TWI548749B

TWI548749B - 人類抑瘤素ｍ抗體及使用方法

Info

Publication number: TWI548749B
Application number: TW100137079A
Authority: TW
Inventors: 胡安阿爾馬格羅; 威廉杜貝爾; 尤漢佛蘭森; 荷西帕迪納斯
Original assignee: 健生生物科技公司
Priority date: 2010-10-13
Filing date: 2011-10-13
Publication date: 2016-09-11
Also published as: IL225573A0; US9163083B2; BR112013009083A2; UY33670A; EA031044B1; SG189322A1; WO2012051111A2; JP6490036B2; ZA201303429B; JP6721655B2; US10179812B2; CN103261223A; RU2013119957A; RU2600444C2; CA2814652A1; IL225573B; AR126555A2; CN103261223B; EA201390493A1; MX2013004209A

Description

人類抑瘤素M抗體及使用方法

本發明係關於一種可將藉由抑瘤素M(oncostatin M)結合至人類細胞上的膜受體所產生的生物活性中和之人類抗體，及其用途。

抑瘤素M(OSM)為28 kDa之多重功能性之IL-6細胞介素家族成員，係由單核白血球、巨噬細胞、嗜中性球及經活化T-淋巴球分泌(Tanaka & Miyajima,Rev Physiol Biochem Pharmacol 149: 39-53,2003)。於接近經分泌OSM羧端處的蛋白酶截切，產生完全活化型OSM，其為209個胺基酸長，具有二個N-連結醣基化位置。OSM屬IL-6細胞介素家族，其包括(IL-6、IL-11、白血病抑制因子(LIF)、心肌營養蛋白-1(cardiotrophin-1)、毛狀神經營養因子(ciliary neutotrophic factor，簡稱CNTF)及類心肌營養蛋白細胞介素(cardiotrophin-like cytokine，簡稱CLC))，其共用同一受體次單元，即gp130蛋白。在人體中，OSM透過由gp130及LIFRα次單元或gp130及OSMRβ次單元所組成之受體異二聚體傳遞信號。與其他IL-6家族之細胞介素相比，OSM直接結合gp130且無任何其他膜結合之共同受體(Gearing等人，Science 255：1434-1437，1992)。OSM結合至gp130後，OSMRβ或LIFRα加入，以形成高親和性之信號傳遞複體(Mosley等人，J Biol Chem 271：32635-32643，1996)。任一受體活化結果為經由JAK/STAT路徑之信號傳遞(Auguste等人，J Biol Chem 272：15760-15764，1997)。

OSM主要由來自免疫系統之細胞所製造，因為其信號傳遞受體分佈廣泛，所以已有和各種生物活性之關聯性，包括細胞生長調控、神經發育以及胞外基質組成之調控。

抑瘤素M一如其名所示，係與致癌過程有關。然而，OSM亦涉及發炎早期事件，以及導致有害病況之肥大性路徑，例如肺纖維化。因此，亟需對人類OSM具有專一性、能阻斷受體信號傳遞(gp130信號傳遞)事件之人類抗體，該信號傳遞阻斷抗體可在gp130表現細胞上發揮臨床可用之細胞毒性、細胞生長抑制性或免疫調節性作用。

本發明提供OSM結合性單株抗體，其可阻斷與宿主對象中的細胞、組織或器官上之OSM及OSM結合受體交互作用相關的一或多種生物活性相關的活性。本發明提供例示性OSM結合單株抗體之胺基酸序列，其可藉由核酸編碼，用於在宿主細胞中表現。本發明之一或多種OSM單株抗體界定一OSM表面之抗原決定區，其當與本發明之抗體嚙合時，防止與信號傳遞複體gp130及LIFRα或gp130及OSMRβ受體組成交互作用，藉此避免配體連接所驅動之信號傳遞及下游生物活性。

本發明之一態樣係一種與人類OSM蛋白質反應之單離抗體，其具有單株抗體的抗原結合能力，包含一抗原結合域，其僅包含如序列識別編號：13至18中所述之胺基酸序列或如序列識別編號：1至3中所述之FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3特定位置，CDR3如序列識別編號：27至29及47所示；或一抗原結合域，其僅包含有如序列識別編號：23至26中所述之胺基酸序列或如序列識別編號：5至8中所述之特定位置及其變異體，且CDR3如序列識別編號：19至22所示。在一特定實施例中，該人類OSM結合抗體包含一選自序列識別編號：49至55之可變域(variable domain)。

在本發明的另一實施例中，經使用作為全長IgG結構之該單株抗體結合域，具有源自人類IgG恆定域或其特定變異體之恆定域，且於製劑中被用作為治療分子，以預防OSM結合至呈現OSM受體組成的細胞。.在另一實施例中，該結合域經組態作為抗體片段，用於作為可預防OSM結合至呈現OSM受體組成的細胞之治療分子。在本發明之一態樣中，提供一種醫藥上可接受之調合物、投遞系統或套組，或一種治療抑瘤素M相關病況之方法，包含本發明之一或多種OSM結合域，例如但不限於序列識別編號：13至28和30至46以及如序列識別編號：29及47所提供之變異體。

所有在本說明中引用、包括但不限於專利及專利申請文件之發表文獻在此全部併入作為參照。

縮寫

BSA=牛血清白蛋白；CDR=互補決定區；Cyno=食蟹獼猴(Macaca fascicularis)；DN=糖尿病腎病變；ECD=胞外域；FR=框架；H=重鏈；IPF=間質性肺關節炎；L=輕鏈；Ig=免疫球蛋白；Mab=單株抗體；OSM=抑瘤素M；OA=骨關節炎；PBS=磷酸鹽緩衝生理食鹽水；RA=類風濕性關節炎；VL=可變輕鏈；VH=可變重鏈。

定義

如本文所用，「抗體」包括整個抗體及其任何抗原結合片段或其單鏈。因此，該抗體包括任何含有包含至少一部分免疫球蛋白分子的蛋白質或胜肽分子，例如但不限於至少一個重鏈或輕鏈的互補決定區(CDR)或其配體結合部分，重鏈或輕鏈可變區，重鏈或輕鏈恆定區，框架(FR)區，或其任何部分，或至少一結合蛋白的一部分，其可被併至本發明之抗體。「抗體」一詞係進一步欲含括抗體、其截切片段、特定部分及變異體，包括抗體模擬物，或包含模擬抗體或其特定片段或部分之結構及/或功能的抗體部分，包括單鏈及單鏈域抗體及片段。功能性片段包括對一預選標靶之抗原結合片段。含括抗體之「抗原結合部分」一詞內的結合片段之實例包括(i) Fab片段，由VL、VH、CL及CH域所組成之單價(monovalent)片段；(ii) F(ab')2片段，係二價(bivalent)片段，其包含二個藉由位在鉸鏈區(hinge region)的雙硫鍵連結之Fab片段；(iii) Fd片段，由VH及CH域組成；(iv) Fv片段，由抗體單臂之VL及VH域組成；(v) dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341：544-546)，其由一VH域組成；以及(vi)經單離之互補決定區(CDR)。此外，雖然Fv片段、VL及VH的二個域係由不同基因所編碼，但可使用重組方法藉由能使該等成為單一蛋白質鏈之合成連接子(linker)將它們結合，其中VL及VH區配對以形成單價分子(即稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人(I 988) Science 242：423-426及Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883)。此種單鏈抗體亦欲含括於抗體之「抗原結合部分」一詞內。這些抗體片段係使用具該領域中技術者所知悉的習知技術而獲得，且該些片段係經篩選具有如完整抗體相同方式之效用。反之，scFv建構庫可被使用以篩選抗原結合能力，並接著使用習知技術被剪接為編碼人類生殖系基因序列的其他DNA。此種庫的一個實例為「HuCAL：人類組合抗體庫(人類Combinatorial Antibody Library)」(Knappik,A.等人J Mol Biol(2000)296(1)：57-86)。

「CDR」一詞係指抗體的互補決定區域或高可變區胺基酸殘基，其參與或負責抗原結合。人類IgG抗體亞型的高可變區或CDR包括如Kabat等人所述(1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)來自輕鏈可變域中的殘基24至34(L-CDR1)、50至56(L-CDR2)及89至97(L-CDR3)之胺基酸殘基，以及來自重鏈可變域中的31至35(H-CDR1)、50至65(H-CDR2)及95至102(H-CDR3)之胺基酸殘基，和/或來自高可變環(hypervariable loop)之殘基(即輕鏈可變域中的殘基26至32(L1)、50至52(L2)及91至96(L3)，以及重鏈可變域中的26至32(H1)、53至55(H2)或現今之H2 Chothia氏定義之52至57以及96至101(H3)，如Chothia及Lesk，J. Mol. Biol. 196：901-917(1987)中所述)。Chothia及Lesk稱結構保留HV為「正則結構(canonical structure)」。框架或FR1-4殘基為非高可變區且托撐高可變區的可變域殘基。Chothia及Lesk之編號系統考慮到在環中的殘基數差異，藉由在特定殘基標註小寫字母記號顯示其擴展，例如30a、30b、30c等。在更近期，已發展並廣泛採用的通用編號系統，即國際ImMunoGeneTics information system(免疫遺傳學資訊系統，簡稱IMGT)(LaFranc等人2005，Nucl Acids Res. 33：D593-D597)。

在此，CDR依據在輕鏈或重鏈內之胺基酸序列及位置兩者、藉由序向編號指稱。由於免疫球蛋白可變域結構內的CDR「位置」在物種間為保留且存於稱為環的結構中，根據結構特徵，藉由比對(align)可變域區域序列使用編號系統，因此即容易辨識CDR及框架殘基。此資訊係用於將來自一物種免疫球蛋白之CDR殘基移接(grafting)及置換至典型上來自人類抗體之受體框架。

「成熟」一詞係用在為改變多肽性質之目的而在抗體可變區的直接改變。如本領域所知悉及本文所述者，大量的V區序列中之位置可以影響抗原辨識。在自然界中，抗體藉由體細胞突變的漸進過程達到高親和性和特異性。此過程可於體外仿製，以允許平行選擇及標靶性變異，同時維護各抗體之序列完整性，使其反映該物種(在本情況中為人類抗體)，同時增強親和性或生物物理參數，例如溶解度或抗氧化。作出直接改變或「成熟」的過程典型上係在編碼序列層級進行，且可藉由建立次庫(sublibrary)，供篩選增強性質。

如本文中所用，「OSM」係指抑瘤素M多肽或包含編碼OSM多肽之編碼序列之聚核苷酸。人類OSM為人類osm基因(Gene 5008)之產物。

術語「抗原決定區(epitope)」是指能特異性結合至抗體的蛋白質決定因素(determinant)。抗原決定區通常由化學性活性表面成群分子組成，例如胺基酸或糖側鏈，且通常具有特定三維結構特性以及特定電荷特性。構形及非構形抗原決定區差別為與前者的結合在變性溶劑存在下即失去，但後者並不會。

如本文中所用，K_D係指解離常數，特定言之，為該抗體對一預定抗原之K_D，且為該抗體對一特定標靶之親和性的量值。高親和性抗體係對一預定抗原具有K_D為10^-8 M或更少，更佳的是10^-9 M或更少，且再佳者為10^-10 M或更少。K_D的倒數為K_A，即結合常數。如文中所用之術語「k_dis」或「k₂」或「k_d」，係意指特定抗體-抗原交互作用的解離速率。「K_D」是解離速率(k₂)(亦稱為「離開速率(k_off)與結合速率(k₁)或「連接速率(k_on)」之比率。因此，K_D等同k₂/k₁或k_off/k_on，且以莫耳濃度(M)表示。K_D越小，則結合越強。因此，K_D為10^-6 M(或1 μM)表示較10^-9 M(或1 nM)結合力弱。

如文中所用之術語「單株抗體」或「單株抗體組成物」係指由單一分子組成之抗體分子的製劑。單株抗體組成物對於一特定抗原決定區呈現單一的結合特異性及親和性。該術語亦包括「重組抗體」及「重組單株抗體」，所有抗體係藉由重組方法製備、表現、產生或單離，例如(a)自動物或融合抗體分泌動物細胞及融合夥伴(fusion partner)融合所製備之融合瘤所單離之抗體；(b)自經轉形以表現抗體之宿主細胞(例如來自轉染瘤(transfectoma))所單離之抗體；(c)自重組株組合人類或其他物種抗體庫單離之抗體；以及(d)藉由任何其他涉及將免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列方式所製備、表現、產生或單離之抗體。如文中所用之「經單離之抗體」，係意指一抗體為實質上不含具有不同抗原特異性的其他抗體。然而，與人類OSM之抗原決定區、異構型或變異體特異性結合之抗體OSM可具有與其他有關抗原(例如OSM物種同源物)之交叉反應性。此外，經單離之抗體可實質上不含其他細胞材料和/或化學物。在本發明之一實施例中，具有不同特異性之「經單離之」單株抗體的組合係經組合至一明確界定之組成物。

如本文中所用，「特異性結合」、「免疫特異性結合」及「免疫特異性地結合」意指抗體結合至一預定抗原。典型上，抗體結合具有解離常數(K_D)為10^-7 M或更少，且結合至預定抗原之K_D至少小於其結合非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其他特定多肽)K_D二倍。片語「辨識抗原之抗體」及「對抗原具特異性之抗體」此處可與術語「特異性結合抗原的抗體」互換使用。如本文中所用，「高度特異性」結合意指特異性標靶抗原決定區的抗體之相對K_D至少比抗體結合其他配體K_D的小10倍。

如本文中所用，「型(type)」係指抗體種類(例如IgA、IgE、IgM或IgG)為重鏈恆定區基因所編碼。某些抗體種類進一步包含次類或「同型(isotype)」，其亦為重鏈恆定區(例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)所編碼。抗體可進一步在恆定區域內特定殘基處藉由連接至蛋白質之寡醣修飾，以增強該抗體生物功能。舉例而言，在人類抗體同型IgG1、IgG3及較少程度之IgG2，呈現如小鼠IgG2a抗體之效應物(effector)功能。

藉由「效應物」功能或「效應物陽性」係指抗體包含不同於抗原特異性結合域之域，能與受體或其他血液成分(例如補體)交互作用，導致例如誘集(recruitment)巨噬細胞，以及導致被抗體之抗原結合域結合之細胞破壞之事件。抗體具有數種藉由結合效應物分子所調介之效應物功能。舉例而言，補體C1成分與抗體結合活化補體系統。補體活化在助噬作用及細胞病源溶裂上為重要的。補體活化刺激發炎反應，且亦涉及自體免疫過敏性。再者，抗體經由Fc區結合至細胞，以抗體Fc區之Fc受體位置結合至細胞上的Fc受體(FcR)。有許多的Fc受體係對不同種類抗體有特異性，包括IgG抗體(γ受體)、IgE(η受體)、IgA(α受體)和IgM(μ受體)。抗體結合至細胞表面之Fc受體引發許多重要及多樣之生物反應，包括吞噬及破壞抗體包覆粒子、廓清免疫複體、藉由殺手細胞溶裂抗體包覆之標靶細胞(稱為抗體相依性細胞調介性細胞毒殺作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)，或ADCC)、釋出發炎調介物、胎盤轉移作用及控制免疫球蛋白產生。

