JP2018518198A - リンパ性血液疾患の予後診断方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、生体試料中の、インターロイキン10を分泌するB細胞リンパ球(B-cell lymphocyte)の量を定量する工程を含み、試料を採取される患者における、IL−10を分泌するB細胞が前記試料の5%未満であり、治療により奏効が得られる尤度が50%を突破する、予後診断方法に関する。【選択図】なし
Description
本発明は、リンパ性血液疾患(特に、リンパ性白血病およびリンパ腫(lymphoma))の予後診断方法に関する。
モノクローナル抗体は、癌および免疫不全症をはじめとする多くの疾患における治療的な処置に変革をもたらしてきた。リツキシマブ(MabThera(登録商標))は、例えば、リンパ腫(lymphoma)または慢性リンパ性白血病(chronic lymphoid leukemia)患者の生存率を高め、且つ免疫性機能不全疾患に罹患する患者のクオリティ・オブ・ライフの向上を可能にしてきた。
リツキシマブは、前リンパ球(pro-lymphocyte)分裂期、プラズマ細胞分裂期のBリンパ球(B lymphocyte)により発現されるCD20を認識するキメラ免疫グロブリンIgG1である。リツキサポートシマブのさまざまな作用機序に関しては、リツキシマブの定常Fc部分(ADCC、CDCおよびファゴサイトーシス)に依存する作用機序、ならびにリツキシマブの可変Fv(アポトーシス)部分に依存する作用機序について、インビトロベースで説明してきた。FcγRIIIaは、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)、マクロファージ、および依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)のエフェクター細胞によって発現される。
遺伝子FCGR3Aの多型によって受容体(FcγRIIIa−158VF)上のアミノ酸158が置換されて、リツキシマブに対して良好に反応する(ホモ接合体158−V)患者と、リツキシマブに対して反応しない(ホモ接合体158−Fおよびヘテロ接合体)患者との判別が可能になることが明らかにされてきた。
特に、特許出願(国際公開第2003035904号)により既知のこととなっているように、リンパ腫(lymphoma)をはじめとする悪性腫瘍の罹患患者に対して、被験者のFCGR3A遺伝子型の判定を用いることができる。この遺伝子型の判定は、最も良好に反応する被験者を選択し、且つ/あるいは低反応プロファイルで反応する被験者に応じて治療条件またはプロトコールを調整するのに適している。
にもかかわらず、インビボ抗CD20(anti-CD20)の作用機序は、依然としてあまり解明されておらず、病理(pathology)に応じて異なる場合がある。なおまた、重要な留意すべき点は、陰性表現型を有する患者の67%は依然としてリツキシマブに適応することから、現在FcγRIIIaの多型158VFの予測効果解析は臨床用途に用いられていないことである。したがって、この作用機序を理解することによって、改善を図るための新たな治療方針を提案するとともに、この種の高額治療が奏効しえない患者をより適正に選択して、他の治療選択肢に転向させることに対する関心が高まってきている。
免疫細胞の中には、インターロイキン−10(IL−10)を分泌するBリンパ球(B lymphocyte)(B10細胞)を含み、特に細胞傷害性T応答を制限するという機能を司る免疫調節性サイトカインが存在する。これらの細胞は、マウスおよびヒトにおいて存在する。Bリンパ球腫瘍(Tumor B lymphocyte)は、IL−10の分泌というB10の機能を呈しうる。
ネズミのリンパ腫(lymphoma)モデルにおいて明らかにされてきたように、マウスにおいてB10が発生するとネズミ抗CD20(anti-CD20)を用いた治療に対する反応が妨げられていた(Horikawaら著「JClinInvest」2011年11月1日発行;第121巻(第11号)、4268〜4280頁)。しかしながら、本研究はマウスにおいて実施する限りで当てはまるものであって、ヒトにおけるB10細胞の発生は、抗CD20(anti-CD20)抗体で治療された患者における治療反応には関係しなかった。更になお、さまざまな免疫グロブリンアイソタイプの生物学的活性、および免疫グロブリンFc部分における受容体の発現に関して、ヒトとマウスとでは極めて大きな相違点がある。マウスにおいて得られた結果をヒトに関して推定することは不可能であり、且つ、いかなる場合でもマウスモデルにおいて得られた結果を臨床的に実証すること無しにヒトに適用することはできない。
免疫療法に対する反応が周知となって久しいことから、患者の治療を適応可能とする成分に対するニーズが存在する。
本発明の一目的は、これらの不利益を克服することにある。
本発明の別の目的は、奏効する尤度を考慮に入れ、治療の失敗に付随するコストを抑えることを視野に入れたうえで、所与の病理学的状況に適用される治療プロトコールを簡単且つ迅速に特定することを可能にする、予後診断方法を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、前記方法を実施するための予後診断パッケージまたはキットを提供することにある。
本発明は、血液疾患に罹患する患者から採取された腫瘍試料中の治療用抗体によって媒介される治療反応に対するインビトロ予後診断方法に関する。前記抗体が、前記血液疾患の細胞を枯渇させる抗体であり、前記腫瘍試料中の、インターロイキン10を分泌するB細胞リンパ球(B-cell lymphocyte)の量のインビトロ定量を含む方法において、腫瘍試料を採取される患者における、IL−10を分泌するB細胞の量が、前記試料の細胞の総量の5%未満であり、前記治療用抗体での治療後には、前記血液疾患の細胞枯渇率が90%超となる尤度が、50%を突破するものと見られる。
本発明は、第一に、上記血液疾患は、IL−10を分泌するB細胞の母集団を示し、第二に、患者に治療用抗体で治療を施したときに、これらの細胞の量が患者の予後に影響を及ぼすという、本発明者らによる驚くべき観察に基づくものである。更にまた、治療前には低量であったIL−10を分泌する細胞の量が増えると治療に対する反応が改善されるため患者の予後診断が良好化されることも、本発明者らによって見出された。
特に、本発明者らは、IL−10を分泌する細胞の量は、血液疾患の循環細胞の総数の5%未満であり、治療後の患者の予後診断は、過半数の症例において利益をもたらすことを明らかにすることができた。
本発明との関連において、用語「血液疾患に罹患する患者由来の腫瘍試料」とは、試料もしくは生検の全部ないしは一部に腫瘍細胞が含まれる、血液試料または生検を指す。上述の腫瘍試料は、血液疾患の根絶を図るための治療の開始に先立って患者から採取される。
赤血球および有核細胞は考慮に入れないものとする。
本発明に係る予後診断方法は、治療用抗体、またはより全般的には「抗体」に関する。本明細書では以降、特に具体的詳細を特記しない限り、両方の呼称を使用するものとする。「治療用抗体」とは、個体または患者において判別された標的細胞を排除する機能を有する抗体であると考えられる。標的細胞の例としては、腫瘍細胞のほか、1種以上のウイルスに感染した細胞、アレルギーおよび自動免疫疾患などに関与する病理学的免疫コンピテント細胞(例えば、Bリンパ球(B lymphocyte)、Tリンパ球(lymphocyte T)もしくは抗原提示細胞など)、または更には正常な細胞(抗血管新生治療方針における内皮細胞の例)が挙げられる。好ましい標的細胞は、腫瘍細胞および感染細胞である。
リツキシマブのような、アイソタイプがIgG1である治療用抗体によって、抗体依存性細胞傷害(antibody-dependent cellular cytotoxicity)(すなわち、ADCC)、抗体依存性細胞ファゴサイトーシス(antibody-dependent cellular phagocytosis)(すなわち、ADPC)および補体依存性細胞溶解(complement-dependent cell lysis)(すなわち、CDC)が媒介される場合もある。
