CN107530431B

CN107530431B - 生物标志物

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Publication number: CN107530431B
Application number: CN201680015517.5A
Authority: CN
Inventors: N·R·韦斯特; B·M·J·欧文斯; A·N·赫加兹; F·M·鲍里
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 2015-01-29
Filing date: 2016-01-28
Publication date: 2022-01-07
Anticipated expiration: 2036-01-28
Also published as: CN107530431A; EP3974450A2; EP3974450A3; US10822406B2; US20180022800A1; EP3250599B1; EP3250599A1; AU2016210996B2; WO2016120625A1; KR20170132143A; AU2016210996A1; JP2018506528A; MX2017009695A; JP6999417B2

Abstract

本发明涉及通过施用制瘤素‑M(OSM)和/或OSM受体‑β(OSMR)的拮抗剂而治疗慢性肠道炎症和/或炎症性肠病的方法。本发明还涉及用于对个体的慢性肠道炎症和/或炎症性肠病进行诊断或预后预测的方法及用于预测个体是否会对抗TNFα治疗作出应答的方法。所述方法包括测量个体中的OSM和/或OSMR。

Description

生物标志物

得到本文所述结果的研究已经获得了根据REA授权协议no.330621的欧盟第七框架计划(FP7/2007-2013)的人类计划(Marie Curie Actions)的资助。

技术领域

本发明涉及用于慢性肠道炎症和/或炎症性肠病(IBD)的治疗、诊断或预后预测的方法和产品，以及用于预测个体是否对使用抗肿瘤坏死因子α(TNFα)治疗的治疗作出应答的方法和产品。

背景技术

诸如包括克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)的炎症性肠病等炎性疾病是使人衰弱的胃肠道慢性炎性病症，具有复发-缓解的过程。治疗目的在于破坏驱动疾病的免疫过程，并且历来广泛使用诸如皮质类固醇等抑制性抗炎剂。最近，对靶向炎性通路的特定组分的兴趣已经有所增长，其主要由诸如英夫利昔单抗等抗肿瘤坏死因子-α (TNFα)抗体的临床成功而大大推动。

虽然抗TNFα抗体可以在许多IBD患者中诱导和维持缓解，但高达40％的患者显示出原发无应答性，另外三分之一会随时间的推移而失去应答性(Ben-Horin和 Chowers，Nat.Rev.Gastroenterol.Hepatol.，2014)。目前还没有可以令人满意地预测治疗失败的方法，也没有揭示作为可行的临床靶标的替代性细胞因子。例如，干扰素 -γ(IFNγ)是Th1免疫应答的主要效应细胞因子，对其进行中和似乎没有什么临床效果。诸如IL-10和IFNβ等抗炎性细胞因子的施用也同样不成功(Neurath，Nat.Rev. Immunol.，2014)。因此，存在如下紧迫的双重需求：(a)鉴定有效的生物标志物，其可准确预测IBD和其他TNFα介导的病症对抗TNFα治疗的临床应答的可能性；及(b) 鉴定和临床验证除TNFα以外的IBD管理的替代性治疗靶标。

IL-6是众所周知的炎性细胞因子，其对于驱动效应CD4⁺T细胞的Th17亚型分化至关重要。在II期试验中，IL-6受体阻断对CD表现出适度的治疗效果(Neurath，Nat.Rev.Immunol.，2014)。IL-6是通过共同使用gp130受体亚基定义的细胞因子家族的原型成员。

制瘤素-M(OSM)是这种细胞因子家族的成员。与仅通过gp130传导信号的IL-6 不同，OSM占用由gp130及OSM受体-β(OSMR)或LIF受体(LIFR)组成的两种可能的异二聚体受体，OSMR或LIFR这两种受体均能够传导不同于gp130的信号(Heinrich 等，Biochemistry，2003)。例如，OSM在各种细胞类型中比IL-6引起更强的丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号(West和Watson，Oncogene，2010；Hintzen等，Arthritis Rheum.，2009)。虽然LIFR在大部分成年组织中弱表达，但OSMR在大部分器官中通过多种细胞类型广泛表达，其包括内皮细胞、上皮细胞、基质细胞、神经胶质细胞和造血细胞(Richards，ISRN Inflam.，2013)。

已经在几种炎性疾病(诸如银屑病和气道炎症)和多种癌症类型中确定了OSM的扰动(Richards，ISRN Inflam.，2013)。在每个所述病症中，实验模型表明OSM通过经OSMR信号传导直接促成炎症过程。最近发现，在全基因组关联研究中，OSM与 CD和UC均相关(Jostins等，Nature，2012)。然而，很少知道OSM信号传导在IBD 中的作用，包括OSM信号传导是否参与IBD的发病机制。

发明内容

本发明的发明人已经发现，在大部分IBD患者的活动性疾病期间，OSM和OSMR 在肠粘膜中高度表达。OSM和OSMR在至少四种不同的结肠炎小鼠模型中也上调，并且其表达与疾病严重程度相关。认为混乱的Th1和Th17辅助细胞活性在IBD的发病机制中是至关重要的，并且本发明的发明人首次将OSM鉴定为Th17诱导通路的组分。此外，OSM的全身施用加剧了鼠结肠炎，而OSM的治疗性阻断或OSM的遗传缺失改善了免疫病理学。

因此，本发明的第一方面提供了一种在个体中治疗或预防慢性肠道炎症和/或IBD的方法，该方法包括向个体施用OSM和/或OSMR的拮抗剂，从而在个体中治疗或预防慢性肠道炎症和/或IBD。

本发明还提供了：

-在个体中治疗或预防慢性肠道炎症和/或IBD的方法中使用的OSM和/或 OSMR的拮抗剂；及

-OSM和/或OSMR的拮抗剂在制备用于在个体中治疗或预防慢性肠道炎症和/ 或IBD的方法的药物中的应用。

在某些情况下，已根据以下方法对个体进行了诊断或预后预测。

在另一方面，本发明提供了一种对个体的慢性肠道炎症和/或IBD进行诊断或预后预测的方法，该方法包括测量个体中的OSM和/或OSMR，从而对个体的慢性肠道炎症和/或IBD进行诊断或预后预测。

细胞因子信号传导通路的潜在强度由配体和受体的相对丰度决定。因此，在某些情况下，有用的是测量个体中的OSM和OSMR并且确定OSM指数(OSMi)(相对OSM 和OSMR的乘积)。

本发明的发明人已经表明，OSMR在疾病缓解期间仍然保持高表达。此外，在成功的抗TNFα治疗后，OSM被抑制。这表明，OSM信号传导在疾病复发中起作用。因此，在某些情况下，对慢性肠道炎症和/或IBD进行诊断或预后预测的方法是预测慢性肠道炎症和/或IBD缓解的个体是否会复发的方法。

在某些情况下，与参考样品或参考水平相比，OSM、OSMR和/或OSMi的水平升高表明阳性诊断、不良预后和/或个体会有复发。在其他情况下，与参考样品或参考水平相比，OSM、OSMR和/或OSMi水平降低表明阴性诊断、良好预后和/或个体不会有复发。

另一方面，本发明提供了一种在个体中治疗或预防慢性肠道炎症和/或IBD的方法，该方法包括：

(a)根据上述方法对个体的慢性肠道炎症和/或IBD进行诊断或预后预测；及

(b)向个体施用在慢性肠道炎症和/或IBD的治疗中有用的试剂。

在某些情况下，该试剂是OSM和/或OSMR的拮抗剂。OSM和/或OSMR拮抗剂可以是OSM或OSMR活性或表达的拮抗剂，诸如抗OSM或抗OSMR抗体，或者 OSM或OSMR融合蛋白。

本发明还提供了：

-在个体中治疗或预防慢性肠道炎症和/或IBD的方法中使用的试剂，其中根据上述方法对个体的慢性肠道炎症和/或IBD进行诊断或预后预测；

-试剂在制备用于治疗或预防个体的慢性肠道炎症和/或IBD的方法的药物中的应用，其中已经根据上述方法对个体的慢性肠道炎症和/或IBD进行了诊断或预后预测。

-产品，其包含：

o用于确定具有或疑似具有或有风险发展为慢性肠道炎症和/或IBD的个体中的OSM和/或OSMR水平的要素(means)；及

o用于治疗慢性肠道炎症和/或IBD的试剂。

本发明的发明人还表明，OSM和OSMR在肠粘膜中的表达可预测对抗TNFα治疗的不应答。

因此，另一方面，本发明提供了一种用于预测个体是否会对抗TNFα治疗应答的方法，该方法包括测量个体中的OSM和/或OSMR，从而预测个体是否会对抗TNFα治疗应答。抗TNFα治疗可以是抗TNFα抗体，诸如英夫利昔单抗。

在某些情况下，与参考样品或参考水平相比，OSM、OSMR和/或OSMi水平的下降表明个体会对抗TNFα治疗应答。该方法因此可以还包括选择或推荐用于治疗个体的抗TNFα治疗。在某些情况下，因此对个体施用抗TNFα治疗。在某些情况下，本发明允许将抗TNFα治疗认定为对不会以其他方式接受抗TNFα治疗的个体适合的治疗，例如作为一线治疗。抗TNFα治疗如英夫利昔单抗是用于诸如IBD等病症的“金标准”治疗。然而通常，抗TNFα治疗不被选为一线治疗，原因在于：由于如强免疫抑制等副作用，原发性和继发性非应答性是常见的；和/或由于治疗昂贵。本发明的方法可用于鉴定会对抗TNFα治疗应答并从中最受益的那些个体。因此可以在其疾病治疗的早期阶段为这些个体选择或推荐抗TNFα治疗。可以选择或推荐抗TNFα治疗作为一线治疗。

在某些情况下，与参考样品或参考水平相比，OSM、OSMR和/或OSMi的水平升高表明个体将不对抗TNFα治疗作出应答。该方法因此可以进一步包括对个体治疗选择或推荐除抗TNFα治疗外的治疗。在某些情况下，因此对个体施用除抗TNFα治疗外的治疗。

另一方面，本发明提供了一种在个体中治疗或预防TNFα介导的疾病或病症的方法，该方法包括向个体施用TNFα拮抗剂，从而治疗或预防TNFα介导的疾病或病症，在该方法中，根据上述方法预测个体对TNFα拮抗剂的应答。

本发明还提供了：

-在个体中治疗或预防TNFα介导的疾病或病症的方法中使用的TNFα拮抗剂，其中已经根据上述方法预测该个体对TNFα拮抗剂应答；

-TNFα拮抗剂在制备用于治疗或预防个体的TNFα介导的疾病或病症的方法的药物中的应用，其中已经根据上述方法预测出个体对TNFα拮抗剂应答。

另一方面提供了用于在具有或疑似具有或有风险发展TNFα介导的疾病、慢性肠道炎症和/或IBD的个体中测量OMS和/或OMSR水平的检验方法，该方法包括：使来自个体的生物样品与结合OSM或OSMR的试剂接触，测量该试剂与OSM或OSMR 之间的复合体形成，可选地计算OSMi，将测量值或OSMi值与参考值进行比较，从而预测具有TNFα介导的疾病的个体是否会对抗TNFα治疗应答，或者对个体的慢性肠道炎症和/或IBD进行诊断或预测。

另一方面，提供了一个系统，其包括：

(a)测量模块，用于对来自具有TNFα介导的疾病、慢性肠道炎症和/或IBD的个体的生物样品中的OSM和/或OSMR水平进行定量；

(b)储存模块，被配置为储存从所述测量模块输出的储存数据、以及参考和/或对照数据；

(c)计算模块，被配置为计算从所述测量模块输出的数据、以及参考或对照数据的值；及

(d)输出模块，被配置为基于输出数据的值，显示患有慢性肠道炎症和/或IBD的个体的诊断或预后预测。

本发明的另一方面提供了用于本发明的任何诊断或预后预测方法的测试试剂盒，该测试试剂盒包括用于确定个体中OSM和/或OSMR水平的要素(means)和用于该方法的说明书。

另一方面，本发明提供了确定个体中慢性肠道炎症和/或IBD的严重程度的方法，该方法包括测量个体中的OSM和/或OSMR，从而确定个体中慢性肠道炎症和/或IBD 的严重程度。

另一方面，本发明提供了一种确定患有慢性肠道炎症和/或IBD的个体需要外科手术的可能性的方法，该方法包括测量个体中的OSM和/或OSMR，从而确定个体需要外科手术的可能性。

现在将通过举例而非限制的方式并参考附图来更详细地描述本发明。对于本领域技术人员当给出本公开时许多等同的修改和变形将是显而易见的。因此，所阐述的本发明的示例性实施方式被认为是说明性的而不是限制性的。在不脱离本发明的范围的情况下，可以对所描述的实施方式进行各种改变。本文引用的所有文件(无论是上文还是下文)都明确地通过引用并入本文。

本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这种组合明显是不允许的或者声明要明确避免。如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“拮抗剂”时包括两种以上这样的拮抗剂。

本文中使用的部分标题仅为方便起见，不应被解释为以任何方式限制。

附图说明

图1

在以下三种不同的模型系统中鉴定了健康小鼠和结肠炎小鼠之间整个结肠组织中差异表达的细胞因子：在C57Bl/6小鼠中口服施用DSS(葡聚糖硫酸钠)，在BALB/c 小鼠中直肠施用TNBS(三硝基苯磺酸)，口服胆螺旋杆菌感染的具有Abcb1a基因缺失的FVB.129P2小鼠。全转录组数据可公开获得，并且分别来自以下基因表达综合(GEO) 条目：GSE34553、GSE35609和GSE72212。选择每个数据集中具有可用数据的45 个候选细胞因子进行分析。然后评估其表达水平，并确定其在结肠炎期间显著改变(基于具有假发现率校正的t检验)的那些。将这些列于维恩图(Venn diagram)中。在全部三个模型系统中，只有Il1a、Il1b、Il6、Tnf和Osm在结肠炎小鼠的结肠中显著增加。

图2

如“方法”中所述，使用Hh+αIL10R模型产生数据，该模型结合免疫失调与共病病原体(肝螺杆菌)感染。(A)来自野生型C57Bl/6小鼠(n＝19个对照，且n＝35个结肠炎小鼠，从>3个实验汇集)的整个结肠组织中Osm和Osmr的mRNA表达。(B)来自近端结肠外植体(左)或盲肠内容物(右)的24小时培养物的OSM的产生，使用对小鼠OSM特异性的ELISA进行定量。OSM浓度对外植体/盲肠内容物质量标准化(n＝4 个未治疗，n＝10个的治疗小鼠，来自三个代表性实验中的一个)。(C)来自稳定状态的小鼠和具有Hh+αIL10R结肠炎的小鼠的整个结肠组织中的Osm mRNA v.s.Il1b、Il6 和Tnf的Pearson相关性(n＝63，来自>3个实验汇集)。*p＝0.01–0.05，**p＝0.001–0.01， ***p＝0.0001–0.001，****p<0.0001，适当使用非参数Mann-Whitney检验或 Kruskal-Wallis测试计算。

