ES2445892T3 - Biomarcadores para el tratamiento anti-TNF en colitis ulcerosa y trastornos relacionados - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para predecir la idoneidad de tratamiento con terapia anti-TNFα para un trastorno relacionado mediado por TNFα en un sujeto, que comprende: a) preparar una muestra de ácidos nucleicos de un espécimen obtenido del sujeto; y b) ensayar dicha muestra con un panel de segmentos de ácidos nucleicos marcados que se hibridan con BCL6 (acc. de GenBank nº AW264036; SEC ID Nº:118) y tx82a04.x1 (acc. de GenBank nº AI689210; SEC ID Nº:123), en el que la regulación por disminución de dichos genes se correlaciona con eficacia terapéutica para el tratamiento de un trastorno inflamatorio gastrointestinal.

Description

Biomarcadores para el tratamiento anti-TNF en colitis ulcerosa y trastornos relacionados

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a la identificación de perfiles de expresión y los ácidos nucleicos indicativos de trastornos mediados por TNF tales como colitis ulcerosa, y al uso de tales perfiles de expresión y ácidos nucleicos en el diagnóstico de colitis ulcerosa y enfermedades relacionadas. La invención se refiere además a procedimientos para identificar, usar y probar agentes y/o dianas candidatos que modulan colitis ulcerosa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El tratamiento de colitis ulcerosa con agentes biológicos presenta varios retos. El determinar qué población de pacientes a estudiar, predecir qué sujetos responderán a un tratamiento y qué sujetos perderán sensibilidad tras el tratamiento son cuestiones que tienen un impacto significativo en el tratamiento y el diseño del estudio clínico. Los biomarcadores pueden ser útiles en responder estas cuestiones.

Los biomarcadores se definen como una característica que se mide y evalúa objetivamente como un indicador de procesos biológicos normales, procedimientos patógenos o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica (Biomarkers Working Group, 2001, abajo). La definición de un biomarcador se ha definido recientemente adicionalmente como proteínas en las que un cambio en la expresión puede correlacionarse con un elevado riesgo de enfermedad o progresión, o predictivo de una respuesta de una enfermedad a un tratamiento dado.

El factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) es una citocina importante en la respuesta inmunitaria innata, que proporciona defensa del huésped inmediata contra organismos invasores antes de la activación del sistema inmunitario adaptativo. TNFa se expresa como un precursor transmembrana que experimenta procesamiento proteolítico para formar un trímero soluble. La unión de tanto las formas unidas a membrana como solubles de TNF a sus receptores, TNFRSF1A y TNFRSF1B (también conocidos como TNFR1 y TNFR2, respectivamente), inicia la expresión de varias otras citocinas pro-inflamatorias y marcadores inflamatorios generales. TNFa es un mediador conocido de muchas enfermedades inflamatorias mediadas por inmunidad crónica.

Hay muchos antagonistas de TNFa biológicos, tales como infliximab (Remicade®), golimumab (Simponi®), adalimumab (Humira®) y etanercept (Enbrel®), que han sido autorizados para uso en pacientes. El mecanismo primario es reducir los niveles de TNF en la circulación, reduciéndose así la inflamación global y mejorando los signos clínicos de enfermedad, sin causar inmunosupresión sistémica en el paciente. Se ha mostrado hasta la fecha que es eficaz en el tratamiento de artritis reumatoide (AR), artritis psoriásica (PsA), enfermedad de Crohn (EC), colitis ulcerosa (CU), psoriasis y espondilitis anquilosante.

La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria del intestino episódica del colon. La patogénesis de la CU depende de una interacción entre factores genéticos, respuesta inmunitaria, infección microbiana y factores medioambientales, produciendo una respuesta anormal a bacterias comúnmente encontradas en el tubo gastrointestinal. La expresión génica no solo controla la evolución global de la enfermedad, sino que también refleja los procedimientos que subyacen a la expresión clínica de enfermedad activa y enfermedad en remisión.

Los actuales tratamientos de CU incluyen agentes antiinflamatorios, inmunomoduladores y agentes de factores de necrosis antitumoral a (TNFa), que incluyen infliximab. El infliximab induce y mantiene la respuesta clínica y la remisión clínica en pacientes con CU como se demuestra en los ensayos ACT 1 y ACT 2.

Aunque ninguno de estos agentes anti-TNFa ha sido autorizado para tratar colitis ulcerosa, el TNFa participa en muchos aspectos de trastornos inflamatorios gastrointestinales. Sin embargo, hay diferencias individuales en respuesta a terapia anti-TNF y algunos pacientes pueden no recibir beneficio terapéutico. Se ha supuesto que las múltiples variaciones genéticas pueden desempeñar una función clave en la variada respuesta.

Por consiguiente, hay una necesidad de identificar y caracterizar nuevos marcadores de genes de suero o plasma útiles en desarrollar procedimientos para diagnosticar y tratar trastornos inflamatorios inmunomediados, tales como colitis ulcerosa, además de otras enfermedades y afecciones, y un procedimiento para predecir cómo respondería un paciente a una intervención terapéutica. En general ya se conocen paneles de marcadores (por ejemplo, documento WO 2008/028044).

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento o kit para diagnosticar y/o tratar colitis ulcerosa y/o enfermedades o trastornos relacionados y/o predecir la idoneidad de agentes candidatos para el tratamiento. La presente invención incluye el descubrimiento de genes particulares de interés que tienen niveles de expresión modificados en pacientes sensibles a tratamiento para colitis ulcerosa (eficaz en reducir los síntomas de colitis ulcerosa) frente a pacientes no sensibles al tratamiento o pacientes tratados con placebo. Los niveles de expresión modificados constituyen un perfil que puede servir de perfil de biomarcador predictivo de sensibilidad de un paciente a tratamiento y/o proporcionar vías de dosificación preferidas.

1. La materia desvelada en el presente documento se refiere a la asociación genética de un conjunto de genes (y expresión de aquellos genes) que están regulados por incremento o por disminución con terapia anti-TNF en sujetos que tienen un trastorno inflamatorio gastrointestinal, tal como colitis ulcerosa. Los genes regulados por incremento o por disminución incluyen BCL6 (acc. de GenBank nº AW264036; SEC ID Nº: 118) y un gen (acc. de GenBank nº AI689210; SEC ID Nº: 123), que opcionalmente comprende además C5AR1 (acc. de GenBank nº NM001736; SEC ID Nº: 119), FOLR1 (acc. de GenBank nº U81501; SEC ID Nº: 142) y/o OSM (acc. de GenBank nº A1079327; SEC ID Nº: 173), y que opcionalmente comprende además un gen presentado en la Figura 7 (por ejemplo, SEC ID Nº: 110 a 203). Los perfiles de expresión de estos genes pueden medirse usando una o más sondas de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1 a 109.

El sujeto presenta una respuesta terapéutica a al menos un agente anti-TNFa (por ejemplo, infliximab, golimumab, Enbrel™, Humira™, u otro fármaco biológico anti-TNF o de molécula pequeña), en el que el sujeto ha sido diagnosticado con colitis ulcerosa u otro trastorno gastrointestinal tal como, pero no se limita a, enfermedad de Crohn, trastorno inflamatorio del intestino y similares, que incluyen formas leves, moderadas, graves, pediátricas o adultas, además de otras formas tales como, pero no se limitan a, formas resistentes a esteroides, metotrexato o AINE de trastornos gastrointestinales.

En una realización, la presente invención usa un panel de genes en un procedimiento de evaluación de la eficacia de agentes candidatos para el tratamiento de colitis ulcerosa o trastornos relacionados, por ejemplo, en momentos de tiempo tempranos de tratamiento en los que la eficacia del tratamiento puede no ser medible por síntomas o características de enfermedad tradicionales.

En una realización particular, la presente invención comprende un procedimiento de predecir la idoneidad de un tratamiento para colitis ulcerosa basándose en el patrón de expresión génica de uno o más genes que constituyen el perfil antes del tratamiento.

Además, la presente invención comprende un procedimiento de identificación de sujetos con colitis ulcerosa y/o enfermedades o trastornos relacionados que son candidatos para el tratamiento con un agente terapéutico particular evaluando su perfil de expresión de uno o más de estos SNP de receptores de TNF del panel.

En otra realización, el perfil de genes relacionado con colitis ulcerosa se usa para crear un procedimiento basado en matrices para fines de pronóstico o diagnóstico, comprendiendo el procedimiento:

a) preparar una muestra de ácidos nucleicos de un espécimen obtenido del sujeto; y b) poner en contacto la muestra con un panel de segmentos de ácidos nucleicos (por ejemplo, SEC ID Nº: 1-109) que comprende una porción de un gen BCL6 (acc. de GenBank nº AW264036; SEC ID Nº: 118) y tx82a04.x1 (acc. de GenBank nº AI689210; SEC ID Nº: 123), que opcionalmente comprende además C5AR1 (acc. de GenBank nº NM001736; SEC ID Nº: 119), FOLR1 (acc. de GenBank nº U81501; SEC ID Nº: 142) y OSM (acc. de GenBank nº A1079327; SEC ID Nº: 173), que opcionalmente comprende además un gen enumerado en la Figura 7 ó 10 (por ejemplo, SEC ID Nº: 110-203) con una respuesta terapéutica a un agente de TNFa (por ejemplo, infliximab, golimumab, Enbrel™, Humira ™, u otro fármaco biológico anti-TNF o de molécula pequeña), en sujetos con colitis ulcerosa u otro trastorno gastrointestinal, tal como, pero no se limitan a, enfermedad de Crohn, trastorno inflamatorio del intestino, y similares, que incluyen formas leves, moderadas, graves, pediátricas o adultas, además de otras formas tales como, pero no se limitan a, formas resistentes a esteroides, metotrexato o AINE de trastornos gastrointestinales.

Opcionalmente, el análisis estadístico se realiza sobre los cambios en niveles de expresión de miembros del panel correspondiente al gen SNP para evaluar la significancia de estos cambios y para identificar qué miembros son miembros significativos del panel.

