JP6999417B2 - Ｉｂｄにおける治療標的及びバイオマーカー - Google Patents

Ｉｂｄにおける治療標的及びバイオマーカー Download PDF

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Description

これらの成果を導く研究は、ＲＥＡ助成承認第３３０６２１号の下、欧州連合の第七フレームワークプログラム（ＦＰ７／２００７－２０１３）の人民プログラム（Ｍａｒｉｅ Ｃｕｒｉｅ Ａｃｔｉｏｎｓ）からの資金提供を受けている。
本発明は、慢性腸炎および／または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の処置、診断または予後診断のための、ならびに個体が抗腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）療法による処置に反応するか否かを予測するための方法および製品に関する。
クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含む炎症性腸疾患などの炎症性疾患は、再発寛解型の経過を有する胃腸管の衰弱性慢性炎症状態である。処置は、疾患を引き起こす免疫プロセスを損なうことを目的とし、歴史的にコルチコステロイドなどの広範な抑制性抗炎症剤を使用してきた。ごく最近では、インフリキシマブなどの抗腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）抗体の臨床的成功によって大きく影響を受け、炎症経路の特定の成分を標的とすることへの関心が高まっている。
抗ＴＮＦα抗体は、多数のＩＢＤ患者において寛解を誘発し、維持することができるが、４０％までは初期の非反応性を示し、残りの３分の１は、時間の経過とともに反応性を失う（Ben-Horin and Chowers, Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol., 2014）。現在、処置の失敗を満足に予測するために利用可能な方法はなく、実行可能な臨床標的として代替のサイトカインは明らかにされていない。例えば、Ｔｈ１免疫反応の一次エフェクターサイトカインであるインターフェロン－γ（ＩＦＮγ）の中和は、臨床効果がほとんどないようである。ＩＬ－１０およびＩＦＮβなどの抗炎症性サイトカインの投与は同様に不成功であった（Neurath, Nat. Rev. Immunol., 2014）。したがって、緊急性の２つの満たされていない要求があり、それは、（ａ）ＩＢＤおよび他のＴＮＦα媒介性状態のための抗ＴＮＦα療法に対する臨床反応の可能性を正確に予測する有効なバイオマーカーを特定すること；（ｂ）ＴＮＦαを超えるＩＢＤ管理のための代替の処置標的を特定し、臨床的に検証することである。
ＩＬ－６は、エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１７サブセットの分化を引き起こすために重要である周知の炎症性サイトカインである。第ＩＩ相試験では、ＩＬ－６受容体の遮断が、ＣＤに対して穏やかな処置有効性を示した（Neurath, Nat. Rev. Immunol., 2014）。ＩＬ－６は、ｇｐ１３０受容体サブユニットの共用によって定義されるサイトカインファミリーのプロトタイプメンバーである。
オンコスタチン－Ｍ（ＯＳＭ）は、このサイトカインファミリーのメンバーである。ｇｐ１３０だけを介してシグナルを伝達するＩＬ－６とは異なり、ＯＳＭは、ｇｐ１３０、および両者がｇｐ１３０とは異なるシグナルを伝達することができるＯＳＭ受容体－β（ＯＳＭＲ）またはＬＩＦ受容体（ＬＩＦＲ）のいずれかを含む２つの可能なヘテロ二量体受容体に関与する（Heinrich et al, Biochemistry, 2003）。例えば、ＯＳＭは、様々な細胞型において、ＩＬ－６よりも強力なマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達を誘発する（West and Watson, Oncogene, 2010；Hintzen et al, Arthritis Rheum., 2009）。ＬＩＦＲは大部分の成人組織では弱く発現するが、ＯＳＭＲは、内皮細胞、上皮細胞、間質細胞、グリア細胞および造血細胞を含むほとんどの臓器において多数の細胞型によって広範に発現される（Richards, ISRN Inflam., 2013）。
ＯＳＭの撹乱は、いくつかの炎症性障害（乾癬および気道炎症など）および複数の癌タイプにおいて特定されている（Richards, ISRN Inflam., 2013）。これらの各条件において、実験モデルは、ＯＳＭがＯＳＭＲを介してシグナル伝達することによって炎症プロセスに直接寄与することを実証している。ＯＳＭは、最近、ゲノムワイド関連研究において、ＣＤおよびＵＣの両方に関連付けられた（Jostins et al, Nature, 2012）。しかしながら、ＯＳＭシグナル伝達がＩＢＤの病因に関与するかどうかを含めて、ＩＢＤにおけるＯＳＭシグナル伝達の役割についてはほとんど知られていない。
本発明者らは、大多数のＩＢＤ患者において、疾患の活動期にＯＳＭおよびＯＳＭＲが腸粘膜において高度に発現されることを発見した。ＯＳＭおよびＯＳＭＲはまた、少なくとも４つの異なる大腸炎マウスモデルにおいてアップレギュレートされ、それらの発現は疾患の重症度と相関する。混乱したＴｈ１およびＴｈ１７ヘルパー細胞活性は、ＩＢＤの病因において重要であると考えられ、本発明者らは、初めてＴｈ１７誘導経路の成分としてＯＳＭを特定した。さらに、ＯＳＭの全身投与はマウス大腸炎を悪化させるが、ＯＳＭの処置的遮断またはＯＳＭの遺伝子欠損は免疫病理を改善する。
したがって、第１の態様において、本発明は、個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを処置または予防する方法であって、個体にＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニストを投与し、それにより個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを処置または予防することを含む方法を提供する。
さらに、本発明は、
－ 個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを処置または予防する方法において使用するためのＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニスト；ならびに
－ 個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを処置または予防する方法において使用するための医薬の製造におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニストの使用
を提供する。
個体は、以下に示される方法に従って診断または予後診断されている場合がある。
さらなる態様において、本発明は、個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを診断または予後診断する方法であって、個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲを測定し、それにより個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤ診断または予後診断することを含む方法を提供する。
サイトカインシグナル伝達経路の潜在的な強さは、リガンドと受容体の両方の相対存在量によって決定される。したがって、個体におけるＯＳＭとＯＳＭＲの両方を測定し、ＯＳＭ指標（ＯＳＭｉ）（相対的なＯＳＭおよびＯＳＭＲの積）を決定することが有用である場合がある。
本発明者らは、ＯＳＭＲが疾患寛解中に高度に発現されたままであることを示した。さらに、抗ＴＮＦα療法が成功した後、ＯＳＭは抑制される。これは、ＯＳＭシグナル伝達が疾患の再発において役割を果たすことを示唆している。したがって、慢性腸炎および／またはＩＢＤを診断または予後診断する方法は、慢性腸炎および／またはＩＢＤから寛解した個体が再発するか否かを予測する方法である場合がある。
参照試料または参照レベルと比較した、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、および／またはＯＳＭｉレベルの上昇は、陽性の診断、陰性の予後診断、および／または個体が再発することを示す場合がある。参照試料または参照レベルと比較した、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、および／またはＯＳＭｉレベルの低下は、陰性の診断、陽性の予後診断、および／または個体が再発しないことを示す場合もある。
別の態様において、本発明は、個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを処置または予防する方法であって、
（ａ）上記の方法に従って個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを診断または予後診断すること；ならびに
（ｂ）慢性腸炎および／またはＩＢＤの処置に有用な薬剤を個体に投与すること
を含む方法を提供する。
薬剤は、ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニストである場合がある。ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲアンタゴニストは、抗ＯＳＭ抗体または抗ＯＳＭＲ抗体などのＯＳＭまたはＯＳＭＲ活性または発現のアンタゴニスト、もしくはＯＳＭまたはＯＳＭＲ融合タンパク質であり得る。
さらに、本発明は、
－ 個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤが上記の方法に従って診断または予後診断されている個体において慢性腸炎および／またはＩＢＤを処置または予防する方法において使用するための薬剤；
－ 個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤが上記の方法に従って診断または予後診断されている個体において慢性腸炎および／またはＩＢＤを処置または予防する方法において使用するための医薬の製造における薬剤の使用；
慢性腸炎および／またはＩＢＤを有する、または有すると疑われる、または発症するリスクがある個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのレベルを決定するための手段；ならびに
慢性腸炎および／またはＩＢＤを処置するための薬剤
を含有する製品
を提供する。
本発明者らは、さらに、腸粘膜におけるＯＳＭおよびＯＳＭＲの発現が、抗ＴＮＦα療法に対する非反応性を予測することを示している。
したがって、さらなる態様において、本発明は、個体が抗ＴＮＦα療法に反応するか否かを予測するための方法であって、個体においてＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲを測定し、それにより個体が抗ＴＮＦα療法に反応するか否かを予測することを含む方法を提供する。抗ＴＮＦα療法は、インフリキシマブなどの抗ＴＮＦα抗体であり得る。
参照試料または参照レベルと比較した、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、および／またはＯＳＭｉレベルの低下は、個体が抗ＴＮＦα療法に反応することを示す場合がある。次に、この方法は、個体の処置のために抗ＴＮＦα療法を選択または推奨することをさらに含み得る。次に、個体に抗ＴＮＦα療法を施す場合がある。本発明は、抗ＴＮＦα療法が、例えば第一選択の処置として、そうでなければ抗ＴＮＦα療法を受けないであろう個体に対して適切な処置として特定されることを可能にする場合がある。インフリキシマブなどの抗ＴＮＦα療法は、ＩＢＤなどの病状に対する「ゴールドスタンダード」処置である。しかしながら、概して、抗ＴＮＦα療法は、一次および二次の非反応性が一般的であるため、強力な免疫抑制などの副作用のため、および／または処置が高価であるため、第一選択の処置として選択されない。本発明の方法は、抗ＴＮＦα療法に反応し、抗ＴＮＦα療法が最も有益であろう個体を特定するために使用することができる。次に、抗ＴＮＦα療法は、それらの疾患の処置の初期段階で個体に選択または推奨され得る。抗ＴＮＦα療法は、第一選択の処置として選択または推奨され得る。
参照試料または参照レベルと比較して、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、および／またはＯＳＭｉレベルの上昇は、個体が抗ＴＮＦα療法に反応しないことを示す場合がある。次に、この方法はさらに、個体の処置のために抗ＴＮＦα療法以外の治療的処置を選択または推奨することを含むことができる。次に、抗ＴＮＦα療法以外の治療的処置を個体に投与する場合がある。
別の態様において、本発明は、個体におけるＴＮＦα媒介性疾患または状態を処置または予防する方法であって、個体にＴＮＦαアンタゴニストを投与し、それによりＴＮＦα媒介性疾患または状態を処置または予防することを含み、個体は上記の方法に従ってＴＮＦαアンタゴニストに反応することが予測されている、方法を提供する。
本方法はまた、
－ 上記の方法に従ってＴＮＦαアンタゴニストに反応することが予測されている個体においてＴＮＦα媒介性疾患または状態を処置または予防する方法において使用するためのＴＮＦαアンタゴニスト；
－ 上記の方法に従ってＴＮＦαアンタゴニストに反応することが予測されている個体においてＴＮＦα媒介性疾患または状態を処置または予防する方法において使用するための医薬を製造するためのＴＮＦαアンタゴニストの使用
を提供する。
さらなる態様は、ＴＮＦα媒介性疾患、慢性腸炎および／またはＩＢＤを有する、または有すると疑われる、または発症するリスクがある個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのレベルを測定するためのアッセイであって、個体由来の生物学的試料をＯＳＭまたはＯＳＭＲに結合する薬剤と接触させること、薬剤とＯＳＭまたはＯＳＭＲの間の複合体形成を測定すること、場合によりＯＳＭｉを計算すること、測定された値またはＯＳＭｉ値を参照値と比較し、それによりＴＮＦα媒介性疾患を有する個体が抗ＴＮＦα療法に反応するか否かを予測すること、または個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを診断または予後診断することを含むアッセイを提供する。
さらなる態様は、
（ａ）ＴＮＦα媒介性疾患、慢性腸炎および／またはＩＢＤを有する個体由来の生物学的試料におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのレベルを定量するための測定モジュール、
（ｂ）測定モジュールから出力されたデータ、ならびに参照および／または対照データを記憶するように構成された記憶モジュール、
（ｃ）測定モジュールから出力されたデータ、および参照または対照データの値をコンピュータ計算するように構成されたコンピュータ計算モジュール、ならびに
（ｄ）出力データの値に基づいて、慢性腸炎および／またはＩＢＤを有する個体の診断または予後診断を表示するように構成された出力モジュール
を含むシステムを提供する。
本発明のさらなる態様は、本発明の診断方法または予後診断方法のいずれにおいて使用するための試験キットであって、個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのレベルを決定するための手段、ならびに方法において使用するための指示書を含む試験キットを提供する。
別の態様において、本発明は、個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤの重症度を決定する方法であって、個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲを測定し、それにより個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤの重症度を決定することを含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、慢性腸炎および／またはＩＢＤを有する個体が外科手術を必要とする可能性を決定する方法であって、個体においてＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲを測定し、それにより個体が外科手術を必要とする可能性を決定することを含む方法を提供する。
本発明は、ここで、例として、限定ではなく、添付の図面を参照することにより、さらに詳細に記載される。当業者には、この開示が与えられたときに、多数の同等な修飾および変形が明らかとなる。したがって、記載された本発明の例示的な実施形態は、例示的なものであり、限定的なものではないと考えられる。記載された実施形態に対する様々な変更が、本発明の範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書において引用された全ての文献は、上記または下記のいずれの文献であっても、それら全体が参照により明示的に組み込まれる。
本発明は、記載された態様および好ましい特徴の組み合わせが明確に許容できない、または明示的に回避されると述べられている場合を除いて、このような組み合わせを含む。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、その内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの（ａｎ）アンタゴニスト」への言及は、２つ以上のこのようなアンタゴニストを含む。
本明細書で使用されるセクションの見出しは、便宜上のものであり、決して限定するものとして解釈されるべきではない。
健常なマウスと大腸炎のマウスの間の結腸組織全体で示差的に発現するサイトカインを３種のモデル系において特定した：Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおける経口ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）投与、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴＮＢＳ（トリニトロベンゼンスルホン酸）の直腸投与、およびＡｂｃｂ１ａ遺伝子を欠損しているＦＶＢ．１２９Ｐ２マウスの経口ヘリコバクター・ビリス（Helicobacter bilis）感染。全トランスクリプトームデータは公開されており、それぞれ、以下のＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）エントリー：ＧＳＥ３４５５３、ＧＳＥ３５６０９、およびＧＳＥ７２２１２に由来する。分析のために、各データセットに利用可能なデータを有する４５個の候補サイトカインを選択した。次に、それらの発現レベルを評価し、大腸炎中に有意に変化したもの（誤発見率補正を伴うｔ検定に基づく）を特定した。これらはＶｅｎｎ図に列挙されている。大腸炎マウスの結腸では、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ６、ＴｎｆおよびＯｓｍのみが３つのモデル系のすべてにおいて有意に増加した。 Ｈｈ＋αＩＬ１０Ｒモデルを用いて作成したデータであり、これは、方法に記載されているように、免疫調節不全を共存する病原体（ヘリコバクター・ヘパチカス（Helicobacter hepaticus））感染と組み合わせる。（Ａ）野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウス（ｎ＝１９対照、およびｎ＝３５大腸炎マウス、３回を超える実験からプールされた）由来の全結腸組織におけるＯｓｍおよびＯｓｍｒのｍＲＮＡ発現。（Ｂ）マウスＯＳＭに特異的なＥＬＩＳＡを用いて定量した近位結腸外植片（左）または盲腸内容物（右）の２４時間培養からのＯＳＭ産生。ＯＳＭ濃度は、外植片／盲腸内容物の質量（３つの代表的な実験のうちの１つからのｎ＝４の未処置およびｎ＝１０の処置マウス）に対して標準化される。（Ｃ）定常状態のマウスおよびＨｈ＋αＩＬ１０Ｒ大腸炎（３回を超えるプールされた実験からのｎ＝６３）を有するマウス由来の全結腸組織における、Ｏｓｍ ｍＲＮＡ対Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ６およびＴｎｆのピアソン相関。非パラメトリックのＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定またはＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を適宜用いて計算した。*ｐ＝０．０１－０．０５、**ｐ＝０．００１－０．０１、***ｐ＝０．０００１－０．００１、****ｐ＜０．０００１。 （Ａ）Ｈｈ＋αＩＬ１０Ｒ大腸炎の誘導後の全結腸組織におけるＯｓｍおよびＯｓｍｒ発現の時間経過動態、（Ｂ）における関連する組織学的疾患の重症度（ｎ＞４マウス／時間点）。（Ｃ）組織学的重症度バンド（健常、スコア＝０～１；軽度／中程度、スコア＝＞１～７、重症度、スコア＞７）を有する全結腸組織におけるＯｓｍおよびＯｓｍｒ発現の相関。