本発明に係る治療用抗体は、ハイブリドーマまたは遺伝子工学によって生成可能で、且つアイソタイプがIgG1またはIgG3であるものが好ましい。本発明において好ましい治療用抗体は、腫瘍抗原(腫瘍の表面上に発現するCD20、CD22、CD25、CD38などの分子)、またはより一般的には造血性腫瘍抗原(hematopoietic tumor antigen)、好ましくはリンパ腫(lymphoid)に対する上記アイソタイプを有する抗体である。
本発明において、「枯渇化(depleting)」抗体とは、標的細胞の枯渇、例えば、標的細胞の減弱または劣化を引き起こす抗体を指す。
本発明の予後診断は、インターロイキン10(すなわちIL−10)を分泌する能力を有する腫瘍(tumor)のB細胞の量を定量することに基づく。IL−10は、インターロイキン2、インターロイキン3、TNFおよび或るインターフェロンなどの、或るサイトカインの生成を阻害することにより、免疫応答を阻害する効果を有する。また、IL−10は、免疫系に関与するさまざまな細胞(マスト細胞、リンパ球(lymphocyte)など)の数を調節することによって免疫に作用する。
本発明者らは、血液疾患においてIL−10を分泌するBリンパ球(B lymphocyte)の数を定量化することによって、治療前のこれらの細胞の5%未満において腫瘍(tumor)が、治療用抗体での治療に対する反応性を高め、結果として、患者の予後診断の良好化につながることを見出した。したがって、この治療用抗体を単独で用いる療法、または他のプロトコール(化学療法、放射線療法など)と併用する療法を、当該の患者に合わせて構想することが可能である。IL−10を分泌するBリンパ球(B lymphocyte)の数が5%の閾値を超え、治療用抗体1種類だけを用いた治療を施された患者の予後診断がおそらくあまり良好ではない場合、別のより好適なレジメンを検討することが推奨される。
したがって、本発明の予後診断は、コストを合理化し、全然ではないにしろ奏効が良好でない患者に対して高額な過剰治療を施すのを回避しながら、治療用抗体での治療が奏効する機会を特定し、患者に提供するのに最善の療法を判別することを可能にするものである。
好都合にも、本発明は、上述の予測方法に関し、配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位にある、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にあるアミノ酸を定量する工程を更に含む。そのような方法において、腫瘍試料を採取される患者における、
− 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位に、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にバリンを有し、
− 治療前に、試料中IL−10を分泌するB細胞の量は、試料の細胞の総量の5%未満であった。前記治療用抗体で治療を施された後には、前記血液疾患の細胞枯渇率が90%超となる尤度が、50%を突破するものと見られる。
− 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位に、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にバリンを有し、
− 治療前に、試料中IL−10を分泌するB細胞の量は、試料の細胞の総量の5%未満であった。前記治療用抗体で治療を施された後には、前記血液疾患の細胞枯渇率が90%超となる尤度が、50%を突破するものと見られる。
言い換えれば、本発明は、血液疾患に罹患する患者から採取された腫瘍試料中の治療用抗体によって媒介される治療反応に対するインビトロ予後診断方法であって、前記抗体を、前記血液疾患の細胞を枯渇させる抗体とした、方法に関する。本方法は、前記試料の細胞における、
− 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位にある、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にあるアミノ酸のインビトロ定量を行う工程と、
− 治療前にインターロイキン10を分泌するB細胞リンパ球(B-cell lymphocyte)の量を定量する工程と、
を含み、そのような方法において、腫瘍試料を採取される患者における、
− 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位に、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にバリンを有し、
− IL−10を分泌するB細胞の量は試料中の全細胞の5%未満であった。前記治療用抗体で治療を施された後には、前記血液疾患の細胞枯渇率が90%超となる尤度が、50%を突破するものと見られる。
− 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位にある、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にあるアミノ酸のインビトロ定量を行う工程と、
− 治療前にインターロイキン10を分泌するB細胞リンパ球(B-cell lymphocyte)の量を定量する工程と、
を含み、そのような方法において、腫瘍試料を採取される患者における、
− 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位に、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にバリンを有し、
− IL−10を分泌するB細胞の量は試料中の全細胞の5%未満であった。前記治療用抗体で治療を施された後には、前記血液疾患の細胞枯渇率が90%超となる尤度が、50%を突破するものと見られる。
本発明者らによって、第2の驚くべき観察が為された。それは、IL−10を分泌するBリンパ球(B lymphocyte)の量を定量することと、FcγRIIIa受容体の特定の多型を判別することとを組み合わせることによって、患者の予後診断が有意に良好化されることである。
下掲の例に示すように、FcγRIIIa受容体の多型を判別しただけでは、治療用抗体で治療される患者の適正な反応を予測するための十分な情報を得ることが可能にならないのが、実情である。
FcγRIIIa受容体の多型に関しては、先行技術において、特に、国際特許出願(国際公開第2003035904号)において既に論述されている。タンパク質の176位にある、または成熟タンパク質の158位にある、変異を経たアミノ酸が、フェニルアラニン(F)もしくはバリン(V)のどちらであるかに応じて、治療用抗体に対する治療反応が異なってくる。
本発明において、配列番号1の配列からなるタンパク質はFcγRIIIaタンパク質に対応していて、配列番号2の配列からなるタンパク質は成熟タンパク質FcγRIIIaに対応している。
ヒトは二倍体であるため、この多型が取りうる遺伝子型には、176V/V(または158V/V)、176V/F(または158V/F)、および176F/F(または158F/F)の3とおりがある。
上述の方法との関連において、FCGR3A遺伝子の両方の対立遺伝子上の176位または158位にバリンを有する個体または患者は、ホモ接合体V/Vを有する患者であると見なされる。それゆえ、FcγRIIIa受容体の176(158)位がホモ接合体V/Vである患者において、治療を施される前にはIL−10を分泌するBリンパ球(B lymphocyte)の濃度が全腫瘍細胞を基準にして5%未満であり、治療後には、治療用抗体での治療が奏効する尤度は50%を突破し、且つ腫瘍細胞の枯渇率も90%を突破するものと見られる。
