ES2564523T3 - Diseño y generación de bibliotecas de presentación en fago por pIX de novo humanas mediante fusión con pIX o pVII, vectores, anticuerpos y métodos - Google Patents

Abstract

Un vector de fago de ácido nucleico recombinante manipulado por ingeniería para expresar secuencias de aminoácidos de fragmentos fab de anticuerpos de fusión con pIX de presentación en fago que se unen a ligandos biológicamente activos seleccionados, que comprende (i) a. una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el conductor de fago recombinante; operativamente enlazada a: b. una secuencia de ácidos nucleicos que codifica marca recombinante, promotor o de selección; operativamente enlazada a: c. una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la línea germinal de la cadena pesada variable que se une selectivamente a dicho ligando biológicamente activo; operativamente enlazada a: d. una porción de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la línea germinal de la cadena pesada constante que se une selectivamente a dicho ligando biológicamente activo; operativamente enlazada a: e. una secuencia de ácidos nucleicos que codifica conector peptídico; operativamente enlazada a: f. una secuencia de ácidos nucleicos que codifica pIX recombinante; y (ii) a. una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la línea germinal de la cadena ligera variable que se une selectivamente a dicho ligando biológicamente activo; operativamente enlazada a: b. una porción de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la línea germinal de la cadena ligera constante que se une selectivamente a dicho ligando biológicamente activo.

Description

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Diseno y generacion de bibliotecas de presentacion en fago por pIX de novo humanas mediante fusion con pIX o pVII, vectores, anticuerpos y metodos

DESCRIPCION

CAMPO DE LA INVENCION

La invencion se refiere a composiciones y metodos para generar y usar bibliotecas de presentacion en fago pIX para producir anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Se ha usado la presentacion en fago filamentoso usando pill y pVIII como componentes de fusion en sistemas de fagos o fagemidos como una tecnologfa para la ingenierfa de protefnas, en particular para el aislamiento y la maduracion por afinidad de anticuerpos de novo. Pueden generarse secuencias de fab similares a humanas a partir de secuencias de anticuerpos conocidas como moldes, y region determinante de la complementariedad (CDR) aleatoria o mutagenizada o regiones de union al antfgeno, tales como CDR3 de cadena pesada (H3), pueden generarse y aislarse de bibliotecas de fagos que presentan variaciones de secuencias de fragmentos de anticuerpo mediante inmunopurificacion contra un antfgeno u otra protefna diana de interes sin inmunizacion. Bibliotecas de anticuerpos de novo humanas previamente usadas se han creado sinteticamente o por clonacion molecular de genes IgG de fuente(s) intacta(s). En una biblioteca sintetica se disenan y sintetizan secuencias de ADN de anticuerpo que incluyen region estructural de cadena pesada y cadena ligera variable y las regiones CDR basandose en 1) un gen IgG definido, 2) un gen de la lfnea germinal de Ig especffico, y 3) secuencias consenso de familias de los genes de la lfnea germinal de Ig y 4) fragmentos de IgG derivados por PCR de fuentes naturales. Ademas de la biblioteca de anticuerpos sinteticos, tambien pueden crearse bibliotecas por clonacion combinatoria de ADN de IgG derivado de tejidos humanos, por ejemplo, medulas oseas y globulos sangufneos perifericos. Tales bibliotecas se han usado para proporcionar fragmentos de anticuerpos fab y para realizar rondas sucesivas de inmunopurificacion y maduracion o modificacion para intentar encontrar fragmentos de anticuerpos fab que tienen propiedades deseadas tales como alta afinidad o actividad biologica inhibidora de una protefna diana seleccionada.

Se han aislado anticuerpos fab similares a humanos para varias protefnas diana de bibliotecas de anticuerpos pIII o pVIII de presentacion en fago. Aunque son satisfactorios en aislar anticuerpos fab para dianas especfficas, tales enfoques de biblioteca de presentacion en fago padecen los problemas de tener que repetir el proceso de generacion de bibliotecas, inmunopurificacion y maduracion varias veces para aislar anticuerpos fab que tienen las caracterfsticas deseadas. Tales bibliotecas de fagos tambien padecen el problema de que no engloban completamente o imitan la variedad de diversidad inmunitaria humana presente en los seres humanos, que incluye la contribucion del par VH/VL, caracterfsticas de topologfa de diferentes familias de la lfnea germinal relacionadas con el reconocimiento del antfgeno, la posicion y el grado de la variacion de aminoacidos, y la abundancia relativa de anticuerpos derivada de diferentes genes de la lfnea germinal humana. La desviacion de anticuerpos sinteticos del repertorio natural puede aumentar el riesgo de propiedades bioqufmicas desfavorables y de inmunogenicidad si se usan como terapeuticos en el hombre.

Existe la necesidad de bibliotecas de anticuerpos sinteticas y metodos que administran simultaneamente los elementos crfticos de anticuerpos terapeuticos humanos de alta afinidad y actividad, alta productividad, buenas propiedades de disolucion, y una propension de baja respuesta inmunitaria cuando se administran en el hombre. Hay otra necesidad de aumentar la eficiencia del aislamiento de anticuerpos de bibliotecas sinteticas, con respecto a los metodos actuales, para reducir los costes de recursos del descubrimiento de anticuerpos y acelerar la administracion de anticuerpos para la evaluacion biologica. Las bibliotecas y metodos de la presente invencion cumplen estas necesidades acoplando diseno completo, tecnologfas de ensamblaje y presentacion de Fab en pIX de fago.

El documento US 2003/186322 describe la presentacion de polipeptidos exogenos sobre fago filamentoso usando una fusion entre el polipeptido exogeno y las protefnas de fago pVII o pIX. Gao et al. (PNAS, 2002, vol. 99(20) 12612-12616) construyeron una gran biblioteca de Fv monocatenario humano (scFv) de 4,5 x 10(9) miembros presentados sobre pIX. El documento US 5 658 727 desvela fago filamentoso que comprende una matriz de protefnas cpVIII. Kunkel et al. (Methods in Enzymology, 1991, vol. 204, 125-139) desvela la eficaz mutagenesis dirigida al sitio usando ADN que contiene uracilo.

RESUMEN DE LA INVENCION

La invencion proporciona un vector de fago de acido nucleico recombinante manipulado por ingenierfa para expresar secuencias de aminoacidos de fragmentos fab de anticuerpos de fusion con pIX de presentacion en fago que se unen a ligandos biologicamente activos seleccionados, que comprende: (i) a) una secuencia de acidos nucleicos que codifica el conductor de fago recombinante; operativamente enlazada a: b) una secuencia de acidos nucleicos que codifica marca recombinante, promotor o de seleccion; operativamente enlazada a: c) una secuencia de acidos nucleicos que codifica la lfnea germinal de la cadena pesada variable que se une selectivamente a dicho ligando

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La invencion tambien proporciona una biblioteca de fagos de celulas huesped bacterianas que comprende una pluralidad de vectores de fago de acido nucleico manipulados por ingenierfa segun la invencion.

La invencion tambien proporciona un metodo de cribado de una biblioteca de fragmentos de anticuerpo fab de fagos que tiene una actividad biologica deseada, que comprende (a) expresar fragmentos de anticuerpos fab de una biblioteca de fagos segun la invencion, y (b) seleccionar celulas bacterianas que expresan dichos fragmentos de anticuerpos fab que tienen dicha actividad biologica deseada.

RESUMEN DE LA DIVULGACION

A diferencia de la ensenanza del estado de la tecnica, se ha descubierto ahora que pVII y pIX pueden usarse satisfactoriamente para generar bibliotecas de fab de alta afinidad, por ejemplo, usando mutagenesis u otras tecnicas productoras de diversidad, opcionalmente con maduracion en lfnea, para proporcionar una plataforma eficaz y rapida para la generacion de fab y de fragmentos de anticuerpo y seleccion de anticuerpos terapeuticos. Segun la presente divulgacion, las regiones variables de anticuerpos o de fab fusionadas con pVII y pIX se acoplan en una interaccion dinamica sobre la superficie del fago para presentar un fragmento de anticuerpo funcional, un motivo heterodimerico representativo. La presentacion sobre el fago de regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo es, por tanto, un metodo adecuado y preferido para presentar y ensayar diversas bibliotecas de matrices heterodimericas combinatorias en las que los miembros pueden funcionar como especies de anticuerpos artificiales dimericas y permitir la seleccion de actividades biologicas novedosas o deseadas.

En el presente documento se desvelan diversos metodos y componentes mejorados y nuevos de generacion de bibliotecas de novo de presentacion en fago de pIX y pVII, tales como, pero no se limitan a, uno o mas de (i) bibliotecas de novo de Fab de anticuerpos disenadas y presentadas fusionadas con las protefnas de fago pIX o pVII; (ii) el uso de una protefna de la superficie del fago diferente de pIII y pVII I ampliamente usadas del fago M13; (iii) el uso de una pequena matriz de genes VH y VL de la lfnea germinal que representan la secuencia y estructura del repertorio humano; (iv) el uso de tales componentes de fago como andamiaje de biblioteca para proporcionar diversidades combinatorias disenadas mejoradas en las regiones de complementariedad de las regiones Vh y Vl; (v) procesos de seleccion de anticuerpos que permiten el examen sistematico del efecto de las secuencias disenadas y topologfas estructurales para el reconocimiento del antfgeno; (vi) un proceso de maduracion por afinidad simplificado y de maduracion en lfnea como parte de la seleccion de bibliotecas. Un nuevo sistema tal de diseno, seleccion, optimizacion y maduracion de bibliotecas a partir de bibliotecas individuales o grupos de bibliotecas proporciona un sistema reproducible y fiable para el satisfactorio descubrimiento de novo de anticuerpos y tambien facilita el entendimiento de la relacion de funcion estructural de la interaccion de anticuerpo con antfgeno.

La biblioteca de novo de Fab humana descrita anteriormente es distinta del actual estado de la tecnica de bibliotecas de anticuerpos por su presentacion mediante el gen pIX del fago M13. El uso de secuencias de la lfnea germinal humana representativas y de estructuras como andamiajes de biblioteca y el diseno de secuencias de CDR que imitan la distribucion de aminoacidos naturales cubren exhaustivamente el repertorio inmunitario humano, y los anticuerpos de biblioteca tienen alta identidad de secuencias con los anticuerpos humanos derivados de naturales. La exhaustiva cobertura del repertorio inmunitario humano aumenta la probabilidad del descubrimiento de novo de anticuerpos comparando con las bibliotecas construidas sobre una unica lfnea germinal o andamiaje del gen IgG informado en la bibliograffa. Las sub-bibliotecas preparadas por separado, que llevan cada una un unico andamiaje (par VH/VL) y/o longitudes de H-CDR3, maximizan la probabilidad de identificar anticuerpo unico y proporcionar un mecanismo para examinar sistematicamente la estructura de union anticuerpo/antfgeno y las relaciones de funcion. El proceso de maduracion por afinidad integrado reducira el tiempo necesario para descubrir diversos anticuerpos y de alta afinidad.

Anticuerpos artificiales se definen aquf como motivos de protefna de gran diversidad que usan la estrategia funcional de la molecula de anticuerpo, pero pueden generarse libres de limitaciones in vivo, que incluyen (1) homologfa de secuencias y toxicidad de antfgenos diana; (2) impacto biologico del anticuerpo generado en el huesped o en cultivos de hibridomas usados para recuperar el anticuerpo; y (3) cribado frente a la seleccion para la actividad deseada. La molecula de anticuerpo es un dispositivo biologico para la presentacion de una matriz combinatoria de elementos de peptidos en el espacio tridimensional. La caracterfstica esencial es que mientras que las CDR (regiones determinantes de la complementariedad) cooperan para formar un sitio de union, su interaccion es dinamica y funcional con poca asociacion estructural entre las propias CDR. De esta forma, el complemento completo de los residuos de aminoacidos esta disponible para el reconocimiento del antfgeno como coste energetico mfnimo para la union. Se propone resumir la capacidad para controlar el diseno combinatorio de no solo el espacio

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de secuencia, sino tambien del espacio tridimensional, y por ultimo lugar trascenderfa el diseno natural del repertorio inmunitario.

Asf, la divulgacion describe un formato de presentacion en fago combinatoria para la construccion de matrices de polipeptidos heterodimericos altamente diversas. En particular, la divulgacion describe una partfcula de fago filamentoso que encapsula un genoma que codifica un polipeptido de fusion, en el que el polipeptido de fusion comprende un polipeptido exogeno fusionado con el extremo amino de una protefna de fago de filamentoso pVII o pIX. Preferentemente, la partfcula de fago comprende la protefna de fusion expresada sobre la superficie de la partfcula de fago.

En una realizacion preferida, el genoma del fago codifica ademas un segundo polipeptido de fusion, en el que el segundo polipeptido de fusion comprende un segundo polipeptido exogeno fusionado con el extremo amino de la protefna pIX y el primer polipeptido exogeno en el primer polipeptido de fusion esta fusionado con el extremo amino de la protefna pVII. En esta realizacion, el primer y segundo polipeptidos de fusion pueden asociarse para formar un complejo de protefna heterodimerica, tal como un Fv de inmunoglobulina, un Fv catalftico, un receptor, una protefna de union a acido nucleico o una enzima.

En una realizacion relacionada, la divulgacion describe un vector para expresar una protefna de fusion sobre la superficie de un fago filamentoso que comprende un casete para expresar la protefna de fusion. El casete incluye secuencias de ADN traducibles en la direccion 5' y en la direccion 3' operativamente enlazadas mediante una secuencia de nucleotidos adaptada para la ligacion direccional de un ADN de inserto, es decir, un policonector, en el que la secuencia en la direccion 5' codifica una senal de secrecion procariota, la secuencia en la direccion 3' codifica una protefna de fago filamentoso pVII o pIX. Las secuencias de aDn traducibles estan operativamente enlazadas a un conjunto de senales de expresion de ADN para la expresion de las secuencias de ADN traducibles como porciones del polipeptido de fusion. En una variacion preferida, el vector comprende ademas un segundo casete para expresar una segunda protefna de fusion sobre la superficie del fago filamentoso, en el que el segundo casete tiene la estructura del primer casete con la condicion de que el primer casete de expresion de la protefna de fusion codifique la protefna pVII y el segundo casete de expresion de la protefna de fusion codifique la protefna pIX. El vector se usa como genoma de fago para expresar complejos de protefna heterodimerica sobre la superficie de la partfcula de fago en la que los dos polipeptidos exogenos del heterodfmero estan anclados sobre la partfcula de fago por la fusion con la primera y segunda protefnas de fago, pVII y pIX, respectivamente.

