EA031044B1 - Человеческие антитела к онкостатину м и способы их применения - Google Patents

Abstract

В изобретении представлены выделенное антитело, которое специфично связывается с человеческим онкостатином М (ОМ), антигенсвязывающий фрагмент антитела, фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент для лечения или профилактики ОМ-ассоциированных состояний, выделенные полинуклеотиды, которые кодируют тяжелую и легкую цепи антитела, стабильно трансформированная или трансфицированная рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая указанный полинуклеотид, а также набор для лечения или профилактики ОМ-ассоциированных состояний. Также представлены способ лечения больного человека, страдающего заболеванием или расстройством, связанным с модулирующей активностью или взаимодействием человеческого ОМ с человеческим белком, и способ получения антитела.

Description

Настоящее изобретение относится к человеческому антителу, способному нейтрализовать биологическую активность, вызванную онкостатином М, путем связывания с мембранными рецепторами, и способам его использования.

Предпосылки создания изобретения

Онкостатин М (ОМ) является мультифункциональным членом семейства цитокинов ИЛ-6 с массой 28 кДа, которые секретируются моноцитами, макрофагами, нейтрофилами и активированными Тлимфоцитами (Tanaka & Miyajima, Rev Physiol Biochem Pharmacol 149: 39-53, 2003). Протеолитическое расщепление в области карбоксильного конца секретированного ОМ приводит к формированию полностью активной формы ОМ, которая составляет 209 аминокислотных остатков в длину и содержит два Nсвязанных участка гликозилирования. ОМ относится к семейству цитокинов ИЛ-6, которое включает ИЛ-6, ИЛ-11, фактор, ингибирующий лейкемию (LIF), кардиотрофин-1, цилиарный нейтротрофический фактор (CNTF) и кардиотрофинподобный цитокин (CLC), которые содержат общую рецепторную субъединицу - белок gp130. У людей ОМ проявляет сигнальную активность посредством рецепторных гетеродимеров, содержащих gp130 и субъединицу LIFRa или gp130 и субъединицу β OSMR. В отличие от других цитокинов семейства ИЛ-6 ОМ непосредственно связывается с gp130 при отсутствии какого-либо дополнительного мембраносвязанного корецептора (Gearing et al., Science 255: 1434-1437, 1992). После того как ОМ связался с gp130, в образовании высокоафинного сигнального комплекса принимают участие OSMRβ или LIFRa (Mosley et al., J Biol Chem 271: 32635-32643, 1996). Активация другого рецептора приводит к передаче сигнала по пути JAK/STAT (Auguste et al., J Biol Chem 272: 15760-15764, 1997).

ОМ главным образом вырабатывается клетками, вырабатываемыми иммунной системой, и в связи с широкой распространенностью сигнальных рецепторов он связан с разнообразными проявлениями биологической активности, включающей регуляцию клеточного роста, развитие нервной системы и регуляцию состава внеклеточного матрикса.

Как следует из названия, онкостатин М связан с процессами онкогенеза. Кроме того, ОМ также принимает участие в ранних стадиях каскадов реакций, происходящих при воспалительных и гипертрофических процессах, приводящих к таким вредоносным состояниям, как легочный фиброз. Таким образом, существует необходимость в получении человеческих антител, специфичных к человеческому ОМ, которые были бы способны к блокированию сигнальных рецепторов (сигнальных рецепторов gp130), и антитела, которые блокируют эти сигналы, могут оказывать используемое в клинике цитотоксическое или иммуномодуляторное действие на клетки, которые экспрессируют gp130.

Изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает ОМ-связывающие моноклональные антитела, способные блокировать активность, связанную с одним или более видом биологической активности, связанной с действием ОМ и ОМ-связывающего рецептора на клетки, ткани или органы в организме пациента. Представлены аминокислотные последовательности примерных ОМ-связывающих моноклональных антител, которые закодированы при помощи нуклеиновых кислот для их экспрессии в клетках организма. Одни или более моноклональные ОМ-антитела настоящего изобретения распознают эпитоп на поверхности ОМ, соединение которого с антителом изобретения предотвращает его взаимодействие с рецепторными компонентами сигнального комплекса gp130 и LIFRa или gp130 и OSMRβ, тем самым предотвращая лигатирование лиганда, вызванное сигнальной и регулирующей последующие звенья сигнальных каскадов биологической активностью.

Одним из аспектов изобретения является выделенное антитело, которое специфично связывается с человеческим онкостатином М (ОМ) и содержит H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14; H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 17; H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21; L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 38; L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 43 и L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46.

В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит вариабельный участок легкой цепи с аминокислотной последовательностью с SEQ ID NO: 51 и вариабельный участок тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью с SEQ ID NO: 55.

Краткое описание некоторых видов на фигурах

Фиг. 1 изображает зародышевые последовательности генов, используемые для построения библиотек Fab-фрагментов, обнаруживаемых на белке оболочки pIX, причем каждый из гипервариабельных участков доменов содержит мозаичный FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 в соответствии с SEQ ID NO: 1-3 (1=IGHV1-69, 2=IGHV3-23 и 3=IGHV5-51), что сопровождается вариабельной длиной, мозаичным участком H-CDR3 и J-участком (FR4, SEQ ID NO: 4); и каждый из низковариабельных участков доменов содержит мозаичный FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 в соответствии с SEQ ID NO: 5-8 (5=IGKV1-39 (012), 6=IGKV3-11 (L6), 7=IGKV3-20 (А27) и 8=IGKV4-1 (В3)), а также CDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 9, который сопровождается J-участком (FR4, SEQ ID NO: 10).

Фиг. 2А является графиком зависимости дозы от эффекта рекомбинантного онкостатина человека и

- 1 031044 яванского макака, который был получен из клеточной линии СНО, для подавления пролиферации клеток A375-S2, которое измерялось при помощи включения 5-бромдезоксиуридина и нормализации до контроля только в присутствии несущей среды.

Фиг. 2В является графиком, изображающим способность антитела М71, содержащего вариабельные домены L180 (SEQ ID NO: 53) и Н17 (SEQ ID NO: 54), для уменьшения супрессии пролиферации ОМ A375-S2, когда ОМ присутствует в концентрации 2 нг/мл.

Фиг. 3 является столбчатой диаграммой, изображающей эффект М64, М71, М55 и М69 в концентрации 20 мкг/мл для увеличения поглощения ³⁵SO₄, которое является мерой увеличения синтеза протеогликанов, который превышает свой нормальный уровень при отсутствии антител и когда антитела неспецифического изотипа использовались в качестве контроля в ко-культивировании человеческих хондроцитов в гранулах альгината и человеческих макрофагах, которые способны секретировать ОМ.

Фиг. 4А является графиком зависимости дозы от эффекта человеческого ОМ, стимулирующего pSTAT3 в клетках неходжкинской лимфомы, когда найденная ЕС₅₀ составляет около 1 нг/мл.

Фиг. 4В является графиком, изображающим способность антитела М71 нейтрализовать сигнал pSTAT3 в присутствии 2 нг/мл ОМ.

Фиг. 5 А и 5В являются диаграммами рассеяния, которые изображают количество IP-10 (А) и МСР-1 (В), обнаруживаемого в сыворотке отдельных мышей после введения ОМ при наличии или отсутствии предварительного введения указанных концентраций антитела М71.

Фиг. 6А и 6В являются графиками, изображающими сывороточные концентрации у яванских макак через некоторое время после внутривенного (А) или подкожного (В) введения 3 мг/кг М71 или Fcварианта М71.

Подробное описание изобретения

Все публикации, упоминаемые в данном описании, включая патенты и патентные заявки, но не ограничиваясь ими, включенные путем ссылок, являются частью настоящего документа, как если бы они были изложены непосредственно в настоящем документе.

Сокращения.

BSA - бычий сывороточный альбумин; CDR - гипервариабельный участок; Супо - Яванский макак (Масаса fascicularis); ДН - диабетическая нефропатия; ECD - внеклеточный домен; FR - каркасный участок; Н - тяжелая цепь; РА-ИЗЛ - интерстициальное заболевание легких при ревматоидном артрите; L легкая цепь; Ig - иммуноглобулин; Mab - моноклональные антитела; ОМ - онкостатин М; ОА - остеортрит; PBS - физиологический раствор с фосфатным буфером; РА - ревматоидный артрит; VL - вариабельный участок легкой цепи; VH - вариабельный участок тяжелой цепи.

Определения.

Используемый в настоящем документе термин антитело включает целые антитела, любые антигенсвязывающие фрагменты или одну из их цепей. Таким образом, антитело включает любую белковую или пептидсодержащую молекулу, которая содержит по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, без ограничений включающую в себя по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой или легкой цепи или их лигандсвязывающую часть, вариабельный участок тяжелой или легкой цепи, константный участок тяжелой или легкой цепи, каркасный участок (FR) или любую их часть или по меньшей мере одну часть связывающего белка, который может быть включен в антитело настоящего изобретения. Термин антитело дополнительно охватывает антитела, их расщепленные фрагменты, специфические части и варианты, включающие миметики антител или содержащие части антител, которые схожи по структуре и/или функции с антителом или его специфическим фрагментом или частью, включая одноцепочечные или однодоменные антитела и их фрагменты.

Функциональные фрагменты включают антигенсвязывающие фрагменты к предопределенной мишени. Примеры связывающих фрагментов охвачены термином антигенсвязывающая часть антитела, которая включает (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, содержащий домены V_L, V_H, C_L и С_Н; (ii) F(ab')₂-фрагмент, который является двухвалентным фрагментом, содержащим два Fab-фрагмента, которые связаны дисульфидным мостиком в области шарнира; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов V_H и С_Н; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов V_L и V_H одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена V_H; и (vi) выделенный гипервариабельный участок (CDR). Более того, хотя два домена V_L и V_H Fv-фрагмента кодируются разными генами, они могут быть объединены способами рекомбинации при помощи синтетического линкера, который позволяет сделать из них одну белковую цепь, в которой участки V_L и V_H соединяются для образования моновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см, например, Bird et al. (I 988) Science 242:423-426, and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином антигенсвязывающая часть антитела. Эти фрагменты антитела получаются при помощи стандартных способов, известных специалистам в данной области техники, и пригодность фрагментов проверяется таким же образом, как и пригодность интактных антител. Напротив, для анализа антигенсвязывающей способности могут использоваться библиотеки конструкций scFv, после чего при помощи стандартных способов они могут сплайсироваться с другой ДНК, которая кодирует зародышевые последовательности генов человека. Одним из примеров такой библиотеки является

- 2 031044

HuCAL - комбинаторная библиотека антител человека (Knappik, A. et al., J Mol. Biol. (2000) 296 (1) :5786).

Термин CDR относится к участку, который определяет комплементарность, или гипервариабельному участку аминокислотных остатков антитела, который участвует или отвечает за связывание с антигеном. Гипервариабельные участки, или CDR, антитела человека подтипа IgG содержат аминокислотные остатки из остатков 24-34 (L-CDR1), 50-56 (L-CDR2) и 89-97 (L-CDR3) в легкой цепи вариабельного домена и 31-35 (H-CDR1), 50-65 (H-CDR2) и 95-102 (H-CDR3) в тяжелой цепи вариабельного домена, как описано у Rabat et al. (1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, пятая редакция Службы общественного здравоохранения, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд), и/или эти остатки из гипервариабельной петли (т.е. остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в легкой цепи вариабельного домена и 26-32 (H1), 53-55 (H2) или текущем обозначении H2 по Хотии 52-57 и 96-101 (H3) в тяжелой цепи вариабельного домена, как описано у Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987). Хотия и Леск относят HV с консервативной структурой к каноническим структурам. Каркасный участок или остатки FR1-4a являются остатками этого вариабельного домена, которые отличаются от гипервариабельных участков, тем самым ограничивая их. Система нумерации по Хотии и Леску учитывает различия в нумерации остатков в петле, указывая протяженность конкретных остатков, обозначенных условными знаками в виде маленьких букв, например 30а, 30b, 30с и т.д. В последнее время была разработана и широко распространена международная система нумерации - международная информационная система ImMunoGeneTics information system® (IMGT) (LaFranc, et al., 2005. Nucl. Acids Res. 33:D593D597).

Здесь CDR упоминаются как с учетом их аминокислотной последовательности, так и расположения в легкой и тяжелой цепях[и при помощи последовательной нумерации. Поскольку расположение CDR в структуре вариабельного домена иммуноглобулина консервативно у различных видов и присутствует там в виде структур, называемых петлями, использование систем нумерации, которые упорядочивают вариабельные домены в соответствии с особенностями структуры, CDR и остатки каркасного участка быстро определяются. Эта информация используется для замены и трансплантации остатков CDR из иммуноглобулинов одного вида в акцепторный каркасный участок, который обычно находится в человеческом антителе.

Термин созревание применяется к направленным изменениям в вариабельном участке антитела с целью изменения свойств полипептида. Как известно в данной области техники и описывается в настоящем документе, большое количество последовательностей, расположенных в V-участке, могут влиять на распознавание антигена. В природе антитела достигают высокой аффинности и специфичности при помощи прогрессивного процесса соматических мутаций. Этот процесс может имитироваться in vitro для обеспечения параллельного отбора и селективной изменчивости, при которых поддерживается целостность последовательности каждой цепи антитела таким образом, что они соответствуют антителам определенных видов, в данном случае человека, а также усиление аффинности или биофизических параметров, таких как растворимость или стойкость к окислению. Процесс создания направленных изменений, или созревание, обычно проводится на уровне кодирующей последовательности и обеспечивается посредством создания подбиблиотек для выбора усиленного свойства.

В настоящем документе термин ОМ относится к полипептиду онкостатину М или полинуклеотиду, содержащему последовательность, которая кодирует полипептид онкостатин М. Человеческий ОМ является продуктом человеческого гена osm (ген 5008).

Термин эпитоп обозначает область связывания белка, которая способна к специфическому связыванию с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных групп на поверхности молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, как и определенные характеристики заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что в присутствии денатурирующих растворителей теряется связывание с первыми, но не теряется связывание со вторыми.

В настоящем документе K_D обозначает константу диссоциации, более конкретно K_D антитела к предопределенному антигену, и является мерой аффинности антитела к конкретной мишени. Высокоаффинные антитела к предопределенному антигену имеют K_D 10-8 М или менее, более предпочтительно 10-9 М или менее и наиболее предпочтительно 10-10 М или менее. Обратной для KD является константа ассоциации KA. Используемые в настоящем документе термины kdis, k2 или kd предназначены для обозначения скорости диссоциации во время определенного взаимодействия антитела с антигеном. KD является отношением скорости диссоциации (k2), также называемой (koff), к скорости ассоциации (k1), или (kon). Таким образом, KD равна k2/k1 или koff/kon и выражается в виде молярной концентрации (М). Из этого следует, что чем меньше KD, тем сильнее связывание. Таким образом, KD 10-6 М (или 1 мкмоль/л) указывает на слабое связывание в сравнении с 10-9 М (или 1 нмоль/л).

Термины моноклональное антитело или композиция моноклональных антител в данном документе относятся к получению молекул антител с одной молекулярной композицией. Композиция моноклональных антител имеет одинаковую специфичность связывания и аффинность к определенному эпитопу. Этот термин также включает рекомбинантное антитело и рекомбинантное моноклональное ан

- 3 031044 титело в качестве антител, которые были получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными способами, в которых (а) антитела, выделенные из клеток животных или гибридом, получаются при помощи слияния клеток животных, секретирующих антитела, и сливающихся клеток, (b) антитела, выделенные из клеток организма, трансформируются для экспрессирования антител, образуя, например, трансфектому, (c) антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки рекомбинантных антител человека или других видов, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина с другими последовательностями ДНК. В настоящем документе термин выделенное антитело предназначен для обозначения антитела, которое, по существу, не содержит других антител, которые имеют другую антигенную специфичность. Выделенное антитело, которое специфично связывается с эпитопом, изоформой или вариантом человеческого ОМ, тем не менее, может быть способно к перекрестной реактивности с другими родственными антигенами, например других видов (например, ОМ гомологичных видов). Кроме того, выделенное антитело может быть практически свободным от постороннего клеточного материала и(или) химических веществ. В одном варианте осуществления комбинация выделенных моноклональных антител, имеющих различную специфичность, имеет четко определенный состав.

В настоящем документе словосочетания специфическое связывание, иммуноспецифическое связывание и связывается иммуноспецифично относятся к связыванию антитела с предопределенным антигеном. Как правило, связывание антитела характеризуется константой диссоциации (K_D) 10^-7 М или менее. Связывание с предопределенным антигеном происходит при K_D, в два раза меньшей, чем K_D связывания с неспецифичным антигеном (например, BSA, казеин или любой другой полипептид), отличным от предопределенного антигена. Фразы антитело распознало антиген и антитело специфично к антигену в настоящем документе взаимозаменяемы с термином антитело, которое специфически связывается с антигеном. В настоящем документе высокоспецифическое связывание означает, что относительная K_D антитела при связывании с эпитопом, который является его специфической мишенью, по меньшей мере в 10 раз меньше, чем K_D при связывании этого антитела с другими лигандами.

В настоящем документе тип относится к классу антитела (например, IgA, IgE, IgM или IgG), который кодируется генами константного участка тяжелой цепи. Некоторые классы антител дополнительно охватывают подклассы, или изотипы, которые также кодируются константными участками тяжелой цепи (например, IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4). Антитела могут быть дополнительно соединены с олигосахаридами, связанными с белком при помощи специфических остатков в доменах константного участка, что дополнительно усиливает биологические функции антитела. Например, у человека изотипы антител IgGl, IgG3 и в меньшей степени IgG2 проявляют такие же эффекторные функции, как и мышиные антитела IgG2a.

Под эффекторными функциями или положительным эффектором подразумевается, что антитело содержит домены, которые отличаются от доменов для специфического связывания антигена и способны взаимодействовать с рецепторами или другими компонентами крови, такими как комплемент, что приводит, например, к рекрутингу макрофагов и событиям, приводящим к разрушению клеток, связанных с антигенсвязывающими доменами антитела. Антитела имеют некоторые эффекторные функции, обусловленные связыванием с эффекторными молекулами. Например, связывание C1-компонента комплемента с антителом активирует систему комплемента. Активация комплемента важна для опсонизации и лизиса клеточных патогенов. Активация комплемента стимулирует воспалительный ответ и может также участвовать в аутоиммунной гиперчувствительности. Кроме того, антитела связываются с клетками при помощи Fc-участка, который содержит Fc рецепторный участок на Fc-участке антитела, связывающегося с Fc-рецептором (FcR) на клетке. Существует множество Fc-рецепторов, которые специфичны для различных классов антител, включая IgG (гамма-рецепторы), IgE (эта-рецепторы), IgA (альфарецепторы) и IgM (мю-рецепторы). Связывание антитела с Fc-рецепторами на поверхностях клеток запускает множество важных и разнообразных биологических ответов, включающих захват и разрушение покрытых антителами частиц, выведение иммунных комплексов, лизис покрытых антителами клетокмишеней при помощи клеток-киллеров (называемый опосредованной антителами клеточной цитотоксичностью, или ADCC), высвобождение медиаторов воспаления, плацентарный перенос и контроль за продукцией иммуноглобулинов.

Термин полипептид означает молекулу, которая содержит аминокислотные остатки, связанные пептидной связью с образованием полипептида. Небольшие полипептиды, состоящие из менее чем 50 аминокислот, могут быть отнесены к пептидам. Полипептиды могут быть также названы белками.

Общее описание.

Настоящее изобретение предусматривает выделенные Mab, способные к связыванию и нейтрализации биологической активности ОМ-белков и продуктов расщепления. В частности, ОМ-связывающие mAb настоящего изобретения способны блокировать связывание ОМ с gp130 или предотвращать рекрутинг LIFRa или OSMRb, вызванный связыванием ОМ с gp130. В ином случае ОМ-связывающее mAb настоящего изобретения способно блокировать вызванное ОМ сигнальное действие рецептора gp130.

Сообщалось, что фосфорилирование STAT3 приводит к гиперпродукции коллагена фибробластами в различных патологических условиях (Lim et al., Oncogene 23(39):5416-25, 2006; Huang et al., J Cell Bio

- 4 031044 chem 81(1): 102-13, 2001). Эти свойства показывают возможное терапевтическое значение этих антител при РА, ОА и при фиброзах, таких как идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) и диабетическая нефропатия (ДН).

Продукт человеческого гена ОМ, ОМ (образец NCBI № NP065391) является препрополипептидом с длиной 252 аминокислот (SEQ ID NO: 11), имеет сигнальный пептид длиной 25 аминокислот и участок протеолитического расщепления между остатками 234 и 235. Он является секретируемым белком, имеющим пять остатков цистеина, которые образуют две внутренние дисульфидные связи между остатками аминокислот 31-152 и 74-192 (Kallestad J.C., et al., J Biol. Chem. 1991 May 15; 266 (14): 8940-5). Имеются два возможных N-связанных участка гликозилирования у остатков 100 и 217, и при продукции в эукариотических клетках данный белок гликозилируется. Человеческий OM содержит свободную сульфгидрильную группу у остатка 105.

Последовательность белка ОМ макак отсутствует в открытом доступе, хотя существует автоматически вычисленная запись 1867 пар нуклеотидных оснований мРНК (NCBI № ХМ_001110148), полученная из аннотированной геномной последовательности (NW_001095169). Для получения последовательности ОМ макак РНК была выделена из мононуклеарных клеток периферической крови макак, и затем ген был амплифицирован из кДНК при помощи ПЦР в реальном времени и секвенирован. Предсказанная трансляция клонированной последовательности (SEQ ID NO: 12) была на 99,6% идентичной предсказанной последовательности Масаса mullata (резус), на 92% идентичной последовательности белка ОМ человека и на 41% идентичной последовательности белка ОМ мыши, как было описано заявителем в одной из заявок, находящихся одновременно на рассмотрении патентного ведомства США (сер. № 12/648430).

Более того, настоящее изобретение направлено на идентификацию полученных у человека ОМсвязывающих Mab, способных ингибировать последующие звенья сигнальных каскадов биологической активности, приводящей к появлению сигналов при связывании ОМ с gp130, и где Mab обнаруживают способность к восстановлению пролиферации клеток в присутствии ОМ, ингибированию вызванной ОМ деградации хондроцитов во внутрисуставном матриксе тканевого эксплантата, эффективной нейтрализации ОМ-зависимого фосфорилирования STAT3 в фибробластах легких человека и предотвращению ОМиндуцированного высвобождения цитокинов.

1. Состав антитела настоящего изобретения.

ОМ-нейтрализующее антитело настоящего изобретения является антителом, которое подавляет, блокирует или противодействует по меньшей мере одному виду активности ОМ или связыванию ОМ с рецептором in vitro, in situ и/или in vivo, и не способствует, не стимулирует, не индуцирует или не увеличивает активность ОМ или его связывание с лигандом, а также не является антителом, которое при своем связывании имитирует эффекты последующих звеньев сигнальных каскадов, вызванных ОМобусловленным лигатированием ОМ-рецепторов, в частности взаимодействие gp130 с ОМ, заключающееся в передаче сигнала в клетке организма. Подходящее ОМ-нейтрализующее антитело, определенная часть или вариант могут также в необязательном порядке влиять по меньшей мере на один вид активности или функцию ОМ, которые неограниченно включают синтез РНК, ДНК или белка; высвобождение белка; активацию, пролиферацию или дифференцировку клетки; секрецию антитела; передачу сигналов рецептором ОМ; расщепление ОМ; связывание ОМ, индукцию, синтез или секрецию ОМ или gp130.