３回の別個の実験からプールされた１群あたりｎ＞１５のマウス。＊ｐ＝０．０１－０．０５、＊＊ｐ＝０．００１－０．０１、＊＊＊ｐ＝０．０００１－０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を用いて計算した。 （Ａ－Ｂ）ＯＳＭおよびＯＳＭＲのｍＲＮＡ発現は、Ｏｘｆｏｒｄ ＩＢＤ患者または健常対照由来の腸切除試料からの腸粘膜ピンチ生検または粘膜の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析を介して評価された。（Ａ）健常対照（ｎ＝１３）、活動性疾患を有するＩＢＤ患者（ｎ＝４４）、活動性疾患を有する腸内位置が関与していないＩＢＤ患者（ｎ＝２１）、および活動性炎症の証拠のないＩＢＤ患者（ｎ＝１４）のＯＳＭ、ＯＳＭＲ、およびＯＳＭ指標（ＯＳＭｉ、相対的ＯＳＭおよびＯＳＭＲの産物）発現。疾患活動性／腸炎症は、試料採取時の内視鏡検査によって決定された。（Ｂ）パネル（Ａ）におけるように行われた分析であり、日常的な臨床病理学的評価中に決定された炎症の組織学的グレードによって分類された試料は以下の通りであった：健常対照（全休止）（ｎ＝１３）、休止ＩＢＤ（ｎ＝２７）、軽度から中程度の活性ＩＢＤ（ｎ＝２９）、および重度の活性ＩＢＤ（ｎ＝９）。Ｔｕｋｅｙの多重比較検定とともに一元配置ＡＮＯＶＡを用いて有意性を決定した。＊ｐ＝０．０１－０．０５、＊＊ｐ＝０．００１－０．０１、＊＊＊ｐ＝０．０００１－０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＯＳＭ発現とＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９（臨床的に確認された粘膜炎症バイオマーカーカルプロテクチンの成分）とのピアソン相関。データは、ＣＤ（ＧＳＥ５７９４５、ｎ＝２２０）およびＵＣ患者（ＧＳＥ２３５９７、ｎ＝１１２）から得られる。 （Ａ）健常対照（ｎ＝１３）対オックスフォードＩＢＤコホートからの活動性ＣＤ（ｎ＝１９）または活動性ＵＣ（ｎ＝２４）患者におけるＯＳＭおよびＯＳＭＲの発現。Ｔｕｋｅｙの多重比較検定とともに一元配置ＡＮＯＶＡを用いて有意性を決定した。（Ｂ）処置未経験の小児回腸ＣＤ患者（ｎ＝１６２）からの回腸粘膜生検と、年齢が一致した健常対照（ｎ＝４２）との比較。データポイントは、誤発見率補正（Ｑ＝１％）を用いたｔ検定によって決定された統計的有意差（ｘ軸）に対する６３個の異なるサイトカイン遺伝子（ｙ軸）に対する平均（±ｓ．ｅ．ｍ．）倍数のＩＢＤ濃縮を反映する。ＧＥＯエントリーＧＳＥ５７９４５から得られたデータ。＊ｐ＝０．０１－０．０５、＊＊ｐ＝０．００１～０．０１、＊＊＊ｐ＝０．０００１～０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 回腸嚢肛門吻合組織から採取された嚢生検におけるＯＳＭおよびＯＳＭＲの発現。データには、嚢炎（嚢組織の炎症）のないＵＣ患者、活動性嚢炎を有するＵＣ患者、および嚢炎のない家族性腺腫様ポリポーシス患者が含まれる。＊ｐ＝０．０１～０．０５、＊＊ｐ＝０．００１～０．０１、Ｄｕｎｎの多重比較検定とともにＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を用いて決定した。ＧＥＯエントリーＧＳＥ６５２７０から得られたデータ。 （Ａ－Ｃ）オックスフォードＩＢＤ患者由来の腸粘膜生検におけるｑＰＣＲによって評価されたＯＳＭおよびＯＳＭＲ発現。（Ａ）患者の性別による発現。（Ｂ）診断時の患者の年齢による発現。（Ｃ）疾患の期間（すなわち、診断日から生検採取時までの年期間）による発現。有意性は、ｔ検定（パネルＡ）および一元配置ＡＮＯＶＡ（パネルＢおよびＣ）を用いて決定した。 オックスフォードＩＢＤ患者由来の腸粘膜生検におけるｑＰＣＲによって評価されたＯＳＭおよびＯＳＭＲ発現。血清採取時の（Ａ）血清ＣＲＰ（Ｃ－反応性タンパク質）レベル、および（Ｂ）末梢血の白血球数と相関した発現。有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて決定した。 処置歴によって分類された患者におけるレベルを比較した、オックスフォードＩＢＤ患者由来の腸粘膜生検におけるｑＰＣＲによって評価されたＯＳＭおよびＯＳＭＲ発現。「外科手術」とは、外科的切除標本から直接採取された粘膜生検、または次いで外科的介入を必要とする患者から内視鏡的に採取された生検を指す。＊＊ｐ＝０．００１～０．０１、＊＊＊ｐ＝０．０００１～０．００１、ｔ検定を用いて決定した。 （Ａ－Ｄ）公的に利用可能な遺伝子発現データセットＧＳＥ１６８７９の分析。（Ａ）コホート（上段）またはＣＤ患者単独（下段）のすべての患者は、インフリキシマブ治療前の腸生検において相対的ＯＳＭ発現レベル（三分位にグループ化した）に従って分類された。次に、各群をインフリキシマブに対する臨床反応性の頻度について評価し、反応率を円グラフとして示した。処置に対する反応は、内視鏡的および組織学的な評価に基づく完全腸粘膜治癒と定義された。有意性をχ２分析を用いて決定した。（Ｂ）治療前生検において示された遺伝子の高発現（上三分位）対低発現（低三分位）を有する患者におけるインフリキシマブ反応率を比較するフィッシャーの正確な検定によって決定されたオッズ比および有意水準。高いオッズ比の値はインフリキシマブに対する臨床的反応性の可能性が低いことを示す。＊ｐ＝０．０１～０．０５、＊＊＊ｐ＝０．０００１～０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 公的に利用可能な遺伝子発現データセットＧＳＥ１６８７９の解析。（Ａ）全員がインフリキシマブ治療前に高いＯＳＭ指標発現を有するＵＳ患者における、インフリキシマブ前とインフリキシマブ後の生検のＯＳＭ指標発現の比較。ＯＳＭ指数発現は、処置反応性患者においてのみインフリキシマブ治療後に一貫して低下する。有意性を対応のあるｔ検定を用いて決定した。（Ｂ）インフリキシマブ反応性のＵＣ患者由来のインフリキシマブ前対後の生検における、示された遺伝子の腸内発現における平均倍数変化（±９５％ＣＩ）。有意性を対応のあるｔ検定を用いて決定した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＧＳＥ１６８７９データセット（合わせたコホートおよびＣＤのみを示す）におけるＯＳＭ指標発現およびインフリキシマブ反応性の可能性に関する受信者動作特性（ＲＯＣ）解析、ならびにＵＣ（ＧＳＥ２３５９７およびＧＳＥ１２２５１）におけるインフリキシマブ反応性に関する他の２つの研究。全てのプロットは、治療前生検からの遺伝子発現データを用いて生じさせた。 インフリキシマブ治療（ＧＥＯデータセットＧＳＥ２３５９７）後の０、８および３０週目の結腸生検におけるＯＳＭおよびＯＳＭＲ発現の関連。患者は、８週目に臨床反応がない患者（黒）、８週目に最初に反応するが３０週目には難治性である患者（灰色）、および８週目および３０週目で持続的反応性である患者（白色）に分類される。Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定とともに一元配置ＡＮＯＶＡを用いて有意性を決定した。＊ｐ＝０．０１～０．０５、＊＊ｐ＝０．００１～０．０１、＊＊＊ｐ＝０．０００１～０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＧＳＥ１６８７９データセットにおけるＯＳＭ、ＯＳＭＲおよびサイトカインｍＲＮＡ発現の階層的クラスタリング分析。ＯＳＭおよびＯＳＭＲを含む一般的な遺伝子クラスタは陰影で示され、Ｔｈ１７ Ｔヘルパー細胞分化を誘導するサイトカイン、ならびにＴｈ１７とＴｈ１免疫反応の両方のエフェクターサイトカインを富化にすることは注目に値する。対照およびインフリキシマブ難治性または反応性ＩＢＤ患者由来の標本をヒートマップ下の陰影バーで特定する。全てのデータはインフリキシマブ前の検体由来である。 （Ａ）ＧＳＥ１６８７９におけるＯＳＭ高対ＯＳＭ低の標本における代表的なＴｈ１７、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカインの平均遺伝子発現の差異。各ドットは、ＵＣ、結腸ＣＤ、または回腸ＣＤの平均差を表す。差異が（ｔ検定に基づいて）統計的に有意である疾患のサブタイプ数は、記号（関連する凡例に定義されている）によって示される。（Ｂ）Ｏｘｆｏｒｄコホート由来のＯＳＭ高（上半分）対ＯＳＭ低（下半分）のＩＢＤ粘膜生検における遺伝子発現の差異。データは、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較補正とともにｔ検定を用いて決定された、統計的有意性に対してプロットされた倍数差として表される。 （Ａ）指示された微生物リガンドを１００ｎｇ／ｍｌで１６時間刺激された２人の健常なヒトドナー由来の単球において、ＥＬＩＳＡによって決定したＯＳＭ分泌。（Ｂ）加熱殺菌された細菌（１６時間のインキュベーション）に反応する２人の健常なドナー由来の末梢血単球によるＯＳＭ分泌を測定する代表的な実験。ＡＩＥＣ、接着性侵襲性大腸菌（Escherichia coli）。 （Ａ）細菌により刺激された単球におけるＯＳＭと他のサイトカイン（ｑＰＣＲによるアッセイ）とのスピアマン相関（図１７）。（Ｂ）ヒト腸内抗原提示細胞におけるＯＳＭ発現。データは、ヒト腸組織から単離されたＦＡＣＳ選別による抗原提示細胞サブセット由来の公的に入手可能な遺伝子発現データセット（ＧＳＥ４９０６６）に由来する。細胞は、系統（ＣＤ３／１９／２０／５６）－ＨＬＡ－ＤＲｈｉｇｈプラス／マイナス示された表面マーカーとして選別された。ＣＤ１４＋ＣＤ１６３ｌｏｗサブセットは、他の示されたＡＰＣサブセットと比較して優れたＴｈ１７誘導能を有することが示されている。（Ｃ）２セットの健常なドナー単球における細菌により刺激後の平均サイトカイン発現（ｑＰＣＲによるアッセイ）の階層的クラスタリング。ＯＳＭおよびＯＳＭＲを含むクラスタを陰影で示す。 ＯＳＭおよびＯＳＭＲの発現は、ＰＭＡ（ホルボールミリステートアセテート）およびイオノマイシンによる刺激後に、エクスビボで直接、末梢血ナイーブおよび記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞において評価された。（Ａ）総ＣＤ４＋ＣＤ２５－生Ｔ細胞を２人の代表的なドナーからＦＡＣＳ精製し、８時間刺激した。ｑＰＣＲによって定量化されたＯＳＭおよびＯＳＭＲの遺伝子発現が示される。（Ｂ）（Ａ）に記載されるように、刺激後の上清中のＯＳＭタンパク質をＥＬＩＳＡによって定量した。（Ｃ）総ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）をＰＭＡ／イオノマイシンで再刺激し、ゲーティングしたＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋集団内のＯＳＭ＋細胞の頻度は、ヒトＯＳＭに特異的な抗体を用いた細胞内サイトカイン染色によって分析された。 （Ａ）総ＣＤ４５ＲＯ＋またはＣＣＲ６＋ＣＤ４５ＲＯ＋記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞をＦＡＣＳ精製し、Ｔｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２および／またはＴｈ１７条件下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共に培養した。ＣＣＲ６＋Ｔ細胞集団は、Ｔｈ１７細胞において富化されていると考えられる。培養７日後のＯＳＭＲ遺伝子発現を示す。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けていない細胞では発現は検出されなかった。（Ｂ－Ｃ）Ｔｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ２２、Ｔｈ９、Ｔｒｅｇ、またはＴｈ１７極性化条件下で５日間、ＯＳＭの有無により、抗ＣＤ３／ＣＤ２８とともに培養された健常なヒトドナー由来のナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞。（Ｂ）ＯＳＭ不含条件と比較した、ＯＳＭ処置条件（２０ｎｇ／ｍｌのＯＳＭ）における相対的細胞増殖。＊＊ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定。（Ｃ）ヘルパーＴ細胞の重要な転写因子（左）およびエフェクターサイトカイン（右）のｍＲＮＡ発現。示されたデータは、ＯＳＭを伴うＴｈ１７条件対ＯＳＭを伴わないＴｈ１７条件の相対的発現を表す。＊ｐ＝０．０１～０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、１標本ｔ検定。 Ｈｈ＋αＩＬ１０Ｒ大腸炎プロトコール（方法を参照）に供されたマウスからの中間－大腸切片の代表的なヘマトキシリン＆エオシン染色した断面。比較された２つの遺伝子型は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＯＳＭノックアウト（Ｏｓｍ－／－）同腹仔である。スケールバーは、０．５ｍｍ（上段）および０．２５ｍｍ（下段）を示す。矢印は、粘膜下浮腫（両頭）および陰窩膿瘍（片頭）を含む重度の炎症の顕著な特徴を示す。 野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＨｈ＋αＩＬ１０Ｒ大腸炎プロトコールに供されたＯｓｍ－／－同腹仔における大腸炎の重症度の比較。（Ａ）２つの独立した実験からプールされたマウスの組織病理学的スコア（方法に記載されたように決定した）。（Ｂ）全体的な組織学的スコアが異なる成分に分割された、パネル（Ａ）からの大腸炎マウスであり、それぞれを０～３の重症度スケールで定量化した。（Ｃ）マウス（パネルＡおよびＢと同じ動物）の全結腸組織における前炎症性サイトカインであるＩｌ６およびＩｌ１ｂ対Ｉｌ１０（抗炎症性）の発現。＊ｐ＝０．０１～０．０５、＊＊ｐ＝０．００１～０．０１、＊＊＊ｐ＝０．０００１～０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて決定した。 マウスＯＳＭを中和するように設計された新規組換えタンパク質（Ｏ－ＲＦＰ、出典：Brolund et al, BMC Biotechnology, 2011）は、市販のヤギポリクローナル抗ＯＳＭ抗体と比較して、インビトロでのＯＳＭ中和能について試験された。このアッセイは、中和剤のモル比の増加とともに、１０ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＯＳＭを用いてエクスビボで培養されたマウス結腸線維芽細胞を処置することを伴う。ＯＳＭ標的遺伝子の発現を２時間後に評価した；ここに示されるのは、ＳＴＡＴ３転写標的ＳＯＣＳ３の結果である。（Ａ）５０％中和（１２．１：１）に必要とされる計算されたモル比を有する市販のポリクローナル抗体の中和曲線。（Ｂ）パネル（Ａ）と同様に、５０％中和のために１．７：１のモル比だけを必要とするＯ－ＲＦＰを使用する。 Ｏ－ＲＦＰはマウスタンパク質をコードし、マウスＯＳＭに対して標的化される。この構築物は、Brolund et al., BMC Biotechnology, 2011に記載されている「ｍＯＳＭ－ＲＦＰ」の改変である。簡単に言うと、組換え受容体は、Ｎ末端からＣ末端に（ａ）マウスＯＳＭＲのドメイン１、２、３および４；（ｂ）フレキシブルリンカーペプチド；（ｃ）マウスｇｐ１３０のドメイン２および３；（ｄ）Ｆｃタグ（マウスＩｇＧ２Ａ）で構成された融合タンパク質である。構築物をＨＥＫ－２９３細胞において発現させ、標準的なプロテインＧカラム精製を用いて精製し、Ｌｏｎｚａによって提供される試験サービスを用いてエンドトキシン不含であることを確認した。この薬剤を用いたインビボ実験について、ＩｇＧ２Ａ－Ｆｃタンパク質を処置対照と同一の条件下で調製した。 腸の炎症を処置するための関連する標的としてのＯＳＭの確立。（Ａ）ヒトＣＤ切除（ｎ＝５）からの粘膜外植片培養におけるＩＬ１Ｂ発現。外植片は、２０μｇ／ｍｌの抗ＯＳＭ中和抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、クローン１７０２２）、適合アイソタイプ対照抗体、またはインフリキシマブ（抗ＴＮＦ）を用いて２４時間処置された。データポイントは、未処置試料に対して標準化された、全外植片ｍＲＮＡにおけるＩＬ１Ｂの平均（±ｓ．ｅ．ｍ．）変化を表す。これらのデータは、エクスビボのヒト組織におけるＯＳＭ遮断の抗炎症効果がインフリキシマブ（抗ＴＮＦ）のものに匹敵し得ることを示唆している。ｌｏｇ変換前の１の仮説平均に対して１試料ｔ検定を用いて有意性を計算した。（Ｂ）Ｈｈ＋αＩＬ１０Ｒ大腸炎プロトコールに供され、７日目から開始して、抗ＴＮＦモノクローナル抗体、ＩｇＧ－Ｆｃ対照タンパク質、またはＯ－ＲＦＰを用いて処置された野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの全組織病理学スコア。（Ｃ）パネル（Ｂ）に示されたマウスの組織病理学的成分スコア。（Ｄ）パネル（Ｂ／Ｃ）において処置され、屠殺の１日前に生存している麻酔動物の内視鏡的評価によって決定されたマウスの代表的な大腸炎スコア。これは、標準的なプロトコール（Becker et al, Nature Protocols, 2007）に従って実施された。＊ｐ＝０．０１～０．０５、＊＊ｐ＝０．００１～０．０１、＊＊＊ｐ＝０．０００１～０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて決定した。 マウス腸組織におけるＯＳＭおよびＯＳＭＲの重要な細胞供給源の特定。生存可能なＦＡＣＳ精製された細胞集団を定常状態（ｎ＝４）の消化された結腸組織およびＨｈ＋αＩＬ１０Ｒプロトコール（ｎ＝１０）に供された大腸炎マウスから単離した。細胞集団を同定および単離するために使用されたマーカーは、以下の通りである：上皮細胞（ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋）；内皮細胞（ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ－ＣＤ３１＋）；ｇｐ３８－間質（ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ－ＣＤ３１－ｇｐ３８－）；ｇｐ３８＋間質（ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ－ＣＤ３１－ｇｐ３８＋）；顆粒球（ＣＤ４５＋ＦＳＣｉｎｔ／ｈｉＳＳＣｈｉ）；ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋）；ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４－）；Ｂ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ１９＋）；他の単核細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ１９－ＳＳＣｌｏ）。単離された細胞をＲＮＡ抽出のために処理し、ＯｓｍおよびＯｓｍｒ発現をｑＰＣＲによって評価した。＊ｐ＝０．０１～０．０５、＊＊ｐ＝０．００１～０．０１、ｔ検定によって決定した。 ヒト腸切除標本（ｎ＝１０）からの粘膜細胞集団のフローサイトメトリー分析。（Ａ）白血球（ＣＤ４５＋）、上皮細胞（ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ＋）、内皮細胞（ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ－ＣＤ３１＋）、ｇｐ３８－ＩＣＡＭ－１ｌｏ間質（ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ－ＣＤ３１－ｇｐ３８－ＩＣＡＭ－１ｌｏ）およびｇｐ３８＋ＩＣＡＭ－１ｈｉ間質（ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ－ＣＤ３１－ｇｐ３８＋ＩＣＡＭ－１ｈｉ）による代表的なＯＳＭＲ表面発現。ＯＳＭＲ＋頻度は、パネル（Ｂ）の全ての集団について提供される。Ｔｕｋｅｙの多重比較検定とともに一元配置ＡＮＯＶＡを用いて有意性を決定した。 （Ａ）ｑＰＣＲによって決定される初代ヒト結腸間質細胞（ＣＣＤ１８Ｃｏ）における様々なサイトカイン受容体遺伝子のベースライン発現。ＯＳＭＲファミリーの受容体が示される。（Ｂ）組換えＯＳＭ、ＩＬ－６、ＴＮＦ、またはＩＬ－１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いたＣＣＤ１８Ｃｏ細胞の２０分間の刺激後の重要なシグナル伝達経路の活性化についてのウェスタンブロット分析。β－アクチンは充填対照として提供される。 （Ａ）Ｈｈ＋αＩＬ１０Ｒプロトコールに従って野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて大腸炎を誘導し、実験群はＰＢＳまたは０．０４ｍｇ／ｋｇの組換えＯＳＭの腹腔内注射を受けた（方法を参照）。結腸薄層固有の細胞集団は、間質および内皮細胞活性化の証拠のためにフローサイトメトリーによって分析された。