置是藉由不同種系序列之間的序列比對來確定的，所述比對用本領域所熟知的比對技術(例如ClustalW)來進行。
預期容許的額外取代是那些對側鏈暴露於溶劑的胺基酸進
行的額外取代，如藉由分析三個共晶結構所確定的。可以用本領域所熟知的技術來評估殘基的溶劑可及的表面積。進一步地，預期對埋藏在可變域內的胺基酸的取代會是更為容許的，如果該胺基酸的側鏈不與鄰近的殘基產生位阻的話。因此，埋藏的胺基酸通常用具有相似或更小的側鏈的胺基酸來取代。例如，用Leu、Val、Ala、或Gly對埋藏的Ile殘基的取代預期是容許的。可以藉由分析所述三個共晶結構來預測可能由取代產生的位阻。預期容許的進一步取代是在可變域內維持現存的靜電相互作用(例如偶極-偶極相互作用、誘導的偶極相互作用、氫鍵、或離子鍵)的那些。
可變域的額外的胺基酸取代包括預期為抗體或其抗原結合片段帶來新的有用特性的那些。例如，可以去除VH和/或VL域中推定的N-糖基化位點以防止或降低N-糖型的形成。可以用Gln來取代胺基末端殘基以引起焦穀醯胺化(pyroglutamylation)，其能降低電荷變體的數目。例如，胺基酸取代可以用於降低等電點，這能降低IgG多肽抗體的清除率。
例如，可變域的表面殘基可以用Cys或Lys殘基來取代，然後其能被共價地修飾並偶聯至分子，所述分子能為抗體或其抗原結合片段帶來有用特性，例如可檢測的標記物、毒素、靶向模塊、或蛋白。例如，Cys殘基能偶聯至細胞毒性藥物以形成接合物。Cys殘基還能偶聯至增加血清半衰期的分子，例如聚乙二醇(PEG)或血清白蛋白。此類胺基酸修飾綜述於例如Beck等(2010)Nature 10：345-52中。
可檢測標記物包括放射性標記物如131I或99Tc，可以用本領域已知方法將其附接至抗體或其抗原結合片段。標記物也包括酶標記物如辣根過氧化物酶。標記物還包括化學部分如生物素，其可藉由對特異性的同族可檢測部分(例如帶標記的抗生物素蛋白(avidin))的結合來檢測。可以附接其他促進純化的部分。例如，抗體或其抗原結合片段可以用熟知的重組修
飾和表現方法加His標簽。
scFv-Fc二聚體的VH和VL域經由連接子(此處稱為連接子1)連接在一起。適於製備scFv片段的連接子是本領域所熟知的。參見如Bird等(1988)Science,242：423-426；Huston等(1988)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 85：5879-5883。例如，這可藉由框內(in-frame)融合編碼核酸和在合適的宿主細胞中表現融合蛋白來完成。合適的連接子包括[G4S]3-型的那些。[G4S]3-型連接子由甘胺酸和絲胺酸殘基的重複單元組成。例如，此類連接子可以具有SGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：3)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：4)的序列或其具有多至4個胺基酸修飾的變體。修飾可包括改變連接子長度的刪除或插入，或胺基酸取代，較佳為從Gly至Ser或反之。[G4S]3-型連接子已廣泛用於連接scFv結構中的可變域，因為該連接子是低變應原的且對可變域造成的構象扭曲最小。參見例如Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-83。
在scFv-Fc二聚體中，一種短連接子序列(此處稱為連接子2)任選地插入VL域和鉸鏈之間。這種連接子序列增加scFv組分相對於Fc組分的柔性。在一個具體實例中，連接子2具有GGSG(SEQ ID NO：20)的序列。對GGSG連接子的合適修飾包括改變其1至4個胺基酸的長度或取代1至2個胺基酸，較佳為從Gly至Ser或反之。
鉸鏈區是柔性域，其將scFv部分與Fc區連接。IgG和IgA分子中鉸鏈區的柔性允許Fab臂採取廣範圍的角度，允許結合至被可變距離隔開的表位。合適的鉸鏈區包括，例如具有的胺基酸序列PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO：7)的人IgG1鉸鏈區。例如，該序列對應於人IgG1上鉸鏈、中鉸鏈的部分、和CH2域的N末端部分，如美國專利第8,048,421號的圖4B中所揭示。來自人IgG1的鉸鏈含有兩個Cys殘基，
其能與對應單體上的鉸鏈的Cys殘基形成二硫鍵。形成二硫鍵的人IgG1鉸鏈部分含有胺基酸序列CPPCP(SEQ ID NO：21)。人IgG1鉸鏈的變體可以包含該序列。
將scFv組分框內融合至Fc區，其形成二聚體的Fc組分。合適的Fc區含有兩個或三個恒定區。Fc區包括來自人IgG1的那些(如SEQ ID NO：8所示)，或來自IgG4的那些(如SEQ ID NO：11的CH2和CH3域中所示)。抗體的Fc區介導其血清半衰期和效應子功能，如補體依賴性的細胞毒性(CDC)、抗體依賴性的細胞毒性(ADCC)和抗體依賴性的細胞吞噬作用(ADCP)。
可以對鉸鏈和Fc區進行修飾以改進scFv-Fc二聚體的多種特性。在一個具體實例中，除了對鉸鏈區的修飾外，還可以對天然存在的人Fc區的1、2、3、4、5或多至10個胺基酸進行修飾。例如，可以修飾Fc區以增加scFv-Fc二聚體的血清半衰期。IgG的半衰期取決於其對受體FcRn的pH依賴性結合。FcRn在內皮細胞表面上表現，其以pH依賴性的方式結合IgG並保護其不備降解。例如，已顯示定位於CH2和CH3域的界面的突變增加對FcRn的結合親和性及IgG1的體內半衰期。例如，此類修飾綜述於Strohl WR.,2009.Optimization of Fc-mediated effector functions of monoclonal antibodies.CurrOpin Biotechnol.20(6)：685-91；及Vaccaro C.等，2005.Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels.Nat Biotechnol.23(10)：1283-8中。
對鉸鏈和/或Fc區的其他修飾可以增加或降低效應子(effector)功能。四種人IgG同種型以不同的親和性結合激活性的Fcγ受體(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)、抑制性的FcγRIIb受體、及第一補體組份(C1q)，導致不同的效應子功能。例如，IgG對FcγRs或C1q的結合取決於定位於IgG鉸鏈區和CH2域中的殘基。這些殘基的單個或多個胺基酸取代能藉由調節
IgG與FcγRs或C1q的相互作用影響效應子功能。已知其他取代影響效應子功能。這些修飾綜述於例如Strohl(2009)“Optimization of Fc-mediated effector functions of monoclonal antibodies,”Curr.Opin.Biotechnol.20：685-91中。