En una realización alternativa, la presente invención comprende un kit para predecir la idoneidad de agentes candidatos para tratar colitis ulcerosa y/o enfermedades o trastornos relacionados basados en el patrón de expresión génica.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Análisis de distribución de la ruta de referencia entre pacientes que responden al tratamiento y que no responden al tratamiento con infliximab. Análisis de distribución de la ruta de los genes diferencialmente expresados al nivel inicial entre pacientes que responden al tratamiento y pacientes que no responden al tratamiento mostrado como porcentaje de genes (eje X) en una ruta dada entre el número total de genes dentro de la lista de entrada que tiene anotaciones de GeneOntology. Todos los enriquecimientos son estadísticamente significativos (valor de p de la puntuación de la prueba exacta de Fisher < 0,05). Figura 2: Agrupamiento jerárquico usando el clasificador de referencia del conjunto de 20 sondas. El agrupamiento jerárquico del clasificador del conjunto de 20 sondas a través de muestras de 12 pacientes que responden al tratamiento frente a 11 pacientes que no responden al tratamiento antes del tratamiento con infliximab. La matriz de similitud se calculó usando la correlación de Pearson de aproximadamente 0 (correlación convencional en GeneSpring). Figura 3: Agrupamiento jerárquico usando el clasificador de referencia del conjunto de 5 sondas. El agrupamiento jerárquico del clasificador del conjunto de 5 sondas a través de tanto muestras de 12 pacientes que responden al tratamiento frente a 11 pacientes que no responden al tratamiento del conjunto de entrenamiento (A) u 8 pacientes que responden al tratamiento y 16 pacientes que no responden al tratamiento del conjunto de prueba fijado antes del tratamiento con infliximab. La matriz de similitud se calculó usando la correlación de Pearson de aproximadamente 0 (correlación convencional en GeneSpring). Figura 4: Perfil de expresión de pacientes que responden al tratamiento/pacientes que no responden al tratamiento con infliximab del clasificador del conjunto de 5 sondas. Representación del diagrama de puntos que compara pacientes que responden al tratamiento con pacientes que no responden al tratamiento con infliximab del clasificador del conjunto de 5 sondas. Se muestran las intensidades normalizadas de cada muestra (círculo negro). También se muestra la mediana de la intensidad, el percentil 75 y 25 y los valores mínimos y máximos para cada población de pacientes que responden al tratamiento y pacientes que no responden al tratamiento para cada uno de los 5 genes. Figura 5: El agrupamiento jerárquico de cohortes de Lovaina del clasificador del conjunto de 20 sondas entre los 8 pacientes que responden al tratamiento y los 16 pacientes que no responden al tratamiento mostró que los 4 pacientes clasificados erróneamente que no responden al tratamiento y el 1 paciente clasificado erróneamente que responde al tratamiento tienen perfiles de expresión muy similares a los de pacientes que responden al tratamiento y pacientes que no responden al tratamiento, respectivamente. Figura 6: Conjuntos de sondas comunes y únicas que comparan ACT1 con la cohorte de validación Figura 7: Clasificador del conjunto de sondas de IFX de referencia Figura 8: Características de distintivo predictivo de IFX de referencia Figura 9: Proteínas expresadas en tanto la membrana de vesículas secretoras como el plasma de los leucocitos polimorfonucleares neutrófilos. Figura 10. Genes diferencialmente regulados de referencia que comparan IFXR con NR. Figura 11. Citocinas y quimiocinas diferencialmente expresadas al nivel inicial que comparan IFXR con NR.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definiciones

Una “actividad,” una actividad biológica y una actividad funcional de un polipéptido se refiere a una actividad ejercida por un gen, o proteína codificada por un gen, del panel de genes relacionados con la colitis ulcerosa en respuesta a su interacción específica con otra proteína o molécula como se determina in vivo, in situ, o in vitro, según técnicas convencionales. Tales actividades pueden ser una actividad directa, tal como una asociación con o una actividad enzimática sobre una segunda proteína, o una actividad indirecta, tal como un proceso celular mediado por interacción de la proteína con una segunda proteína o una serie de interacciones como en señalización intracelular o la cascada de coagulación.

Un “anticuerpo” incluye cualquier molécula que contiene polipéptido o péptido que comprende al menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, tal como, pero no se limita a, al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porción de unión a ligando de la misma, una región variable de la cadena pesada o cadena ligera, una región constante de la cadena pesada o cadena ligera, una región estructural, o cualquier porción, fragmento o variante de las mismas. El término “anticuerpo” pretende además englobar anticuerpos, fragmentos de digestión, porciones especificadas y variantes de los mismos, que incluyen miméticos de anticuerpos o que comprenden porciones de anticuerpos que imitan la estructura y/o función de un anticuerpo o fragmento especificado o porción del mismo, que incluye anticuerpos monocatenarios y fragmentos de los mismos. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos que incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab (por ejemplo, por digestión con papaína), Fab' (por ejemplo, por digestión con pepsina y reducción parcial) y F(ab')2 (por ejemplo, por digestión con pepsina), facb (por ejemplo, por digestión con plasmina), pFc' (por ejemplo, por digestión con pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, por digestión con pepsina, reducción parcial y reagregación), Fv o scFv (por ejemplo, por técnicas de biología molecular) y anticuerpos de un único dominio (por ejemplo, VH o VL), están englobados por la invención (véase, por ejemplo, Colligan, y col., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan y col., Current Protocols in Polypeptide Science, John Wiley & Sons, NY (1997-2001)).

Los términos “matriz” o “micromatriz” o “biochip” o “chip”, como se usan en el presente documento, se refieren a artículos de fabricación o dispositivos que comprenden una pluralidad de elementos diana inmovilizados, comprendiendo elemento diana un “clon”, “característica”, “punto” o área definida que comprende una composición particular, tal como una molécula biológica, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico o polipéptido, inmovilizada a una superficie sólida, como se ha tratado en más detalle, más delante.

“Complemento de” o “complementario a” una secuencia de ácidos nucleicos de la invención se refiere a una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de bases complementaria y orientación inversa con respecto a un primer polinucleótido.

“Identidad”, como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, como se determina comparando las secuencias. En la materia, “identidad” también significa el grado de vinculación de secuencias entre secuencias de polipéptidos o de polinucleótidos, como se ha determinado por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. “Identidad” y “similitud” pueden calcularse fácilmente mediante procedimientos conocidos, que incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., Siam J. Applied Math., 48:1073 (1988). Además, los valores para el porcentaje de identidad pueden obtenerse a partir de alineamientos de secuencias de aminoácidos y nucleótidos generados usando los parámetros por defecto para el componente AlignX de Vector NTI Suite 8.0 (Informax, Frederick, MD).

Los términos “se hibridan específicamente con”, “hibridarse específicamente con”, “hibridación específica” y “se hibridan selectivamente con”, como se usan en el presente documento, se refieren a la unión, duplexado o hibridación de una molécula de ácido nucleico preferencialmente con una secuencia de nucleótidos particular bajo condiciones rigurosas. El término “condiciones rigurosas” se refiere a condiciones bajo las que una sonda se hibridará preferencialmente con su subsecuencia diana; y a un menor grado con, o en absoluto, con otras secuencias. Una “hibridación rigurosa” y “condiciones de lavado de hibridación rigurosa” en el contexto de la hibridación de ácidos nucleicos (por ejemplo, como en hibridaciones en matriz; de Southern o Northern) son dependientes de secuencia, y son diferentes bajo diferentes parámetros medioambientales. Condiciones de hibridación alternativas que pueden usarse para poner en práctica la invención se describen en detalle, más adelante. En aspectos alternativos, las condiciones de hibridación y/o lavado se llevan a cabo bajo condiciones moderadas, condiciones rigurosas y condiciones muy rigurosas, como se describe en más detalle, más adelante. También se usan condiciones de lavado alternativas en diferentes aspectos, como se describe en más detalle, en el presente documento.

Los términos “molécula biológica marcada” o “marcada con una composición detectable” o “marcada con un resto detectable”, como se usan en el presente documento, se refieren a una molécula biológica, por ejemplo, un ácido nucleico, que comprende una composición detectable, es decir, una marca, como se describe en detalle, más adelante. La marca también puede ser otra molécula biológica, como un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico en forma de una estructura de tallo-lazo como una “sonda fluorescible” como se describe más adelante. Ésta incluye incorporación de bases marcadas (o, bases que pueden unirse a una marca detectable) en el ácido nucleico por, por ejemplo, traducción de mellas, extensión de cebadores al azar, amplificación con cebadores degenerados, y similares. Puede usarse cualquier marca, por ejemplo, marcas quimioluminiscentes, radiomarcas, marcas enzimáticas y similares. La marca puede ser detectable mediante cualquier medio, por ejemplo, detección visual, espectroscópica, fotoquímica, bioquímica, inmunoquímica, física, química y/o quimioluminiscente. La invención puede usar matrices que comprenden ácidos nucleicos inmovilizados que comprenden marcas detectables.

El término “ácido nucleico”, como se usa en el presente documento, se refiere a un desoxirribonucleótido (ADN) o ribonucleótido (ARN) en forma tanto mono como bicatenaria. El término engloba ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término ácido nucleico se usa indistintamente con gen, ADN, ARN, ADNc, ARNm, cebador de oligonucleótidos, sonda y producto de amplificación. El término también engloba análogos de esqueleto de ADN tales como fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, alquilfosfotriéster, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno (metilimino), 3'-N-carbamato, morfolinocarbamato y ácidos nucleicos peptídicos (PNA).

Los términos “muestra” o “muestra de ácidos nucleicos”, como se usan en el presente documento, se refieren a una muestra que comprende un ADN o ARN, o ácido nucleico representativo de ADN o ARN aislado de una fuente natural. Una “muestra de ácidos nucleicos” está en una forma adecuada para hibridación (por ejemplo, como una disolución acuosa soluble) con otro ácido nucleico (por ejemplo, sondas inmovilizadas). El ácido nucleico de muestra puede aislarse, clonarse o extraerse de células o tejidos particulares. La célula o muestra de tejido a partir de la cual se prepara la muestra de ácido nucleico se toma normalmente de un paciente que tiene o que se sospecha que tiene CU o una enfermedad o afección relacionada. Los procedimientos de aislar muestras de células y tejido son muy conocidos para aquellos expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, aspiraciones, secciones de tejido, biopsias de aguja, y similares. Frecuentemente, la muestra será una “muestra clínica”, que es una muestra derivada de un paciente, que incluye secciones de tejidos tales como secciones congeladas o secciones de parafina tomadas para fines histológicos. La muestra también puede derivarse de sobrenadantes (de células) o tomarse las propias células de pacientes o de cultivos celulares, células de cultivo de tejido y otros medios en los que puede desearse detectar la respuesta a candidatos a fármaco. En algunos casos, los ácidos nucleicos pueden amplificarse usando técnicas convencionales tales como PCR, antes de la hibridación. La sonda puede producirse a partir de y conjuntamente puede ser representativa de una fuente de ácidos nucleicos de una o más porciones particulares (pre-seleccionadas) de, por ejemplo, un conjunto de productos de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), sustancialmente un cromosoma entero o un fragmento de cromosoma, o sustancialmente un genoma entero, por ejemplo, como un conjunto de clones, por ejemplo, BAC, PAC, YAC, y similares (véase más adelante).

Los “ácidos nucleicos” son polímeros de nucleótidos, en los que un nucleótido comprende una base ligada a un azúcar, azúcares que a su vez están ligados entre sí por una molécula que intercede, al menos bivalente, tal como ácido fosfórico. En ácidos nucleicos que se producen naturalmente, el azúcar es tanto 2'-desoxirribosa (ADN) como ribosa (ARN). Los poli- u oligonucleótidos no naturales contienen bases modificadas, azúcares o moléculas de enlace, pero se entiende generalmente que imitan la naturaleza complementaria de los ácidos nucleicos que se producen naturalmente después de diseñarse. Un ejemplo de un oligonucleótido no natural es una composición de molécula antisentido que tiene un esqueleto fosforotioato. Un “oligonucleótido” generalmente se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene menos de 30 nucleótidos.

El término “perfil” significa un patrón y se refiere a la magnitud y dirección de cambio de varias características. El perfil puede interpretarse rigurosamente, es decir, siendo la variación en la magnitud y/o número de rasgos dentro del perfil que muestra la característica sustancialmente similar a un perfil de referencia o puede interpretarse menos rigurosamente, por ejemplo, requiriendo una tendencia en vez de una coincidencia absoluta de todos o un subconjunto de características de rasgos.

Los términos “proteína”, “polipéptido” y “péptido” incluyen “análogos”, o “variantes conservativas” y “miméticos”, o “peptidomiméticos” con estructuras y actividad que se corresponden sustancialmente con el polipéptido del que se derivó la variante, como se ha tratado en detalle anteriormente.

Un “polipéptido” es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, y un péptido generalmente se refiere a polímeros de aminoácidos de 12 o menos residuos. Los enlaces peptídicos pueden producirse naturalmente como se dirige por el molde de ácido nucleico o sintéticamente mediante procedimientos muy conocidos en la técnica.

