CN114746119A - 抗-ceacam抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供的公开内容涉及结合CEACAM1以及任选的CEACAM5和/或CEACAM6的单特异性和多特异性抗体、以及制备和使用该抗体的方法。

Description

抗-CEACAM抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2019年9月27日提交的美国临时申请序列号62/907,224的优先权。上述申请中的公开内容全文以引用方式并入本文。
以电子方式提交的参考序列表
本申请包含序列表，该序列表作为ASCII格式的序列表经由EFS-Web以电子方式提交，文件名为“JBI6156WOPCT1_sequence_listing.txt”并且创建日期为2020年8月29日，并且大小为62kb。经由EFS-Web提交的该序列表是本说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。
技术领域
本文提供的公开内容涉及对CEACAM1以及任选的CEACAM5和/或CEACAM6特异性的抗体、以及制备和使用所述抗体的方法。
背景技术
免疫系统控制感染或肿瘤的能力常常被宿主设计用于保持免疫系统处于检查状态的机制破坏。这些免疫检查点即使在正常情况下也可能阻止免疫活化。由于许多免疫检查点已经演变以保护健康的组织和细胞，病原体和肿瘤已经适应了该能力，从而利用这些机制而使得它们得利。阻断这些免疫检查点已成为肿瘤学治疗的一种成功策略，并且已经促进了对可能帮助肿瘤避开免疫控制的免疫控制机制的更深理解。
靶向CTLA-4和PD-1的治疗通过阻断负责诱导肿瘤细胞死亡的T细胞上的受体来利用这一策略。表达PD-1和CTLA-4的配体的肿瘤不再能够抑制这些T细胞的免疫应答，并且然后被免疫应答清除。免疫检查点抑制的这种新机制已经导致疾病结果的显著改善，但仅适用于相对较小比例的患者。
CEACAM家族是Ig超级家族的高度保守的糖蛋白，其破坏免疫细胞的活化。典型家族成员CEACAM1在多种癌症类型中过表达，并且在免疫活化时由T细胞上调12。破坏CEACAM1信号传导可以增加T细胞的活性，释放它们以杀死肿瘤靶标。CEACAM家族成员的数目显示，它是免疫抑制进化上保守的机制，具有比PD-1或CTLA-4更广泛的影响。因此，与其他免疫检查点相比，可能更期望靶向CEACAM。
CEACAM1可以通过自身以及CEACAM家族的其他成员(如CEACAM5、CEACAM6和CEACAM8)来连接。仅靶向CEACAM1的当前技术只可以阻止过表达CEACAM1的肿瘤的T细胞破坏，但不足以使表达其他CEACAM家族成员的肿瘤暴露于免疫系统，可能导致较弱的免疫抑制阻断以及最终效力减弱的癌症治疗。
因此，需要开发靶向几个CEACAM家族成员的其他治疗剂。
发明内容
本发明提供与CEACAM1和/或CEACAM5和/或CEACAM6结合的抗体，从而改善T细胞介导的肿瘤生长控制。本发明的抗体结合被感染的细胞或肿瘤靶细胞，上述细胞否则将避免受到宿主免疫监视的清除。这些抗体还结合免疫细胞，例如在存在肿瘤或感染细胞的情况下活化的T细胞、NK细胞或巨噬细胞。此类结合通过CEACAM表达靶标阻止此类免疫细胞失活。
由于多个CEACAM家族成员可以顺式或反式连接并下调免疫应答，本发明的抗体结合并阻断多个CEACAM家族成员。由于CEACAM家族的演变已经导致冗余但遗传上和机制上类似的免疫控制分子，因此功能性治疗剂必须与这些多个分子交叉反应。这种多特异性方法可导致免疫抑制的更强力阻断以及比当前技术更广泛的与单个CEACAM家族成员结合的功能范围。
在一个实施方案中，本发明涉及一种分离的抗-CEACAM(癌胚抗原相关细胞粘附分子)抗体或其抗原结合片段，该分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:79的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:80的轻链可变区(VL)。
在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:81的VH和SEQ ID NO:82的VL。
在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，根据权利要求5所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:83的VH和SEQ ID NO:84的VL。
在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，根据权利要求7所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:85的VH和SEQ ID NO:86的VL。
在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，根据权利要求9所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:87的VH和SEQ ID NO:88的VL。
在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，根据权利要求11所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:89的VH和SEQ ID NO:90的VL。
在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，根据权利要求13所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:91的VH和SEQ ID NO:92的VL。
在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，根据权利要求15所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:93的VH和SEQ ID NO:94的VL。
在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，根据权利要求17所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:95的VH和SEQ ID NO:96的VL。
在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，根据权利要求19所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:97的VH和SEQ ID NO:98的VL。
在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，根据权利要求21所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:99的VH和SEQ ID NO:100的VL。
在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，根据权利要求23所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:101的VH和SEQ ID NO:102的VL。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段与参考抗体竞争结合至CEACAM1、以及任选的CEACAM5或CEACAM6，该参考抗体包含：