鉸鏈和/或Fc區的代表性修飾總結於表1中。
2. Vaccaro等(2005)Nature Biotechnol.23(10)：1283-88.
3. Armour等(1999)Eur.J. Immunol.29(8)：2613-24.
4. Shields等(2001)J.Biol.Chem.276(9)：6591-604.
5. Idusogie等(2000)J.Immunol.164(8)：4178-84.
6. Idusogie等(2001)J.Immunol.166(4)：2571-75.
7. Lazar等(2006)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 103(11)：4005-10.
8. Ryan等(2007)Mol.Cancer Ther.6：3009-18.
9. Datta-Mannan等(2007)Drug Metab.Dispos.35：86-94.
10. Steurer等(1995)J.Immunol.155(3)：1165-74.
11. Richards等(2008)Mol.Cancer Ther.7(8)：2517-27.
12. Labrijn等(2009)Nature Biotechnol.27(8)：767-71.
進一步地，重組胺基酸修飾能用於降低表現的多肽的結構同質性。代表性的例子是Peters等(2012)J.Biol.Chem.287(29)：24525-33，其揭示IgG4鉸鏈區中的Cys至Ser取代，其降低二硫鍵異質性並增加Fab域熱穩定性。類似地，Zhang等(2010)Anal.Chem.82：1090-99公開了設計IgG2鉸鏈區以限制治療應用中二硫鍵雜亂化(scrambling)和結構異構體的形成。對CH3域的胺基酸修飾也能用於刪除羧基末端Lys殘基以減少電荷變體的數目。胺基酸修飾也可能用於改進重組抗體或其抗原結合片段的藥理學功能。例如，胺基酸修飾能用於提高補體活化、藉由增加FcγRIIIA結合或減少FcγRIIIB結合來增強抗體依賴性的細胞毒性(ADCC)、和/或藉由增加FcRn結合來增加血清半衰期。例如，此類胺基酸修飾綜述於Beck等(2010)Nature 10：345-52中。
本發明進一步的方面提供編碼scFv-Fc二聚體的核酸。例如，分離的核酸可以是合成的DNA、非天然存在的mRNA、或cDNA。例子包括編碼美國專利No.6,492,497的SEQ ID NOS：3、5、7、和9中所示的VH和VL域的核酸。額外的核酸包括本發明的SEQ ID NO：13中所示序列，其編碼SEQ ID NO：14中所示的雙抗體-5aa，以及SEQ ID NO：15中所示序列，其編碼衍生自亮胺酸拉鍊肽的二聚體，其具有SEQ ID NO：16中所示的胺基酸序列。
額外的核酸包括SEQ ID NO：17中所示序列，其編碼CAT191(scFv-Fc)，其具有SEQ ID NO：9中所示的胺基酸序列。可以將核酸插入至質體、載體、或者轉錄或表現盒內。可以製備編碼scFv-Fc二聚體的核酸，且表現的抗體可以用本領域所熟知的常規技術來測試，例如Borsi等(2002)Int.J.Cancer 102：75-85中所揭示。
重組宿主細胞可以包含一個或多個上述構築體。用於製備scFv-Fc二聚體的方法包括在宿主細胞中於產生scFv-Fc二聚體的條件下表現編碼核酸，並回收抗體。回收抗體的方法可包括抗體的分離和/或純化。生產方法可以包括將抗體配製於組合物中，所述組合物包含至少一個額外的組分，如藥學可接受的賦形劑。
本文所用的術語“重組宿主細胞”(或簡稱“宿主細胞”)意指其中引入外源DNA的細胞。應當理解此類術語不僅意指具體的細胞本體，還指這種細胞的後代。因為具體的修飾可以發生在隨後的數代中，這是由於無論突變或環境影響，實際上這種後代可能與母代細胞不是完全一樣的，但同樣涵蓋在本文所用的術語“宿主細胞”的範圍內。較佳的是，宿主細胞包括選自生物界任一種的原核和真核細胞。較佳的真核細胞包括原生生物、真菌、植物和動物細胞。最佳的是，宿主細胞包括但不限於原核細胞系大腸桿菌(E.Coli)；哺乳動物細胞系CHO、HEK 293和COS；昆蟲細胞系Sf9；以及真菌細胞釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
可以選擇或構建合適的包含編碼scFv-Fc二聚體的核酸的載體，其包含適當的調控序列，包括啟動子序列、終止子序列、多聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因序列和適當的其他序列。例如，載體可以是質體、噬菌體、噬菌粒、腺病毒、AAV、慢病毒。用於操作核酸(例如製備核酸構築體、誘變、定序、將DNA引入細胞、和基因表現)的技術和實驗
方案，是本領域所熟知的。