Una “proteína” es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteína puede comprender además grupos sustituyentes unidos a los grupos laterales de los aminoácidos que no participan en la formación de los enlaces peptídicos. Normalmente, las proteínas formadas por la expresión de células eucariotas también contienen hidratos de carbono. Las proteínas se definen en el presente documento en términos de su secuencia de aminoácidos o esqueleto y no se especifican sustituyentes, tanto si son conocidos como si no.

El término “receptor” indica una molécula que tiene la capacidad de afectar la actividad biológica en, por ejemplo, una célula, como resultado de interacción con un ligando o componente de unión específico. Los receptores unidos a la membrana celular se caracterizan por un dominio de unión a ligando extracelular, uno o más dominios que atraviesan la membrana o transmembrana, y un dominio efector intracelular que normalmente no participa en la transducción de señales. La unión de ligandos a receptores de la membrana celular produce cambios en el dominio extracelular que se comunican a través de la membrana celular, interacción directa o indirecta con una o más proteínas intracelulares, y altera las propiedades celulares, tales como actividad enzimática, forma de la célula o perfil de expresión génica. Los receptores también pueden estar sin unir a la superficie celular y pueden ser citosólicos, nucleares, o liberarse de la célula completamente. Receptores asociados a no célula se llaman receptores o ligandos solubles.

Todas las publicaciones o patentes citadas en el presente documento muestran el estado de la materia en el momento de la presente invención y/o proporcionan descripción y posibilidad de la presente invención. Publicaciones se refiere a cualquier publicación científica o de patente, o cualquier otra información disponible en cualquier formato de medio, que incluye todos los formatos grabados, electrónicos o impresos, e incluyen: Ausubel, y col., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1987-2008); Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow y Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, y col., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2008);Colligan y col., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (1997-2008).

Identificación y validación de paneles de genes

La presente invención proporciona novedosos procedimientos para cribar moléculas que modulan los síntomas de colitis ulcerosa. La presente invención desvela la asociación genética de un conjunto de regulación por aumento o por disminución de genes con pacientes que responden al tratamiento con anti-TNF en trastorno inflamatorio gastrointestinal, tal como colitis ulcerosa, con BCL6 (acc. de GenBank nº AW264036; SEC ID Nº: 118) y tx82a04.x1 (acc. de GenBank nº AI689210; SEC ID Nº: 123), que comprende opcionalmente además C5AR1 (acc. de GenBank nº NM001736; SEC ID Nº: 119), FOLR1 (acc. de GenBank nº U81501; SEC ID Nº: 142) y OSM (acc. de GenBank nº A1079327; SEC ID Nº: 173)), que comprende opcionalmente además un gen presentado en la Figura 7 (por ejemplo, SEC ID Nº: 110-203) con una respuesta terapéutica a agentes anti-TNFa (por ejemplo, infliximab, golimumab, Enbrel™, Humira™ u otro fármaco biológico anti-TNF o de molécula pequeña), en sujetos con colitis ulcerosa u otro trastorno gastrointestinal, tal como, pero no se limita a, enfermedad de Crohn, trastorno inflamatorio del intestino y similares, que incluyen formas leves, moderadas, graves, pediátricas o adultas, además de otras formas tales como, pero no se limitan a, formas resistentes a esteroides, metotrexato o AINE de trastornos gastrointestinales.

La identificación de estas secuencias (genes o en lo sucesivo “secuencias de genes relacionadas con colitis ulcerosa”) que se expresan diferencialmente en tejido de enfermedad solo o en respuesta a terapia anti-TNF permite el uso de esta información de varias formas. Por ejemplo, la evaluación de una pauta de tratamiento particular puede evaluarse con la información proporcionada por el perfil de expresión de los genes biomarcadores asociados a CU.

Esto pueden hacerse preparando biochips que comprenden conjuntos complementarios a estas secuencias, que pueden entonces usarse en estos cribados (por ejemplo, SEC ID Nº: 1-109). Estos procedimientos también pueden realizarse en base a la proteína; es decir, niveles de expresión de proteínas de los relacionados con colitis ulcerosa ya que estas proteínas de productos génicos pueden evaluarse para fines de diagnóstico o para seleccionar pacientes que responden al tratamiento anti-TNF o para cribar agentes terapéuticos candidatos adicionales. Además, las secuencias de ácidos nucleicos que comprenden el perfil de genes relacionados con colitis ulcerosa pueden usarse para medir si es probable que un paciente responda o no a un agente terapéutico antes del tratamiento.

Las secuencias de genes relacionadas con colitis ulcerosa pueden incluir tanto secuencias de ácidos nucleicos como de aminoácidos. En una realización preferida, las secuencias de genes relacionadas con colitis ulcerosa son ácidos nucleicos recombinantes. Por el término “ácido nucleico recombinante” se indica en el presente documento ácido nucleico, originalmente formado in vitro, en general, por la manipulación de ácido nucleico por polimerasas y endonucleasas, en una forma normalmente no encontrada en la naturaleza. Así, un ácido nucleico aislado, en una forma lineal, o un vector de expresión formado in vitro ligando moléculas de ADN que normalmente no están unidas, se consideran ambos recombinantes para los fines de la presente invención. Se entiende que una vez se prepara un ácido nucleico recombinante y se reintroduce en una célula huésped u organismo, se replicará no recombinantemente, es decir, usando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped en vez de manipulaciones in vitro; sin embargo, tales ácidos nucleicos, una vez producidos recombinantemente, aunque posteriormente se repliquen no recombinantemente, todavía se consideran recombinantes para los fines de la invención.

Procedimiento de puesta en práctica de la invención

La invención proporciona in vitro, in situ, o in silico, procedimientos basados en ácidos nucleicos, proteínas y/o matrices que se basan en la cantidad relativa de una molécula de unión (por ejemplo, secuencia de ácidos nucleicos) en dos o más muestras. También se proporcionan procedimientos implementados por ordenador para determinar la cantidad relativa de una molécula de unión (por ejemplo, secuencia de ácidos nucleicos) en dos o más muestras y usar la cantidad de unión relativa determinada para predecir la sensibilidad a una terapia particular, y monitorizar y potenciar el tratamiento terapéutico.

En la práctica de los procedimientos de la invención, una o más muestras de moléculas biológicas marcadoras (por ejemplo, ácido nucleico) se aplican a dos o más ensayos o matrices, teniendo los ensayos o matrices sustancialmente el mismo complemento de molécula de unión inmovilizada (por ejemplo, ácido nucleico inmovilizado que puede hibridarse con ácido nucleico de muestra marcado). Las dos o más matrices son normalmente múltiples copias de la misma matriz. Sin embargo, debido a que cada “punto”, “clon” o “rasgo” sobre la matriz tiene moléculas biológicas similares (por ejemplo, ácidos nucleicos de la misma secuencia) y las moléculas biológicas (por ejemplo, ácido nucleico) en cada punto son conocidas, como es típico de ácido nucleico y otras matrices, no es necesario que las múltiples matrices usadas en la invención sean idénticas en configuración, es solo necesario que la posición de cada rasgo sobre el sustrato sea conocida, es decir, tenga una dirección. Así, en un aspecto, múltiples moléculas biológicas (por ejemplo, ácido nucleico) en muestras se unen comparativamente a la matriz (por ejemplo, se hibridan simultáneamente) y la información obtenida se codifica de manera que los resultados se basen en las propiedades inherentes del rasgo (por ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos) y no la posición sobre el sustrato.

Amplificación de ácidos nucleicos

Procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos muy conocidos usando cebadores de oligonucleótidos pueden usarse para generar ácidos nucleicos usados en las composiciones y procedimientos de la invención, para detectar

o medir niveles de muestras de prueba o de control hibridadas con una matriz, y similares, por ejemplo, para detectar la presencia de polimorfismos SNP de TNFR de la presente invención. El experto puede seleccionar y diseñar cebadores de amplificación de oligonucleótidos adecuados. Los procedimientos de amplificación también son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, PCR (PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) y PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase, por ejemplo, Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117); amplificación de la transcripción (véase, por ejemplo, Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173); y, replicación de secuencias autosostenidas (véase, por ejemplo, Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874); amplificación de Q-Beta replicasa (véase, por ejemplo, Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491), ensayo de amplificación de Q-beta replicasa automatizado (véase, por ejemplo, Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271) y otras técnicas mediadas por ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); véase también Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; patentes de EE.UU. nº 4.683.195 y 4.683.202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564.

Hibridación de ácidos nucleicos

En la práctica de los procedimientos de la invención, muestras de prueba y de control de ácido nucleico se hibridan con sondas de ácido nucleico inmovilizadas, por ejemplo, sobre matrices. En aspectos alternativos, las condiciones de hibridación y/o lavado se llevan a cabo bajo condiciones moderadas, condiciones rigurosas y condiciones muy rigurosas. Una amplia guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en, por ejemplo, Sambrook Ausubel, Tijssen. Generalmente, las condiciones de hibridación y lavado altamente rigurosas se seleccionan para ser aproximadamente 5 ºC inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50 % de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente apareada. Las condiciones muy rigurosas se seleccionan para ser iguales a la Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios sobre una matriz o un filtro en una transferencia Southern o Northern es 42 ºC usando disoluciones de hibridación convencionales (véase, por ejemplo, Sambrook), llevándose a cabo la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente rigurosas es NaCl 0,15 M a 72 ºC durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado con 0,2×SSC a 65 ºC durante 15 minutos (véase, por ejemplo, Sambrook). Frecuentemente, un lavado de alta rigurosidad va precedido de un lavado de rigurosidad media o baja para eliminar la señal de la sonda de ruido de fondo. Un ejemplo de lavado de rigurosidad media para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1×SSC a 45 ºC durante 15 minutos. Un ejemplo de un lavado de rigurosidad baja para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4× a 6×SSC a 40 ºC durante 15 minutos.

En aspectos alternativos de las composiciones y procedimientos de la invención, por ejemplo, en la práctica de la hibridación de ácidos nucleicos comparativa, tal como hibridación genómica comparativa (CGH) con matrices, los colorantes fluorescentes Cy3® y Cy5® se usan para marcar diferencialmente fragmentos de ácido nucleico de dos muestras, por ejemplo, el ácido nucleico inmovilizado en matriz frente al ácido nucleico de muestra, o, ácido nucleico generado a partir de una célula de control frente a una de prueba o tejido. Muchos instrumentos comerciales se diseñan para adaptar la detección de estos dos colorantes. Para aumentar la estabilidad de Cy5®, o flúor u otros compuestos sensibles a la oxidación, los antioxidantes y secuestrantes de radicales libres pueden usarse en mezclas de hibridación, las disoluciones de hibridación y/o de lavado. Así, las señales de Cy5® aumentan espectacularmente y son posibles tiempos de hibridación más largos. Véase el documento WO 0194630 A2 y la solicitud de patente de EE.UU. nº 20020006622.

Para aumentar la sensibilidad de hibridación, la hibridación puede llevarse a cabo en un entorno de humedad insaturada controlado; así, la eficiencia de hibridación mejora significativamente si la humedad no se satura. Véase el documento WO 0194630 A2 y la solicitud de patente de EE.UU. nº 20020006622. La eficiencia de hibridación puede mejorarse si la humedad se controla dinámicamente, es decir, si la humedad cambia durante la hibridación. La transferencia de masa se facilitará en un entorno de humedad dinámicamente equilibrada. La humedad en el entorno de hibridación puede ajustarse escalonada o continuamente. Pueden usarse dispositivos de matriz que comprenden alojamientos y controles que permiten que el operario controle la humedad durante las etapas de prehibridación, hibridación, lavado y/o detección. El dispositivo puede tener componentes de detección, control y memoria para permitir la programación previa de los controles de humedad y temperatura (que son constantes y precisos o que fluctúan), y otros parámetros durante el ciclo de procedimiento entero, que incluyen etapas de prehibridación, hibridación, lavado y de detección. Véase el documento WO 0194630 A2 y la solicitud de patente de EE.UU. nº 20020006622.

