KR20170132143A - 바이오마커 - Google Patents

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KR20170132143A
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KR1020177024112A
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나타니엘 리차드 웨스트
벤자민 마이클 조셉 오웬스
아메드 나빌 헤가지
피오나 마가렛 파우리
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옥스포드 유니버시티 이노베이션 리미티드
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Abstract

본 발명은 온코스타틴-M(Oncostatin-M, OSM) 및/또는 OSM 수용체-β(OSMR)의 길항제를 투여함으로써 만성 장염 및/또는 염증성 장 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개체의 만성 장염 및/또는 염증성 장 질환을 진단 또는 예측하고 및 개체가 항-TNFα 치료에 반응할 것인지 여부를 예측하기 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 개체의 OSM 및/또는 OSMR을 측정하는 단계를 포함한다.

Description

바이오마커{BIOMARKER}
본 결과를 이끌어낸 연구는 REA 보조금 협정 제 330621호 하에 유럽 연합(EU)의 제7차 프레임워크 프로그램(FP7/2007-2013)의 피플 프로그램(People Program(Marie Curie Actions))으로부터 재정 지원을 받았다.
본 발명은 만성 장염 및/또는 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)의 치료, 진단 또는 예후를 위한 그리고 개체가 항-종양 괴사 인자-α(anti-tumour necrosis factor, anti-TNFα) 치료에 반응할 것인지 여부를 예측하기 위한 방법 및 제품에 관한 것이다.
크론병(Crohn's disease, CD) 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis, UC)을 포함하는 염증성 장 질환과 같은 염증성 질환은 재발-회복 과정으로 인해 위장관의 만성 염증성 질환을 악화시킨다. 치료는 질병을 일으키는 면역 과정을 손상시키는 것을 목표로 하며 역사적으로 코르티코스테로이드(corticosteroid)와 같은 광범위한 억제성 항-염증제를 사용한다. 최근에는 인플릭시맙(infliximab)과 같은 항-종양 괴사 인자-α(TNFα) 항체의 임상적 성공으로 인해 염증 경로의 특정 구성 요소를 표적으로 하는 것에 대한 관심이 증가했다.
항-TNFα 항체는 많은 IBD 환자에서 차도를 유도하고 유지할 수 있지만, 40% 정도는 일차적인 무-반응성을 나타내고 또 다른 3 분의 1은 시간이 지남에 따라 반응성을 잃을 것이다(Ben - Horin and Chowers , Nat . Rev . Gastroenterol . Hepatol ., 2014). 치료 실패를 만족스럽게 예측할 수 있는 방법은 현재 없으며, 실행 가능한 임상 표적으로 대안적인 사이토카인이 아직 밝혀지지 않았다. 예를 들어, Th1 면역 반응의 일차 작동자(effector) 사이토카인인 인터페론-γ(IFNγ)의 중화는 임상 효과가 거의 없는 것으로 보인다. IL-10 및 IFNβ와 같은 항-염증성 사이토카인의 투여도 마찬가지로 실패했다(Neurath , Nat . Rev . Immunol ., 2014). 따라서, (a) IBD 및 그 밖의 TNFα-매개 질환에 대해 항-TNFα 치료에 대한 임상 반응의 가능성을 정확하게 예측할 수 있는 효과적인 바이오마커를 확인하고; 및 (b) TNFα 이후의 IBD 관리를 위한 대안적인 치료 표적을 확인하고 임상적으로 입증해야 할 긴급하고 이중적인 충족되지 않는 필요성이 존재한다.
IL-6은 작동자 CD4+ T 세포의 Th17 아집단(subset)의 분화를 유도하는데 중요한 잘 알려진 염증성 사이토카인이다. 제2상 임상 시험에서, IL-6 수용체 차단은 CD에 대해 약간의 치료 효과를 보였다(Neurath , Nat . Rev . Immunol ., 2014). IL-6은 gp130 수용체 아형(subunit)의 공유된 사용에 의해 정의된 사이토카인 패밀리의 원형(prototype) 멤버이다.
온코스타틴-M(Oncostatin-M, OSM)은 이 사이토카인 패밀리의 멤버이다. gp130을 통해서만 신호를 전달하는 IL-6와는 달리, OSM은 gp130 및 OSM 수용체-β(OSMR) 또는 LIF 수용체(LIFR)로 구성된 두 개의 가능한 이종이량체 수용체를 결합하며, 이들 모두는 gp130의 신호와는 구별되는 신호를 전달할 수 있다(Heinrich et al , Biochemistry , 2003). 예를 들어, OSM은 다양한 세포 유형에서 IL-6보다 강력한 미토겐-활성화 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 신호 전달 체계를 유도한다(West and Watson , Oncogene , 2010; Hintzen et al , Arthritis Rheum ., 2009). LIFR은 대부분의 성인 조직에서 약하게 발현되지만, OSMR은 대부분의 기관에서 내피 세포, 상피 세포, 기질 세포, 교질 세포 및 조혈 세포를 포함하는 수많은 세포 유형에 의해 광범위하게 발현된다(Richards , ISRN Inflam., 2013).
OSM의 섭동(perturbation )은 여러 염증성 질환(건선 및 기도 염증) 및 다수의 암 유형에서 확인되었다(Richards , ISRN Inflam ., 2013). 이들 각각의 질환에서, 실험 모델은 OSM이 OSMR을 통해 신호를 전달함으로써 염증 과정에 직접 기여한다는 것을 입증한다. OSM은 전체 게놈 연관성 연구에서 CD와 UC 모두에 관련되었다(Jostins et al , Nature , 2012). 그러나, OSM 신호 전달이 IBD의 발병에 관여하는지 여부를 포함하여, IBD에서의 OSM 신호 전달의 역할에 대해서는 거의 알려지지 않았다.
본 발명자들은 대부분의 IBD 환자에서 활성 질환 동안 장 점막에서 OSM 및 OSMR이 고도로 발현된다는 것을 발견했다. OSM 및 OSMR은 또한 적어도 네 가지 다른 대장염 마우스 모델에서 상향 조절되며, 이들의 발현은 질병의 중증도와 관련이 있다. 정상이 아닌 Th1 및 Th17 헬퍼 세포 활성은 IBD의 발병 기전에 결정적인 것으로 생각되며, 본 발명자들은 처음으로 Th17 유도 경로의 성분으로서 OSM을 확인하였다. 또한, OSM의 전신 투여는 마우스 대장염을 악화시키지만, OSM의 치료적 차단 또는 OSM의 유전적 결실은 면역 병리학을 개선시킨다.
따라서, 제 1 양태에서, 본 발명은 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 방법은 개체에 OSM 및/또는 OSMR의 길항제를 투여함으로써 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 치료 또는 예방하는 단계를 포함한다.
본 발명은,
- 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 OSM 및/또는 OSMR의 길항제; 및
- 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의 OSM 및/또는 OSMR의 길항제의 용도를 더 제공한다.
경우에 따라서, 개체는 아래에서 설명되는 방법에 따라 진단되거나 예측된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 진단 또는 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에서 OSM 및/또는 OSMR을 측정함으로써 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 진단하고 예측하는 단계를 포함한다.
사이토카인 신호 전달 경로의 잠재적인 강도는 리간드 및 수용체 모두의 상대 빈도(relative abundance)에 의해 결정된다. 그러므로, 경우에 따라서, 개체에서 OSM 및 OSMR 모두를 측정하고 OSM 지수(OSMi, 상대적 OSM 및 OSMR의 곱)를 결정하는 것이 유용하다.
본 발명자들은 OSMR이 질병 완화 기간 동안 고도로 발현되는 것을 입증하였다. 또한, 성공적인 항-TNFα 치료 후에 OSM이 억제된다. 이는 OSM 신호 전달이 질병 재발에 역할을 한다는 것을 시사한다. 그러므로, 경우에 따라서, 만성 장염 및/또는 IBD를 진단 또는 예측하는 방법은 만성 장염 및/또는 IBD에 차도가 있는 개체가 재발할 것인지 여부를 예측하는 방법이다.
경우에 따라서, 기준 샘플 또는 기준 레벨과 비교할 때, OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 증가한 레벨은 양성 진단, 음성 예후 및/또는 개체가 재발할 수 있음을 나타낸다. 그 밖의 경우, 기준 샘플 또는 기준 레벨과 비교할 때, OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 감소한 레벨은 음성 진단, 양성 예후 및/또는 개체가 재발하지 않을 것임을 나타낸다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(a) 상기 방법에 따라 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 진단 또는 예측하는 단계; 및
(b) 만성 장염 및/또는 IBD의 치료에 유용한 제제(agent)를 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
경우에 따라서, 상기 제제는 OSM 및/또는 OSMR의 길항제이다. OSM 및/또는 OSMR 길항제는 항-OSM 또는 항-OSMR 항체, 또는 OSM 또는 OSMR 융합 단백질과 같은 OSM 또는 OSMR 활성 또는 발현의 길항제일 수 있다.
본 발명은 또한,
- 상기 방법에 따라 만성 장염 및/또는 IBD가 진단 또는 예측된 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 제제;
- 상기 방법에 따라 만성 장염 및/또는 IBD가 진단 또는 예측된 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 약제(medicament)의 제조에 있어서의 제제의 용도;
- 제품으로서, 만성 장염 및/또는 IBD를 가지고 있거나 또는 갖고 있는 것으로 의심되거나 또는 발병 위험에 처한 개체에서 OSM 및/또는 OSMR의 레벨을 측정하기 위한 수단; 및 만성 장염 및/또는 IBD의 치료용 제제를 포함하는 제품을 제공한다.
본 발명자들은 장 점막에서의 OSM 및 OSMR의 발현이 항-TNFα 치료에 대한 무-반응성을 예측한다는 것을 더 입증하였다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 개체가 항-TNFα 치료에 반응할 것인지 여부를 예측하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에서 OSM 및/또는 OSMR을 측정함으로써 개체가 항-TNFα 치료에 반응할 것인지 여부를 예측하는 단계를 포함한다. 항-TNFα 치료는 인플릭시맙과 같은 항-TNFα 항체일 수 있다.
경우에 따라서, 기준 샘플 또는 기준 레벨과 비교할 때, OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 감소한 레벨은 개체가 항-TNFα 치료에 반응할 것임을 나타낸다. 방법은 이후 개체의 치료를 위해 항-TNFα 치료를 선택하거나 추천하는 단계를 더 포함할 수 있다. 경우에 따라서, 이후 항-TNFα 치료를 개체에 투여한다. 일부 경우에 있어서, 본 발명은 항-TNFα 치료가 예를 들어 1차 치료로서 항-TNFα 치료를 받지 않을 개체에 대해 적합한 치료로서 확인되도록 한다. 인플릭시맙과 같은 항-TNFα 치료는 IBD와 같은 질환에 대해 "이상적 표준" 치료법이다. 그러나 일반적으로 항-TNFα 치료는 1차 및 2차 무-반응성이 일반적이기 때문에, 강력한 면역 억제와 같은 부작용으로 인해, 및/또는 치료 비용이 비싸기 때문에 1차 치료법으로 선택되지 않는다. 본 발명의 방법은 항-TNFα 치료에 반응하고 그 효과가 가장 큰 개체를 확인하는데 사용될 수 있다. 이후, 항-TNFα 치료는 병의 치료 초기에 이들 개체에 대해 선택되거나 추천될 수 있다. 항-TNFα 치료는 1차 치료로서 선택되거나 추천될 수 있다.
경우에 따라서, 기준 샘플 또는 기준 레벨과 비교할 때, OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 증가한 레벨은 개체가 항-TNFα 치료에 반응하지 않을 것임을 나타낸다. 방법은 이후 개체의 치료를 위해 항-TNFα 치료 이외의 치료를 선택하거나 추천하는 단계를 더 포함할 수 있다. 경우에 따라서, 이후 항-TNFα 치료 이외의 치료법이 개체에 투여된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에서 TNFα 매개 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 방법에 따라 TNFα 길항제에 반응하는 것으로 예측된 개체에 TNFα 길항제를 투여함으로써 TNFα 매개 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한,
- 상기 방법에 따라 TNFα 길항제에 반응하는 것으로 예측된 개체에서 TNFα 매개 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 TNFα 길항제;
- 상기 방법에 따라 TNFα 길항제에 반응하는 것으로 예측된 개체에서 TNFα 매개 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의 TNFα 길항제의 용도를 제공한다.
또 다른 양태는 TNFα 매개 질환, 만성 장염 및/또는 IBD를 가지고 있거나 또는 갖고 있는 것으로 의심되거나 또는 발병 위험에 처한 개체에서 OMS 및/또는 OMSR의 레벨을 측정하기 위한 분석법을 제공하며, 상기 분석법은 개체의 생물학적 시료를 OSM 또는 OSMR에 결합하는 제제와 접촉시키는 단계, 제제와 OSM 또는 OSMR 간의 복합체 형성(complex formation)을 측정하는 단계, 선택적으로 OSMi를 계산하는 단계, 측정된 값 또는 OSMi 값을 기준 값과 비교하는 단계, 및 이에 따라 TNFα 매개 질환을 가지고 있는 개체가 항-TNFα 치료에 반응할 것인지 여부를 예측하거나, 또는 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 진단 또는 예측하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태는,
(a) TNFα 매개 질환, 만성 장염 및/또는 IBD를 가지고 있는 개체의 생물학적 시료 내의 OSM 및/또는 OSMR의 레벨을 정량화하기 위한 측정 모듈;
(b) 측정 모듈로부터 출력된 데이터 및 기준 및/또는 제어 데이터를 저장하도록 구성된 저장 모듈;
(c) 측정 모듈로부터 출력된 데이터의 값 및 기준 또는 제어 데이터를 계산하도록 구성된 계산 모듈; 및
(d) 출력 데이터의 값을 기반으로 만성 장염 및/또는 IBD를 가지고 있는 개체에 대한 진단 또는 예후를 표시하도록 구성된 출력 모듈을 포함하는 시스템을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는, 본 발명의 임의의 진단 또는 예후 방법에서 사용하기 위한 테스트 키트를 제공하며, 상기 테스트 키트는 개체에서 OSM 및/또는 OSMR의 레벨을 결정하기 위한 수단 및 상기 방법에서의 사용을 위한 설명서를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD의 중증도를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에서 OSM 및/또는 OSMR을 측정함으로써 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD의 중증도를 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 만성 장염 및/또는 IBD를 가진 개체가 수술을 필요로 할 가능성을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에서 OSM 및/또는 OSMR을 측정함으로써 개체가 수술을 필요로 할 가능성을 결정하는 단계를 포함한다.
이제 본 발명을 제한이 아닌 예로서 첨부 도면을 참조하여 더욱 상세하게 설명한다. 본 개시 내용이 주어지면 많은 동등한 수정 및 변형이 본 기술 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 따라서, 명시된 본 발명의 예시적인 실시형태는 예시적이고 제한적인 것으로 간주되지 않는다. 개시된 실시형태에 대한 다양한 변경이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 위에서건 아래에서건 본원에 인용된 모든 문서는 이들의 전체가 명시적으로 참고로 포함된다.
본 발명은 조합이 명백하게 허용 불가능하거나 명시적으로 회피되는 것으로 언급되는 경우를 제외하고 개시된 양태 및 바람직한 특징의 조합을 포함한다. 본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "길항제"에 대한 언급은 둘 이상의 이러한 길항제를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 섹션 표제는 단지 편의를 위한 것이며 어떠한 방식으로든지 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
도 1
건강한 마우스와 대장염 마우스 간의 전체 대장 조직에서 차별적으로 발현되는 사이토카인이 C57Bl/6 마우스에서의 DSS(덱스트란 황산나트륨염(dextran sodium sulphate))의 구강 투여, BALB/c 마우스에서의 TNBS(트리니트로벤젠술폰산(trinitrobenzenesulfonic acid))의 직장 투여, 및 헬리코박터 빌리스(Helicobacter bilis)의 구강 감염의 세 가지 상이한 모델 시스템에서 확인되었다. 전체 전사체 데이터는 공중이 이용 가능하며 각각 GSE34553, GSE35609 및 GSE72212와 같은 유전자 발현 옴니버스(Gene Expression Omnibus, GEO) 항목에서 얻었다. 각각의 데이터 세트에서 이용 가능한 데이터를 갖는 45 개의 후보 사이토카인을 분석을 위해 선택하였다. 이후, 이들의 발현 수준을 평가하였고, (오발견율 보정을 이용한 t-테스트를 기반으로) 대장염 동안 크게 변화된 것들을 확인하였다. 이들을 벤 다이어그램(Venn diagram)에 나타내었다. 세 가지 모델 시스템 모두에서 대장염 마우스의 대장에서 Il1a , Il1b , Il6 , Tnf 및 Osm 만 유의하게 증가하였다.
도 2
방법에 기재된 바와 같이 면역 조절 장애와 공생 유해균(헬리코박터 헤파티쿠스(Helicobacter hepaticus)) 감염을 결합한 Hh+αIL10R 모델을 사용하여 생성된 데이터. (A) 야생형 C57Bl/6 마우스(>3 회의 실험에서 모은n=19 대조군 및 n=35 대장균 마우스)의 전체 대장 조직에서 Osm 및 Osmr의 mRNA 발현. (B) 마우스 OSM에 대한 특정 ELISA를 사용하여 정량화된, 근위부 대장 외식편(explant)(왼쪽) 또는 맹장 내용물(오른쪽)의 24 시간 배양으로부터의 OSM 생산. OSM 농도는 외식편/맹장 내용물 질량으로 정규화하였다(세 가지 대표 실험 중 하나로부터 n=4 미처리 마우스 및 n=10 처리 마우스). (C) 정상 상태의 마우스 및 Hh+αIL10R 대장염을 가지고 있는 마우스(>3의 실험에서 모은 n=63)로부터의 전체 대장 조직에서 Osm mRNA 대 Il1b, Il6 및 Tnf의 피어슨 상관관계. *p=0.01-0.05, **p=0.001-0.01, ***p=0.0001-0.001, ****p<0.0001, 비-모수적 맨-휘트니 검정(non-parametric Mann-Whitney test) 또는 크루스칼-왈리스 검정(Kruskal-Wallis test)을 적절하게 사용하여 계산됨.
도 3
(A) Hh+αIL10R 대장염 유도 후 전체 대장 조직에서 Osm 및 Osmr 발현의 시간 경과 동역학, (B) (시간 점당 n> 4 마우스)에서의 관련된 조직학적 질병의 중증도. (C) 전체 대장 조직에서 Osm및 Osmr 발현의 조직학적 중증도와의 상관 관계(건강, 점수=0 내지 1; 경증/중등증, 점수 => 1 내지7; 중증도, 점수>7). 세 번의 별도의 실험으로부터 모은, 그룹당 >15 마리의 마우스. *p=0.01-0.05, **p=0.001-0.01, ***p=0.0001-0.001, ****p<0.0001, 크루스칼-왈리스 검정을 사용하여 계산됨.
도 4
옥스포드 IBD 환자 또는 건강한 대조군의 장 절제 시료로부터의 장 점막 핀치 생검 또는 점막의 정량적 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응(qPCR) 분석을 통해 평가한 OSM 및 OSMR의 mRNA 발현. (A) 건강한 대조군(n=13), 활성 질환을 가지고 있는 IBD 환자(n=44), 활성 질환을 가지고 있는 IBD 환자(n=21)의 연관이 없는 장내 위치, 및 활동성 염증의 영향이 없는 IBD 환자(n=14)의 생검에서의 OSM, OSMR 및 OSM 지수(OSMi, 상대적 OSM 및 OSMR의 곱) 활성 질환(n=21), 활동성 염증의 증거가 없는 IBD 환자(n=14). 질병 활동성/장염은 시료 수집 시점에 내시경 평가로 측정하였다. (B) 패널 (A)에서와 수행한 분석, 다음과 같은 일상적인 임상 병리학적 평가 동안 결정된 조직학적 등급의 염증으로 분류된 시료: 건강한 대조군(모두 정지 상태)(n=13), 정지 IBD(n=27), 경-중등증 활성 IBD(n=29), 중증 활성 IBD(n=9). 유의성은 Tukey의 다중 비교 검정(Tukey's multiple comparisons test)과 함께 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 결정하였다. *p=0.01-0.05, **p=0.001-0.01, ***p=0.0001-0.001, ****p<0.0001.
도 5
OSM 발현 및 P100A8 및 S100A9의 발현의 피어슨 상관관계(임상적으로 검증된 점막 염증 바이오마커인 칼프로텍틴(calprotectin)의 구성 요소). 데이터는 CD(GSE57945, n=220) 및 UC 환자(GSE23597, n=112)에서 얻었다.