En otra realizacion, la invencion contempla una biblioteca de partfculas de fago segun la presente invencion, es decir, una biblioteca combinatoria, en la que partfculas representativas en la biblioteca presentan cada una una protefna de fusion diferente. Si la partfcula presenta un complejo de protefna heterodimerica, la biblioteca comprende una biblioteca combinatoria de heterodfmeros, tales como anticuerpos en forma de una biblioteca de moleculas Fv. Bibliotecas preferidas tienen una diversidad combinatoria de al menos 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, o cualquier intervalo o valor allf dentro, diferentes especies de protefna de fusion.

Una realizacion relacionada describe una protefna de fusion que comprende primer y segundo polipeptidos, en la que el primer polipeptido es una protefna exogena y el segundo polipeptido es una protefna de fago filamentoso pVII o pIX, en la que la protefna exogena esta fusionada con el extremo amino de la protefna de fago filamentoso.

Todavfa ademas, la divulgacion contempla una variedad de metodos de produccion de una biblioteca combinatoria de fago, que incluye clonar repertorios de genes que codifican un polipeptido exogeno en un vector de la presente invencion, modificar la estructura de los polipeptidos exogenos en una biblioteca por mutagenesis, por combinacion aleatoria de poblaciones de bibliotecas de la primera y segunda protefna de fusion, por seleccion de diana y por afinidad (“inmunopurificacion”) para alterar la diversidad de una biblioteca, y similares.

El diseno de protefnas con funciones mejoradas o novedosas es un objetivo importante con una variedad de aplicaciones medicas, industriales, medioambientales y de investigacion basica. Tras el desarrollo de bibliotecas de anticuerpos combinatorias, una siguiente etapa poderosa es la evolucion hacia construcciones de anticuerpos artificiales, ademas de otros motivos de protefna en los que especies dimericas son nativas o podrfan ser funcionales.

La presente divulgacion trata estos retos proporcionando un formato de presentacion en fago para la construccion de matrices de polipeptidos heterodimericas combinatorias en las que se utilizan pVII y pIX para la presentacion de protefnas de fusion que forman especies dimericas. Es importante tener en cuenta que esto es una metodologfa completamente nueva debido a que pueden presentarse independientemente dos motivos de protefna en estrecha proximidad para generar una biblioteca de interacciones funcionales.

Inherente en el alcance y potencia de la tecnologfa es la capacidad para presentar una variedad de protefnas que pueden acoplarse en interacciones dimericas. Estas incluyen no solo anticuerpos, sino tambien algunas enzimas, hormonas y receptores de hormona, y protefnas de union a ADN. La tecnologfa de presentacion descrita en el presente documento puede usarse para la alteracion combinatoria de regiones estructurales de anticuerpo y para reorganizar y miniaturizar la estructura del anticuerpo o para presentar protefnas de union a ADN, tales como

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represores, como una biblioteca de heterodfmeros para la seleccion contra secuencias de ADN particulares de importancia clfnica y terapeutica.

Asf, la presente tecnologfa proporciona la presentacion y seleccion de protefnas dimericas mutantes y bibliotecas combinatorias en las que los miembros consisten en matrices heterodimericas. Usando esta tecnologfa, la estructura de inmunoglobulina nativa, en un formato de Fv Vh-Vl heterodimerico mostrado en el presente documento, puede modificarse en diferentes formas y cribarse para especificidad y actividad. Por ejemplo, por alteracion combinatoria de regiones estructurales (FR) u otras manipulaciones para reorganizar y miniaturizar la estructura de anticuerpo por procesos acunados “barajado de la region determinante de la complementariedad (CDR)” y formacion de “twinicuerpos”, emergeran estructuras secundarias similares a anticuerpos que contienen nuevos paratopes o elementos estructurales completamente diferentes. Se usara la seleccion para la union y/o catalisis contra el antfgeno natural y/o sustrato, ademas de algunos compuestos relacionados, para cribar las bibliotecas de protefnas heterodimericas.

Ademas, las aleatorizaciones de secuencias para formar bibliotecas y los protocolos de barajado de cadenas para formar especies hfbridas pueden conducir a subconjuntos de protefnas novedosas. Por ejemplo, la presentacion y modificacion de matrices de dominios de dedo de cinc en forma homodimerica o heterodimerica produce estructuras que poseen interacciones de ADN especfficas. Ademas, son posibles construcciones completamente nuevas mediante la insercion de un fragmento codificante deseado dentro de un andamiaje previamente formado tal como una cadena de anticuerpo. Posibles inserciones incluyen una secuencia distintiva de enzima o una protefna de union a represor.

Debe entenderse que tanto la descripcion general anterior como la siguiente descripcion detallada son a modo de ejemplo y explicativas solo y no son restrictivas de la invencion como se reivindica.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Secuencias de aminoacidos de VH y VL de andamiaje.

Figura 2. Diagrama de vectores de la presentacion en fago y vector de expresion de Fab: pCNTO-Fab-pIX- lacl.

Figura 3A-C: Representacion grafica e imagen de la expresion de Fab del andamiaje de biblioteca y presentacion. 3A muestra niveles relativos de la expresion de Fab sobre la superficie de M13. 3B muestra la expresion relativa de Fab en una transferencia Western usando anti-Fab'(2) como reactivo de deteccion. 3C muestra la expresion aproximada de andamiajes de Fab en sobrenadante de medio de E. coli por comparacion con un Fab de concentracion desconocida. Esto incluye los andamiajes de gen kappa (barras solidas) y andamiajes de gen lambda (barras sombreadas).

Figura 4. Esquema del patron de diseno de H-CDR3.

Figura 5. Esquema del diseno de oligonucleotidos de H-CDR3.

Figura 6. Distribucion de aminoacidos en posiciones de H-CDR3 para el molde de H1-69. A. Distribucion en las 393 posiciones D (longitud 9-14). B. Distribucion en las 2163 posiciones N (longitud 9-14). C. Distribucion en las 973 posiciones Y en H-CDR3 (longitud 9-14); D. Distribucion en todas las posiciones en la longitud de H-CDR3 7 y 8 usando el codon NNS.

Figura 7. Diagrama resumen de las arquitecturas de bibliotecas.

Figura 8. Esquema de la eliminacion de hebras parentales asistida por palfndromo.

Figura 9. Esquema de mega-cebador que se dirige a la region entera de una region V.

Figura 10. El fragmento VH de exito(s) se amplifica por PCR y se clona en un vector de bucle de VL. El plasmido resultante se produce como ADNmc y sirve de molde para la hibridacion del mega-cebador y la mutagenesis de digestion. El mega-cebador de la biblioteca Lc se usa para replicar el plasmido, incorporando asf la diversidad de la biblioteca Lc en asociacion con la secuencia de Hc aislada. Esta biblioteca de maduracion por afinidad esta encapsidada como el fago M13 y se utiliza para la inmunopurificacion en fago contra el antfgeno inicial para dar exitos madurados por afinidad.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente divulgacion proporciona diversos metodos nuevos y componentes de generacion de bibliotecas de novo de presentacion en fago, tales como, pero no se limitan a (i) bibliotecas de novo de anticuerpos Fab disenadas y presentadas fusionadas con las protefnas de fago pIX u otras; (ii) el uso de una protefna de fago de la superficie

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diferente de pIII y pVIII ampliamente usadas del fago M13; (iii) el uso de una pequena matriz de genes VH y VL de la linea germinal que representa la secuencia y estructura del repertorio humano; (iv) uso de tales componentes de fago como andamiaje de biblioteca para proporcionar diversidades combinatorias disenadas mejoradas en las regiones de complementariedad de las regiones Vh y VI; (v) procesos de seleccion de anticuerpos que permiten el examen sistematico del efecto de las secuencias disenadas y topologfas estructurales para el reconocimiento del antfgeno; (vi) un proceso de maduracion por afinidad simplificado como parte de la seleccion de bibliotecas. Un sistema nuevo tal de diseno de bibliotecas, seleccion, optimizacion y maduracion de bibliotecas individuales o grupos de bibliotecas proporciona un sistema reproducible y fiable para el satisfactorio descubrimiento de novo de anticuerpos y tambien facilita el entendimiento de la relacion de la funcion estructural de la interaccion del anticuerpo con el antfgeno.

La biblioteca de novo de Fab humanos descrita anteriormente es distinta del actual estado de la tecnica de bibliotecas de anticuerpos por su presentacion mediante el gen pIX del fago M13. El uso de secuencias de la linea germinal humana representativas y de estructuras como andamiajes de biblioteca y el diseno de secuencias de CDR que imitan la longitud natural y la distribucion de aminoacidos cubren exhaustivamente el repertorio inmunitario humano, y los anticuerpos de biblioteca son altamente homologos a los anticuerpos humanos derivados naturales. La exhaustiva cobertura del repertorio inmunitario aumenta la probabilidad del descubrimiento de novo de anticuerpos comparando con las bibliotecas construidas sobre una unica linea germinal o andamiaje del gen IgG informado en la bibliograffa. Las sub-bibliotecas preparadas por separado, que llevan cada una un unico andamiaje (par VH/VL y/o las longitudes de H-CDR3), maximizan la probabilidad de identificar anticuerpo unico y proporcionar un mecanismo para examinar sistematicamente la estructura de union anticuerpo/antfgeno y las relaciones de funcion. El proceso de maduracion por afinidad integrado reducira el tiempo necesario para descubrir diversos anticuerpos y de alta afinidad.

Definiciones:

Anticuerpo: El termino anticuerpo en sus diversas formas gramaticales se usa en el presente documento para referirse a moleculas de inmunoglobulina y porciones inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina, es decir, moleculas que contienen un sitio de combinacion de anticuerpos o paratope. Moleculas de anticuerpo a modo de ejemplo son moleculas de inmunoglobulina intactas, moleculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y porciones de una molecula de inmunoglobulina, que incluyen aquellas porciones conocidas en la tecnica como Fab, Fab', F(ab')2 y Fv.

Sitio de combinacion de anticuerpos: Un sitio de combinacion de anticuerpos es aquella porcion estructural de una molecula de anticuerpo que comprende regiones variables e hipervariables de cadena pesada y ligera que se unen especfficamente a (inmunorreaccionan con) un antfgeno. El termino inmunorreaccionan en sus diversas formas significa la union especffica entre una molecula que contiene determinante antigenico y una molecula que contiene un sitio de combinacion de anticuerpos tal como una molecula de anticuerpo completo o una porcion de la misma.

Polipeptido de fusion: Un polipeptido que comprende al menos dos polipeptidos y una secuencia de enlace para enlazar operativamente los dos polipeptidos en un polipeptido continuo. Los dos polipeptidos enlazados en un polipeptido de fusion normalmente se derivan de dos fuentes independientes, y por tanto un polipeptido de fusion comprende dos polipeptidos enlazados no normalmente encontrados enlazados en la naturaleza.

Cistron: Secuencia de nucleotidos en una molecula de ADN que codifica una secuencia de residuos de aminoacido y que incluye elementos de control de la expresion de ADN en la direccion 5' y en la direccion 3'.

Fago filamentoso

La presente divulgacion contempla un fago filamentoso que comprende una matriz de protefnas que encapsula un genoma que codifica una protefna de fusion (protefna). La protefna de fusion comprende una porcion de polipeptido exogeno fusionada con el extremo amino de una protefna pVII o pIX de fago filamentoso.

Por “exogeno” se indica que el polipeptido fusionado con la protefna de fago no esta normalmente asociado a la protefna pVII o pIX de fago en variedades no mutantes de fago filamentoso, sino que son extranos para la protefna de fago normal.

Un polipeptido exogeno tfpico es cualquier polipeptido de interes, que incluye un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (Vh), un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina (Vl), polipeptidos naturales o sinteticos, un anticuerpo monocatenario (scFv), y similares.

En una realizacion preferida, un fago filamentoso encapsula un genoma que codifica una primera y segunda protefna de fusion, en la que la primera protefna de fusion comprende un primer polipeptido exogeno fusionado con pVII y la segunda protefna de fusion comprende un segundo polipeptido exogeno fusionado con pIX.

El fago filamentoso contendra adicionalmente la(s) protefna(s) de fusion presentada(s) sobre la superficie de la

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partfcula de fago, como se describe en los ejemplos. Asf, si hay primera y segunda protefnas de fusion, el fago puede mostrar estas protefnas en un modo de funcion de forma que el primer y segundo polipeptidos exogenos puedan interaccionar como un heterodfmero para formar un complejo de protefna bicatenaria funcional sobre la superficie del fago.

Si una protefna heterodimerica expresada tiene la capacidad de unirse al ligando se denomina alternativamente en el presente documento un receptor heterodimerico de union al ligando.

El receptor heterodimerico en una realizacion preferida es un complejo de union al epitope. Es decir, un complejo de primer y segunda polipeptidos capaces de unirse a un epitope. Preferentemente, el primer y segundo polipeptidos son polipeptidos de la cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo. En particular, una realizacion preferida utiliza Vh y Vl para formar un complejo de Fv. Otros complejos de protefna heterodimerica incluyen un Fv catalftico, un receptor, una protefna de union a acido nucleico, y enzima y protefnas heterodimericas similares.

En una protefna de fusion presente sobre un fago desvelado en el presente documento, la “fusion” entre el polipeptido exogeno y la protefna pVII o pIX de fago filamentoso puede comprender un enlace amida tfpico, o puede comprender un polipeptido conector (es decir, un “conector”) como se describe en los ejemplos. Puede usarse cualquiera de una variedad de conectores que normalmente son un estiramiento de aproximadamente 5 a 50 aminoacidos de longitud. Conectores particularmente preferidos proporcionan un alto grado de movilidad a la protefna de fusion en el punto del conector.

Diseno de bibliotecas: bibliotecas sinteticas previas han incorporado algunos de los siguientes, pero ninguna ha incluido todo de una manera exhaustiva.