術語「多肽」意指包含藉由胜肽鍵連接之胺基酸殘基以形成一多肽的分子。少於50個胺基酸之小多肽可稱為「胜肽」。多肽亦可稱為「蛋白質」。

綜述

本發明提供經單離之Mab，其能夠結合並中和OSM蛋白質及斷裂產物之生物活性。特別是，本發明之OSM結合mAb可阻斷OSM結合至gp130或避免藉由OSM結合gp130之LIFRa或OSMRb的誘集。在任一情況中，本發明之OSM mAb能阻斷OSM驅動之gp130受體信號傳遞。

已有發表在各種病理性情況中，STAT3的磷酸化導致纖維母細胞的膠原蛋白過度生產(Lim等人Oncogene 23(39)：5416-25，2006；Huang等人J Cell Biochem 81(1)：102-13，2001)。這些性質顯示這些抗體潛在的RA、OA及纖維化病徵(例如特發性肺纖維化(IPF)及糖尿病腎病變(DN))之治療性價值。

人類OSM基因產物OSM(NCBI Accession No. NP_065391)為一初前多肽，長度為252個胺基酸(序列識別編號：11)，具有25個胺基酸長之信號胜肽(signal peptide)，且於殘基234及235之間有一蛋白酶切位。其為分泌蛋白，具有5個半胱胺酸殘基，在殘基31至152及74至192之間形成二個內二硫化物(Kallestad JC等人J Biol Chem. 1991 May 15；266(14)：8940-5)。有二個潛在的N-連結醣基化位點在殘基100和217，且當在真核細胞中產生時，該蛋白質會被醣基化。人類OSM在殘基105具有自由氫硫基。

雖然有一筆源自註解基因組序列(NW_001095169)的1867 bp mRNA(NCBI No. XM_001110148)之自動化計算產生記錄，但食蟹獼猴OSM蛋白之序列無法於公共領域中取得。為取得食蟹獼猴OSM序列，自食蟹獼猴PBMC單離RNA，且接著藉由RT-PCR將該基因自此cDNA擴增並定序。經發現所選殖序列(序列識別編號：12)之預測轉譯結果與預測之台灣獼猴(恆河猴)序列有99.6%相似度，與人類OSM蛋白質序列有92%相似度，與小鼠OSM蛋白質序列有41%相似度(如申請人共同申請案(美國專利申請案第12/648430號)。

因此，本發明係針對找出源自人類、可抑制因OSM結合gp130信號傳遞之下游生物活性之OSM結合Mab，且其中Mab展現的能力；恢復細胞在OSM存在下的細胞增生、抑制組織移出物中OSM驅動之軟骨細胞的關節內基質降解，有效率中和人類肺纖維母細胞中之OSM相依性STAT3磷酸化，以及避免OSM誘發之細胞介素釋放。

1.　本發明之抗體組成

本發明之OSM中和抗體為體外、原位和/或體內抑制、阻斷或干擾至少一種OSM活性或OSM受體結合，且不促進、刺激、誘發或促效(agonize)OSM活性或配體結合，且抗體結合亦不會模擬OSM驅動之OSM受體連接之下游作用，特別是gp130與OSM之交互作用，例如宿主細胞中的信號傳遞。合適的OSM中和抗體、特定部分或變異體亦可視情況下影響至少一個OSM活性或功能，例如但不限於，RNA、DNA或蛋白質合成；蛋白質釋放；細胞活化、增生或分化；抗體分泌；OSM受體信號傳遞；OSM截切；OSM結合；OSM或gp130誘發、合成或分泌。

本發明是根據抗人類OSM單株抗體能抑制OSM結合或藉由OSM之LIFR誘集後gp130信號傳遞的發現。以呈現在絲狀噬菌體粒子上連接至pIX外殼蛋白抗體Fab庫形式(見WO29085462A1及下文的進一步說明)的抗體結合域篩選結合OSM之能力。使用gp130之競爭性分析，是用來區分那些Fab當結合至OSM時，避免OSM結合gp130。或者，在結合至OSM時，Fab可避免LIFR誘集至gp130結合。以細胞為基礎(A375，人類黑素瘤細胞)分析是用以找出數種能抑制OSM表現宿主細胞的gp130調介之pSTAT3活化作用之候選抗體。

此處所描述的OSM結合抗體辨識活化形式人類OSM蛋白質的至少二個不同區域，代表額外發現OSM上多處適於作為抗體或其他具有類似阻斷能力的功能化合物之標靶位置。因此，表現及純化此處提供之抗體結合域胺基酸序列進一步提供可提供篩選展現OSM中和活性之新穎分子的方法之工具。

在一實施例中，該抗人類OSM抗體具有結合區，包含一輕鏈可變(VL)區或重鏈可變(VH)區，含有如序列識別編號：49至55中所示之胺基酸序列，且抗體或其結合部分免疫特異性結合OSM。在本發明之另一實施例中，包含具有序列識別編號：54或55之重鏈及其抗原結合部分，與OSM蛋白質結合，且另外具有本發明之特定功能性性質，例如：

1.結合人類OSM的K_D為少於100 pM

2.結合食蟹獼猴OSM的K_D為少於500 pM

3.在2 ng/ml的人類OSM存在下，能恢復A375-S2細胞增生為無OSM下的90%量，

4.在2 ng/ml的食蟹獼猴OSM存在下，能恢復A375-S2細胞增生為無OSM下的90%量，

5.　抑制組織移出物中OSM驅動之軟骨細胞的關節內基質降解，

6.　有效率地中和正常人類肺纖維母細胞(NHLF)之OSM相依性STAT3磷酸化，或

7.　在小鼠中，於全身投與OSM後，阻斷細胞介素釋放。

在本發明另一態樣中，該抗體的結構特性展現某些或所有上文引用如本文所述之生物活性，且特別是，被命名為M55及M71結合域之Mab係用於產生結構性相關之人類抗OSM抗體，其留有至少一個本發明抗體之功能性質，例如結合至OSM。更具體地說，M55及M71之一或多種CDR區(例如序列識別編號：1及8之特定殘基)可以已知人類框架區及CDR(例如序列識別編號：13至28、30至46)被重組組合以產生本發明之額外、重組工程化之人類抗OSM抗體。

在一實施例中，木發明之抗體具有(包括FR1、2及/或3)IGVH1-69(序列識別編號：1)或IGVH5-51(序列識別編號：3)序列，其中選自於由序列識別編號：13至22所組成的群組之一個或多個CDR殘基係存在於序列識別編號：1或3之CDR位置，同時仍留有絡合OSM的抗體能力(例如保留性取代)。因此，在另一實施例中，經工程化之抗體可由一或多個CDR構成，其為例如與序列識別編號：13-22中列出的CDR有90%、95%、98%或99.5%相似度，或如序列識別編號：29或47之L-CDR3變異體。

除了與OSM的簡單結合之外，如上述之工程化抗體，可經篩選保留其他本發明抗體功能性性質，例如抑制OSM蛋白質或其截切產物結合至GP130陽性細胞的能力，其中結合會形成活體內GP130陽性細胞增生抑制。

本發明之人類單株抗體可藉由例如標準ELISA測試與OSM之結合。

2. OSM-中和抗體的產生

展現所需之生物活性譜的OSM中和抗體，在此由M5、M6、M9、M10、M42、M45、M53、M54、M55、M62、M63、M65、M66、M67、M68、M69、M71及M83示例，包含重鏈及輕鏈序列，其包含庫框架序列識別編號：1、3、8，且具有CDRs序列識別編號：13至28、30至46之CDR可由各種技術產生。

在另一實施例中，本發明抗體所結合之抗原決定區(包含序列識別編號：11的殘基51至227的少至五個、多至全部或其編碼核酸序列)可用以免疫化一對象，直接於宿主中產生本發明之抗體，以達治療、避免或改善與OSM產生有關之疾病或疾病症狀之目的。

在一實施例中及本文之示例，人類抗體係選自噬菌體庫，其中噬菌體包含人類免疫球蛋白基因，且該庫表現人類抗體結合域，例如單鏈抗體(scFv)、如Fab或某些其他展現成對或未成對之抗體可變區的構築(Vaughan等人Nature Biotechnology 14:309-314(1996)；Sheets等人PITAS(USA) 95:6157-6162(1998))；Hoogenboom及Winter，J. Mol. Biol.，227:381(1991)；Marks等人J. Mol. Biol.，222:581(1991))。本發明之人類單株抗體亦可使用噬菌體呈現法製備，以供篩選人類免疫球蛋白基因庫。此種用於單離人類抗體之噬菌體呈現法已於本領域中建立。請參見實例：Ladner等人美國專利第5,223,409、5,403,484號及第5,571,698號；Dower等人美國專利第5,427,908及5,580,717號；McCafferty等人美國專利第5,969,108及6,172,197號；以及Griffiths等人美國專利第5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915及6,593,081號。

噬菌體純系由稱為生物淘選(biopanning)之多重步驟程序篩選及鑑定。生物淘選是藉由將呈現蛋白質配體變異體噬菌體(噬菌體呈現庫)與標靶培養、藉由洗滌技術移除未結合噬菌體以及特異性沖提結合的噬菌體來進行。視情況下，於進行結合及視情況進行擴增以富集有利於帶有呈現與標靶有最佳結合之抗體片段噬菌體純系的特定序列池的額外循環之前，將經沖提噬菌體擴增。於數回後，個別噬菌體純系經特徵化，且純系呈現之胜肽序列由定序對應噬菌體病毒粒子之DNA來測得。

Fab噬菌體pIX庫

在本噬菌體呈現技術之特定實施例中，一呈現在pIX噬菌體外殼蛋白上之合成Fab庫(如Shi等人J Mol Biol 397：385-396，2010；WO29085462A1及美國專利申請案第12/546850號中所述，且於此文將進一步詳述)，係用於選擇源自人類生殖系基因之人類IgG序列集合(repertoire)之連接物(binder)。庫是基於四個VL及三個VH域所構築，該四個VL及三個VH域係由已知IGV及IGJ生殖系序列所編碼，IGV及IGJ生殖系序列係根據已由天然來源單離之人類抗體觀察到之序列的頻率所選擇。VH、IMGT命名、所選擇者為IGHV1-69(序列識別編號：1)、IGHV3-23(序列識別編號：2)或IGHV5-51(序列識別編號：3)。VH設計中的多樣性產生在CDR3區中具有變異長度序列之重鏈，在H-CDR1及H-CDR2中限制多樣性位置仍為恆定長度。框架四(H-FR4)於庫的所有成員中維持恆定(序列識別編號：4)。

VH169,IGHV1-69*01長度=98,CDR1=31-35,CDR2=50-66QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYX₁ISWVRQA PGQGLEWMGX₂ IX₃X₄X₅X₆GTANY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR(序列識別編號：1)其中，在169庫中，X₁為A或G，X₂為G或W，X₃可為I或S，X₄可為P或A，X₅可為I或Y，且X₆可為F或N。

VH323,IGHV3-23*01長度=98,CDR1=31至35,CDR2=50至66EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS X₁YX₂MX₃WVRQA PGKGLEWVSX₄ IX₅X₆X₇GX₈STYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAK(序列識別編號：2)其中，在323庫中，X₁可為S、D、N或T；X₂可為A、G或W；X₃可為S或H；X₄可為V、A、N或G；X₅可為S、N、K或W；X₆可為Y、S、G或Q；X₇可為S或D；且X₈可為S或G。

VH551,IGHV5-51*03長度=98,CDR1=31至35,CDR2=50至66EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT X₁YWIX₂WVRQM PGKGLEWMGX₃ IX₄PX₅DSX₆TRY SPSFQGQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCAR(序列識別編號：3)其中，在551庫中，X₁可為S、N或T；X₂可為S或G；X₃可為I或R；X₄可為D或Y；X₅可為G或S；X₆可為D或Y。

FR4或JH區具有(11個殘基)WGQGTLVTVSS(序列識別編號NO：4)，已結合至上述序列，以形成一完整重鏈可變區。

為多樣化之標靶的H-CDR1及H-CDR2位置係經由下列決定：1)生殖系基因多樣化；以及2)於結構已知的抗體-抗原複體中經發現與抗原接觸之頻率(Almagro J Mol Recognit. 17:132-143,2004)。在選定的位置的胺基酸多樣性經由下列決定：1)生殖系中之使用；2)於人類重排之V基因中最常見之胺基酸；3)經預測為單個鹼基體細胞突變的結果之胺基酸以及4)胺基酸生化及生物物理性質有助於抗原辨識。

該庫在VH(H3)的CDR3併入多樣性，模擬人類抗體集合(Shi等人2010 supra)，如下所示(式I)，其中該最終長度為介於7和14個殘基。在超過5000個人類可變區之CDR3之中，胺基酸甘胺酸(G)及丙胺酸(A)係經常用於所有位置。此外，天門冬胺酸(D)經常用於位置95，而酪胺酸(Y)經常被編碼於J段的正則區前位置。用於IgG這些位置中位置99-101主要多為胺基酸苯丙胺酸(F)、天門冬胺酸(D)及酪胺酸(Y)。由於這些位置常作為H-CDR3之結構支持，且較少接觸抗原和/或IgG表面，於位置99之胺基酸苯丙胺酸加上白胺酸(50/50比率)、於位置100之天門冬胺酸及於位置101之酪胺酸被固定。因此，式I之序列被插在序列識別編號：1、2或3及序列識別編號：4之間，以產生完整VH。

-(D)-(N)n(N+O)m(F)DY-　(I)

其中：

(D)=富含Asp(D)及Gly(G)位置。

(N)n=富含Ala(A)及Gly(G)位置，n=3至7。

(O)m=富含Ala(A)、Gly(G)及Y(Tyr)，m=1至4。

(F)=The Phe(F)為主之位置。

各種庫的版本含括配對固定或多樣化的亦源自人類生殖系集合之輕鏈。在本發明中，4個輕鏈庫VL_kappa基因(Kawasaki等人2001. Eur J Immunol 31:1017-1028以及稍晚的Schaeble & Zachau，1993 Biol Chem Hoppe Seyler 374：1001-1022)為A27(IGKV3-20*01)、B3(IGKV4-1*01)、L6(IGKV3-11*01)及O12(IGKV1-39*01)，其中括弧中基因名稱為假定對應IMGT基因。Fabs為經由表現二順反子載體(dicistronic vector)而呈現於pIX上，其中該VH-CH1域係融合外殼蛋白序列，且VL-CLkappa或VL-CLlambda係表現為游離多肽，其與VH-CH1自行連接。標以底線者為CDR區。

