JP6216917B2 - ヒトオンコスタチンm抗体及び使用方法 - Google Patents
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Description
BSA=ウシ血清アルブミン;CDR=相補性決定領域;Cyno=カニクイザル(Macaca fascicularis);DN=糖尿性腎障害;ECD=細胞外ドメイン;FR=フレームワーク;H=重鎖;IPF=間質性肺関節炎;L=軽鎖;Ig=免疫グロブリン;Mab=モノクローナル抗体;OSM=オンコスタチンM;OA=変形性関節症;PBS=リン酸緩衝生理食塩水;RA=関節リウマチ;VL=可変軽鎖;VH=可変重鎖。
本明細書で使用されるとき、「抗体」は、抗体全体、及びその任意の抗原結合断片又は短鎖を含む。したがって、抗体は、本発明の抗体の中に組み込むことのできる、重鎖若しくは軽鎖の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)若しくはそのリガンド結合部、重鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク(FR)領域若しくはその任意の部分、又は結合タンパク質の少なくとも一部分などが挙げられるが、これらに限定されない免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む、任意のタンパク質又はペプチド含有分子を含む。用語「抗体」は、抗体、その消化断片、特定部分及び変異体を更に含むことを意図し、これには抗体模倣薬が挙げられ、又は抗体の構造及び/若しくは機能を模倣する抗体の部分若しくはその特定断片若しくは一部を含み、単鎖並びに単一ドメイン抗体及びその断片が挙げられる。機能的断片は、予め選択された標的に対する抗原結合断片を含む。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例は、(i)Fab断片、VL、VH、CL及びCH、ドメインからなる一価断片;(ii)F(ab’)2断片、ヒンジ領域にてジスルフィド架橋により結合された2つのFab断片を含む二価断片;(iii)VH及びCH、ドメインからなるFd断片;(iv)抗体の単腕(single arm)のVL及びVHドメインからなるFv断片、(v)VHドメインからなるdAb断片(Ward et al.,(1989)Nature 341:544〜546);並びに(vi)単離された相補性決定領域(CDR)を含む。更に、Fv断片の2つのドメイン、VL及びVHは別個の遺伝子によりコードされているが、これらのドメインは組み換え方法を使用して合成リンカーにより連結することができ、合成リンカーは、VL及びVH領域を対にして、一価分子を形成する単一タンパク質鎖(単鎖Fv(scFv)として知られる、例えば、Birdら(1988)Science 242:423〜426、及びHustonら(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA 85:5879〜5883を参照のこと)として作製することを可能にする。そのような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることを意図する。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を使用して得られ、これらの断片はインタクト抗体と同一の方法で、有用性に関してスクリーニングされる。逆に、scFvコンストラクトのライブラリを使用して抗原結合能力に関してスクリーニングした後、従来の技術を使用して、ヒト生殖系列遺伝子配列をコードする他のDNAにスプライスしてもよい。そのようなライブラリの1つの例は、「HuCAL:ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリ」(Knappik,A.et al.J Mol Biol(2000)296(1):57〜86)である。
本発明は、OSMタンパク質及び開裂生成物を結合し、それらの生物学的活性を中和することができる単離されたMabを提供する。特に、本発明のOSM結合mAbは、gp130に対するOSM結合を遮断する、又はOSM結合gp130によるLIFRa又はOSMRbの動員を防止することができる。いずれの場合においても、本発明のOSM mAbは、OSM誘導gp130受容体シグナル伝達を遮断することができる。