Настоящее изобретение основывается на открытии противочеловеческих моноклональных антител к ОМ, способных подавлять сигнальное действие gp130 после связывания с ОМ или ОМиндуцированного рекрутинга LIFR. Для связывания ОМ были выбраны связывающие домены антитела в виде Fab-библиотеки, которые отображаются в виде частиц нитевидного фага, связанных с оболочечным белком pIX (см. WO 29085462A1 и дальнейшее описание ниже). Для распознавания этих Fab-фрагментов был использован сравнительный анализ при помощи gp130 таким образом, чтобы при их связывании с ОМ происходило предотвращение связывания ОМ с gp130. В ином случае Fab-фрагменты должны были предотвращать рекрутинг LIFR, вызванный связыванием gp130 с ОМ. Клеточный анализ (А375, клетки меланомы человека) был использован для идентификации некоторых подходящих антител, способных к ингибированию gp130-обусловленной активации pSTAT3 в ОМ-экспрессирующих клетках организма.

ОМ-связывающие антитела, описанные в настоящем документе, распознают по меньшей мере две различных области в активной форме человеческого белка ОМ, что указывает на дополнительное открытие множественных участков ОМ, которые подходят для направленного воздействия антител или других соединений со схожими блокирующими функциями. Таким образом, экспрессия и очистка связывающих доменов антител в настоящем документе сводится к аминокислотной последовательности, которая является инструментом, который может обеспечить возможность выбора новых молекул, проявляющих ОМнейтрализующую активность.

В одном варианте осуществления противочеловеческое OM-антитело содержит связывающий участок, имеющий вариабельный участок легкой цепи (VL) или вариабельный участок тяжелой цепи (VH), который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 49-55, и это антитело или его связывающая часть иммуноспецифически связывает ОМ. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, который содержит тяжелую цепь, содержащую в своей антигенсвязывающей части SEQ ID NO: 54 или 55, антитело связывается с белком ОМ и помимо этого имеет специфические

- 5 031044 функциональные свойства антитела изобретения, такие как:

1) связывание человеческий ОМ с K_D менее 100 пмоль/л,

2) связывание ОМ макак с K_D менее 500 пмоль/л,

3) способность восстанавливать пролиферацию клеток A375-S2 в присутствии 2 нг/мл человеческого ОМ на 90% от уровня, который наблюдается при отсутствии ОМ,

4) способность восстанавливать пролиферацию клеток A375-S2 в присутствии 2 нг/мл ОМ макак на 90% от уровня, который наблюдается при отсутствии ОМ,

5) ингибирование ОМ-индуцированной деградации хондроцитов во внутрисуставном матриксе тканевых эксплантатов,

6) эффективная нейтрализация ОМ-зависимого фосфорилирования STAT3 в фибробластах легких нормального человека (NHLF) или

7) блокирование высвобождения цитокинов после системной проверки иммунности к ОМ у мышей.

В другом аспекте настоящего изобретения структурные особенности антител, проявляющих некоторые или все виды вышеперечисленной биологической активности, в частности Mab, обозначенных как связывающие домены М55 и М71, используются для создания родственных по структуре человеческих анти-ОМ антител, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител настоящего изобретения, такое как связывание с ОМ. Более конкретно, один или более участок CDR в М55 и М71 (такой как специфические остатки в SEQ ID NO: 1 и 8) может быть рекомбинирован с известными каркасными участками человека и такими CDR, как SEQ ID NO: 13-28, 30-46, для создания дополнительных рекомбинантных генно-инженерных человеческих анти-ОМ антител настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления антитела настоящего изобретения имеют последовательности, включающие FR1, 2 и/или 3; IGVH1-69 (SEQ ID NO: 1) или IGVH5-51 (SEQ ID NO: 3), причем один или более остаток CDR выбирается из группы, включающей SEQ ID NO: 13-22, которые находятся в CDR, расположенном в SEQ ID NO: 1 или 3, причем способность антитела к связыванию ОМ сохраняется (например, за счет консервативных замен). Таким образом, в другом варианте осуществления генноинженерное антитело может содержать один или более CDR, который, например, может быть на 90, 95, 98 или 99,5% идентичным CDR, перечисленным в SEQ ID NO: 13-22, или вариантам L-CDR3, приведенным в SEQ ID NO: 29 или 47.

В дополнение к простому связыванию с ОМ генно-инженерные антитела, такие как описанные выше антитела, могут быть выбраны с точки зрения сохранения функциональных свойств антител настоящего изобретения, таких как способность подавлять связывание белка ОМ или его продуктов расщепления с GP130-положительными клетками, и это связывание может привести к подавлению пролиферации GP130-положительных клеток in vivo.

Человеческие моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть исследованы на связывание с ОМ, например, при помощи стандартного твердофазного иммуноферментного анализа.

2. Синтез ОМ-нейтрализующих антител.

ОМ-нейтрализующие антитела, демонстрирующие желаемый спектр биологической активности, примерами чего являются антитела М5, М6, М9, М10, М42, М45, М53, М54, М55, М62, М63, М65, М66, М67, М68, М69, М71 и М83, содержащие последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, которые указаны в библиотеке каркасных участков SEQ ID NO: 1, 3, 8, а также имеющие CDR с SEQ ID NO: 13-28, 30-46, могут быть синтезированы различными способами.

В другом варианте осуществления эпитоп, связываемый антителами настоящего изобретения и содержащий всего лишь пять из всех остатков 51-227 с SEQ ID NO: 11, или нуклеиновая кислота, кодирующая данную последовательность, могут использоваться для иммунизации испытуемого для продуцирования антител настоящего изобретения непосредственно в организме с целью лечения, профилактики или облегчения течения заболевания или симптомов заболевания, которые связаны с продукцией ОМ.

В одном варианте осуществления и в качестве примера в настоящем документе человеческое антитело выбирается из библиотеки фагов, где эти фаги содержат гены человеческого иммуноглобулина, и библиотека экспрессирует связывающие домены антитела, например, в виде одноцепочечных антител (scFv), Fab-фрагментов или некоторых других конструкций, содержащих парные и непарные вариабельные участки антител (Vaughan et lo al., Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al., PITAS (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Человеческие моноклональные антитела настоящего изобретения могут также получаться при помощи способов фагового дисплея для скрининга библиотек генов человеческих иммуноглобулинов. В данной области техники признаны данные способы фагового дисплея для изоляции человеческих антител (см., например: патенты США №№ 5223409; 5403484; и 5571698 Ладнер и соавт.; патенты США №№ 5427908 и 5580717 Довер и соавт.; патенты США №№ 5969108 и 6172197 МкКафферти и соавт. и патенты США №№ 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 Гриффите и соавт.

Клоны фагов выбираются и идентифицируются при помощи многоэтапной процедуры, которая известна как биопэннинг. Биопэннинг осуществляют посредством инкубирования фага, мишенью которого являются варианты белковых лигандов (библиотеки генов фагового дисплея), удаления несвязанного фага при помощи промывания и специфического элюирования связанного фага. Элюированный фаг не

- 6 031044 обязательно может амплифицироваться перед прохождениями дополнительных циклов связывания и необязательной амплификации, которые пополняют пул специфических последовательностей в пользу клонов этих фагов, которые несут фрагменты антител, демонстрирующих наилучшее связывание с мишенью. После нескольких циклов характеризуются отдельные клоны фагов, и пептидные последовательности, отображенные при помощи клонов, предопределяются посредством секвенирования соответствующей ДНК вириона фага.

Библиотека Fab-фрагментов фага-pIX.

В конкретном варианте осуществления способа фагового дисплея синтетические Fab-библиотеки отображаются на фаговом оболочечном белке pIX, описанном Shi et al., J Mol Biol 397:385-396, 2010; а также в международной заявке WO 29085462 A1 и патенте США сер. № 12/546850, что будет подробно рассматриваться далее, и используются для выбора связующего вещества из иммунного репертуара последовательностей человеческого IgG, которые получены из зародышевых генов человека. Библиотеки сконструированы из четырех доменов VL и трех доменов VH, кодирующихся известными зародышевыми последовательностями IGV и IGJ, выбранными на основании частоты, с которой эти последовательности обнаруживаются в человеческих антителах, выделенных из естественных источников. По номенклатуре IMGT Vh является IGHV1-69 (SEQ ID NO: 1), IGHV3-23 (SEQ ID NO: 2) или IGHV5-51 (SEQ ID NO: 3). Разнообразие конструкций V_H приводит к образованию тяжелых цепей с последовательностью вариабельной длины в участке CDR3, многообразие положений которых ограничивается H-CDR1 и H-CDR2, длина которых остается постоянной. Каркасный участок четыре 0T-FR4) остается постоянным у всех представителей библиотеки (SEQ ID NO: 4).

VH169, IGHV1-69*01 Длина=98, CDR1=31-35, CDR2=50-66

QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYXiISWVRQA PGQGLEWMGX₂

IX3X4X5X6GTANY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR (SEQ ID

NO: 1)

Причем в 169 библиотеке X₁ является А или G, Х₂ является G или W, Х₃ может быть I или S, X₄ может быть Р или А, Х₅ может быть I или Y, и Х₆ может быть F или N.

VH323, IGHV3-23*01 Длина=98, CDR1=31-35, CDR2=50-66

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS XiYX₂MX₃WVRQA PGKGLEWVSX₄

IX₅X₆X₇GX₈STYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAK (SEQ ID

NO: 2)

Причем в 323 библиотеке X₁ может быть S, D, N или Т; X₂ может быть A, G или W; Х₃ может быть S или Н; Х₄ может быть V, А, N или G; X₅ может быть S, N, K или W; Х₆ может быть Y, S, G или Q; Х₇ может быть S или D; и Х8 может быть S или G.

VH551, IGHV5-51*03 Длина=98, CDR1=31-35, CDR2=50-66

EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT XiYWIX₂WVRQM PGKGLEWMGX3

IX₄PX₅DSX₆TRY SPSFQGQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCAR (SEQ ID

NO: 3)

Причем в 551 библиотеке X1 может быть S, N или Т; X2 может быть S или G; Х3 может быть I или R; Х₄ может быть D или Y; Х₅ может быть G или S; Х₆ может быть D или Y.

Участки FR4 или JH, содержащие 11 остатков, WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 4), были присоединены к вышеупомянутым последовательностям для образования целого вариабельного участка тяжелой цепи.

Положения H-CDR1 и H-CDR2, которые были использованы в качестве мишени для разнообразия, были предопределены 1) разнообразием в зародышевых генах; и 2) частотой, с которой они обнаруживаются с антигеном в комплексах антитело-антиген с известной структурой (Almagro J Mol. Recognit.17:132-143, 2004). Разнообразие аминокислот в выбранных положениях предопределяется 1) использованием зародышевой линии; 2) аминокислотами, которые наиболее часто обнаруживаются в реаранжированных V-генах человека; 3) аминокислоты, которые предположительно являются результатами соматических мутаций в одном основании; и 4) биохимическими и биофизическими свойствами аминокислот, которые участвуют в распознавании антигена.

Библиотека включает разнообразие CDR3 в VH (H3), имитирующее иммунный репертуар человеческих антител (Shi et al., 2010 supra) показанным ниже способом (формула I), где итоговая длина составляет от 7 до 14 остатков. Среди CDR3 из 5000 человеческих вариабельных участков во всех положениях часто используются аминокислоты глицин (G) и аланин (А). Кроме того, аспарагиновая кислота (D) часто используется в положении 95, и тирозин (Y) зачастую закодирован в положениях, предшествующих каноническому участку J-сегмента. Аминокислоты фенилаланин (F), аспарагиновая кислота (D) и тирозин (Y) предопределены в положениях 99-101, и в этих же положениях используются в IgG. Поскольку эти положения часто служат для структурной поддержки H-CDR3 и менее открыты для антигена и/или на поверхности IgG, аминокислоты фенилаланин с лейцином (в соотношении 50/50) фиксируются в положении 99, аспарагиновая кислота - в положении 100, а тирозин - в положении 101. Таким образом, последовательность формулы I вставлена между SEQ ID NO: 1, 2 или 3 и SEQ ID NO: 4 для образования

- 7 031044 целого домена V_H (D)-(N)n(N+0)m(F)DY- (I) где (D) - положения, богатые аспарагиновой кислотой (D) и глицином (G), (N) _n - положения, богатые аланином (А) и глицином (G), n=3-7, (O) _m - положения, богатые аланином (А), глицином (G) и Y (тирозином), m=1-4.

(F) - основное положение фенилаланина (F).

Различные версии библиотек, охватывающих объединения с фиксированными или разнообразными легкими цепями, также были получены из иммунного репертуара человеческой зародышевой линии. В настоящем изобретении четыре библиотеки генов легких цепей VL _каппа (Kawasaki et al., 2001. Eur J Immunol 31: 1017-1028 и Schaeble & Zachau, 1993 Biol. Chem Hoppe Seyler 374: 1001-1022) являются A27 (IGKV3-20*01), B3 (IGKV4-1*01), L6 (IGKV3-11*01) и 012 (IGKV1-39*01), где название гена в круглых скобках было предположено при помощи соответствующего гена IMGT. Fab-фрагменты отображены на pIX за счет экспрессии двухцистронного вектора, в котором домен V_H-CH1 конденсирован с последовательностью оболочечного белка, и V_l-CL каппа или V_l-CL лямбда экспрессируются в виде свободного полипептида, который самостоятельно соединяется с V_H-CH1. Участки CDR подчеркнуты.

Библиотека вариабельных участков легких цепей основывается на зародышевых генах V каппа (Vk) 012; IGKV1-39*O1, IGKV1D-39*O1 Длина=88; CDRl=24-34,

CDR2=50-56

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQ5IS XiX₂X₃NWYQQKP GKAPKLLIYX₄

ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC (SEQ ID NO: 5)

L6, IGKV3-ll*01 Длина=88, CDRl=24-34, CDR2=50-56

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSV XiXzXsEAWYQQKP GQAPRLLIYX4

ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC (SEQ ID NO: 6)

A27, IGKV3-20*01, Длина=89, CDRl=24-35, CDR2=51-57

EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVXi X2X3X4LAWYQQK PGQAPRLLIY

X₅ASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYC (SEQ ID NO: 7)

B3, DPK24, VKIVKlobeck; IGKV4-l*01 Длина=94, CDR1=24-4O,

CDR2=56-62

DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL X1SSNNX2NX3LA WYQQKPGQPP

KLLIYX₄ASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYC (SEQ ID NO:

8)

Разнообразие определенных положений каждого поддерживающего вариабельного участка суммировано ниже в табл. 1, где применяется однобуквенный аминокислотный код, который используется и присутствует в качестве альтернативы для определенных положений, которые показаны на фиг. 1.

Таблица 1

CDR	Положение по Кабату	012 (SEQ ID NO: 5)	L6 (SEQ ID NO: 6)	A27 (SEQ ID NO: 7)	B3 (SEQ ID NO: 8)
1	30	X4 SRNAD	Xi	SRNAD	Xi	SRNTD		L
	30а	-		-	X2	SNR	Xi	YSHFA
	ЗОе	-		-		-
	30f						X2	KTNE
	31	X2 SNKDG	X2	NSKD	X3	SNRADH		Кол-во
	32	X3 YHNDWFSAV	x3	YWDFHSAN	x4	YFHQSEK	X3	YFHNWDA
								S
2	50	X4 FYTNKADG	x4	ADKGYFTN	X5	ADGS	x4	WSRDYA

Домен V_L CDR3 во всех библиотеках содержит семь остатков, причем первые два остатка являются глутамином (Gln, Q), и остаток, соответствующий 95 остатку по Кабату, является пролином (Pro, P). В LCDR3 последовательность соответствует QQX₁X₂X₃X₄PX₅T (SEQ ID NO:9), причем ее изменчивость приведена ниже в таблице, а положения остатков соответствуют нумерации по Кабату.

Таблица 2

Остаток-	Положение CDR3 no Кабату	012	L6	A27	B3
Xi	91	SAYHPD	RYSGF	YSHA	YSHA
X2	92	FIYHNDKGRE	RHNSL	YNDSHIFKG	YNDSHIFKG
Хз	93	STHNDRG	NDKR	SNTDGHR	SNTDGHR
X4	94	TYLVFSRGPI	WA	TYLVFAS	TYLVFAS
X5	96	LWRFYIN	WYFLIR	WYFLIR	WYFLIR

Поскольку длина вариабельной последовательности изменяется от гена к гену, разнообразие поло- 8 031044 жений определенного остатка в гипервариабельной петле или CDR может быть описано следующим образом при помощи нумерации остатков, приведенной в A1-Lazikani В., Lesk A.M., Chothia С., 1997 (Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. J Mol. Biol. 273: 927-948). В этой системе изменения длины гипервариабельных петель определяются посредством обозначения субположений a, b, c и т.д. для данного остатка.

Такой сегмент каркасного участка 4 (FR4), как JK4, FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 10) используется для образования целостного человеческого вариабельного участка легкой цепи.

Во время исходных отборов была продемонстрирована аффинность Fab-фрагментов к отдельным белкам-мишеням, которая составила от 0,2 до 20 нМ.

Способы интегрированного процесса созревания для улучшения параметров связывания включают перестановку экзонов VL или VH в целях разнообразия, или, напротив, направленную или ограниченную модификацию домена VL, которая производится при помощи векторов и праймеров, созданных и используемых для библиотек, как описано в указанной публикации и настоящем документе, и комбинации со способами, которые известны специалистам в данной области техники.

Альтернативные источники ОМ-связывающих доменов иимуноглобулинов.

ОМ-связывающие антитела, имеющие характеристики человеческих Mab, которые были описаны в настоящем документе, могут быть изготовлены, или связывающие фрагменты, полученные из доменов иммуноглобулинов, могут быть сформированы множеством способов, включающих стандартные способы гибридизации соматических клеток (способ гибридомы) по Kohler и Milstein (1975) Nature 256:495. При получении гибридомы мышь или другое подходящее животное, например хомячка или макаку, иммунизируют описанным в настоящем документе способом, чтобы выделить лимфоциты, производящие или способные производить антитела, специфически связывающиеся с белками, используемыми для иммунизации. В ином случае лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты могут быть слиты с клетками миеломы при помощи подходящего фактора, вызывающего слияние клеток, такого как полиэтиленгликоль, для образования клеток гибридомы (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

ОМ-нейтрализующие антитела также необязательно могут быть синтезированы посредством иммунизации трансгенных животных (например, мыши, крысы, хомяка, приматов (за исключением человека) и т. п.), способных к продуцированию иммунологического репертуара человеческих антител, как описывается в настоящем документе и/или известно специалистам в данной области техники. Клетки, продуцирующие человеческие анти-ОМ антитела, могут быть выделены из этих животных и иммунизированы при помощи подходящих способов, таких как способы, описанные в настоящем документе. В другом случае последовательности, кодирующие антитело, можно клонировать, ввести в подходящий вектор и использовать для трансфекции клетки-хозяина, чтобы экспрессировать и выделить антитела описанными в настоящем документе способами и другими способами, известными специалистам в данной области.

Использование трансгенных мышей, являющихся носителями локуса человеческого иммуноглобулина (Ig) в конфигурации своей зародышевой линии, обеспечивает изоляцию высокоаффинных полностью человеческих моноклональных антител, направленных против различных мишеней, включая собст венные антигены человека, к которым нормальная иммунная система человека толерантна (Lonberg, N. et al., Патент США US5569825, Патент

США US6300129 и 1994, Nature 368:856-9; Green, L. et al., 1994,

Nature Genet. 7:13-21; Green, L. & Jakobovits, 1998, Exp. Med.

188:483-95; Lonberg, N and Huszar, D., 1995, Int. Rev. Immunol.

13:65-93;

Kucherlapati, et al.

US6713610; Bruggemann

M. et al., 1991

Eur. J.

Immunol. 21:13231326; Fishwild, D. et al.

1996, Nat.

Biotechnol.

Mendez

M. et al.

1997

Nat. Genet

15:146-156;

Green, L.

1999

J.

Immunol. Methods

231:11-23,Bruggemann

Yang, X. et

M. and Taussig al.

1999

J.

Cancer Res. 59:1236-1243;

Curr. Opin. Biotechnol.

1997; Tomizuka et al.

международная заявка

WO02043478)

Эндогенный локус иммуноглобулина у таких мышей можно разрушить или подвергнуть делеции, чтобы таким образом лишить животное способности образовывать антитела, кодируемые эндогенными генами. Кроме того, компании, такие как Abgenix, Inc. (Фримонт, Калифорния) и Medarex (Сан-Хосе, Калифорния), могут привлекаться к получению человеческих антител, направленных против определенного антигена, при помощи описанной выше технологии.

Подготовка полипептидов для использования в качестве лигандов мишени способом пэннинга и иммуногенных антигенов может проводиться при помощи любого подходящего способа, такого как рекомбинантное получение белка. Лиганд мишени или его фрагмент в виде очищенного белка или белковой смеси, включающей целые клетки, клеточные или тканевые экстракты, или в случае иммунизации

- 9 031044 антиген может быть сформирован de novo в теле животного из нуклеиновых кислот, кодирующих упомянутый антиген или его часть.

Как хорошо известно специалистам, выделенные нуклеиновые кислоты, составляющие предмет настоящего изобретения, могут быть получены с использованием (а) рекомбинантных способов, (b) синтетических способов, (c) способов очистки или их сочетаний. ДНК, кодирующая моноклональные антитела, легко выделяется и секвенируется при помощи способов, известных в данной области техники (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи участков человеческого антитела). При создании гибридом такие клетки могут служить источником такой ДНК. В другом случае, когда используется способ дисплея со слиянием кодирующей последовательности и продукта трансляции (например, библиотеки фагового или рибосомального дисплея), селекция связующего звена и нуклеиновой кислоты упрощена. После селекции участки фага, кодирующие антитело, можно выделить и использовать для синтеза целых антител (в том числе человеческих) или любых других требуемых антигенсвязывающих участков, и экспрессировать в любом желаемом хозяине (в том числе в клетках млекопитающих, клетках насекомых, клетках растений, дрожжах и бактериях).

Человеческие антитела.

Кроме того, изобретение предусматривает человеческие иммуноглобулины (или антитела), которые связывают человеческий ОМ. Эти антитела также можно охарактеризовать как генно-инженерные или адаптированные антитела. Иммуноглобулины имеют вариабельные участки, которые, по существу, происходят из человеческих зародышевых иммуноглобулинов, и включают направленную изменчивость в остатках, которые, как известно, участвуют в распознавании антигена, примером чего могут служить CDR по Кабату или гипервариабельные петли с известной структурой. Константные участки, если они имеются, также, по существу, находятся в человеческом иммуноглобулине. Человеческие антитела имеют K_D для ОМ по меньшей мере около 10^-6 М (1 мкм/л), около 10^-7 М (100 нмоль/л), 10^-9 М (1 нмоль/л) или менее. Для изменения аффинности, которое, например, выражается в улучшении аффинности или уменьшении K_D человеческого антитела с ОМ, могут быть введены заместители в любой из остатков CDR или другие остатки.

Источником продукции человеческих антител, которые связываются с ОМ, предпочтительно являются представленные здесь последовательности, которые содержат вариабельные участки, каркасные участки и/или CDR, обозначенные как SEQ ID NO: 13-55, которые идентифицированы как способные к связыванию человеческого ОМ и перекрестному реагированию с ОМ яванского макака за счет иммунного репертуара полученных у человека Fab-фрагментов, введенных в частицы нитевидного фага.