具体的には、ＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ－ｇｐ３８＋ＣＤ３１－間質細胞およびＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ－ｇｐ３８－ＣＤ３１＋内皮細胞を表面ＩＣＡＭ－１発現（炎症性活性化のマーカー）および細胞内Ｋｉ－６７（増殖のマーカー）について染色した。群あたりｎ＝４～６。（Ｂ）対照Ｆｃタンパク質またはＯ－ＲＦＰを用いて処置されたマウスにおけるＨｈ＋αＩＬ１０Ｒ大腸炎の定常状態または誘導後における結腸内皮細胞およびｇｐ３８＋間質細胞上のＩＣＡＭ－１表面発現のフローサイトメトリー分析（群あたりｎ＝４～９、２つの独立した実験のうちの代表のもの）。大腸炎Ｏｓｍ－／－マウス対野生型同腹仔において同様の結果が見られた。＊ｐ＝０．０１～０．０５、＊＊ｐ＝０．００１～０．０１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて決定した。 エクスビボで培養したマウス結腸間質細胞の処置であり、（Ａ）において１０ｎｇ／ｍｌのマウスＯＳＭ、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ、または両方の組み合わせによる処置の、２時間後の代表的な遺伝子の発現における影響を示す（群あたりｎ＝６～７個の独立した培養物）。Ｄｕｎｎの多重比較検定とともにＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定によって決定された有意性。（Ｂ）ＯＳＭファミリーの３つの主要メンバー：ＯＳＭ、ＩＬ－６、およびＬＩＦ（すべて１０ｎｇ／ｍｌ；群あたりｎ＝２～４、７つの独立した培養からプールされた）によって誘発されたマウス間質細胞における反応の相対強度（Ｉｌ６発現の誘導によって測定）。有意性は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定とともに一元配置ＡＮＯＶＡによって決定された。＊ｐ＝０．０１～０．０５、＊＊ｐ＝０．００１～０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 （Ａ）公的に入手可能なトランスクリプトームデータセットＧＳＥ５７９４５（回腸ＣＤおよび対照粘膜）におけるヒトサイトカインおよびケモカイン遺伝子発現の階層的クラスタリング。ＯＳＭの発現に最も強く関連する遺伝子セットは、下部パネルで強調され、好中球（例えば、ＣＸＣＬ１）、単球（例えば、ＣＣＬ２／ＣＣＬ７）、およびＴｈ１細胞（ＣＸＣＬ９／１０／１１）を誘引するＴｈ１／Ｔｈ１７反応およびケモカインに関連する広範囲のサイトカインを特徴とする。 （Ａ）１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＯＳＭを用いて刺激されたＣＣＤ１８Ｃｏ細胞（ヒト結腸間質細胞）における遺伝子発現動態。ここに示されているのは、図３０において強調された異なる機能的クラスからの代表的な遺伝子である：ＣＣＬ２（単球走化性物質）；ＣＸＣＬ９（Ｔｈ１細胞走化性物質）；ＣＸＣＬ１（好中球化学誘引物質）；およびＩＣＡＭ１（白血球組織の浸潤および保持に必要とされる重要な細胞接着分子）。データポイントは、三連の培養物における平均（±ｓ．ｅ．ｍ．）誘導レベルを表す。（Ｂ）ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞はＬＩＦ（ＯＳＭの最も近い同族体）に反応せず、ＯＳＭはＬＩＦＲ（ＯＳＭの代替の受容体サブユニット）を介して結腸間質細胞を刺激しない。三連培養物を１０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦまたは１０ｎｇ／ｍｌのＯＳＭ単独で、または１５μｇ／ｍｌヤギＩｇＧ対照もしくは１５μｇ／ｍｌ抗ＬＩＦＲポリクローナルヤギＩｇＧの存在下で２時間刺激した。有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定とともに一元配置ＡＮＯＶＡを用いて決定された。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 １０ｎｇ／ｍｌのＯＳＭ、ＩＬ－６、ＴＮＦ、またはそれらの組み合わせを用いて三連のＣＣＤ１８Ｃｏ培養物を２時間処理して、これらのサイトカインからの刺激の相対強度および可能性のある相乗作用を評価する。ＯＳＭおよびＴＮＦは、分析された反応遺伝子に依存して、相加的効果と相乗的効果の両方を発揮する。 １０ｎｇ／ｍｌのＯＳＭ、ＩＬ－１β、またはＯＳＭとＩＬ－１βの両方を用いて三連のＣＣＤ１８Ｃｏ培養物を２時間処理して、これらのサイトカイン間の機能的相乗作用を評価する。ＯＳＭおよびＩＬ－βは、分析された反応遺伝子に依存して、相加的効果と相乗的効果の両方を発揮する。有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定とともに一元配置ＡＮＯＶＡを用いて決定された。＊＊＊ｐ＝０．０００１～０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 非炎症性外科的切除標本（条件ごとにｎ＝３～４の独立した培養物）から単離および増殖したヒト結腸間質細胞の一次エクスビボ培養を用いて、図３２に記載したものと同じ処置および分析戦略を展開した。有意性は、対照標準化の前に対応のあるｔ検定を用いて決定した。
治療
本発明は、いくつかの態様において、抗ＴＮＦα療法、ＴＮＦαのアンタゴニスト、またはＯＳＭおよび／もしくはＯＳＭＲのアンタゴニストによる処置方法に関する。「抗ＴＮＦα療法」は、ＴＮＦαに対して指向され、またはＴＮＦαに拮抗する、例えば、ＴＮＦαのアンタゴニストを投与する治療的処置である。ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲのアンタゴニストは、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲ機能を低下させる薬剤である。アンタゴニストは、任意の治療上または予防上有効な量までＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲの機能を減少させることができる。例えば、機能は、適宜、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％減少させることができる。アンタゴニストは、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲの機能を無効にし得る（すなわち、機能が１００％低下する）。ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲ機能は、任意の適切な技術によって測定することができる。
アンタゴニストは、ＴＮＦα、ＯＳＭもしくはＯＳＭＲ活性のアンタゴニストまたはＴＮＦα、ＯＳＭもしくはＯＳＭＲ発現のアンタゴニストであってもよい。アンタゴニストは、例えば、ＴＮＦα、ＯＳＭもしくはＯＳＭＲの産生もしくは発現を減少させることによって、またはＴＮＦα、ＯＳＭもしくはＯＳＭＲの分解を増加させることによって、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲの量を減少させることができる。アンタゴニストは、細胞からの可溶性ＴＮＦαまたはＯＳＭの放出を減少させることができる。アンタゴニストは、可溶性もしくは細胞外ＴＮＦαもしくはＯＳＭおよび／または受容体に結合したＴＮＦαもしくはＯＳＭおよび／または膜貫通ＴＮＦαを中和または除去することができる。アンタゴニストは、ＴＮＦαまたはＯＳＭと１つ以上の受容体との有効な結合を阻害または防止することができる。アンタゴニストは、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲの転写を低下させることができる。アンタゴニストは、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼなどの方法を用いた部位特異的突然変異誘発によって、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲのＤＮＡを破壊し得る。アンタゴニストは、例えばアンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡ干渉によって、ＴＮＦα、ＯＳＭもしくはＯＳＭＲのｍＲＮＡレベルを低下させ、またはＴＮＦα、ＯＳＭもしくはＯＳＭＲのｍＲＮＡのプロセッシングを干渉し得る。アンタゴニストは、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲのタンパク質分解を増加させることができる。アンタゴニストは、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲの天然の阻害物質のレベルを増加させることができる。アンタゴニストは、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化などの翻訳後修飾によって、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲの機能を低下させることができる。
ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲアンタゴニストは、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲに特異的であり得、すなわち、それは、ＴＮＦα、ＯＳＭもしくはＯＳＭＲに対して主にもしくは排他的に作用し、または他の分子に優先してＴＮＦα、ＯＳＭもしくはＯＳＭＲに作用する。例えば、抗ＴＮＦα療法は、２種類のＴＮＦが同じ受容体を利用することができるとしても、好ましくはＴＮＦαに作用するが、ＴＮＦβには作用しない。
ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニストは、Ｔｈ１７ヘルパーＴ細胞もしくはＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＴｈ１７経路の発生を阻害し得る。アンタゴニストは、Ｔｈ１７条件下で活性化されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を阻害することができる。アンタゴニストは、Ｔｈ１７条件下で活性化されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の生存を低下させ、または阻害することができる。アンタゴニストは、Ｔｈ１７細胞におけるＴｈ２サイトカインの発現を増加させることができる。
代替的にまたは加えて、ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニストは、間質および／または病原性線維症の異常な活性化を阻害し得る。ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニストは、組織の血管分布、白血球の動員および保持、ならびに／または局所的炎症過程を阻害し得る。ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニストは、上皮増殖を阻害し得る。ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニストは、慢性腸炎に関連する重症な有害事象である形成異常および新生組織形成の発症を阻害し得る。
いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、抗体、小分子、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子（例えば、アンチセンスＲＮＡもしくはモルホリノ）、または干渉ＲＮＡ（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）もしくは改変されたＲＮＡｉ治療的プロドラッグ、例えば、短鎖干渉リボ核酸中性（ｓｉＲＮＮ））である。
抗体
アンタゴニストは、抗ＴＮＦα、抗ＯＳＭもしくは抗ＯＳＭＲ抗体、またはその抗原結合フラグメントであり、すなわち、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲに特異的に結合し（以下に定義される）、およびＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲ活性を中和または阻害する抗体またはそのフラグメントである場合がある。例えば、アンタゴニストは、単離もしくは複合体化されたナノボディ（単一ドメイン抗体；ｓｄＡｂ）もしくはＦａｂ’フラグメントであってもよく、または二重特異的治療薬（ｍＡｂ２）としての代替標的に対する特異的Ｆａｂドメインを有する、単離もしくは複合体化された修飾Ｆｃ領域、例えばＦｃａｂであってもよい。抗体は、二重特異性抗体、例えば、ＯＳＭとＴＮＦαの両方を標的とする二重特異性抗体である場合がある。本発明に従って使用するための抗体はまた、以下にさらに記載される。アンタゴニストは、合成の抗原結合スキャホールドまたは合成抗体であってもよく、例えば、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲに特異的なアルファボディ、アフィボディ、アフィチン、アンチカリン、モノボディまたはアドネクチンが挙げられる。
抗ＴＮＦα抗体の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブまたはゴリムマブである。
インフリキシマブおよびアダリムマブは、ＴＮＦαの全ての形態（細胞外、膜貫通および受容体結合）を中和することができる抗体の例である。インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）という商品名で販売されている）は、炎症性疾患および自己免疫疾患を処置するために使用される薬物である。インフリキシマブは、マウス結合性ＶＫおよびＶＨドメインならびにヒト定常Ｆｃ領域を含むキメラモノクローナル抗体である。インフリキシマブは、ＴＮＦαの可溶性形態（血液中の遊離浮遊性）および膜貫通形態（Ｔ細胞および同様の免疫細胞の外膜上に配置される）に高親和性で結合することによってＴＮＦαの生物活性を中和し、ＴＮＦαの有効な結合をその受容体により阻害または防止する。インフリキシマブはＴＮＦαに対して高い特異性を有し、ＴＮＦβを中和しないが、ＴＮＦβはＴＮＦαと同じ受容体を利用する。インフリキシマブは、例えば、乾癬、小児性クローン病、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬性関節炎、関節リウマチおよび潰瘍性大腸炎の処置に関して、米国食品医薬品局によって承認されている。
また、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）の商品名で販売されている）は、ＴＮＦαに結合し、ＴＮＦαがＴＮＦ受容体を活性化するのを防止する。アダリムマブは完全なヒトモノクローナル抗体から構築され、一方、インフリキシマブはマウス－ヒトキメラ抗体である。アダリムマブは、例えば、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬および若年性特発性関節炎の処置に関して、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。
抗ＴＮＦ療法は、ＴＮＦ受容体に対する中和抗体の投与を含み得る。典型的には、ＴＮＦ受容体に対する中和抗体は、ＴＮＦＲ１受容体に対する中和抗体であり、例えば、ヒト野生型ＴＮＦＲ１受容体である。ＴＮＦＲ１受容体に対する中和抗体の例としては、限定されないが、アトロサブが含まれる。アトロサブは、ヒトＴＮＦＲ１のアミノ酸１～７０に結合し、ＴＮＦＲ１媒介性のシグナル伝達を選択的に阻害する。
抗ＯＳＭ抗体の例は、米国特許出願公開第２０１４／０９９３１５号明細書および国際公開第２０１２／０６９４３３号パンフレットに記載されている。
抗ＯＳＭＲ抗体の例は、国際公開第２０１４／１９４２７４号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１６８８２９号パンフレットに記載されている。
非機能性形態および融合タンパク質
アンタゴニストは、天然（すなわち野生型）のＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲと競合し、それにより天然のＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲ機能を拮抗するＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲの機能低下性形態または非機能性形態であり得る。機能低下性形態の機能は、任意の量まで低下／減少させることができる。例えば、機能は、野生型ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲと比較して、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％低下／減少させることができる。
ヒトＴＮＦαのｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５９４．３）のｍＲＮＡ配列を配列番号１に示す。アミノ酸配列を配列番号２（ＮＰ＿０００５８５．２）に示す。ヒトＯＳＭのｍＲＮＡのｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０５３０．４）を配列番号３に示す。アミノ酸配列を配列番号４（ＮＭ＿０２０５３０．４）に示す。ヒトＯＳＭＲのｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３９９９．２）のｍＲＮＡ配列を配列番号５に示す。アミノ酸配列を配列番号６（ＮＰ＿００３９９０．１）に示す。アンタゴニストは、配列番号２、４もしくは６の機能低下性変異体もしくは非機能性変異体またはその任意のアイソフォームであり得る。機能低下性変異体は、配列番号２、４もしくは６のアミノ酸配列またはその任意のアイソフォームから変化し、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲとして機能する能力が低下したアミノ酸配列を有するタンパク質である。非機能性変異体は、配列番号２、４もしくは６のアミノ酸配列またはその任意のアイソフォームから変化し、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲとして機能する能力を持たないアミノ酸配列を有するタンパク質である。
例えば、ＯＳＭＲの非機能性変異体は、二量体受容体を形成し、またはシグナル伝達経路と相互作用する部位において１つ以上の突然変異を有し得る。ＯＳＭＲの非機能性変異体はまた、ＯＳＭを隔離する切断形態であってもよい。非機能性変異体はまた、ＯＳＭを隔離する受容体の可溶性形態であり得る。
ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲとして機能する変異体の能力は、当該技術分野において公知である任意の方法を用いてアッセイすることができる。機能低下性変異体および非機能性変異体の対比機能能力は、典型的には、配列番号２、４または６などの野生型ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲと対比して測定される。
配列番号２、４もしくは６のアミノ酸配列またはその任意のアイソフォームの全長にわたって、変異体は、アミノ酸同一性に基づいて、その配列に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％相同であり得る。２００以上のストレッチ、例えば、３００、４００、５００、６００、７００、８００、１０００、１５００もしくは２０００またはそれを超える連続したアミノ酸にわたって、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が存在し得る（「ハード相同性」）。
当該技術分野における標準的な方法を用いて相同性を決定することができる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、デフォルト設定で使用される、相同性を計算するために使用可能なＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。例えば、Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S.F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載されているように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、相同性またはラインアップ配列（例えば、同等残基または対応する配列を（典型的には、それらのデフォルト設定で）特定すること）を計算することができる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて公的に入手可能である。