本文所用的術語“載體”意指能將運輸預期連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質體”，其意指螺旋雙鏈DNA環，額外的DNA片段可以連接到其中。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA片段可以連接到該病毒基因組中。一些載體能在它們所被引入的宿主細胞(例如具有細菌複製起點的細菌載體和游離體(episomal)哺乳動物載體)中自主複製。其他載體(例如非游離體(non-episomal)哺乳動物載體)在引入宿主細胞中時能整合至宿主細胞的基因組中，並由此與宿主基因組一起複製。此外，一些載體能指導與其可操作地連接的基因的表現。此類載體在此稱為“重組表現載體”(或簡稱“表現載體”)。通常，在重組DNA技術中實用的表現載體常常以質體的形式。在本說明書中，“質體”和“載體”可以互換地使用，因為質體是最常用的載體形式。然而，本發明意在包括這些其他形式的表現載體，如病毒載體(例如複製缺陷逆轉錄病毒、腺病毒、和腺相關病毒)，其發揮等價的功能。
將此類核酸引入宿主細胞可以用本領域所熟知的技術來完成。對於真核細胞而言，合適的技術可以包括例如磷酸鈣轉染、DEAE-右旋糖酐(DEAE-Dextran)、電穿孔、脂質體介導的轉染、和用逆轉錄病毒或其他病毒轉導。對於細菌細胞，合適的技術可以包括氯化鈣轉化、電穿孔、和用噬菌體轉染。引入後可為引起或允許由核酸的表現，例如藉由在用於表現基因的條件下培養宿主細胞來進行。在一個具體實例中，本發明的核酸整合至宿主細胞的基因組(例如染色體)中。可按照標準技術藉由包含促進與基因組重組的序列來促進整合。
用於在熟知的多種不同的宿主細胞中選殖和表現多肽的系統。合適的宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、真
菌、酵母和轉基因植物和動物。本領域中用於表現異源多肽的可用哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、小鼠黑色素瘤細胞、大鼠骨髓瘤細胞、人胚腎細胞(例如HEK293細胞)、人胚視網膜細胞、和許多其他細胞系。抗體及其抗體片段在原核細胞(例如大腸桿菌)中的表現在本領域中已發展完善。綜述參見例如Plückthun Bio/Technology9：545-551(1991)。在培養的真核中的表現對於本領域技術人員而言也是可用的，如例如Andersen等(2002)Curr.Opin.Biotechnol.13：117-23中所綜述的。
scFv-Fc二聚體可天然地或是表現宿主(例如CHO、HEK293、或NSO(ECACC 85110503)細胞)選擇地被糖基化，或它們可以是非糖基化的，例如如果藉由在原核細胞中表現來產生的話。還可以特意對糖基化進行改變，例如藉由抑制岩藻糖基化，從而增加所得scFv-Fc二聚體的ADCC活性。
scFv-Fc二聚體可用於治療或診斷人或動物身體的方法中，如人患者中的疾病或病症的治療方法(其可以包括預防性治療)，其包括使用有效量來治療該患者。可治療的病況包括TGFβ1起作用的任何病況，例如纖維化疾病、癌症、免疫介導的疾病、和傷口癒合，例如彌散性皮膚系統性硬化病、骨重塑疾病、腎病和/或其組合。
已顯示對人TGFβ1具特異性的抗體在動物模型中對於治療TGFβ1腎小球性腎炎(Border等(1990)Nature 346：371-374)、神經瘢痕形成(Logan等(1994)Eur.J.Neurosci.6：355-363)、真皮瘢痕形成(Shah等(1992)Lancet 339：213-214；Shah等(1994)J.Cell Science 107：1137-1157；Shah等(1995)J.Cell Science 108：985-1002)、及肺纖維化(Giri等(1993)Thorax 48：
959-966)是有效的。進一步地，已顯示針對TGFβ1、2、和3的抗體在肺纖維化、輻射誘導的纖維化(美國專利第5,616,561號)、骨髓纖維化、燒傷、Dupuytren氏攣縮(Dupuytren’s contracture)、胃潰瘍、和類風濕性關節炎模型中是有效的(Wahl等(1993)Exp.Medicine 177：225-230)。
scFv-Fc二聚體對於治療由TGFβ1活性直接或間接引起的疾病和病況是有用的。scFv-Fc二聚體可以在體外或體內選擇性抑制人TGFβ1同種型的活性。TGFβ1同種型的活性包括但不限於：TGFβ介導的信號傳輸、細胞外基質(ECM)沉積、抑制上皮和內皮細胞增殖、促進平滑肌增殖、誘導III型膠原表現、誘導TGF-β、纖連蛋白(fibronection)、VEGF和IL-11表現、結合潛在相關肽(Latency Associated Peptide)、腫瘤誘導的免疫抑制、促進血管生成、活化成肌纖維細胞、促進轉移、和抑制NK細胞活性。例如scFv-Fc二聚體對於治療局灶性節段性腎小球硬化(FSGS)、肝纖維化(HF)、急性心肌梗死(AMI)、特發性肺纖維化(IPF)、硬皮病(SSc)、和馬方症候群(Marfan Syndrome)。
scFv-Fc二聚體對於治療疾病和病況是有用的，所述疾病和病況包括但不限於纖維化疾病(如腎小球性腎炎、神經瘢痕形成、真皮瘢痕形成、肺纖維化(pulmonary fibrosis)、肺部纖維化(lung fibrosis)、輻射誘導的纖維化、肝纖維化、骨髓纖維化)、燒傷、免疫介導的疾病、炎症性疾病(包括類風濕性關節炎)、移植排斥、癌症、Dupuytren氏攣縮、和胃潰瘍。它們對於治療、預防腎機能不全或其降低發病風險也是有用的，所述腎機能不全包括但不限於：糖尿病(I型和II型)腎病、輻射誘導的腎病、梗阻性腎病、彌散性系統性硬化病、肺纖維化、同種異體移植物排斥、遺傳性腎病(例如多囊性腎病、髓質海綿腎、馬蹄腎)、腎小球性腎炎、腎硬化、腎鈣質沉著症、系統性紅斑狼瘡、斯耶格倫氏症候群(Sjogren’s syndrome)、貝格爾氏病
