TWI504609B - 抗原結合蛋白質 - Google Patents

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Description

抗原結合蛋白質
本發明係關於特異性結合抑瘤素M(OSM)且尤其人類OSM(hOSM)之免疫球蛋白。
本發明亦係關於用該等免疫球蛋白治療疾病或病症之方法、包含該等免疫球蛋白之醫藥組合物及其製造方法。經由以下描述將顯而易見本發明之其他實施例。
抑瘤素M為28 KDa醣蛋白，其屬於細胞因子之介白素6(IL-6)家族，其包括IL-6、白血病抑制因子(LIF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、心調理素-1(CT-1)及心調理素-1樣細胞因子(參見KishimotoT等人(1995)Blood 86：1243-1254)，其共用gp130跨膜信號傳導受體(參見Taga T及Kishimoto T(1997)Annu.Rev.Immunol.15：797-819)。OSM最初由於其能夠抑制黑素瘤細胞株A375生長而被發現(參見Malik N(1989)等人，Mol Cell Biol 9：2847-2853)。隨後，發現了更多作用且發現其為多功能介體，類似於IL-6家族之其他成員。OSM於多種細胞類型中產生，包括巨噬細胞、活化T細胞(參見Zarling JM(1986)PNAS(USA)83：9739-9743)、多形核嗜中性白血球(參見Grenier A等人，(1999)Blood 93：1413-1421)、嗜伊紅血球(參見Tamura S等人，(2002)Dev.Dyn.225：327-31)、樹突狀細胞(參見Suda T等人，(2002)Cytokine 17：335-340)。其亦於胰臟、腎、睪丸、脾、胃及腦(參見Znoyko I等人，(2005)Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 283：182-186)以及骨髓(參見Psenak O等人，(2003)Acta Haematol 109：68-75)中表現。其主要生物學作用包括活化內皮(參見Brown TJ等人，(1993)Blood 82：33-7)、活化急性期反應(參見Benigni F等人，(1996)Blood 87：1851-1854)、誘導細胞增殖或分化、調節發炎性介體釋放及血細胞生成(參見Tanaka M等人，(2003)102：3154-3162)、骨骼重塑(參見de Hooge ASK(2002)Am J Pathol 160：1733-1743)以及促進血管生成(參見Vasse M等人，(1999)Arterioscler Thromb Vasc Biol 19：1835-1842)及傷口癒合。
OSM之受體(OSM受體β，「OSMRβ」)於包括以下之多種細胞上表現：上皮細胞、軟骨細胞、纖維母細胞(參見Langdon C等人，(2003)J Immunol 170：548-555)、神經元平滑肌、淋巴結、骨骼、心臟、小腸、肺及腎(參見Tamura S等人，(2002)Mech Dev 115：127-131)及內皮細胞。若干證據表明內皮細胞為OSM之主要目標。該等細胞在受OSM刺激後表現10倍至20倍數目之高親和力受體及低親和力受體且呈現深遠及長期的表現型變化(參見Modur V等人，(1997)J Clin Invest 100：158-168)。此外，OSM為卡堡氏肉瘤細胞(Kaposi's sarcoma cell)之主要自分泌生長因子，卡堡氏肉瘤細胞被認為是起源於內皮細胞(參見Murakami-MoriK等人，(1995)J Clin Invest 96：1319-1327)。
與其他IL-6家族細胞因子相同，OSM結合於跨膜信號轉導醣蛋白gp130。gp130細胞激素之關鍵特徵為形成包含 gp130及一或多個共受體(視配位體而定)的寡聚受體複合物(評述於Heinrich PC等人，(2003)Biochem J.374：1-20中)。因此，視所形成之受體複合物之組成而定，該等細胞激素可在活體外及活體內介導共有及獨特的生物學活性。人類OSM(hOSM)與其他IL-6細胞激素之不同之處在於其可與gp130及兩種共受體(LIFR或抑瘤素受體(OSMR))中之任一者形成複合物。圖27說明hOSM與gp130、LIFR及OSMR之間的相互作用。
已解析hOSM之晶體結構且顯示其包含具有2個潛在糖基化作用位點之四α螺旋束。已藉由hOSM分子上之定點突變誘發鑑別兩個獨立的配位體結合位點(參見Deller MC等人，(2000)Structural Fold Des.8：863-874)。稱為位點II(有時稱為「位點2」)的第一位點與gp130相互作用且處於分子相對末端之稱為位點III(有時稱為「位點3」)的第二位點與LIFR或OSMR相互作用。突變誘發實驗已顯示LIFR之結合位點與OSMR之結合位點幾乎相同，但單胺基酸突變可區分兩者。
越來越多的證據支持調節OSM-gp130相互作用可有益於治療RA及其他疾病及病症，尤其慢性發炎性疾病及病症(諸如骨關節炎、特發性肺纖維化、疼痛、發炎性肺病、心血管疾病及牛皮癬)之假設。
在人類RA患者之SF中發現OSM(參見Hui W等人，(1997)56：184-7)。該等含量與SF中之嗜中性白血球數目、SF中之TNF α(有時稱為「TNF」)含量及軟骨損傷標誌物相關 (Manicourt DH等人，(2000)Arthritis Rheum 43：281-288)。此外，來自RA患者之滑液組織離體時自發地分泌OSM(參見Okamoto H等人，(1997)Arthritis and Rheumatism 40：1096-1105)。亦已證實OSM存在於滑液巨噬細胞中(Cawston TE等人，(1998)Arthritis Rheum 41：1760-1771)且如先前論述，OSM受體及gp130於內皮細胞、滑液纖維母細胞、軟骨細胞及成骨細胞上表現。正常小鼠關節中鼠類OSM(mOSM)之腺病毒表現引起嚴重發炎性及糜爛性關節炎(參見Langdon C等人，(2000)Am J Pathol 157：1187-1196)。類似地，侵襲性疾病見於腺病毒mOSM傳輸之後無TNF、IL-1、IL-6及iNOS之基因剔除(knockout)小鼠中(參見de Hooge ASK等人(2003)Arthritis and Rheumatism 48：1750-1761)，表明OSM可介導關節炎病理學之所有實施例。使用腺病毒表現之mOSM載體來表現小鼠OSM引起作為幼年特發性關節炎之特徵之生長板破壞(參見de Hooge ASK等人(2003)Arthritis and Rheumatism 48：1750-1761)。在膠原蛋白誘發之關節炎之實驗模型中，治療性投與小鼠之抗OSM抗體防止疾病之所有進一步發展。當預防性投與患異姥鮫烷(pristane)誘發之關節炎之小鼠(模擬人類疾病之復發/緩解模型)抗OSM時，發現類似結果(參見Plater-Zyberk C等人，(2001)Arthritis and Rheumatism 44)。
骨關節炎為影響關節之病狀。骨關節炎具有3個特徵。其引起軟骨(使骨骼排齊且使關節能夠在無摩擦情況下容易地移動之堅固光滑表面)損傷。其引起關節邊緣周圍形 成骨骼生長且其引起關節周圍組織之輕度炎症(滑膜炎)。已證明OSM在軟骨損壞、炎症及骨骼轉換中起重要作用且因此阻斷此細胞激素可在疾病病因之關鍵態樣中起作用。OSM與IL-1或TNF協同作用以誘導人類鼻軟骨中之膠原溶解，其涉及蛋白聚糖(PG)及膠原蛋白損失，後者與誘導MMP-1及MMP-13有關。OSM與IL-1一起將亦誘導人類關節軟骨之PG損失，但膠原蛋白損失未顯著增加(Morgan等人，2006)。許多使用腺病毒載體增加關節細胞激素濃度之研究表明OSM過表現將誘發炎症、關節翳形成、軟骨破壞及骨侵蝕(Langdon等人，2000)。總而言之，文獻提出OSM(尤其當與其他細胞激素組合時)誘導與引起軟骨退化及骨侵蝕之蛋白聚糖及膠原蛋白分解有關之蛋白酶。
來自文獻之資訊表明OSM分子可能與跟牛皮癬相關之發炎過程有一定的相關性。Boifati等人，(1998)之研究表明與非病灶性牛皮癬皮膚及正常皮膚相比，牛皮癬病灶之器官培養物中OSM之自發性釋放增加(Kunsfeild等人，2004)。角質化細胞表現此分子之受體且回應於該配位體，此引起角質化細胞遷移且增加重組表皮之厚度。比較OSM與33種不同細胞激素之基因調節作用之微陣列分析表明OSM為有效的角質化細胞活化劑且在諸如S100A7之分子之誘導及β-防禦素2表現(牛皮癬皮膚之特徵)中可與促炎性細胞激素協同作用(Gazel等人，2006)。
文獻中亦提出OSM在發炎性肺病(諸如哮喘及肺纖維化)中之作用。該等疾病之特徵在於細胞外基質(ECM)沈積增 加，伴有上皮下層纖維母細胞增殖及活化。已在急性肺損傷期間(尤其在肺炎情況下)患者之支氣管肺泡灌洗流體中偵測到OSM(Grenier等人，2001)。
已在MS患者腦中偵測到OSM，其在MS患者腦中侷限於微神經膠質細胞、星形膠質細胞及浸潤性白血球(Ruprecht等人，2001)。此外，與來自健康對照物之細胞相比，自MS患者分離之PBMC自發地釋放更多細胞激素(包括OSM)且MS患者展示血清[OSM]增加的趨勢(Ensoli等人，2002)。
除促進腦部炎症外，OSM可直接促成神經退化，此為阿茲海默氏病(Alzhiemer's disease)、MS及一部分HIV患者之特徵。來自HIV患者之單核細胞上清液引起極度神經母細胞生長抑制及神經元細胞死亡。該等作用係由培養物上清液中之抑瘤素M介導(Ensoli等人，1999)。因為許多HIV患者罹患由神經元細胞損失引起之腦萎縮，所以OSM可為此病理之一種介體。
Tamura等人之研究表明OSM可能與神經痛之發展及維持有關(2003)。其研究揭示一小部分表現OSMβ受體之疼痛感受性感覺神經元。所有OSMβR+ve神經元亦表現VR1及P2X3受體，已證實VR1及P2X3受體對神經痛及發炎性疼痛之發展為關鍵的(Jarvis等人，2002,Walker等人，2003)。亦已證實OSM -/-小鼠對化學、熱、內臟及機械疼痛展示之有害反應降低(Morikawa等人，2004)。有趣的是，該等動物缺乏VR1+、P2X3+小型神經元，但在其他方 面表現正常。
文獻中亦提出支持OSM調節癌細胞生物學之作用。已報導在使用腫瘤細胞株之研究中OSM具有生長刺激及生長抑制兩種性質(Grant及Begly 1999)。其為卡堡氏肉瘤衍生之細胞(Miles等人，1992)及骨髓瘤細胞株(Zhang等人，1994)之有效有絲分裂促進劑。OSM降低多種腫瘤細胞株(包括乳房(Douglas等人，1998)及肺(McKormick等人，2000))之生長速率且增加其分化。然而，儘管OSM可抑制生長(至少在一些乳房癌瘤細胞株中)，但其增加細胞分離且增強轉移潛能(Holzer等人，2004,Jorcyk等人，2006)。在一些腫瘤細胞株中，OSM亦上調玻尿酸受體CD44之表現及活化狀態(Cichy等人，2000)，玻尿酸受體CD44與腫瘤生長及轉移有關(Yu等人，1997)。此外，OSM之血管生成性質及其誘導一些腫瘤細胞中之其他血管生成因子之能力(Repovic等人，2003)表明其可促成該等表現OSM之腫瘤中之腫瘤血管生成。科學文獻提出OSM與腫瘤生物學有關，但指出其複雜性。OSM中和作用可能對治療一些腫瘤有益。另一方面，類似於TNF及IL-6中和作用，其在其他方面具有一定潛在風險。
來自文獻之證據表明OSM於心血管疾病中之潛在作用。在動脈粥樣硬化病灶中之組織巨噬細胞中發現OSM(Modur等人，1997)且其作為血管生成因子(Vasse等人，1999)可促進認為促成血管壁脆性之動脈粥樣硬化斑之新血管形成特徵。然而，OSM亦誘導內皮細胞中之其他血管生成因 子，VEGF(Wijelah等人，1997)及bFGF(Bernard等人，1999)之表現。有趣的是，人類內皮細胞之OSM受體密度為其他細胞的大約10-20倍(Brown等人，1991)。
因此本發明之一目標為提供治療RA及其他疾病及病症，尤其慢性發炎性疾病及病症(諸如骨關節炎、特發性肺纖維化、癌症、哮喘、疼痛、心血管病及牛皮癬)之治療方法。詳言之，本發明之一目標為提供特異性結合OSM(例如hOSM，尤其其位點II)且調節(亦即抑制或阻斷)OSM與gp130之間相互作用的免疫球蛋白，尤其為抗體，用於治療對該相互作用之調節起反應之疾病及病症。
WO 99/48523中揭示OSM拮抗劑治療發炎性疾病及病症之用途。此揭示案在關節炎鼠類模型中使用抗小鼠OSM抗體。
本說明書中揭示之所有專利及參考文獻均明確地且完整地以引用的方式併入本文中。
本發明提供能夠結合於OSM之抗原結合蛋白質，例如特異性結合於OSM之抗體，且其抑制OSM與gp130受體之結合但不直接與位點II處之殘基相互作用。
本發明之OSM抗體係指或衍生自鼠類mAb 10G8。10G8鼠類重鏈可變區胺基酸序列提供為SEQ ID NO：26且10G8鼠類輕鏈可變區胺基酸序列提供為SEQ ID NO：28。
本發明之重鏈可變區(VH)可包含以下CDR或該等CDR之變異體(如由Kabat定義(Kabat等人；Sequences of proteins of Immunological Interest NIH,1987))：
SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：77之CDRH1
SEQ ID NO：2之CDRH2
SEQ ID NO：3之CDRH3。
本發明之輕鏈可變區(VL)可包含以下CDR或該等CDR之變異體(如由Kabat定義(Kabat等人；Sequences of proteins of Immunological Interest NIH,1987))：
SEQ ID NO：4之CDRL1
SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：78之CDRL2
SEQ ID NO：6之CDRL3。
本發明亦提供編碼本文中所描述之任何抗原結合蛋白質之重鏈的聚核苷酸序列及編碼本文中所描述之任何抗原結合蛋白質之輕鏈的聚核苷酸。該等聚核苷酸表示對應於等效多肽序列之編碼序列，然而應理解，該等聚核苷酸序列可與起始密碼子、適當信號序列及終止密碼子一起選殖至表現載體中。
本發明亦提供重組轉型或轉染之宿主細胞，其包含一或多個編碼本文中所描述之任何抗原結合蛋白質之重鏈及/或輕鏈之聚核苷酸。
本發明進一步提供製備本文中所描述之任何抗原結合蛋白質之方法，該方法包含於合適培養基(例如無血清培養基)中培養包含第一載體及第二載體之宿主細胞之步驟，該第一載體包含編碼本文中所描述之任何抗原結合蛋白質之重鏈的聚核苷酸且該第二載體包含編碼本文中所描述之 任何抗原結合蛋白質之輕鏈的聚核苷酸。
本發明進一步提供包含本文中所描述之抗原結合蛋白質及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明提供治療或預防對調節hOSM與gp130之間的相互作用起反應之疾病或病症的方法，該方法包含投與該患者治療有效量之如本文中所描述之抗原結合蛋白質之步驟。
因此本發明之一目標為提供治療RA及其他疾病及病症，尤其慢性發炎性疾病及病症(諸如骨關節炎、特發性肺纖維化、疼痛、發炎性肺病、心血管疾病及牛皮癬)之治療方法。詳言之，本發明之一目標為提供特異性結合OSM(例如hOSM，尤其其位點II)且調節(亦即抑制或阻斷)OSM與gp130之間的相互作用的免疫球蛋白，尤其為抗體，用於治療對該相互作用之調節起反應之疾病及病症。
在本發明之另一態樣中，提供治療罹患發炎性疾病或病症之人類患者之方法，該方法包含投與該患者治療有效量之如本文中所描述之抗原結合蛋白質之步驟。
在本發明之另一態樣中，提供人類化抗體之方法，該方法包含以下步驟：獲得結合於目標抗原之非人類抗體，獲得抗體-抗原共晶體之晶體結構，自晶體結構確定與抗原結合直接相關之非人類抗體之殘基為約2-5 Å，使與衍生自人類序列之殘基結合無關的殘基中之一或多者突變及回收該抗體。
本發明提供特異性結合於OSM之抗原結合蛋白質，例如特異性結合於人類OSM(hOSM)之抗原結合蛋白質，且其抑制OSM與gp130受體之結合但不直接與位點II處之殘基相互作用。
在如本文中所描述之本發明之另一態樣中，抗原結合蛋白質不直接結合於殘基Q20、G120、Q16、N124。
在如本文中所描述之本發明之另一態樣中，提供特異性結合於OSM之抗原結合蛋白質，例如特異性結合於人類OSM(hOSM)之抗原結合蛋白質，且其抑制OSM與gp130受體之結合且與hu OSM之殘基82、83、84、90、94、112、115、122、123、152中之一或多者相互作用。
在一個該類態樣中，本發明提供特異性結合於OSM之抗原結合蛋白質，例如特異性結合於人類OSM(hOSM)之抗原結合蛋白質，且其抑制OSM與gp130受體之結合但不直接與位點II處之殘基相互作用且在競爭性ELISA分析法中不與具有SEQ ID NO：79之重鏈及SEQ ID NO：80之輕鏈的抗體競爭。
在一個該類態樣中，本發明提供與本文中所描述之抗原結合蛋白質競爭結合於OSM(例如人類OSM)之抗原結合蛋白質。
在另一態樣中，抗原結合蛋白質以高親和力結合於人類OSM，例如當藉由Biacore量測時，抗原結合蛋白質以500 pM或500 pM以下之親和力或400 pM或400 pM以下、或300 pM或300 pM以下、或250 pM或250 pM以下、或200 pM或 200 pM以下、或例如140 pM或140 pM以下之親和力結合於人類OSM。在另一實施例中，當藉由Biacore量測時，抗原結合蛋白質以介於約100 pM與約500 pM之間，或介於約100 pM與約300 pM之間，或介於約100 pM與約250 pM之間，或介於約100 pM與約200 pM之間的親和力結合於人類OSM。在本發明之一個實施例中，抗原結合蛋白質以小於250 pm之親和力結合OSM。在本發明之另一實施例中，抗原結合蛋白質以小於140 pm之親和力結合OSM。
在一個該類實施例中，此係藉由Biacore量測，例如實例2.5.1中所述。
在另一態樣中，抗原結合蛋白質以高親和力結合於人類OSM，例如當藉由基於溶液之Kinexa方法量測時，抗原結合蛋白質以200 pM或200 pM以下之親和力或150 pM或150 pM以下、或100 pM或100 pM以下、或50 pM或50 pM以下、或例如40 pM或40 pM以下之親和力結合於人類OSM。在另一實施例中，當藉由Kinexa量測時，抗原結合蛋白質以介於約10 pM與約200 pM之間，或介於約10 pM與約150 pM之間，或介於約10 pM與約100 pM之間，或介於約10 pM與約70 pM之間，或介於約10 pM與約40 pM之間的親和力結合於人類OSM。在本發明之一個實施例中，抗原結合蛋白質以小於70 pm之親和力結合OSM。在本發明之另一實施例中，抗原結合蛋白質以小於40 pm之親和力結合OSM。
在一個該類實施例中，此係藉由Kinexa量測，例如實例 2.5.1中所述。
在另一態樣中，抗原結合蛋白質在細胞中和分析法中結合於人類OSM且中和OSM，其中抗原結合蛋白質之IC50 介於約10 pM與約200 pM之間，或介於約10 pM與約150 pM之間，或介於約10 pM與約100 pM之間，或介於約20 pM與約100 pM之間，或介於約20 pM與約100 pM之間。在本發明之另一實施例中，抗原結合蛋白質在細胞中和分析法中結合OSM且中和OSM，其中抗原結合蛋白質之IC50 為約20 pM且親和力小於140 pm。
在一個該類實施例中，此係藉由細胞中和分析法量測，例如實例2章節2.2.1中所述。
在一個態樣中，本發明進一步提供包含SEQ ID NO：3或SEO ID NO：3之變異體之CDRH3的抗原結合蛋白質，在該SEQ ID NO：3之變異體中，CDRH3在以下一或多個位置處經下述替代性胺基酸取代(使用Kabat編號)：
位置95經Ala、Glu、Gly、His、Leu、Met、Pro、Gln、Ser、Thr或Val取代
位置96經Ala、Cys、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Ser、Thr、Trp或Tyr取代
位置97經Ala、Cys、Phe、Met或Ser取代
位置98經Ala、Asp、Phe、Gly、Leu、Pro、Gln或Trp取代
位置99經Ala、Cys、Pro、Ser、Val或Tyr取代
位置100B由Glu取代
位置100C經Ala、Glu、Phe、Gly、Val或Trp取代
位置100D經Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Leu、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代
位置101經Glu、Gly、Ser、Thr或Val取代
位置102經Ala、Phe、Gly、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Tyr、His、Ile、Asp或Trp取代
在本發明之另一態樣中，抗原結合蛋白質包含：i)如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3之變異體所述之CDRH3，在該SEQ ID NO：3之變異體中，Val 102經Tyr、His、Ile、Ser、Asp或Gly取代；ii)如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2之變異體所述之CDRH2，在SEQ ID NO：2之變異體中，Thr50經Gly、Tyr、Phe、Ile、Glu或Val取代及/或Ile51經Leu、Val、Thr、Ser或Asn取代及/或Ser52經Phe、Trp或His取代及/或Gly53經Asp、Ser或Asn取代及/或Gly54經Ser取代及/或Phe56經Ser、Tyr、Thr、Asn、Asp或Arg取代及/或Tyr58經Gly、His、Phe、Asp或Asn取代；iii)如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：4之變異體所述之CDRL1，在該SEQ ID NO：4之變異體中，Ser27A經Asn、Asp、Thr或Glu取代及/或Ser27C經Asp、Leu、Tyr、Val、Ile、Asn、Phe、His、Gly或Thr取代及/或Asn31經Ser、Thr、Lys或Gly取代及/或Phe32經Tyr、Asn、Ala、His、Ser或Arg取代及/或Met33經Leu、Val、Ile或Phe取代；iv)如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：6之變異體所述之CDRL3，在該SEQ ID NO：6之變異體中，Leu89經Gln、 Ser、Gly或Phe取代及/或His90經Gln或Asn取代，Ser91經Asn、Phe、Gly、Arg、Asp、His、Thr、Tyr或Val取代及/或Arg92經Asn、Tyr、Trp、Thr、Ser、Gln、His、Ala或Asp取代及/或Glu93經Asn、Gly、His、Thr、Ser、Ar或Ala取代及/或Phe96經Pro、Leu、Tyr、Arg、Ile或Trp取代。
在又一態樣中，抗原結合蛋白質進一步包含：v)如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：78所述之CDRL2。
在又一態樣中，抗原結合蛋白質進一步包含：vi)如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：77之變異體所述之CDRH1，在該SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：77之變異體中，Tyr32經Ile、His、Phe、Thr、Asn、Cys、Glu或Asp取代及/或Ala33經Tyr、Trp、Gly、Thr、Leu或Val取代及/或Met34經Ile、Val或Trp取代及/或Ser35經His、Glu、Asn、Gln、Tyr或Thr取代。