Los procedimientos de la invención pueden comprender condiciones de hibridación que comprenden fluctuación osmótica. La eficiencia de hibridación (es decir, tiempo hasta el equilibrio) también puede potenciarse por un entorno de hibridación que comprende cambiar la hiper-/hipo-tonicidad, por ejemplo, un gradiente de soluto. Se crea un gradiente de soluto en el dispositivo. Por ejemplo, una disolución de hibridación de baja sal se coloca sobre un lado de la cámara de hibridación de la matriz y un tapón de mayor sal se coloca en el otro lado para generar un gradiente de soluto en la cámara. Véase el documento WO 0194630 A2 y la solicitud de patente de EE.UU. nº 20020006622.

Bloqueo de la capacidad de secuencias de ácidos nucleicos repetitivas para hibridarse

Los procedimientos de la invención pueden comprender una etapa de bloqueo de la capacidad de secuencias de ácidos nucleicos repetitivas para hibridarse (es decir, bloquear la “capacidad de hibridación”) en los segmentos inmovilizados de ácidos nucleicos. La capacidad de hibridación de secuencias de ácidos nucleicos repetitivas en las secuencias de ácidos nucleicos de muestra puede bloquearse mezclando secuencias de ácidos nucleicos de muestra con secuencias de ácidos nucleicos repetitivas sin marcar o alternativamente marcadas. Las secuencias de ácidos nucleicos de muestra pueden mezclarse con secuencias de ácidos nucleicos repetitivas antes de la etapa de puesta en contacto con los segmentos de ácidos nucleicos inmovilizados en matriz. Las secuencias de bloqueo son, por ejemplo, ADN de Cot-1, ADN de esperma de salmón, o secuencias genómicas repetitivas específicas. Las secuencias de ácidos nucleicos repetitivas pueden estar sin marcar. Se conocen varios procedimientos para eliminar y/o inhabilitar la capacidad de hibridación de secuencias repetitivas usando, por ejemplo, Cot-1; véase, por ejemplo, Craig (1997) Hum. Genet. 100:472-476; documento WO 93/18186. Las secuencias de ADN repetitivas pueden eliminarse de sondas de bibliotecas por medio de purificación magnética y PCR de afinidad, véase, por ejemplo, Rauch (2000) J. Biochem. Biophys. Methods 44:59-72.

Las matrices son genéricamente una pluralidad de elementos diana inmovilizados sobre la superficie de la placa como “puntos” o “agrupaciones”, o “rasgos”, definidos, comprendiendo cada elemento diana una o más moléculas biológicas (por ejemplo, ácidos nucleicos o polipéptidos) inmovilizadas a una superficie sólida para la unión específica (por ejemplo, hibridación) a una molécula en una muestra. Los ácidos nucleicos inmovilizados pueden contener secuencias de mensajes específicos (por ejemplo, como bibliotecas de ADNc) o genes (por ejemplo, bibliotecas genómicas), que incluyen un genoma humano. Otros elementos diana pueden contener secuencias de referencia y similares. Las moléculas biológicas de las matrices pueden disponerse sobre la superficie sólida en diferentes tamaños y diferentes densidades. Las densidades de las moléculas biológicas en una agrupación y el número de agrupaciones sobre la matriz dependerá de varios factores, tales como la naturaleza de la marca, el soporte sólido, el grado de hidrofobia de la superficie del sustrato, y similares. Cada rasgo puede comprender sustancialmente la misma molécula biológica (por ejemplo, ácido nucleico), o, una mezcla de moléculas biológicas (por ejemplo, ácidos nucleicos de diferentes longitudes y/o secuencias). Así, por ejemplo, un rasgo puede contener más de una copia de un trozo clonado de ADN, y cada copia puede romperse en fragmentos de diferentes longitudes.

Las superficies de sustrato de matriz sobre las que se inmovilizan moléculas biológicas (por ejemplo, ácidos nucleicos) pueden incluir nitrocelulosa, vidrio, cuarzo, sílice fundida, plásticos y similares, como se trata además, más adelante. Las composiciones y procedimientos de la invención pueden incorporarse en diseños completos o parciales de matrices, y componentes y procedimientos asociados, como se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 6.344.316; 6.197.503; 6.174.684; 6.159.685; 6.156.501; 6.093.370; 6.087.112; 6.087.103; 6.087.102; 6.083.697; 6.080.585; 6.054.270; 6.048.695; 6.045.996; 6.022.963; 6.013.440; 5.959.098; 5.856.174; 5.843.655; 5.837.832; 5.770.456; 5.723.320; 5.700.637; 5.695.940; 5.556.752; 5.143.854; véanse, por tanto, por ejemplo, los documentos WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958; WO 89/10977; véanse, por tanto, por ejemplo, Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-174; Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21:25-32; Epstein (2000) Current Opinion in Biotech. 11:36-41; Mendoza (1999 Biotechniques 27: 778-788; Lueking (1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Davies (1999) Biotechniques 27:1258-1261.

Superficies de sustrato

Las superficies de sustrato que pueden usarse en las composiciones y procedimientos de la invención incluyen, por ejemplo, vidrio (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.843.767), cerámicas y cuarzo. Las matrices pueden tener superficies de sustrato de un material rígido, semi-rígido o flexible. La superficie de sustrato puede ser llana o plana, estar formada como pocillos, regiones elevadas, fosas grabadas, poros, perlas, filamentos, o similares. Las superficies de sustrato también puede comprender diversos materiales tales como nitrocelulosa, papel, sustratos cristalinos (por ejemplo, arseniuro de galio), metales, metaloides, polacriloilmorfolida, diversos plásticos y copolímeros de plástico, Nilon®, Teflon®, polietileno, polipropileno, látex, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), rayón, nailon, poli(butirato de vinilo) y acetato de celulosa. Los sustratos pueden recubrirse y el sustrato y el recubrimiento pueden funcionalizarse, por ejemplo, para permitir la conjugación con una amina.

Matrices que comprenden secuencias de calibración

La invención contempla el uso de matrices que comprenden secuencias de calibración inmovilizadas para normalizar los resultados de reacciones de hibridación basadas en matrices, y procedimientos para usar estas secuencias de calibración, por ejemplo, para determinar el número de copias de una secuencia de calibración para “normalizar” o “calibrar” perfiles de relación. Las secuencias de calibración pueden ser sustancialmente las mismas que una secuencia única en una secuencia de ácidos nucleicos inmovilizada sobre una matriz. Por ejemplo, una secuencia de “marcador” de cada “punto” o “biositio” sobre una matriz (que está presente solo sobre ese punto, haciéndolo un “marcador” para ese punto) se representa por una secuencia correspondiente sobre uno o más puntos de “control” o “calibración”.

Los “puntos de control” o “puntos de calibración” se usan para la “normalización” para proporcionar información que es fidedigna y repetible. Los puntos de control pueden proporcionar un resultado coherente independiente de la muestra marcada hibridada con la matriz (o una molécula de unión marcada de una muestra). Los puntos de control pueden usarse para generar una curva de “normalización” o “calibración” para compensar posibles errores de intensidad entre las dos matrices (o más) usadas en los procedimiento basados en matrices por ordenador de la invención.

Un procedimiento de generación de un control sobre la matriz sería usar una mezcla equimolar de todas las moléculas biológicas (por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos) aplicadas en puntos sobre la matriz y generar un único punto. Este único punto tendría cantidades iguales de las moléculas biológicas (por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos) de todos los otros puntos sobre la matriz. Pueden generarse múltiples puntos de control variando la concentración de la mezcla equimolar.

Muestras y especímenes

El ácido nucleico de muestra puede aislarse, clonarse o extraerse de células, tejidos u otros especímenes particulares. La célula o muestra de tejido a partir de la cual se prepara la muestra de ácido nucleico se toma normalmente de un paciente que tiene o que se sospecha que tiene colitis ulcerosa o una afección relacionada. Los procedimientos de aislamiento de muestras de células y tejidos son muy conocidos para aquellos expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, aspiraciones, secciones de tejido, biopsias de aguja, y similares. Frecuentemente, la muestra será una “muestra clínica”, que es una muestra derivada de un paciente, que incluye sangre completa, suero, plasma, o secciones de tejidos, tales como secciones congeladas o secciones de parafina tomadas para fines histológicos. La muestra también puede derivarse de sobrenadantes (de células) o tomarse las propias células de pacientes o de cultivos celulares, células de cultivo de tejido y otros medios en los que puede desearse detectar la respuesta a candidatos de fármaco. En algunos casos, los ácidos nucleicos pueden amplificarse usando técnicas convencionales tales como PCR, antes de la hibridación.

En una realización, la presente invención es un procedimiento de pre-tratamiento de predicción de la regresión o resolución de enfermedad. El procedimiento incluye (1) tomar una biopsia de tejido adecuada u otro espécimen de un individuo diagnosticado con colitis ulcerosa o una enfermedad o trastorno relacionado, (2) medir los niveles de expresión de los genes del perfil del panel, (3) comparar el nivel de expresión de pre-tratamiento de los genes con un perfil de referencia de pre-tratamiento de pacientes que responden al tratamiento, y (4) predecir la respuesta del tratamiento monitorizando los niveles de expresión del panel de genes.

Procedimientos de evaluación de la utilidad de biomarcadores

La utilidad pronóstica del presente panel de genes biomarcadores para evaluar la respuesta de un paciente a tratamiento o pronóstico de enfermedad puede validarse usando otros medios para evaluar un estado de enfermedad del paciente. Por ejemplo, la medición macroscópica de enfermedad puede evaluarse y registrarse por ciertos procedimientos de obtención de imágenes, tales como, pero no se limitan a: obtención de imágenes por tecnología fotográfica, radiométrica o de resonancia magnética. Los índices generales de salud o enfermedad incluyen adicionalmente composición de suero o sangre (proteína, enzimas del hígado, pH, electrolitos, volumen de glóbulos rojos, hematocrito, hemoglobina o proteína específica). Sin embargo, en algunas enfermedades, la etiología es todavía poco entendida. La colitis ulcerosa es un ejemplo de una enfermedad tal.

Evaluación y monitorización de pacientes

Los patrones de expresión de los genes durante el transcurso del tratamiento no han sido estudiados en el tratamiento de colitis ulcerosa u otros trastornos gastrointestinales, y ninguno se ha identificado como que tiene valor predictivo El panel de biomarcadores de expresión génica desvelado en el presente documento permite la generación de procedimientos para la rápida y fidedigna predicción, herramientas de diagnóstico que predicen el desenlace clínico de un ensayo de colitis ulcerosa, o herramientas de pronóstico para seguir la eficacia de la terapia de colitis. Se proporcionan procedimientos de pronóstico basados en detectar estos genes en una muestra. Estas composiciones pueden usarse, por ejemplo, a propósito del diagnóstico, prevención y tratamiento de una variedad de enfermedades inflamatorias inmunomediadas.