変異体は、配列番号２、４もしくは６のフラグメントまたはその任意のアイソフォームを含み得る。このようなフラグメントは、典型的には、配列番号２、４もしくは６またはその任意のアイソフォームの少なくとも１つの機能的ドメイン、例えば、結合ドメインを保持するが、非機能性である。フラグメントは、長さが少なくとも６００、７００、８００または９００アミノ酸であってもよい。上記ポリペプチドに、１つ以上のアミノ酸を代替的にまたは付加的に加えてもよい。
アンタゴニストは、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲ（または上記のＴＮＦα、ＯＳＭもしくはＯＳＭＲタンパク質のフラグメント）および異種タンパク質配列を含む融合タンパク質またはキメラであり得る。融合タンパク質は、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲのデコイ結合パートナーとして作用し、それによりＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲ活性を阻害し得る。一実施形態において、アンタゴニストは、ＯＳＭＲ、ｇｐ３０および免疫グロブリンＦｃ領域、例えばＩｇＧ２ＡのＦｃ領域を含むＯＳＭ受容体融合タンパク質である。
一実施形態において、キメラは、可溶性ＴＮＦαまたはＯＳＭ受容体キメラである。可溶性ＴＮＦ受容体キメラの例としては、限定されないが、レネルセプトおよびエタネルセプトが挙げられる。エタネルセプトは、ＴＮＦαに結合し、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチなどの自己免疫疾患を含むヒトおよび他の動物における過剰な炎症を伴う疾患において、および潜在的には、過剰なＴＮＦαによって媒介される様々な他の疾患においてＴＮＦαの役割を低減させる。
核酸
アンタゴニストは、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲに対する修飾核酸、例えばアプタマーであってもよい。アンタゴニストは、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲのアンタゴニストまたは非機能性変異体をコードするポリヌクレオチドであり得る。アンタゴニストまたは非機能性変異体は、本明細書において検討されているもののいずれかであり得る。
核酸などのポリヌクレオチドは、２つ以上のヌクレオチドを含むポリマーである。ヌクレオチドは天然に存在するか、または人工的であってもよい。ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖、およびリン酸、２’Ｏ－メチル、２’－メトキシ－エチル、ホスホラミデート、メチルホスホネートまたはホスホロチオエート基などの少なくとも１つの連結基を含有する。核酸塩基は、典型的には複素環式である。核酸塩基としては、限定されないが、プリンおよびピリミジン、より具体的にはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）およびシトシン（Ｃ）が挙げられる。糖は、典型的にはペントース糖である。ヌクレオチド糖には、限定されないが、リボースおよびデオキシリボースが含まれる。ヌクレオチドは、典型的には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、典型的には、一リン酸、二リン酸または三リン酸を含む。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に結合していてもよい。
ヌクレオチドには、限定されないが、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５－メチルシチジン一リン酸、５－メチルシチジン二リン酸、５－メチルシチジン三リン酸、５－ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、５－ヒドロキシメチルシチジン二リン酸、５－ヒドロキシメチルシチジン三リン酸、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、５－メチル－２’－デオキシシチジン一リン酸、５－メチル－２’－デオキシシチジン二リン酸、５－メチル－２’－デオキシシチジン三リン酸、５－ヒドロキシメチル－２’－デオキシシチジン一リン酸、５－ヒドロキシメチル－２’－デオキシシチジン二リン酸、および５－ヒドロキシメチル－２’－デオキシシチジン二リン酸が含まれる。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。
ヌクレオチドは追加の修飾を含有することができる。特に、適切な修飾ヌクレオチドには、限定されないが、２’－アミノピリミジン（例えば、２’－アミノシチジンおよび２’－アミノウリジン）、２’－ヒドロキシルプリン（例えば、２’－フルオロピリミジン（例えば、２’－フルオロシチジンおよび２’－フルオロウリジン）、ヒドロキシルピリミジン（例えば、５’－α－Ｐ－ボラノウリジン）、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチルアデノシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルシチジンおよび２’－Ｏ－メチルウリジン）、４’－チオピリミジン（例えば、４’－チオウリジンおよび４’－チオシチジン）が含まれ、ヌクレオチドは、核酸塩基の修飾を有する（５－ペンチニル－２’－デオキシウリジン、５－（３－アミノプロピル）－ウリジンおよび１，６－ジアミノヘキシル－Ｎ－５－カルバモイルメチルウリジン）。
ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドは、酸化またはメチル化され得る。ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドが損傷され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ピリミジン二量体を含み得る。このような二量体は、典型的には、紫外線による損傷に関連する。
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、任意の様式で互いに結合することができる。ヌクレオチドは、リン酸、２’Ｏ－メチル、２’メトキシ－エチル、ホスホラミデート、メチルホスホネートまたはホスホロチオエート結合によって連結されていてもよい。ヌクレオチドは、典型的には、核酸の場合のように糖およびリン酸基によって結合される。ヌクレオチドは、ピリミジン二量体の場合のように核酸塩基を介して連結されていてもよい。
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であり得る。ポリヌクレオチドは、当該技術分野において公知である任意の合成核酸であってもよく、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸、またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよい。
ポリヌクレオチド配列は、例えば、特異的プライマーを伴うＰＣＲ、組換え複製可能な（クローニング）ベクターおよび適切な宿主細胞を使用して、当該技術分野における標準的方法を用いて誘導および複製することができる。このような標準的技術を用いてポリヌクレオチド配列を生成することは、一般に容易である。
アンチセンスとＲＮＡｉ
ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲのアンタゴニストは、例えば、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲの発現をノックダウンすることによって、個体に存在するＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲの量を低下させることができる。タンパク質発現をノックダウンするためのアンチセンスおよびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術は、当該技術分野において周知であり、標準的方法を用いて、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲの発現をノックダウンすることができる。
アンチセンス技術とｓｉＲＮＡ技術の両方はｍＲＮＡに干渉する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの一セクションに結合する（ハイブリッド形成する）ことによってｍＲＮＡと干渉する。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに相補的であるように設計される（オリゴヌクレオチドは、以下に検討するように１００％相補的である必要はない）。換言すれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはｃＤＮＡの一セクションであってもよい。さらに、オリゴヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列に対して１００％同一でなくてもよい。これについてはまた以下に検討される。
ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡに結合し、タンパク質発現を阻害することができる、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などの二本鎖ＲＮＡの使用を伴う。
したがって、アンタゴニストは、以降標的配列と呼ばれる、ＴＮＦα、ＯＳＭまたはＯＳＭＲのｍＲＮＡの特定の配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、典型的には、５０個以下のヌクレオチド、例えば、４０個以下、３０個以下、２２個以下、２１個以下、２０個以下、１０個以下または５個以下のヌクレオチドを有する短鎖ヌクレオチドポリマーである。本発明に用いられるオリゴヌクレオチドは、好ましくは長さが２０～２５ヌクレオチドであり、より好ましくは長さが２１または２２ヌクレオチドである。ヌクレオチドは天然に存在するか、または人工的であってもよい。ヌクレオチドは、上述されたもののいずれかであり得る。
標的配列の長さは、典型的には、オリゴヌクレオチドの長さに対応する。例えば、２１または２２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、典型的には、２１または２２ヌクレオチドの標的配列に特異的にハイブリダイズする。したがって、標的配列は、オリゴヌクレオチドの長さに関連して上記で検討された長さのいずれかであり得る。標的配列は、典型的には、標的ポリヌクレオチド内の連続したヌクレオチドである。
オリゴヌクレオチドは、標的配列に対して優先的または高親和性でハイブリダイズするが、実質的にハイブリダイズせず、他の配列に対してハイブリダイズしないかまたはごく低親和性でハイブリダイズする場合、標的配列に「特異的にハイブリダイズする」。
オリゴヌクレオチドは、少なくとも２℃、例えば、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃または少なくとも１０℃であり、他の配列についてその融解温度（Ｔｍ）より高いＴｍを有する標的配列にハイブリダイズする場合、「特異的にハイブリダイズする」。より好ましくは、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２℃、例えば、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも３０℃または少なくとも４０℃であり、他の核酸についてそのＴｍより高いＴｍを有する標的配列にハイブリダイズする。好ましくは、部分は、少なくとも２℃、例えば、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも３０℃または少なくとも４０℃であり、標的配列と１つ以上のヌクレオチドで、例えば、１、２、３、４、または５個以上のヌクレオチドで異なる配列についてそのＴｍより高いＴｍを有する標的配列にハイブリダイズする。この部分は、典型的には、少なくとも９０℃、例えば、少なくとも９２℃または少なくとも９５℃のＴｍを有する標的配列にハイブリダイズする。Ｔｍは、ＤＮＡマイクロアレイの使用を含む公知の技術を用いて実験的に測定することができるか、またはインターネット上で入手可能なものなどの公的に利用可能なＴｍ計算機を使用して計算することができる。
ハイブリダイゼーションを可能にする条件は、当該技術分野において周知である（例えば、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press；およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York (1995)）。ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェントな条件下で、例えば、３７℃で３０～３５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌおよび１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液の存在下で、続いて５０℃で１×（０．１６５０ＭのＮａ＋）から２×（０．３３ＭのＮａ＋）ＳＳＣ（標準クエン酸ナトリウム）中で２０回の洗浄を用いて行うことができる。ハイブリダイゼーションは、中程度のストリンジェントな条件下で、例えば、３７℃で４０～４５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌおよび１％ＳＤＳの緩衝液の存在下で、続いて５５℃で０．５×（０．０８２５ＭのＮａ＋）から１×（０．１６５０ＭのＮａ＋）ＳＳＣ中での洗浄を用いて行うことができる。ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェントな条件下で、例えば、３７℃で５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝溶液の存在下で、続いて６０℃で０．１×（０．０１６５ＭのＮａ＋）ＳＳＣ中で洗浄を用いて行うことができる。
オリゴヌクレオチドは、標的配列と実質的に相補的である配列を含み得る。典型的には、オリゴヌクレオチドは１００％相補的である。しかしながら、９５％、９０％、８５％、さらには８０％などのより低いレベルの相補性もまた許容され得る。オリゴヌクレオチドが標的配列に特異的にハイブリダイズする限り、１００％未満の相補性が許容され得る。したがって、オリゴヌクレオチドは、５、１０、１５、２０、２１、２２、３０、４０または５０ヌクレオチドの領域にわたって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のミスマッチを有し得る。
オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドなどの上記のヌクレオチドのいずれかを含み得る。オリゴヌクレオチドは、上記で検討した核酸のいずれかのものなどの核酸であり得る。オリゴヌクレオチドは、好ましくはＲＮＡである。オリゴヌクレオチドは一本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドはヘアピンを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、当該技術分野において公知である標準的な技術を用いて合成することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドを購入してもよい。
本発明は、抗ＴＮＦα療法以外の治療的処置に関する場合がある。個体は、炎症性疾患または状態を有し、処置は、抗炎症剤、例えばコルチコステロイドの投与である場合がある。
個体は、以下に記載される本発明の方法に従って診断されるかまたは予後診断されている場合がある。
「ＴＮＦα媒介性の疾患または状態」は、抗ＴＮＦα療法を用いて処置され得て、または抗ＴＮＦα療法に一般的に反応性である疾患または状態であり、すなわち、該療法は、その特定の疾患または状態を処置するための標準的な医学的知識および／または実施に従う。疾患または状態は、抗ＴＮＦα療法が、一般に、その疾患もしくは状態に対する共通または第一選択の処置ではない場合でも、またはその疾患もしくは状態を有する高い割合の個体が非反応性であることが分かっている場合でも、療法が一部の患者において効果的な処置であるものとして認識される限り、その用語に含まれる。ＴＮＦα媒介性の疾患または状態は、抗ＴＮＦα療法またはＴＮＦαアンタゴニストが疾患または状態の処置に関する規制承認を有する疾患または状態であり得る。ＴＮＦα媒介性の疾患または状態は、慢性腸炎、自己免疫疾患または炎症性疾患であり得る。ＴＮＦα媒介性の疾患または状態の例は、ＩＢＤ、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、炎症性皮膚疾患、例えば、乾癬（例えば、慢性重症プラーク乾癬）、腹水炎および喘息である。ＴＮＦα媒介性の疾患または状態は乾癬である場合がある。
ＩＢＤは、結腸および小腸の一群の炎症状態を指し、ときには消化管の他の領域にも影響を及ぼす。クローン病（結腸および回腸のクローン病を含む）および潰瘍性大腸炎は、ＩＢＤの最も一般的な形態である。他の形態には、コラーゲン蓄積大腸炎、リンパ球性大腸炎、便流変更性大腸炎、ベーチェット大腸炎、不確定大腸炎および急性重症大腸炎、例えば免疫チェックポイントインヒビターの生物学的療法を用いる処置によって誘導される急性重症大腸炎、例えば癌が含まれる。ＩＢＤはまた、結腸直腸癌の発症に関して危険因子である。本発明に関しては、ＩＢＤは大腸癌と関連している場合がある。本発明は、疾患の重症度または兆候にかかわらず、重症潰瘍性大腸炎、劇症性潰瘍性大腸炎、もしくは毒性メガコロンを有する患者、またはシクロスポリンもしくはインフリキシマブなどの従来の療法（生物学的または非生物学的のいずれか）に失敗した患者の処置、診断または予後診断において使用するためのものである場合がある。
慢性腸炎は、再発寛解型経路を伴う異常な炎症反応および組織損傷を伴う胃腸管を患う状態の範囲である。慢性腸炎状態には、潰瘍性大腸炎、クローン病、不確定大腸炎、顕微鏡下大腸炎（コラーゲン蓄積およびリンパ性大腸炎を含む）、難治性セリアック病（スプルー）、難治性好酸球性胃腸炎、好酸球性食道炎、慢性憩室疾および便流変更性大腸炎が含まれる。
実施例に示されるように、ＯＳＭは、ヒト腸間質細胞に同時投与された場合、ＴＮＦαおよびＩＬ－１βの相乗作用を実証している。ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニストは、好ましくは、抗ＴＮＦα療法および／またはＩＬ－１βのアンタゴニストを組み合わせて投与される。抗ＴＮＦα療法は、以下においてより詳細に検討される。ＩＬ－１βのアンタゴニストは、ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲについて上記で定義されたアンタゴニストのいずれかのタイプであり得る。ＩＬ－１βの承認されたアンタゴニストの例としては、限定されないが、アナキンラ（組換えＩＬ－１受容体アンタゴニスト）、リロナセプト（可溶性ＩＬ－１受容体）、およびカナキヌマブ（抗ＩＬ－１β ｍＡｂ）が挙げられる。ＩＬ－１βの種々の他のアンタゴニストは臨床開発中である（Dinarello et al, Nat Rev Drug Discovery, 2012を参照されたい）。方法は、二重特異性抗体、例えば、ＯＳＭまたはＯＳＭＲとＩＬ－１βの両方を標的とする二重特異性抗体の使用を含み得る。本発明による使用のための抗体はまた、以下にさらに記載される。
組み合わせとは、治療薬が個体に同時に投与され得ることを意味する。治療薬は、同じ治療レジメンの一部として、個体に別々にまたは任意の順序で逐次的に投与することができる。
本発明はまた、個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤの処置において、同時、別々または逐次使用のための、（ａ）ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニスト、ならびに（ｂ）抗ＴＮＦα療法および／またはＩＬ－１βのアンタゴニストを含有する製品を提供する。
診断／予後診断
本発明は、いくつかの態様において、診断または予後診断の方法に関する。診断には、個体が疾患もしくは状態を有するか否かを決定すること、および／または疾患もしくは状態の重症度を決定することが含まれる。予後診断には、個体が疾患もしくは状態を発症するか否か、処置を必要とするか否か、個体が必要とする処置のタイプ、処置に反応するか否か、疾患のエピソード、再発もしくは再燃を起こすか否かおよび／またはいつ起こすか、ならびに症状もしくは疾患のエピソード、再発もしくは再燃の重症度または持続期間を予測することを含む。