图3

(A)诱导Hh+αIL10R结肠炎后，在整个结肠组织中的Osm和Osmr表达的时间过程动力学，在(B)中具有相关的组织学疾病严重程度(n>4个小鼠/时间点)。(C)整个结肠组织中的Osm和Osmr表达与组织学严重程度柱(健康，评分＝0～1；轻度/中度，评分＝>1～7；重度，评分>7)的相关性。自三个单独实验汇集的n>15个小鼠/组。 *p＝0.01–0.05，**p＝0.001–0.01，***p＝0.0001–0.001，****p<0.0001，使用Kruskal-Wallis 检验计算。

图4

(A–B)对牛津IBD患者或健康对照的肠粘膜活检或肠切除样品的粘膜，通过实时定量聚合酶链式反应(qPCR)分析评估的OSM和OSMR的mRNA表达。(A)健康对照 (n＝13)、具有活动性疾病的IBD患者(n＝44)、具有活动性疾病的IBD患者的未受累肠部位(n＝21)、和无活动性炎症证据的IBD患者(n＝14)的组织活检样中的OSM、OSMR 和OSM指数(OSMi，相对OSM和OSMR的乘积)表达。在采集样品时通过内窥镜评估确定疾病活动性/肠道炎症。(B)如小图(A)进行分析，依照在常规临床病理学评估期间确定的炎症组织学等级分类的样品如下：健康对照(全部静息)(n＝13)，静息 IBD(n＝27)，轻度至中度活动性IBD(n＝29)，及重度活动性IBD(n＝9)。使用单因素方差分析与Tukey多重比较检验确定显著性。*p＝0.01–0.05，**p＝0.001–0.01， ***p＝0.0001–0.001，****p<0.0001。

图5

OSM表达与S100A8和S100A9(临床验证的粘膜炎症生物标志物钙卫蛋白的组分)的表达的Pearson相关性。数据来源于CD(GSE57945，n＝220)和UC患者(GSE23597， n＝112)。

图6

(A)来自牛津IBD组群的健康对照(n＝13)与活动性CD(n＝19)或活动性UC(n＝24)患者中的OSM和OSMR的表达。使用单因素方差分析与Tukey多重比较检验确定显著性。(B)来自治疗初始儿科回肠CD患者(n＝162)与年龄相匹配的健康对照(n＝42)的回肠粘膜活检的比较。数据点反映了通过具有假发现率校正(Q＝1％)的t检验确定的 63种不同的细胞因子基因(y-轴)的IBD富集的平均(+/–s.e.m.)倍数与统计学显著性(x- 轴)。数据来源于GEO条目GSE57945.*p＝0.01–0.05，**p＝0.001–0.01， ***p＝0.0001–0.001，****p<0.0001。

图7

从回肠袋-肛门吻合组织收集的袋活检中OSM和OSMR的表达。数据包括无结肠袋炎(袋组织的炎症)的UC患者、具有活动性结肠袋炎的UC患者、以及无结肠袋炎的家族性腺瘤性息肉病患者。*p＝0.01–0.05，**p＝0.001–0.01，使用Kruskal-Wallis检验与Dunn’s多重比较检验来测定。数据来源于GEO条目GSE65270。

图8

(A–C)通过qPCR在来自牛津IBD患者的肠粘膜活检中评估OSM和OSMR表达。 (A)根据性别划分的患者的表达。(B)根据诊断时年龄划分的患者的表达。(C)根据疾病持续时间(即从诊断日期到活检收集时以年计的时间)划分的表达。使用t检验(图 A)和单因素方差分析(图B和C)确定显著性。

图9

通过qPCR在来自牛津IBD患者的肠粘膜活检中评估OSM和OSMR表达。与样本采集时(A)血清CRP(C反应蛋白)水平和(B)外周血白细胞计数相关的表达。使用单向方差分析确定显著性。

图10

通过qPCR评估来自牛津IBD患者的肠粘膜活检的OSM和OSMR表达，比较按治疗史分类的患者的水平。“外科手术”是指直接从手术切除样本收集的粘膜活检或来自后续需要外科手术的患者的内镜收集的活检。**p＝0.001–0.01，***p＝0.0001–0.001，使用t检验确定。

图11

(A–B )可公开获得的基因表达数据集GSE16879的分析。(A)在英夫利昔单抗治疗前，将组群(顶排)的全部患者或仅CD患者(底排)均按肠活检中的相对OSM表达水平 (分为三分位数)进行分类。然后评估每组对英夫利昔单抗的临床应答频率，应答率表示为饼图。基于内镜和组织学评估，将对治疗的应答性定义为完全肠粘膜愈合。使用χ²分析确定显著性。(B)通过Fisher精确检验，对治疗前活检中指示基因的高表达(上三分之一)与低表达(下三分之一)患者比较了英夫利昔单抗应答率的比值比和显著性水平。高比值表明对英夫利昔单抗临床应答的可能性降低。*p＝0.01–0.05， ***p＝0.0001–0.001，****p<0.0001。

图12

可公开获得的基因表达数据集GSE16879的分析。(A)UC患者在用英夫利昔单抗前与用英夫利昔单抗后的活检的OSM指数表达比较，他们在英夫利昔单抗治疗前均具有高OSM指数表达。仅在治疗应答性患者中，英夫利昔单抗治疗后OSM指数表达一直下降。使用配对t检验确定显著性。(B)来自英夫利昔单抗应答性UC患者的在用英夫利昔单抗后相对于英夫利昔单抗前活检中指示基因的肠表达的变化平均倍数 (+/–95％CI)。使用配对t检验确定显著性。****p<0.0001。

图13

在GSE16879数据集中的OSM指数表达和英夫利昔单抗应答概率的接受者-操作者特征(ROC)分析(显示联合组和仅有CD)，以及UC(GSE23597和GSE12251)中英夫利昔单抗应答性的其他两项研究。使用来自治疗前活检的基因表达数据产生所有图。

图14

在英夫利昔单抗治疗后第0周、第8周和第30周，结肠活检中OSM和OSMR 表达的关联(GEO数据集GSE23597)。患者分类为在第8周没有临床应答的患者(黑色)，在第8周有初始应答但在第30周变成难治性的患者(灰色)，以及在第8周和第30周持续应答的患者(白色)。使用单因素方差分析与Holm-Sidak多重比较检验确定显著性。*p＝0.01–0.05，**p＝0.001–0.01，***p＝0.0001–0.001，****p<0.0001。

图15

GSE16879数据集中，OSM、OSMR和细胞因子mRNA表达的分层聚类分析。包括OSM和OSMR的一般基因聚类用阴影标出，并且制得注意的是富含诱导Th17T辅助细胞分化的细胞因子以及Th17和Th1免疫应答的效应细胞因子。以热图下方的阴影条鉴别来自对照和英夫利昔单抗难治性或应答性IBD患者的样本。所有数据均来自以英夫利昔单抗治疗前样本。

图16

(A)在GSE16879中，在OSM-高样本与OSM-低样本中的代表性Th17、Th1和 Th2细胞因子的平均基因表达差异。每个点代表UC、结肠CD或回肠CD的平均差。统计学上差异显著(基于t检验)的疾病亚型的数量由符号(在相关图例中定义)表示。(B) 来自牛津组群的OSM-高(上半部分)与OSM-低(下半部分)IBD粘膜活检的基因表达差异。数据表示为相对于使用t检验和Holm-Sidak多重比较校正确定的统计学显著性作图的平均差异倍数。

图17

(A)在来自用100ng/ml指示的微生物配体刺激16个小时的2个健康人供体的单核细胞中通过ELISA测定的OSM分泌。(B)测量来自应答于热杀死细菌(16小时孵育) 的2名健康供体的外周血单核细胞的OSM分泌的代表性实验。AIEC，粘附侵袭性大肠杆菌。

图18

(A)在细菌刺激的单核细胞(如图17)中的OSM与其他细胞因子(通过qPCR测定) 的Spearman相关性。(B)人肠道抗原呈递细胞中的OSM表达。数据来源于FACS分选的分离自人肠组织的抗原呈递细胞子集的公众可得的基因表达数据集(GSE49066)。将细胞分选为谱系(CD3/19/20/56)^–HLA-DR^高加/减所指示的表面标志物。已显示 CD14⁺CD163^低子集相对于其他指示的APC子集具有优异的Th17诱导能力。(C)2组健康供体单核细胞中在细菌刺激后，平均细胞因子表达(由qPCR测定)的分层聚类。包含OSM和OSMR的聚类用阴影表示。

图19

在用PMA(佛波酯)和离子霉素刺激后，在外周血初始和记忆性CD4⁺T细胞中直接离体评估OSM和OSMR表达。(A)从2名代表性供体中FACS纯化总CD4⁺CD25^-活T细胞并且刺激8小时。描绘了通过qPCR定量的OSM和OSMR的基因表达。(B) 在如(A)中所述的刺激后的上清液中通过ELISA定量OSM蛋白。(C)用PMA/离子霉素再刺激总PBMC(外周血单核细胞)，并使用人OSM特异性抗体通过细胞内细胞因子染色分析门控CD4⁺CD45RA⁺和CD4⁺CD45RO⁺群体内OSM⁺细胞的频率。

图20

(A)将总CD45RO⁺或CCR6⁺CD45RO⁺记忆性CD4⁺T细胞在Th0、Th1、Th2和/ 或Th17条件下用抗CD3/CD28珠进行FACS纯化并进行培养。认为在Th17细胞中富含CCR6⁺T细胞群体。培养7天后显示OSMR基因表达。在没有接受抗CD3/CD28 刺激的细胞中没有检测到表达。(B–C)在具有或不具有OSM的Th0、Th1、Th2、Th22、 Th9、Treg或Th17极化条件下用抗CD3/CD28培养5天的健康人类供体的初始 CD4⁺CD45RA⁺T细胞。(B)与用无OSM的条件相比，OSM处理条件(20ng/ml的OSM) 下的相对细胞扩增。**p<0.01，配对t检验。(C)T辅助细胞的关键转录因子(左)和效应细胞因子(右)的mRNA表达。显示的数据表示具有OSM的Th17条件下v.s.不具有OSM的Th17条件下的相对表达。*p＝0.01–0.05，**p<0.01，单样本t检验。

图21

来自进行Hh+αIL10R结肠炎方案(参见“方法”)的小鼠的中结肠切片的代表性苏木精&伊红染色的截面。比较的两种基因型是野生型C57BL/6小鼠和OSM敲除 (Osm^-/-)同窝出生小鼠。比例条表示0.5mm(顶行)和0.25mm(底行)。箭头指示重度炎症的显著特征，其包括粘膜下水肿(双头)和隐窝脓肿(单头)。

图22

来自进行Hh+αIL10R结肠炎方案的野生型C57BL/6小鼠和Osm^-/-同窝出生小鼠中结肠炎严重性的比较。(A)从两个独立实验汇集的小鼠的组织病理学评分(如“方法”所述进行测定)。(B)来自图(A)的结肠炎小鼠，其总体组织学评分分为不同的组分，每个以0至3的严重程度量化。(C)小鼠(与图A和B相同的动物)的整个结肠组织中促炎性细胞因子Il6和Il1bv.s.Il10(抗炎性)的表达。*p＝0.01–0.05，**p＝0.001–0.01， ***p＝0.0001–0.001，****p<0.0001，使用Mann-Whitney检验测定。

图23

测试为中和小鼠OSM而设计的新型重组蛋白(O-RFP，改造自Brolund等，BMCBiotechnology，2011)相对于市售山羊多克隆抗OSM抗体的体外OSM中和能力。该测定涉及用10ng/ml重组小鼠OSM以及增加摩尔比的中和剂处理离体培养的小鼠结肠成纤维细胞。2小时后评估OSM靶基因的表达；这里显示的是STAT3转录靶标 SOCS3的结果。(A)市售多克隆抗体的中和曲线，其具有计算出的对于50％中和所需的摩尔比(12.1:1)。(B)如图(A)那样，使用O-RFP，对于50％的中和，其仅需要1.7:1 摩尔比。

O-RFP编码鼠蛋白，并靶向鼠OSM。该构建体是Brolund等(BMC Biotechnology，2011)描述的“mOSM-RFP”的改造物。简而言之，重组受体从N端至C端是由以下部分组成的融合蛋白：(a)鼠OSMR的结构域1、2、3和4；(b)柔性接头肽；(c)鼠gp130 的结构域2和3；(d)Fc标签(鼠IgG2A)。该构建体在HEK-293细胞中表达，使用标准蛋白G柱纯化法进行纯化，并使用由Lonza提供的检测服务确认为其不含内毒素。对于使用该试剂的体内实验，在相同的条件下制备IgG2A-Fc蛋白作为治疗对照。

图24

OSM作为治疗肠道炎症的相关靶标的确立。(A)来自人CD切除的粘膜外植体培养物中的IL1B表达(n＝5)。外植体用20μg/ml的抗OSM中和抗体(R&D Systems，克隆17022)、匹配的同种型对照抗体或英夫利昔单抗(抗TNF)处理24小时。数据点表示整个外植体mRNA中的IL1B的平均(+/–s.e.m.)变化，相对于未处理的样品进行了标准化。这些数据表明，OSM阻断在离体人组织中的抗炎作用可以与英夫利昔单抗 (抗TNF)的抗炎作用相当。在对数转换之前，使用单样本t检验与假设平均值1计算显著性。(B)进行Hh+αIL10R结肠炎方案并按照“方法”中所述在第7天开始用抗 TNF单克隆抗体、IgG-Fc对照蛋白或O-RFP治疗的野生型C57BL/6小鼠的总体组织病理学评分。(C)图(B)中描绘的小鼠的组织病理学成分评分。(D)如图(B/C)中进行治疗的小鼠的代表性结肠炎评分，其通过在处死前一天的活麻醉动物的内窥镜评估来确定。这是按照标准方案进行的(Becker等，Nature Protocols，2007).*p＝0.01–0.05， **p＝0.001–0.01，***p＝0.0001–0.001，****p<0.0001，使用Mann-Whitney检验进行确定。