도 6
(A) 옥스포드 IBD 집단의 건강한 대조군(n=13) 대 활동성 CD(n=19) 또는 활동성 UC(n=24) 환자에서의 OSM 및 OSMR의 발현. 유의성은 Tukey의 터키 다중 비교 검정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 결정하였다. (B) 치료 경험이 없는 소아 회장 CD 환자(n-162)와 나이가 일치하는 건강한 대조군(n=42)의 회장 점막 생검의 비교. 데이터 포인트는 오발견율 보정(Q=1%)을 이용한 t-테스트에 의해 결정된 통계적 유의성(x-축) 대 63 개의 상이한 사이토카인 유전자(y-축)에 대한 평균(+/- s.e.m.) 폴드 IBD 농축을 반영한다. 데이터는 GEO 항목 GSE57945에서 얻었다. *p=0.01-0.05, **p=0.001-0.01, ***p=0.0001-0.001, ****p<0.0001.
도 7
회장낭 항문 문합술(ileal pouch-anal anastomosis) 조직에서 채취한 낭 생검에서의 OSM 및 OSMR의 발현. 데이터는 낭염(pouchitis, 낭 조직의 염증)이 없는 UC 환자, 활동성 낭염이 있는 UC 환자, 및 낭염이 없는 가족성 샘종 폴립증(adenomatous polyposis) 환자를 포함한다. *p=0.01-0.05, **p=0.001-0.01, Dunn의 다중 비교 검정과 함께 크루스칼-왈리스 검정을 사용하여 결정됨. 데이터는 GEO 항목 GSE65270에서 얻었다.
도 8
(A-C) 옥스포드 IBD 환자의 장 점막 생검에서 qPCR에 의해 평가한 OSM 및 OSMR 발현. (A) 환자의 성별에 따른 발현. (B) 진단 당시의 환자 연령에 따른 발현. (C) 질병의 지속 기간(즉, 진단 날짜로부터 생검 수집 시점까지의 시간(연))에 따른 발현. 유의성은 t-테스트(패널 A) 및 일원 분산 분석(패널 B 및 C)을 사용하여 결정하였다.
도 9
옥스퍼드 IBD 환자의 장 점막 생검에서 qPCR에 의해 평가한 OSM 및 OSMR 발현. (A) 표본 수집 당시 혈청 CRP(C-반응성 단백질) 수준 및 (B) 말초 혈액 백혈구 수와 관련된 발현. 유의성은 일원 분산 분석을 사용하여 결정하였다.
도 10
치료 내력으로 분류된 환자의 레벨을 비교한, 옥스포드 IBD 환자의 장 점막 생검에서 qPCR에 의해 평가한 OSM 및 OSMR 발현. "수술"은 수술적 절제 표본에서 직접 채취한 점막 생검 또는 이후 수술적 개입이 필요한 환자로부터 내시경적으로 채취한 생검을 말한다. **p=0.001-0.01, ***p=0.0001-0.001, t-검정을 사용하여 결정됨.
도 11
(A-D) 공중이 이용 가능한 유전자 발현 데이터 세트 GSE16879의 분석. (A) 집단의 모든 환자(맨 윗줄) 또는 CD 환자(맨 아랫줄)를 인플릭시맙 치료 전에 장 생검에서 상대적 OSM 발현 수준(삼분위수로 분류)에 따라 분류하였다. 이후 각각의 그룹에 대해 인플릭시맙에 대한 임상 반응의 빈도를 평가하였고, 응답률은 원 그래프로 나타내었다. 치료에 대한 반응은 내시경 및 조직학적 평가를 기반으로 한 완전한 장 점막 치유로 정의되었다. 유의성은 χ2 분석을 사용하여 결정하였다. (B) 사전 치료 생검에서 표시된 유전자의 높은 발현(상위 삼분위수) 대 낮은 발현(낮은 삼분위수) 환자에서의 인플릭시맙 반응률을 비교하는 Fisher의 정확한 검정에 의해 결정된 교차비(odds ratio) 및 유의성 수준. 높은 교차비 값은 인플릭시맙에 대한 임상 반응의 감소된 가능성을 나타낸다. *p=0.01-0.05, ***p=0.0001-0.001, ****p<0.0001.
도 12
공중이 이용 가능한 유전자 발현 데이터 세트 GSE16879의 분석. (A) 인플릭시맙 치료 전 OSM 지수가 높은 모든 UC 환자에서 인플릭시맙 이전 및 인플릭시맙 이후 생검에서의 OSM 발현의 비교. OSM 지수 발현은 치료 반응성 환자에서만 인플릭시맙 치료 후에 지속적으로 감소한다. 유의성은 페이드 t-테스트를 사용하여 결정하였다. (B) 인플릭시맙 반응성 UC 환자로부터의 인플릭시맙 생검 전후의 지시된 유전자의 장내 발현에서 평균 배수의 변화(+/- 95% CI). 유의성은 페어드t-테스트를 사용하여 결정하였다. ****p<0.0001.
도 13
GSE16879 데이터 세트에서 OSM 지수 발현과 인플릭시맙 반응 가능성의 수용자 반응 특성(ROC) 분석(결합된 집단과 CD만을 보여줌) 및 UC(GSE23597 및 GSE12251)에서 인플릭시맙 반응성에 대한 두 가지 다른 연구. 모든 플롯은 치료 전 생검으로부터의 유전자 발현 데이터를 사용하여 생성하였다.
도 14
인플릭시맙 치료 후 0 주, 8 주, 및 30 주에 결장 생검에서의 OSM 및 OSMR 발현의 연관성(GEO 데이터 세트 GSE23597). 환자는 8 주에 임상 반응이 없는 환자(검정), 8 주에 반응이 있었으나 30 주에는 불응인 환자(회색), 8 주와 30 주에 지속적인 반응이 있는 환자(흰색)로 분류된다. 유의성은 Holm-Sidak의 다중 비교 검정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 결정하였다. *p=0.01-0.05, **p=0.001-0.01, ***p=0.0001-0.001, ****p<0.0001.
도 15
GSE16879 데이터 세트에서 OSM, OSMR 및 사이토카인 mRNA 발현의 계층적 클러스터링 분석. OSM 및 OSMR을 포함하는 일반적인 유전자 클러스터는 음영으로 표시되며, Th17 및 Th1 면역 반응 모두의 작동자 사이토카인뿐만 아니라 Th17 T 헬퍼 세포 분화를 유도하는 사이토카인을 풍부하게 하는 것으로 유명하다. 대조군과 인플릭시맙 불응성 또는 반응성 IBD 환자의 생검은 히트 맵(heat-map) 아래의 음영 막대로 확인된다. 모든 데이터는 인플릭시맙 사전 표본에서 나온 것이다.
도 16
(A) GSE16879에서 높은 OSM 표본 대 낮은 OSM 표본에서 대표적인 Th17, Th1 및 Th2 사이토카인의 평균 유전자 발현 차이. 각각의 점은 UC, 결장 CD 또는 회장 CD의 평균 차이를 나타낸다. 차이가 통계적으로 유의한(t-테스트를 근거로 함) 질병 아형의 수는 기호(관련 범례에서 정의됨)로 표시된다. (B) 옥스포드 집으로부터의 높은 OSM(위의 절반) 대 낮은 OSM (아래의 절반) IBD 점막 생검에서의 유전자 발현 차이. 데이터는 Holm-Sidak의 다중 비교 보정과 함께 t-테스트를 사용하여 결정된 통계적 유의성에 대해 도시된 배수 차이로 표현된다.
도 17
(A) 지시된 미생물 리간드로 100 ng/ml에서 16 시간 동안 자극된 2 명의 건강한 인간 기증자의 단핵구에서 ELISA로 측정한 OSM 분비. (B) 열 살균 박테리아(16 시간 배양)에 대한 반응으로 2 명의 건강한 기증자로부터 말초 혈액 단핵구에 의한 OSM 분비를 측정하는 대표적인 실험. AIEC, 접착성-침습성 대장균.
도 18
(A) 박테리아에 의해 자극된 단핵구에서(도 17에서와 같이) OSM 및 다른 사이토카인의 스피어만의 상관 관계(qPCR에 의해 분석함). (B) 인간 장내 항원 제시 세포에서의 OSM 발현. 데이터는 인간의 장 조직에서 분리된 FACS-정렬된 항원 제시 세포 아집단으로부터의 공중이 이용 가능한 유전자 발현 데이터 세트(GSE49066)에서 얻었다. 세포를 혈청 계통(CD3/19/20/56)-HLA-DRhigh 플러스/마이너스 표시된 표면 마커로 분류했다. CD14+CD163low 아집단은 다른 표시된 APC 아집단에 비해 우수한 Th17-유도 능력을 보유하는 것으로 나타났다. (C) 2 세트의 건강한 기증자 단핵구에서 박테리아 자극 후 평균 사이토카인 발현(qPCR에 의해 분석됨)의 계층적 클러스터링. OSM 및 OSMR을 포함하는 클러스터는 음영으로 표시된다.
도 19
OSM 및 OSMR 발현은 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate, PMA) 및 이오노마이신(ionomycin)으로 자극한 후 직접 생체 외에서 말초 혈액 미접촉 및 기억 CD4+ T 세포에서 평가하였다. (A) 총 CD4+CD25- 라이브 T 세포를 2 명의 대표적인 기증자로부터 FACS 정제하고 8 시간 동안 자극하였다. qPCR에 의해 정량화된 OSM 및 OSMR의 유전자 발현이 도시되어 있다. (B) OSM 단백질은 (A)에서 설명한 바와 같이 자극 후 상층액에서 ELISA에 의해 정량화되었다. (C) 총 PBMC(말초 혈액 단핵구 세포)를 PMA/이오노마이신으로 재-자극하였고, 선별된 CD4+CD45RA+ 및 CD4+CD45RO+ 집단 내의 OSM+ 세포의 빈도를 인간 OSM에 특이적인 항체를 사용하여 세포내 사이토카인 염색에 의해 분석하였다.
도 20
(A) 총 CD45RO+ 또는 CCR6+CD45RO+ 기억 CD4+ T 세포를 FACS 정제하고 Th0, Th1, Th2 및/또는 Th17 조건 하에서 항-CD3/CD28 비드와 함께 배양하였다. CCR6+ T 세포군은 Th17 세포에서 농축되는 것으로 간주된다. OSMR 유전자 발현은 배양 7 일 후에 나타난다. 항-CD3/CD28 자극을 받지 않은 세포에서는 발현이 검출되지 않았다. (B-C) 건강한 인간 기증자로부터의 미접촉 CD4+CD45RA+ T 세포를5 일 동안 OSM가 있어나 없는 Th2, Th1, Th2 Th22, Th9, Treg 또는 Th17 분극 조건 하에서 항-CD3/CD28로 배양하였다. (B) OSM 처리 조건에 대배 OSM 처리된 조건(20 ng/ml OSM)에서의 상대적인 세포 증식. **p<0.01, 페어드t-테스트. (C) T 헬퍼 세포의 중요한 전사 인자(왼쪽) 및 작동자 사이토카인(오른쪽)의 mRNA 발현. 표시된 데이터는 OSM이 있는 Th17 조건과 OSM이 없는 Th17 조건에서의 상대적 발현을 나타낸다. *p=0.01-0.05, **p<0.01, 단일 표본 t-테스트.
도 21
대표적인 헤마톡실린 및 에오신(haematoxylin & eosin)으로 Hh+αIL10R 대장염 프로토콜(방법 참조)을 받은 마우스에서 중간 대장 절편의 단면을 염색하였다. 비교된 두 가지 유전자형은 야생형 C57BL/6 마우스와 OSM 녹아웃(Osm -/-) 한배 새끼이다. 눈금 막대는 0.5 mm(맨 윗줄)와 0.25 mm(맨 아랫줄)를 나타낸다. 화살표는 점막하 부종(양방향 화살표) 및 음와 농양(단방향 화살표)을 포함하는 중증 염증의 현저한 특징을 나타낸다.
도 22
야생형 C57BL/6 마우스와 Hh+αIL10R 대장염 프로토콜을 받은 Osm -/- 한배 새끼에서의 대장염의 중증도 비교. (A) 두 가지 독립적인 실험에서 모아진 마우스의 조직병리학 점수(방법에 기재된 바와 같이 결정됨). (B) 전반적인 조직학 점수가 별개의 구성 요소로 분리된 패널 (A)로부터의 대장염 마우스. 각각 0 내지 3의 중증도 척도로 정량화됨. (C) 마우스(패널 A 및 B에서와 동일한 동물)의 전체 대장 조직에서의 전염증성 사이토카인인 Il6 및 Il1b 대 Il10(항-염증성)의 발현. *p=0.01-0.05, **p=0.001-0.01, ***p=0.0001-0.001, ****p<0.0001, 맨-휘트니 검정을 사용하여 결정됨.
도 23
마우스 OSM을 중화하도록 고안된 새로운 재조합 단백질(O-RFP, Brolund et al, BMC Biotechnology, 2011)을 상업적으로 이용 가능한 염소 다 클론 항-MOS 항체에 대해 시험관 내에서 OSM 중화 능력에 대해 시험하였다. 분석은 중화제의 몰비 증가와 함께 10 ng/ml 재조합 마우스 OSM으로 생체외 배양된 마우스 결장 섬유아세포를 치료하는 것을 포함한다. OSM 표적 유전자의 발현을 2 시간 후에 평가하였다; 여기에 표시된 것은 STAT3 전사 표적 SOCS3에 대한 결과이다. (A) 50% 중화(12.1: 1)에 필요한 계산된 몰비와 함께 상업적으로 이용 가능한 항체의 중화 곡선. (B) 패널(A) 에서처럼 50% 중화를 위해 1.7: 1의 몰비 만을 필요로 하는 O-RFP를 사용한다.
O-RFP는 쥐 단백질을 암호화하고 쥐 OSM에 대해 표적화된다. 이 구조물은 Brolund et al., BMC Biotechnology, 2011에 기술된 "mOSM-RFP"의 변형이다. 간략하게, 재조합 수용체는 N 말단에서 C 말단까지 (a) 쥐 OSMR의 도메인 1, 2, 3 및 4; (b) 가요성 링커 펩타이드; (c) 쥐 gp130의 도메인 2 및 3; (d) Fc 태그(쥐 IgG2A)로 구성되는 융합 단백질이다. 구조물은 표준 단백질 G 컬럼 정제를 사용하여 정제된 HEK-293 세포에서 발현되었으며, Lonza가 제공하는 테스트 서비스를 사용하여 내독소가 없는 것으로 확인되었다. 이 제제를 사용하는 생체내 실험에서, IgG2A-Fc 단백질은 처리 대조군과 동일한 조건 하에서 제조되었다.
도 24
장염 치료를 위한 적절한 표적으로서의 OSM의 확립. (A) 인간 CD 절제술(n=5)로부터의 점막 외식편 배양에서의 IL1B 발현. 외식편은 24 시간 동안 20 μg/ml의 항-OSM 중화 항체(R&D Systems, 클론 17022), 일치하는 동형 대조군 항체 또는 인플릭시맙(항-TNF) 로 처리하였다. 데이터 포인트는 전체 외식편 mRNA에서 IL1B의 평균(+/- s.e.m.) 변화를 나타내며, 처리되지 않은 샘플로 정규화하였다. 이러한 데이터는 생체외 인간 조직에서 OSM 차단의 항-염증 효과가 인플릭시맙(항-TNF)의 항-염증 효과와 유사할 수 있음을 시사한다. 유의성은 로그 변환 이전에 1의 이론 평균에 대해 단일 표본 t-테스트를 검정을 사용하여 계산하였다. (B) Hh+αIL10R 대장염 프로토콜을 받고 방법에 기재된 바와 같이 7일째부터 항TNF 단클론 항체, IgG-Fc 대조군 단백질 또는 O-RFP로 처리한 야생형 C57BL/6 마우스의 전반적인 조직병리학 성분 점수. (C) 패널(B)에 도시된 마우스의 조직병리학적 구성 요소 점수. (D) 희생하기 하루 전에 살아있는 마취된 동물의 내시경 평가를 통해 결정된, 패널(B/C)에서 처리된 마우스의 대표적인 대장염 점수. 이는 표준 프로토콜(Becker et al, Nature Protocols, 2007)에 따라 수행되었다. *p=0.01-0.05, **p=0.001-0.01, ***p=0.0001-0.001, ****p<0.0001, 맨-휘트니 검정을 사용하여 결정됨.
도 25
마우스 장 조직에서 OSM 및 OSMR의 중요한 세포 공급원의 확인. 정상 상태 (n=4)의 분해된 대장 조직 및 Hh+αIL10R 프로토콜(n=10)을 받은 대장염 마우스로부터 생존 가능한 FACS-정제 세포군을 분리하였다. 세포군을 확인하고 분리하는데 사용된 마커는 다음과 같다: 상피 세포(CD45-EpCAM+); 내피 세포(CD45-EpCAM-D31+); gp38- 기질(CD45-EpCAM-CD31-gp38-); gp38+ 기질(CD45-EpCAM-CD31-gp38+); 과립구(CD45+FSCint / hiSSChi); CD4+T 세포(CD45+CD3+CD4+); CD8+ T 세포(CD45+CD3+CD4-); B 세포(CD45+CD3-CD19+); 그 밖의 단핵 세포(CD45+CD3-CD19-SSClo). 분리된 세포는 RNA 추출을 위해 처리하였고, Osm 및 Osmr 발현은 qPCR에 의해 평가하였다. *p=0.01-0.05, **p=0.001-0.01, t-테스트에 의해 결정됨.
도 26
인간의 장 절제 표본(n=10)으로부터의 점막 세포군의 유세포 분석. (A) 백혈구(CD45+), 상피 세포(CD45-EpCAM+), 내피 세포(CD45-EpCAM-CD31+), gp38-ICAM-1lo 기질(CD45-EpCAM-CD31-gp38-ICAM-1lo) 및 gp38+CAM-1hi 기질(CD45-EpCAM-CD31-gp38+ICAM-1hi)에 의한 대표적인 OSMR 표면 발현. OSMR+ 빈도는 패널(B)의 모든 모집단에 제공된다. 유의성은 Tukey의 다중 비교 검정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 결정하였다.
도 27
(A) qPCR에 의해 결정된 원발성 인간 결장 기질 세포(CCD18Co)에서 상이한 사이토카인 수용체 유전자의 기저 발현. OSMR 패밀리의 수용체가 표시된다. (B) 재조합 OSM, IL-6, TNF, 또는 IL-1β(10 ng/ml)로 CCD18Co 세포를 20 분 자극한 후 주요 신호 전달 경로의 활성화에 대한 웨스턴 블롯 분석. β-액틴은 로딩 대조군으로서 제공된다.
도 28
(A) Hh+αIL10R 프로토콜에 따라 야생형 C57BL/6 마우스에서 대장염을 유도하였고, 실험군은 PBS 또는 0.04 mg/kg의 재조합 OSM의 복강내 주사를 받았다(방법 참조). 대장 고유판(lamina propria) 세포군을 기질 및 내피 세포 활성화의 증거에 대해 유세포 분석에 의해 분석하였다. 특히, CD45-EpCAM-gp38+CD31- 기질 세포 및 CD45-EpCAM-gp38-CD31+ 내피 세포를 표면 ICAM-1 발현(염증 활성화의 마커) 및 세포내 Ki-67(증식의 마커)에 대해 염색하였다. 그룹당 n=4 내지6. (B) 대조군 Fc 단백질 또는 O-RFP로 처리된 마우스에서 정상 상태 또는 Hh+αIL10R 대장염 유도 후 결장 내피 세포 및 gp38+ 기질 세포에 대한 ICAM-1 표면 발현의 유세포 분석(그룹당 n=4 내지 9, 두 번의 독립적인 실험을 대표함). 대장염 Osm -/- 마우스 대 야생형 한배 새끼에서 유사한 결과가 나타났다. *p=0.01-0.05, **p=0.001-0.01, 맨-휘트니 검정을 사용하여 결정됨.
도 29
10 ng/ml 마우스 OSM, 10 ng/ml TNF 또는 이들의 조합의 처리가 2 시간 후 대표 유전자의 발현에 미치는 영향을 (A)에서 보여주는 생체 외에서 배양된 마우스 결장 기질 세포의 처리(n=6-7, 그룹당 독립적인 배양 문화). 유의성은 Dunn의 다중 비교 검정과 함께 크루스칼-왈리스 검정에 의해 결정하였다. (B) OSM 패밀리의 세 개의 주요 멤버, 즉, OSM, IL-6 및 LIF(모두 10 ng/ml; 7 개의 독립적인 배양에서 모은, 그룹당 n=2-4)에 의해 유도된 마우스 기질 세포에서의 상대적 반응 강도(Il6 발현 유도에 의해 측정됨). 유의성은 Dunnett의 다중 비교 검정과 함께 일원 분산 분석에 의해 결정하였다. *p=0.01-0.05, **p=0.001-0.01, ****p<0.0001.