この方法は、個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲを測定することを含む。ＯＳＭとＯＳＭＲの両方を測定し、参照ＯＳＭおよびＯＳＭＲレベルまたは参照試料のＯＳＭおよびＯＳＭＲレベルと比較して、ＯＳＭ指標（ＯＳＭｉ）を決定する場合がある。ＯＳＭｉは、２つ以上の直接比較することができる試料における活性なＯＳＭ－ＯＳＭＲシグナル伝達の相対的確率に近似する。ＯＳＭｉの理論的根拠は以下の通りである：公開された文献に基づいて、ヒト組織におけるＯＳＭに対する優性受容体は、１つのｇｐ１３０鎖および１つのＯＳＭＲ鎖からなるヘテロ二量体である。Ｇｐ１３０は、ほとんどのヒト細胞型および組織において無差別的におよび高度に発現される；対照的に、ＯＳＭＲ発現は、より厳密に制御され、特定の細胞型および条件に限定される。したがって、ＯＳＭＲは、ＯＳＭ受容体複合体における制限因子である。ＯＳＭは、同様に、制御された形で表現される；したがって、１：１の化学量論で相互作用するＯＳＭおよびＯＳＭＲは、ＯＳＭ経路活性を制御する主要な制限因子である。組織試料中の相対的なＯＳＭまたはＯＳＭＲ発現は、その系における活性なＯＳＭシグナル伝達の理論的可能性に直接対応する。ＯＳＭｉは、直接比較することができる試料を含むデータセット内の試料中のＯＳＭおよびＯＳＭＲの相対的発現の産物である。
ＯＳＭｉの計算の例は、以下の通りである：本発明者らは、対照患者由来のものとＩＢＤ患者由来のものとの２つの腸粘膜生検を有する。定量的ＰＣＲを用いて、試料中のＯＳＭとＯＳＭＲの両方のｍＲＮＡレベルを、対応するハウスキーピング遺伝子レベル（例えば、ＲＰＬＰ０）と比較して見出す。これらの数値は以下の通りである：
対照：
ＯＳＭ－０．００００５８；ＯＳＭＲ－０．０００８３
ＩＢＤ：
ＯＳＭ－０．００２２；ＯＳＭＲ－０．００７３。
ＩＢＤ検体におけるＯＳＭの発現は、対照試料のものより３８倍高い。ＩＢＤ検体におけるＯＳＭＲの発現は、対照試料のものより８．８倍高い。したがって、対照試料のＯＳＭｉを１と指定すると、ＩＢＤ検体のＯＳＭｉは、２つの有効数字＝３８×８．８＝３３０に丸められる。
ＯＳＭｉを正しく解釈するために、入力値（すなわち、相対的なＯＳＭおよびＯＳＭＲ式）を適切な基準値に対して計算しなければならない。これは、状況に応じていくつかの形態をとる。ここでの例では、ＩＢＤ検体の論理コンパレーターが健常対照試料である。以下の例に含まれるデータでは、ＯＳＭｉ値は、与えられたデータセット内の中央値をコンパレーターとして用いて計算される。臨床シナリオにおいてＯＳＭｉを計算するために、不死化細胞株のパネルにおける平均ＯＳＭ／ＯＳＭＲ発現などの一貫した参照試料を各アッセイに使用することができる。
本発明の診断方法または予後診断方法は、診断または予後診断を改善するための１つ以上の他のアッセイまたは試験と併せて実施することができる。例えば、他のマーカーを分析に含めることができる。例としては、ＩＢＤの診断／予後診断のための血清Ｃ－反応性タンパク質（ＣＲＰ）である。Ｓ１００Ａ８は、腸の炎症の重症度のバイオマーカーである。糞便カルプロテクチンは、一般に、粘膜炎症の指標として病院においてアッセイされる。
診断または予後診断の方法は、慢性腸炎および／またはＩＢＤから寛解した個体が疾患再発を有するか否かを予測する方法である場合がある。個体が再発するか否かの予測には、個体が再発する可能性を判断すること、および／またはいつ再発するかを予測することが含まれる。個体は、抗ＴＮＦα療法、例えば、本明細書に記載される抗ＴＮＦα療法を用いた処置後、寛解している場合がある。
予後診断の方法は、個体が抗ＴＮＦα療法または抗ＯＳＭもしくは抗ＯＳＭＲ療法に、例えば、ＯＳＭおよび／もしくはＯＳＭＲのアンタゴニストに反応するか否かを予測する方法である場合がある。個体が反応するか否かの予測は、個体が反応する可能性を決定すること、および／または個体が反応する程度、例えば、個体の症状が処置によって緩和される程度を予測すること含む。
個体における抗ＴＮＦαまたは抗ＯＳＭ／ＯＳＭＲ療法に対する予測された反応性とは、個体が抗ＴＮＦαまたは抗ＯＳＭ／ＯＳＭＲ療法を受けることから利益または十分な程度の利益を得ることが期待されることを意味する。個体における抗ＴＮＦαまたは抗ＯＳＭ／ＯＳＭＲ療法に対する予測される非反応性とは、個体が抗ＴＮＦαまたは抗ＯＳＭ／ＯＳＭＲ療法を受けることから利益または十分な程度の利益を得ることが期待されないことを意味する。反応を予測する方法は、抗ＴＮＦαまたは抗ＯＳＭ／ＯＳＭＲ療法の投与前に行うことができる。次に、予測は、個体に適切な処置を選択または推奨するときに考慮され得る。あるいは、この方法は、抗ＴＮＦαまたは抗ＯＳＭ／ＯＳＭＲ療法による処置後に実施され、処置に対する個体の反応をモニターおよび予測するために使用され得る。典型的には、この方法は、個体が抗ＴＮＦαまたは抗ＯＳＭ／ＯＳＭＲ療法による処置に対する一次反応を有するか否か、すなわち、最初に処置を受けたときに個体が反応するか否かを予測するためのものである。この方法は、二次的な非反応性、すなわち、処置に最初に反応する個体が、後に処置に対する反応を停止しまたは処置にほとんど反応しないか否かを予測するための方法である場合がある。
本発明によれば、参照試料または参照レベルと比較して、個体におけるＯＳＭ、ＯＳＭＲおよび／またはＯＳＭｉのレベルの上昇は、疾患の存在に関する陽性の診断を示し、例えば、個体が関連疾患もしくは状態を有するまたはより重症な疾患を有することを示す。ＯＳＭ、ＯＳＭＲおよび／またはＯＳＭｉのレベルの上昇は、陰性の診断を示し、すなわち、例えば、個体が抗ＴＮＦα療法に反応せず、疾患から寛解した個体が再発を有し、または個体が疾患もしくは状態を発症するリスクが高いという個体の予後不良を示す。逆に、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、および／またはＯＳＭｉのレベルの低下は、例えば、個体が関連疾患もしくは状態を有していない、または重症疾患をほとんど有さないという陰性の診断を示す。ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、および／またはＯＳＭｉのレベルの低下は、陽性の診断を示し、すなわち、例えば、個体が抗ＴＮＦα療法に反応し、または疾患から寛解した個体が再発を有さず、もしくは疾患および状態を発症するリスクの増加がないという患者の予後良好を示す。個体が疾患または状態を有するか否かの診断について、参照試料またはレベルは、典型的には、関連する疾患もしくは状態を有さない、または疾患もしくは状態を有することが疑われるが、その後、疾患および状態を有さないことが確認される個体におけるＯＳＭ、ＯＳＭＲまたはＯＳＭｉのベースラインレベルを表す。適切な参照試料またはレベルは、本明細書に記載される診断または予後診断の他の方法について同様に選択することができる。
診断または予後診断の方法は、個体に適切な処置、すなわち診断または予後診断に基づく処置を選択または推奨することを含むことができる。次に、選択または推奨される処置は、個体に投与され得る。例えば、参照試料または参照レベルと比較して、ＯＳＭ、ＯＳＭＲおよび／またはＯＳＭｉのレベルの低下は、個体が抗ＴＮＦα療法に反応することを示す場合がある。その後、抗ＴＮＦα療法を選択または推奨してもよく、次に、個体にさらに投与されてもよい。参照試料または参照レベルと比較して、ＯＳＭ、ＯＳＭＲおよび／またはＯＳＭｉのレベルの上昇は、個体が抗ＴＮＦα療法に反応しないことを示す場合もある。その後、抗ＴＮＦα療法は個体に投与されない。さらに、個体の処置のために、抗ＴＮＦα療法以外の治療的処置が選択または推奨され得、次に個体にさらに施されてもよい。
本発明の全ての態様において、疾患または状態（例えば、ＩＢＤまたは慢性腸炎）を有する個体は、疾患もしくは状態を有することが疑われる個体、および／または疾患もしくは状態を発症するリスクがある個体を含む。例えば、個体は、正式に診断されていないが、１つ以上の症状の存在のために疾患または状態を有することが疑われる場合がある。ＩＢＤおよび／または慢性腸炎の症状には、腹痛または骨盤痛、痙攣または筋肉痙攣、嘔吐、下痢、直腸出血、体重減少、発熱および貧血が含まれる。個体は、疾患もしくは状態に関連する１つ以上の危険因子、および／または疾患もしくは状態に対する感受性を増加させる１つ以上の素因を有する場合、疾患または状態を発症するリスクがあるとみなされ得る。ＩＢＤおよび／または慢性腸炎の危険因子には、遺伝的素因および抗生物質による処置が含まれる。
本方法は、好ましくは、個体におけるＴＮＦαおよび／またはＩＬ－１βを測定し、それにより個体における慢性腸炎および／もしくはＩＢＤを診断または予後診断することをさらに含む。方法は、好ましくは、ＴＮＦαとＩＬ－１βの両方を測定することをさらに含む。ＴＮＦαおよび／またはＩＬ－１βは、ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲについて以下に検討される方法のいずれかにおいて測定することができる。この方法は、好ましくは、個体におけるＴＮＦαおよび／またはＩＬ－１βを測定すること、ＴＮＦαおよび／またはＩＬ－１βレベルを参照ＴＮＦαおよび／もしくはＩＬ－１βレベルまたは参照試料のＴＮＦαおよび／もしくはＩＬ－１βレベルと比較すること、ならびにＴＮＦαおよび／またはＩＬ－１β（ＴＮＦαｉおよび／またはＩＬ－１βｉ）を決定することをさらに含む。参照試料もしくは参照レベルと比較した、または参照試料もしくは参照レベルを用いて計算した、ＴＮＦαおよび／もしくはＩＬ－１βまたはＴＮＦαｉおよび／もしくはＩＬ－１βｉのレベルの上昇は、典型的には、陽性の診断、陰性の予後診断、および／または個体は再発することを示す。参照試料もしくは参照レベルと比較した、または参照試料もしくは参照レベルを用いて計算した、ＴＮＦαおよび／もしくはＩＬ－１βまたはＴＮＦαｉおよび／もしくはＩＬ－１βｉのレベルの低下は、陰性の診断、陽性の予後診断、および／または個体が再発しないことを示す。
本発明はまた、個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤの重症度を決定する方法を提供する。本発明はまた、慢性腸炎および／またはＩＢＤを有する個体が外科手術を必要とする可能性を決定する方法を提供する。これらの方法の両方は、個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲの測定することを含む。この方法は、典型的には、個体におけるＯＳＭおよびＯＳＭＲを測定すること、ＯＳＭおよびＯＳＭＲレベルを参照ＯＳＭおよびＯＳＭＲレベルまたは参照試料のＯＳＭおよびＯＳＭＲレベルと比較すること、ならびにＯＳＭ指標（ＯＳＭｉ）を決定することを含む。これは、上述のように達成することができる。参照試料もしくは参照レベルと比較した、または参照試料もしくは参照レベルを用いて計算した、ＯＳＭ、ＯＳＭＲおよび／またはＯＳＭｉのレベルの上昇は、疾患が重症であり、および／または個体が外科手術を必要とする可能性があることを示す。参照試料もしくは参照レベルと比較した、または参照試料もしくは参照レベルを用いて計算した、ＯＳＭ、ＯＳＭＲおよび／またはＯＳＭｉのレベルの低下は、疾患が重症でなく、および／または個体が外科手術を必要とする可能性がないことを示す。
この文脈における重症度は、現在、標準的な内視鏡的および組織病理学的評価によって決定される疾患の強さを指す。これは、患者における処置難治性状況に関連しており、より大きな疾患重症度を有する患者は、薬理学的介入に反応する可能性が低く、したがって、外科的介入を必要とするリスクがより高い。外科手術は、一般的に、胃腸管の患部の除去および関連する合併症の修復を含み、これは特定の状況に応じて変わる。例えば、クローン病（ＣＤ）の患者は、しばしば、腸の別個の線維性領域の除去を必要とするが、一部の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の患者は、結腸の完全な除去を必要とする場合がある。一部の患者は、瘻孔（ｆｉｓｔｕｌａ）の矯正またはストーマ（ｓｔｏｍａ）の構築などの追加の外科的介入を必要とする。
疾患の重症度または外科手術の可能性を決定するために、参照試料またはレベルは、典型的には、外科手術を必要としない軽度の形態の疾患または状態を有する個体におけるＯＳＭ、ＯＳＭＲまたはＯＳＭｉのベースラインレベルを表す。参照試料またはレベルは、関連する疾患もしくは状態を有していない、または疾患もしくは状態を有する疑いがあるが、その後に疾患もしくは状態を有していないことが確認される個体におけるＯＳＭ、ＯＳＭＲまたはＯＳＭｉのベースラインレベルを表すことができる。
対象とする個体は、典型的には、哺乳動物、例えば、霊長類、齧歯類（マウスおよびラットを含む）、または他の一般的な研究室、家畜または農業用の動物、例えば、限定されないが、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどが挙げられる。個体はヒトであってもよい。
ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲの検出
ＯＳＭまたはＯＳＭＲのレベルは、典型的には、個体から得られた生物学的試料においてインビトロで測定される。試料は、個体の体液を含むことができる。流体試料は、例えば、血液、血漿、血清、便、尿、脳脊髄液または関節液の試料であり得る。
あるいは、試料は、組織試料を含んでもよい。典型的には、組織試料は、疾患または状態によって影響される身体の一部に由来する。例えば、疾患または状態がＩＢＤまたは慢性腸炎である場合、組織試料は、腸生検（例えば、腸粘膜生検）または外科的切除試料であり得る。
試料は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質の遠心分離または抽出によって、アッセイさせる前に処理することができる。試料はまた、アッセイ前に、好ましくは－７０℃未満で保存することができる。
当該技術分野において公知である標準的な方法を用いて、ＯＳＭまたはＯＳＭＲのレベルをアッセイすることができる。これらの方法は、典型的には、関連するタンパク質に結合する、またはそれと反応する薬剤を使用することを伴う。薬剤を個体由来の試料と接触させ、薬剤と関連タンパク質の間の複合体形成または反応を測定する。薬剤は、典型的には、タンパク質に特異的に結合する。薬剤は、タンパク質に特異的な抗体であってもよく、またはタンパク質に結合するアプタマーであってもよい。本明細書に記載される抗体または他の薬剤は、そのタンパク質と優先的にまたは高親和性で結合するが、他のタンパク質と実質的に結合しない、結合しない、または低親和性でのみ結合する場合、タンパク質に「特異的に結合する」。例えば、抗体または類似の薬剤は、１×１０－７Ｍ以下、より好ましくは５×１０－８Ｍ以下、より好ましくは１×１０－８Ｍ以下、またはより好ましくは５×１０－９Ｍ以下のＫｄで結合する場合、優先的にまたは高親和性で結合する。抗体は、１×１０－６Ｍ以上、より好ましくは１×１０－５Ｍ以上、より好ましくは１×１０－４Ｍ以上、より好ましくは１×１０－３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０－２Ｍ以上のＫｄで結合する場合、低親和性で結合する。抗体または抗体構築物およびオリゴヌクレオチドなどの化合物の特異的な結合能を決定するための競合結合または免疫放射線測定アッセイのための様々なプロトコールが、当該技術分野において周知である（例えば、Maddox et al, J. Exp. Med. 158, 1211-1226, 1993を参照されたい）。
ＯＳＭまたはＯＳＭＲレベルを評価する方法には、抗原捕捉ディップスティックアッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。ＥＬＩＳＡは、典型的には、当業者に公知であるサンドイッチ技術または競合技術を用いて行われる。本発明はまた、直接検出技術においてＯＳＭまたはＯＳＭＲに対する抗体を使用することができ、例えば、限定されないが、表面プラズモン共鳴、表面音波、水晶マイクロバランス、マイクロ熱量測定または電気化学インピーダンス分光法に基づくものが含まれる。特定のＯＳＭ ｍＡｂは、体液中のＯＳＭレベルを検出するためのモノクローナル抗体ベースの免疫クロマトグラフィーストリップ試験において使用することができる。修飾されたオリゴヌクレオチドアプタマーは、ソマロジックプラットフォームを用いた多重検体検出システムの一部として使用することができる。ＯＳＭＲ発現レベルは、例えば、フローサイトメトリーまたは患者の腸組織の組織学的切片に関する定量的免疫組織化学分析によって決定することができる。ＯＳＲとＯＳＭＲのｍＲＮＡレベルは、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび次世代シーケンシングを含むＲＮＡ分析法によって正確に定量することができる。
抗体
本発明の方法において使用される抗体は、関連するタンパク質に結合することができる全抗体またはそのフラグメントのいずれかであり得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、当該技術分野において公知である任意の適切な方法によって生成され得る。例えば、ポリクローナル抗体は、適切な条件下で哺乳動物、典型的にはウサギまたはマウスをＨＢＰで免疫すること、例えば、前記哺乳動物の血清から抗体分子を単離することによって得ることができる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法または組換え法によって得ることができる。
典型的には、抗体は、霊長類、ヒト、齧歯類（例えば、マウスもしくはラット）、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウマまたはラクダ抗体などの哺乳動物抗体である。抗体は、ラクダ化抗体またはサメ抗体であってもよい。抗体は、ナノボディ（単一ドメイン抗体；ｓｄＡｂ）であってもよい。抗体は、抗体の任意のクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＭであってもよいが、好ましくはＩｇＧである。この方法において使用することができる全抗体のフラグメントは、抗原結合部位、例えば、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ）２フラグメントまたはＳｃＦＶを含む。全抗体またはフラグメントは、単離された抗体もしくはそのフラグメントであり得、または他の部分と会合しもしくは複合体化され得、または融合タンパク質の形態であり得る。一実施形態において、抗体は、異なる天然抗体由来の配列を含むキメラ抗体、例えば、ヒト化抗体である。
医薬組成物および投与様式
本明細書に記載される処置方法において使用するための薬剤は、医薬組成物に製剤化することができる。これらの組成物は、治療有効成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、希釈剤、緩衝剤、安定剤または当業者に周知である他の物質を含み得る。このような物質は無毒でなければならず、有効成分の有効性を妨げてはならない。医薬的担体または希釈剤は、例えば、等張溶液であってもよい。
担体または他の物質の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内および腹腔内経路に依存し得る。適切な組成物および投与方法の例は、ＥｓｓｅｋｕおよびＡｄｅｙｅｙｅ（２０１１)ならびにＶａｎ ｄｅｎ Ｍｏｏｔｅｒ Ｇ．（２００６）に提供されている。例えば、固体経口形態は、活性物質とともに、希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンデンプンまたはジャガイモデンプン；潤滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム、および／またはポリエチレングリコール；結合剤；例えば、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン；脱凝集剤、例えば、デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩またはグリコール酸ナトリウムデンプン；発泡性混合物；染料；甘味料；湿潤剤、例えば、レシチン、ポリソルベート、ラウリルスルフェート；一般的に、医薬製剤に使用される非毒性および薬理学的に不活性な物質を含有し得る。このような医薬製剤は、公知の方法、例えば、混合、造粒、打錠、糖衣またはフィルムコーティング法によって製造することができる。
経口製剤には、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤が含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤または散剤の形態をとり、１０％～９５％、好ましくは２５％～７０％の有効成分を含有する。医薬組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥された材料は投与前に再構成されてもよく、懸濁液であってもよい。再構成は、好ましくは緩衝液中で行われる。
個体への経口投与用のカプセル、錠剤および丸剤には、例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ「Ｓ」、Ｅｕｄｒａｇｉｔ「Ｌ」、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む腸溶性コーティングを施してもよい。
経口投与用の液体分散液は、シロップ、エマルジョンまたは懸濁液であってもよい。シロップは、担体として、例えば、サッカロース、またはグリセリンおよび／もしくはマンニトールおよび／もしくはソルビトールとともにサッカロースを含むことができる。