OSMの存在下で細胞の増殖を回復させる、組織外植片における関節内(関節部)マトリックスのOSM誘発軟骨細胞分解を阻害する、
ヒト肺線維芽細胞におけるOSM依存STAT3リン酸化反応を効率的に中和する、及びOSM誘発サイトカイン放出を防止する能力を示す。
本発明のOSM中和抗体は、インビトロ、原位置、及び/又はインビボで少なくとも1つのOSM活性又はOSM受容体結合を阻害する、遮断する、又はそれに干渉し、OSM活性又はリガンド結合を促進、刺激、誘発、又は作動させず、そしてまた抗体結合がOSM受容体のOSM誘導ライゲーションの下流作用、特に、宿主細胞のシグナル伝達等の、OSMとのgp130相互作用も模倣しない抗体である。好適なOSM中和抗体、特定部分、又は変異体は、任意に、これらに限定されないが、RNA、DNA、又はタンパク質合成、タンパク質放出、細胞活性化、増殖又は分化、抗体分泌、OSM受容体シグナル伝達、OSM開裂、OSM結合、OSM又はgp130の誘発、合成、又は分泌等の、少なくとも1つのOSM活性又は機能に影響を及ぼすこともできる。
1.100pM未満のKDでヒトOSMに結合する、
2.500pM未満のKDでカニクイザルOSMに結合する、
3.2ng/mLのヒトOSMの存在下で、OSMの不在下の90%のレベルまでA375−S2細胞の増殖を回復させることができる、
4.2ng/mLのカニクイザルOSMの存在下で、OSMの不在下の90%のレベルまでA375−S2細胞の増殖を回復させることができる、
5.組織外植片における関節内(関節部)マトリックスのOSM誘発軟骨細胞分解を阻害する、
6.正常なヒト肺線維芽細胞(NHLF)におけるOSM依存STAT3リン酸化反応を効率的に中和する、又は
7.マウスにおいてOSMで全身誘発された後のサイトカイン放出を遮断する等の、本発明の抗体の特異的な機能特性を有する。
本明細書において、配列番号1、3、8のライブラリフレームワークを含む指定される重鎖及び軽鎖配列を含み、かつ配列番号13〜28、30〜46のCDRを有する、M5、M6、M9、M10、M42、M45、M53、M54、M55、M62、M63、M65、M66、M67、M68、M69、M71、及びM83により例示される、所望の生物活性スペクトルを示すOSM中和抗体は、様々な技法により生成され得る。
ファージ提示技術の特定の実施形態では、Shi et al.J Mol Biol 397:385〜396,2010、第WO29085462A1号、及びUS第12/546850号に記載され、本明細書に更に詳述される、pIXファージコートタンパク質上に提示される合成Fabライブラリは、ヒト生殖系列遺伝子由来のヒトIgG配列のレパートリーから結合剤を選択するために使用される。ライブラリは、配列が天然源から単離されたヒト抗体に存在することが観察された頻度に基づき選択された既知のIGV及びIGJ生殖系列配列によりコードされた4つのVL及び3つのVHドメイン上に構築された。選択されたVH(IMGT命名法)は、IGHV1〜69(配列番号1)、IGHV3〜23(配列番号2)、又はIGHV5〜51(配列番号3)である。VH設計における多様性は、CDR3領域に可変長の配列を有する重鎖を生成し、一定の長さを保持するH−CDR1及びH−CDR2において多様性位置を制限する。フレームワーク4(H−FR4)は、ライブラリの全メンバーの中で一定に保たれた(配列番号4)。
この場合、323ライブラリにおいて、X1は、S、D、N、又はTであってもよく、X2は、A、G、又はWであってもよく、X3は、S又はHであってもよく、X4は、V、A、N、又はGであってもよく、X5は、S、N、K、又はWであってもよく、X6は、Y、S、G、又はQであってもよく、X7は、S又はDであってもよく、X8は、S又はGであってもよい。
−(D)−(N)n(N+O)m(F)DY− (I)
式中、
(D)=Asp(D)及びGly(G)豊富位置。
(N)n=Ala(A)及びGly(G)豊富位置、n=3−7。
(O)m=Ala(A)、Gly(G)、及びY(Tyr)豊富、m=1−4。
(F)=Phe(F)優先位置。
本明細書に開示されるヒトMabの特徴を備えたOSM結合抗体が作製されるか、又は結合断片が、Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法(ハイブリドーマ法)を含む、多くの方法により形成された免疫グロブリンドメインから供給され得る。ハイブリドーマ法では、マウス又はハムスター若しくはマカクザル等の他の適切な宿主動物を上記のように免疫して、免疫に用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する又は産生し得るリンパ球を誘発する。代替的に、リンパ球はインビトロで免疫化されてもよい。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59〜103(Academic Press,1986))。