도 30
(A) 공중이 이용 가능한 전사체 데이터 세트 GSE57945(회장 CD 및 대조군 점막)에서 인간 사이토카인 및 케모카인 유전자 발현의 계층적 클러스터링. OSM 발현과 가장 관련이 있는 유전자 세트는 하단 패널에 강조되어 있으며, Th1/Th17 반응 및 호중구(예를 들어, CXCL1), 단핵구(예를 들어, CCL2/CCL7) 및 Th1 세포CXCL9/10/11)를 유인하는 케모카인과 관련된 다양한 종류의 사이토카인을 특징으로 한다.
도 31
(A) 10 ng/ml 재조합 인간 OSM으로 자극된 CCD18Co 세포(인간 결장 기질 세포)의 유전자 발현 동역학. 도 30에서 강조된 다양한 기능 클래스의 대표적인 유전자, 즉, CCL2(단핵구 화학주성인자(chemoattractant)); CXCL9(Th1 세포 화학주성인자); CXCL1(호중구 화학주성인자); 및 ICAM1(백혈구 조직 침투 및 보유에 필요한 중요한 세포 부착 분자)이 도시되어 있다. 데이터 포인트는 3중 배양물에서 평균(+/- s.e.m.) 유도 수준을 나타낸다. (B) CCD18Co 세포는 LIF(OSM의 가장 가까운 동족체)에 반응하지 않으며, OSM은 LIFR(OSM의 다른 수용체 아형)을 통해 결장 기질 세포를 자극하지 않는다. 3중 배양물을 10 ng/ml LIF 또는 10 ng/ml OSM 단독 또는 15 μg/ml 염소 IgG 대조군 또는 15 μg/ml 항-LIFR 다클론 염소 IgG 존재 하에 2 시간 동안 자극시켰다. 유의성은 Tukey의 다중 비교 검정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 결정하였다, ****p<0.0001.
도 32
10 ng/ml OSM, IL-6, TNF 또는 이들의 조합으로 2 시간 동안 3중 CCD18Co 배양물을 처리하여 이들 사이토카인으로부터의 상대적 자극 강도 및 가능한 상승 작용을 평가하였다. OSM 및 TNF는 분석된 반응 유전자에 따라 부가 효과와 상승 효과 모두를 발휘한다.
도 33
10 ng/ml OSM, IL-1β, 또는 OSM 및 IL-1β로 2 시간 동안 3중 CCD18Co 배양물을 처리하여 이들 사이토카인 간의 기능적 상승 작용을 평가하였다. OSM 및 IL-β는 분석된 반응 유전자에 따라 부가 효과와 상승 효과 모두를 발휘한다. 유의성은 Tukey의 다중 비교 검정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 결정하였다. ***p=0.0001-0.001, ****p<0.0001.
도 34
비-염증성 수술적 절제 표본(조건당 n=3-4 독립 배양)으로부터 분리되고 확장된 인간 결장 기질 세포의 일차 생체외 배양물을 사용하여 도 32에 도시된 것과 동일한 처리 및 분석 전략을 사용하였다. 유의성은 대조군-정규화 이전에 페어드 t-테스트를 사용하여 결정하였다.
치료법
본 발명은 일부 양태에서 항-TNFα 치료, TNFα의 길항제 또는 OSM 및/또는 OSMR의 길항제로 치료하는 방법에 관한 것이다. "항-TNFα 치료"는 TNFα에 대해 대항하거나 길항하는 치료, 예를 들어, TNFα 길항제 투여를 말한다. TNFα, OSM 또는 OSMR의 길항제는 TNFα, OSM 또는 OSMR 기능을 감소시키는 제제이다. 길항제는 임의의 치료적 또는 예방적 유효량만큼 TNFα, OSM 또는 OSMR의 기능을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 기능은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%만큼 적절하게 감소될 수 있다 포함한다. 길항제는 TNFα, OSM 또는 OSMR의 기능을 폐지할 수 있다(즉, 기능이 100% 감소됨). TNFα, OSM 또는 OSMR 기능은 임의의 적합한 기술에 의해 측정될 수 있다.
길항제는 TNFα, OSM 또는 OSMR 활성의 길항제 또는 TNFα, OSM 또는 OSMR 발현의 길항제일 수 있다. 길항제는 예를 들어 TNFα, OSM 또는 OSMR의 생산 또는 발현을 감소시키거나 또는 TNFα, OSM 또는 OSMR의 분해를 증가시킴으로써 TNFα, OSM 또는 OSMR의 양을 감소시킬 수 있다. 길항제는 세포로부터 가용성 TNFα 또는 OSM의 방출을 감소시킬 수 있다. 길항제는 가용성 또는 세포외 TNFα 또는 OSM 및/또는 수용체 결합 TNFα 또는 OSM 및/또는 막횡단(transmembrane) TNFα를 중화 또는 제거할 수 있다. 길항제는 TNFα 또는 OSM 및 하나 이상의 수용체와의 효과적인 결합을 억제 또는 방지할 수 있다. 길항제는 TNFα, OSM 또는 OSMR의 전사를 감소시킬 수 있다. 길항제는 예를 들어 아연-집게(Zinc-finger) 핵산분해효소와 같은 방법을 사용하여 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 TNFα, OSM 또는 OSMR의 DNA를 파괴시킬 수 있다. 길항제는 TNFα, OSM 또는 OSMR의 mRNA 레벨을 감소시키거나, 예를 들어, 안티센스 RNA 또는 RNA 간섭에 의한 TNFα, OSM 또는 OSMR mRNA의 처리를 방해할 수 있다. 길항제는 TNFα, OSM 또는 OSMR의 단백질 분해를 증가시킬 수 있다. 길항제는 TNFα, OSM 또는 OSMR의 천연 저해제의 레벨을 증가시킬 수 있다. 길항제는 인산화, 유비퀴틴화(ubiquitylation), 수모화(sumoylation) 등과 같은 번역 후 변형에 의해 TNFα, OSM 또는 OSMR의 기능을 감소시킬 수 있다.
TNFα, OSM 또는 OSMR 길항제는 TNFα, OSM 또는 OSMR에 특이적일 수 있는데, 이는 TNFα, OSM 또는 OSMR에 우세하게 또는 독점적으로 작용하거나, 다른 분자들보다 우선적으로 TNFα, OSM 또는 OSMR에 작용한다. 예를 들어, 두 가지 유형의 TNFα가 동일한 수용체를 이용할 수 있음에도 불구하고, 항-TNFα 치료는 바람직하게 TNFα에는 작용하지만 TNFβ에는 작용하지 않는다.
OSM 및/또는 OSMR의 길항제는 Th17 헬퍼 T 세포 또는 Th17 CD4+ T 세포 또는 Th17 경로의 발달을 억제할 수 있다. 길항제는 Th17 조건 하에서 활성화된 미접촉 CD4+ T 세포의 증식을 억제할 수 있다. 길항제는 Th17 조건 하에서 활성화된 미접촉 CD4+ T 세포의 생존을 감소시키거나 억제할 수 있다. 길항제는 Th17 세포에서 Th2 사이토카인의 발현을 증가시킬 수 있다.
대안적으로 또는 부가적으로, OSM 및/또는 OSMR의 길항제는 기질 및/또는 병원성 섬유증의 무질서한 활성화를 억제할 수 있다. OSM 및/또는 OSMR의 길항제는 조직 혈관 형성, 백혈구의 모집 및 유지, 및/또는 국소 염증 과정을 억제할 수 있다. OSM 및/또는 OSMR의 길항제는 상피 증식을 억제할 수 있다. OSM 및/또는 OSMR의 길항제는 만성 장염과 관련된 심각한 이상 반응인 이형성증(dysplasia) 및 종양 형성(neoplasia)의 개시를 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, 길항제는 항체, 소분자, 단백질, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 분자(안티센스 RNA 또는 모르폴리노), 또는 간섭 RNA(예를 들어, 작은 간섭 RNA(siRNA)), 작은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 짧은 간섭 리보핵 중성(short interfering ribonucleic neutral, siRNN)과 같은 변형된 RNAi 치료 전구 약물이다.
항체
경우에 따라서, 길항제는 항-TNFα, 항-MOS 또는 항-OSMR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 즉 TNFα, TNFα, 또는 OSM에 특이적으로 결합하고(아래에서 정의되는 바와 같이) 또는 TNFα, TNFα, 또는 OSM 활성을 중화 또는 억제하는 항체 또는 이의 단편이다. 예를 들어, 길항제는 분리된 또는 복합체화된 나노바디( 단일 도메인 항체; sdAb), 또는 Fab' 단편일 수 있거나, 또는 예를 들어, 분리된 또는 이중 특이성 치료제(mAb2)로서 대안적인 표적에 대한 특이적 Fab 도메인과 결합한 개질된 Fc 영역일 수 있다. 경우에 따라서, 항체는 이중 특이성 항체, 예를 들어 OSM 및 TNFα 모두를 표적으로 하는 이중 특이성 항체이다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 항체가 또한 아래에서 더 기술된다. 길항제는 예를 들어 TNFα, OSM 또는 OSMR에 특이적인 알파바디(Alphabody), 어피바디(Affibody), 어피틴(Affitin), 안티칼린(Anticalin), 모노바디(Monobody) 또는 아드넥틴(Adnectin)과 같은 합성 항원 결합 스캐폴드 또는 합성 항체일 수 있다.
항-TNFα 항체의 예는 인플릭시맙(infliximab), 아달리무맙(adalimumab), 세르톨리주맙(certolizumab) 또는 골리무맙(golimumab)이다.
인플릭시맙 및 아달리무맙은 모든 형태(세포외, 막횡단 및 수용체-결합)의 TNFα를 중화할 수 있는 항체의 예이다. 인플릭시맙(상표명 Remicade®로 시판중)은 염증 및 자가면역 질환을 치료하는데 사용되는 약물이다. 인플릭시맙은 쥐 결합 VK 및 VH 도메인 및 인간 불변 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단클론 항체이다. 인플릭시맙은 높은 친화도를 가지고 TNFα의 가용성(혈액에서 자유롭게 떠님) 및 막횡단(T 세포 및 유사한 면역 세포의 외부 막에 위치함) 막에 결합함으로써 TNFα의 생물학적 활성을 중화시키고, 수용체에 대한 TNFα의 효과적인 결합을 억제하거나 방지한다. 인플릭시맙은 TNFα에 대한 높은 특이성을 가지며, TNFβ를 중화시키지 않지만, TNFβ는 TNFα와 동일한 수용체를 사용한다. 인플릭시맙은 예를 들어 건선, 소아 크론병, 강직성 척추염, 크론병, 건선성 관절염, 류마티스성 관절염, 및 궤양성 대장염의 치료제로 미국 식품 의약국(FDA)의 승인을 받았다.
아달리무맙(상표명 Humira®로 시판중)도 TNFα에 결합하여 TNF 수용체가 활성화되는 것을 방지한다. 아달리무맙은 완전 인간 단클론 항체로 구성된 반면, 인플릭시맙은 마우스-인간 키메라 항체이다. 아달리무맙은 예를 들어 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 크론병, 궤양성 대장염, 건선 및 소아 특발성 관절염의 치료제로 미국 식품 의약국(FDA)의 승인을 받았다.
항-TNF 치료는 TNF 수용체에 대한 중화 항체의 투여를 포함할 수 있다. 일반적으로, TNF 수용체에 대한 중화 항체는 TNFR1 수용체, 예를 들어, 인간 야생형 TNFR1 수용체에 대한 중화 항체이다. TNFR1 수용체에 대한 중화 항체의 예는 아트로삽(atrosab)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 아트로삽은 인간 TNFR1의 아미노산 1 내지 70에 결합하고 TNFR1 매개 신호 전달을 선택적으로 억제한다.
항-OSM 항체의 예는 US2014099315 (A1) 및 WO2012069433 (A2)에 기재되어 있다.
항-OSMR 항체의 예는 WO2014194274 (A2) 및 WO2013168829 (A1)에 기재되어 있다.
비기능적 형태 및 융합 단백질
길항제는 천연(즉, 야생형) TNFα, OSM 또는 OSMR과 경쟁할 수 있고 따라서 천연 TNFα, OSM 또는 OSMR의 기능을 길항할 수 있는 TNFα, OSM 또는 OSMR의 감소된 기능적 형태 또는 비기능적 형태일 수 있다. 감소된 기능적 형태의 기능은 어느 정도 축소되거나 감소될 수 있다. 예를 들어, 기능은 야생형 TNFα, OSM 또는 OSMR과 비교하여 적어도 10%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 95% 이상 축소되거나 감소될 수 있다.
인간 TNFα mRNA(진뱅크 수탁 번호: NM_000594.3)의 mRNA 서열을 SEQ ID NO: 1에 나타내었다. 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 2(NP_000585.2)에 나타내었다. 인간 OSM mRNA(진뱅크 수탁 번호: NM_020530.4)의 mRNA 서열을 SEQ ID NO: 3에 나타내었다. 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 4(NM_020530.4)에 나타내었다. 인간 OSMR mRNA(진뱅크 수탁 번호: NM_003999.2)의 mRNA 서열을 SEQ ID NO: 5에 나타내었다. 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 6(NP_003990.1)에 나타내었다. 길항제는 SEQ ID NO: 2, 4 또는 6의 감소된 기능적 변이체 또는 비기능성 변이체 또는 이의 임의의 아형일 수 있다. 감소된 기능적 변이체는 SEQ ID NO: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열과는 다른 아미노산 서열 또는 이의 임의의 아형을 가지며 TNFα, OSM 또는 OSMR로서 기능하는 능력이 감소된 단백질이다. 비기능적 변이체는 SEQ ID NO: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열과는 다른 아미노산 서열 또는 이의 임의의 아형을 가지며 TNFα, OSM 또는 OSMR로서 기능하는 능력을 가지지 않는 단백질이다.
예를 들어, OSMR의 비기능적 변이체는 이량체 수용체를 형성하거나 신호 전달 경로와 상호 작용하는 부위에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. OSMR의 비기능적 변이체는 또한 OSM을 격리하는 절두된 형태일 수 있다. 비기능적 변이체는 또한 OSM을 격리하는 수용체의 가용성 형태일 수 있다.
TNFα, OSM 또는 OSMR로서 기능하는 변이체의 능력은 본 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 감소된 기능 및 비기능적 변이체의 비교 기능 능력은 일반적으로 SEQ ID NO: 2, 4 또는 6과 같은 야생형 TNFα, OSM 또는 OSMR과 비교하여 측정된다.
SEQ ID NO: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 아형의 전체 길이에 걸쳐, 변이체는 아미노산 동일성(identity)을 기반으로 해당 서열에 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 상동일 수 있다. 200 이상, 예를 들어 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1500 또는 2000 이상의 인접한 아미노산("강력한 상동성(hard homology)")의 스트레치(stretch )에 걸쳐 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 90% 또는 95%의 아미노산 동일성이 있을 수 있다.
상동성을 결정하기 위해 본 기술 분야의 표준 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, UWGCG 패키지는 상동성을 계산하는데 사용될 수 있는, 예를 들어 기본 설정(Devereux et al(1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395)에서 사용되는BESTFIT 프로그램을 제공한다. PILEUP 및 BLAST 알고리즘은, 예를 들어 Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S.F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10에 기술된 바와 같이, 상동성 또는 라인 업 서열(동등한 잔기 또는 상응하는 서열(일반적으로 기본 설정에서))을 계산하는데 사용될 수 있다.BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 공중이 이용할 수 있다.
변이체는 SEQ ID NO: 2, 4 또는 6의 단편 또는 이의 임의의 아형을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 일반적으로 적어도 하나의 기능적 도메인, 예를 들어, SEQ ID NO: 2, 4 또는 6의 결합 도메인 또는 이의 임의의 아형이지만 기능적이지 않은 결합 도메인을 보유한다. 단편은 길이가 최소 600, 700, 800 또는 900 아미노산일 수 있다. 하나 이상의 아미노산이 대안적으로 또는 부가적으로 상기한 폴리펩티드에 첨가될 수 있다.
길항제는 TNFα, OSM 또는 OSMR(또는 상기한 바와 같은 TNFα, OSM 또는 OSMR 단백질의 단편) 및 이종 단백질 서열을 포함하는 융합 단백질 또는 키메라일 수 있다. 융합 단백질은 TNFα, OSM 또는 OSMR에 대한 디코이(decoy) 결합 파트너로서 작용할 수 있고, 이에 따라 TNFα, OSM 또는 OSMR 활성을 억제할 수 있다. 일 실시형태에서, 길항제는 예를 들어 OSMR, gp30 및 IgG2A의 Fc 영역과 같은 면역 글로불린 Fc 영역을 포함하는 OSM 수용체 융합 단백질이다.
일 실시형태에서, 키메라는 가용성 TNFα 또는 OSM 수용체 키메라이다. 가용성 TNF 수용체 키메라의 예는 레너셉트(lenercept) 및 이타너셉트(etanercept)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이타너셉트는 TNFα와 결합하여, 강직성 척추염, 소아 류마티스성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스성 관절염 및 잠재적으로 과량의 TNFα에 의해 매개되는 다양한 다른 질병과 같은 자가면역 질환을 포함하는, 인간 및 다른 동물의 과도한 염증과 관련된 질병에서 이의 역할을 감소시킨다.
핵산
길항제는 TNFα, OSM 또는 OSMR에 대한 변형 핵산, 예를 들어 앱타머(Aptamer)일 수 있다. 길항제는 TNFα, OSM 또는 OSMR의 길항제 또는 비기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 길항제 또는 비기능적 변이체는 본원에 논의된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
핵산과 같은 폴리뉴클레오티드는 두 개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리머이다. 뉴클레오티드는 자연 발생적이거나 인공적일 수 있다. 뉴클레오티드는 일반적으로 핵염기(nucleobase), 당 및 인산염, 2'O-메틸, 2'-메톡시-에틸, 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate)기와 같은 적어도 하나의 연결기를 포함한다. 핵염기는 일반적으로 헤테로시클릭이다. 핵염기는 퓨린 및 피리미딘, 더욱 구체적으로는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 우라실(U) 및 시토신(C)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당은 일반적으로 펜토오스 당(pentose sugar)이다. 뉴클레오티드 당은 일반적으로 리보오스 및 데옥시리보오스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오티드는 일반적으로 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드는 일반적으로 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 포함한다. 인산염은 뉴클레오티드의 5' 또는 3' 측에 부착될 수 있다.
뉴클레오티드는 아데노신 모노포스페이트(adenosine monophosphate, AMP), 아데노신 디포스페이트(adenosine diphosphate, ADP), 아데노신 트리포스페이트(adenosine triphosphate, ATP), 구아노신 모노포스페이트(guanosine monophosphate, GMP), 구아노신 디포스페이트(guanosine diphosphate, GDP), 구아노신 트리포스페이트(guanosine triphosphate, GTP), 티미딘 모노포스페이트(thymidine monophosphate, TMP), 티미딘 디포스페이트(thymidine diphosphate, TDP), 티미딘 트리포스페이트(thymidine triphosphate, TTP), 우리딘 모노포스페이트(uridine monophosphate, UMP), 우리딘 디포스페이트(uridine diphosphate, UDP), 우리딘 트리포스페이트(uridine triphosphate, UTP), 시티딘 모노포스페이트(cytidine monophosphate, CMP), 시티딘 디포스페이트(cytidine diphosphate, CDP), 시티딘 트리포스페이트(cytidine triphosphate, CTP), 5-메틸시티딘 모노포스페이트, 5-메틸시티딘 디포스페이트, 5-메틸시티딘 트리포스페이트, 5-하이드록시메틸시티딘 모노포스페이트, 5-하이드록시메틸시티딘 디포스페이트, 5-하이드록시메틸시티딘 트리포스페이트, 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cyclic adenosine monophosphate, cAMP), 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cyclic guanosine monophosphate, cGMP), 데옥시아데노신 모노포스페이트 (deoxyadenosine monophosphate, dAMP), 데옥시아데노신 디포스페이트(deoxyadenosine diphosphate, dADP), 데옥시아데노신 트리포스페이트(deoxyadenosine triphosphate, dATP), 데옥시구아노신 모노포스페이트(deoxyguanosine monophosphate, dGMP), 데옥시구아노신 디포스페이트(deoxyguanosine diphosphate, dGDP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(deoxyguanosine triphosphate, dGTP), 데옥시티미딘 모노포스페이트(deoxythymidine monophosphate, dTMP), 데옥시티미딘 디포스페이트(deoxythymidine diphosphate, dTDP), 데옥시티미딘 트리포스페이트(deoxythymidine triphosphate, dTTP), 데옥시우리딘 모노포스페이트(deoxyuridine monophosphate, dUMP), 데옥시우리딘 디포스페이트(deoxyuridine diphosphate, dUDP), 데옥시우리딘 트리포스페이트(deoxyuridine triphosphate, dUTP), 데옥시시티딘 모노포스페이트(deoxycytidine monophosphate, dCMP), 데옥시시티딘 디포스페이트(deoxycytidine diphosphate, dCDP) 및 데옥시시티딘 트리포스페이트(deoxycytidine triphosphate, dCTP), 5-메틸-2'-데옥시시티딘 모노포스페이트, 5-메틸-2'-데옥시시티딘 디포스페이트, 5-메틸-2'-데옥시시티딘 트리포스페이트, 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 모노포스페이트, 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 디포스페이트 및 5-하이드록시메틸-2'-데옥시시티딘 트리포스페이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오티드는 바람직하게 AMP, TMP, GMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP 또는 dCMP에서 선택된다.