IL−10を分泌するB細胞の比率は、腫瘍細胞の総量の5%未満であれば有利である。つまり、IL−10を分泌する細胞の比率が4.9%、4.8%、4.7%、4.6%、4.5%、4.4%、4.3%、4.2%、4.1%、4%、3.9%、3.8%、3.7%、3.6%、3.5%、3.4%、3.3%、3.2%、3.1%、3%、2.9%、2.8%、2.7%、2.6%、2.5%、2.4%、2.3%、2.2%、2.1%、2%、1.9%、1.8%、1.7%、1.6%、1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%または0.1%であれば、特に有利である。
好都合にも、本発明は、該血液疾患がCD20表面マーカーを発現する細胞における血液疾患である(つまり、CD20表面マーカーを発現する腫瘍細胞における血液疾患である)、上述の予後診断方法に関する。
CD20は、ヒトBリンパ球(B lymphocyte)の第1の分化抗原であり、モノクローナル抗体を使用して同定されてきた。B細胞の特異的マーカーは、細胞発育過程である前駆B(pre-B)ステージから成熟Bリンパ球(B lymphocyte)ステージまでの間にわたって存在するが、血漿(plasma)細胞の表面には存在しない。コード遺伝子は染色体11に位置する。CD20が属する分子系統(family)は、CD20と、高親和性IgE受容体のβ鎖と、リンパ性および骨髄性造血細胞の表面上に存在し且つ未知の機能を有するHTm4分子とを含んで構成される。
有利な一実施形態において、本発明は、血液疾患が、CD20を発現する慢性B細胞リンパ性白血病(B-cell chronic lymphoid leukemia)(CLL)、リンパ腫(lymphoma)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(diffuse large B cell lymphoma)およびその全ての組織学的変種;濾胞性のリンパ腫およびマントル細胞リンパ腫;辺縁帯リンパ腫(marginal zone lymphoma)、MALTリンパ腫(英名:粘膜関連リンパ組織)、バーキットリンパ腫(Burkitt lymphoma)、リンパ形質細胞性リンパ腫(lymphoplasmacytic lymphoma)、ワルデンストレーム病(Waldenstrom’s disease)、B細胞前リンパ性白血病(B-cell prolymphocytic leukemia)、ならびに全ての分類不能なB細胞リンパ腫(B-cell lymphoma)CD20+からなる群から選択される、上述の予後診断方法に関する。
したがって、好都合にも、本発明は、慢性リンパ性白血病(chronic lymphoid leukemia)患者から採取された腫瘍試料中の治療用抗体によって媒介される治療反応に対する上記インビトロ(in vitro)予後診断方法を提供する。
有利な一実施形態において、本発明は、上記に定義されている予後診断方法に関するものであり、本方法は、IL−10の分泌が活性化された後にフローサイトメトリで、あるいは血清中IL−10の循環濃度を測定することによって、試料中のIL−10を分泌するB細胞の量を定量する。
腫瘍試料中のIL−10を分泌するB細胞の量を定量するにはいくつかの方法があるが、本発明の方法は、フローサイトメトリによる検出からなることが好ましい。
この目的に合うように、患者から単離された有核細胞を、培養液中に入れてIL−10の分泌を促す化合物で処理する。その後で、培養培地内に分泌されたIL−10の量を定量することもできるし(ただし、この定量的情報は刺激が人為的なものである限りにおいては精度が良くない)、あるいは分泌阻止工程を遂行し、生成されたIL−10が分泌元のB細胞内に接収されるようにもできる。続いて、細胞を抗IL−10抗体で標識し、フローサイトメトリで定量化してもよい。実験の詳細については、後述の実施例に示す。
また、本発明者らによって明らかにされてきたように、上記に定義されている血液疾患に罹患する患者における腫瘍(tumor)中のIL−10を分泌するB細胞の量と、前記患者の血漿(plasma)中を循環するIL−10の量との間には相関がある(下掲の例を参照のこと)。また、血清中IL−10の単回投与によって、確かにより大雑把ではあるが、患者におけるIL−10を分泌するB細胞の比率を定量することが可能である。
別の有利な実施形態において、本発明は、配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位にある、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にあるアミノ酸のインビトロ定量を、常法および特異的オリゴヌクレオチド(プライマー)を使用して、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)、例えば、PCR単独使用、またはPCRと逆転写(RT−PCR)もしくはネステッドPCR(nested PCR)との併用などによって遂行する、上述の予後診断方法に関する。
FcγRIIIa受容体をコードする遺伝子の遺伝子型判定は、核酸またはタンパク質の解析をはじめとするさまざまな技法により達成できる。制限酵素での特異的消化、ハイブリダイゼーション、または有利には、増幅/分離/配列決定によって、解析(analyses)を実行できる。RNAからの多型を判別し同定することを、検討することさえできる。その技法としては、国際公開第2003035904号の出願に記載されているものが準用される。
PCR技法などの増幅反応を用いた状況において、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、50個のヌクレオチド、好ましくは約30個のヌクレオチド、好ましくは17〜25個のヌクレオチドを含む、一本鎖オリゴヌクレオチドであることが好ましい。オリゴヌクレオチドは、少なくとも5個、または更には少なくとも8個のヌクレオチド、厳密には、増幅の対象となる標的配列に相補的なヌクレオチド、特に、前記オリゴヌクレオチドの3’位にヌクレオチドを有することが好ましい。有利なオリゴヌクレオチドを特定するために、当業者は、データベースで(具体的にはGenBankデータベースで)AL590385という番号でアクセスできるヒトFCGR3A遺伝子の配列を使用することもできるし、あるいはGenBankデータベースでNM_000569という番号で指定できる相補的DNA配列を使用することもできる。
本発明に係る予後診断を特定するうえで特に有利なオリゴヌクレオチドは、配列番号3、配列番号4および配列番号5の配列で表されるオリゴヌクレオチドである。
当然ながら、本発明はこれらの特異的オリゴヌクレオチドに限定されるものではなく、当業者であれば、より特異的なオリゴヌクレオチドを想到できる。
更に別の有利な実施形態において、本発明は、前記治療用抗体を、IgG1またはIgG3免疫グロブリン、特に抗CD20(anti-CD20)抗体、具体的にはリツキシマブとする、上述の方法に関する。
ゆえに、本発明の方法との関連において使用される治療用抗体は、有利には、抗CD20(anti-CD20)抗体、具体的にはリツキシマブである。本構成において、本発明の方法は、好都合にも、慢性B細胞リンパ性白血病(B-cell chronic lymphoid leukemia)またはB細胞リンパ腫(B-cell lymphoma)に対する本抗体で治療される患者に対して奏効する予後診断を提案しようとするものである。
リツキシマブは、CD20表面分子に対するキメラモノクローナル抗体である。リツキシマブのFab可変部分は、Bリンパ球(B lymphocyte)のCD20抗原に結合する。これらのリンパ球(lymphocytes)の溶解を引き起こす免疫エフェクター機能はリツキシマブの定常Fc部分によって生起されうる。エフェクターによって誘発される可能性のある細胞溶解の機序としては、C1qフラグメントの結合を伴う補体依存性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity)(CDC);顆粒球、マクロファージおよびNK細胞の表面上の1つ以上のFcγ受容体を介した抗体依存性細胞傷害(ADCC);ならびに顆粒球およびマクロファージの表面上のFcγ受容体との相互作用を同様に介したファゴサイトーシス(すなわち、ADPC)が挙げられる。また、リツキシマブが、Bリンパ球(B lymphocyte)のCD20抗原に結合することによって、アポトーシスによる細胞死を誘発することも実証されてきた。