本発明は更に、ヒトOSMに結合するヒト免疫グロブリン(又は抗体)を提供する。これらの抗体はまた、遺伝子操作を受けた又は適応されたとして特徴付けされ得る。免疫グロブリンは、実質的にヒト生殖系列免疫グロブリンからの可変領域(複数可)を有し、抗原認識に関与することが知られる残基において指向された変形、例えば、KabatのCDR又は構造的に画定されるような高頻度可変ループを含む。存在する場合、定常領域(1つ以上)も、実質的にヒト免疫グロブリンからである。ヒト抗体は、少なくとも約10-6M(1マイクロM)、約10-7M(100nM)、10-9M(1nM)以下のOSMに対するKDを示す。親和性の変化に影響を及ぼす、例えば、OSMに対するヒト抗体の親和性を改善する、又はそのKDを減少させるために、CDR残基又は他の残基のいずれかの置換が行われ得る。
以下により詳細に記載されるように、本発明は、M5、M6、M9、M10、M42、M45、M53、M54、M55、M62、M63、M65、M66、M67、M68、M69、M71、及びM83の可変ドメインを有する単離されたモノクローナル抗体がOSM上の重複エピトープに結合し、インビトロ及び/又はインビボOSM阻害活性を提示することを示す。有意に、選択されたMAbの反応性は、gp130とのOSM相互作用を用量依存的に遮断する、gp130の存在下でOSMシグナル伝達を減少させる、A375細胞のOSM刺激された増殖を減少させる、マクロファージ刺激された軟骨細胞コラーゲン産生を防止する、又はインビボでOSMによるサイトカイン放出を減少させる能力を含む。
本発明のOSM中和抗体、その抗原結合断片、又は特定の変異体を使用して、細胞、組織、臓器又は動物(哺乳動物及びヒトを含む)内で測定し又は効果をもたらして、OSM又OSMを発現する細胞により媒介、影響又は調節される状態の発生を診断し、監視し、調節し、治療し、軽減し、予防を補助する、又は状態の症状を軽減することができる。よって、本発明は、当該技術分野において既知のように、又は本明細書に記載されているように、本発明の少なくとも1つのOSM抗体を用いて、細胞、組織、臓器、動物、又は患者における少なくとも1つのOSM関連疾患を調節又は治療するための方法を提供する。
本発明の発明者は、OSMが軟骨破壊を媒介することを示し、OSMが組織外植片からの関節内マトリックスにおいて、軟骨細胞分解をもたらすことを示した。OSMは、T.Cawston et al(1998,Arthritis and Rheumatism,41(10)1760〜1771)に示されるように軟骨からのコラーゲン放出を促進することができるTNFα等のサイトカイン放出も促進し、現在、M71結合ドメインとして例示される抗体が全身性サイトカイン放出を遮断することができる。本発明の抗体であるM55、M64、M69、及びM71は、マクロファージ−軟骨細胞共培養系においてプロテオグリカン合成をOSM特異的抗体の不在下で見られるレベルより上に増加させる能力を示した。
本発明は、OSM中和抗体の安定な製剤を提供するものであって、好ましくは、水性リン酸緩衝生理食塩水又は混合塩水だけでなく、保存加工された溶液及び製剤、並びに、薬学的用途又は家畜への使用に適した多目的の保存加工された製剤であり、薬学上許容できる製剤には少なくとも1つのOSM中和抗体が含まれている。好適な媒体及びその製剤(他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む)は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,Part 5,Pharmaceutical Manufacturing pp 691〜1092、具体的にはpp.958〜989に記載されている。
