KR20220033504A - 흉선 기질 림프포이에틴(tslp)-수용체 신호전달을 방해하는 제제 - Google Patents

흉선 기질 림프포이에틴(tslp)-수용체 신호전달을 방해하는 제제 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은(인간) 흉선 기질 림포포이에틴(TSLP)에 특이적으로 결합하여 중화하는 항체(예를 들어, 인간 항체) 및 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 이러한 분자는 항체 반감기를 증가시키고, 프로테아제에 대한 내성을 증가시키고/거나 Fc 감마 수용체와 상호작용하는 능력을 감소시키는 변형된 Fc 영역을 가질 수 있다. 이들 분자는 TSLP 관련 장애 및 질병과 관련된 알레르기 및 비알레르기성 염증의 치료에 유용하다.

Description

흉선 기질 림프포이에틴(TSLP)-수용체 신호전달을 방해하는 제제
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 7월 11일에 출원된 미국 가출원 제 62/873,051호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
전자 출원된 텍스트 파일에 대한 설명
본 명세서에 전자 출원된 텍스트 파일의 내용은 그 전문이 참조로 혼입된다: 컴퓨터 판독 가능한 형태의 서열 목록 사본(파일명: TABI_002_01WO_SeqList_ST25. 기록 날짜: 2020년 7월 3일, 파일 크기 49킬로바이트).
흉선 기질 림포포이에틴(Thymic stromal lymphopoietin), TSLP는 면역 반응의 조절 및 조혈 세포의 분화에서 중요한 역할을 하는 인터루킨(interleukin) 7 유사 사이토카인(cytokine)이다. TSLP는 폐, 피부 및 장의 상피 세포, 흉선 수질의 Hassall 소체, 점막 관련 림프 조직 및 편도선에서 광범위하게 발현된다(문헌[Liu, Soumelis et al. 2007, Rochman 및 Leonard 2008, Sokol, Barton et al. 2008]). 높은 TSLP 발현 수준은 폐, 골격근, 신장, 비장, 난소, 소장 및 결장의 발현 수준과 비교하여 심장, 간, 비장 및 전립선에서 발견된다(문헌[Quentmeier, Drexler et al. 2001]).
상피 세포 유도 사이토카인은 환경 및 전염증 자극에 반응하여 생산된다. 이는 단핵구로부터 케모카인을 유도하는 T 세포의 방출을 유도하고 골수성 수지상 세포의 성숙을 향상시킨다. 흉선 내에서 TSLP는 골수성 및 형질세포양 수지상 세포를 활성화하여 조절 T 세포를 생산한다. TSLP는 수지상 세포, T 및 B 세포에 대한 활성과 항원 특이적 Th2 세포에 의한 사이토카인 생산을 통해 2형(Th2, T2) 면역을 조절하는데 중요하다(문헌[Ziegler, Roan et al. 2013]).
TSLP는 흉선 기질 림프포이에틴 수용체(TSLPR) 및 IL-7R 알파 사슬로 구성된 이종이량체 수용체 복합체를 통해 신호를 전달한다(문헌[Verstraete, van Schie et al. 2014]). 수용체 복합체에 결합하면 TSLP는 다중 신호 전달 경로를 활성화할 수 있다(문헌[Zhong, Sharma et al. 2014]). TSLP에 의한 IL7R/TSLPR 복합체의 자극은 야누스 키나제(JAK)의 인산화 및 활성화를 유도한다. 활성화된 JAK는 결과적으로 STAT1, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b 및 STAT6을 포함하는 다중 전사(STAT) 인자의 활성을 조절한다. AKT1, ERK1/2, JNK, 리보솜 단백질 S6 키나제 및 4E-BP1과 같은 다수의 다른 단백질 또한 TSLP 자극에 의해 활성화된다. 또한, 인단백질체 분석은 TSLP가 SHP-1 및 SHP-2와 같은 키나제 및 단백질 포스파타제를 포함한 226개 단백질의 인산화를 조절할 수 있음을 보여준다.
TSLP는 염증 전달계의 개시에 관여하는 것으로 알려져 있으며 알레르기성 천식, 아토피 피부염, 알레르기성 비염, 궤양성 대장염 및 많은 만성 섬유증식성 장애를 포함하는 만성 질병의 발병에 관여할 수 있다(문헌[Vannella, Ramalingam et al. 2016]). 또한 연구에 따르면 TSLP가 감염(문헌[Piliponsky et al. 2016]), 암(문헌[De Monte et al. 2011]), 자가면역(문헌[Moret et al. 2011])을 포함하는 면역 장애뿐만 아니라, 선천성 및 후천성 면역 반응(문헌[Ziegler, Roan, 2013; Headley et al. 2009])에 관여하는 것에 제시된다.
TSLP는 알레르기성 염증, 특히 2형 염증 경로의 주 조절인자이며, 따라서 천식 치료를 위한 유망한 표적이었다. 천식은 기관지 내부의 점액 생산 증가와 함께 기관지의 염증을 특징으로 하는 장애이다. 천식이 있는 사람들은 일반적으로 호산구 침윤과 함께 만성 기도 과민성으로 인해 기침, 쌕쌕거림, 숨가쁨, 가슴 답답함, 통증 또는 압력과 같은 증상을 경험한다(문헌[Ohta, Nagase et al. 2017]). 중증 천식이 있는 일부 환자는 경구 글루코코르티코이드의 존재 또는 부재 하에 고 투여량 흡입 글루코코르티코이드를 지속적으로 치료했음에도 불구하고 지속적인 호산구성 염증과 관련된 악화가 빈번한다. 기존 치료에 반응하지 않는 특정 비율의 난치성 천식 환자는 비호산구, 비 Th2 세포 집합으로 인해 중증 증상을 보인다. TSLP 발현은 건강한 대조군보다 천식 환자의 기도에서 더 높으며 그 수준은 Th2 사이토카인 및 케모카인 발현 및 질병 중증도와 상관관계가 있다(문헌[Gauvreau, O'Byrne et al. 2014]). 보다 최근에, 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 인간 항-TSLP IgG2 항체인 테제펠루맙(Tezepelumab)(AMG 157)이 비제어 천식(uncontrolled asthma)에 대한 임상 시험에 있다(문헌[(Comeau, DESMEDT et al. 2006)(Comeau, Smothers et al. 2012)(Corren, Parnes et al. 2017)]).
TSLP를 표적화하는 것 외에도, IL-5에 대한 3개의 mAb가 중증 천식 및 호산구성 표현형 환자에 대해 승인되었으며, 메폴리주맙(Mepolizumab) 및 레슬리주맙(Reslizumab)은 IL-5에 직접 결합하고 벤랄리주맙(Benralizumab)은 IL-5 수용체에 결합한다(문헌[(Ortega, Liu et al. 2014)(Castro, Zangrilli et al. 2015)(Bleecker, FitzGerald et al. 2016)]). IL-4 수용체 알파 사슬에 결합하고 IL-4와 IL-13 모두의 결합을 방지하는 항체인 두필루맙(Dupilumab)은 중등도 내지 중증의 호산구성 천식 환자에 대해 승인되었다(문헌[Castro, Corren et al. 2018]). 특히, 이러한 모든 치료 항체는 더 낮은 수준의 환자에 비해 T2 바이오마커의 수준이 증가하는 환자에서 더 효과적인 것으로 보인다.
다른 비알레르기성 질병 및 다수의 섬유증 병태(condition)에서 TSLP의 유병률 또한 요법 치료에서 정당한 것으로 고려되어야 한다(문헌[Ying, Zhang 2015]). 자가면역질병인 전신경화증에서 TSLP는 혈관주위 부위와 피부의 면역세포에서 많이 발현된다. TSLP는 전신 경화증 환자의 피부 상피 세포, 비만 세포 및 섬유아세포에서 상향조절된다(문헌[Usategui, Criado et al. 2013]). TSLP 및 이의 수용체는 중증 섬유성 폐 질병인 특발성 폐 섬유증 환자의 폐에서 강하게 발현된다(문헌[Datta, Alexander et al. 2013]). 섬유성 피부 질병에서 진피 섬유아세포는 켈로이드 조직의 TGFβ에 반응하여 높은 수준의 TSLP를 생산한다.
치료 표적으로서 TSLP에 대한 추가 지원은 TSLP가 다양한 종양의 개시 및 진행에 관여한다는 발견에서 비롯된다. 여기에는 고형 종양(예를 들어, 유방, 결장 및 췌장)과 혈액 종양(예를 들어, B 세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL))이 포함된다(문헌[Corren, Ziegler 2019]). Th2형 반응을 나타내는 종양은 일반적으로 Th형 반응이 우세한 종양보다 예후가 더 나쁘다. 종양 세포는 암 관련 섬유아세포에 의한 TSLP 발현에 필요한 Il-1α 및 IL-1β를 분비하는데, 이는 종양 및 종양 미세환경이 TSLP 유도에 중요함을 시사한다. 인간 자궁경부암 세포, 위암 및 난소암에 대한 연구는 또한 종양 및 기질에 침투하는 조혈 세포와 종양 자체 사이에 TSLP 매개 혼선이 있다는 증거를 제공한다.
TSLP가 암에서 중요한 역할을 하지만, 프로 또는 항종양 인자로서의 기능은 종양의 유형에 따라 다르다. 전이성 유방암에서 TSLP는 집중 연구 영역이지만 마우스 모델과 인간 유방암 세포주에서 모순되는 결과가 있었다. 유사하게, 피부 종양에서 TSLP의 역할은 이분법적이다. B-ALL에서 TSLP의 역할은 예후가 불량한 환자의 50 내지 60%에서 발생하는 TSLP 신호전달 경로의 구성요소를 인코딩(encoding)하는 유전자에 돌연변이가 있는 유전적 병변의 존재로 인해 복합적이다(문헌[Corren, Ziegler 2019]).
이러한 관찰은 인간 질병에서 TSLP의 중요한 역할을 시사하고, TSLP 및 TSLP 수용체 신호전달 경로의 파괴는 효과적인 치료가 부재하는 질병에 대해 임상적 이점을 가질 수 있다. 예를 들어 천식의 경우 천식 관련 증상으로 인한 사망률은 전 세계적으로 연간 약 250,000명이며 그 수는 2025년까지 1억명 이상 증가할 것으로 예상된다(문헌[Pawankar 2014]). 알레르기성 천식이 있는 사람들은 종종 당뇨병, 비만, 심혈관 질병, 위식도 질병과 같은 다른 병태를 가지고 있어 더 복합적이고 더 나쁜 결과를 초래한다. 천식 환자의 약 70%는 알레르기가 있다. 알레르기 질병에는 아나필락시스(anaphylaxis), 식품 알레르기, 특정 형태의 천식, 비염, 결막염, 혈관부종, 두드러기, 아토피 피부염, 습진, 호산구성 식도염을 포함한 호산구성 장애 및 약물 및 곤충 알레르기가 포함된다(문헌[(Pawankar 2014)(Kay 2001)]).
높은 의료 비용, 이환율, 삶의 질에 대한 영향, 결근, 열악한 작업 성과, 알레르기 및 비알레르기 질병을 가진 환자 인구 증가로 인해 의심할 여지 없이 Th2 사이토카인 관련 염증을 감소시킬 상당한 필요성이 있다. TSLP 수용체 결합 및 신호전달을 방해하고 적절한 효능 및 약동학적 프로파일을 갖는 중화 항체 분자와 같은 제제(agent)는 만성 염증 병태와 관련된(고 T2 및 저 T2 모두) 증상 억제에 대한 충족되지 않은 요건이다.
본 개시내용은 흉선 기질 림포포이에틴, TSLP에 특이적으로 결합하고 이의 적어도 하나의 활성을 중화, 억제, 차단, 제거(abrogating), 감소 또는 방해하는 단일클론 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 단편에 의해 중화, 억제, 차단, 제거, 감소 또는 방해될 수 있는 TSLP의 활성은 다음에 제한되는 것은 아니나, 이의 수용체 복합체의 TSLP 활성화의 중화 등을 포함한다. 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체, 예를 들어 마우스 단일클론 항체 또는 인간화 항체이다. 실시양태에서, 항체는 항원-결합 항체 단편이다.
본 개시내용은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 TAVO202로 지정된 인간 TSLP에 대한 마우스 단일클론 항체를 제공한다.
본 개시내용은 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 지정된 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 TAVO202의 중쇄 가변 영역을 제공한다.
본 개시내용은 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 지정된 3개의 CDR을 포함하는 TAVO202의 경쇄 가변 영역을 제공한다.
본 개시내용은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 202H2로 지정된 TAVO202의 하나의 인간화 중쇄 가변 영역을 제공한다.
본 개시내용은 각각 서열번호 10 및 서열번호 11에 세지된 아미노산 서열을 갖는 202L3 및 202L4로 지정된 TAVO202의 2개의 인간화 경쇄 가변 영역을 제공한다.
실시양태에서, 본 개시내용은 각각 서열번호 3, 서열번호 4 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 따른 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 실시양태에서, 인간화 항체는 서열번호 9에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 실시양태에서, 인간화 항체는 서열번호 10 또는 서열번호 11에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
비제한적인 예로서, 본 개시내용은 서열번호 12에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호 13에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 TAVO6264로 지정된 인간 IgG2 Fc를 갖는 인간화 중쇄 가변 영역 202H2 및 인간화 경쇄 가변 영역 202L3을 포함하는 TAVO202에 대한 제1 인간화 항체를 제공한다.
본 개시내용은 서열번호 12에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호 14에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 TAVO6265로 지정된 인간 IgG2 Fc를 갖는 인간화 중쇄 가변 영역 202H2 및 인간화 경쇄 가변 영역 202L4를 포함하는 TAVO202에 대한 제2 인간화 항체를 제공한다.
본 개시내용은 서열번호 15에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호 13에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 TAVO7264로 지정된 L234F, L235E, D265A, F405L 돌연변이된 인간 IgG1 Fc를 갖는 인간화 중쇄 가변 영역 202H2 및 인간화 경쇄 가변 영역 202L3을 포함하는 TAVO202에 대한 제3 인간화 항체를 제공한다.
본 개시내용은 서열번호 15에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호 14에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 TAVO7265로 지정된 L234F, L235E, D265A, F405L 돌연변이된 인간 IgG1 Fc를 갖는 인간화 중쇄 가변 영역 202H2 및 인간화 경쇄 가변 영역 202L4를 포함하는 TAVO202에 대한 제4 인간화 항체를 제공한다.