ゆえに、この好ましい態様において、本発明は、慢性リンパ性白血病(chronic lymphoid leukemia)またはB細胞リンパ腫(B-cell lymphoma)の罹患患者から採取された腫瘍試料中の、アイソタイプがIgG1またはIgG3である抗CD20(anti-CD20)治療用抗体によって媒介される治療応答のインビトロ予後診断方法に関するものであり、本方法は、前記試料の細胞における、
− 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位にある、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にあるアミノ酸を、インビトロ定量する工程と、
− インターロイキン10を分泌するB細胞リンパ球(B-cell lymphocyte)の量を定量する工程と、
を含み、そのような方法において、腫瘍試料を採取される患者における、
− 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位に、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にバリンを有し、
− IL−10を分泌するB細胞の量は試料中の全細胞の5%未満であり、前記抗CD20(anti-CD20)治療用抗体での治療後に、前記白血病またはリンパ腫(lymphoma)の細胞枯渇率が90%超となる尤度が、50%を突破するものと見られる。
− 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位にある、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にあるアミノ酸を、インビトロ定量する工程と、
− インターロイキン10を分泌するB細胞リンパ球(B-cell lymphocyte)の量を定量する工程と、
を含み、そのような方法において、腫瘍試料を採取される患者における、
− 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位に、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にバリンを有し、
− IL−10を分泌するB細胞の量は試料中の全細胞の5%未満であり、前記抗CD20(anti-CD20)治療用抗体での治療後に、前記白血病またはリンパ腫(lymphoma)の細胞枯渇率が90%超となる尤度が、50%を突破するものと見られる。
別の態様において、本発明は、治療用抗体で治療することの可能な血液疾患に罹患する患者のインビトロ予後診断用のキットに関し、具体的には、慢性リンパ性白血病(chronic lymphoid leukemia)またはB細胞リンパ腫(B-cell lymphoma)の予後診断用のキットに関するものであり、本予後診断キットは、
− 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の176位にある、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にあるアミノ酸を検出する手段と、
− IL−10を分泌するB細胞リンパ球(B-cell lymphocyte)の量を定量する手段と、
− 1種以上の対照試料とを含む。
− 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の176位にある、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にあるアミノ酸を検出する手段と、
− IL−10を分泌するB細胞リンパ球(B-cell lymphocyte)の量を定量する手段と、
− 1種以上の対照試料とを含む。
本発明に係る予後診断パッケージまたはキットは、上記方法に必須の2つのパラメータ:受容体多型およびIL−10を分泌するB細胞の量、を測定する手段を提供するものである。予後診断を標準化するため、本キットまたは本パッケージには、対照試料もまた付属している。これらの対照試料は、健常者から採取された試料(陰性対照)、ならびに/または病人(陽性対照)および/もしくは予後診断(陽性対照)が不良であると診断された個体の予後不良に対応している。
本対照試料(1種以上)は、IL−10を分泌するB細胞の量を定量するフローサイトメーターの較正を可能にする指示データ(indications)、または物理媒体上のコンピュータデータとすることができる。
上述したように、IL−10を分泌するB細胞の量を定量する手段は、細胞のフローサイトメトリで評価される対象の抗体としてもよいし、あるいはIL−10の生成を刺激し且つ/または阻害するための薬物としてもよい。また、血漿(plasma)中に循環しているIL−10の量を定量するための抗体とすることもできる。
好都合にも、本発明は、上記に定義されている予後診断用のキットに関する。配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の176位にある、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にあるアミノ酸を検出する手段には、配列番号3、配列番号4および配列番号5の配列のオリゴヌクレオチドが包含される。
もちろん、当業者は、多型に対応している領域のPCR増幅用に他のオリゴヌクレオチドを供給することによって、試験対象の患者が保有する対立遺伝子を判別することができる。
別の態様において、本発明は、血液疾患に罹患する患者由来の試料中のIL−10を分泌するB細胞のインビトロ検出用の適切な媒体上に実装されたコンピュータプログラム製品に関する。
本発明の別の態様は、IL−10を分泌するB細胞の検出をフローサイトメトリで実行するように設計され、且つ/あるいは(特に、フローサイトメーターに接続された)コンピュータ上で前記プログラムが実行されたときに、前記検出を実行する部分/手段/指示プログラムコードを備える、ソフトウェア製品またはコンピュータプログラム製品に関する。好都合にも、前記プログラムは、コンピュータ可読データ記録媒体内に収録されている。そのようなサポートは、CD−ROMなどの携帯型記録媒体だけに限定されず、コンピュータの内部メモリー(例えば、RAMおよび/もしくはROM)、またはハードドライブもしくはUSBメモリスティック(USB key)などの外部メモリーデバイスを備えるデバイス、または近傍サーバーもしくは遠隔サーバーも共有できる。
したがって、本発明は、上記に定義されているような予後診断方法の実施用の適切な媒体上に実装されたコンピュータプログラム製品であって、IL−10を分泌するB細胞の量の定量を可能にする前記コンピュータプログラム製品に関する。
本コンピュータプログラムは、特に、自動調整および標準化の実行によって、ユーザーが単に情報をサイトメーター内にローディングして再現的に取得される腫瘍細胞を渡すだけで、IL−10を分泌するB細胞の量の定量を可能にするものである。
別の態様において、本発明は、治療用抗体により血液疾患の改善を図る方法において、リンパ球(lymphocyte)によるIL−10の分泌または活性に対する少なくとも1つの阻害剤の使用を含む方法に関する。
特に、本発明は、抗CD20(anti-CD20)抗体、具体的にはリツキシマブにより血液疾患の治療の改善を図る方法において、リンパ球(lymphocyte)によるIL−10の分泌または活性に対する少なくとも1つの阻害剤の使用を含む方法に関する。
別の態様において、本発明は、IL−10を分泌するリンパ球(lymphocytes)に対する少なくとも1つの阻害剤の使用を含む、治療用抗体により血液疾患の改善を図る方法に関する。
特に、本発明は、IL−10を分泌するB細胞に対する少なくとも1つの阻害剤の使用を含む、抗CD20(anti-CD20)抗体、具体的にはリツキシマブによる血液疾患の治療の改善を図る方法に関する。