Diversidad de la familia de la region V de la lfnea germinal. El repertorio variable humano para cadenas pesadas y ligeras consiste en familias de secuencias relacionadas que se definen por homologfa de secuencias y longitud. En cualquiera de tal familia, miembros individuales se diferencian principalmente en secuencia y longitud de las regiones determinantes de la complementariedad. Estas diferencias conducen a patrones de variacion estructurales conocidos (estructura canonica), ademas de a variacion de aminoacidos de la lfnea germinal en posiciones estructuralmente similares que tienen predisposicion para interaccionar con el antfgeno. La eleccion de solo un unico molde del gen Vh y VI para una biblioteca disminuye el alcance de la diversidad de la lfnea germinal natural que puede ser capturado (citar bibliotecas de Genentech). La eleccion de todos los genes Vh y VI paraliza la eficiencia de generacion de bibliotecas. Las bibliotecas de la invencion capturan eficazmente la diversidad de la lfnea germinal (1) identificando un pequeno numero de Vh, Vk y V-lambda de la lfnea germinal que representan los grupos de estructura canonica dominantes en anticuerpos humanos reorganizados (IMGT, Kabat, NCBI) y (2) incorporar la diversidad de la lfnea germinal humana natural de miembros de la familia relacionado en las CDR 1 y 2 codificadas por el gen VH, o tambien en CDR 1-3 de las regiones Vk y V-lambda, por mutagenesis de oligonucleotidos combinatoria.

Diversidad de VH-CDR3. Se crea VH-CDR3 por la union de los segmentos V, D y J y va acompanado por tanto la adicion de extremos como por acontecimientos exonucleolfticos. Hay aproximadamente 25 segmentos de la region D de la lfnea germinal y este numero se acoplo con los acontecimientos de union al complejo y la mutacion somatica crea la region mas diversa de anticuerpos. Estos acontecimientos se producen en un conjunto definido de secuencias de la lfnea germinal y asf no son aleatorios; pero son diffciles de predecir. Sin embargo, la base de datos de secuencias reorganizadas de anticuerpo humano ha alcanzado ahora tamano suficiente (aproximadamente 5000 regiones VH) para aplicar evaluacion estadfstica de tanto la longitud como la distribucion de aminoacidos en cada posicion en VH-CDR3. Las bibliotecas de la presente invencion resumen esta diversidad humana natural utilizando oligonucleotidos degenerados disenados para ensamblar esta region.

Posicion y naturaleza de la diversidad somatica. La diversidad somatica es un distintivo de como los anticuerpos humanos maduran a entidades de union selectivas de alta afinidad. Esta generacion y acumulacion de mutaciones somaticas no es aleatoria. El sitio y tipo de mutacion de nucleotidos esta influido por la secuencia de ADN y el mecanismo, pero solo las mutaciones que proporcionan la union y ventaja funcional estan seleccionadas y se guardan, frecuentemente junto con sustituciones neutras. Aunque no son susceptibles a prediccion del mecanismo, la base de datos de secuencias de anticuerpo humano reorganizadas y el analisis de la funcion estructural identifica posiciones y sustituciones de amino lo mas frecuentemente asociadas al reconocimiento de antfgeno en regiones CDR, incluyendo la diferenciacion entre protefna, peptido y antfgenos de molecula pequena. Las bibliotecas de la presente invencion resumen esta diversidad humana natural utilizando oligonucleotidos degenerados disenados para incorporar sustituciones en CDR1 y 2 de VH, o tambien CDR 1-3 de las regiones Vk y V-lambda.

Uso de genes de la lfnea germinal. El repertorio de la lfnea germinal humana consiste en aproximadamente 30 genes funcionales de V-kappa, 56 de V-lambda y 40 de la cadena pesada de V. Sin embargo, su representacion en anticuerpos reorganizados esta fuertemente influida y esto se refleja en la frecuencia de apareamiento de diferentes regiones V de la cadena ligera-pesada (de Wildt et al., J Mol Bio 285: 895-901 (1999)). Las bibliotecas de la invencion capturan esta influencia seleccionando una region V de la lfnea germinal dominante para cada una de las clases de diversidad indicadas en (a) anteriormente.

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Expresion, propiedades bioqufmicas y bioffsicas. Anticuerpos humanos preferidos tienen actividades biologicas y de union deseadas, pero tambien se producen eficazmente a partir de una variedad de huespedes, son estables y tienen buenas propiedades de disolucion. El uso de genes de la linea germinal de alta frecuencia (1d) tambien indica buena expresion en sistemas de mamffero. Ademas, los anticuerpos recuperados de bibliotecas por metodos de seleccion de presentacion en fago bacteriano o cribado deben expresarse bien en el huesped bacteriano. Las bibliotecas de la invencion se basan en moldes derivados de la linea germinal humana que se expresan bien y se purifican a partir de huespedes de mamffero recombinantes estandar (por ejemplo, celulas hEk 293 y CHO), ademas de huespedes bacterianos, y tienen alta estabilidad y buenas propiedades de disolucion.

Maduracion. El gran numero de posiciones en las secuencias de la region V que pueden influir en el reconocimiento de antfgeno, acoplado con la posible variacion de hasta 20 aminoacidos diferentes en cada posicion, excluyen la utilidad de incluir todas las variaciones en una unica biblioteca. Los anticuerpos humanos logran alta afinidad y especificidad por el proceso progresivo de mutacion somatica. Las bibliotecas de la invencion se disenan y se ordenan para permitir la seleccion paralela y la variacion dirigida, mientras que mantienen la integridad de secuencia de cada cadena de anticuerpo de forma que reflejen anticuerpos humanos.

Diseno alternativo. El diseno anterior resume los anticuerpos humanos naturales. La naturaleza modular del sistema es susceptible a la incorporacion de cualquier coleccion de aminoacidos en cualquier coleccion de posiciones.

Tecnologfas de ensamblaje de bibliotecas. Bibliotecas de anticuerpo de novo preferidas son de alta diversidad (> 1010), susceptibles a alteracion, y faciles de ensamblar y tener un bajo fondo de secuencias no deseadas. Estas secuencias de fondo incluyen molde parental y diversidad dirigida baja. El acoplamiento de los siguientes metodos acelera el ensamblaje de bibliotecas y conduce a fondo bajo. (a) Mutagenesis monocatenaria basada en Kunkle; (b) Bucle palindromico con sitio de restriccion; (c) Mega-cebador

Presentacion en fago de Fab pIX. Todas las bibliotecas de anticuerpos humanos de novo filamentosas anteriores utilizan proteinas de la envuelta del fago pill o pVIII para la presentacion, con la excepcion de una biblioteca de Fv individual (referencia de Scripps). La combinacion de pIX con los moldes de Fab seleccionados es un sistema de seleccion mas eficaz para recuperar anticuerpos que retienen sus propiedades seleccionadas tras la conversion en mAb y otras moleculas relacionadas.

Presentacion de Fab. A diferencia de scFv, los Fab son segmentos naturales de anticuerpos humanos y resumen mejor su actividad cuando se manipulan por ingenierfa en anticuerpos completos. La eficaz presentacion filamentosa de Fab puede requerir propiedades mas alla de la buena expresion en el huesped bacteriano. Los moldes de la region V de la presente invencion se eligieron para la eficaz presentacion por pIX sobre fago filamentoso.

Presentacion en fagemido. La molecula de Fab es grande con respecto a las proteinas de la envoltura pIX de fago y asf pueden interferir con el ensamblaje de partfculas de fago recombinantes si se enlazan con todas las protefna pIX producidas en la celula bacteriana. Un enfoque para evitar esta interferencia es usar un sistema de fagemido de pIX, tal descrito por (referencia Scripps), por el cual tanto las proteinas pIX no mutantes como enlazadas a Fab pueden incorporarse en la partfcula de fago recombinante. En una aplicacion preferida, las bibliotecas de la presente invencion se presentan por pIX en un sistema de fagemido.

Protefna de la envoltura del fago pIX para la presentacion. Al igual que pIII, pIX esta presente a bajo numero de copias sobre el fago y es susceptible a seleccion por afinidad de Fab presentados. Sin embargo, la protefna pIII participa crfticamente en el proceso de infeccion y las proteinas presentadas sobre esta protefna pueden interferir con la eficiencia de infeccion. Ademas, cualquiera de Fd de la cadena pesada o segmentos de la cadena ligera pueden fusionarse con pIX para la presentacion. Se predice que las bibliotecas de la presente invencion presentadas sobre la protefna pIX se replican eficazmente y se presentan para la seleccion y/o cribado.

Expresion de Fab-pIX. Un enfoque para cribar Fab recuperados de las bibliotecas de fagos es eliminar la protefna de envoltura del fago que esta enlazada a la molecula de Fab para la presentacion. El pequeno tamano de la protefna pIX proporciona la opcion de la produccion del cribado de Fab directamente sin esta etapa.

DISENO DE ANDAMIAJES DE BIBLIOTECA. El andamiaje de biblioteca esta hecho de un conjunto de genes VH y VL de la linea germinal humana. La bibliograffa del analisis, ademas de la informacion de anticuerpos patentados, condujo a la identificacion de genes de la linea germinal que representaban a las familias de genes de IgG humana, uso en el repertorio de IgG y las estructuras canonicas de anticuerpo humano. Tambien se consideraron en el analisis el buen emparejamiento entre Vh y VL y la probabilidad de fabricacion satisfactoria de anticuerpo derivado de los genes de la linea germinal. El diseno de la naturaleza humana y el buen emparejamiento de Vh y VL del andamiaje es superior al diseno de uso de un consenso de gen de la linea germinal humana como andamiajes de biblioteca (MorfoSys HuCAL GOLD) y esta representando mas exhaustivamente el repertorio humano que los disenos basados en un unico gen de la linea germinal como andamiaje de biblioteca (Dyax VH y Affytech).

CAPACIDAD DE EXPRESION Y DE PRESENTACION DE LOS ANDAMIAJES DE BIBLIOTECA. La buena

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capacidad de expresion y de presentacion de Fab del andamiaje de biblioteca se refieren directamente a la calidad de la biblioteca para desarrollarse con respecto a los genes del andamiaje. La capacidad de expresion y de presentacion de Fab del andamiaje de biblioteca se examino antes de la construccion de la biblioteca. Algunos Fab de andamiaje que se expresaron, pero fueron incapaces o se presentaron malamente, se excluyeron de la construccion de biblioteca. Los andamiajes de biblioteca bien expresados y presentados garantizan que una alta proporcion de los Fab en la biblioteca son funcionales, mas superiores que las bibliotecas derivadas de la clonacion combinatoria de genes VH y VL geneticamente amplificados de fuentes naturales (CAT).

DISENO DE LA DIVERSIDAD EN H-CDR3. La biblioteca VH-CDR3 se diversifico en tanto las longitudes como las secuencias. Se disenaron aproximadamente 109 a 1018 posibilidades de secuencia totales dependiendo de las longitudes de las CDR en VH-CDR3 que reflejan la importancia de VH-CDR3 en la union al antfgeno. A diferencia del uso de todos los codones de aminoacido para la diversificacion de aminoacidos (por ejemplo, NNK por Genentech 2004) y el uso de exhaustivos metodos de clonacion para manipular por ingenierfa secuencias de VH- CDR3 de fuentes naturales (CAT, Dyax, Affytech), los presentes inventores crearon VH-CDR3 usando oligonucleotidos disenados que codifican codones de aminoacido que imitan el patron de uso de aminoacidos en el repertorio de IgG humana. VH-CDR3 disenada contiene menos aminoacidos no deseados (por ejemplo, codon de terminacion) y menos no favorecidos (por ejemplo, cistefna), pero mas proporcion de secuencias de CDR3 tipo IgG. Los oligonucleotidos degenerados pueden usarse facilmente para generar una biblioteca de genes de gran tamano en una reaccion de mutagenesis.

DISENO DE DIVERSIDAD EN H-CDR1 Y H-CDR2. Se diseno la diversidad de aminoacidos en VH-CDR1 y VH- CDR2 para imitar las variaciones dentro de las secuencias de la lfnea germinal. La diversidad de la secuencia total combinada en VH-CDR1 y VH-CDR2 oscila entre 102-105 Combinando con las grandes variaciones de secuencias de VH-CDR3, esto aumenta las variaciones de secuencia totales en la biblioteca y de ahf que aumente la probabilidad de identificar anticuerpos de union al antfgeno. El diseno unico de la pequena diversidad similar a la lfnea germinal favorece el descubrimiento de la lfnea germinal o secuencias de anticuerpos tipo natural y minimiza el potencial de aislar combinaciones de CDR no naturales debido al efecto combinatorio sobre la creacion de bibliotecas. Este diseno es diferente de muchas de las otras bibliotecas de anticuerpos sinteticas o semi-sinteticas que contuvieron mayores variaciones de secuencia en las tres CDR de VH (Genentech, Dyax y MorfoSys) y tambien solo una pequena porcion de la gran diversidad de secuencias teoricas fue capaz de capturarse en la biblioteca.

DISENO DE DIVERSIDAD EN LC. Las cadenas ligeras de la biblioteca se disenaron estrategicamente para variarse en la biblioteca de novo y las diversidades de Lc se introdujeron en las CDR despues de seleccionarse Fab mediante inmunopurificacion de fagos. Como la diversidad de Lc en los Fab de union al antfgeno se disena para mejora de la afinidad de union, se eligieron para diversificacion las posiciones de CDR que se encontraron frecuentemente en contacto con el antfgeno en el complejo antfgeno-anticuerpo de estructura conocida. La estrategia de diversificacion de CDR escalonada gestiona eficazmente la gran diversidad de secuencias de CDR teorica y genera anticuerpos de alta afinidad de union, mas adecuados para la caracterizacion biologica.

METODOS PARA LA GENERACION DE BIBLIOTECAS. Se usa un metodo de mutagenesis de Kunkel modificado, que genera eficazmente billones de colonias de E. coli que aloja cada una una secuencia de Fab diferente, para la generacion de las grandes bibliotecas de Fab. Aunque es eficaz, el porcentaje de ADN parental no mutagenizado aumenta cuando se adapta en la generacion de una biblioteca de secuencias altamente compleja. Ademas, la limitacion tecnica de la sfntesis de oligonucleotidos largos redujo la eficacia del metodo para hacer bibliotecas que contuvieran diversidades de secuencia en regiones distanciadas. Para vencer las limitaciones, se usaron tecnicas adicionales de generacion de oligonucleotido >350 bases (mega-cebador) y de creacion de una secuencia de tallo- bucle que contiene un sitio de reconocimiento de enzima de restriccion en el molde de mutagenesis en combinacion del metodo de mutagenesis de Kunkel estandar. Comparando con otras tecnologfas de bibliotecas, tales como la clonacion por restriccion (MorfoSys, CAT y Dyax), recombinacion en fago (Giggapack, Invitrogen) y recombinacion especffica de secuencia (CAT), usadas por otros para la generacion de bibliotecas, el metodo basado en Kunkel mejorado es significativamente mas eficaz en la generacion de bibliotecas diversas de >109 secuencias y es mas versatil para introducir diversidad de secuencia en cualquier localizacion sobre el ADN dirigido.