Замещение любого из CDR в любом каркасном участке вариабельного домена человека скорее всего приведет к сохранению его правильной ориентации в пространстве, если каркасный участок вариабельного домена человека примет конформацию, которая аналогична или схожа с родительским вариабельным каркасным участком, из которого был получен CDR. Вариабельные каркасные участки тяжелой и легкой цепи могут быть объединены в итоговое Mab, которое может быть получено из одинаковых или различных последовательностей человеческого антитела. Последовательности человеческого антитела могут быть последовательностями естественных человеческих антител, могут получаться из зародышевых последовательностей иммуноглобулинов или могут быть консенсусной последовательностью некоторых человеческих антител и/или зародышевых последовательностей.

Подходящие последовательности человеческих антител идентифицируются при помощи компьютерного сравнения аминокислотных последовательностей вариабельных участков мыши с последовательностями известных человеческих антител. Сравнение проводится отдельно для тяжелых и легких цепей, однако его принцип для них одинаков.

Что касается эмпирического способа, то было обнаружено, что он особенно удобен для создания библиотеки вариантов последовательностей, которые могут быть исследованы для обнаружения желаемой активности и аффинности или специфичности связывания. Одним из форматов создания подобной библиотеки вариантов является вектор для фагового дисплея. В ином случае варианты могут быть созданы при помощи альтернативных известных способов рандомизирования и мозаицирования последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей целевые остатки в вариабельном домене.

При необходимости дальнейшей замены может использоваться другой способ предопределения, в котором выбор аминокислотных остатков для замещения может осуществляться с помощью компьютерного моделирования. Широко доступно аппаратное и программное обеспечение компьютера для получения трехмерных изображений молекул иммуноглобулина. В целом, молекулярные модели создаются на основе известных структур цепей иммуноглобулина или его доменов. Аминокислотная последовательность моделируемых цепей сравнивается с цепями или доменами известных трехмерных структур для обнаружения их сходства, и цепи и домены, чья последовательность оказалась наиболее схожей, выбираются в качестве начальной точки для конструирования молекулярной модели. Известные исходные структуры модифицируются с учетом различий между аминокислотами в цепях или доменах моделируемого иммуноглобулина и исходной структурой. Затем модифицированные структуры объединяются в смешанный иммуноглобулин. В итоге модель совершенствуют путем минимизации энергии и убеждают

- 10 031044 ся в том, что все атомы находятся на надлежащем расстоянии друг от друга, и что длины связей и углы находятся в химически приемлемых пределах.

В связи с вырожденностью кода каждую аминокислотную последовательность иммуноглобулина может кодировать множество последовательностей нуклеиновых кислот. Желаемые последовательности нуклеиновых кислот могут создаваться de novo при помощи твердофазного синтеза ДНК или ПЦРмутагенеза полученного ранее варианта желаемого полинуклеотида. Все нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, описанные в данной заявке, специально включены в настоящее изобретение.

Вариабельные сегменты человеческих антител, получаемые в соответствии с настоящим документом, обычно связаны, по меньшей мере, с частью константного участка человеческого иммуноглобулина. В составе антитела будут константные участки и легкой, и тяжелой цепей. Константный участок тяжелой цепи обычно содержит домены СН1, шарнирный, СН2, СН3 и иногда СН4.

Человеческие антитела могут содержать любой тип константных доменов любого класса антител, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого подкласса (изотипа), включая IgG₁, IgG₂, IgG₃ и IgG₄. Когда желательно, чтобы гуманизированное антитело проявляло цитотоксическую активность, константный домен обычно является константным доменом, который фиксирует комплемент и обычно принадлежит к классу IgG1. Когда такая цитотоксическая активность нежелательна, в качестве константного домена можно использовать IgG₂. Гуманизированное антитело может содержать последовательности из более чем одного класса или изотипа антител.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные участки легкой и тяжелой цепей гуманизированного антитела, которые необязательно могут быть связаны с константным участком, помещены в экспрессионные векторы. Легкую и тяжелую цепи можно клонировать в одном или в разных векторах экспрессии. Сегменты ДНК, кодирующие цепи иммуноглобулинов, функционально связаны с контрольными последовательностями в экспрессионных векторах, которые обеспечивают экспрессию полипептидов иммуноглобулина. Такими контролирующими последовательностями являются сигнальная последовательность, промотор, энхансер и терминатор транскрипции (см. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989); WO 90/07861, Co et al., J. Immunol. 148, 1149 (1992), которые включены во всей полноте в настоящий документ посредством ссылки).

3. Способы применения анти-ОМ антител.

Как подробно описывается ниже, настоящее изобретение показывает, что выделенные моноклональные антитела, имеющие вариабельные домены М5, М6, М9, М10, М42, М45, М53, М54, М55, М62, М63, М65, М66, М67, М68, М69, М71 и М83, связываются с перекрывающимися антигенными детерминантами ОМ и проявляют in vitro и/или in vivo активность, связанную с подавлением ОМ. Существенно, что реактивность выбранных MAb включает способность к дозозависимому блокированию взаимодействия ОМ с gp130, уменьшению сигнальной активности ОМ в присутствии gp130, уменьшению стимулируемой ОМ пролиферации клеток А375, предотвращению стимулируемой макрофагами продукции коллагена хондроцитами или уменьшению высвобождения цитокинов под действием ОМ in vivo.

Учитывая свойства моноклональных антител, описанных в настоящем изобретении, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты пригодны для использования в качестве как лечебных, так и профилактических средств для лечения или профилактики ОМ-ассоциированных состояний у людей и животных.

В целом, применение может включать введение терапевтически или профилактически эффективного количества одних или более моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов в соответствии с настоящим изобретением или антител или молекул, которые были выбраны из-за сходного спектра связывающей и биологической активности, восприимчивому субъекту или субъекту, находящемуся в состоянии, в котором ОМ вызывает известные патологические последствия, такие как иммунологические расстройства или рост опухоли и метастазов. Вводить можно любую активную форму антитела, в том числе фрагменты Fab и F(ab')2.

Предпочтительно использовать антитела, совместимые с видом реципиента, чтобы действие MAb не было слишком коротким или не индуцировало у субъекта иммунный ответ на MAb. При приеме MAb могут проявлять некоторые второстепенные функции, такие как связывание с Fc-рецепторами субъекта и активация механизмов опосредованной антителами клеточной цитотоксичности для истощения популяции клеток-мишеней при помощи цитолитических или цитотоксических механизмов, или они могут быть генетически сконструированы с учетом ограничения или исключения этих вторичных эффекторных функций с целью сохранения популяции клеток-мишеней.

Лечение индивидуумов может заключаться во введении терапевтически эффективного количества антител настоящего изобретения. Антитела могут быть в составе набора, описанного ниже. Антитела могут применяться или вводиться в виде смеси, например, в равных количествах, или по отдельности в виде определенной последовательности или они могут вводиться все сразу. При обеспечении пациента антителами или их фрагментами, способными связывать ОМ, или антителами, способными защищать реципиента от ОМ, дозировка вводимого агента может варьироваться в зависимости от таких факторов, как возраст пациента, вес, рост, пол, общее медицинское состояние, медицинский анамнез и т.д.

При подобном подходе другим терапевтическим применением моноклональных антител настояще

- 11 031044 го изобретения является активная иммунизация пациента при помощи антиидиотипического антитела, индуцированного против одного из настоящих моноклональных антител. Иммунизация антиидиотипическими антителами, которые имитируют структуру эпитопа, позволяет вызвать ответную реакцию против ОМ (Linthicum D.S. и Farid N.R., Anti-idiotypes, Receptors, and Molecular Mimicry (1988), с. 1-5 и 285-300).

Более того, активную иммунизацию можно индуцировать, включив в состав вакцины один и более антигенных и(или) иммуногенных эпитопов. Вакцинацию в целях профилактики или терапии можно проводить орально или парентерально в количестве, достаточном для генерации реципиентом защитных антител к этим биологически активным участкам. Хозяина можно активно иммунизировать антигенным/иммуногенным пептидом в чистом виде, фрагментом этого пептида или модифицированной формой пептида. К N- или C-концу оригинального пептида или его части можно добавить одну и более аминокислот, отсутствующих в оригинальной последовательности белка. Такие дополнительные аминокислоты обычно включают для обеспечения взаимодействия пептида с другим пептидом, с белком-носителем или с подложкой. Аминокислоты, которые могут использоваться в этих целях, включают тирозин, лизин, глютаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, цистеин и их производные. В альтернативных способах модификации белков могут использоваться, например, NH^-ацетилирование или COOH-концевое аминирование для обеспечения дополнительных средств для объединения или конденсации пептида с другим белком, пептидной молекулой или подложкой.

Антитела, способные защищать от нежелательной биологической активности ОМ, предназначены для их предоставления реципиентам в количествах, достаточных для эффективного подавления, разрешения или смягчения симптомов или патологий, связанных с ОМ. Количество называется достаточным или терапевтически эффективным количеством для эффективного уменьшения симптомов, если дозировка, пути введения и т.д. агента достаточны для его влияния в виде такого ответа. Реакции в ответ на введение антитела можно измерить, анализируя ткани, органы или клетки субъекта способами визуализации или получая образцы тканей и изучая их ex vivo. Вещество считается физиологически значимым, если его присутствие вызывает поддающиеся обнаружению изменения физиологии реципиента.

Терапевтические применения.

ОМ-нейтрализующие антитела настоящего изобретения, антигенсвязывающие фрагменты или их специфические варианты могут использоваться для вызова эффектов в клетке, ткани, органе или животном (включая млекопитающих и людей) для диагностики, наблюдения, модулирования, лечения, облегчения или предотвращения заболевания, уменьшения симптомов, состояний, опосредованных, вызванных или модулируемых ОМ или клетками, экспрессирующими ОМ. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ модулирования или лечения по меньшей мере одного заболевания, связанного с ОМ, клетки, ткани, органа, животного или пациента известными в данной области техники способами или способами, которые описаны в настоящем документе, при помощи по меньшей мере одного антитела к ОМ настоящего изобретения.

Известно, что ген ОМ активируется при различных патологических состояниях, которые включают воспаление, и играет различные биологические роли в процессах, включающих формирование кости, деградацию хряща, поглощение холестерина, боль и воспаление. Конкретные показания обсуждаются ниже.

Показания.

Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что ОМ обуславливает деструкцию хряща, и было показано, что ОМ вызывает деградацию хондроцитов во внутрисуставном матриксе тканевых эксплантатов. ОМ также способствует высвобождению цитокинов, таких как ФНО-a, которые способны стимулировать выработку коллагена в хряще, как показано Т. Cawston et al. (1998, Arthritis and Rheumatism, 41(10) 1760-1771), и в настоящее время такое антитело, как, например, связывающие домены М71, способно блокировать систему высвобождения цитокинов. Антитела настоящего изобретения М55, М64, М69 и М71 в системе, в которой проводится ко-культивирование микрофагов и хондроцитов, демонстрируют способность к повышению синтеза протеогликанов, который превышает уровень, наблюдающийся при отсутствии ОМ-специфичного антитела.

Авторы настоящего изобретения далее показали, что введение нейтрализующего анти-ОМ антитела настоящего изобретения может подавлять вызванное ОМ высвобождение таких цитокинов и хемокинов in vivo, как ИЛ-6, IP-10 и KC. IP-10, интерферон-гамма индуцируемый протеин массой 10 кДа, или малый индуцируемый цитокин В10, является белком, который у человека кодируется геном CXCL10 (С-ХС мотив хемокина 10 (CXCL10). CXCL10 был связан с некоторыми биологическими ролями, такими как хемоаттракция моноцитов/макрофагов, Т-клеток, НК-клеток и дендритных клеток, и стимуляция адгедии Т-клеток к эндотелию. KC, теперь известный как лиганд 1 (CXCL1) хемокина с мотивом С-Х-С, является малым цитокином, принадлежащим к семейству хемокина СХС, который ранее назывался GRO1онкогеном, GROa, нейтрофилактивирующим протеином 3 (NAP-3) и стимулирующим активатором роста меланомы альфа (MSGA-a). У людей этот белок кодируется геном CXCL1. CXCL1 экспрессируется макрофагами, нейтрофилами и эпителиальными клетками, и он обладает хемоаттрактантной активностью для нейтрофилов.

- 12 031044

Поэтому в соответствии с настоящим изобретением в данном документе предлагается использование антитела или фрагмента антитела, выбранного из группы М5, М6, М9, М10, М42, М45, М53, М54, М55, М62, М63, М65, М66, М67, М68, М69, М71 и М83, для производства лекарственного препарата для лечения или профилактики заболеваний суставов, связанных с деградацией протеогликанов, таких как остеоартрит, воспалительная артропатия или воспалительные расстройства. Конкретным использованием антагониста OM является производство лекарственного препарата, который предотвращает или уменьшает синтез коллагена в хряще. Изобретение далее предполагает способ лечения или профилактики воспалительной артропатии или воспалительного расстройства, заключающийся во введении эффективного количества антител, которые блокируют связывание ОМ с gp130 у пациентов, которые страдают данными расстройствами.

Антитело настоящего изобретения может использоваться при подготовке к лечению воспалительных процессов, при которых ОМ прямо или косвенно, например посредством высвобождения провоспалительных цитокинов, приводит к патологическим изменениям в тканях или органах, в особенности в коже, легких и суставах. Такие патологии включают остеоартрит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, нейропатическую артропатию, реактивный артрит, артропатию при поражении вращателей плеча, острую ревматическую лихорадку, синдром Рейтера, прогрессирующий системный склероз, первичный билиарный цирроз печени, пемфигоид, некротический васкулит, тяжелую псевдопаралитическую миастению, рассеянный склероз, красную волчанку, полимиозит, саркоидоз, гранулематоз, васкулит, пернициозную анемию, воспалительное нарушение ЦНС, заболевания, обусловленные действием комплекса антиген-антитело, аутоиммунную гемолитическую анемию, тиреоидит Хашимото, болезнь Грейвса, болезнь Рейно, гломерулонефрит, дерматомиозит, хронический активный гепатит, целиакию, аутоиммунные осложнения СПИДа, атрофический гастрит, болезнь Аддисона, эндотоксикоз или септический шок (сепсис), или один или более симптом сепсиса и других видов острого или хронического воспаления. Пациенты, которые, в частности, способны извлечь для себя пользу из данного способа лечения, страдают от инфекций, вызванных Е. coli, Haemophilus influenza В, Neisseria meningitides, стафилококков или пневмококков. Пациенты с риском сепсиса включают пациентов, страдающих от ожогов, ран, почечной или печеночной недостаточности, травм, ожогов, иммунодефицита (ВИЧ), гемопоэтических неоплазий, множественной миеломы, болезни Кастлемена или миксомы сердца.

Другие состояния, связанные с ОМ и поддающиеся лечению или превентивной терапии антителами настоящего изобретения, включают склерозирующие заболевания, такие как легочный фиброз, диабетическая нефропатия, идиопатический легочный фиброз, системная склеродермия и цирроз. Другим показанием к использованию антител настоящего изобретения является лечение или профилактика ноцицептивной боли, затрагивающей нейроны дорсальных корешковых ганглиев.

Введение и дозирование.

Изобретение предусматривает наличие стабильных составов антител, которые нейтрализуют ОМ и предпочтительно являются водными растворами фосфатного буфера или растворами смеси солей, а также консервированными растворами и составами, как и консервированными составами для многоразового использования, которые пригодны для фармацевтического и ветеринарного применения, и содержат по меньшей мере одно ОМ-нейтрализующее антитело в фармацевтически приемлемом составе. Допустимые для целей настоящего изобретения несущие среды и их композиция с возможностью введения других белков человека, например сывороточный альбумин человека, описаны, например, в публикации Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition, Troy D.B. ред., Lipincott Williams and Wilkins, Филадельфия, Пенсильвания, 2006, часть 5, Pharmaceutical Manufacturing на с. 691-1092, особенно см. с. 958-989.

Описанное в настоящем документе ОМ-нейтрализующее антитело в стабильном или консервированном составе или растворе может быть введено пациенту в соответствии с настоящим изобретением при помощи множества путей введения, включая внутривенный (в/в); внутримышечный (в/м); подкожный (п/к); трансдермальный; легочный; чресслизистый; использование состава в имплантате, осмотическом насосе, картридже, микронасосе; или других средствах, которые хорошо известны специалистам в данной области техники.

Например, возможно направленное введение в ту или иную часть тела или полость, такое как внутрисуставное введение, внутрь бронха, внутрибрюшинное, внутрь капсулы, хряща, полости, интрацелиальное, внутрь мозжечка, желудочка мозга, внутрь толстой кишки, шейки, желудка, печени, миокарда, внутрь кости, таза, перикарда, полости живота, плевры, простаты, легких, внутрь прямой кишки, внутрь почки, сетчатки, позвоночника, суставной сумки, грудной клетки, внутрь матки, мочевого пузыря, внутрь поврежденной ткани, вагинально, ректально, за щеку, под язык, интраназально или трансдермально.

В целом, при системном введении антител желательно давать реципиенту дозу антител в диапазоне 1-100, 100-500 нг/кг, 500 нг/кг-1 мкг/кг, 1-100 мкг/кг, 100-500 мкг/кг, 500 мкг/кг-1 мг/кг, 1-50 мг/кг, 50100 мг/кг, 100-500 мг/кг (веса тела реципиента), хотя возможно применение более низких или более высоких доз. Конечно, подходящие дозировки антагониста настоящего изобретения могут варьироваться в зависимости от таких факторов, как заболевание или расстройство, которое подвергается лечению, путь

- 13 031044 введения, возраст и вес индивидуума, который подвергается лечению, и природа антагониста. Без привязки к какой-либо конкретной дозе считается, что при парентеральном введении дневная дозировка составляет от 0,01 до 20 мг/кг антитела (или другой крупной молекулы) настоящего изобретения (обычно присутствует как часть указанной выше фармацевтической композиции), которое подходит для лечения обычного взрослого человека.

Лечить пациента можно однократной дозой или, что предпочтительнее, по схеме с многократным введением препарата, при этом первичный курс лечения может состоять из 1-10 доз, и далее через определенные промежутки времени, так, чтобы иммунный ответ сохранялся или усиливался (например, через 1-4 месяца - вторая серия доз и при необходимости еще через несколько месяцев следующая серия). Примеры допустимых схем лечения включают (i) 0, 1 месяц и 6 месяцев, (ii) 0, 7 дней и 1 месяц, (iii) 0 и 1 месяц, (iv) 0 и 6 месяцев или другие схемы, достаточные для вызова желаемых ответов, при которых ожидается уменьшение симптомов заболевания или уменьшение тяжести заболевания.

Антитела настоящего изобретения могут использоваться по отдельности или в комбинации с иммуносупрессивными агентами, такими как стероиды (преднизолон и т.д.), циклофосфамид, циклоспорин А или аналоги пуринов (например, метотрексат, 6-меркаптопурин и т.п.), или антителами, такими как антитела к антилимфоцитарному антигену, антитела к антилейкоцитарному антигену, антагонисты ФНО, например анти-ФНО антитела или ингибиторы ФНО, например растворимый рецептор ФНО, или такие агенты, как НПВС или другие ингибиторы цитокинов.

Таблица последовательностей

№ ПОСЛ.:	Описание	Последовательность и свойства
1	IGHV1-	69*01	QVQLVQSGAE	VKKPGSSVKV	SCKASGGTFS
	человека	SYXiISWVRQA	PGQGLEWMGX2__	JX3X4X5X6GTANY
			AQKFQGRVTI	TADESTSTAY	MELSSLRSED
			TAVYYCAR
			Где Xi является А или G,	Хг является G
			или W, Хз может быть I или S,X4 может
			быть Р или А,	. Х5 может быть I или Υ, и
			Хб может быть	F или Ν.
2	IGHV3-	23*01	EVQLLESGGG	LVQPGGSLRL	SCAASGFTFS
	человека	XiYX2MX3WVRQA	PGKGLEWVSX4	IX5X6X7GX8STYY
			ADSVKGRFTI	SRDNSKNTLY	LQMNSLRAED
			TAVYYCAK
			Где Xi может	быть S, D,	N или Т; Х2
			может быть А,	. G или W; Хз	может быть S
			или Н; Х4 может быть V, А	, N или G; Х5
			может быть S,	Ν, К или W;	Хб может быть
			Y, S, G или ζ	); Х7 может быть S или D; и
			Х8 может быть	S или G
3	IGHV5-	51*01	EVQLVQSGAE	VKKPGESLKI	SCKGSGYSFT
	человека	XiYWIX2WVRQM	PGKGLEWMGX3	IX4PX5DSX6TRY
			SPSFQGQVTI	SADKSISTAY	LQWSSLKASD
			TAMYYCAR
			Где Xi может	быть S, N или Т; Х2 может
			быть S или G;	Х3 может быть I или R; Х4
			может быть D	или Υ; Х5 может быть G или
			S; Х6 может быть D или Υ
4	JH человека	WGQGTLVTVSS

- 14 031044

5	IGKV1-39*O1 человека (012)	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSI Х4 X2X3LNWYQQKP gkapklliyx4 asslqsgvps RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC Где Xi может быть A, D, N, S или R; X2 может быть D, G, K, N или S; X3 может быть A, D, F, Η, N, S, W, V или Y; X4 может быть A, D, F, G, K, N, T или Y.
6	IGKV3-11 (L6)	EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSV X1X2X3LAWYQQKP gqaprlliyx4 asnratgipa RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC Где Xi может быть A, D, N, R или S; X2 может быть D, К, N или S; X3 может быть A, D, F, Η, N, S, W или Y; X4 может быть A, D, K, G, F, T или N.
7	IGKV3-20 человека (А27)	EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCX1X2X3X4 SVS SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY X5ASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYC Где Xi может быть D, N, S, R или T; X2 может быть N, S или R; X3 может быть A, D, Η, N, S или R; X4 может быть E, F, Η, K, Q, S или Y; X5 может быть A, D, G или S.
8	IGKV4-l*01 человека (ВЗ)	DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL X1SSNNX2NX3LA WYQQKPGQPP KLLIYX4ASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYC Где Xi может быть A, F, H, S или Y; X2 может быть E, К, N или T; Х3 может быть A, D, F, Η, N, S, W или Y; Х4 может быть A, D, S, W или Y.
9	Формула LCDR3	QQX1X2X3X4PX5T Где Xi может быть A, D, F, Η, Р, S или Y; Х2 может быть D, Е, G, Η, I, К, N, R, Т или Y; Х3 может быть D, G, Н, К, N, S, Т или R; Х4 может быть F, I, L, N, R, W или Y, как определено в Таблице 2.
10	JK4	FGQGTKVEIK
11	Последователь ность белка ОМ человека	AAIGSCSKEYRVLLGQLQKQTDLMQDTSRLLDPYIRIQ
GLDVPKLREHCR ERPGAFPSEETLRGLGRRGFLQTLNATLGCVLHRLADL
EQRLPKAQDLER SGLNIEDLEKLQMARPNILGLRNNIYCMAQLLDNSDTA
EPTKAGRGASQP PTPTPASDAFQRKLEGCRFLHGYHRFMHSVGRVFSKWG
ESPNRSRRHSPH QALRKGVRRTRPSRKGKRLMTRGQLPR
12	Белок ОМ яванского макака (Мас ас а fascicularis)	AAMGSCSKEYRMLLGQLQKQTDLMQDTSRLLDPYIRIQ GLDIPKLREHCR ESPGAFPSEETLRGLGRRGFLQTLNATLGRVLHRLADL EQHLPKAQDLER SGLNIEDLEKLQMARPNVLGLRNNIYCMAQLLDNSDMT EPTKAGRGTPQP PTPTPTSDVFQRKLEGCSFLRGYHRFMHSVGRVFSKWG ESPNRSRRHSPH QALRKGVRRTRPSRKGNRLMPRGQLPR
13	Н2 H-CDR1	SYAIS
14	Н14 & Н17 НCDR1	SYWIS
15	Н135 H-CDR1	SYWIG
16	Н2 H-CDR2	GIIРIFGNANYAQKFQG
17	Н14 & Н17 НCDR2	IIYPGDSYTRYSPSFQG
18	Н135 H-CDR2	IIYPGDSDTRYSPSFQG
19	Н2 H-CDR3	YGAKGLLDY