已使用突變誘發及/或典型技術測定CDR L1、L2、L3、H1及H2之變異CDR序列。互補決定區(CDR)L1、L2、L3、H1及H2傾向於在結構上呈現有限數目之主鏈構形中之一者。CDR之特定典型結構類別係由CDR長度及環填充(loop packing)兩者來定義，由位於CDR及構架區中之關鍵位置處的殘基(結構決定殘基或SDR)來決定。Martin及Thornton(1996；J Mol Biol 263：800-815)已建立一種定義「關鍵殘基」典型模板之自動方法。使用群集分析來定義CDR組之典型類別，接著藉由分析嵌入式疏水物(buried hydrophobic)、氫鍵結之殘基及保守性甘胺酸及脯胺酸來 鑑別典型模板。可藉由將序列與關鍵殘基模板比較且使用一致性或相似性矩陣對各模板進行記分來將抗體序列之CDR歸類為典型類別。
在一個態樣中，本發明提供抗原結合蛋白質，其包含SEQ ID NO：3之CDRH3、SEQ ID NO：2之CDRH2、SEQ ID NO：4之CDRL1及SEQ ID NO：6之CDRL3且可進一步包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：77之CDRH1及SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：78之CDRL2。
在另一態樣中，抗原結合蛋白質包含SEQ ID NO：3之CDRH3、SEQ ID NO：2之CDRH2、SEQ ID NO：4之CDRL1、SEQ ID NO：5之CDRL2及SEQ ID NO：6之CDRL3。
在又一態樣中，抗原結合蛋白質包含SEQ ID NO：3之CDRH3、SEQ ID NO：2之CDRH2、SEQ ID NO：1之CDRH1、SEQ ID NO：4之CDRL1、SEQ ID NO：5之CDRL2及SEQ ID NO：6之CDRL3。
在又一態樣中，抗原結合蛋白質包含SEQ ID NO：3之CDRH3、SEQ ID NO：2之CDRH2、SEQ ID NO：1之CDRH1、SEQ ID NO：4之CDRL1、SEQ ID NO：78之CDRL2及SEQ ID NO：6之CDRL3。
在又一態樣中，抗原結合蛋白質包含SEQ ID NO：3之CDRH3、SEQ ID NO：2之CDRH2、SEQ ID NO：77之CDRH1、SEQ ID NO：4之CDRL1、SEQ ID NO：5之CDRL2及SEQ ID NO：6之CDRL3。
在又一態樣中，抗原結合蛋白質包含SEQ ID NO：3之CDRH3、SEQ ID NO：2之CDRH2、SEQ ID NO：77之CDRH1、SEQ ID NO：4之CDRL1、SEQ ID NO：78之CDRL2及SEQ ID NO：6之CDRL3。
在本發明之一個態樣中，抗原結合蛋白質不直接經由CDRH1與OSM相互作用。
在一個態樣中，抗原結合蛋白質不直接經由CDRH1或CDRL2與OSM相互作用。
本發明之抗原結合蛋白質可包含本發明之重鏈可變區及輕鏈可變區，其可格式化為天然抗體或其功能性片段或等效物之結構。因此，本發明之抗原結合蛋白質可包含當與合適輕鏈配對時格式化為全長抗體、(Fab')2 片段、Fab片段或其等效物(諸如scFV、雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體、四價雙特異性抗體(Tandab)等)之本發明之VH區。抗體可為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgM；IgA、IgE或IgD或其經修飾之變異體。可相應選擇抗體重鏈之恆定域。輕鏈恆定域可為恆定域或λ恆定域。此外，抗原結合蛋白質可包含所有類別之修飾，例如IgG二聚物、Fc突變體，其不再結合Fc受體或介導Clq結合。抗原結合蛋白質亦可為WO 86/01533中所描述類型之嵌合抗體，其包含抗原結合區及非免疫球蛋白區。
根據任何所需功能性選擇恆定區。IgG1可顯示經由結合於補體達成之溶解能力及/或將介導ADCC(抗體依賴性細胞毒性)。若需要非細胞毒性阻斷抗體，則可使用IgG4。 然而，IgG4抗體在製備過程中可顯示不穩定性且因此替代方法為修飾通常更穩定的IgG1。推薦之修飾描述於EP0307434中，例如位置235及237處之突變。因此本發明提供抗原結合蛋白質(例如本發明之抗體)之溶解或非溶解形式。
在某些形式中，本發明之抗體為具有本文中所描述之任何重鏈可變區之全長(例如H2L2四聚物)溶解或非溶解IgG1抗體。
本發明之抗原結合蛋白質係衍生自具有如SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：28所描述之可變區的鼠類抗體或其非鼠類等效物，諸如其大鼠、人類、嵌合或人類化變異體，例如其係衍生自具有如SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：62所描述之重鏈及輕鏈的人類化抗體。
在本發明之一個態樣中，提供包含選自以下任一者之經分離重鏈可變域的抗原結合蛋白質：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：74。
在本發明之另一態樣中，提供包含選自以下任一者之經分離輕鏈可變域的抗原結合蛋白質：SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：68。
在本發明之另一態樣中，提供包含選自SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEO ID NO：58或SEQ ID NO：74中之任一者之經分離重鏈可變域及選自SEO ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66或SEO ID NO：68中之任一者之經分離輕鏈可變域的抗原結合蛋白質。
在本發明之另一實施例中，提供包含SEQ ID NO：54之經分離重鏈可變域及SEQ ID NO：62之經分離輕鏈可變域的抗原結合蛋白質。在另一實施例中，抗原結合蛋白質包含SEQ ID NO：74之重鏈可變區及SEQ ID NO：62之輕鏈可變區。
在一個態樣中，本發明之抗原結合蛋白質包含由SEQ ID NO：53編碼之重鏈可變區及由SEQ ID NO：61編碼之輕鏈可變區。
在一個態樣中，本發明之抗原結合蛋白質包含由SEQ ID NO：73編碼之重鏈可變區及由SEQ ID NO：61編碼之輕鏈可變區。
在一個態樣中，提供編碼經分離可變重鏈之聚核苷酸，該聚核苷酸包含SEO ID NO：53或SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：73。
在一個態樣中，提供編碼經分離可變輕鏈之聚核苷酸，該聚核苷酸包含SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：65或SEO ID NO：67。
在另一態樣中，提供編碼經分離可變重鏈之聚核苷酸，該聚核苷酸包含SEO ID NO：53或SEQ ID NO：73；及編碼經分離可變輕鏈之聚核苷酸，該聚核苷酸包含SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：63或SEO ID NO：65或SEO ID NO：67。
在又一態樣中，提供編碼經分離可變重鏈之聚核苷酸，該聚核苷酸包含SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：73；及編碼經分離可變輕鏈之聚核苷酸，該聚核苷酸包含SEQ ID NO： 61。
在另一態樣中，抗原結合蛋白質可包含本文中所描述之任一可變重鏈與本文中所描述之任一輕鏈之組合。
在一個態樣中，抗原結合蛋白質為包含一或多個本文中所描述之本發明之CDR或本文中所描述之本發明之重鏈或輕鏈中之一者或兩者之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，抗原結合蛋白質結合靈長類動物OSM。在一個該類實施例中，抗原結合蛋白質另外結合非人類靈長類動物OSM，例如短尾獼猴OSM。在另一實施例中，抗原結合蛋白質結合狨猿OSM。
在一個態樣中，提供一種抗原結合蛋白質，其當藉由Biacore或Kinexa量測時以強於1 nM之親和力結合於狨猿OSM及人類OSM。
該等抗體中和狨猿OSM之能力提供評估OSM在其他適應症之狨猿疾病模型(諸如MS之EAE模型)中之作用的獨特手段。
在另一態樣中，抗原結合蛋白質係選自由dAb、Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、微抗體(miniantibody)及微型抗體(minibody)組成之群。
在本發明之一個態樣中，抗原結合蛋白質為人類化或嵌合抗體，在另一態樣中，抗體為人類化抗體。
在一個態樣中，抗體為單株抗體。
在一個態樣中，本發明進一步提供包含以下各者之抗原 結合蛋白質：i)如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3之變異體所述之CDRH3，在該SEQ ID NO：3之變異體中，CDRH3在以下一或多個位置處經下述替代性胺基酸取代：
位置95經Ala、Glu、Gly、His、Leu、Met、Pro、Gln、Ser、Thr或Val取代
位置96經Ala、Cys、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Ser、Thr、Trp或Tyr取代
位置97經Ala、Cys、Phe、Met或Ser取代
位置98經Ala、Asp、Phe、Gly、Leu、Pro、Gln或Trp取代
位置99經Ala、Cys、Pro、Ser、Val或Tyr取代
位置100B經Glu取代
位置100C經Ala、Glu、Phe、Gly、Val或Trp取代
位置100D經Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Leu、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代
位置101經Glu、Gly、Ser、Thr或Val取代
位置102經Ala、Phe、Gly、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Tyr、His、Ile、Asp或Trp取代；
ii)如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：77之變異體所述之CDRH1，在該SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：77之變異體中，Tyr32經Ile、His、Phe、Thr、Asn、Cys、Glu或Asp取代及/或Ala33經Tyr、Trp、Gly、Thr、Leu或Val取代及/或Met34經Ile、Val或Trp取代及/或Ser35經His、Glu、Asn、Gln、Tyr或Thr取代； iii)如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2之變異體所述之CDRH2，在該SEQ ID NO：2之變異體中，Thr50經Gly、Tyr、Phe、Ile、Glu或Val取代及/或Ile51經Leu、Val、Thr、Ser或Asn取代及/或Ser52經Phe、Trp或His取代及/或Gly53經Asp、Ser或Asn取代及/或Gly54經Ser取代及/或Phe56經Ser、Tyr、Thr、Asn、Asp或Arg取代及/或Tyr58經Gly、His、Phe、Asp或Asn取代；iv)如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：4之變異體所述之CDRL1，在該SEQ ID NO：4之變異體中，Ser27A經Asn、Asp、Thr或Glu取代及/或Ser27C經Asp、Leu、Tyr、Val、Ile、Asn、Phe、His、Gly或Thr取代及/或Asn31經Ser、Thr、Lys或Gly取代及/或Phe32經Tyr、Asn、Ala、His、Ser或Arg取代及/或Met33經Leu、Val、Ile或Phe取代；v)如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：78所述之CDRL2；vi)如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：6之變異體所述之CDRL3，在該SEQ ID NO：6之變異體中，Leu89經Gln、Ser、Gly或Phe取代及/或His90經Gln或Asn取代，Ser91經Asn、Phe、Gly、Arg、Asp、His、Thr、Tyr或Val取代及/或Arg92經Asn、Tyr、Trp、Thr、Ser、Gln、His、Ala或Asp取代及/或Glu93經Asn、Gly、His、Thr、Ser、Ar或Ala取代及/或Phe96經Pro、Leu、Tyr、Arg、Ile或Trp取代；vii)重鏈構架包含以下殘基：
位置2 Val、Ile或Gly
位置4 Leu或Val
位置20 Leu、Ile、Met或Val
位置22 Cys
位置24 Thr、Ala、Val、Gly或Ser
位置26 Gly
位置29 Ile、Phe、Leu或Ser
位置36 Trp
位置47 Trp
位置48 Ile、Met、Val或Leu
位置69 Ile、Leu、Phe、Met或Val
位置71 Arg
位置78 Ala、Leu、Val、Tyr或Phe
位置80 Leu、Met
位置90 Tyr或Phe
位置92 Cys
位置94 Arg、Lys、Gly、Ser、His或Asn。
在一個態樣中，本發明進一步提供包含以下各者之抗原結合蛋白質：i)如SEQ ID NO：3所述之CDRH3；ii)如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：77所述之CDRH1；iii)如SEO ID NO：2所述之CDRH2；iv)如SEO ID NO：4所述之CDRL1；v)如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：78所述之CDRL2；vi)如SEQ ID NO：6所述之CDRL3；vii)重鏈構架包含以下殘基：
位置2 Val、Ile或Gly
位置4 Leu或Val
位置20 Leu、Ile、Met或Val
位置22 Cys
位置24 Thr、Ala、Val、Gly或Ser
位置26 Gly
位置29 Ile、Phe、Leu或Ser
位置36 Trp
位置47 Trp
位置48 Ile、Met、Val或Leu
位置69 Ile、Leu、Phe、Met或Val
位置71 Arg
位置78 Ala、Leu、Val、Tyr或Phe
位置80 Leu、Met
位置90 Tyr或Phe
位置92 Cys
位置94 Arg、Lys、Gly、Ser、His或Asn。
在一個態樣中，本發明進一步提供包含以下各者之抗原結合蛋白質：
i)如SEQ ID NO：3所述之CDRH3；
ii)如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：77所述之CDRH1
iii)如SEQ ID NO：2所述之CDRH2
iv)如SEQ ID NO：4所述之CDRL1
v)如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：78所述之CDRL2
vi)如SEQ ID NO：6所述之CDRL3
vii)重鏈構架包含以下殘基：
位置2 Val
位置4 Leu
位置20 Leu
位置22 Cys
位置24 Ala
位置26 Gly
位置29 Phe
位置36 Trp
位置47 Trp
位置48 Val
位置69 Ile
位置71 Arg
位置78 Leu
位置80 Leu
位置90 Tyr
位置92 Cys
位置94 Arg。
在一個態樣中，本發明進一步提供包含以下各者之抗原結合蛋白質：i)如SEQ ID NO：3所述之CDRH3；ii)如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：77所述之CDRH1；iii)如SEQ ID NO：2所述之CDRH2； iv)如SEQ ID NO：4所述之CDRL1；v)如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：78所述之CDRL2；vi)如SEQ ID NO：6所述之CDRL3；vii)重鏈構架包含以下殘基：
位置2 Val
位置4 Leu
位置20 Leu
位置22 Cys
位置24 Ala
位置26 Gly
位置29 Phe
位置36 Trp
位置47 Trp
位置48 Leu
位置69 Ile、Leu、Phe、Met或Val
位置71 Arg
位置78 Ala
位置80 Leu、Met
位置90 Tyr或Phe
位置92 Cys
位置94 Arg、Lys、Gly、Ser、His或Asn。
本發明之抗原結合蛋白質(例如抗體)可藉由用包含本發明之抗原結合蛋白質之編碼序列之表現載體轉染宿主細胞來製備。藉由使抗原結合蛋白質之該等編碼序列與能夠控 制宿主細胞中之複製及表現及/或自宿主細胞分泌之習知調節控制序列操作性連結來製備表現載體或重組質體。調節序列包括啟動子序列(例如CMV啟動子)及訊號序列，其可衍生自其他已知抗體。類似地，可產生具有編碼互補抗原結合蛋白質輕鏈或重鏈之DNA序列的第二表現載體。在某些實施例中，除相關編碼序列及可選擇標記外，該第二表現載體與第一表現載體相同，以便儘可能確保各多肽鏈得以功能表現。或者，抗原結合蛋白質之重鏈及輕鏈編碼序列可存於單一載體上。
藉由習知技術用第一載體及第二載體兩者來共轉染所選宿主細胞(或僅藉由單一載體轉染)以產生本發明之經轉染之宿主細胞，其包含重組或合成輕鏈及重鏈兩者。接著藉由習知技術培養轉染之細胞以產生本發明之經工程改造之抗原結合蛋白質。藉由適當分析法(諸如ELISA或RIA)自培養物篩選包括重組重鏈及/或輕鏈之結合的抗原結合蛋白質。可使用類似習知技術構築其他抗原結合蛋白質。
熟習此項技術者可選擇用於在本發明之方法及組合物之構築中採用之選殖及次選殖步驟的適當載體。舉例而言，可使用習知pUC系列之選殖載體。一種載體，pUC19，可自諸如Amersham(Buckinghamshire,United Kingdom)或Pharmacia(Uppsala,Sweden)之供應機構購得。此外，任何能夠容易地複製、具有豐富的選殖位點及選擇基因(例如抗生素抗性)且易於操縱之載體均可用於選殖。因此，選殖載體之選擇不為本發明之限制因素。
表現載體亦可由適於擴增異源DNA序列表現之基因(例如哺乳動物二氫葉酸還原酶基因(DHFR))表徵。其他載體序列包括聚腺苷酸信號序列(諸如來自牛生長激素(BGH))及β球蛋白啟動子序列(β-glo-pro)。可由熟習此項技術者熟知的技術合成適用於本文之表現載體。
該等載體之組份(例如複製子、選擇基因、增強子、啟動子、信號序列及其類似物)可自商業或天然來源獲得或藉由用於引導重組DNA產物在所選宿主中表現及/或分泌之已知程序來合成。為此目的亦可選擇其他適當表現載體，其中許多類型在此項技術中已知用於哺乳動物、細菌、昆蟲、酵母及真菌表現。
本發明亦涵蓋經含有本發明之抗原結合蛋白質之編碼序列之重組質體轉染之細胞株。適用於選殖及該等選殖載體之其他操作之宿主細胞亦為習知的。然而，來自大腸桿菌(E.coli)之多種菌株之細胞可用於複製選殖載體及本發明之抗原結合蛋白質之構築過程中的其他步驟。
用於表現本發明之抗原結合蛋白質之合適宿主細胞或細胞株包括哺乳動物細胞(諸如NS0、Sp2/0、CHO(例如DG44)、COS、HEK)、纖維母細胞(例如3T3)及骨髓瘤細胞，例如其可於CHO或骨髓瘤細胞中表現。可使用人類細胞，因此使分子能夠經人類糖基化模式修飾。或者，可使用其他真核細胞株。適當哺乳動物宿主細胞之選擇以及轉殖、培養、擴增、篩選及產物產生及純化之方法在此項技術中為已知的。參見例如上文所引用之Sambrook等人。
可證明細菌細胞適用作適於表現本發明之重組Fab或其他實施例之宿主細胞(參見例如Plückthun,A.,Immunol.Rev.,130：151-188(1992))。然而，由於在細菌細胞中表現之蛋白質有呈未摺疊或不正確摺疊形式或呈非糖基化形式的趨勢，在細菌細胞中產生的任何重組Fab必須經篩選以保留抗原結合能力。若由細菌細胞表現之分子以適當摺疊形式產生，則該細菌細胞將為理想宿主，或在替代性實施例中，分子可於細菌宿主中表現，接著經後續再摺疊。舉例而言，用於表現之大腸桿菌之多種菌株在生物技術領域中熟知作為宿主細胞。在此方法中亦可使用枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、鏈黴菌(Streptomyces)、其他桿菌及類似物之多種菌株。
若需要，為熟習此項技術者所知之酵母細胞之菌株，以及昆蟲細胞(例如果蠅(Drosophila)及鱗翅目(Lepidoptera))及病毒表現系統亦可用作宿主細胞。參見例如Miller等人，Genetic Engineering,8：277-298,Plenum Press(1986)及其中引用的參考文獻。
可用來構築載體之一般方法、產生本發明之宿主細胞所需之轉染方法及自該宿主細胞產生本發明之抗原結合蛋白質所需之培養方法均可為習知技術。通常，本發明之培養方法為無血清培養方法，通常藉由在懸浮液中無血清培養細胞。類似地，一旦產生，即可根據此項技術中之標準程序自細胞培養物內含物純化本發明之抗原結合蛋白質，包括硫酸銨沈澱、親和管柱、管柱層析、凝膠電泳及其類似 方法。該等技術處於此項技術之技能範疇內且不限制本發明。舉例而言，WO 99/58679及WO 96/16990描述變化之抗體之製備。
表現抗原結合蛋白質之又一方法可利用於轉殖基因動物中表現，諸如美國專利第4,873,316號中所描述。此係關於使用動物酪蛋白啟動子之表現系統，動物酪蛋白啟動子在以轉殖基因方式併入哺乳動物中時使雌性能夠在其乳汁中產生所需重組蛋白質。
在本發明之另一實施例中，提供產生本發明之抗體之方法，該方法包含培養經編碼本發明之抗體之輕鏈及/或重鏈的載體轉型或轉染之宿主細胞及回收由此產生之抗體之步驟。
根據本發明，提供產生本發明之抗OSM抗體之方法，該抗體結合於人類OSM且中和人類OSM之活性，該方法包含以下步驟；(a)提供編碼抗體之重鏈之第一載體；(b)提供編碼抗體之輕鏈之第二載體；(c)用該等第一載體及第二載體轉型哺乳動物宿主細胞(例如CHO)；(d)在有助於抗體自該宿主細胞分泌至該培養基中之條件下培養步驟(c)之宿主細胞；(e)回收步驟(d)之所分泌抗體。
一旦藉由所需方法表現，接著藉由使用合適分析法來檢驗抗體之活體外活性。使用當前習知的ELISA分析法格式 來評估抗體與OSM之定性及定量結合。此外，其他活體外分析法亦可用於檢驗中和功效，隨後執行後續人類臨床研究以評估不管常用清除機制如何抗體在體內的持久性。
治療劑量及持續時間係關於本發明之分子在人體循環中之相對持續時間，且可由熟習此項技術者視所治療病狀及患者之一般健康狀況調整。預計可能需要在長時期(例如四至六個月)內重複給藥(例如一週一次或每兩週一次)以達成最大治療功效。
在本發明之一個實施例中，提供包含至少一個表現卡匣之重組轉型、轉染或轉導之宿主細胞，例如其中該表現卡匣包含編碼本文中所描述之本發明之抗原結合蛋白質之重鏈的聚核苷酸且進一步包含編碼本文中所描述之本發明之抗原結合蛋白質之輕鏈的聚核苷酸，或其中存在兩個表現卡匣且第一表現卡匣編碼輕鏈且第二表現卡匣編碼重鏈。舉例而言，在一個實施例中，第一表現卡匣包含編碼本文中所描述之本發明之包含恆定區之抗原結合蛋白質或其連接至恆定區之抗原結合片段之重鏈的聚核苷酸且進一步包含第二卡匣，該第二卡匣包含編碼本文中所描述之本發明之包含恆定區之抗原結合蛋白質或其連接至恆定區之抗原結合片段之輕鏈的聚核苷酸，例如第一表現卡匣包含編碼選自SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：76之重鏈的聚核苷酸且第二表現卡匣包含編碼選自SEQ ID NO：72之輕鏈的聚核苷酸。
應理解，本文中所描述之序列(SEO ID NO：25、27、 29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、83)包括實質上一致之序列，例如與本文中所描述之序列至少90%一致，例如至少91%、或至少92%、或至少93%或至少94%或至少95%、或至少96%、或至少97%或至少98%、或至少99%一致之序列。