MADURACION POR AFINIDAD EN LINEA. Se disena un proceso de maduracion por afinidad integrado, o maduracion por afinidad en lfnea, para mejorar la afinidad de union de todos los Fab seleccionados de la biblioteca. Como la biblioteca se disena estrategicamente para dejar que VL de Fab varfe, sitios de union al antfgeno adicionales deben crearse facilmente en VL mediante la diversificacion de secuencias de CDR. El mejorar la afinidad de union de todos los Fab despues de la inmunopurificacion aumenta el exito de identificar el anticuerpo terapeutico conductor. El uso del metodo de Kunkel para la generacion de bibliotecas garantiza la eficaz ejecucion de la estrategia de diversificacion de la secuencia de VL en un proceso simple y continuo. La estrategia de diseno y las ventajas tecnicas de uso del metodo de mutagenesis de Kunkel mejorado hicieron el enfoque superior a otras estrategias de maduracion reunidas informadas por CAT y MorfoSys, en las que se emplean tediosos metodos de generacion de bibliotecas que reducen la eficiencia y beneficio del fin.

INMUNOPURIFICACION DE BIBLIOTECAS PARALELA. Se desarrolla un proceso de inmunopurificacion paralela usando un equipo semi-automatizado del estado de la tecnica para procesar las sub-bibliotecas individualmente

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preparadas. La inmunopurificacion paralela maximiza el potencial de descubrimiento de un diverso conjunto de anticuerpos, soportando las bibliotecas unicamente disenadas y generadas. El uso eficaz de inmunopurificacion paralela en la maduracion por afinidad en lfnea tambien permite que se mejoren simultaneamente anticuerpos que tienen un amplio intervalo de afinidad. El desarrollo de una inmunopurificacion basada en maquina tambien permite examinar sistematicamente diferentes condiciones de inmunopurificacion para el descubrimiento de anticuerpo de propiedades deseadas.

CLASIFICACION DE AFINIDAD. Los ensayos de union basados en afinidad se aplican a los anticuerpos de union especfficos de antfgeno grandes, diversos y de alta afinidad para seleccionar los mejores anticuerpos de union para la caracterizacion adicional. Metodos bioqufmicos estandar como ELSIA, ademas de equipos de medicion de afinidad, por ejemplo, BIAcore, Octet y BIND, que son adecuados para procesar un gran numero de muestras, se usan solos o en combinacion para este fin.

Aunque la invencion se ha descrito en terminos generales, las realizaciones de la invencion se desvelaran adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes del alcance de las reivindicaciones.

EJEMPLO 1: Ejemplo 1. Diseno de andamiajes de biblioteca

Se disenaron genes de la lfnea germinal humana como esqueletos de biblioteca. Se identificaron inicialmente un panel de genes VH y VL de la lfnea germinal basandose en las propiedades de 1) uso en IgG naturalmente expresada, 2) topologfa de estructura (conformacion de cadena principal) que favorece el reconocimiento de antfgeno de protefna y de peptido, 3) propiedades bioqufmicas y bioffsicas de anticuerpos derivados de genes de la lfnea germinal y 4) probabilidad de formacion de heterodfmero de VH y VL como anticuerpo. Se seleccionan adicionalmente cuatro (4) genes de la lfnea germinal VH y cuatro (4) VL del panel que son los que mejor representan las propiedades enumeradas anteriormente. Se uso una unica secuencia de H-CDR3 artificial de 10 aminoacidos derivada de un anticuerpo conocido con modificaciones de secuencia y el segmento JH4 humano en combinacion con cada VH de la lfnea germinal para completar las secuencias de VH completas. Para VL, se uso el segmento Jk1 para combinar con cada uno de VL de la lfnea germinal seleccionada. Estos 4 genes basados en la lfnea germinal VH y 4 VL se sintetizan qufmicamente. Combinando con una secuencia de CH y de CL definida, constituyeron dieciseis (16) Fab humanos recombinantes. Para VL-A, el segmento JA2 se combino con cada uno de los andamiajes de la lfnea germinal VL-A seleccionada. Se combinaron tres genes de la lfnea germinal VH (169, 323 y 551) con los andamiajes de la lfnea germinal VL-A y se clonaron en vectores que contenfan las secuencias CH1 y Ca para dar 12 Fab humanos recombinantes. Estos 28 Fab se usaron como andamiaje de biblioteca o molde para presentar la diversidad de secuencia en regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada y/o Lc. La Figura 1 muestra las secuencias de las cuatro VH y cuatro VL disenadas.

Ejemplo 2. Expresion y presentacion de los andamiajes de biblioteca

Se clonan los ADN de Fab sintetico en el vector pCNTO-lacI-pIX (Fig --). El gen VH se clono mediante los sitios Ncol y Apal. El gen VL, que incluye la secuencia senal ompA y secuencias en la direccion 5', se clono mediante sitios Nhel y BsiWI (Figura 2). Se examinaron la expresion y presentacion de los Fab de andamiaje en un analisis de transferencia Western y en un ELISA en fago, respectivamente.

Para examinar la presentacion, el fago se preparo y se probo en un ELISA en fago. Brevemente, la construccion pCNTO-Fab-pIX-lacI se transformo en las celulas MC1061 F' y se cultivaron durante la noche en 2x medio YT / Carb (100 ug/ml) / TET (15 ug/ml) / 1 % de glucosa a 37 °C con agitacion. A la manana siguiente se usaron 50 ul de este crecimiento para sembrar 5 ml de 2xYT / Carb (100 ug/ml) y cultivar a una DO600 de 0,6-0,8. El cultivo se infecto entonces con (n° de fago) de fago cooperador durante 40 minutos a 37 °C sin agitacion. Las celulas infectadas se centrifugaron, se resuspendieron en 5 ml de 2x medio YT / Carb (100 ug/ml) / TET (15 ug/ml) / Kan (35 ug/ml) / IPTG 0,5 mM, y se cultivaron durante la noche a 30 °C con agitacion. A la manana siguiente, las celulas se centrifugaron y se recogio el sobrenadante de fago y se uso para ELISA en fago. Se anadieron 50 ul de sobrenadante de fago (puro), ademas de 3 diluciones sucesivas de 1:5, a pocillos de ELISA recubiertos con anticuerpos anti-Fd (especffico de Hc) o anti-kappa (especffico de Lc). Despues de la incubacion, el fago sin unir se elimino lavando y el fago de union se detecto por anticuerpo anti-M13. Todas las combinaciones de andamiaje, excepto H3-53/L-B3 y H3-53/L- A27, mostraron buena union a anticuerpos anti-Fd y anti-kappa, que indica presentacion suficiente de tanto Hc como Lc sobre la superficie del fago (Figura 3).

Para examinar la expresion de Fab, el gen pIX se escinde primero del vector pCNTO-Fab-lacI-pIX por digestiones con enzimas de restriccion en Spel y Nhel, seguido de auto-ligacion del aDn de vector digerido. Esto crea la construccion de expresion de Fab, pCNTO-Fab-lacI (Figura 2). Celulas M1061F' que alojan el fagemido pCNTO-Fab- lacI se cultivaron durante la noche en 2x medio YT/1 % de glucosa/Amp (100 ug/ml) a 37 °C con agitacion. Se uso una alfcuota de 5 ml del medio durante la noche como control sin inducir. Se inocularon 0,1 ml del cultivo durante la noche en 10 ml de 2x medio de cultivo YT/0,1 % de glucosa/Amp (100 ug/ml). El cultivo se cultivo a 37 °C con agitacion a DO600nm 0,8 - 1,0. Se anadio IPTG a una concentracion final de 0,5 mM para inducir la expresion de Fab. El cultivo continuo creciendo durante 16-20 horas adicionales a 30 °C con agitacion. Se centrifugaron los cultivos

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inducidos y cada sedimento de celulas se liso anadiendo 0,4 ml de reactivo BPER II (Pierce). Se recogio el sobrenadante del lisado celular gastado y se analizo por transferencia Western para la expresion de Fab. Todos los Fab se expresaron bien a (> 2 ug/ml), con la excepcion de aquellos que contenfan LC de B3 que se expresaron a aproximadamente un nivel 10 veces menor. Tambien se examino la expresion de Fab usando un ELISA. Se anadieron 50 ul de lisado celular gastado, ademas de 6 diluciones sucesivas de 1:5 a pocillos de ELISA recubiertos con anti-Fd (especffico de Hc). Se detecto Fab con tanto anticuerpos anti-kappa como anti-lambda conjugados con HRP. Las cantidades de Fab se cuantificaron con respecto a una curva estandar de control de Fab (Figura 3C).

Ejemplo 3. Diseno de diversidad en H-CDR3

Los presentes inventores disenaron grandes diversidades de secuencia en H-CDR3 que imitan el repertorio inmunitario natural. Se recogieron un total de aproximadamente 5250 secuencias de anticuerpo humano no redundantes y completas (incluyendo la region V, CDR3 y region estructural 4) de diversas fuentes publicas. El conjunto de datos contuvo las 7 familias de Vh. Se escribieron programas patentados para extraer segmento de CDR3 basado en la definicion de Kabat. Las secuencias de anticuerpos se analizaron adicionalmente basandose en la longitud de CDR3. Las longitudes de H-CDR3 oscilaron de 1 a 27 aminoacidos, y se mostraron como una distribucion normal. El mayor numero de anticuerpos contuvo 12 aa en H-CDR3. Se alinearon las secuencias de anticuerpos con la misma longitud y se agruparon. Se restaron las secuencias derivadas de JH6 de los grupos de longitud para minimizar las secuencias de JH6 que contenfan tirosina asociadas, multiples y consecutivas. Se escribieron programas para calcular la distribucion de aminoacidos para cada longitud. Se clasificaron los residuos en cada posicion del grupo de secuencia de longitud de H-CDR3 basandose en su frecuencia. Se uso un Weblogo internamente instalado (9-Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE WebLogo: A sequence logo generator, Genome Research, 14:1188-1190, (2004)) para representar una distribucion para cada longitud de HCDR3. Los presentes inventores decidieron trabajar en las secuencias que contenfan 7-14 aminoacidos de H-CDR3, que aproximadamente cubrieron aproximadamente el 65 % para el repertorio de anticuerpos humanos total.

Analizando la distribucion de aminoacidos, los presentes inventores identificaron un patron que describe la distribucion de aminoacidos de H-CDR3 que contiene 7-14 aminoacidos. La Figura 4 mostro el patron de H-CDR3. A pesar de los aminoacidos altamente diversos observados en H-CDR3, los aminoacidos glicina y alanina se usan frecuentemente en todas las posiciones. Ademas, el acido aspartico (D) se usa frecuentemente en la posicion 95 y la tirosina (Y) esta frecuentemente codificada en las posiciones mas proximas al segmento J en H-CDR3. Aunque la secuencia en la posicion 99-101 varfa, los aminoacidos fenilalanina (F), acido aspartico (D) y tirosina (Y) se usan predominantemente en IgG en estas posiciones. Como estas posiciones frecuentemente sirven de soporte estructural para H-CDR3 y son menos accesibles al antfgeno y/o a la superficie de IgG, los presentes inventores fijaron los aminoacidos F/L a 99, D a 100 e Y a 101, respectivamente.

Para imitar la distribucion de aminoacidos altamente diversa en H-CDR3, los presentes inventores disenaron oligonucleotido de bases mixtas para codificar la secuencia de H-CDR3 y los usaron en la construccion de bibliotecas. Se usa un procedimiento descrito por Wang & Saven (10-Wang W, Saven JG. Designing gene libraries from protein profiles for combinatorial protein experiments. Nucleic Acids Res. Vol 30, No 21, e120. 2002) para determinar los valores iniciales de las relaciones de mezcla de nucleotidos en cada posicion de un triplete de codon en multiples ensayos aleatorios de manera que los aminoacidos codificantes derivados de los tripletes de codon imitaran la distribucion de aminoacidos dirigida. Con el fin de minimizar los codones de terminacion (<3 %) y reducir el codon de cistefna por los oligonucleotidos de bases mixtas, los presentes inventores refinaron adicionalmente los valores de las relaciones de mezcla de nucleotidos en cada posicion de un triplete de codon usando un script en Solver de Microsoft Excel™ contra la misma funcion diana que el procedimiento de Wang & Saven. La composicion de nucleotidos usada para las posiciones D y N se muestran en la Figura 5. Para las longitudes de H-CDR3 mas cortas, por ejemplo, 7-8 aminoacidos, en su lugar se usa el codon NNS.

Los presentes inventores generaron entonces oligonucleotidos de bases mixtas basados en el diseno de codones. Ademas de la posicion D y N, las posiciones ricas en tirosina (~18 % de Y) comparten de otro modo la distribucion de aa similar como en las posiciones N. Se prepararon oligonucleotidos separados con codon de diseno N en la posicion N mas codon fijo Tat en cada posicion de tirosina y se usaron para mezcla con los oligonucleotidos de codon de diseno N para bibliotecas que llevan longitudes de CDR de 11 a 14 aminoacidos. La relacion usada para mezclar oligonucleotido de codon N y oligonucleotidos de codon N mas TAT para una posicion Y particular es aproximadamente 7:1. Como el codon N de diseno da aproximadamente el 4,7 % para tirosina, esta mezcla produce un 13 % de tirosina adicional a partir del codon TAT fijo en la posicion Y.

Se usaron los oligonucleotidos para construir la biblioteca de Fab de novo usando los metodos descritos en el Ejemplo 6. Se obtuvieron secuencias de ADN de aproximadamente 100 colonias de cada sub-biblioteca y se analizaron. Los clones que se mutaron del codon de terminacion TAA en H-CDR3 se consideraron clones positivos. Se usaron las secuencias de H-CDR3 traducidas para determinar las distribuciones de aminoacidos en las posiciones D, N y Y individuales o combinadas. El resultado mostro que la distribucion de aminoacidos observada en estas posiciones imito estrechamente la distribucion encontrada en la base de datos y en el diseno (Figura 6). Por tanto, el oligonucleotido de bases mixtas disenado mostro mejor imitacion de la distribucion de aminoacidos en estas posiciones para el diseno y base de datos que por los oligonucleotidos degenerados NNS (Figura 6).