图25

鉴定小鼠肠组织中OSM和OSMR的关键细胞来源。有活力的FACS-纯化细胞群体分离自稳定状态(n＝4)和进行Hh+αIL10R方案的结肠炎小鼠(n＝10)的经消化的结肠组织。用于鉴定和分离细胞群体的标志物如下：上皮细胞(CD45^–EpCAM⁺)；内皮细胞(CD45^–EpCAM^–CD31⁺)；gp38^–基质(CD45^–EpCAM^–CD31^–gp38^–)；gp38⁺基质 (CD45^–EpCAM^–CD31^–gp38⁺)；粒细胞(CD45⁺FSC^int/hiSSC^hi)；CD4⁺T细胞 (CD45⁺CD3⁺CD4⁺)；CD8⁺T细胞(CD45⁺CD3⁺CD4^–)；B细胞(CD45⁺CD3^–CD19⁺)；其他单核细胞(CD45⁺CD3^–CD19^–SSC^lo)。对分离的细胞进行处理以提取RNA，并通过qPCR评估Osm和Osmr表达。*p＝0.01–0.05，**p＝0.001–0.01，通过t检验确定。

图26

来自人肠道切除样本(n＝10)的粘膜细胞群体的流式细胞术分析。(A)通过白细胞(CD45⁺)、上皮细胞(CD45^–EpCAM⁺)、内皮细胞(CD45^–EpCAM^–CD31⁺)、gp38^–ICAM-1^lo基质(CD45^–EpCAM^–CD31^–gp38^–ICAM-1^lo)和gp38⁺ICAM-1^hi基质 (CD45^–EpCAM^–CD31^–gp38⁺ICAM-1^hi)的代表性OSMR表面表达。图(B)中提供了全部群体的OSMR⁺频率。使用单因素方差分析与Tukey多重比较检验确定显著性。

图27

(A)由qPCR测定的原代人结肠基质细胞(CCD18Co)中不同细胞因子受体基因的基线表达。指示了OSMR家族中的受体。(B)在用重组OSM、IL-6、TNF或IL-1β(10 ng/ml)刺激CCD18Co细胞20分钟后，对于激活关键信号传导通路的Western印记分析。提供β-肌动蛋白作为上样对照。

图28

(A)根据Hh+αIL10R方案在野生型C57BL/6小鼠中诱导结肠炎，并且实验组接受PBS或0.04mg/kg重组OSM的腹腔内注射(参见“方法”)。通过流式细胞术分析结肠固有层细胞群体，以获得基质和内皮细胞激活的证据。具体而言，对于表面ICAM-1 表达(炎症激活的标志物)和细胞内Ki-67(增殖标志物)，对CD45^–EpCAM^–gp38⁺CD31^–基质细胞和CD45^–EpCAM^–gp38^–CD31⁺内皮细胞染色。n＝4只/组至6只/组。(B)在稳定状态或者在用对照Fc蛋白或O-RFP治疗的小鼠(n＝4只/组至9只/组，代表2次独立实验)中诱导Hh+αIL10R结肠炎后对结肠内皮细胞和gp38⁺基质细胞上的ICAM-1 表面表达进行流式细胞术分析。在结肠炎Osm^–/–小鼠v.s.野生型同窝出生小鼠中观察到类似的结果。*p＝0.01–0.05，**p＝0.001–0.01，使用Mann-Whitney检验确定。

图29

离体培养的小鼠结肠基质细胞的处理，(A)中显示用10ng/ml小鼠OSM、10ng/mlTNF或它们的组合进行处理对2小时后代表性基因表达的影响(n＝6-7个独立培养/ 组)。通过Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验确定显著性。(B)由OSM家族的以下三个主要成员引起的小鼠基质细胞中的应答的相对强度(通过Il6表达的诱导进行测量)：OSM、IL-6和LIF(全部为10ng/ml；n＝2只/组至4只/组，从7个独立培养中汇集)。通过单因素方差分析和Dunnett多重比较检验确定显著性。*p＝0.01–0.05， **p＝0.001–0.01，****p<0.0001。

图30

在可公开获得的转录组数据集GSE57945(回肠CD和对照粘膜)中的人细胞因子和趋化因子基因表达的分层聚类。与OSM表达最强烈相关的基因集在下图中突出显示，并且特征在于：多种与Th1/Th17应答相关的细胞因子和吸引嗜中性粒细胞(例如CXCL1)、单核细胞(例如CCL2/CCL7)和Th1细胞(CXCL9/10/11)的趋化因子。

图31

(A)用10ng/ml的重组人OSM刺激的CCD18Co细胞(人结肠基质细胞)中的基因表达动力学。此处显示的是来自图30中突出显示的不同功能类别的代表性基因： CCL2(单核细胞化学引诱物)；CXCL9(Th1细胞化学引诱物)；CXCL1(嗜中性粒细胞化学引诱物)；和ICAM1(白细胞组织浸润和保留所必需的关键细胞粘附分子)。数据点表示重复的三个培养中的平均(+/–s.e.m.)诱导水平。(B)CCD18Co细胞对LIF(OSM最接近的同源物)没有应答，OSM不通过LIFR(OSM的替代受体亚基)刺激结肠基质细胞。重复的三个培养用10ng/ml的LIF或10ng/ml的OSM(单独或在15μg/ml山羊IgG 对照或15μg/ml抗LIFR多克隆山羊IgG的存在下)刺激2小时。使用单因素方差分析和Tukey多重比较检验确定显著性，****p<0.0001。

图32

用10ng/ml的OSM、IL-6、TNF或它们的组合处理重复的三个CCD18Co培养物2 小时，以评估来自这些细胞因子的刺激的相对强度和可能的协同作用。根据所分析的应答基因，OSM和TNF发挥加和作用和协同作用。

图33

用10ng/ml的OSM、IL-1β、或者OSM和IL-1β处理重复的三个CCD18Co培养物2 小时，以评估这些细胞因子之间的功能性协同作用。根据所分析的应答基因，OSM 和TNF发挥加和作用和协同作用。OSM和IL-β根据分析的应答基因发挥添加和协同作用。使用单因素方差分析和Tukey多重比较检验确定显著性，***p＝0.0001–0.001， ****p<0.0001。

图34

使用从非炎性手术切除样本(n＝3至4个独立培养物/条件)分离和扩增的人结肠基质细胞的原代离体培养物，进行与图32所示相同的处理和分析策略。在进行对照-标准化之前，使用配对t检验确定显著性。

具体实施方式

治疗

本发明在某些方面涉及用抗TNFα治疗、TNFα的拮抗剂、或者OSM和/或OSMR 拮抗剂进行治疗的方法。“抗TNFα治疗”是针对或拮抗TNFα的治疗性处理，例如，施用TNFα的拮抗剂。TNFα、OSM或OSMR的拮抗剂是降低TNFα、OSM或OSMR 功能的试剂。该拮抗剂可以通过任何治疗或预防有效量降低TNFα、OSM或OSMR 的功能。例如，该功能可以适当地降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。拮抗剂可以消除TNFα、OSM或OSMR的功能(即，功能降低100％)。可以通过任何合适的技术测量TNFα、OSM或OSMR功能。

拮抗剂可以是TNFα、OSM或OSMR活性的拮抗剂或者是TNFα、OSM或OSMR 表达的拮抗剂。该拮抗剂可以例如通过减少TNFα、OSM或OSMR的产生或表达，或者增加TNFα、OSM或OSMR的降解，来减少TNFα、OSM或OSMR的量。该拮抗剂可以减少来自细胞的可溶性TNFα或OSM的释放。该拮抗剂可以具有中和或去除可溶性或细胞外TNFα或OSM、和/或受体结合的TNFα或OSM、或/和跨膜TNFα的能力。该拮抗剂可以抑制或防止TNFα或OSM与一种或多种受体的有效结合。该拮抗剂可以降低TNFα、OSM或OSMR的转录。该拮抗剂可以破坏TNFα、OSM或 OSMR的DNA，例如通过使用锌指核酸酶等方法进行位点特异性诱变。该拮抗剂可以降低TNFα、OSM或OSMR的mRNA水平，或者干扰TNFα、OSM或OSMR mRNA 的加工，例如通过反义RNA或RNA干扰。该拮抗剂可以增加TNFα、OSM或OSMR 的蛋白质降解。该拮抗剂可以增加TNFα、OSM或OSMR的天然抑制剂的水平。该拮抗剂可通过诸如磷酸化、泛素化、SUMO化等翻译后修饰降低TNFα、OSM或OSMR 的功能。

TNFα、OSM或OSMR拮抗剂可以对TNFα、OSM或OSMR是特异性的，即其主要或只作用于TNFα、OSM或OSMR，比其他分子优先作用于TNFα、OSM或OSMR。例如，抗TNFα治疗优先作用于TNFα，而不是TNFβ，尽管两种类型的TNF使用相同受体。

OSM和/或OSMR的拮抗剂可以抑制Th17辅助T细胞或Th17CD4⁺T细胞，或 Th17通路的发展。该拮抗剂可以抑制在Th17条件下激活的初始CD4⁺T细胞的扩增。该拮抗剂可以减少或抑制在Th17条件下激活的初始CD4⁺T细胞的存活。该拮抗剂可以增加Th2细胞因子在Th17细胞中的表达。

作为另选或作为补充，OSM和/或OSMR的拮抗剂可以抑制基质和/或病原性纤维化的异常激活。OSM和/或OSMR的拮抗剂可以抑制组织血管分布、白细胞募集和保留、和/或局部炎性过程。OSM和/或OSMR的拮抗剂可以抑制上皮增殖。OSM和/或 OSMR的拮抗剂可以抑制发育异常和肿瘤的发生，这是与慢性肠道炎症相关的严重不良事件。

在某些实施方式中，该拮抗剂是抗体、小分子、蛋白质、肽、多核苷酸、寡核苷酸、反义分子(如反义RNA或吗啉代)、或干扰RNA(如小干扰RNA(siRNA)、小发夹 RNA(shRNA)或经修饰的RNAi治疗前药，诸如中性短干扰核糖核酸(siRNN))。

抗体

在某些情况下，拮抗剂是抗TNFα、抗OSM或抗OSMR抗体，或者它们的抗原 -结合片段，即，特异性结合(如下所限定)TNFα、OSM或OSMR并中和或抑制TNFα、 OSM或OSMR活性的抗体或片段。例如，该拮抗剂可以是纳米抗体(单结构域抗体； sdAb)，或分离或结合的Fab’片段，或者可以是经修饰的Fc区，例如分离的Fcab或与特异性Fab结构域结合的Fcab，其作为双特异性治疗试剂(mAb²)针对替代靶标。在某些情况下，该抗体是双特异性抗体，例如同时靶向OSM和TNFα的双特异性抗体。下文也进一步描述根据本发明使用的抗体。拮抗剂可以是合成的抗原结合支架或合成抗体，例如，对TNFα、OSM或OSMR特异性的Alphabody、Affibody、Affitin、 Anticalin、Monobody或Adnectin。

抗TNFα抗体的实例是英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗或戈利木单抗。

英夫利昔单抗和阿达木单抗是能够中和所有形式(细胞外、跨膜和与受体结合的)TNFα的抗体的实例。英夫利昔单抗(以商标名

出售)是用于治疗炎症和自身免疫性疾病的药物。英夫利昔单抗是包含鼠结合VK和VH结构域和人恒定Fc 结构域的嵌合单克隆抗体。英夫利昔单抗通过以高亲和力结合可溶性(游离血液中)和跨膜(位于T细胞和类似免疫细胞的外膜上)形式的TNFα而中和TNFα的生物学活性，并抑制或防止TNFα与其受体的有效结合。英夫利昔单抗对TNFα具有高度的特异性，并且不会中和TNFβ，尽管TNFβ使用与TNFα相同的受体。英夫利昔单抗已被美国食品和药物管理局批准例如用于治疗银屑病、儿科克罗恩氏病、强直性脊柱炎、克罗恩氏病、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎。

阿达木单抗(以商标名

出售)也结合TNFα，防止其激活TNF受体。阿达木单抗构建自完全的人单克隆抗体，而英夫利昔单抗是小鼠-人类嵌合抗体。阿达木单抗已被美国食品和药物管理局批准例如用于治疗类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、银屑病和幼年特发性关节炎。

抗TNF治疗可以包括施用针对TNF受体的中和抗体。通常，针对TNF受体的中和抗体是针对TNFR1受体，例如人野生型TNFR1受体的中和抗体。针对TNFR1 受体的中和抗体的实例包括但不限于atrosab。Atrosab结合人TNFR1的1至70位氨基酸并选择性抑制TNFR1介导的信号传导。

抗OSM抗体的实例描述于US2014099315(A1)和WO2012069433(A2)。

抗OSMR抗体的实例描述于WO2014194274(A2)和WO2013168829(A1)。

非功能形式和融合蛋白

拮抗剂可以是TNFα、OSM或OSMR的功能降低形式或无功能形式，其可与天然(即野生型)TNFα、OSM或OSMR竞争，从而拮抗天然TNFα、OSM或OSMR的功能。功能降低形式的功能可以降低/减少任何量。例如，与野生型TNFα、OSM或 OSMR相比，功能可以降低/减少至少10％、至少30％、至少40％、至少50％、至少 60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。

人类TNFαmRNA的mRNA序列(GenBank登录号NM_000594.3)示于SEQ ID NO. 1。其氨基酸序列示于SEQ ID NO:2(NP_000585.2)。人OSM mRNA的mRNA序列 (GenBank登录号NM_020530.4)示于SEQ ID NO.3。其氨基酸序列示于SEQ ID NO:4 (NM_020530.4)。人类OSMRmRNA的mRNA序列(GenBank登录号NM_003999.2) 示于SEQ ID NO.5。其氨基酸序列示于SEQID NO:6(NP_003990.1)。拮抗剂可以是 SEQ ID NO:2、4或6或其任意同种型的功能降低的变体或无功能的变体。功能降低的变体是具有从NO:2、4或6或其任意同种型的基酸序列变化而来的氨基酸序列并且行使TNFα、OSM或OSMR功能的能力降低的蛋白质。无功能的变体是具有从 NO:2、4或6或其任意同种型的基酸序列变化而来的氨基酸序列并且不具有行使TNFα、OSM或OSMR功能的能力的蛋白质。

例如，OSMR无功能的变体可以在形成二聚体受体或在与信号传导通路相互作用的位点中具有一个或多个突变。OSMR的无功能变体也可以是隔离OSM的截短形式。无功能的变体也可以是隔离OSM的可溶形式受体。

可以使用本领域已知的任何方法测定变体行使TNFα、OSM或OSMR功能的能力。功能降低的和无功能的变体的比较功能能力通常在与野生型TNFα、OSM或 OSMR(如SEQ ID NO:2、4或6)相比的情况下进行测量。

在NO:2、4或6或其任意同种型的氨基酸序列的整个长度上，变体可以与上述序列基于氨基酸同一性至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同源。在成段的200个以上(例如300、400、500、600、700、800、1000、1500或2000个以上)的连续氨基酸上可以具有至少80％(例如至少85％、90％或95％)的氨基酸同一性(“硬同源”)。