SEQ ID NO:79的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:80的轻链可变区(VL)；或者
SEQ ID NO:81的VH和SEQ ID NO:82的VL；
SEQ ID NO:83的VH和SEQ ID NO:84的VL；
SEQ ID NO:85的VH和SEQ ID NO:86的VL；
SEQ ID NO:87的VH和SEQ ID NO:88的VL；
SEQ ID NO:89的VH和SEQ ID NO:90的VL；
SEQ ID NO:91的VH和SEQ ID NO:92的VL；
SEQ ID NO:93的VH和SEQ ID NO:94的VL；
SEQ ID NO:95的VH和SEQ ID NO:96的VL；
SEQ ID NO:97的VH和SEQ ID NO:98的VL；
SEQ ID NO:99的VH和SEQ ID NO:100的VL；或者
SEQ ID NO:101的VH和SEQ ID NO:102的VL。
在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体是多特异性抗体。
在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体是双特异性抗体。
在另一个实施方案中，一种药物组合物包含抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段缀合至一个或多个异源分子。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码抗-CEACAM抗体或抗原结合片段的分离的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，并且包含编码选自由SEQ ID NO:79-102组成的组的多核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种载体，其包含多核苷酸，该多核苷酸包含编码选自由SEQ ID NO:79-102组成的组的序列的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及包含载体的宿主细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种制备抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在表达该抗体的条件下培养宿主细胞，并且回收由宿主细胞产生的抗体。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种治疗对其有需要的受治疗者的CEACAM阳性癌症的方法，该方法包括向受治疗者施用治疗有效量的分离的本发明抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物，用以治疗CEACAM阳性癌症。在另一个实施方案中，其中抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂组合施用的方法。在另一个实施方案中，该方法为第二治疗剂为外科手术、化学疗法、雄激素阻断疗法或放射疗法、或它们的任何组合。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的抗体的试剂盒。
附图说明
图1示出代表性的流式细胞术图；黑线显示CEACAM1在抗CD3活化的T细胞上的表达，灰线显示在活化之前在静息T细胞上的基线CEACAM表达。
图2示出CEACAM抗体与重组CEACAM1的结合。
图3示出代表性的流式细胞术图；黑线显示转染以过表达CEACAM1的HEK293T细胞，灰线显示未表达CEACAM1的亲本HEK293T细胞。
图4示出通过流式细胞术得到的抗-CEACAM1抗体对过表达CEACAM1的HEK293T细胞的结合曲线
图5a示出通过ELISA得到的抗-CEACAM1抗体对固定的重组CEACAM5的结合。
图5b示出通过ELISA得到的抗-CEACAM1抗体对固定的重组CEACAM6的结合。
图6a示出代表性的流式细胞术图；黑线显示过表达CEACAM5的HEK293T细胞，灰线显示未表达CEACAM5的细胞。
图6b示出代表性的流式细胞术图；黑线显示过表达CEACAM6的HEK293T细胞，灰线显示未表达CEACAM6的亲本HEK293T细胞。
图7a.示出抗-CEACAM1抗体对过表达CEACAM5的HEK293T细胞的结合。
图7b.示出抗-CEACAM1抗体对过表达CEACAM6的HEK293T细胞的结合。
图8示出通过抗-CD3抗体(深灰色)刺激时、或者通过抗-CD3抗体和抗-CEACAM抗体CCMB18的组合刺激时(黑色)、或者通过抗-CD3抗体和抗-CEACAM抗体CCMB61的组合刺激时(浅灰色)，PD-1阳性T细胞(CD4+或CD8+)的百分比。
图9示出通过抗-CD3抗体(深灰色)刺激时、或者通过抗-CD3抗体和抗-CEACAM抗体CCMB18的组合刺激时(黑色)、或者通过抗-CD3抗体和抗-CEACAM抗体CCMB61的组合刺激时(浅灰色)，细胞微量紫(Cell Trace Violet)-阴性T细胞(CD4+或CD8+)的百分比。
图10a示出在存在或不存在抗-CEACAM结合抗体(CCMB18或CCMB61)的情况下，用抗-CD3抗体刺激的T细胞的干扰素(IFN)γ的分泌。
图10b示出在存在或不存在抗-CEACAM结合抗体(CCMB18或CCMB61)的情况下，用抗-CD3抗体刺激的T细胞的肿瘤坏死因子(TNF)α的分泌。
具体实施方式
本说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。
结合形成本公开一部分的附图，并参考以下具体实施方式，可更容易地理解本发明所公开的主题。应当理解，本发明所公开的主题不限于本文所描述和/或示出的那些，并且本文所用的术语仅用于以举例方式描述具体实施方案，并不旨在限制受权利要求书保护的主题。
除非另外特别说明，否则关于可能的机制或作用模式或改善原因的任何描述仅旨在出于示例性目的，并且本发明所公开的主题不受任何此类建议的机制或作用模式或改善原因的正确或错误的约束。
当表示值的范围时，另一个实施方案包括从一个具体的值和/或到其他具体的值。另外，对范围中所述的值的引用包括该范围内的每一个值。所有范围均包括端值在内并且可组合。当前面使用“约”将值表示为近似值时，应当理解，该具体值构成了另一个实施方案。提及具体数值至少包括该具体值，除非上下文另有明确规定。
应当理解，本发明所公开的主题的某些特征为清楚起见在本文各单独实施方案的上下文中进行描述，但也可以组合形式提供在单个实施方案中。相反地，本文所公开的主题的各种特征为简明起见在单个实施方案的上下文中进行描述，也可分开地或以任何子组合形式提供。
定义
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。
与说明书的各方面相关的各种术语在说明书和权利要求书中通篇使用。除非另外指明，否则此类术语被赋予本领域的普通含义。其他具体定义的术语应按照与本文所提供的定义相符的方式理解。
当参考数值范围、截止值或特定值使用时，术语“约”用于指示所列举的值可与所列出的值相差多达10％。因此，术语“约”用于涵盖与指定值相差±10％或更小的变化、±5％或更小的变化、±1％或更小的变化、±0.5％或更小的变化、或者±0.1％或更小的变化。