Agentes terapéuticos

Antagonistas

Como se usa en el presente documento, el término “antagonistas” se refieren a sustancias que inhiben o neutralizan la actividad biológica del producto génico del panel de genes relacionado con colitis ulcerosa de la invención. Tales antagonistas realizan este efecto de una variedad de formas. Una clase de antagonistas se unirá a la proteína del producto génico con suficiente afinidad y especificidad para neutralizar los efectos biológicos de la proteína. En esta clase de moléculas se incluyen anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, moléculas de F(ab) o F(ab')2). Otra clase de antagonistas comprende fragmentos de la proteína del producto génico, muteínas o moléculas orgánicas pequeñas, es decir, peptidomiméticos, que se unirán a los componentes de unión relacionados

o ligandos del producto génico, inhibiendo así la actividad biológica de la interacción específica del producto génico con su ligando o receptor relacionado. El antagonista de gen relacionado con colitis ulcerosa puede ser de cualquiera de estas clases en tanto que sea una sustancia que inhibe una actividad biológica del producto génico.

Los antagonistas incluyen anticuerpos dirigidos a una o más regiones de la proteína del producto génico o fragmentos de la misma, anticuerpos dirigidos al ligando o receptor relacionado, y péptidos parciales del producto génico o su ligando relacionado que inhiben una actividad biológica del producto génico. En el presente documento se desvela otra clase de antagonistas que incluyen ARNip, ARNhc, moléculas antisentido y ADNzimas que eligen como diana la secuencia del gen como se conoce en la técnica.

Anticuerpos adecuados incluyen aquellos que compiten para unirse al producto génico relacionado con colitis ulcerosa con anticuerpos monoclonales que bloquean la activación del producto génico relacionado con colitis ulcerosa o previenen la unión del producto génico relacionado con colitis ulcerosa a su ligando relacionado, o previenen la señalización del producto génico relacionado con colitis ulcerosa.

Un agente terapéutico que elige como diana el inductor del producto génico relacionado con colitis ulcerosa puede proporcionar mejores posibilidades de éxito. La expresión génica puede modularse de varias formas diferentes que incluyen el uso de ARNip, ARNhc, moléculas antisentido y ADNzimas. Pueden diseñarse ARNip, ARNhc y ADNzimas sintéticos para elegir específicamente como diana uno o más genes y pueden administrarse fácilmente a células in vitro o in vivo.

En el presente documento se desvelan moléculas de ácidos nucleicos antisentido, es decir, moléculas que son complementarias a un ácido nucleico sentido que codifica un polipéptido de producto génico relacionado con colitis ulcerosa, por ejemplo, complementario a la hebra codificante de una molécula de ADNc bicatenario o complementario a una secuencia de ARNm. Por consiguiente, un ácido nucleico antisentido puede enlazar hidrógeno con un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una hebra codificante entera, o a solo una porción de la misma, por ejemplo, toda o parte de la región codificante de proteínas (o marco de lectura abierto). Una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser antisentido a toda o parte de una región no codificante de la hebra codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de producto génico relacionado con colitis ulcerosa. Las regiones no codificantes (“regiones sin traducir 5' y 3'”) son las secuencias de 5' y 3' que flanquean la región codificante y no se traducen en aminoácidos.

En el presente documento se desvelan proteínas quiméricas o de fusión. Como se usa en el presente documento, una “proteína quimérica” o “proteína de fusión” comprende toda o parte (preferentemente biológicamente activa) de un polipéptido de producto génico relacionado con colitis ulcerosa operativamente ligado a un polipéptido heterólogo (es decir, un polipéptido distinto del mismo polipéptido del producto génico relacionado con CU). Dentro de la proteína de fusión, el término “operativamente ligada” está previsto que indique que el polipéptido de producto génico relacionado con colitis ulcerosa y el polipéptido heterólogo están fusionados en marco entre sí. El polipéptido heterólogo puede fusionarse con el extremo amino o el extremo carboxilo del polipéptido de producto génico relacionado con colitis ulcerosa. En otra realización, un polipéptido de producto génico relacionado con colitis ulcerosa o un dominio o fragmento activo del mismo puede fusionarse con una secuencia de proteínas heteróloga o fragmento de la misma para formar una proteína quimérica, en la que los polipéptidos, dominios o fragmentos no están fusionados extremo a extremo, pero están interpuestos dentro de la región estructural de proteína heteróloga.

En otra realización más, la proteína de fusión es una proteína de fusión de inmunoglobulina en la que toda o parte de un polipéptido de producto génico relacionado con colitis ulcerosa está fusionado con secuencias derivadas de un miembro de la familia de proteínas de inmunoglobulina. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas y administrarse a un sujeto para inhibir una interacción entre un ligando (soluble o unido a membrana) y una proteína sobre la superficie de una célula (receptor), para así suprimir la transducción de señales in vivo. La proteína de fusión de inmunoglobulina puede usarse para afectar la biodisponibilidad de un ligando relacionado de un polipéptido de producto génico relacionado con colitis ulcerosa. La inhibición de la interacción ligando/receptor puede ser terapéuticamente útil, tanto para tratar trastornos proliferativos y diferenciativos como para modular (por ejemplo, promover o inhibir) la supervivencia celular. Además, las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos dirigidos contra un polipéptido de producto génico relacionado con colitis ulcerosa en un sujeto, para purificar ligandos y en ensayos de cribado para identificar moléculas que inhiben la interacción de receptores con ligandos.

Composiciones y sus usos

Los antagonistas anti-producto génico relacionado con colitis ulcerosa neutralizante, tales como anticuerpos monoclonales, descritos en el presente documento pueden usarse para inhibir el producto génico relacionado con actividad de colitis ulcerosa. Adicionalmente, tales antagonistas pueden usarse para inhibir la patogénesis de colitis ulcerosa y enfermedades inflamatorias relacionadas susceptibles a tal tratamiento, que pueden incluir, pero no se limitan a, enfermedades reumáticas. El individuo que va a tratarse puede ser cualquier mamífero y es preferentemente un primate, un animal de compañía que es un mamífero y lo más preferentemente un paciente humano. La cantidad de antagonista administrada variará según el fin para el que se use y el procedimiento de administración.

Los antagonistas de genes relacionados con colitis ulcerosa pueden administrarse por cualquier número de procedimientos que produzcan un efecto en tejido en el que se desea prevenir o detener la actividad patológica. Además, los antagonistas anti-producto génico relacionado con colitis ulcerosa no necesitan estar presentes localmente para conferir un efecto sobre la actividad de producto génico relacionado con colitis ulcerosa, por tanto, pueden administrarse en cualquier sitio donde se logre acceso a compartimentos del cuerpo o fluidos que contienen producto génico relacionado con colitis ulcerosa. En el caso de tejidos inflamados, malignos o de otro modo comprometidos, estos procedimientos pueden incluir aplicación directa de una formulación que contiene los antagonistas. Tales procedimientos incluyen administración intravenosa de una composición líquida, administración transdérmica de un líquido o formulación sólida, administración tópica oral o administración intersticial o interoperatoria. La administración puede afectarse por la implantación de un dispositivo cuya función primaria puede no ser como un vehículo de administración de fármaco.

Para anticuerpos, la dosificación preferida es aproximadamente 0,1 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal (generalmente aproximadamente 10 mg/kg a 20 mg/kg). Si el anticuerpo va a actuar en el cerebro, una dosificación de aproximadamente 50 mg/kg a 100 mg/kg es normalmente apropiada. Generalmente, anticuerpos parcialmente humanos y anticuerpos completamente humanos tienen una mayor semivida dentro del cuerpo humano que otros anticuerpos. Por consiguiente, el uso de menores dosificaciones y administración menos frecuente es frecuentemente posible. Las modificaciones, tales como lipidación, pueden usarse para estabilizar anticuerpos y para potenciar la captación y penetración de tejido (por ejemplo, en el cerebro). Un procedimiento para la lipidación de anticuerpos se describe por Cruikshank y col. ((1997) J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193).

Las moléculas de ácidos nucleicos de antagonistas de producto génico relacionado con colitis ulcerosa pueden insertarse en vectores y usarse como vectores de terapia génica. Los vectores de terapia génica pueden administrarse a un sujeto por, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (patente de EE.UU. nº 5.328.470) o por inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054- 3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que se incorpora el vehículo de administración génica. Alternativamente, si el vector de administración génica completo puede producirse intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de administración génica.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, envase o dispensador, junto con instrucciones para administración.

Farmacogenómica

Los agentes, o moduladores que tienen un efecto estimulante o inhibidor sobre la actividad o expresión de un polipéptido de producto génico relacionado con colitis ulcerosa como se identifica por un ensayo de cribado descrito en el presente documento, pueden administrarse a individuos para tratar (profilácticamente o terapéuticamente) trastornos asociados a actividad anómala del polipéptido. Conjuntamente con tal tratamiento puede considerarse la farmacogenómica (es decir, el estudio de la relación entre el genotipo de un individuo y la respuesta de ese individuo a un compuesto o fármaco extraño) del individuo. Las diferencias en el metabolismo de agentes terapéuticos pueden conducir a toxicidad grave o fallo terapéutico que altera la relación entre dosis y concentración en sangre del fármaco farmacológicamente activo. Así, la farmacogenómica del individuo permite la selección de agentes eficaces (por ejemplo, fármacos) para tratamientos profilácticos o terapéuticos basados en una consideración del genotipo del individuo. Tal farmacogenómica puede usarse adicionalmente para determinar dosificaciones y pautas terapéuticas apropiadas. Por consiguiente, la actividad de un polipéptido de producto génico relacionado con colitis ulcerosa, la expresión de un ácido nucleico de producto génico relacionado con colitis ulcerosa, o contenido de mutaciones de un gen de producto génico relacionado con colitis ulcerosa en un individuo, pueden determinarse para así seleccionar un agente(s) apropiado(s) para el tratamiento terapéutico o profiláctico del individuo.

La farmacogenómica trata de variaciones hereditarias clínicamente significativas en respuesta a fármacos debido a disposición de fármacos alterada y acción anormal en personas afectadas. Véase, por ejemplo, Linder (1997) Clin. Chem. 43(2): 254-266. En general, pueden diferenciarse dos tipos de condiciones farmacogenéticas. Las condiciones genéticas transmitidas como un único vector que alteran la forma en la que los fármacos actúan sobre el cuerpo se denominan “acción de fármaco alterada”. Las condiciones genéticas transmitidas como factores individuales que alteran la forma en la que el cuerpo actúa sobre fármacos se denominan “metabolismo de fármacos alterado”. Estas condiciones farmacogenéticas pueden producirse o bien como defectos raros o como polimorfismos. Por ejemplo, la deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) es una enzimopatía heredada común en la que la principal complicación clínica es la hemólisis después de la ingestión de fármacos oxidantes (antipalúdicos, sulfonamidas, analgésicos, nitrofuranos) y consumo de habas.

Como realización ilustrativa, la actividad de enzimas metabolizantes de fármaco es un determinante importante de tanto la intensidad como la duración de la acción del fármaco. El descubrimiento de polimorfismos genéticos de enzimas metabolizantes de fármaco (por ejemplo, N-acetiltransferasa 2 (NA 2) y enzimas de citocromo P450 CYP2D6 y CYP2C19) ha proporcionado una explicación en cuanto a por qué algunos pacientes no obtienen los efectos del fármaco esperados o muestran exagerada respuesta de fármacos y grave toxicidad después de tomar la dosis convencional y segura de un fármaco. Estos polimorfismos se expresan en dos fenotipos en la población, el metabolizador extensivo (ME) y el metabolizador pobre (MP). La prevalencia de MP es diferente entre diferentes poblaciones. Por ejemplo, el gen que codifica CYP2D6 es altamente polimórfico y se han identificado varias mutaciones en MP, conduciendo todas a la ausencia de CYP2D6 funcional. Los metabolizadores pobres de CYP2D6 y CYP2C19 experimentan bastante frecuentemente respuesta de fármaco y efectos secundarios exagerados cuando reciben dosis convencionales. Si un metabolito es el resto terapéutico activo, un MP no mostrará respuesta terapéutica, como se demuestra para el efecto analgésico de codeína mediada por su morfina de metabolito formada por CYP2D6. El otro extremo son los llamados metabolizadores ultra-rápidos, que no responden a dosis convencionales. Recientemente, la base molecular del metabolismo ultra-rápido se ha identificado por ser debido a amplificación génica de CYP2D6.