본 개시내용은 서열번호 16에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호 13에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 TAVO9764로 지정된 L234A, L235A, M428L, N434S 돌연변이된 인간 IgG1 Fc를 갖는 인간화 중쇄 가변 영역 202H2 및 인간화 경쇄 가변 영역 202L3을 포함하는 TAVO202에 대한 제5 인간화 항체를 제공한다.
본 개시내용은 서열번호 16에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호 14에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 TAVO9765로 지정된 L234A, L235A, M428L, N434S 돌연변이된 인간 IgG1 Fc를 갖는 인간화 중쇄 가변 영역 202H2 및 인간화 경쇄 가변 영역 202L4를 포함하는 TAVO202에 대한 제6 인간화 항체를 제공한다.
항-TSLP 단일클론 항체는 전장의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 항체일 수 있고, 또는,(예를 들어, 인간) TSLP에 특이적으로 결합하고, TSLP의 적어도 하나의 활성을 중화, 억제, 차단, 제거, 감소 또는 방해하는 Fab, F(ab')2, 또는 scFv 단편을 포함하는 항원 결합 부분만을 포함할 수 있다. 항체 골격은 기능에 영향을 미치기 위해, 예를 들어 나머지 효과기(effector) 기능을 제거하기 위해 변형될 수 있다.
본 개시내용은 또한 야생형 항체와 비교하여 연장된 반감기를 갖는 항-TSLP 단일클론 항체를 제공한다. 반감기의 연장은 모 야생형 항체와 비교하여, EU 인덱스(EU index)에 따른 잔기 넘버링(residue numbering)으로, M252Y/S254T/T256E, M428L/N434S, T250Q/M428L, N434A 및 T307A/E380A/N434A로부터 선택되는 돌연변이 중 임의의 한 세트로 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 조작함으로써 실행될 수 있다.
본 개시내용은 또한 잔기 222 내지 237(EU 넘버링) 사이 또는 상기 잔기에서 야생형 항체를 절단하는 프로테아제에 의한 단백질분해적 분해(proteolytic degradation)에 대한 내성이 향상된 항-TSLP 단일클론 항체를 제공한다. 단백질분해적 분해에 대한 내성은 모 야생형 항체와 비교하여, EU 인덱스에 따른 잔기 넘버링으로, G236이 결실된 힌지 영역에서 E233P/L234V/L235A 돌연변이를 조작함으로써 실행될 수 있다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(vector)를 제공한다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 항-TSLP 단일클론 항체를 생산하는 방법으로서 항체가 발현되는 조건 하에 본 개시내용의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체를 정제하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 항-TSLP 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한 항-TSLP 항체의 결합을 검출하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 TSLP와 이의 수용체 TLPR의 결합을 차단하는 방법으로서, TSLPR을 본 명세서에 제공된 항-TSLP 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 임의의 하나와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 천식을 치료하는 방법으로서, TSLP에 대해 제공된 항체의 치료적 유효량을 필요로 하는 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 COPD 및 특발성 폐 섬유증을 치료하는 방법으로서, TSLP에 대해 제공된 항체의 치료적 유효량을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 아토피 피부염의 증상을 치료하는 방법으로서, TSLP에 대해 제공된 항체의 치료적 유효량을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 습진의 증상을 치료하는 방법으로서, TSLP에 대해 제공된 항체의 치료적 유효량을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 호산구성 식도염과 같은 다른 알레르기 병태의 증상을 치료하는 방법으로서, TSLP에 대해 제공된 항체의 치료적 유효량을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 염증성 장 질병의 증상을 치료하는 방법으로서, TSLP에 대해 제공된 항체의 치료적 유효량을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 전신 경화증, 전신 특발성 폐 섬유증 및 켈로이드 질병과 같은 섬유증 병태를 치료하는 방법으로서, TSLP에 대해 제공된 항체의 치료적 유효량을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 암, 즉, 유방암, 췌장암, 결장직장암, 림프모구성 백혈병, 두경부암을 치료하는 방법으로서, TSLP에 대해 제공된 항체의 치료적 유효량을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
도 1:(A) 인간 및(B) 마우스 TSLP와 마우스 단일클론 항-인간 TSLP 항체 TAVO202의 결합.
도 2:(A). 인간 TSLP 수용체 복합체로 형질감염된 BAF 세포에서 인간 TSLP에 의한 자극 시 세포 증식의 반응.(B). TAVO202에 의한 투여량 의존적 중화 인간 TSLP 유도 세포 증식.
도 3:(A). 루시퍼라제 리포터 분석에서 인간 TSLP에 의한 자극 시 투여량 의존적 STAT5 리포터 유전자 발현.(B). 인간 TSLP 유도 리포터 유전자 발현 분석에서 TAVO202에 의한 리포터 유전자 발현의 투여량 의존적 중화.
도 4: 인간화 VH 및 VL 변이체를 갖는 TAVO202의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열 정렬. 인간화 항체는 인간화 VH 변이체(202H2) 및 2개의 인간화 VL 변이체(202L3 및 202L4)를 상이한 IgG Fc와 짝지음으로써 형성될 수 있다.
도 5:(A) 비환원 및(B) 환원 조건 하에서 예시적인 인간화 항-TSLP IgG 항체의 SDS-PAGE 분석.(C). 예시적인 항-TSLP IgG 항체의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석.
도 6:(A) 인간 및(B) 사이노몰구스(cynomolgus) TSLP와 예시적 인간화 항-TSLP IgG 항체의 결합.
도 7: STAT5 리포터 유전자 발현 분석에서 예시적인 인간화 항-TSLP IgG 항체에 의한 인간 TSLP 유도 리포터 유전자 활성화 중화.
도 8: 인간화 항-TSLP IgG 항체에 의해 2명의 공여체로부터 단리된 수지상 세포로부터 인간 TSLP 유도 CCL17 방출 중화.
도 9: pH 6.0에서 반감기 연장 Fc 돌연변이가 있는 인간화 항-TSLP IgG 항체 TAVO9765 및 이러한 돌연변이가 부재하는 TAVO7265와 마우스 FcRn의 결합.
도 10: 사이노몰구스 원숭이에서 항-TSLP 항체의 PK 특징. 반감기 연장을 위한 Fc 돌연변이를 갖는 항-TSLP 항체(TAVO9765)를 사이노몰구스 원숭이에 4 mg/kg 정맥내 투여량으로 투여하였다. 혈장 농도는 투여 후 35일까지의 시점에서 표시된다.
정의
본 명세서에서 사용된 용어는 단지 실시양태를 설명하기 위해 사용된 것으로 제한하고자 하는 것이 아니다. 달리 규정되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 개시내용을 기재하고 청구함에 있어서, 다음과 같은 용어가 사용될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")는 내용상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포"에 대한 언급은 둘 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
"항체"는 넓은 의미로 뮤린, 인간, 인간화 및 키메라 단일클론 항체를 포함하는 단일클론 항체, 항체 단편, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체, 이량체, 사량체 또는 다량체 항체, 단일 사슬 항체, 도메인 항체 및 요구되는 특이성의 항원 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 입체형태를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. "전장 항체 분자"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄 및 이의 다량체(예를 들어, IgM)로 구성된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(도메인 CH1, 힌지, CH2 및 CH3으로 구성됨)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이 산재된 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR 절편으로 구성되며, 아미노 말단에서 카복실 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 배열된다.
"상보성 결정 영역(CDR)"은 항체 내의 "항원 결합 부위"이다. CDR은 다양한 용어를 사용하여 규정할 수 있다:(i) 상보성 결정 영역(CDR), VH의 3개(HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 VL의 3개(LCDR1, LCDR2, LCDR3)는 서열 가변성을 기반으로 하고(문헌[(Wu and Kabat 1970)(Kabat, National Institutes of et al. 1991)]).(ii) "초가변 영역, "HVR" 또는 "HV", VH(H1, H2, H3)의 3개 및 VL(L1, L2, L3)의 3개는 초티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)에 의해 규정된 바와 같이 구조가 초가변인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다(문헌[(Chothia and Lesk 1987]). The International ImMunoGeneTics(IMGT) 데이터베이스(http://www_imgt_org)는 항원 결합 부위의 표준화된 넘버링 및 정의를 제공한다. CDR, HV 및 IMGT 서술 간의 관련성(문헌[Lefranc et al.(Lefranc, Pommie et al. 2003]에 기재되어 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CDR," "HCDR1," "HCDR2," "HCDR3," "LCDR1," "LCDR2" 및 "LCDR3"은 명세서에서 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 상기 기재된 방법, 카밧(Kabat), 초티아 또는 IMGT 중 임의의 것에 의해 규정된 CDR을 포함한다.
면역글로불린은 중쇄 불변 영역 아미노산 서열에 따라 5가지 주요 부류, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 구별될 수 있다. IgA 및 IgG는 동형(isotype) IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위 분류된다. 모든 척추동물 종의 항체 경쇄는 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 두 가지 명확하게 구별되는 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 지정될 수 있다.
"항체 단편"은 중쇄 및/또는 경쇄 항원 결합 부위, 예를 들어 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 2 및 3, 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 2 및 3, 중쇄 가변 영역(VH), 또는 경쇄 가변 영역(VL)을 보유하는 면역글로불린 분자의 일부를 지칭한다. 항체 단편에는 잘 알려진 Fab, F(ab')2, Fd 및 Fv 단편 및 하나의 VH 도메인으로 구성된 도메인 항체(dAb)가 포함된다. VH 및 VL 도메인은 VH 및 VL 도메인이 별도의 단일 사슬 항체 작제물에 의해 발현되어, 단일 사슬 Fv(scFv) 또는 디아바디와 같은 1가 항원 결합 부위를 형성하는 경우 VH/VL 도메인이 분자내에서 또는 분자간에 쌍을 이룰 수 있는 다양한 유형의 단일 사슬 항체 설계를 형성하기 위해 합성 링커를 통해 함께 연결될 수 있으며; 이는 예를 들어 국제 특허 공개 WO1998/44001, WO1988/01649, WO1994/13804 및 WO1992/01047에 기재되어 있다.
"단일클론 항체"는 항체 중쇄로부터 C-말단 리신의 제거와 같은 가능한 잘 알려진 변경을 제외하고 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄에 단일 아미노산 조성을 갖는 항체 집합을 지칭한다. 이중특이적 단일클론 항체가 2개의 별개의 항원 에피토프에 결합한다는 점을 제외하고 단일클론 항체는 통상적으로 하나의 항원 에피토프에 결합한다. 단일클론 항체는 항체 집합 내에서 이종 글리코실화될 수 있다. 단일클론 항체는 단일특이성 또는 다중특이성, 또는 1가, 2가 또는 다가일 수 있다. 이중특이적 항체는 단일클론 항체라는 용어에 포함된다.
"단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 부재하는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다(예를 들어, 예를 들어 TSLP에 특이적으로 결합하는 단리 항체는 TSLP 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 부재함).
"단리된 항체"는 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순도의 항체와 같이 더 높은 순도로 단리된 항체를 포함한다.
"인간화 항체"는 항원 결합 부위가 비인간 종으로부터 유래되고 가변 영역 프레임워크가 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 프레임워크가 발현된 인간 면역글로불린 또는 인간 면역글로불린 생식계열 유전자 서열의 정확한 카피가 아닐 수 있도록 프레임워크에 치환을 포함할 수 있다.
"인간 항체"는 프레임워크 및 항원 결합 부위 모두가 인간 유래의 서열로부터 유래되고 인간 대상체에게 투여될 때 최소 면역 반응을 나타내도록 최적화된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 항체가 불변 영역 또는 불변 영역의 일부를 포함하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 유래의 서열로부터 유래된다.
명세서 전체에 걸쳐 항체 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 문헌[Kabat et al.]에 기재된 바와 같은 EU 인텍스에 따른다(문헌[Kabat, National Institutes of et al. 1991]).
통상적인 1문자 및 3문자 아미노산 코드는 표 1에 나타낸 바와 같이 본 명세서에서 사용된다.
아미노산 3문자 코드 1문자 코드
알라닌 Ala A
아르기닌 Arg R
아스파라긴 Asn N
아스파테이트 Asp D
시스테인 Cys C
글루타메이트 Gln E
글루타민 Glu Q
글리신 Gly G
히스티딘 His H
이소류신 Ile I
류신 Leu L
리신 Lys K
메티오닌 Met M
페닐알라닌 Phe F
프롤린 Pro P
세린 Ser S
트레오닌 Thr T
트립토판 Trp W
티로신 Tyr Y
발린 Val V
폴리펩타이드(예를 들어, 항원 결합 단백질, 또는 항체)의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 폴리펩타이드 서열에 비해 아미노산 서열에 삽입, 결실 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 변이체는 본 명세서에 제공된 항체 또는 단편 또는 열거된 DNA 또는 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 단편에 대해 열거된 동일성 퍼센트를 갖는 항체 및 이의 단편을 포함한다.
"동일성"이라는 용어는 서열을 정렬하고 비교함으로써 결정되는 2개 이상의 폴리펩타이드 분자 또는 2개 이상의 핵산 분자의 서열 사이의 관계를 지칭한다. "동일성 퍼센트", "상동성 퍼센트", "서열 동일성" 또는 "서열 상동성" 등은 비교 분자 내의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 사이의 동일한 잔기의 퍼센트를 의미하며, 비교되는 분자의 가장 작은 것의 크기에 기반하여 계산된다. 이러한 계산을 위해 정렬의 간격(존재하는 경우)은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 처리되는 것이 바람직하다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩타이드의 동일성을 계산하기 위해 사용될 수 있는 방법은 문헌[Computational Molecular Biology,(Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I,(Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer,(Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073]에 기재된 것을 포함한다. 동일성 퍼센트를 계산할 때, 비교되는 서열은 일반적으로 서열 간에 가장 큰 일치를 제공하는 방식으로 정렬된다.