“抗体”广义上是指并包括免疫球蛋白分子，具体包括单克隆抗体(包括鼠科动物单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体)，抗原结合片段，多特异性抗体(诸如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等)，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体、结构域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。“全长抗体”包含由二硫键互连的两条重链(HC)与两条轻链(LC)以及它们的多聚体(例如IgM)。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(由结构域CH1、铰链、CH2和CH3构成)构成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。VH区和VL区可进一步细分为超变区，该超变区称为互补决定区(CDR)并间插有框架区(FR)。各个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，并按以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
“互补决定区(CDR)”是结合抗原的抗体区域。CDR可使用各种描绘来定义，诸如Kabat(Wu等人，(1970)J Exp Med 132:211-50)(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1991)、Chothia(Chothia等人，(1987)J Mol Biol 196:901-17)、IMGT(Lefranc等人，(2003)Dev Comp Immunol 27:55-77)和AbM(Martin和Thornton(1996)，J Bmol Biol 263:800-15)。描述了各种描绘和可变区编号之间的对应关系(参见例如Lefranc等人，(2003)Dev Comp Immunol 27:55-77；Honegger和Pluckthun，(2001)JMol Biol，309:657-70；国际免疫遗传学(IMGT)数据库；Web资源，http://www_imgt_org)。可用程序(诸如UCL Business PLC的abYsis)可用于描绘CDR。除非说明书中另有明确地说明，否则如本文所用，术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括由任何上述方法(Kabat、Chothia、IMGT或AbM)定义的CDR。
免疫球蛋白可根据重链恒定结构域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基于其恒定域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。
“抗原结合片段”是指免疫球蛋白分子的结合抗原的部分。抗原结合片段可以是合成的、可酶促获得的或经遗传工程改造的多肽，并且含有VH、VL、VH和VL、Fab、F(ab')2、Fd和Fv片段、由一个VH结构域或一个VL结构域组成的结构域抗体(dAb)、鲨鱼可变IgNAR结构域、驼峰化VH结构域、由模拟抗体的CDR诸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3以及LCDR1、LCDR2和/或LCDR3的氨基酸残基组成的最小识别单元。VH和VL结构域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中在VH和VL结构域由单独的单链抗体构建体表达的情况下，VH/VL结构域可在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体；例如在国际专利公布WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804和WO1992/01047中有所描述。
抗体可变区由被三个“抗原结合位点”中断的“框架”区组成。使用不同术语来定义抗原结合位点：(i)三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)的互补决定区(CDR)是基于序列变异性(Wu和Kabat,J Exp Med 132:211-50,1970；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。(ii)三个在VH中(H1、H2、H3)且三个在VL中(L1、L2、L3)的“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域的在结构上高变的区域，如Chothia和Lesk所定义(Chothia和Lesk，Mol Biol 196:901-17,1987)。其他术语包括“IMGT-CDR”(Lefranc等，Dev Comparat Immunol 27:55-77,2003)和“特异性决定残基用途”(SDRU)(Almagro,Mol Recognit 17:132-43,2004)。国际免疫遗传学(IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。CDR、HV和IMGT描述之间的对应性在Lefranc等，Dev Comparat Immunol 27:55-77,2003中有所描述。
“抗体片段”是指免疫球蛋白分子的一部分，其保留重链抗原结合位点和/或轻链抗原结合位点，诸如重链互补决定区(HCDR)1、2和3，轻链互补决定区(LCDR)1、2和3，重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。抗体片段包括熟知的Fab、F(ab')2、Fd和Fv片段以及由一个VH域组成的域抗体(dAb)。VH和VL结构域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中在VH和VL结构域由单独的单链抗体构建体表达的情况下，VH/VL结构域在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体；例如在国际专利公布WO1998/44001、国际专利公布WO1988/01649；国际专利公布WO1994/13804；国际专利公布WO1992/01047中有所描述。
“单克隆抗体”是指从抗体分子的基本上同质群体中获得的抗体，即，除了可能熟知的改变(诸如从抗体重链移除C末端赖氨酸)或翻译后修饰(诸如氨基酸异构化或脱酰胺、甲硫氨酸氧化或天冬酰胺或谷氨酰胺脱酰胺)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体通常结合一个抗原表位。双特异性单克隆抗体结合两个不同的抗原表位。单克隆抗体可在抗体群内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的，诸如双特异性的、单价的、二价的或多价的。