Así, la actividad de una colitis ulcerosa u otro polipéptido de producto génico relacionado con trastorno gastrointestinal, expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido, o contenido de mutaciones de un gen que codifica el polipéptido en un individuo, puede determinarse para así seleccionar agente(s) apropiado(s) para tratamiento terapéutico o profiláctico del individuo. Además, pueden usarse estudios farmacogenéticos para aplicar el genotipado de alelos polimórficos que codifican enzimas metabolizantes de fármacos a la identificación de un fenotipo de sensibilidad a fármaco individual. Este conocimiento, cuando se aplica a la selección de dosificación o fármaco, pueden evitar reacciones adversas o fallo terapéutico, y así potenciar la eficiencia terapéutica o profiláctica cuando se trata un sujeto con un modulador de actividad o expresión del polipéptido, tal como un modulador identificado por uno de los ensayos de cribado a modo de ejemplo descritos en el presente documento.

Procedimientos de tratamiento

En el presente documento se desvelan procedimientos profilácticos y terapéuticos para tratar un sujeto en riesgo de (o susceptible a) un trastorno o que tiene un trastorno asociado a expresión o actividad anómala de un polipéptido de producto génico relacionado con colitis ulcerosa y/o en el que participa el polipéptido de producto génico relacionado con colitis ulcerosa.

En el presente documento se desvela un procedimiento para modular o tratar enfermedad o afección relacionada con producto génico relacionado con colitis ulcerosa, en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente, como se conoce en la técnica o como se describe en el presente documento, usando un antagonista de producto génico relacionado con colitis ulcerosa. Las composiciones de antagonista de producto génico relacionado con colitis ulcerosa pueden encontrar uso terapéutico en el tratamiento de colitis ulcerosa o afecciones relacionadas, tales como colitis ulcerosa u otros trastornos mediados por TNF.

En el presente documento se desvela un procedimiento para modular o tratar una enfermedad inmunorrelacionada mediada por TNF en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente, que incluye, pero no se limita a, úlcera gástrica, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, patología de Crohn, y similares. Véanse, por ejemplo, the Merck Manual, 12ª-17ª ediciones, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells y col., eds., segunda edición, Appleton y Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000).

Los trastornos caracterizados por expresión o actividad anómalas de los polipéptidos de producto génico relacionado con colitis ulcerosa se describen adicionalmente en cualquier parte en esta divulgación.

Procedimientos profilácticos

En el presente documento se desvela un procedimiento para prevenir sustancialmente en un sujeto una enfermedad

o afección asociada a una expresión o actividad anómala de un polipéptido de producto génico relacionado con colitis ulcerosa, administrando al sujeto un agente que modula la expresión o una actividad del polipéptido. Sujetos en riesgo de una enfermedad que es causada o contribuida por la expresión o actividad anómala de un producto génico relacionado con colitis ulcerosa pueden identificarse, por ejemplo, por cualquiera o una combinación de ensayos de diagnóstico o de pronóstico como se describen en el presente documento. La administración de un agente profiláctico puede producirse antes de la manifestación de síntomas característicos de la aberración, de forma que una enfermedad o trastorno se prevenga o, alternativamente, retrase en su progresión. Dependiendo del tipo de aberración, por ejemplo, un agente agonista o antagonista puede usarse para tratar el sujeto. El agente apropiado puede determinarse basándose en ensayos de cribado descritos en el presente documento.

Procedimientos terapéuticos

En el presente documento se desvelan procedimientos de modulación de la expresión o actividad del gen o producto génico relacionado con colitis ulcerosa para fines terapéuticos. El procedimiento modulador implica poner en contacto una célula con un agente que modula una o más de las actividades del polipéptido. Un agente que modula actividad puede ser un agente como se describe en el presente documento, tal como un ácido nucleico o una proteína, un ligando relacionado que se produce naturalmente del polipéptido, un péptido, un peptidomimético, u otra molécula pequeña. En una realización, el agente estimula una o más de las actividades biológicas del polipéptido. En otra realización, el agente inhibe una o más de las actividades biológicas del polipéptido de gen o producto génico relacionado con colitis ulcerosa. Ejemplos de tales agentes inhibidores incluyen moléculas de ácidos nucleicos antisentido y anticuerpos y otros procedimientos descritos en el presente documento. Estos procedimientos moduladores pueden realizarse in vitro (por ejemplo, cultivando la célula con el agente) o, alternativamente, in vivo (por ejemplo, administrando el agente a un sujeto). Como tal, en el presente documento se desvelan procedimientos para tratar un individuo aquejado con una enfermedad o trastorno caracterizado por expresión o actividad anómala de un polipéptido de producto génico relacionado con colitis ulcerosa. En una realización, el procedimiento implica administrar un agente (por ejemplo, un agente identificado por un ensayo de cribado descrito en el presente documento), o combinación de agentes que modulan (por ejemplo, regula por incremento o regula por disminución) la expresión o actividad. La inhibición de la actividad se desea en situaciones en las que la actividad o expresión se regule anormalmente alta o por incremento y/o en las que es probable que la actividad disminuida tenga un efecto beneficioso.

Mientras que se ha descrito la invención en términos generales, las realizaciones de la invención se desvelarán adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes del alcance de las reivindicaciones.

Abreviaturas:

ACT 1 ensayo 1 de colitis ulcerosa activa ANOVA análisis de la varianza C5a complemento 5a CD célula dendrítica TFD tasa de falso descubrimiento CEI célula epitelial intestinal IL interleucina ARNm ARN mensajero PMN leucocitos polimorfonucleares TLR receptor similar a toll TNFa factor de necrosis tumoral alfa Th linfocitos T colaboradores TREM-1 receptor desencadenante expresado sobre células mieloides CU colitis ulcerosa

EJEMPLO 1

Usando biopsias de mucosa colónica obtenidas de un subgrupo de pacientes en un estudio clínico se realizó un análisis retrospectivo de ARN mensajero (ARNm). Se identificaron patrones de expresión de ARNm que proporcionaban un perfil molecular antes del tratamiento con infliximab que distingue pacientes que responden al tratamiento de pacientes que no responden al tratamiento. Las moléculas identificadas se usaron para definir distintivos de respuesta molecular de 20 y 5 genes, que clasificaron con exactitud pacientes como pacientes que respondían al tratamiento o pacientes que no respondían al tratamiento.

Los conjuntos de sondas distintivas de respuesta se aplicaron a una segunda cohorte independiente de pacientes. Los resultados confirmaron la capacidad de los conjuntos de sonda para clasificar con exactitud sujetos antes del tratamiento con infliximab.

Infliximab, un anticuerpo monoclonal anti-TNFa, es un tratamiento eficaz para colitis ulcerosa (CU) que induce que más del 60% de los pacientes respondan al tratamiento. Por consiguiente, aproximadamente el 40% de los pacientes no responden. Este experimento analizó la expresión génica de mucosa de pacientes enrolados en un ensayo clínico (“ACT1”) para proporcionar un distintivo de respuesta predictiva para el tratamiento con infliximab.

Veintidós pacientes se sometieron a colonoscopias con biopsia antes del tratamiento con infliximab. La respuesta a infliximab se definió como curación endoscópica e histológica en la semana 8. Se aisló ARN mensajero de biopsias pre-infliximab, se marcó y se hibridó con una matriz Affymetrix HGU133Plus_2.0. El distintivo de respuesta predictiva se verificó por un conjunto de datos independientes.

Cuando se compararon el perfil de expresión de mucosa de 12 pacientes que responden al tratamiento con infliximab y 10 pacientes que no responden al tratamiento con infliximab se identificaron 109 conjuntos de sondas diferencialmente expresadas. Se enriquecieron los genes ligados a funciones de células neutrófilas, función de la barrera epitelial mucosa y respuestas inmunitarias innatas. De estos 109 genes se definió un distintivo de respuesta predictiva de 20 conjuntos de sonda que muestra una exactitud global del 95,4 % (21/22), sensibilidad del 91,7 % (11/12 pacientes que responden al tratamiento) y especificidad del 100 % (10/10 pacientes que no responden al tratamiento). Una reducción a conjuntos de cinco sondas mantuvo la exactitud global del 90,9 % (20/22), sensibilidad del 91,7 % (11/12 pacientes que responden al tratamiento) y especificidad del 90,0 % (9/10 pacientes que no responden al tratamiento). Ambos distintivos del conjunto de sondas se validaron en una cohorte independiente dando precisiones globales del 75 % (18/24), sensibilidades del 87,5 % (7/8 pacientes que responden al tratamiento) y especificidades del 68,8 % (11/16 pacientes que no responden al tratamiento). Los datos de micromatrices se depositaron en Gene Expression Omnibus bajo el número de acceso de serie GSE12251 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=rdatvkmqcaiqizk&acc=GSE12251).

Materiales y procedimientos

Se recogieron biopsias de pacientes en los momentos de tiempo especificados en el protocolo de un subconjunto de paciente aleatorizados a ACT1. Se analizaron veintitrés biopsias obtenidas en la semana 0 de un subgrupo de 22 pacientes que recibieron tanto 5 como 10 mg/kg de infliximab (11 biopsias de 10 pacientes que no responden al tratamiento y 12 biopsias de 12 pacientes que responden al tratamiento; dos de las biopsias de pacientes que no responden al tratamiento se obtuvieron en el plazo de dos semanas del mismo sujeto). La respuesta se determinó en la semana 8. La respuesta a infliximab se definió como curación de la mucosa completa (es decir, subpuntuación endoscópica de Mayo de 0 ó 1) y un grado de 0 ó 1 en la puntuación histológica para CU. Los pacientes que no consiguieron curación de la mucosa se consideraron pacientes que no responden al tratamiento, aunque algunos pacientes mostraron mejora histológica. Las características de referencia de esta cohorte se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1: Características de referencia de las cohortes del estudio

ACT1 COHORTE

Características

Respondedores (n=12) No respondedores (n=10)

Hombre/mujer

6/6 4/6

Edad media al inicio del estudio (años)

39.0 (29-70) 51.5 (24-68)

Peso mediao al inicio del estudio (kg)

75 (63.0-159.0) 69.0 (46.0-102.0)

Duración media de la enfermedad al inicio del estudio (años)

5.9 (1.6-42.1) 5.7 (2.9-26.8)

Media de Proteina C reactiva al inicio del estudio (mg/dL)

0.7 (0.2-2.9) 1.35 (0.2-6.8)

Medicación concomitante al inicio del estudio

5-Aminosalicylatos

1 1

Corticoesteroides

8 6

Azathioprina/6-Mercaptopurina

2 3

Corticoesteroides + Immunosupresantes

0 0

Tabquismo activo al inicio del estudio

1 0

Se recogieron biopsias intestinales 15 a 20 centímetros distales del borde anal durante endoscopias realizadas en la semana 0. Las biopsias se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se guardaron a menos 80 ºC hasta que se procesaron. Se aisló ARN total con el mini-kit RNeasy según las instrucciones del fabricante (Qiagen Inc., Valencia, CA). La calidad y cantidad de ARN se analizaron con un bioanalizador 2100 (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA).