OSM結合抗体を選択し、特徴付けるために、ヒト及びカニクイザルOSMの構築物が哺乳動物の細胞発現のために生成された。ヒトOSM(NM_020530によってコードされたNP_065391)は、227のアミノ酸(配列番号11)の完全長の分泌タンパク質に加工される252のアミノ酸前駆体であり、これは、より完全な活性成熟形態のアミノ酸1〜184に更に加工されるプロタンパク質である。ヒトOSM cDNAは、OriGene(カタログ番号SC121421)から注文し、OriGeneクローンからヒトOSMのORFをPCRにより増幅し、タンパク質精製のためのヘキサHisタグ、及び部位指向タンパク質ビオチン化のためのAviTag(配列番号56)と共にシグナルペプチド(マウスIgG1)を導入した。後者は、受容体と相互作用するOSMの周辺に存在するリジン残基の無作為な化学ビオチン化を避けるために選択された。
対照抗体が使用された場合、CNTO6234と命名されるヒトIgG1アイソタイプ抗体が使用された。
サイトカイン上のアミン残基を標的とするNHS−エステルケミストリー(EZ−Link Sulfo−NHS−LC−Biotinylation Kit、Pierce,#21435)を使用して、組み換えヒトOSMをビオチン化した。ビオチンカップリング反応は、1モルの抗原当り1モルのビオチンの標的標識効率について最適化された。後者は、結合及び機能活性の損失を最小にし、一方で、タンパク質集団のほぼ完全な標識を確実にする。反応の完了時に、EZ−Link Sulfo−NHS−LC−Biotinylation Kit(Pierce)に含まれるZeba Desalt Spin Columnsを使用して、遊離ビオチン試薬及び残りの脱離基からタンパク質を精製した。約80%の出発原料を回収した。ビオチンの取り込みのレベルを測定するために、1モルのヒトOSM当り約1モルのビオチンを示す、HABAアッセイ(Pierce Biotin Quantitation Kit,#28005)を使用した。ビオチン化タンパク質におけるストレプトアビジンカップリング及びgp130−Fc(R&D Systems、カタログ番号671−GP)結合の両方を検証するために、Octet機器(ForteBIO)を使用した。Octet測定値は、ビオチン化ヒトOSMが未標識の出発原料と基本的に同一のプロファイルで、gp130に結合したことを示した。
15残基AviTag(GLNDIFEAQKIEWHE)(配列番号56)は、内因性BirA基質BCCPと類似するビオチンアクセプター動態を有する(Beckett et.al.1999,Protein Science)。関心のタンパク質に連結される際、1つのアクセプターリジン残基を有するAviTagは、1つの位置でのみビオチン化される。組み換えカニクイザルOSMは、Avidityから商業的に入手可能なビオチン−タンパク質リガーゼ及び試薬を使用して、インビトロで部位特異的にビオチン化された。一価のストレプトアビジン親和性樹脂を使用して、ビオチン化カニクイザルOSMを精製した。得られたタンパク質の質は、SDS−PAGE及びSEC−HPLCによって評価された。ビオチンの取り込みのレベルを測定するために、1モルのカニクイザルOSM当り約1モルのビオチンを示す、HABAアッセイ(Pierce Biotin Quantitation Kit,#28005)が使用された。ビオチン化タンパク質におけるストレプトアビジンカップリング及びgp130−Fcキメラ結合の両方を検証するために、Octet機器(ForteBIO)を使用した。Octet測定値は、ビオチン化カニクイザルOSMが未標識の出発原料と基本的に同一のプロファイルで、gp130に結合したことを示した。
最初のファージ−Fabパンニングには、TBS中の2μg/mLのビオチン化ヒトOSM又はカニクイザルOSMでコーティングされたNEUTRAVIDIN(商標)ELISAプレート(Pierce)を使用した。4℃で一晩インキュベートし、遮断、そして洗浄した後、パンニングの各回からのポリクローナルファージプールの1:100希釈物を添加した。pVIIIに特異的なHRP抱合モノクローナル、M13ファージ主要コートタンパク質(GE Healthcare、カタログ番号27−9421−01)、次に、化学発光基質POD(Roche、カタログ番号11582950001)の添加、そしてPerkinElmer機器で読み取り、結合ファージを検出した。
エピトープビニングは、ヒトIgG1変換mAb及び市販の抗体であるMAB29(OSMRβ/LIFRα動員遮断剤(R遮断剤)として知られる)を使用して実施された結合特徴に基づきMAbを分類するために実施された競合アッセイである。