포유류 IgG 중쇄의 불변 영역 서열은 순서대로 CH1-힌지-CH2-CH3으로 지정된다. IgG의 "힌지", "힌지 영역" 또는 "힌지 도메인"은 일반적으로 EU 인덱스에 따라 인간 IgG1의 Glu216을 포함하고 Pro230에서 종결되는 것으로 규정되지만 기능적으로 사슬의 가요성 부분은 추가로 포함하는 것으로 고려될 수 있으며, Glu216 내지 Gly237과 같이 상부 및 하부 힌지 영역으로 지칭되는 잔기 및 하부 힌지는 FcγR 결합이 일반적으로 기인하는 Fc 영역의 잔기 233 내지 239로 지칭되었다. 다른 IgG 동형의 힌지 영역은 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫 번째 및 마지막 시스테인 잔기를 배치함으로써 IgG1 서열과 정렬될 수 있다. 경계가 약간 다를 수 있지만, EU 인덱스에 따른 넘버링으로, CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고 아미노 말단은 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 인접하며 면역글로불린 중쇄의 첫 번째(가장 아미노 말단) 불변 영역, 예를 들어 약 EU 위치 118 내지 215를 포함한다. Fc 도메인은 아미노산 231 내지 아미노산 447까지 연장되고; CH2 도메인은 약 Ala231 내지 Lys340 또는 Gly341까지이고 CH3은 약 Gly341 또는 Gln342 내지 Lys447까지이다. CH1 영역의 IgG 중쇄 불변 영역의 잔기는 Lys에서 종결된다. Fc 도메인 포함 분자는 항체 불변 영역의 적어도 CH2 및 CH3 도메인을 포함하고, 따라서 적어도 IgG 중쇄 불변 영역의 약 Ala231 내지 Lys447 영역을 포함한다. Fc 도메인 포함 분자는 선택적으로 힌지 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다.
"에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부분을 지칭한다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 다당류 측쇄와 같은 모이어티의 화학적 활성(예를 들어, 극성, 비극성 또는 소수성) 표면 기로 구성되며 특정 3차원 구조적 특성과 특정 전하 특성을 나타낼 수 있다. 에피토프는 입체형태 공간 단위를 형성하는 인접 및/또는 비인접 아미노산으로 구성될 수 있다. 비인접 에피토프의 경우, 항원의 선형 서열의 서로 다른 부분의 아미노산이 단백질 분자의 접힘을 통해 3차원 공간에서 근접하게 된다. 항체 "에피토프"는 에피토프를 확인하는데 사용되는 방법에 따라 다르다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "리더 서열"은 인간 B2M 리더를 포함하는 포유류 세포에 의해 처리될 수 있는 임의의 신호 펩타이드를 포함한다. 이러한 서열은 당업계에 잘 알려져 있다.
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호 혼용되며, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 코딩된 아미노산 및 코딩되지 않은 아미노산 또는 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩타이드 골격을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭한다. 이 용어는 또한 예를 들어 이황화 결합 형성, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 단백질 분해 절단 등과 같은 폴리펩타이드의 동시 번역(예를 들어, 신호 펩타이드 절단) 및 번역 후 변형된 폴리펩타이드를 포함한다. 추가로, 본 명세서에서 사용되는 "폴리펩타이드"는 단백질이 적절한 활성을 유지하는 경우, 천연 서열에 대한 변형, 예컨대 결실, 첨가 및 치환(당업자에게 공지된 바와 같이 일반적으로 자연적으로 보존적임)을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이러한 변형은 부위 지정 돌연변이 유발과 같이 의도적일 수 있거나 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭 또는 기타 재조합 DNA 방법으로 인한 오류와 같이 우발적일 수 있다.
핵산 분자를 설명하기 위해 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합"은 게놈, cDNA, 바이러스, 반합성 및/또는 합성 유래의 폴리뉴클레오타이드를 의미하며, 이는 유래 또는 조작으로 인해 자연에서 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합되지 않는다. 단백질 또는 폴리펩타이드와 관련하여 사용되는 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오타이드로부터의 발현에 의해 생산된 폴리펩타이드를 지칭한다. 숙주 세포 또는 바이러스와 관련하여 사용되는 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오타이드가 도입된 숙주 세포 또는 바이러스를 지칭한다. 재조합은 또한 물질(예를 들어, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터)과 관련하여 이종 물질(예를 들어, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터)의 도입에 의해 변형된 것을 지칭한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드", "핵산" 및 "핵산 분자"는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 포함하는 것으로 본 명세서에서 상호 혼용된다. 이 용어는 분자의 기본 구조만을 지칭한다.
"벡터"는 생물학적 시스템 내에서 복제될 수 있거나 이러한 시스템 사이에서 이동할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 벡터 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 벡터를 복제할 수 있는 생물학적 구성요소를 사용하여 세포, 바이러스, 동물, 식물 및 재구성된 생물학적 시스템과 같은 생물학적 시스템 내에서의 이러한 폴리뉴클레오타이드의 복제 또는 유지를 가능하게 하는 기능을 하는 복제, 폴리아데닐화 신호 또는 선택 마커의 유리와 같은 요소를 포함한다. 벡터 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 분자, cDNA, 또는 이의 혼성체, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
"발현 벡터"는 발현 벡터에 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드의 번역을 유도하기 위해 생물학적 시스템 또는 재구성된 생물학적 시스템에서 사용될 수 있는 벡터를 지칭한다.
"가"는 분자 내 항원에 특이적인 특정 수의 결합 부위의 존재를 지칭한다. 이와 같이, 용어 "1가", "2가", "4가" 및 "6가"는 분자 내의 항원에 대해 특이적인 각각 1, 2, 4 및 6개의 결합 부위의 존재를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 핵산 서열, 단백질 또는 폴리펩타이드와 관련하여 사용된 용어 "이종"은 이러한 분자가 이종 핵산 서열, 단백질 또는 폴리펩타이드가 유래된 세포에서 자연적으로 발생하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 인간 세포가 아닌 세포에 삽입되는 인간 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 그 상황에서 이종 핵산 서열이다. 이종 핵산은 상이한 유기체 또는 동물 종으로부터 유래될 수 있으며, 이러한 핵산은 이종성이기 위해 별도의 유기체 종으로부터 유래되어야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 일부 경우에, 합성 핵산 서열 또는 이로부터 인코딩된 폴리펩타이드는 세포가 이전에 합성 핵산을 포함하지 않았다는 점에서 그것이 도입된 세포에 이종성일 수 있다. 이와 같이, 합성 핵산 서열 또는 이로부터 인코딩된 폴리펩타이드는 예를 들어 합성 핵산 서열 또는 이로부터 인코딩된 폴리펩타이드의 하나 이상의 성분이 원래 인간 세포로부터 유래된 경우에도 인간 세포에 이종성인 것으로 고려될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "숙주 세포"는 생체내 또는 시험관내 진핵 세포 또는 단세포 개체로서 배양된 다세포 유기체(예를 들어, 세포주)로부터의 세포를 나타내며, 진핵 세포는 핵산(예를 들어, 본 개시내용의 다량체 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터)에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나 사용되었고, 핵산에 의해 유전자 변형된 원래 세포의 자손을 포함한다. 단일 세포의 자손은 자연적, 우발적 또는 의도적 돌연변이로 인해 형태나 게놈 또는 전체 DNA 보체에서 원래의 모체와 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있음을 이해한다.
"재조합 숙주 세포"("유전자 변형된 숙주 세포"로도 지칭됨)는 이종 핵산, 예를 들어 발현 벡터가 도입된 숙주 세포이다. 예를 들어, 유전자 변형된 진핵 숙주 세포는 이종 핵산, 예를 들어 진핵 숙주 세포에 대해 외래인 외인성 핵산, 또는 일반적으로 진핵 숙주 세포에 존재하지 않는 재조합 핵산을 적합한 진핵 숙주 세포 내로 도입함으로써 유전자 변형된다.
"특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "결합하다"는 다른 항원에 대한 것보다 더 큰 친화도로 특정 항원에 결합하는 항체를 지칭한다. 통상적으로, 항체는 결합에 대한 평형 해리 상수(KD)가 약 1Х10-8 M 이하, 예를 들어 약 1Х10-9 M 이하, 약 1Х10-10 M 이하, 약 1Х10-11 M 이하, 또는 약 1Х10-12 M 이하일 때 통상적으로 비특이적 항원(예를 들어, BSA, 카제인)에 대한 결합에 대한 KD보다 적어도 100배 적은 KD로 "특이적으로 결합"한다. KD는 표준 절차를 사용하여 측정할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는" 등은 적절한 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 획득하는 것을 지칭한다. 그 효과는 질병 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적일 수 있고/거나 질병 및/또는 질병에 기인할 수 있는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료"는 포유류, 예를 들어 인간의 질병의 임의의 치료를 포함하며,(a) 질병의 소인이 있을 수 있지만 아직 발병한 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질병이 발생하는 것의 예방;(b) 질병의 억제, 즉 질병의 발달 저지; 및(c) 질병 경감, 즉 질병의 퇴행 유발을 포함한다.
본 명세서에서 상호 혼용되는 용어 "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 다음에 제한되는 것은 아니나, 뮤린(예를 들어, 랫트, 마우스), 토끼목(예를 들어, 토끼), 인간이 아닌 영장류, 인간, 개과, 고양이과, 유제류(예를 들어, 말, 소, 양, 돼지, 염소) 등을 포함하는 포유류를 지칭한다.
"치료적 유효량" 또는 "유효량"은 질병을 치료하기 위해 포유류 또는 다른 대상체에게 투여될 때 질병에 대한이러한 치료에 영향을 미치기에 충분한 제제의 양 또는 두 제제의 조합된 양을 지칭한다. "치료 유효량"은 제제(들), 질병 및 이의 중증도 및 치료될 대상체의 연령, 중량 등에 따라 달라질 것이다.
본 개시내용이 추가로 설명되기 전에, 본 개시내용은 설명된 실시양태들에 제한되지 않으며, 그 자체가 물론 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 본 개시내용의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
항-TSLP 항체 및 항원 결합 단편의 조성
본 명세서에서는 TSLP에 특이적으로 결합하고 이의 적어도 하나의 활성, 예를 들어, 수용체 복합체에 대한 TSLP의 기능적 활성을 중화, 억제, 차단, 제거, 감소 또는 방해하는 단일클론 항체 및 이의 항원 결합 단편이 기재되어 있다. 항-TSLP 항체 및 항원 결합 단편은 TSLP 매개 질병을 치료하기 위해 대상체에 치료적으로 투여될 수 있다.
본 개시내용은 인간 흉선 기질 림포포이에틴(TSLP)에 특이적으로 결합하고, 이의 적어도 하나의 활성을 중화, 억제, 차단, 제거, 감소 또는 방해하는 마우스 하이브리도마 스크리닝으로부터 확인된, TAVO202로 지정된 마우스 단일클론 항체를 제공한다. TAVO202는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. TAVO202의 중쇄 가변 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 지정된 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며, 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 각각 제시된다. TAVO202의 경쇄 가변 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 지정된 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며, 아미노산 서열은 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 각각 제시된다.
항-인간 TSLP 마우스 단일클론 항체 TAVO202의 중쇄 가변 영역 서열(서열번호 1)
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYTFSSYWVNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTDYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGTYYNNYYGTDYWGQGTSVTVSS
중쇄의 3개의 CDR의 서열은 밑줄 표시되어 있다.
항-인간 TSLP 마우스 단일클론 항체 TAVO202의 경쇄 가변 영역 서열(서열번호 2)
EIVLTQSPALMAASPGEKVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKSETSPKPWIYGTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGGGTKLEIK
경쇄의 3개의 CDR의 서열은 밑줄 표시되어 있다.
항-인간 TSLP 마우스 단일클론 항체 TAVO202의 HCDR1 서열(서열번호 3)
GYTFSSYWVN
항-인간 TSLP 마우스 단일클론 항체 TAVO202의 HCDR2 서열(서열번호 4)
QIYPGDGDTD
항-인간 TSLP 마우스 단일클론 항체 TAVO202의 HCDR3 서열(서열번호 5)
GTYYNNYYGTDY
항-인간 TSLP 마우스 단일클론 항체 TAVO202의 LCDR1 서열(서열번호 6)
SVSSSISSSNLH
항-인간 TSLP 마우스 단일클론 항체 TAVO202의 LCDR2 서열(서열번호 7)
GTSNLAS
항-인간 TSLP 마우스 단일클론 항체 TAVO202의 LCDR3 서열(서열번호 8)
QQWSSYPLT
마우스 항-인간 TSLP 항체 TAVO202는 마우스 CDR을 인간 생식계열 스캐폴드 상에 이식함으로써 인간화될 수 있다. 소수의 주요 마우스 잔기는 면역원성을 최소화하면서 더 높은 안정성과 더 적절한 발현을 달성하기 위해 역돌연변이에 의해 보존된다. TAVO202의 경우 1개의 인간화 VH 변이체(202H2)가 IGHV1-69*02를 기반으로 설계되고 2개의 인간화 VL 변이체가 IGKV1-9*01 기반 202L3 및 IGKV6-21*01 기반 202L4 및 2개의 프레임워크의 역돌연변이로 설계되었다.
전술한 내용을 기반으로 하여, 본 개시내용은 202H2로 지정된 TAVO202의 하나의 인간화 중쇄 가변 영역을 제공하며, 아미노산 서열은 서열번호 9에 제시된다.
인간화 중쇄 가변 영역 202H2 서열(서열번호 9)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSYWVNWVRQAPGQGLEWIGQIYPGDGDTDYAQKFQGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARGTYYNNYYGTDYWGQGTTVTVSS
인간화 중쇄의 3개의 CDR의 서열은 밑줄 표시되어 있다.
본 개시내용은 202L3 및 202L4로 지정된 TAVO202의 2개의 인간화 경쇄 가변 영역, 아미노산 서열은 서열번호 10 및 서열번호 11에 각각 제시된다.
인간화 경쇄 가변 영역 202L3 서열(서열번호 10)
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKPGKAPKPWIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIK
인간화 경쇄의 3개의 CDR의 서열은 밑줄 표시되어 있다.
인간화 경쇄 가변 영역 202L4 서열(서열번호 11)
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKPDQSPKPWIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIK
인간화 경쇄의 3개의 CDR의 서열은 밑줄 표시되어 있다.
비제한적인 예로서, 상이한 IgG Fc를 갖는 인간화된 202H2 중쇄 가변 영역 및 2개의 인간화 경쇄 가변 영역 202L3 및 202L4를 짝지음으로써, TAVO202의 6개의 인간화 항체가 생성될 수 있다(도 4, 표 2).
예시적 항체
인간화된 mAb V H V L Fc
TAVO6264 202H2 202L3 IgG2
TAVO6265 202H2 202L4 IgG2
TAVO7264 202H2 202L3 IgG1(L234F, L235E, D265A, F405L)
TAVO7265 202H2 202L4 IgG1(L234F, L235E, D265A, F405L)
TAVO9764 202H2 202L3 IgG1(L234A, L235A, M428L, N434S)
TAVO9765 202H2 202L4 IgG1(L234A, L235A, M428L, N434S)
본 개시내용은 서열번호 12에 제시된 중쇄 서열, 서열번호 13에 제시된 중쇄 서열을 포함하는 TAVO6264으로 지정된 인간 IgG2 Fc를 갖는 인간화 중쇄 가변 영역 202H2 및 인간화 경쇄 가변 영역 202L3을 포함하는 TAVO202의 제1 인간화 항체를 제공한다.