本领域的标准方法可用于确定同源性。例如，UWGCG软件包提供了可用于计算同源性的BESTFIT程序，例如使用其默认设置(Devereux等(1984)Nucleic Acids Research 12，第387-395页))。PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或排序序列 (例如识别等同残基或相应序列(通常采用其默认设置))，例如Altschul SF(1993)J Mol Evol 36：290-300；Altschul，S.F等(1990)J Mol Biol 215：403-10中所述。用于进行 BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。

变体可以包括NO:2、4或6或其任意同种型的片段。这样的片段通常保留NO:2、 4或6或其任意同种型的至少一个功能结构域，例如结合结构域，但无功能。片段长度可以是至少600个、700个、800个或900个氨基酸。一个或多个氨基酸可以替代地或额外添加到上述多肽中。

拮抗剂可以是包含TNFα、OSM或OSMR(或如上所述TNFα、OSM或OSMR的蛋白片段)和异源蛋白序列的融合蛋白或嵌合体。融合蛋白可以作为TNFα、OSM或 OSMR欺骗性结合配偶体，从而抑制TNFα、OSM或OSMR活性。在一个实施方式中，拮抗剂是OSM受体融合蛋白，例如包含OSMR、gp30和诸如IgG2A的Fc区等免疫球蛋白Fc区。

在一个实施方式中，嵌合体是可溶性TNFα或OSM受体嵌合体。可溶性TNF受体嵌合体的实例包括但不限于：来那西普(lenercept)和依那西普(etanercept)。依那西普结合TNFα并降低其在人和其他动物的涉及过度炎症的疾病中中的作用，所述疾病包括：自身免疫性疾病，如强直性脊柱炎、幼年型类风湿性关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎，和潜在由过量的TNFα介导的多种其他疾病。

核酸

拮抗剂可以是针对TNFα、OSM或OSMR的经修饰的核酸，例如，适体。拮抗剂可以是编码TNFα、OSM或OSMR的拮抗剂或无功能变体的多核苷酸。拮抗剂或无功能变体可以是本文所讨论的任何一种。

多核苷酸，诸如核酸，是包含两个以上核苷酸的聚合物。核苷酸可以是天然存在的或人造的。核苷酸通常含有核碱基、糖和至少一个连接基团，例如磷酸酯、2'O-甲基、2'甲氧基-乙基、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯或硫代磷酸酯基团。核碱基通常是杂环。核碱基包括但不限于嘌呤和嘧啶，更具体地，包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶 (T)、尿嘧啶苷(U)和胞嘧啶(C)。糖通常是戊糖。核苷酸糖包括但不限于核糖和脱氧核糖。核苷酸通常是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。核苷酸通常包含一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。磷酸酯可以连接在核苷酸的5'或3'侧。

核苷酸包括但不限于：单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、单磷酸鸟苷(GMP)、二磷酸鸟苷(GDP)、三磷酸鸟苷(GTP)、单磷酸胸苷(TMP)、二磷酸胸苷(TDP)、三磷酸胸苷(TTP)、单磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、单磷酸胞苷(CMP)、二磷酸胞苷(CDP)、三磷酸胞苷(CTP)、5-甲基胞苷单磷酸、5-甲基胞苷二磷酸、5-甲基胞苷三磷酸、5-羟甲基胞苷单磷酸、5-羟甲基胞苷二磷酸、5-羟甲基胞苷三磷酸、环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、脱氧单磷酸腺苷(dAMP)、脱氧二磷酸腺苷(dADP)、脱氧三磷酸腺苷(dATP)、脱氧单磷酸鸟苷 (dGMP)、脱氧二磷酸鸟苷(dGDP)、脱氧三磷酸鸟苷(dGTP)、脱氧单磷酸胸苷(dTMP)、脱氧二磷酸胸苷(dTDP)、脱氧三磷酸胸苷(dTTP)、脱氧单磷酸尿苷(dUMP)、脱氧二磷酸尿苷(dUDP)、脱氧三磷酸尿苷(dUTP)、脱氧单磷酸胞苷(dCMP)、脱氧二磷酸胞苷(dCDP)和脱氧三磷酸胞苷(dCTP)、5-甲基-2'-脱氧单磷酸胞苷、5-甲基-2'-脱氧二磷酸胞苷、5-甲基-2'-脱氧三磷酸胞苷、5-羟甲基-2'-脱氧单磷酸胞苷、5-羟甲基-2'-脱氧二磷酸胞苷和5-羟甲基-2'-脱氧三磷酸胞苷。核苷酸优选选自AMP、TMP、GMP、 UMP、dAMP、dTMP、dGMP或dCMP。

核苷酸可以包含其他修饰。特别是，适合的经修饰的核苷酸包括但不限于：2'- 氨基嘧啶(例如2'-氨基胞苷和2'-氨基尿苷)、2'-羟基嘌呤(例如2'-氟嘧啶(如2'-氟胞苷和2'-氟尿苷)、羟基嘧啶(如5'-α-P-硼烷尿苷)、2'-O-甲基核苷酸(如2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基鸟苷、2'-O-甲基胞苷和2'-O-甲基尿苷)、4'-巯基嘧啶(如4'-巯基尿苷和4'-巯基胞苷)和具有核碱基修饰的核苷酸(如作为5-戊炔基-2'-脱氧尿苷、5-(3-氨基丙基)-尿苷和1,6-二氨基己基-N-5-氨基甲酰基甲基尿苷)。

多核苷酸中的一个或多个核苷酸可被氧化或甲基化。多核苷酸中的一个或多个核苷酸可能被损坏。例如，多核苷酸可以包含嘧啶二聚体。这种二聚体通常与紫外线的损伤有关。

多核苷酸中的核苷酸可以以任何方式彼此连接。核苷酸可以通过磷酸酯、2'O-甲基、2'甲氧基-乙基、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯键连接。核苷酸通常如在核酸中一样通过其糖和磷酸酯基团连接。核苷酸可以如在嘧啶二聚体中一样通过其核碱基连接。

多核苷酸可以是核酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。多核苷酸可以是本领域已知的任何合成核酸，如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)、吗啉代核酸或其他具有核苷酸侧链的合成聚合物。多核苷酸可以是单链或双链的。

可以使用本领域的标准方法衍生和复制多核苷酸序列，例如使用涉及特异性引物的PCR、重组可复制(克隆)载体和合适的宿主细胞。通常使用这种标准技直接术产生多核苷酸序列。

反义和RNAi

TNFα、OSM或OSMR的拮抗剂可以减少个体中存在的TNFα、OSM或OSMR 的量，例如通过敲减TNFα、OSM或OSMR的表达。用于敲减蛋白质表达的反义RNA 和RNA干扰(RNAi)技术是本领域公知的，并且可以采用标准方法敲减TNFα、OSM 或OSMR的表达。

反义和siRNA技术都会干扰mRNA。反义寡核苷酸通过与mRNA的一部分结合 (杂交)来干扰mRNA。因此，反义寡核苷酸被设计为与mRNA互补(尽管如下讨论的那样寡核苷酸不必具有100％的互补性)。换句话说，反义寡核苷酸可以是cDNA的一部分。同样，寡核苷酸序列可以不与cDNA序列100％相同。这也在下面讨论。

RNAi涉及使用可以结合mRNA并抑制蛋白质表达的双链RNA，如小干扰 RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)。

因此，拮抗剂可以包含与TNFα、OSM或OSMR的mRNA中的特定序列(以下称为靶序列)特异性杂交的寡核苷酸。寡核苷酸是通常具有50个以下核苷酸、40个以下、30个以下、22个以下、21个以下、20个以下、10个以下或5个以下核苷酸的短核苷酸聚合物。本发明中使用的寡核苷酸的长度优选为20个至25个核苷酸，更优选长度为21至22个核苷酸。核苷酸可以是天然存在的或人造的。核苷酸可以是上述核苷酸中的任何一种。

靶序列的长度通常对应于寡核苷酸的长度。例如，21个或22个核苷酸的寡核苷酸通常与21个或22个核苷酸的靶序列特异性杂交。因此，靶序列可以是上文参照寡核苷酸长度讨论的任何长度。靶序列通常是靶多核苷酸内的连续核苷酸。

当寡核苷酸优先或以高亲和力与靶序列杂交，但与其他序列基本上不杂交、不杂交、或以低亲和力杂交时，寡核苷酸“特异性杂交”靶序列。

如果寡核苷酸与靶序列杂交的熔解温度(Tm)比与其他序列杂交的Tm高至少 2℃(如至少3℃、至少4℃、至少5℃、至少6℃、至少7℃、至少8℃、至少9℃或至少10℃)，则寡核苷酸“特异性杂交”。寡核苷酸与靶序列杂交的Tm更优选比与其他序列杂交的Tm高至少2℃(如至少3℃、至少4℃、至少5℃、至少6℃、至少7℃、至少8℃、至少9℃、至少10℃、至少20℃、至少30℃或至少40℃)。该部分与靶序列杂交的T_m优选比与和靶序列相差一个或多个核苷酸(如1、2、3、4或5个以上核苷酸)的序列杂交的Tm高至少2℃(如至少3℃、至少4℃、至少5℃、至少6℃、至少7℃、至少8℃、至少9℃、至少10℃、至少20℃、至少30℃或至少40℃)。该部分通常以至少90℃(如至少92℃或至少95℃)的Tm与靶序列杂交。Tm可以使用已知技术进行实验性测量，包括使用DNA微阵列，或者可以使用可公开获得的Tm计算器(如通过互联网获得的Tm计算器)来计算Tm。

允许杂交的条件在本领域是公知的(例如，Sambrook等，2001，MolecularCloning： a laboratory manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；和Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Ausubel等编，Greene Publishingand Wiley-Interscience， New York(1995))。杂交可以在低严格条件下进行，例如在37℃时在30％至35％甲酰胺、1M NaCl和1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液的存在下进行，然后在50℃在1× (0.1650M Na⁺)至2×(0.33M Na⁺)SSC(标准柠檬酸钠)中冲洗。杂交可以在中度严格条件下进行，例如在37℃时在40％至45％甲酰胺、1M NaCl和1％SDS的缓冲溶液的存在下进行，然后在55℃时在0.5×(0.0825M Na⁺)至1×(0.1650M Na⁺)SSC中冲洗。杂交可以在高严格条件下进行，例如在37℃时在50％甲酰胺、1M NaCl，1％SDS的缓冲溶液的存在下进行，然后在60℃时在0.1×(0.0165M Na⁺)SSC中冲洗。

寡核苷酸可以包含与靶序列基本互补的序列。通常，寡核苷酸是100％互补的。然而，较低的互补水平也可以接受，例如95％、90％、85％甚至80％。低于100％的互补性是可接受的，只要寡核苷酸与靶序列特异性杂交即可。因此，寡核苷酸可能在 5、10、15、20、21、22、30、40或50个核苷酸的区域中具有1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10个以上的错配。

寡核苷酸可以包含上述任何核苷酸，包括经修饰的核苷酸。寡核苷酸可以是核酸，如任何上述核酸。寡核苷酸优选为RNA。寡核苷酸可以是单链的。寡核苷酸可以是双链的。寡核苷酸可以包含发夹。寡核苷酸可以使用本领域已知的标准技术合成。作为另一种选择，寡核苷酸可以是市售的。

在某些情况下，本发明涉及除抗TNFα治疗之外的治疗。在某些情况下，个体具有炎性疾病或病症，并且治疗是施用抗炎剂，例如皮质类固醇。

在某些情况下，已经根据下面描述的本发明的方法对个体进行诊断或预后预测。

“TNFα介导的疾病或病症”是可以用抗TNFα治疗或通常对抗TNFα治疗应答的疾病或病症，即根据用于治疗该特定疾病或病症的标准医学知识和/或实践。术语中包括这样的疾病或病症，即使抗TNFα治疗通常不是该疾病或病症的常见或一线治疗选择，或者如果已知高比例的具有该疾病或病症的个体是非应答性的，但只要该治疗被认为是某些患者的有效治疗方法即可。TNFα介导的疾病或病症可以是抗TNFα治疗或TNFα拮抗剂被监管批准用于治疗的疾病或病症。TNFα介导的疾病或病症可以是慢性肠道炎症、自身免疫性疾病或炎性疾病。TNFα介导的疾病或病症的实例是 IBD、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、诸如银屑病等炎症性皮肤病(例如慢性重度斑块性银屑病)、化脓性汗腺炎和哮喘。在某些情况下，TNFα介导的疾病或病症是银屑病。

IBD是指结肠和小肠的一类炎症病症，有时也影响消化道的其他区域。克罗恩氏病(包括结肠和回肠克罗恩氏病)和溃疡性结肠炎是IBD的最常见形式。其他形式包括胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、转移性结肠炎、

结肠炎、不确定性结肠炎和急性重度结肠炎，其例如包括用于治疗癌症时用免疫检查点抑制剂生物疗法治疗引起的急性重度结肠炎。IBD也是结肠直肠癌发展的危险因素。在某些情况下，根据本发明，IBD与肠癌有关。在某些情况下，本发明用于治疗、诊断或预后预测具有严重的溃疡性结肠炎、暴发性溃疡性结肠炎或有毒巨结肠炎的患者，或常规治疗(无论是生物学还是非生物学)失败的患者，如环孢菌素或英夫利昔单抗，无论疾病严重程度或表现如何。

慢性肠道炎症是伴随复发-缓解过程的一系列影响胃肠道的病症，其涉及异常的炎症应答和组织损伤。慢性肠道炎症病症包括溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、不确定性结肠炎、微小结肠炎(包括胶原和淋巴细胞性结肠炎)、难治性乳糜泻(口炎性腹泻)、难治性嗜酸性胃肠道炎症、嗜酸细胞性食管炎、慢性憩室疾病和转移性结肠炎。

如实施例所示，当共同施用于人肠基质细胞时，OSM显示出与TNFα和IL-1β的协同作用。OSM和/或OSMR的拮抗剂优选与抗TNFα治疗和/或IL-1β拮抗剂组合施用。下面将更详细地讨论抗TNFα治疗。IL-1β的拮抗剂可以是以上对OSM和/或 OSMR定义的任何类型的拮抗剂。批准的IL-1β拮抗剂的实例包括但不限于：阿那白滞素(重组IL-1受体拮抗剂)、利纳西普(可溶性IL-1受体)和康纳单抗(抗IL-1βmAb)。 IL-1β的各种其他拮抗剂在临床开发中(参见Dinarello等，Nat Rev Drug Discovery， 2012)。该方法可以包括使用双特异性抗体，例如同时靶向OSM或OSMR和IL-1β的双特异性抗体。下面将进一步描述根据本发明使用的抗体。