本発明において、IL−10を分泌するB細胞に対する阻害剤、またはIL−10を分泌するリンパ球(lymphocyte)に対する阻害剤は、それらの増殖を阻害することによりIL−10を分泌する能力を阻害するか、あるいはアポトーシス等の死を誘発するかのいずれかによって、B10リンパ球(lymphocyte)の活性を妨げる能力を有する化合物もしくは分子、またはこれらの混合物であると定義される。
B10細胞がリツキシマブの有効性に及ぼす影響、およびIL−10の分泌との相関が、本発明者らによって同定されたことから、
− Bリンパ球(B lymphocyte)によるIL−10の生成を、例えば、合成または分泌を抑制することによって阻害すること、
− またはIL−10の生物学的活性を阻害すること、
のいずれかを正しく実現する方法が提案されれば有利である。
− Bリンパ球(B lymphocyte)によるIL−10の生成を、例えば、合成または分泌を抑制することによって阻害すること、
− またはIL−10の生物学的活性を阻害すること、
のいずれかを正しく実現する方法が提案されれば有利である。
分泌阻害剤としてブレフェルディンAを使用してもよい。
また、IL−10抗体などのIL−10阻害剤を使用することもできるし、あるいは標的インターロイキンを飽和させるペプチド模倣薬を使用して、天然タンパク質の活性を阻害しても差し支えない。
一般知識を有する当業者であれば、IL−10を阻害する分子、またはIL−10の分泌を阻害する分子を、スクリーニングするための方法を、容易に提供することができる。
本発明はまた、治療用抗体(特に、抗CD20(anti-CD20)またはリツキシマブ)による血液疾患の処置の促進を図る薬剤の調製を目的とした、IL−10の活性または分泌に対する阻害剤の使用に関する。
本発明は、少なくとも1つの治療用抗体(特に、抗CD20(anti-CD20)抗体またはリツキシマブ)を用いた血液疾患の治療という状況において用いるための、IL−10の活性または分泌に対する阻害剤に関する。
好都合にも、本発明は、IL−10の活性または分泌に対する少なくとも1つの阻害剤と、少なくとも1つの治療用抗体(特に、血液疾患治療用の抗CD20(anti-CD20)抗体またはリツキシマブであって、その腫瘍細胞が、配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位にある、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にある、バリンを有するもの)とを含む組成物に関する。
4つの図面および以下の実施例に照らし合わせれば、本発明に関する理解が深まるであろう。
実施例1
(MabThera(登録商標)、Rituxan(登録商標)として市場投入されている)リツキシマブの作用機序は、依然として解明されていないが、B細胞性リンパ増殖性疾患の亜型に応じて異なる場合がある。リツキシマブは、インビトロ・アポトーシス、補体依存性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity)(CDC)、細胞媒介性細胞傷害(ADCC)および抗体依存性ファゴサイトーシス(ADPC)を誘発することで知られており、一部の結果は、傾向的に見れば、これらインビボ機序との関連性を有する。
(MabThera(登録商標)、Rituxan(登録商標)として市場投入されている)リツキシマブの作用機序は、依然として解明されていないが、B細胞性リンパ増殖性疾患の亜型に応じて異なる場合がある。リツキシマブは、インビトロ・アポトーシス、補体依存性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity)(CDC)、細胞媒介性細胞傷害(ADCC)および抗体依存性ファゴサイトーシス(ADPC)を誘発することで知られており、一部の結果は、傾向的に見れば、これらインビボ機序との関連性を有する。
最近になって、リツキシマブに対する反応に影響するいくつかの要因が発見された。
本発明者らは以前から、FcγRIIIa受容体の多型V/Fが、リツキシマブ治療に対する臨床反応に影響することを観察してきた。(NK細胞およびマクロファージの表面上に発現される)FcγRIIIa受容体のIgG1の定常領域の親和性が、多型によって改変されることから、リツキシマブで治療される濾胞性リンパ腫(follicular lymphoma)に対する治療との関連においてADCCの機序を重要視すべきであろうという仮説が本発明者によって想定された。
最近、ヒトおよびマウスにおいてIL−10を分泌する能力を有する細胞タイプとして同定されているのが、制御性B細胞である。また、これらのB細胞はB10細胞(B10 cell)またはB10とも呼ばれ、IL−10を生成することを基礎にして、炎症の抑制、自己免疫、および先天性もしくは適応性免疫応答を可能にするという特徴を備える。ネズミモデルにおいて、B10細胞は、免疫グロブリンの定常部分(Fc部分)によって媒介される単球機能に対して作用することにより、抗CD20(anti-CD20)抗体によって誘発されたリンパ腫(lymphoma)を死滅させる細胞を阻害できる。
より最近では、慢性リンパ性白血病(chronic lymphoid leukemia)(CLL)クローナル由来の細胞が、免疫抑制特性およびIL−10コンピテンスを呈することが明らかにされてきた。
その後、本発明者らによって見出されたように、IL−10コンピテント慢性リンパ性白血病(CLL)細胞は、この種の白血病患者の治療におけるリツキシマブの有効性に対して影響を及ぼす可能性がある。
患者および治療
患者
2012年6月〜2013年1月の期間にわたって、フランスにおいて患者140例を収容する59施設で、前向き無作為化第II相研究が実施された。本治験では、以前に治療を受けたことがなく(18〜65歳)、且つ免疫表現型の分類基準に基づいて確かに慢性リンパ性白血病(chronic lymphoid leukemia)であると診断された患者を、IWCLL2008(ビネーステージCにある患者、またはビネーステージAもしくはBにあって且つ活動性疾患を伴う患者)として登録した。17pの欠失の無いことを追加的な組み入れ基準として考慮に入れ、FISHにより評価した(<10%陽性核)。患者全員が、治験に組み入れられる前に、書面によるインフォームド・コンセントを提出した。
患者
2012年6月〜2013年1月の期間にわたって、フランスにおいて患者140例を収容する59施設で、前向き無作為化第II相研究が実施された。本治験では、以前に治療を受けたことがなく(18〜65歳)、且つ免疫表現型の分類基準に基づいて確かに慢性リンパ性白血病(chronic lymphoid leukemia)であると診断された患者を、IWCLL2008(ビネーステージCにある患者、またはビネーステージAもしくはBにあって且つ活動性疾患を伴う患者)として登録した。17pの欠失の無いことを追加的な組み入れ基準として考慮に入れ、FISHにより評価した(<10%陽性核)。患者全員が、治験に組み入れられる前に、書面によるインフォームド・コンセントを提出した。
無作為化
FISH(11qの欠失)解析後、IgVHの変異状態に従って患者らを層別化し、FCR(フルダラビン、シクロフォスファミドおよびリツキシマブ)化学療法で標準用量を投与されるA群、あるいは標準FCR治療に先立って、濃縮FCRと初期相(pre-phase)リツキシマブとを併用投与されるB群のいずれかに、1:1の比率で無作為的に割り当てた。
FISH(11qの欠失)解析後、IgVHの変異状態に従って患者らを層別化し、FCR(フルダラビン、シクロフォスファミドおよびリツキシマブ)化学療法で標準用量を投与されるA群、あるいは標準FCR治療に先立って、濃縮FCRと初期相(pre-phase)リツキシマブとを併用投与されるB群のいずれかに、1:1の比率で無作為的に割り当てた。
治療