Vkappa(Vk)生殖系基因為基礎之輕鏈變異庫

012；IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01長度=88;CDR1=24至34,CDR2=50至56DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS X₁X₂X₃NWYQQKP GKAPKLLIYX₄ ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC(序列識別編號：5)

L6,IGKV3-11*01長度=88,CDR1=24至34,CDR2=50至56EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSV X₁X₂X₃LAWYQQKP GQAPRLLIYX₄ ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC(序列識別編號：6)

A27,IGKV3-20*01，長度=89,CDR1=24至35,CDR2=51至57EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVX₁ X₂X₃X₄LAWYQQK PGQAPRLLIY X₅ASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYC(序列識別編號：7)

B3,DPK24,VKIVKlobeck;IGKV4-1*01長度=94,CDR1=24至40,CDR2=56至62 DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL X₁SSNNX₂NX₃LA WYQQKPGQPP KLLIYX₄ASTRESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYC(序列識別編號：8)

在每個可變區框架的特定位置多樣性總結於下表1中，其中使用胺基酸單字母代碼，且呈現如圖1所示之在特定位置的替代。

在所有的庫中之VL CDR3具有七個殘基，其中前兩個殘基為麩醯胺(Gln，Q)且對應Kabat殘基95之殘基為脯胺酸(Pro，P)。針對L-CDR3，序列對應QQX₁X₂X₃X₄PX₅T(序列識別編號：9)，其中變異如下表，且殘基位置係根據Kabat。

隨基因間變異序列長度不同，高可變環或CDR內特定殘基位置的多樣性可如下說明，其使用殘基編號係如Al-Lazikani B,Lesk AM,Chothia C,1997(Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. J Mol Biol 273: 927-948)所定義。在此系統中，藉由針對特定殘基下標a、b、c等，以便標明高可變環的長度改變。

框架4(FR4)片段，例如JK4、FGQGTKVEIK(序列識別編號：10)係用於形成完整人類輕鏈可變區。

對各種蛋白質標靶的Fab親和性為0.2至20 nM，此已在初始篩選中闡明。

整合成熟程序以改善結合參數之方法(由改組(reshuffling)VL或VH多樣性或導向性或限制性VL修改組成)，藉由使用如引用發表文獻、此處所教示及結合本領域中已知的經設計且用於庫的載體及引子而達成。

OSM結合免疫球蛋白域的替代來源

具有本文所揭露人類單株抗體以外的特徵的OSM結合抗體可製得或可為藉由數種方法所形成之免疫球蛋白域為來源之結合片段，包括標準體細胞雜交技術(融合瘤的方法)，科勒和米爾斯坦(1975)Nature 256:495。在融合瘤方法中，小鼠或其他適當宿主動物(例如倉鼠或食蟹獼猴)如此文所述免疫，以引起產生或能夠產生抗體特異結合至用於免疫的蛋白質的抗體的淋巴細胞。或者，淋巴細胞可為體外免疫。然後將淋巴細胞使用一個合適的融合劑，如聚乙二醇，與骨髓瘤細胞融合，形成融合瘤細胞株(Goding，單株抗體：原理與實踐，pp.59- 103(學術出版社，1986))。

OSM-中和抗體亦可視情況下藉由將能夠生產人類抗體集合的基因轉殖動物(如小鼠，大鼠，倉鼠，非人類靈長類動物等)進行免疫而產生，如同本文所述的和/或此項技術領域已知的。產生人類抗OSM抗體的細胞可以從這些動物中單離出且使用合適的方法不死化，如本文所述的方法。或者，編碼序列的抗體可為經選殖的，引入到一個合適的載體，且藉由本文所教示及此項技術領域已知的方法轉染用於表現和分離抗體的宿主細胞。

利用生殖系組態中攜帶人類免疫球蛋白(Ig)基因位點的基因轉殖小鼠提供單離高親和性的針對各種標靶之完全人類單株抗體，標靶包括正常人類免疫系統可耐受的人類自體抗原(Lonberg,N.等人，US5569825，US6300129及1994，Nature 368:856-9；Green,L.等人，1994，Nature Genet. 7:13-21；Green,L. & Jakobovits，1998，Exp. Med. 188：483-95；Lonberg,N and Huszar,D.，1995,Int. Rev. Immunol. 13:65-93；Kucherlapati等人US6713610；Bruggemann,M.等人，1991,Eur. J. Immunol. 21：1323-1326；Fishwild,D.等人，1996,Nat. Biotechnol. 14：845-851：Mendez,M.等人，1997，Nat. Genet. 15：146-156；Green,L.，1999，J. Immunol. Methods 231：11-23：Yang，X.等人，1999，Cancer Res. 59：1236-1243：Brggemann,M.及Taussig,M J.，Curr. Opin. Biotechnol. 8：455-458，1997；Tomizuka等人WO02043478)。在這種小鼠的內源性免疫球蛋白基因位點可以被破壞或刪除，以消除動物產生內源性基因編碼的抗體的能力。此外，如Abgenix公司(弗里蒙特，加利福尼亞州)和Medarex(聖何塞市，加利福尼亞州)的公司，從事使用如上所述的技術，提供針對對選定的抗原的人類抗體。

用於作為淘選策略的標靶配體以及作為免疫性抗原的多肽的製備可以使用任何合適的技術進行，如重組蛋白生產。呈經純化的蛋白質，或包括全細胞或細胞或組織的抽出物的蛋白質混合物形式，或於免疫的強況下的標靶配體或其片段，該抗原可由編碼該基因或其部份之核酸於該動物體內重新地(de novo)形成。

本發明之經單離的核酸可使用(a)重組方法、(b)合成技術、(c)純化技術、或其組合而製得，如同此項技術領域已知者。編碼該單株抗體的DNA係使用此項技術領域以之方法(例如藉由使用能特異性地結合至編碼人類抗體區域的重鏈與輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易地經單離與定序。當生產融合瘤時，該等細胞可做為該等DNA的來源。或者使用其中編碼序列與轉譯產物相連結的顯示技術，如噬菌體或核糖體顯示庫，該結合子與該核酸的選擇則簡化。噬菌體選擇後，源自噬菌體之編碼區的抗體可經單離且用於產生全抗體，包括人類抗體，或任何所欲抗原結合片段，且表現於任何所欲宿主，包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母菌與細菌。

人類抗體

本發明進一步提供結合人類OSM的人類免疫球蛋白(或抗體)。這些抗體也可以被特徵化為工程化或適應化。該免疫球蛋白具有實質上來自人類生殖系列免疫球蛋白的可變區且包括以之參予抗原辨識的殘基的相關變異，例如Kabat或結構所定義的高可變環的CDRs。恆定區若存在時，亦可實質上為來自人類免疫球蛋白。人類抗體展現對OSM的K_D為至少約10^-6 M(1微M)、約10^-7 M(100 nM)、10^-9 M(1 nM)或更少。為影響改變親和性，例如改善親和性或減少人類抗體對OSM之K_D，可在CDR殘基或其他殘基進行取代。

用於結合至OSM的人類抗體的製造來源較佳為本文所提供的序列如可變區、框架及/或CDRs，註記為SEQ ID NO: 13至55，其經鑑定為使用人類衍生Fab顯示於絲狀噬菌體顆粒的集合而能結合人類OSM且與食蟹獼猴OSM交叉反應。

如果人類可變域框架接受相同或類似的構形為來自原始CDRs的親代可變框架，對人類可變域框架的CDRs的任何取代最可能造成其正確的空間取向的延遲。欲配對於最終Mab的重鏈與輕鏈可變框架區可衍生自相同或不同的人類抗體序列。該人類抗體序列可為天然發生的人類抗體的序列，可為衍生自人類生殖系列免疫球蛋白序列的序列，或可為數種人類抗體及/或生殖系列序列的共有序列。

合適的人類抗體序列係經由電腦比較小鼠可變區的胺基酸序列與已知人類抗體的序列而加以鑑定。比較係分別對重鏈與輕鏈進行但原則為彼此類似。

關於經驗方法，已發現特別便利地為創造可用於篩選所欲多樣性、結合親和性或特異性的變異株序列庫。一種用於創造該等變異株庫的格式為噬菌體顯示載體。或者，變異株可使用替代與已知用於使編碼可變區內的標靶殘基的核酸序列隨機化或變異化的方法而產生。

決定是否需要進一步取代的另一方法，以及用於取代的胺基酸殘基的選擇，可使用電腦模型完成。用於製造免疫球蛋白分子的三維影像的電腦硬體與軟體已可廣為取得。一般而言，分子模型係由經解析的免疫球蛋白鏈或其域的結構開始產生。欲模型化的鏈是與相似於經解析的三維結構的鏈或域的胺基酸序列比較，以及選擇顯示最大相似性的鏈或域作為構築該分子模型的起點。經解析的起始結構係修正以使介於免疫球蛋白鏈或域之真實胺基酸之間的差異被模型化，且其等於起始結構中。然後經修正的結構被組裝為組合免疫球蛋白。最終地，該模型藉由能量模擬以及藉由確認所有原子皆彼此於適當距離內且結合長度與角度皆於化學可接受限制內而被精細化。

由於編碼的簡併，核酸序列的變異性將編碼各免疫球蛋白胺基酸序列。所欲核酸序列可藉由該所欲多肽早期製備的變異株的重新地固相DNA合成或PCR突變而製造。編碼本發明所揭示的抗體的所有核酸皆涵括於本發明。

如本文所述而製造得人類抗體的可變區段典型地係連結至人類抗體恆定區的至少一部份。該抗體將含有輕鏈與重鏈恆定區兩者。重鏈恆定區通常包括CH1域、鉸鏈域、CH2域、CH3域，以及有時的CH4域。

人類抗體可包含來自任何抗體種類的任何類型的恆定域，抗體種類包括IgM、IgG、IgD、IgA與IgE，以及任何亞種類(同型)，包括IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4。當期望人類抗體顯現細胞毒性活性時，恆定域通常為補體-固定恆定域且該種類典型為IgG₁。當不期望該等細胞毒性活性時，該恆定域可為IgG₂種類。人源化抗體可包括來自多於一種的種類或同型的序列。

視需要連結至恆定區的編碼人類輕鏈與重鏈可變區的核酸，可插入至表現載體。輕鏈與重鏈可選殖於相同或不同的表現載體。編碼免疫球蛋白的DNA區段可操作地連結至表現載體的調控序列以確保免疫球蛋白多肽的表現。該等調控序列包括信號序列、啟動子、增強子以及轉錄終止序列(參照Queen等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，10029(1989)；WO 90/07861；Co等人，J. Immunol. 148，1149(1992)，其等以引用形式並入本文為所有目的)。

3.使用抗OSM抗體之方法

如下文詳述所示，本發明證實經單離的具有M5、M6、M9、M10、M42、M45、M53、M54、M55、M62、M63、M65、M66、M67、M68、M69、M71及M83的可變域的單株抗體於OSM結合重疊抗決定區且顯示活體外及/或活體內的OSM抑制活性。具體地，經選擇的MAbs的反應性包括劑量依賴性阻斷OSM與gp130交互作用的能力、再gp130存在下降低OSM信號傳遞、降低OSM-刺激的A375細胞增生、預防巨噬細胞-刺激的軟骨細胞膠原蛋白的產生、或降低於活體內藉由OSM的細胞介素釋放。

如本發明所述之規定的單株抗體的性質，抗體或其抗原結合片段皆為合適的作為人類或動物治療或預防OSM相關症狀的治療劑或預防劑。

一般而言，用途將包括將治療或預防有效量的本發明的一或多種單株抗體或抗原結合片段，或選自具有相同結合與與生物活性的範圍的抗體或分子，投與至有疑慮之對象或一顯示OSM活性已知具有病理後遺症，如免疫失調或腫瘤生長與轉移的症狀者。可投與任何活性形式，包括Fab與F(ab')2片段。

較佳地，所使用地抗體為與接受者種型相容以使對象對於MAbs的免疫回應不造成不可接受的短循環半衰期或誘發對MAbs的免疫回應。所投與的MAbs可顯示某些二級功能，例如結合至對象的Fc受體以及ADCC機制的活化，以去除使用細胞分解或細胞毒性機制的標靶細胞族群或其等可藉由該等二級起效子功能的限制或缺乏予以工程化以預防標靶細胞族群。

個體的治療可包含本發明抗體的治療有效量的投與。抗體可如下文所述以套組提供。抗體可呈混合物投與，例如等量或個別地、依序提供或全部於一次投與。以能結合至OSM的抗體或其片段，或能於接受患者保護對抗OSM的抗體提供給患者時，投與劑的劑型會根據某些因子而變動，例如患者的年齡、體重、高度、性別、一般醫學症狀、先前就醫史等。

於相似的方案中，本發明單株抗體的另一治療用途為使用抗-同型抗體升高抗本發明單株抗體之一的患者的活性化免疫。使用模擬抗原決定區的結構的抗-同性抗體的免疫儜引出活性化抗OSM回應Linthicum,D. S.及Farid,N. R.，Anti-idiotypes,Receptors,and Molecular Mimicry(1988)，pp 1-5及285-300)。

同樣地，活性化免疫可藉由投與一或多種抗原性及/或免疫性抗原決定區作為疫苗組分而誘發。疫苗接種可以足以使接受者產生對抗此生物性功能區的抗體的量，預防性或治療性，經口或腸道外地進行。宿主可使用抗原性/免疫性肽之純的形式、肽的片段或汰的修改形式，予以活性化地免疫。不相應於原始蛋白質序列的一或多種胺基酸，可添加至原始肽或該態的截斷形式的胺基或羧基終端。該等額外的胺基酸有用於偶合該肽至另一肽、至大的攜帶蛋白質或至支撐體。有用於此等目的的胺基酸包括：酪胺酸、離胺酸、麩胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸及其等之衍生物。可使用其他的蛋白質改質技術，例如，NH2-乙醯化或COOH-終端醯胺化，以提供用於偶合或融合該肽至另一蛋白質或肽分子或支撐體的額外手段。

能保護對抗分所欲地OSM生物活性的抗體係企圖以足以有效於降低、解決或緩和OSM相關的症候或病理的量提供給接受對象。若要劑的劑型、投與途徑等足以影響該等回應，則量係稱為充足的或「治療有效量」以「有效於」症候的減少。對於抗體投與的回應可藉由例如成像技術或藉由組織樣本的活體外分析而分析對象受到影響的組織、器官或細胞予以量測。一藥劑為生理顯著的係當其存在時造成接受患者之生理的可偵測變化。