- 15 031044

20	Н14 H-CDR3	GSVFEAYFDY
21	Н17 H-CDR3	VPVSPAYLDY
22	Н135 H-CDR3	GFGASYLDY
23	ВЗ & L2 LCDR1	KS S QSVLYS SNNKNYLA
24	L12 L-CDR1	KS S QSVLS S SNNENWLA
25	Llll L-CDR1	KS S QSVLAS SNNNNFLA
26	ВЗ L-CDR2	WASТRES
27	ВЗ L-CDR3	QQYYSTPL
28	L2 L-CDR3	QQSFSFPI
29	консенсус LCDR3	QQ-(SY)-(FY)-S-(FT)-PLT
30	L171-CDR1	KSSQSVLSS GNNGNYLA
31	L172-CDR1	KSSQSVLSSGSNHNYLA
32	L173-CDR1	KSSQSVLSSRGNNNYLA
33	L174-CDR1	KSSQSVLGSWGNDNYLA
34	L175-CDR1	KSSQSVLYSGGNGNYLA
35	L176-CDR1	KSSQSVLGSWGNGHYLA
36	L177-CDR1	KS S QSVLS SNGNHNYLA
37	L178-CDR1	KSSQSVLSS DGNHNYLA
38	L180-CDR1	KSSQSVLGSSSNINFLA
39	L182-CDR1	KSSQSVLGSGDNRNYLA
40	L184 & L186 L-CDR1	KSSQSVLGSGYNRNYLA
41	L192 L-CDR1	KSSQSVLGSWHNDNYLA
42	L-CDR2	KASTRES
43	L180-CDR2	SASTRES
44	L182-CDR2	NASTRES
45	L175-CDR3	QQYSTTPLT
46	L180-CDR3	QQYFSTPIT
47	Повторно выбранный консенсус LCDR3	QQY-(F,Y)-STP-(L,I)-T
48	H-FR1-CDR1FR2-CDR2-FR3	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWISWVR QMPGKGLEWMGIIYPGDSYTRYS PS FQGQVTISADKSI STAYLQWSSLKASDTAMYYC
49	L173	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLSSRGNNNY LAWYQQKPGQPPKLLIYKASTRESGVPDRFSGSGSGTD FTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPL
50	L178	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLSSDGNHNY LAWYQQKPGQPPKLLIYKASTRESGVPDRFSGSGSGTD FTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPL
51	L180	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLGSSSNINF LAWYQQKPGQPPKLLIYSASTRESGVPDRFSGSGSGTD FTLTISSLQAEDVAVYYCQQYFSTPI
52	L185	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLSSGGNWNY LAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTD FTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPL
53	L186	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLSSGSNRNY LAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTD FTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPL
54	Н14	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWISWVR QMPGKGLEWMGIIYPGDSYTRYS PS FQGQVTISADKSI STAYLQWSSLKASDTAMYYCARGSVFEAYFDY
55	Н17	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWISWVR QMPGKGLEWMGIIYPGDSYTRYS PS FQGQVTISADKSI S TAYLQWS S LKAS DTAMYYCARVPVSPAYLDY
56	AviTag	GLNDIFEAQKIEWHE

Настоящее изобретение далее будет рассмотрено со ссылкой на конкретные, но не лимитирующие примеры.

Пример 1. Реагенты и анализы.

Для выбора и характеристики ОМ-связывающих антител были созданы конструкты из ОМ человека

- 16 031044 и макак, которые позволяют оценить экспрессию в клетке млекопитающего. Человеческий ОМ (NP_065391, кодируемый NM_020530) является предшественником из 252 аминокислот, который процессируется в непроцессированный секретируемый белок из 227 аминокислот (SEQ ID NO: 11), который является пропротеином, который далее процессируется в более активную зрелую форму из аминокислот 1-184. кДНК человеческого ОМ была заказана в OriGene (кат. № SC121421), и открытая рамка считывания человеческого ОМ из клона OriGene была амплифицирована при помощи ПЦР, сигнальный пептид (мышиный IgG1) был введен отдельно с гексагистидиновой меткой для очистки белка, a AviTag (SEQ ID NO: 56) - для направленной обработки белка биотином. Последний реагент был выбран для предотвращения случайного химического биотинилирования остатков лизина, присутствующих в области, в которой ОМ взаимодействует с рецепторами.

ОМ яванских макак был клонирован из РНК мононуклеарных клеток периферической крови макак при помощи первой системы синтеза нитей Superscript III (InVitrogen) для получения кДНК, после чего она была амплифицирована при помощи ПЦР и нетранслируемых областей праймеров, созданных из последовательности человеческого ОМ, как описано в заявке на патент США сер. № 12/648430. Экспрессированный непроцессированный белок приведен в SEQ ID NO: 12 с расщепленной активной формой, представленной 184 остатками 51-227.

Предшественники - зрелые формы ОМ человека и макак были экспрессированы клетками HEK 293 и очищены при помощи стандартных способов. Функциональная активность белков была изучена во время анализов пролиферации клеток A375-S2 и сигнальной активности pSTAT3, причем в качестве контроля использовался полученный из Е. coli имеющийся в продаже человеческий ОМ (R&D Systems, кат. № 295-ОМ).

Mab.

В случае, если использовались контрольные антитела, были использованы человеческие антитела изотипа IgG1, обозначенные как CNTO6234.

Химическое биотинилирование.

Рекомбинантный человеческий ОМ был биотинилирован при помощи эфира Nгидроксисукцинимида (набор для биотинилирования EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit, Pierce, №21435), направленно воздействующего на аминные остатки цитокинов.

Реакция присоединения биотина была оптимизирована для эффективного мечения мишеней одним молем биотина на моль антигена. Последнее минимизирует потерю связывающей и функциональной активности, тем самым обеспечивая почти полное мечение совокупности белков. После завершения реакции белок очищается от несвязанного биотинового реагента и оставшихся уходящих групп при помощи центрифужных колонок Zeba Desalt Spin Column, которые включены в набор для биотинилирования EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit (Pierce). Было восстановлено приблизительно 80% исходного материала. Анализ с 2-п-гидроксифенилазобензойной кислотой (набор Pierce Biotin Quantitation Kit, № 28005) был использован для оценки уровня встраивания биотина, который ориентировочно указывает на один моль биотина на моль человеческого ОМ. Прибор Octet (ForteBIO) был использован для проверки связывания стрептавидина и gp130-Fc (R&D Systems, кат. № 671-GP) с биотинилированным белком. Измерения при помощи прибора Octet показали, что профиль связывания биотинилированного ОМ с gp130, по существу, аналогичен таковому для немеченного исходного материала.

Направленное биотинилирование in vitro.

AviTag из 15 остатков (GLNDIFEAQKIEWHE) (SEQ ID NO: 56) имеет схожую кинетику соединения с биотином с эндогенным BirA и субстратом ВССР (Beckett et. al., 1999, Protein Science). После связывания интересующего нас белка с AviTag, имеющего один акцепторный остаток лизина, он может быть биотинилирован только в одном положении. Рекомбинантный ОМ макак был направленно биотинилирован in vitro при помощи биотин-протеин лигазы и имеющихся в продаже реагентов для определения авидности. Биотинилированный ОМ макак был очищен при помощи моновалентной смолы, аффинной к стрептавидину. Качество полученного белка было оценено при помощи ДСН-ПААГ-электрофореза эксклюзионной ВЭЖХ. Анализ с 2-п-гидроксифенилазобензойной кислотой (набор Pierce Biotin Quantitation Kit, № 28005) был использован для оценки уровня встраивания биотина, который ориентировочно указывает на один моль биотина на моль ОМ макак. Прибор Octet (ForteBIO) был использован для проверки связывания стрептавидина и химеры gp130-Fc с биотинилированным белком. Измерения при помощи прибора Octet показали, что профиль связывания биотинилированного ОМ макак с gp130, по существу, аналогичен таковому для немеченного исходного материала.

Твердофазные иммуноанализы.

Начальный пэннинг фаговых Fab-фрагментов был осуществлен при помощи планшетов для твердофазного ИФА NEUTRA VIDIN™ (Pierce), покрытых 2 мкг/мл биотинилированного ОМ человека или ОМ макак в TBS. После инкубации в течение ночи при 4°C, блокирования и промывания, разведения 1:100 на каждом этапе пэннига были добавлены поликлональные фаговые пулы. Связанные фаги были обнаружены при помощи моноклонального антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена и специфичного к pVIII, который является главным оболочечным белком фага М13 (GE Healthcare, кат. № 279421-01), после чего была добавлена хемилюминесцентная подложка из пероксидазы (Roche, кат. №

- 17 031044

11582950001), и фаги были прочитаны при помощи прибора PerkinElmer.

Первичный поиск отдельных клонов был проведен при помощи секретируемого растворимого FabHis-белка из супернатантов Е. coli. Бактериальные супернатанты, содержащие Fab-His-белок, были использованы для связывания в условиях твердофазного ИФА. Планшеты Black MaxiSorp (Nunc, кат. № 437111) были покрыты 1 мкг/мл овечьих противочеловеческих Fd (CH1) антител (The Binding Site, кат. № PC075) и инкубированы при 4°C в течение ночи. После блокирования и промывания планшетов было добавлено 50 мкл неразведенного бактериального супернатанта (содержащего Fab-His-белок), после чего было продолжено инкубирование в течение 1 ч при комнатной температуре и аккуратном встряхивании. Планшеты были промыты, после чего к связанным Fab-фрагментам было добавлено 20 нМ биотинилированного ОМ человека или макак. После 1 ч при комнатной температуре был добавлен конъюгат стрептавидин-пероксидазы хрена (Invitrogen, кат. № 43-4323), после чего было проведено хемилюминесцентное обнаружение описанным выше способом. Было рассчитано, что проверка первичного связывания при помощи твердофазного ИФА с человеческим ОМ в концентрации 20 нМ позволяет обнаружить клоны с аффинностью в наномолярном диапазоне аффинности.

Сортировка эпитопов.

Сортировка эпитопов является конкурентным анализом, проводимым для группировки MAb на основании связывающих характеристик при помощи моноклональных конвертированных человеческих IgGi и имеющихся в продаже антител МАВ29, которые известны как блокаторы рекрутинга OSMR[^J>/LIFR(/. (R-блокаторы).

В каждую лунку 384-луночного планшета Multi-Array (Meso Scale Discovery (MSD), L25XA-4) было добавлено 2,5 мкг/мл противочеловеческого Fc (Jackson Immuno, 709-005-149) в фосфатно-солевом буфере (PBS) с pH 7,4 (Sigma, P3813). Планшет был инкубирован при 4°C в течение ночи, а затем блокирован 50 мкл блокатора A MSD при комнатной температуре в течение 1 ч. 384-луночный планшет MultiArray был промыт три раза (PBS pH 7,4, 0,05% полисорбат 20 (Scytek, PBT010)), и в каждую лунку было добавлено 1,0 мкг/мл раствора исследуемых mAb с последующим встряхиванием на 6 уровне встряхивателя титровального планшета при комнатной температуре в течение 1 ч. Как и ранее, планшет был промыт три раза.

Параллельно этому 5 мкг/мл раствор конкурирующих mAb и 1 мкг/мл биотинилированного ОМ (R&D Systems, 295-OM-010/CF) были смешаны на отдельном 96-луночном планшете (COSTAR, 3357) в буфере для анализа MSD (1:3 блокирующего буфера с PBS pH 7,4 и 0,05% полисорбатом 20) и встряхивались на 3 уровне встряхивателя титровального планшета при комнатной температуре в течение 1 ч. Прекомплекс конкурирующего антитела и биотинилированного ОМ был добавлен в каждую лунку 384луночного планшета Multi-Array и перемешан (на уровне 6 встряхивателя титровального планшета) при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшет был промыт три раза, и в каждую лунку был добавлен стрептавидин sulfo TAG (MSD, R32Ad-S) и перемешан (на уровне 6 встряхивателя титровального планшета) при комнатной температуре в течение 30 мин. Планшет был промыт три раза, и в каждую лунку был добавлен буфер Т для считывания, разведенный в отношении 1:4 дистиллированной водой (MSD, R92TC-1). Планшет был считан при помощи прибора MSD S6000.

Данные были интерпретированы на основании сигналов, полученных для исследуемых mAb в присутствии биотинилированного ОМ и без какого-либо конкурирующего mAb (максимальный сигнал), вместе с сигналами при самоконкуренции (уменьшение максимального сигнала в 2-4 раза). Конкурирующий анализ эпитопов был завершен, когда значение, полученное в присутствии конкурирующего mAb, было в пределах трех стандартных отклонений от значения, полученного при самоконкурирующем анализе.

Клетки A375.

Клетки А375 (АТСС; CRL-1619) являются клетками человеческого эпителия, полученными из злокачественной меланомы. Клетки A375-S2 (АТСС; CRL-1872, сублиния CRL-1619, чувствительная к ИЛ1) культивируются в готовой питательной среде (DMEM/GlutaMax-I, Gibco) с добавлением 10%-ной фетальной бычьей сыворотки (FBS, Gibco) в колбы с культурой Т-175 (Corning; Кат. № 431080), и пассируются, когда в течение каждых трех-четырех дней происходит приблизительно 80% слияние с соотношением субкультур 1:20.

Анализ пролиферации клеток A375-S2 (включение 5-бромдезоксиуридина).

Уменьшение пролиферации клеток A375-S2 под действием ОМ человека или яванских макак было измерено по включению 5-бромдезоксиуридина при помощи хемилюминесцентного твердофазного ИФА. Онкостатин М снижает пролиферацию в линии клеток меланомы человека A375-S2 (Zarling et al., PNAS 83:9739-9743). Эта клеточная линия была использована для оценки активности антител к онкостатину М на всех стадиях обнаружения антител. Клетки A375-S2 были помещены в колбы с культурой ткани Т-150 (BD Falcon 35-5001) в DMEM (модифицированную по способу Дульбекко среду Игла, Gibco 11995)+10% FBS (Gibco 16140)+1% Pen-Strep (пенициллин/стрептомицин, Gibco 15140) при 37°C в 95% O₂ - 5% CO₂ и разводились при пересеве в соотношении 1:10 два раза в неделю.

Для проведения анализа пролиферации клетки были трипсинизированы (0,25%, Gibco 25200) для их удаления из колб Т150, а затем помещены на планшеты с плотностью 2000 клеток на лунку во внутрен

- 18 031044 ние 48 лунок черных планшетов, обработанных тканевой культурой (BD Falcon 353948), с 200 мкл DMEM/FBS/Pen-Strep. После инкубации в течение ночи при 37°C/95% O₂ - 5% CO₂ среда была удалена и заменена 180 мкл свежей среды. Был подготовлен отдельный планшет, содержащий все исследуемые растворы с десятикратной конечной концентрацией. Из этого планшета 20 мкл было перенесено в соответствующую лунку с клеточной пластинкой для создания надлежащих условий для эксперимента. Каждые экспериментальные условия проверялись на трех экземплярах. В любом эксперименте, в котором оценивается нейтрализация, в клетки добавляются антитело и онкостатин М, после чего они инкубируются вместе по меньшей мере в течение 1 ч. Затем планшеты инкубируются при 37°C/95% О₂ - 5% СО₂ в течение дополнительных 72 ч. В это время проводится хемилюминесцентный анализ пролиферации клеток способом твердофазного ИФА с 5-бромдезоксиуридином (Roche 11669915001). Реагент для мечения 5-бромдезоксиуридина добавляется в культуру на 4 ч. Затем среда удаляется, и в каждую лунку добавляется 100 мкл фиксирующего раствора. После 30 мин при комнатной температуре раствор удаляется, и в каждую лунку добавляется по 100 мкл раствора анти-5-бромдезоксиуридинпероксидазы. После 2 ч при комнатной температуре планшет был промыт PBS-полисорбатом, и в каждую лунку было добавлено по 100 мкл Super Signal Pico (Thermo Scientific 37069). Затем люминесценция была считана при помощи прибора Perkin Elmer Victor3.

Исходные эксперименты были проведены для определения дозозависимого ответа на рекомбинантный онкостатин М человека и яванских макак, который был выделен из клеток СНО, полученных внутрилабораторно, при подавлении пролиферации. ОМ был исследован с начальной концентрацией 100 нг/мл с 1-5 разведениями до конечной концентрации 0,0244 нг/мл. Процентное подавление пролиферации было рассчитано в сравнении с клетками, обработанными растворителем. Результаты этого эксперимента показаны на фиг. 2А. Повышение концентрации онкостатина М человека и макак соответствует уменьшению встраивания 5-бромдезоксиуридина. Антипролиферативная активность онкостатина М человека и яванских макак неотличима друг от друга и основывается на степени антипролиферативной активности и эффекте ЕС₅₀.

На основании данных экспериментов можно сказать, что концентрация 2 нг/мл онкостатина М была использована для оценки и сравнения антител против онкостатина М, поскольку эта концентрация ингибирует пролиферацию приблизительно на 80%, образуя большое окно, в котором можно определять дозозависимый ответ на антитела. Полный диапазон доз антител был оценен в присутствии 2 нг/мл онкостатина М человека или макак. Кроме того, в эксперимент был включен контроль изотипов при использовании более высоких концентраций антител к онкостатину М. Окно анализа было определено по разнице между необработанными контрольными лунками (с максимальной пролиферацией) и лунками, инкубированными с 2 нг/мл одного онкостатина М (с минимальной пролиферацией), и в этом окне определяется процент нейтрализации при любой концентрации.

Анализ сигнальной активности pSTAT3 при помощи A375-S2 Phospho-STAT3Assay.

ОМ ингибирует рост клеток A375-S2 путем связывания с рецептором gp130 на поверхности клеток и индуцирования гетеродимеризации рецептора, что позволяет OSMR[^J> запустить каскад внутриклеточных сигнальных реакций, которые включают активацию (фосфорилирование) сигнальной молекулы STAT3 (Kortylewski et al., Oncogene 18: 3742-3753, 1999). Нарушение сигнальной активности STAT3 прекращает вызванное ОМ подавление роста клеток A375-S2, тем самым демонстрируя, что активация STAT3 является ключевым шагом в сигнальной активности ОМ (Heinrich et al., Biochem. j. 374: 1-20, 2003). Было показано, что фосфорилирование STAT3 в клетках A375-S2 зависит от концентрации ОМ, и при помощи имеющихся в продаже наборов возможно его измерить в стимулированных клетках. Нейтрализация ОМ-индуцированного фосфорилирования STAT3 в клетках A375-S2 была выбрана в качестве главного анализа при отборе кандидатов для Mab.

Для нейтрализации антител при ОМ-индуцированном фосфорилировании STAT3 клетки A375-S2 были посеяны в 96-луночные планшеты с тканевой культурой (Corning; кат. № 3596) в количестве 25000 клеток на лунку в 200 мкл готовой питательной среды и инкубированы в течение 24 ч. Клетки были обработаны раствором, содержащим 5 нг/мл человеческого ОМ (рекомбинантного OSMN1-1, полученного из клеток млекопитающих), который был предварительно инкубирован в течение 3 ч при комнатной температуре с серийно разведенными экспериментальными mAb в соотношении 1:5 с начальной концентрацией 10 мкг/мл. Контроли включали необработанные клетки, стимулированные клетки (5 нг/мл только ОМ) и контрольные mAb изотипа hIgGi. Все обработки проводились в трех экземплярах, если не было указано иное.

Анализ содержания pSTAT3 проводился при помощи набора Phospho-STAT3 Whole-Cell Lysate Kit (MSD; кат. № K150DID-1, серия № K0010570) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, клетки обрабатывались в лунке объемом 200 мкл в течение 10 мин; растворы для обработки удалялись, и при помощи многоканальной пипетки было добавлено 50 мкл буфера для лизиса клеток MSD. Планшет помещался в орбитальный встряхиватель (при 300 об/мин) на 5 мин. После этого 30 мкл каждого лизата переносилось на 96-луночный планшет MSD phospho-STAT3. Планшет герметизировали и помещали в орбитальный встряхиватель (при 300 об/мин) на 1 ч при комнатной температуре, промывался три раза 150 мкл промывочного буфера MSD, и в каждую лунку добавлялось по 25 мкл конъюгата вторичных

- 19 031044 детекторных антител (анти-pSTAT3-Ru(bpy)32+), после чего планшет снова герметизировался и инкубировался на орбитальном встряхивателе (при 300 об/мин) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет предварительно промывался, и в каждую лунку было добавлено по 150 мкл буфера для считывания MSD (раствора трипропиламина). Планшет был считан при помощи прибора MSD SECTOR Imager 6000.

Полные кривые дозы-ответа ЕС₅₀ для встроенных зрелых, родственных и контрольных mAb были получены и изображены как нормализованный процент сигнала pSTAT3.

Измерение аффинности при помощи поверхностного плазмонного резонанса (Biacore).

Связывающая способность была измерена при помощи поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на оптическом биосенсоре Biacore 3000 (Biacore) с использованием конструктов ОМ человека или макак описанным здесь способом. Поверхность биосенсора была подготовлена путем соединения смеси антител анти-IgG Fc (противомышиных (Jackson, кат. № 315-005-046) и противочеловеческих (Jackson, кат. № 109-005-098)) с поверхностью карбоксиметилированного декстрана чипа СМ-5 (Biacore, кат. № BR-1000-14) с использованием инструкций производителя для проведения реакции аминирования. Приблизительно 19000 ЕО (единиц ответа) анти-Ом антител было иммобилизировано на каждой из четырех проточных ячеек. Кинетические эксперименты были проведены при 25°C в подвижном буфере (DPBS (фосфатно-солевой буфер Дульбекко)+0,005% Р20+3 мМ ЭДТА). В подвижном буфере были приготовлены серийные разведения ECD ОМ человека и макак от 100 до 0,412 нМ. Около 200 ЕО mAb было захвачено проточными ячейками 2-4 сенсорного чипа. Проточная ячейка 1 была использована как поверхность сравнения. Захват mAb сопровождался трехминутным введением (фаза ассоциации) антигена со скоростью 50 мкл/мин, после чего в течение 10 мин подавался буфер (фаза диссоциации). Поверхность чипа была регенерирована двумя выбросами в виде 18-секундных введений 100 мМ Н₃РО₄ (Sigma, кат. № 7961) со скоростью 50 мкл/мин.

Собранные данные были обработаны при помощи программного обеспечения BIAevaluation (Biacore, версия 3.2). Во-первых, проводили двойное эталонное вычитание данных, вычитая графики, полученные при инъекции буфера, из эталонных графиков, полученных при инъекциях анализируемых веществ. Кинетический анализ данных был проведен при помощи описанной общей модели связывания в пропорции 1:1. Результат для каждого mAb регистрировали в формате Ka (скорость ассоциации), Kd (скорость диссоциации) и KD (константа сродства).

Пример 2. Выбор ОМ-связывающих и FAB-фрагментов.