標準FCR治療は6周術期からなり、28日単位で区切られた各周術期には、リツキシマブ(第1周術期の第1日目に375mg/m2、以降の周術期では500mg/m2)、フルダラビン(第2日目〜第4日目に40mg/m2/日)、およびシクロフォスファミド(第2日目〜第4日目に250mg/m2/日)が投与される。この実験群においては、FCR治療に先立つ初期相にて、リツキシマブを4回連続的に(第0日目に500mg、第1日目、第8日目および第15日目に2000mgのように配分して)投与する。患者においては、第22日目に第1周術期が始まり、以降の周術期は28日単位で区切られている。
標準FCR治療は6周術期からなり、28日単位で区切られた各周術期には、リツキシマブ(第1周術期の第1日目に375mg/m2、以降の周術期では500mg/m2)、フルダラビン(第2日目〜第4日目に40mg/m2/日)、およびシクロフォスファミド(第2日目〜第4日目に250mg/m2/日)が投与される。この実験群においては、FCR治療に先立つ初期相にて、リツキシマブを4回連続的に(第0日目に500mg、第1日目、第8日目および第15日目に2000mgのように配分して)投与する。患者においては、第22日目に第1周術期が始まり、以降の周術期は28日単位で区切られている。
IL−10コンピテントCLL細胞の同定、IL−10の治験およびFCGR3Aの遺伝子型判定
精製ポリクローナルの刺激後に、フローサイトメトリで、単核血液細胞からIL−10コンピテントCLL細胞を同定した。
精製ポリクローナルの刺激後に、フローサイトメトリで、単核血液細胞からIL−10コンピテントCLL細胞を同定した。
本研究のB群におけるCLLの罹患患者から採取された末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll-Hypaque密度勾配(フランス共和国クルタブフに本拠を置くEurobio)を使用して精製した。
このPBMCを、10%ウシ胎仔血清(フランス共和国クルタブフに本拠を置くEurobio)と、2mMのL−グルタミン(フランス共和国クルタブフのEurobio)と、100U/mLのペニシリンと、100μg/mlのストレプトマイシンと、2.5μg/mlのアンフォテリシンと(抗生物質はいずれも、フランス共和国イヴリーヌ県のTebu-bioから入手されたもの)を含有する培養物(ドイツ連邦共和国アイデンバッハのBiotech GmbH製RPMI 1640)中に(9×106細胞/mlにて)再懸濁させた。
シトシン−リン酸−グアニン(CpG)(ODN 2006、10μg/mL;米国サンディエゴに本拠を置くInvivoGen)と、CD40L(50ng/mL;米国ミネソタ州ミネアポリスに本拠を置くR & D Systems)と、抗ポリヒスチジン(500ng/mL;米国ミネソタ州ミネアポリスに本拠を置くR & D Systems)とを用い、CO25% と空気95%との混合物を含有する加湿雰囲気中、37℃で48時間にわたって、Bリンパ球(B lymphocyte)のクローン活性化を行った。IL−10の生成を促すため、酢酸塩およびミリスチン酸フォルボール(PMA、50ng/mL;米国ミズーリ州セントルイスに本拠を置くSigma-Aldrich)、ならびにイオノマイシン(1μg/mL;米国ミズーリ州セントルイスに本拠を置くSigma-Aldrich)を加えた。4時間後に、CO25%と空気95%との混合物を含有する加湿雰囲気中、IL−10の分泌を阻止するため37℃にてブレフェルディンA(1×溶液/ml;米国カリフォルニア州サンディエゴに本拠を置くBioLegend)を加えて、B10細胞を同定した。細胞を、以下の抗体:BioLegend(米国カリフォルニア州サンディエゴ)製の抗CD19BV421(HIB19)、抗CD69PE/Cy7(FN50)、抗CD38APC(HIT2)、抗IL−10PE(JES3−9D7)および抗CD45KO(J.33)、ならびにBeckmanCoulter(米国カリフォルニア州ブレア)製の抗CD5FITC(BL1a)で標識した。クローナルCLL細胞を、CD19+CD5+CD20intリンパ球(lymphocyte)として同定した。フローサイトメーターCyAnTM ADP(米国カリフォルニア州ブレアに本拠を置くBeckma Coulter)を使用して、解析を実行した。
メーカー(米国ミネアポリスに本拠を置くR & D Systems)の推奨事項に従い、レーザー二重読み取りシステムを介して、磁気ビーズベースのLuminexテクノロジー(登録商標)を利用して、血漿(plasma)中IL−10濃度を測定した。68例の患者由来の血漿(plasma)を、抗IL−10抗体を塗布した超常磁性ビーズとともに室温下で2時間インキュベートすることによって1/2に希釈した。検出対象となった2種類の抗体:IL−10ビオチニル化抗体およびストレプトアビジン抗体(フィコエリトリンに接合されたもの)を組み合わせて使用して、血漿(plasma)中IL−10を定量化した。
FcγRIIIaの多型158VFを、ネステッドPCRによって判別した。概略説明すると、単一工程において対立遺伝子に特異的な多重PCR検定を、DallOzzoらの特許 (DallOzzoら著「J Immunol Methods」2003年発行;第277巻(第1−2号):185〜192頁)に記載されている方法に若干の修正を加えて遂行した。ゲノムDNA、400nMのフォワードプライマー(5’-TCCAAA AGCCACACTCAAAGTC-3’(配列番号3))、V対立遺伝子(5’-AGACACATTTTTACTCCCATC -3’(配列番号4))に特異的な400nMのリバースプライマー、およびF対立遺伝子(5 -GCGGGCAGGGCGGCGGGGGCGGGGCCGGTGATGTTCACAGTCTCTGATCACACA TTTTTACTCCCATA-3’(配列番号5))に特異的な200nMのリバースプライマー、400μΜの各ヌクレオチド(dNTP)、2mMのMgCl2ならびに0.5UのTaq DNAポリメラーゼを、その緩衝液(米国マディソンに本拠を置くPromega)中に溶解させたものが、25μLの反応混合物中に含有されている。このPCR条件では、95℃で3.5分間、続いて、95℃で20秒間、56℃で20秒間および72℃で30秒間を1サイクルとして、35サイクル分繰り返す。増幅後、PCR産物(F対立遺伝子では137bp、V対立遺伝子では81bp)を8%アクリルアミドゲル(米国カールスバッドに本拠を置くInvitrogen)で分離し、臭化エチジウムで標識して明視化する。
統計解析
データの分布を、シャピロ−ウィルク(Shapiro-Wilk)検定を使用して試験した。範疇別のデータには、カイ二乗(χ2)検定およびフィッシャー検定を用いた。
データの分布を、シャピロ−ウィルク(Shapiro-Wilk)検定を使用して試験した。範疇別のデータには、カイ二乗(χ2)検定およびフィッシャー検定を用いた。
中央値の比較を、スチューデントのt検定またはマン・ホイットニー検定を用いて行った。
単変量解析においてp値<0.10である全ての変数を、中間モデルに含める。スチューデントのt検定(有意モデルとしてp<0.05)を使用して、フェーズダウン/フェーズアウトの手法により、最終的なモデルにおける変数を求めた。
3.0.2.10バージョンのRソフトウェアを使用して、α水準0.05にて両側検定(bilateral test)を行い、全ての統計解析を実行した。
結果および考察
第22日目(D22)にリツキシマブ単剤療法が評価された後のリンパ球枯渇の結果および考察を基に、IL−10コンピテント白血病細胞(B10)が、本研究の実験群に含まれる68例の患者においてインビボのリツキシマブの有効性に及ぼす影響を調査した。
第22日目(D22)にリツキシマブ単剤療法が評価された後のリンパ球枯渇の結果および考察を基に、IL−10コンピテント白血病細胞(B10)が、本研究の実験群に含まれる68例の患者においてインビボのリツキシマブの有効性に及ぼす影響を調査した。
リンパ性白血病(lymphocytic leukemia)細胞数の中央値は、リツキシマブ4回投与以前の第0日目に91.13G/L(範囲:3.74〜497.40)であったのが、初期相終了時から第22日目のリツキシマブ単剤療法までの間では2.60G/L(範囲:0.14〜189.40)になった。ゆえに、初期相治療でのリツキシマブ単剤療法(第22日目)以後、リンパ球枯渇率の中央値は95.1%(範囲77.0〜99.9%)に達し、そのうちの66%はリンパ球枯渇率が90%超であった。