治療性應用

本發明之OSM-中和抗體、抗原結合片段或其剪切變異體，可用於量測或引起細胞、組織、器官或動物(包括哺乳動物與人類)，對診斷、監測、調控、治療、和緩、有助於OSM或表現OSM細胞所媒介、影響或調控的症狀的發症的預防、或症候的降低。因此，本發明提供一種使用本發明之至少一種OSM相關疾病的方法，抗體，用以於細胞、組織、器官、動物或患者，調控或治療至少一種OSM相關疾病，如已知於此項技術領域。

OSM已知於涉及發炎的多種疾病狀態中為向上調控且牽涉多樣的生物角色包括骨形成、軟骨降解、膽固醇攝取、疼痛以及發炎。特別的適應症係於下文討論。

適應症

本發明已顯示OSM媒介軟骨毀損且由組織外植體於骨關節內顯示OSM造成軟骨細胞降解。OSM也驅動細胞介素釋放，例侞TNFα，其能驅動膠原蛋白由軟骨釋放，如T. Cawston等人(1998，Arthritis及Rheumatism，41(10) 1760-1771)所示結果，以及能阻斷全身性細胞介素釋放的現存的抗體例示如M71結合域。本發明抗體；M55、M64、M69以及M71證實於巨噬細胞-軟骨細胞共培養系統增加蛋白多醣的合成超過OSM-特異性抗體不存在時所觀察到的濃度。

本發明進一步證實，本發明中和抗OSM抗體的投與，將抑制活體內OSM驅動的細胞介素與驅化激素的釋放，例如IL-6、IP-10及KC。IP-10，干擾素γ-誘發蛋白質10 kDa或小型-可誘發之細胞介素B10，為於人類由CXCL10基因(C-X-C模體驅化激素10(CXCL10)基因所編碼的蛋白質。CXCL10已知有助於數種角色，例如對於單核細胞/巨噬細胞、T細胞、NK細胞與樹突細胞的化學吸引，以及T細胞黏附至內皮細胞地促進。KC，目前已知為屬於CXC驅化激素家族的驅化激素，其先前稱為GRO1致癌基因、GROα、中性球-活化蛋白質3(NAP-3)以及黑色素瘤生長刺激活性，alpha(MSGA-α)。在人類，此蛋白質係由CXCL1基因所編碼。CXCL1係由巨噬細胞、中性球與上皮細胞所表現，且具有中性球化學吸引活性。

根據本發明所以提供選自M5、M6、M9、M10、M42、M45、M53、M54、M55、M62、M63、M65、M66、M67、M68、M69、M71及M83群組之抗體或抗體片段的用途，用於製造用以治療或預防關節蛋白多醣降解疾病的醫藥品，疾病如骨關節炎、炎性關節病或炎性失調。OSM拮抗劑的特別用途為製造預防或降低膠原蛋白由軟骨釋放的醫藥品。本發明進一步提供治療或預防炎性關節病或炎性失調的方法，包括對罹患該等時調的患者投與有效量的阻斷OSM結合至gp130的抗體。

本發明的抗體可使用於用以治療前炎性過程的製劑，該過程中OSM為直接或不直接，例如經由炎性細胞介素的釋放，導致組織或器官，特別是皮膚、肺與關節的病理。這種病症包括骨關節炎、類風濕性關節炎、銀屑病關節炎、強直性脊柱炎、神經性關節病、反應性關節炎、肩袖撕裂關節病、風濕熱、Reiter綜合徵、進行性系統性硬化症、原發性膽汁性肝硬化、天皰瘡、類天皰瘡、壞死性血管炎、重症肌無力、多個硬化症、紅斑狼瘡、多發性肌炎、結節病、肉芽腫、血管炎、惡性貧血、中樞神經系統炎症紊亂、抗原抗體複合物介導疾病、自身免疫性溶血性貧血、橋本氏甲狀腺炎、甲亢病、Reynard的綜合症、腎小球腎炎、皮肌炎、慢性活動性肝炎、腹腔疾病愛滋病、萎縮性胃炎，阿狄森氏病、內毒素血症或敗血性性休克(敗血症)，或一個或多個敗血症的症狀和其他類型的急性和慢性炎症、自體免疫性併發症。更特別地能由本發明的方法受益的患者為遭受大腸桿菌、出血性流感病毒B、與OSM相關的其他症狀且適合以本發明抗體治療或預防的療法包括纖維化疾病如肺部纖化、糖尿病性腎病變、特發性肺纖維化、全身性硬化症及肝硬化。有風險罹患敗血病的患者，包括那些因燒傷、創傷、腎功能或肝功能衰竭、創傷、燒傷、免疫功能低下(HIV)的造血細胞病變、多發性骨髓瘤、Castleman病或心臟粘液瘤的痛苦。

OSM和服從發明的抗體治療或預防性治療相關的其他條件包括肝纖維化的肺間質纖維化、糖尿病腎病、特發性肺間質纖維化、系統性硬化症和肝硬化等疾病。使用本發明抗體的另一適應症為治療或預防涉及背根神經節的神經元的感覺接受性疼痛。

投藥及用劑

本發明提供OSM-中和抗體的安定調配物，該調配物較佳為磷酸鹽緩衝生理鹽水或混合鹽溶液，以及保存溶液且調配物以及多用途保存調配物適合於醫藥或獸醫用途，於醫藥可接受調配物中包括至少一種OSM-中和抗體。合適的媒劑及其調配物，包含其他的人類蛋白質，例如人類血清白蛋白，舉例而言，揭示於Remington：The Science and Practice of Pharmacy，21st Edition，Troy,D.B.編輯，Lipincott Williams and Wilkins，Philadelphia，PA 2006，第五部份，Pharmaceutical Manufacturing第691至1092頁中，請特別參見第958至989頁。

該OSM-中和抗體於本文所述的安定或保存的調配物或溶液中時，可根據本發明經由各種方法投與至患者，包括靜脈注射(I.V.)；肌肉內(I.M.)；皮下(S.C.)穿皮；肺；穿黏膜；在植入物使用的配方、滲透泵、匣、微泵；或其他此項技術領域者所讚賞手段，如已知此項技術領域者。

舉例而言，網站的具體管理可為身體艙或如關節內、支氣管內、腹腔內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、側腦室、結腸內、子宮頸內、灌胃、肝內、心肌內、骨內、腹膜內、心包腔內、腹腔、胸腔內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、椎管內、滑膜腔內、胸腔內、宮腔內、膀胱內、病灶內、陰道、直腸、口腔、舌下含服、滴鼻，或透皮吸收的方法。

在一般情況下，如果管理一個全身劑量的抗體，這是需要提供的抗體用量範圍約1 ng/kg至100 ng/kg，100 ng/kg至500 ng/接受者kg，500 ng/kg至1 ug/kg，1 ug/kg至100 ug/kg，100 ug/kg至500 ug/斤，500 ug/kg至1 mg/kg，1 mg/kg至50 mg/kg，50 mg/kg至100 mg/kg，100 mg/kg至500 mg/kg(體重接受者)，雖然較低或較高的劑量可為投與。當然，本發明拮抗劑的適合劑量取決於如欲治療之疾病或失調、頭與途徑以及欲治療個體的年齡與體重以及該拮抗劑的本質而變化。不欲受任何特定劑量所限，咸信例如用於腸道外投與時，每日劑量由0.01至20 mg/kg的本發明抗體(或其他大分子)(通常存在為上述之醫藥組成物的一部分)可適合用於治療典型的成人。

治療可為單一劑量排程，或較佳為多劑量排程，其中治療的主要療程可為1至10的不同劑量，接著其他劑量以需要維持或強制回應的後續的時間間隔給予，例如第二劑量為1至4個月，以及需要時於數個月後給予後續劑量。合適治療療程的實例包括：(i) 0、1個月及6個月，(ii) 0、7日及1個月，(iii) 0及1個月，(iv) 0及6個月，或其他排程足以引出所期望的回應，期望降低疾病症候或降低疾病嚴重性。

本發明的抗體可為單獨使用或結合，如固醇(潑尼松龍等)，環磷酰胺，環孢素A或嘌呤類似物(如甲氨蝶呤，6-巰基，或類似)，或抗體，如免疫抑製劑抗淋巴細胞抗原抗體，抗白細胞抗原抗體，腫瘤壞死因子拮抗劑如抗TNF抗體和TNF抑製劑如可溶性TNF受體，或藥劑如NSAIDs或其他細胞介素抑製劑。

本發明將參照下面特定、非限制性實例說明。

實例1：試劑及分析法

為了選擇和特徵化OSM結合抗體，人類和食蟹獼猴OSM之構築體係產生用以哺乳動物細胞表現。人類OSM(NP_065391為NM_020530所編碼)為252個胺基酸前驅物，經處理成為完整長度之分泌蛋白質，長度227個胺基酸(序列識別編號：11)，其為前蛋白，會再進一步處理成更具完整活性成熟型，胺基酸為1至184。人類OSM cDNA購自OriGene(Cat. No. SC121421)以及來自OriGene純系之人類OSM的ORF以PCR擴增，並將信號胜肽(小鼠IgG1)與蛋白質純化用之六His標籤及定位蛋白質生物素化用之AviTag(序列識別編號：56)導入。後者經選擇以避免鄰近OSM與受體交互作用處的離胺酸殘基的隨機化學生物素化。

食蟹獼猴OSM，係使用Superscript III第一股合成合成系統(InVitrogen公司)自食蟹獼猴PBMC中的RNA選殖，以獲得cDNA，及接著使用由人類OSM序列(如美國專利申請案第12/648430號)所設計的UTR引子進行PCR擴增。經表現之全長蛋白質示於序列識別編號：12，具有經截切、活化型，為184個殘基(51至227)。

人類和食蟹獼猴OSM的前驅物和成熟形式於HEK 293中表現，並使用標準方法和純化。蛋白質功能活性於A375-S2細胞增生中測試，且pSTAT3信號傳遞分析是使用作為對照之E. coli衍生之市售人類OSM(R&D Systems,Cat. No. 295-OM)。

Mab

當使用對照抗體，則使用IgG1同型抗體(標記為CNTO6234)。

化學生物素化作用

重組人類OSM使用NHS酯化學(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit,Pierce,#21435)，其以細胞介素上胺殘基為標靶。生物素偶合反應係對每莫耳抗原的一莫耳生物素的標靶標識效率予以最佳化。後者最小化結合及功能活性損失，同時確保了近乎完整的蛋白質族群的標識。反應完成後，使用EZ-LinkSulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit(Pierce)中所含的Zeba Desalt Spin Columns，從游離生物素試劑和殘基脫離群純化該蛋白質。約80%起始原料被回收。使用HABA分析(Pierce生物素定量套組，#28005)測量生物素嵌入量，其顯示每莫耳人類OSM約一莫耳生物素。使用Octet儀器(FortBIO)以確認卵白素偶合及gp130-Fc(R&D Systems,Cat. No. 671-GP)對生物素化蛋白質的結合。Octet測量顯示生物素化人類OSM結合之gp130具有基本上與未標識之起始原料的數據相同。

體外經標靶生物素化作用

15個殘基之AviTag(GLNDIFEAQKIEWHE)(序列識別編號：56)具有與內源性BirA基質BCCP類似的生物素受體動力學(Beckett et. al. 1999,Protein Science)。當加上關注之蛋白質，AviTag(具有一個受體離胺酸殘基)將僅於一個位置上被生物素化。使用購自Avidity之生物素-蛋白質接合酶及試劑將重組食蟹獼猴OSM體外定位生物素化。生物素化之食蟹獼猴OSM以單價卵白素親和性樹脂純化。產生的蛋白質的質量以SDS-PAGE和SEC-HPLC進行評估。該HABA分析法(Pierce生物素定量套組，#28005)是用來測量生物素納入的量，其為每莫耳的食蟹獼猴OSM約一莫耳的生物素。一個Octet儀器(FortBIO)是用來驗證生物素化蛋白的卵白素偶合和GP130-FC嵌合體結合。Octet的測量結果表明，生物素化食蟹獼猴OSM的約束與配置文件基本上未標記的起始原料相同的GP130。

固相免疫分析法

初步噬菌體的Fab淘選使用經塗有於TBS的2 μg/ml生物素化的人類OSM或食蟹獼猴的OSM的NEUTRAVIDIN^TM ELISA 板(Pierce)。經過整夜培養在4℃，封阻和洗滌，分別加入1:100稀釋的每一輪淘選的多株噬菌體池。結合噬菌體係以對pVIII，M13的噬菌體主要外殼蛋白，特異的HRP-聯結單株檢測(GE Healthcare,Cat. No. 27-9421-01)，其次是加入化學發光基質的POD(Roche,Cat.目錄編號11582950001)，並於PerkinElmer儀器上讀值。

個別純系的主要篩選是利用來自大腸桿菌上清的分泌的可溶性Fab-His蛋白質進行。細菌上清，含可溶性Fab-His蛋白質，用於在ELISA格式進行結合。黑色MaxiSorp盤(Nunc，目錄編號437111)以1 μg/ml的山羊抗人類Fd(CHl)抗體(The Binding Site，目錄編號PC075)被覆並於4℃靜置培養整夜。將板洗滌和封阻後，添加50 μl未稀釋的細菌上清(含Fab-His蛋白質)且使其在室溫輕輕搖動1小時培育。將板洗滌且將生物素化人類或食蟹獼猴的OSM的20 nM添加到經捕捉之Fab。室溫1小時後，加入SA-HRP(Invitrogen，目錄編號43-4323)，且如上述進行化學發光偵測。經計算以人類OSM的濃度為20 nM與主要結合ELISA篩選，將允許具有親和性的純系以奈莫耳親和性範圍檢測。

抗原決定區歸類(Epitope Binning)

抗原決定區歸類係進行競爭分析法，以利用人類IgG1轉換的單株抗體以及商業可得抗體，MAB29，這被稱為是一個OSMRβ/LIFRα誘集-阻斷劑(R-受體阻斷劑)，所進行的結合特徵為基礎而集團化MAbs。

對384-孔多陣列板(Meso Scale Discovery(MSD)，L25XA-4)的每孔，添加2.5 μg/ml在磷酸鹽緩衝液的抗-人類Fc(Jaskson Immuno，709-005-149)(PBS)pH7.4(Sigma公司，P3813)。該板於4℃培養整夜，然後以50 μl的MSD阻斷劑A在室溫封阻1小時。384多陣列板洗3次(PBSpH7.4，0.05%吐溫20(Scytek，PBT010)，每孔加入1.0 μg/ml的測試mAb的溶液，接著在力價板振盪器第6級在室溫振盪1小時。如之前一樣，將該板洗滌三次。