组合意味着所述治疗可以同时对个体施用。作为相同治疗方案的一部分，治疗可以以任何顺序单独或依次施用于个体。

本发明还提供了这样的产品：包含(a)OSM和/或OSMR的拮抗剂和(b)抗TNFα治疗和/或IL-1β拮抗剂，以同时、分别或顺序应用于在个体中治疗慢性肠道炎症和/ 或IBD。

诊断/预后

本发明在某些方面涉及诊断或预后的方法。诊断包括确定个体是否具有疾病或病症和/或确定疾病或病症的严重程度。预后包括预测个体是否会发展疾病或病症，他们是否需要治疗，个体需要的治疗类型，他们是否对治疗作出应答，他们是否和/或何时将发生疾病发作、再发或复发，以及症状或疾病发作、再发或复发的严重程度或持续时间。

该方法包括测量个体中的OSM和/或OSMR。在某些情况下，同时测量OSM和 OSMR，并与参考OSM和OSMR水平或参考样品的OSM和OSMR水平进行比较，以确定OSM指数(OSMi)。OSMi近似于两个以上直接可比较的样品中的活性OSM-OSMR 信号传导的相对概率。OSMi的理论基础如下：根据已发表的文献，人体组织中OSM 的主要受体是由一个gp130链和一个OSMR链组成的异源二聚体。Gp130在大多数人类细胞类型和组织中不加区分地高表达；与此相反，OSMR表达受到更严格的调节并且限于特定的细胞类型和病症。因此，OSMR是OSM受体复合物的限制因素。OSM类似地以受控的方式表达；因此，以1:1化学计量相互作用的OSM和OSMR是控制OSM 通路活性的主要限制因素。组织样品中的相对OSM或OSMR表达直接对应于该系统中活性OSM信号传导的理论可能性。OSMi是由直接可比样品组成的数据集内的样品中 OSM和OSMR的相对表达的乘积。

计算OSMi的实例如下：我们有两个肠粘膜活检，一个来自对照患者，一个来自 IBD患者。使用定量PCR，我们发现了样品中OSM和OSMR的mRNA水平均相对于其相应的管家基因水平(例如RPLP0)。这些数字是：

对照：

OSM—0.000058；OSMR—0.00083

IBD：

OSM—0.0022；OSMR—0.0073

IBD样本中OSM的表达高于对照样品的38倍。IBD样本中OSMR的表达高于对照样品的8.8倍。因此，如果我们将对照样品的OSMi指定为1，舍入到两个有效数字的IBD 样本的OSMi＝38×8.8＝330。

为了正确说明OSMi，必须相对于适当的参考值计算输入值(即相对OSM和OSMR 表达)。取决于具体情况，这可能采取几种形式。在这里的实例中，IBD样本的逻辑比较物是健康对照样品。在以下实例中包含的数据中，使用给定数据集中的中位数作为比较物来计算OSMi值。为了在临床情况下计算OSMi，可以对每个测定使用一致的参考样品，例如一组永生化细胞系中的平均OSM/OSMR表达。

本发明的诊断或预后预测方法可以结合一种或多种其他测定或测试进行，以细化诊断或预后。例如，可以在分析中包括其他标志物。例如用于IBD的诊断/预后的血清 C反应蛋白(CRP)。S100A8是肠道炎症严重程度的生物标志物。粪便钙卫蛋白通常在临床上作为粘膜炎症的指标进行测定。

在某些情况下，诊断或预后预测的方法是预测从慢性肠道炎症和/或IBD中缓解的个体是否会发生疾病复发的方法。预测个体是否会发生复发，包括确定个体会发生复发的可能性，和/或预测他们何时会发生复发。在某些情况下，个体处于用抗TNFα疗法，例如本文所述的抗TNFα疗法治疗后的缓解过程中。

在某些情况下，预后预测的方法是预测个体是否对抗TNFα治疗或者抗OSM或抗OSMR治疗(例如，OSM和/或OSMR的拮抗剂)做出应答。预测个体是否应答包括确定个体将作出应答的可能性和/或预测个体作出应答的程度，例如个体的症状通过治疗缓解的程度。

个体对抗TNFα或抗OSM/OSMR治疗的预测应答性意味着预期该个体从接受抗 TNFα或抗OSM/OSMR治疗中获益或达到足够程度的益处。个体对抗TNFα或抗 OSM/OSMR治疗的预测非应答性意味着个体不会从接受抗TNFα或抗OSM/OSMR 治疗中获益或达到足够程度的益处。预测应答的方法可以在施用抗TNFα或抗 OSM/OSMR治疗之前进行。然后可以在为个体选择或推荐合适的治疗时考虑所述预测。作为另一种选择，该方法可以在用抗TNFα或抗OSM/OSMR治疗后进行，并用于监测和预测个体对治疗的应答。通常，该方法用于预测个体是否对抗TNFα或抗 OSM/OSMR治疗的治疗具有原发性应答，即个体是否在第一次接受治疗时应答。在某些情况下，该方法是用于预测次发性非应答性，即最初对治疗作出应答的个体是否稍后将停止对治疗的应答或将对治疗应答不太好。

根据本发明，与参考样品或参考水平相比，个体中OSM、OSMR和/或OSMi水平的升高指示涉及疾病存在的阳性诊断，例如个体具有相关疾病或病症或者有更严重的疾病。OSM、OSMR和/或OSMi水平的升高指示不良预后，即个体的预测结果不良，例如个体不会对抗TNFα治疗作出应答，从疾病中缓解的个体将会复发或者个体发展疾病或病症风险增加。相反，OSM、OSMR和/或OSMi水平的降低表明阴性诊断，例如个体不具有相关疾病或病症或者具有较不严重的疾病。OSM、OSMR和/或 OSMi水平的降低表明预后良好，这对患者来说是一个很好的结果，例如个体将对抗 TNFα治疗作出应答，或者从疾病中缓解的个体不会复发或不增加发展疾病或病症的风险。为了诊断个体是否患有疾病或病症，参考样品或水平通常表示不具有相关疾病或病症，或者疑似具有该疾病或病症但随后证实不具有该疾病或病症的个体的OSM、 OSMR或OSMi的基线水平。同样可以选择合适的参考样品或水平用于本文所述的其他诊断方法或预后预测方法。

诊断或预后预测的方法可以包括为个体选择或推荐合适的治疗，即基于诊断或预后。然后可以向个体施用所选择的或推荐的治疗。例如，在某些情况下，与参考样品或参考水平相比，OSM、OSMR和/或OSMi水平的降低表明个体将对抗TNFα治疗作出应答。于是可以选择或推荐抗TNFα治疗，然后可以进一步向该个体施用。在其他情况下，与参考样品或参考水平相比，OSM、OSMR和/或OSMi水平的升高表明个体不会对抗TNFα治疗作出应答。因此不向该个体施用抗TNFα治疗。此外，可以选择或推荐用于个体治疗的除了抗TNFα治疗之外的治疗，然后可以进一步向个体施用。

在本发明的所有方面，具有疾病或病症(例如IBD或慢性肠道炎症)的个体包括疑似具有疾病或病症的个体和/或具有发展疾病或病症风险的个体。例如，个体可能没有被正式诊断，但是由于存在一种或多种症状，可能疑似具有该疾病或病症。IBD和/或慢性肠道炎症的症状包括腹部或盆腔疼痛、痉挛或肌肉痉挛、呕吐、腹泻、直肠出血、体重减轻、发热和贫血。如果个体具有与疾病或病症相关的一种或多种风险因素和/或增加其对疾病或病症易感性的一个或多个倾向，那么该个体可以被认为有发展疾病或病症的风险。IBD和/或慢性肠道炎症的危险因素包括遗传倾向和用抗生素治疗。

该方法优选还包括测量个体中的TNFα和/或IL-1β，从而对个体中的慢性肠炎症和/或IBD进行诊断或预后预测。该方法优选还包括同时测量TNFα和IL-1β。TNFα和/或IL-1β可用以下述用于OSM和/或OSMR的任何方式测量。该方法优选还包括测量个体中的TNFα和/或IL-1β，将TNFα和/或IL-1β水平与参考TNFα和/或IL-1β水平或参考样品的TNFα和/或IL-1β水平进行比较，并测定TNFα和/或IL-1β(TNFαi 和/或IL-1βi)。与参考样品或参考水平相比或者使用参考样品或参考水平进行计算， TNFα和/或IL-1β或TNFαi和/或IL-1βi水平的升高通常指示阳性诊断、不良预后和/ 或个体会发生复发。与参考样品或参考水平相比或者使用参考样品或参考水平进行计算，TNFα和/或IL-1β或TNFαi和/或IL-1βi水平的降低指示阴性诊断、良好预后和/ 或个体将不会复发。

本发明还提供了确定个体慢性肠道炎症和/或IBD的严重程度的方法。本发明还提供了确定具有慢性肠道炎症和/或IBD的个体需要外科手术的可能性的方法。这两种方法都包括测量个体中的OSM和/或OSMR。该方法通常包括测量个体中的OSM 和OSMR，将OSM和OSMR水平与参考OSM和OSMR水平或参考样品的OSM和 OSMR水平进行比较，以及确定OSM指数(OSMi)。其可以如上所述实现。与参考样品或参考水平相比或者使用参考样品或参考水平进行计算，OSM、OSMR和/或OSMi 水平的升高指示该疾病是严重的和/或该个体可能需要外科手术。与参考样品或参考水平相比或者使用参考样品或参考水平进行计算，OSM、OSMR和/或OSMi水平的降低指示该疾病是不严重的和/或该个体不可能需要外科手术。

在这种情况下，严重程度是指目前通过标准内窥镜和组织病理学评估确定的疾病强度。这与患者的治疗难治状态有关，具有较高疾病严重程度的患者对药物干预的应答较少，因此有较高风险需要外科手术干预。手术通常涉及去除GI道的受影响区域并修复相关并发症，这取决于具体情况而变化。例如，具有克罗恩氏病(CD)的患者通常需要去除离散的肠纤维化区域，而某些溃疡性结肠炎(UC)患者可能需要彻底去除结肠。某些患者将需要额外的手术干预，例如矫正瘘管或构造造口。

为了确定疾病的严重性或手术的可能性，参考样品或水平通常表示具有不需要手术的轻度形式的疾病或病症的个体的OSM、OSMR或OSMi的基线水平。参考样品或水平可以表示不具有相关疾病或病症，或者疑似具有该疾病或病症但随后被证实不具有该疾病或病症的个体中的OSM、OSMR或OSMi的基线水平。

关心的个体通常是哺乳动物，例如灵长类动物、啮齿动物(包括小鼠和大鼠)或其他常见实验室动物、家畜或农业动物，其包括但不限于兔、狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、猪等。个体可以是人类。

OSM和/或OSMR的检测

通常在获自个体的生物样品中体外测量OSM或OSMR的水平。样品可以包括个体的体液。液体样品例如可以是血液、血浆、血清、粪便、尿液、脑脊液或关节液样品。

作为另一种选择，样品可以包括组织样品。通常，组织样品来自受到疾病或病症影响的身体部分。例如，当疾病或病症是IBD或慢性肠道炎症时，组织样品可以是肠活检(例如肠粘膜活检)或手术切除样品。

样品可以在测定之前进行处理，例如通过离心或提取DNA、RNA或蛋白质。样品也可以在测定之前储存，优选低于-70℃储存。

可采用本领域已知的标准方法测定OSM或OSMR的水平。这些方法通常涉及使用与相关蛋白结合或与相关蛋白反应的试剂。可以将试剂与来自个体的样品接触，并测试测量试剂和相关蛋白之间的复合物形成或者反应。该试剂通常特异性结合该蛋白质。该试剂可以是特异性针对该蛋白质的抗体或者是结合该蛋白质的适体。当其优选或以高亲和力结合蛋白质而基本上不结合、不结合或仅以低亲和力结合其他蛋白质时，本文所述的抗体或其他试剂“特异性结合”该蛋白质。例如，如果其以1×10-7M以下，更优选5×10-8M以下，更优选1×10-8M以下或更优选5×10-9M以下的Kd结合，则抗体或类似试剂优选或以高亲和力结合。如果其以1×10-6M以上，更优选1×10-5M 以上，更优选1×10-4M以上，更优选1×10-3M以上，甚至更优选1×10-2M以上的 Kd结合，则抗体以低亲和力结合。用于确定化合物(例如抗体或抗体构建体和寡核苷酸)的特异性结合能力的竞争性结合或免疫放射测定法的各种方案是本领域公知的 (例如参见Maddox等，J.Exp.Med.158，1211-1226，1993)。

评估OSM或OSMR水平的方法包括抗原捕获试纸测定和酶联免疫吸附测定(ELISA)。ELISA通常使用本领域技术人员已知的夹心技术或竞争技术进行。本发明还可以在直接传感技术中使用OSM或OSMR的抗体，直接传感技术包括但不限于基于表面等离子体共振、表面声波、石英晶体微量天平、微量热法或电化学阻抗谱的技术。特异性OSM mAb可用于基于单克隆抗体的免疫层析条带测试，以检测生物流体中的 OSM水平。经修饰的寡核苷酸适体可以用作使用Somalogic Platform的多重分析物检测系统的一部分。OSMR表达水平可以例如通过流式细胞术或通过对患者肠组织的组织切片的定量免疫组织化学分析来确定。OSM和OSMR mRNA水平都可以通过RNA 分析方法进行准确定量，RNA分析方法包括qRT-PCR和下一代测序。

抗体

用于本发明方法的抗体可以是整个抗体或其能够结合相关蛋白的片段。抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可以通过本领域已知的任何合适的方法制备。例如，可以在合适的条件下用HBP免疫哺乳动物(通常是兔或小鼠)，并从例如所述哺乳动物血清中分离抗体分子，从而获得多克隆抗体。单克隆抗体可以通过杂交瘤或重组方法获得。

通常，抗体是哺乳动物抗体，例如灵长类、人类、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、兔、羊、猪、马或骆驼抗体。抗体可以是骆驼抗体或鲨鱼抗体。抗体可以是纳米抗体 (单结构域抗体；sdAb)。抗体可以是抗体的任何类别或同种型，例如IgM，但优选为 IgG。可用于该方法的全抗体的片段包含抗原结合位点，例如，Fab或F(ab)2片段或 ScFV。整个抗体或片段可以是分离的抗体或其片段，或者可以与其他部分相连或复合，或者可以是融合蛋白的形式。在一个实施方式中，抗体是包含来自不同天然抗体的序列的嵌合抗体，例如人源化抗体。

药物组合物和施用模式

用于本文所述治疗方法的试剂可以配制成药物组合物。除了治疗活性成分之外，这些组合物可以包含本领域技术人员熟知的药学上可接受的赋形剂、载体、稀释剂、缓冲液、稳定剂或其他材料。这些材料应该是无毒的，不应干扰活性成分的功效。药物载体或稀释剂可以例如是等渗溶液。