A375細胞(ATCC;CRL−1619)は、悪性メラノーマに由来するヒト上皮細胞である。A375−S2細胞(ATCC;CRL−1872、IL−1に敏感なCRL−1619の亜系統)は、T−175培養フラスコ(Corning、カタログ番号431080)中の10%のFBS(Gibco)で補われた完全成長培地(DMEM/GlutaMax−I,Gibco)中で培養され、約80%のコンフルエントになったとき、1:20の継代培養比で、3日〜4日毎に継代培養された。
ヒト又はカニクイザルOSMによるA375−S2細胞増殖の減少を、化学発光ELISAを使用して、BrdU取り込みにより測定した。オンコスタチンMは、A375−S2ヒトメラノーマ細胞系において増殖を減少させた(Zarling et al.PNAS 83:9739〜9743)。この細胞系は、抗体発見の全段階で抗オンコスタチンM抗体を評価するために使用された。A375−S2細胞を、T−150組織培養フラスコ(BD Falcon 35−5001)中で、95% O2−5% CO2、37℃のDMEM(Gibco 11995)+10% FBS(Gibco 16140)+1% Pen/Strep(Gibco 15140)に維持し、1週間に2回1:10に分けた。
OSMは、細胞表面受容体gp130に結合し、OSMRβにより受容体ヘテロ二量体化を誘発して、シグナル伝達分子STAT3の活性化(リン酸化反応)を含む細胞内シグナル伝達カスケードを開始させることにより、A375−S2細胞の成長を阻害する(Kortylewski et al.,Oncogene 18:3742〜3753,1999)。STAT3シグナル伝達の乱れは、A375−S2細胞のOSM成長阻害を破壊し、STAT3活性化がOSMシグナル伝達において主要な工程であることを示す(Heinrich et al.,Biochem.J.374:1〜20,2003)。A375−S2細胞におけるSTAT3リン酸化反応は、OSM濃度依存であることが示され、刺激された細胞でそれを測定するための市販のキットが入手可能である。A375−S2細胞におけるOSM誘発STAT3リン酸化反応の中和は、Mab候補の一次スクリーニングアッセイとして選択された。
前述のヒト又はカニクイザルOSM構築物を用い、Biacore 3000光バイオセンサー(Biacore)を使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)により結合親和性を測定した。アミンカップリングケミストリーの製造者の指示を用いて、抗マウス(Jackson、カタログ番号315−005−046)及び抗ヒト(Jackson、カタログ番号109−005−098)の抗IgG Fc抗体混合物をカルボキシメチル化デキストラン表面のCM−5チップ(Biacore、カタログ番号BR−1000−14)にカップリングすることにより、バイオセンサー表面を調製した。抗OSM抗体の約19,000RU(反応単位)を、4つのフローセルそれぞれに固定化した。ランニング緩衝液(DPBS+0.005% P20+3mM EDTA)の中で25℃で速度実験を実施した。100nM〜0.412nMの範囲の連続希釈ヒト及びカニクイザルOSM ECDをランニング緩衝液中で調製した。約200RUのmAbをセンサーチップのフローセル2〜4の上に捕捉した。フローセル1は、参照表面として用いた。mAbの捕捉に続いて、抗原を50μL/分で3分間注入(結合相)し、次いで緩衝液フロー(解離相)を10分間注入した。100mMのH3PO4(Sigma、カタログ番号7961)の50μL/分での18秒注入の2つのパルスによってチップ表面を再生した。
新規Fab−pIXライブラリは、Shi et al.J Mol Biol397:385〜396,2010、WO第09085462A1号、U.S.第12/546850号に記載され、本明細書の上記において、IMGT命名法において、IGHV1−69(配列番号1)、IGHV3−23(配列番号2)、又はIGHV5−51(配列番号3)で使用される重鎖ヒト生殖系列フレームワークに言及する169、323、及び551と呼ばれる。3つの重鎖ライブラリフレームワークは、4つの軽鎖ライブラリVLカッハ゜フレームワーク:A27(IGKV3−20*01(配列番号5))、B3(IGKV4−1*01(配列番号6))、L6(IGKV3−11*01(配列番号7))、及びO12(IGKV1−39*01(配列番号8))と組み合わされる。ライブラリにおいて、Fabs V領域は、重鎖に配列番号4及び軽鎖に配列番号10を含むJ領域(FR4)の追加により完成する。重鎖CDR3は、7〜14残基の可変長のものである。各ライブラリの完全なV領域の例は、図1に示され、付番され、CDR領域はKabatに従い示される。