Se obtuvo una cohorte de validación independiente de datos de expresión de ARNm de biopsia de 24 pacientes con CU tratados con IFX del Hospital Universitario de Gasthuisberg, Lovaina, Bélgica. Las biopsias se obtuvieron en el plazo de una semana antes de la infusión intravenosa de 5 mg/kg de IFX. Las biopsias se congelaron a -80 ºC antes del procesamiento para la expresión de ARNm. La respuesta a IFX se determinó 4-6 semanas después de la infusión, con respuesta definida como antes. Los especímenes de la cohortes de Lovaina se procesaron para aislamiento e hibridación de ARNm usando los mismos procedimientos que se usaron para los especímenes de ACT1.

La hibridación de micromatrices se realizó sobre matrices GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 según el protocolo del fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA). El chip permite el análisis de expresión de más de 47.000 transcritos y variantes, que incluyen 38.500 genes humanos bien caracterizados. Los chips se barrieron con un escáner 3000 de GeneChip, y la intensidad de fluorescencia para cada rasgo de la matriz se obtuvo con el software GeneChip Operating versión 1.4 (Affymetrix, Santa Clara, CA). Los datos se depositaron en Gene Expression Omnibus bajo el número de acceso de serie GSE12251 (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/geo/query/acc.cgi?token=rdatvkmqcaiqizk&acc=GSE12251). Los datos de la cohorte de validación también se depositaron en Gene Expression Omnibus bajo el número de acceso de serie GSE10892 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.Ggi?loken=dlyphyokcomkmto&acc=GSE 10892).

La calidad de datos se evaluó por distribución de la intensidad de hibridación y correlación de Pearson con Partek Genomic Suite 6.3 (Partek Inc., St. Charles, MO). Los coeficientes de correlación de Pearson oscilaron de 0,80 a 1,0.

La intensidad de conjuntos de sondas se normalizaron a lo largo de todas las muestras usando GeneSpringGX 7.3 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

Las diferencias significativas entre muestras de pacientes que no responden al tratamiento y pacientes que responden al tratamiento con infliximab se identificaron usando análisis de la varianza (ANOVA) sobre intensidades normalizadas transformadas con log 2. Se aplicó una tasa de falso descubrimiento del 5 % (TFD) para múltiples correcciones de pruebas. Se seleccionaron transcritos con expresión diferencial superior a 2 veces para analizar la comparación. Para excluir conjuntos de sondas que pasaron el ANOVA y el filtro del cambio de veces, pero no fueron detectados en ambas condiciones de una comparación por pares, solo se seleccionaron aquellas muestras designadas como “presentes” (detectadas) o “marginales” (detección limitada) entre muestras que representan la condición.

La clasificación de sensibilidad a infliximab para cada muestra de paciente se generó con el algoritmo 'K-Nearest Neighbours” usando GeneSpring GX 7.3. Se evaluó un clasificador que contiene transcriptos que muestran expresión diferencial significativa entre paciente que no responde al tratamiento (n=11 muestras) y paciente que responde al tratamiento (n=12 muestras) antes del tratamiento con infliximab por validación cruzada dejando uno fuera. Se calculó un valor de p para medir la probabilidad de una muestra de prueba que se clasificó por causalidad. Se usó la prueba exacta de Fisher para seleccionar los mejores transcritos predictivos.

El análisis del agrupamiento jerárquico se aplicó a datos obtenidos de los análisis de datos de micromatrices. El agrupamiento se ejecutó usando la correlación de Pearson entre los perfiles de expresión de dos genes o pacientes para calcular la matriz de similitud en GeneSpringGX 7.3. Los resultados se visualizaron como un mapa de calor bidimensional con dos dendrogramas, uno que indica la similitud entre pacientes y el otro que indica la similitud entre genes.

Se realizó el análisis de enriquecimiento de la anotación de Gene usando en línea DAVID de los Institutos Nacionales de Salud (http://david.abcc.ncifcrf.gov/). La significancia estadística se determinó usando la prueba exacta de Fisher. Las categorías funcionales con un valor de p ≤ 0,05 se consideraron significativas.

Resumen de resultados

El perfil de expresión de biopsias de mucosa en la semana 0 antes del tratamiento con infliximab se estableció a partir de 22 pacientes (11 biopsias de 10 pacientes que no responden al tratamiento y 12 biopsias de 12 pacientes que responden al tratamiento; dos de las biopsias de pacientes que no responden al tratamiento se obtuvieron en el plazo de dos semanas del mismo sujeto) basándose en la respuesta a infliximab en la semana 8. Un total de conjuntos de 109 sondas, 102 regulados por disminución y 7 regulados por incremento, pasaron una TFD del 5% y un corte diferencial de dos veces que representaba 86 genes (Figura 10). Cuando se clasificaron en procesos biológicos, hubo una predominancia de procesos inmunitarios innatos. Los cinco procesos inmunitarios innatos más predominantes fueron respuesta de defensa, respuesta inmunitaria, transducción de señales, respuesta a otros organismos y respuesta a plagas, patógenos o parásitos (Figura 1). Conjuntos de diez sondas fueron citocinas/quimiocinas o receptores de citocinas/quimiocinas. En el conjunto de sondas se incluyó CXCL8/interleucina (IL)-8, una quimiocina quimiotáctica para leucocitos polimorfonucleares neutrófilos (PMN). Los receptores para CXCL8/IL-8, CXCR1/IL-8RA y CXCR2/IL-8RB también estuvieron presentes. También estuvo presente CXCL11/I-TAC, un factor quimiotáctico que activa linfocitos T y linfocitos citolíticos espontáneos. Finalmente, IL-1β, IL-1RN y IL-11, fueron todos regulados por disminución más de cuatro veces cuando se compararon pacientes que respondían al tratamiento con pacientes que no respondían al tratamiento (Figura 10).

Análisis de la predicción de clases de pacientes que responden al tratamiento y pacientes que no responden al tratamiento

Se usó la prueba exacta de Fisher para seleccionar los mejores conjuntos predictivos de sondas que distinguen pacientes que responden al tratamiento de pacientes que no responden al tratamiento dentro de los conjuntos de 109 sondas que se muestra que se expresan diferencialmente en la semana 0 (Figura 10). Un subconjunto de conjuntos de 20 sondas clasificaron pacientes que responden al tratamiento y pacientes que no responden al tratamiento en la semana 0 (Figura 7) con una exactitud global del 95,4 % (21/22), sensibilidad del 91,7 % (11/12 pacientes que responden al tratamiento) y especificidad del 100 % (10/10 pacientes que no responden al tratamiento) (Figura 7). Se representaron genes que participan en las respuestas inmunitarias (por ejemplo IL-1β, TLR2, TREM1 o LILRA2), transducción de señales (por ejemplo PDE4B, NAMPT o FCN1) o rutas de señalización de proteínas de receptores acoplados a proteína G (por ejemplo, GPR109B, C5AR1 o FPRL1). Ocho de estos 20 genes se expresaron por PMN, que están presentes en grandes números en la mucosa colónica de pacientes con CU activo. El agrupamiento jerárquico del clasificador del conjunto de 20 sondas mostró una clara separación entre pacientes que responden al tratamiento y pacientes que no responden al tratamiento (Figura 3). Posteriormente se determinó el número mínimo de transcritos que permiten una clasificación equivalente. Un clasificador que contiene tan solo conjuntos de 5 sondas seleccionadas de las 20 anteriores pudo alcanzar una exactitud global del 90,9 % (20/22), sensibilidad del 91,7 % (11/12 pacientes que responden al tratamiento) y especificidad del 90,0 % (9/10 pacientes que no responden al tratamiento) (Figuras 3 y 7). Los 5 genes obtenidos fueron BCL6, CSAR1, FPRL1, OSM y tx82a04.x1, un gen similar a CREB5. Tanto BCL6 como tx82a04.x1 tuvieron potencia predictiva ligeramente mayor mientras que los 3 genes restantes tuvieron igual potencia predictiva. De importancia, cualquiera de los 15 genes restantes sustituiría C5AR1, FPRL1 y OSM sin ninguna pérdida en la calidad predictiva del clasificador del conjunto de 5 sondas (datos no mostrados). El agrupamiento jerárquico del clasificador del conjunto de 5 sondas a través de los 10 pacientes que no responden al tratamiento y 12 pacientes que responden al tratamiento mostró separación sorprendente (Figura 3) con un perfil de expresión muy contrastado a través de los conjuntos de 5 sondas cuando se compararon pacientes que responden al tratamiento con pacientes que no responden al tratamiento. El único paciente erróneamente clasificado que responde al tratamiento tuvo un perfil de expresión muy similar a pacientes que no responden al tratamiento, con la excepción de tx82a04.x1, que es similar a CREB5 (Figuras 2 y 3). Finalmente, la Figura 4 muestra una representación del diagrama de puntos del clasificador de 5 genes usando las intensidades sin procesar normalizadas en las que se observa una diferencia marcada para cada uno de los cinco genes en el nivel inicial comparando pacientes que responden al tratamiento con pacientes que no responden al tratamiento.

Validación de la predicción de clases

Los presentes inventores validaron a continuación tanto los clasificadores del conjunto de 20 como de 5 sondas usando la cohorte de Lovaina como prueba de validación independiente compuesta por 8 pacientes que responden al tratamiento y 16 pacientes que no responden al tratamiento. Las precisiones globales del 75 % (18/24), sensibilidades del 87,5 % (7/8 pacientes que responden al tratamiento) y especificidades del 68,8 % (11/16 pacientes que no responden al tratamiento) se obtuvieron para ambos clasificadores. El agrupamiento jerárquico del clasificador del conjunto de 20 sondas entre los 8 pacientes que responden al tratamiento y 16 pacientes que no responden al tratamiento mostró que los 4 pacientes que no responden al tratamiento erróneamente clasificados y el 1 paciente que responde al tratamiento erróneamente clasificado tienen perfiles de expresión muy similares a pacientes que responden al tratamiento y pacientes que no responden al tratamiento, respectivamente (Figura 5).

Dos criterios rigurosos que definen respuesta a infliximab (curación endoscópica e histológica) dio conjuntos de 109 sondas diferencialmente expresadas en la semana 0 que representaban 86 genes. Estos conjuntos de sondas pasaron todos un 5% de TFD y un corte de expresión diferencial de dos veces. Dos distintivos de respuestas predictivas, uno un conjunto de 20 sondas y uno de sub-conjuntos de 5 de las 20, se establecieron y se verificaron usando una cohorte independiente. Los cuatro pacientes que no responden al tratamiento se habían clasificado erróneamente, pero tenían patrones de expresión que se parecían a los de pacientes que respondían al tratamiento de los 109 genes diferencialmente expresados en la semana 0. Esto sugiere que estos pacientes no son ni lentos ni manifiestan un beneficio clínico del tratamiento con infliximab o tienen factores que influyen en su respuesta clínica no evidente mediante el perfilado de expresión mucosa en la semana 0. Un paciente que responde al tratamiento de la cohorte de ACT1 se clasificó erróneamente por los clasificadores del conjunto de 20 y 5 sondas, mientras que un paciente que responde al tratamiento en la cohorte de validación independiente se clasificó erróneamente (Figuras 2, 3, y 5).