(Berger’s disease)、系統性或腎小球性高血壓、小球間質性腎病、腎小管性酸中毒、腎結核、及腎梗死。具體而言，當與腎素-血管緊張素-醛固酮系統的拮抗劑組合時，它們是有用的，所述拮抗劑包括但不限於：腎素抑制劑、血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑、Ang II受體拮抗劑(也稱為“Ang II受體阻斷劑”)、和醛固酮拮抗劑。例如，用於組合使用scFv-Fc二聚體與此類拮抗劑的方法示於WO 2004/098637中。
scFv-Fc二聚體對於治療與ECM沉積相關的疾病和病況也是有用的，所述疾病和病況包括系統性硬化病、手術後黏附(postoperative adhesions)、瘢痕疙瘩(keloid)和肥厚性瘢痕形成、增殖性玻璃體視網膜病變、青光眼引流手術(glaucoma drainage surgery)、角膜損傷、白內障、佩倫涅氏病(Peyronie’s disease)、成人呼吸窘迫症候群、肝硬化、心肌梗死後瘢痕形成、血管成形術後再狹窄(post angioplasty restenosis)、蛛網膜下腔出血後瘢痕形成、多發性硬化、椎板切除術後纖維化、肌腱和其他修復後纖維化、由去除紋身引起的瘢痕形成、膽汁性肝硬化(包括硬化性膽管炎)、心包炎、胸膜炎、氣管造口術、滲透性中樞神經系統損傷、嗜曙紅細胞肌痛症候群、血管再狹窄、靜脈閉塞性病、胰腺炎和牛皮癬性關節病。
scFv-Fc二聚體對於在疾病和病況中促進上皮細胞再形成也是有用的，所述疾病和病況如靜脈性潰瘍、缺血性潰瘍(褥瘡)、糖尿病性潰瘍、移植部位、移植供體部位、擦傷和燒傷、支氣管上皮的疾病，如哮喘、ARDS、腸上皮的疾病，如與細胞毒性治療相關的黏膜炎、食管潰瘍(反流疾病)、胃潰瘍、小腸和大腸的損傷(炎性腸病)。
scFv-Fc二聚體也用於促進內皮細胞增殖(例如在穩定動脈粥樣硬化斑塊中)、促進血管吻合術(anastomosis)的傷癒、或抑制平滑肌細胞增殖(例如在動脈疾病、再狹窄、和哮喘中)。
scFv-Fc二聚體對於增強針對巨噬細胞介導的感染的免疫反應而言是有用的。它們對於降低免疫抑制(例如腫瘤、AIDS、或肉芽腫性疾病引起的免疫抑制)也是有用的。scFv-Fc二聚體對於治療過度增生性疾病是有用的，所述過度增生性疾病如癌症，包括但不限於乳腺、前列腺、卵巢、胃、腎、胰腺、結腸直腸、皮膚、肺、子宮頸及膀胱癌、膠質瘤、間皮瘤、以及多種白血病及肉瘤，如卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)，並且對於治療或預防此類腫瘤的復發或轉移是有用的。本發明的scFv-Fc二聚體還用於抑制環孢菌素(cyclosporin)介導的轉移。
在癌症治療的上下文中，“治療”包括任何導致腫瘤生長減緩或腫瘤轉移減少、以及癌症部分緩解從而延長患者預期壽命的醫學干預。
治療方法包括投予scFv-Fc二聚體或包含scFv-Fc二聚體的醫藥組合物。scFv-Fc二聚體可用於製造用於投予的藥物中。例如，製備藥物或醫藥組合物的方法包括用藥學可接受的賦形劑配製scFv-Fc二聚體。組合物可以單獨投予或與其他治療組合同時或連續投予，取決於其要治療的病況。
投予較佳為以足以對患者顯示出益處的“治療有效量”進行。此類益處可以是具體疾病或病況的至少一個症狀的改善。實際的投予量及投予的速率和時間進程會取決於治療的疾病或病況的性質和嚴重程度。治療的處方，例如對劑量等的決定，可以基於臨床前和臨床研究來確定，對所述研究的設計完全是在本領域技術水平內的。
精確劑量會取決於一些因素，包括scFv-Fc二聚體是用於診斷還是用於治療、要治療的部位的大小和位置、以及附接於所述scFv-Fc二聚體的任何可檢測標記物或其他分子的性質。例如，scFv-Fc二聚體的典型劑量用於全身應用可在100μg至1克的範圍，而用於局部應用可為1μg至1
mg。用於成人患者單一治療的劑量可以針對少兒和嬰兒進行比例性調整。治療可以每天一次、每週兩次、每週一次、每月一次或根據其他間隔進行重複，由醫師斟酌決定。治療可以是週期性的，並且投予之間的週期為約2周或更多周、較佳為約3周或更多周、更佳為4周或更多周，或每週約一次。
預期約0.1、0.3、1、3、10、或15毫克每千克患者體重的劑量水平是有用且安全的。例如，大鼠和小鼠中的0.5-5mg/kg在急性病情中是有效的劑量。因此，對於長期給藥而言，基於預期的21天半衰期，可以對人投予0.3-10mg/kg。劑量對於功效而言可以是足夠的，即使足夠低以助於最佳投予。例如，低於50mg的劑量有助於皮下投予。可將靜脈內投予用作針對嚴重疾病的遞送途徑，其中可能需要高劑量和長給藥間隔。皮下注射能增加對於產品的潛在免疫反應。對局部疾病的局部投予能降低投予的產品量並增加作用部位的濃度，其能提高安全性。