下掲の表1に、リンパ球枯渇率90%の場合を基準として患者背景および分布を示す。
リンパ球枯渇率が90%であることと、臨床パラメータ(年齢、性別、ビネー段階、IGHV変異、細胞遺伝学的異常またはβ2ミクログロブリン)との間には、有意な相関が全く見られなかった。
試験対象となった全ての患者において、B10細胞の亜群が同定された(n=47、中央値:CLL細胞の3.06%、範囲:0.12〜29.55)。白血病細胞中でのB10細胞の発生は、血漿(plasma)中IL−10の量に相関する(図1中、R=0.39、p=0.02)。対照的に、血漿(plasma)中IL−10の濃度は、非B10(non-B10)白血病細胞には相関しない(不図示)。B10細胞の発生は、患者の特性に応じて差を生じることもなく、且つIgVH変異有りまたは無しCLL患者において有意な差を生じることもない(中央値6.29%、範囲:0.12〜15.83と、中央値:1.85%範囲:0.23〜20.81とをそれぞれ比較対照)。加えて、そのようなB10細胞の発生は、細胞遺伝学的な変化とは相関しなかった(del11q、del13q、三染色体性12)。
単変量解析から明らかであるように、初期相におけるリツキシマブ治療(第22日目)以降にはじめて、リンパ球枯渇率が、B10細胞の発生の影響を受け、90%を突破するようになる(図2中、p=0.004)。また、B10細胞の発生に基づいて、フルダラビンおよびシクロフォスファミドおよびリツキシマブで治療後3か月目には臨床反応(完全寛解)が予測され、この標準治療が慢性リンパ性白血病(chronic lymphoid leukemia)患者に適応しているものと見なされた(p=0.04)。
これらの結果から明らかであるように、全てのCLL患者がB10細胞の副母集団を有しており、この副母集団は、白血病B細胞の可変比率を呈するとともに、リツキシマブの臨床的に意義のある活性に対してインビボでの阻害効果を及ぼす。
FcγRIIIaの多型158V/Fは、濾胞性リンパ腫(follicular lymphoma)におけるインビボでリツキシマブの有効性に相関するため、本発明者らはコホート内のさまざまな患者における多型を判別した。
第22日目に、FcγRIIIaの多型158V/Fは、リンパ球(lymphocyte)数が正常なこと(<5G/L)(p=0.03)、およびリンパ球枯渇率が90%であること(p=0.03)に有意に関連している。このことはまた、FcγRIIIaの多型158Vの保有者にも当てはまる(p=0.01)(図3)。
対照的に、FcγRIIIaの多型158V/Fは、免疫化学療法後3か月目の臨床反応とは相関しない。また、これらの結果が示唆するように、FcγRIIIaによって媒介された免疫機能は、リツキシマブの活性に決定的に重要な役目を果たすが、FcγRIIIaの多型158V/Fの関与は、高水準の免疫化学療法、あるいは化学療法での免疫エフェクター細胞の直接阻害のどちらかによってマスキングされうる。
ロジスティック回帰解析から判るように、初期相治療中の第22日目のリツキシマブ単剤療法以後にはじめて、90%であったリンパ球枯渇率に対して、B10細胞の発生およびFcγRIIIaの多型158V/Fが関連性を持つようになる(近相対危険度(OR)=0,83;信頼区間(CI)=0.72〜0.3;p=0.002とOR=4.95;95%CI=1.07〜27.48;p=0.04とをそれぞれ比較対照)。
B10細胞の発生およびFcγRIIIaの多型158V/Fを使用して作成された受信者動作特性(ROC)曲線から判るように、曲線下面積(AUC)が極めて有意(AUC=0.855;95%CI=0.732〜0.978)であり、リンパ球枯渇率が90%を突破した患者とリンパ球枯渇率が90%に満たない患者とが判別し易い(図4)。
ROC曲線(図4)から、以下のデータを抽出できる。
1− FcγRIIIa、単一の受容体の遺伝子型判定によって得られたデータ。
多変量解析(n=44)では、母集団ベースとして、曲線下面積(AUC=0.669)、95%CI=0.514〜0.824が用いられた。これらに基づいて得られた結果は下表のとおりである。
1− FcγRIIIa、単一の受容体の遺伝子型判定によって得られたデータ。
多変量解析(n=44)では、母集団ベースとして、曲線下面積(AUC=0.669)、95%CI=0.514〜0.824が用いられた。これらに基づいて得られた結果は下表のとおりである。
同定された偽陽性が(約33%と)極めて多いことが判る。
2− B10細胞の数のみから得られたデータ。
a.閾値を4.34%とした場合
2− B10細胞の数のみから得られたデータ。
a.閾値を4.34%とした場合
多変量解析(n=44)では、母集団ベースとしてAUC=0.779、95%CI=0.652〜0.905が用いられた。これらに基づいて得られた結果は下表のとおりである。
b.閾値を3%とした場合
多変量解析(n=44)では、母集団ベースとしてAUC=0.729、95%CI=0.598〜0.589であり、結果は次のとおりである。
c.閾値を5%とした場合
多変量解析(n=44)では、母集団ベースとしてAUC=0.726、95%CI=0.586〜0.866が用いられた。これらに基づいて得られた結果は下表のとおりである。
B10細胞の閾値を5%未満とした場合、偽陽性率が約5%にまで低下することが明らかである。B10の検出による予後診断の改善度は、多型の検出による場合と比較して有意である。
3− FcγRIIIa受容体およびB10の遺伝子型判定によって得られたデータ。
多変量解析(n=44)では、母集団ベースとして(曲線下面積(AUC=0.0855)95%CI=0.732〜0.978が用いられた。これらに基づいて得られた結果は下表のとおりである。
3− FcγRIIIa受容体およびB10の遺伝子型判定によって得られたデータ。
多変量解析(n=44)では、母集団ベースとして(曲線下面積(AUC=0.0855)95%CI=0.732〜0.978が用いられた。これらに基づいて得られた結果は下表のとおりである。
上掲の表2〜表6において、病態が存在するときに、その病態を検定で同定することの可能な程度を測る尺度を、感受性(Sensitivity)と言う。この感受性は、Se=TP/(TP+FN)、つまり、病態を有するものとして検定で検出される真陽性(True positive)(TP)が占める比率である。偽陰性(False negative)とは、「病態」を有するにもかかわらず、検定では検出されない患者のことを言う。病態無しの患者を切り離すことの方が容易であるという理由から、スクリーニングにおいては感受性の高いことが好ましい。
病態が存在しないときに、その病態を検定で排除しても差し支えのないことを、特異性と言う。この特異性は、Sp=TP/(TP+FP)、つまり、病態を有さないものとして検定で検出される真陰性(True negative)(TN)が占める比率である。偽陽性(False positive)とは、「病態」を有さないにもかかわらず、試験では陽性として検出されてしまう患者のことを言う。
多型およびB10細胞数の検出を組み合わせることによって、予後診断に改善が見られる。特に、偽陰性と見なされた患者の数の低減がかなり有意である。更に、この二重検出によって、閾値がB10の5%未満の場合には感受性が良好(およそ86%)となる。
このようにして、本発明者らにより、慢性リンパ性白血病(chronic lymphoid leukemia)に罹患しリツキシマブを投与されている患者において母集団B10が判別されたと同時に、これらの患者のFcγRIIIaの表現型158VFも判別された。
B10細胞の発生およびFcγRIIIaの多型158VFが慢性リンパ性白血病(chronic lymphoid leukemia)患者におけるリツキシマブに対する反応に影響を及ぼすことを、本発明者らは証明することができた。
これらの2つの要因の解析によって、予後応答の予測に対する感受性および特異性が高まる。
実施例2