對於核酸，術語「大體上一致性」指示兩個核酸或其指定序列在適當插入或缺失核苷酸下最佳對準且比較時，至少約80%核苷酸，至少約90%至約95%，或至少約98%至約99.5%核苷酸一致。或者，當該等區段在選擇性雜交條件下將與該股之互補序列雜交時存在大體上一致性。
對於核苷酸及胺基酸序列，術語「一致」指示兩個核酸或胺基酸序列之間在適當插入或缺失下最佳對準且比較時之一致程度。或者，當該等DNA區段在選擇性雜交條件下將與該股之互補序列雜交時存在大體上一致性。
在本發明之另一實施例中，提供經穩定轉型之宿主細胞，該宿主細胞包含載體，該載體包含一或多個編碼本文中所描述之包含恆定區之抗體或其連接至恆定區之抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈的表現卡匣。舉例而言，該等宿主細胞可包含編碼輕鏈之第一載體及編碼重鏈之第二載體，例如第一載體編碼選自SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：76之重鏈且第二載體編碼輕鏈，例如SEQ ID NO：72之輕鏈。
在本發明之另一實施例中，提供本文中所描述之本發明 之宿主細胞，其中該細胞為真核細胞，例如其中該細胞為哺乳動物細胞。該等細胞株之實例包括CHO或NS0。
在本發明之另一實施例中，提供產生本文中所描述之本發明之包含恆定區之抗體或其連接至恆定區之抗原結合片段之方法，該方法包含於培養基(例如無血清培養基)中培養宿主細胞之步驟。
在本發明之另一實施例中，提供本文中所描述之本發明之方法，其中該抗體進一步純化至相對於含有該抗體之無血清培養基至少95%或95%以上(例如98%或98%以上)純度。
在又一實施例中，提供包含抗原結合蛋白質及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物。
在本發明之另一實施例中，提供包含本文中所描述之本發明之組合物及使用說明書之分裝部分之套組。
本發明治療劑之投藥模式可為向宿主傳遞治療劑之任何合適途徑。本發明之抗原結合蛋白質及醫藥組合物尤其適用於非經腸投藥，亦即皮下(s.c.)、鞘內、腹膜內、肌肉內(i.m.)或靜脈內(i.v.)投藥。
本發明治療劑可製備為於醫藥學上可接受之載劑中含有有效量之本發明抗原結合蛋白質作為活性成分之醫藥組合物。在一個實施例中，本發明之預防性藥劑為呈備妥用於注射之含有抗原結合蛋白質之水性懸浮液或溶液形式。在一個實施例中，該懸浮液或溶液在生理學pH值下緩衝。在一個實施例中，用於非經腸投藥之組合物將包含本發明之 抗原結合蛋白質或其混合物溶解於醫藥學上可接受之載劑中之溶液。在一個實施例中，載劑為水性載劑。可使用多種水性載劑，例如0.9%生理鹽水、0.3%甘胺酸及其類似物。該等溶液可製成無菌的且通常不含顆粒物質。該等溶液可藉由習知的熟知滅菌技術(例如過濾)滅菌。組合物可視需要含有醫藥學上可接受之助劑物質以接近生理條件，諸如pH值調節劑及緩衝劑等。該醫藥調配物中本發明之抗原結合蛋白質之濃度可廣泛變化，亦即自小於約0.5重量%，通常為或至少約1重量%至高達約15重量%或20重量%不等且將主要基於流體體積、黏度等根據所選特定投藥模式選擇。
因此，用於肌肉內注射之本發明之醫藥組合物可製備為含有約1 mL無菌緩衝水及介於約1 ng至約100 mg之間，例如約50 ng至約30 mg或約5 mg至約25 mg抗原結合蛋白質，例如本發明之抗體。類似地，用於靜脈內輸注之本發明之醫藥組合物可製備為含有約250 ml無菌林格氏溶液(Ringer's solution)及約1 mg至約30 mg或5 mg至約25 mg本發明之抗原結合蛋白質/毫升林格氏溶液。用於製備可非經腸投藥之組合物之實際方法已為吾人所熟知或將為熟習此項技術者顯而易見且更詳細地描述於例如Remington's Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania中。關於可靜脈內投藥之本發明之抗原結合蛋白質調配物之製備，參見Lasmar U及Parkins D「The formulation of Biopharmaceutical products」， Pharma.Sci.Tech.today，第129-137頁，第3卷(2000年4月3日)；Wang,W「Instability,stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals」，Int.J.Pharm 185 (1999)129-188；Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B Ahern T.J.編，Manning M.C.,New York,NY：Plenum Press(1992)；Akers,M.J.「Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations」，J.Pharm Sci 91(2002)2283-2300；Imamura,K等人，「Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state」，J Pharm Sci 92(2003)266-274；Izutsu,Kkojima,S.「Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying」，J Pharm.Pharmacol,54(2002)1033-1039；Johnson,R,「Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization」，J.Pharm.Sci,91(2002)914-922；及Ha,E Wang W.Wang Y.j.「Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability」，J.Pharm Sci,91,2252-2264,(2002)，其以全文引用的方式併入本文中且由讀者特定參考。
在一個實施例中，本發明之治療劑當呈醫藥製劑形式時以單位劑型呈現。合適治療有效劑量將易於由熟習此項技術者確定。可根據患者體重計算合適劑量，例如合適劑量可在約0.1至約20 mg/kg，例如約1至約20 mg/kg，例如約10至約20 mg/kg或例如約1至約15 mg/kg，例如約10至約15 mg/kg範圍內。為有效治療人類之病狀，諸如哮喘或IPF， 合適劑量可在約0.1至約1000 mg，例如約0.1至約500 mg，例如約500 mg，例如約0.1至約100 mg，或約0.1至約80 mg，或約0.1至約60 mg，或約0.1至約40 mg，或例如約1至約100 mg，或約1至約50 mg本發明之抗原結合蛋白質範圍內，其可非經腸投與，例如皮下、靜脈內或肌肉內投與。可視需要以由醫師適當時選擇之合適時間間隔重複投與該劑量。
本文中所描述之抗原結合蛋白質可經凍乾以供儲存且在使用前於合適載劑中復原。已證實此技術對習知免疫球蛋白有效且可使用此項技術中已知的凍乾及復原技術。
在本發明之另一態樣中，提供治療罹患發炎性關節病(諸如類風濕性關節炎、幼年特發性關節炎、骨關節炎、牛皮癬性關節炎及僵直性脊椎炎)之人類患者之方法，該方法包含投與該患者治療有效量之如本文中所描述之抗原結合蛋白質之步驟。
在本發明之另一態樣中，提供治療罹患選自以下之疾病或病症之人類患者之方法：1型糖尿病、牛皮癬、發炎性腸病(IBD)(包括克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎(UC))、全身性紅斑狼瘡(SLE，狼瘡)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺炎、嗜伊紅血球性食道炎、全身性硬化症(SS)或特發性肺纖維化(IPF)、休格連氏症候群(Sjögren's syndrome)、硬皮病、血管炎(包括高安氏動脈炎(Takayasu arteritis)、巨細胞(顳)動脈炎、結節性多動脈炎、韋格納氏肉芽腫(Wegener's granulomatosis)、 川崎氏病(Kawasaki disease)、孤立性CNS血管炎、徹奇-斯全司動脈炎(Churg-Strauss arteritis)、顯微性多動脈炎/多血管炎、超敏性血管炎(過敏性血管炎)、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)及原發性冷凝球蛋白血症血管炎)、未分化脊柱關節病(USpA)、僵直性脊椎炎(AS)、移植體抗主體疾病(GVHD)、原發性膽汁肝硬化(PBC)、原發性硬化性膽管炎(PSC)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、多發性硬化症(MS)及哮喘，其中該方法包含投與該患者治療有效量之本文中所描述之抗原結合蛋白質之步驟。
上述疾病中之任一或多者可為本發明之治療方法之目標疾病。
在一特定態樣中，疾病或病症選自由骨關節炎(OA)、牛皮癬、特發性肺纖維化(IPF)、全身性硬化症(SS)、休格連氏症候群、硬皮病或多發性硬化症(MS)組成之群。
在本發明之一個態樣中，自體免疫疾病為骨關節炎。
在本發明之一個態樣中，自體免疫疾病為牛皮癬。
在本發明之一個態樣中，自體免疫疾病或病症為纖維變性疾病或病症。
在本發明之一個態樣中，自體免疫疾病為特發性肺纖維化(IPF)。
在本發明之一個態樣中，自體免疫疾病為全身性硬化症(SS)。
在本發明之一個態樣中，自體免疫疾病為休格連氏症候群。
在本發明之一個態樣中，自體免疫疾病為硬皮病。
在本發明之另一態樣中，提供降低或預防罹患軟骨退化(或易發生軟骨退化)之人類患者之軟骨退化之方法，該方法包含投與該患者治療有效量之本文中所描述之抗原結合蛋白質之步驟。
在本發明之另一態樣中，提供降低罹患對TNF α降低起反應之疾病或病症之患者中TNF α產生之方法，該方法包含投與該患者治療有效量之本文中所描述之抗原結合蛋白質。
在本發明之另一態樣中，提供治療關節炎疾病或病症之關節外表現(例如費爾提氏症候群(Feltys syndrome))及/或治療動脈粥樣硬化斑形成之方法，該方法包含投與罹患關節炎疾病或病症之關節外表現之人類患者治療有效量之如本文中所描述之抗原結合蛋白質之步驟。
在本發明之另一態樣中，提供治療罹患源於內皮細胞之疾病之人類患者之方法，該方法包含投與該患者治療有效量之如本文中所描述之抗原結合蛋白質之步驟。
在本發明之另一態樣中，提供治療罹患纖維變性疾病或病症(諸如特發性肺纖維化、進行性全身性硬化症(硬皮病)、肝纖維化、肝肉芽腫、血吸蟲病及利什曼體病(leishmaniasis))之人類患者之方法，該方法包含投與該患者治療有效量之如本文中所描述之抗原結合蛋白質之步驟。
在本發明之另一態樣中，提供治療罹患中樞神經系統疾 病或病症(諸如多發性硬化症(MS)、阿茲海默症(AD)及其他癡呆症)之方法且此外係關於在治療疼痛(尤其神經痛及/或發炎性疼痛)中之用途，其中該方法包含投與該患者治療有效量之如本文中所描述之抗原結合蛋白質之步驟。
亦提供本文中所描述之抗原結合蛋白質在製造用於治療本文中所描述之疾病及病症之藥劑中的用途。
舉例而言，在本發明之一個態樣中，提供本文中所描述之抗原結合蛋白質之用途，其係用於治療或預防對調節hOSM與gp130之間的相互作用起反應之疾病及病症。
在本發明之另一態樣中，提供本文中所描述之抗原結合蛋白質之用途，其係用於治療或預防發炎性關節病，諸如類風濕性關節炎、幼年特發性關節炎、骨關節炎、牛皮癬性關節炎及僵直性脊椎炎。
在本發明之又一態樣中，提供本文中所描述之抗原結合蛋白質之用途，其係用於治療或預防選自以下之疾病或病症：1型糖尿病、牛皮癬、發炎性腸病(IBD)(包括克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎(UC))、全身性紅斑狼瘡(SLE，狼瘡)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺炎、嗜伊紅血球性食道炎、全身性硬化症(SS)或特發性肺纖維化(IPF)、休格連氏症候群、硬皮病、血管炎(包括高安氏動脈炎、巨細胞(顳)動脈炎、結節性多動脈炎、韋格納氏肉芽腫、川崎氏病、孤立性CNS血管炎、徹奇-斯全司動脈炎、顯微性多動脈炎/多血管炎、超敏性血管炎(過敏性血管炎)、亨-含二氏紫癜及原發性冷凝球蛋白 血症血管炎)、未分化脊柱關節病(USpA)、僵直性脊椎炎(AS)、移植體抗主體疾病(GVHD)、原發性膽汁肝硬化(PBC)、原發性硬化性膽管炎(PSC)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、多發性硬化症(MS)及哮喘，其中該方法包含投與該患者治療有效量之如本文中所描述之抗原結合蛋白質之步驟。
舉例而言，在一特定態樣中，提供抗原結合蛋白質用於治療或預防骨關節炎(OA)、牛皮癬、特發性肺纖維化(IPF)或多發性硬化症(MS)之用途。
本發明之其他態樣及優點進一步描述於實施方式及其實施例中。
在一個態樣中，本發明提供包含本發明之抗原結合蛋白質或其功能性片段及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物，其係用於治療或預防發炎性疾病及/或病症，例如發炎性關節病，諸如類風濕性關節炎、幼年特發性關節炎、骨關節炎、牛皮癬性關節炎及僵直性脊椎炎，或選自以下之疾病及/或病症：1型糖尿病、牛皮癬、發炎性腸病(IBD)(包括克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎(UC))、全身性紅斑狼瘡(SLE，狼瘡)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺炎、嗜伊紅血球性食道炎、全身性硬化症(SS)或特發性肺纖維化(IPF)、休格連氏症候群、硬皮病、血管炎(包括高安氏動脈炎、巨細胞(顳)動脈炎、結節性多動脈炎、韋格納氏肉芽腫、川崎氏病、孤立性CNS血管炎、徹奇-斯全司動脈炎、顯微性多動脈炎/多血管 炎、超敏性血管炎(過敏性血管炎)、亨-舍二氏紫癜及原發性冷凝球蛋白血症血管炎)、未分化脊柱關節病(USpA)、僵直性脊椎炎(AS)、移植體抗主體疾病(GVHD)、原發性膽汁肝硬化(PBC)、原發性硬化性膽管炎(PSC)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、多發性硬化症(MS)及哮喘。
在本發明之另一實施例中，提供治療罹患發炎性病症或疾病之人類患者之方法，該方法包含投與治療有效量之如本文中所描述之本發明之抗原結合蛋白質之步驟，例如提供治療罹患發炎性病症或疾病之人類患者之方法，該方法包含投與包含本文中本發明之抗原結合蛋白質與醫藥學上可接受之載劑之組合之步驟。在另一實施例中，提供治療罹患選自例如以下之發炎性病症或疾病之人類患者之方法：發炎性關節病(諸如類風濕性關節炎、幼年特發性關節炎、骨關節炎、牛皮癬性關節炎及僵直性脊椎炎)、1型糖尿病、牛皮癬、發炎性腸病(IBD)(包括克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎(UC))、全身性紅斑狼瘡(SLE，狼瘡)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺炎、嗜伊紅血球性食道炎、全身性硬化症(SS)或特發性肺纖維化(IPF)、休格連氏症候群、硬皮病、血管炎(包括高安氏動脈炎、巨細胞(顳)動脈炎、結節性多動脈炎、韋格納氏肉芽腫、川崎氏病、孤立性CNS血管炎、徹奇-斯全司動脈炎、顯微性多動脈炎/多血管炎、超敏性血管炎(過敏性血管炎)、亨-舍二氏紫癜及原發性冷凝球蛋白血症血管炎)、未分化脊柱關節病(USpA)、僵直性脊椎炎(AS)、移植體抗 主體疾病(GVHD)、原發性膽汁肝硬化(PBC)、原發性硬化性膽管炎(PSC)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、多發性硬化症(MS)及哮喘。
在本發明之一替代性態樣中，提供人類化非人類抗體或其抗體片段之方法，該方法包含以下步驟：a)在人類受者構架上併入一或多個非人類CDR以產生嵌合或人類化抗體；b)使嵌合或人類化抗體與其抗原結合；c)確定與抗原結合直接相關之抗體殘基；d)使步驟(c)中未涉及之殘基中之一或多者突變為人類生殖系序列；e)回收該抗體。
在另一態樣中，可藉由結晶學、同源模型化、蛋白質對接、突變誘發或線性肽圖譜確定與抗原結合相關之抗體殘基。
舉例而言，在如本文中所描述之本發明之一個該類態樣中，獲得抗體-抗原共晶體之晶體結構且確定與結合有關之殘基介於約2-5 Å之間。
術語非人類涵蓋可以某種方式突變或取代以使其更接近人類生殖系序列之任何抗體。藉此降低產生免疫原性之可能性。
在一個態樣中，至少一個CDR反突變為生殖系序列。在另一態樣中，至少兩個CDR反突變為生殖系序列。在又一態樣中，至少5個殘基反突變為生殖系序列，例如至少7個 或至少8個或至少9個或至少10個殘基反突變為生殖系序列。
非人類單株抗體或其片段轉移至人類受者上通常另外依賴於在構架內引入變化以重建適當CDR區-抗原相互作用，該等變化通常稱為回復突變。在本發明之一個實施例中，需要回復突變以重建適當CDR區-抗原相互作用。
在一替代性實施例中，人類受者構架可併入至具有一或多個非人類CDR之抗體上以產生嵌合抗體。在又一替代性實施例中，可藉由寡核苷酸合成(oilgo-synthesis)產生序列。
非人類抗體之CDR(或高變區殘基)併入至VL及/或VH人類受者構架中。舉例而言，可將對應於Kabat CDR殘基、Chothia高變環殘基、Abm殘基及/或Contact殘基之殘基併入。
在一個實施例中，提供人類化抗體之方法，該方法包含以下步驟：a)獲得結合於目標抗原之非人類抗體；b)獲得抗體-抗原共晶體之晶體結構；c)自晶體結構確定與抗原結合直接相關之非人類抗體之殘基為約2-5 Å；e)使步驟(c)中未涉及之殘基中之一或多者突變為衍生自人類序列之殘基；f)回收該抗體。
在本文中所描述之方法之另一實施例中，抗體或抗體結 合片段保持結合於其抗原。舉例而言，與非人類抗體相比，抗體或抗體結合片段保持結合於其抗原。舉例而言，步驟f)之抗體之結合親和力(KD)可在步驟a)之非人類抗體之10倍以內或為其10倍，例如步驟f)之抗體之結合親和力(KD)可在步驟a)之非人類抗體之3-5倍以內或為其3-5倍。
舉例而言，抗體或抗體結合片段當藉由Biacore量測時在非人類抗體之1000 nM以內，或當藉由Biacore量測時在非人類抗體之500 nM以內，或當藉由Biacore量測時在非人類抗體之100 nM以內保持結合於其抗原。舉例而言，抗體或抗體結合片段當藉由Biacore量測時在非人類抗體之500 pM以內，或當藉由Biacore量測時在非人類抗體之300 pM以內，或當藉由Biacore量測時在非人類抗體之100 pM以內保持結合於其抗原。舉例而言，步驟f)之抗體以等於或小於400 pM，或等於或小於300 pM，或等於或小於200 pM，或等於或小於140 pM之親和力(KD)結合於其抗原。
在本文中所描述之方法之另一實施例中，抗體或抗體結合片段保持與非人類抗體或抗體片段相同之典型結構。
在又一實施例中，非人類抗體或其抗體片段係來自非人類動物，例如小鼠、大鼠、兔、駱駝或鯊魚。
在另一實施例中，非人類抗體或其抗體片段係來自小鼠。
在又一實施例中，非人類抗體或其抗體片段為單株抗體、多株抗體或多特異性抗體或其可為免疫球蛋白單可變域，例如駱駝或鯊魚免疫球蛋白單可變域，或其可為非人 類非抗體蛋白質骨架衍生之結構域。
在又一實施例中，非人類抗體為單株抗體。
在本文中所描述之方法之一個實施例中，至少2個非人類CDR併入至人類受者序列中，或至少3個CDR或至少4個CDR或至少5個CDR或全部6個CDR均併入至人類受者序列中。
在本文中所描述之方法之另一實施例中，欲突變為衍生自人類序列之殘基的殘基(其不與結合抗原直接相關且已不為人類序列)可為CDR中或構架區中或兩者中之殘基。在另一實施例中，至少1個CDR突變為人類生殖系序列，或至少2個CDR突變或至少3個CDR突變，或至少4個CDR突變。
在又一實施例中，至少5個殘基突變為人類生殖系序列，或至少7個殘基，或至少10個殘基或至少15個殘基或至少20個殘基或至少40個殘基或至少60個殘基突變為人類生殖系序列。
在本文中所描述之方法之又一實施例中，確定與抗原結合直接相關之抗體之殘基介於約2-5 Å之間，或介於約3-5 Å之間，或介於約3-4 Å之間，或為約3.5 Å。
在本文中所描述之方法之又一實施例中，提供可由該方法獲得之抗體。
定義
如本文中所用之術語「抗原結合蛋白質」係指能夠結合於人類OSM且中和人類OSM之抗體、抗體片段及其他蛋白 質構築體。
術語Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)2 以其標準含義使用(參見例如Harlow等人，Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1988))。
術語「抗體」於本文中以最廣泛含義使用且特別涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自一群實質上均質之抗體獲得之抗體，亦即構成該群之個別抗體除可能以微量存在之可能天然存在之突變以外為相同的。單株抗體對單一抗原結合位點具有高特異性。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑形成對比，每一單株抗體係針對抗原上之單一決定子。
「嵌合抗體」係指一種經工程改造之抗體，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與衍生自特定供者抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源，而鏈之其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體以及該等抗體之片段中的相應序列一致或同源，只要其呈現所需生物活性即可(美國專利第4,816,567號及Morrison等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855)(1984))。
「人類化抗體」係指一種經工程改造之抗體，其具有衍生自非人類供者免疫球蛋白之CDR，該分子之其餘免疫球蛋白衍生部分係衍生自一種(或多種)人類免疫球蛋白。此外，可改變構架支撐殘基以保留結合親和力(參見例如 Queen等人，Proc.Natl Acad Sci USA,86：10029-10032(1989)；Hodgson等人，Bio/Technology,9：421(1991))。合適人類受者抗體可為基於與供者抗體之核苷酸及胺基酸序列之同源性選自例如KABAT®資料庫、Los Alamos資料庫及Swiss Protein資料庫之習知資料庫的人類受者抗體。特徵為與供者抗體之構架區之同源性(基於胺基酸)的人類抗體可適於提供重鏈恆定區及/或重鏈可變構架區以插入供者CDR。可以類似方式選擇能夠提供輕鏈恆定區或可變構架區之合適受者抗體。應注意，受者抗體重鏈及輕鏈無需源於同一受者抗體。先前技術描述產生該等人類化抗體之若干種方式-參見例如EP-A-0239400及EP-A-054951。
視情況而定，對於聚核苷酸及多肽，「一致性」意謂使用以下(1)及(2)中提供之演算法計算之比較結果：
(1)藉由將既定序列中核苷酸之總數乘以定義一致性百分比之整數除以100，接著自該序列中之該核苷酸總數中減去所得乘積來計算聚核苷酸之一致性，或：nnxn-(xn．y)，其中nn為核苷酸變化數，xn為既定序列中核苷酸總數，y為0.95(95%)、0.97(97%)或1.00(100%)，且．為乘法運算子符號，且其中在將xn與y之任何非整數乘積向下捨入為最接近整數之後再自xn中減去該整數。編碼多肽之聚核苷酸序列之變化可在該編碼序列中產生反義、誤義或讀框轉移突變且藉此在該等變化後改變由該聚核苷酸編碼之多肽。
(2)藉由用胺基酸之總數乘以定義一致性百分比之整數 除以100，接著自該胺基酸總數中減去所得乘積來計算多肽之一致性，或：naxa-(xa．y)，其中na為胺基酸變化數，xa為序列中胺基酸總數，y為0.95(95%)、0.97(97%)或1.00(100%)，且．為乘法運算子符號，且其中在將xa與y之任何非整數乘積向下捨入為最接近整數之後再自xa中減去該整數。