與此同時，5μg/m1的競爭mAb溶液與1μg/m1的生物素化OSM(R&D Systems,295-OM-010/CF)合併在一個不同的96孔板MSD(COSTAR，3357)於MSD分析緩衝液(PH7.4，用PBS緩衝塊1：3，0.05%吐溫20)中且和於力價板振盪器第3級在室溫振盪1小時。競爭抗體和生物素化OSM的預複合物添加到384多陣列板的每孔且在室溫振盪(力價板振盪器第6級)1小時。該板洗滌3次，每孔加入卵白素磺酸TAG(MSD，R32Ad-S)，並在室溫振盪(力價板振盪器第6級)30分鐘。該板洗滌3次，每孔加入讀值緩衝液1:4與蒸餾水稀釋(MSD，R92TC-1)。該板於MSD S6000儀器讀值。

數據係以由生物素化OSM存在下沒有競爭的mAb存在的測試mAb所得信號(最大信號)以及與從自我的競爭的信號(最大信號降低2至4倍)為基礎進行解讀。抗原決定區競爭係指定為當競爭mAb存在時的質為從自我競爭的值的三標準偏差內。

A375細胞

A375細胞(ATCC；CRL-1619)為人類上皮細胞，其源自惡性黑素瘤。A375-S2細胞(ATCC；CRL-1872，為CRL-1619亞細胞株，對IL-1敏感)培養於完全生長培養基(DMEM/GlutaMax-I,Gibco)，補充以10% FBS(Gibco)，培養於為T-175培養瓶(Corning；目錄編號431080)，且當每三至四日約80%匯合時以1:20的次培養比例進行次培養。

A375-S2細胞增生(BrdU嵌入)分析法

藉由人類或食蟹猴OSM造成之A375-S2細胞增生的減少係使用化學發光ELISA藉由BrdU併入而測量。抑瘤素M減少A375-S2人類黑素瘤細胞株增生(Zarling et al. PNAS 83:9739-9743)。該細胞株用於評估抗抑瘤素M所有階段的抗體發現。A375-S2細胞維持在T-150組織培養燒瓶(BD Falcon 35-5001)的DMEM(Gibco公司11995)10%胎牛血清(GIBCO16140)1%筆/鏈黴素(Gibco公司15140)在37℃在95% O2-5% CO2且每週兩次以1:10劃分。

要執行增生分析法，細胞經胰酶消化(0.25%，25200 Gibco公司)，由T150燒瓶將其移除後，然後以2000個細胞/孔的密度平鋪於黑色TC被覆板(BD Falcon 353948)的內48孔，在200 μl的DMEM/FBS/Pen-Strep中。經過整夜培養在37℃/95% O2-5% CO2，移除培養基且以180 μl新鮮培養基置換。準備不同的板，其中包含了10X終濃度的所有測試溶液。從這個板，移轉20 μl到細胞版的相應孔以產生適當的實驗條件。每個實驗條件進行三重複測試。任何評估中和的實驗中，抗體和抑瘤素M被添加到細胞前至少一起培育至少1個小時。然後在37℃/95% O2-5% CO2培育該板額外的72小時。此時進行化學發光BrdU細胞增生ELISA(羅氏11669915001)。BrdU標識試劑加入到培養物4個小時。然後移除培養基，且每孔加入100 μl固定溶液。在室溫30分鐘後移除該溶液且加入100 μl/抗BrdU-POD溶液。室溫2小時後，該板用PBS- Tween洗滌且加入100 μl的Super Signal Pico(Thermo Scientific的37069)。然後使用Perkin Elmer公司Victor3儀器讀取發光。

進行最初的實驗，以確定在內部生成的CHO細胞衍生的重組人類和食蟹獼猴的抑瘤素M在抑制增生的劑量-回應。Osm是從起始濃度100 ng/ml，以1至5個稀釋到0.0244 ng/ml的終濃度予以測試。增生的抑制百分比計算係與使用媒劑對照組處理的細胞進行比較。此實驗的結果顯示在圖2A。隨著人類或食蟹獼猴的抑瘤素M濃度增加而有BrdU併入的相應降低。基於兩者的抗增生活性的程度和效果的EC50，人類和食蟹獼猴的抑瘤素M的抗增生活性是沒有區別的。

根據這些實驗，2 ng/ml濃度的抑瘤素M用於評估和比較抗抑瘤素M抗體，因為這種濃度抑制增生約80%，給一個大窗口以於其中確定抗體劑量回應。於2 ng/ml人類或食蟹獼猴的抑瘤素M的存在下評估抗體的完整劑量範圍此外，同型對照以所使用之抗抑瘤素M抗體的最高濃度包括於實驗中。分析窗口係藉由介於未處理對照孔(最大增生)與利用2 ng/ml抑瘤素M單獨培養的孔(最小增生)之間的差異而定義且於任何濃度抗體的中和百分比係定義於此窗口內。

pSTAT3信號傳遞(使用A375-S2磷-STAT3分析法)

OSM抑制A375-S2細胞的生長係藉由結合細胞表面受體gp130以及誘發受體與OSMRβ雜二聚化以起始細胞內信號傳遞的級聯反應，包括信號傳遞分子STAT3的活性化(磷酸化)(Kortylewski等人，Oncogene18：3742-3753，1999)。STAT3信號傳遞的中斷會廢除A375 - S2細胞的OSM生長抑制，表明STAT3活化在OSM的信號傳遞為重要步驟(Heinrich等人，Biochem. J. 374：1-20，2003)。STAT3的磷酸化在A375 - S2細胞已顯示是OSM的濃度依賴性和商業套組可用來於受刺激細胞中測量。OSM誘發STAT3磷酸化在A375 - S2細胞的中和被選作為Mabs候選者的初篩分析法。

對於OSM誘發STAT3磷酸化的抗體中和，A375 - S2細胞接種於96孔組織培養板(Corning；目錄編號No. 3596)以25,000細胞/孔於200 μl完整的生長培養基中且培育24小時。細胞以含5 ng/ml人類OSM(重組，哺乳動物細胞衍生，OSMN1-1)的溶液處理，其經以1:5連續稀釋的實驗mAb由10 μg/ml開始於室溫培育3小時。對照組包括未經處理的細胞，刺激細胞(僅有5 ng/ml的OSM)和hIgG1同型對照mAb。除非另有說明，所有的治療都以三重複形式進行。

pSTAT3的內容係使用磷酸化STAT3 Whole-Cell Lysate Kit(MSD；目錄編號K150DID-1,Lot No. K0010570)按照製造商的方案進行分析。簡言之，細胞在200 μl/孔體積處理10分鐘；移除處理溶液，以及50 μl的細胞MSD裂解緩衝液是通過多道移液器加入。該板被放置在迴轉式振盪器(300 RPM)5分鐘。此後，30 μ的每個裂解液轉移到MSD的磷酸化STAT3的96孔板。板密封且放置在迴轉式振盪器(300轉)於室溫1小時，以150 MSD洗滌緩衝液洗滌三次，且對每孔加入25 μl的二次檢測抗體結合物(抗pSTAT3-Ru(bpy)32+)，再次密封且於迴轉式振盪器(300轉)於室溫培育1小時。如前述洗滌該板且每孔加入150 μl MSD讀取緩衝液(三丙胺溶液)。該板塊於MSD SECTOR Imager 6000儀器讀值。

獲得對於內聯成熟、親代和對照mAbs的完整EC50劑量-回應曲線並繪製正常化pSTAT3信號百分比。

藉由表面電漿子共振(Biacore)之親和性測量

結合親和性的測量，以Biacore 3000光學感測器(Biacore)，使用表面電漿子共振(SPR)，使用如所述之人類或食蟹獼猴OSM的構築體。使用製造商之胺偶合化學使用說明，以抗小鼠(Jackson，目錄編號315-005-046)及抗人類(Jackson，目錄編號315-005-046)的抗IgG Fc抗體混合物偶合至CM-5晶片(Biacore，目錄編號BR-1000-14)之羧甲基化聚葡萄糖表面，製備生物感測器表面。約19,000 RU(回應單位)的抗OSM的抗體被固定化在四流體細胞。在25℃於操作緩衝液(DPBS+0.005% P20+3 mM EDTA)進行動力學實驗。人類和食蟹獼猴OSM ECD的連續稀釋物從100 nM到0.412 nM製備於操作緩衝液中。約200 RU的mAb被感測晶片的流體細胞2至4捕捉。流體細胞1使用作為參考表面。接著mAb的捕捉係藉由以50 μl/min三分鐘注射(結合相)抗原，隨後10分鐘的緩衝液流(解離相)。晶片表面是藉由以50 μl/min的100 mM H3PO4(Sigma公司，目錄編號7961的18秒注射的兩個脈衝而再生。

收集到的數據使用BIAevaluation的軟體(Biacore,version 3.2)處理。首先，數據的雙參考減法係藉由緩衝液注射減去來自分析物注射的參考減去曲線所產生的曲線而進行。全球適合使用1:1結合模型進行動力學分析數據。各mAb的結果以Ka(結合速率)、Kd(解離速率)及K_D(親和性常數)格式呈現。

實例2：OSM結合FAB的選擇

重新的Fab-pIX庫已說明於Shi等人之J Mol Biol 397:385-396,2010；WO09085462A1；U.S. Ser. No. 12/546850；且本文上述被指定為169、323和551引用的重鏈人類生殖細胞框架被使用：IGHV1-69(序列識別編號：1)，IGHV3-23(序列識別編號：2)，或IGHV5-51(序列識別編號：3)在IMGT命名。三個重鏈庫框架相組合，與4個輕鏈庫VL_kappa框架：A27(IGKV3-20*01(序列識別編號：5))，B3(IGKV4-1*01(序列識別編號：6))，L6(IGKV3-11*01(序列識別編號：7))，O12(IGKV139*01(序列識別編號：8))在庫中，Fabs的V-區的完成係藉由添加包括序列識別編號：4於重鏈和序列識別編號：10於輕鏈的J-區(FR4)。重鏈CDR3是可變長度從7至14個殘基。每個庫的完整V-區的實例請參見圖1，且所顯示的編號和CDR區根據Kabat。

使用市售去糖基化人類OSM鑑定抗OSM噬菌體顯示中擊的起始組。Fab-PIX噬菌體顯示庫使用生物素化人類OSM(R&D Systems，目錄編號295-OM)捕捉於順磁卵白素(SA)珠粒(Invitrogen，目錄編號112.05D)接著為噬菌體選擇的公開方案(Marks及Bradbury，Antibody Engineering，第248卷：161-176，Humana Press，2004)而淘選。簡言之，生物素化人類OSM添加到已預吸附於未結合珠粒的噬菌體庫到最終濃度為100 nM且以溫和的旋轉培育1小時。添經封阻的SA珠粒且培育15分鐘以捕捉具有結合的噬菌體的生物素化OSM。磁捕捉噬菌體/抗原/珠粒複體以1 ml的TBST5次以及一次1 ml的TBS洗滌。移除最後的TBS洗液後，添加1 ml的指數生長TG1細胞(Stratagene，目錄編號200123)且於37℃無振盪的培養30分鐘。經感染細菌佈於LB/瓊脂(1%葡萄糖/100μg/ml卡本西林)盤(Teknova，目錄編號L5804)，並於37℃培養整夜。刮除細菌苔且製備甘油原液[15%甘油/卡本西林(100 μg/ml)/2xYT]，並儲存在-80℃為了準備第二輪的淘選噬菌體，25 ml的2xYT/Carbenicillin(100 μg/ml)以25 μl細菌甘油原液接種且在37℃生長直到OD600值大約為0.5。助手噬菌體VCSM13(Stratagene，目錄編號200251)以約10:1的多重感染添加至培養物且培養是在37℃無振盪進行30分鐘。旋降細菌且小粒懸浮在誘發培養基(2xYT/Carb/Kan/IPTG)並於30℃生長整夜。噬菌體是以2%PEG/0.25 M NaCl(終濃度)沉澱且再懸浮於2 ml的PBS。第一輪噬菌體是儲存在4℃，用於開展第二輪淘選。淘選參數為：第1輪，100 nM抗原，在室溫1小時培養，用TBST 5x接著用TBS 1x洗滌；第2輪，10 nM抗原，在室溫1小時的培養，用TBST/10x/TBS1x洗滌；和第3輪，1 nM抗原，16小時(整夜)4℃培養，用TBST10x/TBS1x洗滌。

當Fabs以抗-人類Fd(CH1)抗體捕捉且以20 nM添加生物素化人類OSM並以SA-HRP偵測結合的OSM時使用ELISA針測成功。

鑑定三十(30)個獨特的重鏈-輕鏈配對於所顯示的Fabs顯示，此由ELISA顯示與食蟹獼猴OSM交叉反應。重鏈代表從169(IGHV1-69衍生的)和551(IGHV5-51衍生的)庫的序列，且與結表示所有四個庫生殖系起源(A27、B3、L6和O12)的輕鏈可變區組合。

實例3：OSM結合MABS的特徵化

四螺旋束結構OSM具有由相對非結構的環連結的指定為A、B、C合D的4個α螺旋段的特徵。OSM與gp130交互作用係經由位在螺旋A與C的表面(位置II)被確定為包括與序列識別編號：1的胺基酸殘基Q16、Q20、G120、N123、N124接觸(Deller et al. Structure 8(8): 863-874,2000;Liu et al. Int. J. Mol. Med. 23: 161-172,2009)。負責OSM與OSMRβ和LIFRαOSM的交互作用(位置III)的表面被認為主要藉由位於螺旋D的殘基所定義(Deller等人同上)。

目標係選擇對OSM高親和性結合劑能夠防止OSM所驅動的gp130信號傳遞經由預防OSM結合至gp130(位置II或B-阻斷劑)或預防經結合gp130的OSM的LIFRa或OSMRb的誘集(位置III或R-阻斷劑)。

初步選定的30個OSM結合Fabs中，29個被選殖到載體用以轉換為全長度人類IgG1的Mabs。特徵化分析法為(1)競爭結合，以確定抗原決定區組或「歸類」，(2)藉由表面等離子體共振(Biacore)的親和性測量，(3)阻斷pSTAT3信號傳遞的能力。所有篩選和分析法已使用哺乳動物細胞生產如實例1所述的(糖基化)的人類和食蟹獼猴的蛋白質。

結果

根據相對於對照MAB295(R&D Systems)在pSTAT3和ELISA結合分析法的其等的排名為基礎所選定的mAbs的子集的親和性測量數據顯示在表3。

表3.抗OSM第一輪mAb選擇子集之親和性

歸類分析的結果顯示，M5、M6和M9相互競爭，但不與MAB295競爭。M10沒有與MAB295競爭。這四個mAbs也由pSTAT3分析法顯示有功能於中和gp130信號傳遞。因此，可知M10是R-阻斷劑且M5、M6和M9阻斷OSM結合至gp130(B-阻斷劑)。