“嵌合抗体”为其不同部分来源于不同的动物物种的分子，例如具有来源于鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些分子。具有基本上来自人抗体(称为受体抗体)的可变区框架残基以及基本上来自小鼠抗体(称为供体抗体)的互补决定区的抗体也称为人源化抗体。嵌合抗体主要用于减少应用中的免疫原性并且提高制备时的产率，例如，其中鼠mAb具有较高的杂交瘤产率，但具有较高的人免疫原性，使得人/鼠嵌合mAb得到使用。嵌合抗体及其制备方法是本领域已知的(例如PCT专利申请WO 86/01533、WO 97/02671和WO 90/07861，以及美国专利5,693,762、5,693,761和5,225,539)。另外，可以进行CDR移植以改变抗体分子的某些性质，包括亲和力或特异性。CDR移植的非限制性示例公开于美国专利5,225,539中。
“人源化抗体”是指其中至少一个CDR来源于非人物种并且至少一个框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架中可包含取代，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白种系基因序列的精确拷贝。
“人抗体”是指当施用于人受试者时被优化以具有最小限度的免疫应答的抗体。人抗体的可变区源自人免疫球蛋白序列。如果人抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也源自人免疫球蛋白序列。如果人抗体的可变区由使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系统获得，则该人抗体包含“源自”人起源序列的重链可变区和轻链可变区。此类示例性系统为在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带人免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠。由于用于获得人抗体和人免疫球蛋白基因座的系统之间的差异，体细胞突变的引入或有意将取代引入框架或CDR中或两者，因此“人抗体”与在人中表达的免疫球蛋白相比通常包含氨基酸差异。通常，“人抗体”的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些情况下，“人抗体”可包含由人框架序列分析得到的共有框架序列(例如Knappik等人，(2000)J Mol Biol 296:57-86中所述)；或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3(例如Shi等人，(2010)J Mol Biol 397:385-96和国际专利公开WO2009/085462中有所描述。
“双特异性”是指特异性结合两个不同抗原或同一抗原内的两个不同表位的抗体。双特异性抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca cynomolgus)(cynomolgus,cyno)或黑猩猩(Pantroglodytes))的相同抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个不同抗原之间所共享的表位。
“多特异性”是指特异性结合两个或更多个不同抗原或同一抗原内的两个或更多个不同表位的抗体。多特异性抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(cynomolgus,cyno)或黑猩猩的相同抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个不同抗原之间所共享的表位。
“表位”是指抗原的与抗体特异性结合的部分。表位通常由部分诸如氨基酸或多糖侧链的化学活性(诸如，极性、非极性或疏水性)表面基团组成，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸因蛋白质分子的折叠而在三维空间上靠近。
“有效量”是指在所需剂量和时间段有效实现期望结果的量。有效量可根据以下因素而变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体在个体中引发期望的应答的能力。有效量也是其中治疗剂的有益效应远远超过任何毒性或有害效应的量。
“分离的细胞或组织样本”是从受治疗者或个体的组织获得的细胞的集合。细胞或组织样本的来源可以是来自新鲜、冷冻和/或保存器官、组织样本、活检和/或抽吸物的固体组织；血液或任何血液成分，如血浆；体液，如脑脊髓液、羊水、腹膜液或间质液；来自受治疗者的妊娠期或发育的任何时间的细胞。细胞或组织样本也可以是原代或培养的细胞或细胞系。任选地，从疾病组织/器官获得组织样本或组织碎片。组织样本可以含有本质上不与组织天然混合的化合物，如防腐剂、抗凝血剂、缓冲液、固定剂、营养物质、抗生素等。
“分离的”是指已经与分子产生于其中的系统(例如重组细胞)中的其它组分基本上分离和/或从其中纯化出来的分子(诸如合成多核苷酸或蛋白质，如抗体)的同质群体，以及已经受至少一个纯化或分离步骤的蛋白质。“分离的抗体”是指基本上不含其他细胞材料和/或化学物质的抗体，并且涵盖分离至更高纯度，诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的抗体。
“重组体”是指当将来自不同来源的片段连接以产生重组DNA、抗体或蛋白质时，通过重组手段制备、表达、形成或分离的DNA、抗体和其他蛋白质。
如本文所用，“特异性结合”或“抗原特异性”或“对抗原靶具有特异性”或“与抗原具有免疫反应性”的抗体是指以比其他类似序列的抗原更大的亲和力结合抗原的本发明的抗体或多肽结合剂。在一个方面，本发明的多肽结合剂或其片段、变体或衍生物将以比与其他(即，非人类)物种的类似抗原的结合亲和力更大的亲和力与人抗原结合，但是识别和结合靶标的直系同源物的多肽结合剂在本发明的范围内。
“受治疗者”是指人和非人动物，包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物诸如非人灵长类动物、小鼠、兔、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在所述主题的许多实施方案中，受治疗者是人。
“治疗”(“treating”或“treatment”)是指在减轻或改善损伤、病变或病症方面取得的任何成功或成功迹象，包括任何客观或主观参数，诸如症状减轻、缓解、削弱或使患者更能耐受病症，减缓退变或衰退速率，使退变终点衰竭程度降低，改善受治疗者的身体或心理健康，或延长存活时间。可以通过客观或主观参数评估治疗，包括身体检查、神经检查或精神评估的结果。
“变体”是指因一处或多处修饰(例如，一个或多个置换、插入或缺失)而不同于参考多肽或参考多核苷酸的多肽或多核苷酸。
“载体”是指能够在生物系统内复制或可在这类系统之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有元件诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记物，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统，例如细胞、病毒、动物、植物、以及利用能够复制载体的生物组分的重组生物系统中的复制或保持。载体多核苷酸可为单链或双链DNA或RNA分子或这些分子的杂合分子。
“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中以指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽进行翻译的载体。
“多核苷酸”是指包含磷酸糖类主链共价连接的核苷酸链或其他等同共价化学物的合成分子。cDNA是示例性合成多核苷酸。