载体或其他材料的精确性质可取决于施用途径，例如口服、静脉内、皮肤或皮下、鼻、肌内和腹腔内途径。合适的组合物和施用方法的实例在Esseku和Adeyeye(2011) 及Vanden Mooter G(2006)中提供。例如，固体口服形式可以含有活性物质以及稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙、和/或聚乙二醇；粘合剂，例如淀粉、阿拉伯树胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；分解剂，例如淀粉、藻酸、藻酸盐或淀粉羟乙酸钠；泡腾起泡混合物；染料；甜味剂；润湿剂，如卵磷脂、聚山梨醇酯、月桂基硫酸盐；及通常用于药物制剂中的无毒和药理学惰性物质。这样的药物制剂可以以已知的方式制备，例如通过混合、制粒、压片、包糖衣或薄膜包衣工序。

口服制剂包括通常使用的赋形剂，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉剂的形式，并含有10％至95％的活性成分，优选25％至70％。当药物组合物被冻干时，冻干材料可以在施用之前被重构，例如悬浮液。重构优选在缓冲液中进行。

可向个体口服施用的胶囊、片剂和丸剂可提供有肠溶衣，其例如包括Eudragit“S”、Eudragit“L”、乙酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素或羟丙基甲基纤维素。

用于口服施用的液体分散体可以是糖浆、乳剂或悬浮液。糖浆可以包含例如具有甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇的蔗糖或蔗糖作为载体。

悬浮液和乳剂可以包含例如天然胶、琼脂、藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇作为载体。用于肌内注射的悬浮液或溶液可以含有活性物质以及药学上可接受的载体，例如，无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇等(如丙二醇)，和必要时的适量的盐酸利多卡因。

用于静脉内施用或输注的溶液可以包含例如无菌水作为载体，或者优选地，它们可以是无菌水性等渗盐水溶液的形式。

对于栓剂，传统的粘合剂和载体可例如包括聚亚烷基二醇或甘油三酸酯；这种栓剂可以由含有0.5％至10％，优选1％至2％范围内的活性成分的混合物形成。

多核苷酸或寡核苷酸抑制剂可以是裸核苷酸序列或与阳离子脂质、聚合物或靶向系统组合。它们可能通过任何可用的技术递送。例如，多核苷酸或寡核苷酸可以通过针头注射，优选皮内、皮下或肌内注射引入。作为另一种选择，多核苷酸或寡核苷酸可以使用诸如颗粒介导的基因递送等递送装置直接递送穿过皮肤。多核苷酸或寡核苷酸可以局部施用于皮肤，或者例如通过鼻内、口服或直肠内施用于粘膜表面。

多核苷酸或寡核苷酸构建体的摄取可以通过几种已知的转染技术增强，例如包括使用转染试剂的转染技术。这些试剂的实例包括阳离子试剂，例如磷酸钙和DEAE- 葡聚糖和脂质体，例如lipofectam和transfectam。可以改变多核苷酸或寡核苷酸的施用剂量。

施用通常是“预防有效量”或“治疗有效量”(视情况而定，尽管预防可以被认为是治疗)，这足以显示对个体的益处，例如，预防或延缓疾病或病症发作、改善一种或多种症状、诱导或延长缓解、或延缓再发或复发的有效量。

剂量可以根据各种参数来确定，特别是根据所使用的物质；待治疗个体的年龄、体重和病症；施用途径；和所需的方案。医生将能够决定任何特定个体所需的施用途径和剂量。根据上述条件，典型的每日剂量为约0.1mg/kg体重至50mg/kg体重。剂量可以以单一剂量提供，或者可以以多个剂量提供，例如每隔一定时间间隔施用，例如每小时施用2个、3个或4个剂量。通常，多核苷酸或寡核苷酸抑制剂以1pg至1mg，优选1pg至10μg核酸的范围施用用于颗粒介导的递送，并且以10μg至1mg的范围施用用于其他路径。

上述技术和方案的实例可以在以下文献中找到：Remington's PharmaceuticalSciences，第20版，2000，pub.Lippincott，Williams&Wilkins。

组合物可以单独施用或与其他治疗组合物或治疗(例如作为辅助治疗)组合施用。其他治疗组合物或治疗可以例如是本文讨论的那些中的一种或多种，并且可以与本发明的组合物或治疗同时或依次施用。

慢性肠道炎症的标准现有治疗包括5-ASA(氨基水杨酸)、各种抗生素、皮质类固醇(例如布地奈德、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、强的松龙和强的松)、硫唑嘌呤、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、环孢菌素、抗TNF抗体(例如英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗)、抗α4β7整联蛋白抗体(例如，韦多珠单抗)。靶向OSM 和/或OSMR的试剂或者OSM和/或OSMR的拮抗剂可以与上述任何试剂组合使用。临床数据表明，接受抗TNF治疗和非生物治疗组合的IBD患者比接受单独抗TNF或单独非生物治疗的患者具有更高的临床应答率(Colombel等，2010，N Engl J Med；1383-95 及Panaccione等，2014，Gastroenterology；392-400)。尽管关于组合不同生物治疗的数据有限，但有科学的理由相信将抗OSM/OSMR试剂与抗TNF治疗结合可具有益处，因为OSM和TNF可以对靶细胞发挥协同作用(例如OSM和TNF协同诱导结肠基质细胞的IL-6表达)。作为另一种选择，可以使用具有两种以上靶标特异性的单试剂生物治疗 (例如靶向OSM和TNF的双特异性抗体)。OSM靶向治疗也可以与其他类型的治疗剂组合使用，例如小分子或寡核苷酸治疗剂。

试剂盒

本发明还提供了一种诊断试剂盒，其包括用于测量个体中的OSM和/或OSMR水平的要素(means)(例如试剂)和根据本发明的方法使用试剂盒的说明书。试剂盒还可以包括关于可以对其进行该方法的个体的细节。试剂盒通常含有一种或多种特异性结合 OSM或OSMR的试剂，例如抗体。试剂盒可另外包括用于测量其他实验室或临床参数的要素(means)。例如，试剂盒可以包括用于测量C-反应蛋白(CRP)的要素(means)。

试剂盒可以另外包含一种或多种使得能够进行该方法的其他试剂或仪器。这些试剂或仪器包括以下的一种或多种：适合的缓冲液(水溶液)、用于从样品中分离OSM 和/或OSMR的要素(means)、用于从个体获得样品的装置(如包括针的容器或仪器)或包含可在其上进行定量反应的孔的载体。

其他方面

因此，第一方面，本发明提供了在个体中治疗或预防银屑病或Th17介导的疾病或病症的方法，该方法包括向个体施用OSM和/或OSMR的拮抗剂，从而在个体中治疗或预防银屑病或Th17介导的疾病或病症。

本发明还提供了：

-在个体中治疗或预防银屑病或Th17介导的疾病或病症的方法中使用的OSM 和/或OSMR的拮抗剂；及

-OSM和/或OSMR的拮抗剂在制备用于在个体中治疗或预防银屑病或Th17 介导的疾病或病症的方法中使用的药物中的应用。

在某些情况下，已按照以下方法对个体进行了诊断或预后预测。

另一方面，本发明提供了在个体中对银屑病或Th17介导的疾病或病症进行诊断或预后预测的方法，所述方法包括测量个体中的OSM和/或OSMR，从而在个体中诊断或预后预测银屑病或Th17介导的疾病或病症。

细胞因子信号传导通路的潜在强度由配体和受体二者的相对丰度决定。因此，在某些情况下，有用的是测量个体中的OSM和OSMR，并确定OSM指数(OSMi)(相对 OSM和OSMR的乘积)。

本发明的发明人已经表明，OSMR在疾病缓解期间仍然高度表达。此外，在成功的抗TNFα治疗后，OSM被抑制。这表明OSM信号传导在疾病复发中起作用。因此，在某些情况下，银屑病或Th17介导的疾病或病症的诊断或预后预测的方法是预测来自银屑病或Th17介导的疾病或病症缓解的个体是否会发生复发的方法。

在某些情况下，与参考样品或参考水平相比，OSM、OSMR和/或OSMi水平的升高指示阳性诊断、不良预后和/或个体会发生复发。在其他情况下，与参考样品或参考水平相比，OSM、OSMR和/或OSMi水平的降低指示阴性诊断、良好预后和/ 或个体不会发生复发。

另一方面，本发明提供了在个体中治疗或预防银屑病或Th17介导的疾病或病症的方法，该方法包括

(c)根据上述方法在个体中对银屑病或Th17介导的疾病或病症进行诊断或预后预测；及

(d)向个体施用对银屑病或Th17介导的疾病或病症的治疗有用的试剂。

在某些情况下，所述试剂是OSM和/或OSMR的拮抗剂。OSM和/或OSMR拮抗剂可以是OSM或OSMR活性或表达的拮抗剂，诸如抗OSM或抗OSMR抗体，或 OSM或OSMR融合蛋白。

本发明还提供了：

-一种在个体中治疗或预防银屑病或Th17介导的疾病或病症的方法中使用的试剂，其中根据以上方法已在个体中对银屑病或Th17介导的疾病或病症进行了诊断或预后预测；

-试剂在制造用于在个体中治疗或预防银屑病或Th17介导的疾病或病症的方法中使用的药物中的应用，其中根据以上方法已在个体中对银屑病或Th17介导的疾病或病症进行了诊断或预后预测。

-包含以下的产品：

o用于在具有或疑似具有或有风险发展银屑病或Th17介导的疾病或病症的个体中确定OSM和/或OSMR水平的要素(means)；及

o用于治疗银屑病或Th17介导的疾病或病症的试剂。

另一方面提供了用于在具有或疑似具有或有风险发展银屑病或Th17介导的疾病或病症的个体中测量OSM和/或OSMR水平的检验方法，其包括使来自个体的生物样品与结合OSM或OSMR的试剂接触，测量试剂与OSM或OSMR之间的复合物形成，可选地计算OSMi，将测量值或OSMi值与参考值进行比较，从而在个体中对银屑病或Th17介导的疾病或病症进行诊断或预后预测。

另一方面提供了包括以下模块的系统：

(e)测量模块，用于量化来自具有银屑病或Th17介导的疾病或病症的个体的生物样品中OSM和/或OSMR水平；

(f)储存模块，被配置为储存从测量模块输出的数据和参考和/或对照数据；

(g)计算模块，被配置计算从所述测量模块输出的数据、以及所述参考或对照数据的值；及

(h)输出模块，被配置为基于所述输出数据的值，显示针对具有银屑病或Th17 介导的疾病或病症的个体的诊断或预后预测。

上文关于慢性肠道炎症和/或IBD和TNFα治疗讨论的任何实施方式同样适用于关于银屑病或Th17介导的疾病或病症的实施方式。Th17介导的疾病或病症可以例如是IBD、银屑病、特应性皮炎、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎或癌症。

实施例

方法

人类组群中的基因表达分析

全部人体组织收集均在牛津胃肠道疾病生物库(参考号11/YH/0020)的伦理批准下进行。我们从John Radcliffe医院(牛津，英国)治疗的知情IBD患者或健康对照(进行非IBD病例的内窥镜检查)收集肠粘膜样本，并提取RNA用于cDNA合成和定量实时逆转录聚合酶链式反应(qPCR)分析。作为补充方法，我们评估了通过Gene Expression Omnibus网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)访问的可公开获得的基因表达研究得出的数据。在使用这些研究的情况下，参考相关的登录号。在某些数据中，我们包含了OSM指数(OSMi)作为可测量因素。其计算为数据集中相对OSM和OSMR 表达的乘积。因为细胞因子信号传导通路的潜在强度由配体和受体的相对丰度决定 (并且由于OSM和OSMR以1:1化学计量相互作用)，因此相对OSMi对应于此受体- 配体对的理论信号传导强度。

人类单核细胞分析

使用标准ficoll梯度离心，然后用CD14⁺细胞的磁激活细胞分选(MACS)分离来自健康人供体的外周血单核细胞。其通常根据流式细胞术分析得到≥95％的单核细胞纯度。单核细胞在具有10％胎牛血清的RPMI培养基中培养。具体治疗方法在图名中描述。通过qPCR(对于mRNA)或通过用于分泌产物的酶联免疫吸附测定(ELISA)评估单核细胞应答。

人类CD4⁺T细胞分析

使用ficoll梯度离心从健康人血液中分离外周血白细胞。然后使用MACS将非 CD4⁺T细胞消耗，并且使用荧光激活细胞分选(FACS)将剩余部分纯化成初始的 CD4⁺CD45RA⁺CD45RO^–CCR7⁺和记忆性CD4⁺CD45RA^–CD45RO⁺T辅助细胞级分。在不同极化细胞因子的存在下，使用抗CD3/抗CD28珠，对T细胞激活并扩增5天至7天。使用的极化细胞因子组合如下：Th0(中性，无细胞因子)、Th1(IFNγ+IL-12)、 Th2(IL-4)、Th9(TGFβ+IL-4)、Th22(TNFα+IL-6)、Treg(TGFβ)和Th17(IL-1β+TGFβ +IL-6+IL-23)。对于初始T细胞扩增，适当使用IFNγ和/或IL-4的中和抗体。Th17 条件的基础培养基为IMDM+5％人血清；所有其他条件的培养基为RPMI+5％人血清。如图所示通过qPCR或流式细胞术分析T细胞。

小鼠

在牛津大学认可的动物设施中，在特定的无病原体条件下繁殖并维持野生型C57BL/6、C57BL/6.Rag^-/-、Il23r^gfp报告子小鼠和C57BL/6.Osm^-/-小鼠。C57BL/6.Osm^-/-最初获自Jackson实验室(储存号#022338)。所有程序均根据1986年的UK ScientificProcedures Act进行。小鼠对螺杆菌属和其他已知肠道病原体均为阴性，小鼠进行年龄和性别匹配，第一次使用时超过6周龄。对于所有实验，雄性和雌性小鼠的使用比例大致相等。将小鼠随机分配到不同的治疗组中，所有治疗都在给定的动物笼中表示。