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Ejemplo 4. Diseno de la diversidad en H-CDR1 y H-CDR2.

Los presentes inventores disenan las diversidades en H-CDR1 y H-CDR2 para imitar el repertorio de genes de la linea germinal. Las posiciones de H-CDR1 y CDR2 que son dirigidas para diversificacion se determinan por 1) diversidad en genes de la linea germinal, (11-Vbase) y 2) frecuencia encontrada en la puesta en contacto con antigeno en los complejos anticuerpo-antfgeno de estructura conocida determinada por el analisis de exposicion a disolvente y por bibliografia (12-Almagro 2004). La diversidad de aminoacidos en las posiciones se determinan por 1) uso en la linea germinal (11), 2) aminoacidos que se usan lo mas frecuentemente en las IgG derivadas de los genes de la linea germinal (base de datos patentada), 3) aminoacidos predichos que se derivan como resultado de mutaciones somaticas y 4) propiedades bioqufmicas y bioffsicas de aminoacidos que contribuyen al reconocimiento del antigeno. La diversidad de secuencias combinadas en H-CDR1 y CDR2 oscila de 102 a 105. Se uso la frecuencia de uso como un filtro para limitar los aminoacidos que frecuentemente no se usan en IgG. Esto minimiza la secuencia no natural creada por mutaciones combinatorias. La Tabla 1 mostro el analisis de secuencias y los disenos de diversidad en H-CDR1 y CDR2.

Se disenan y sintetizan los oligonucleotidos degenerados que mejor cubrieron el diseno de H-CDR1 y H-CDR2 (Tabla 1). Los oligonucleotidos se usan como cebadores en una reaccion de mutagenesis dependiente de ADNmc de Kunkle individual. La degeneracion disenada en las posiciones de H-CDR1 y CDR2 definidas se introduce asf en H-CDR1 y H-CDR2 como era de esperar. El analisis de secuencias que eligio aleatoriamente clones tras la reaccion de mutagenesis de Kunkel mostro que del 31 % al 55,7 % de los clones secuenciados tuvieron mutaciones en regiones H-CDR1 y/o H-CDR2 (Tabla 2). Se encontro que el porcentaje de clones con tanto mutaciones de H-CDR1 como de H-CDR2 era igual o superior al de los clones que tenfan mutaciones en solo una region CDR.

Ejemplo 5. Diseno de la diversidad en Lc

Se consideran los siguientes parametros en el diseno de la diversidad en CDR de cadena ligera. Primero, los presentes inventores definieron que la diversidad en Lc combinada no debe superar 108, ya que las bibliotecas de Lc se usan en la maduracion por afinidad y asf se combinan con un conjunto de aproximadamente 102 clones de Hc unicos derivados de la seleccion en fago durante la primera etapa de inmunopurificacion de las bibliotecas. Por tanto, la complejidad de Hc y Lc combinada es aproximadamente <1010, que puede ser capturada eficazmente en una biblioteca generada por una unica reaccion de mutagenesis de Kunkel. Segundo, los presentes inventores dirigieron las posiciones de diversificacion frecuentemente encontradas en contacto con los antfgenos en complejos de antfgeno-anticuerpo de estructura conocida o los llamados residuos determinantes de la especificidad (SDR; 12); es decir, las posiciones 30-32, 50 y 91-94, para L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3, respectivamente. Tercero, la posicion 96 tambien esta diversificada debido a que esta codificada en los genes de union (J) y los cinco genes J humanos se diferencian entonces en esa posicion. Cuarto, igual que el concepto usado en el diseno de H-CDR1 y H-CDR2, los presentes inventores minimizaron la diversidad de secuencias que probablemente no se producen en la naturaleza eligiendo los aminoacidos codificados por la linea germinal que tambien se encuentran frecuentemente en la IgG reordenada en las posiciones que van a diversificarse. Finalmente, los presentes inventores evaluan las propiedades bioqufmicas y bioffsicas de los aminoacidos adecuados para la union al antigeno en las posiciones dadas (13- Tomlinson et al., 1995) y complementaron la diversidad de los genes de la linea germinal V con aquellos aminoacidos para alcanzar los criterios 108. Las diversidades en Lc-CDR individualmente disenadas se muestran en la Tabla 5.

Se usa un metodo de PCR de solapamiento para generar el Lc que contiene las diversidades disenadas en las posiciones especfficas. Pueden colocarse codones degenerados en las posiciones dentro de oligonucleotidos de amplificacion que engloban CDR individuales. Estos codones degenerados codifican los aminoacidos disenados en las posiciones de CDR. Alternativamente, pueden sintetizarse varios oligonucleotidos que codifican los codones deseados especfficos en cada posicion. Estos oligonucleotidos pueden entonces mezclarse para generar una biblioteca que se usara para amplificar el ADN de biblioteca usado en la PCR de solapamiento. Los oligonucleotidos disenados se usan para amplificar fragmentos de un Lc, generar un conjunto de variantes de secuencia en las posiciones de SDR deseadas. Fragmentos de Lc que codifican la region estructural n° 1, region mutada en CDR1-2 y la region estructural mutada en n° 3-CDR3 se sintetizaron por PCR con oligonucleotidos degenerados. Los fragmentos de biblioteca de VL antes mencionados se combinaron entonces en una PCR de solapamiento con cebadores de amplificacion flanqueantes. Esta reaccion produce una biblioteca de VL de longitud completa con variaciones de secuencia en las tres CDR en las posiciones deseadas.

Alternativamente, puede usarse el metodo de sfntesis de ADN, “GeneWriter” para sintetizar las bibliotecas de Lc individuales segun los disenos. Las secuencias de nucleotidos pueden retro-traducirse a partir de las secuencias de aminoacidos disenadas usando codon preferido de E. coli. Los oligonucleotidos, cada uno cubre una parte de la secuencia disenada y contiene las variaciones de nucleotido disenadas, pueden sintetizarse y ensamblarse como un gen usando una tecnologfa descrita en cualquier parte (14-Patente de EE.UU. 0165946 A1). Brevemente, las secuencias de oligonucleotidos y variaciones de secuencia disenadas pueden procesarse mediante el software “MultiWriter” para la generacion de oligonucleotidos. Puede generarse un diverso numero de oligonucleotidos de biblioteca para la hebra codificante para representar todas las combinaciones de variaciones de secuencia deseadas

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basadas. La hebra no codificante puede disenarse y sintetizarse usando el mismo software. Los genes VL pueden ensamblarse mediante una serie de hibridacion-ligacion de los oligomeros sinteticos mas pequenos como se describe como “Gene assembler” en la patente (14). Los ADN de VL de longitud completa se amplificaron por PCR y los productos de PCR pueden usarse bien como un cebador en el metodo de Kunkel o bien como una fuente para la clonacion directa en los sitios disenados en el vector pCNTO-pIX-lacI para la generacion de bibliotecas. Tambien pueden usarse sfntesis de ADN alternativa y metodos de ensamblaje de genes grandes para generar los genes VL disenados.

Ejemplo 6. Metodos para la generacion de bibliotecas

Se usa un metodo de mutagenesis monocatenaria de Kunkel modificado para preparar la biblioteca individual basandose en cada Fab de andamiaje (15-Documento de Genentech, 16-Henry Lowman's book). Para minimizar el efecto del molde de Fab de andamiaje no mutagenizado sobre la funcion de biblioteca final, el codon de terminacion TAA se inserto en la region H-CDR3 de los moldes. Se preparo ADN monocatenario de cada molde que contenfa codon de terminacion a partir de la cepa CJ236. Los oligonucleotidos codifican cada uno la diversidad en H-CDR1 y CDR2 disenada y se usaron simultaneamente como cebadores en una reaccion de polimerizacion de ADN usando ADN polimerasa T7 y T4 ligasa. La mezcla de reaccion se uso para transformar celulas competentes MC1 061 F', dando normalmente > 109 colonias independientes por construccion de biblioteca. Las colonias se rasparon de las placas para inocular medios frescos, se preparo ADN de plasmido bicatenario y se uso para transformar celulas CJ236. Las celulas transformadas se infectaron con fago cooperador, y se preparo ADN monocatenario a partir de cultivo celular durante la noche y se uso como molde de reaccion para introducir diversidad en H-CDR3. Se construyo individualmente la biblioteca de andamiaje/molde de Fab individual. Se construyeron las 8 longitudes diferentes de H-CDR3 en cuatro reacciones, en las que la longitud de H-CDR3 de 7 y 8, 9 y 10, 11 y 12 y 13 y 14 aa se agruparon, respectivamente. La Figura 7 muestra las arquitecturas de bibliotecas.

Aunque es eficaz, los presentes inventores encontraron que el actual metodo de Kunkel frecuentemente solo eliminaba ADNmc parentales no mutados al intervalo del 20-50 % cuando se construfa una biblioteca de secuencias altamente compleja. El oligonucleotido corto usado en las reacciones de Kunkel escalonadas durante la generacion de bibliotecas redujo adicionalmente la eficiencia del metodo. Para eliminar adicionalmente el ADN parental, se manipulo un palfndromo que contenfa un sitio de enzima de restriccion (Xbal) de 6 cortadores en las regiones de secuencias mutagenicas dirigidas, por ejemplo, VH y/o VL. Durante la hibridacion del cebador con el ADNmc, el palfndromo forma una estructura de etapa bicatenaria-bucle y el cebador mutagenico engloba este palfndromo por hibridacion con secuencias flanqueantes (Figura 8). La replicacion de ADN avanza a partir del cebador hibridado usando ADN polimerasa T7. Se genera ADN circular cerrado por ADN ligasa T4. Este producto se digiere con la endonucleasa de restriccion en su sitio (Xbal) dentro del bucle palindromico, cortando asf la hebra de ADN parental y destruyendo su potencial replicativo in vivo. La eliminacion de la secuencia del palfndromo combinada y el metodo de Kunkel eliminan el ADN parental mas del 95 %, una mejora significativa con respecto al actual metodo de Kunkel solo. Los presentes inventores tambien generaron mega-cebadores que cubren las tres CDR dirigidas para diversificacion de secuencias por PCR de solapamiento y se usaron en la reaccion de mutagenesis. Esto permite que toda la diversificacion de secuencias combinatorias se lleve a cabo en una reaccion, mas eficaz que las reacciones escalonadas, usando oligonucleotidos cortos. Por ejemplo, los presentes inventores han generado fragmentos de bibliotecas de VL por PCR de solapamiento y/o por sfntesis qufmica usando GeneWriter™ y los usaron como mega-cebadores para la mutagenesis por hibridacion. El megacebador se produce por PCR y la cadena menos se amplifica con un cebador biotinilado (Figura 9). La hebra biotinilada se captura sobre perlas magneticas de estreptavidina (Dynal) y la hebra sin biotinilar se purifica por desnaturalizacion en NaOH 0,15 M. Entonces, la hebra eluida se usa entonces para la replicacion de ADN mediada por mega-cebador sobre ADNmc (REStr420jw).

Tambien pueden generarse bibliotecas con diversidad en VH y VL por metodos alternativos y fuentes. Por ejemplo, pueden amplificarse genes VH y VL a partir de tejidos de animal inmunizado y clonarse en marco con la region constante para preparar bibliotecas de Fab (17-winter). Alternativamente, las regiones CDR de animales inmunizados, por ejemplo, H-CDR3, pueden amplificarse por PCR y clonarse en la region correspondiente de la biblioteca de novo formando un hfbrido de H-CDR3 inmunizado en una referencia de biblioteca de novo de H-CDR1, H-CDR2 y VL. La inmunopurificacion en fago de tales bibliotecas puede aislar anticuerpos de union de alta afinidad.

Ejemplo 7. Maduracion por afinidad en linea

Los presentes inventores disenaron la maduracion por afinidad de los ligantes seleccionados de la biblioteca de novo como parte del proceso de inmunopurificacion en fago, y llamaron el proceso “maduracion en linea”. El proceso empieza con un conjunto de anticuerpos de union, con o sin caracterizacion detallada, seguido de la diversificacion de secuencias de CDR en Lc de los ligantes, que se derivaron de uno de los cuatro Lc de la linea germinal usados como andamiajes de biblioteca. Las diversidades en CDR de Lc crearan actividades de union adicionales que pueden seleccionarse mediante otra inmunopurificacion en fago. Los procesos se describen mas adelante y tambien se detallan mas adelante (Figura 10). Primero, las regiones VH de anticuerpos conductores aisladas mediante inmunopurificacion de la biblioteca de novo de Fab se subclonaron en vectores de bucle palindromicos de VL. Los ADNmc de estos vectores se preparan para mutagenesis por hibridacion con los megacebadores de la biblioteca de

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VL o metodos adecuados descritos en el Ejemplo 6. Por ejemplo, la eliminacion de la secuencia del palfndromo y el metodo de mutagenesis de Kunkel del mega-cebador combinados pueden usarse eficazmente para generar la biblioteca secundaria diversificada en CDR de VL para la maduracion por afinidad en lfnea. Se elimina ADN parental por digestion con Xbal y por transformacion posterior en la cepa huesped no permisiva. Este metodo permitio la creacion altamente eficaz de una biblioteca que cubre diversidades de secuencia disenadas. Entonces se prepararon bibliotecas de fago por infeccion de la biblioteca mutacional con el fago cooperador. A continuacion, la biblioteca se sometio a rondas adicionales de inmunopurificacion con mayor rigurosidad de seleccion para enriquecer en ligantes con afinidad de union mejorada con respecto a los ligantes seleccionados inicialmente a partir de la biblioteca primaria. Estos incluyen reducir las concentraciones de antfgeno, aumentar el tiempo de lavado y frecuencia. Alternativamente, pueden incluirse competidores de union u otros componentes del estres de union, por ejemplo, alterar la temperatura de union y anadir detergentes, en el tampon de union y/o de lavado para seleccionar ligantes con propiedades deseadas. Tambien pueden incluirse otras condiciones bioqufmicas y bioffsicas adecuadas para su uso en la union a fago y posterior infeccion por E. coli en la inmunopurificacion. Despues de la inmunopurificacion, el ADN se recupera del fago. Los Fab se expresan y se someten a union, ademas de a otras caracterizaciones bioqufmicas, bioffsicas y biologicas. El ADN recuperado del fago tambien puede clonarse directamente en vectores de IgG. En este caso, se expresara y caracterizara el mAb en lugar de Fab. Por ejemplo, los presentes inventores han generado fragmentos de bibliotecas de VL por metodos de PCR de solapamiento y los han usado como megacebadores para mutagenesis por hibridacion. El mega-cebador se produce por PCR y la hebra menos se amplifica con un cebador biotinilado (vease el Ejemplo n° 6). La hebra biotinilada se captura sobre perlas magneticas de estreptavidina (Dynal) y la hebra no biotinilada se purifica por desnaturalizacion en NaOH 0,15 M. La hebra eluida se usa entonces para la replicacion de ADN mediada por megacebador sobre ADNmc. Las regiones VH de anticuerpos conductores aisladas mediante inmunopurificacion de la biblioteca de novo de Fab se subclonaron en vectores de bucle de VL. Estos vectores de bucle de VH/VL seleccionados se prepararon en ADNmc para la mutagenesis por hibridacion con los megacebadores de bibliotecas de VL. La eliminacion de ADN parental, como se indica por la perdida del palfndromo que contiene Xbal, se determino del 100 % por secuencia de muestra de clones de bibliotecas aleatoriamente seleccionados. La mutagenesis de las tres cDr con una biblioteca de variantes fue del 75 %. Este metodo permitio la creacion altamente eficaz de una biblioteca de 4 x 108 variantes. Los presentes inventores han observado resultados similares para la creacion de bibliotecas en las otras 3 cadenas VL-k usadas en la biblioteca de novo de Fab. Las bibliotecas se transformaron a 2 x 108 y el fago se preparo a 1011 ufc/ml. Se inmunopurifico BSA con la biblioteca de novo de pIX y se aislaron exitos (Tabla 3). Se construyeron dos bibliotecas de LC sobre exitos primarios contra BSA usando los metodos descritos anteriormente. Las bibliotecas consistieron en HC de F4 con diversidad en LC de A27 y un conjunto de HC D6, F6, C2, C6 con diversidad de LC de B3.