Библиотеки Fab-pIX de novo были описаны Shi et al., J Mol Biol 397:385-396, 2010; в международной заявке WO 09085462 A1; патенте США сер. № 12/54 6850 и выше в настоящем документе обозначены как 169, 323 и 551, что соответствует использованным человеческим зародышевым каркасным участкам тяжелых цепей: IGHV1-69 (SEQ ID NO: 1), IGHV3-23 (SEQ ID NO: 2) или IGHV5-51(SEQ ID NO: 3) по номенклатуре IMGT. Библиотека каркасных участков трех тяжелых цепей комбинируется с библиотекой каркасных участков VL _каппа четырех легких цепей: А27 (IGKV3-20*01 (SEQ ID NO: 5)), B3 (IGKV4-l*01 (SEQ ID NO: 6)), L6 (IGKV3-11*01 (SEQ ID NO: 7)) и 012 (IGKV1-39*01 (SEQ ID NO: 8)). В библиотеках Fab-фрагментов V-участки завершаются добавлением J-участка (FR4), содержащего SEQ ID NO: 4 в тяжелых цепях и SEQ ID NO: 10 в легких цепях. Тяжелая цепь CDR3 имеет вариабельную длину в 7-14 остатков. Примеры целых V-участков из каждой библиотеки показаны на фиг. 1, и пронумерованные участки CDR показаны в соответствии с нумерацией по Кабату.

Исходный набор анти-ОМ попаданий в фаговом дисплее был идентифицирован при помощи доступного в продаже агликозилированного человеческого ОМ. Библиотеки фаговых дисплеев Fab-pIX были разделены способом пэннинга с использованием захвата биотинилированного человеческого ОМ (R&D Systems, кат. № 295-ОМ) на парамагнитных гранулах стрептавидина (SA) (Invitrogen, кат. № 112.05D) в соответствии с опубликованным протоколом для отбора фагов (Marks and Bradbury, Antibody Engineering, vol. 248: 161-176, Humana Press, 2004). Вкратце, биотинилированный человеческий ОМ был добавлен к фаговой библиотеке, которая была предварительно абсорбирована на неконъюгированных гранулах, до получения конечной концентрации 100 нМ и инкубирован в течение 1 ч при легком вращении. Блокированные гранулы SA были добавлены и инкубированы в течение 15 мин для захвата биотинилированного ОМ со связанным фагом. Захваченный магнитом комплекс фага/антигена/гранулы был промыт 5 раз 1 мл TBST (буферного раствора Трис и полисорбата 20) и однократно 1 мл TBS. После удаления остатков от промывания TBS был добавлен 1 мл экспоненциально растущих клеток TG1 (Stratagene, кат. № 200123) и инкубирован при 37°C в течение 30 мин без встряхивания. Инфицированные бактерии были нанесены на планшеты с агаром Луриа-Бертани (1% глюкозы/100 мкг/мл карбенициллина) (Teknova, кат. № L5804) и инкубированы в течение ночи при 37°C. Бактериальные газоны были соскоблены, после чего в глицерине была приготовлена чистая культура [15% глицерин/карбенициллин (100 мкг/мл)/2xYT], которая хранилась при -80°C. Для приготовления фагов для второго этапа пэннинга было инокулировано 25 мл 2xYT/карбенициллина (100 мкг/мл) с 25 мкл чистой культуры бактерий в глицерине с последующим выращиванием при 37°C до OD₆₀₀ около 0,5. Хелперный фаг VCSM13 (Stratagene, кат. № 200251) был добавлен в культуру с множественным заражением в соотношении около 10:1,

- 20 031044 и инкубирование проводилось в течение 30 мин при 37°C без встряхивания. Бактерии были отцентрифугированы, и осадок был ресуспендирован в индукционную среду (2xYT/Carb/Kan/изопропилтиогалактозид) и культивирован при 30°C в течение ночи. Фаги были осаждены с 2% полиэтиленгликолем/0,2 5M NaCl (конечная концентрация) и ресуспендированы в 2 мл PBS. После первого этапа пэннинга фаги хранились при 4°C и использовались для проведения второго этапа пэннинга. Параметры пэннинга: этап 1, 100 нМ антигена, 1 ч инкубирования при комнатной температуре, пятикратное промывание TBST с последующим однократным промыванием TBS; этап 2, 10 нМ антигена, 1 ч инкубирования при комнатной температуре, десятикратное промывание TBST/однократное промывание TBS; и этап 3, 1 нМ антигена, 16 ч (в течение ночи) инкубирование при 4°C, десятикратное промывание

TBST/однократное промывание TBS.

Результаты наблюдались при помощи твердофазного ИФА, где Fab-фрагменты захватывались противочеловеческими антителами Fd (CH1), биотинилированный человеческий ОМ был добавлен в концентрации 20 нМ, и связывание ОМ было обнаружено при помощи конъюгата стрептавидинпероксидазы хрена.

Как было отображено на Fab-фрагментах, было идентифицировано 30 уникальных пар тяжелых цепей-легких цепей, и при помощи твердофазного ИФА было показано, что они перекрестно реагируют с ОМ макак. Тяжелые цепи отобразили последовательности из 169 (получена из IGHV1-69) и 551 (получена из IGHV5-51) библиотеки, и они были скомбинированы с вариабельными участками легких цепей, которые отобразили все четыре библиотеки зародышевого происхождения (А27, В3, L6 и 012).

Пример 3. Характеристика ОМ-связывающих МАВ.

Строение ОМ в виде узла из четырех спиралей характеризуется четырьмя a-спиральными сегментами, обозначенными как А, В, С и D, которые связаны относительно неструктурированными петлями. ОМ взаимодействует с gp130 поверхностью, находящейся на спиралях А и С (участок II), которые предопределены для контакта с аминокислотными остатками Q16, Q20, G120, N123, N124 из SEQ ID NO: 1 (Deller et al., структура 8(8): 863-874, 2000; Liu et al., Int. J. Mol. Med. 23: 161-172, 2009). Считается, что поверхность, отвечающая за взаимодействие ОМ с OSMR[^J> и LIFRa (участок III), большей частью определяется остатками, расположенными в спирали D (Deller et al., ibid).

Цель состояла в выборе высокоаффинных связующих веществ для ОМ, которые были бы способны предотвращать вызванную ОМ сигнальную активность gp130, или за счет предотвращения связывания ОМ с gp130 (участок II или В-блокатор), или за счет предотвращения рекрутинга LIFRa или OSMRb, вызванного связыванием ОМ с gp130 (участок III или R-блокатор).

Из 30 изначально отобранных ОМ-связывающих Fab-фрагментов 29 были клонированы в векторы для конверсии в непроцессированные человеческие Mab IgG₁. Характеризующие анализы включали (1) конкурентное связывание для идентификации групп эпитопов, или сортов, (2) измерение аффинности посредством поверхностного плазмонного резонанса (Biacore), и (3) способность блокировать сигнальную активность pSTAT3. Все отборы и анализы проводились с использованием клеток млекопитающих, вырабатывающих (гликозилированные) белки человека и макак, как описано в примере 1.

Результаты.

Данные измерений аффинности для субпопуляции mAb, выбранных на основании их положения относительно контроля МАВ295 (R&D Systems) при анализах связывания pSTAT3 и твердофазном ИФА, показаны в табл. 3.

- 21 031044

Таблица 3

Аффинность выбранной субпопуляции анти-ОМ mAb после первого этапа пэннинга

	Связывание с ОМ человека	Связывание с ОМ макак	Отношение Ко
mAb	ка (1/Мс) 10Л4	kd (1/с) 10л-4	KD (нМ)	ка (1/Мс) 10Л4	kd (1/с) 10л-4	KD(hM)	Макак/ Человек
МАВ295	118,00	21,70	1,85	70,95	141,00	19,75	10,70
М2	54,57	9,03	1,66	50,23	67,40	13,50	8,10
Мб	19,15	1,97	1,03	20,30	2,99	1,48	1,40
М22	10,20	3,57	3,52	9,43	101,00	107,00	30,40
М9	6,63	0,81	1,22	7,31	0,54	0,73	0,60
М21	30,00	12,55	4,17	31,80	14,30	4,50	1,10
М10	6,02	0,63	1,05	5,33	10,05	18,90	18,10
М7	8,24	1,08	1,31	8,49	0,37	0,43	0,30
М3	39,85	1,75	0,44	41,95	1,20	0,29	0,70
М19	7,89	0,26	0,34	7,70	2,43	3,15	9,40
М25	8,19	5,09	6,21	9,45	71,70	75,80	12,20
М24			Слабое			Нет связывания	н/д
М8	4,71	0,33	0,70	4,98	0,31	0,62	0,90
М4			Слабое			Слабое	н/д
М20	16,60	7,43	4,48	15,30	16,20	10,60	2,40
М5	6,59	7,79	11,85	9,22	11,10	12,05	1,00
М17	2,78	0,45	1,61	2,90	0,77	2,64	1,60
МИ	8,64	8,32	9,63	19,65	10,70	5,46	0,60
М27	6,39	34,95	55,50			Слабое	Н/д
М18			Слабое			Нет связывания	Н/д

Результаты сортировки показали, что М5, М6 и М9 конкурируют друг с другом, но не с МАВ295. M10 может конкурировать с МАВ295. В анализе pSTAT3 было показано, что эти четыре mAb могут играть роль функциональных нейтрализаторов сигнальной активности gp130. Таким образом, из этого следует, что М10 является R-блокатором, а М5, М6 и М9 блокируют связывание ОМ с gp130 (В-блокаторы).

Аффинность к мишени с точки зрения терапевтического применения была продиктована необходимостью убедительного конкурирования при взаимодействии ОМ с gp130, измеренная аффинность которого (K_D) составляет около 1 нМ. Поэтому желательно, чтобы аффинность к мишени для ОМ составляла 100 пМ или имела меньшую K_D.

Обнаружено, что нейтрализующие MAb М5, М6 и М9 являются блокаторами взаимодействия ОМ с gp130, a M10 выл выбран в связи с соответствующим созреванием, в ходе которого образуются производные, которые соответствуют требованиям аффинности 100 пМ для кандидата, который может использоваться в лечебных целях. Дополнительным желательным свойством является связывание mAb с ОМ яванского макака с пятикратной аффинностью в сравнении с ОМ человека (KD 500 пМ или менее).

Было обнаружено, что композиции связывающих доменов этих четырех Mab соответствуют четырем уникальным парам тяжелых и легких цепей, обозначенных, как показано в табл. 4.

Таблица 4

mAb	Библиотека НС	Идентификатор тяжелой цепи	Идентификатор легкой цепи
М10	169	Н2	L2
Мб	551	Н14	L12
М9	551	Н17	IGKV4-1 (ВЗ)
М5	551	Н135	L111

Полные последовательности вариабельных участков содержат зародышевые последовательности, используемые для создания фаговых библиотек, которые были описаны выше, следовательно, фиксированные остатки соответствуют немутированным родительским зародышевым остаткам. Таким образом, каждый V-участок состоит из обозначенных CDR1 и CDR2 в поддерживающем участке, обозначенном как SEQ ID NO: 1-3 или 5-8; с последующим CDR3 (табл. 3 и 4) для вариабельного участка легкой цепи соответственно (табл. 5 для LC и табл. 6 для НС) и с последующим J-участком с SEQ ID NO: 4 для тяжелой цепи и SEQ ID NO: 10 для легкой цепи.

- 22 031044

Таблица 5

Идентификатор VH	Каркасный участок (SEQ ID NO:)	H-CDR1	№ ПОСЛ.:	H-CDR2	№ ПОСЛ.:	H-CDR3	№ ПОСЛ.:
Н2	1-69(1)	SYAIS	13	GIIPIFGNANYA QKFQG	16	YGAKGLLDY	19
Н14	5-51 (3)	SYWIS	14	IIYPGDSYTRYS PSFQG	17	GSVFEAYFDY	20
Н17	5-51 (3)	SYWIS	14	IIYPGDSYTRYS PSFQG	17	VPVSPAYLDY	21
Н135	5-51 (3)	SYWIG	15	IIYPGDSDTRYS PSFQG	18	GFGASYLDY	22

Вариабельный участок НС Н2 содержит FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3, полученную из SEQ ID NO: 1, где X₁=A, X₂=G, X₃=I, X₄=P, X₅=I и X₆=F с дополнительной мутацией в H-CDR2. НС из библиотеки 551 (Н14, Н17 и Н135) содержит FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3, полученную из SEQ ID NO: 3, где X1=S, X2=S или G, X₃=I, X₄=Y, X₅=G и X₆=Y или D. Каждый из четырех НС содержал уникальную CDR3 (SEQ ID NO: 19-22).

Таблица 6

Идентификатор VL	Каркасный участок (SEQ ID NO:)	CDR1	№ ПОСЛ.:	CDR2	№ ПОСЛ.:	CDR3	№ПОСЛ:
IGKV4-1 (B3)	B3 (8)	KSSQSVLYSSN NKNYLA	23	WASTRES	26	QQYYSTPL	27
L2	B3 (8)	KSSQSVLYSSN NKNYLA	23	WASTRES	26	QQSFSFPI	28
L12	B3 (8)	KSSQSVLSSSN NENWLA	24	WASTRES	26	QQYYSTPL	27
LI 11	B3 (8)	KSSQSVLASSN NNNFLA	25	WASTRES	26	QQYYSTPL	27

Все вариабельные участки LC выбранных Fab были получены из библиотеки В3 и включают проверенную зародышевую последовательность, обозначенную в базе данных IMGT как IGKV4-1 (В3), которая используется как начальная последовательность для обеспечения разнообразия описанным здесь способом и в соответствии с публикациями. Три из четырех легких цепей имеют различия в CDR1 и содержат идентичный H-CDR2. Консенсусная последовательность для четырех выбранных вариабельных участков легких цепей FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 была получена из SEQ ID NO: 8, где X1 является Y, S или А; X₂ является K, Е или N; Х₃ является Y, W или F; и Х₄ всегда является W.

Были идентифицированы две уникальные последовательности CDR3. L-CDR3 может быть представлен консенсусной последовательностью (SEQ ID NO: 29), обозначенной формулой Q-Q-(S,Y)-(F,Y)S-(F,T)-PLT.

Пример 4. Повторный выбор аффинности.

Четыре пары V-участков, OSMM5, OSMM6, OSMM9 и OSMM10, описанных в примере 3, были повторно выбраны для легкой цепи для улучшения аффинности. Для быстрого и эффективного установления аффинности большого количества антител при первичном отборе был использован процесс внутрилинейного созревания, описанный Shi et al., в J Mol. Biol. 397:385-396, 2010, международной заявке WO 09085462A1 и заявке на патент США сер. № 12/546850. Вкратце, участки V_H антигенспецифичных клонов, полученных на начальных этапах селекции, были комбинированы с библиотеками соответствующих поддерживающих участков V_L, в этом случае B3 основывается на участке V (SEQ ID NO: 8).

Были созданы три новые библиотеки, в одной из которых используется библиотека VL, использующаяся при первичных отборах как источник отдельных V_L цепей, и две дополнительные библиотеки, разработанные на основе предыдущих анализов комплексов антиген-антитело известной структуры (Raghuanthan et al., J. Mol. Recognit, 2010). Остатки были выбраны из разнообразия, основанного на остатках, которые наиболее вероятно будут участвовать в связывании белка-мишени, что также называется использованием специфически предопределенных остатков (SDRU). В легких цепях V каппа были предопределены три контактирующих участка, сконцентрированных вокруг гипервариабельных петель, как было установлено Хотией и Леском, которые несколько отличаются в зависимости от того, является ли мишень белком, пептидом или небольшим гаптеном. Табл. 5 показывает библиотеки VL, использованные для установления аффинности, где B3 является той же библиотекой, которая используется во время фазы поиска, библиотека 2, сфокусированная на SDRM, основывается на остатках SDRU и фокусируется на их разнообразии, и NNK является разупорядоченной библиотекой. В таблице X означает любую аминокислоту с одним стоп-кодоном, созданным из смеси NNK.

Табл. 7 суммирует разнообразие в библиотеках 1, 2 и 3. Во время анализа итоговой библиотеки некоторые аминокислоты были идентифицированы не как части исходной структуры и поэтому представляются как следствия применения способа синтеза. В библиотеке 2, синтезированной с использованием

- 23 031044 динуклеотидов, эти аминокислоты были: S (положение 30с), Т (положение 30d), EK (положение 30f), IW (положение 32), TV (положение 50), I (положение 92), D (положение 93) и F (положение 96).

Таблица 7

Библиотека

CDR	положение	1	2	3
	Последова-	Кабат	pIX ВЗ de	С фокусом	SDRM NNK
	тельность		novo	на SDRM
L1	30	30	L	L	L
	31	30а	YSHFA	RNDGHSY	X
	32	ЗОЬ	S	S	S
	33	30с	s	RNDGHWSY	X
	34	30d	Кол-во	RNDGHSTY	X
	35	ЗОе	Кол-во	Кол-во	Кол-во
	36	30f	KTNE	EKRNDGHWY	X
	37	31	Кол-во	Кол-во	Кол-во
	38	32	YFHNWDAS	IRNDWY	X
L2	56	50	WSRDYA	YWNKTV	X
L3	97	91	YSHA	SYGH	X
	98	92	YNDSHIFKG	ISYGN	X
	99	93	SNTDGHR	DSTER	X
	100	94	TYLVFAS	YSHT	X
	102	96	WYFLIR	FYRWL	X

Fab-His-протеин был получен из результатов третьего этапа пэннинга, и твердофазный ИФА моноклональных Fab-His-протеинов используется для идентификации отдельных пиков с большим связывающим сигналом, чем у соответствующего родительского Fab-фрагмента. В этой сортировке при помощи твердофазного ИФА были использованы две концентрации биотинилированного человеческого антигена: 2 и 0,2 нМ. Сигнал при связывании для каждого родительского клона был принят за 100%. Были получены 22 пика от увеличения аффинности М6 и М9, которые показали девятикратное (900%) улучшение связывания при сравнении с родительскими Fab, содержащими исходные V-участки тяжелых и легких цепей. Некоторые из этих новых пар тяжелых и легких цепей были выбраны для дальнейшей оценки.

Аффинности (KD) внутрилинейного зрелого mAb к ОМ человека и яванского макака в сравнении с контрольным антителом МАВ295 и родительскими антителами mAb М6 и М9 были суммированы в табл. 8, и состав CDR этих mAb показан в табл. 9. В некоторых случаях LCV образовывал пару и с Н14, и с Н17. Некоторые mAb, которые были признаны возможными кандидатами для использования в терапевтических целях на основании их биофизических свойств и функциональных возможностей, были выде лены серым.

Таблица 8

Внутрилинейные Зрелые Анти-ОМ mAb	Аффинность с ОМ человека	Аффинность с ОМ макак
mAb	Тяжелая цепь Идентификатор	Легкая цепь Идентификатор	Константа ассоциации ка (1/Мс) 10л4	Константа диссоциации kd (1/с) 10л-4	Аффинность KD(hM)	Константа ассоциации ка (1/Мс) 10л4	Константа диссоциации kd (1/с) 10л-4	Аффинность KD(hM)	Соотношение Макак/Человек
MAB 295			11,80	2,17	1,85	7,10	14,10	19,75	10,70
Мб	Н14	L12	1,68	21,20	1,260	1,85	30,70	1,660	1,3
М42	Н14	L173	2,88	13,90	0,484	2,65	13,70	0,516	1,1
М45	Н14	L176	4,68	6,73	0,144	3,80	6,03	0,159	1,1
М53	Н14	L184	1,83	3,92	0,214	1,84	2,71	0,147	0,7
М54	Н14	L185	3,20	1,70	0,053	3,51	2,01	0,057	1,1
М55	Н14	L186	3,51	1,90	0,054	3,86	2,22	0,058	1,1
М9	Н17	ВЗ	0,60	8,54	1,420	0,65	5,83	0,898	0,6
М62	Н17	L171	2,62	4,82	0,184	2,85	6,19	0,217	1,2
М63	Н17	L172	4,22	4,89	0,116	4,50	4,36	0,097	0,8
М64	Н17	L173	3,15	2,98	0,095	3,29	0,75	0,023	0,2
М65	Н17	L174	8,59	5,45	0.064	6,42	3,40	0,053	0,8
М66	Н17	L175	3,20	2,29	0,071	3,73	4,59	0,124	1,7
М67	Н17	L176	6,40	3,39	0,053	5,24	1,80	0,034	0,6
М68	Н17	L177	3,43	2,55	0,064	4,35	2,12	0,049	0,8
М69	Н17	L178	3,75	1,83	0,045	4,84	2,99	0,062	1,4
М71	Н17	L180	3,44	3,61	0,105	4,09	4,42	0,108	1,0
М83	Н17	L192	4,66	1,94	0,042	4,67	1,39	0,030	0,7

- 24 031044

Таблица 9

LC-CDR таблица высокоаффинных Mab

PAIRED VH ID	ИДЕНТИФ ИКАТОР VL	L-CDR1	О c	L-CDR2	№ ПОСЛ.:	L-CDR3	№ ПОСЛ.:
Н17	IGKV4-1	KSSQSVL	23	WASTRES	26	QQYYS	27
	(ВЗ)	YSSNNKN				TPLT
		YLA
Н14	L12	KSSQSVL	24	WASTRES	26	QQYYS	27
		SSSNNEN				TPLT
		WLA
Н17	L171	KSSQSVL	30	KASTRES	42	QQYYS	27
		SSGNNGN				TPLT
		YLA
Н17	L172	KSSQSVL	31	KASTRES	42	QQYYS	27
		SSGSNHN				TPLT
		YLA
Η14/7	L173	KSSQSVL	32	KASTRES	42	QQYYS	27
		SSRGNNN				TPLT
		YLA
Н17	L174	KSSQSVL	33	KASTRES	42	QQYYS	27
		GSWGND				TPLT
		NYLA
Н17	L175	KSSQSVL	34	KASTRES	42	QQYST	45
		YSGGNGN				TPLT
		YLA
Η14/7	L176	KSSQSVL	35	KASTRES	42	QQYYS	27
		GSWGNG				TPLT
		HYLA
Η17	L177	KSSQSVL	36	KASTRES	42	QQYYS	27
		SSNGNHN				TPLT
		YLA
Η17	L178	KSSQSVL	37	KASTRES	42	QQYYS	27
		SSDGNHN				TPLT
		YLA
Η17	L180	KSSQSVL	38	SASTRES	43	QQYFS	46
		GSSSNINF				TPIT
		LA
Η14	L182	KSSQSVL	39	NASTRES	44	QQYYS	27
		GSGDNRN				TPLT
		YLA
Η14	L186	KSSQSVL	40	KASTRES	42	QQYYS	27
		GSGYNRN				TPLT
		YLA
Η14	L184	KSSQSVL	40	WASTRES	26	QQYYS	27
		GSGYNRN				TPLT
		YLA
Η17	L192	KSSQSVL	41	KASTRES	42	QQYYS	27
		GSWHND				TPLT
		NYLA

Разнообразие LC-CDR3 Q-Q-(S,Y)-(F,Y)-S-(F,T)-PLT (SEQ ID NO: 29) в выбранных кандидатах было уменьшено, и консенсусные последовательности повторно выбранных высокоаффинных LC-CDR3 представлены как QQY-(F,Y)-STP-(L,I)-Т (SEQ ID NO: 47).

В повторно выбранных mAb V_H из H14 и H17 содержат общий участок FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3, который представлен в SEQ ID NO, и содержит SEQ ID NO: 14 (CDR1) и SEQ ID NO: 17 (CDR2).

Способность уменьшать пролиферацию клеток A375-S2 у человека и макак.