「經分離」意謂「藉由人工」自其天然狀態改變、已自其原始環境改變或移除，或兩者。舉例而言，天然存在於活有機物中之聚核苷酸或多肽未經「分離」，但與其天然狀態之共存物質分離之相同聚核苷酸或多肽為「經分離」，包括(但不限於)該聚核苷酸或多肽引入回細胞中之情況，即使該細胞與分離聚核苷酸或多肽之細胞為相同物種或類型。
貫穿本說明書及隨附申請專利範圍，術語「包含」合併有「由…組成」。亦即，該等字詞意欲表示在上下文允許的情況下可能包含其他未特別敍述之元素或整體。
貫穿本說明書關於本發明之抗原結合蛋白質所用之術語「特異性結合」意謂該抗原結合蛋白質結合人類OSM(hOSM)而不結合於或幾乎不結合於其他人類蛋白質。然而，該術語不排除本發明之抗原結合蛋白質亦可與其他形式之OSM(例如靈長類動物OSM)交叉反應之事實。
貫穿本說明書關於本發明之抗原結合蛋白質所用之術語「直接相互作用」意謂當該抗原結合蛋白質結合於人類 OSM(hOSM)時，抗原結合蛋白質上之特異性殘基位於hOSM上特異性殘基之3.5Å內。
貫穿本說明書關於本發明之抗原結合蛋白質所用之術語「抑制」意謂與不存在本發明之抗原結合蛋白質情況下OSM之活性相比，存在本發明之抗原結合蛋白質時OSM之生物活性降低。抑制可能歸因於(但不限於)阻斷配位體結合、阻止配位體活化受體、下調OSM或影響效應子功能性中之一或多者。本發明之抗體可中和OSM。可以若干種方式量測中和程度，例如藉由使用如以下實例中所述之分析法，例如2.2.1中之KB細胞中和分析法。OSM能夠經由經Gp130/OSMR複合物進行之信號傳導來誘導自KB細胞釋放介白素6。此分析法中對OSM之中和作用藉由評估抗OSM單株抗體抑制IL6產生之能力來量測。
若抗體或其抗原結合片段能夠進行中和，則其指示抑制人類OSM與其gp130受體之間的相互作用。視為具有針對人類OSM之中和活性之抗體在如實例2.2.1中所述之KB細胞中和分析法中之IC50 將小於10微克/毫升，或小於5微克/毫升，或小於2微克/毫升，或小於1微克/毫升或小於0.1微克/毫升。
「CDR」定義為抗體之互補決定區胺基酸序列，其為免疫球蛋白重鏈及輕鏈之高變區。免疫球蛋白之可變部分中存在三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR(或CDR區)。因此，如本文中所用之「CDR」可指代所有三個重鏈CDR或所有三個輕鏈CDR(或視情況指代所有重鏈CDR及所有輕鏈 CDR)。
CDR提供用於抗體與抗原或抗原決定基結合之大部分contact殘基。本發明中之相關CDR係衍生自供者抗體可變重鏈及輕鏈序列，且包括天然存在之CDR之類似物，該等類似物亦共有或保留與衍生其之供者抗體相同的抗原結合特異性及/或中和能力。
可藉由Kabat編號系統(Kabat等人；Sequences of proteins of Immunological Interest NIH,1987)測定抗體之CDR序列，或可使用Chothia編號系統(Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948)、contact定義法(MacCallum R.M.,及Martin A.C.R.及Thornton J.M,(1996),Journal of Molecular Biology,262(5),732-745)或熟習此項技術者已知的用於對抗體中之殘基進行編號且測定CDR之任何其他公認方法測定。
可為熟習此項技術者所用之其他CDR序列編號規則包括「AbM」(University of Bath)及「contact」(University College London)方法。可確定使用Kabat、Chothia、AbM及contact方法中之至少兩者的最小重疊區以提供「最小結合單元」。最小結合單元可為CDR之子部分。
下表呈現一種使用各編號規則對各CDR或結合單元之定義。下表中使用Kabat編號機制對可變域胺基酸序列進行編號。應注意，一些CDR定義可視所用之個別公開案而變。
貫穿本說明書，根據Kabat機制對抗體序列中之胺基酸殘基進行編號。類似地，術語「CDR」、「CDRL1」、「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」、「CDRH3」按照如Kabat等人；Sequences of proteins of Immunological Interest NIH,1987中闡述之Kabat編號系統。
本文中術語「VH」及「VL」分別用於指代抗體之重鏈可變域及輕鏈可變域。
如本文所用之術語「域/結構域」係指獨立於蛋白質之其餘部分具有三級結構的摺疊蛋白質結構。通常，結構域負責蛋白質的個別功能特性，且在許多情況下可添加、移除或轉移至其他蛋白質而不使蛋白質及/或結構域其餘部分的功能損失。「抗體單可變域」為包含抗體可變域之特徵序列之摺疊多肽域。因此，其包括完整抗體可變域及經修飾可變域(例如其中一或多個環已由不為抗體可變域之特徵的序列置換)，或經截短或包含N-末端或C-末端延伸之抗體可變域，以及至少保留全長結構域之結合活性及特異性的可變域之摺疊片段。
片語「免疫球蛋白單可變域」係指獨立於不同V區或域特異性結合抗原或抗原決定基的抗體可變域(VH、VHH、VL)。免疫球蛋白單可變域可以具有其他不同可變區或可變域之形式(例如同或異多聚體)存在，其中該等其他可變區或可變域不為單免疫球蛋白可變域結合抗原所需(亦即其中免疫球蛋白單可變域獨立於其他可變域結合抗原)。當用於本文時，術語「結構域抗體」或「dAb」與能夠結合抗原之「免疫球蛋白單可變域」相同。免疫球蛋白單可變域可為人類抗體可變域，但亦包括來自其他物種之單抗體可變域，諸如齧齒動物(例如WO 00/29004中所揭示)、護士鯊(nurse shark)及駱駝科VHH dAb。駱駝科VHH為衍生自包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駝及原駝在內之物種之免疫球蛋白單可變域多肽，其產生天然缺乏輕鏈之重鏈抗體。該等VHH結構域可根據此項技術中可用之標準技術人類化，且該等結構域仍被視為本發明之「結構域抗體」。如本文所用，「VH」包括駱駝科VHH結構域。NARV為另一種免疫球蛋白單可變域，其於軟骨魚(包括護士鯊)中鑑別。該等結構域亦稱為新穎抗原受體可變區(通常縮寫為V(NAR)或NARV)。關於其他細節，參見Mol.Immunol.44,656-665(2006)及US20050043519A。
術語「抗原決定基結合域」係指獨立於不同V區或域特異性結合抗原或抗原決定基之結構域，其可為結構域抗體(dAb)，例如人類、駱駝或鯊魚免疫球蛋白單可變域或其可為選自由以下組成之群之骨架衍生之結構域：CTLA-4 (Evibody)；脂質運載蛋白；蛋白質A衍生之分子，諸如蛋白質A之Z結構域(親和抗體(Affibody)，SpA)、A結構域(Avimer/Maxibody)；熱休克蛋白，諸如GroEl及GroES；運鐵蛋白(穿膜抗體(trans-body))；錨蛋白(ankyrin)重複單元蛋白質(DARPin)；肽適體；C型凝集素結構域(四連接素(Tetranectin))；人類γ-晶狀體球蛋白及人類泛素(affilin)；PDZ結構域；人類蛋白酶抑制劑之蠍毒素孔尼茲型結構域(scorpion toxinkunitz type domains of human protease inhibitor)；及纖維結合蛋白(adnectin)；其已經蛋白質工程改造以結合於除天然配位體以外的配位體。
CTLA-4(細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4)為主要在CD4+T細胞上表現之CD28家族受體。其細胞外域具有可變域樣Ig摺疊。與抗體之CDR對應之環可經異源序列取代以賦予不同結合特性。經工程改造成具有不同結合特異性之CTLA-4分子亦稱為Evibody。更多詳情參見Journal of Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。
脂質運載蛋白為傳輸諸如類固醇、後膽色素、類視色素及脂質之小疏水性分子的細胞外蛋白質家族。其具有在錐形結構之開放端具有多個環的剛性β片二級結構，其可經工程改造以結合於不同目標抗原。抗運載蛋白(Anticalin)的尺寸介於160-180個胺基酸之間，且由脂質運載蛋白衍生。更多詳情參見Biochim Biophys Acta 1482：337-350(2000)、US 7250297B1及US 20070224633。
親和抗體為由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )之 蛋白質A衍生的骨架，其可經工程改造以結合於抗原。該結構域由約58個胺基酸之三螺旋束組成。已藉由表面殘基之隨機化產生文庫。更多詳情參見Protein Eng.Des.Sel.17,455-462(2004)及EP 1641818A1。
Avimer為由A結構域骨架家族衍生之多結構域蛋白質。約35個胺基酸之天然結構域採用經定義之二硫化物鍵結之結構。A結構域家族所展現之天然變化的改組產生多樣性。更多詳情參見Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)及Expert Opinion On Investigational Drugs 16(6),909-917(2007年6月)。
運鐵蛋白為單體血清傳輸醣蛋白。運鐵蛋白可藉由在容許的表面環中插入肽序列來進行工程改造以結合不同目標抗原。經工程改造之運鐵蛋白骨架之實例包括穿膜抗體。更多詳情參見J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。
經設計之錨蛋白重複單元蛋白質(DARPin)係由錨蛋白衍生，錨蛋白為介導整合膜蛋白質與細胞骨架連接的蛋白質家族。單一錨蛋白重複單元為由2個α螺旋及1個β旋轉組成之33個殘基的基元。其可藉由隨機化各重複單元之第一α螺旋及β旋轉中之殘基來進行工程改造以結合不同目標抗原。其結合界面可藉由增加模組數而增加(親和力成熟法)。更多詳情參見J.Mol.Biol.332,489-503(2003),PNAS 100(4),1700-1705(2003)及J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)及US 20040132028A1。
纖維結合蛋白為可經工程改造以結合抗原之骨架。 Adnectin由III型人類纖維結合蛋白(FN3)之15個重複單元的第10結構域之天然胺基酸序列之主鏈構成。在β夾層之一端的三個環可經工程改造以使Adnectin能夠特異性辨識相關治療目標。更多詳情參見Protein Eng.Des.Sel.18,435-444(2005)、US 20080139791、WO 2005056764及US 6818418B1。
肽適體為由恆定骨架蛋白構成之組合辨識分子，該恆定骨架蛋白通常為含有在活性位點處插入之限制性可變肽環的硫氧還蛋白(TrxA)。更多詳情參見Expert Opin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。
微體係由長度為25-50個胺基酸的含有3-4個半胱胺酸橋的天然存在之微蛋白產生-微蛋白之實例包括KalataB1及芋螺毒素(conotoxin)及打結素(knottin)。微蛋白具有可經工程改造以包括至多25個胺基酸而不影響微蛋白之整體摺疊之環。經工程改造之打結素結構域的更多詳情參見WO 2008098796。
其他抗原決定基結合域包括已用作工程改造不同目標抗原結合特性之骨架的蛋白質，包括人類γ晶狀體球蛋白及人類泛素(affilin)、人類蛋白酶抑制劑之孔尼茲型結構域、Ras-結合蛋白AF-6之PDZ結構域、蠍毒素(卡律布德蠍毒素(charybdotoxin))、C型凝集素結構域(四連接素)，其評論於Handbook of Therapeutic Antibodies之第7章-Non-Antibody Scaffolds(2007,Stefan Dubel編)及Protein Science 15：14-27(2006)中。本發明之抗原決定基結合域可衍生自 該等替代性蛋白質結構域中之任一者。
如本文中所用，術語「抗原結合位點」係指蛋白質上能夠特異性結合於抗原之位點，其可為單一結構域，例如抗原決定基結合域，或其可為配對VH/VL域，如可見於標準抗體中。在本發明之一些實施例中，單鏈Fv(ScFv)結構域可提供抗原結合位點。
術語「mAbdAb」及「dAbmAb」在本文中用於指代本發明之抗原結合蛋白質。如本文中所用，兩術語可互換使用且意欲具有相同含義。
如本文中所用之術語「抗原結合蛋白質」係指抗體、抗體片段，例如結構域抗體(dAb)、ScFv、FAb、FAb2 及其他蛋白質構築體。抗原結合分子可包含至少一個Ig可變域，例如抗體、結構域抗體(dAb)、Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、ScFv、雙功能抗體、mAbdAb、親和抗體、異結合抗體或雙特異性抗體。在一個實施例中，抗原結合分子為抗體。在另一實施例中，抗原結合分子為dAb，亦即免疫球蛋白單可變域，諸如獨立於不同V區或域特異性結合抗原或抗原決定基之VH、VHH或VL。抗原結合分子可能夠結合於兩個目標，亦即其可為雙重靶向蛋白質。抗原結合分子可為抗體與抗原結合片段之組合，諸如連接至單株抗體之一或多個結構域抗體及/或一或多個ScFv。抗原結合分子亦可包含非Ig結構域，例如選自由以下組成之群之骨架衍生之結構域：CTLA-4(Evibody)；脂質運載蛋白；蛋白質A衍生之分子，諸如蛋白質A之Z結構域(親和抗體，SpA)、A結 構域(Avimer/Maxibody)；熱休克蛋白，諸如GroEl及GroES；運鐵蛋白(穿膜抗體)；錨蛋白重複單元蛋白質(DARPin)；肽適體；C型凝集素結構域(四連接素)；人類γ-晶狀體球蛋白及人類泛素(affilin)；PDZ結構域；人類蛋白酶抑制劑之蠍毒素孔尼茲型結構域；及纖維結合蛋白(adnectin)；其已經蛋白質工程改造以結合於OSM。如本文中所用，「抗原結合蛋白質」將能夠拮抗及/或中和人類OSM。此外，抗原結合蛋白質可藉由結合於OSM且阻止天然配位體結合及/或活化gp130受體來抑制及/或阻斷OSM活性。
如本文中所用之術語「效應功能」意謂指代抗體依賴性細胞介導之細胞毒性活性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性活性(CDC)介導之反應、Fc介導之噬菌作用及經由FcRn受體進行之抗體再循環中之一或多者。對於IgG抗體，包括ADCC及ADCP在內之效應功能性係由重鏈恆定區與免疫細胞表面上Fcγ受體家族之相互作用所介導。在人類中，該等受體包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)。結合於抗原之抗原結合蛋白質與形成Fc/Fcγ複合物之間的相互作用誘導一系列效應，包括細胞毒性、免疫細胞活化、噬菌作用及發炎性細胞激素釋放。
咸信抗原結合蛋白質之恆定區與多種Fc受體(FcR)之間的相互作用可介導抗原結合蛋白質之效應功能。效應功能性可引起顯著生物學效應，尤其為抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體固定(補體依賴性細胞毒性或CDC)及抗原結 合蛋白質之半衰期/清除率。通常，介導效應功能之能力需要抗原結合蛋白質與抗原結合且並非所有抗原結合蛋白質均將介導每一效應功能。
可以多種方式量測效應功能，包括例如經由FcγRIII與自然殺手細胞結合或經由FcγRI與單核細胞/巨噬細胞結合來量測ADCC效應功能。舉例而言，可於自然殺手細胞分析法中評估本發明之抗原結合蛋白質之ADCC效應功能。該等分析法之實例可見於Shields等人，2001 The Journal of Biological Chemistry，第276卷，第6591-6604頁；Chappel等人，1993 The Journal of Biological Chemistry，第268卷，第25124-25131頁；Lazar等人，2006 PNAS,103；4005-4010中。
測定CDC功能之分析法之實例包括1995 J Imm Meth 184：29-38中描述之分析法。
人類恆定區之一些同型(尤其IgG4及IgG2同型)基本上缺乏以下功能：a)藉由經典路徑活化補體；及b)抗體依賴性細胞毒性。可視所需效應子性質對抗原結合蛋白質之重鏈恆定區進行多種修飾。已獨立地描述含有特定突變之IgG1恆定區可降低與Fc受體之結合且因此降低ADCC及CDC(Duncan等人Nature 1988,332；563-564；Lund等人J.Immunol.1991,147；2657-2662；Chappel等人PNAS 1991,88；9036-9040；Burton及Woof,Adv.Immunol.1992,51；1-84；Morgan等人，Immunology 1995,86；319-324；Hezareh等人，J.Virol.2001,75(24)；12161-12168)。
在本發明之一個實施例中，提供抗原結合蛋白質，其包含恆定區使得該抗原結合蛋白質具有降低之ADCC及/或互補活化或效應功能性。在一個該類實施例中，重鏈恆定區可包含IgG2或IgG4同型之天然失能恆定區或突變之IgG1恆定區。合適修飾之實例描述於EP0307434中。一個實例包含位置235及237(EU索引編號)處丙胺酸殘基之取代。
亦描述在殘基Asn297上含有特定突變或變化之糖基化作用之人類IgG1恆定區可增強與Fc受體之結合。在一些情況下，亦證實該等突變可增強ADCC及CDC(Lazar等人PNAS 2006,103；4005-4010；Shields等人J Biol Chem 2001,276；6591-6604；Nechansky等人Mol Immunol,2007,44；1815-1817)。
在本發明之一個實施例中，該等突變係位於選自239、332及330(IgG1)之一或多個位置處或其他IgG同型中之等效位置處。合適突變之實例為S239D及I332E及A330L。在一個實施例中，本文中描述之本發明之抗原結合蛋白質在位置239及332處突變，例如S239D及I332E，或在另一實施例中，其在選自239及332及330中之三個或三個以上位置處突變，例如S239D及I332E及A330L(EU索引編號)。
在本發明之一替代性實施例中，提供抗原結合蛋白質，其包含具有變化糖基化作用型態之重鏈恆定區以使得該抗原結合蛋白質具有增強之效應功能。舉例而言，抗原結合蛋白質具有增強之ADCC或增強之CDC或其具有增強之ADCC及CDC效應功能。製備具有變化糖基化作用型態之 抗原結合蛋白質之合適方法之實例描述於WO 2003011878、WO 2006014679及EP 1229125中，其均可應用於本發明之抗原結合蛋白質。
本發明亦提供製備本發明之抗原結合蛋白質之方法，其包含以下步驟：a)培養包含表現載體之重組宿主細胞，該表現載體包含如本文中所描述之經分離核酸，其中在該重組宿主細胞中編碼α-1,6-海藻糖基轉移酶之FUT8基因已不活化；及b)回收抗原結合蛋白質。
該等製備抗原結合蛋白質之方法可例如使用可自BioWa,Inc.(Princeton,NJ)購得之POTELLIGENTTM 技術系統進行，其中缺乏FUT8基因之功能性複本之CHOK1SV細胞產生具有增強之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性的單株抗體，該活性與具有功能性FUT8基因之細胞中產生之相同單株抗體相比增加。POTELLIGENTTM 技術系統之態樣描述於US 7214775、US 6946292、WO 0061739及WO 0231240中，其均以引用的方式併入本文中。一般熟習此項技術者亦將想到其他合適系統。
在本發明之一個實施例中，提供包含嵌合重鏈恆定區之抗原結合蛋白質，例如包含具有至少一個來自IgG3之CH2結構域之嵌合重鏈恆定區以使得抗原結合蛋白質具有增強之效應功能的抗原結合蛋白質，例如其中其具有增強之ADCC或增強之CDC，或增強之ADCC及CDC功能。在一個該類實施例中，抗原結合蛋白質可包含一個來自IgG3之 CH2結構域或兩個CH2結構域均可來自IgG3。
亦提供製備本發明之抗原結合蛋白質之方法，其包含以下步驟：a)培養包含表現載體之重組宿主細胞，該表現載體包含如本文中所描述之經分離核酸，其中該表現載體包含編碼具有IgG1及IgG3兩種Fc結構域胺基酸殘基之Fc結構域的核酸序列；及b)回收抗原結合蛋白質。
該等製備抗原結合蛋白質之方法可例如使用可自BioWa，Inc.(Princeton,NJ)及Kyowa Hakko Kogyo(現為Kyowa Hakko Kirin Co.,Ltd.)Co.,Ltd.購得之COMPLEGENTTM 技術系統進行，其中重組宿主細胞包含表現載體，其中表現編碼具有IgG1及IgG3兩種Fc結構域胺基酸殘基之嵌合Fc結構域的核酸序列以產生具有增強之補體依賴性細胞毒性(CDC)活性之抗原結合蛋白質，該活性與缺乏該嵌合Fc結構域但其他方面均相同之抗原結合蛋白質相比增加。COMPLEGENTTM 技術系統之態樣描述於WO 2007011041及US 20070148165中，其均以引用的方式併入本文中。在一替代性實施例中，可藉由在IgG鏈之Fc區中引入序列特異性突變來增加CDC活性。一般熟習此項技術者亦將識別其他合適系統。
熟習此項技術者將顯而易見，該等修飾不僅可單獨使用，且亦可彼此組合使用以進一步增強效應功能。
在本發明之一個該類實施例中，提供包含重鏈恆定區之 抗原結合蛋白質，該重鏈恆定區包含突變及嵌合重鏈恆定區，例如其中抗原結合蛋白質包含至少一個來自IgG3之CH2結構域及一個來自IgG1之CH2結構域，其中IgG1 CH2結構域在選自239及332及330之位置處具有一或多個突變(例如突變可選自S239D及I332E及A330L)以使得抗原結合蛋白質具有增強之效應功能，例如其中其具有一或多種以下功能：增強之ADCC或增強之CDC，例如其中其具有增強之ADCC及增強之CDC。在一個實施例中，IgG1 CH2結構域具有突變S239D及I332E。
在本發明之一替代性實施例中，提供包含嵌合重鏈恆定區且具有變化之糖基化作用型態之抗原結合蛋白質。在一個該類實施例中，重鏈恆定區包含至少一個來自IgG3之CH2結構域及一個來自IgG1之CH2結構域且具有變化之糖基化作用型態以使得海藻糖與甘露糖之比率為0.8：3或0.8：3以下，例如其中抗原結合蛋白質經去海藻糖基化以使得該抗原結合蛋白質與具有缺乏該等突變及變化之糖基化作用型態之免疫球蛋白重鏈恆定區的等效抗原結合蛋白質相比具有增強之效應功能，例如其中其具有一或多種以下功能：增強之ADCC或增強之CDC，例如其中其具有增強之ADCC及增強之CDC。
在一替代性實施例中，抗原結合蛋白質具有至少一個IgG3 CH2結構域及至少一個來自IgG1之重鏈恆定域，其中兩種IgG CH2結構域均根據本文中所描述之限制條件突變。
在本發明之一個態樣中，提供製備本文中所描述之本發明之抗原結合蛋白質之方法，其包含以下步驟：a)培養含有表現載體之重組宿主細胞，該表現載體含有如本文中所描述之經分離核酸，該表現載體進一步包含編碼具有IgG1及IgG3兩種Fc結構域胺基酸殘基之嵌合Fc結構域之Fc核酸序列，且其中在該重組宿主細胞中編碼α-1,6-海藻糖基轉移酶之FUT8基因已不活化；及b)回收抗原結合蛋白質。
該等製備抗原結合蛋白質之方法可例如使用可自BioWa,Inc.(Princeton,NJ)購得之ACCRETAMABTM 技術系統製備，該系統組合POTELLIGENTTM 及COMPLEGENTTM 技術系統以產生具有增強之ADCC及CDC活性之抗原結合蛋白質，該等活性與缺乏嵌合Fc結構域且在寡醣上具有海藻糖但其他方面相同之單株抗體相比增加。
在本發明之又一實施例中，提供包含突變及嵌合重鏈恆定區之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質具有變化之糖基化作用型態以使得抗原結合蛋白質具有增強之效應功能，例如其具有一或多種以下功能：增強之ADCC或增強之CDC。在一個實施例中，突變係選自位置239及332及330，例如突變係選自S239D及I332E及A330L。在另一實施例中，重鏈恆定區包含至少一個來自IgG3之CH2結構域及一個來自IgG1之CH2結構域。在一個實施例中，重鏈恆定區具有變化之糖基化作用型態以使得海藻糖與甘露糖之比率為0.8：3或0.8：3以下，例如抗原結合蛋白質經去海藻糖 基化以使得該抗原結合蛋白質與等效非嵌合抗原結合蛋白質或缺乏該等突變及變化之糖基化作用型態之免疫球蛋白重鏈恆定區相比具有增強之效應功能。