Tabla 3. Ejemplos de BSA

imagen1

Se realizaron tres rondas de inmunopurificacion con 10 nM, 1 nM y 1 nM de antfgeno, respectivamente, usando tanto condiciones de lavado no rigurosas como rigurosas. Se realizo la secuenciacion de clones positivos para antfgeno y se purificaron clones seleccionados para obtener datos de afinidad. Para la biblioteca de B3 inmunopurificada con condiciones menos rigurosas, la mayorfa de los clones enriquecidos fueron no mutantes. De aquellos clones que no fueron no mutantes, ninguno mostro enriquecimiento, y los datos de Biacore confirmaron que no tenfan mejora en la afinidad. Cuando las condiciones de inmunopurificacion mas rigurosas se aplicaron a esta misma biblioteca se observo enriquecimiento de clones con mutaciones en CDR1 de LC y analisis de Biacore posteriores mostraron una mejora en la afinidad de aproximadamente 3 veces (Tabla 4). Todos los clones aislados de esta biblioteca contuvieron la cadena pesada D6, que tuvo la mayor afinidad por BSA con respecto a las otras cadenas pesadas. Para la biblioteca A27, ni el metodo de inmunopurificacion dio enriquecimiento clonal ni la recuperacion de no mutante. Aunque no se observo enriquecimiento de clones individuales, se observo el enriquecimiento en aminoacido o caracterfsticas de aminoacido en posiciones de CDR particulares. Los clones seleccionados

Table A: Inr’uncpuriFkaciifi rigurnaa de la biblin-twa B3

demostraron una mejora de la afinidad de hasta 10 veces en comparacion con la parental (Tablas 5 y datos no mostrados).

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Ejemplo 8. Inmunopurificacion de bibliotecas paralela

Como la biblioteca de los presentes inventores se disena y construye de tal forma que cada sub-biblioteca pueda usarse individualmente basandose en el andamiaje HC o LC usado, los presentes inventores disenaron una estrategia de inmunopurificacion paralela para inmunopurificar un conjunto de bibliotecas individuales, ademas de sub-reunidas, para maximizar la probabilidad de identificar diversos anticuerpos de union.

Se eligieron BSA y Lysozyme como antfgenos modelo para la validacion inicial de bibliotecas. Los presentes inventores reunieron sub-bibliotecas de la region estructural 1-69 y 3-23 HC en 4 sub-conjuntos manteniendo la region estructural LC separada para la inmunopurificacion paralela usando Kingfisher ( ). Como comparacion, los presentes inventores tambien reunieron completamente todas las sub-bibliotecas 1-69 y 3-23 HC y asociaron LC en un conjunto y lo usaron para inmunopurificar contra BSA. Las perlas paramagneticas recubiertas con antfgenos biotinilados (Dyal) se incubaron con fago durante 1 h a TA. Se realizaron la union y lavados en formato de alto rendimiento en un bloque de 96 pocillos. Despues de varias etapas de lavado, los fagos unidos se eluyeron y se amplificaron infectando celulas MC1061F' para la siguiente ronda de seleccion (Ejemplo 2 para detalles). Despues de las rondas de seleccion, se aislo ADN, se elimino pIX por digestion con restriccion y se ligo y transformo en MC1061F' para expresar Fab solubles. Se probaron clones individuales aislados para la expresion de Fab y union al antfgeno por ELISA. La expresion de Fab se detecto incubando extracto de celulas que contenfan Fab sobre placa de ELISA recubierta con anti-Fd, seguido de HRP conjugado con anti-kappa. La especificidad por antfgenos se probo capturando antfgenos biotinilados sobre placas recubiertas con estreptavidina con la posterior adicion de lisados celulares que contenfan Fab. Para ELISA competitivo se incluyeron antfgenos no biotinilados en cantidad en exceso para competir por la union a Fab. Se detecto Fab unido usando HRP conjugado con anti-kappa.

Los resultados de inmunopurificacion paralela mostraron 30 de los 90 clones cribados unidos a BSA, que representa el 33 % de la tasa de exitos en este experimento. La tasa de exitos es muy superior a una tasa de exitos del 7 % cuando la inmunopurificacion se completo usando una biblioteca reunida completa (Tabla 6). Aunque no hay comparacion directa de dos estrategias de inmunopurificacion para Lysozyme, donde solo se realizo una inmunopurificacion de bibliotecas completamente reunidas, la tasa de exitos representa el 4 %. (Tabla 6). En la Figura 11 se muestra que el analisis de secuencias identifico 6 anticuerpos unicos para BSA y 3 para Lysozyme.

Los ligantes de BSA y Lysozyme unicos se purificaron para determinar la afinidad de union (KD). Se uso un procedimiento de purificacion de Fab de dos etapas (REStm334bw.doc) para purificar los Fab. Brevemente, el lisado de E. coli se sometio primero a un procedimiento de IMAC de una unica etapa. Despues de la dialisis, el eluato de la columna de IMAC se sometio a una segunda etapa de purificacion, intercambio anionico usando resina QFF Sepharose, que mejoro la pureza del Fab a -80-90 %. La Figura 12 muestra Fab para BSA y Lysozyme purificados.

Se uso analisis BIAcore para determinar la afinidad de los seis ligantes de BSA y tres de Lysozyme. Los resultados mostraron afinidades de union de los Fab que oscilaron entre 0,1 y 28 nM para ligantes de BSA y 6-260 nM para los ligantes Lysozyme, respectivamente. No se detecto union no especffica de cualquier grupo de Fab a BSA, Lysozyme o la superficie de referencia (matriz de CM5 vacfa, activada y bloqueada). La Tabla 7 y 8 muestran la union cinetica de los ligantes BSA y Lysozyme.

Ejemplo 9. Clasificacion por afinidad

Para clasificar el orden de los Fab por la constante de disociacion de la union Kdis, se midieron sobrenadantes de E. coli en bruto que usa el sistema Octet (por ejemplo, como se describe en las paginas web publicas, tales como forteo.com). La sonda sensor SA se recubrio con antfgeno biotinilado de prueba. Los cultivos de induccion de E. coli durante la noche se lisaron con un tampon 2x BBS/Lysozyme y se dispusieron en 96 pocillos de ensayo. Las puntas de sensor calibradas se sumergieron en los pocillos de ensayo que contenfan el lisado de E. coli para medir la asociacion de la union. La punta de union se coloco entonces por transferencia en tampon solo para medir la disociacion de la union. La cinetica de union se analizo usando el software del fabricante. Para referencia, la Tabla 6 compara los resultados de clasificacion derivados de Octet y BIAcore con 3 muestras de Fab diferentes para el mismo antfgeno. Tambien se evaluo la union cinetica usando un instrumento BIND (por ejemplo, por sistemas srubio), los lisados celulares que expresan Fab se filtraron primero para eliminar celulas no lisadas, grandes residuos de celulas, lfpidos y acidos nucleicos cizallados. Se calibraron las placas del sensor recubiertas de estreptavidina y se incubaron con antfgeno biotinilado. Los pocillos se leyeron durante 2 minutos a intervalos de 30 segundos y se lavaron 3x con 100 pl/pocillo de 1xPBS. Entonces se anadieron los lisados de Fab tratados con filtro a los pocillos de ensayo para permitir la union al antfgeno presentado sobre la superficie de la placa del sensor con estreptavidina. Se vaciaron los pocillos y se anadieron 200 pl de 1xPBS. Se midio la senal de union al antfgeno biotinilado de 2 a 5 minutos a intervalos de 30 s. La constante Kdis se obtiene ajustando los datos de disociacion para multiples cantidades conocidas de antfgeno unido a la superficie del sensor. Aunque no pudieron obtenerse las constantes de asociacion, las constantes de disociacion, que son independientes de la concentracion de Fab, fueron comparables a los resultados de Biacore.

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Formatos de ensayo alternatives a los descritos anteriormente son para presentar los Fab por anti-F(ab')2, anti-Fd, o anti-HIS o anti-FLAG segun convenga para las marcas incluidas sobre la protefna Fab. El anticuerpo puede conjugarse con una superficie reactiva con amina de la placa del sensor. Los lisados de E. coli filtrados o fracciones periplasmicas que contienen protefna Fab se capturan por anti-F(ab')2 conjugado sobre la placa del sensor. Despues de la incubacion con antfgeno, la cinetica de union puede medirse como se ha descrito anteriormente.

Se desarrollaron dos metodos para medir las constantes de disociacion de la union (Kdis) usando sobrenadantes de E. coli en bruto. Uno es un metodo basado en ELISA que usa sobrenadante de medio de E. coli en bruto y el otro es el sistema Octet (pagina web Fortebio), que es un instrumento de mesa capaz de medir la cinetica de union de multiples muestras de una vez. Para un ELISA de clasificacion por afinidad, se cuantifico la cantidad de Fab generada por micro-expresion (500 ul). Un ELISA de expresion de Fab muestra la cantidad de protefna Fab en la fraccion de lisado celular y la fraccion de medio gastada. Como ambas fracciones tienen cantidades similares de protefna Fab y el lisado celular es mas laborioso de generar, se eligio la fraccion de medio gastada para su uso en el ELISA de clasificacion. Se usaron tres antfgenos para establecer el metodo de clasificacion de ELISA. Son ST2L de raton, resistina humana y MCP-5 de raton. Se usaron Fab unicos de secuencia para probar su capacidad para unirse a su antfgeno respectivo. Se aplicaron diluciones multiples de los medios gastados que contenfan Fab expresado para cada muestra a cada ELISA. Cada dilucion de Fab se dividio en dos, una alfcuota para unirse al antfgeno y la otra alfcuota para medir la cantidad relativa de protefna Fab contenida en cada muestra diluida. Se calcularon los resultados de la union del antfgeno y los ELISA de expresion para establecer una relacion de actividad especffica para cada punto de dilucion. El representar la relacion de actividad especffica con el clon correspondiente proporciona una vision global de todas las muestras de Fab. A partir de esta vision puede determinarse que dilucion se encuentra en un punto lineal de la curva y captura los candidatos de Fab mas probables para la clasificacion. Se probaron cincuenta y tres muestras de mST2L a diluciones 1:2 y 1:4.

Se uso la dilucion 1:4 para determinar la clasificacion de estos Fab debido a que parecio estar en el sector lineal de la curva de dilucion. Se hizo la clasificacion de ocho Fab mMCP-5 usando un intervalo de dilucion mas amplio, 1:2 y 1:10. El intervalo de dilucion usado aquf estuvo fuera del intervalo lineal de la curva de union. Se diluyeron ochenta Fab resistina a 1:2, 1:4, y 1:8, para determinar si tres diluciones establecerfan mejor un intervalo lineal. Solo un subconjunto de estos Fab tuvo un comportamiento de actividad:concentracion lineal en este intervalo de dilucion. Los Fab resistina se expresaron de nuevo y los sobrenadantes gastados se diluyeron 1:5, 1:10 y 1:20. Las diluciones 1:5 y 1:10 no tuvieron muestras dentro de la curva de valoracion lineal, pero 1:20 estuvo dentro del intervalo lineal. Las relaciones de actividad especffica se calcularon para todas las muestras y se establecio un orden de clasificacion (Tablas 9A, B y C). Las mediciones de afinidad sobre Biacore mostraron muy poca diferencia entre algunos de los Fab mST2L en cuanto a su cinetica de union, mientras que los datos del ELISA de clasificacion mostraron poca diferencia (Tabla 9A). El desacuerdo en la clasificacion de Fab 28 entre los resultados de ELISA y de Biacore podrfa ser debido a los formatos que se usaron para la orientacion del antfgeno. El ELISA tuvo el antfgeno en disolucion mientras que el formato de Biacore tuvo el antfgeno presentado sobre la superficie. Fab 40 en los resultados de Biacore muestra una rapida constante de asociacion (ka) dando la peor KD global. Esto puede ser debido a una imprecisa concentracion de protefna. Los Fab mMCP-5 muestran buena correlacion en la clasificacion entre los resultados de ELISA y de Biacore. Los Fab S10, S14 y S30 fueron los ligantes clasificados mas bajos y los Fab P9, P12, P20 y S1 fueron los ligantes mejor clasificados en ambos ensayos (Tabla 9B). Aun cuando Fab P1 fue un buen ligante en el ensayo de clasificacion de ELISA, tambien mostro una senal reducida a la dilucion 1:10 y fue un ligante mediocre en Biacore.

Los Fab resistina muestran correlacion entre las clasificaciones de ELISA y de Biacore (Tabla 9C). El clon 551-22 es el mejor y el clon 169-7 es el peor en las clasificaciones de ELISA y Biacore. Ademas, 323-7 y 323-32 son las siguientes mejores clasificaciones al clon 551-22 en tanto las clasificaciones de ELISA como de Biacore.