“多肽”或“蛋白质”是指包含由肽键连接以形成多肽的至少两个氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。
“CEACAM1”(癌胚抗原相关细胞粘附分子1)是指CEACAM1基因的蛋白产物，例如NP—001020083.1、NP—001703.2。全长人CEACAM1的氨基酸序列示出在SEQ ID NO:1中。CEACAM1的细胞外结构域示出在SEQ ID NO:2中并跨越全长CEACAM1的残基35-428。已知人的11种不同CEACAM1剪接变体。单个CEACAM1同工型对于细胞外免疫球蛋白样结构域的数量或膜锚固和/或它们的细胞质尾部的长度不同。所有变体(包括这些剪接变体)包含在术语“CEACAM1”内。
SEQ ID NO:1(全长人CEACAM1)：
MGHLSAPLHRVRVPWQGLLLTASLLTFWNPPTTAQLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGTQQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPETQDTTYLWWINNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSANRSDPVTLNVTYGPDTPTISPSDTYYRPGANLSLSCYAASNPPAQYSWLINGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCHANNSVTGCNRTTVKTIIVTELSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNLTCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNTTLSINPVKREDAGTYWCEVFNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENGLSPGAIAGIVIGVVALVALIAVALACFLHFGKTGRASDQRDLTEHKPSVSNHTQDHSNDPPNKMNEVTYSTLNFEAQQPTQPTSASPSLTATEIIYSEVKKQ
SEQ ID NO:2(人CEACAM1的细胞外结构域)：
QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGTQQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPETQDTTYLWWINNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSANRSDPVTLNVTYGPDTPTISPSDTYYRPGANLSLSCYAASNPPAQYSWLINGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCHANNSVTGCNRTTVKTIIVTELSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNLTCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNTTLSINPVKREDAGTYWCEVFNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENGLSPG
“抗-CEACAM1抗体”、“识别CEACAM1的抗体”、“抗CEACAM1的抗体”或“CEACAM1的抗体”是具有足够的亲和力和特异性的结合CEACAM1蛋白的抗体。通常，根据本教导内容的抗体能够以约10-8或10-9M或更高的最小亲和力结合CEACAM1。
“CEACAM5”(癌胚抗原相关细胞粘附分子5)是指CEACAM5基因的蛋白产物。全长人CEACAM5的氨基酸序列示出在SEQ ID NO:3中。迄今为止，已经描述了由选择性剪接产生的人的两种同工型。所有同工型(包括这些剪接变体)包含在术语“CEACAM5”内。
SEQ ID NO:3(全长人CEACAM5)：
MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAEPPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNKLSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALI
“CEACAM6”(癌胚抗原相关细胞粘附分子6)是指CEACAM6基因的蛋白产物。全长人CEACAM6的氨基酸序列示出在SEQ ID NO:4中。
SEQ ID NO:4(全长人CEACAM6)：
MGPPSAPPCRLHVPWKEVLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLAHNLPQNRIGYSWYKGERVDGNSLIVGYVIGTQQATPGPAYSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPEVQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNMTLTLLSVKRNDAGSYECEIQNPASANRSDPVTLNVLYGPDGPTISPSKANYRPGENLNLSCHAASNPPAQYSWFINGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTMITVSGSAPVLSAVATVGITIGVLARVALI
“抗-CEACAM抗体”是可以与至少CEACAM1、CEACAM5和CEACAM6蛋白以及任选的任何其他CEACAM家族蛋白结合的抗体。
“CD3”是指作为多分子T细胞受体(TCR)复合物的一部分在T细胞上表达并且由同源二聚体或异源二聚体组成的抗原，该同源二聚体或异源二聚体由两条或四条受体链：CD3ε、CD3δ、CD3ζ和CD3γ的缔合形成。人CD3ε包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。除非明确指明来自非人物种，否则本文对蛋白质、多肽和蛋白质片段的所有提及均旨在指相应蛋白质、多肽或蛋白质片段的人型式。因此，除非指明来自非人物种，例如“小鼠CD3”或“猴CD3”等，否则“CD3”意指人CD3。
SEQ ID NO:5(人CD3ε)：
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI
“双特异性抗CEACAM1/抗CD3抗体”、CEACAM1/CD3抗体、CEACAM1xCD3抗体等是指结合CEACAM1和CD3的抗体。
“双特异性抗-CEACAM/抗-CD3抗体”、CEACAM/CD3抗体、CEACAMxCD3抗体等是指能够结合CD3和至少CEACAM1、CEACAM5和CEACAM6蛋白以及任选的任何其他CEACAM家族蛋白的抗体。
“与……组合”意指将两种或更多种治疗剂以混合物一起、作为单一药剂同时或作为单一药剂以任何顺序依次施用给受治疗者。
“CEACAM阳性癌症”是指显示可测量水平的CEACAM1和/或CEACAM5和/或CEACAM6和/或任何其他CEACAM家族蛋白的癌症组织或癌细胞。蛋白质的水平可使用熟知的测定法，使用例如ELISA、免疫荧光法、流式细胞术或放射性免疫测定法，在活细胞或裂解细胞上测量。在一个实施方案中，CEACAM阳性癌症是指表现出可测量水平的CEACAM1的癌症组织或癌症细胞。在另一个实施方案中，CEACAM阳性癌症是指表现出可测量水平的CEACAM5的癌症组织或癌症细胞。在另一个实施方案中，CEACAM阳性癌症是指表现出可测量水平的CEACAM6的癌症组织或癌症细胞。