4つの螺旋体束構造のOSMは、比較的非構造的なループによって結合されるA、B、C、及びDと呼ばれる4つのα螺旋状セグメントを特徴とする。OSMは、配列番号1のアミノ酸及び残基Q16、Q20、G120、N123、N124による接触を含むように決定された螺旋体A及びC(部位II)に位置する表面を介してgp130と相互作用する(Deller et al.Structure 8(8):863〜874,2000、Liu et al.Int.J.Mol.Med.23:161〜172,2009)。OSMRβ及びLIFRα(部位III)とのOSM相互作用に関与する表面は、螺旋体Dに位置する残基によって主に画定されると考えられている(Dellerら、同章)。
(1)エピトープ群又は「ビン」を同定するための競合結合、(2)表面プラズモン共鳴(Biacore)による親和性測定、及び(3)pSTAT3シグナル伝達を遮断する能力、であった。全てのスクリーニング及びアッセイは、実施例1に記載するように、哺乳動物の細胞生成(グリコシル化)されたヒト及びカニクイザルタンパク質を使用して行われた。
pSTAT3及びELISA結合アッセイの対照MAB295(R&D Systems)に対するそのランク付けに基づき選択されたmAbのサブセットの親和性測定のデータを表3に示す。
実施例3に記載されるOSMM5、OSMM6、OSMM9、及びOSMM10の4つのV領域対合は、親和性を改善するために、軽鎖再選択のために選択された。効率的かつ能率的な様式で一次選択から多数の抗体を親和性成熟させるために、Shi et al.J Mol Biol 397:385〜396,2010及びWO第09085462A1号並びにU.S.第12/546850号に記載される「インライン」成熟過程が使用された。簡潔に、選択の初回に得た抗原特異的クローンのVH領域は、対応するVLスカフォールドのライブラリ(この場合、B3ベースのV領域(配列番号8))と組み合わされた。
インライン成熟抗体を評価するために、1〜5希釈で5μg/mL又は1μg/mLから開始して、それぞれ、0.0016又は0.00032μg/mLに至るまで用量応答が実施された。M71による中和を図2Bに示す。抗体の濃度が増加すると、ヒト及びカニクイザルオンコスタチンMの両方の抗増殖作用が中和される。用量応答曲線は、ヒト(開記号)及びカニクイザル(閉記号)オンコスタチンMを用いた3つの別個の実験からのデータを使用して計算された。表10は、ヒト及びカニクイザルオンコスタチンMに対するM55、M64、M69、及びM71のIC50(95%信頼区間)をまとめる。
競合実験は、実施例1に記載されるBiacore 3000光学バイオセンサー(Biacore)を用いた表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して、インライン成熟+上記の表からの選択された新しい結合剤用に選択された抗OSM mAbとヒトgp130との間で行われた。
M6及びM9の5ng/mLのhOSMの存在下又は不在下で、A375細胞及びこれらのMabのインライン成熟変異体において実施された、計算されたpSTAT3阻害のEC50値を表12に示す。
マクロファージ−軟骨細胞共培養アッセイ
マクロファージ−軟骨細胞共培養系において、M71を評価した。分化マクロファージは、オンコスタチンMを生成することが知られている(Hasegawa et al.Rheumatology 38:612〜617,1999)。OSMは、軟骨マトリックスの大部分を作り上げる高度に硫酸化されたプロテオグリカンアグリカン(GAG)の合成を減少させることができる。
OSMは、正常なヒト肺線維芽細胞において増殖及びコラーゲン産生を誘発する(Scaffidi et al.,Br.J.Pharmacol 136:793〜801,2002)。線維芽細胞によるコラーゲンの過剰産生は、多くの病理学的状態の主な特徴である(Lim et al.Oncogene 23(39):5416〜25,2006、Huang et al.J Cell Biochem 81(1):102〜13,2001)。オンコスタチンM受容体シグナル伝達は、JAK−STAT経路を活性化し、STAT3のリン酸化反応は、シグナル伝達経路における初期事象である(Auguste et al.(1997)Signaling of Type II Oncostatin M Receptor.J Biol Chem 272:15760〜15764)。オンコスタチンMがpSTAT3を生成する能力は、R&D Systems human/mouse pSTAT3 Duoset(DYC4607−5)を用いて、正常なヒト肺維芽細胞(NHLF)において決定された。次に、このアッセイは、M55及びM71がオンコスタチンMシグナル伝達を中和する能力を決定するために使用された。