另一種修飾本發明之抗原結合蛋白質之手段涉及藉由修飾免疫球蛋白恆定域或FcRn(新生兒Fc受體)結合域來延長該等蛋白質之活體內半衰期。
在成年哺乳動物中，FcRn(亦稱為新生兒Fc受體)藉由充當結合且救助IgG同型之抗體使其免於降解之保護受體而在維持血清抗體含量中起重要作用。IgG分子經內皮細胞吞噬，且若其結合於FcRn，則再循環入循環中。相對比而言，未結合於FcRn之IgG分子進入細胞中且靶向其藉以降解之溶酶體路徑。
咸信新生兒FcRn受體與抗體清除及跨組織轉胞吞作用(transcytosis)有關(參見Junghans R.P(1997)Immunol.Res 16.29-57及Ghetie等人，(2000)Annu.Rev.Immunol.18,739-766)。確定與人類FcRn直接相互作用之人類IgG1殘基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434及His435。本章節中描述之任何此等位置處之變化均可使本發明之抗原結合蛋白質之血清半衰期延長及/或效應性質改變。
本發明之抗原結合蛋白質可具有增加恆定域或其片段對FcRn之親和力的胺基酸修飾。延長治療性及診斷性IgG及其他生物活性分子之半衰期可具有多種益處，包括降低該等分子之投藥量及/或頻率。因此，在一個實施例中，提 供根據本發明之抗原結合蛋白質或融合蛋白質，其包含具有一或多種該等胺基酸修飾之IgG恆定域之全部或一部分(FcRn結合部分)及結合於該經修飾之IgG恆定域之非IgG蛋白質或非蛋白質分子，其中存在經修飾之IgG恆定域延長抗原結合蛋白質之活體內半衰期。
PCT公開案第WO 00/42072號揭示包含具有變化之FcRn結合親和力之變異Fc區之多肽，該多肽在Fc區之胺基酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439及447中之任一或多處包含胺基酸修飾，其中Fc區中殘基之編號係根據EU索引(Kabat等人)。
PCT公開案第WO 02/060919 A2號揭示包含IgG恆定域之經修飾之IgG，該IgG恆定域相對於野生型IgG恆定域包含一或多個胺基酸修飾，其中經修飾之IgG之半衰期與具有野生型IgG恆定域之IgG之半衰期相比延長，且其中該一或多個胺基酸修飾位於位置251、253、255、285-290、308-314、385-389及428-435中之一或多處。
Shields等人(2001,J Biol Chem；276：6591-604)使用丙胺酸掃描突變誘發來改變人類IgG1抗體之Fc區中之殘基，接著評估與人類FcRn之結合。當變為丙胺酸時有效廢止與FcRn結合之位置包括I253、S254、H435及Y436。展示較不顯著的結合降低之其他位置如下：E233-G236、R255、 K288、L309、S415及H433。若干個胺基酸位置在變為丙胺酸時展現與FcRn之結合改良；其中尤其顯著的為P238、T256、E272、V305、T307、Q311、D312、K317、D376、E380、E382、S424及N434。許多其他胺基酸位置展現FcRn結合輕微改良(D265、N286、V303、K360、Q362及A378)或無變化(S239、K246、K248、D249、M252、E258、T260、S267、H268、S269、D270、K274、N276、Y278、D280、V282、E283、H285、T289、K290、R292、E293、E294、Q295、Y296、N297、S298、R301、N315、E318、K320、K322、S324、K326、A327、P329、P331、E333、K334、T335、S337、K338、K340、Q342、R344、E345、Q345、Q347、R356、M358、T359、K360、N361、Y373、S375、S383、N384、Q386、E388、N389、N390、K392、L398、S400、D401、K414、R416、Q418、Q419、N421、V422、E430、T437、K439、S440、S442、S444及K447)。
對於具有改良之FcRn結合的組合變異體發現最顯著效應。在pH 6.0下，E380A/N434A變異體與FcRn之結合為天然IgG1的8倍以上，此與E380A與FcRn之結合為天然IgG1的2倍及N434A與FcRn之結合為天然IgG1的3.5倍形成對比。向其中添加T307A實現與天然IgG1相比結合改良12倍。在一個實施例中，本發明之抗原結合蛋白質包含E380A/N434A突變且與FcRn之結合增加。
Dall'Acqua等人(2002,J Immunol.；169：5171-80)描述隨 機突變誘發及針對小鼠FcRn篩選人類IgG1鉸鏈Fc片段噬菌體呈現文庫。其揭示位置251、252、254-256、308、309、311、312、314、385-387、389、428、433、434及436處之隨機突變誘發。位於跨越Fc-FcRn界面之帶狀區中的殘基(M252、S254、T256、H433、N434及Y436)的取代引起IgG1-人類FcRn複合物穩定性之主要改良而周邊殘基(例如V308、L309、Q311、G385、Q386、P387及N389)之取代所引起的穩定性改良程度較低。對人類FcRn之親和力最高之變異體係藉由組合M252Y/S254T/T256E及H433K/N434F/Y4366H突變獲得且與野生型IgG1相比親和力增加57倍。與野生型IgG1相比，獼猴中該種突變人類IgG1之活體內表現呈現血清半衰期延長約4倍。
因此本發明提供與FcRn之結合最佳之抗原結合蛋白質之變異體。在一較佳實施例中，該抗原結合蛋白質變異體與該親本多肽相比在該抗原結合蛋白質之Fc區中包含至少一個胺基酸修飾，其中該修飾係選自由Fc區之226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、 396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446及447組成之群，其中Fc區中胺基酸之編號係根據Kabat中之EU索引。
在本發明之另一態樣中，修飾為M252Y/S254T/T256E。
此外，多個公開案描述獲得半衰期藉由以下方式改良之生理學活性分子之方法：在分子中引入FcRn結合多肽(WO 97/43316；美國專利第5,869,046號；美國專利第5,747,035號；WO 96/32478；WO 91/14438)或使分子與保留FcRn結合親和力但對其他Fc受體之親和力極大降低之抗體融合(WO 99/43713)或與抗體之FcRn結合域融合(WO 00/09560；美國專利第4,703,039號)。
此外，亦提供製備生物半衰期縮短之抗原結合蛋白質之方法。His435突變為丙胺酸之變異IgG引起FcRn結合選擇性損失且血清半衰期顯著縮短(Firan等人2001,International immunology 13：993)。美國專利第6,165,745號揭示藉由將突變引入編碼抗原結合蛋白質之DNA區段中來製備生物半衰期縮短之抗原結合蛋白質之方法。突變包括Fc鉸鏈結構域之位置253、310、311、433或434處之胺基酸取代。
如本文中所用之術語「非人類抗體或其抗體片段」意謂指代來源於除人類以外的任何物種之抗體或其片段，其中人類抗體包括嵌合抗體。
術語「供者抗體」係指向第一免疫球蛋白搭配物貢獻其 可變域、CDR、或其他功能片段或其類似物之胺基酸序列，以便提供變化之免疫球蛋白編碼區且產生具有該供者抗體之特徵性抗原特異性及中和活性之經表現之變化抗體的抗體(單株及/或重組)。
術語「受者抗體」係指與供者抗體異源之抗體(單株及/或重組)，其向第一免疫球蛋白搭配物貢獻編碼其重鏈及/或輕鏈構架區及/或其重鏈及/或輕鏈恆定區之所有(或任何部分，但較佳所有)胺基酸序列。人類抗體為受者抗體。
如本文中所用之術語「人類受者序列」意謂指代抗體或其抗體片段之構架，其包含衍生自人類抗體或其抗體片段之VH或VL構架或其中可合併有來自非人類物種之CDR之人類共同序列構架之胺基酸序列。
如本文中所用之術語「併入」CDR或高變區涵蓋藉以使非人類CDR位於人類受者構架中之任何手段。應瞭解，此可以多種方式實現，舉例而言，可藉由使編碼非人類可變域序列之核酸突變以使得其構架殘基變為人類受者構架殘基，或藉由使編碼人類可變域序列之核酸突變以使得CDR變為非人類殘基，或藉由合成編碼所需序列之核酸來產生編碼所需胺基酸序列之核酸。在一個實施例中，以電子雜交方式產生最終序列。
現僅以實例來描述本發明。隨附申請專利範圍可包括一或多個以下實例之概括。
實例 實例1 單株抗體產生及選擇 1.1免疫方案
自由經重組糖基化人類OSM(K598)免疫接種之小鼠獲得之融合瘤鑑別抗人類OSM mAb S168110G08(1)1A09(「10G8」)。習知地經腹膜內使用共10 μg蛋白質及類AS02佐劑對雌性SJL小鼠(n=2，Harlan,UK,HOST SP06-06031)進行免疫接種。用5 μg蛋白質進行加強劑免疫接種。在投與各加強劑後獲取測試血樣且選擇具有最佳反應之小鼠(168#4)用於融合瘤融合(R16092/177-198)。切除脾，分解且用小鼠骨髓瘤細胞X63 AG8 653.GFP.Bcl-2.11(BioCat 112754；R17209/58)進行PEG1500誘導之體細胞融合。將融合物於含有甲基纖維素之半固體培養基中接種於10×96孔板及5個Nunc Omnitray中。自半固體培養基中挑選細胞群落置於5×96孔板中。
1.2篩選方案 1.2.1初次篩選
基於選擇能夠結合人類OSM及(為了選擇抗位點II分子)抑制人類OSM及獼猴OSM與gp130受體結合的融合瘤物質來進行抗OSM備用抗體之初次篩選。藉由BIACore解離速率動力分析來自該等篩選之陽性融合瘤上清液以選擇最強結合融合瘤。
自融合物回收超過3000個純系，藉由結合ELISA發現其中86個純系顯著結合於人類OSM。藉由gp130 ELISA用人類OSM及獼猴OSM對陽性融合瘤進行抗位點II活性分析，對抑制人類OSM及獼猴OSM與人類gp13結合的融合瘤純系 進行BIACore解離速率動力學分析。對根據解離速率分析結合程度最靠前的四種人類OSM結合物10G8、9G2、3E3及2B7進行單選殖及再篩選。來自各融合瘤之單純系之間BIACore及ELISA結合活性或gp130抑制作用無差異。冷凍保存子純系：10G8.A9、9G2.C1、2B7.A6及3E3.A1且用於無血清按比例放大試驗及純化。對該等純系進行二次篩選。
1.2.2二次篩選
用於對四個子純系10G8/A9、9G2/C1、2B7/A6及3E3/A1進行排名之二次篩選包括針對人類/獼猴OSM之BIACore動力學分析；用人類/獼猴OSM進行之人類gp130 ELISA；用人類/獼猴OSM進行之KB細胞中和分析法。除此之外，亦評估中和內源嗜中性白血球衍生之人類OSM之能力、25%人類AB血清中保持中和能力及針對人類LIF之反應性。
BIACore分析：
BIACore分析表明10G8、9G2、3E3及2B7對人類OSM之親和力高於替代性非競爭性抗OSM小鼠抗體(15E10)(表1 )。10G8對人類OSM(約550 pM)及獼猴OSM(約310 pM)之親和力最高。與15E10相比，10G8對人類OSM之親和力增加8倍/0.9 log且對獼猴OSM之親和力增加11倍/1 log。10G8及9G2均呈現對獼猴OSM之增加之親和力超過對人類OSM之增加之親和力。
表：BIACore動力學- 四種抗OSM備用先導抗體(lead antibody)10G8、9G2、3E3及2B7與15E10比較。
人類gp130 ELISA：
人類gp130 ELISA使用相對高含量OSM(25 ng/ml)，降低其在配位體過量時區分高親和力抗體與較低親和力抗體之能力。在重複進行四次該分析法後，表明10G8為此分析法中阻斷人類OSM及獼猴OSM與gp130受體結合之最有效抗體(圖1；表2)。
在25%人類AB血清存在下重複人類gp130分析法。重複進行兩次此分析法發現所有四種先導抗體10G8、9G2、3E3及2B7以及15E10均保持其阻斷人類OSM及獼猴OSM與gp130結合之能力(數據未顯示)。
KB細胞中和分析法：
OSM誘導自KB細胞(表現gp130及OSM受體之mRNA的人類上皮細胞)釋放IL-6。簡言之，在37℃下用1 ng/mlOSM+/-不同抗體濃度刺激KB細胞16-18小時且藉由ELISA監測IL6釋放。KB細胞中和分析法中所用OSM量與gp130分析法相比較少(1 ng/ml對25 ng/ml)。此使得其成為用於區分高親和力中和劑與低親和力中和劑之辨別力更強的分析法。KB細胞中和分析法中，10G8對人類OSM之有效性為抗體15E10的15倍/1.2 log。經由3次重複分析法，10G8在所有重複分析法中位居第一，其針對人類OSM之平均IC50 值為8 ng/ml且針對獼猴OSM之平均IC50 值為6 ng/ml(圖2；表3 )。9G2在此分析法中位居第二，其針對人類OSM及獼猴OSM之IC50 分別為18 ng/ml及15 ng/ml。
表3：KB細胞中和分析法- 用於對10G8、9G2、3E3及2B7針對人類OSM及獼猴OSM之活性進行排名之三次重複KB細胞中和分析法之概述。出於比較之目的添加抗體15E10。工具抗體用作陰性對照。
在25%人類AB血清存在下，10G8、9G2及3E3保持其中和人類OSM及獼猴OSM之能力(圖3)。15E10及2B7未能產生具有足以計算IC50 值之品質的擬合曲線。與非人類血清KB細胞分析法相同，最有效抗體為10G8且9G2位居第二。在25% AB血清存在下發現活性有一定程度的降低。此在一定程度上可能歸因於AB血清干擾此分析法之結果讀取。與非人類血清的情況下相比，此分析法中觀測到更高的IL-6背景含量。
內源人類OSM(gp130分析法)：
所有四種先導抗體10G8、9G2、3E3及2B7以及抗體15E10均抑制來自四個獨立供者之內源人類OSM(圖4 )。由GM-CSF刺激健康人類嗜中性白血球產生此原生OSM。
人類LIF反應性(KB細胞中和分析法)：
人類LIF為IL-6家族中與人類OSM相關性最強的成員。初始研究顯示10G8、9G2、3E3及2B7與人類LIF之間不存在反應性，表明該等抗體具OSM特異性(圖5 )。
狨猿OSM反應性(KB細胞中和分析法)：
KB細胞中和分析法中證實所有四種先導分子10G8、 9G2、3E3及2B7均中和狨猿OSM(圖6 )。15E10以及三種其他抗人類OSM抗體10D3DLE、OM4.11.17及OM4.11.31之群組亦未能中和狨猿OSM。
經由兩次重複分析法，10G8為狨猿OSM之最有效中和劑且9G2位居第二。
1.2.3選擇用於作進一步研究(progression)之單株抗體
由於10G8在上述所有分析法中均位居第一，因此自四種抗體中選擇10G8作為先導抗體進行嵌合。在難以人類化的情況下，亦選擇9G2作為備用分子進行嵌合。
1.3抗體工程改造及先導抗體系列選擇 1.3.2可變區序列
分離四種所選單株抗體2B7、3E3、9G2及10G8之可變基因且平行定序以能夠產生相應嵌合抗體。自融合瘤細胞小球提取全部RNA。藉由RT-PCR或5'RACE擴增重鏈及輕鏈V基因編碼序列，接著經TA選殖以用於序列分析。對各抗體一式兩份地進行V基因擴增以能夠隨後由兩個獨立反應驗證正確序列。獲得所有4種融合瘤純系之可變重鏈及可變輕鏈之序列。蛋白質序列對準表明抗體在可變重鏈及輕鏈區中均具有高度序列一致性(圖7及8 )。該等抗體之重鏈及輕鏈可變區之序列由SEQ ID NO：26-48所述。參見表A。
四種單株抗體與抗體15E10之間的序列比較顯示輕鏈(圖9 )或重鏈(圖10 )之一致性僅為50-60%。此表明該等抗體結合的抗原決定基與抗體15E10所識別者不同。
1.3.3抗體選殖 1.3.3.1嵌合體構築
藉由分別在密碼子最佳化之人類γ 1 Fc野生型及人類恆定區上移植上述小鼠VH及VL區來產生嵌合抗體形式之10G8及9G2。使用嵌合抗體確認所選殖之小鼠V區之功能性且經純化且用作測試人類化構築體時之參考物。基於2.3.1中測定之5'及3' DNA序列設計PCR引子以包括選殖至Rlx及pTT5哺乳動物表現載體中所需的限制位點。亦設計引子以用Campath信號序列置換原生信號序列。設計Hind III及Spe I位點以建構VH 結構域之構架且允許選殖至含有人類γ1 C區之經修飾之Rld或pTT5載體中。將Spe I位點引入構架4序列中引起FR4中位置108處之單一胺基酸變化。對於9G2 VH區，內部SpeI位點存在於DNA序列之5'端，設計9G2嵌合體之PCR引子以移除此內部SpeI位點。設計Hind III及BsiWI位點以建構VL 結構域之構架且允許選殖至含有人類C區之經修飾之Rln或pTT5載體中。
鑑別具有正確VH 及VL 序列之純系且製備用於在CHO或HEK細胞中表現的質體。
1.3.3.2嵌合體之表現
藉由電穿孔將分別編碼嵌合10G8及9G2 VH 及VL 結構域之Rld及Rln質體共轉染至CHOE1A細胞中且於多株細胞培養物中表現。使用脂質轉染方法將編碼嵌合10G8及9G2VH 及VL 結構域之pTT質體共轉染至HEK293細胞中以實現短暫游離基因表現，於游離基因表現系統中轉染可能產生毫克量級之抗體。藉由在蛋白質A瓊脂糖凝膠上進行親和 層析自細胞培養物上清液純化所產生之嵌合抗體(10G8c及9G2c)。藉由SDS-PAGE分析及尺寸排阻層析對經純化之抗體進行QC。
1.3.3.3結合分析法數據 人類OSM結合ELISA：
10G8及9G2嵌合體均成功地結合於人類OSM，結合程度大於15E10嵌合體(15E10c)(圖11 )。此為直接ELISA，其中以1 μg/ml塗佈人類OSM且使用抗人類IgG偵測結合抗體。
BIACore分析：
BIACore分析表明與小鼠親本抗體相比，嵌合10G8及9G2分子中人類或獼猴OSM結合損失極小或無損失(表4 )。10G8嵌合體位居第一(654 pM)，之後為9G2嵌合體(1.33 nM)。所有抗體均呈現對獼猴OSM之增加之親和力超過對人類OSM之增加之親和力。
1.3.3.4功能性分析法數據 人類gp130 ELISA：
人類gp130 ELISA使用相對高含量OSM(25 ng/ml)，降低其在配位體過量時區分高親和力抗體與較低親和力抗體之能力。在重複3次此分析法後，10G8嵌合體為抑制人類OSM及獼猴OSM與gp130受體結合之最有效抗體。此分析法中10G8小鼠親本抗體及10G8嵌合體之值極類似(圖12；表5 )。9G2與其嵌合體之間不存在顯著差異。
對於人類OSM及獼猴OSM，在人類AB血清存在下重複人類gp130分析法。所有分子均在25%血清中保持其活性。針對人類OSM及獼猴OSM，10G8嵌合體及10G8小鼠親本抗體分別位居第一及第二。該兩種抗體之IC50 值類 似。未觀測到9G2嵌合體(位居第三)與其小鼠親本抗體間存在顯著差異(數據未顯示)。
KB細胞中和分析法：
10G8小鼠親本抗體與嵌合體具有類似表現(圖13；表6 )。此等分析法中9G2小鼠親本抗體及嵌合體分別位居第三及第四。
在25%人類AB血清存在下，10G8、10G8嵌合體、9G2及9G2嵌合體均保持其中和人類OSM及獼猴OSM之能力(圖14 )。在25% AB血清存在下發現活性有一定程度的降低。儘管在1 μg/ml抗體起始濃度下不能計算IC50 值，但除不相關陰性對照外所有抗體均被發現有顯著滴定中和作用。此活性降低可在一定程度上歸因於AB血清干擾此分析法中之結果讀取。與非人類血清的情況下相比，此分析法中觀 測到更高的IL-6背景含量。
內源人類OSM(gp130分析法)：
10G8、10G8嵌合體、9G2及9G2嵌合體抑制來自兩個獨立供者之內源人類OSM(圖15 )。對於該兩種供者，10G8及10G8嵌合體並列第一，而9G2及其嵌合體分別位居第三及第四(表7 )。由GM-CSF刺激健康人類嗜中性白血球產生此原生OSM。
人類LIF反應性(KB細胞中和分析法)：
人類LIF為IL-6家族中與人類OSM相關性最強的成員。三次重複人類LIF KB細胞分析法表明10G8、10G8嵌合體、9G2及9G2嵌合體不中和人類LIF。此分析法中，市售抗人類LIF抗體中和LIF(圖16 )。此證明該等抗體具OSM特異性。
實例2：人類化 2.1.1重鏈人類化方案
在BLAST分析人類V基因生殖系資料庫之後，選擇與小鼠10G8可變重鏈序列具有74%一致性(包括CDR)之人類生殖系IGHV3_7作為較佳受者構架用於人類化。以電子雜交方式組合生殖系V區與合適FR4(在此情況下基於序列相似性為JH2袖珍基因(Kabat Vol.II))。JH2袖珍基因殘基之前六個殘基屬於由來自供者抗體之輸入CDR置換之CDR3區內。基於序列比較產生三個人類化重鏈變異體且可能影響抗體功能。構築體H0為來自10G8之小鼠CDR(使用Kabat定義)移植至以上所選人類受者構架中之直接移植物。構築體H1及H2係以H0為基礎，兩者均合併有另一構架突變，該突變在各構築體中不同；分別位於位置2及105處。
2.1.2輕鏈人類化
在BLAST分析人類V基因生殖系資料庫之後，選擇與小鼠10G8可變輕鏈序列具有64%一致性(包括CDR)之人類生殖系IGKV4_1作為較佳受者構架用於人類化。以電子雜交方式組合生殖系V區與合適FR4(在此情況下基於序列相似性為J區4袖珍基因(Kabat Vol.II))。JK-4袖珍基因殘基中之前兩個殘基屬於CDR3區內且與小鼠10G8輕鏈CDR3中之最後兩個殘基相同。基於序列比較產生五個人類化輕鏈變異體且可能影響抗體功能。構築體L0為來自10G8之小鼠CDR(使用Kabat定義)移植至以上所選人類受者構架中之直接移植物。構築體L1、L2及L3係以L0為基礎，各合併有另一構架突變，該突變在各構築體中不同；分別位於位置46、84及103處。構築體L4合併有所有三種上述回復突 變。
2.1.3構築人類化載體
使用LETO 1.0軟體(Entelechon GmbH)對人類化可變區之DNA序列進行序列最佳化且藉由重疊寡核苷酸積聚及PCR擴增來重新合成。引子包括用於選殖至哺乳動物表現載體中之限制位點及用於分泌之人免疫球蛋白信號序列。使用HindIII及SpeI將人類化可變重鏈區H0-H2選殖至含有人類γ 1恆定區之哺乳動物表現載體中。平行地，使用HindIII及BsiWI將人類化可變輕鏈區L0-L4選殖至含有人類恆定區之哺乳動物表現載體中。
2.1.4人類化變異體群組之初始篩選
為篩選及縮小人類化變異體群組(3個重鏈×5個輕鏈=15)，於HEK細胞中表現抗體且藉由BIACore、ELISA及功能性分析法進行評估。
2.2人類化10G8抗體生物分析法：人類化mAb之嵌合體 2.2.1二次篩選
對人類化10G8抗體(列於表9中)進行排名之二次篩選包括針對人類OSM之BIACore動力學分析；用人類OSM/獼猴OSM進行之人類gp130 ELISA；用人類OSM/獼猴OSM進行之KB細胞中和分析法。此外，評估於25%人類AB血清中阻斷gp130結合之能力。
BIACore分析：
對轉染上清液之初始BIACore分析表明L1及L4人類化變異體對人類OSM之親和力高於L0、L2及L3人類化變異體 (表8 )。與單獨直接移植物(H0L0)及10G8嵌合體相比，該等輕鏈突變改良親和力。重鏈變異體H1及H2與直接移植物H0相比對抗體親和力的影響極小。
對按比例放大之經純化之L1及L4變異體的分析表明該等mAb對人類OSM及獼猴OSM之親和力之間的差異極小(表9 )。
KB細胞中和分析法：
KB細胞中和分析法中所用OSM量與gp130分析法相比較少(1 ng/ml對25 ng/ml)。此使得其成為用於區分高親和力中和劑與低親和力中和劑之辨別力更強的分析法。初始H0、H1、H2、L0、L1、L2、L3及L4變異體構築體之KB細胞分析法篩選表明L1構築體較優(數據未顯示)。以較大批量製備該等構築體以及在BIACore分析中表現良好之L4變異體以進行其他分析法。經由3次重複分析法，人類化10G8 L1變異體位居第一，其針對人類OSM之平均IC50 值為14 ng/ml且針對獼猴OSM之平均IC50 值為10 ng/ml(圖17；表10 )。
選擇人類化10G8 L1變異體進行其他測試，因為其在KB細胞分析法中展示與L4變異體相比較強的生物活性。在CHO-E1a系統中L4變異體產率極低且此亦將其排除在作進一步研究之範疇外。
人類gp130 ELISA：