肝螺杆菌/抗IL-10R结肠炎模型

这种T细胞依赖性结肠炎模型涉及共生细菌肝螺杆菌(Hh)的小鼠口服感染，以及IL-10受体(IL-10R)的抗体阻断，其损害正常免疫调节功能，导致结肠炎(Schiering和Krausgruber等，Nature，2014)。通过药理学或遗传学手段降低TNF、IL-6或IL-1β在该模型中具有可忽略的治疗功效(未发表的观察和图24)，使其成为对抗TNF治疗不敏感的高度难治性疾病的模型。简而言之，在实验的第0天和第1天，通过22G 弯曲钝针头递送的口服管饲中，给予6周龄至12周龄的C57BL/6小鼠1×10⁸个集落形成单位(cfu)的Hh。IL-10R阻断抗体在第0天和第7天以腹腔内(IP)1mg注射施用。在第14天处死小鼠，其对应于疾病严重性的峰值。在某些实验中，小鼠额外施用重组鼠OSM(从第7天至第13天每天IP注射1μg(约等于0.04mg/kg))以评估额外的OSM 是否可以影响疾病进程。将其与接受作为假治疗的单独PBS注射的小鼠进行比较。在其他实验中，用包含OSMR、gp130和鼠IgG2A的Fc区的重组鼠OSM受体融合蛋白(O-RFP)治疗小鼠。从第7天至第13天，O-RFP每2天以150μg IP注射施用(相当于约6mg/kg)。作为对照治疗，根据相同的方案，用与O-RFP相同的条件下制备的摩尔当量的IgG2A-Fc治疗小鼠。最后，某些小鼠也用抗TNFα中和抗体以600μg/动物的总每周剂量进行治疗。根据我们的经验，该剂量足以在其他Hh驱动的结肠炎模型中完全中和疾病。

因为微生物群落可能对临床前研究的结果产生深远的影响，并且根据动物和设施有所变化，所有实验中的小鼠随机分配到不同的治疗组，并在实验前和实验期间共同饲养。在涉及Osm敲除小鼠的实验中，敲除动物与野生型同窝出生小鼠共同饲养并比较。最后，在两个不同的动物住房设施中重复治疗和Osm敲除实验，以证明具有不同的微生物群、动物饮食和富集的环境之间的再现性。

实验性结肠炎的组织学评估

按照描述(Izcue et al，Immunity，2008)对小鼠进行疾病严重程度评分。简而言之，近端、中部和远端结肠的福尔马林固定的石蜡包埋横切片用苏木精和伊红染色，并按 0至3的等级分为四个参数：上皮增生和杯状细胞消耗、白细胞浸润、受累区域及严重疾病活动的特征。常见的严重性特征包括隐窝脓肿形成、粘膜下白细胞浸润和间质性水肿。每个标准的分数相加，得出每个结肠切片0至12的总评分。对来自三个结肠区域的数据取平均值，以得到结肠炎症的总评分。评分是以盲法进行的，并由独立的盲法观察者证实。观察者间的Pearson相关系数为0.90～0.95。

肠组织制备和细胞分离

用EDTA冲洗小鼠结肠以除去上皮，并用胶原酶VIII消化以所述释放细胞群体(Uhlig等，J.Immunol，2006)。通过在30％/40％/70％percoll梯度上离心分离组织消化物。如图所示，收集30/40界面的细胞作为富含基质/上皮细胞的级分，同时在40/70 的界面收集细胞作为富含固有层白细胞的级分，并制备用于培养或流式细胞术分析。对于离体基质培养物，将基质级分铺板并如所述进行培养(Schiering和Krausgruber 等，Nature，2014)。

人肠活检或手术切除物首先在室温下用1mM DTT(二硫苏糖醇)溶液冲洗15分钟以除去粘液。如果需要，首先通过将粘膜与下面的组织分离并且尽可能多地去除残留的粘膜下层物质来制备手术切除样本。然后将切除组织在室温下冲洗三次，每次在 (HBSS(Hank's平衡盐溶液))的0.75mM EDTA(乙二胺四乙酸)溶液中30分钟，除去大部分上皮细胞。剩余组织在HBSS中冲洗以除去残留的EDTA，切成小块，并在RPMI 培养基+10％胎牛血清中的0.1mg/ml胶原酶A溶液中消化过夜。对于活检物制备，在DDT冲洗后，立即使用1mg/ml胶原酶A溶液在小体积中消化组织1小时。所有溶液都含有所述抗生素(Owens等，Front Immunol，2013)。如(Geremia等，J Exp Med， 2011)所述将消化的细胞过滤并按Percoll梯度分离。将基质细胞铺板并按照前述方案进行培养(Owens等，Front Immunol，2013)。

统计

所有统计数据都使用Graphpad Prism软件进行计算。适当使用参数和非参数分析以及多次测试校正，并在图例中进行了说明，所有测试的α＝0.05。除非另有说明，否则带有误差条的所有柱状图均表示平均值±标准误差。

实施例1在IBD的临床前模型中，鉴定OSM为强烈的疾病相关物

图1所示的数据表明，在机理不同的IBD模型中，仅有少量的细胞因子一致地过表达，其中包括TNF(几种成功的IBD药物例如英夫利昔单抗的靶标)和OSM。DSS 模型涉及用葡聚糖硫酸钠进行口服管饲，其刺激肠粘膜并产生类似于人UC的病理学。TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)是一种替代性化学结肠炎模型，其中化学物质直肠内施用，导致类似于人CD的病理学。最终，Abcb1a^-/-小鼠发展自发性结肠炎，其通过胆型螺旋杆菌肠道定殖而得到促进。该模型中所产生的结肠炎具有同时类似于UC和 CD的特征(Maggio-Price等，Am J Path，2002)。重要的是，用于此分析的每个数据集来源于具有不同遗传背景的动物，并涉及不同的分析平台。因此，独立于动物种系或分析策略，在具有代表人IBD的所有主要亚型的具有不同作用机制的结肠炎模型中OSM可再现地强烈增加。

实施例2 OSM和OSMR在Hh+αIL10R结肠炎模型中的表达

图2所示的数据表明，在Hh+αIL10R模型中，OSM及其受体OSMR的表达在结肠炎动物中在mRNA和蛋白质水平均增加(在组织和粪便物质中均可检测到)。OSM 表达与IL-1β、IL-6和TNF的表达密切相关，表明OSM是共同调节的炎性细胞因子核心组的以前未被认识的成员。图3所示的数据表明，该模型中OSM和OSMR表达的诱导与病理进展的动力学以及总体病理学严重性相关。因此，在这种情况下，OSM 和OSMR的表达与疾病密切相关。

实施例3 OSM和OSMR在人类IBD肠粘膜中的表达

图4所示的数据表明，在大多数IBD患者的活动性疾病期间，OSM、OSMR和 OSM指数在肠粘膜中高度增多。这在基于疾病活动性的内窥镜和组织学测量时是明确的。值得注意的是，OSM和OSMR表达的增加与组织学疾病严重性增加直接相关。图5显示，OSM与已知的肠粘膜炎症生物标志物S100A8和S100A9的表达密切相关， S100A8和S100A9一起形成粪便蛋白生物标记钙卫蛋白。图6表明OSM和OSMR 表达在UC和CD患者中是相等的。此外，OSM可能是IBD中经典细胞因子家族中最一致的过表达成员。最后，OSM和OSMR在发炎回肠袋-肛门吻合术患者的袋组织中集中，其中袋炎症是手术的常见且引发问题的并发症(图7)。

实施例4 OSM和OSMR在独立IBD组群中的表达

表1总结了IBD患者v.s.健康对照的肠粘膜活检中OSM和OSMR表达的变化倍数和显著性。总的来说，表1显示来自跨UC、CD、及成人和儿科IBD的5个地理上不同的患者组的数据。总样本量为118名健康对照和370名IBD患者。这些数据表明 OSC和OSMR在IBD患者肠粘膜中过度表达，在不同患者群体中具有高度的再现性。

表1.独立组群中的活动性IBD肠粘膜v.s.健康对照的OSM和OSMR表达平均变化倍数

*所有数据均来源于肠粘膜

+RISK:代表来自北美28个地点的儿科患者的初始组群

++数据不正常分布。结果描绘了来源于非参数Mann-Whitney U检验的中位数差异和显著性值

1.West等，未发表的数据2015.

2.Haberman等，J clin Invest 124:3617-33 2014.

3.Vanhove等，Inflamm Bowl Dis 21:2673-82 2015.

4.Arijs等，Plos ONE 4:e7984 2009.

5.Galamb等，Dis Markers 25:1-16 2008.

6.Planell等，Gut 62：:97-76 2013。

实施例5 OSM和OSMR与IBD临床特征的相关性

图8和图9所示的数据表明，OSM和OSMR在IBD患者的粘膜中以等同水平表达，与患者性别、诊断时的年龄、疾病持续时间或诸如血清CRP(C反应蛋白)和外周血白细胞计数等系统性疾病生物标志物无关。在本研究中给予患者的各种治疗类别中，OSM和OSMR表达仅与对外科手术干预的更大需求(具有增加类固醇使用的趋势) 显著相关，表明OSM通路的激活与侵袭性难治性疾病相关(图10)。总之，这些数据表明，OSM和OSMR是组织病理学的标志物，其可优于诸如血清CRP等常规生物标志物。此外，OSM和OSMR表达不限于IBD患者的特定亚组。

实施例6 OSM通路与人类IBD中对抗TNFα治疗的临床反应相关

图11、图12和图13所示的数据表明，肠粘膜中OSM和OSMR的高表达强烈地预测了IBD中对金标准生物治疗(英夫利昔单抗)的原发性无应答性。此外，与其他临床感兴趣的细胞因子相比，OSM是对治疗失败的更强的预测因素，并且是成功的抗TNFα治疗后可重复抑制的仅有的细胞因子之一。值得注意的是，图14表明，OSM 和OSMR不仅与短期英夫利昔单抗应答相关，而且也是多至30周的时间点的持久应答的预测因子。因此，OSM、OSMR和OSM指数可以是用于预测目前方案(特别是抗TNFα治疗)的治疗结果的有用生物标志物。此外，OSM可作为抗TNF难治性患者的治疗靶标。

实施例7 IBD中OSM与混合Th17/Th1细胞因子特征关联表达

无序的Th1和Th17T辅助细胞活动性被认为对于IBD的发病机制至关重要。图 15和图16中的数据表明OSM和OSMR的表达与的细胞因子的表达密切相关，该细胞因子i)有助于Th17发展(IL6、IL1B、IL23)或ii)由Th1和/或Th17细胞产生(IL17A、 IFNG、CSF2、IL22)。这在IBD的多个组群和所有亚型中都是一致的。因此，OSM 在人肠道中被认为是致病性免疫应答的背景下得到表达。

实施例8 OSM通过细菌刺激的人单核细胞与Th17极化细胞因子关联表达

包括单核细胞在内的抗原呈递细胞对于初始CD4⁺T细胞的激活和分化以及记忆性CD4⁺T细胞的再刺激是至关重要的。在抗原呈递的背景下表达的细胞因子是分化途径的主要决定因素，因此是辅助T细胞的效应器功能。图17中的数据显示，在暴露于各种细菌分子以及在人粘膜表面(包括病原体和共生物种)上发现的呈现出多种属的多种完整细菌时，人单核细胞强烈诱导OSM表达。图18显示，在细菌攻击后，OSM与单核细胞中的Th17极化细胞因子IL-6、IL-1β和IL-23关联表达。此外，OSM 由具有强Th17诱导能力的人肠中发现的抗原呈递细胞亚型高表达。总体来说，这些数据涉及OSM作为在暴露于微生物刺激时被人抗原呈递细胞强烈诱导的Th17诱导通路(被认为在IBD患者的肠组织中以增加的水平发生)的先前未知的组分。

实施例9 OSM在人记忆性CD4⁺T细胞中表达

图19的数据表明，在刺激后，OSM在CD4⁺T细胞的mRNA和蛋白质水平上表达。此外，虽然静息CD4⁺T细胞不表达可检测的OSMR，但它们在激活时诱导OSMR 表达。OSM表达主要是记忆性(CD45RO⁺)细胞的特征。因此，CD4⁺T细胞是人OSM 的来源和潜在靶细胞。

实施例10 OSM增强人类Th17分化和扩增

图20中的数据显示Th17-极化的CD4⁺T细胞表达升高水平的OSMR，OSM增强了在Th17条件下激活的初始CD4⁺T细胞的扩增。CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯) 和PI(碘化丙啶)染色表明这是由于细胞存活的增强而不是增殖(未示出)。OSM抑制 Th17细胞中主要Th2转录因子GATA3以及特征Th2细胞因子IL-4的表达，从而提高产生的Th17表型的纯度。此外，OSM增强Th17细胞中IL-23受体的表达，这可能使它们更易于发展IL-23依赖性致病功能。这些数据表明OSM可以在增强人的致病性Th17应答方面发挥重要作用。

实施例11 OSM是体内侵袭性结肠炎所必需的

图21和图22中的数据表明，相对于野生型同窝出生对照，在具有OSM遗传缺失的小鼠中，Hh+αIL10R结肠炎方案导致显著减弱的疾病。虽然这对于组织学评估(包括上皮/杯状细胞破裂和白细胞浸润)的所有主要参数是明显的，但是在严重疾病表现(如脓肿形成、粘膜下炎症和间质性水肿)的水平尤其明显。此外，OSM的缺乏减弱肠中其他炎性细胞因子的表达，特别是IL-6和IL-1β，而不损害抗炎细胞因子IL-10 的诱导。因此，OSM似乎是诸如IL-6等更经典的促炎性通路的上游驱动因素，但不是诱导有益的免疫调节通路所需要的。重要的是，对多个淋巴和外周器官的详细检查显示，Osm^-/-小鼠在稳定状态下不显示明显的免疫表型，也没有肠结构异常(未发表，未示出)。此外，Osm^-/-和野生型同窝出生小鼠在肠中显示等同的肝螺杆菌定殖，表明 Osm缺失在该结肠炎模型中的保护作用不是由于细菌处理的改变(未发表，未示出)。

实施例12 O-RFP，一种新型小鼠OSM阻断试剂的中和功效

图23中的数据显示O-RFP体外中和小鼠OSM的能力(参见“方法”和图23的说明)。与市售的多克隆抗血清相比，该蛋白质具有优异的中和能力。

实施例13治疗性OSM阻断在体内减弱结肠炎

图24中的数据表明，使用O-RFP在具有确定的结肠炎的小鼠的治疗性阻断(在 Hh+αIL10R方案的第7天开始的治疗)降低了由内窥镜和组织学标准确定的疾病严重性。该治疗效果优于TNF阻断的效果。与OSM敲除小鼠获得的结果(参见实施例11) 一致，这些实验中最明显的OSM依赖性参数是严重疾病特征的表现。此外，在来自 5种不同人类CD患者的肠粘膜外植体培养物中使用特异性单克隆抗体的人类OSM 的阻断显著减弱组织炎症，由IL-1β表达降低所证明。这种效应与英夫利昔单抗的效果相当。总而言之，这些数据表明OSM是IBD的潜在有价值的临床靶标，特别是对抗TNF治疗具有抗性的侵袭性疾病表型。