為治療導致的標靶親和性是藉由競爭果斷的OSM-gp130交互作用的需要所引出，其親和性(K_D)已測得約1 nM。因此，對於OSM的標靶親和性為100 pM或較低K_D是所欲的。

中和MAbs M5、M6和M9，已發現為OSM-gp130交互作用的阻斷劑，加上M10被選為內部成熟，以生產達到對於治療候選者的100 pM親和性要求的衍生物。額外所期望的性質為mAbs以對人類OSM為5倍以內的親和性(K_D為500 pM或更少)結合至食蟹獼猴OSM。

這四個Mabs的結合域的組成，已發現代表四個獨特的重鏈和輕鏈配對經指定如表4所示。

完整的可變區序列，包括用於創建本文所述的噬菌體庫的生殖系序列，因此固定殘基相配於未突變的親代生殖系殘基。因此，每個V-區是由指定的CDR1和CDR2在序列識別編號：1至3或5至8指定的支架內；接著為CDR3(表3和4)且用於輕鏈可變區以及分別地(表5為LC和表6為HC)，其次是J區如序列識別編號：4用於重鏈以及序列識別編號：10用於輕鏈。

HC可變區H2包括衍生自序列識別編號：1的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3其中X₁=A，X₂=G，X₃=I，X₄=P，X5=I和X₆=F與一個額外的突變於H-CDR2。來自庫551的HC(H14、H17以及H135)包括衍生自序列識別編號：3的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3，其中X₁=S，X₂=S或G，X₃=I，X₄=Y，X₅=G和X₆=Y或D。四個HC的各者包括一個獨特的CDR3(序列識別編號數：19至22)。

所選定的Fabs的LC可變區皆衍生自B3庫且包括策劃生殖系序列代表在IMGT數據庫如IGKV4-1(B3)，其使用作為如本文與參考公開文獻所述之庫多樣性的起始序列。四個輕鏈中的三個在CDR1有差異並具有相同的H-CDR2。對於該四個所選定的LC可變的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的共同序列衍生自序列識別編號：8，其中X₁Y、S或A，X₂K、E或N；X₃Y、W或F；X₄通常是W。

兩個獨特的CDR3序列進行了鑑定。L-CDR3可以代表一個共同序列(序列識別編號：29)由公式代表的Q-Q-(S,Y)-(F,Y)-S-(F,T)-PLT。

實例4親和性再選擇

實例3所述的四個V型區配對，OSMM5、OSMM6、OSMM9和OSMM10，係經輕鏈再選擇以提高親和性。要以有效和快捷的方式由主要選擇的大量抗體的親和性成熟，使用Shi等人J Mol Biol 397: 385-396，2010以及WO09085462A1及美國專利申請案第12/546850號所述的「線內」的成熟過程。簡言之，在最初的幾輪選擇中獲得的抗原-特異純系的V_H區，與相應的V_L支架的庫組合，在這種情況下的B3基於V型區(序列識別編號：8)。

創建三個新庫，一個使用主要選擇中所使用的V_L庫作為多樣化V_L鏈的來源，以及基於最近一個已知結構的抗原抗體複體的分析的基礎上設計鏈的兩個額外的庫(Raghuanthan等人，J. Mol. Recognit，2010)。選擇殘基係基於最有可能涉及標靶蛋白質的結合的該等殘基，也被稱為特異性決定殘基的用法(SDRU)。在Vkappa輕鏈，此已被決定為三個接觸區中心圍繞如Chothia和Lesk所定義的高可變環，其取決於該標靶是否為蛋白質、肽或小的半抗原(hapten)而稍微差異。表5顯示用於親和性成熟的V_L庫，其中B3是發現階段中所使用的相同庫，庫2「SDRM聚焦」是基於SDRU殘基和聚焦的多樣性，和NNK是隨機的庫。在表中，「X」表示任何胺基酸，加上由NNK組合產生一個終止密碼子。

表7總結庫1、2及3的多樣性。最終庫分析期間，某些胺基酸查明了非為原設計的一部分，因此導入作為合成方法的後續。對於庫2，合成所使用的二核苷酸，這些胺基酸是：S(位置30c)、T(位置30d)、EK(位置30f)、IW(位置32)、TV(位置50)、I(位置92)、D(位置93)與F(位置96)。

Fab-His由第三輪的淘選輸出而製備以及應用單株Fab-His ELISAs以鑑定較相應的親代Fab為較高的結合信號中擊的個體。使用兩種濃度的生物素化人類抗原於下列範圍的ELISA：2 nM和0.2 nM。對於各親代純系的結合信號被設為100%。從M6和M9的親和性成熟有22個中擊，顯示多達9倍(900%)的改良結合，此係相較於包括原始重鏈與輕鏈V-區的親代Fab。選擇某些新配對的重和輕鏈作進一步評估。

對於人類與食蟹獼猴OSM的內呈熟的mAbs的親和性(K_D)，相較於MAB295對照和親代mAbs M6和M9者是概括在表8和表9且該等mA的CDR組成示於表9。在某些情況下，LCV與H14和H17兩者配對。基於其生物物理性質與功能潛力而被指定的候選的治療藥物的某些mAbs係以灰色突出顯示。

表9較高親和性Mabs之LC-CDR表

LC-CDR3多樣性的Q-Q-(S,Y)-(F,Y)-S-(F,T)-PLT(序列識別編號：29)在選定的候選者減少，再選擇的高親和性LC-CDR3的共同序列表示為QQY-(F,Y)-STP-(L,I)-T(序列識別編號：47)。

對於再選擇的mAbs，H14與H17的VH共享一個共同的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3其規定為序列識別編號：48且包括序列識別編號：14(CDR1)和序列識別編號：17(CDR2)。

減少人類及食蟹獼猴A375-S2細胞增生之能力

為了評估內成熟的抗體，進行由5 μg/ml或1 μg/ml起始以1至5個稀釋分別下降至0.0016或0.00032 μg/ml的劑量-回應。由M71中和，示於圖2B。隨著抗體濃度的增加，兩者人類和食蟹獼猴抑瘤素M的抗增生效果是被中和的。使用來自以人類(空心符號)與食蟹獼猴(封閉符號)抑瘤素M的三個獨立實驗的數據計算劑量-回應曲線。表10總結M55、M64、M69及M71抗人類及食蟹獼猴抑瘤素M的IC₅₀(具95%信賴區間)。

人類gp130競爭作用

競爭實驗係於選自內成熟加上由上述表選定的兩個新結合劑之間進行，且人類gp130使用如實例1中所述的表面等離子體共振(SPR)Biacore3000光學生物感應器(Biacore)。

該生物感應器的表面根據製造商的指示藉由偶合各個測試mAb至CM-5晶片(Biacore，目錄編號#BR-1000-14)的羧甲基葡聚醣而製備。約4,000至15,000 RU(回應單位)的各個測試mAb被固定在儀器的四個流體細胞。運行緩衝液在25℃(DPBS0.005% P20+3 mM的EDTA)進行競爭實驗。人類OSM(在內部，OSMN1-1)以運行緩衝液稀釋至30 nM，並以3 μl/min對於各個具有經固定的mAb的流體細胞注射歷時3分鐘。接著人類OSM的捕捉有三分鐘以300 nM注射競爭的mAb或人類gp130-Fc(結合相)接著流通緩衝流(解離相)300 nM。晶片表面是藉由兩個12秒的100 mM H₃PO₄(Sigma,Cat# 7961)以50 μl/min的脈衝而再生。收集的數據使用BIAevaluation軟體版本3.2(Biacore)進行處理。首先，感應譜後注射人類OSM一致。然後紀錄人類OSM、競爭mAb或gp130-Fc的結合程度(RU)。當競爭mAb或GP130-Fc注射於OSM表面時於結合RU上升顯示與固定的測試mAb沒有競爭，反之亦然。流通池(Fc1等)固定化mAbs單獨呈示於表10的水平樣本行。

之前M2顯示與已知不與gp130競爭結合製OSM的市售抗體MAB295相競爭。結果表明競爭結合分析法顯示M54、M55、M64、M69和M71與人類gp130-Fc競爭OSM的抗原(表11)。

表11人類gp130競爭經成熟之候選藥物mAb。

在A375細胞中阻斷pSTAT3的能力

對於對於M6與M9以及該等Mabs的內成熟變異體之進行於A375細胞於5 ng/ml的hOSM的化不存在下的pSTAT3抑制所計算之EC50值，示於表12。

表12. pSTAT3抑制

實例5生物活性巨噬細胞-軟骨細胞共培養分析

於巨噬細胞-軟骨細胞共培養系統中評估M71。已知經分化的聚示細胞產生抑瘤素M(長谷川等人，Rheumatology 38:612-617，1999)。OSM可以降低高度硫酸化蛋白多醣蛋白聚醣(GAG)的合成而製造顯著部分的軟骨基質。

抗人類抑瘤素M抗體被發現使用重組HEK-生成的His-Avi標籤標定的人類和食蟹獼猴抑瘤素M且這些抗體的活性使用該等分子以及來自R& D系統的細菌衍生的重組人類抑瘤素M(295-OM)進行了評估。這些都不是完全相同的原生內源性人類抑瘤素M，因為His-Avi標籤(HEK-生成的OSM)或缺乏糖基化(細菌重組Osm)。巨噬細胞已知分泌抑瘤素M(Grove等人，J Lipid Res 32：1889-97，1991)，且抑瘤素M減少人類軟骨細胞蛋白多醣的合成(Sanchez等人OA及Cart. 12:810-10，2004)。因此，巨噬細胞-軟骨細胞共培養系統是用來確定的抗-人類抑瘤素M抗體對中和內源性的或原生的人類抑瘤素M的能力。簡言之，單一海藻酸鹽珠粒，含有40,000個正常人類關節軟骨細胞，於經分化的人類聚示細胞的存在下培養72小時。這些實驗於抗抑瘤素M的劑量範圍的存在下進行。在實驗結束時，蛋白多醣的合成係由放射性³⁵SO₄的併入而測量。

從AllCells獲得CD14+外周血單核細胞。單核細胞培養在48孔盤以2.5×105個細胞/孔的0.5 ml的巨噬細胞培養基(RPMI+麩胺醯胺與10%熱滅活胎牛血清，1% NEAA和1% Pen-Strep)。細胞用100 ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)處理。48小時後，置換培養基已移除未貼附細胞。第6天，M-CSF的含有巨噬細胞培養基以無M-CSF的巨噬細胞培養基置換。在第8天，巨噬細胞培養基以軟骨細胞的培養(50% Ham's F-12/50%與10%小牛血清的DMEM)置換以及每孔加入海藻酸鹽珠粒軟骨細胞培養物(關節工程#CDD-H-2200)。分裝的經調整的巨噬細胞培養基被保留且保存於-80℃用於抑瘤素M濃度分析，使用的R&D系統人類抑瘤素M DuoSet(DY295)。

海藻酸鹽珠粒巨噬細胞共培養物係保持於存在20 μg/ml的抗人類抑瘤素M抗體(M64、M71、M55、M69)，或存在劑量範圍(5 μg/ml至0.00076 μg/ml;1至3個稀釋)的抗體(M71和M55)。此外，人類IgG1的同型對照(CNTO6234)以所測試的抗抑瘤素M抗體的最高濃度被包括至該板。其他對照為軟骨細胞單獨(無共培養)以及於2 ng/ml的人類抑瘤素M的存在下的軟骨細胞。此外，僅維持含有巨噬細胞的孔以測量抑瘤素M的生產。共培養72小時後，10 μCi/ml放射性35SO4(NEX041H002MC在Perkin-Elmer)加至每孔後繼續額外的20個小時。

併入的³⁵SO₄使用CPC沉澱技術(MP BIomedicals(#190177)。經過20小時與³⁵SO₄的培養後，移除經標記的培養基且各珠粒以具有Ca與Mg的DPBS洗滌兩次。第二次洗滌後，對各珠粒添加200 μl的檸檬酸緩衝液(150 mM NaCl，55 mM NaCitrate，pH 6.8)。該板在37℃培育10至15分鐘質導珠粒溶解。從每孔分取100 μl轉移到以1% CPC預濕潤的Millipore Multiscreen 96-孔過濾盤後對每孔添加10 μl的10%CPC並維持5分鐘。然後將真空應用於板，直到過濾器乾燥。然後每孔以200 μl的1% CPC洗滌兩次且每次使用真空直到過濾器乾燥。然後由該盤移除塑膠底且以密封劑(Perkin Elmer公司#6005185)置換。閃爍液(50 μl，Perkin Elmer公司#6013621)添加至每孔且將盤密封膜施用至盤的頂部。然後該盤於頂計數讀值儀計數。

在20 μg/ml，M64、M71、M55和M69增加的蛋白多醣合成超過在銅行對照無效果時的抗體不存在時所觀察到的程度(圖3)。在另一項實驗中，M71劑量依賴性增加的蛋白多醣合成達藉由軟骨細胞單獨(定義為100%，中和)所顯現的程度，具有30 ng/ml的EC50且該同型對照無效果。這些數據表明，巨噬細胞衍生性Osm減少在共培養軟骨細胞的蛋白多醣合成以及抗-人類抑瘤素M抗體中和原生抑瘤素M。

人類肺纖維母細胞磷-STAT3分析法

OSM在正常的人類肺纖維母細胞誘發增生和膠原蛋白的生產(Scaffidi等人，Br. J. Pharmacol 136: 793-801，2002)。由纖維母細胞過度生產的膠原蛋白是數種病理狀況的重要特徵(Lim等人Oncogene 23(39)：5416-25，2006；Huang等人J Cell Biochem 81(1)：102-13，2001)。抑瘤素M受體信號傳遞激活JAK-STAT信號途徑以及STAT3的磷酸化是該信號傳遞途徑中的早期事件(Auguste等人(1997)Signaling of Type II Oncostatin M Receptor. J Biol Chem 272:15760-15764)。抑瘤素M產生pSTAT3的能力係在正常的人類肺纖維母細胞(NHLF)使用R&D系統的人類/小鼠pSTAT3 Duoset(DYC4607-5)而測定。然後這種分析法是用來測定M55和M71中和抑瘤素M信號傳遞的能力。

這些實驗使用生長於Lonza專有的FGM-2(CC-3132)培養基之來自Lonza的NHLF(CC-2512)進行。簡言之，細胞接種在25,000細胞/孔在FGM-2和培養24小時。然後細胞用抑瘤素M或抗體加抑瘤素M處理10分鐘。為了避免在這10分鐘的培養中的溫度依賴效果，用於準備該等處理的所有溶液係預熱且並保持在37℃。10分鐘的處理後，抽吸培養基且以完整裂解緩衝液置換。裂解緩衝液(pH=7.2)由1% NP-40、1%去氧膽酸鈉、0.1% SDS、0.15 M NaCl和0.01 M磷酸鈉組成且存儲在4℃。使用時，完整裂解緩衝液藉由添加1錠Protease Inhibitor Cocktail(Roche，11836153001)和110 μl HALT磷酸酶抑製劑(Thermo Scientific的78420)至11 ml的裂解緩衝液而製備。經過10分鐘的裂解步驟，由此產生的裂解物用於pSTAT3檢測。