M71は、ヒトオンコスタチンMの全身性投与後のインビボでサイトカインの産生を遮断するその能力について評価された。ヒトオンコスタチンMの腹腔内注入は、おそらくマウス白血病阻害因子受容体を通して、及びそれと相互作用して特定の血清サイトカインのレベルを増加させる。
V領域H17(配列番号51)及びL180(配列番号55)を含むFab断片は、ヒトOSM(配列番号10)残基26〜212と共に結晶化された。
複合体の結晶化は、0.2μLのタンパク質複合体(10.95mg/mL)及び0.2μLのリザーバ溶液の等容量を分配するOryx4タンパク質結晶化ロボット(Douglas Instruments)を使用して、20℃でシッティングドロップ(sitting-drop)蒸気拡散法により実施された。多重結晶化スクリーニングが実施された。大半の液滴は透明なままであり、複合体の高可溶性を示す。結晶は、0.1MのMES(pH 6.5)、2.4Mの硫酸アンモニウム、及び0.1Mのトリス(pH 8.5)、3.5Mのギ酸ナトリムから得た。
H14/L180 Fabと接触するOSM残基は、結合エピトープを構成する。OSMと接触する抗体残基は、結合パラトープを構成する。2つの可変ドメインの6つ全てのCDRは、OSM結合に関与する。接触する残基は表13に記載され、図5に示される。重鎖可変領域H1のCDRと共に、長いCDR−L1は、底部に小さい隆起を有する谷のような結合部位を形成する(図4C、左側のパネル)。結合時、谷の両側は、2つの螺旋体の間に底部隆起結合を有する螺旋体A及びCに沿ってOSMの4つの螺旋体束を抱持する(図4C、右側のパネル)。抗体及び抗原結合接触面は、溶媒アクセス可能表面の2,514Å2を埋設する(Abにおいては1225Å2及びAgについては1298Å2)。接触面に多くの荷電残基が存在するが、荷電−荷電対合は存在せず、vdw及びH結合が抗体及び抗原相互作用に最も重要な役割を果たすことを示唆する。
OSMは、細胞上の細胞表面提示標的とは反対に、炎症性過程に関連する可溶性標的である。本明細書で発見された結合領域を含み、Fcドメインを更に有する完全なIgGの性質は、よって、改変FcR結合を付与する変異体でFcを操作する方法を使用して、その使用に関連する目的及び治療仕様に合わせることができる。
M71及びM71 L/Sは、A375−S2増殖アッセイにおいて、並べて比較された。用量応答は、1〜5希釈で1μg/mLの開始濃度から0.00032μg/mLまで評価された。1μg/mLの濃度で、これらの抗体のアイソタイプ対照であるCNTO3930及びCNTO8852は、それぞれ、2ng/mLのヒトオンコスタチンMが増殖を阻害する能力に対して効果がなかった。M71及びM71 L/Sの両方は、1μg/mLでオンコスタチンMの作用を完全に中和し、IC50において測定可能な相違はなかった。
非末端カニクイザル薬物動態研究において、M71及びM71 L/Sの血清半減期を比較した。研究は、総数12匹のカニクイザルを含み、各抗体について皮下(s.c.、n=3)及び静脈内(i.v.、n=3)投与を評価した。3mg/kgの抗体が投与され、研究は60日にわたって行われた。血液サンプルは、1(IV群のみ)時間及び6時間、並びに1、2、4、6、8、12、16、30、37、45、及び60日目に採取された。サンプルからの血清は、試験まで−80℃で凍結された。血清の抗体レベルは、カニクイザル血清において、MesoScale Discoveryプラットホーム用に最適化されたELISAを使用して決定された。ビオチン化捕捉抗体は、M71(マウス抗M71)に対して生じた抗イディオタイプ抗体であった。検出抗体はルテニウム標識された抗ヒトIgGであり、読み出しはMesoScale Discovery化学発光であった。
Claims (24)
- 配列番号51の軽鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号55の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、単離された抗体。
- IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、及びIgMからなる群から選択されるヒト重鎖定常領域を更に含む、請求項1に記載の抗体。
- 前記定常領域が、ヒトIgGアイソタイプを含む、請求項2に記載の単離された抗体。
- 前記アイソタイプがIgG1である、請求項3に記載の単離された抗体。
- 前記定常領域が、前記抗体に非溶解性を付与するように変異したものである、請求項4に記載の単離された抗体。
- 前記定常領域が、野生型IgG1定常ドメイン配列を有する抗体と比較して、新生児受容体(FcRn)に対する前記抗体の親和性を強化するように変異したものである、請求項3に記載の単離された抗体。
- 前記定常領域が、428位及び434位で変異し、付番は、KabatのEU付番に従う、請求項6に記載の単離された抗体。
- 前記変異が、M428L及びN434Sであり、付番は、KabatのEU付番に従う、請求項7に記載の単離された抗体。
- 請求項1に記載の抗体の抗原結合断片。
- 前記断片が、Fab、Fab’、Fd、F(ab) 2 、及びScFvからなる群から選択される、請求項9に記載の抗原結合断片。
- 請求項1に記載の単離された抗体又は前記抗体の抗原結合断片、及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む、薬学的組成物。
- 請求項1に記載の単離された抗体又はその断片の減菌調製物、及びそれを必要とする対象に前記抗体を投与するための説明書を含む、キット。
- ヒトOSMタンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、
配列番号14のアミノ酸配列を有するH−CDR1と、
配列番号17のアミノ酸配列を有するH−CDR2と、
配列番号21のアミノ酸配列を有するH−CDR3と、
配列番号38のアミノ酸配列を有するL−CDR1と、
配列番号43のアミノ酸配列を有するL−CDR2と、
配列番号46のアミノ酸配列を有するL−CDR3と、を含む単離された抗体。 - IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、及びIgMからなる群から選択されるヒト重鎖定常領域を更に含む、請求項13に記載の抗体。
- 前記定常領域が、ヒトIgGアイソタイプを含む、請求項14に記載の単離された抗体。
- 前記アイソタイプがIgG1である、請求項15に記載の単離された抗体。
- 前記定常領域が、前記抗体に非溶解性を付与するように変異したものである、請求項16に記載の単離された抗体。
- 前記定常領域が、野生型IgG1定常ドメイン配列を有する抗体と比較して、新生児受容体(FcRn)に対する前記抗体の親和性を強化するように変異したものである、請求項15に記載の単離された抗体。
- 前記定常領域が、428位及び434位で変異し、付番は、KabatのEU付番に従う、請求項18に記載の単離された抗体。
- 前記変異が、M428L及びN434Sであり、付番は、KabatのEU付番に従う、請求項19に記載の単離された抗体。
- 請求項13に記載の抗体の抗原結合断片。
- 前記断片が、Fab、Fab’、Fd、F(ab) 2 、及びScFvからなる群から選択される、請求項21に記載の抗原結合断片。
- 請求項13のいずれか一項に記載の単離された抗体又は前記抗体の抗原結合断片、及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む、薬学的組成物。
- ヒトOSMタンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、
配列番号14のアミノ酸配列を有するH−CDR1と、
配列番号17のアミノ酸配列を有するH−CDR2と、
配列番号21のアミノ酸配列を有するH−CDR3と、
配列番号38のアミノ酸配列を有するL−CDR1と、
配列番号43のアミノ酸配列を有するL−CDR2と、
配列番号46のアミノ酸配列を有するL−CDR3と、を含み、
ここで、前記定常領域が、野生型IgG1定常ドメイン配列を有する抗体と比較して、新生児受容体(FcRn)に対する前記抗体の親和性を強化するように変異したものであり、かつ、前記変異が、M428L及びN434Sであり、付番は、KabatのEU付番に従う、前記単離された抗体。
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