人類gp130 ELISA使用相對高含量OSM(25 ng/ml)，降低其在配位體過量時區分高親和力抗體與較低親和力抗體之能力。在用人類化10G8 L1變異體重複兩次此分析法後，證實此分析法中所有三種變異體阻斷人類OSM及獼猴OSM與gp130受體結合之能力等效(圖18 )。
亦在25%人類AB血清存在下進行人類gp130分析法。重複進行兩次此分析法發現所有抗體(人類化10G8 H0L1、 H1L1及H2L1變異體)均保持其阻斷人類OSM及獼猴OSM與gp130結合之能力(數據未顯示)。
2.3分離Fab片段及10G8 mAb-OSM複合物之結晶 2.3.1產生Fab片段
藉由在37℃下於含有20 mM磷酸鹽緩衝液pH 7、10 mM EDTA及10 mML-半胱胺酸之緩衝液中用珠粒固定之木瓜酶(Pierce 20341)消化20小時自10G8親本抗體產生Fab片段。在消化後，使用拋棄式塑膠管柱移除珠粒，接著使用蛋白質A型層析(MabSelect,GE Healthcare 17-5438-03)自Fab片段移除污染性Fc片段及未消化之抗體。使用Superdex 200 pg尺寸排阻層析(SEC)(GE Healthcare 17-1069-01)使用25 mM HEPES pH 7.7、150 mM NaCl緩衝液作為移動相進一步純化含有Fab片段之未結合部分。藉由在4℃下經1.5小時混合11.5 mg經純化之Fab(GRITS30249)與5.75 mg重組OSM(GRITS23122)(莫耳比率1：1)來製備複合物。接著使用Superdex 200 pg SEC純化複合物除去未複合物質。使用配備有10 kmwco膜(Vivaspin VS20()2)之離心濃縮裝置將經解析之複合物濃縮至44 mg/mL全蛋白質(產量9.2 mg)。使用N端定序、質譜分析法及SDS-PAGE驗證複合物組分。使用gp130抑制分析法確認Fab片段之OSM功能性結合活性(數據未顯示)。
2.3.2 10G8-OSM複合物結晶
使10G8 OSM Fab片段與OSM複合且使用PEG3500作為沈澱試劑(precipitate)在20℃下結晶。使結晶最佳化，送往歐 洲同步輻射研究中心(European Synchrotron Radiation Facility，ESRF)進行分析且在3.5 Å下解析結構。10G8 mAb以良好表面互補性結合OSM之螺旋B及C且單純藉由位阻阻斷OSM位點II與gp130受體結合，不與來自位點II之任何殘基直接相互作用。在3.5 Å下解析時與結合(距離小於5 Å)直接有關之殘基說明於表11及圖19 中。此阻斷作用大部分由輕鏈引起。四種CDR(CDRH2、H3及CDRL1及L3)直接或經水介導之相互作用結合OSM之螺旋B及C。結合10G8 mAb後OSM分子未出現顯著畸變。由於兩種CDR(CDRH1及L2)未結合，製備其中該等CDR中之一或兩者回復突變為人類序列之抗體變異體。此可產生與直接人類化移植物相比免疫原性較低之分子。
2.3.3人類化10G8抗體：人類CDR取代
內部解析之抗OSM 10G8 mAb與OSM之複合物之晶體結構表明CDRH1及CDRL2不與抗原結合直接相關。選擇合適人類生殖系CDR置換該等小鼠生殖系CDR。測試兩種CDRH1人類生殖系序列及兩種CDRL2人類生殖系序列對抗原結合之作用。對於重鏈及輕鏈CDR，測試來自原始人類生殖系受者構架之序列(分別為IGHV3_7及IGKV4_1)以及基於CDR及側接構架同源性選擇之兩種其他人類生殖系序列(IGHV3_23及IGKV1_5)。將人類生殖系CDRH1及CDRL2序列換為人類化H0及L1 V區中之各別小鼠CDR。與章節1.1.4中相同，藉由重疊寡核苷酸積聚及PCR擴增重新合成新的V區。
2.4人類化10G8抗體生物分析法：用人類化非結合CDR將人類化10G8 H0L1 mAb轉化為人類化10G8 mAb 2.4.1二次篩選 BIACore分析：
對來自多種人類化10G8 H0L1 CDRH1及CDRL2構築體之轉染上清液之BIACore分析表明唯一完全保持準候選mAb之人類OSM親和力之抗體為H0(IGHV3_23)L1分子(表12 )。按比例放大且純化該構築體以及具有次最佳KD值之兩種其他分子(H0L1(IGKV4_1)及H0(IGHV3_23)L1(IGK4_1))以用於進一步研究。
KB細胞中和分析法：
KB細胞中和分析法表明人類化10G8 H0(IGHV3_23)L1構築體(標記為H0('CDRH1)L1)之效能與親本人類化10G8 H0L1(標記為H0L1)mAb極其類似。非結合CDRL2以任何方式反突變為人類序列均顯示中和活性降低，如自H0L1(IGKV4_1)(標記為H0L1(huCDRL2))及H0(IGHV3_23)L1(IGK4_1)(標記為H0(huCDRH1)L1(huCDRL2))抗體之數據發現(圖20，表13 )。
由該等數據選擇人類化10G8 H0(huCDRH1)L1作為先導準候選mAb進行充分表徵。
2.5人類化10G8抗體生物分析法：人類化10G8 H0(IGHV3_23)L1 mAb 2.5.1二次篩選 BIACore分析：
對經純化之H0(IGHV3_23)L1 mAb進行BIACore分析且針對10G8嵌合體及人類化10G8 H0L1親本mAb進行排名。H0(IGHV3_23)L1 mAb與親本H0L1 mAb針對人類OSM及獼猴OSM之親和力之間的差異極小或無差異(表6)。H0(IGHV3_23)L1 mAb對人類OSM之親和力為替代性非競爭性抗OSM人類化抗體15E10h的6.5倍(0.8 log)。此研究中使用新一批OSM，但產生較低KD值，人類化變異體與非競爭性抗體之間的差異保持相同。
Kinexa分析
使用Kinexa(Sapidyne Instruments 3200)溶液相親和力來測定抗OSM抗體H0(huCDRH1)L1及人類化15E10(不相關OSM抗體)對人類OSM、獼猴OSM、恆河猴OSM及狨猿OSM之總親和力(表15 )。出於比較之目的添加人類化15E10。
藉由吸附(聚甲基丙烯酸甲酯珠粒-PMMA)或胺偶合(NHS活化之瓊脂糖凝膠珠粒)製備OSM珠粒。所研究之一系列OSM分子需要產生經不同濃度之OSM塗佈之珠粒。對於分析法之溶液相部分，將固定濃度之抗體與寬範圍濃度之OSM一起培育且藉由在室溫下培育至少2小時來達到平衡，隨後進行分析。接著使用OSM珠粒借助於游離抗體結合於OSM珠粒基質，接著使用經螢光染料標記之合適二次抗體(視測試之構築體而定為抗人類抗體或抗小鼠抗體)偵測來測定溶液相樣品中游離抗體之量。使用機器固有之Kinexa Pro分析軟體擬合結合曲線。接著彙編使用不同起始濃度之抗體進行之多次操作且使用n曲線分析軟體進行分析以得到更精確的親和力測定。
與先前藉由Biacore分析評估相同，H0(huCDRH1)L1對人類OSM展示較高親和力。與Biacore中抗體結合於晶片表面不同，Kinexa使用游離抗體及呈流體相之配位體評估親和力，其更接近天然狀態。
表15：Kinexa動力學- 經純化之抗OSM備用抗體H0(huCDRH1)L1及人類化15E10之人類OSM、獼猴OSM、恆河猴OSM及狨猿OSM結合動力學。
總結論為人類化15E10與狨猿OSM之結合顯著弱於人類化15E10與人類OSM之結合。
人類gp130 ELISA：
人類gp130 ELISA使用過量OSM(25 ng/ml)，由此降低其區分高親和力抗體與較低親和力抗體之能力。在重複3次gp130分析法後，確認此分析法中10G8小鼠親本抗體、10G8嵌合體、人類化10G8 H0L1親本抗體(H0L1)及H0(huCDRH1)L1均有效阻斷人類OSM及獼猴OSM與gp130受體結合(圖21 )。由於此分析法中抗原含量較高，因此未辨別明確排名。
在25%人類AB血清及25%人類混合滑液存在下重複人類gp130分析法。對各基質重複三次此分析法表明所有抗體(10G8小鼠親本抗體、10G8嵌合體、人類化10G8 H0L1親 本抗體(H0L1)及H0(huCDRH1)L1以及15E10h)均保持其阻斷人類OSM及獼猴OSM與gp130結合之能力(數據未顯示)。
KB細胞中和分析法：
由於使用較低(1 ng/ml)OSM含量，因此與gp130分析法相比，KB細胞中和分析法為用於區分高親和力中和劑與低親和力中和劑之辨別力更強的分析法。重複三次分析法，H0(huCDRH1)L1針對人類OSM之平均IC50 值為30 ng/ml，針對獼猴OSM之平均IC50 值為41 ng/ml且針對狨猿OSM之平均IC50 值為36 ng/ml(圖22；表17 )。
在25%人類AB血清或25%混合人類滑液存在下，H0(huCDRH1)L1及15E10h均保持其中和人類OSM及獼猴OSM之能力(圖23 )。在25% AB血清或25%混合滑液存在下發現活性有一定程度的降低。此極有可能係由於該等基質干擾此分析法結果讀取所引起。與正常分析法相比，此分析法中觀測到更高的IL-6背景含量。
與15E10h不同，KB細胞中和分析法中證實H0(huCDRH1)L1中和狨猿OSM。三種其他抗人類OSM抗體10D3DLE、OM4.11.17及OM4.11.31之群組亦未能中和狨猿OSM。
內源人類OSM gp130分析法：
10G8小鼠親本抗體、10G8嵌合體、人類化10G8 H0L1親本抗體(H0L1)及H0(huCDRH1)L1以及15E10h均抑制來自四個獨立供者之內源人類OSM(圖24 )。經由該四種供者之結果，H0L1親本抗體與H0(huCDRH1)L1 mAb之間的差異極小；該兩種抗體排名位於10G8小鼠親本抗體及其嵌合體之前(表18 )。H0(huCDRH1)L1與15E10h相比效能增加約12倍(1.09 log)。由GM-CSF刺激健康人類嗜中性白血球產生原生OSM。
表18：內源OSM人類gp130分析法- 用於評估10G8小鼠親本抗體、10G8Ch、人類化10G8 H0L1親本抗體(H0L1)及H0(huCDRH1)L1針對內源人類OSM之活性之gp130 ELISA中四種嗜中性白血球供者之概述。出於比較之目的添加15E10h。不相關抗體用作陰性對照。
人類LIF反應性(KB細胞中和分析法)：
人類LIF為IL-6家族中與人類OSM相關性最強的成員。三次重複人類LIF KB細胞分析法表明10G8小鼠親本抗體、10G8嵌合體、人類化10G8 H0L1親本抗體(H0L1)及H0(huCDRH1)L1或15E10h均不中和人類LIF。出於比較之目的添加15E10h。此分析法中，市售抗人類LIF抗體中和LIF(圖25 )。此證明該等抗體具OSM特異性。
初級人類肝細胞分析法：
人類初級肝細胞對OSM敏感且回應於OSM刺激釋放急性期蛋白質，諸如SAA及CRP。H0(huCDRH1)L1以劑量依賴性方式抑制來自三個獨立供者之肝細胞中人類OSM誘導之SAA(圖26 )及CRP(圖27 )釋放。出於比較之目的添加人類化15E10。
使用其他初級人類細胞類型進行等效分析法。該等細胞包括人類臍靜脈內皮細胞；來自類風濕性關節炎患者之人類纖維母細胞樣滑膜細胞；來自健康人員及特發性肺纖維化患者之人類肺纖維母細胞(數據未顯示)。與先前分析法相同，H0(huCDRH1)L1對OSM之中和效能優於人類化15E10。H0(huCDRH1)L1與人類化15E10之間的效能差異 倍數視細胞株及OSM濃度而不同。
2.6生物物理學表徵
進行H0(huCDRH1)L1及人類化10G8 H0L1親本mAb之基本生物物理學概況研究。抗體經受環境應力，諸如：-溫度，藉由在4℃或37℃下培育14天；-五次凍融循環；-強制脫醯胺作用，藉由與1%碳酸氫銨一起在37℃下培育48小時。
兩種抗體在經受上述應力後均未顯示生物物理學變化損失或活性損失。
2.6CDRH3變異人類化抗體 2.6.1構築CDRH3變異人類化抗體
在作為基底分子之pTT質體(National Research Council Canada，具有經修飾之多選殖位點(MCS))上使用重鏈H0(IGHV3_23)全長序列SEO ID NO：75(可變序列：SEQ ID NO：74)將CDRH3(SEQ ID NO：3)之各殘基取代為替代性胺基酸殘基。使用定點突變誘發技術(SDM)，藉此設計在胺基酸取代位置處具有序列NNK(N=A/T/G/C；K=G或T)之寡核苷酸。使用聚合酶鏈反應(PCR)產生含有變化之新質體且使用DNA定序鑑別具有胺基酸變化之純系。藉此，分離在12個CDRH3位置之每一處具有10至17個不同胺基酸之變異體。藉由將包含H0(IGHV3_23)變異體之pTT載體與L1輕鏈(SEQ ID NO：72)一起共轉染來產生CDRH3變異抗體並測試上清液之結合。
產生164個CDRH3變異體且於後續分析中進行測試(參見2.6.2及2.6.3)。
2.6.2 CDRH3變異體於HEK 293 6E細胞中表現
將編碼重鏈(H0(IGHV3_23))CDRH3變異體之pTT質體與輕鏈L1暫時性共轉染至HEK 293 6E細胞中且小規模表現以產生抗體。直接自組織培養物上清液評估抗體。
2.6.3 CDRH3變異體組織培養物上清液之動力學分析
用ProteOn XPR36(Biorad Laboratories)進行CDRH3篩選物之初始動力學分析且選擇某些上清液在BiaCore T100上進行更精確的動力學分析。
對於ProteOn分析，藉由一級胺偶合使抗人類IgG(GE Healthcare/Biacore BR-1008-39)與GLM晶片(Biorad Laboratories 176-5012)偶合。CDRH3變異體經直接捕捉至此表面上且重組人類OSM在256、64、16、4及1 nM下穿過捕捉抗體表面，使用單獨緩衝液注射(亦即0 nM)作為結合曲線之雙參考。在OSM結合事件後，用3 M MgCl2 再生捕捉表面，再生作用移除先前捕捉之抗體以準備用於另一捕捉循環及結合分析。接著以ProteOn分析軟體固有的1：1模型(在質量輸送下)擬合數據。使用HBS-EP(Biacore/GE-Healthcare BR-1006-69)執行操作且分析溫度為25℃。
使用Biacore T100以類似方法分析構築體，藉由一級胺偶合使抗人類IgG(GE Healthcare/Biacore BR-1008-39)與CM5晶片(GE Healthcare/Biacore BR-1006-68)偶合，抗體經捕捉在該表面上且重組人類OSM在256、64、16、4及1 nM下穿過捕捉抗體表面，使用單獨緩衝液注射(亦即0 nM)作為結合曲線之雙參考。使用3 M MgCl2 或100 mM磷酸之脈衝或使用兩種試劑進行再生。以Biacore T100分析軟體固有的1：1模型擬合數據。使用HBS-EP(Biacore/GE-Healthcare BR-1006-69)執行操作且分析溫度為25℃。
關於結合數據結果參見圖33。
序列表
SEQ ID NO：1 10G8 CDRH1
NYAMS
SEQ ID NO：2 10G8 CDRH2
TISDGGSFTYYLDNVRG
SEQ ID NO：3 10G8 CDRH3
DVGHTTFWYFDV
SEQ ID NO：4 10G8 CDRL1
RASKSVSAAGYNFMH
SEQ ID NO：5 10G8 CDRL2
YASNLES
SEQ ID NO：6 10G8 CDRL3
LHSREFPFT
SEQ ID NO：7 3E3 CDRH1
SYAMS
SEQ ID NO：8 3E3 CDRH2
TISDGGSFTYYFANIQG
SEQ ID NO：9 3E3 CDRH3
DVGLTTFWYFDV
SEQ ID NO：10 3E3 CDRL1
RASKSVSPSGYDFMH
SEQ ID NO：11 3E3 CDRL2
YASELES
SEQ ID NO：12 3E3 CDRL3
QHSREFPFT
SEQ ID NO：13 2B7 CDRH1
NYAMS
SEQ ID NO：14 2B7 CDRH2
TISDGGGYTYYLDNGQG
SEQ ID NO：15 2B7 CDRH3
DVGLTTFWYFDV
SEQ ID NO：16 2B7 CDRL1
RASKSVSPSSYNFMH
SEQ ID NO：17 2B7 CDRL2
YASNLES
SEQ ID NO：182B7 CDRL3
QHSREFPFT
SEQ ID NO：199G2 CDRH1
NYAMS
SEQ ID NO：209G2 CDRH2
TISDGGSFTYYLDNVKG
SEQ ID NO：219G2 CDRH3
DVGHTTFWYFDV
SEQ ID NO：229G2 CDRL1
RASKSVSASGYNFMH
SEQ ID NO：239G2 CDRL2
YASNLES
SEQ ID NO：249G2 CDRL3
QHSREFPFT
SEQ ID NO：25 10G8 V H 核苷酸序列
GAAATGCAACTGGTGGAGTCTGGGGAAGGCTTAGTGGAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA GAGCCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTTCACCTACTATCTAGACAATGTAA GGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTATTTGCAAATGAGCCATTTG AAGTCTGACGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGACATACTACCTTTTGGTACTT CGATGTCTGGGGCTCAGGGACCGCGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：26 10G8 V H 胺基酸序列
EMQLVESGEGLVEPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKSLEWVATISDGGSFTYYLDNVRG RFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSDDTAMYYCARDVGHTTFWYFDVWGSGTAVTVSS
SEO ID NO：27 10G8 V L 核苷酸序列
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTTCTTAGTTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC CTGTAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTGCAGCTGGCTATAATTTCATGCACTGGTACCAACAGAAA CCAGGACAGCCGCCCAAAGTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCA GGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGG ATGCTGTAACATATTACTGTCTGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAA CCTGGAAATAAAA
SEO ID NO：28 10G8 V L 胺基酸序列
DIVLTQSPVFLVVSLGQRATISCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLESGVPARFS GSGSGTDFTLNIHPVEEEDAVTYYCLHSREFPFTFGGGTNLEIK
SEO ID NO：29 3E3 V H 核苷酸序列
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAACCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC TGTGTACCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGTTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA GAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTTCACCTACTATTTTGCCAATATAC AGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATACCAAGAACAACCTATACCTGCAAATGAACCATCTG AAGTCTGAGGACGCAGGCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGCCTTACTACGTTTTGGTATTT CGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：30 3E3 V H 胺基酸序列
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCVPSGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGSFTYYFANIQG RFTISRDNTKNNLYLQMNHLKSEDAGMYYCARDVGLTTFWYFDVWGTGTTVTVSS
SEQ ID NO：31 3E3 V L 核苷酸序列
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAACTATATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC CTGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTCCATCTGGCTATGATTTCATGCACTGGTATCAACAGAAG CCAGGACAGCCGCCCAAACTCCTCATCAAGTATGCATCCGAACTAGAATCTGGGGTCCCTGGGA GGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAAGAAGA TGCTGCAACATATTTCTGTCAGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAG CTGGAAATAAAA
SEQ ID NO：32 3E3 V L 胺基酸序列
DIVLTQSPASLTISLGQRATISCRASKSVSPSGYDFMHWYQQKPGQPPKLLIKYASELESGVPGRFSG SGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYFCQHSREFPFTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：33 2B7 V H 核苷酸序列
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAACCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA GAGGCTGGAGTGGGTCGCGACCATTAGTGATGGTGGTGGTTACACCTACTATTTAGACAATGGA CAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAGATGAGCCATV TGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGACTTACTACGTTTTGGTAC TTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：34 2B7 V H 胺基酸序列
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGGYTYYLDNGQ GRFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSEDTAMYYCARDVGLTTFWYFDVWGTGTTVTVSS
SEQ ID NO：35 2B7 V L 核苷酸序列