要測定抑瘤素M的劑量-回應，NHLF細胞以OSM的劑量範圍(100 ng/ml至0.024 ng/ml，以1至4個稀釋，三重複孔)處理。稀釋盤係於預熱的PBS+1%BSA中製備，其中於每孔中知Osm濃度為10X高於處理所需最終濃度，包括僅有培養基的孔作為未處理對照。由培養盤完全移除培養基且以180 μl的預熱FGM-2置換。計時器開始10分鐘，然後由稀釋盤的每孔轉移20 μl至培養盤的相應孔。10分鐘後，藉由抽吸完全移除細胞盤中的處理溶液且以100 μl的完整裂解緩衝液置換。為了最小化培養時間的差異，裂解緩衝液以處理之相同次序添加至孔。然後將分析盤置於振盪器10分鐘。振盪後，裂解物冷凍在-80℃用於後續的測試或直接轉移至經以抗-pSTAT3被覆的ELISA盤。ELISA(R&D系統人類/小鼠pSTAT3 Duoset)進行根據製造商的說明除了1)只有90 μl的裂解物或標準品添加到每孔和2)使用SuperSignal Pico(ThermoScientific 37069)作為HRP的基質。ELISA盤係於Victor3盤讀值儀讀取發光。

要評估的M55和M71中和OSM於NHLFs的信號傳遞能力，細胞以抗OSM抗體的劑量範圍(三重複，500 ng/ml至0.005 ng/ml以1至10個稀釋或50 ng/ml至1.563 ng/ml以1至2個稀釋)於2 ng/ml的人類Osm存在下處理。稀釋盤是在PBS中製備用於20X最終濃度的劑量-回應處理，以包括同型對照(抗OSM抗體的最高濃度)以及對於不含抗體之未處理的對照與僅以OSM處理的細胞兩者。人類抑瘤素M是分別在40 ng/ml(20倍最終濃度)於FGM-2中製備。20X抗體和OSM溶液於稀釋盤中等體積混合以產生10X處理溶液且該盤於37℃培育1小時使OSM結合至該抗體。1小時後，由培養盤移除培養基並以180 μl的預熱FGM-2置換。計時器開始10分鐘且由稀釋盤之每孔轉移20 μl到培養盤的相應孔。10分鐘後，藉由抽吸完全移除細胞盤中的處理溶液且以100 μl的完整裂解緩衝液置換。為了最小化培養時間的差異，裂解緩衝液以處理之相同次序添加至孔。然後將分析盤置於振盪器10分鐘。振盪後，裂解物冷凍在-80℃用於後續的測試或直接轉移至經以抗-pSTAT3被覆的ELISA盤。ELISA(R&D系統人類/小鼠pSTAT3 Duoset)進行根據製造商的說明除了1)只有90 μl的裂解物或標準品添加到每孔和2)使用SuperSignal Pico(ThermoScientific 37069)作為HRP的基質。ELISA盤係於Victor3盤讀值儀讀取發光。

人類抑瘤素M在NHLF細胞中增加的pSTAT3具有約1 ng/ml的EC50。抑瘤素M的劑量回應的一個實例子係提供於圖4A。此實例中，EC50為具有95%可信區間為0.70至1.17 ng/ml的0.90 ng/ml。抗抑瘤素M抗體中合的能力於2 ng/ml抑瘤素M的存在下被測定且所有數據係於無抗體存在的2 ng/ml OSM的存在下的發光正常化。圖4B顯示了由M71之OSM誘發STAT3鄰酸化的劑量-依賴性中和。由於M71的濃度增加，STAT3磷酸化的程度降低。來自6個獨立的實驗數據計算劑量-回應曲線，並計算M71具有95%可信區間為6.9至11.6 ng/ml的IC50為8.9 ng/ml。

實例6：體內活性

M71在全身性投與抑瘤素M之後於活體內評估其阻斷細胞介素產生的能力。人類抑瘤素M的腹腔注射增加某些血清細胞介素的濃度，大概是經由且與小鼠白血病抑制因子受體的交互作用。

全身(i.p.)投與人類抑瘤素M至小鼠係開發評估該抗抑瘤素M單株抗體於活體內設置的能力的模型。小鼠以i.p.注射10 μg的人類抑瘤素M在200 μl PBS或PBS媒劑對照。1小時後，小鼠以二氧化碳麻醉和終端心臟穿刺收集血液。個體的血液樣本被允許於冰凝結20分鐘，然後在3500 RPM旋轉10至15分鐘。血清樣本冰凍保存直到分析，按製造商的指示，使用Murine MAP Cytokine/Chemokine Multiplex(32)板。樣本的分析表明，相較於媒劑對照，人類抑瘤素M顯著增加小鼠KC、IP-10、MCP-1、IL-6和eotaxin的血清濃度，對於板中的其他細胞界素無效果。這些數據表明，注射人類抑瘤素M誘發細胞介素的釋放，想必經由與小鼠白血病抑制因子受體的交互作用(Richards等人J Immunol. 159：2431-37，1997；Lindberg等人，Mol Cell Biol 18：3357-3367，1988)，其可以用來測試抗抑瘤素M抗體中和活體內的能力。

M71和M55在小鼠全身性的投與模式進行了評估。簡單地說，小鼠用藥皮下注射M71或M55(人類IgG1的抗人類OSM20，2.0或0.2 mg/kg)、CNTO6234(huIgG1同型對照，20 mg/kg)或PBS在體積為10 μl/g。24小時後，每個小鼠腹腔注射10 μg的內部產生CHO細胞衍生的重組人類抑瘤素M於PBS(Sigma公司D8357)具有/0.1%小鼠血清白蛋白(Sigma公司A3559)或PBS-MSA媒劑對照單獨(200 μl，總體積)。1小時後，小鼠以二氧化碳麻醉和終端心臟穿刺收集血液。個體的血液樣本被允許於冰凝結20分鐘，然後在3500 RPM旋轉10至15分鐘。血清樣本冰凍保存直到分析，按製造商的指示，使用Murine MAP Cytokine/Chemokine Multiplex(32)板。血清樣本進行了分析，依據製造商的指示。

人類抑瘤素M誘發顯著的(未配對Student氏t檢驗)藉由套組所偵測的5個細胞介素的血清濃度增加：eotaxin、IL-6、IP-10、KC和MCP-1。同型對照在CNTO6234的20 mg/kg的預用藥對於抑瘤素的M-誘發細胞介素釋放沒有影響。然而，使用M71的預用藥顯著減少IP-10、MCP-1，IL-6和eotaxin在2.0和20 mg/kg以及KC在20 mg/kg的血清濃度。於0.2 mg/kg的M71對該等細胞介素之任一者沒有效果。M71的效果和IP-10和MCP-1的同型對照分別顯示在圖5A和B。較少堅固的中和被觀察於M55而於20和2.0mg/kg兩者皆可見中和者僅有IP-10。IL-6、eotaxin和MCP-1的血清濃度分別減少於20 mg/kg M55但在任何劑量的M55沒有見到KC濃度的減少。這些數據表明該抗抑瘤素M抗體於老鼠全身性投與模型中，中和外源性人類抑瘤素M的生物效果的能力。

IP-10，干擾素γ-誘發蛋白質10 kDa或小型-可誘發之細胞介素B10，為於人類由CXCL10基因(C-X-C模體驅化激素10(CXCL10)基因所編碼的蛋白質。CXCL10已知有助於數種角色，例如對於單核細胞/巨噬細胞、T細胞、NK細胞與樹突細胞的化學吸引，以及T細胞黏附至內皮細胞地促進。KC，目前已知為屬於CXC驅化激素家族的驅化激素，其先前稱為GRO1致癌基因、GROα、中性球-活化蛋白質3(NAP-3)以及黑色素瘤生長刺激活性，alpha(MSGA-α)。在人類，此蛋白質係由CXCL1基因所編碼。CXCL1係由巨噬細胞、中性球與上皮細胞所表現，且具有中性球化學吸引活性。

實例7.共結晶學

包括V-區H17(序列識別編號：51)和L180(序列識別編號：55)的Fab片段與人類OSM(序列識別編號：10)殘基26至212一起結晶。

OSM與gp130細胞介素家族的其他成員共享四螺旋束三維結構。四螺旋束結構的特徵是由4個α螺旋段指定A(殘基10至37)、B(殘基67至90)、C(殘基105至131)和D(殘基159至185)藉由相對非結構化環所連結。OSM與gp130經由被稱為位置II的抗原決定區交互作用，其中包括胺基酸殘基(Q16、Q20、G120、N123、N124)位在螺旋A和C(Deller等人，Structure 8(8)：863-874，2000劉等人，Int. J. Mol. Med. 23: 161-172,2009)。位置三，負責OSM與OSMRβ和LIFRα的交互作用的抗原決定區，在很大程度上被認為是藉由位於螺旋D的殘基所定義(Deller等人，Structure 8(8)：863-874，2000)。

結晶

複體的結晶係藉由坐滴氣相擴散法於20℃使用Oryx4蛋白結晶機器(道格拉斯儀器)，分配等體積的0.2 μL蛋白質複體(10.95 mg/ml)和0.2 μL儲存溶液。進行多重結晶篩選。液滴的大部分仍然透明，反映了複體的溶解度高。由0.1 M MES pH 6.5、2.4 M硫酸銨以及0.1 M Tris pH 8.5、3.5 M甲酸鈉獲得結晶。

晶體結構溶液結果

OSM殘基與H14/L180 Fab構成之抗原決定區接觸。該抗體殘基與OSM構成的結合互補位接觸。兩個可變域的所有六個CDR涉及OSM結合。殘基接觸提供於表13且示於圖5。長CDR-L1，與重鏈可變區H1的CDR一起形成類似谷且於底部具有小的突起的抗原結合位置(圖4C，左圖)。一旦結合，該谷的兩側懷抱的OSM四螺旋束沿螺旋A和C且於兩螺旋之間具有底部突起結合(圖4C，右圖)。抗體和抗原結合介面埋有2,514 2的溶劑易於得到的表面(Ab為12252以及Ag為1298 A2)。雖然界面也有一些帶電荷的殘基，沒有電荷-電荷的配對，建議vdw(凡德瓦耳力)和氫鍵在抗體與抗原的交互作用中扮演最重要的角色。

因此，H17/L180Fab接觸OSM於先前顯示為解由gp130所接觸的殘基；Q20和G120，以及沿著A和C螺旋。

實例8：藥動學

OSM是一種與炎症過程相關聯的可溶性標靶與細胞之細胞-表面顯示標靶相對比。包括本文所討論的結合區以及額外地具有Fc域的完整的IgG的本質，可因而針對相關於其用途之目的與治療特異性使用工程化具有賦予經改變的FcR結合的突變的Fc的方法量身定做。

在目前的組成中，持續的活性以及循環中的持續是治療性單株IgG的有利規格。因此，Fc-域對於新生兒受體具有增強親和性。

使用先前所述之突變M428L(MedImmune US. Pat No. 7670600)，併以N434S(US 7371826,WO2006/053301)，使用標準重組技術構築突變及野生型抗體。這兩個Mabs，M71和M71 L/S於標準活性分析中相比較且於非人類靈長類的循環中比較持續性。

分析

在A375-S2增生分析中並列比較M71及M71 L/S。從起始濃度為1 μg/ml的劑量-回應評估，1至5個稀釋0.00032 μg/ml。在濃度1 μg/ml的同型對照這些抗體，分別為CNTO3930和CNTO8852，於2 ng/ml的人類抑瘤素M對抑制增生的能力沒有效果。M71和M71都L/S完全中和1 μg/ml抑瘤素M的效果，IC50沒有可測量的差異。

M71和M71的L/S在小鼠全身性投與模式進行了比較。簡單地說，小鼠是劑量皮下注射，M71和M71 L/S(20、10或5.0 mg/kg)，CNTO3930(huIgG1同型對照，20 mg/kg)，CNTO8852(Fc變異型的同型對照，20 mg/kg)或PBS在10 μl/g的體積。24小時後，每隻小鼠腹腔注射10 μg的內部產生的CHO細胞衍生的重組人類抑瘤素M於PBS(Sigma公司D8357)與0.1%小鼠血清白蛋白(Sigma公司A3559)或以PBS-MSA媒劑對照單獨(200 μl總體積)。1小時後，小鼠以二氧化碳麻醉和終端心臟穿刺收集血液。個體的血液樣本被允許於冰凝結20分鐘，然後在3500 rpm旋轉10至15分鐘。血清標本冰凍保存直到分析，使用由特異於IL-6、MCP-1、eotaxin、KC和IP-10的珠粒所組成的客製化Millipore murine multiplex。無任何同型對照對於人類抑瘤素M所誘發的細胞介素釋放有任何效果。然而，M71和M71的L/S兩者中和抑瘤素M-誘發的細胞介素釋放，於效力或藥效無明顯差異。

藥動學分析

M71和M71 L/S的血清半衰期在非終端食蟹獼猴藥動學研究中比較。這項研究共包括12之食蟹獼猴且評估皮下(s.c.，n=3)和靜脈(i.v.，n=3)用於每個抗體投與。在3 mg/kg劑量的抗體的研究進行60天以上。在第1、2、4、6、8、12、16、30、37、45和60天時，在1小時(僅第IV組)及6小時及抽取血液樣本。來自樣本之血清於測試前冰在-80℃。血清中的抗體濃度係使用對於MesoScale Discovery平台經於食蟹獼猴血清中最適化的ELISA予以測定。生物素化捕捉抗體為抗M71之抗個體遺傳型抗體(小鼠抗-M71)。檢測抗體釕標記的抗-人類IgG且讀值為MesoScale Discovery化學發光。

本研究之結果顯示於圖6A及B。圖6A顯示來自靜脈用藥之圖，其中M71血清半衰期為15.21+/-3.0天，M71 L/S的半衰期為29.4+/-2.3天。皮下用劑也獲得類似結果(圖6B)，M71血清半衰期為15.4+/-4天，M71 L/S的半衰期為32.0+/-5.9天。

結果顯示M71 L/S t 相較於M71增加了約二倍。

圖1顯示用於建立於pIX外殼蛋白上表現之Fab庫的生殖系基因序列，其中HV域各者由根據序列識別編號：1至3(1=IGHV1-69，2=IGHV3-23及3=IGHV5-51)的間雜之FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3所組成，其接以不同長度、間雜之H-CDR3區域以及J區域(FR4，序列識別編號：4)；且LV域各者由根據序列識別編號：5至8(5=IGKV1-39(O12)，6=IGKV3-11(L6)、7=IGKV3-20(A27)及8=IGKV4-1(B3))的間雜之FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3所組成，其接以根據序列識別編號：9之CDR3，CDR3之後接以J區域(FR4，序列識別編號：10)。

圖2A為CHO細胞衍生重組型人類及食蟹獼猴抑瘤素M在抑制A375-S2細胞增生之劑量-反應圖，其藉由BrdU嵌入測量並以僅存有媒劑之對照組標準化。

圖2B為顯示抗體M71減輕OSM的A375-S2增生抑制能力圖，該抗體由L180(序列識別編號：53)及H17(序列識別編號：54)可變域所構成，其中OSM存在濃度為2 ng/ml。

圖3係顯示M64、M71、M55及M69於20 μg/ml增加之³⁵SO₄攝入(測量蛋白多醣合成增加)超過無抗體時之觀察量之效應的直條圖，其中係以於在藻酸珠粒之人類軟骨細胞及可分泌OSM之人類巨噬細胞共培養中的非專一性同型抗體為對照組。

圖4A為顯示經人類OSM刺激pSTAT3於NHLF細胞之劑量反應圖，結果顯示EC50約為1 ng/ml。

圖4B為顯示在2 ng/ml OSM存在下抗體M71中和pSTAT3信號的能力之圖。

圖5A及5B係顯示小鼠個體於投與OSM並以或未以所示濃度之M71抗體預處理後血清中所偵測到的P-10(A)及MCP-1(B)量的散佈圖。

圖6A及6B係顯示食蟹獼猴於靜脈內(A)及皮下(B)投與3 mg/Kg M71或M71之Fc變異體後的血清濃度與時間之作圖。

<110>　Janssen Biotech,Inc.