懸濁液およびエマルジョンは、担体として、例えば、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルアルコールを含有してもよい。筋肉内注射用の懸濁液または溶液は、活性物質とともに、薬学的に許容される担体、例えば、滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール、例えば、プロピレングリコール、および必要に応じて適量の塩酸リドカインを含有してもよい。
静脈内投与または輸液用の溶液は、担体として、例えば、滅菌水を含有してもよく、好ましくは滅菌した水性の等張性生理食塩水の形態であってもよい。
坐剤の場合、伝統的な結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含んでもよく；このような坐剤は、０．５％～１０％、好ましくは１％～２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成されてもよい。
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド阻害剤は、裸のヌクレオチド配列であってもよく、またはカチオン性脂質、ポリマーまたは標的系と組み合わせてもよい。それらは、利用可能な技術によって送達されてもよい。例えば、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、針注射によって、好ましくは皮内、皮下または筋肉内に導入され得る。あるいは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、粒子媒介性の遺伝子送達などの送達デバイスを用いて皮膚を介して直接送達されてもよい。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、典型的には、皮膚に、または、例えば、鼻腔内、経口または直腸内投与によって粘膜表面に投与されてもよい。
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド構築物の取り込みは、いくつかの公知のトランスフェクション技術、例えば、トランスフェクション剤の使用を含むものによって増強することができる。これらの薬剤の例には、カチオン性薬剤、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ－デキストランおよびリポフェクタント、例えば、リポフェクタムおよびトランスフェクタムが含まれる。投与されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの投薬量を変更することができる。
投与は、典型的には、「予防的有効量」または「治療的有効量」（場合によっては、予防は治療と見なすことができる）であり、これは個体に利益を示すのに十分であり、疾患もしくは状態の開始を妨げまたは遅延させ、１つ以上の症状を改善させ、寛解を誘発または延長させ、あるいは再燃または再発を遅延させるのに有効な量である。
投与量は、特に、使用される物質；処置されるべき個体の年齢、体重および状態；投与経路；ならびに必要とされるレジメンに応じて、様々なパラメータに従って決定され得る。医師は、任意の特定の個体の必要とされる投与経路および投薬量を決定することができる。典型的な１日投薬量は、上記の条件に依存して、体重１ｋｇあたり約０．１～５０ｍｇである。投与量は、単回投与として提供されてもよく、または複数回の投与として提供されてもよく、例えば、定期的な間隔で、例えば、２、３または４回の投与が毎時投与されてもよい。典型的には、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド阻害剤は、粒子媒介性の送達については１ｐｇ～１ｍｇ、好ましくは１ｐｇ～１０μｇの範囲、および他の経路については１０μｇ～１ｍｇの範囲で投与される。
上記の技術およびプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkinsに見出すことができる。
組成物は、単独で、または他の治療用組成物もしくは処置、例えば補助療法と組み合わせて投与されてもよい。他の治療用組成物または処置は、例えば、本明細書において検討されているものの１つ以上であってもよく、本発明の組成物もしくは処置と同時にまたは連続して投与されてもよい。
慢性腸炎の標準的な現在の治療薬としては、５－ＡＳＡ（アミノサリチル酸）、種々の抗生物質、コルチコステロイド（例えば、ブデソニド、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、およびプレドニゾン）、アザチオプリン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、抗ＴＮＦ抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セツリズマブ、ゴリムマブ）、抗α４β７インテグリン抗体（例えば、ベドリズマブ）が挙げられる。ＯＳＭおよび／もしくはＯＳＭＲを標的とする薬剤またはＯＳＭおよび／もしくはＯＳＭＲのアンタゴニストは、上記薬剤のいずれかと組み合わせて使用されてもよい。臨床データは、抗ＴＮＦ療法および非生物学的療法の組合せを受けているＩＢＤ患者が、抗ＴＮＦまたは非生物学的製剤単独を受けている患者より高い臨床反応性を経験することを示唆している（Colombel et al, 2010, N Engl J Med; 1383-95およびPanaccione et al, 2014, Gastroenterology; 392-400）。異なった生物学的療法を組み合わせたデータは限られているが、抗ＯＳＭ／ＯＳＭＲ剤を抗ＴＮＦ療法と組み合わせることは、ＯＳＭおよびＴＮＦが標的細胞に相乗効果を及ぼすことができる点で有益であり得ると考える科学的理由がある（例えば、ＯＳＭおよびＴＮＦは結腸間質細胞によるＩＬ－６発現を相乗的に誘導する）。あるいは、２つ以上の標的特異性を有する単剤生物学的療法（例えば、ＯＳＭとＴＮＦの両方を標的とする二重特異性抗体）が使用され得る。ＯＳＭ標的化治療薬はまた、他の種類の治療薬、例えば、小分子またはオリゴヌクレオチド治療薬と組み合わせて使用することができる。
キット
本発明はさらに、個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲレベルを測定するための手段（例えば、試薬）、ならびに本発明の方法によるキットを使用するための説明書を含む診断キットを提供する。キットはまた、上記方法をどの個体に実施するかに関しての詳細を含むことができる。キットは、典型的には、ＯＳＭまたはＯＳＭＲに特異的に結合する１つ以上の薬剤、例えば、抗体を含有する。キットは、他の実験室または臨床パラメータの測定手段をさらに含んでもよい。例えば、キットは、Ｃ－反応性タンパク質（ＣＲＰ）を測定するための手段を含んでもよい。
キットは、上記方法を実施することを可能にする１つ以上の他の試薬または装置を追加的に含んでもよい。このような試薬または装置は、以下のうちの１つ以上を含む：適切な緩衝液（水溶液）、試料からＯＳＭおよび／もしくはＯＳＭＲを単離する手段、個体から試料を得る手段（例えば、容器もしくは針を含む装置）、または定量的反応を行うことができるウェルを含む支持体。
他の態様
したがって、第１の態様において、本発明は、個体における乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を処置または予防する方法であって、ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニストを個体に投与し、それにより個体における乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を処置または予防することを含む方法を提供する。
さらに、本発明は、
－ 個体における乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を処置または予防する方法において使用するためのＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニスト；ならびに
－ 個体における乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を処置または予防する方法における使用のための医薬の製造におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニストの使用
を提供する。
個体は、以下に示される方法に従って診断または予後診断されている場合がある。
さらなる態様において、本発明は、個体における乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を診断または予後診断する方法であって、個体においてＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲを測定し、それにより個体における乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を診断または予後診断することを含む方法を提供する。
サイトカインのシグナル伝達経路の潜在的な強さは、リガンドと受容体の両方の相対存在量によって決定される。したがって、個体におけるＯＳＭとＯＳＭＲの両方を測定し、ＯＳＭ指標（ＯＳＭｉ）（相対的なＯＳＭおよびＯＳＭＲの積）を決定することが有用である場合がある。
本発明者らは、ＯＳＭＲが疾患寛解中に高度に発現されたままであることを示した。さらに、抗ＴＮＦα療法が成功した後、ＯＳＭは抑制される。これは、ＯＳＭシグナル伝達が疾患再発において役割を果たすことを示唆している。したがって、乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を診断または予後診断する方法は、乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態から寛解した個体が再発するか否かを予測する方法である場合がある。
参照試料または参照レベルと比較した、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、および／またはＯＳＭｉのレベルの上昇は、陽性の診断、陰性の予後診断、および／または個体が再発することを示す場合がある。参照試料または参照レベルと比較した、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、および／またはＯＳＭｉのレベルの低下は、陰性の診断、陽性の予後診断、および／または個体が再発しないことを示す場合もある。
別の態様において、本発明は、個体における乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を処置または予防する方法であって、
（ｃ）上記の方法に従って個体における乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を診断または予後診断すること；および
（ｄ）乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態の処置に有用な薬剤を個体に投与すること
を含む方法を提供する。
薬剤は、ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニストである場合がある。ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲアンタゴニストは、抗ＯＳＭもしくは抗ＯＳＭＲ抗体、またはＯＳＭもしくはＯＳＭＲ融合タンパク質などのＯＳＭもしくはＯＳＭＲ活性または発現のアンタゴニストであってもよい。
さらに、本発明は、
－ 個体における乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態が上記方法に従って診断または予後診断されている個体における乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を処置または予防する方法において使用するための薬剤；
－ 個体における乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態が上記方法に従って診断または予後診断されている個体における乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を処置または予防する方法において使用するための医薬の製造における薬剤の使用；
乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を有する、または有すると疑われる、または発症するリスクがある個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのレベルを決定するための手段；ならびに
乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を処置するための薬剤
を含有する製品
を提供する。
さらなる態様は、乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を有する、または有すると疑われる、または発症するリスクがある個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのレベルを測定するためのアッセイであって、個体由来の生物学的試料をＯＳＭまたはＯＳＭＲに結合する薬剤と接触させること、薬剤とＯＳＭまたはＯＳＭＲの間の複合体形成を測定すること、場合によりＯＳＭｉを計算すること、測定された値またはＯＳＭｉ値を参照値と比較し、それにより個体における乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を診断または予後診断することを含むアッセイを提供する。
さらなる態様は、
（ｅ）乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を有する個体由来の生物学的試料におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのレベルを定量するための測定モジュール；
（ｆ）上記測定モジュールから出力されたデータ、および参照および／または対照データを記憶するように構成された記憶モジュール；
（ｇ）上記測定モジュールから出力されたデータの値、および参照または対照データをコンピュータ計算するように構成されたコンピュータ計算モジュール；ならびに
（ｈ）出力データの値に基づいて、乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態を有する個体の診断または予後診断を表示するように構成された出力モジュール
を含むシステムを提供する。
慢性腸炎および／またはＩＢＤおよびＴＮＦα療法に関連して上記で検討した実施形態のいずれかは、乾癬またはＴｈ１７媒介性の疾患もしくは状態に関する実施形態に等しく適用される。Ｔｈ１７媒介性の疾患または状態は、例えば、ＩＢＤ、乾癬、アトピー性皮膚炎、関節リウマチ、若年特発性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫ブドウ膜炎、または癌であり得る。
[実施例]
方法
ヒトコホートにおける遺伝子発現分析
全てのヒト組織の回収は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｉｌｌｎｅｓｓ Ｂｉｏｂａｎｋ（参照番号１１／ＹＨ／００２０）からの倫理的承認の下で行われた。本発明者らは、ジョンラドクリフ病院（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）で処置された、同意を受けたＩＢＤ患者または健常対照（非ＩＢＤ状態の内視鏡検査を受けている）から腸粘膜検体を採取し、ｃＤＮＡ合成および定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析のためにＲＮＡを抽出した。相補的アプローチとして、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）を介してアクセス可能な公的に利用可能な遺伝子発現研究から得られたデータを評価した。このような研究が利用される場合、関連する受託番号が参照される。いくつかの図において、本発明者らは、ＯＳＭ指標（ＯＳＭｉ）を測定可能なものとして含めている。これは、データセット内の相対的なＯＳＭおよびＯＳＭＲ発現の積として計算される。サイトカインのシグナル伝達経路の潜在的な強さが、リガンドおよび受容体の相対存在量によって決定されるため（ＯＳＭおよびＯＳＭＲが１：１の化学量論と相互作用するため）、相対的なＯＳＭｉは、この受容体－リガンド対に潜在的な理論的シグナル伝達に対応する。
ヒト単球分析
健常なヒトドナー由来の末梢血単球は、標準的なフィコール勾配遠心分離、続いてＣＤ１４＋細胞について磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いて単離した。これは、通常、フローサイトメトリー分析に基づいて≧９５％の単球純度をもたらした。単球は、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ培地で培養した。具体的な処置は、図の説明に記載されている。単球反応は、分泌産物についてｑＰＣＲ（ｍＲＮＡについて）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のいずれかによって評価した。
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞分析
末梢血白血球は、フィコール勾配遠心分離を用いて健常なヒトの血液から単離した。次に、非ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＡＣＳを用いて枯渇させ、残りの画分は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いてナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋および記憶ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ヘルパーＴ細胞画分に精製した。Ｔ細胞を活性化し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて異なる極性化サイトカインの存在下で５～７日間増殖させた。使用した極性化サイトカインの組み合わせは以下の通りである：Ｔｈ０（中性、サイトカインなし）、Ｔｈ１（ＩＦＮγ＋ＩＬ－１２）、Ｔｈ２（ＩＬ－４）、Ｔｈ９（ＴＧＦβ＋ＩＬ－４）、Ｔｈ２２（ＴＮＦα＋ＩＬ－６）、Ｔｒｅｇ（ＴＧＦβ）、およびＴｈ１７（ＩＬ－１β＋ＴＧＦβ＋ＩＬ－６＋ＩＬ－２３）。ＩＦＮγおよび／またはＩＬ－４に対する中和抗体を必要に応じてナイーブＴ細胞増殖に使用した。Ｔｈ１７条件のための基本培地はＩＭＤＭ＋５％ヒト血清であった；全ての他の条件のための培地はＲＰＭＩ＋５％ヒト血清であった。Ｔ細胞は、図の説明に示されるようにｑＰＣＲまたはフローサイトメトリーによって分析した。
マウス
オックスフォード大学の認可された動物施設において、野生型Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６．Ｒａｇ－／－、Ｉｌ２３ｒｇｆｐレポーターマウス、およびＣ５７ＢＬ／６．Ｏｓｍ－／－マウスを飼育し、特定の病原体のない条件下で維持した。Ｃ５７ＢＬ／６．Ｏｓｍ－／－は、元々、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ストック＃０２２３３８）から得られた。すべての手順は、１９８６年の英国科学手順に従って行った。マウスは、ヘリコバクター（Helicobacter）種および他の公知の腸内病原体に対して陰性であり、年齢および性別が一致し、最初に使用されたときには６週間を超えていた。雄性と雌性マウスの両方を、すべての実験についてほぼ等しい割合で使用した。マウスを異なる処置に無作為化し、全ての処置を動物の所定のケージに示した。
ヘリコバクター・ヘパチカス（Helicobacter hepaticus）／抗ＩＬ－１０Ｒ大腸炎モデル