뉴클레오티드는 추가적인 변형을 포함할 수 있다. 특히, 적절한 변형된 뉴클레오티드는 2'-아미노 피리미딘(예를 들어, 2'-아미노 시티딘 및 2'-아미노 우리딘), 2'-하이드록실 퓨린(예를 들어, 2'-플루오로 피리미딘(예를 들어, 2'-플루오로시티딘 및 2'플루오로 우리딘)), 하이드록실 피리미딘(예를 들어, 5'-α-P-보라노 우리딘), 2'-O-메틸 뉴클레오티드(예를 들어, 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 구아노신, 2'-O-메틸 시티딘 및 2'-O-메틸 우리딘), 4'-티오 피리미딘(예를 들어, 4'-티오 우리딘 및 4'-티오 시티딘) 및 핵염기의 변형을 갖는 뉴클레오티드(예를 들어, 5-펜티닐-2'-데옥시 우리딘, 5-(3-아미노프로필)-우리딘 및 1,6-디아미노헥실-N-5-카르바모일메틸 우리딘)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 뉴클레오티드는 산화되거나 메틸화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 뉴클레오티드는 손상될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 피리미딘 이량체를 포함할 수 있다. 이러한 이량체는 일반적으로 자외선에 의한 손상과 관련이 있다.
폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드는 임의의 방식으로 서로 부착될 수 있다. 뉴클레오티드는 인산, 2'O-메틸, 2'-메톡시-에틸, 포스포르아미데이트, 메틸포스포네이트 또는 포스포로티오에이트 결합에 의해 연결될 수 있다. 뉴클레오티드는 일반적으로 핵산에서와 같이 당 및 인산기에 의해 부착된다. 뉴클레오티드는 피리미딘 이량체에서와 같이 이들의 핵염기를 통해 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)과 같은 핵산일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 글리세롤 핵산(glycerol nucleic acid, GNA), 트레오스 핵산(threose nucleic acid, TNA), 잠금 핵산(locked nucleic acid, LNA), 모르폴리노 핵산 또는 그 밖의 뉴클레오티드 측쇄를 갖는 합성 중합체와 같은 본 기술 업계에 공지된 임의의 합성 핵산일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들어 특정 프라이머, 재조합 복제 가능(클로닝) 벡터 및 적합한 숙주 세포를 포함하는 PCR을 사용하여 본 기술 분야의 표준 방법을 사용하여 유도 및 복제될 수 있다. 이러한 표준 기술을 사용하여 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하는 것은 일반적으로 간단하다.
안티센스 및 RNAi
TNFα, OSM 또는 OSMR의 길항제는 예를 들어 TNFα, OSM 또는 OSMR의 발현을 넉-다운(knock down)시킴으로써 개체에 존재하는 TNFα, OSM 또는 OSMR의 양을 감소시킬 수 있다. 단백질 발현을 넉-다운시키기 위한 안티센스 및 RNA 간섭(RNAi) 기술은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 표준 방법을 사용하여 TNFα, OSM 또는 OSMR의 발현을 넉-다운시킬 수 있다.
안티센스와 siRNA 기술은 모두 mRNA를 간섭한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA의 절편에 결합(혼성화)함으로써 mRNA를 간섭한다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA와 상보적으로 설계된다(아래에서 논의된 바와 같이 올리고뉴클레오티드가 100% 상보적일 필요는 없음에도). 다시 말해, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 cDNA의 일부분일 수 있다. 다시, 올리고 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열과 100% 동일하지 않을 수 있다. 이는 아래에도 설명되어 있다.
RNAi는 mRNA에 결합하여 단백질 발현을 억제할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)와 같은 이중 가닥 RNA의 사용을 포함한다.
따라서, 길항제는 TNFα, OSM 또는 OSMR에 대한 mRNA 내의 특정 서열(이하, 표적 서열이라 칭함)에 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 50 개 이하의 뉴클레오티드, 예를 들어 40 개 이하, 30 개 이하, 22 개 이하, 21 개 이하, 20 개 이하, 10 개 이하 또는 5 개 이하의 뉴클레오티드를 갖는 짧은 뉴클레오티드 폴리머이다. 본 발명에서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 길이가 20 내지 25 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 21 또는 22 뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드는 자연 발생적이거나 인공적일 수 있다. 뉴클레오티드는 상기 기술된 것들 중 임의일 수 있다.
표적 서열의 길이는 일반적으로 올리고뉴클레오티드의 길이에 상응한다. 예를 들어, 21 또는 22 뉴클레오티드 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 21 또는 22 뉴클레오티드 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다. 따라서, 표적 서열은 올리고뉴클레오티드의 길이를 참조하여 상기 논의된 임의의 길이일 수 있다. 표적 서열은 일반적으로 표적 폴리뉴클레오티드 내의 연속적인 뉴클레오티드이다.
올리고뉴클레오티드는 표적 서열에 대해 특이적 또는 높은 친화도를 가지고 혼성화할 때 표적 서열에 "특이적으로 혼성화"하지만, 다른 서열에는 실질적으로 혼성화하지 않거나 낮은 친화도를 가지고 혼성화하거나 혼성화하지 않는다.
올리고뉴클레오티드는 그 밖의 서열에 대해 이의 용융 온도(Tm)보다는 큰 적어도 2℃, 예를 들어 적어도 3℃, 적어도 4℃, 적어도 5℃, 적어도 6℃, 적어도 7℃, 적어도 8℃, 적어도 9℃ 또는 적어도 10℃인 용융 온도로 표적 서열에 혼성화하는 경우 "특이적으로 혼성화"한다. 더욱 바람직하게, 올리고뉴클레오티드는 그 밖의 핵산에 대한 이의 용융 온도(Tm)보다는 적어도 2℃, 예를 들어 적어도 3℃, 적어도 4℃, 적어도 5℃, 적어도 6℃, 적어도 7℃, 적어도 8℃, 적어도 9℃, 적어도 10℃, 적어도 20℃, 적어도 30℃, 적어도 40℃인 Tm으로 표적 서열에 혼성화한다. 바람직하게, 부분은 1, 2, 3, 4 또는 5 개 이상의 뉴클레오티드와 같은 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 표적 서열과는 다른 서열에 대해 이의 Tm보다는 적어도 2℃, 예를 들어 적어도 3℃, 적어도 4℃, 적어도 5℃, 적어도 6℃, 적어도 7℃, 적어도 8℃, 적어도 9℃, 적어도 10℃, 적어도 20℃, 적어도 30℃, 적어도 40℃인 Tm으로 표적 서열에 혼성화한다. 부분은 일반적으로 적어도 92℃ 또는 적어도 95℃와 같은 적어도 90℃의 Tm으로 표적 서열에 혼성화한다. Tm은 DNA 마이크로 어레이의 사용을 포함하는 공지된 기술을 사용하여 실험적으로 측정되거나 인터넷 상에서 이용할 수 있는 것들과 같은 공중이 이용 가능한 Tm 계산기를 사용하여 계산될 수 있다.
혼성화를 허용하는 조건은 본 기술 분야에 공지되어있다(예를 들어, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press; and Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York (1995)). 혼성화는 예를 들어 37℃에서 30 내지 35% 포름아미드, 1 M NaCl 및 1% SDS(소듐 도세실 설페이트(sodium dodecyl sulphate))의 완충 용액의 존재 하에 낮은 엄격 조건 하에서 수행될 수 있고, 이어서 50℃에서 1X(0.1650 M Na+) 내지 2X(0.33 M Na+) SSC(표준 구연산나트륨(standard sodium citrate))로 20회 세척된다. 혼성화는 적당한 엄격 조건 하에서, 예를 들어 37℃에서 40 내지 45% 포름아미드, 1 M NaCl 및 1% SDS의 완충 용액의 존재 하에 수행될 수 있고, 이어서 55℃에서 0.5X(0.0825M Na+) 내지 1X(0.1650M Na+) SSC로 세척된다. 혼성화는 높은 엄격 조건 하에서, 예를 들어 37℃에서 50% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS의 완충 용액의 존재 하에서 수행될 수 있고, 이어서 60℃에서 0.1X(0.0165M Na+) SSC로 세척된다.
올리고뉴클레오티드는 표적 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 100% 상보적이다. 그러나, 95%, 90%, 85% 및 심지어 80%와 같이 낮은 수준의 상보성도 허용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드가 표적 서열에 특이적으로 혼성화되는 한, 100% 미만의 상보성이 허용된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 21 개, 22 개, 30 개, 40 개 또는 50 개의 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 1 개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 불일치(mismatch)를 가질 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드를 포함하여 상기 논의된 임의의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 상기한 것들 중 임의의 것 같은 핵산일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 RNA인 것이 바람직하다. 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 헤어핀을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 본 기술 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드는 구입될 수 있다.
경우에 따라서, 본 발명은 항-TNFα 치료 이외의 치료에 관한 것이다. 경우에 따라서, 개체는 염증성 질병 또는 질환을 갖고, 치료는 예를 들어 코르티코스테로이드와 같은 함-염증제의 투여이다.
경우에 따라서, 개체는 아래에 기술되는 본 발명의 방법에 따라 진단되거나 예측된다.
"TNFα-매개 질병 또는 질환"은 표준 의학 지식 및/또는 특정 질병 또는 질환의 치료를 위한 관행에 따라 항-TNFα 치료로 치료될 수 있거나 일반적으로 항-TNFα 치료에 반응을 보이는 있는 질병 또는 질환이다. 항-TNFα 치료가 일반적으로 질병 또는 질환에 대한 치료의 공통 또는 1차 선택이 아니거나, 질병 또는 질환을 가지고 있는 개체의 높은 비율이 무-반응성인 것으로 알려진 경우에도, 치료가 일부 환자에서 효과적인 치료로 인정되는 한 질병 또는 질환이라는 용어가 포함된다. TNFα 매개 질병 또는 질환은, 항-TNFα 치료 또는 TNFα 길항제가 질병 또는 질환의 치료에 대한 규제적 승인을 갖는 질병 또는 질환일 수 있다. TNFα 매개 질병 또는 질환은 만성 장염, 자가면역 질환 또는 염증성 질환일 수 있다. TNFα 매개 질병 또는 질환의 예는 IBD, 류마티스성 관절염, 소아 특발성 관절염, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 건선(예를 들어, 만성 중증 판형 건선(plaque psoriasis))과 같은 염증성 피부 질환, 화농성 한선염이 있다. 경우에 따라서, TNFα 매개 질병 또는 질환은 건선이다.
IBD는 대장과 소장의 염증성 질환군을 말하며 때로는 소화관(alimentary canal)의 다른 부위에도 영향을 미친다. 크론병(결장 및 회장 크론병 포함) 및 궤양성 대장염은 IBD의 가장 흔한 형태이다. 그 밖의 형태는 콜라겐성 대장염, 림프성 대장염, 전환 대장염, 베체트 대장염, 불확정 대장염 및 면역 관문 저해제 생물학적 치료에 의해 유발될 수 있는 급성 중증 대장염, 예를 들어, 암을 포함하는 급성 중증 대장염을 포함한다. IBD는 또한 대장 암 발병의 위험 인자이기도 하다. 경우에 따라, 본 발명에 따르면, IBD는 장암과 관련된다. 일부 경우, 본 발명은 중증 궤양성 대장염, 급성 궤양성 대장염 또는 독성 거대결장을 가지고 있는 환자, 또는 질병의 중증도 또는 징후에 관계없이 시클로스포린(cyclosporine) 또는 인플릭시맙과 같은 종래의 치료법에 실패한 환자의 치료, 진단 또는 예후에 사용하기 위한 것이다.
만성 장염은 비정상적인 염증 반응 및 재발-회복 과정으로 인한 조직 손상을 포함하는, 위장관을 괴롭히는 다양한 질환이다. 만성 염증 질환은 궤양성 대장염, 크론병, 불확정 대장염, 미세 대장염(콜라겐성 및 림프성 대장염 포함), 불응성 복강 질병(sprue), 불응성 호산구성 위장염, 호산구성 식도염, 만성 게실병 및 전환 대장염을 포함한다.
실시예에 나타낸 바와 같이, OSM은 인간 장내 기질 세포에 동시 투여될 때 TNFα 및 IL-1β와의 상승 작용을 입증한다. OSM 및/또는 OSMR의 길항제는 바람직하게는 항-TNFα 치료 및/또는 IL-1β의 길항제와 병용 투여된다. 항-TNFα 치료는 아래에서 더욱 상세히 논의된다. IL-1β의 길항제는 OSM 및/또는 OSMR에 대해 상기 정의된 길항제 유형들 중 하나일 수 있다. IL-1β의 승인된 길항제의 예는 아나킨라(Anakinra, 재조합 IL-1 수용체 길항제), 릴로나셉트(Rilonacept, 가용성 IL-1 수용체) 및 카나키누맙(Canakinumab, 항-IL-1β 단클론 항체)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. IL-1β의 그 밖의 길항제는 임상 개발 단계에 있다(Dinarello et al, Nat Rev Drug Discovery, 2012 참조). 방법은 이중 특이성 항체, 예를 들어 OSM 또는 OSMR 및 IL-1β 모두를 표적으로 하는 이중 특이성 항체의 사용을 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 항체들이 또한 아래에서 더 기술된다.
조합은 치료법이 개체에 동시에 투여될 수 있음을 의미한다. 치료법은 동일한 치료의 일부로서 개체에 임의의 순서로 개별적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD의 치료에서 동시에, 별도로 또는 순차적으로 사용하기 위해 (a) OSM 및/또는 OSMR의 길항제 및 (b) 항-TNFα 치료 및/또는 IL-1β 길항제를 함유하는 제품을 제공한다.
진단/예후
본 발명은 일부 양태에서 진단 또는 예후의 방법에 관한 것이다. 진단은 개체가 질병 또는 질환을 가지고 있는지 여부 및/또는 질병 또는 질환의 중증도를 판단하는 단계를 포함한다. 예후는 개체가 질병 또는 질환으로 발병할 것인지 여부, 개체가 치료를 필요로 할 것인지 여부, 개체가 필요로 할 치료 유형, 개체가 치료에 반응할 것인지 여부, 개체가 질병 사례, 재발 또는 악화로 고통 받을 것인지 여부 및/또는 증상 또는 질병 사례, 재발 또는 악화의 중증도 또는 지속 기간을 예측하는 단계를 포함한다.
방법은 개체에서 OSM 및/또는 OSMR을 측정하는 단계를 포함한다. 경우에 따라서, OSM 및 OSMR을 모두 측정하여 기준 샘플의 기준 OSM 및 OSMR 레벨 또는 OSM 및 OSMR 레벨과 비교하여 OSM 지수(OSMi)를 결정한다. OSMi는 직접 비교 가능한 두 개 이상의 샘플에서 활성 OSM-OSMR 신호 전달의 상대 확률을 근사화한다. OSMi의 이론적 근거는 다음과 같다: 공개된 문헌에 따르면, 인간 조직에서 OSM에 대한 지배적인 수용체는 하나의 gp130 사슬과 하나의 OSMR 사슬로 구성된 이종이량체이다. Gp130은 대부분의 인간 세포 유형 및 조직에서 무차별적으로 고도로 발현된다; 대조적으로, OSMR 발현은 더욱 엄격하게 조절되고 특정 세포 유형 및 조건으로 제한된다. 따라서, OSMR은 OSM 수용체 복합체의 제한 인자이다. OSM은 마찬가지로 통제된 방식으로 발현된다. 그러므로 1: 1 화학양론으로 상호 작용하는 OSM 및 OSMR은 OSM 경로 활성을 제어하는 주요 제한 요소이다. 조직 샘플에서의 상대 OSM 또는 OSMR 발현은 해당 시스템에서의 활성 OSM 신호 전달의 이론적 가능성에 직접적으로 해당된다. OSMi는 직접 비교 가능한 표본으로 구성된 데이터 세트 내의 표본에서 OSM 및 OSMR의 상대적 발현의 곱이다.
OSMi를 계산하는 예는 다음과 같다: 본 발명자들은 두 명의 장 점막 생검을 갖는데, 하나는 대조군 환자이고 다른 하나는 IBD 환자이다. 정량적 PCR을 사용하여, 상응하는 하우스키핑 유전자 수준(예를 들어, RPLP0)과 관련된 샘플 내 OSM 및 OSMR 모두의 mRNA 레벨을 찾는다. 이들 번호는 다음과 같다:
대조군:
OSM-0.000058; OSMR-0.00083
IBD:
OSM-0.0022; OSMR-0.0073
IBD 검체에서의 OSM의 발현은 대조군 시료보다 38 배 더 높다. IBD 검체에서의 OSMR의 발현은 대조군 시료보다 8.8 배 더 높다. 따라서, 본 발명자들은 대조군 시료의 OSMi를 1로 지정하면 IBD 검체의 OSMi는 두 개의 유효 숫자로 반올림되어 38×8.8=330이 된다.
OSMi를 올바르게 해석하기 위해서는, 입력 값(즉, 상대 OSM 및 OSMR 발현)을 적절한 기준 값에 대해 계산해야 한다. 이는 상황에 따라 여러 가지 형태가 있을 수 있다. 본 예에서, IBD 검체에 대한 논리 비교기는 건강한 대조군 시료이다. 아래의 예에 포함된 데이터에서, OSMi 값은 비교기로서 주어진 데이터 집합 내의 중간 값을 사용하여 계산된다. 임상 시나리오에서 OSMi를 계산하기 위해, 불멸화 세포주의 패널에서 평균 OSM/OSMR 발현과 같은 일관된 기준 시료가 각각의 분석에 사용될 수 있다. 본 발명의 진단 또는 예후 방법은 진단 또는 예후를 개선하기 위한 하나 이상의 다른 분석 또는 테스트와 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, 다른 마커가 분석에 포함될 수 있다. 예는 IBD의 진단/예후를 위한 혈청 C-반응성 단백질(C-reactive protein, CRP)이다. S100A8은 장염 중증도의 바이오마커이다. 분변 칼프로텍틴은 일반적으로 점막 염증의 지표로서 임상에서 분석된다. 경우에 따라서, 진단 또는 예후의 방법은 만성 장염 및/또는 IBD에 차도가 있는 개체가 질병이 재발할 것인지 여부를 예측하기 위한 방법이다. 개체가 재발할 것인지 여부를 예측하는 것은 개체가 재발할 가능성을 결정하고 및/또는 재발할 것인지 여부를 예측하는 것을 포함한다. 일부 경우, 개체는 항-TNFα 치료, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항-TNFα 치료 이후 재발된다. 경우에 따라서, 예후 방법은 개체가 항-TNFα 치료 또는 항-OSM 또는 항-OSMR 치료 또는 항-OSM 및/또는 항-OSMR OSM 치료, 예를 들어 OSM 및/또는 OSMR의 길항제에 반응할 것인지 여부를 예측하기 위한 방법이다. 개체가 반응할 것인지 여부를 예측하는 것은 개체가 반응할 가능성을 결정하고 및/또는 개체가 반응하는 정도, 예를 들어 치료로 인해 개체의 증상이 완화되는 정도를 예측하는 것을 포함한다.
항-TNFα 또는 항-OSM/OSMR 치료에 대한 개체의 예측된 반응성은 개체가 항-TNFα 또는 항-OSM/OSMR 치료를 받음으로써 이익 또는 충분한 정도의 이익을 얻을 것으로 기대된다는 것을 의미한다. 항-TNFα 또는 항-OSM/OSMR 치료에 대한 개체의 예측된 무-반응성은 개체가 항-TNFα 또는 항-OSM/OSMR 치료를 받음으로써 이익 또는 충분한 정도의 이익을 얻을 것으로 기대되지 않는다는 것을 의미한다. 반응을 예측하기 위한 방법은 항-TNFα 또는 항-OSM/OSMR 치료의 투여 전에 수행될 수 있다. 개체에 대해 적절한 치료를 선택하거나 추천할 때 예측이 고려될 수 있다. 대안적으로, 방법은 항-TNFα 또는 항-OSM/OSMR 치료로 치료한 후에 수행될 수 있고, 치료에 대한 개체의 반응을 모니터하고 예측하는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 방법은 개체가 항-TNFα 또는 항-OSM/OSMR 치료로 치료에 대한 일차 반응을 가질 것인지 여부, 즉 치료를 처음 받을 때 개체가 반응할 것인지 여부를 예측하기 위한 것이다. 경우에 따라서, 방법은 이차 무-반응성, 즉 처음에는 치료에 반응한 개체가 나중에 치료에 대한 응답을 멈추거나 치료에 덜 응답할 것인지 여부를 예측하기 위한 것이다.