本發明的scFv-Fc二聚體可以藉由注射投予，例如皮下、靜脈內、腔內(例如在腫瘤切除後)、病損內(intralesionally)、腹膜內、或肌內注射。ScFv-Fc二聚體還可以藉由吸入或局部地(例如眼內、鼻內、直腸、傷口中、皮膚上)、或口服遞送。
scFv-Fc二聚體通常會以醫藥組合物的形式投予，所述醫藥組合物可包含除scFv-Fc二聚體外的至少一個組分。因此醫藥組合物可包含藥學可接受的賦形劑、載體、緩衝劑、穩定劑或其他本領域技術人員所熟知的材料。此類材料應當是無毒的且應當不干擾活性成分的功效。此類材料可包括例如任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑、和吸收延遲劑。藥學可接受的載體的一些例子是水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等等，及其組合。在許多情況下，較佳在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇、如甘露醇、山梨醇，或氯化鈉。
藥學可接受的物質的其他例子是潤濕劑或輔助物質，如乳化劑、防腐劑、或緩衝劑，其增加儲藏期或有效性。
載體或其他材料的準確性質取決於投予途徑。對於靜脈內注射或在患處的注射而言，活性成分會是非經腸的可接受水溶液形式，其是無熱原的且具有合適的pK、等滲性、和穩定性。本領域那些相關技術能很好地製備合適的溶液，例如用等滲介質(如氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringer’s injection)、和乳酸林格氏注射液)來製備。可以包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。
可以將scFv-Fc二聚體配製於液體、半固體、或固體形式中，如液體溶液(例如可注射和可輸注(infusible)溶液)、分散液或懸浮液、粉劑、脂質體、和栓劑。較佳的形式取決於意欲投予的模式、治療應用、分子的理化特性、以及遞送途徑。配製物可以包括賦形劑、或賦形劑的組合，例如：糖、胺基酸和表面活性劑。液體配製物可以包括廣範圍的scFv-Fc二聚體濃度和pH。固體配製物可以藉由例如凍乾法、噴霧乾燥、或藉由超臨界流體技術的乾燥來生產。
可以將治療組合物配製為溶液、微乳液、分散液、脂質體、或其他適於高藥物濃度的有序結構。可以藉由將scFv-Fc二聚體與上述成分的一個或其組合合併於合適的溶劑中，然後過濾除菌，來製備無菌注射液。通常，藉由將活性化合物併入含有基本分散介質和其他來自上述的成分的無菌介質中，來製備分散液。在用於製備無菌注射液的無菌粉末的情況中，較佳的製備方法是真空乾燥法和凍乾法，其得到活性成分加任何額外想要的成分的粉末，所述想要的成分來自其先前經無菌過濾的溶液。例如，可以藉由使用包衣(如卵磷脂)、藉由維持分散液的粒度、或藉由使用表面活性劑來維持溶液的適當流動性。對注射組合物的延長的吸收可以藉由將延遲
吸收的藥劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)包含於組合物中來實現。
在一些具體實例中，可將活性化合物與載體一起製備，所述載體會保護scFv-Fc二聚體不被快速釋放，如控釋製劑，包括移植物、透皮貼片、和微囊化的遞送系統。可使用生物可降解的、生物可相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯類、和聚乳酸。許多用於製備此類製劑的方法是獲准專利或是本領域技術人員普遍知曉的。
使用scFv-Fc二聚體的方法可包括引起或允許對TGFβ的結合。這種結合可以在體內發生，例如在對患者投予scFv-Fc二聚體後發生，或其可以在體外發生，例如在ELISA、Western印跡、免疫細胞化學法、免疫沉澱法、親和色譜法、或基於細胞的測定中發生，或在基於活體外(ex vivo)的治療方法中發生，例如其中將細胞或體液活體外與scFv-Fc二聚體接觸然後投予於患者之方法。
提供包含scFv-Fc二聚體的套組。可將scFv-Fc二聚體進行標記以允許其在要確定的樣品中的反應性。例如，可在診斷分析中採用所述套組。套組可含有用於使用組分的說明。用於幫助此種方法或使其能夠實施的輔助材料可包含在套組內。
scFv-Fc二聚體在樣品中的反應性可藉由任何合適的方法來確定，例如放射免疫測定法(RIA)。可將帶放射性標記的抗原與未標記的抗原(測試樣品)混合並允許其結合至scFv-Fc二聚體。將結合的抗原與未結合的抗原物理性地分離，並確定結合至scFv-Fc二聚體的放射性抗原的量。也可用非放射性抗原來使用競爭性結合測定，其使用連接至報告分子的抗原或類似物。所述報告分子可以是螢光染料、磷光體(phosphor)、或染料。合適的螢光染料包括螢光素、羅丹明、藻紅蛋白、和德州紅(Texas Red)。合適的
發色染料包括二胺基聯苯胺。
其他報告子包括大分子膠原顆粒或微粒材料如膠乳球(其是有色的、磁性的或順磁性的)，以及生物或化學活性劑，其能直接或間接引起可檢測信號被視覺觀察到、電子地檢測到，或以其他方式記錄到。例如，這些分子可以是催化反應的酶，所述反應顯出顏色或改變顏色或是引起電特性的變化。它們可以是分子可激動性的(molecularly excitable)，從而能態之間的電子躍遷導致特有的光譜吸收或發射。它們可以包括連同生物傳感器一起使用的化學實體。可採用生物素/抗生物素蛋白或生物素/鏈黴抗生物素蛋白和鹼性磷酸酶檢測系統。抗體-報告子接合物產生的信號可用於產生樣品中相關抗體結合的可量化絕對或相對數據。