このＴ細胞依存性大腸炎のモデルは、大腸炎において生じる正常な免疫調節機能を損なうＩＬ－１０受容体（ＩＬ－１０Ｒ）の抗体遮断と併せて共生細菌ヘリコバクター・ヘパチカス（Helicobacter hepaticus）（Ｈｈ）を用いてマウスに経口感染させることを伴う（Schiering and Krausgruber et al, Nature, 2014）。薬理学的または遺伝学的手段によるＴＮＦ、ＩＬ－６またはＩＬ－１βの減弱は、このモデルにおいては無視できる程度の治療有効性を有し（未公開の観察および図２４）、これを抗ＴＮＦ療法に対して感受性ではない高度処置難治性疾患のモデルとする。簡単には、６～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスは、実験の０日目および１日目に、２２Ｇの湾曲した鈍い針で送達される経口胃管栄養法において、１×１０８コロニー形成単位（ｃｆｕ）のＨｈが与えられる。ＩＬ－１０Ｒ遮断抗体は、０日目および７日目に腹腔内（ＩＰ）１ｍｇ注射として投与する。マウスは、疾患の重症度のピークに対応する１４日目に屠殺する。いくつかの実験において、マウスは、追加のＯＳＭが疾患の経過に影響を及ぼし得るか否かを評価するために、組換えマウスＯＳＭ（７日目から１３日目まで毎日、１μｇ（およそ０．０４ｍｇ／ｋｇ相当）のＩＰ注射）を追加的に投与された。これは、模擬処置としてＰＢＳ単独の注射を受けたマウスと比較した。他の実験において、マウスは、ＯＳＭＲ、ｇｐ１３０、およびマウスＩｇＧ２ＡのＦｃ領域を組み込んだ組換えマウスＯＳＭ受容体融合タンパク質（Ｏ－ＲＦＰ）を用いて処置した。Ｏ－ＲＦＰは、７日目から１３日目まで２日ごとに１５０μｇ（およそ６ｍｇ／ｋｇ相当）のＩＰ注射として投与した。対照処置として、マウスは、Ｏ－ＲＦＰと同じ条件で製造されたモル当量のＩｇＧ２Ａ－Ｆｃを用いて同じスケジュールに従って処置した。最後に、何匹かのマウスはまた、動物あたり１週間に６００μｇの合計投与量で抗ＴＮＦα中和抗体を用いて処置した。本発明者らの経験では、この投与量は、他のＨｈ誘発性の大腸炎モデルにおいて疾患を完全に中和するのに十分である。
微生物フローラは、前臨床研究の結果に大きな影響を及ぼし、動物と施設の間で変化する可能性があるため、すべての実験におけるマウスは、異なる処置群に無作為に割り振り、実験期間前とその期間中に共存させた。Ｏｓｍノックアウトマウスを伴う実験において、ノックアウト動物を野生型の同腹仔と共存させ、比較した。最後に、治療実験とＯｓｍノックアウト実験の両方を、異なる微生物叢、動物飼料および濃縮物を含む環境間の再現性を実証するために、２つの異なる動物収容施設において複製した。
実験的大腸炎の組織学的評価
マウスは、記載されているように（Izcue et al, Immunity, 2008）、疾患の重症度について採点された。簡単には、近位、中位および遠位の結腸のホルマリン固定したパラフィン包埋切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、上皮肥厚および杯細胞枯渇、白血球浸潤、罹患した領域、および重篤な疾患活動の特徴の４つのパラメータについて０～３の尺度で等級分けされる。共通の重症度の特徴には、陰窩膿瘍形成、粘膜下白血球浸潤、および間質性浮腫が含まれる。各基準のスコアを加え、結腸切片あたり０～１２の総合スコアを与える。３つの結腸領域からのデータを平均して、結腸炎症の総合スコアを得る。採点は、盲検で行われ、独立した盲検の観察者によって確認された。観察者間のピアソン相関係数は０．９０～０．９５の範囲であった。
腸組織の調製および細胞の単離
マウス結腸をＥＤＴＡで洗浄して、上皮を除去し、コラゲナーゼＶＩＩＩで消化して、記載のように細胞集団を遊離させた（Uhlig et al, J. Immunol, 2006）。組織消化物は、３０％／４０％／７０％のパーコール勾配による遠心分離によって分離した。３０／４０界面の細胞を間質／上皮富化画分として収集し、４０／７０界面の細胞を薄層特異性白血球富化画分として回収し、図の凡例に示されるように培養またはフローサイトメトリー分析のために調製した。エクスビボでの間質培養に関して、間質画分を記載されるように播種し、培養した（Schiering and Krausgruber et al, Nature, 2014）。
ヒトの腸生検または外科的切除物は、最初に、粘液を除去するために１ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）溶液を用いて室温で１５分間洗浄した。必要に応じて、外科的切除標本は、最初に、粘膜を下層組織から分離し、可能な限り多くの残留粘膜下組織を除去することによって調製した。次に、切除組織は、（ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液））中の０．７５ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液において、それぞれ３０分間室温で３回洗浄して、上皮細胞の大部分を除去した。残りの組織をＨＢＳＳ中で洗浄して、残留ＥＤＴＡを除去し、小片に切断し、ＲＰＭＩ培地＋１０％ウシ胎仔血清中の０．１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＡ溶液中で一晩消化した。生検調製について、組織は、少量の１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＡ溶液を用いて１時間のＤＴＴ洗浄の直後に消化した。全ての溶液は、記載されるように抗生物質を含有した（Owens et al, Front Immunol, 2013）。記載されるように、消化された細胞をろ過し、パーコール勾配により分離した（Geremia et al, J Exp Med, 2011）。以前に記載されたプロトコール（Owens et al, Front Immunol, 2013）に従って、間質細胞を播種し、培養した。
統計
全ての統計は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算した。パラメトリック分析とノンパラメトリック分析は、複数のテスト矯正とともに、適宜使用され、図の凡例に示される。全てのテストについてα＝０．０５である。特に明記しない限り、エラーバーを有する全ての棒グラフは、平均±標準誤差を表す。
強力な疾患としてのＯＳＭの特定はＩＢＤの前臨床モデルにおいて相関する
図１に示されるデータは、ＴＮＦ（いくつかの成功したＩＢＤ薬物の標的、例えばインフリキシマブ）およびＯＳＭを含む、ＩＢＤの機構的に異なるモデルにおいて、少数のサイトカインだけが一貫して過剰発現されることを実証する。ＤＳＳモデルは、腸粘膜を刺激し、ヒトＵＣに似た病理学を生じるデキストラン硫酸ナトリウムによる経口強制飼養を含む。ＴＮＢＳ（２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸）は、化学物質を直腸内に投与し、ヒトＣＤに似た病理学を生じる代替の化学的な大腸炎モデルである。最後に、Ａｂｃｂ１ａ－／－マウスは、ヘリコバクター・ビリス（Helicobacter bilis）による腸内でのコロニー形成を促進する自発的な大腸炎を発症する。このモデルにおいて得られた大腸炎は、ＵＣとＣＤの両方に類似した特徴を有する（Maggio-Price et al, Am J Path, 2002）。重要なことに、この分析に使用された各データセットは、異なる遺伝的背景を有する動物に由来し、異なる分析プラットフォームを伴う。したがって、ＯＳＭは、動物株または分析戦略とは独立して、ヒトＩＢＤの全ての主要なサブタイプを代表する異なる作用機序を有する大腸炎モデルにおいて、再現可能であり、強く増加される。
Ｈｈ＋αＩＬ１０Ｒ大腸炎モデルにおけるＯＳＭおよびＯＳＭＲ発現
図２に示されるデータは、Ｈｈ＋αＩＬ１０Ｒモデルにおいて、ＯＳＭおよびその受容体ＯＳＭＲの両方の発現が、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベル（組織と糞便物質の両方で容易に検出可能）で大腸炎動物において増加することを実証している。ＯＳＭ発現は、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、およびＴＮＦの発現と密接に相関しており、これは、ＯＳＭは、同時調節される炎症性サイトカインのコアグループの、以前には認識されていないメンバーであることを示唆している。図３に示されるデータは、このモデルにおけるＯＳＭおよびＯＳＭＲ発現の誘導が、病理学的進行の動力学、および全体的な病理学的な重症度と相関することを実証している。したがって、ＯＳＭおよびＯＳＭＲの発現は、この状況では疾患と密接に関連している。
ヒトＩＢＤ腸粘膜におけるＯＳＭおよびＯＳＭＲ発現
図４に示されるデータは、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、およびＯＳＭ指標が、大多数のＩＢＤ患者において活動性疾患中に腸粘膜において高度に富化されることを実証している。これは、疾患活動の内視鏡的と組織学的測定の両方に基づいて明らかである。特に、ＯＳＭおよびＯＳＭＲ発現は、組織学的な疾患重症度の上昇と直接的に相関して増加する。図５は、ＯＳＭが、腸粘膜炎症の公知のバイオマーカーである、ともに糞便タンパク質バイオマーカーカルプロテクチンを形成するＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の発現と密接に相関することを実証している。図６は、ＯＳＭおよびＯＳＭＲの発現が、ＵＣ患者とＣＤ患者の両方で同等であることを実証している。さらに、ＯＳＭはおそらく、ＩＢＤにおける古典的サイトカインファミリーのうちで最も一貫して過剰発現しているメンバーである。最後に、ＯＳＭおよびＯＳＭＲはともに、嚢胞性炎症が外科手術の一般的であり、問題のある合併症である、炎症性の回腸嚢肛門吻合部を有する患者の嚢組織に富化される（図７）。
独立したＩＢＤコホートにおけるＯＳＭおよびＯＳＭＲ発現
表１は、ＩＢＤ患者対健常対照からの腸粘膜生検におけるＯＳＭおよびＯＳＭＲ発現の倍数変化および有意性をまとめたものである。全体として、表１は、ＵＣ、ＣＤ、および成人と小児ＩＢＤにわたる、地理的に異なる５つの患者群からのデータを示す。全試料サイズは、健常対照が１１８人であり、ＩＢＤ患者が３７０人である。これらのデータは、ＯＳＭおよびＯＳＭＲが、異なる患者集団において高程度の再現性でＩＢＤ患者の腸粘膜において過剰発現されることを実証している。
Figure 0006999417000001
ＯＳＭおよびＯＳＭＲとＩＢＤの臨床的特徴との相関
図８および図９に示されるデータは、ＯＳＤおよびＯＳＭＲが、患者の性別、診断時の年齢、疾患の持続時間、または血清ＣＲＰ（Ｃ－反応性タンパク質）などの全身性疾患バイオマーカーおよび末梢血白血球数にかかわらず、ＩＢＤ患者の粘膜において同等レベルで発現することを実証している。この研究において患者に与えられた様々な処置クラスのうち、ＯＳＭとＯＳＭＲの発現は、外科的介入の高い必要性（ステロイド使用の増加傾向を伴う）だけに有意に関連し、これは、ＯＳＭ経路の活性化が侵攻性の処置難治性疾患と関連することを示唆している（図１０）。総合すると、これらのデータは、ＯＳＭおよびＯＳＭＲが、血清ＣＲＰなどの従来のバイオマーカーよりも優れている可能性がある組織病理のマーカーであることを示唆している。さらに、ＯＳＭおよびＯＳＭＲの発現は、ＩＢＤ患者の特定のサブグループに限定されない。
ＯＳＭ経路はヒトＩＢＤにおける抗ＴＮＦα療法に対する臨床的反応と関連する
図１１、図１２および図１３に示されるデータは、腸粘膜におけるＯＳＭおよびＯＳＭＲの高発現が、ＩＢＤにおけるゴールドスタンダードの生物療法（インフリキシマブ）に対する主要な非反応性を強く予測することを実証している。さらに、ＯＳＭは、臨床的に関心のある他のサイトカインよりも処置失敗のより強い予測因子であり、成功した抗ＴＮＦα療法後に再現性よく抑制される唯一のサイトカインのうちの１つである。特に、図１４は、ＯＳＭおよびＯＳＭＲが短期インフリキシマブ反応に関連するだけでなく、３０週までの時点で持続的反応の予測因子でもあることを実証している。したがって、ＯＳＭ、ＯＳＭＲおよびＯＳＭ指標は、現行のレジメン、特に抗ＴＮＦα療法による治療結果を予測するため有用なバイオマーカーであり得る。さらに、ＯＳＭは、抗ＴＮＦ難治性患者に対する治療標的として役立つ可能性がある。
ＯＳＭはＩＢＤにおける混合Ｔｈ１７／Ｔｈ１サイトカイン特性と関連して発現される
混乱したＴｈ１およびＴｈ１７のＴヘルパー細胞活性は、ＩＢＤの病因にとって重要であると考えられる。図１５および図１６のデータは、ＯＳＭおよびＯＳＭＲの発現が、ｉ）Ｔｈ１７発生に寄与するサイトカイン（ＩＬ６、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２３）、またはｉｉ）Ｔｈ１および／もしくはＴｈ１７細胞によって産生されるサイトカイン（ＩＬ１７Ａ、ＩＦＮＧ、ＣＳＦ２、ＩＬ２２）の発現に密接に関連することを実証している。これは、複数のコホートおよびＩＢＤの全てのサブタイプにおいて一貫している。したがって、ＯＳＭは、ヒトの腸における病原性免疫反応であると考えられるものと関連して発現される。
ＯＳＭは細菌により刺激されたヒト単球によるＴｈ１７極性化サイトカインと結合して発現される
単球を含む抗原提示細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および分化に対して、ならびに記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の再刺激において重要である。抗原提示との関連で上記細胞が発現するサイトカインは、分化経路の主要な決定因子であり、したがって、ヘルパーＴ細胞のエフェクター機能である。図１７のデータは、ＯＳＭ発現が、種々の細菌分子、および病原性と共生種の両方を含む、ヒト粘膜表面上に見出される多様な属を表す広範囲の全細菌への曝露により、ヒト単球によって強く誘導されることを示す。図１８は、ＯＳＭは、細菌チャレンジ後の単球においてＴｈ１７極性化サイトカインであるＩＬ－６、ＩＬ－１β、およびＩＬ－２３に関連して発現されることを実証している。さらに、ＯＳＭは、強力なＴｈ１７誘発能を有する、ヒト腸に見出される抗原提示細胞サブタイプによって高度に発現される。まとめると、これらのデータは、微生物による刺激に曝露された場合、ヒト抗原提示細胞によって強く誘導されるＴｈ１７誘導経路の以前には未知である成分としてＯＳＭを暗示し、プロセスは、ＩＢＤ患者の腸組織において増加したレベルで生じると考えられる。
ＯＳＭはヒト記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞において発現される
図１９のデータは、ＯＳＭが、刺激後にＣＤ４＋Ｔ細胞によってｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで発現されることを実証している。さらに、休止ＣＤ４＋Ｔ細胞は検出可能なＯＳＭＲを発現しないが、活性化するとＯＳＭＲ発現を誘導する。ＯＳＭ発現は、主として、記憶（ＣＤ４５ＲＯ＋）細胞の特徴である。したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヒトにおけるＯＳＭの起源と潜在的標的細胞の両方である。
ＯＳＭはヒトＴｈ１７の分化および増殖を促進する
図２０のデータは、Ｔｈ１７極性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞が上昇したレベルのＯＳＭＲを発現し、ＯＳＭがＴｈ１７条件下で活性化されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を増強することを示す。ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）およびＰＩ（ヨウ化プロピジウム）染色は、これが増殖よりむしろ細胞生存の増強に起因するものであることを示唆する（図示しない）。ＯＳＭは、Ｔｈ１７細胞におけるマスターＴｈ２転写因子ＧＡＴＡ３、および特性Ｔｈ２サイトカインＩＬ－４の発現を抑制し、したがって、結果として生じるＴｈ１７表現型の純度を高める。さらに、ＯＳＭは、Ｔｈ１７細胞におけるＩＬ－２３受容体の発現を増強し、ＩＬ－２３依存性の病原性機能をより発症し易くする可能性がある。これらのデータは、ＯＳＭがヒトにおける病原性Ｔｈ１７反応を増強する上で重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。
ＯＳＭはインビボでの侵襲性大腸炎に必要である
図２１および図２２のデータは、ＯＳＭの遺伝子欠損を有するマウスにおいて、Ｈｈ＋αＩＬ１０Ｒ大腸炎プロトコールが、野生型の同腹仔対照と比較して、実質的に弱毒化された疾患をもたらすことを実証している。これは、組織学的評価（上皮／杯細胞の破壊および白血球浸潤を含む）の全ての主要なパラメータについて明らかであるが、これは、膿瘍形成、粘膜下の炎症および間質性浮腫などの重症な疾患兆候のレベルで特に明らかである。さらに、ＯＳＭの非存在は、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の誘導を損なうことなく、腸における他の炎症性サイトカイン、特にＩＬ－６およびＩＬ－１βの発現を減弱させる。したがって、ＯＳＭは、ＩＬ－６などのより古典的な前炎症性経路の上流の駆動源であるようであるが、有益な免疫調節経路の誘導には必要ではない。重要なことに、複数のリンパ系および末梢器官の詳細な検査により、Ｏｓｍ－／－マウスが定常状態で明白な免疫学的表現型を示さず、腸構造も異常ではないことが明らかにされた（未公開、図示しない）。さらに、Ｏｓｍ－／－および野生型の同腹仔は、腸内で同等のＨ．ヘパチカス（H. hepaticus）のコロニー形成を示し、これは、この大腸炎モデルにおけるＯｓｍ欠失の保護効果が、細菌の取り扱いの変更によるものではないことを実証している（未公開、図示しない）。
新規マウスＯＳＭ遮断試薬であるＯ－ＲＦＰの中和効率
図２３のデータは、インビトロでマウスＯＳＭを中和するＯ－ＲＦＰ能（方法および図２３の説明を参照）を実証している。このタンパク質は、市販のポリクローナル抗血清と比較して優れた中和能を有する。
治療的ＯＳＭ遮断はインビボで大腸炎を弱める
図２４のデータは、確立された大腸炎を有するマウスにおけるＯ－ＲＦＰを用いたＯＳＭの治療的遮断（Ｈｈ＋αＩＬ１０Ｒプロトコールの７日目に開始された処置）が、内視鏡的と組織学的基準の両方によって決定される疾患重症度を低下させることを実証している。この治療効果は、ＴＮＦ遮断よりも優れている。ＯＳＭノックアウトマウスから得られた結果と一致して（実施例１１参照）、これらの実験における最も明白なＯＳＭ依存性パラメータは、重症な疾患特徴の兆候であった。さらに、５人の異なるヒトＣＤ患者由来の腸粘膜外植片培養物中の特定のモノクローナル抗体を用いたヒトＯＳＭの遮断は、ＩＬ－１β発現の低下によって示されるように組織炎症を有意に減弱させる。この効果はインフリキシマブに匹敵する。総合すると、これらのデータは、ＯＳＭがＩＢＤ、特に抗ＴＮＦ療法に耐性のある侵攻性疾患の表現型に対して潜在的に価値のある臨床標的であることを示唆している。
したがって、ＩＢＤに対する治療的介入との関連でＯＳＭの標的化は有効な戦略である。
ＯＳＭは造血集団によって広く発現されるが、非造血系間質細胞は腸内の主要なＯＳＭ反応性細胞型である
図２５のデータは、野生型マウスにおいて、腸におけるＯＳＭ産生が、ＣＤ４＋Ｔ細胞および抗原提示細胞などの様々な白血球サブタイプに起因し得ることを示す。特に、ＯＳＭＲの最高発現レベルは、腸間質細胞および内皮細胞上で観察される。対照的に、ＯＳＭＲは、造血集団および上皮細胞において非常に低いレベルで発現される。図２６のデータは、ヒト腸細胞集団においても同様の結果を示し、この場合、フローサイトメトリー分析によるＯＳＭＲ染色は、間質細胞とより少ない程度で内皮細胞だけを含む制限された染色パターンを示す。ＯＳＭＲ＋間質細胞はまた、免疫学的に活性な「リンパ系組織様」間質集団のマーカーであるｇｐ３８およびＩＣＡＭ－１を有する（Owens, Front Immunol, 2015）。この間質細胞サブセットは、組織の内皮細胞数を実質的に上回っているため、本発明者らは、ｇｐ３８＋ＩＣＡＭ－１＋間質細胞がマウスとヒトの腸の両方において優性のＯＳＭ反応性細胞型であると結論付ける。予期した通り、ヒト腸組織におけるＯＳＭタンパク質発現についての染色は、Ｔ細胞および抗原提示細胞を含む多様な造血集団による産生を示した（図示しない）。
腸間質細胞はＯＳＭに対して高度に反応性である
図２７に示されるデータは、他のサイトカイン受容体と比較して、ＯＳＭＲが初代ヒト腸間質細胞によって高レベルで発現されることを実証している。同様に、ＯＳＭＲのヘテロ二量体パートナー（ｇｐ１３０）は非常に高度に発現される。対照的に、ＯＳＭＲファミリーの他の受容体であるＩＬ－６受容体およびＬＩＦ受容体などは低レベルで発現される。高いＯＳＭＲ／ｇｐ１３０発現と一致して、ＯＳＭは、腸間質細胞の多様な経路を介して迅速であり、強力なシグナル伝達反応を刺激するが、ＩＬ－６に対する反応は非常に低い。したがって、ＯＳＭは、腸間質細胞生物学に関して、そのファミリーの重要なメンバーであると考えられる。
腸間質細胞および内皮細胞はインビボでＯＳＭによって調節される
図２８のデータは、ｉ）腸間質細胞および内皮細胞が活性化され（ＩＣＡＭ－１表面発現に基づく）、マウス大腸炎中に増強された増殖を示し、ｉｉ）ＯＳＭが、Ｈｈ＋αＩＬ１０Ｒ大腸炎の経過中に全身投与された場合、それらの活性化および増殖をさらに促進することを示す。全身性ＯＳＭ処置はまた、悪化した白血球動員および悪化した組織学的疾患の重症度を特徴とする、より強い大腸炎表現型をもたらす（図示しない）。マウスをＨｈ＋αＩＬ１０Ｒ大腸炎に供した場合、Ｏ－ＲＦＰを用いたＯＳＭ遮断は、内皮細胞とｇｐ３８＋ＩＣＡＭ－１＋間質細胞の両方の表面上のＩＣＡＭ－１の蓄積を有意に減弱させる。ＯＳＭノックアウトマウスを用いて同様の結果が観察される（図示しない）。したがって、ＯＳＭは、インビボでの間質／内皮集団の炎症活性化状態を調節し、ＯＳＭが大腸炎の重症度を促進する重要な機序であり得る。
ＯＳＭはＴＮＦとの相乗作用においてマウス腸間質細胞におけるサイトカインおよびケモカイン発現を活性化する