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTCCTTAGTTATATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC CTGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTCCATCTAGCTATAATTTCATGCACTGGTACCAACAGAGAC CAGGACAGCCGCCCAAACTCCTCATCACGTATGCTTCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAG GTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAAGAGGAT GCTGCAACATATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAGGC TGGAAATAAAA
SEQ ID NO：36 2B7 V L 胺基酸序列
DIVLTQSPVSLVISLGQRATISCRASKSVSPSSYNFMHWYQQRPGQPPKLLITYASNLESGVPARFSG SGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPFTFGGGTRLEIK
SEQ ID NO：37 9G2 V H 核苷酸序列
GAAGTACAACTAGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGGAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGGCAGACTCCGGAAAA GAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTTCACCTACTATCTAGACAATGTAA AGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTATTTGCAAATGAGCCATTTG AAGTCTGACGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGACATACTACGTTTTGGTACTT CGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：38 9G2 V H 胺基酸序列
EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGSFTYYLDNVKG RFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSDDTAMYYCARDVGHTTFWYFDVWGTGTTVTVSS
SEQ ID NO：39 9G2 V L 核苷酸序列
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGITTTCTTAGTTATATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC CTGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTGCATCTGGCTATAATTTCATGCACTGGTACCAACAGAAAC CAGGACAGCCGCCCAAAGTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAG GTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGAT GCTGTAACATATTACTGTCAGGACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGC TGGAAATAAAA
SEQ ID NO：40 9G2 V L 胺基酸序列
DIVLTQSPVFLVISLGQRATISCRASKSVSASGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLESGVPARFSG SGSGTDFTLNIHPVEEEDAVTYYCQHSREFPFTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：41 10G8 V H 嵌合體核苷酸序列
GAAATGCAACTGGTGGAGTCTGGGGAAGGCTTAGTGGAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA GAGCCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTTCACCTACTATCTAGACAATGTAA GGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTATTTGGAAATGAGCCATTTG AAGTCTGACGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGACATACTACCTTTTGGTACTT CGATGTCTGGGGCTCAGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGT GTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCG TGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCG TGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACAC CAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCC TGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCT GATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGA GGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGA GGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCT GAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACC ATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATC GCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTG GACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGTGGCAGCAG GGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCC TGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID NO：42 10G8 V H 嵌合體胺基酸序列
EMQLVESGEGLVEPGGSLKLSCAASGFTFSNYRMSWVRQTPEKSLEWVATISDGGSFTYYLDNVRG RFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSDDTAMYYCARDVGHTTFWYFDVWGSGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWTVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：43 10G8 V L 嵌合體核苷酸序列
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTTCTTAGTTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC CTGTAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTGCAGCTGGCTATAATTTCATGCACTGGTACCAACAGAAA CCAGGACAGCCGCCCAAAGTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCA GGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGG ATGCTGTAACATATTACTGTCTGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAA CCTGGAAATAAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAG CTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAG GTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCA GGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGA GAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAG CTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ ID NO：44 10G8 V L 嵌合體胺基酸序列
DIVLTQSPVFLVVSLGQRATISCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPQQPPKVLIKYASNLESGVPARFS GSGSGTDFTLNIHPVEEEDAVTYYCLHSREFPFTFGGGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：45 9G2 V H 嵌合體核苷酸序列
GAAGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGGAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA GAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTTCACCTACTATCTAGACAATGTAA AGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTATTTGCAAATGAGCCATTTG AAGTCTGACGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGACATACTACGTTTTGGTACTT CGATGTCTGGGGCACAGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGT GTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCG TGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCG TGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACAC CAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCC TGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCT GATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGA GGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGA GGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCT GAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACC ATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATC GCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTG GACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAG GGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCC TGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID NO：46 9G2 V H 嵌合體胺基酸序列
EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGSFTYYLDNVKG RFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSDDTAMYYCARDVGHTTFWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：47 9G2 V L 嵌合體核苷酸序列
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTTCTTAGTTATATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC CTGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTGCATCTGGCTATAATTTCATGCACTGGTACCAACAGAAAC CAGGACAGCCGCCCAAAGTCCTCATCAAGATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAG GTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGAT GCTGTAACATATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGC TGGAAATAAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCT GAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGT GCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGG ACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGA AGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCT TCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ ID NO：48 9G2 V L 嵌合體胺基酸序列
DIVLTQSPVFLVISLGQRATISCRASKSVSASGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLESGVPARFSG SGSGTDFTLNIHPVEEEDAVTYYCQHSREFPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：49 IGHV3_7人類V H 生殖系受者核苷酸序列
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTC CTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTG TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGA
SEQ ID NO：50 IGHV3_7人類V H 生殖系受者胺基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLGCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVK GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
SEQ ID NO：51 IGKV4_1人類V L 生殖系受者核苷酸序列
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCA ACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAG CAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCC CTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGC TGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGTACT
SEQ ID NO：52 IGKV4_1人類V L 生殖系受者胺基酸序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDR FSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYST
SEQ ID NO：53 10G8人類化V H H0核苷酸序列-leto密碼子最佳化
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ ID NO：54 10G8人類化V H H0胺基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGRGTLVTVSS
SEQ ID NO：55 10G8人類化V H H1核苷酸序列-leto密碼子最佳化
GAGATGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ ID NO：56 10G8人類化V H H1胺基酸序列
EMQLVESGGGLVQPGGSLRLGCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGRGTLVTVSS
SEQ ID NO：57 10G8人類化V H H2核苷酸序列leto密碼子最佳化
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATGAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAATAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCTCCGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ ID NO：58 10G8人類化V H H2胺基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGSGTLVTVSS
SEQ ID NO：59 10G8人類化V L L0核苷酸序列-密碼子最佳化
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAAGGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO：60 10G8人類化V L L0胺基酸序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKLLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLHSREFPFTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：61 10G8人類化V L L1核苷酸序列-Leto密碼子最佳化
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGGTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAAGGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO：62 10G8人類化V L L1胺基酸序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPQQPPKLLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLHSREFPFTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：63 10G8人類化V L L2核苷酸序列-leto密碼 子最佳化
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGTGGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAAGGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO：64 10G8人類化V L L2胺基酸序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKLLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLGAEDVVYYYCLHSRFFPFTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：65 10G8人類化V L L3核苷酸序列-leto密碼子最佳化
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAACGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO：66 10G8人類化V L L3胺基酸序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKLLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYCLHSREFPFTFGGGTNVEIK
SEQ ID NO：67 10G8人類化V L L4核苷酸序列-leto密碼子最佳化
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGGTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGTGGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAACGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO：68 10G8人類化V L L4胺基酸序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVVVYYCLHSREFPFTFGGGTNVEIK
SEO ID NO：69成熟H0重鏈核苷酸序列-leto密碼子最佳化