本發明還提供scFv-Fc二聚體用於測量競爭測定中抗原水平的用途。可將scFv-Fc二聚體連接至報告子分子，從而在結合時發生例如物理學或光學變化。報告子分子可以直接或間接地產生可檢測的，較佳為可測量的信號。報告子分子的連接可以是直接或間接的、共價的(例如經肽鍵連接)或非共價的。scFv-Fc二聚體和蛋白報告子可經由肽鍵連接並重組表現為融合蛋白。
本發明進一步的方面和具體實例根據本揭示內容對於本領域技術人員而言會是明顯的，包括如下實驗例示。
本附圖在此用於描述的目的，而不用於限制本發明的範圍。
圖1描繪多種形式的一般結構。
圖2描繪Biacore TGFβ1結合測定的結果，其顯示當scFv(CAT191)轉變為全長IgG4(CAT192)分子時親和性的損失。
圖3顯示A549細胞生物測定的結果，該測定比較多種抗體構築體對
TGFβ1刺激的IL-11生產之抑制性作用：scFv雙抗體5aa(SEQ ID NO：14)；CAT191(scFv)(SEQ ID NO：12)；CAT191(scFv-Fc)(SEQ ID NO：9)；和CAT192(IgG4)(輕鏈SEQ ID NO：10和重鏈SEQ ID NO：11)。
圖4描繪藥物動力學測試的結果，以確定CAT191(scFv-Fc)在靜脈內(IV)投予後的半衰期。
圖5描繪藥物動力學測試的結果，其確定CAT191(scFv-Fc)在腹膜內(IP)投予後的半衰期。
圖6顯示製備自CHO細胞的CAT191(scFv-Fc)的TGFβ1特異性的結合結果。
圖7顯示製備自CHO細胞的CAT191(scFv-Fc)的基於細胞的效力測定結果。
CAT192(IgG4)(美替木單抗)是選擇性中和TGF-β1的人IgG4單株抗體。將TGF-β1(20-600RU)用NHS/EDC化學固定化至Biacore上的CM5芯片。將多個量的CAT192的注射在表面上，以監測其對TGFβ1的結合，其藉由表面等離子體共振來確定。用1：1結合模型來分析數據，以確定結合常數。如藉由表面等離子體共振所確定的，當與親代CAT191 scFv的結合相比時，發現CAT192(IgG4)以相對低的親和性結合TGFβ1，如圖2中所示。CAT192(IgG4)還在基於A549細胞的效力測定中顯示出相對低的效力(IC50=~10nM)，所述效力測定測量對TGFβ1刺激的IL-11生產的抑制。A549測定的代表性結果示於圖3中。A549測定是根據Rapoza等(2006)“Development of an in vitro potency assay for therapeutic TGFβ antagonists：the A549 cell bioassay,”J.Immunol.Methods 316：18-26中揭示的步驟進行的。當
明顯的~10nM的離解常數顯示出對TGFβ1的特異性結合，CAT192(IgG4)的治療應用會從較高的相對效力獲益。
CAT192(IgG4)親和性能被一些變性條件輕微地增強，這說明抗體折疊可能在scFv至IgG4的轉換過程中引起了親和性損失。已有人提出IgG4折疊是獨特的(Aalberse和Schuurman“IgG4 breaking the rules”,Immunology 105：9-19)。IgG4中的Fab臂交換和Fab與Fc CH2域的相互作用可能解釋了這種CAT192(IgG4)的親和性損失。因此，藉由用共有的IgG1序列替換IgG4 Fc(CH1、CH2和CH3域)，將CAT192重塑以產生IgG1版本。編碼CAT192(IgG1)的DNA自GeneArt合成並被次選殖至表現載體pCEP4(-E+I)Dest中。
從HEK293轉染產生CAT192(IgG1)並用Protein A柱將其純化。然而，將CAT192從IgG4重塑為IgG1不增加其親和性。產生自IgG1和IgG4的Fab片段也不增加其親和性。結論為CAT191(scFv)(SEQ ID NO：12)的高親和性在轉換為全長抗體形式的過程中有損失，無論其是IgG1還是IgG4。這是沒有預料到的，因為獲取自文庫的scFv組分通常被工程化為全長IgG形式，以用於治療開發。
用表面等離子體共振發現CAT191(scFv)(SEQ ID NO：12)以高親和性結合TGFβ1，但CAT191(scFv)缺乏TGFβ1的有效中和所需的親合力。因而，用scFv組分作為基本構件測試多種其他形式。抗體片段的通用形式(包括測試的形式)示於圖1中。
測試的形式包括雙抗體、亮胺酸拉鍊肽衍生的二聚體、和scFv-Fc二聚體。scFv CAT191雙抗體具有以短的5aa連接子(GSSGG)(SEQ ID
NO：19)替換的正常(Gly4Ser)3-型連接子以產生非共價二價結合體(雙抗體二聚體)。每個單體具有SEQ ID NO：14中所示序列。亮胺酸拉鍊肽衍生的二聚體的每個單體具有SEQ ID NO：16中所示序列。最後，scFv-Fc二聚體的每個單體具有SEQ ID NO：9中所示序列。所述雙抗體和肽衍生的二聚體表現於大腸桿菌中，並且scFv-Fc表現於HEK293細胞中。