본 개시내용은 서열번호 12에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호 14에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 TAVO6265로 지정된 인간 IgG2 Fc를 갖는 인간화 중쇄 가변 영역 202H2 및 인간화 경쇄 가변 영역 202L4를 포함하는 TAVO202의 제2 인간화 항체를 제공한다.
본 개시내용은 서열번호 15에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호 13에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 TAVO7264로 지정된 L234F, L235E, D265A, F405L 돌연변이된 인간 IgG1 Fc를 갖는 인간화 중쇄 가변 영역 202H2 및 인간화 경쇄 가변 영역 202L3을 포함하는 TAVO202의 제3 인간화 항체를 제공한다.
본 개시내용은 서열번호 15에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호 14에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 TAVO7265로 지정된 L234F, L235E, D265A, F405L 돌연변이된 인간 IgG1 Fc를 갖는 인간화 중쇄 가변 영역 202H2 및 인간화 경쇄 가변 영역 202L4를 포함하는 TAVO202의 제4 인간화 항체를 제공한다.
본 개시내용은 서열번호 16에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호 13에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 TAVO9764로 지정된 L234A, L235A, M428L, N434S 돌연변이된 인간 IgG1 Fc를 갖는 인간화 중쇄 가변 영역 202H2 및 인간화 경쇄 가변 영역 202L3을 포함하는 TAVO202의 제5 인간화 항체를 제공한다.
본 개시내용은 서열번호 16에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호 14에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 TAVO9765로 지정된 L234A, L235A, M428L, N434S 돌연변이된 인간 IgG1 Fc를 갖는 인간화 중쇄 가변 영역 202H2 및 인간화 경쇄 가변 영역 202L4를 포함하는 TAVO202의 제6 인간화 항체를 제공한다.
IgG2 Fc를 갖는 202H2 기반 항-TSLP 인간화 항체 중쇄(서열번호 12)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSYWVNWVRQAPGQGLEWIGQIYPGDGDTDYAQKFQGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARGTYYNNYYGTDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
중쇄의 가변 도메인의 서열은 밑줄 표시되어 있다.
202L3 기반 항-TSLP 인간화 항체 경쇄(서열번호 13)
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKPGKAPKPWIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
경쇄의 가변 도메인의 서열은 밑줄 표시되어 있다.
202L4 기반 항-TSLP 인간화 항체 경쇄(서열번호 14)
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKPDQSPKPWIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
경쇄의 가변 도메인의 서열은 밑줄 표시되어 있다.
L234F, L235E, D265A, F405L 돌연변이된 IgG1 Fc를 갖는 202H2 기반 항-TSLP 인간화 항체 중쇄(서열번호 15)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSYWVNWVRQAPGQGLEWIGQIYPGDGDTDYAQKFQGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARGTYYNNYYGTDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
중쇄의 가변 도메인의 서열은 밑줄 표시되어 있다. L234F, L235E, D265A, F405L 돌연변이는 굵은 글씨로 표시되어 있다.
L234A, L235A, M428L, N434S 돌연변이된 IgG1 Fc를 갖는 202H2 기반 항-TSLP 인간화 항체 중쇄(서열번호 16)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSYWVNWVRQAPGQGLEWIGQIYPGDGDTDYAQKFQGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARGTYYNNYYGTDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK
중쇄의 가변 도메인의 서열은 밑줄 표시되어 있다. L234A, L235A, M428L, N434S 돌연변이는 굵은 글씨로 표시되어 있다.
본 개시내용은 또한 아미노산 서열은 서열번호 9에 제시된 202H2로 지정된 TAVO202의 1개의 인간화 중쇄 가변 영역과 아미노산 서열은 서열번호 10 및 서열번호 11에 각각 제시된 202L3 및 202L4로 지정된 TAVO202의 2개의 인간화 경쇄 가변 영역 중 하나를 포함하는 Fab 또는 scFv 도메인을 가짐으로써 임의의 2, 3, 또는 4개의 TSLP 에피토프의 결합을 포함할 수 있는 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체의 제조를 제공한다. 예를 들어, 이는 Fab 또는 scFv 도메인 202H2와 202L3 및 202H2와 202L4, 또는 2, 3 또는 4개의 에피토프와 결합할 수 있는 도메인의 임의의 다른 순열을 갖는 이중특이적 항체일 수 있다.
본 개시내용의 TSLP 결합 항체 및 단편은 TSLP에 특이적으로 결합하는 충분한 능력을 보유하는 항원-결합 단편을 포함한다. 본 명세서에 사용된 TSLP 결합 단편은 항체의 임의의 3개 이상의 인접 아미노산(예를 들어, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 8개 이상, 또는 심지어 10개 이상의 인접 아미노산)을 포함할 수 있고 Fab, Fab', F(ab')2, 및 F(v) 단편, 또는 개별 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 또는 이의 부분을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 온전한 항체의 Fc 단편이 부재하고 순환계로부터 더 빨리 배출되고 온전한 항체보다 덜 비특이적인 조직 결합을 나타낼 수 있다. 이들 단편은 예를 들어 파파인(Fab 단편 생산) 또는 펩신(F(ab')2 단편 생산)과 같은 효소를 사용한 단백질 분해 절단에 의해 잘 알려진 방법을 사용하여 온전한 항체로부터 생산될 수 있다.
본 개시내용의 TSLP 결합 항체 및 단편은 또한 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 사슬에서 발현되지만 동일한 사슬에서 두 도메인 사이의 쌍을 형성하여, 도메인이 강제로 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 형성하고 두 개의 항원 결합 부위가 생성되기에는 너무 짧은 링커를 사용하는 2가 항체인 디아바디를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 TSLP 결합 항체 및 단편은 또한 TSLP에 결합하는 단일 사슬 항체 단편(scFv)을 포함할 수 있다. scFv는 항체 경쇄 가변 영역(VL)에 작동 가능하게 연결된 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하며, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 함께 또는 개별적으로 TSLP에 결합하는 결합 부위를 형성한다. 이러한 TSLP 결합 단편은 예를 들어, 아미노산 Gly 및 Ser으로 구성된 가요성 단백질 링커 및 항체 분자의 중쇄 및 경쇄 가변 부분의 합성 또는 PCR 매개 증폭과 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 생성된 DNA 단편은 E. 콜라이 또는 포유류 세포에서의 발현을 위해 클로닝된다. 발현된 TSLP 결합 단편은 숙주 세포로부터 정제된다.
본 개시내용의 TSLP 결합 항체 및 단편은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 전장 항체를 포함한다. 예시적 인간 또는 인간화 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, 및 IgD 항체를 포함한다. 본 항체는 임의의 부류(IgG, IgM, IgE, IgGA, IgD 등) 또는 동형일 수 있다. 예를 들어, 인간 항체는 IgG Fc 도메인, 예컨대 동형, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일부 예에서, IgG Fc 도메인은 서열번호 17로서 IgG1 Fc 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%, 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 예에서, IgG Fc 도메인은 서열번호 18로서 IgG2 Fc 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%, 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 예에서, IgG Fc 도메인은 서열번호 19로서 IgG3 Fc 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%, 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 예에서, IgG Fc 도메인은 서열번호 20으로서 IgG4 Fc 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%, 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
S228P 돌연변이는 IgG4 안정성을 향상시키기 위해 IgG4 항체로 생성될 수 있다.
IgG1 Fc(서열번호 17):
KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG2 Fc(서열번호 18):
TVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG3 Fc(서열번호 19):
RVELKTPLGDTTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG4 Fc(서열번호 20)
RVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
본 발명의 항-TSLP 항체는 변형된 Fc 영역을 포함할 수 있고, 변형된 Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-TSLP 항체는 천연 발생 Fc 영역이 생물학적 환경에서 모 야생형 항체와 비교하여 항체의 반감기, 예를 들어 혈청 반감기 또는 시험관내 분석에 의해 측정된 반감기를 연장하도록 변형된 변형 Fc 영역과 함께 제공된다.
단독으로 또는 조합하여 생성될 수 있는 예시적인 돌연변이는 T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P257I, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A 및 H435R 돌연변이 또는 상기 Fc 돌연변이가 부재하는 대조군에 비해 향상된 순환 항체 반감기를 갖는 Fc)의 C 말단 상의 알부민 결합 펩타이드의 융합이다.
특정 실시양태에서, 반감기의 연장은 서열번호 21로서, EU 인덱스에 따른 잔기 넘버링으로, IgG1 Fc에 M252Y/S254T/T256E 돌연변이를 조작함으로써 실행될 수 있다(문헌[Dall'Acqua, Kiener et al. 2006]).
특정 실시양태에서, 반감기의 연장은 서열번호 22로서 IgG1 Fc에 M428L/N434S 돌연변이를 조작함으로써 실행될 수 있다(문헌[Zalevsky, Chamberlain et al. 2010]).
특정 실시양태에서, 반감기의 연장은 서열번호 23으로서 IgG1 Fc에 T250Q/M428L 돌연변이를 조작함으로써 실행될 수 있다(문헌[Hinton, Xiong et al. 2006]).
특정 실시양태에서, 반감기의 연장은 서열번호 24로서 IgG1 Fc에 N434A 돌연변이를 조작함으로써 실행될 수 있다(문헌[Shields, Namenuk et al. 2001]).
특정 실시양태에서, 반감기의 연장은 서열번호 25로서 IgG1 Fc에 T307A/E380A/N434A 돌연변이를 조작함으로써 실행될 수 있다(문헌[Petkova, Akilesh et al. 2006]).
항체 반감기의 연장에 대한 Fc 조작의 효과는 천연 IgG Fc를 갖는 항체와 비교하여 마우스의 PK 연구에서 평가될 수 있다.
M252Y/S254T/T256E 돌연변이된 IgG1 Fc(서열번호 21)
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M428L/N434S 돌연변이된 IgG1 Fc(서열번호 22)
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T250Q/M428L 돌연변이된 IgG1 Fc(서열번호 23)
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N434A 돌연변이된 IgG1 Fc(서열번호 24)
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T307A/E380A/N434A 돌연변이된 IgG1 Fc(서열번호 25)
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일부 실시양태에서, 본 발명의 항-TSLP 항체에는 잔기 222 내지 237(EU 넘버링) 사이 또는 상기 잔기에서 야생형 항체를 절단하는 프로테아제에 의한 단백질분해적 분해에 대한 항체 내성을 향상시키기 위해 천연 발생 Fc 영역이 변형된 변형 Fc 영역과 함께 제공된다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fc의 하부 힌지 영역에서의 돌연변이(예를 들어, IgG1 Fc의 잔기 222 내지 237과 균등함)를 추가로 포함하고 내인성 단백질 분해 활성이 있는 상황에서 천연 IgG1 항체에 비해 증가된 프로테아제 내성(예를 들어, MMP-3, MMP-7, MMP-12, MMP-13, 카텝신(cathepsin) G, 펩신(pepsin), IdeS, 또는 GluV8에 대한 내성)을 가능하게 한다.
특정 실시양태에서, 단백질분해적 분해에 대한 내성은, EU 인덱스에 따른 잔기 넘버링으로, 서열번호 26으로서 모 야생형 항체와 비교하여 G236이 결실된 힌지 영역에서 E233P/L234V/L235A 돌연변이를 조작함으로써 실행될 수 있다(문헌[Kinder, Greenplate et al. 2013]).
E233P/L234V/L235A 돌연변이 및 G236 결실된 IgG1 Fc(서열번호 26)
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효과기 기능이 적절하지 않은 경우에, 본 개시내용의 항체는 활성화 Fcγ 수용체(FcγR)에 대한 항체의 결합을 감소시키고/거나, Fc 효과기 기능, 예컨대 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 또는 식균작용(ADCP)을 감소시키는 항체 Fc에 적어도 하나의 돌연변이가 도입되도록 추가로 조작될 수 있다.
활성화 FcγR에 대한 항체의 결합을 감소시키고 이어서 효과기 기능을 감소시키기 위해 돌연변이될 수 있는 Fc 위치는 예를 들어(문헌[(Xu, Alegre et al. 2000)(Vafa, Gilliland et al. 2014)(Bolt, Routledge et al. 1993)(Chu, Vostiar et al. 2008)(Shields, Namenuk et al. 2001)])에 기재되어 있다. 최소 ADCC, ADCP, CDC, Fc 매개 세포 활성화를 갖는 Fc 돌연변이는 IgG1, IgG2 및 IgG4에 대한 시그마 돌연변이로도 기재되었다(문헌[Tam, McCarthy et al. 2017]).
단독으로 또는 조합하여 생성될 수 있는 예시적인 돌연변이는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 K214T, E233P, L234V, L234A, G236의 결실, V234A, F234A, L235A, G237A, P238A, P238S, D265A, S267E, H268A, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, P329A, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, A330S 및 P331S 돌연변이이다.
감소된 ADCC에 대해 생성될 수 있는 예시적인 조합 돌연변이는 IgG1의 L234A/L235A, IgG2의 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S /P331S, IgG4의 F234A/L235A, IgG4의 S228P/F234A/L235A, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 N297A, IgG2의 V234A/G237A, IgG1의 K214T/E233P/L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M, IgG2의 H268Q/V309L/A330S/P331S, IgG1의 S267E/L328F, IgG1의 L234F/L235E/D265A, IgG1의 L234A/L235A/G237A/P238S /H268A/A330S/P331S, IgG4의 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S, 및 IgG4의 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S이다. 혼성체 IgG2/4 Fc 도메인, 예컨대 IgG2로부터의 잔기 117 내지 260 및 IgG4로부터의 잔기 261 내지 447을 갖는 Fc가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-TSLP 항체에는 천연 발생 Fc 영역이 변형되어 Fc 이종이량체화에 의한 이중특이적 항체의 생성을 용이하게 하는 변형된 Fc 영역이 제공된다.
특정 실시양태에서, Fc 이종이량체화는 Fab 아암 교체로 공지된 과정에서 2개의 모 항체에 대한 F405L 및 K409R 돌연변이를 조작하고 이중특이적 항체의 생성에 의해 실행될 수 있다(문헌[Labrijn, Meesters et al. 2014]).