본 발명에 따르면, 기준 샘플 또는 기준 레벨과 비교할 때, 개체에서 OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 증가한 레벨은 질환의 존재에 관한 양성 진단, 예를 들어 개체가 관련 질병 또는 질환을 갖거나 더욱 심한 질병을 가짐을 나타낸다. OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 증가한 레벨은 개체에 대한 예측 결과가 나쁜 음성 예후, 예를 들어 개체가 항-TNFα 치료에 반응하지 않을 것이라는, 또는 질병에 차도가 있는 개체가 재발할 것이라는, 또는 개체가 질병 또는 질환의 발병 위험이 높음을 나타낸다. 반대로, OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 감소한 레벨은 음성 진단, 예를 들어 개체가 관련 질병 또는 질환을 가지고 있지 않거나 덜 심각한 질병을 가지고 있음을 나타낸다. OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 감소한 레벨은 환자에 대한 좋은 결과인 양성 예후, 예를 들어 개체가 항-TNFα 치료에 반응할 것이라는 또는 질병에 차도가 있는 개체가 재발하지 않거나 질병 또는 질환의 발병 위험이 높지 않음을 나타낸다. 개체가 질병 또는 질환을 가지고 있는지 여부를 진단하기 위해, 기준 샘플 또는 레벨은 일반적으로 관련 질병 또는 질환을 가지고 있지 않거나, 또는 질병 또는 질환을 가지고 있는 것으로 의심되지만 이후 질병 또는 질환을 가지고 있지 않는 것으로 확인된 개체에서의 OSM, OSMR 또는 OSMi의 기준선 레벨을 나타낸다. 적합한 기준 샘플 또는 레벨은 본원에 기술된 다른 진단 또는 예후 방법에 대해 마찬가지로 선택될 수 있다.
진단 또는 예후의 방법은 예를 들어 진단 또는 예후를 기반으로 개체에 대한 적절한 치료를 선택하거나 추천하는 단계를 포함할 수 있다. 선택되거나 추천되는 치료는 이후 개체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 경우에 따라서, 기준 샘플 또는 기준 레벨과 비교할 때, OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 감소한 레벨은 개체가 항-TNFα 치료에 반응할 것임을 나타낸다. 항-TNFα 치료가 선택되거나 추천될 수 있으며, 이후 개체에 더 투여될 수 있다. 그 밖의 경우, 기준 샘플 또는 기준 레벨과 비교할 때, OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 증가한 레벨은 개체가 항-TNFα 치료에 반응하지 않을 것임을 나타낸다. 그러면, 항-TNFα 치료는 개체에 투여되지 않는다. 또한, 항-TNFα 치료 이외의 치료가 개체의 치료를 위해 선택되거나 추천될 수 있으며, 개체에 추가로 투여될 수 있다.
본 발명의 모든 양태에서, 질병 또는 질환(예를 들어, IBD 또는 만성 장염)을 가지고 있는 개체는 질병 또는 질환을 가지고 있는 것으로 의심되는 개체 및/또는 질병 또는 질환의 발병 위험에 처한 개체를 포함한다. 예를 들어, 개체는 공식적으로 진단되지 않았지만 하나 이상의 증상으로 인해 질병 또는 질환을 갖고 있는 것으로 의심될 수 있다. IBD 및/또는 만성 장염의 증상은 복부 또는 골반 통증, 경련 또는 근육 경련, 구토, 설사, 직장 출혈, 체중 감소, 발열 및 빈혈을 포함한다. 개체가 질병 또는 질환과 관련된 하나 이상의 위험 인자 및/또는 질병 또는 질환에 대한 민감성을 증가시키는 하나 이상의 소인을 갖는 경우, 개체는 질병 또는 질환이 발병할 위험에 처한 것으로 간주될 수 있다. IBD 및/또는 만성 장염의 위험 인자는 유전적 소인 및 항생제 치료가 포함된다.
방법은 바람직하게 개체에서 TNFα 및/또는 IL-1β를 측정함으로써 개체의 만성 장염 및/또는 IBD를 진단 또는 예측하는 단계를 더 포함한다. 방법은 바람직하게 TNFα 및 IL-1β 모두를 측정하는 단계를 더 포함한다. TNFα 및/또는 IL-1β는 OSM 및/또는 OSMR에 대해 아래에서 논의되는 방식 중 임의의 방식으로 측정될 수 있다. 방법은 바람직하게 개체에서 TNFα 및/또는 IL-1β를 측정하는 단계, TNFα 및/또는 IL-1β 레벨을 기준 TNFα 및/또는 IL-1β 레벨 또는 기준 샘플의 TNFα 및/또는 IL-1β 레벨과 비교하는 단계, 및 TNFα 및/또는 IL-1β(TNFαi 및/또는 IL-1βi)를 측정하는 단계를 더 포함한다. 기준 샘플 또는 기준 레벨과 비교할 때 또는 이를 이용하여 계산된 TNFα 및/또는 IL-1β 또는 TNFαi 및/또는 IL-1βi의 증가한 레벨은 일반적으로 양성 진단, 음성 예후 및/또는 개체가 재발할 것임을 나타낸다. 기준 샘플 또는 기준 레벨(들)과 비교할 때 또는 이를 이용하여 계산된 TNFα 및/또는 IL-1β 또는 TNFαi 및/또는 IL-1βi의 감소한 레벨은 음성 진단, 양성 예후 및/또는 개체가 재발하지 않을 것임을 나타낸다.
본 발명은 또한 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD의 중증도를 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 만성 장염 및/또는 IBD를 가진 개체가 수술을 필요로 할 가능성을 결정하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 모두 개체에서 OSM 및/또는 OSMR를 측정하는 단계를 포함한다. 방법은 일반적으로 개체에서 OSM 및 OSMR을 측정하는 단계, OSM 및 OSMR 레벨을 기준 OSM 및 OSMR 레벨 또는 기준 샘플의 OSM 및 OSMR 레벨과 비교하는 단계, 및 OSM 지수(OSMi)를 결정하는 단계를 포함한다. 이는 상기한 바와 같이 달성될 수 있다. 기준 샘플 또는 기준 레벨(들)과 비교할 때 또는 이를 이용하여 계산된OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 증가한 레벨은 질병이 심각하고 및/또는 개체가 수술을 필요로 할 가능성이 있음을 나타낸다. 기준 샘플 또는 기준 레벨(들)과 비교할 때 또는 이를 이용하여 계산된OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 감소한 레벨은 질병이 심각하지 않고 및/또는 개체가 수술을 필요로 할 가능성이 없음을 나타낸다.
이러한 문맥에서의 중증도는 표준 내시경 및 조직병리학적 평가에 의해 현재 결정되는 질병의 강도를 의미한다. 이는 환자의 치료 불응성 상태와 관련이 있으며, 이에 따라 질병의 중증도가 큰 환자는 약리학적 개입에 반응할 가능성이 적고 따라서 수술적 개입을 필요로 할 위험이 높다. 수술은 일반적으로 위장관의 발병 부위를 제거하고 특정 상황에 따라 가변적인 관련 합병증의 수리를 포함한다. 예를 들어, 크론병(CD)을 갖고 있는 환자는 일반적으로 장의 별도의 섬유화 부위를 제거해야 할 필요가 있지만, 일부 궤양성 대장염(UC) 환자는 대장을 완전히 제거해야 할 필요가 있다. 일부 환자는 누관 교정이나 장루(stoma)의 형성과 같은 추가적인 수술적 개입을 필요로 할 것이다.
질병의 중증도 또는 수술의 가능성을 결정하기 위해, 기준 샘플 또는 레벨은 일반적으로 수술을 필요로 하지 않는 경미한 형태의 질병 또는 질환을 가지고 있는 개체의 OSM, OSMR 또는 OSMi의 기준선 레벨을 나타낸다. 기준 샘플 또는 레벨은 관련 질병 또는 질환을 가지고 있지 않거나, 또는 질병 또는 질환을 가지고 있는 것으로 의심되지만 이후 질병 또는 질환을 가지고 있지 않는 것으로 확인된 개체에서의 OSM, OSMR 또는 OSMi의 기준선 레벨을 나타낼 수 있다.
관련 개체는 일반적으로 포유 동물, 예를 들어 영장류, 설치류(마우스 및 래트 포함), 또는 토끼, 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 돼지 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 기타 일반적인 실험실 동물, 가축, 또는 농업용 동물이다. 개체는 인간일 수 있다.
OSM 및/또는 OSMR 의 검출
OSM 또는 OSMR의 레벨은 일반적으로 개체로부터 수득된 생물학적 시료에서 시험관내에서 측정된다. 시료는 개체의 체액을 포함할 수 있다. 유체 샘플은 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 뇌척수액 또는 관절액의 샘플일 수 있다.
대안적으로, 시료는 조직 샘플을 포함할 수 있다. 일반적으로 조직 샘플은 질병 또는 질환의 영향을 받는 신체의 일부에서 온다. 예를 들어, 질병 또는 질환이 IBD 또는 만성 장염인 경우, 조직 샘플은 장 생검(예를 들어, 장 점막 생검) 또는 수술적 절제 샘플일 수 있다.
시료는 분석하기 전에, 예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질의 원심분리 또는 추출에 의해 처리될 수 있다. 시료는 또한 분석 전에 바람직하게 -70℃이하로 저장될 수 있다.
본 기술 분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 OSM 또는 OSMR의 레벨을 분석할 수 있다. 이들 방법은 일반적으로 관련 단백질에 결합하거나 반응하는 제제를 사용하는 단계를 포함한다. 제제는 개체의 시료와 접촉될 수 있으며 제제 및 관련 단백질 간의 복합체 형성 또는 반응이 측정된다. 제제는 일반적으로 단백질에 특이적으로 결합한다. 제제는 단백질에 특이적인 항체 또는 단백질에 결합하는 앱타머일 수 있다. 본원에 기술된 항체 또는 다른 제제는 단백질에 우선적인 또는 높은 친화도를 가지고 결합할 때 단백질에 "특이적으로 결합"하지만, 다른 단백질에 실질적으로 결합하지 않거나, 낮은 친화도만으로 결합하거나 결합하지 않는다. 예를 들어, 항체 또는 유사한 제제가 1×10-7 M 이하, 더욱 바람직하게는 5×10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 1×10-8 M 또는 더욱 바람직하게는 5×10-9 M 이하의 Kd를 가지고 결합할 때, 우선적인 또는 높은 친화도를 가지고 결합한다. 항체가 1×10-6 M 이상, 더욱 바람직하게는 1×10-5 M 이상, 더욱 바람직하게는 1×10-4 M 이상, 더욱 바람직하게는 1×10-3 M 이상, 심지어 더욱 바람직하게는 1×10-2 M 이상의 Kd를 가지고 결합할 때 낮은 친화도를 가지고 결합한다. 항체 또는 항체 구조물 및 올리고뉴클레오티드와 같은 화합물의 특이적 결합 능력을 결정하기 위한 경쟁적 결합 또는 면역 방사 분석을 위한 다양한 프로토콜이 본 기술 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, Maddox et al, J. Exp. Med. 158, 1211-1226, 1993 참조).
OSM 또는 OSMR 레벨을 평가하는 방법은 항원-포착 딥스틱(antigen-capture dipstick) 분석법 및 효소-결합 면역 흡착 분석법(Enzyme-linked Immunosorbant Assay, ELISA)을 포함한다. ELISA는 일반적으로 샌드위치 기술 또는 경쟁 기술을 사용하여 수행되며, 이는 분 기술 분야에 공지되어 있다. 본 발명은 또한 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 표면 탄성파(surface acoustic wave), 수정 미세 저울(quartz crystal microbalance), 미세열량계(microcalorimetry) 또는 전기화학적 임피던스 분광법(electrochemical impedance spectroscopy)을 기반으로 하는 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 직접 감지 기술에서 OSM 또는 OSMR에 대한 항체를 사용할 수 있다. 특정 OSM mAb는 생물학적 유체에서 OSM 레벨을 검출하기 위한 단클론 항체 기반 면역크로마토그래피 스트립 검사에 사용될 수 있다. 변형된 올리고뉴클레오티드 앱타머는 Somalogic Platform을 사용하는 다중 분석물 검출 시스템의 일부로 사용될 수 있다. OSMR 발현 수준은 예를 들어 유세포 분석 또는 환자 장 조직의 조직학적 절편에 대한 정량적 면역조직화학 분석에 의해 결정될 수 있다. qRT-PCR 및 차세대 시퀀싱을 포함하는 RNA 분석 방법에 의해 OSM 및 OSMR mRNA 레벨 모두를 정확하게 정량화할 수 있다.
항체
본 발명의 방법에서 사용되는 항체는 관련 단백질에 결합할 수 있는 전체 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 항체는 본 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 적절한 조건 하에서 포유류, 일반적으로 토끼 또는 마우스를 HBP로 면역시키고, 예를 들어 상기 포유 동물의 혈청으로부터 항체 분자를 분리함으로써 수득될 수 있다. 단클론 항체는 하이브리도마(hybridoma) 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.
일반적으로, 항체는 영장류, 인간, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 토끼, 양, 돼지, 말 또는 낙타 항체와 같은 포유류 항체이다. 항체는 낙타 항체 또는 상어 항체일 수 있다. 항체는 나노바디(단일 도메인 항체; sdAb)일 수 있다. 항체는 항체의 임의의 부류 또는 동형, 예를 들어 IgM일 수 있지만, 바람직하게는 IgG이다. 상기 방법에서 사용될 수 있는 전체 항체의 단편은 항원 결합 부위, Fab 또는 F(ab)2 단편 또는 ScFV를 포함한다. 전체 항체 또는 단편은 분리된 항체 또는 이의 단편일 수 있고 또는 다른 잔기와 결합되거나 복합체화될 수 있거나 또는 융합 단백질의 형태일 수 있다. 일 실시형태에서, 항체는 상이한 천연 항체, 예를 들어 인간화 항체로부터의 서열을 포함하는 키메라 항체이다.
약학적 조성물 및 투여 방법
본원에 기술된 치료 방법에서 사용하기 위한 제제는 약학적 조성물로 제제화될 수 있다. 이들 조성물은 치료적 활성 성분(들)에 부가하여, 본 기술 분야의 숙련자에게 공지된 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제, 완충제, 안정화제 또는 그 밖의 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 무독성이어야 하며 활성 성분의 효능을 방해해서는 안 된다. 약학적 담체 또는 희석제는 예를 들어 등장액일 수 있다.
담체 또는 기타 물질의 정확한 특성은 투여 경로, 예를 들어, 경구, 정맥내, 피부 또는 피하, 비강, 근육내 및 복강내 경로에 의존할 수 있다.. 적합한 조성물 및 투여 방법의 예는 Esseku and Adeyeye (2011) and Van den Mooter G. (2006)에서 제공된다. 예를 들어, 고형 경구 형태는 활성 물질과 함께 희석제, 예를 들어 락토오스, 덱스트로스, 사카로스, 셀룰로스, 옥수수 전분 또는 감자 전분; 윤활제, 예를 들어 실리카, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜; 결합제, 예를 들어 전분, 아라비아 고무, 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로스 또는 폴리비닐 피롤리돈; 분해제, 예를 들어 전분, 알긴산, 알긴산염 또는 전분 글리콜산 나트륨; 발포 혼합물; 염료; 감미료; 습윤제, 예를 들어 레시틴, 폴리솔베이트, 라우릴설페이트; 및 일반적으로 약학적 제제에 사용되는 비독성 및 약학적 비활성 물질을 포함할 수 있다. 이러한 약학적 제제는 공지된 방법, 예를 들어, 혼합, 과립화, 정제화, 당-코팅 또는 필름-코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
경구 제제는 예를 들어 약학 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 사카린 나트륨, 셀룰로스, 탄산 마그네슘 등과 같은 통상적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 서방성 제제 또는 분말의 형태를 취하며 10% 내지 95%, 바람직하게는 25% 내지 70%의 활성 성분을 함유한다. 약학적 조성물이 동결 건조된 경우, 동결 건조된 물질은 투여 전에 예를 들어 서스펜션으로 재구성될 수 있다. 재구성은 바람직하게는 완충액에서 수행된다.
개체에 경구 투여를 위한 캡슐, 정제 및 환제는 예를 들어 유드라짓(Eudragit) "S", 유드라짓 "L”, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스를 포함하는 장용 코팅을 구비할 수 있다.
경구 투여용 액상 분산액은 시럽, 유제 또는 현탁액일 수 있다. 시럽은 담체로서, 예를 들어 사카로스 또는 글리세린 및/또는 만니톨 및/또는 솔비톨과 함께 사카로스를 함유할 수 있다.
현탁액 및 유제는 담체로서, 예를 들어 천연 검, 한천, 알긴산 나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 또는 폴리비닐 알코올을 함유할 수 있다. 근육내 주사용 현탁액 또는 용액은 활성 물질과 함께 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어 멸균수, 올리브 오일, 에틸 올레에이트, 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜, 및 필요한 경우 적절한 양의 리도카인 염산염을 함유할 수 있다.
정맥내 투여 또는 주입용 용액은 담체로서, 예를 들어 멸균수를 함유랄 수 있고, 바람직하게 용액은 멸균, 수성, 등장성 생리 식염수 용액의 형태일 수 있다.
좌제의 경우, 전통적인 결합제 및 담체는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함할 수 있고; 이러한 좌제는 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1% 내지 2% 범위의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 제조될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 저해제는 네이키드(naked) 뉴클레오티드 서열일 수 있거나 양이온성 지질, 중합체 또는 표적 시스템과의 조합일 수 있다. 이들은 임의의 이용 가능한 기술에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 바늘 주사에 의해, 바람직하게는 피내, 피하 또는 근육내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 입자 매개 유전자 전달과 같은 전달 장치를 사용하여 피부를 통해 직접 전달될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 피부에 국소적으로 또는 점막 표면에, 예를 들어 비내, 구강 또는 직장내 투여에 의해 투여될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 구조물의 흡수는 예를 들어 형질감염제의 사용을 포함하는 몇 가지 공지된 형질감염 기술에 의해 강화될 수 있다. 이들 제제의 예는 양이온성 제제, 예를 들어. 인산 칼슘 및 DEAE-덱스트란 및 리포펙턴트(lipofectant), 예를 들어, 리포펙탐(lipofectam) 및 트랜스펙탐(transfectam)을 포함한다. 투여되는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 투여량은 변경될 수 있다.
투여는 일반적으로 "예방적 유효량"또는 "치료적 유효량"(경우에 따라 예방이 치료로 간주될 수 있지만)이며, 이는 개체에게 이익을 나타내는데 충분한, 예를 들어 질병 또는 질환의 발병을 예방 또는 지연시키거나, 하나 이상의 증상을 개선하거나, 차도를 유도하거나 연장하거나, 재발 또는 악화를 지연시키기 위한 유효량이다.
투여량은 다양한 파라미터, 즉 치료할 개체의 연령, 체중 및 상태; 투여 경로; 및 필요한 요법에 따라, 특히 사용된 물질에 따라 결정될 수 있다. 의사는 특정 개체에게 필요한 투여 경로와 투여량을 결정할 수 있다. 일반적인 1 일 투여량은 상기 언급된 조건에 따라 체중 1 kg 당 대략 0.1 내지 50 mg이다. 투여량은 단일 투여로서 제공되거나, 예를 들어 일정한 간격으로 다중 투여량으로 제공될 수 있으며, 예를 들어 매시간마다 2, 3 또는 4 투여량으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 저해제는 입자 매개 전달에 대해서는 1 pg g 내지 1 mg, 바람직하게는 1 μg 내지 10 μg의 범위로, 다른 경로에 대해서는 10 μg 내지 1 mg으로 투여된다.
상기한 기술 및 프로토콜의 예는 Remington 's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins에서 찾을 수 있다.