亮胺酸拉鍊肽衍生的二聚體是難以表現的，並且部分純化的二聚體僅顯示中等親和性，如表面等離子體共振所測量。雙抗體(scFv 5aa)僅顯示中等親和性，但沒有親合力。相比之下，發現產生自瞬時HEK293轉染的scFv-Fc二聚體以高親和性和親合力特異性地結合至TGFβ1。藉由表面等離子體共振獲得的表示為表觀離解常數的結合結果概括於下表2中。
還在基於A549細胞的生物測定中比較多種形式的TGFβ1中和效力。圖3顯示雙抗體(“scFv雙抗體5aa”)、CAT191(scFv)(“scFv”)、scFv-Fc二聚體(“CAT191(scFv-Fc”)、和CAT192(IgG4)(“CAT192”)的A549生物測定結果。如圖3中所見，scFv-Fc二聚體在此項測定中顯示出比CAT192低了超過4個數量級(~10-3nM對~101nM)的表觀離解常數。
在CHO細胞中以較大的規模選殖和產生CAT191(scFv-Fc)。用基因特異性的正向和反向引子組從基於pCEP4的表現載體來PCR擴增CAT191 scFv-Fc編碼序列。作為PCR擴增的一部分，將如下變化引入至CAT191 scFv-Fc編碼序列：1)在5’和3’末端處添加內切核酸酶位點，2)
在起始密碼子的緊鄰上游添加Kozak共有序列，3)將“TAG”終止密碼子變為“TAA”，及4)將終止密碼子上游的胸腺嘧啶核苷4核苷酸突變為鳥嘌呤核苷，從而消除內源的剪接供體位點。所述剪接供體位點突變不導致胺基酸變化。
將PCR擴增的CAT191編碼序列次選殖至穿梭載體中，以幫助序列驗證和分子選殖。在序列驗證後，將CAT191編碼序列選殖至Genzyme表現載體pGZ600和pGZ620中。兩個載體都使用倉鼠β-肌動蛋白啟動子來驅動CAT191轉基因的表現。它們還含有DHFR選擇標誌物，其由單獨的啟動子(SV40)驅動，從而能夠在CHO細胞中進行選擇。用pGZ600-CAT191或pGZ620-CAT191表現質體轉染CHO-8D6宿主細胞系。在簡短的回收期後，將經轉染的細胞置於缺乏核苷酸的用於選擇的生長培養基中以產生穩定轉染子的匯合物(pools)。在從選擇回收匯合物後，在20nM胺甲喋呤的存在下進行第二輪選擇。將以此種方式選出的CHO匯合物按比例增加，並將經調適的培養基用於使用Protein A柱純化。
CHO細胞產生的蛋白藉由SDS-PAGE、Biacore結合、SEC-HPLC及A549細胞效力測定來特徵化。結果證實scFv-Fc二聚體具有較高的親和性和效力，並且其特異性地中和TGFβ1。所述效力有利地相比於泛特異性的GC1008抗體(圖6和圖7)。
在小鼠模型中用表3中所示的研究設計測試CAT191(scFv-Fc)的循環半衰期。
在腹膜內(IP)或靜脈內(IV)投予後指定時間從眼球後血管叢(retro-orbital plexus)採血。收集約60μL的全血於血細胞比容管內並加工為血清。所有樣品儲存於-80℃直至分析。藉由ELISA測定CAT191(scFv-Fc)濃度。此藥物動力學研究的結果示於圖4和圖5中。結果表明1.5-2.0天的循環半衰期，這比典型的scFv分子要長得多，後者僅為數小時。
藉由SEC-HPLC、Biacore TGFβ1結合、及A549效力測定對儲存於-80℃的CAT191(scFv-Fc)的穩定性監測一年。在測試期間對聚集、親和性、或效力未觀察到變化。儲存於4℃的材料在一年表現出輕微但穩定的聚集增加。較小的尺寸、高選擇性、針對TGFβ1的效力、及長體內半衰期的獨特組合使CAT191(scFv-Fc)成為用於治療應用的理想候選物。
本文全文引用的所有文獻，包括但不限於科學出版品、專利及專利申請出版品，在此以參考方式併入本揭示內容中，如同其完整內容再現於此。
序列表
SEQ ID No.1：人IgG1 VH域選殖株SL15(SQN4 US6492497)
SEQ ID No.2：人IgG1 VH域選殖株JT182(SQN10 US6492497)
SEQ ID No.3：合成連接子SGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID No.4：合成連接子GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID No.5：人IgG1 Vκ域選殖株SL15A：(SQN6 US6492497)
SEQ ID No.6：人IgG1 Vκ域選殖株SL15S：(SQN8 US6492497)
SEQ ID No.7：人IgG1鉸鏈區PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
SEQ ID No.8：人IgG1 Fc區
SEQ ID No.9：CAT191(scFv-Fc)
SEQ ID No.10：CAT192(IgG4)輕鏈
SEQ ID No.11：CAT192(IgG4)重鏈
SEQ ID No.12：CAT191(scFv)
SEQ ID No.13：雙抗體-5aa編碼核酸
SEQ ID No.14：雙抗體-5aa
SEQ ID No.15：亮胺酸拉鍊肽衍生的二聚體編碼核酸
SEQ ID No.16：亮胺酸拉鍊肽衍生的二聚體