<120>　人類抑瘤素M抗體及使用方法

<130>　CEN5306PCT

<160>　56

<170>　PatentIn第3.5版

<210>　1

<211>　98

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<220>

<221>　變異體

<222>　(33)..(33)

<223>　X可為Ala或Gly

<220>

<221>　變異體

<222>　(50)..(50)

<223>　X可為Gly或Trp

<220>

<221>　變異體

<222>　(52)..(52)

<223>　X可為Ile或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(53)..(53)

<223>　X可為Ala或Pro

<220>

<221>　變異體

<222>　(54)..(54)

<223>　X可為Ile或Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(55)..(55)

<223>　X可為Asn或Phe

<400>　1

<210>　2

<211>　98

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<220>

<221>　變異體

<222>　(31)..(31)

<223>　X可為Asp、Asn或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(33)..(33)

<223>　X可為Asp、Gly或Trp

<220>

<221>　變異體

<222>　(35)..(35)

<223>　X可為His或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(50)..(50)

<223>　X可為Ala、Asn、Gly或Val

<220>

<221>　變異體

<222>　(52)..(52)

<223>　X可為Asn、Lys、Ser或Trp

<220>

<221>　變異體

<222>　(53)..(53)

<223>　X可為Gln、Gly、Ser或Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(54)..(54)

<223>　X可為Asp或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(56)..(56)

<223>　X可為Gly或Ser

<400>　2

<210>　3

<211>　98

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<220>

<221>　變異體

<222>　(31)..(31)

<223>　X可為Asn或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(35)..(35)

<223>　X可為Gly或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(50)..(50)

<223>　X可為Arg或Ile

<220>

<221>　變異體

<222>　(52)..(52)

<223>　X可為Asp或Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(54)..(54)

<223>　X可為Gly或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(57)..(57)

<223>　X可為Asp或Tyr

<400>　3

<210>　4

<211>　11

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　4

<210>　5

<211>　88

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<220>

<221>　變異體

<222>　(30)..(30)

<223>　X可為Ala、Asp、Asn、Ser或Arg

<220>

<221>　變異體

<222>　(31)..(31)

<223>　X可為Asp、Gly、Lys、Asn或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(32)..(32)

<223>　X可為Ala、Asp、Phe、His、Asn、Ser、Trp、Val或Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(50)..(50)

<223>　X可為Ala、Asp、Phe、Gly、Asn、Lys、Thr或Tyr

<400>　5

<210>　6

<211>　88

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<220>

<221>　變異體

<222>　(30)..(30)

<223>　X可為Ala、Asn、Asp、Arg或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(31)..(31)

<223>　X可為Asn、Asp、Lys或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(32)..(32)

<223>　X可為Ala、Asn、Asp、His、Phe、Ser、Trp或Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(50)..(50)

<223>　X可為Ala、Asn、Asp、Gly、Lys、Phe、Thr或Tyr

<400>　6

<210>　7

<211>　89

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<220>

<221>　變異體

<222>　(30)..(30)

<223>　X可為Asn、Asp、Arg、Ser或Thr

<220>

<221>　變異體

<222>　(31)..(31)

<223>　X可為Asn、Arg或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(32)..(32)

<223>　X可為Ala、Asp、Asn、Arg、His或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(33)..(33)

<223>　X可為Glu、Gln、His、Lys、Phe、Ser或Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(51)..(51)

<223>　X可為Ala、Asp、Gly或Ser

<400>　7

<210>　8

<211>　94

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<220>

<221>　變異體

<222>　(31)..(31)

<223>　X可為Ala、His、Phe、Ser或Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(36)..(36)

<223>　X可為Asn、Glu、Lys或Thr

<220>

<221>　變異體

<222>　(38)..(38)

<223>　X可為Ala、Asp、Asn、His、Phe、Ser、Trp或Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(56)..(56)

<223>　X可為Ala、Asp、Arg、Ser、Trp或Tyr

<400>　8

<210>　9

<211>　9

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<220>

<221>　變異體

<222>　(3)..(3)

<223>　X可為Ala、Asp、Arg、Gly、His、Phe、Pro、Ser或Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(4)..(4)

<223>　X may be Asp,Asn,Arg,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Phe,Ser,or Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(5)..(5)

<223>　X可為Asp、Asn、Arg、Gly、His、Lys、Thr或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(6)..(6)

<223>　X可為Ala、Arg、Gly、Leu、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val

<220>

<221>　變異體

<222>　(8)..(8)

<223>　X可為Asn、Arg、Ile、Leu、Phe、Trp或Tyr

<400>　9

<210>　10

<211>　10

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　10

<210>　11

<211>　227

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　11

<210>　12

<211>　227

<212>　PRT

<213>　食蟹概猴(Macaca fascicularis)

<400>　12

<210>　13

<211>　5

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　13

<210>　14

<211>　5

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　14

<210>　15

<211>　5

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　15

<210>　16

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　16

<210>　17

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　17

<210>　18

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　18

<210>　19

<211>　9

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　19

<210>　20

<211>　10

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　20

<210>　21

<211>　10

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　21

<210>　22

<211>　9

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　22

<210>　23

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　23

<210>　24

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　24

<210>　25

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　25

<210>　26

<211>　7

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　26

<210>　27

<211>　8

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　27

<210>　28

<211>　8

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　28

<210>　29

<211>　9

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<220>

<221>　變異體

<222>　(3)..(3)

<223>　X可為Ser或Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(4)..(4)

<223>　X可為Phe或Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(6)..(6)

<223>　X可為Phe或Thr

<400>　29

<210>　30

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　30

<210>　31

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　31

<210>　32

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　32

<210>　33

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　33

<210>　34

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　34

<210>　35

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　35

<210>　36

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　36

<210>　37

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　37

<210>　38

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　38

<210>　39

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　39

<210>　40

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　40

<210>　41

<211>　17

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　41

<210>　42

<211>　7

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　42

<210>　43

<211>　7

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　43

<210>　44

<211>　7

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　44

<210>　45

<211>　9

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　45

<210>　46

<211>　9

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　46

<210>　47

<211>　9

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<220>

<221>　變異體

<222>　(4)..(4)

<223>　X可為Phe或Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(8)..(8)

<223>　X可為Ile或Leu

<400>　47

<210>　48

<211>　96

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　48

<210>　49

<211>　102

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　49

<210>　50

<211>　102

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　50

<210>　51

<211>　102

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　51

<210>　52

<211>　102

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　52

<210>　53

<211>　102

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　53

<210>　54

<211>　108

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　54

<210>　55

<211>　108

<212>　PRT

<213>　智人(Homo sapiens)

<400>　55

<210>　56

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　供酵素性生物素化之共同序列(consensus sequence)

<400>　56

Claims

一種經單離之抗體，其特異性結合OSM並且抑制OSM及gp130之間的交互作用，其中該抗體係選自：包含一選自於由序列識別編號：49、52及53所組成的群組之輕鏈可變區胺基酸序列及一選自於序列識別編號：54之重鏈可變區胺基酸序列之抗體，或包含一選自於由序列識別編號：49、50及51所組成的群組之輕鏈可變區胺基酸序列及一選自於序列識別編號：55之重鏈可變區胺基酸序列之抗體，其中該輕鏈可變區包含：a.一輕鏈互補決定區1(L-CDR1)胺基酸序列，其選自於由序列識別編號：23至25及30至41所組成的群組；b.一輕鏈互補決定區2(L-CDR2)胺基酸序列，其選自於由序列識別編號：26、42至44所組成的群組；以及c.一輕鏈互補決定區3(L-CDR3)胺基酸序列，其選自於由序列識別編號：10、27至29、45、47所組成的群組，及該重鏈可變區包含：a.一重鏈互補決定區1(H-CDR1)胺基酸序列，其選自於由序列識別編號：14及15所組成的群組； b.一重鏈互補決定區2(H-CDR2)胺基酸序列，其選自於由序列識別編號：16至18所組成的群組；以及c.一重鏈互補決定區3(H-CDR3)胺基酸序列，其選自於由序列識別編號：19至22所組成的群組。
如申請專利範圍第1項之經單離之抗體，其中該抗體包含一序列識別編號：51之輕鏈可變區胺基酸序列及包含一序列識別編號：55之重鏈可變區胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項之經單離之抗體，其中該抗體包含一序列識別編號：53之輕鏈可變區胺基酸序列及包含一序列識別編號：54之重鏈可變區胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項之經單離之抗體，其中該抗體互補位(paratope)於Q16、Q20及G120位置接觸具有序列識別編號：11之胺基酸序列的人類OSM之抗原決定區(epitope)。
一種經單離之抗體，其特異性結合至OSM，包含：一H-CDR1，其具有序列識別編號：14之胺基酸序列；一H-CDR2，其具有序列識別編號：17之胺基酸序列；一H-CDR3，其具有序列識別編號：21之胺基酸序列；一L-CDR1，其具有序列識別編號：38之胺基酸序列；一L-CDR2，其具有序列識別編號：43之胺基酸序列；以及一L-CDR3，其具有序列識別編號：46之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之經單離之抗體，其進一步包含一選自於由IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgM所組成的群組之人類重鏈恆定區。
如申請專利範圍第6項之經單離之抗體，其中該恆定區包含一人類IgG同型(isotype)。
如申請專利範圍第7項之經單離之抗體，其中該同型為IgG1。
如申請專利範圍第8項之經單離之抗體，其中該恆定區係經突變以使該抗體不溶解(non-lytic)。
如申請專利範圍第7項之經單離之抗體，其中該恆定區係經突變，相較於具有野生型(wildtype)IgG1恆定域序列之抗體，增加該抗體對新生兒受體(FcRn)之親和性。
如申請專利範圍第10項之經單離之抗體，其中該恆定區於位置428及434處經突變，其中該編號係根據Kabat EU編號。
如申請專利範圍第11項之經單離之抗體，其中該突變為M428L及N434S，其中該編號係根據Kabat EU編號。
一種申請專利範圍第1至12項中任一抗體之抗原結合片段。
如申請專利範圍第13項之抗原結合片段，其中該片段係選自於由Fab、Fab'、Fd、F(ab)2及ScFv所組成的群組。
一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至14項中任一項之經單離之抗體或該抗體之抗原結合片段以及醫藥上可接受之賦形劑或載劑。
一種申請專利範圍第15項之醫藥組成物之用途，其用於製造供治療罹患對抑制hOSM及gp130之間交互作用有反應的疾病或失調之人類患的藥劑。
如申請專利範圍第16項之用途，其中該疾病或失調係一選自於由骨關節炎、類風濕性關節炎、乾癬性關節炎、僵直性脊椎炎、神經病性關節病、反應性關節炎及旋轉肌腱破裂關節病(rotator cuff tear arthropathy)所組成的群組之關節病。
一種申請專利範圍第15項之醫藥組成物之用途，其用於製造供治療罹患特徵為藉由巨噬細胞及單核白血球釋放發炎前細胞介素及趨化激素(chemokine)的疾病或失調之人類患者的藥劑。
如申請專利範圍第16項之用途，其中該疾病或失調係選自於由類風濕性關節炎、幼年特發性關節炎、乾癬性關節炎、僵直性脊椎炎、牛皮癬、慢性斑塊疾病(chronic plaque disease)、紅斑性狼瘡、發炎性肺病、特發性肺纖維化、敗血病、先兆子癇(pre-eclampsia)、COPD、氣喘及多發性硬化症所組成的群組。
如申請專利範圍第16項之用途，其中該患者罹患選自於由動脈粥狀硬化、糖尿病腎病變、肺纖維化、特發性肺纖維化、全身性硬化症及硬化所組成的群組之纖維變性病(fibrotic disease)。
一種經單離之聚核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1至12項中任一項之治療性抗體或其抗原結合片段之重鏈及輕鏈。
一種經穩定轉形或轉染之重組宿主細胞，其包含申請專利範圍第21項之經單離之聚核苷酸。
如申請專利範圍第22項之經穩定轉形或轉染之重組宿主細胞，其包含一載體，其包含一編碼序列識別編號：53之輕鏈可變胺基酸序列之聚核苷酸以及一編碼序列識別編號：54之重鏈可變胺基酸序列之第二聚核苷酸。
如申請專利範圍第22項之經穩定轉形或轉染之重組宿主細胞，其包含一載體，其包含一編碼序列識別編號：51之輕鏈可變胺基酸序列之聚核苷酸以及一編碼序列識別編號：55之重鏈可變胺基酸序列之第二聚核苷酸。
如申請專利範圍第23或24項中任一項之宿主細胞，其中該細胞係哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第25項之宿主細胞，其中該細胞係CHO。
一種用於製造抗體之方法，包含培養如申請專利範圍第25項之宿主細胞並自該細胞回收該抗體之步驟。
一種套組，其包含如申請專利範圍第1至12項中任一項之經單離之抗體或片段的無菌製劑，以及用於將該抗體投與至需要彼之對象的使用說明。