図２９のデータは、エクスビボで培養されたマウス結腸の腸間質細胞がＯＳＭに反応性であり、ＯＳＭ刺激に反応していくつかの関連する炎症性因子を発現することを実証している。特に、細胞がＯＳＭおよびＴＮＦと共刺激されると、いくつかの反応遺伝子が非常に高レベルで誘導され、これは、ＯＳＭおよびＴＮＦが腸内で機能性の炎症を促進する軸を構成することを示唆している。腸間質細胞はＯＳＭに対して高度に反応性であるが、ＯＳＭ：ＩＬ－６およびＬＩＦの最も近い同族体にほとんど反応しない。
ヒト腸間質細胞のＯＳＭ刺激は臨床的に関連する炎症性徴候の活性化を誘発する
図３０～３３は、ＯＳＭが、ＩＢＤ患者の大きなコホートにおけるサイトカインおよびケモカインの個別の群と密接に相関することを示す（図３０）。この遺伝子特性の富化は、一般的に、深い腸潰瘍などの重症疾患の特徴を有する患者を示し、インフリキシマブに対して難治性の患者において富化される。Ｔ細胞および骨髄細胞の動員および保持に関連する様々な生物学的機能を実行する特性中のいくつかの遺伝子は、腸間質細胞における様々な動力学を用いてＯＳＭによって直接的に調節される（図３１）。マウス間質細胞と同様に、本発明者らは、特に、Ｔｈ１細胞動員を促進するケモカイン（ＣＸＣＬ９／１０／１１）に関して、ＯＳＭとＴＮＦの間の機能的相乗作用の明らかな証拠を観察する（図３２）。本発明者らは、ＯＳＭとＩＬ－１βの間に同様の相乗作用を観察する（図３３）。特に、腸間質細胞に対するＯＳＭの効果は、ＬＩＦＲ経路によって媒介されず、これは、ｇｐ１３０－ＯＳＭＲヘテロ二量体が腸間質細胞において、関連するＯＳＭ受容体複合体であることを示している（図３１Ｂ）。図３４に示されるデータは、いくつかのドナー由来の初代腸間質培養を用いて、ＯＳＭが臨床発現特性において見出されるいくつかの遺伝子の発現を直接調節することを確認するが（図３０）、ＩＬ－６は、概して非常に弱い効果を有する。まとめると、これらのデータは、腸内のＯＳＭ／ＯＳＭＲ軸の重要な局面が、腸組織における白血球浸潤および保持の増加、および炎症の治癒の遅延の可能性がある結果とともに、ケモカインおよびサイトカイン産生の増大を含む炎症性間質の活性化を維持または増幅する可能性であることを示す。
ＯＳＭＲは、様々なレベルでいくつかの細胞型によって発現され、したがって、ＯＳＭは多面発現効果を発揮する。例えば、ＯＳＭＲは、内皮細胞および間葉系間質細胞、例えば、腸内に存在するものによって、健常な条件下で高度に発現される。ＯＳＭＲレベルはまた、これらの細胞型における炎症中に増加し得る。これらの細胞型のＯＳＭ刺激は、ＩＣＡＭ－１などの白血球接着受容体の発現／活性化、増殖の増加、ならびにＩＬ－６およびＣＣＬ２などの前炎症性サイトカインまたはケモカインの発現を含む様々な反応を生じる。間質系集団の異常な活性化および数的な増殖は、病原性線維症の重要な側面であり、したがって、ＯＳＭ－ＯＳＭＲシグナル伝達は、クローン病において観察されるものなどの有害な線維性反応を促進し得る。同様に、これらの細胞型におけるサイトカイン／ケモカイン産生、増殖および接着受容体発現を促進するその能力により、ＯＳＭは、組織の血管新生、白血球の動員および保持、ならびに局所的炎症過程を増強することができる。さらに、直接的または間接的にＯＳＭによる上皮増殖の増強は、慢性腸炎に関連する重症な有害事象である異形成および新生組織形成の発症を促進し得る。
造血細胞型は、一般的に、定常状態の条件下で高レベルのＯＳＭＲを発現しない。しかしながら、ＯＳＭＲ発現は、細胞が適切な刺激に曝露された場合に、これらの細胞型において誘導性である。Ｔ細胞の場合、ＯＳＭＲ発現は、ＩＬ－６などの適切な極性化サイトカインと組み合わせたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した活性化を必要とする。ＩＬ－６は、ＩＢＤ、多発性硬化症、関節炎、乾癬および癌を含む様々な障害における病原性炎症反応を促進すると考えられる炎症性Ｔｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞の発生にとって重要である。Ｔｈ１７極性化条件下で活性化されると、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＯＳＭの存在下でより効率的に増殖し（数が増加し）、Ｔｈ２細胞の産物であるサイトカインＩＬ－４などの別の極性化状態に関連する低レベルの遺伝子を発現する。炎症を起こしたヒトの腸において、ＯＳＭは、ＩＬ－６およびＩＬ－１βを含むＴｈ１７の発生を促進することが知られているサイトカインと一緒になって発現される。興味深いことに、Ｔ細胞は、活性化すると高レベルのＯＳＭを発現するが、刺激された抗原提示細胞との相互作用と関連して起こるように、これはＯＳＭの外因性供給源の曝露によってさらに増強される。したがって、ＯＳＭは、Ｔｈ１７駆動による免疫反応の増大を介して病原性炎症に寄与し得る。
Ｔ細胞と同様に、単球などの単核食細胞は、安静中にＯＳＭＲ発現が低レベルであるが、細菌全体または精製された細菌分子などの活性化刺激に曝露されると、ＯＳＭＲを１０～１００倍増加させることがある。それらはまた、活性化の際に高レベルのＯＳＭを産生する。腸組織からの観察と一致して、微生物刺激された単球によるＯＳＭ発現は、ＩＬ－６、ＩＬ－１βおよびＩＬ－２３などのＴｈ１７極性化サイトカインの発現と高度に相関する。さらに、ＯＳＭを用いた細菌により刺激された単球の刺激は、ＩＬ－２３などの炎症性サイトカインの発現を増加させることができる。
したがって、まとめると、ヒト組織、インビトロ実験、および前臨床インビボモデルの分析に基づくいくつかの系統の証拠は、ＯＳＭが広範囲に作用して、特に、微生物刺激が顕著である粘膜表面と関連して、ＩＢＤおよび他の胃腸障害などの病原性炎症を促進することができるという概念を支持する。この研究で用いられた一次インビボ大腸炎モデル（Ｈｈ＋αＩＬ１０Ｒ）は、ＴＮＦ遮断（ならびにＩＬ－６およびＩＬ－１βの遮断）に難治性であるため、ＯＳＭは、生物学的療法が現在承認されていない患者にとって特に価値のある臨床標的であり得る。
本発明は、以下の実施形態を包含する。
１．個体における慢性腸炎および／または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置または予防する方法であって、オンコスタチン－Ｍ（ＯＳＭ）および／またはＯＳＭ受容体－β（ＯＳＭＲ）のアンタゴニストを前記個体に投与し、それにより前記個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを処置または予防することを含む方法。
２．前記アンタゴニストが、Ｔｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＴｈ１７経路の発生を阻害する、上記１に記載の方法。
３．個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを診断または予後診断する方法であって、個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲを測定し、それにより個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを診断または予後診断することを含む方法。
４．前記個体におけるＯＳＭおよびＯＳＭＲを測定すること、前記ＯＳＭおよびＯＳＭＲレベルを参照ＯＳＭおよびＯＳＭＲレベルまたは参照試料のＯＳＭおよびＯＳＭＲレベルと比較すること、ならびにＯＳＭインデックス（ＯＳＭｉ）を決定することを含む、上記３に記載の方法。
５．慢性腸炎および／またはＩＢＤから寛解した個体が再発するか否かを予測する方法である、上記３に記載の方法。
６．参照試料もしくは参照レベルと比較した、または参照試料もしくは参照レベルを用いて計算した、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、および／またはＯＳＭｉレベルの上昇が、陽性の診断、陰性の予後診断、および／または前記個体が再発することを示す、上記３～５のいずれかに記載の方法。
７．参照試料もしくは参照レベルと比較した、または参照試料もしくは参照レベルを用いて計算した、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、および／またはＯＳＭｉレベルの低下が、陰性の診断、陽性の予後診断、および／または前記個体が再発しないことを示す、上記３～５のいずれかに記載の方法。
８．前記個体が、上記３～６のいずれかに記載の方法に従って診断または予後診断されている、上記１に記載の慢性腸炎および／またはＩＢＤを処置または予防する方法。
９．個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを処置または予防する方法であって、（ａ）上記３～６のいずれかに記載の方法に従って前記個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを診断または予後診断すること；ならびに（ｂ）慢性腸炎および／またはＩＢＤの処置に有用な薬剤を前記個体に投与することを含む方法。
１０．前記薬剤が、ＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのアンタゴニストである、上記９に記載の方法。
１１．前記アンタゴニストが、ＯＳＭまたはＯＳＭＲの活性または発現のアンタゴニストである、上記１、８および９のいずれかに記載の方法。
１２．前記アンタゴニストが、抗ＯＳＭ抗体もしくは抗ＯＳＭＲ抗体、またはＯＳＭもしくはＯＳＭＲ融合タンパク質である、上記１１に記載の方法。
１３．（ｉ）慢性腸炎および／またはＩＢＤを有する、または有すると疑われる、または発症するリスクがある個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのレベルを決定するための手段；ならびに
（ｉｉ）慢性腸炎および／またはＩＢＤを処置または予防するための薬剤
を含有する製品。
１４．個体が抗腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）療法に反応するか否かを予測するための方法であって、前記個体においてＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲを測定し、それにより前記個体が前記抗ＴＮＦα療法に反応するか否かを予測することを含む方法。
１５．前記抗ＴＮＦα療法が抗ＴＮＦα抗体による処置である、上記１４に記載の方法。
１６．前記抗ＴＮＦα抗体が、インフリキシマブ、アダリムマブ、セトリズマブまたはゴリムマブである、上記１５に記載の方法。
１７．参照試料もしくは参照レベルと比較した、または参照試料もしくは参照レベルを用いて計算した、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、および／またはＯＳＭｉレベルの低下が、前記個体が前記抗ＴＮＦα療法に反応することを示す、上記１４～１６のいずれかに記載の方法。
１８．前記個体の処置のために抗ＴＮＦα療法を選択または推奨することをさらに含む、上記１７に記載の方法。
１９．前記抗ＴＮＦα療法が、前記個体に対する第一選択の処置方法として選択または推奨される、上記１８に記載の方法。
２０．前記個体に抗ＴＮＦα療法を施すことをさらに含む、上記１８または上記１８に記載の方法。
２１．参照試料もしくは参照レベルと比較した、または参照試料もしくは参照レベルを用いて計算した、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、および／またはＯＳＭｉレベルの上昇が、前記個体が、前記抗ＴＮＦα療法に反応しないことを示す、上記１３～１５のいずれかに記載の方法。
２２．前記個体の処置のために抗ＴＮＦα療法以外の治療的処置を選択または推奨することをさらに含む、上記２０に記載の方法。
２３．前記個体に抗ＴＮＦα療法以外の治療的処置を施すことをさらに含む、上記２１に記載の方法。
２４．抗ＴＮＦα療法以外の前記治療的処置が抗炎症剤の投与である、上記２２に記載の方法。
２５．前記抗炎症剤がコルチコステロイドである、上記２３に記載の方法。
２６．個体におけるＴＮＦα媒介性疾患または状態を処置または予防する方法であって、前記個体にＴＮＦαアンタゴニストを投与し、それにより前記ＴＮＦα媒介性疾患または状態を処置または予防することを含み、前記個体が、上記１３～１８のいずれかに記載の方法に従って前記ＴＮＦαアンタゴニストに反応することが予測されている、方法。
２７．ＴＮＦα媒介性疾患、慢性腸炎および／またはＩＢＤを有する、または有すると疑われる、または発症するリスクがある個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのレベルを測定するためのアッセイであって、前記個体由来の生物学的試料をＯＳＭまたはＯＳＭＲに結合する薬剤と接触させること、前記薬剤とＯＳＭまたはＯＳＭＲの間の複合体形成を測定すること、場合によりＯＳＭｉを計算すること、前記測定された値またはＯＳＭｉ値を参照値と比較し、それによりＴＮＦα媒介性疾患を有する前記個体が抗ＴＮＦα療法に反応するか否かを予測すること、または前記個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを診断または予後診断することを含むアッセイ。
２８．（ａ）ＴＮＦα媒介性疾患、慢性腸炎および／またはＩＢＤを有する個体由来の生物学的試料におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのレベルを定量するための測定モジュール；
（ｂ）前記測定モジュールから出力されたデータ、ならびに参照および／または対照データを記憶するように構成された記憶モジュール；
（ｃ）前記測定モジュールから出力されたデータ、ならびに前記参照または対照データの値をコンピュータ計算するように構成されたコンピュータ計算モジュール；ならびに
（ｄ）出力データの値に基づいて、ＴＮＦα媒介性疾患を有する前記個体が、前記個体の処置のための抗ＴＮＦα療法もしくは推奨療法に反応するか否かの予測、または慢性腸炎および／もしくはＩＢＤを有する前記個体についての診断もしくは予後診断を表示するように構成された出力モジュール
を含むシステム。
２９．前記個体由来の生物学的試料について実施される、上記２～６および１３～２４のいずれかに記載の方法。
３０．前記生物学的試料が、血液試料、血清試料、便試料、腸生検、または外科的切除試料である、上記２６に記載のアッセイ、上記２７に記載のシステム、または上記２８に記載の方法。
３１．前記生物学的試料が血清試料である、上記２９に記載のアッセイ、システムまたは方法。
３２．上記２～６、１３～２４および２８～３０のいずれかに記載の方法において使用するための試験キットであって、前記個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのレベルを決定するための手段、ならびに前記方法において使用するための指示書を含む試験キット。
３３．前記個体が慢性腸炎、自己免疫疾患または炎症性疾患を有する、上記１３～３１のいずれかに記載の方法、アッセイ、システムまたは試験キット。
３４．自己免疫疾患または炎症性疾患がＩＢＤである、上記３２に記載の方法、アッセイ、システムまたは試験キット。
３５．前記ＩＢＤが結腸直腸癌に関連する、上記１～１２、２６～３１および３３のいずれかに記載の方法、製品、アッセイ、システムまたは試験キット。
３６．前記ＩＢＤがクローン病（ＣＤ）または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である、上記１～１２、２６～３１、３３および３４のいずれかに記載の方法、製品、アッセイ、システムまたは試験キット。
３７．前記ＣＤが結腸ＣＤまたは回腸ＣＤである、上記３５に記載の方法、製品、アッセイ、システムまたは試験キット。
３８．前記個体が哺乳動物である、上記１～３７のいずれかに記載の方法、製品、アッセイ、システムまたは試験キット。
３９．前記哺乳動物がヒトである、上記３７に記載の方法、製品、アッセイ、システムまたは試験キット。
４０．慢性腸炎および／またはＩＢＤを有する個体が手術を必要とする可能性を決定する方法であって、前記個体においてＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲを測定し、それにより個体が手術を必要とする可能性を決定することを含む方法。

Claims (11)

  1. 個体における慢性腸炎および／または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置または予防する方法において使用するための、オンコスタチン－Ｍ（ＯＳＭ）活性またはＯＳＭシグナリングのアンタゴニストを含む医薬組成物であって、前記アンタゴニストが、抗ＯＳＭもしくは抗ＯＳＭＲ抗体、ＯＳＭもしくはＯＳＭＲのｍＲＮＡに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＯＳＭもしくはＯＳＭＲのｍＲＮＡに結合する干渉ＲＮＡ、もしくはＯＳＭもしくはＯＳＭＲのデコイ結合パートナーとして作用するＯＳＭもしくはＯＳＭＲ融合タンパク質、または抗ＯＳＭもしくは抗ＯＳＭＲ抗体をコードするポリ核酸、ＯＳＭもしくはＯＳＭＲのｍＲＮＡに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするポリ核酸、ＯＳＭもしくはＯＳＭＲのｍＲＮＡに結合する干渉ＲＮＡをコードするポリ核酸、もしくはＯＳＭもしくはＯＳＭＲのデコイ結合パートナーとして作用するＯＳＭもしくはＯＳＭＲ融合タンパク質をコードするポリ核酸である、医薬組成物。
  2. 前記個体が、個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲを測定し、それにより個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを診断または予後診断することを含む方法により、診断または予後診断されている、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 診断または予後診断方法が、前記個体におけるＯＳＭおよびＯＳＭＲを測定すること、前記ＯＳＭおよびＯＳＭＲレベルを参照ＯＳＭおよびＯＳＭＲレベルまたは参照試料のＯＳＭおよびＯＳＭＲレベルと比較すること、ならびにＯＳＭインデックス（ＯＳＭｉ）を決定することを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 診断または予後診断方法が、慢性腸炎および／またはＩＢＤから寛解した個体が再発するか否かを予測する方法である、請求項２または３に記載の医薬組成物。
  5. 診断または予後診断方法が、個体が手術を必要とする可能性を決定する方法である、請求項２または３に記載の医薬組成物。
  6. 前記アンタゴニストが、Ｔｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＴｈ１７経路の発生を阻害する、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 処置方法が、
    （i）個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲを測定し、それにより個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを診断または予後診断することを含む方法を用いて個体における慢性腸炎および／またはＩＢＤを診断または予後診断すること；ならびに
    （ii）ＯＳＭ活性またはＯＳＭシグナリングのアンタゴニストを前記個体に投与すること
    を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 前記個体が哺乳動物であり、場合により前記哺乳動物がヒトである、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. （ｉ）慢性腸炎および／またはＩＢＤを有する、または有すると疑われる、または発症するリスクがある個体におけるＯＳＭおよび／またはＯＳＭＲのレベルを決定するための手段であって、場合により、前記個体が哺乳動物であり、場合により前記哺乳動物がヒトである手段；ならびに
    （ｉｉ）請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物
    を含有する、個体における慢性腸炎および／または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置または予防する方法において使用するための製品。
  10. 前記ＩＢＤが結腸直腸癌に関連し、および／または前記ＩＢＤがクローン病（ＣＤ）または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）であり、さらに場合により、前記ＣＤが結腸ＣＤまたは回腸ＣＤである、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  11. 前記ＩＢＤが結腸直腸癌に関連し、および／または前記ＩＢＤがクローン病（ＣＤ）または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）であり、さらに場合により、前記ＣＤが結腸ＣＤまたは回腸ＣＤである、請求項９に記載の製品。
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