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGG GCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGC CCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCT AAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCAC GAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACC AAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCAC CAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTA TCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCC CTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCC CAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCC CCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACC CAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID NO：70成熟H0重鏈胺基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：71成熟L1輕鏈核苷酸序列-leto密碼子最佳化
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGGTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGAT GAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAG GCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGAC CGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGA CTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGAC CAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ ID NO：72成熟L1輕鏈胺基酸序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLHSREFPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：73人類化V H 變異體H0(IGHV3_23 CDRH1)核苷酸序列-leto密碼子最佳化
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ ID NO：74人類化V H 變異體H0(IGHV3_23 CDRH1)胺基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGRGTLVTVSS
SEQ ID NO：75成熟H0(IGHV3_23 CDRH1)重鏈核苷酸序列-leto密碼子最佳化
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGG GCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGC CCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCT AAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCAC GAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACC AAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCAC CAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTA TCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCC CTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCC CAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCC CCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACC CAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID NO：76成熟H0(IGHV3_23 CDRH1)重鏈胺基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：77人類重鏈生殖系IGHV3_23 CDRH1
SYAMS
SEQ ID NO：78人類輕鏈生殖系IGKV1_5 CDRL2
KASSLES
SEQ ID NO：79 15E10人類化重鏈胺基酸序列：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEWVAVIWRGGSTDYNAAFM SRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPNSNFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEO ID NO：80 15E10人類化輕鏈胺基酸序列：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSGSSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIEDTSNLASGIPARFSGSGSGT DYTLTISNLEPEDFAVYYCQQWSSYPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：81 15E10人類化V H B3
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLTNYGYHWVRQAPGKGLEWVAVIWRGGSTDUMAAFM SRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPNSNFYWYFDVWGRGTLV(TVSS)
SEQ ID NO：82 15E10人類化V L L2
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSGSSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIEDTSNLASGIPARFSGSGSGT DYTLTISNLEPEDFAVYYCQQWSSYPPTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：83人類OSM聚核苷酸序列
ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC CTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCGGCTATAGGCAGCTGCTCGAAAGAG TACCGCGTGCTCCTTGGCCAGCTCCAGAAGCAGACAGATCTCATGCAGGAC ACCAGCAGACTCCTGGACCCCTATATACGTATCCAAGGCCTGGATGTTCCT AAACTGAGAGAGCACTGCAGGGAGCGCCCCGGGGCCTTCCCCAGTGAGGAG ACCCTGAGGGGGCTGGGCAGGCGGGGCTTCCTGCAGACCCTCAATGCCACA CTGGGCTGCGTCCTGCACAGACTGGCCGACTTAGAGCAGCGCCTCCCCAAG GCCCAGGATTTGGAGAGGTCTGGGCTGAACATCGAGGACTTGGAGAAGCTG CAGATGGCGAGGCCGAACATCCTCGGGCTCAGGAACAACATCTACTGCATG GCCCAGCTGCTGGACAACTCAGACACGGCTGAGCCCACGAAGGCTGGCCGG GGGGCCTCTCAGCCGCCCACCCCCACCCCTGCCTCGGATGCTTTTCAGCGC AAGCTGGAGGGCTGCAGGTTCCTGCATGGCTACCATCGCTTCATGCACTCA GTGGGGCGGGTCTTCAGCAAGTGGGGGGAGAGCCCGAACCGGAGCCGGAGA CACAGCCCCCACCAGGCCCTGAGGAAGGGGGTGCGCAGGACCAGACCCTCC AGGAAAGGCAAGAGACTCATGACCAGGGGACAGCTGCCCCGGTAG
SEQ ID NO：84人類OSM胺基酸序列
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAAIGSCSKEYRVLLG Q LQK Q TDLMQD TSRLLDPYIRIQGLDVPKLREHCRERPGAFPSEETLRGLGRRGFLQTLNAT LGCVLHRLADLEQRLPKAQDLERSGLNIEDLEKLQMARPNIL G LRN N IYCM AQLLDNSDTAEPTKAGRGASQPPTPTPASDAFQRKLEGCRFLHGYHRFMHS VGRVFSKWGESPNRSRRHSPHQALRKGVRRTRPSRKGKRLMTRGQLPR.
圖1：人類gp130 ELISA- 10G8、9G2、3E3及2B7對人類OSM與人類gp130之結合之抑制作用。出於比較的目的添加非競爭性抗OSM小鼠抗體(15E10)。工具抗體(tool antibody)用作陰性對照。所展示之數據表示四次重複分析 中之一者。
圖2：KB細胞分析法- 10G8、9G2、3E3及2B7對人類OSM之抑制作用。出於比較的目的添加非競爭性抗OSM小鼠抗體(15E10)。工具抗體用作陰性對照。所展示之數據表示三次重複分析中之一者。
圖3：KB細胞分析法- 在25%人類AB血清存在下10G8、9G2、3E3及2B7對人類OSM之抑制作用。出於比較的目的添加非競爭性抗OSM小鼠抗體(15E10)。工具抗體用作陰性對照。所展示之數據表示兩次重複分析中之一者。
圖4：內源OSM人類gp130分析法- 10G8、9G2、3E3及2B7抗體對內源人類OSM與人類gp130之結合之抑制作用。出於比較的目的添加非競爭性抗OSM小鼠抗體(110)。工具抗體用作為陰性對照。所展示之數據表示兩種供者中之一者。
圖5：KB細胞分析法- 10G8、9G2、3E3及2B7對人類LIF缺乏抑制作用。出於比較的目的添加非競爭性抗OSM小鼠抗體(15E10)。市售抗人類LIF mAb(R&D Systems，MAB250)用作為陽性對照。工具抗體用作陰性對照。
圖6：KB細胞分析法- 10G8、9G2、3E3及2B7對狨猿OSM之抑制作用。出於比較的目的添加非競爭性抗OSM小鼠抗體(15E10)。工具抗體用作陰性對照。所展示之數據表示兩次重複分析中之一者。
圖7：2B7、3E3、9G2及10G8融合瘤之VH序列之比較。 小框中之殘基表示與大多數殘基不同。跨越序列之大框表 示CDR。
圖8：2B7、3E3、9G2及10G8融合瘤之VL序列之比較。 小框中之殘基表示與大多數殘基不同。跨越序列之大框表示CDR。
圖9：可變輕鏈之序列分析- 10G8、9G2、3E3及2B7與非競爭性抗OSM小鼠親本抗體15E10比較。
圖10：可變重鏈之序列分析- 10G8、9G2、3E3及2B7與非競爭性抗OSM小鼠親本抗體15E10比較。
圖11：直接人類OSM結合ELISA- 10G8及9G2嵌合體之人類OSM結合與15E10嵌合體(15E10c)之人類OSM結合比較。
圖12：人類gp130 ELISA- 10G8、10G8嵌合體、9G2及9G2嵌合體對人類OSM與人類gp130之結合之抑制作用。出比較的目的添加非競爭性抗OSM小鼠抗體(15E10)。工具抗體用作為陰性對照。所展示之數據表示三次重複分析中之一者。
圖13：KB細胞分析法- 10G8、10G8嵌合體、9G2及9G2嵌合體對人類OSM之抑制作用。出於比較的目的添加非競爭性抗OSM小鼠抗體(15E10)。工具抗體用作陰性對照。所展示之數據表示三次重複分析中之一者。
圖14：KB細胞分析法- 在25%人類AB血清存在下10G8、10G8嵌合體、9G2及9G2嵌合體對人類OSM之抑制作用。出於比較的目的添加非競爭性抗OSM小鼠抗體(15E10)。工具抗體用作陰性對照。所展示之數據表示三次重複分析 中之一者。
圖15：內源OSM人類gp130分析法- 10G8、10G8嵌合體、9G2及9G2嵌合體抗體對內源人類OSM與人類gp130結合之抑制作用。出於比較的目的添加非競爭性抗OSM小鼠抗體(15E10)。工具抗體用作陰性對照。所展示之數據表示兩種供者中之一者。
圖16：人類LIF KB細胞分析法- 10G8、10G8嵌合體、9G2及9G2嵌合體對人類LIF無抑制作用。出於比較的目的添加非競爭性抗OSM小鼠抗體(15E10)。抗人類LIF抗體(MAB250，R&D Systems)用作陽性對照。工具抗體用作陰性對照。所展示之數據表示三次重複分析中之一者。
圖17：KB細胞分析法- 人類化10G8 L1及L4變異體對人類OSM之抑制作用。添加15E10h以作比較。所展示之數據表示三次重複分析中之一者。
圖18：人類gp130 ELISA- 人類化10G8 H0L1、H1L1及H2L1變異體對人類OSM與人類gp130之結合之抑制作用。添加15E10h以作比較。工具抗體用作陰性對照。所展示之數據表示兩次重複分析中之一者。
圖19：人類OSM-10G8 mAb結合複合物- 人類OSM與10G8 mAb輕鏈及重鏈之結合。展示OSM受體結合位點(位點II及位點III)。列出各位點之受體結合區中之重要胺基酸殘基。
圖20：KB細胞分析法- 人類化10G8 H0L1 CDRH1及CDRL2變異抗體對人類OSM之抑制作用。添加15E10h以作 比較。工具抗體用作陰性對照。所展示之數據表示三次重複分析中之一者。
圖21：人類gp130 ELISA- 10G8小鼠親本抗體、10G8嵌合體、人類化10G8 H0L1親本抗體(H0L1)及H0(huCDRH1)L1對人類OSM與人類gp130之結合之抑制作用。添加15E10h以作比較。工具抗體用作陰性對照。所展示之數據表示三次重複分析中之一者。
圖22：KB細胞分析法- 10G8小鼠親本抗體、10G8嵌合體、人類化10G8 H0L1親本抗體(H0L1)及H0(huCDRH1)L1對人類OSM之抑制作用。添加15E10h以作比較。所展示之數據表示三次重複分析中之一者。
圖23：KB細胞分析法- 在25%人類AB血清存在下10G8小鼠親本抗體、10G8嵌合體、人類化10G8 H0L1親本抗體(H0L1)及H0(H1)L1對人類OSM之抑制作用。添加15E10h以作比較。工具抗體用作陰性對照。所展示之數據表示兩次重複分析中之一者。
圖24：內源OSM人類gp130分析法- 10G8小鼠親本抗體、10G8嵌合體、人類化10G8 H0L1親本抗體(H0L1)及H0(huCDRH1)L1對內源人類OSM與人類gp130之結合之抑制作用。添加15E10h以作比較。工具抗體用作陰性對照。所展示之數據表示四種供者中之一者。
圖25：人類LIF KB細胞分析法- 10G8小鼠親本抗體、10G8嵌合體、人類化10G8 H0L1親本抗體(H0L1)，H0(huCDRH1)L1對人類LIF無抑制作用。添加15E10h以作比 較。抗人類LIF抗體(MAB250，R&D Systems)用作陽性對照。工具抗體用作陰性對照。所展示之數據表示三次重複分析中之一者。
圖26：人類初級肝細胞分析法- H0(huCDRH1)L1對經(A)3 ng/ml及(B)10 ng/ml人類OSM刺激之人類肝細胞釋放血清類澱粉蛋白A(SAA)之抑制作用。出於比較的目的添加人類化15E10。所展示之數據表示三種肝細胞供者中之一者。
圖27：人類初級肝細胞分析法- H0(huCDRH1)L1對經(A)3 ng/ml及(B)10 ng/ml人類OSM刺激之人類肝細胞釋放C-反應性蛋白質(CRP)之抑制作用。出於比較的目的添加人類化15E10。所展示之數據表示三種肝細胞供者中之一者。
圖28：人類RA纖維母細胞樣分析法- H0(huCDRH1)L1對經(A)0.3 ng/ml及(B)3 ng/ml人類OSM刺激之人類RA纖維母細胞樣滑膜細胞(HFLS-RA)釋放IL-6之抑制作用。出於比較的目的添加人類化15E10。所展示之數據表示三種HFLS-RA供者中之一者。
圖29：人類RA纖維母細胞樣分析法- H0(huCDRH1)L1對經(A)0.3 ng/ml及(B)3 ng/ml人類OSM刺激之人類RA纖維母細胞樣滑膜細胞(HFLS-RA)釋放MCP-1之抑制作用。出於比較的目的添加人類化15E10。所展示之數據表示三種HFLS-RA供者中之一者。
圖30：人類臍靜脈內皮細胞分析法- H0(huCDRH1)對經 (A)30 ng/ml及(B)100 ng/ml人類OSM刺激之人類臍靜脈內皮細胞釋放IL-6之抑制作用。出於比較的目的添加人類化15E10。所展示之數據表示三次重複分析中之一者。
圖31：人類肺纖維母細胞分析法- H0(huCDRH1)L1對經人類OSM刺激之人類肺纖維母細胞釋放MCP-1之抑制作用。出於比較的目的添加人類化15E10。所展示之數據表示(A)1名健康供者及(B)1名IPF供者。
圖32：人類肺纖維母細胞分析法- H0(huCDRH1)L1對經人類OSM刺激之人類肺纖維母細胞釋放IL-6之抑制作用。出於比較的目的添加人類化15E10(標記為抗體X)。所展示之數據表示(A)1名健康供者及(B)1名IPF供者。
圖33：CDRH3變異體結合數據- 對於CDRH3中發現之殘基進行丙胺酸掃描。提供之數據展示該種殘基之變化如何影響結合親和力。
圖34： 說明hOSM與gp130、LIFR及OSMR之間的相互作用。
抗體命名法-為避免引起疑問，15E10h及人類化15E10係指相同抗體且在一些圖式中標記為抗體X。10G8/A9及10G8亦係指相同抗體。
<110> 英商葛蘭素栠團有限公司
<120> 抗原結合蛋白質
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Claims (23)

  1. 一種抗原結合蛋白質，其特異性結合於OSM且抑制OSM與gp130受體結合但不直接與位點II處之殘基相互作用，且其中該抗原結合蛋白質包含：i)如SEQ ID NO：3所示之CDRH3；ii)如SEQ ID NO：2所示之CDRH2；iii)如SEQ ID NO：4所示之CDRL1；及iv)如SEQ ID NO：6所示之CDRL3。
  2. 如請求項1之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質進一步包含：i)如SEQ ID NO：1所示之CDRH1；及iii)如SEQ ID NO：5所示之CDRL2。
  3. 如請求項1或2之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質不直接結合於殘基Q20、G120、Q16、N124中之任一者。
  4. 如請求項1或2之抗原結合蛋白質，其與人類OSM之殘基82、83、84、90、94、112、115、122、123、152中之一或多者相互作用。
  5. 如請求項2之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質包含：i)如SEQ ID NO：3所示之CDRH3；ii)如SEQ ID NO：1所示之CDRH1；iii)如SEQ ID NO：2所示之CDRH2；iv)如SEQ ID NO：4所示之CDRL1； v)如SEQ ID NO：5所示之CDRL2；vi)如SEQ ID NO：6所示之CDRL3；及vii)該重鏈構架包含以下殘基：位置2 Val、Ile或Gly位置4 Leu或Val位置20 Leu、Ile、Met或Val位置22 Cys位置24 Thr、Ala、Val、Gly或Ser位置26 Gly位置29 Ile、Phe、Leu或Ser位置36 Trp位置47 Trp位置48 Ile、Met、Val或Leu位置69 Ile、Leu、Phe、Met或Val位置71 Arg位置78 Ala、Leu、Val、Tyr或Phe位置80 Leu、Met位置90 Tyr或Phe位置92 Cys位置94 Arg、Lys、Gly、Ser、His或Asn。
  6. 如請求項1或2之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質不直接經由CDRH1或CDRL2與OSM相互作用。
  7. 如請求項1或2之抗原結合蛋白質，其進一步包含由SEQ ID NO：73編碼之重鏈可變區及由SEQ ID NO：71編碼之 輕鏈可變區。
  8. 如請求項1或2之抗原結合蛋白質，其進一步包含由SEQ ID NO：74編碼之重鏈可變區及由SEQ ID NO：72編碼之輕鏈可變區。
  9. 如請求項1或2之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質為人類化抗體。
  10. 如請求項9之抗原結合蛋白質，其中該抗體為IgG1。
  11. 如請求項1或2之抗原結合蛋白質，其中當結合於OSM時，共晶體包含具有約a=168.525 A，b=81.614 A，c=55.540 A且β=106.60度之尺寸之單位晶胞。
  12. 如請求項1或2之包含CDR之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質為片段，該片段為Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、微抗體(miniantibody)、微型抗體(minibody)、經分離VH 或經分離VL 。
  13. 如請求項1或2之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質另外結合非人類靈長類動物OSM。
  14. 如請求項1或2之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質以小於40pm之親和力結合OSM。
  15. 如請求項1或2之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質在競爭ELISA分析法中不與具有SEQ ID NO：79之重鏈及SEQ ID NO：80之輕鏈的抗體競爭。
  16. 如請求項1或2之抗原結合蛋白質，當藉由Biacore或kinexa量測時，其以強於1nM之親和力結合於狨猿OSM 及人類OSM。
  17. 一種抗原結合蛋白質，其與如請求項1至16中任一項之抗原結合蛋白質競爭。
  18. 一種重組轉型、轉染或轉導之宿主細胞，其包含至少一個表現卡匣，其中該表現卡匣包含編碼如請求項7或8之抗原結合蛋白質之重鏈的聚核苷酸且進一步包含編碼如請求項7或8之抗原結合蛋白質之輕鏈的聚核苷酸。
  19. 如請求項18之宿主細胞，其中該細胞為哺乳動物。
  20. 如請求項19之宿主細胞，其中該細胞為CHO或NSO。
  21. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至16中任一項之抗原結合蛋白質及醫藥學上可接受之載劑。
  22. 一種如請求項21之組合物之用途，其係用於製備用以治療罹患發炎性病症或疾病之人類患者之藥劑。
  23. 一種如請求項21之組合物之用途，其係用於製備用以治療罹患發炎性關節病、類風濕性關節炎、骨關節炎、特發性肺纖維化(IPF)、全身性硬化症、休格連氏症候群(Sjogrens syndrome)、硬皮病及/或牛皮癬之人類患者之藥劑。
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