Оценка зависимости ответа от дозы внутрилинейных зрелых антител проводилась, начиная от дозы 5 или 1 мкг/мл с 1-5 разведениями до 0,0016 или 0,00032 мкг/мл соответственно. Нейтрализация М71 показана на фиг. 2В. При повышении концентрации антител антипролиферативный эффект онкостатина М человека и макак будет нейтрализован. Кривые зависимости ответа от дозы были рассчитаны с использованием данных из трех отдельных экспериментов с онкостатином М человека (незакрашенные обозначения) и яванских макак (закрашенные обозначения). В табл. 10 суммированы IC50 (с 95% доверительными интервалами) М55, М64, М69 и М71 против онкостатина М человека и яванских макак.

- 25 031044

Таблица 10

Антитело	ОМ человека	ОМ макак
IC50 (нг/мл)	95% доверительный интервал	IC50 (нг/мл)	95% доверительный интервал
М55	54.5	42,5-70,0	88,4	67,8-115,2
М64	162,4	125,7-210	321,1	272,6-378,1
М69	44, 6	32,7-60,9	50, 81	37,4-69,1
М71	21,9	16,9-28,4	39, 67	31,2-50,4

Конкуренция с gp130 человека.

Конкурентные эксперименты были проведены между анти-ОМ mAb, выбранными для внутрилинейного созревания, и новыми связывающими веществами из приведенной выше таблицы и gp130 человека при помощи поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на оптическом биосенсоре Biacore 3000 (Biacore), как описывалось в примере 1.

Поверхность биосенсора была подготовлена посредством соединения каждого исследуемого mAb с поверхностью карбоксиметилированного декстрана чипа СМ-5 (Biacore, кат. № BR-1000-14) в соответствии с инструкциями производителя. Приблизительно 4000-15000 ЕО (единиц ответа) каждого исследуемого mAb было иммобилизировано в четырех проточных ячейках прибора. Конкурентные эксперименты проводились при 25°C в подвижном буфере (DPBS+0,005% P20+3 мМ ЭДТА). ОМ человека (внутрилабораторный OSMN1-1) был разведен до 30 нМ в подвижном буфере и введен со скоростью 3 мкл/мин в течение 3 мин в каждую проточную ячейку с иммобилизированными mAb. Последующий захват ОМ человека происходил во время трехминутного введения (фаза ассоциации) каждого конкурентного mAb или gp130-Fc человека в концентрации 300 нМ с последующим промыванием буфером (фаза диссоциации) в течение 3 мин. Поверхность чипа была регенерирована двумя 12-секундными выбросами 100 мМ Н₃РО₄ (Sigma, Ka. № 7961) со скоростью 50 мкл/мин. Полученные данные были обработаны при помощи программного обеспечения BIAevaluation версии 3.2 (Biacore). Во-первых, сенсорограммы были нацелены на введение ОМ человека. Затем были записаны уровни связывания (ЕО) для ОМ человека, конкурирующего mAb или gp130-Fc. Увеличение связывания (ЕО) при введении конкурентного mAb или gp130Fc на поверхность ОМ указывает на то, что они не конкурируют с иммобилизированными исследуемыми mAb и наоборот. Проточная ячейка (Fc1 и т.д.) с иммобилизированными mAb находится вдоль горизонтальных рядов образцов из табл. 10.

Ранее было показано, что М2 конкурирует с имеющимся в продаже антителом МАВ295, которое, как известно, не конкурирует с gp130 при связывании с ОМ. Результаты анализов конкурентного связывания показывают, что М54, М55, М64, М69 и М71 конкурируют с gp130-Fc человека при связывании с антигеном ОМ (табл. 11).

- 26 031044

Уровень связывания (ЕО) Конкуренция

Образец	М2 (Fcl)	М55 (Fc2)	М64 (Fc3)	М2 (Fcl)	М55 (Fc2)	М64 (Fc3)
Буфер	-54	50	30
gpl30-Fc человека	251	25	18	НЕТ	ДА	ДА
МАВ295	-80	2950	1948	ДА	НЕТ	НЕТ
Мб	926	36	33	НЕТ	ДА	ДА
М54	1634	19	16	НЕТ	ДА	ДА
М55	1316	21	19	НЕТ	ДА	ДА
М64	1665	20	22	НЕТ	ДА	ДА
М69	1148	17	11	НЕТ	ДА	ДА
М71	1127	22	17	НЕТ	ДА	ДА
М2	-74	3474	2203	ДА	НЕТ	НЕТ
gpl30-Fc человека	248	26	20	НЕТ	ДА	ДА
Буфер	-47	60	38

Способность блокировать pSTAT3 в клетках А375.

Рассчитанные значения ЕС₅₀ для ингибирования pSTAT3, происходящего в клетках А375 в присутствии или отсутствие 5 нг/мл человеческого ОМ для М6, М9 и внутрилинейных зрелых вариантов этих Mab, показаны в табл. 12.

Таблица 12

Ингибирование pSTAT3

Идентификатор mAb	ЕС50 (нг/мл)	Критерий согласия	Кривая R2 пика
М65	29, 5	24,35-35,82	0,9921
М67	37,7	30,93-45,92	0,9905
М45	50, 0	42,45-58,91	0,9931
М83	71,2	59,59-85,05	0,9908
ΜΆΒ295	72,1	46,91-110,7	0,9848
М54	78,5	66,11-93,23	0,9930
М63	88,2	58,55-132,9	0,9819
М64	97,1	77,01-122,4	0,9902
М68	126, 9	107,2-150,1	0,9924
М69	141,7	115,1-174,5	0,9914
М66	152,7	111,1-209,8	0,9833
М71	159, 6	128,3-198,5	0,9885
М55	181, 6	153,0-215,6	0,9869
М42	191,3	93,67-390,7	0,9607
М62	233,5	206,4-264,1	0,9947
М53	236, 6	196,3-285,2	0,9859
Мб	650,3	241,7-1750	0,9540
М9	1218,0	352,8-4208	0,9614
М85	-		0,4454
IL13	-		0,3438

Пример 5. Биологическая активность.

Анализ ко-культуры макрофагов и хондроцитов.

М71 был исследован в системе ко-культуры макрофагов и хондроцитов. Известно, что дифференцированные макрофаги продуцируют онкостатин М (Hasegawa et al., Rheumatology 38:612-617, 1999). ОМ может снижать синтез высокосульфатированных протеогликановых аггреканов (гликозоаминогликанов), которые образуют значительную часть матрикса хряща.

Противочеловеческие антитела к онкостатину М были обнаружены при помощи рекомбинантного меченного His-Avi-белком онкостатина М человека и яванских макак из клеток HEK, и активность этих антител была оценена при помощи этих молекул и полученного из бактерий рекомбинантного человеческого онкостатина М компании R&D Systems (295-ОМ). Ни один из них не является идентичным к естественному эндогенному онкостатину М человека либо из-за мечения his-avi-белком (ОМ из клеток HEK), либо из-за отсутствия гликозилирования (бактериальный рекомбинантный ОМ). Известно, что макрофаги секретируют онкостатин М (Grove et al., J Lipid Res 32:1889-97, 1991), и онкостатин М снижает синтез протеогликанов в хондроцитах человека (Sanchez et al. ОА and Cart. 12: 810-10, 2004). Таким образом, ко

- 27 031044 культуральная система используется для определения способности противочеловеческих антител к онкостатину М нейтрализовывать эндогенный или естественный человеческий онкостатин М. Вкратце, одиночные альгинатные гранулы, содержащие 40000 нормальных человеческих суставных хондроцитов, были культивированы в течение 72 ч в присутствии дифференцированных макрофагов человека. Эти эксперименты проводились в присутствии диапазона доз антител к онкостатину М. В конце эксперимента синтез протеогликанов измерялся по включению радиоактивного ³⁵SO₄.

CD14+ моноциты периферической крови были получены из компании AllCells. Моноциты культивировались на 48-луночных планшетах с 2,5x105 клетками в лунке в 0,5 мл макрофагальной среды (RPMI+глутамин с 10% термоинактивированной FBS, 1% NEAA (заменимые аминокислоты) и 1% PenStrep). Клетки обрабатывались 100 нг/мл макрофагального колониестимулирующего фактора (М-CSF). Через 48 ч среда была заменена для удаления неприкрепившихся клеток. На 6 день макрофагальная среда, содержащая M-CSF, была заменена макрофагальной средой без М-CSF. На 8 день макрофагальная среда была заменена хондроцитарной средой (50% F-12 Хэма/50% DMEM с 10% фетальной телячьей сыворотки), и в каждую лунку были добавлены отдельные альгинатные гранулы с культурой хондроцитов (Articular Engineering №CDD-H-2200). Аликвоты кондиционированной макрофагальной среды были дублированы и сохранены при -80°C для анализов уровней онкостатина М при помощи набора R&D Systems Human Oncostatin M DuoSet (DY295).

Ко-культуры макрофагов с альгинатными гранулами содержались в присутствии или 20 мкг/мл противочеловеческих антител против онкостатина М (М64, М71, М55, М69) или в присутствии диапазона доз (от 5 мкг/мл до 0,00076 мкг/мл; 1-3 разведения) антитела (М71 и М55). Кроме того, контроль в виде человеческого изотипа IgG1 (CNTO6234) внесен на планшет к наибольшей концентрации исследуемого антитела против онкостатина М. Другие контроли включали только хондроциты (в ко-культуре) и хондроциты в присутствии 2 нг/мл человеческого онкостатина М. Кроме того, лунки, содержащие только макрофаги, содержались для измерения продукции онкостатина М. После 72 ч ко-культивирования в каждую лунку было добавлено 10 мкКи/мл радиоактивного 35SO4 (Perkin-Elmer NEX041H002MC) на дополнительные 20 ч.

Включение ³⁵SO₄ было измерено при помощи способа преципитации СРС (МР Blomedicals (№ 190177). Через 20 ч инкубирования с ³⁵SO4 меченая среда была удалена, и каждая гранула была дважды промыта DPBS с Ca и Mg. После второго промывания к каждой грануле было добавлено 200 мкл цитратного буфера (150 мМ NaCl, 55 мМ цитрата Na, pH 6,8). Планшеты инкубировались в течение от 10 до 15 мин при 37°C до тех пор, пока гранулы не растворились. 100 мкл аликвоты из каждой лунки было перенесено на 96-луночный фильтровальный планшет Millipore Multiscreen, предварительно смоченный 1% СРС, после чего в каждую лунку было добавлено по 10 мкл 10% СРС на 5 мин. Затем планшет был помещен в вакуум до тех пор, пока фильтры не стали сухими. Затем каждая лунка была промыта 2 раза 200 мкл 1% СРС, после чего лунки были помещены в вакуум до тех пор, пока фильтры не стали сухими. Затем из планшета было удалено пластиковое дно, и оно было заменено на приспособление для заклеивания планшетов (Perkin Elmer № 6005185). В каждую лунку была добавлена сцинтилляционная жидкость (50 мкл, Perkin Elmer № 6013621), и приспособление для заклеивания планшетов было помещено на верхнюю часть планшета. Затем планшет был считан при помощи считывателя Top Count.

В концентрации 20 мкг/мл М64, М71, М55 и М69 повышают синтез протеогликанов выше уровня, наблюдаемого при отсутствии антител, когда контрольный изотип неэффективен (фиг. 3). В отдельном эксперименте М71 дозозависимо повышает синтез протеогликанов до уровня, наблюдаемого у одних хондроцитов (определен как 100% нейтрализация), причем ЕС₅₀ составила 30 нг/мл, и контрольный изотип был неэффективен. Эти данные показывают, что полученный из макрофагов ОМ снижает синтез протеогликанов в ко-культивированных хондроцитах, и что противочеловеческие антитела к онкостатину М нейтрализуют естественный онкостатин М.

Анализ фосфорилирования STAT3 в фибробластах человечесекого легкого.

ОМ индуцирует пролиферацию и продукцию коллагена в нормальных фибробластах человеческого легкого (Scaffidi et al., Br. J. Pharmacol 136: 793-801, 2002). Чрезмерная продукция коллагена фибробластами является ключевой особенностью многих патологических состояний (Lim et al., Oncogene 23(39): 5416-25, 2006; Huang et al., J Cell Biochem 81(1): 102-13, 2001). Сигнальная активность рецептора онкостатина М запускает каскад реакций JAK-STAT, и фосфорилирование STAT3 является начальным этапом этого сигнального пути (Auguste et al. (1997) Signaling of Type II Oncostatin M Receptor. J Biol, Chem, 272:15760-15764). Способность онкостатина М к образованию фосфорилированного STAT3 была определена в нормальных фибробластах человеческого легкого (NHLF) при помощи набора R&D Systems human/mouse pSTAT3 Duoset (DYC4607-5). Этот анализ затем был использован для определения способности М55 и М71 к нейтрализации сигнальной активности онкостатина М.

Эти эксперименты были проведены при помощи NHLF из Lonza (СС-2512), которые культивировались на соответствующей среде Lonza FGM-2 (СС-3132). Вкратце, клетки были помещены на планшет в количестве 25000 клеток на лунку в FGM-2 и культивировались в течение 24 ч. Затем клетки были обработаны онкостатином М или антителами и онкостатином М в течение 10 мин. Для предотвращения влияния температуры во время 10-минутной инкубации все растворы, используемые для подготовки к обра

- 28 031044 ботке, были предварительно нагреты и содержались при 37°C. После 10-минутной обработки среда была аспирирована и заменена полным лизирующим буфером. Лизирующий буфер (pH 7,2), содержащий 1% NP-40, 1% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS, 0,15М NaCl и 0,01М фосфат натрия, хранился при 4°C. Во время использования полный лизирующий буфер был приготовлен посредством добавления 1 таблетки смеси ингибиторов протеаз (Roche, 11836153001) и 110 мкл ингибитора фосфатазы HALT (Thermo Scientific 78420) в 11 мл лизирующего буфера. Через 10 мин лизиса полученный лизат был готов для определения фосфорилированного STAT3.

Для определения дозозависимого ответа на онкостатин М клетки NHLF были обработаны диапазоном доз ОМ (от 100 до 0,024 нг/мл с 1-4 разведениями для трех лунок). Планшет для разведения был подготовлен при помощи предварительно нагретого PBS+1% BSA, в каждой лунке которого концентрация ОМ была в 10 раз выше, чем конечная концентрация, которая необходима для обработки, а лунки, содержащие только среду, были включены в качестве необработанных контролей. Среда была полностью удалена из культурального планшета и заменена 180 мкл предварительно подогретой среды FGM-2. Таймер был включен на 10 мин, и затем из каждой лунки планшета для разведения 20 мкл были перенесены в соответствующую лунку культурального планшета. Через 10 мин растворы для обработки были полностью удалены из клеточной пластинки путем аспирации и замещены 100 мкл полного лизирующего буфера. Для минимизации различий во времени инкубирования лизирующий буфер был добавлен в лунки в том же порядке, что и растворы для обработки. Затем анализируемый планшет был помещен во встряхиватель на 10 мин. После встряхивания лизаты были или заморожены при -80°C для дальнейшего анализа, или напрямую нанесены на планшеты для твердофазного ИФА, которые были покрыты антителами к фосфорилированному STAT3. Твердофазный ИФА (набор R&D Systems human/mouse pSTAT3 Duoset) был проведен в соответствии с инструкциями производителя, за исключением того, что 1) в каждую лунку было добавлено только 90 мкл лизата или стандарта, и 2) в качестве подложки для SuperSignal Pico (ThermoScientific 37069) была использована пероксидаза хрена. Люминесценция планшета для твердофазного ИФА была считана при помощи спектрофотометра для прочтения планшетов Victor3.

Для оценки способности М55 и М71 к нейтрализации сигнальной активности ОМ в клетках NHLF эти клетки были обработаны диапазоном доз антител к ОМ (по три лунки для каждого опыта, от 500 до 0,005 нг/мл с 1-10 разведениями или от 50 до 1,563 нг/мл с 1-2 разведениями) в присутствии 2 нг/мл человеческого ОМ. Планшет для разведения был подготовлен при помощи PBS для дозозависимой обработки антителами в концентрации, которая в 20 раз превышает конечную, причем планшет содержал лунки для контроля изотипов (с большей концентрацией антител к ОМ) и лунки без антител для необратонанных контролей и клеток, обработанных только ОМ. Человеческий онкостатин М был приготовлен отдельно в концентрации 40 нг/мл (двадцатикратная конечная концентрация) в среде FGM-2. Антитела в 20-кратной концентрации с растворами ОМ были перемешаны в равных объемах на планшете для разведения для получения растворов для обработки с десятикратной концентрацией, и планшет был инкубирован в течение 1 ч при 37°C для обеспечения связывания ОМ с антителами. Через 1 ч среда была удалена из культурального планшета и замещена 180 мкл предварительно нагретого FGM-2. Таймер был включен на 10 мин, и затем из каждой лунки планшета для разведения 20 мкл были перенесены в соответствующую лунку культурального планшета. Через 10 мин растворы были полностью удалены из клеточной пластинки путем аспирации и замещены 100 мкл полного лизирующего буфера. Для минимизации различий во времени инкубирования лизирующий буфер был добавлен в лунки в том же порядке, что и растворы для обработки. Затем анализируемый планшет был помещен во встряхиватель на 10 мин. После встряхивания лизаты были или заморожены при -80°C для дальнейшего анализа, или напрямую нанесены на планшеты для твердофазного ИФА, которые были покрыты антителами к фосфорилированному STAT3. Твердофазный ИФА (набор R&D Systems human/mouse pSTAT3 Duoset) был проведен в соответствии с инструкциями производителя, за исключением того, что 1) в каждую лунку было добавлено только 90 мкл лизата или стандарта, и 2) в качестве подложки для SuperSignal Pico (ThermoScientific 37069) была использована пероксидаза хрена. Люминесценция планшета для твердофазного ИФА была считана при помощи спектрофотометра для прочтения планшетов Victor3.

Человеческий онкостатин М повышает фосфорилирование STAT3 в клетках NHLF с ЕС₅₀ около 1 нг/мл. Примеры ответов на введение доз онкостатина М приведены на фиг. 4А. В этом примере ЕС50 составила 0,90 нг/мл с 95% доверительным интервалом от 0,70 до 1,17 нг/мл. Нейтрализующая способность антилел к онкостатину М была определена в присутствии 2 нг/мл онкостатина М, и все данные были нормализованы в соответствии с люминесценцией в присутствии 2 нг/мл ОМ в отсутствие антител. Фиг. 4В изображает дозозависимую нейтрализацию ОМ-индуцированного фосфорилирования STAT3 антителами М71. При повышении концентрации М71 степень фосфорилирования STAT3 снижается. Кривая зависимости ответа от дозы была рассчитана на основании данных шести отдельных экспериментов, и рассчитанная IC50 для М71 составила 8,9 нг/мл с 95%-ным доверительным интервалом от 6,9 до 11,6 нг/мл.

Пример 6 Активность in vivo.

Способность М71 к блокированию продукции цитокинов in vivo была оценена после системного введения человеческого онкостатина М. Внутрибрюшинное введение человеческого онкостатина М по

- 29 031044 высило уровень некоторых сывороточных цитокинов, вероятно, за счет взаимодействия с рецептором мышиного фактора ингибирования лейкемии.

Системное (и/п) введение человеческого онкостатина М мышам было разработано в качестве модели оценки нейтрализующей способности моноклональных антител к онкостатину М в условиях in vivo. Мышам и/п вводилось по 10 мкг человеческого онкостатина М в 200 мкл контрольной несущей среды PBS или PBS. Через 1 ч мыши были наркотизированы CO₂, и кровь была забрана при помощи терминальной пункции сердца. Отдельным образцам крови дали свернуться на льду в течение 20 мин, а затем они были центрифугированы на 3500 об/мин в течение 10-15 мин. В соответствии с инструкциями производителя образцы сыворотки оставались замороженными до проведения анализа при помощи панели Milliplex Murine MAP Cytokine/Chemokine Multiplex (32). Анализы образцов показали, что в сравнении с контрольной несущей средой человеческий онкостатин М существенно повысил уровень мышиных КС, IP-10, МСР-1, ИЛ-6 и эотаксина и не повлиял на другие цитокины данной панели. Эти данные показали, что введение человеческого онкостатина М индуцирует высвобождение цитокинов, предположительно, за счет взаимодействия с рецептором мышиного фактора ингибирования лейкемии (Richards et al., J Immunol. 159:2431-37, 1997; Lindberg et al., Mol, Cell Biol, 18:3357-3367, 1988), который может использоваться для исследования нейтрализующей способности антител к онкостатину М in vivo.

М71 и М55 были оценены в мышиной модели системного введения онкостатина М. Вкратце, мышам подкожно были введены дозы М71 или М55 (человеческих IgG1 к ОМ в дозе 20, 2,0 или 0,2 мг/кг), CNTO6234 (контрольного изотипа huIgG1, 20 мг/кг) или PBS в объеме 10 мкл/г. Через 24 ч каждой мыши подкожно было введено или по 10 мкг внутрилабораторного рекомбинантного онкостатина М, полученного из клеток СНО, в PBS (Sigma D8357) с 0,1% мышиным сывороточным альбумином (Sigma A3559), или только контрольной несущей среды PBS-MSA (общим объемом 200 мкл). Через 1 ч мыши были наркотизированы СО2, и кровь была забрана при помощи терминальной пункции сердца. Отдельным образцам крови дали свернуться на льду в течение 20 мин, а затем они были центрифугированы на 3500 об/мин в течение 10-15 мин. Образцы сыворотки оставались замороженными до проведения анализа при помощи панели Milliplex Murine MAP Cytokine/Chemokine Multiplex (32). Образцы сыворотки были проанализированы в соответствии с инструкциями производителя.

Человеческий онкостатин М достоверно (в соответствии с критерием Стьюдента для одной выборки) индуцирует повышение уровней пяти цитокинов в сыворотке крови, что было определено при помощи набора: эотаксина, ИЛ-6, IP-10, КС и МСР-1. Предварительное введение дозировки контрольного изотипа CNTO6234 в дозе 20 мг/кг не повлияло на вызванное онкостатином М высвобождение цитокинов. Тем не менее, предварительное введение дозировки М71 достоверно снизило уровни IP-10, МСР-1, ИЛ-6 и эотаксина в сыворотке при 2,0 и 20 мг/кг и KC при 20 мг/кг. Введение 0,2 мг/кг М71 не оказало эффекта на цитокины. Эффект М71 и контрольного изотипа на IP-10 и МСР-1 показан на фиг. 5А и В соответственно. Менее сильная нейтрализация наблюдалась при введении М55 в дозе 20 и 2,0 мг/кг наблюдалась только с IP-10. Сывороточные уровни ИЛ-6, эотаксина и МСР-1 были снижены при введении 20 мг/кг М55, но снижение уровня KC было отмечено только при введении любой дозы М55. Эти данные демонстрируют способность антител к онкостатину М к нейтрализации биологических эффектов экзогенного человеческого онкостатина М в мышиной модели его системного введения.

IP-10, интерферон-гамма индуцируемый протеин массой 10 кДа или малый индуцируемый цитокин В10, является белком, который у человека кодируется геном CXCL10 (С-Х-С мотив хемокина 10 (CXCL10). CXCL10 был связан с некоторыми биологическими ролями, такими как хемоаттракция моноцитов/макрофагов, Т-клеток, НК-клеток и дендритных клеток, и стимуляция адгедии Т-клеток к эндотелию. KC, теперь известный как лиганд 1 (CXCL1) хемокина с мотивом С-Х-С, является малым цитокином, принадлежащим к семейству хемокина СХС, который ранее назывался GRO1-онкогеном, GROa, нейтрофилактивирующим протеином 3 (NAP-3) и стимулирующим активатором роста меланомы альфа (MSGA-a). У людей этот белок кодируется геном CXCL1. CXCL1 экспрессируется макрофагами, нейтрофилами и эпителиальными клетками, и он обладает хемоаттрактантной активностью для нейтрофилов.