Tabla 9A. Diagrama de comparacion de Fab mST2L con resultados de Biacore

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Ranking ELISA SAri’6n1:4-diln It, * h-Ib-1 10"* *1 Kn In MI

IB

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»

1 220 1.47 0.31 4.3

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4 4 2.12 o.a 3.1

40

2 94 0.57 5.27 9.2

49

2 71 1.44 3.8 2.B

5

10

15

20

25

30

35

Tabla 9B. Diagrama de comparacion de Fab mMCP-5 con resultados de Biacore

Fab

Ranking ELISA SAr= icn 1: s tli In Jfj* 10= ITV1 s'1 K0(nM)

PI

2 111 7.7 2.009 2.5

Pfl

1 138 23.7 0.42 DL2

P12

2 105 74.7 2.31 0.33

P20

1 151 11.23 0.32 0.55

SI

3 91 23.2 1.71 d.D

510

6 ID 25 15.a Due

S14

5 3D 4.3 4 a

SI 7

nd nd 33.1 JM 2.5

524

nd nd 12.5 1.33 1.5

530

4 49 93 13 1.4

Tabla 9C. Diagrama de comparacion de Fab resistina con resultados de Biacore

EjemplD Fab

Ranking ELISA SAraicn 1:3 diln A,* 101 M-1,-1 10-la-' o(n»)

3

i A A.Q6 ,D7 .5

7

5 5 1.39 41 .B

No Union pobre

2

union o union

5

2 13 11.4 .5 .5

S

2 11 5.4 .4 .7

A

3 A 12.3 .99 .a

5

1 25 34.3 .0 .2

5

3 5 14.3 .33 .6

Los datos de clasificacion de ELISA se correlacionaron mejor con los valores de disociacion estimados a partir del analisis de interaccion Biacore, excepto por algunas excepciones. El metodo de clasificacion basado en ELISA optimizado soporta el apropiado cribado y gestion de grandes numeros de candidatos de Fab. Usando el instrumento Octet, se desarrollaron dos formatos para clasificar candidatos de Fab por actividad de union cinetica. El formato de disolucion se realiza con el Fab aplicado a la superficie del sensor de punta y el Ag esta presente en disolucion. Las velocidades de asociacion se calculan cuando el Ag esta uniendose al Fab mediante la medicion de biomasa anadida a la superficie del sensor durante un periodo de tiempo. Las velocidades de disociacion se calculan cuando el sensor se coloca en un tampon (es decir, IxPBS) despues de que el Ag se una al Fab, produciendo una disminucion en la biomasa sobre el sensor con el tiempo. En el ensayo de union cinetico inmovilizado, el antfgeno se aplica a la superficie del sensor de punta y el Fab esta presente en disolucion. Las velocidades de asociacion y de disociacion se determinan por el Fab que aumenta y luego que disminuye la biomasa sobre la punta con el tiempo.

El protocolo basico para las puntas de sensor reactivas con amina empieza estableciendo un nivel de referencia inicial, seguido de la etapa de activacion en la que la primera molecula (es decir, rgt secundario, Fab, o Ag) se aplica al sensor de punta. Se realiza una etapa de extincion despues de unirse la primera molecula al sensor de punta y se establece otro nivel de referencia antes de permitir que se produzca una interaccion por union con otra molecula. A continuacion se realiza tanto una etapa de carga (es decir, anadir un Fab o Ag a un sensor de punta recubierto con reactivo secundario) como de asociacion (es decir, sensor recubierto de Fab o Ag). Si esto es una etapa de carga, entonces se establece otro nivel de referencia antes de hacerse una etapa de asociacion. Una vez se completa una etapa de asociacion, se realiza una etapa de disociacion y se completa el experimento. El ensayo de union cinetico en disolucion usa puntas de sensor recubiertas con SA de alta union. Se prepara una placa de 96 pocillos de muestra (cat n° 675076, Greiner Bio-One) del siguiente modo: la columna 1 se llena con 100 ul de IxPBS hasta el nivel de referencia de los sensores de la punta, la columna 2 se llena con Bt-anti-F(Ab)'2 humano (cat n° 109-066097, Jackson Immunological) a una concentracion de 10 ug/ml en 1xPBS para cargar la superficie de la punta de sensor recubierta de SA, la columna 3 se llena con 100 ul de 1xPBS para el segundo nivel de referencia, la columna 4 se llena con 100 ul de 10 ug/ml de muestras Fab en 1xPBS para la segunda etapa de carga, la columna 5 se llena con 100 ug/ml de 1xPBS para el tercer nivel de referencia, la columna 6 se llena con 10 ug/ml de Ag en 1xPBS para la etapa de asociacion, y los pocillos de la columna 6 contienen 1xPBS para la etapa de disociacion. Se establece el protocolo cinetico para cada etapa para ejecutar a 30 °C y se agita a 1000 rpm. El primer nivel de referencia se realiza durante 100 segundos. La primera etapa de carga (anti-F(Ab)'2 humano) se ejecuta durante 600 segundos. El segundo nivel de referencia se ejecuta durante 200 segundos. La segunda etapa de carga (candidatos a Fab) se ejecuta durante 600 o 900 segundos. El tercer nivel de referencia se ejecuta durante no mas de 300 segundos. La etapa de asociacion (Ag) se ejecuta durante 600 segundos y la etapa de disociacion se ejecuta durante hasta 900

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segundos. El ensayo de union cinetico inmovilizado usa puntas de sensor reactivas con amina. La caja de sensor de punta se incuba primero en disolucion de MES a pH apropiado (kit de acoplamiento de amina, Fortebio) a TA durante 10 minutos. Se prepara una placa de 96 pocillos de muestra (cat n° 675076, Greiner Bio-One) del siguiente modo: la columna 1 se llena con la disolucion de MES a pH apropiado hasta el nivel de referencia de los sensores de punta, la columna 2 se llena con una relacion 1:50 de EDC/NHS (kit de acoplamiento de amina, Fortebio) en la disolucion de MES a pH del nivel de referencia para activar la superficie de sensor, la columna 3 se llena con 10 ug/ml de Ag en la disolucion de MES a pH para cargar la punta del sensor, la columna 4 se llena con disolucion de etanolamina (kit de acoplamiento de amina, Fortebio) para extinguir la superficie no ocupada del sensor cargado con Ag, la columna 5 se llena con 100 ul de 1xPBS para el segundo nivel de referencia, la columna 6 se llena con 10 ug/ml de muestra de Fab en 1xPBS para la etapa de asociacion, los pocillos de la columna 7 se llenan con 1xPBS para la etapa de disociacion. Se establece el protocolo cinetico para cada etapa para ejecutar a 30 °C y se agita a 1000 rpm. El primer nivel de referencia se ejecuta durante 100 segundos. La etapa de activacion se ejecuta durante hasta 900 segundos. La etapa de carga de Ag se ejecuta durante 600 segundos. La etapa de extincion se ejecuta durante hasta 300 segundos. El segundo nivel de referencia se ejecuta durante hasta 300 segundos. La etapa de asociacion (Ag) se ejecuta durante 600 segundos y la etapa de disociacion se ejecuta durante hasta 900 segundos. Se realizo el ensayo cinetico en disolucion contra antfgenos de 3 tamanos diferentes. Esta variable adicional (tamano de antfgeno) se uso para ganar entendimiento sobre como las diferentes construcciones de biomasa afectarfan los resultados calculados finales para la clasificacion de candidatos para Fab. Los presentes inventores encontraron que el mayor tamano del antfgeno dio mejor senal (eje y) y valor de R2 (Tabla 13A-C). La amina que acopla los Fab directamente al sensor podrfa ayudar a aumentar la senal de asociacion en el ensayo cinetico en disolucion debido a la eliminacion de la molecula de 1009 kDa, anti-F(Ab)'2, de la superficie del sensor, aumentando, por tanto, la capacidad de ver el efecto de la adicion de la masa de la ultima molecula. Octet puede mostrar diferencias entre los Fab segun sus curvas de senales de asociacion y disociacion y se correlacionan con las constantes de velocidad calculadas. Los Fab mST2L 16, 26, y 28 tienen mejores velocidades de union que los Fab 1 y 38 (Figura 13a). Los Fab resistina 323-11 y 551-7 son los mejores y los Fab 169-1 y 551-38 son los peores ligantes (Figura 13b). Con los Fab mMCP-5 no puede distinguirse en este formato la clasificacion para la union a Ag, excepto que Fab 14 es el peor (Figura 13c). Como se ha tratado previamente, este formado para medir mMCP-5 puede no ser el mejor. El tamano de mMCP-5 es considerablemente mas pequeno que un Fab, 9 kDa frente a 50 kDa, mas la punta que esta recubierta con un reactivo secundario de 100 kDa empeorara incluso el ser capaz de medir una diferencia de senal.

El formato de ensayo inmovilizado proporciona otro medio para evaluar la cinetica de union al Fab. Cuando el Ag es mas pequeno, por ejemplo, mMCP-5, que el Fab como se observa en la Figura 13C del ensayo en el formato de disolucion, la senal es reducida. El intentar leer una protefna pequena encima de una gran masa ya establecida sobre el sensor tiene un efecto pequeno. Girando los componentes de union alrededor de donde la molecula mas pequena, mMCP-5, esta sobre el sensor y entonces leyendo la actividad de union de la molecula mayor, por ejemplo un Fab, debe producirse una senal mas significativa. Este efecto se observa en la Figura 14, en la que mMCP-5 acopla la amina a la superficie del sensor y la asociacion se mide cuando se anade el Fab. El aumento de senal en este formato de ensayo es al menos dos veces superior al observado en el formato de disolucion. Adicionalmente, los valores de R2 de asociacion son ahora superiores a 0,85, mientras que estuvieron promediando 0,57 en el formato de disolucion (Tabla 14).

Biacore es actualmente el estandar para determinar la cinetica de union. Los presentes inventores compararon los datos de Octet para los Fab anteriormente mencionados con los datos de Biacore. Parece haber una diferencia en la sensibilidad entre Biacore y Octet (Figura 15). La constante de afinidad, KD, para Biacore es generalmente superior a la constante de afinidad de Octet. En los experimentos de Octet, el analito se uso a una concentracion de 10 ug/ml y 1 ug/ml con Biacore. El usar diez veces el analito para Octet puede hacer que la constante de la velocidad de asociacion parezca mas rapida. Por tanto, la constante de la velocidad de disociacion puede afectarse indirectamente debido al analito en exceso que compite en el ensayo. En combinacion, esto hace que las constantes de afinidad parezcan peor para Octet en comparacion con Biacore. Aunque no se ha demostrado directamente, esta cuestion de sensibilidad tambien puede tener un efecto sobre la clasificacion. En cuanto a la clasificacion, los Fab resistina mostraron alguna correlacion entre Biacore y Octet. La unica diferencia entre la resistina y los otros ejemplos de Ag fue la diferencia en el tamano de molecula entre Fab y Ag. Los Fab tienen 50 kDa y la resistina tiene 66 kDa, haciendolas mas proximas en tamano, mientras que mST2L a 100 kDa y mMCP-5 a 9 kDa son de tamano diferente.

Tambien se midio la cinetica de union usando BIND (
www.srubiosvstems.com). otro instrumento de mesa, que puede medir 96 muestras de una vez. Se filtraron primero los lisados celulares que expresan Fab para eliminar celulas no lisadas, grandes residuos de celulas, lfpidos y acidos nucleicos cizallados. Se calibraron las placas del sensor recubiertas con estreptavidina y se incubaron con antfgeno biotinilado. Los pocillos se leyeron durante 2 minutos a intervalos de 30 segundos y se lavaron 3x con 100 □l/pocillo de 1xPBS. A continuacion se anadieron los lisados de Fab tratados con filtro a los pocillos de ensayo para permitir la union al antfgeno presentado sobre la superficie de la placa del sensor con estreptavidina. Los pocillos se vaciaron y se anadieron 200 □l de 1xPBS. Las senales para unirse al antfgeno biotinilado se midieron durante 2-5 minutos a intervalos de 30 segundos. Un software SRU-BIND resta la senal de tamano obtenida de los pocillos de referencia, en los que se anadieron los lisados celulares sin Fab. La Kdis se obtuvo ajustando los datos de disociacion a multiples antfgenos conocidos

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unidos a la superficie del sensor. Aunque las velocidades de asociacion son muy diffciles de obtener, las velocidades de disociacion, que son independientes de la concentracion de Fab, fueron comparables con los resultados de Biacore.

Hay varios formatos de ensayo alternativos a los descritos anteriormente. Por ejemplo, con el instrumento BIND, los Fab pueden capturarse por anti-F(ab')2, anti-Fd o anti-HIS o anti-FLAG inmovilizado sobre la placa del sensor segun convenga. Se dejan capturar los lisados de E. coli filtrados o fracciones periplasmicas que contienen protefna Fab por anti-F(ab')2 conjugado sobre la placa del sensor. Despues de la incubacion con antfgeno, la cinetica de union pueden medirse como se ha descrito anteriormente. Por tanto, los Fab purificados pueden conjugarse directamente con una superficie reactiva con amina de la placa del sensor y se usan en este formato para medir la union al antfgeno.

Tambien se midieron las cineticas de union usando BIND™ (sitio web de Srubiosystems), otro instrumento de mesa, que puede medir 96 muestras de una vez. Los lisados celulares que expresan Fab se expresan primero para eliminar celulas no lisadas, residuos de celulas grandes, lfpidos y acidos nucleicos cizallados. Se calibraron las placas del sensor recubiertas con estreptavidina y se incubaron con antfgeno biotinilado. Los pocillos se leyeron durante 2 minutos a intervalos de 30 segundos y se lavaron 3x con 100 pl/pocillo de IxPBS. A continuacion se anadieron los lisados de Fab tratados con filtro a los pocillos de ensayo para permitir la union al antfgeno presentado sobre la superficie de la placa del sensor con estreptavidina. Se vaciaron los pocillos y se anadieron 200 pl de IxPBS. Las senales para unirse al antfgeno biotinilado se midieron durante 2-5 minutos a intervalos de 30 segundos. Un software SRU-BIND ™ resta la senal de tamano obtenida de los pocillos de referencia, en los que se anadieron lisados celulares sin Fab. La Kdis se obtuvo ajustando los datos de disociacion a multiples antfgenos conocidos unidos a la superficie de sensor. Aunque las velocidades de asociacion son muy diffciles de obtener, las velocidades de disociacion, que son independientes de la concentracion de Fab, fueron comparables con los resultados de Biacore.