조성물은 단독으로 또는 다른 치료 조성물 또는 치료, 예를 들어 부가 요법과 함께 투여될 수 있다. 다른 치료 조성물 또는 치료는 예를 들어 본원에서 논의된 것들 중 하나 이상일 수 있고, 본 발명의 조성물 또는 치료와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
만성 장염에 대한 현재의 표준 치료법은 5-ASA(아미노살리실산(aminosalicylic acid)), 다양한 항생제, 코르티코스테로이드(예를 들어 부데소니드(budesonide), 덱사메타손(dexamethasone), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 프레드니솔론(prednisolone) 및 프레드니손(prednisone)), 아자티오프린(azathioprine), 6-메르캅토푸린(6-mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 시클로스포린(cyclosporine), 항-TNF 항체(예를 들어, 인플릭시맙(infliximab), 아달리무맙(adalimumab), 세르톨리주맙(certolizumab), 골리무맙(golimumab)), 항-α4β7 인테그린 항체(예를 들어, 베돌리주맙(vedolizumab))을 포함한다. OSM 및/또는 OSMR 또는 OSM 및/또는 OSMR의 길항제를 표적으로 하는 제제는 상기 제제 중 임의의 제제와 함께 사용될 수 있다. 임상 데이터는 항-TNF 치료와 비-생물학적 치료의 병용 치료를 받은 IBD 환자는 항-TNF 또는 비-생물학적 제제를 단독으로 받은 환자보다 높은 임상 반응률을 경험한다는 것을 시사한다(Colombel et al, 2010, N Engl J Med; 1383-95 and Panaccione et al, 2014, Gastroenterology; 392-400). 별개의 생물학적 치료들의 조합에 관한 데이터는 제한적이지만, OSM 및 TNF가 표적 세포에 상승 효과(예를 들어, OSM 및 TNF는 결장 기질 세포에 의해 IL-6 발현을 상승적으로 유도)를 발휘할 수 있다는 점에서 항-OSM/OSMR 제제와 항-TNF 치료를 병용하는 것이 유익할 수 있다고 믿을만한 과학적 근거가 있다. 대안적으로, 둘 이상의 표적 특이성(예를 들어, OSM 및 TNF 모두를 표적으로 하는 이중 특이성 항체)을 갖는 단일 제제 생물학적 치료가 사용될 수 있다. OSM-표적 치료제는 또한 다른 부류의 치료제, 예를 들어 소분자 또는 올리고뉴클레오티드 치료제와 조합하여 사용될 수 있다.
키트
본 발명은 개체에서 OSM 및/또는 OSMR 레벨을 측정하기 위한 수단(예를 들어, 시약) 및 본 발명의 방법에 따라 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 진단 키트를 더 제공한다. 키트는 또한 방법을 수행되는 개체에 관한 세부 사항을 포함할 수도 있다. 키트는 일반적으로 OSM 또는 OSMR에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 약제, 예를 들어, 항체를 함유한다. 키트는 그 밖의 실험실 또는 임상 파라미터의 측정 수단을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 C-반응성 단백질(CRP)을 측정하기 위한 수단을 포함할 수 있다.
키트는 방법을 수행할 수 있게 하는 하나 이상의 다른 시약 또는 기기를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 시약 또는 기기는 다음 중 하나 이상을 포함한다: 적합한 완충액(수용액), 시료에서 OSM 및/또는 OSMR을 분리하는 수단, 개체로부터 시료를 수득하는 수단(용기 또는 바늘을 포함하는 기기) 또는 정량 반응이 수행될 수 있는 웰을 포함하는 지지체를 포함할 수 있다.
기타 양태
따라서, 제 1 양태에서, 본 발명은 개체에서 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에 OSM 및/또는 OSMR의 길항제를 투여함으로써 개체에서 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 단계를 포함한다.
본 발명은,
- 개체에서 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 OSM 및/또는 OSMR의 길항제; 및
- 개체에서 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의 OSM 및/또는 OSMR의 길항제의 용도를 더 제공한다.
경우에 따라서, 개체는 아래에서 설명되는 방법에 따라 진단되거나 예측된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에서의 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 진단 또는 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에서 OSM 및/또는 OSMR을 측정함으로써 개체에서 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 진단 또는 예측하는 단계를 포함한다.
사이토카인 신호 전달 경로의 잠재적인 강도는 리간드 및 수용체 모두의 상대 빈도에 의해 결정된다. 그러므로, 경우에 따라서, 개체에서 OSM 및 OSMR 모두를 측정하고 OSM 지수(OSMi, 상대적 OSM 및 OSMR의 곱)를 결정하는 것이 유용하다.
본 발명자들은 OSMR이 질병 완화 기간 동안 고도로 발현되는 것을 입증하였다. 또한, 성공적인 항-TNFα 치료 후에 OSM이 억제된다. 이는 OSM 신호 전달이 질병 재발에 역할을 한다는 것을 시사한다. 그러므로, 경우에 따라서, 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 진단 또는 예측하는 방법은 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환에 차도가 있는 개체가 재발할 것인지 여부를 예측하는 방법이다.
경우에 따라서, 기준 샘플 또는 기준 레벨과 비교할 때, OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 증가한 레벨은 양성 진단, 음성 예후 및/또는 개체가 재발할 수 있음을 나타낸다. 그 밖의 경우, 기준 샘플 또는 기준 레벨과 비교할 때, OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 감소한 레벨은 음성 진단, 양성 예후 및/또는 개체가 재발하지 않을 것임을 나타낸다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에서 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(a) 상기 방법에 따라 개체에서 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 진단 또는 예측하는 단계; 및
(b) 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환의 치료에 유용한 제제를 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
경우에 따라서, 상기 제제는 OSM 및/또는 OSMR의 길항제이다. OSM 및/또는 OSMR 길항제는 항-OSM 또는 항-OSMR 항체, 또는 OSM 또는 OSMR 융합 단백질과 같은 OSM 또는 OSMR 활성 또는 발현의 길항제일 수 있다.
본 발명은 또한,
- 상기 방법에 따라 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환이 진단 또는 예측된 개체에서 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 제제;
- 상기 방법에 따라 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환이 진단 또는 예측된 개체에서 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 약제(medicament)의 제조에 있어서의 제제의 용도;
- 제품으로서, 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 가지고 있거나 또는 갖고 있는 것으로 의심되거나 또는 발병 위험에 처한 개체에서 OSM 및/또는 OSMR의 레벨을 측정하기 위한 수단; 및 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환의 치료용 제제를 포함하는 제품을 더 제공한다.
또 다른 양태는 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 가지고 있거나 또는 갖고 있는 것으로 의심되거나 또는 발병 위험에 처한 개체에서 OMS 및/또는 OMSR 레벨을 측정하기 위한 분석법을 제공하며, 상기 분석법은 개체의 생물학적 시료를 OSM 또는 OSMR에 결합하는 제제와 접촉시키는 단계, 제제와 OSM 또는 OSMR 간의 복합체 형성을 측정하는 단계, 선택적으로 OSMi를 계산하는 단계, 측정된 값 또는 OSMi 값을 기준 값과 비교하는 단계, 및 이에 따라 개체에서 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 진단 또는 예측하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태는,
(a) 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 가지고 있는 개체의 생물학적 시료 내의 OSM 및/또는 OSMR의 레벨을 정량화하기 위한 측정 모듈;
(b) 측정 모듈로부터 출력된 데이터 및 기준 및/또는 제어 데이터를 저장하도록 구성된 저장 모듈;
(c) 측정 모듈로부터 출력된 데이터의 값 및 기준 또는 제어 데이터를 계산하도록 구성된 계산 모듈; 및
(d) 출력 데이터의 값을 기반으로 건선 또는 Th17 매개 질병 또는 질환을 가지고 있는 개체에 대한 진단 또는 예후를 표시하도록 구성된 출력 모듈을 포함하는 시스템을 제공한다.
만성 장염 및/또는 IBD 및 TNFα 치료와 관련하여 위에서 논의된 모든 실시형태는 건선 또는 Th17-매개 질병 또는 질환에 관한 실시형태에 동등하게 적용된다. Th17 매개 질병 또는 질환은 예를 들어 IBD, 건선, 아토피성 피부염, 류마티스성 관절염, 소아 특발성 관절염, 강직성 척추염, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 자가면역 포도막염 또는 암일 수 있다.
실시예
방법
인간 집단에서의 유전자 발현 분석
모든 인간 조직 수집은 옥스포드 위장 질환 바이오뱅크(Oxford Gastrointestinal Illness Biobank, 참조 번호 11/YH/0020)의 윤리적 승인 하에 수행되었다. 본 발명자들은 존 래드클리프 병원(John Radcliffe Hospital, Oxford, UK)에서 치료를 받은 동의한 IBD 환자 또는 건강한 대조군(비-IBD 질환에 대한 내시경 검사를 받음)에서 장 점막 표본을 수집하였고, cDNA 합성 및 정량적 실시간 역전사 폴리머라아제 연쇄 반응(qPCR) 분석을 위해 RNA를 추출하였다. 보완적인 접근법으로, 본 발명자들은 유전자 발현 옴니버스(Gene Expression Omnibus, GEO) 웹 사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)를 통해 액세스한 공중이 이용 가능한 유전자 발현 연구로부터 얻은 데이터를 평가했다. 이러한 연구가 이용되는 경우, 관련 수탁 번호가 참조된다. 일부 수치에서, 본 발명자들은 OSM 지수(OSMi)를 측정 가능 것으로 포함하였다. 이는 데이터 세트에서 상대 OSM 및 OSMR 발현의 곱으로 계산된다. 사이토카인 신호 전달 경로의 잠재적인 강도는 리간드 및 수용체 모두의 상대 빈도에 의해 결정되므로(그리고 OSM 및 OSMR은 1: 1 화학양론으로 상호 작용하기 때문에), 상대적 OSMi는 이러한 수용체-리간드 쌍의 이론적 신호 가능성에 해당한다.
인간 단핵구 분석
건강한 사람 기증자로부터의 말초 혈액 단핵구를 표준 피콜-구배 원심분리(ficoll-gradient centrifugation) 및 CD14+ 세포에 대한 자기 활성화 세포 분류(magnetic activated cell sorting, MACS)를 사용하여 분리하였다. 이는 일상적으로 유세포 분석법을 기반으로 95% 이상의 단핵구 순도를 나타냈다. 단핵구를 10% 소태아 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 배양하였다. 특정 치료는 도면 캡션에 설명되어 있다. 단핵구 반응은 분비된 제품에 대한 qPCR(mRNA의 경우) 또는 효소-결합 면역 흡착 분석법(Enzyme-linked Immunosorbant Assay, ELISA)으로 평가하였다.
인간 CD4 + T 세포 분석
피콜-구배 원심분리를 사용하여 건강한 사람의 혈액으로부터 말초 혈액 백혈구를 분리하였다. 이후, 비-CD4+ T 세포를 MACS를 사용하여 고갈시키고 나머지 분획을 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS)를 사용하여 미접촉 CD4+CD45RA+CD45RO-CCR7+ 및 기억 CD4+CD45RA-CD45RO+ T 헬퍼 세포 분획으로 정제하였다. 항-CD3/항-CD28 비드를 사용하여 다양한 분극 사이토카인의 존재 하에 T 세포를 활성화시키고 5 내지 7 일 동안 팽창시켰다. 사용된 분극 사이토카인 조합은 다음과 같다: Th1(중성, 사이토카인 없음), Th1 (IFNγ + IL-12), Th2 (IL-4), Th9 (TGFβ + IL-4), Th22 (TNFα + IL-6), Treg (TGFβ), 및 Th17 (IL-1β + TGFβ + IL-6 + IL-23). 미접촉 T 세포 증식에IFNγ 및/또는 IL-4에 대한 중화 항체를 적절하게 사용하였다. Th17 조건에 대한 기본 배지는 IMDM + 5% 인간 혈청이었고; 다른 모든 조건의 배지는 RPMI + 5% 인간 혈청이었다. T 세포를 도면 캡션에 명시된 대로 qPCR 또는 유세포 분석법으로 분석하였다.
야생형 C57BL/6, C57BL/6.Rag -/-, Il23rgfp 리포터 마우스 및 C57BL/6.Osm -/- 마우스를 옥스포드 대학의 공인된 동물 시설에서 특정 병원체가 없는 조건 하에서 사육하고 유지시켰다. C57BL/6.Osm -/-은 처음부터 잭슨 실험실(Jackson Laboratory, 스톡 # 022338)에서 구입했다. 모든 절차는 1986 년 동물에 관한 과학적 실험에 관한 법률(UK Scientific Procedures Act)에 따라 수행되었다. 마우스는 헬리코박터 종 및 그 밖의 알려진 장 병원체에 대해 음성이었고, 연령과 성이 일치했으며, 처음 사용했을 때 6 주령 이상이었다. 수컷 및 암컷 마우스 모두를 모든 실험에서 대략 같은 비율로 사용하였다. 마우스를 다양한 치료로 무작위 배정하고 모든 치료를 동물의 주어진 케이지에서 나타났다.
마우스
야생형 C57BL/6, C57BL/6.Rag -/-, Il23rgfp 리포터 마우스 및 C57BL/6.Osm -/- 마우스를 옥스포드 대학의 공인된 동물 시설에서 특정 병원체가 없는 조건 하에서 사육하고 유지시켰다. C57BL/6.Osm -/-은 처음부터 잭슨 실험실(Jackson Laboratory, 스톡 # 022338)에서 구입했다. 모든 절차는 1986 년 동물의 과학적 실험에 관한 법률(UK Scientific Procedures Act)에 따라 수행되었다. 마우스는 헬리코박터 종 및 그 밖의 알려진 장 병원체에 대해 음성이었고, 연령과 성이 일치했으며, 처음 사용했을 때 6 주령 이상이었다. 수컷 및 암컷 마우스 모두를 모든 실험에서 대략 같은 비율로 사용하였다. 마우스를 다양한 치료로 무작위 배정하고 모든 치료를 동물의 주어진 케이지에서 나타났다.
헬리코박터 헤파티쿠스 ( Helicobacter hepaticus )/항- IL -10R 대장염 모델
이T-세포 의존성 대장염 모델은 IL-10 수용체(IL-10R)의 항체 차단과 함께 공생균인 헬리코박터 헤파티쿠스(Hh)를 이용한 마우스의 구강 감염을 포함하며, 이는 정상 면역 조절 기능을 손상시켜 대장염을 유발시킨다(Schiering and Krausgruber et al, Nature, 2014). 약리학적 또는 유전적 수단을 통한 TNF, IL-6 또는 IL-1β의 감쇠는 이 모델에서 미약한 치료 효능을 가지며(미공개 관찰 및 도 24), 이는 항-TNF 치료에 둔감한 고도의 치료-불응성 질병 모델을 만든다. 간단히 말해서, 6-12 주령의 C57BL/6 마우스에게 실험 0 일과 1 일째 22 G의 둥근 굵은 바늘로 전달되는 경구 섭식으로 1×108 콜로니 형성 단위(cfu)의 Hh를 투여한다. IL-10R 차단 항체는 0 일 및 7 일째 복강내(IP) 1 mg 주사로서 투여된다. 질병의 중증도의 정점에 해당하는 14 일째 마우스를 희생시킨다. 일부 실험에서, 추가적인 OSM이 질병의 진행 과정에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 평가하기 위해 마우스에게 재조합 쥐 OSM을 추가로 투여했다(7 일에서 13 일까지 매일 1 μg의 IP 주사(대략 0.04 mg/kg에 해당)). 이는 모의 치료로서 PBS 단독 주사를 받은 마우스와 비교되었다. 다른 실험에서, OSMR, gp130 및 쥐 IgG2A의 Fc 부위를 포함하는 재조합 쥐 OSM 수용체 융합 단백질(O-RFP)로 마우스를 처리하였다. O-RFP는 7 일부터 13 일까지 매 2 일마다 150 μg IP 주사(대략 6 mg/kg에 해당당)로 투여되었다. 대조군 처리로서, O-RFP와 동일한 조건 하에 제조된 몰 당량 투여량의 IgG2A-Fc로 동일한 스케줄에 따라 마우스를 처리하였다. 마지막으로, 동물당 600 μg의 총 매주 투여량의 항-TNFα 중화 항체로 일부 마우스를 처리하였다. 본 발명자들의 경험에서 볼 때, 이 용량은 다른 대장염의 Hh 유도 모델에서 질병을 완전히 중화시키기에 충분하다.
미생물군(microflora)은 전임상 연구의 결과에 중대한 영향을 미칠 수 있고 동물과 시설에 따라 다를 수 있기 때문에, 모든 실험에서 마우스를 다양한 치료 방법으로 무작위로 추출한 후 실험 기간 이전 및 실험 기간 동안 공동 수용했다. Osm 녹아웃 마우스를 포함하는 실험에서, 녹아웃 동물을 야생형 한배 새끼와 함께 공동 수용하고 이와 비교하였다. 마지막으로, 구별되는 미생물군, 동물 사료 및 풍부화(enrichment)를 포함하는 환경 간의 재현성을 입증하기 위해 치료 및 Osm 녹아웃 실험 모두는 두 개의 다른 동물 수용 시설에서 복제하였다.
실험적 대장염의 조직학적 평가
기재된 바와 같이(Izcue et al, Immunity, 2008) 질병의 중증도에 대해 마우스에 점수를 매겼다. 간단히 말해서, 근위부, 중간부 및 원위부 대장의 포르말린-고정 파라핀-포매된 단면은 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되고 네 가지 파라미터, 즉 상피 과증식(epithelial hyperplasia) 및 배상 세포 고갈(goblet cell depletion), 백혈구 침윤(leukocyte infiltration), 발병 영역, 및 증증 질병 활성의 특징에 대해 0 내지 3의 등급으로 나뉜다. 공통적인 중증도 특징은 음와 농양 형성, 점막하 백혈구 침윤 및 간질성 부종을 포함한다. 대장 절편당 합계 점수가 0에서 12 점이 되도록 각각의 기준별 점수가 추가된다. 세 개의 대장 영역으로부터의 데이터는 대장 염증에 합계 점수를 제공하도록 평균화된다. 채점은 맹검 방식으로 수행되었으며 독립적인 맹검 관찰자에 의해 확인되었다. 관찰자간 피어슨 상관 계수는 0.90에서 0.95 범위였다.
장 조직 준비 및 세포 분리
마우스 대장을 EDTA로 세척하여 상피를 제거하고 콜라게나아제 VIII로 분해하여 기재된 바와 같이(Uhlig et al, J. Immunol, 2006) 세포군을 유리시켰다. 30%/40%/70% 퍼콜-구배(percoll gradient)에서 원심분리하여 조직 분해물을 분리하였다. 30/40 인터페이스에서의 세포를 기질/상피 풍부 분획으로 수집된 반면, 40/70 인터페이스에서의 세포를 고유판 백혈구 풍부 분획으로 수집하고 도면 범례에 표시된 바와 같이 배양 또는 유세포 분석을 위해 준비하였다. 생체외 기질 배양을 위해, 기질 분획물을 기재된 바와 같이(Schiering and Krausgruber et al, Nature, 2014) 분주하고 배양하였다.
인간의 장 생검이나 수술적 절제를 우선 1 mM DTT(디티오트레이톨(dithiothreitol)) 용액으로 실온에서 15 분간 세척하여 점액을 제거하였다. 필요한 경우, 수술적 절제 표본은 먼저 기본 조직에서 점막을 분리하고 가능한 한 많은 잔여 점막하 물질을 제거하여 준비하였다. 절제 조직을 HBSS(행크스 평형 염액(Hank’s balanced salt solution)) 중의 0.75 mM EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)) 용액에서 각각 30 분 동안 상온에서 세 번 세척하여 상피 세포의 대부분을 제거하였다. 잔류 조직을 HBSS로 세척하여 잔류 EDTA를 제거하고, 작은 조각으로 절단하고, RPMI 배지 + 10% 소태아 혈청 중의 0.1 mg/ml 콜라게나아제 A 용액에서 밤새 분해하였다. 생검 준비를 위해, 소량의 1 mg/ml 콜라게나아제 A 용액을 사용하여 DTT 세척 직후 1 시간 동안 조직을 분해하였다. 모든 용액은 기재된 바와 같이(Owens et al, Front Immunol, 2013) 항생제를 포함한다. 기재된 바와 같이(Geremia et al, J Exp Med, 2011) 분해된 세포를 여과하고 퍼콜 구배로 분리하였다. 이전에 기재된 프로토콜에 따라(Owens et al, Front Immunol, 2013) 기질 세포를 분주하고 배양하였다.
통계
모든 통계는 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 다중 검정 교정(multiple testing correction)과 함께 모수적 분석 및 비-모수적 분석을 적절하게 사용하였으며, 모든 테스트에 대해 α=0.05로 도면 범례에 명시하였다. 달리 명시하지 않는 한, 오차 막대가 있는 모든 막대형 차트는 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
실시예 1: IBD 의 전임상 모델에서 강력한 질환 상관관계로서의 OSM 의 동정
도 1에 도시된 데이터는 TNF(예를 들어 인플릭시맙과 같은 성공적인 IBD 약물의 표적) 및 OSM을 포함하는 소수의 사이토카인만이 기계론적으로 구별되는 IBD 모델에서 지속적으로 과발현된다는 것을 입증한다. DSS 모델은 장 점막을 자극하고 인간 UC와 유사한 병리학을 생성하는 덱스트란 황산나트륨염의 경구 섭식을 포함한다. TNBS(2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid))은 화학 물질이 직장내 투여되어 인간 CD와 유사한 병리학을 유발하는 대체 화학적 대장염 모델이다. 마지막으로, Abcb1a -/- 마우스는 헬리코박터 빌리스(Helicobacter bilis)의 장내 정착시 가속되는 자발적인 대장염을 유발한다. 이 모델에서 생성된 대장염은 UC 및 CD와 유사한 특징을 지니고 있다(Maggio-Price et al, Am J Path, 2002). 중요하게도, 이 분석에 사용된 각각의 데이터 세트는 구별되는 유전적 배경을 갖는 동물에서 얻었으며 구별되는 분석 플랫폼을 포함한다. 따라서, OSM은 동물 품종 또는 분석 전략과는 무관하게 인간 IBD의 모든 주요 아형을 나타내는 작용 기전이 다른 대장염 모델에서 재현 가능하고 강력하게 증가한다.