また、制御性B細胞の発生率を解析するための、単純且つ迅速な方法が、本発明者らによって提案された。この方法を、フローサイトメトリによるIL−10の合成の細胞質内検出に基づく基準の方法と比較した。
また、制御性B細胞の発生率を解析するための、単純且つ迅速な方法が、本発明者らによって提案された。この方法を、フローサイトメトリによるIL−10の合成の細胞質内検出に基づく基準の方法と比較した。
本方法は、末梢血試料からの陰性選択によって、通常は白血球中にごく少量しか存在しないBリンパ球(lymphocyte B)の母集団の第1富化工程からなる。血液を、相分離管(タイプBDバキュテイナCPT)中に採取する。代わりに、相分離管内に抗凝血剤が含有されている一次管から、血液を移すこともできる。
白血球相(leukocyte phase)をBリンパ球(B lymphocyte)で富化するため、血液試料にRosetteSepStemCellタイプの枯渇カクテルを加える。インキュベーションと、遠心分離と、2回の遠心による細胞洗浄とを含めた本工程の終了時に、Bリンパ球(B lymphocyte)含有率が90%超の母集団が得られる。
細胞を顕微鏡下で目視計数するかまたはサイトメトリで計数して、6×106細胞/mlの濃度に調製し、RPMI+10%ウシ胎仔血清を含有する培養物中に入れた。細胞を、CPGモチーフとCD40+ファシジング−ヒスチジン抗体との混合物としてのカクテルポリクローナル活性化因子のカクテルで刺激する。これと並行的に、未だ刺激を受けていない窪み(well)が出来る。培養物を、18時間〜48時間にわたって介入無しで37℃に維持した。
このインキュベーション終了時に、細胞培養を遠心し、培養物の上清を集めて−20℃で貯臓するか、または分泌されたIL−10の濃度を判別する酵素免疫アッセイ(EIA)で直ちに検定した。
サイトメトリにおいて参照法(reference method)と比較して得られたデータから判るように、IL−10分泌アッセイEIAを用いた方法によって、2つの方法の間でかなり相関性のある結果が得られる。このようにして、制御性B細胞の含有率が5%超である細胞試料が、正しく同定される(図5)。
Claims (11)
- 血液疾患に罹患する患者から採取された腫瘍試料中の治療用抗体によって媒介される治療反応に対するインビトロ予後診断方法であって、前記抗体が、前記血液疾患の細胞を枯渇させる抗体であり、前記試料中の、インターロイキン10を分泌するB細胞リンパ球(B-cell lymphocyte)の量のインビトロ定量を含む方法において、腫瘍試料を採取される患者における、IL−10を分泌するB細胞の量が、前記試料の細胞の総量の5%未満であり、前記治療用抗体での治療後には、前記血液疾患の細胞枯渇率が90%超となる尤度が50%を突破する、方法。
- 血液疾患に罹患する患者から採取された腫瘍試料中の治療用抗体によって媒介される治療反応に対するインビトロ予後診断方法であって、前記抗体が、前記血液疾患の細胞を枯渇させる抗体であり、前記方法が、前記試料の細胞における、
− 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位にある、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にあるアミノ酸のインビトロ定量を行う工程と、
− 治療前にインターロイキン10を分泌するB細胞リンパ球(B-cell lymphocyte)の量を定量する工程と
を含む方法において、腫瘍試料を採取される患者における、
− 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位に、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にバリンを有し、
− IL−10を分泌するB細胞の量が、試料中の全細胞の5%未満であり、前記治療用抗体で治療を施された後に、前記血液疾患の細胞枯渇率が90%超となる尤度が50%を突破する、方法。 - 前記血液疾患が、CD20表面マーカーを発現する細胞における血液病である、請求項1または2に記載の予後診断方法。
- 前記血液疾患が、慢性B細胞リンパ性白血病(B-cell chronic lymphoid leukemia)(CLL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(diffuse large B cell lymphoma)およびCD20を発現するこれら全ての組織学的変種;濾胞性のリンパ腫(follicular lymphoma)およびマントル細胞リンパ腫;辺縁帯リンパ腫(marginal zone lymphoma)、MALTリンパ腫(英名:粘膜関連リンパ組織)、バーキットリンパ腫(Burkitt lymphoma)、リンパ形質細胞性リンパ腫(lymphoplasmacytic lymphoma)、ワルデンストレーム病(Waldenstrom’s disease)、B細胞前リンパ性白血病(B-cell prolymphocytic leukemia)、ならびに全ての分類不能なB細胞リンパ腫(B-cell lymphoma)CD20+からなる群から選択される、ことにより特徴付けられる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の予後診断方法。
- IL−10の分泌の活性後に、前記試料中5%未満におけるIL−10を分泌するB細胞の量が、フローサイトメトリでの測定、または血清中IL−10の循環濃度の測定によって定量される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の予後診断方法。
- IL−10の分泌の活性化および前記分泌の不活性化後に、IL−10を分泌するB細胞の量をフローサイトメトリで測定する、請求項5に記載の予後診断方法。
- 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位にある、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にあるアミノ酸のインビトロ定量を行う工程が、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)、例えば、PCR単独使用、またはPCRと逆転写(RT−PCR)もしくはネステッドPCR(nested PCR)との併用などにより遂行される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の予後診断方法。
- 前記抗体が、IgG1またはIgG3、具体的には抗CD20(anti-CD20)抗体、具体的にはリツキシマブである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の予後診断方法。
- 血液疾患に罹患する、治療用抗体での治療が可能な患者に対するインビトロ予後診断用のキットであって、
− 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の176位にある、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にあるアミノ酸の検出手段と、
− IL−10を分泌するB細胞リンパ球(B-cell lymphocyte)の量を定量する手段と、
− 1種以上の対照試料とを含むキット。 - 配列番号1の配列で表されるFcγRIIIa受容体の176位にある、または配列番号2の配列で表されるFcγRIIIa受容体の配列の158位にあるアミノ酸の検出手段に、配列番号3、配列番号4および配列番号5の配列のオリゴヌクレオチドが包含される、請求項9に記載の予後診断用キット。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の予後診断方法を実施するための適切な媒体上に実装されたコンピュータプログラム製品であって、前記コンピュータプログラム製品が、IL−10を分泌するB細胞の量の定量を可能にする、コンピュータプログラム製品。
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