특정 실시양태에서, Fc 이종이량체화는 또한 노브-인-홀(Knob-in-Hole) 전략을 촉진하기 위해 Fc 돌연변이에 의해 실행될 수 있다(예를 들어, 국제 공개 WO 2006/028936 참조). 하나의 Fc 도메인에는 작은 측쇄(홀)를 갖는 아미노산이 도입되고 다른 Fc 도메인에는 큰 측쇄(노브)를 갖는 아미노산이 도입된다. 2개의 중쇄의 동시 발현 후, "홀"이 있는 중쇄와 "노브"가 있는 중쇄의 우선적인 상호작용의 결과로 이종이량체가 형성된다(문헌[Ridgway, Presta et al. 1996]).
노브 및 홀을 형성하는 예시적인 Fc 돌연변이 쌍은 다음과 같다: T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S 및 T366W/T366S/L368A/Y407V.
특정 실시양태에서, Fc 이종이량체화는 또한 정전기적으로 일치된 상호작용 전략을 촉진하기 위해 Fc 돌연변이에 의해 실행될 수 있다(문헌[Gunasekaran, Pentony et al. 2010]). 미국 특허 공개 US2010/0015133; 미국 특허 공개 US2009/0182127; 미국 특허 공개 US2010/028637 또는 미국 특허 공개 US2011/0123532에 기재된 바와 같이, 하나의 Fc 도메인에 양으로 하전된 잔기 및 다른 Fc 도메인에 음으로 하전된 잔기가 생성되도록 돌연변이를 조작할 수 있다. 중쇄 이종이량체화는 2개의 돌연변이된 Fc 간의 정전기적으로 일치된 상호작용에 의해 형성될 수 있다.
보존적 변형을 추가로 포함하는 본 개시내용의 항체는 본 개시내용의 범위 내에 있다.
"보존적 변형"은 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성에 유의한 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 보존적 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 보존적 치환은 아미노산이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 잘 규정되어 있으며 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 티로신, 트레오닌, 트립토판), 방향족 측쇄(예를 들어, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신), 지방족 측쇄(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌), 아미드(예를 들어, 아스파라긴, 글루타민), 베타-분지 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 황 포함 측쇄(시스테인, 메티오닌)를 포함한다. 또한, 이전에 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 대해 기재된 바와 같이, 폴리펩타이드의 임의의 천연 잔기가 또한 알라닌으로 치환될 수 있다(문헌[(MacLennan, Rice et al. 1998);(Sasaki and Sutoh 1998)]). 본 개시내용의 항체에 대한 아미노산 치환은 공지된 방법, 예를 들어 PCR 돌연변이유발에 의해 이루어질 수 있다(미국 특허 제 4,683,195호). 대안적으로, 변이체의 라이브러리는 예를 들어 11개의 아미노산(Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp)을 인코딩하는 무작위(NNK) 또는 비-무작위 코돈, 예를 들어 DVK 코돈을 사용하여 생성될 수 있다. 생성된 항체 변이체는 본 명세서에 기재된 분석을 사용하여 이의 특성에 대해 시험될 수 있다.
본 개시내용의 항체는 글리코실화, 이성질체화, 탈글리코실화 또는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 첨가(페길화) 및 지질화와 같은 비-천연 발생 공유 변형과 같은 과정에 의해 번역 후 변형될 수 있다. 이러한 변형은 생체내 또는 시험관내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체는 이의 약동학적 특성을 개선하기 위해 폴리에틸렌 글리콜에 접합될 수 있다(PEG화). 접합은 당업자에게 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. PEG와 치료 항체의 접합은 기능을 방해하지 않으면서 약력학을 향상시키는 것으로 나타났다(문헌[Leong, DeForge et al. 2001, Yang, Basu et al. 2003, Knight, Jordan et al. 2004]).
본 개시내용의 항체는 안정성, 선택성, 교차-반응성, 친화도, 면역원성, 또는 다른 적절한 생물학적 또는 생물물리학적 특성을 개선하기 위해 변형될 수 있으며 이는 본 개시내용의 범위 내에 있다. 항체의 안정성은(1) 고유 안정성에 영향을 미치는 개별 도메인의 중심부 패킹,(2) HC 및 LC 쌍에 영향을 미치는 단백질/단백질 계면 상호작용,(3) 극성 및 하전된 잔기의 차단,(4) 극성 및 하전된 잔기에 대한 H-결합 네트워크;(5) 다른 분자내 및 분자간 힘 사이의 표면 전하 및 극성 잔기 분포를 포함하여 다수의 인자에 의해 영향을 받는다(문헌[Worn and Pluckthun 2001]). 잠재적인 구조 불안정화 잔기는 항체의 결정 구조를 기반으로 하거나 특정 경우에 분자 모델링에 의해 확인될 수 있으며, 항체 안정성에 대한 잔기의 효과는 확인된 잔기에 돌연변이가 있는 변이체를 생성 및 평가함으로써 시험할 수 있다. 항체 안정성을 증가시키는 방법 중 하나는 시차 주사 열량계(DSC)로 측정한 바와 같이 열전이 중간점(Tm)을 증가시키는 것이다. 일반적으로, 단백질 Tm은 그 안정성과 상관관계가 있고, 용액에서 풀림 및 변성에 대한 감응성 및 단백질의 풀림 경향에 의존하는 분해 과정과 역 상관관계가 있다(문헌[Remmele and Gombotz 2000]). 많은 연구에서 DSC에 의해 열적 안정성으로 측정되는 제형의 물리적 안정성 순위와 다른 방법으로 측정한 물리적 안정성 사이에 상관관계가 있음을 발견하였다(문헌[(Maa and Hsu 1996, Remmele, Nightlinger et al. 1997, Gupta and Kaisheva 2003, Bedu-Addo, Johnson et al. 2004, Zhang, Roy et al. 2004]). 제형 연구는 Fab Tm이 상응하는 mAb의 장기간 물리적 안정성에 대해 영향을 미친다는 것을 시사한다.
본 개시내용의 항체는 제조 및 약물 안정성을 개선하는 Fc 영역의 아미노산 치환을 가질 수 있다. IgG1의 예는 힌지 221-DKTHTC-226의 H224S(또는 H224Q)(Eu 넘버링)로, 이는 근본적으로 유도된 절단을 차단하며(문헌[Yates, Gunasekaran et al. 2010]), IgG4의 경우 S228P 돌연변이는 반항체 교환을 차단한다(문헌[Angal, King et al. 1993, Labrijn, Buijsse et al. 2009]).
항-TSLP 항체의 발현 및 정제
본 개시내용의 항-TSLP 항체 및 단편은 단일 핵산(예를 들어, 항체의 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단일 핵산) 또는 각각이 항체 또는 항체 단편의 상이한 부분을 인코딩하는 2개 이상의 별개의 핵산에 의해 인코딩될 수 있다.
비제한적 예로서, 본 개시내용은 IgG2 Fc를 갖는 202H2에 기반한 항-TSLP 인간화 항체 중쇄를 인코딩하는 서열번호 27로서의 핵산 서열, 202L3에 기반한 항-TSLP 항체 경쇄 서열을 인코딩하는 서열번호 28로서 핵산 서열, 및 202L4에 기반한 항-TSLP 항체 경쇄 서열을 인코딩하는 서열번호 29로서 핵산 서열을 제공한다.
IgG2 Fc를 갖는 202H2에 기반한 항-TSLP 인간화 항체 중쇄에 대한 뉴클레오타이드 서열(서열번호 27)
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202L3에 기반한 항-TSLP 인간화 항체 경쇄의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 28)
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202L4에 기반한 항-TSLP 인간화 항체 경쇄의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 29)
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핵산은 벡터, 예를 들어 핵산 발현 벡터 및/또는 표적화 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이러한 벡터는 예를 들어 세포 또는 형질전환 동물에서 항-TSLP 결합 항체 또는 항체 단편의 발현을 위해 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 벡터는 일반적으로 벡터가 사용될 숙주 세포에서 기능하는 것으로 선택된다. 항-TSLP 결합 항체 또는 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 원핵생물, 효모, 곤충(배큘로바이러스 시스템) 및/또는 진핵생물 숙주 세포에서 증폭/발현될 수 있다. 숙주 세포의 선택은 부분적으로 항-TSLP 결합 항체 또는 단편이 번역 후 변형(예를 들어, 글리코실화 및/또는 인산화)되어야 하는지에 달려 있다. 그렇다면, 효모, 곤충 또는 포유류 숙주 세포가 바람직하다. 발현 벡터는 일반적으로 다음 구성요소 중 하나 이상을 포함한다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 복제 기점, 전사 종결 서열, 공여체 및 수용체 스플라이스 부위를 포함하는 완전한 인트론 서열, 분비를 위한 리더 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현될 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 영역, 및 선택가능한 마커 요소.
대부분의 경우, 리더 또는 신호 서열은 이의 분비를 유도하기 위해 항-TSLP 항체 또는 단편의 N-말단에서 조작된다. 숙주 세포로부터 항-TSLP 항체 또는 단편의 분비는 항체 또는 단편으로부터 신호 펩타이드의 제거를 초래할 것이다. 따라서 성숙한 항체 또는 단편에는 임의의 리더 또는 신호 서열이 부재한다. 진핵 숙주 세포 발현 시스템에서 글리코실화가 필요한 경우와 같은 일부 경우에, 글리코실화 또는 수율을 개선하기 위해 다양한 프리서열(presequence)을 조작할 수 있다. 예를 들어, 신호 펩타이드의 펩티다제 절단 부위를 변경하거나 글리코실화에 영향을 미칠 수 있는 프로서열(prosequence)을 첨가할 수 있다.
본 개시내용은 본 개시내용의 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포(예를 들어, 단리 또는 정제된 세포)를 추가로 제공한다. 세포는 본 개시내용의 핵산 또는 벡터로 형질전환되어 그에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 임의의 유형의 세포일 수 있다. 항-TSLP 결합 항체 또는 단편을 발현시키기 위해, 상기 기재된 바와 같이 획득된 부분 또는 전체 길이의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA를 발현 벡터에 삽입하여 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 한다.
핵산 및 벡터의 단리된 세포에의 도입 및 시험관내 형질전환된 숙주 세포의 배양 및 선택 방법은 당업계에 공지되어 있으며 염화칼슘-매개 형질전환, 형질도입, 접합, 삼부모 교배, DEAE, 덱스트란-매개된 형질감염, 감염, 리포솜과의 막 융합, DNA 코팅된 미세발사체를 사용한 고속 충격, 단일 세포로의 직접 미세주입 및 전기천공의 사용을 포함한다.
본 개시내용의 핵산 또는 벡터를 세포 내로 도입한 후, 세포를 인코딩된 서열의 발현에 적합한 조건 하에 배양한다. 항체, 항원 결합 단편, 또는 항체의 일부는 그 다음 세포로부터 단리될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-TSLP 결합 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 함께 인코딩하는 둘 이상의 벡터가 세포 내로 도입될 수 있다.
세포 배지로 분비된 항-TSLP 결합 항체 또는 단편의 정제는 친화도, 면역친화도 또는 이온 교환 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피, 분취 겔 전기영동 또는 등전점 집속, 크로마토포커싱 및 고압 액체 크로마토그래피를 포함하는 다양한 기술을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, Fc 영역을 포함하는 항체는 Fc 영역에 선택적으로 결합하는 단백질 A와의 친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
항체 또는 항원 결합 단편의 변형된 형태는 카복실 또는 아미노 말단에서 헥사히스티딘 또는 다른 작은 펩타이드와 같은 친화도 태그, 예컨대 FLAG(Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.) 또는 myc(Invitrogen)로 제조할 수 있고 1단계 친화도 컬럼으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 폴리히스티딘은 니켈에 대해 높은 친화도 및 특이성을 가지고 결합하므로 니켈의 친화도 컬럼(예를 들어, Qiagen® 니켈 컬럼)은 폴리히스티딘 태깅된 선택적 결합제의 정제에 사용할 수 있다. 일부 예에서, 하나 초과의 정제 단계가 사용될 수 있다.
항체 또는 항원 결합 단편의 변형된 형태는 카복실 또는 아미노 말단에서 헥사히스티딘 또는 다른 작은 펩타이드와 같은 친화도 태그, 예컨대 FLAG(Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.) 또는 myc(Invitrogen)로 제조할 수 있고 1단계 친화도 컬럼으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 폴리히스티딘은 니켈에 대해 높은 친화도 및 특이성을 가지고 결합하므로 니켈의 친화도 컬럼(예를 들어, Qiagen® 니켈 컬럼)은 폴리히스티딘 태깅된 선택적 결합제의 정제에 사용할 수 있다. 일부 예에서, 하나 초과의 정제 단계가 사용될 수 있다.
TSLP
흉선 기질 림포포이에틴, TSLP는 알레르기 염증과 관련된 사이토카인 패밀리에 속하는 상피 세포 유래 단백질이다(문헌[Cianferoni and Spergel 2014]). 이는 주로 섬유아세포, 상피세포 및 다른 유사 세포와 같은 비조혈 세포에서 생산되며 항원 제시 세포의 활성화를 통해 T 세포 집합의 성숙에 중요한 역할을 한다. TSLP는 전염증성 자극에 대한 반응으로 생산되고 주로 T 헬퍼(Th) 2 사이토카인 생산을 위한 수지상 세포에 대한 영향에 의해 알레르기 염증 반응을 유발한다.
인간 TSLP는 2개의 동형(isoform)을 갖는다. TSLP의 긴 형태인 lfTSLP는 심장, 간 및 전립선을 포함한 여러 조직에서 발현되고 단핵구로부터 케모카인을 유도하는 T 세포의 방출을 유도하고 CD11c-수지상 세포의 성숙을 향상시킨다. 비만 세포를 직접 활성화하여 알레르기 염증을 유발할 수 있다(문헌[Reche, Soumelis et al. 2001, Zhang and Zhou 2012]). 동형 2는 TSLP, sfTSLP의 짧은 형태이고 구강 점막, 피부 및 침샘의 각질 세포에서 우세한 형태이며 항균 펩타이드로 기능할 수 있다(문헌[Bjerkan, Sonesson et al. 2016]). 인간 TSLP는 염색체 5q22.1에 매핑된다(문헌[Quentmeier, Drexler et al. 2001]).
lfTSLP의 아미노산 서열은 서열번호 30으로 제공되고, 이 중 처음 28개 아미노산은 신호 펩타이드를 구성하고 Y29 내지 Q159는 성숙한 형태이다. sfTSLP의 아미노산 서열은 서열번호 31로 제공된다.