Hay varios formatos de ensayo alternativos a los descritos anteriormente. Por ejemplo, con el instrumento BIND, los Fab pueden capturarse por anti-F(ab')2, anti-Fd o anti-HIS o anti-FLAG inmovilizados sobre la placa del sensor segun convenga. Se dejan capturar los lisados de E. coli filtrados o fracciones periplasmicas que contienen protefna Fab por anti-F(ab')2 conjugado sobre la placa del sensor. Despues de la incubacion con antfgeno, la cinetica de union puede medirse como se ha descrito anteriormente. Por tanto, los Fab purificados pueden conjugarse directamente con una superficie reactiva con amina de la placa del sensor y usarse en este formato para medir la union al antfgeno.

Ventajas

La biblioteca de novo de Fab humanos descrita anteriormente es distinta de tales otras bibliotecas debido a que la presentacion es mediante la protefna pIX del fago M13. El uso de lfnea germinal humana representativa y secuencias de la estructura canonica como andamiajes de biblioteca y el diseno de secuencias de CDR que imitan la distribucion natural de aminoacidos en H-CDR3 hace la biblioteca exhaustiva en la cobertura del repertorio inmunitario humano. Este diseno de biblioteca aumenta la probabilidad del descubrimiento de anticuerpos para dirigir a antfgenos en comparacion con otras bibliotecas de novo informadas en la bibliograffa que se construyeron sobre un unico gen o consenso de genes de la lfnea germinal o un andamiaje de mAb maduros. Las sub-bibliotecas separadas, cada una compuesta de un unico andamiaje (par VH/VL) y/o longitudes de H-CDR3, acopladas con inmunopurificacion paralela de las bibliotecas maximiza la probabilidad de descubrimiento de anticuerpos de secuencia diversa para el antfgeno diana. Ademas, esto proporciona un mecanismo para el estudio detallado de la funcionalidad de cada par VH/VL y sus secuencias respectivas y estructura en la union anticuerpo/antfgeno. El proceso de maduracion por afinidad en lfnea integrada es un metodo eficaz para aislar anticuerpos de alta afinidad mientras que se mantiene la diversidad.

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1.2 k 10T 1.5 X UK 2.4 X 10» 9X 10»

Lambda

Position

Position 1b Position 2a2 Position 3L

31b

GATND 31a NS 31a GS 29 STNR

32

DG 32 YTA Sic ND

34

HN 34 SN 32 YLR 33 SN

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GSAD 50 DESR 50 ED

51

SN 51 ND 53 NK 52 NS

53

NHY 52 ND

53 KQ

39 GA

90 TA 92 TA

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SNRT1 93 SD 93 SG 93 SNTG

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SNRT1 SN 94 SGT

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SHN 95a SN 95a TN 95a ND

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GAV 95b AG 95b FLSPYHVAE

95c

SHPL 95c DHSGAFNL

96

DESIGNADO 93 DESIGNADO 96 DESIGNADO 96 DESIGNADO

DivETEidad

9.20 E+06 2.3QE+00 1.50E-I-D5 4.00E-Q4

Tabla 6. Resumen de los resultados de inmunopurificacion de BSA y Lysozyme

Total screened Bind to Ag

BSA

sub-piscina: indiv dual 4Lc

90 30(333fc)

BSA

Piscina com plata.

TEC 12(7li)

Lisoana

Piscina completa

1BD 7(4%)

Tabla 7: Actividad de Fab purificado y su Kd aparente de union a BSA (40 UR)

Fab

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4-3 (1) 11.3(1) 26 43

NE: sir union

Tabla 8: Actividad de Fab purificado y su Kd aparente de union a Lysozyme (10 UR)

Fab

M KAM-'a-1 M 1a-3 a-1 Kd (nM) FWFtU)

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2.21 (1) 2.33(1) 10 51

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Tabla 13A

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[ 1,'H-s] m

IB

2.65E-04 9.36E-06 9.&3E+M 2.93E-09 0.96902

2B

1.66E-M 1.27E-05 1.02E+H5 1.33E-09 0.95909

2E:

1.66E-04 1.65E-05 S.0BE-tB4 2.67E-09 0.96932

1

3.12E-M 4.12E-D5 1.0BE+M 2.«E-aa 0.96172

3B

2.15E-04 2.55E-D5 1.46E+M 1.47E-Q3 0.97907

Tabla 13B

Rastro ID

ErTDr kj kg Assoc R:

[1*1 [Ill'S] ]M]

109-3

5.-59E-03 5.24E-04 5.37E-H>5 1.06E-00 0.01771

109-7

8.47E-M 347E-05 1.93E-U35 4.39E-09 0.77090

[1*1 ErTorin k^ [1,1s] ]M] Assoc. R:

323-11

4.47E-04 2.37E-05 2.99E405 1.50E-09 0.79093

323-32

9.B9E-04 2.69E-05 3.07E405 3.22E-09 0.30572

551-7

1.16E-03 3.23E-05 OTE-H15 1.S7E-09 0.69029

551-22

S.39E-03 446E-04 3.79E-H15 6.13E-09 0.06241

551-36

6.29E-03 7.70E-04 1.59E-U15 3.97E-00 0.45525

Tabla 13C

Rasim ID

Error Kd Assoc R"

[1*1

[11s] |M]

PI

0.53E-D3 4.65E-04 2.40Ef B4 2.77E-07 0.73200

P9

3.31 E-03 1.19E-D3 2.1BE+M 1.51E-07 0.6116

FI 2

5.76E-03 7.73E-04 1.93EtD4 2.96E-07 0.57343

F2D

9.54E.-03 6.49E-04 2.21EtB4 4.32E-07 0.53307

SI

5.60E-D3 6.61E-04 2.07E+M 2.71E-07 0.56443

S14

1.01E-02 1.16E-D3 0.B3E4D3 1.66E-06 0.43719

S3D

7.66E-03 6.22E-04 1.13E-HH 6.77E-07 0.52733

La Tabla 13A-C muestra los datos cineticos en formato de disolucion de Octet. A) Fab, Fab 26, Fab 28, Fab 1, Fab 38 que se unen a ST2L de 100 kD se clasificaron usando Octet por las constantes de la velocidad de asociacion y disociacion. B) Fab 169-3, Fab 169-7, Fab 323-11, Fab 323-32, Fab 551-7, Fab 551-22 y Fab 551-38 que se unen a 5 resistina de 66 kDa se clasificaron usando Octet por las constantes de la velocidad de asociacion y disociacion. C) Fab P1, Fab P9, Fab P12, Fab P20, Fab S1, Fab S14 y Fab S30 que se unen a MCP-5 de 9 kDa se clasificaron usando Octet por las constantes de la velocidad de asociacion y disociacion.

FLastno 1D

«-[tW ErTDr kj It, [1Ms] K„ |H] Asso: R2

PI

1.87E-03 4.27E4J5 6.76E»04 2.76E-0B .95439

pg

2.69E-03 7.76E-05 l.NE+M S.93E-08 .97197

P12

6.97E-03 1J29E-Q4 1.HE+89 S.46E-06 .65772

P20

5.97E-03 1.Q4E4J4 2.39E*05 2.5OE-0S .66625

neg Fab

6.70E-03 2.49E-03 -2.36E4" - .65597

no Fab

3.86E-3' 2.33E-G3 - - .07006

Tabla 14: Datos cineticos en formato inmovilizado de Octet. Fab P1, Fab P9, Fab P12, Fab P20, Fab S1, Fab S14 y 5 Fab S30 que se unen a MCP-5 de 9 kDa se clasificaron usando Octet por las constantes de la velocidad de asociacion y disociacion.

Tabla 15A: mST2L

Biacore SA m uestra de Bt-Ag

Otteto solution

Ejempb Fab

(rtf*1 6,1103 HHs-i Jttf* 10-<5' Kp(nH)

2.41 7J 3 0.903 2.85 2.0

26

1469 6.31 4.3 1.02 1.86 1.6

Ejempb Fab

k, * 10! M-'s-' k,x 101 KD(nM)

28

2.12 ■J 0.31 0.508 1.86 3.6

Tabla 15B: Resistina

Biacore solution

Octeto solution

Ejempb Fab

(f,x10=H'is-1 jftf*ie-i&-i H0(nM) k, * IQ5 M-is-1 k„*104s-i D(nM)

169-3

8.06 2.07 2.5 5.37 50.9 0.6

169-7

1.39 041 2.6 1.93 647 .3

323-11

114 0.6 0.5 2.99 447 .5

323-32

5.4 04 0.7 3.07 3.89 .2

551-7

(11 0.99 0.6 6.97 11.6 .6

551-22

34.6 0.0 0.2 6.79 53.9 .1

551-36

14.6 2.33 1.6 1.59 62.9 9.7

Tabla 15C: mMCP-5

Biacore InmovilEado

Octet® InmovilEado

Fab sample

k,* lo'ir 1»1 k„*10-Js'1 KD(i*Hj fr,* 10J || V* Jt^llO^a1 KnlnM)

pi

7.7 2.009 2.6 0.67 1.67 27.6

P9

29.7 042 0J 0.36 2.69 09.3

P12

74.7 2.81 0.36 1.06 8.79 04.6

P2B

11.23 0.82 0.55 2.39 S.97 25

51

28.2 1.71 0.0 0.39 1.63 41.3

510

25 15.0 0.0 1.65 3.92 21.1

514

4.6 4 8 8.97 19.6 26.1

530

93 13 1.4 3.05 16.6 46.1

Tabla 15A-C: Diagramas de comparacion de las constantes de velocidad cinetica entre Biacore y Octet. Diagramas de arriba a abajo grupos de Fab mST2L, resistina y mMCP-5.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   1. Un vector de fago de acido nucleico recombinante manipulado por ingenierfa para expresar secuencias de aminoacidos de fragmentos fab de anticuerpos de fusion con pIX de presentacion en fago que se unen a ligandos biologicamente activos seleccionados, que comprende

   (i) a. una secuencia de acidos nucleicos que codifica el conductor de fago recombinante; operativamente enlazada a:

   b. una secuencia de acidos nucleicos que codifica marca recombinante, promotor o de seleccion; operativamente enlazada a:

   c. una secuencia de acidos nucleicos que codifica la lfnea germinal de la cadena pesada variable que se une selectivamente a dicho ligando biologicamente activo; operativamente enlazada a:

   d. una porcion de una secuencia de acidos nucleicos que codifica la lfnea germinal de la cadena pesada constante que se une selectivamente a dicho ligando biologicamente activo; operativamente enlazada a:

   e. una secuencia de acidos nucleicos que codifica conector peptfdico; operativamente enlazada a:

   f. una secuencia de acidos nucleicos que codifica pIX recombinante; y

   (ii) a. una secuencia de acidos nucleicos que codifica la lfnea germinal de la cadena ligera variable que se une selectivamente a dicho ligando biologicamente activo; operativamente enlazada a:

   b. una porcion de una secuencia de acidos nucleicos que codifica la lfnea germinal de la cadena ligera constante que se une selectivamente a dicho ligando biologicamente activo.
2. 2. Un vector de fago de acido nucleico manipulado por ingenierfa segun la reivindicacion 1;

   i) en el que dicha secuencia codificante de conductor de fago es una secuencia pelB,

   ii) en el que la secuencia de marca recombinante o de seleccion es una secuencia de marca FLAG,

   iii) en el que dicho promotor es un promotor inducible,

   iv) en el que dicho promotor inducible es un promotor lac, y/ o

   v) en el que dichos ligandos biologicamente activos median en al menos una actividad biologica in vivo.
3. 3. Una celula huesped bacteriana que comprende un vector de fago de acido nucleico manipulado por ingenierfa segun la reivindicacion 1.
4. 4. Una biblioteca de fagos de celulas huesped bacterianas que comprende una pluralidad de vectores de fago de acido nucleico manipulados por ingenierfa segun la reivindicacion 1.
5. 5. Una biblioteca de fagos segun la reivindicacion 4, en la que la variante de fragmento de anticuerpo fab

   biologicamente activa se expresa como una pluralidad de fragmentos de anticuerpos fab.
6. 6. Una biblioteca de fagos segun la reivindicacion 5, en la que dicha pluralidad es al menos una seleccionada de al

   menos 103, 104

   105, 106, 10', 10°, 109, 10IU, 10

   6

   '
7. -.9
8. -.10
9. -.11

   1012 o 1013 de dichas variantes.
10. 7. Una biblioteca de fagos segun la reivindicacion 5, en la que dichas variantes se generan usando un metodo de mutagenesis de Kunkel.

    °. Una biblioteca de fagos segun la reivindicacion 5, en la que dichas variantes comprenden una pluralidad de diversas variantes de la region determinante de la complementariedad (CDR) 3 de cadena pesada comprendidas en dichos fragmentos de anticuerpos fab, en la que opcionalmente dichas diversas variantes de CDR3 comprenden aproximadamente 109 a 1018 variaciones de secuencia.
11. 9. Una biblioteca de fagos segun la reivindicacion 5, en la que dichas variantes comprenden una pluralidad de diversas variantes de la region determinante de la complementariedad (CDR) 1 y 2 de cadena pesada comprendidas en dichos fragmentos de anticuerpos fab, en la que opcionalmente dichas diversas variantes CDR1 y 2 comprenden aproximadamente 102 a 105 variaciones de secuencia.
12. 10. Una biblioteca de fagos segun la reivindicacion 5, en la que dicha biblioteca de fagos comprende adicionalmente fragmentos de anticuerpos fab madurados por afinidad que tienen afinidad de union mejorada con respecto a versiones previas de dicha biblioteca de fagos.
13. 11. Una biblioteca de fagos segun la reivindicacion 10, en la que dichos fragmentos de anticuerpos fab se inmunopurifican para aumentar la afinidad o actividad biologica.
14. 12. Una biblioteca de fagos segun la reivindicacion 11, en la que dicha inmunopurificacion se realiza como parte del proceso de generacion de bibliotecas o en paralelo usando un subconjunto de dicha biblioteca de fagos.
15. 13. Un metodo de cribado de una biblioteca de fragmentos de anticuerpos en fago para fragmentos de anticuerpos fab que tienen una actividad biologica deseada, que comprende (a) expresar fragmentos de anticuerpos fab de una biblioteca de fagos segun la reivindicacion 9, y (b) seleccionar celulas bacterianas que expresan dichos fragmentos de anticuerpos fab que tienen dicha actividad biologica deseada.