“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指在体内、离体或组织培养物中的癌性、癌前或转化的细胞，其具有自发或诱导的表型变化。这些变化未必涉及新遗传物质的摄取。虽然转化可由感染转化病毒以及结合新基因组核酸、或摄取外源核酸而发生，但是还可自发地发生或在暴露于致癌物之后发生，从而使内源基因突变。转化/癌症示例为合适的动物宿主(诸如裸小鼠等)中体外、体内和离体的形态变化、细胞永生、异常生长控制、病灶形成、增殖、恶性肿瘤、肿瘤特异性标记物水平调节、侵入、肿瘤生长(Freshney，Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique(第3版，1994年))。
“治疗”是指治疗性治疗以及预防性或防御性措施两者，其中目标是防止或减缓(减轻)不期望的生理变化或障碍。有益或期望的临床结果包括症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病的稳定(即，未恶化)状态、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(不论是部分缓解还是完全缓解)，不论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可意指与受试者未接受治疗时的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的个体包括已患有病症或障碍的个体以及易患病症或障碍的个体或者要预防病症或障碍的个体。
生成抗体
嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利4,816,567以及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个示例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(如猴)的可变区)和人恒定区。在另一示例中，嵌合抗体为其中类别或子类别已从亲本抗体的类别或子类别改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包含其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常将非人类抗体人源化以减少对人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般来说，人源化抗体包含其中HVR如CDR(或其部分)来源于非人抗体并且FR(或其部分)来源于人类抗体序列的一个或多个可变结构域。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，在人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如HVR残基来源于其的抗体)的相应残基取代，例如用于恢复或改进抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法评述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)，以及Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述用于FR改组的“定向选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等人，J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定子组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人，J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)，以及Rosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。人抗体可使用本领域已知的各种技术来制备。人抗体通常描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
人类抗体可通过将免疫原施用于转基因动物来制备，该转基因动物已经被修饰以产生完整人抗体或具有响应抗原攻击的人可变区的完整抗体。此类动物通常含有全部或一部分的人免疫球蛋白基因座，其替换内源性免疫球蛋白基因座，或者其存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已失活。从转基因动物获得人类抗体的方法的评述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述了XENOMOUSETM技术的美国专利6,075,181和6,150,584；描述
Figure BDA0003661755770000191
技术的美国专利5,770,429；描述K-M
Figure BDA0003661755770000193
技术的美国专利7,041,870、以及描述
Figure BDA0003661755770000192
技术的美国专利申请公布US 2007/0061900)。来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区可进行进一步修饰，例如通过与不同的人恒定区组合来修饰。
人类抗体也可通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于制备人单克隆抗体的人骨髓瘤和鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor，J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人，J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。另外的方法包括描述于例如美国专利7,189,826(描述来自杂交瘤细胞系的单克隆人IgM抗体的制备)和Ni，现代免疫学(XiandaiMianyixue),26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)，以及Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
人抗体也可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生。然后可将此类可变结构域序列与所需人类恒定结构域组合。从抗体库中选择人类抗体的技术在下文中描述。
文库来源的抗体