Пример 7. Ко-кристаллография.

Fab-фрагмент, содержащий V-участки Н17 (SEQ ID NO: 51) и L180 (SEQ ID NO: 55), был кристаллизован с остатками человеческого ОМ (SEQ ID NO: 10) 26-212.

ОМ имеет общую трехмерную структуру в виде узла из четырех спиралей с другими членами семейства цитокинов gp130. Строение в виде узла из четырех спиралей характеризуется четырьмя аспиральными сегментами, обозначенными как А (основания 10-37), В (основания 67-90), С (основания 105-131) и D (основания 159-185) и связанными относительно неструктурированными петлями. ОМ взаимодействует с gp130 посредством конечного участка эпитопа II, который включает аминокислотные остатки (Q16, Q20, G120, N123, N124), расположенные в спиралях А и С (Deller et al., структура 8(8): 863-874, 2000; Liu et al., Int. J. Mol. Med. 23: 161-172, 2009). Участок III, эпитоп, ответственный за взаимодействие ОМ с OSMRP и LIFRa, вероятно, большей частью определяется остатками, расположенными в спирали D (Deller et al., структура 8(8): 863-874, 2000).

- 30 031044

Кристаллизация.

Кристаллизация комплекса проведена при помощи способа диффузии паров в сидячей капле при 20°C с использованием робота для кристаллизации протеина Oryx4 (Douglas Instruments), распределяющего равные объемы 0,2 л белкового комплекса (10,95 мг/мл) и 0,2 л резервуарного раствора. Было проведено несколько попыток кристаллизации. Множество капель, которые остались прозрачными, отражают высокую растворимость комплекса. Кристаллы были получены из 0,1М MES pH 6,5, 2,4М сульфата аммония и 0,1М Трис pH 8,5, 3,5М формиата натрия.

Полученная кристаллическая структура раствора.

Остатки ОМ в сочетании с H14/L180 Fab-фрагментами образуют связываемый эпитоп. Остатки антитела в сочетании с ОМ образуют связываемый паратоп. Все шесть CDR двух вариабельных доменов участвуют в связывании ОМ. Контактирующие остатки приведены в табл. 13 и показаны на фиг. 5. Длинный CDR-L1 вместе с CDR из вариабельного участка H1 тяжелой цепи образуют участок связывания антигена в виде впадины с небольшим ребром снизу (фиг. 4С, левая панель). После связывания две стороны впадины охватывают узел из четырех спиралей ОМ вдоль спиралей А и С, причем нижнее ребро связывается между двумя спиралями (фиг. 4С, правая панель). Поверхность для связывания антитела и антигена закрывает 2,514 А2 поверхности, доступной для воздействия растворителя (1225 А2 для антитела и 1298 А2 для антигена). Хотя на поверхности присутствует множество заряженных остатков, там отсутствуют ионные связи, тем самым подтверждая, что вандервальсовы и водородные связи играют наиболее важные роли во взаимодействиях антитела и антигена.

Таблица 13

ОМ VH (Н17) VL (L180)

Q16	Y32,	R98
К19	Y105			Y55,	Е61
Q2 0	S31,	Р100,	V101
D22				136
	Р100,		Y105,
L23	А104,	, V101		Y97
Q25				S34
D2 6				G31,	S32,	S33
Т27				S32,	S33
S28				S32,	F38,	F98
R2 9				F38,	Y97,	F98
D32				S32
1105	R59
Е106				Т100
Е109	Y57,	R59
К110				F98,	S99
Q112	Y57
М113	Y57,	R59,	S102	Т100
Р116	W33,	Y52
N117	W33,	V101,	S102
L119	Y52,	D55
G120	ТЗО,	Y52

* Длина составляет 3,3 А для водородных связей (выделены жирным) и 3,9 А для вандервальсовых сил.

Поэтому H17/L180 Fab контактирует с ОМ остатками, которые, как было показано ранее, взаимодействуют с gp130; Q20 и G120 и вдоль спиралей А и С.

Пример 8. Фармакокинетика.

ОМ является растворимой мишенью, связанной с воспалительными процессами, в отличие от клеточной поверхности, презентирующей мишень на клетке. Целый IgG содержит связывающие участки, которые были описаны в настоящем документе, и дополнительно имеет Fc домен, который с учетом цели и терапевтических характеристик, относящихся к применению использованных способов генной инженерии Fc с мутациями, обеспечивает изменения в связывании FcR.

В настоящем составе длительная активность и персистенция в крови является положительной характеристикой для терапевтического моноклонального IgG. Поэтому Fc-домен имеет сильную аффинность к неонатальному рецептору (FcRn).

Использование описанных ранее мутаций M42 8L (MedImmune патент США № 7670600) в сочетании с N434S (заявка на патент США № 7371826, международная заявка WO 2006/053301) позволяет использовать стандартные способы рекомбинации для создания мутантных антител и антител дикого типа. Два Mab, M71 и М71 L/S, были сравнены в анализах стандартной активности и с точки зрения персистенции в крови приматов (кроме человека).

- 31 031044

Анализы.

М71 и М71 L/S были сравнены друг с другом в анализе пролиферации A375-S2. Зависимость ответов от дозы была оценена с начальной концентрации 1 мкг/мл и 1-5 разведениями до 0,00032 мкг/мл. При концентрации 1 мкг/мл контрольный изотип этих антител, CNTO3930 и CNTO8852 соответственно, не влияет на способность 2 нг/мл человеческого онкостатина М ингибировать пролиферацию. М71 и М71 L/S полностью нейтрализовали влияние онкостатина М в концентрации 1 мкг/мл с измеренной разницей в IC50.

М71 и М71 L/S были сравнены в мышиной модели системного введения ОМ. Вкратце, мышам подкожно вводили дозы М71 и М71 L/S (20, 10 или 5,0 мг/кг), CNTO3930 (контрольный изотип huIgGi, 20 мг/кг), CNTO8852 (контрольный изотип для мутантной версии Fc, 20 мг/кг) или PBS в объеме 10 мкл/г. Через 24 ч каждой мыши было введено и/п 10 мкг или лабораторного рекомбинантного человеческого онкостатина М, полученного из клеток СНО, в PBS (Sigma D8357) с 0,1% мышиного альбумина сыворотки (Sigma А3559), или одной контрольной несущей среды PBS-MSA (общий объем 200 мкл). Через 1 ч мыши были наркотизированы СО₂, и кровь была забрана при помощи терминальной пункции сердца. Отдельным образцам крови дали свернуться на льду в течение 20 мин, а затем они были центрифугированы на 3500 об/мин в течение 10-15 мин. Образцы сыворотки оставались замороженными до проведения анализа при помощи изготовленного на заказ мышиного мультикомплекса Millipore, содержащего гранулы, специфичные к ИЛ-6, МСР-1, эотаксину, КС и IP-10. Контрольный изотип не оказал какоголибо воздействия на высвобождение цитокинов, вызванное человеческим онкостатином М. Тем не менее, М71 и М71 L/S нейтрализуют вызванное онкостатином М высвобождение цитокинов без очевидных различий в силе и эффективности.

Фармакокинетический анализ.

Периоды полужизни М71 и М71 L/S в сыворотке были сравнены в неконечном исследовании фармакокинетики на яванских макаках. Исследование включало всего 12 яванских макак, у которых оценивалось подкожное (п/к, n=3) и внутривенное (в/в, n=3) введение каждого антитела. Антитела вводились в дозе 3 мг/кг, и исследование продолжалось в течение 60 дней. Образцы крови были взяты через 1 (только IV группы) и 6 ч и на 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 30, 37, 45 и 60 дни. Сыворотка образцов была заморожена при -80°C до начала исследования. Уровни антител в сыворотке были определены при помощи твердофазного ИФА, оптимизированного для сыворотки яванских макак на платформе MesoScale Discovery. Биотинилированные захваченные антитела были антиидиотипическими антителами против М71 (мышиные анти-М71). Детекторное антитело было мечено рутением противочеловеческим IgG, и считывающее устройство было представлено хемилюминесцентным прибором MesoScale Discovery.

Результаты исследования показаны на фиг. 6А и 6В. Фиг. 6А изображает графики при в/в введении, при котором период полужизни в сыворотке М71 составляет 15,21±3,0 дня, и период полужизни М71 L/S составляет 29,4±2,3 дня. Схожие результаты были получены при подкожном введении (фиг. 6В) с периодом полужизни в сыворотке 15,4±4 дня для М71 и 32,0±5,9 дня для М71 L/S.

Результаты показали, что М71 L/S t ¹/2 повысилась в два раза в сравнении с М71.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Janssen Biotech, Inc.

<120> Человеческие иммуноглобулины класса М к онкостатину и методы их применения <130> CEN5306WOPCT <160> 56 <170> PatentIn версия3.5 <210> 1 <211> 98 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <220>

<221> Вариант <222> (33)..(33) <223> X возможно Ала либо Гли

- 32 031044

<220> <221> <222> <223>	Вариант	либо	Три
(50). X во	..(50) можно	Гли
<220>
<221>	Вариант
<222>	(52).	.(52)
<223>	X возможно	Иле	либо	Сер
<220>
<221>	Вариант
<222>	(53).	.(53)
<223>	X возможно	Ала	либо	Про
<220>
<221>	Вариант
<222>	(54).	.(54)
<223>	X возможно	Иле	либо	Тир
<220>
<221>	Вариант
<222>	(55).	.(55)
<223>	X возможно	Асн	либо	Фен
<400>	1
Глн Вал	Глн	Лей Вал Глн Сер	Гли
1		5
Сер Вал	Лиз	Вал Сер Цис Лиз	Ала
		20
Xaa Иле	Сер	Три Вал Арг Глн	Ала
	35				40
Гли Xaa	Иле	Xaa Xaa Xaa Xaa	Гли
50				55
Глн Гли	Арг	Вал Тре Иле Тре	Ала
65			70
Мет Глу	Лей	Сер Сер Лей Арг	Сер
		85

Ала	Глу 10	Вал	Лиз	Лиз	Про	Гли 15	Сер
Сер 25	Гли	Гли	Тре	Фен	Сер 30	Сер	Тир
Про	Гли	Глн	Гли	Лей 45	Глу	Три	Мет
Тре	Ала	Асн	Тир 60	Ала	Глн	Лиз	Фен
Асп	Глу	Сер 75	Тре	Сер	Тре	Ала	Тир 80
Глу	Асп 90	Тре	Ала	Вал	Тир	Тир 95	Цис

Ала Арг <210> 2 <211> 98 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <221> Вариант <220>

- 33 031044

<222> <223>	(31)..(31) X возможно	Асп, Асн	либо	Сер
<220>
<221>	Вариант
<222>	(33)..(33)
<223>	X возможно	Асп, Гли	либо	Три
<220>
<221>	Вариант
<222>	(35)..(35)
<223>	X возможно	Гис либо	Сер
<220>
<221>	Вариант
<222>	(50)..(50)
<223>	X возможно	Ала, Асн,	Гли	либо	Вал
<220>
<221>	Вариант
<222>	(52)..(52)
<223>	X возможно	Асн, Лиз,	Сер	либо	Три
<220>
<221>	Вариант
<222>	(53)..(53)
<223>	X возможно	Глн, Гли,	Сер	либо	Тир
<220>
<221>	Вариант
<222>	(54)..(54)
<223>	X возможно	Асп либо	Сер
<220>
<221>	Вариант
<222>	(56)..(56)
<223>	X возможно	Гли либо	Сер

<400> 2

Глу 1

Вал

Глн

Лей

Лей 5

Глу

Сер

Гли

Гли

Гли 10

Лей

Вал

Глн

Про

Гли 15

Гли

Сер

Лей

Арг

Лей

Сер

Цис

Ала

Ала

Сер

Гли

Фен

Тре

Фен

Сер

Xaa

Тир

20

25

30

Xaa

Мет

Xaa

Три

Вал

Арг

Глн

Ала

Про

Гли

Лиз

Гли

Лей

Глу

Три

Вал

35

40

45

Сер

Xaa

Иле

Xaa

Xaa

Xaa

Гли

Xaa

Сер

Тре

Тир

Тир

Ала

Асп

Сер

Вал

50

55

60

Лиз Гли Арг Фен Тре ИлеСер Арг Асп Асн Сер Лиз Асн Тре Лей Тир

70 75 80

Лей Глн Мет Асн Сер Лей Арг Ала Глу Асп Тре Ала Вал Тир Тир Цис

- 34 031044

Ала Лиз <210> 3 <211> 98 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека

<220> <221> <222> <223>	Вариант (31)..(31) X возможно	Асн	либо	Сер
<220>
<221>	Вариант
<222>	(35)..(35)
<223>	X возможно	Гли	либо	Сер
<220>
<221>	Вариант
<222>	(50)..(50)
<223>	X возможно	Арг	либо	Иле
<220>
<221>	Вариант
<222>	(52)..(52)
<223>	X возможно	Асп	либо	Тир
<220>
<221>	Вариант
<222>	(54)..(54)
<223>	X возможно	Гли	либо	Сер
<220>
<221>	Вариант
<222>	(57)..(57)
<223>	X возможно	Асп	либо	Тир

<400> 3

Глу 1

Вал

Глн

Лей

Вал 5

Глн

Сер

Гли

Ала

Глу 10

Вал

Лиз

Лиз

Про

Гли 15

Глу

Сер

Лей

Лиз

Иле

Сер

Цис

Лиз

Гли

Сер

Гли

Тир

Сер

Фен

Тре

Xaa

Тир

20

25

30

Три

Иле

Xaa

Три

Вал

Арг

Глн

Мет

Про

Гли

Лиз

Гли

Лей

Глу

Три

Мет

35

40

45

Гли

Xaa

Иле

Xaa

Про

Xaa

Асп

Сер

Xaa

Тре

Арг

Тир

Сер

Про

Сер

Фен

50

55

60

Глн

Гли

Глн

Вал

Тре

Иле

Сер

Ала

Асп

Лиз

Сер

Иле

Сер

Тре

Ала

Тир

65

70

75

80

- 35 031044

Лей Глн Три Сер Сер Лей Лиз Ала Сер Асп Тре Ала Мет 8590

Тир Тир Цис

Ала Арг

<210> <211> <212> <213>

4 11 Программная справочная таблица Геном человека

<400> 4

Три Гли Глн Гли Тре Лей Вал Тре Вал Сер Сер

510 <210>5 <211> 88 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека

<220>
<221>	Вариант
<222>	(30)..(30)
<223>	X возможно Ала,	Асп,	Асн	, Сер либо	Арг
<220>
<221>	Вариант
<222>	(31)..(31)
<223>	X возможно Асп,	Гли,	Лиз	, Асн либо	Сер
<220>
<221>	Вариант
<222>	(32)..(32)
<223>	X возможно Ала,	Асп,	Фен	, Гис, Асн,	Сер	Три, Вал либо Тир
<220>
<221>	Вариант
<222>	(50)..(50)
<223>	X возможно Ала,	Асп,	Фен	, Гли, Асн,	Лиз,	Тре либо Тир
<400>	5
Асп ИлеГлн Мет Тре Глн	Сер	Про	Сер Сер Лей Сер	Ала Сер Вал Гли
1	5			10		15

Асп

Арг

Вал

Тре 20

Иле

Тре

Цис

Арг

Ала 25

Сер

Глн

Сер

Иле

Xaa Xaa Xaa 30

Лей

Асн

Три

Тир

Глн

Глн

Лиз

Про

Гли

Лиз

Ала

Про

Лиз

Лей

Лей

Иле

35

40

45

Тир

Xaa

Ала

Сер

Сер

Лей

Глн

Сер

Гли

Вал

Про

Сер

Арг

Фен

Сер

Гли

50

55

60

- 36 031044

Сер Гли Сер Гли Тре Асп Фен Тре Лей Тре Иле Сер Сер Лей Глн Про

70 75 80

Глу Асп Фен Ала Тре Тир Тир Цис 85 <210> 6 <211> 88 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <220>

<221> Вариант <222> (30)..(30) <223> X возможно Ала, Асн, Асп, Арг либо Сер <220>

<221> Вариант <222> (31)..(31) <223> X возможно Асн, Асп, Лиз либо Сер <220>

<221> Вариант <222> (32)..(32) <223> X возможно Ала, Асн, Асп, Гис, Фен, Сер, Три либо Тир <220>

<221> Вариант <222> (50)..(50) <223> X возможно Ала, Асн, Асп, Гли, Лиз, Фен, Тре либо Тир <400> 6

Глу 1

Иле

Вал

Лей

Тре 5

Глн

Сер

Про

Ала

Тре 10

Лей

Сер

Лей

Сер

Про 15

Гли

Глу

Арг

Ала

Тре

Лей

Сер

Цис

Арг

Ала

Сер

Глн

Сер

Вал

Xaa

Xaa

Xaa

20

25

30

Лей

Ала

Три

Тир

Глн

Глн

Лиз

Про

Гли

Глн

Ала

Про

Арг

Лей

Лей

Иле

35

40

45

Тир

Xaa

Ала

Сер

Асн

Арг

Ала

Тре

Гли

Иле

Про

Ала

Арг

Фен

Сер

Гли

50

55

60

Сер

Гли

Сер

Гли

Тре

Асп

Фен

Тре

Лей

Тре

Иле

Сер

Сер

Лей

Глу

Про

65

70

75

80

Глу Асп Фен Ала

Вал Тир Тир Цис <210> 7 <211> 89 <212> Программная справочная таблица

- 37 031044 <213> Геном человека

<220> <221> <222> <223>	Вариант (30)..(30) X возможно	Асн,	Асп ,	Арг,	Сер	либо	Тре
<220>
<221>	Вариант
<222>	(31)..(31)
<223>	X возможно	Асн,	Арг,	либо	Сер
<220>
<221>	Вариант
<222>	(32)..(32)
<223>	X возможно	Ала,	Асп ,	Асн ,	Арг,	Гис	либо	Сер
<220>
<221>	Вариант
<222>	(33)..(33)
<223>	X возможно	Глу,	Глн,	Гис,	Лиз,	, Фен,	, Сер	либо Тир
<220>
<221>	Вариант
<222>	(51)..(51)
<223>	X возможно	Ала,	Асп ,	Гли	либо	Сер

<400> 7

Глу 1

Иле

Вал

Лей

Тре 5

Глн

Сер

Про

Ала

Тре 10

Лей

Сер

Лей

Сер

Про 15

Гли

Глу

Арг

Ала

Тре

Лей

Сер

Цис

Арг

Ала

Сер

Глн

Сер

Вал

Xaa

Xaa

Xaa

20

25

30

Xaa

Лей

Ала

Три

Тир

Глн

Глн

Лиз

Про

Гли

Глн

Ала

Про

Арг

Лей

Лей

35

40

45

Иле

Тир

Xaa

Ала

Сер

Сер

Арг

Ала

Тре

Гли

Иле

Про

Асп

Арг

Фен

Сер

50

55

60

Гли

Сер

Гли

Сер

Гли

Тре

Асп

Фен

Тре

Лей

Тре

Иле

Сер

Сер

Лей

Глу

65

70

75

80

Про Глу Асп Фен Ала Вал Тир Тир Цис 85 <210> 8 <211> 94 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <220>

<221> Вариант <222> (31)..(31)

- 38 031044

<223>	X возможно	Ала,	Гис,	Фен,	Сер,	либо	Тир
<220>
<221>	Вариант
<222>	(36)..(36)
<223>	X возможно	Асн,	Глу,	Лиз,	либо	Тре
<220>
<221>	Вариант
<222>	(38)..(38)
<223>	X возможно	Ала,	Асп ,	Асн ,	Гис,	Фен,	Сер,	Три, либо Тир
<220>
<221>	Вариант
<222>	(56)..(56)
<223>	X возможно	Ала,	Асп ,	Арг,	Сер,	Три,	либо	Тир

<400> 8

Асп 1

Иле

Вал

Мет

Тре 5

Глн

Сер

Про

Асп

Сер 10

Лей

Ала

Вал

Сер

Лей 15

Гли

Глу

Арг

Ала

Тре

Иле

Асн

Цис

Лиз

Сер

Сер

Глн

Сер

Вал

Лей

Xaa

Сер

20

25

30

Сер

Асн

Асн

Xaa

Асн

Xaa

Лей

Ала

Три

Тир

Глн

Глн

Лиз

Про

Гли

Глн

35

40

45

Про

Про

Лиз

Лей

Лей

Иле

Тир

Xaa

Ала

Сер

Тре

Арг

Глу

Сер

Гли

Вал

50

55

60

Про

Асп

Арг

Фен

Сер

Гли

Сер

Гли

Сер

Гли

Тре

Асп

Фен

Тре

Лей

Тре

65

70

75

80

Иле

Сер

Сер

Лей

Глн

Ала

Глу

Асп

Вал

Ала

Вал

Тир

Тир

Цис

85

90

<210> 9 <211> 9 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <220>

<221> Вариант <222> (3)..(3) <223> X возможно Ала, Асп, Арг, Гли, Гис, Фен, Про, Сер либо Тир

<220>
<221>	Вариант
<222>	(4)..(4)
<223>	X возможно Асп, Асн, Арг, Глу, Гли, Гис, Иле, Лей, Лиз, Фен, либо Тир	Сер

<220>

<221> Вариант <222> (5)..(5)

- 39 031044

<223>	X возможно	Асп,	Асн,	Арг,	Гли,	Гис,	Лиз,	Тре	либо Сер
<220>
<221>	Вариант
<222>	(6)..(6)
<223>	X возможно	Ала,	Арг,	Гли,	Лей,	Фен,	Про,	Сер,	Тре, Три либо Вал
<220>
<221>	Вариант
<222>	(8)..(8)
<223>	X возможно	Асн,	Арг,	Иле,	, Лей,	, Фен,	, Три	либо	Тир

<400> 9

Глн Глн Xaa Xaa Xaa Xaa Про Xaa Тре

5

<210> <211> <212> <213>	10 10 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	10

Фен Гли Глн Гли Тре Лиз Вал Глу Иле Лиз

5 10

<210> <211> <212> <213>	11 227 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	11