긴 형태의 TSLP lfTSLP에 대한 아미노산 서열(서열번호 30)
MFPFALLYVLSVSFRKIFILQLVGLVLTYDFTNCDFEKIKAAYLSTISKDLITYMSGTKSTEFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQINA
TQAMKKRRKRKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQ
짧은 형태의 TSLP sfTSLP의 아미노산 서열(서열번호 31)
MFAMKTKAALAIWCPGYSETQINATQAMKKRRKRKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQ
TSLP 수용체(TSLPR)는 낮은 친화도로 TSLP에 결합하고 조혈포이에틴 수용체 패밀리의 구성원이다(문헌[Park, Martin et al. 2000]). 3원 복합체를 형성하기 위한 TSLP의 고친화도 결합에는 IL-7 수용체 알파 사슬(IL-7Rα)과 TSLPR의 조합이 필요하다(문헌[Verstraete, van Schie et al. 2014]). 3원 복합체는 세포 증식과 신호전달에 필요하다.
TSLP의 결합 후, STAT5 인산화가 유도되어 하류 전사 인자의 발현을 초래한다. 초기 결과는 TSLPR 복합체에 대한 TSLP 결합이 검출 가능한 JAK 활성화 없이 STAT5를 활성화한다는 것을 시사하지만, 최근 결과는 각각 IL-7Rα 및 TSLPR 사슬에 결합하는 JAK1 및 JAK2가 TSLP 매개 STAT5 활성화에 필요함을 보여준다(문헌[Rochman, Kashyap et al. 2010]). ERK1,2 및 p70S6K의 활성화와 같은 많은 사이토카인에 의해 자극되는 다른 신호전달 경로는 TSLP 활성에 관여하지 않는다(문헌[Quentmeier, Drexler et al. 2001]).
마우스와 인간 TSLP 사이의 상동성은 TSLPR에 대해 43% 및 39%이고, 종 사이에 교차 반응성이 없다. 뮤린과 인간 TSLP 및 뮤린과 인간 TSLPR 사이의 저조한 아미노산 서열 동일성에도 불구하고, 두 종 모두에서 TSLP의 수용체에 대한 높은 친화도 결합에 IL-7Rα가 필요하다는 사실은 인간 TSLP와 TLPLR이 마우스 TSLP 및 TSLPR에 대한 이종상동체임을 시사한다. 따라서, 마우스 모델은 키메라 인간 TSLP 및 인간 TSLPR 형질전환 마우스 균주의 사용을 포함하여 다양한 생물학적 연구에 사용되었다(문헌[Francis, Milford et al. 2016]).
TSLP 발현은 천식(문헌[Ying, O'Connor et al. 2005]), 염증성 관절염(문헌[Koyama, Ozawa et al. 2007]), 염증성 장 질병(문헌[Park, Jung et al. 2017]), 아토피 피부염(문헌[Ebner, Nguyen et al. 2007]), 습진, 호산구성 식도염 및 기타 알레르기 상태(문헌[(Soumelis 및 Liu 2004),(Soumelis, Reche et al. 2002)])를 포함하는 다수의 질병 상태에 관련된다. TSLP 생산 메커니즘과 생산을 차단하는 잠재적 물질을 이해하면 이러한 병태를 예방하거나 치료하는 더 적절한 방법을 사용할 수 있다. 따라서, TSLP를 표적화하면 천식 및 Th2 사이토카인 매개 염증성 장애와 관련된 여러 생물학적 경로를 억제할 수 있다(문헌[Gauvreau , O'Byrne et al. 2014]).
항-TSLP 항체의 결합 및 기능적 활성
본 개시내용은 다른 항원에 비해 더 큰 친화도로 TSLP에 선택적으로 결합하는 항-TSLP 단일클론 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 항-TSLP 단일클론 항체 및 단편은 인간 TSLP에 선택적으로 결합할 수 있지만, 또한 비인간 TSLP에도 검출가능하게 결합한다. 대안적으로 또는 추가적으로, TSLP 결합 항체 및 항체 단편은 재조합 인간 TSLP 및 내인성 인간 TSLP에 대해 동일하거나 실질적으로 동일한 효능을 가질 수 있다.
시험관내 및 세포-기반 분석은 이의 수용체에 대한 TSLP 항체와 그 표적의 결합을 결정하는데 사용하기 위해 당업계에 잘 설명되어 있다. 예를 들어, 이의 수용체에 대한 TSLP의 결합은 TSLP 결합 항체를 고정화하고, 고정된 항체로 TSLP를 격리하고, TSLP가 항체에 결합하는지를 결정하고, 수용체의 가용성 형태를 결합된 TSLP/항체 복합체와 접촉시키고 가용성 수용체가 복합체에 결합하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 프로토콜은 또한 가용성 수용체가 고정된 항체에 결합하지 않는다는 것을 확인하기 위해 TSLP 항체와 접촉하기 전에 가용성 수용체를 고정된 항체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 프로토콜은 결합 상호작용의 동역학 분석을 위해 Biacore® 기기를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 프로토콜은 또한 항체 또는 기타 분자가 수용체에 대한 TSLP의 결합을 가능하게 하거나 차단하는지를 결정하는데 사용될 수 있다.
다른 TSLP/수용체 결합 분석의 경우, 이의 수용체에 대한 TSLP 결합의 가능 또는 차단은 TSLP 항체 또는 이의 TSLP 결합 단편의 존재 또는 부재 하에 수용체에 대한 TSLP의 결합을 비교함으로써 결정될 수 있다. 차단은 항-TSLP 항체 또는 이의 TSLP 결합 단편의 존재 하에 수용체에 대한 TSLP 결합의 지정된 감소로 분석 판독값에서 확인되며, 이는 TSLP 항체 또는 이의 TSLP 결합 단편은 포함하지 않지만, 해당 완충제 또는 희석제는 포함하는 대조군 샘플과 비교하는 바와 같다. 분석 판독값은 차단의 존재 또는 부재를 나타내는 것으로 정성적으로 확인될 수 있거나 항체 또는 단편의 존재로 인한 결합의 백분율 또는 감소 배수를 나타내는 것으로 정량적으로 확인될 수 있다. TSLP 결합 항체 또는 TSLP 결합 단편이 수용체에 대한 TSLP 결합을 실질적으로 차단하는 경우, 수용체에 대한 TSLP 결합은 항체 또는 단편의 부재 하에 수용체에 결합하는 동일한 농도의 TSLP 결합과 비교하여 적어도 10배, 대안적으로 적어도 약 20배, 대안적으로 적어도 약 50배, 대안적으로 적어도 약 100배, 대안적으로 적어도 약 1000배, 대안적으로 적어도 약 10000배 감소한다.
본 개시내용에 따라 사용하기 위한 바람직한 항-TSLP 항체는 일반적으로 예를 들어 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 500 pM 이하, 또는 더욱 바람직하게는 약 250 pM 이하, 약 100 pM 이하, 약 50 pM 이하, 약 25 pM 이하, 약 10 pM 이하, 약 5 pM 이하, 약 3 pM 이하 약 1 pM 이하, 약 0.75 pM 이하, 약 0.5 pM 이하, 또는 약 0.3 pM 이하의 TSLP의 평형 결합 해리 상수(KD)와 같은 높은 친화도로 인간 TSLP에 결합한다(예를 들어, BIACORE로 결정됨).
본 개시내용의 항체 또는 단편은, 예를 들어, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 2 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 0.75 nM 이하, 약 0.5 nM 이하, 약 0.4 nM 이하, 약 0.3 nM 이하, 또는 심지어 약 0.2 nM 이하의 EC50으로 TSLP에 결합할 수 있으며, 이는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정되는 바와 같다.
바람직하게는, 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편은 TSLP 이외의 임의의 표적과 교차 반응하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 항체 및 단편은 TSLP에 결합할 수 있지만 TSLP에 검출 가능하게 결합하지 않거나 다른 단백질의 결합에 비해 TSLP의 결합에서 적어도 약 100배(예를 들어, 적어도 약 150배, 적어도 약 200배, 또는 심지어 적어도 약 250배) 더 큰 선택성을 갖는다.
본 개시내용에 기재된 TSLP 결합 항체 또는 단편에 의해 결합된 주요 아미노산 잔기(에피토프)는 펩타이드 어레이, 예를 들어 PepSpot™ 펩타이드 어레이(JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany)를 사용하여 결정될 수 있고, 각각의 펩타이드는 이전 펩타이드에 11개 아미노산이 중첩되는 전체 TSLP 아미노산 서열에 걸쳐 있는 12개의 아미노산 펩타이드의 스캔이 막에서 직접 합성된다. 대안적으로, 또는 추가로, 항체 경쟁 실험이 수행될 수 있고 이러한 분석은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 개시내용은 또한 생물학적 활성을 중화시키기 위해 TSLP에 결합하는 중화 항체 또는 이의 중화 단편을 포함한다. 생물학적 활성 중화는 리포터 분석에서 TSLP 자극 리포터 유전자 발현과 같은 TSLP 생물학적 활성의 하나 이상의 지표에 대한 분석으로 평가할 수 있다. TSLP의 생물학적 활성 중화는 또한 천식 또는 아토피 피부염의 동물 모델에 의해 생체내에서 평가될 수 있다. 바람직하게는 본 개시내용의 TSLP 결합 항체 및 단편은 TSLP에 의해 결합된 이의 수용체의 신호전달 기능과 연결된 TSLP의 생물학적 활성을 중화시킨다.
본 발명의 항체 또는 단편은 TSLP의 생물학적 활성에 영향을 미치는 TSLP 에피토프에 특이적으로 결합하는 중화 항체 또는 단편일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 단편은 TSLP의 중화-감응성 에피토프에 결합할 수 있다. TSLP의 중화-감응성 에피토프가 본 발명의 항체 또는 단편 중 하나에 의해 결합되는 경우, 에피토프를 포함하는 생물학적 활성의 손실이 초래된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 단편은 TSLP의 표적화된 활성에 직접적으로 관여하지 않는 TSLP의 에피토프에 결합함으로써 TSLP의 활성을 중화, 억제, 차단, 제거, 감소 또는 방해할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 단편은 TSLP의 표적화된 활성에 직접적으로 관여하지 않는 TSLP의 에피토프에 결합함으로써 TSLP의 활성을 중화, 억제, 차단, 제거, 감소 또는 방해할 수 있지만, 본 항체 또는 이에 결합하는 단편은 TSLP의 표적화된 활성을 입체적으로 또는 입체형태적으로 억제, 차단, 제거, 감소 또는 방해한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 그의 단편은 TSLP의 표적화된 활성에 직접적으로 관여하지 않는 TSLP의 에피토프에 결합하지만(즉, 비차단 항체), 본 항체 또는 이에 결합하는 단편은 TSLP의 제거율을 향상시킨다.
특정 실시양태에서, 본 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: a) TSLP 및 TSLPR의 결합을 억제하고; b) TSLP-의존적 유전자의 발현 수준을 감소시키고; c) TSLP-유도된 세포 증식을 억제하고; d) TSLP-유도된 STAT5 활성화를 억제하고/거나, e) 1차 인간 수지상 세포로부터 TSLP-유도된 CCL17 생산을 억제한다.
약제학적 조성물
본 개시내용에 따라 사용하기 위한 TSLP 결합 항체 및 항체 단편은 본 명세서의 방법에서 사용하기 위한 조성물, 특히 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 치료적 또는 예방학적 유효량의 본 개시내용의 TSLP 결합 항체 또는 항체 단편을 적합한 담체, 예를 들어 약제학적으로 허용 가능한 제제와 혼합물로 포함한다. 통상적으로, 본 개시내용의 TSLP 결합 항체 및 항체 단편은 약제학적 조성물로 제형화하기 전에 동물에 투여하기 위해 충분히 정제된다.
약제학적으로 허용 가능한 제제는 담체, 부형제, 희석제, 항산화제, 보존제, 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 현탁제, 용매, 충전제, 증량제, 완충제, 전달 비히클, 등장화제, 공용매, 습윤제, 착화제, 완충제, 항균제 및 계면활성제를 포함한다.
조성물은 액체 형태 또는 동결건조 또는 냉동건조 형태일 수 있고, 하나 이상의 동결보호제, 부형제, 계면활성제, 고분자량 구조 첨가제 및/또는 증량제를 포함할 수 있다.
조성물은 비경구 투여에 적합할 수 있다. 예시적인 조성물은 관절내, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 뇌내(실질내), 뇌실내, 근육내, 안구내, 동맥내, 병변내, 직장내, 경피, 경구 및 흡입 경로와 같이 당업자에게 이용가능한 임의의 경로에 의해 동물에 주사 또는 주입하기에 적합하다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 산물의 국소 농도(예를 들어, 볼루스(bolus), 데포(depot) 효과) 지속 방출 및/또는 특정 국소 환경에서 증가된 안정성 또는 반감기를 제공하는 방식으로 제어 또는 지속 전달을 위해 제형화될 수 있다.
사용 방법
본 발명의 항체 및 단편은 TSLP-매개 질병 또는 의학적 병태, 예를 들어 천식, 알레르기성 비염, 아토피 피부염, 알레르기 및 특정 암의 예방 및 치료에 유용하다.
본 개시내용의 일 양상은 치료적 유효량의 대상 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 임의의 하나 및 대상 약제학적 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여함으로써 Th2 유도되지 않은 천식을 포함하는 중등도 내지 중증의 비제어 천식을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 치료적 유효량의 대상 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 임의의 하나 및 대상 약제학적 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여함으로써 섬유증 질병 및 전신 경화증, 전신 특발성 폐 섬유증, 및 켈로이드 질병을 포함하는 관련 병태를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 치료적 유효량의 대상 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 임의의 하나 및 대상 약제학적 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여함으로써 제거종, 만성 기관지염 및 난치성 천식과 같은 만성 폐쇄성 폐 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 비염, 아토피 피부염, 습진, 식품 알레르기 및 염증성 장 질병을 포함하는 염증성 질병과 관련된 장애를 치료하는 방법을 제공하며; 본 방법은 본 개시내용의 또 다른 양상은 치료적 유효량의 대상 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 임의의 하나 및 대상 약제학적 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 폐암, 유방암, 췌장암, 결장직장암, 림프모구성 백혈병, 두경부 암종을 포함하는 특정 암을 치료하는 방법을 제공하며; 본 방법은 치료적 유효량의 대상 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 임의의 하나 및 대상 약제학적 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 일 양상은 또한 TSLP와 이의 수용체 TLPR의 결합을 차단하기 위한 의약, 및/또는 본 명세서에 제공된 것과 같은 TSLP 매개 질병 또는 의학적 병태의 예방 및 치료를 위한 의약의 제조에서 본 명세서에 제공된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 본 개시내용의 양상은 또한 TSLP와 이의 수용체 TLPR의 결합을 차단하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 본 명세서에 제공된 것과 같은 TSLP 매개 질병 또는 의학적 병태의 예방 및 치료를 위한 방법의 용도를 제공한다. 예를 들어, 실시양태에서, 본 개시내용은 천식, COPD, 특발성 폐 섬유증, 아토피 피부염, 습진, 호산구성 식도염, 염증성 장 질병, 전신 경화증, 전신 특발성 폐 섬유증, 켈로이드 질병, 또는 암을 치료하기 위한 방법에서 본 명세서에 제공된 항체의 용도를 제공한다.