可以通过筛选具有期望的一种或多种活性的抗体的组合文库来分离本发明的抗体。例如，本领域中已知有多种方法用于产生噬菌体展示文库并针对具有期望结合特性的抗体筛选此类文库。此类方法在例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology178:1-37(O'Brien等人编辑，Human Press,Totowa,N.J.,2001)中进行了评述，并且进一步描述于例如McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature 352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury，Methods inMolecular Biology 248:161-175(Lo编辑，Human Press,Totowa,N.J.,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)单独克隆VH和VL基因的库，并且在噬菌体文库中随机重组，然后可以筛选抗原结合噬菌体，这在Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中有所描述。噬菌体通常显示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。来自免疫源的文库无需构建杂交瘤即可提供针对免疫原的高亲和力抗体。另选地，可以克隆原始库(例如，来自人的原始库)以在无任何免疫的情况下向广泛的非自体抗原以及自体抗原提供单一来源的抗体，如Griffiths等人，EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，也可以通过克隆来自干细胞的未重排V-基因片段并且使用含有随机序列的PCR引物来合成制备原始文库，用于编码高度可变的CDR3区并在体外完成重排，这在Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)中有所描述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开内容包括例如：美国专利5,750,373和美国专利公布2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
认为从人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文的人抗体或人抗体片段。
多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性中的一种针对CEACAM1，另一种针对任何其他抗原。在某些实施方案中，结合特异性中的一种针对CEACAM5，另一种针对任何其他抗原。在某些实施方案中，结合特异性中的一种针对CEACAM6，另一种针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合到CEACAM1或CEACAM5或CEACAM6的两个不同的表位。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位到表达CEACAM1或CEACAM5或CEACAM6的细胞。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段。
抗体变体
在某些实施方案中，设想本文所提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可期望改进抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。抗体的氨基酸序列变体可通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰来制备，或者通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入及取代的任何组合以得到最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
在某些实施方案中，本文所提供的抗体发生改变以提高或降低抗体糖基化的程度。抗体上的糖基化位点添加或缺失可以方便地通过改变氨基酸序列使得产生或移除一个或多个糖基化位点来实现。
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入到本文所提供的抗体的Fc区中，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，该人Fc区序列在一个或多个氨基酸位点处包含氨基酸修饰(例如取代)。
在某些实施方案中，本发明设想了具有一些但不是所有效应功能的抗体变体，这使其成为以下应用的期望候选抗体：其中抗体在体内的半衰期很重要但是某些效应功能(如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性分析，从而证实CDC和/或ADCC活性的减少/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合分析，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在造血细胞上的FcR表达综述于以下文献第464页的表3中：Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)。体外分析以评估所关注分子的ADCC活性的非限制性示例描述于美国专利5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))以及Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。另选地，可以采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,Calif.；以及CytoTox
Figure BDA0003661755770000221
非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，Wis.)。用于此类测定法的可用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。另选地或除此之外，可以在体内评估所关注分子的ADCC活性，例如在诸如以下文献所公开的动物模型中：Clynes等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)。还可进行C1q结合测定以证实抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S与M.J.Glennie，Blood 103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法进行(参见例如Petkova,S.B.等人，Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应功能的抗体包括取代Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的抗体(美国专利6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位点265、269、270、297和327的两个或多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其在残基265和297处被丙氨酸取代(美国专利7,332,581)。
描述了具有改进或减弱的FcR结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利6,737,056；WO 2004/056312，以及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改进ADCC的一个或多个氨基酸取代的Fc区，例如在Fc区的位点298、333和/或334处的取代(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，其导致改变的(即，改进的或减少的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利6,194,551、WO 99/51642，以及Idusogie等人，J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