Ала 1

Ала

Иле

Гли

Сер 5

Цис

Сер

Лиз

Глу

Тир 10

Арг

Вал

Лей

Лей

Гли 15

Глн

Лей

Глн

Лиз

Глн

Тре

Асп

Лей

Мет

Глн

Асп

Тре

Сер

Арг

Лей

Лей

Асп

20

25

30

Про

Тир

Иле

Арг

Иле

Глн

Гли

Лей

Асп

Вал

Про

Лиз

Лей

Арг

Глу

Гис

35

40

45

Цис

Арг

Глу

Арг

Про

Гли

Ала

Фен

Про

Сер

Глу

Глу

Тре

Лей

Арг

Гли

50

55

60

Лей

Гли

Арг

Арг

Гли

Фен

Лей

Глн

Тре

Лей

Асн

Ала

Тре

Лей

Гли

Цис

65

70

75

80

Вал

Лей

Гис

Арг

Лей

Ала

Асп

Лей

Глу

Глн

Арг

Лей

Про

Лиз

Ала

Глн

85

90

95

Асп

Лей

Глу

Арг

Сер

Гли

Лей

Асн

Иле

Глу

Асп

Лей

Глу

Лиз

Лей

Глн

100

105

110

- 40 031044

Мет

Ала

Арг 115

Про

Асн

Иле

Лей

Гли 120

Лей Арг

Асн

Асн

Иле 125

Тир

Цис

Мет

Ала

Глн

Лей

Лей

Асп

Асн

Сер

Асп

Тре

Ала

Глу

Про

Тре

Лиз

Ала

Гли

130

135

140

Арг

Гли

Ала

Сер

Глн

Про

Про

Тре

Про

Тре

Про

Ала

Сер

Асп

Ала

Фен

145

150

155

160

Глн

Арг

Лиз

Лей

Глу

Гли

Цис

Арг

Фен

Лей

Гис

Гли

Тир

Гис

Арг

Фен

165

170

175

Мет

Гис

Сер

Вал

Гли

Арг

Вал

Фен

Сер

Лиз

Три

Гли

Глу

Сер

Про

Асн

180

185

190

Арг

Сер

Арг

Арг

Гис

Сер

Про

Гис

Глн

Ала

Лей

Арг

Лиз

Гли

Вал

Арг

195

200

205

Арг

Тре

Арг

Про

Сер

Арг

Лиз

Гли

Лиз

Арг

Лей

Мет

Тре

Арг

Гли

Глн

210

215

220

Лей Про Арг

225 <210> 12 <211> 227 <212> Программная справочная таблица <213> Macaca fascicularis <400> 12

Ала 1

Ала

Мет

Гли

Сер 5

Цис

Сер

Лиз

Глу

Тир 10

Арг

Мет

Лей

Лей

Гли 15

Глн

Лей

Глн

Лиз

Глн

Тре

Асп

Лей

Мет

Глн

Асп

Тре

Сер

Арг

Лей

Лей

Асп

20

25

30

Про

Тир

Иле

Арг

Иле

Глн

Гли

Лей

Асп

Иле

Про

Лиз

Лей

Арг

Глу

Гис

35

40

45

Цис

Арг

Глу

Сер

Про

Гли

Ала

Фен

Про

Сер

Глу

Глу

Тре

Лей

Арг

Гли

50

55

60

Лей

Гли

Арг

Арг

Гли

Фен

Лей

Глн

Тре

Лей

Асн

Ала

Тре

Лей

Гли

Арг

65

70

75

80

Вал

Лей

Гис

Арг

Лей

Ала

Асп

Лей

Глу

Глн

Гис

Лей

Про

Лиз

Ала

Глн

85

90

95

- 41 031044

Асп

Лей

Глу

Арг 100

Сер

Гли Лей

Асн

Иле 105

Глу

Асп

Лей

Глу

Лиз 110

Лей

Глн

Мет

Ала

Арг

Про

Асн

Вал

Лей

Гли

Лей

Арг

Асн

Асн

Иле

Тир

Цис

Мет

115

120

125

Ала

Глн

Лей

Лей

Асп

Асн

Сер

Асп

Мет

Тре

Глу

Про

Тре

Лиз

Ала

Гли

130

135

140

Арг

Гли

Тре

Про

Глн

Про

Про

Тре

Про

Тре

Про

Тре

Сер

Асп

Вал

Фен

145

150

155

160

Глн

Арг

Лиз

Лей

Глу

Гли

Цис

Сер

Фен

Лей

Арг

Гли

Тир

Гис

Арг

Фен

165

170

175

Мет

Гис

Сер

Вал

Гли

Арг

Вал

Фен

Сер

Лиз

Три

Гли

Глу

Сер

Про

Асн

180

185

190

Арг

Сер

Арг

Арг

Гис

Сер

Про

Гис

Глн

Ала

Лей

Арг

Лиз

Гли

Вал

Арг

195

200

205

Арг

Тре

Арг

Про

Сер

Арг

Лиз

Гли

Асн

Арг

Лей

Мет

Про

Арг

Гли

Глн

210

215

220

Лей Про Арг

225

<210>	13
<211>	5
<212>	Программная справочная таблица
<213>	Геном человека
<400>	13

Сер Тир Ала Иле Сер

5

<210> <211> <212> <213>	14 5 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	14

Сер Тир Три Иле Сер

5 <210>

<211>

<212>

<213>

Программная справочная таблица

Геном человека

- 42 031044 <400> 15

Сер Тир Три Иле Гли

5

<210> <211> <212> <213>	16 17 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	16

Гли Иле Иле Про Иле Фен Гли Асн Ала Асн Тир Ала Глн Лиз

5 10

Фен Глн

Гли

<210> <211> <212> <213>	17 17 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	17

Иле Иле Тир Про Гли Асп Сер Тир Тре Арг Тир Сер Про

5 10

Сер

Фен Глн

Гли

<210> <211> <212> <213>	18 17 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	18

Иле Иле Тир Про Гли Асп Сер Асп Тре Арг Тир

5 10

Сер Про Сер Фен Глн

Гли <210>19 <211>9 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <400>19

Тир Гли Ала Лиз Гли Лей Лей Асп Тир

- 43 031044 <210> 20 <211> 10 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <400> 20

Гли Сер Вал Фен Глу Ала Тир Фен Асп Тир

5 10 <210> 21 <211> 10 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <400>21

Вал Про Вал Сер Про Ала Тир Лей Асп Тир 1 510 <210> 22 <211>9 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <400>22

Гли Фен Гли Ала Сер Тир Лей Асп Тир

<210> <211> <212> <213>

23 17 Программная справочная таблица Геном человека

<400> 23

Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Тир Сер Сер Асн Асн Лиз Асн Тир Лей

5 1015

Ала

<210> <211> <212> <213>

24 17 Программная справочная таблица Геном человека

<400> 24

Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Сер Сер Сер Асн Асн Глу Асн Три Лей

5 1015

Ала

- 44 031044 <210>25 <211>17 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <400>25

Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Ала Сер Сер Асн Асн Асн Асн Фен Лей

5 1015

Ала <210> 26 <211>7 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <400>26

Три Ала Сер Тре Арг Глу Сер <210>27 <211> 8 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <400>27

Глн Глн Тир Тир Сер Тре Про Лей <210> 28 <211> 8 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <400> 28

Глн Глн Сер Фен Сер Фен Про Иле

5

<210> <211> <212> <213>

29 9 Программная справочная таблица Геном человека

<221> Вариант <222> (3)..(3) <223> X возможно Сер либо Тир <221> Вариант <222> (4)..(4) <223> X возможно Фен либо Тир <220>

<220>

- 45 031044 <220>

<221> Вариант <222> (6)..(6) <223> X возможно Фен либо Тре <400>29

Глн Глн Xaa Xaa Сер Xaa Про Лей Тре

<210> <211> <212> <213>	30 17 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	30

Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Сер Сер Гли Асн Асн Гли Асн

510

Тир Лей

Ала

<210> <211> <212> <213>	31 17 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	31

Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Сер Сер Гли Сер Асн Гис Асн Тир Лей

5 1015

Ала

<210> <211> <212> <213>	32 17 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	32

Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Сер Сер Арг Гли Асн Асн Асн

510

Тир Лей

Ала

<210> <211> <212> <213>	33 17 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	33

- 46 031044

Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Гли Сер Три Гли Асн Асп Асн

5 10

Тир Лей

Ала

<210> <211> <212> <213>	34 17 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	34

Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Тир Сер Гли Гли Асн Гли Асн

5 10

Тир Лей

Ала

<210> <211> <212> <213>	35 17 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	35

Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Гли Сер Три Гли Асн Гли Гис

5 10

Тир Лей

Ала

<210> <211> <212> <213>	36 17 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	36

Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Сер Сер Асн Гли Асн Гис Асн

5 10

Тир Лей

Ала

<210> <211> <212> <213>	37 17 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	37

Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Сер Сер Асп Гли Асн Гис Асн Тир Лей
1	5	10	15

- 47 031044

Ала

<210> <211> <212> <213>	38 17 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	38

Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Гли Сер Сер Сер Асн Иле Асн Фен Лей

5 1015

Ала

<210> <211> <212> <213>	39 17 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	39

Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Гли Сер Гли Асп Асн Арг Асн Тир Лей

5 1015

Ала

<210> <211> <212> <213>	40 17 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	40

Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Гли Сер Гли Тир Асн Арг Асн

510

Тир Лей

Ала

<210> <211> <212> <213>	41 17 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	41

Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Гли Сер Три Гис Асн Асп Асн Тир Лей

5 1015

Ала

- 48 031044

<210> <211> <212> <213>	42 7 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	42

Лиз Ала Сер Тре Арг Глу Сер

1	5
<210> <211> <212> <213>	43 7 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	43

Сер Ала Сер Тре Арг Глу Сер

1	5
<210> <211> <212> <213>	44 7 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	44

Асн Ала Сер Тре Арг Глу Сер

1	5
<210> <211> <212> <213>	45 9 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	45

Глн Глн Тир Сер Тре Тре Про Лей Тре

1	5
<210> <211> <212> <213>	46 9 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	46

Глн Глн Тир Фен Сер Тре Про Иле Тре

1	5
<210> <211> <212> <213>	47 9 Программная справочная таблица Геном человека

- 49 031044 <220>

<221> Вариант <222> (4)..(4) <223> X возможно Фен либо Тир <220>

<221> Вариант <222> (8)..(8) <223> X возможно Иле либо Лей <400> 47

Глн Глн Тир Xaa Сер Тре Про Xaa Тре

5

<210> <211> <212> <213>	48 96 Программная справочная таблица Геном человека
<400>	48

Глу 1

Вал

Глн

Лей

Вал 5

Глн

Сер

Гли

Ала

Глу 10

Вал

Лиз

Лиз

Про

Гли 15

Глу

Сер

Лей

Лиз

Иле

Сер

Цис

Лиз

Гли

Сер

Гли

Тир

Сер

Фен

Тре

Сер

Тир

20

25

30

Три

Иле

Сер

Три

Вал

Арг

Глн

Мет

Про

Гли

Лиз

Гли

Лей

Глу

Три

Мет

35

40

45

Гли

Иле

Иле

Тир

Про

Гли

Асп

Сер

Тир

Тре

Арг

Тир

Сер

Про

Сер

Фен

50

55

60

Глн

Гли

Глн

Вал

Тре

Иле

Сер

Ала

Асп

Лиз

Сер

Иле

Сер

Тре

Ала

Тир

65

70

75

80

Лей

Глн

Три

Сер

Сер

Лей

Лиз

Ала

Сер

Асп

Тре

Ала

Мет

Тир

Тир

Цис

85

90

95

<210>	49
<211>	102
<212>	Программная справочная таблица
<213>	Геном человека
<400>	49
Асп Иле	Вал Мет Тре Глн Сер Про Асп Сер Лей Ала	Вал Сер Лей Гли
1	5 10	15

Глу Арг Ала Тре Иле Асн Цис Лиз Сер Сер Глн Сер Вал Лей Сер Сер
20	25	30

- 50 031044

Арг

Гли

Асн 35

Асн

Асн

Тир

Лей

Ала 40

Три

Тир

Глн

Глн

Лиз 45

Про

Гли

Глн

Про

Про 50

Лиз

Лей

Лей

Иле

Тир 55

Лиз

Ала

Сер

Тре

Арг 60

Глу

Сер

Гли

Вал

Про 65

Асп

Арг

Фен

Сер

Гли 70

Сер

Гли

Сер

Гли

Тре 75

Асп

Фен

Тре

Лей

Тре 80

Иле

Сер

Сер

Лей

Глн 85

Ала

Глу

Асп

Вал

Ала 90

Вал

Тир

Тир

Цис

Глн 95

Глн

Тир

Тир

Сер

Тре 100

Про

Лей

<210>50 <211> 102 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <400> 50

Асп 1

Иле

Вал

Мет

Тре 5

Глн

Сер

Про

Асп

Сер 10

Лей

Ала

Вал

Сер

Лей 15

Гли

Глу

Арг

Ала

Тре

Иле

Асн

Цис

Лиз

Сер

Сер

Глн

Сер

Вал

Лей

Сер

Сер

20

25

30

Асп

Гли

Асн

Гис

Асн

Тир

Лей

Ала

Три

Тир

Глн

Глн

Лиз

Про

Гли

Глн

35

40

45

Про

Про

Лиз

Лей

Лей

Иле

Тир

Лиз

Ала

Сер

Тре

Арг

Глу

Сер

Гли

Вал

50

55

60

Про

Асп

Арг

Фен

Сер

Гли

Сер

Гли

Сер

Гли

Тре

Асп

Фен

Тре

Лей

Тре

65

70

75

80

Иле

Сер

Сер

Лей

Глн

Ала

Глу

Асп

Вал

Ала

Вал

Тир

Тир

Цис

Глн

Глн

85

90

95

Тир

Тир

Сер

Тре

Про

Лей

100 <210>51 <211> 102 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <400>51

Асп Иле Вал Мет Тре Глн Сер Про Асп Сер Лей Ала Вал Сер Лей Гли

- 51 031044

1

5

10

15

Глу

Арг

Ала

Тре 20

Иле

Асн

Цис

Лиз

Сер 25

Сер

Глн

Сер

Вал

Лей 30

Гли

Сер

Сер

Сер

Асн 35

Иле

Асн

Фен

Лей

Ала 40

Три

Тир

Глн

Глн

Лиз 45

Про

Гли

Глн

Про

Про 50

Лиз

Лей

Лей

Иле

Тир 55

Сер

Ала

Сер

Тре

Арг 60

Глу

Сер

Гли

Вал

Про 65

Асп

Арг

Фен

Сер

Гли 70

Сер

Гли

Сер

Гли

Тре 75

Асп

Фен

Тре

Лей

Тре 80

Иле

Сер

Сер

Лей

Глн 85

Ала

Глу

Асп

Вал

Ала 90

Вал

Тир

Тир

Цис

Глн 95

Глн

Тир

Фен

Сер

Тре 100

Про

Иле

<210> 52 <211> 102 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <400> 52

Асп 1

Иле

Вал

Мет

Тре 5

Глн

Сер

Про

Асп

Сер 10

Лей

Ала

Вал

Сер

Лей 15

Гли

Глу

Арг

Ала

Тре

Иле

Асн

Цис

Лиз

Сер

Сер

Глн

Сер

Вал

Лей

Сер

Сер

20

25

30

Гли

Гли

Асн

Три

Асн

Тир

Лей

Ала

Три

Тир

Глн

Глн

Лиз

Про

Гли

Глн

35

40

45

Про

Про

Лиз

Лей

Лей

Иле

Тир

Три

Ала

Сер

Тре

Арг

Глу

Сер

Гли

Вал

50

55

60

Про

Асп

Арг

Фен

Сер

Гли

Сер

Гли

Сер

Гли

Тре

Асп

Фен

Тре

Лей

Тре

65

70

75

80

Иле

Сер

Сер

Лей

Глн

Ала

Глу

Асп

Вал

Ала

Вал

Тир

Тир

Цис

Глн

Глн

85

90

95

Тир Тир Тре

Тре Про Лей

100 <210> 53

- 52 031044 <211> 102 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <400> 53

Асп Иле 1

Вал

Мет

Тре 5

Глн

Сер

Про

Асп

Сер 10

Лей

Ала

Вал

Сер

Лей 15

Гли

Глу

Арг

Ала

Тре

Иле

Асн

Цис

Лиз

Сер

Сер

Глн

Сер

Вал

Лей

Сер

Сер

20

25

30

Гли

Сер

Асн

Арг

Асн

Тир

Лей

Ала

Три

Тир

Глн

Глн

Лиз

Про

Гли

Глн

35

40

45

Про

Про

Лиз

Лей

Лей

Иле

Тир

Три

Ала

Сер

Тре

Арг

Глу

Сер

Гли

Вал

50

55

60

Про

Асп

Арг

Фен

Сер

Гли

Сер

Гли

Сер

Гли

Тре

Асп

Фен

Тре

Лей

Тре

65

70

75

80

Иле

Сер

Сер

Лей

Глн

Ала

Глу

Асп

Вал

Ала

Вал

Тир

Тир

Цис

Глн

Глн

85

90

95

Тир

Тир

Сер

Тре

Про

Лей

100 <210> 54 <211> 108 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <400> 54

Глу 1

Вал

Глн

Лей

Вал 5

Глн

Сер

Гли

Ала

Глу 10

Вал

Лиз

Лиз

Про

Гли 15

Глу

Сер

Лей

Лиз

Иле

Сер

Цис

Лиз

Гли

Сер

Гли

Тир

Сер

Фен

Тре

Сер

Тир

20

25

30

Три

Иле

Сер

Три

Вал

Арг

Глн

Мет

Про

Гли

Лиз

Гли

Лей

Глу

Три

Мет

35

40

45

Гли

Иле

Иле

Тир

Про

Гли

Асп

Сер

Тир

Тре

Арг

Тир

Сер

Про

Сер

Фен

50

55

60

Глн

Гли

Глн

Вал

Тре

Иле

Сер

Ала

Асп

Лиз

Сер

Иле

Сер

Тре

Ала

Тир

65

70

75

80

Лей

Глн

Три

Сер

Сер

Лей

Лиз

Ала

Сер

Асп

Тре

Ала

Мет

Тир

Тир

Цис

90 95

- 53 031044

Ала Арг Гли Сер Вал Фен Глу Ала Тир Фен Асп Тир

100105 <210>55 <211> 108 <212> Программная справочная таблица <213> Геном человека <400> 55

Глу 1

Вал

Глн

Лей

Вал 5

Глн

Сер

Гли

Ала

Глу 10

Вал

Лиз

Лиз

Про

Гли 15

Глу

Сер

Лей

Лиз

Иле

Сер

Цис

Лиз

Гли

Сер

Гли

Тир

Сер

Фен

Тре

Сер

Тир

20

25

30

Три

Иле

Сер

Три

Вал

Арг

Глн

Мет

Про

Гли

Лиз

Гли

Лей

Глу

Три

Мет

35

40

45

Гли

Иле

Иле

Тир

Про

Гли

Асп

Сер

Тир

Тре

Арг

Тир

Сер

Про

Сер

Фен

50

55

60

Глн

Гли

Глн

Вал

Тре

Иле

Сер

Ала

Асп

Лиз

Сер

Иле

Сер

Тре

Ала

Тир

65

70

75

80

Лей

Глн

Три

Сер

Сер

Лей

Лиз

Ала

Сер

Асп

Тре

Ала

Мет

Тир

Тир

Цис

85

90

95

Ала

Арг

Вал

Про

Вал

Сер

Про

Ала

Тир

Лей

Асп

Тир

100

105

<210>56 <211>15 <212> Программная справочная таблица <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Обобщающая типичная последовательность для энзимного биотинилирования <400> 56

Гли Лей Асн Асп Иле Фен Глу Ала Глн Лиз Иле Глу Три Гис Глу

5 10 15

Claims (24)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенное антитело, которое специфично связывается с человеческим онкостатином М (ОМ), содержащее

   H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14;

   H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 17;

   - 54 031044

   H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21;

   L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 38;

   L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 43 и

   L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46.
2. 2. Выделенное антитело по п.1, содержащее вариабельный участок легкой цепи с аминокислотной последовательностью с SEQ ID NO: 51 и вариабельный участок тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью с SEQ ID NO: 55.
3. 3. Выделенное антитело по п.1 или 2, содержащее константный участок тяжелой цепи человека, выбранный из группы, содержащей IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG|. IgG₂, IgG₃, IgG₄ и IgM.
4. 4. Выделенное антитело по п.3, в котором константный участок относится к изотипу IgGi.
5. 5. Выделенное антитело по п.4, в котором константный участок изменен для предотвращения лизиса антитела.
6. 6. Выделенное антитело по п.3, в котором константный участок изменен для усиления аффинности антитела к неонатальному рецептору (FcRn) в сравнении с антителом с нативной последовательностью константного домена IgG₁.
7. 7. Выделенное антитело по п.6, в котором константный участок изменен в положениях 428 и 434, причем нумерация соответствует европейской нумерации по Кабату.
8. 8. Выделенное антитело по п.7, в котором мутациями являются M428L и N434S, причем нумерация соответствует европейской нумерации по Кабату.
9. 9. Антигенсвязывающий фрагмент любого из антител по пп.1-8.
10. 10. Антигенсвязывающий фрагмент по п.9, который выбран из группы, содержащей Fab, Fab', Fd, F(ab)₂ и ScFv.
11. 11. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики ОМ-ассоциированных состояний, содержащая выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из пп.18 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество или носитель.
12. 12. Способ лечения больного человека, страдающего заболеванием или расстройством, связанным с модулирующей активностью или взаимодействием человеческого ОМ с человеческим белком gp130, включающий введение больному человеку терапевтически эффективного количества композиции по п.11.
13. 13. Способ по п.12, в котором заболевание или расстройство является артропатией, выбранной из группы, содержащей остеоартрит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, нейропатическую артропатию, реактивный артрит и артропатию при поражении вращателей плеча.
14. 14. Способ лечения больного человека, страдающего заболеванием или расстройством, характеризующимся высвобождением провоспалительных цитокинов и хемокинов из макрофагов и моноцитов, включающий введение больному человеку терапевтически эффективного количества композиции по п.11.
15. 15. Способ по п.12, в котором заболевание или расстройство выбирается из группы, содержащей ревматоидный артрит, ювенильный артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, псориаз, хронический бляшковидный псориаз, красную волчанку, воспалительные заболевания легких, идиопатический легочный фиброз, сепсис, преэклампсию, ХНЗЛ, астму и рассеянный склероз.
16. 16. Способ лечения больного человека по п.12, в котором пациент страдает от склерозирующего заболевания, выбранного из группы, содержащей атеросклероз, диабетическую нефропатию, легочный фиброз, идиопатический легочный фиброз, системную склеродермию и цирроз.
17. 17. Выделенный полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь выделенного антитела по любому из пп.1-8 или его антигенсвязывающего фрагмента по п.9 или 10.
18. 18. Выделенный полинуклеотид, кодирующий легкую цепь выделенного антитела по любому из пп.1-8 или его антигенсвязывающего фрагмента по п.9 или 10.
19. 19. Стабильно трансформированная или трансфицированная рекомбинантная клетка-хозяин для экспрессии и выделения антитела по любому из пп.1-8, содержащая выделенный полинуклеотид по п.17 и 18.
20. 20. Стабильно трансформированная или трансфицированная рекомбинантная клетка-хозяин по п.19, содержащая вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела с SEQ ID NO: 51, и второй полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела с SEQ ID NO: 55.
21. 21. Клетка-хозяин по любому из п.19 или 20, которая является клеткой млекопитающего.
22. 22. Клетка-хозяин по п.21, которая является клеткой СНО.
23. 23. Способ получения антитела по любому из пп.1-8, включающий этапы культивирования клеткихозяина по п.21 и выделения антител из этой клетки.
24. 24. Набор для лечения или профилактики ОМ-ассоциированных состояний, содержащий стерильный препарат выделенных антител по любому из пп.1-8 или их антигенсвязывающих фрагментов по п.9

    - 55 031044 или 10 и инструкции по введению антител нуждающемуся в них субъекту.

    Аминокислотные последовательности и нумерация каркасных участков человеческих зародышевых антител, которые были использованы в библиотеке

    I- I100

    -|abcdef _:WGQGTLVTVSS

    100

    100

    Фиг. 1

    М71 Концентрация (нг/мл)

    Фиг. 2В

    Фиг. 3

    - 56 031044

    Контрольная группа

    CNTO6234

    0,2 mg/kg М71 2,0 mg/kg М71 mg/kg М71

    М71 Концентрация (нг/мл)

    Фиг. 4В

    Концентрация ОМ (нг/мл)

    Фиг. 4А

    Фиг. 5А

    Фиг. 5В

    - 57 031044 день

    Фиг. 6B