치료적 용도에 추가하여, 본 발명의 항체 및 단편은 효소 결합 면역흡착 분석법(Rizos C.V.), 방사선면역분석법(RIA) 또는 조직 면역조직화학법과 같은 통상적인 면역분석을 사용하여(예를 들어, 혈청 또는 혈장과 같은 생물학적 샘플 내) TSLP를 검출하기 위한 진단 방법에 사용될 수 있다.
생물학적 샘플에서 TSLP를 검출하는 방법은 생물학적 샘플을 본 발명의 항체 또는 단편 중 하나 이상과 접촉시키고 TSLP에 결합된 항체 또는 단편 또는 결합되지 않은 항체 또는 단편을 검출하여 생물학적 샘플에서 TSLP를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 항체 또는 단편은 결합되거나 결합되지 않은 항체의 검출을 용이하게 하기 위해 검출 가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 적절한 검출 가능한 물질은 다양한 효소, 보결 그룹, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용을 보다 상세히 설명하기 위해 제공된다. 이는 본 개시내용을 제한하는 것이 아니라 예시하기 위한 것이다.
실시예 1: 마우스 항-TSLP 항체 TAVO202에 대한 TSLP 결합 친화도
TAVO202를 하이브리도마 스크리닝에 의해 마우스 항-인간 TSLP 항체로 확인하였다. ELISA 기반 결합 분석을 사용하여 재조합 인간 TSLP에 대한 TAVO202 결합을 평가했다. 이 분석에서 1 μg/mL 재조합 인간 TSLP(R&D Systems)를 ELISA 플레이트에 코팅하였다. TAVO202 항체의 농도를 증가시키면서 플레이트에 적용하고 재조합 인간 TSLP에 대한 이의 결합을 HRP-접합된 항-마우스 2차 항체에 의해 검출하였다. TAVO202는 2.4 ng/mL에서 EC50으로 재조합 인간 TSLP에 투여량 의존적으로 결합하는 것으로 관찰되었다(도 1a).
마우스 TSLP와 TAVO202의 결합을 또한 플레이트를 마우스 TSLP(R&D Systems)로 코팅함으로써 유사한 ELISA 분석에서 평가하였다. TAVO202는 마우스 TSLP에 대한 유의한 결합 친화도를 나타내지 않았다(도 1b).
실시예 2: TAVO202에 의한 TSLP 중화에 대한 시험관내 분석
TAVO202의 기능적 활성을 평가하기 위해 TSLP-매개 세포 증식 분석을 개발하였다. 이 분석에서, 인간 IL-7 수용체 알파(IL-7Rα) 및 TSLP 수용체(TSLPR)를 BAF3 마우스 pro-B 세포에 공동 형질감염시켰다. 재조합 인간 TSLP를 형질감염된 세포에 첨가하고 2일 후 세포 증식 분석으로 세포 증식을 정량화하였다. 재조합 인간 TSLP는 0.18 ng/mL에서 EC50으로 투여량 의존적 방식으로 형질감염된 BAF3 세포주의 증식을 자극할 수 있는 것으로 관찰되었다(도 2a).
TAVO202의 기능적 활성을 평가하기 위해, 0.5 ng/mL 인간 TSLP와 함께 TAVO202의 농도를 증가시키면서 IL-7Rα 및 TSLPR로 공동 형질감염된 BAF3 세포에 적용하였다. TAVO202는 6.6 ng/mL에서 IC50으로 형질감염된 BAF3 세포 증식을 자극하는 TSLP 활성을 투여량 의존적으로 중화할 수 있는 것으로 관찰되었다(도 2b).
세포 증식 분석 외에, TSLP-유도 리포터 유전자 발현 분석을 또한 TAVO202의 기능적 활성을 평가하기 위해 개발하였다. STAT5 활성화는 TSLP가 수용체 복합체(TSLPR:IL-7Rα)에 결합하여 활성화한 후 발생하는 하류 사건이다. 이 분석에서, TSLPR, IL-7Rα 및 STAT5 루시퍼라제 리포터 작제물을 발현하는 플라스미드를 HEK293T 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 1일 후, 재조합 인간 TSLP를 첨가하고 24시간 후에 TSLP-유도 루시페라제 리포터 유전자 발현을 정량화하였다. 인간 TSLP가 1.4 ng/mL에서 EC50으로 리포터 유전자 발현을 투여량 의존적으로 유도할 수 있는 것으로 관찰되었다(도 3a).
TAVO202의 기능적 활성을 평가하기 위해, 10 ng/mL 인간 TSLP와 함께 TAVO202의 농도를 증가시키면서 IL-7Rα, TSLPR 및 STAT5 루시퍼라제 리포터 유전자로 공동 형질감염된 HEK293T 세포에 적용하였다. TAVO202는 20 ng/mL의 IC50으로 리포터 유전자 발현을 자극하는 TSLP 활성을 투여량 의존적으로 중화시키는 것으로 관찰되었다(도 3b).
실시예 3: 마우스 항-인간 TSLP 항체 TAVO202의 인간화
마우스 항-인간 TSLP 항체 TAVO202를 마우스 CDR을 인간 생식계열 스캐폴드 상에 이식함으로써 인간화하였다. 소수의 주요 마우스 잔기를 면역원성을 최소화하면서 더 높은 안정성과 더 적절한 발현을 달성하기 위해 역돌연변이에 의해 보존시켰다. TAVO202의 경우 1개의 인간화 VH 변이체(202H2)를 IGHV1-69*02를 기반으로 설계하고 2개의 인간화 VL 변이체를 각각 IGKV1-9*01 및 IGKV6-21*01 기반 202L3 및 202L4 및 2개의 프레임워크의 역돌연변이로 설계하였다(도 4). 인간화 VH 변이체와 2개의 인간화 VL 변이체의 조합에 의해, TAVO6264 및 TAVO6265로 지정된 IgG2 Fc를 갖는 2개의 인간화 TAVO202 항체를 각각 202L3 및 202L4와 쌍을 이루는 202H2 변이체에 의해 생성하였다(도 4). 유사하게, TAVO7264 및 TAVO7265로 지정된 L234F, L235E, D265A, F405L 돌연변이된 IgG1 Fc를 갖는 2개의 인간화 TAVO202 항체를 또한 각각 202L3 및 202L4와 쌍을 이루는 202H2 변이체에 의해 생성하였다. 또한, TAVO9764 및 TAVO9765로 지정된 L234A, L235A, M428L, N434S 돌연변이된 IgG1 Fc를 갖는 2개의 인간화 TAVO202 항체를 또한 각각 202L3 및 202L4와 쌍을 이루는 202H2 변이체로 생성하였다(도 4).
실시예 4: 인간화 TAVO202의 발현 및 정제
TAVO6264, TAVO6265, TAVO7264, TAVO7265, TAVO9764, TAVO9765의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 플라스미드를 형질감염 키트 지침(Thermo Scientific)에 따라 Expi293F 세포에 공동 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후 세포를 원심분리시키고 상청액을 0.2 μm 필터에 통과시켰다. 상청액에 발현된 항체의 정제를 단백질 A 아가로스 컬럼(GE Healthcare Life Sciences)을 통한 친화도 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 정제된 항체를 투석을 통해 DPBS, pH 7.2로 완충액 교체하고, 단백질 농도를 280 nm에서의 UV 흡광도에 의해 결정하였다.
정제된 인간화 TAVO202 항체를 SDS-PAGE 분석에 적용하고 TAVO7264 및 TAVO7265에 대한 예를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다. 환원 조건 하에서 4개의 항체 모두 예상 분자량을 갖는 중쇄 및 경쇄를 나타내었다. 비환원 조건 하에 4개의 항체 모두는 약 150 kDa의 분자량을 갖는 주요 단백질 밴드로 이동했다. 정제된 인간화 TAVO202 항체를 또한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 평가하였다. 도 5c는 예시적인 항체 TAVO7264 및 TAVO7265의 SEC 프로파일을 나타냈다.
실시예 5: 인간화 TAVO202와 TSLP의 결합
ELISA 기반 결합 분석을 사용하여 재조합 인간 TSLP 항원에 결합하는 인간화 TAVO202 항체를 평가하였다. 이 분석에서 1 μg/mL 재조합 인간 TSLP(R&D Systems)를 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 인간화 TAVO202 항체의 농도를 증가시키면서 플레이트에 적용하고 재조합 인간 TSLP에 대한 이의 결합을 HRP-접합된 항-마우스 2차 항체에 의해 검출하였다. 예를 들어, TAVO6264 및 TAVO6265는 유사한 효능으로 재조합 인간 TSLP에 투여량 의존적으로 결합하고 마우스 항체 TAVO202와 유사한 것으로 관찰되었다(도 6a).
사이노몰구스 원숭이 TSLP에 대한 인간화 TAVO202 항체의 결합을 또한 플레이트를 사이노몰구스 원숭이 TSLP로 코팅함으로써 유사한 ELISA 분석에서 평가하였다. TAVO7264 또는 TAVO7265 항체 중 어느 것도 원숭이 TSLP에 결합할 수 없었다(도 6b).
고정된 재조합 TSLP에 대한 인간화 항체의 결합을 추가로 측정하기 위해 Biacore를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR) 결합 분석을 수행한다. 이 분석에 의해 결합 친화도뿐만 아니라 결합의 운동 속도 상수 및 열역학을 측정할 수 있다.
실시예 6: 인간화 TAVO202 항체에 의한 TSLP 중화에 대한 시험관내 분석
TSLP-유도 STAT5 루시퍼라제 리포터 유전자 발현 분석을 사용하여 인간화 TAVO202 항체의 기능적 활성을 평가하였다. 10 ng/mL 인간 TSLP와 함께 TAVO6264 및 TAVO6265의 농도를 증가시키면서 IL-7Rα, TSLPR 및 STAT5 루시퍼라제 리포터 유전자로 공동 형질감염된 HEK293T 세포를 적용했다. TAVO6264 및 TAVO6265 모두 TAVO202에 유사한 IC50으로 리포터 유전자 발현 자극에서 TSLP 활성을 투여량 의존적으로 중화할 수 있는 것으로 관찰되었다(도 7).
실시예 7: 인간화 TAVO202에 의한 TSLP 매개 수지상 세포 활성화의 억제
TSLP는 CCL17 케모카인의 증가된 분비로 1차 인간 CD1c+ 혈액 수지상 세포의 활성화를 자극할 수 있다. 활성화된 수지상 세포로부터의 TSLP-유도 CCL17 방출의 중화에서 인간화 TAVO202 항체를 평가하기 위해 생체외 분석을 설정하였다. CD1c+ 수지상 세포를 항-CD1c+ 항체 코팅 자기 비드 선택(Miltenyi Biotec)에 의해 공여체 말초혈 단핵 세포(PBMC)로부터 단리하였다. 단리된 세포를 재조합 인간 TSLP와 함께 인큐베이션하고 CCL17의 방출을 ELISA에 의해 정량화하였다. 15 ng/mL 재조합 인간 TSLP가 48시간 인큐베이션 후 활성화된 수지상 세포로부터 수배의 향상된 CCL17 방출을 자극할 수 있는 것으로 관찰되었다. TAVO7264와 TAVO7265는 모두 TSLP와 함께 1 ug/mL를 첨가할 때 활성화된 수지상 세포로부터 TSLP 유도 CCL17 방출을 차단할 수 있다. 도 8은 2개의 다른 공여체로부터 단리된 PBMC를 사용한 분석 결과를 보여준다.
실시예 8: 연장된 반감기 및 감소된 효과기 기능을 위한 인간화 항체의 F c 조작
인간화 항체의 PK 특징을 개선하기 위해, Fc 돌연변이를 IgG1 항체에 도입하여 항체 반감기를 연장할 수 있다. 구체적으로, M428L/N434S 돌연변이는 FcRn 결합 친화도를 증가시켜 항체 반감기를 연장하는 것으로 나타났다(문헌[Booth, Ramakrishnan et al. 2018]). 또한, L234A/L235A Fc 돌연변이는 IgG1 항체의 ADCC 및 CDC 효과기 기능을 제거할 수 있다(문헌[Hezareh, Hessell et al. 2001]). 따라서, L234A/L235A/M428L/N434S(AALS) 돌연변이된 202H1을 기반으로 하는 인간화 IgG1 중쇄를 생성하였으며, 이는 서열번호 16에 제시된 서열을 포함한다. 이 Fc-조작된 202H1 중쇄를 인간화 202L3 또는 202L4 경쇄와 짝지음으로써, 반감기가 연장되고 효과기 기능이 감소된 인간화 TAVO202 항체 2개를 생성하고 각각 TAVO9764 및 TAVO9765로 지정하였다(도 4).
Fc 조작 항체가 개선된 FcRn 결합 친화도를 갖는지를 연구하기 위해, 마우스 FcRn에 대한 TAVO9765 및 TAVO7265의 결합을 ELISA 기반 결합 분석에서 평가하였다. 1 μg/mL 재조합 마우스 FcRn(R&D Systems)을 ELISA 플레이트에 코팅했다. TAVO9765 및 TAVO7265 항체의 농도를 증가시키면서 플레이트에 적용하고 pH 6.0에서 재조합 FcRn에 대한 결합을 HRP-접합된 항-인간 2차 항체에 의해 검출하였다. Fc M428L/N434S 돌연변이된 TAVO9765는 이러한 반감기 연장 돌연변이가 부재하는 TAVO7265보다 약 10배 더 우수한 효능으로 FcRn에 결합할 수 있는 것으로 관찰되었다(도 9).