실시예 2: Hh +α IL10R 대장염 모델에서의 OSM 및 OSMR 발현
도 2에 도시된 데이터는 Hh+αIL10R 모델에서 OSM 및 이의 수용체 OSMR 모두의 발현이 대장염 동물에서 mRNA 및 단백질 레벨(조직 및 대변에서 쉽게 검출 가능) 모두에서 증가한다는 것을 입증한다. OSM 발현은 IL-1β, IL-6 및 TNF의 발현과 밀접한 관련이 있는데, 이는 OSM이 공동 조절된 염증성 사이토카인의 핵심 그룹의 이전에 확인되지 않은 일원임을 시사한다. 도 3에 도시된 데이터는 이 모델에서 OSM 및 OSMR 발현의 유도가 전체적인 병리학적 중증도뿐만 아니라 병리학 진행의 동역학과 관련이 있다는 것을 입증한다. 따라서, OSM 및 OSMR의 발현은 이러한 환경에서 질병과 밀접하게 관련이 있다.
실시예 3: 인간 IBD 장 점막에서의 OSM 및 OSMR 발현
도 4에 도시된 데이터는 OSM, OSMR및 OSM 지수가 대다수의 IBD 환자에서 활성 질병 동안 장 점막에 고도 농축된다는 것을 입증한다. 이는 질병 활성의 내시경 및 조직학적 측정 모두를 근거하여 명확하다. 특히, OSM 및 OSMR 발현은 조직학적 질병의 중증도가 증가함에 따라 직접적인 상관 관계가 증가한다. 도 5는 OSM이 대장 점막 염증의 공지된 바이오마커인 S100A8 및 S100A9의 발현과 밀접한 상관 관계가 있음을 보여 주며, 이들은 함께 대변 단백질 바이오마커인 칼프로텍틴을 형성한다. 6은 OSM 및 OSMR 발현이 UC 및 CD 환자 모두에서 동등하다는 것을 입증한다. 또한, OSM은 아마도 IBD의 고전적인 사이토카인 패밀리 중 가장 일관되게 과발현된 멤버일 것이다. 마지막으로, OSM 및 OSMR 모두는 낭 염증이 수술의 흔하고 문제가 있는 합병증인 회장낭 항문 문합술(ileal pouch-anal anastomosis) 환자의 낭 조직에서 풍부해진다(도 7).
실시예 4: 독립적인 IBD 집단에서의 OSM 및 OSMR 발현
표 1은 IBD 환자 대 건강한 대조군의 장 점막 생검에서 OSM 및 OSMR 발현의 배수 변화와 유의성을 요약한 것이다. 전체적으로, 표 1은 UC, CD, 성인 및 소아 IBD 모두에 걸친 지리적으로 구별되는 5 개의 환자군의 데이터를 보여준다. 총 표본 크기는 건강한 대조군 118 명과 IBD 환자 370 명이다. 이들 데이터는 OSM 및 OSMR이 다양한 환자군에서 높은 재현도를 갖고 IBD 환자 장 점막에서 과발현됨을 입증한다.
Figure pct00001
실시예 5: OSM 및 OSMR 과 IBD 에서의 임상 특징의 상관 관계
도 8 및 도 9에 도시된 데이터는 OSM 및 OSMR이 환자의 성별, 진단시의 나이, 질병 지속 기간 또는 혈청 CRP(C-반응성 단백질) 및 말초 혈액 백혈구 수와 같은 전신 질환 바이오마커와 상관없이 IBD 환자의 점막에서 동등한 레벨로 발현된다는 것을 입증한다. 이 연구에서 환자에게 주어진 다양한 치료 부류 중 OSM 및 OSMR 발현은 (증가하는 스테로이드 사용 경향으로 인해) 수술적 개입에 대한 더 큰 필요성과 상당히 관련이 있었는데, 이는 OSM 경로의 활성화가 공격적인 치료-불응성 질병과 관련이 있다는 것을 시사한다(도 10). 이들 데이터는 함께 OSM 및 OSMR이 혈청 CRP와 같은 기존의 바이오마커보다 우월할 수 있는 조직 병리학의 마커임을 시사한다. 또한, OSM 및 OSMR 발현은 IBD 환자의 특정 하위 집단에만 국한되지 않는다.
실시예 6: OSM 경로는 인간 IBD 에서의 항- TNF α 치료에 대한 임상 반응과 관련이 있다
도 11, 도 12 및 도 13에 도시된 데이터는 장 점막에서의 OSM 및 OSMR의 높은 발현이 IBD에서 이상적 표준 생물학적 치료(인플릭시맙)에 대한 1차 무-반응성을 강력하게 예측한다는 것을 입증한다. 또한, OSM은 임상적 관심이 있는 다른 사이토카인보다 치료 실패의 더욱 강력한 예측 인자이며, 성공적인 항-TNFα 치료 후에 재현 가능하게 억제되는 유일한 사이토카인 중 하나이다. 특히, 도 14는 OSM 및 OSMR이 단기간의 인플릭시맙 반응과 관련이 있을 뿐만 아니라 최대 30 주까지의 시점에서 내구성 있는 반응의 예측 인자이기도 하며, 따라서 OSM, OSMR 및 OSM 지수는 현재의 요법, 특히 항-TNFα 치료의 치료 결과를 예측하기 위한 유용한 바이오마커일 수 있다는 것을 입증한다. 또한, OSM은 항-TNF 불응성 환자의 치료 표적의 역할을 할 수 있다.
실시예 7: OSM 은 IBD 에서 혼합 Th17 / Th1 사이토카인 표지와 공동으로 발현된다
정상이 아닌 Th1과 Th17 T 헬퍼 세포 활성은 IBD의 발병에 중요하다고 생각된다. 도 15 및 도 16의 데이터는 OSM 및 OSMR의 발현이 i) Th17 발달(Il6, IL1B, IL23)에 기여하고 또는 ii) Th1 및/또는 Th17 세포(IL17A , IFNG , CSF2 , IL22)에 의해 생성되는 사이토카인의 발현과 밀접한 관련이 있다는 것을 입증한다. 이는 다수의 집단에 걸쳐 그리고 IBD의 모든 아형에서 일관된다. 따라서, OSM은 인간 장에서 병원성 면역 반응으로 여겨지는 맥락에서 발현된다.
실시예 8: OSM 은 박테리아-자극된 인간 단핵구에 의해 Th17 - 분극 사이토카인과 공동으로 발현된다
단핵구를 포함한 항원 제시 세포는 미접촉 CD4+ T 세포의 활성화 및 분화 그리고 기억 CD4+ T 세포의 재-자극에 있어서 중요하다. 항원 제시의 맥락에서 이들이 발현하는 사이토카인은 분화 경로의 주요 결정 인자이며 따라서 헬퍼 T 세포의 작동자 기능이다. 도 17의 데이터는 OSM 발현이 병원성 및 공생 종 모두를 포함하는 인간 점막 표면에서 발견되는 다양한 속을 대표하는 다양한 박테리아 분자뿐만 아니라 다양한 박테리아 분자에 노출될 때 인간 단핵구에 의해 강력하게 유도된다는 것을 보여준다. 도 18은 OSM이 세균 감염 후 단핵구에서 Th17-분극 사이토카인인 IL-6, IL-1β 및 IL-23과 공동으로 발현된다는 것을 입증한다. 또한, OSM은 강력한 Th17 유도 능력을 갖는 인간 장에서 발견되는 항원 제시 세포 아형에 의해 고도로 발현된다. 종합해서, 이들 데이터는 OSM이 미생물 자극에 노출될 때 인간 항원 제시 세포에 의해 강하게 유도되는 Th17 유도 경로의 이전에 알려지지 않은 구성 요소로서 IBD 환자의 장 조직에서 높은 레벨로 발생한다고 여겨지는 과정에 연루된다는 것을 시사한다.
실시예 9: OSM 은 인간 기억 CD4 + T 세포에서 발현된다
도 19의 데이터는 OSM이 자극 후 CD4+ T 세포에 의해 mRNA 및 단백질 수준에서 발현된다는 것을 입증한다. 또한, 휴지기 CD4+ T 세포가 감지 가능한 OSMR을 발현하지 않지만, 이들은 활성화될 때 OSMR 발현을 유도한다. OSM 발현은 주로 기억(CD45RO+) 세포의 특징이다. 따라서 CD4+ T 세포는 사람에서 OSM의 공급원 이자 잠재적인 표적 세포이다.
실시예 10: OSM 은 인간 Th17 분화 및 증식을 향상시킨다
도 20의 데이터는 Th17-분극화된 CD4+ T 세포가 높은 레벨의 OSMR를 발현하고, OSM이 Th17 조건 하에서 활성화된 미접촉 CD4+ T 세포의 팽창을 향상 시킨다는 것을 보여준다. CFSE(카르복시플루오레신 숙신이미딜 에스테르(carboxyfluorescein succinimidyl ester))와 PI(프로피디움 요오드화물(propidium iodide)) 염색은 이것이 증식보다는 세포 생존의 증진으로 인한 것임을 시사한다(미도시). OSM은 Th17 세포에서 표지 Th2 사이토카인 IL-4뿐만 아니라 마스터 Th2 전사 인자 GATA3의 발현을 억제하고, 따라서 생성되는 Th17 표현형의 순도를 증가시킨다. 또한, OSM은 Th17 세포에서 IL-23 수용체의 발현을 증진시키고, 이는 IL-23 의존성 병원성 기능을 발달시키는 경향이 있다. 이들 데이터는 OSM이 인간에서 병원성 Th17 반응을 향상시키는데 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다.
실시예 11: OSM 은 생체 내에서 공격적인 대장염에 필요하다
도 21 및 도 22의 데이터는 OSM의 유전자 결실을 가진 쥐에서 Hh +αIL10R 대장염 프로토콜이 야생형 한배 새끼 대조군에 비해 실질적으로 약화된 질병을 유발한다는 것을 입증한다. 이는 조직학적 평가(상피/배상 세포 파괴 및 백혈구 침윤 포함)의 모든 주요 파라미터에 대해서는 분명하지만, 농양 형성, 점막하 염증 및 간질성 부종과 같은 심각한 질병 징후의 수준에서 특히 명확하다. 또한, OSM의 부재는 항-염증성 사이토카인 IL-10의 유도를 손상시키지 않으면 서, 장에서의 그 밖의 염증성 사이토카인, 특히 IL-6 및 IL-1β의 발현을 감소시킨다. 따라서, OSM은 IL-6와 같은 더욱 고전적인 전염증성 경로의 상류 요인인 것으로 보이지만 유익한 면역 조절 경로의 유도에는 필요하지 않다. 중요하게도, 다수의 림프계 및 말초 기관에 대한 상세한 검사는 Osm -/- 마우스가 정상 상태에서 명시적인 면역학적 표현형을 나타내지도 않고, 장 구조가 비정상적이지도 않음을 보였다(미공개, 미도시). 또한, Osm -/- 및 야생형 한배 새끼는 장에서 동등한 헬리코박터 헤파티쿠스의 정착을 보여주며, 이 대장염 모델에서 Osm 결실의 보호 효과는 변경된 세균 처리로 인한 것이 아님을 보여준다(미공개, 미도시).
실시예 12: 신규한 마우스 OSM 차단 시약인 O- RFP 의 중화 효능
도 23의 데이터는 시험관 내에서 마우스 OSM을 중화하기 위한 O-RFP의 능력을 입증한다(방법 및 도 23 설명 참조). 이 단백질은 상업적으로 이용 가능한 다클론 항-혈청과 비교할 때 우수한 중화 능력을 갖는다.
실시예 13: 치료적 OSM 차단은 생체 내에서 대장염을 약화시킨다
도 24의 데이터는 확립된 대장염을 가지고 있는 마우스(Hh +αIL10R 프로토콜의 7 일째 개시된 치료)에서 O-RFP를 사용한 OSM의 치료적 차단이 내시경 및 조직학적 기준 모두에 의해 결정되는 질병의 중증도를 감소시킨다는 것을 입증한다. 이러한 치료 효과는 TNF 차단의 치료 효과보다 우수하다. OSM 녹아웃 마우스로부터 얻은 결과와 일관되게(실시예 11 참조), 이들 실험에서 가장 명확한 OSM-의존 파라미터는 심각한 질병 특징의 징후였다. 또한, 5 명의 다른 인간 CD 환자의 장 점막 외식편 배양물에서 특이적인 단클론 항체를 사용하는 인간 OSM의 차단은 감소된 IL-1β 발현에 의해 입증된 바와 같이 조직 염증을 현저히 약화시킨다. 이러한 효과는 인플릭시맙의 효과와 유사하다. 이들 데이터는 함께 OSM이 IBD, 특히 항-TNF 치료에 내성이 있는 공격적 질병 표현형에 대해 잠재적으로 가치 있는 임상 표적임을 시사한다.
IBD에 대한 치료적 개입이라는 맥락에서 OSM을 표적으로 하는 것은 따라서 유효한 전략이다.
실시예 14: OSM 은 조혈 집단에 의해 광범위하게 발현되는 반면, 비-조혈 기질 세포는 장에서 주요 OSM -반응성 세포 유형이다
도 25의 데이터는 야생형 마우스에서, 장에서의 OSM 생산이 CD4+ T 세포 및 항원 제시 세포와 같은 다양한 백혈구 아형에 기인할 수 있음을 보여준다. 특히, OSMR의 가장 높은 발현 수준은 장내 기질 세포 및 내피 세포에서 관찰된다. 대조적으로, OSMR은 조혈 집단 및 상피 세포에서 훨씬 낮은 수준으로 발현된다. 도 26의 데이터는 인간 장내 세포군에서 비슷한 결과를 보여주는데, 유세포 분석에 의한 OSMR 염색은 기질 세포 및 더욱 적은 정도로는 내피 세포만을 포함하는 제한된 염색 패턴을 보인다. OSMR+ 기질 세포는 또한 면역학적으로 활동적인 "림프 조직과 같은" 기질 집단의 표지인 gp38 및 ICAM-1을 가지고 있다(Owens, Front Immunol, 2015). 이 기질 세포 아집단은 조직 내 내피 세포보다 현저히 수적으로 우세하기 때문에, 본 발명자들은 gp38+ICAM-1+ 기질 세포가 마우스와 인간의 장 모두에서 지배적인 OSM-반응성 세포 유형이라는 결론을 내린다. 예상대로, 인간 장 조직에서 OSM 단백질 발현에 대한 염색은 T 세포 및 항원 제시 세포를 포함하는 다양한 조혈 집단에 의한 생산을 보였다(미도시).
실시예 15: 장내 기질 세포는 OSM 에 고도로 반응을 보인다
도 27에 도시된 데이터는 그 밖의 사이토카인 수용체에 비하여, OSMR이 주요 인간 장내 기질 세포에 의해 높은 수준으로 발현된다는 것을 입증한다. 유사하게, OSMR의 이종이량체 파트너(gp130)는 매우 높게 발현된다. 대조적으로, OSMR 패밀리의 그 밖의 수용체는 IL-6 수용체 및 LIF 수용체와 같이 낮은 수준으로 발현된다. 높은 OSMR/gp130 발현과 일관되게, OSM은 장내 기질 세포에서 다양한 경로를 통해 빠르고 강력한 신호 전달 반응을 자극하지만, IL-6에 대한 반응은 훨씬 낮다. 따라서 OSM은 장내 기질 세포 생물학과 관련하여 이의 패밀리 중 중요한 멤버인 것으로 보인다.
실시예 16: 장내 기질 세포 및 내피 세포는 생체 내에서 OSM 에 의해 조절된다
도 28의 데이터는 i) 장내 기질 세포 및 내피 세포가 활성화되어(ICAM-1 표면 발현을 기반으로 함), 쥐의 대장염 동안 증가한 증식을 보이고; ii) OSM은 Hh +αIL10R 대장염의 과정 동안 전신적으로 투여될 때 이들의 활성 및 증식을 촉진시킨다는 것을 보여준다. 전신 OSM 치료는 악화된 백혈구 모집 및 악화된 조직학적 질병의 중증도를 특징으로 하는 강력한 대장염 표현형을 생성한다(미도시). 마우스가 Hh +αIL10R 대장염에 노출될 때, O-RFP를 사용한 OSM 차단은 내피 세포와 gp38+ICAM-1+ 기질 세포 모두의 표면에서 ICAM-1의 축적을 상당히 감소시킨다. 유사한 결과가 OSM 녹아웃 마우스를 사용하여 관찰된다(미도시). 따라서, OSM은 생체 내에서 기질/내피 집단의 염증성 활성화 상태를 조절하고, OSM이 대장염의 중증도를 촉진시키는 중요한 메커니즘일 수 있다.
실시예 17: OSM 은 TNF 와의 상승 작용으로 마우스 내장 기질 세포에서 사이토카인 및 케모카인 발현을 활성화시킨다
도 29의 데이터는 생체 외에서 배양된 마우스의 대장 기질 세포가 OSM에 반응하고 OSM 자극에 반응하여 여러 가지 관련된 염증 인자를 발현한다는 것을 입증한다. 특히, 세포가 OSM 및 TNF와 공동 자극될 때 몇몇 반응 유전자가 매우 높은 수준으로 유도되는데, 이는 OSM 및 TNF가 장에서 기능성 전염증성 축을 구성한다는 것을 시사한다. 장내 기질 세포는 OSM에 매우 민감하지만, OSM의 가장 가까운 동족체인 IL-6 및 LIF에 크게 반응하지 않는다.
실시예 18: 인간 장내 기질 세포의 OSM 자극은 임상적으로 관련된 염증성 표지의 활성화를 유발한다
도 30 내지 도 33은 IBD 환자의 대규모 집단에서 OSM이 별개의 사이토카인 및 케모카인 군과 밀접한 상관 관계가 있음을 입증한다(도 30). 이 유전자 표지의 풍부화는 일반적으로 심부 장 궤양과 같은 중증 질병의 특징을 지닌 환자를 나타내며 인플릭시맙에 불응성인 환자에서 풍부해진다. T 세포 및 골수 세포 모집 및 유지와 관련된 다양한 생물학적 기능을 수행하는 표지 내의 여러 유전자는 장내 기질 세포에서 다양한 동역학을 통해 OSM에 의해 직접 조절된다 (도 31). 마우스 기질 세포에서와 마찬가지로, 본 발명자들은 특히 Th1 세포 모집(CXCL9/10/11) 을 촉진하는 케모카인과 관련하여 OSM 및 TNF 간의 기능적 상승 작용의 명확한 증거를 관찰했다(도 32￢). 본 발명자들은 OSM 및 IL-1β 간의 유사한 상승 작용을 관찰했다(도 33). 특히, 장내 기질 세포에 대한 OSM의 영향은 LIFR 경로에 의해 매개되지 않는데, 이는 gp130-OSMR 이종이량체가 장내 기질 세포에서 적절한 OSM 수용체 복합체임을 나타낸다(도 31B). 도 34에 도시된 데이터는 몇몇 기증자로부터의 1차 장내 기질 배양물을 사용하여 OSM이 임상 발현 표지에서 발견되는 몇몇 유전자의 발현을 직접적으로 조절하는 반면, IL-6은 대체로 훨씬 약한 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 종합해서, 이들 데이터는 장내 조직에서 증가된 백혈구 침윤 및 보유 및 지연된 염증 해소라는 가능성 있는 결과로 인해 장에서 OSM/OSMR 축의 중요한 측면은 증가된 케모카인 및 사이토카인 생산을 포함하는 염증성 기질 활성화를 유지하거나 증폭시킬 수 있는 이의 가능성이라는 것을 주장한다.
OSMR은 다양한 수준에서 여러 세포 유형에 의해 발현되며 따라서 OSM은 다면 발현 효과를 발휘한다. 예를 들어, OSMR은 장내에 존재하는 세포를 포함하는 내피 세포 및 간엽 기질 세포에 의해 건강한 상태에서 고도로 발현된다. OSMR 레벨은 또한 이러한 세포 유형의 염증 동안 증가할 수 있다. 이러한 세포 유형의 OSM 자극은 ICAM-1과 같은 백혈구 부착 수용체의 발현/활성화, 증가된 증식 및 IL-6 및 CCL2와 같은 전염증성 사이토카인 또는 케모카인의 발현을 포함하는 다양한 반응을 유발한다. 기질 집단의 무질서한 활성화 및 수치적 증식은 병원성 섬유증의 중요한 측면이며, OSM-OSMR 신호 전달은 따라서 크론병에서 관찰되는 것과 같은 손상된 섬유화 반응을 촉진할 수 있다. 유사하게, 이들 세포 유형에서 사이토카인/케모카인 생산, 증식, 및 접착 수용체 발현을 촉진시키는 이의 능력을 통해, OSM은 조직 혈관 형성, 백혈구의 모집 및 유지 및 국소 염증 과정을 향상시킬 수 있다. 또한 직접 또는 간접적으로 OSM에 의한 상피 세포 증식의 증진은 만성 장염과 관련된 심각한 이상 반응인 이형성증(dysplasia) 및 종양 형성(neoplasia)의 개시를 촉진시킬 수 있다.