Varios de los genes expresados antes del tratamiento con infliximab participan en la regulación de la función de PMN. Los PMN representan un componente central de la respuesta inmunitaria innata que sirven de respondedores primarios a la exposición microbiana. Los PMN migran rápidamente a tejidos inflamados empleando fagocitosis, producción de especies de oxígeno reactivo y la liberación de mediadores inflamatorios y sustancias antimicrobianas como potentes mecanismos efectores. La entrada de PMN es común en CU como se muestra por el examen histológico de biopsias de mucosa colónica obtenidas de pacientes con CU activa, y se iguala por la extensa lesión de la mucosa y/o transmural que incluye edema, pérdida de células caliciformes, disminución de la producción mucosa, hiperplasia de células de la cripta, erosiones y ulceraciones. Por tanto, los PMN representan una importante patogénesis de CU que acciona e influye en los tipos de células. La normalización de la entrada y actividad de PMN es una parte integral de la respuesta a tratamiento con infliximab. Trece genes diferencialmente expresados en la semana 0 codifican proteínas tanto en la membrana de vesículas secretoras como la membrana plasmática de PMN (Figura 8). Siete (CSF3R, FCN1, FGR, FPRL1, OSM, NAMPT, TLR2) están incluidos en el panel de genes de respuesta del conjunto de 20 sondas predictivo y dos (FPRL y OSM) están incluidos en el panel de genes de respuesta del conjunto de 5 sondas predictivo (Figura 7). Además, todos se regulan por disminución entre pacientes que responden al tratamiento con infliximab cuando se comparan con pacientes que no responden al tratamiento en la semana 0, sugiriendo un estado de activación de PMN diferencial.

La unión del complemento 5a (C5a) al receptor del componente del complemento 5a (C5aR1) desempeña una función esencial en la inmunidad innata de PMN. Las interacciones de C5a-C5aR1 preservan las funciones inmunes innatas de PMN (quimiotaxia, fagocitosis, estallido respiratorio), atenúan la reacción inflamatoria, mejoran la coagulopatía, alteran la expresión de la molécula de adhesión y modulan la apoptosis. Sin embargo, se ha descrito que excesiva interacción de C5a-C5aR1 produce la parálisis de funciones de PMN, que a su vez pueden conducir a defensas comprometidas del huésped. Debido a que C5aR1 se reguló por disminución cuando se compararon pacientes que responden al tratamiento con pacientes que no responden al tratamiento con infliximab en la semana 0 (Figura 8), podría suponerse que las funciones de PMN pueden paralizarse parcialmente o totalmente en pacientes que no responden al tratamiento con infliximab produciendo defensa comprometida del huésped.

El receptor similar a toll (TLR) 2 y TLR4 son dos receptores que participan en la defensa del huésped, que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos específicos. Ambos se regularon por disminución en la semana 0 cuando se compararon pacientes que responden al tratamiento con pacientes que no responden al tratamiento con infliximab (Figura 7 y Figura 10). TLR2 y TLR4 se expresan en leucocitos que incluyen PMN y se expresan en exceso en CU cuando se compara con controles normales. Las células dendríticas (CD) reconocen y responden a estructuras microbianas mediante TLR. En el intestino, las CD son cruciales en la inducción de tolerancia y en dirigir la diferenciación de linfocitos T. En individuos sanos, algunas CD intestinales expresan TLR2 o TLR4; sin embargo, ambas están significativamente potenciadas en CU. Debido a la importancia de señales de TLR en el mantenimiento de la homeostasis de células epiteliales intestinales (CEI) y como las bacterias comensales tienen una función significativa en el mantenimiento de la homeostasis IEC, la señalización desregulada de TLR podría ser un factor contribuyente en CU.

El receptor desencadenante expresado sobre células mieloides (TREM-1) es un receptor expresado sobre la superficie de PMN y monocitos en presencia de componentes microbianos. TREM-1 se reguló por disminución cuando se compararon pacientes que responden al tratamiento con pacientes que no responden al tratamiento en la semana 0 (Figura 7). CXCL8/IL-8, CXCRI/IL-8RA y CXCR2/IL-8RB (Figura 7 y Figura 10) también se regularon por disminución, un hallazgo resaltado por el aumento de la expresión de estas moléculas en los especímenes de la mucosa intestinal de pacientes con CU. Por tanto, los elevados niveles de CXCL8/IL-8 en la mucosa rectal están significativamente asociados a recaída de CU. Finalmente, CXCL8/IL-8 puede iniciar la migración transepitelial de PMN. Estos genes también indican hacia una diferencia en la actividad de PMN en pacientes que no responden al tratamiento con infliximab.

BCL6 y el gen similar a CREB5 fueron los dos genes expresados en la semana 0 en el panel predictivo de 20 ó 5 con el mayor valor predictivo. BCL6 es un proto-oncogén que codifica una represor de la transcripción nuclear, con funciones cruciales en la formación de centros germinativos y la regulación de la función, diferenciación y supervivencia de linfocitos. Los ratones BCL6 muestran un fenotipo caracterizado por un defecto en la formación del centro germinativo y una respuesta inflamatoria multiorgánica masiva, especialmente el corazón y el pulmón, correspondiente a una respuesta hiperinmunitaria de Th2 típica. Por tanto, BCL6 regula la expresión de múltiples citocinas Th2 controlando la expresión del factor de transcripción GATA-3, sugiriendo que una respuesta de Th2 más activa está contribuyendo al estado de pacientes que no responden al tratamiento con infliximab. IL-13Ralfa2 fue la sonda de gen más significativa que distingue entre pacientes que responden al tratamiento y pacientes que no responden al tratamiento en CU y EII en general en la corte de validación. IL-13 es un regulador de la respuesta de Th2 y recientemente se ha supuesto que el receptor IL-13Ralfa2 participa en fibrogénesis.

La expresión alterada de IL-11 puede participar en la patogénesis de CU. La interleucina-11 tiene propiedades antiinflamatorias, y la regulación por disminución de este gen en pacientes con CU que responden a infliximab puede tener efectos positivos sobre la evolución de la enfermedad. Mientras que los polimorfismos del gen de interleucina11 y interleucina-1RN se han asociado a CU, IL-11 se ha asociado a elevada permeabilidad intestinal mediada por elevada expresión y actividad de proteínas MLCK.

Cuando los resultados de ambas cohortes se comparan existe un solapamiento muy significativo entre los dos distintivos de genes resaltando la inmunidad innata y desviando Th2 como esencial para la resolución de CU (Figura 6). Estos resultados también demuestran que múltiples distintivos de expresión génica en rutas comunes pueden usarse para predecir respuesta a IFX.

Los presentes inventores han usado análisis de expresión de ARNm para desarrollar un distintivo de respuesta predictiva para el tratamiento con infliximab en CU. Este distintivo proporciona percepción de la acción de infliximab a un nivel molecular. La expresión de genes que afectan PMN y las funciones de células Th2 fueron los más influyentes en predecir la respuesta a infliximab como era el caso en los resultados descritos para la cohorte de validación. Los presentes inventores proponen que en pacientes con CU, el gen de mucosa de estos genes explica ampliamente la falta de respuesta a tratamiento con infliximab observada en algunos pacientes tras 8 semanas de tratamiento.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0107]

<110> CENTOCOR ORTHO BIOTECH INC. LI, Katherine BARIBAUD, Frederic

<120> BIOMARCADORES PARA EL TRATAMIENTO ANTI-TNF EN COLITIS ULCEROSA Y TRASTORNOS RELACIONADOS

<130> CEN5228WOPCT

<140> Desconocido

<141> Adjunto

<150> 61/091,641

<151> 2009-08-25

<160> 203

<170> FastSEQ para Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 560

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para predecir la idoneidad de tratamiento con terapia anti-TNFa para un trastorno relacionado mediado por TNFa en un sujeto, que comprende:

   a) preparar una muestra de ácidos nucleicos de un espécimen obtenido del sujeto; y

   b) ensayar dicha muestra con un panel de segmentos de ácidos nucleicos marcados que se hibridan con BCL6 (acc. de GenBank nº AW264036; SEC ID Nº:118) y tx82a04.x1 (acc. de GenBank nº AI689210; SEC ID Nº:123), en el que la regulación por disminución de dichos genes se correlaciona con eficacia terapéutica para el tratamiento de un trastorno inflamatorio gastrointestinal.

2. 2.

   Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho ensayo comprende además ensayar una hibridación de ácido nucleico con un miembro seleccionado del grupo que consiste en C5AR1 (acc. de GenBank nº NM001736; SEC ID Nº: 119), FOLR1 (acc. de GenBank nº U81501; SEC ID Nº: 142) y OSM (acc. de GenBank nº A1079327; SEC ID Nº: 173).

3. 3.

   Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho ensayo comprende además ensayar la hibridación de ácido nucleico con un gen seleccionado de SEC ID Nº: 110 a 203.

4. 4.

   Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha terapia anti-TNFa está seleccionada del grupo que consiste en infliximab, golimumab, Enbrel™ y Humira™.

5. 5.

   Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho trastorno inflamatorio gastrointestinal está seleccionado del grupo que consiste en enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino y colitis ulcerosa.

6. 6.

   Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho trastorno inflamatorio gastrointestinal está seleccionado del grupo que consiste en formas leves, moderadas, graves, pediátricas y adultas.

7. 7.

   El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo anti-TNFa es golimumab o infliximab y el trastorno relacionado mediado por TNFa es colitis ulcerosa.

8. 8.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el perfil de expresión de los genes se mide usando una o más sondas de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1 a 109.

9. 9.

   Un procedimiento según la reivindicación 1 que es un procedimiento de prueba basado en matrices para predecir la idoneidad del tratamiento con una terapia anti-TNFa para un trastorno relacionado mediado por TNFa en un paciente, que comprende:

   a) preparar una mezcla de ácidos nucleicos de un espécimen obtenido del paciente;

   b) ensayar dicha muestra con un panel de sondas de ácido nucleico marcadas que se hibridan con BCL6 (acc. de GenBank nº AW264036; SEC ID Nº: 118) y tx82a04.x1 (acc. de GenBank nº AI689210; SEC ID Nº:123), en el que dichas sondas comprenden SEC ID Nº: 37, y SEC ID Nº: 41, en el que la regulación por disminución de dichos genes se correlaciona con eficacia terapéutica para el tratamiento de un trastorno inflamatorio gastrointestinal.

10. 10.

    Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho ensayo comprende además ensayar C5AR1 (acc. de GenBank nº NM001736; SEC ID Nº: 119), FOLR1 (acc. de GenBank nº U81501; SEC ID Nº: 142) u OSM (acc. de GenBank nº A1079327; SEC ID Nº: 173).

11. 11.

    Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho ensayo comprende además ensayar uno de los genes de SEC ID Nº: 110- 203

12. 12.

    Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicha terapia anti-TNFa está seleccionada del grupo que consiste en infliximab, golimumab, Enbrel™ y Humira ™, u otro fármaco biológico anti-TNF o de molécula pequeña.

13. 13.

    Uso de un kit que comprende oligonucleótidos o oligonucleótidos complementarios a un polinucleótido que codifica un gen marcador o la hebra complementaria del mismo y células que expresan los genes marcadores, en el que los genes marcadores están seleccionados del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos que codifican una porción de BCL6 (acc. de GenBank nº AW264036; ; SEC ID Nº: 118) y tx82a04.x1 (acc. de GenBank nº AI689210; SEC ID Nº: 123), en el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

14. 14.

    El uso según la reivindicación 13, en el que dichos genes marcadores comprenden además C5AR1 (acc. de GenBank nº NM001736; SEC ID Nº: 119), FOLR1 (acc. de GenBank nº U81501; SEC ID Nº: 142) u OSM (acc. de GenBank nº A1079327; SEC ID Nº: 173).

15. 15.

    El uso según la reivindicación 14, en el que dichos genes marcadores comprenden además un gen enumerado en SEC ID Nº: 110-203 y dichos oligonucleótidos comprenden una sonda de una cualquiera de SEC ID Nº 1-109.

    Destacado en negrita: Inicio clasificador IFX de las sondas