M428L/N434S 돌연변이가 항-TSLP 항체의 순환 반감기를 연장할 수 있는지를 결정하기 위해, TAVO9765를 시노몰구스 원숭이 PK 모델에서 시험하였다. TAVO9765를 0일째 체중을 기준으로 3분 동안 1.0 mL/kg의 부피로 수컷 나이브 사이노몰구스 원숭이에 4 mg/kg의 정맥내 주입으로 투여하였다. 전혈을 투여 전 및 투여 1h, 2h, 및 2일, 5일, 9일, 12일, 16일, 21일, 24일, 26일, 29일, 32일, 35일 후에 EDTA-K2 수집 튜브에 수집하였다. 혈장을 4℃에서 3500xg에서 10분 동안 원심분리하여 분리한 다음 -80℃에서 저장하기 위해 마이크로퍼지 튜브로 옮겼다. 인간 IgG를 검출하기 위해 표준 ELISA 방법으로 혈장 샘플을 측정하였다. 염소 항-인간 IgG는 포획 항체이고 HRP 접합된 염소 항-인간 IgG(H+L)는 검출 항체였다. 포획 및 검출 항체의 희석 배수는 각각 13,333 및 30,000이었다. PK 데이터를 반감기에 대해 분석하였다: Winnonlin 6.4 소프트웨어를 사용한 C0, AUC, Vd 및 제거율. TAVO9765에 대한 혈장 농도 대 시간의 PK 특징은 도 10에 나와 있다. TAVO9765에 대한 PK 매개변수는 다음과 같다: C0: 131405 ng·mL-1, 반감기: 26.131 d, AUC0-t: 1268621 ng·d·mL-1, AUC0-inf: 2128728 ng·d·mL-1, 제거율: 1.879 mL·kg-1·d-1, Vd: 71.049 mL·kg-1.
참조문헌
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SEQUENCE LISTING <110> TAVOTEK BIOTHERAPEUTICS (HONG KONG) LIMITED <120> AGENTS THAT INTERFERE WITH THYMIC STROMAL LYMPHOPOIETIN (TSLP)-RECEPTOR SIGNALING <130> TABI-002/01WO <150> US 62/873,051 <151> 2019-07-11 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Asn Asn Tyr Tyr Gly Thr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu 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Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 115 120 125 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 130 135 140 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 145 150 155 160 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165 170 175 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 19 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG3 Fc <400> 19 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 1 5 10 15 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 20 25 30 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 35 40 45 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 50 55 60 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 65 70 75 80 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 85 90 95 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 100 105 110 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 115 120 125 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 130 135 140 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 165 170 175 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 180 185 190 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 195 200 205 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 210 215 220 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 235 <210> 20 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 Fc <400> 20 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 1 5 10 15 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 100 105 110 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 225 230 <210> 21 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 Fc with M252Y/S254T/T256E mutations <400> 21 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys 35 40 45 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 50 55 60 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 65 70 75 80 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 85 90 95 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 100 105 110 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 115 120 125 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 130 135 140 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 165 170 175 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 180 185 190 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 195 200 205 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 210 215 220 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 22 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 Fc with M428L/N434S mutations <400> 22 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 35 40 45 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 50 55 60 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 65 70 75 80 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 85 90 95 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 100 105 110 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 115 120 125 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 130 135 140 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 165 170 175 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 180 185 190 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 195 200 205 Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr 210 215 220 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 23 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 Fc with T250Q/M428L mutations <400> 23 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 35 40 45 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 50 55 60 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 65 70 75 80 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 85 90 95 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 100 105 110 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 115 120 125 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 130 135 140 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 165 170 175 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 180 185 190 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 195 200 205 Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 210 215 220 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 24 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 Fc with N434A mutations <400> 24 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 35 40 45 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 50 55 60 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 65 70 75 80 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 85 90 95 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 100 105 110 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 115 120 125 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 130 135 140 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 165 170 175 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 180 185 190 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 195 200 205 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr 210 215 220 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 25 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 Fc with T307A/E380A/N434A mutations <400> 25 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 35 40 45 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 50 55 60 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 65 70 75 80 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Ala Val Leu 85 90 95 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 100 105 110 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 115 120 125 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 130 135 140 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Ser Asp Ile Ala Val Ala Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 165 170 175 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 180 185 190 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 195 200 205 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr 210 215 220 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 26 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 Fc with E233P/L234V/L235A mutations and G236 deleted <400> 26 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 20 25 30 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 50 55 60 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 65 70 75 80 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 85 90 95 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 100 105 110 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 115 120 125 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 130 135 140 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 165 170 175 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 27 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nti-TSLP humanized antibody heavy chain based on 202H2 with IgG2 Fc <400> 27 caagtgcagc tggtgcagtc cggagccgag gtgaagaagc ccggctccag cgtgaaggtg 60 agctgcaaag cctccggcta caccttcagc agctactggg tgaactgggt cagacaagcc 120 cccggccaag gactggagtg gattggccag atctatcccg gcgacggcga caccgattac 180 gcccagaagt tccaaggcag agccacactg accgccgaca agtccaccag caccgcctac 240 atggagctga gctctctgag gagcgaggat accgccgtgt acttctgcgc tagaggcacc 300 tactacaaca actactacgg caccgactac tggggccaag gcaccaccgt gaccgtgagc 360 agcgccagca ccaagggccc atccgtcttc cccctggccc cttgctccag aagcacctcc 420 gagagcacag ccgccctcgg atgtctggtg aaagactact tccccgagcc tgtgaccgtg 480 agctggaaca gcggcgccct gacaagcggc gtgcatacct ttcctgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt actccctgtc cagcgtggtg accgtgccca gcagcaattt cggcacccag 600 acctacacct gtaacgtgga tcacaagccc tccaacacca aagtggacaa gaccgtggag 660 aggaagtgct gtgtggaatg ccccccttgt cctgcccctc ccgtggctgg ccccagcgtg 720 ttcctcttcc ctcccaagcc caaggacacc ctcatgatca gcagaacacc cgaggtgacc 780 tgcgtcgtgg tggacgtgtc ccacgaggac cccgaggtgc agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag cccagggagg agcagttcaa ttccaccttc 900 agggtggtga gcgtgctgac cgtggtgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtga gcaacaaggg cctgcccgcc cccatcgaaa agaccatttc caaaaccaaa 1020 ggccagccca gggagcccca ggtgtacaca ctgcccccca gcagagagga gatgacaaag 1080 aaccaggtga gcctgacatg cctggtgaag ggcttttacc ctagcgacat cgctgtggag 1140 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacaa cccctcccat gctggattcc 1200 gatggctcct tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1260 aacgtgttct cctgttccgt gatgcatgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320 ctgagcctga gccccggcaa g 1341 <210> 28 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSLP humanized antibody light chain based on 202L3 <400> 28 gatatccagc tgacccagag ccccagcttt ctgagcgcta gcgtgggaga cagagtgacc 60 atcacatgca gcgtgtccag cagcatcagc agcagcaatc tgcactggta ccagcagaag 120 cccggcaagg cccccaagcc ttggatctac ggaaccagca atctggccag cggcgtgcct 180 agcagatttt ccggatccgg aagcggcacc gagtacacac tgaccatcag ctctctgcag 240 cccgaagacg ccgctaccta ctactgccag cagtggagca gctaccctct gaccttcggc 300 caaggcacca agctggagat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 29 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSLP humanized antibody light chain based on 202L4 <400> 29 gagatcgtgc tgacccagag ccccgatttc cagtccgtga cccccaagga gaaggtgacc 60 attacatgct ccgtgagcag cagcatcagc agcagcaatc tgcactggta ccagcagaag 120 cccgatcaga gccccaagcc ttggatttac ggcacaagca atctggccag cggagtgccc 180 tccagattca gcggcagcgg aagcggcacc gactacacac tgaccatcaa ctctctggag 240 gccgaggatg ccgccaccta ctactgccag cagtggagca gctaccctct gaccttcggc 300 caaggcacca agctggaaat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 30 <211> 159 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Phe Pro Phe Ala Leu Leu Tyr Val Leu Ser Val Ser Phe Arg Lys 1 5 10 15 Ile Phe Ile Leu Gln Leu Val Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asp Phe Thr 20 25 30 Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Ser Thr Ile Ser 35 40 45 Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser Thr Glu Phe Asn 50 55 60 Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu Thr Glu Ile Gln 65 70 75 80 Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser Leu Ala Lys Glu 85 90 95 Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly 100 105 110 Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg 115 120 125 Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu 130 135 140 Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln 145 150 155 <210> 31 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly 1 5 10 15 Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg 20 25 30 Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu 35 40 45 Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln 50 55 60

Claims (42)

  1. 흉선 기질 림포포이에틴(thymic stromal lymphopoietin) TSLP에 특이적으로 결합하고 TSLP의 활성을 중화, 억제, 차단, 제거(abrogating), 감소 또는 방해하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 항체 또는 단편은 서열번호 1에 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2에 제시된 경쇄 가변 영역을 갖는 마우스 단일클론 항체 또는 항체 단편인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 항체 또는 단편은 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 따르는 바와 같은 중쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 서열 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 항체 또는 단편은 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 따르는 바와 같은 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 서열 LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 항체 또는 단편은 인간화 항체 또는 항체 단편인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 인간화 항체 또는 단편은 서열번호 9에 제시된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  7. 제5항에 있어서, 인간화 항체 또는 단편은 서열번호 10에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  8. 제5항에 있어서, 인간화 항체 또는 단편은 서열번호 11에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  9. 제5항에 있어서, 항체 또는 단편은 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 따른 중쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 서열 HCDR1, HCDR2, HCDR3, 및 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 따른 경쇄의 LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함하고, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 9에 대해 적어도 80% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 10 또는 11에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  10. 제5항에 있어서, 인간화 항체는 서열번호 12에 제시된 인간 IgG 중쇄 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  11. 제5항에 있어서, 인간화 항체는 서열번호 13에 제시된 인간 경쇄 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  12. 제5항에 있어서, 인간화 항체는 서열번호 14에 제시된 인간 경쇄 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  13. 제5항에 있어서, 인간화 항체는 서열번호 15에 제시된 인간 IgG 중쇄 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  14. 제5항에 있어서, 인간화 항체는 서열번호 16에 제시된 인간 IgG 중쇄 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 동형(isotype)인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 모 야생형 항체와 비교하여 조작된 항체의 반감기를 연장하는 하나 이상의 Fc 돌연변이를 갖는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 모 야생형 항체와 비교하여 프로테아제에 의한 단백질분해적 분해(proteolytic degradation)에 대한 조작된 항체 내성을 향상시키는 하나 이상의 Fc 돌연변이를 갖는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 모 야생형 항체와 비교하여 조작된 항체의 효과기(effector) 기능을 감소 또는 제거하는 하나 이상의 Fc 돌연변이를 갖는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  19. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 모 야생형 항체와 비교하여, EU 인덱스(EU Index)에 따른 잔기 넘버링(residue numbering)으로, 반감기를 연장하고 조작된 항체의 효과기 기능을 감소시키는 L234A, L235A, M428L 및 N434S Fc 돌연변이를 갖는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  20. 제5항에 있어서, 인간화 항체 또는 단편은 서열번호 16에 제시된 L234A, L235A, M428L, N434S Fc 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 중쇄를 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 단편은 인간 TSLP와 이의 수용체 복합체의 결합을 차단하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 단편은 이의 수용체 복합체에 대한 TSLP의 기능적 활성을 중화, 감소 또는 방해하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 단편은 STAT5 리포터 유전자 분석에서 TSLP 유도 리포터 유전자를 중화시키는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 단편은 세포 증식 분석에서 TSLP 수용체 복합체를 발현하는 세포의 TSLP 유도 증식을 중화시키는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  25. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 단편은 사이토카인(cytokine) 방출 분석에서 인간 수지상 세포로부터의 TSLP 유도 사이토카인 방출을 억제하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  26. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 단편은 동물 천식 모델에서 TSLP 유도 천식 및 폐 염증을 억제하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  27. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에서와 같은 이의 항-TSLP IgG 항체를 인코딩(encoding)하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  28. 제27항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(vector).
  29. 제28항에 있어서, 발현 벡터인, 벡터.
  30. 제28항 또는 제29항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  31. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에서와 같은 항-TSLP IgG 항체 또는 단편을 생산하는 방법으로서, 항-TSLP IgG 항체 또는 단편이 발현되는 조건에서 제29항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항-TSLP IgG 항체 또는 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에서와 같은 항-TSLP IgG 항체 또는 단편의 반감기를 측정하는 방법.
  33. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에서와 같은 항-TSLP IgG 항체 또는 단편의 단백질분해적 분해에 대한 내성을 측정하는 방법.
  34. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에서와 같은 항-TSLP IgG 항체 또는 단편의 효과기 기능을 측정하는 방법.
  35. 이를 필요로 하는 대상체(subject)에서 TSLP 매개 질병 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항-TSLP IgG 항체 또는 단편의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, TSLP 매개 질병 또는 장애는 중증도 내지 중증의 비제어 천식(uncontrolled asthma)을 포함하는 천식인, 방법.
  37. 제35항에 있어서, TSLP 매개 질병 또는 장애는 전신 경화증(systemic sclerosis), 전신 특발성 폐 섬유증(systemic idiopathic pulmonary fibrosis), 및 켈로이드 질병(keloidal disease)을 포함하는 섬유성 질병 및 관련 병태(condition)인, 방법.
  38. 제35항에 있어서, TSLP 매개 질병 또는 장애는 제거종(emphysema), 만성 기관지염(chronic bronchitis) 및 난치성 천식(refractory asthma)과 같은 만성 폐쇄성 폐 질병인, 방법.
  39. 제35항에 있어서, TSLP 매개 질병 또는 장애는 비염(rhinitis), 아토피 피부염(atopic dermatitis), 습진(eczema), 전신 경화증, 식품 알레르기 및 염증성 장 질병을 포함하는 염증성 질병인, 방법.
  40. 제35항에 있어서, TSLP 매개 질병 또는 장애는 폐, 유방, 췌장, 결장직장, 림프모구성 백혈병, 두경부 암종을 포함하는 특정 암인, 방법.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상체에게 제2 제제(agent)를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 제2 제제는 코르티코스테로이드(corticosteroid), 기관지확장제(bronchodilator), 항히스타민제(antihistamine), 항-류코트리엔(anti-leukotriene), PDE-4 억제제; 항암제, 면역조절제, 사이토카인 치료제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.





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