조혈 세포 유형은 일반적으로 정상 상태 조건에서 높은 레벨의 OSMR을 발현하지 않는다. 그러나 OSMR 발현은 세포가 적절한 자극에 노출될 때 이러한 세포 유형에서 유도할 수 있다. T 세포의 경우, OSMR 발현은 IL-6와 같은 적절한 분극 사이토카인과 함께 T 세포 수용체(TCR)를 통한 활성화를 필요로 한다. IL-6는 IBD, 다발성 경화증, 관절염, 건선 및 암을 포함하는 다양한 장애에서 병원성 염증 반응을 촉진시키는 것으로 여겨지는 염증성 Th17 CD4+ T 세포의 발달에 중요하다. Th17 분극 조건 하에서 활성화될 때, CD4+ T 세포는 OSM의 존재 하에서 더욱 효율적으로 증식하고(숫자 증가), Th2 세포의 생성물인 사이토카인 IL-4와 같은 대안적인 분극 상태와 관련된 유전자를 더욱 낮은 레벨로 발현한다. 염증이 있는 사람의 장에서, OSM은 IL-6 및 IL-1β를 포함하는, Th17 발달을 촉진시키는 것으로 알려진 사이토카인과 함께 발현된다. 흥미롭게도, T 세포는 활성화될 때 높은 레벨의 OSM을 발현하지만, 자극된 항원 제시 세포와의 상호 작용의 맥락에서 발생하는 것처럼 외인성 OSM의 공급원에 노출됨으로써 더욱 강화된다. OSM은 따라서 Th17 유도 면역 반응의 증가를 통해 병원성 염증에 기여할 수 있다.
T 세포와 마찬가지로, 단핵구와 같은 단핵 식세포는 휴지지 상태에서 낮은 레벨의 OSMR 발현을 갖지만, 전체 박테리아 또는 정제 박테리아 분자와 같은 활성화 자극에 노출될 경우 OSMR을 10 배에서 100 배까지 증가시킬 수 있다. 이들은 또한 활성화될 때 높은 레벨의 OSM을 생성한다. 장내 조직으로부터의 관찰과 일관되게, 미생물에 의해 자극된 단핵구에 의한 OSM 발현은 IL-6, IL-1β 및 IL-23과 같은 Th17-분극 사이토카인의 발현과 높은 상관 관계가 있다. 또한 OSM으로 박테리아 자극 단핵구를 자극하면 IL-23과 같은 염증성 사이토카인의 발현을 증가시킬 수 있다.
따라서, 종합적으로, 인간 조직, 시험관내 실험 및 전임상 생체내 모델의 분석을 기반으로 한 몇 가지 증거는 OSM이, 특히 IBD 및 다른 위장 장애와 같이 미생물 자극이 두드러지는 점막 표면의 맥락에서, 병원성 염증을 촉진시키기 위해 광범위하게 작용할 수 있다는 개념을 지지한다. 이 연구에서 사용된 일차 생체내 대장염 모델(Hh +αIL10R)은 TNF 차단(및 IL-6 및 IL-1β의 차단)에 불응성이기 때문에, OSM은 현재 승인된 생물학적 치료에 실패한 환자에 대해 특히 가치 있는 임상 표적이 될 수 있다.
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Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 145 150 155 160 Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro 165 170 175 Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 180 185 190 Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 195 200 205 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly 210 215 220 Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 225 230 <210> 3 <211> 1869 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gtcaccccca gcgggcgcgg gccggagcac gggcacccag catgggggta ctgctcacac 60 agaggacgct gctcagtctg gtccttgcac tcctgtttcc aagcatggcg agcatggcgg 120 ctataggcag ctgctcgaaa gagtaccgcg tgctccttgg ccagctccag aagcagacag 180 atctcatgca ggacaccagc agactcctgg acccctatat acgtatccaa ggcctggatg 240 ttcctaaact gagagagcac tgcagggagc gccccggggc cttccccagt gaggagaccc 300 tgagggggct gggcaggcgg ggcttcctgc agaccctcaa tgccacactg ggctgcgtcc 360 tgcacagact ggccgactta gagcagcgcc tccccaaggc ccaggatttg gagaggtctg 420 ggctgaacat cgaggacttg gagaagctgc agatggcgag 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tgcctgccgt cagcatggtg 5100 gaaatggctc tgcctatgct catgcttctg gtgcccaatg ccttgcactg tgccattcaa 5160 cactatgaag agaaacaagt agccacacct caaaataatg tggctgtcaa caactggcct 5220 aaataaacct acacaaacca gtacttgcct tttgctggaa acattgatta tgtgctcctc 5280 acgtagtaga aagcggtatc ctgattagtc taacagttgt gttagacttt agggccagta 5340 ttgtcagcat ttatttattt atgtaccttt gttatgatgg gatatttttc atttgaaact 5400 tgttcataaa aatgtcaatg acattgatga ctgatttgta catatttttc atatagtttt 5460 gtttaaaaaa taattcacgc aaaatcttga agtcattttt gctattgaaa taaaccttaa 5520 ttaaaatatt tcatcatcaa aaaaaaaaaa aaaaaa 5556 <210> 6 <211> 979 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Leu Phe Ala Val Phe Gln Thr Thr Phe Phe Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Thr Tyr Gln Ser Glu Val Leu Ala Glu Arg Leu Pro Leu 20 25 30 Thr Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Thr Asn Ser Thr Arg Gln Ser Leu 35 40 45 His Leu Gln Trp Thr Val His Asn Leu Pro Tyr His Gln Glu Leu Lys 50 55 60 Met Val Phe Gln Ile Gln Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser Asn Val Ile 65 70 75 80 Trp Val Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Trp Asn Gln Val Leu His 85 90 95 Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr His Phe Val 100 105 110 Arg Ile Lys Ser Leu Val Asp Asp Ala Lys Phe Pro Glu Pro Asn Phe 115 120 125 Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gln Asp Ser Thr 130 135 140 Gly Gln Asp Ile Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu Val Glu Glu 145 150 155 160 Gly Thr Asn Val Thr Ile Cys Tyr Val Ser Arg Asn Ile Gln Asn Asn 165 170 175 Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Lys Gln Ile His Gly Glu Gln Leu Asp 180 185 190 Pro His Val Thr Ala Phe Asn Leu Asn Ser Val Pro Phe Ile Arg Asn 195 200 205 Lys Gly Thr Asn Ile Tyr Cys Glu Ala Ser Gln Gly Asn Val Ser Glu 210 215 220 Gly Met Lys Gly Ile Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu Glu Glu Pro 225 230 235 240 Lys Asp Phe Ser Cys Glu Thr Glu Asp Phe Lys Thr Leu His Cys Thr 245 250 255 Trp Asp Pro Gly Thr Asp Thr Ala Leu Gly Trp Ser Lys Gln Pro Ser 260 265 270 Gln Ser Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Phe Ser Gly Glu Lys Lys Leu Cys 275 280 285 Thr His Lys Asn Trp Cys Asn Trp Gln Ile Thr Gln Asp Ser Gln Glu 290 295 300 Thr Tyr Asn Phe Thr Leu Ile Ala Glu Asn Tyr Leu Arg Lys Arg Ser 305 310 315 320 Val Asn Ile Leu Phe Asn Leu Thr His Arg Val Tyr Leu Met Asn Pro 325 330 335 Phe Ser Val Asn Phe Glu Asn Val Asn Ala Thr Asn Ala Ile Met Thr 340 345 350 Trp Lys Val His Ser Ile Arg Asn Asn Phe Thr Tyr Leu Cys Gln Ile 355 360 365 Glu Leu His Gly Glu Gly Lys Met Met Gln Tyr Asn Val Ser Ile Lys 370 375 380 Val Asn Gly Glu Tyr Phe Leu Ser Glu Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr 385 390 395 400 Met Ala Arg Val Arg Cys Ala Asp Ala Ser His Phe Trp Lys Trp Ser 405 410 415 Glu Trp Ser Gly Gln Asn Phe Thr Thr Leu Glu Ala Ala Pro Ser Glu 420 425 430 Ala Pro Asp Val Trp Arg Ile Val Ser Leu Glu Pro Gly Asn His Thr 435 440 445 Val Thr Leu Phe Trp Lys Pro Leu Ser Lys Leu His Ala Asn Gly Lys 450 455 460 Ile Leu Phe Tyr Asn Val Val Val Glu Asn Leu Asp Lys Pro Ser Ser 465 470 475 480 Ser Glu Leu His Ser Ile Pro Ala Pro Ala Asn Ser Thr Lys Leu Ile 485 490 495 Leu Asp Arg Cys Ser Tyr Gln Ile Cys Val Ile Ala Asn Asn Ser Val 500 505 510 Gly Ala Ser Pro Ala Ser Val Ile Val Ile Ser Ala Asp Pro Glu Asn 515 520 525 Lys Glu Val Glu Glu Glu Arg Ile Ala Gly Thr Glu Gly Gly Phe Ser 530 535 540 Leu Ser Trp Lys Pro Gln Pro Gly Asp Val Ile Gly Tyr Val Val Asp 545 550 555 560 Trp Cys Asp His Thr Gln Asp Val Leu Gly Asp Phe Gln Trp Lys Asn 565 570 575 Val Gly Pro Asn Thr Thr Ser Thr Val Ile Ser Thr Asp Ala Phe Arg 580 585 590 Pro Gly Val Arg Tyr Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Leu Ser Thr Lys Arg 595 600 605 Ile Ala Cys Leu Leu Glu Lys Lys Thr Gly Tyr Ser Gln Glu Leu Ala 610 615 620 Pro Ser Asp Asn Pro His Val Leu Val Asp Thr Leu Thr Ser His Ser 625 630 635 640 Phe Thr Leu Ser Trp Lys Asp Tyr Ser Thr Glu Ser Gln Pro Gly Phe 645 650 655 Ile Gln Gly Tyr His Val Tyr Leu Lys Ser Lys Ala Arg Gln Cys His 660 665 670 Pro Arg Phe Glu Lys Ala Val Leu Ser Asp Gly Ser Glu Cys Cys Lys 675 680 685 Tyr Lys Ile Asp Asn Pro Glu Glu Lys Ala Leu Ile Val Asp Asn Leu 690 695 700 Lys Pro Glu Ser Phe Tyr Glu Phe Phe Ile Thr Pro Phe Thr Ser Ala 705 710 715 720 Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr Pro Asp Glu 725 730 735 His Ser Ser Met Leu Ile His Ile Leu Leu Pro Met Val Phe Cys Val 740 745 750 Leu Leu Ile Met Val Met Cys Tyr Leu Lys Ser Gln Trp Ile Lys Glu 755 760 765 Thr Cys Tyr Pro Asp Ile Pro Asp Pro Tyr Lys Ser Ser Ile Leu Ser 770 775 780 Leu Ile Lys Phe Lys Glu Asn Pro His Leu Ile Ile Met Asn Val Ser 785 790 795 800 Asp Cys Ile Pro Asp Ala Ile Glu Val Val Ser Lys Pro Glu Gly Thr 805 810 815 Lys Ile Gln Phe Leu Gly Thr Arg Lys Ser Leu Thr Glu Thr Glu Leu 820 825 830 Thr Lys Pro Asn Tyr Leu Tyr Leu Leu Pro Thr Glu Lys Asn His Ser 835 840 845 Gly Pro Gly Pro Cys Ile Cys Phe Glu Asn Leu Thr Tyr Asn Gln Ala 850 855 860 Ala Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly His Val Pro Val Ser Pro Lys Ala 865 870 875 880 Pro Ser Met Leu Gly Leu Met Thr Ser Pro Glu Asn Val Leu Lys Ala 885 890 895 Leu Glu Lys Asn Tyr Met Asn Ser Leu Gly Glu Ile Pro Ala Gly Glu 900 905 910 Thr Ser Leu Asn Tyr Val Ser Gln Leu Ala Ser Pro Met Phe Gly Asp 915 920 925 Lys Asp Ser Leu Pro Thr Asn Pro Val Glu Ala Pro His Cys Ser Glu 930 935 940 Tyr Lys Met Gln Met Ala Val Ser Leu Arg Leu Ala Leu Pro Pro Pro 945 950 955 960 Thr Glu Asn Ser Ser Leu Ser Ser Ile Thr Leu Leu Asp Pro Gly Glu 965 970 975 His Tyr Cys

Claims (40)

  1. 개체에서 만성 장염 및/또는 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 상기 방법은 개체에 온코스타틴-M(Oncostatin-M, OSM) 및/또는 OSM 수용체-β(OSMR)의 길항제를 투여함으로써 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    길항제는 Th17 CD4+ T 세포 또는 Th17 경로의 발달을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 진단 또는 예측하는 방법에 있어서, 상기 방법은 개체에서 OSM 및/또는 OSMR을 측정함으로써 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 진단하고 예측하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    개체에서 OSM 및 OSMR을 측정하는 단계, OSM 및 OSMR 레벨을 기준 OSM 및 OSMR 레벨 또는 기준 샘플의 OSM 및 OSMR 레벨과 비교하는 단계, 및 OSM 지수(OSMi)를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 방법은 만성 장염 및/또는 IBD에 차도가 있는 개체가 재발할 것인지 여부를 예측하는 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    기준 샘플 또는 기준 레벨(들)과 비교할 때 또는 이를 이용하여 계산된OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 증가한 레벨은 양성 진단, 음성 예후 및/또는 개체가 재발할 수 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    기준 샘플 또는 기준 레벨(들)과 비교할 때 또는 이를 이용하여 계산된OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 감소한 레벨은 음성 진단, 양성 예후 및/또는 개체가 재발하지 않을 것임을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    개체는 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 진단 또는 예측된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
    (a) 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 진단 또는 예측하는 단계; 및
    (b) 만성 장염 및/또는 IBD의 치료에 유용한 제제(agent)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    제제는 OSM 및/또는 OSMR의 길항제인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항, 제 8 항 및 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    길항제는 OSM 또는 OSMR 활성 또는 발현의 길항제인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    길항제는 항-OSM 또는 항-OSMR 항체, 또는 OSM 또는 OSMR 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제품으로서,
    (i) 만성 장염 및/또는 IBD를 가지고 있거나 또는 갖고 있는 것으로 의심되거나 또는 발병 위험에 처한 개체에서 OSM 및/또는 OSMR의 레벨을 측정하기 위한 수단; 및
    (ii) 만성 장염 및/또는 IBD의 치료용 제제를 포함하는 제품.
  14. 개체가 항-종양 괴사 인자-α(anti-tumour necrosis factor, anti-TNFα) 치료에 반응할 것인지 여부를 예측하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 개체에서 OSM 및/또는 OSMR을 측정함으로써 개체가 항-TNFα 치료에 반응할 것인지 예측하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    항-TNFα 치료는 항-TNFα 항체를 이용한 치료인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    항-TNFα 항체는 인플릭시맙(infliximab), 아달리무맙(adalimumab), 세르톨리주맙(certolizumab) 또는 골리무맙(golimumab)인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    기준 샘플 또는 기준 레벨(들)과 비교할 때 또는 이를 이용하여 계산된OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 감소한 레벨은 개체가 항-TNFα 치료에 반응할 것임을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    개체의 치료를 위해 항-TNFα 치료를 선택하거나 추천하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    항-TNFα 치료는 개체에 대한 1차 치료 방법으로서 선택되거나 추천되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    개체에 항-TNFα 치료를 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    기준 샘플 또는 기준 레벨(들)과 비교할 때 또는 이를 이용하여 계산된OSM, OSMR 및/또는 OSMi의 증가한 레벨은 개체가 항-TNFα 치료에 반응하지 않을 것임을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20 항에 있어서,
    개체의 치료를 위해 항-TNFα 치료 이외의 치료를 선택하거나 추천하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21 항에 있어서,
    개체에 항-TNFα 치료 이외의 치료를 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서,
    항-TNFα 치료 이외의 치료는 항-염증제의 투여인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서,
    항-염증제는 코르티코스테로이드(corticosteroid)인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 개체에서 TNFα 매개 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 상기 방법은 개체에 TNFα 길항제를 투여함으로써 TNFα 매개 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 단계를 포함하고, 상기 방법에서 개체는 제 13 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 TNFα 길항제에 반응한 것으로 예측된 것을 특징으로 하는 방법.
  27. TNFα 매개 질환, 만성 장염 및/또는 IBD를 가지고 있거나 또는 갖고 있는 것으로 의심되거나 또는 발병 위험에 처한 개체에서 OMS 및/또는 OMSR의 레벨을 측정하기 위한 분석법에 있어서, 상기 분석법은 개체의 생물학적 시료를 OSM 또는 OSMR에 결합하는 제제와 접촉시키는 단계, 제제와 OSM 또는 OSMR 간의 복합체 형성(complex formation)을 측정하는 단계, 선택적으로 OSMi를 계산하는 단계, 측정된 값 또는 OSMi 값을 기준 값과 비교하는 단계, 및 이에 따라 TNFα 매개 질환을 가지고 있는 개체가 항-TNFα 치료에 반응할 것인지 여부를 예측하거나, 또는 개체에서 만성 장염 및/또는 IBD를 진단 또는 예측하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석법.
  28. 시스템으로서,
    (a) TNFα 매개 질환, 만성 장염 및/또는 IBD를 가지고 있는 개체의 생물학적 시료 내의 OSM 및/또는 OSMR의 레벨을 정량화하기 위한 측정 모듈;
    (b) 측정 모듈로부터 출력된 데이터 및 기준 및/또는 제어 데이터를 저장하도록 구성된 저장 모듈;
    (c) 측정 모듈로부터 출력된 데이터의 값 및 기준 또는 제어 데이터를 계산하도록 구성된 계산 모듈; 및
    (d) 출력 데이터의 값을 기반으로, TNFα 매개 질환을 가지고 있는 개체가 항-TNFα 치료에 반응할 것인지 여부의 예측, 또는 개체의 치료를 위한 추천된 치료, 또는 만성 장염 및/또는 IBD를 가지고 있는 개체에 대한 진단 또는 예후를 표시하도록 구성된 출력 모듈을 포함하는 시스템.
  29. 제 2 항 내지 제 6 항 및 제 13 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 개체의 생물학적 시료 상에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 26 항, 제 27 항, 또는 제 28 항에 있어서,
    생물학적 시료는 혈액 샘플, 혈청 샘플, 대변 샘플, 장 생검, 또는 수술적 절제 샘플인 것을 특징으로 하는 분석법, 시스템, 또는 방법.
  31. 제 29 항에 있어서,
    생물학적 시료는 혈청 샘플인 것을 특징으로 하는 분석법, 시스템, 또는 방법.
  32. 제 2 항 내지 제 6 항, 제 13 항 내지 제 24 항 및 제 28 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 사용하기 위한 테스트 키트에 있어서, 상기 테스트 키트는 개체에서 OSM 및/또는 OSMR의 레벨을 결정하기 위한 수단 및 상기 방법에서의 사용을 위한 설명서를 포함하는 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
  33. 제 13 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체는 만성 장염, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 방법, 분석법, 시스템 또는 테스트 키트.
  34. 제 32 항에 있어서,
    자가면역 질환 또는 염증성 질환은 IBD인 것을 특징으로 하는 방법, 분석법, 시스템 또는 테스트 키트.
  35. 제 1 항 내지 제 12 항, 제 26 항 내지 제 31 항 및 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    IBD는 대장암과 관련되는 것을 특징으로 하는 방법, 제품, 분석법, 시스템 또는 테스트 키트
  36. 제 1 항 내지 제 12 항, 제 26 항 내지 제 31 항 및 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    IBD는 크론병(Crohn's disease, CD) 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis, UC)인 것을 특징으로 하는 방법, 제품, 분석법, 시스템 또는 테스트 키트
  37. 제 35 항에 있어서,
    CD는 결장 CD 또는 회장 CD인 것을 특징으로 하는 방법, 제품, 분석법, 시스템 또는 테스트 키트
  38. 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체는 포유 동물인 것을 특징으로 하는 방법, 제품, 분석법, 시스템 또는 테스트 키트
  39. 제 37 항에 있어서,
    포유 동물은 인간인 것을 특징으로 하는 방법, 제품, 분석법, 시스템 또는 테스트 키트
  40. 만성 장염 및/또는 IBD를 가진 개체가 수술을 필요로 할 가능성을 결정하는 방법에 있어서, 상기 방법은 개체에서 OSM 및/또는 OSMR을 측정함으로써 개체가 수술을 필요로 할 가능성을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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