SEQ ID No.17：CAT191(scFv-Fc)編碼核酸
SEQ ID No.18：人TGFβ1
SEQ ID No.19 GSSGG
SEQ ID No.20 GGSG
SEQ ID No.21 CPPCP
SEQ ID No.22 SYGMH
SEQ ID No.23 VISYDGSIKYYADSVKG
SEQ ID No.24 TGEYSGYDTSGVEL
SEQ ID No.25 TGEYSGYDTDPQYS
SEQ ID No.26 TGFYSGYDTPASPD
SEQ ID No.27 RASQGIGDDLG
SEQ ID No.28 GTSTLQS
SEQ ID No.29 LQDSNYPLT
SEQ ID No.30 TGX1YSGYDTX2X3X4X5X6
<110> 美商健臻公司(Genzyme Corporation)
<120> 具有高親和性、結合性及專一性之結合轉形生長因子-β1的scFV-Fc二聚體(SCFV-FC DIMERS THAT BIND TRANSFORMING GROWTH FACTOR-Betal WITH HIGH AFFINITY,AVIDITY AND SPECIFICITY)
<150> 62/128133
<151> 2015-03-04
<160> 30
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
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<400> 28
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 其他特徵
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為任何自然發生的胺基酸
<220>
<221> 其他特徵
<222> (10)..(14)
<223> Xaa可為任何自然發生的胺基酸
<400> 30
Claims (10)
- 一種選擇性地結合TGFβ1的分離的結合蛋白，其中該結合蛋白為由從N末端至C末端具有下式之多肽鏈所形成之二聚體：(VH域)-(連接子1)-(VL域)-(連接子2)-(鉸鏈)-(Fc區)，其中該VH域包含具有SEQ ID NO：22的胺基酸序列之重鏈互補決定區(HCDR)1、具有SEQ ID NO：23的胺基酸序列之HCDR2及具有SEQ ID NO：25的胺基酸序列之HCDR3；及該VL域包含具有具A2S取代的SEQ ID NO：27的胺基酸序列之輕鏈互補決定區(LCDR)1、具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列之LCDR2及具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列之LCDR3；該連接子1為[G4S]3-型連接子；該連接子2為SEQ ID NO：20或其變體，其中該變體與SEQ ID NO：20的差異為一至四個胺基酸的長度，或與SEQ ID NO：20的差異為具有至多兩個由甘胺酸至絲胺酸或由絲胺酸至甘胺酸之胺基酸取代；該鉸鏈包含來自人類IgG1或IgG4鉸鏈區之胺基酸序列，或SEQ ID NO：7或21之胺基酸序列；且該Fc區源自於人IgG1或人IgG4。
- 如請求項1的分離的結合蛋白，其中該VH域包含SEQ ID NO：1中所示的人VH域序列；且該VL域包含SEQ ID NO：6中所示的人Vκ域序列。
- 如請求項1的分離的結合蛋白，其中該連接子1包含胺基酸序列SGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：3)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：4)。
- 如請求項1的分離的結合蛋白，其中該連接子2為SEQ ID NO：20。
- 如請求項1的分離的結合蛋白，其中該多肽鏈包含SEQ ID NO：9中所示的胺基酸序列。
- 如請求項1的分離的結合蛋白，其中該分離的結合蛋白具有至少一種下列的特性：a)在A549生物測定中具有針對人TGFβ1的低於1nM的IC50；b)展現出比針對人TGFβ2的Kd低至少約50%之針對人TGFβ1的Kd，如藉由表面等離子體共振測得；及c)展現出比針對人TGFβ3的Kd低至少約50%之針對人TGFβ1的Kd，如藉由表面等離子體共振測得。
- 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項1至6中任一項的分離的結合蛋白以及藥學可接受的賦形劑。
- 一種如請求項1至6中任一項的分離的結合蛋白或如請求項7的醫藥組合物之用途，其係製造用於在需要的人中抑制TGFβ1活性之藥物。
- 如請求項8的用途，其中該人類具有選自下列組成之群組的疾病：纖維化疾病、癌症及免疫介導的疾病。
- 如請求項8的用途，其中該疾病是彌散性皮膚系統性硬化病(diffuse cutaneous systemic sclerosis)、骨重塑疾病或腎病。
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