因此，在IBD治疗性干预的背景下靶向OSM是有效的策略。

实施例14 OSM在造血细胞群体中广泛表达，而非造血基质细胞是肠中主要的OSM 应答性细胞类型

图25中的数据显示，在野生型小鼠中，肠中的OSM产生可归因于各种白细胞亚型，诸如CD4⁺T细胞和抗原呈递细胞。值得注意的是，在肠基质细胞和内皮细胞上观察到OSMR的最高表达水平。与此相反，OSMR在造血细胞群体和上皮细胞中的表达水平低得多。图26中的数据在人肠细胞群体中表现出类似结果，其中通过流式细胞术分析的OSMR染色揭示了受限的染色模式，其仅包括基质细胞，并且在较小程度上包括内皮细胞。OSMR⁺基质细胞还具有gp38和ICAM-1，其是免疫学活性的“淋巴样组织样”基质群体的标志物(Owens，FrontImmunol，2015)。因为这种基质细胞子集大大超出组织中的内皮细胞，我们得出结论，gp38⁺ICAM-1⁺基质细胞是小鼠和人肠中主要的OSM应答细胞类型。如所预期，人肠组织中OSM蛋白表达的染色显示出其由包括T细胞和抗原呈递细胞在内的多种造血细胞产生(未示出)。

实施例15肠基质细胞对OSM具有高应答性

图27所示的数据表明，相对于其他细胞因子受体，OSMR由原代人肠道基质细胞高水平表达。类似地，OSMR的异二聚体配偶体(gp130)非常高地表达。与此相反， OSMR家族的其他受体如IL-6受体和LIF受体以低水平表达。与高OSMR/gp130表达一致，OSM通过肠道基质细胞中的不同通路刺激快速和强烈的信号传导应答，而对IL-6的应答要低得多。因此，OSM对于肠基质细胞生物学似乎是其家族中的重要成员。

实施例16肠基质细胞和内皮细胞在体内受OSM调节

图28中的数据表明i)肠基质细胞和内皮细胞被激活(基于ICAM-1表面表达)并且在鼠结肠炎期间显示增强的增殖；ii)当在Hh+αIL10R结肠炎过程系统施用时，OSM 进一步促进它们的激活和增殖。系统性OSM治疗还导致更强的结肠炎表型，其特征是加重的白细胞募集和组织学疾病严重性恶化(未示出)。当小鼠经受Hh+αIL10R结肠炎时，用O-RFP进行OSM阻断显著减弱ICAM-1在内皮细胞和gp38⁺ICAM-1⁺基质细胞表面的积累。使用OSM敲除小鼠观察到类似的结果(未示出)。因此，OSM在体内调节基质/内皮群体的炎症激活状态，并且可能是OSM促进结肠炎严重程度的重要机制。

实施例17 OSM与TNF协同激活小鼠肠基质细胞中的细胞因子和趋化因子表达

图29中的数据表明，离体培养的小鼠结肠肠基质细胞对OSM作出应答，并应答于OSM刺激而表达几种相关的炎性因子。值得注意的是，当细胞用OSM和TNF 共同刺激时，诱导了非常高水平的几种应答基因，表明OSM和TNF在肠中构成功能性促炎症轴。虽然肠基质细胞对OSM具有高应答性，但它们在很大程度上对OSM 的最接近的同源物：IL-6和LIF是非应答性的。

实施例18人肠道基质细胞的OSM刺激触发临床相关的炎症特征的激活

图30至33表明，OSM与IBD患者大量组群中的离散的细胞因子和趋化因子组密切相关(图30)。该基因特征的富集通常表示具有严重疾病特征例如深部肠溃疡的患者，并且在英夫利昔单抗难治性患者中集中。执行与T细胞和骨髓细胞募集和保留相关的各种生物学功能的特征中的几个基因由OSM在肠基质细胞中以变化的动力学直接调节(图31)。在小鼠基质细胞中，我们观察到OSM和TNF之间的功能协同作用的明显证据，特别是关于促进Th1细胞募集的趋化因子(CXCL9/10/11)(图32)。我们观察到OSM 和IL-1β之间的类似协同作用(图33)。值得注意的是，OSM对肠基质细胞的影响不是由LIFR通路介导的，表明gp130-OSMR异二聚体是肠基质细胞中的相关OSM受体复合物(图31B)。图34所示的数据使用来自几个供体的原代肠基质培养物证实，OSM直接调节临床表达特征中发现的几种基因的表达(图30)，而IL-6通常具有弱得多的作用。总体来说，这些数据认为，肠中的OSM/OSMR轴的一个重要方面是其维持或扩大炎症基质激活的潜力，其涉及趋化因子和细胞因子的产生增加，可能是白细胞浸润增加和在肠组织中保留和延迟解决炎症的结果。

OSMR由各种水平的几种细胞类型表达，因此OSM发挥多效性作用。例如，OSMR 在健康条件下由内皮细胞和间充质基质细胞(包括存在于肠内的那些细胞)中高表达。在这些细胞类型的炎症期间OSMR水平也可以增加。对这些细胞类型的OSM刺激导致各种应答，包括诸如ICAM-1等白细胞粘附受体的表达/激活，增殖的增加以及诸如IL-6 和CCL2等促炎细胞因子或趋化因子的表达。基质群体的异常激活和数值扩增是病原性纤维化的关键方面，因此OSM-OSMR信号传导可以促进损伤性纤维化应答，如在克罗恩氏病中观察到的那些。类似地，通过其在这些细胞类型中促进细胞因子/趋化因子产生、增殖和粘附受体表达的能力，OSM可以增强组织血管分布、白细胞的募集和保留、以及局部炎症过程。此外，OSM直接或间接增强上皮增生可能促进发育不良和瘤形成的开始，这是与慢性肠道炎症相关的严重不良事件。

造血细胞类型通常在稳态条件下不表达高水平的OSMR。然而，当细胞暴露于适当的刺激物时，OSMR表达在这些细胞类型中是可诱导的。在T细胞的情况下，需要通过T细胞受体(TCR)与诸如IL-6等适当的极化细胞因子的组合来激活OSMR表达。 IL-6对于炎性Th17CD4⁺T细胞的发育至关重要，其被认为在各种疾病中促进致病性炎症反应，所述疾病包括IBD、多发性硬化、关节炎、银屑病和癌症。当在Th17极化条件下激活时，在OSM存在下，CD4⁺T细胞更有效地扩增(增加数目)，并且表达与替代极化状态相关的较低水平的基因，如Th2细胞的产物细胞因子IL-4。在发炎的人肠道中，OSM与已知促进Th17发育的细胞因子(包括IL-6和IL-1β)一起表达。有趣的是，虽然T细胞在激活后表达高水平的OSM，但是通过暴露于外源性OSM进一步增强，如在与受刺激的抗原呈递细胞相互作用的情况下将发生的那样。因此OSM可能通过增加Th17驱动的免疫应答而促成致病性炎症。

与T细胞一样，诸如单核细胞等单核吞噬细胞在静息时具有低水平的OSMR表达，但当暴露于诸如全细菌或纯化的细菌分子等激活刺激时，OSMR可增加10倍至100倍。它们在激活后也会产生高水平的OSM。与肠组织观察结果一致，微生物刺激的单核细胞的OSM表达与诸如IL-6、IL-1β和IL-23等Th17极化的细胞因子的表达高度相关。此外，用OSM刺激经细菌刺激的单核细胞可以增加其诸如IL-23等炎性细胞因子的表达。

因此，总体来说，基于人体组织分析、体外实验和临床前体内模型的几条证据支持了OSM可广泛作用以促进致病性炎症的概念，特别是在微生物刺激突出的粘膜表面的情况中，如IBD和其他胃肠道疾病。由于本研究中使用的主要体内结肠炎模型 (Hh+αIL10R)对TNF阻断(以及IL-6和IL-1β的阻断)而言是难治性的，OSM可能是对目前批准的生物治疗失败的患者特别有价值的临床靶标。

序列表

<110> 牛津大学创新有限公司

<120> 生物标志物

<130> N403422WO

<150> 1501480.6

<151> 2015-01-29

<150> 1501511.8

<151> 2015-01-29

<150> 1521446.3

<151> 2015-12-04

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1686

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

cagacgctcc ctcagcaagg acagcagagg accagctaag agggagagaa gcaactacag 60

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ggggccccag ggctccaggc ggtgcttgtt cctcagcctc ttctccttcc tgatcgtggc 300

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ctaccagacc aaggtcaacc tcctctctgc catcaagagc ccctgccaga gggagacccc 720

agagggggct gaggccaagc cctggtatga gcccatctat ctgggagggg tcttccagct 780

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gtctgggcag gtctactttg ggatcattgc cctgtgagga ggacgaacat ccaaccttcc 900

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aaaaaa 1686

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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ctctgctact agccactgag aagtgcactt taagaggtgg gagctgggca gacccctcta 960

cctcctccag gctgggagac agagtcaggc tgttgcgctc ccacctcagc cccaagttcc 1020

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ccaaaacaga ttttagactt accttgaacg gataagaatc tatagttcac tgacacagta 3900

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Lys Glu Val Glu Glu Glu Arg Ile Ala Gly Thr Glu Gly Gly Phe Ser

530 535 540

Leu Ser Trp Lys Pro Gln Pro Gly Asp Val Ile Gly Tyr Val Val Asp

545 550 555 560

Trp Cys Asp His Thr Gln Asp Val Leu Gly Asp Phe Gln Trp Lys Asn

565 570 575

Val Gly Pro Asn Thr Thr Ser Thr Val Ile Ser Thr Asp Ala Phe Arg

580 585 590

Pro Gly Val Arg Tyr Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Leu Ser Thr Lys Arg

595 600 605

Ile Ala Cys Leu Leu Glu Lys Lys Thr Gly Tyr Ser Gln Glu Leu Ala

610 615 620

Pro Ser Asp Asn Pro His Val Leu Val Asp Thr Leu Thr Ser His Ser

625 630 635 640

Phe Thr Leu Ser Trp Lys Asp Tyr Ser Thr Glu Ser Gln Pro Gly Phe

645 650 655

Ile Gln Gly Tyr His Val Tyr Leu Lys Ser Lys Ala Arg Gln Cys His

660 665 670

Pro Arg Phe Glu Lys Ala Val Leu Ser Asp Gly Ser Glu Cys Cys Lys

675 680 685

Tyr Lys Ile Asp Asn Pro Glu Glu Lys Ala Leu Ile Val Asp Asn Leu

690 695 700

Lys Pro Glu Ser Phe Tyr Glu Phe Phe Ile Thr Pro Phe Thr Ser Ala

705 710 715 720

Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr Pro Asp Glu

725 730 735

His Ser Ser Met Leu Ile His Ile Leu Leu Pro Met Val Phe Cys Val

740 745 750

Leu Leu Ile Met Val Met Cys Tyr Leu Lys Ser Gln Trp Ile Lys Glu

755 760 765

Thr Cys Tyr Pro Asp Ile Pro Asp Pro Tyr Lys Ser Ser Ile Leu Ser

770 775 780

Leu Ile Lys Phe Lys Glu Asn Pro His Leu Ile Ile Met Asn Val Ser

785 790 795 800

Asp Cys Ile Pro Asp Ala Ile Glu Val Val Ser Lys Pro Glu Gly Thr

805 810 815

Lys Ile Gln Phe Leu Gly Thr Arg Lys Ser Leu Thr Glu Thr Glu Leu

820 825 830

Thr Lys Pro Asn Tyr Leu Tyr Leu Leu Pro Thr Glu Lys Asn His Ser

835 840 845

Gly Pro Gly Pro Cys Ile Cys Phe Glu Asn Leu Thr Tyr Asn Gln Ala

850 855 860

Ala Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly His Val Pro Val Ser Pro Lys Ala

865 870 875 880

Pro Ser Met Leu Gly Leu Met Thr Ser Pro Glu Asn Val Leu Lys Ala

885 890 895

Leu Glu Lys Asn Tyr Met Asn Ser Leu Gly Glu Ile Pro Ala Gly Glu

900 905 910

Thr Ser Leu Asn Tyr Val Ser Gln Leu Ala Ser Pro Met Phe Gly Asp

915 920 925

Lys Asp Ser Leu Pro Thr Asn Pro Val Glu Ala Pro His Cys Ser Glu

930 935 940

Tyr Lys Met Gln Met Ala Val Ser Leu Arg Leu Ala Leu Pro Pro Pro

945 950 955 960

Thr Glu Asn Ser Ser Leu Ser Ser Ile Thr Leu Leu Asp Pro Gly Glu

965 970 975

His Tyr Cys

Claims

1.一种制瘤素-M(OSM)和/或OSM受体-β(OSMR)的拮抗剂在药物制备中的应用，所述药物用于在个体中治疗或预防慢性肠道炎症和/或炎症性肠病(IBD)，所述药物包含所述制瘤素-M(OSM)和/或OSM受体-β(OSMR)的拮抗剂，从而在所述个体中治疗或预防慢性肠道炎症和/或IBD，

其中，所述拮抗剂是抗OSM或抗OSMR的抗体，或者其抗原结合片段；抗OSM或抗OSMR的反义分子、抗OSM或抗OSMR的干扰RNA、或抗OSM或抗OSMR的适体；或多核苷酸，

其中，所述多核苷酸编码抗OSM或抗OSMR的抗体，或者其抗原结合片段。

2.如权利要求1所述的应用，其中，所述拮抗剂抑制Th17 CD4⁺T细胞或Th17通路的发展。

3.如权利要求1所述的应用，其中，所述个体已根据下述方法进行诊断或预后预测，所述方法包括测量所述个体的OSM和/或OSMR，从而对所述个体的慢性肠道炎症和/或IBD进行诊断或预后预测。

4.如权利要求3所述的应用，其中，所述诊断或预后预测的方法包括测量所述个体的OSM和OSMR，将其OSM和OSMR的水平与参考OSM和OSMR水平或参考样品的OSM和OSMR水平进行比较，和确定OSM指数(OSMi)。

5.如权利要求3所述的应用，其中，所述诊断或预后预测的方法是预测慢性肠道炎症和/或IBD缓解的个体是否会复发的方法。

6.如权利要求3所述的应用，其中，所述诊断或预后预测方法是确定所述个体需要外科手术的可能性的方法。

7.如权利要求1至6中任一项所述的应用，其中，所述拮抗剂是OSM或OSMR活性或表达的拮抗剂。

8.如权利要求7所述的应用，其中，所述拮抗剂是抗OSM或抗OSMR的抗体，或者其抗原结合片段。

9.如权利要求1～6中任一项所述的应用，其中，IBD与结肠直肠癌相关。

10.如权利要求1～6中任一项所述的应用，其中，IBD是克罗恩氏病(CD)或溃疡性结肠炎(UC)。

11.如权利要求10所述的应用，其中，CD是结肠CD或回肠CD。

12.如权利要求1～6中任一项所述的应用，其中，所述个体是哺乳动物。

13.如权利要求12所述的应用，其中，所述哺乳动物是人类。