具有增加的半衰期和改进的与新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体，该抗体负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)以及Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))，描述于US2005/0014934A1中(Hinton等人)。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，该取代改进Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在Fc区残基中的一者或多者处具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，在Fc区残基434处的取代(美国专利7,371,826)。
在某些实施方案中，可期望产生半胱氨酸工程化抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，被取代的残基存在于抗体的可及位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，由此将反应性硫醇基团定位在抗体的可及位点处，并且可用于将抗体与其他部分(如药物部分或接头-药物部分)缀合以产生免疫缀合物，如本文进一步所述。在某些实施方案中，以下任何一个或多个残基可被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化抗体可以如例如美国专利7,521,541所述来产生。
重组方法和组合物
可使用重组方法和组合物产生抗体，例如，如美国专利4,816,567所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗-CD122抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH(例如抗体的轻链和/或重链)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用以下进行转化)：(1)包含核酸的载体，该核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或者(2)包含核酸的第一载体，该核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，以及包含核酸的第二载体，该核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如YO、NSO、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了一种制备抗-CD122抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含编码该抗体的核酸的宿主细胞(如上文所提供)，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组制备抗-CD122抗体，例如如上所述将编码抗体的核酸分离并插入一个或多个载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合到编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核细胞或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中制备，尤其是当不需要糖基化和Fc效应功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利5,648,237、5,789,199和5,840,523。(也参见Charlton，Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo编辑，Humana Press,Totowa,N.J.,2003)，第245-254页，描述了大肠杆菌中的抗体片段的表达)在表达后，可以从可溶性级分中的细菌细胞浆料中分离抗体，并且可以进一步纯化。
除了原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母对于编码抗体的载体也是合适的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已经被“人源化”的真菌菌株和酵母菌株，从而产生具有部分或全部人糖基化模式的抗体。参见Gerngross，Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，以及Li等人，Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的适合的宿主细胞来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的示例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了多种可以与昆虫细胞结合使用的杆状病毒株，特别是用于转染的草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如美国专利5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其他示例是由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1细胞系；人胚胎肾细胞系(293或293细胞，如例如Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977)所述)；乳仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))中所述；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。有关适合抗体制备的某些哺乳动物宿主细胞系的评述，参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，HumanaPress,Totowa,N.J.)，第255-268页(2003)。
抗体的修饰
可对本发明的抗体进行本领域已知的一种或多种修饰，该修饰可用于操纵储存稳定性、药代动力学和/或肽的生物活性的任何方面，例如效力、选择性和药物相互作用。肽可以经受的化学修饰包括但不限于与以下中的一者或多者的肽的缀合：聚乙二醇(PEG)、单甲氧基聚乙二醇、葡聚糖、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇、多聚乙酰神经氨酸或其他碳水化合物基聚合物、氨基酸的聚合物和生物素衍生物。蛋白质在半胱氨酸残基处的PEG缀合公开于例如Goodson,R.J.&Katre,N.V.(1990)Bio/Technology 8,343以及Kogan,T.P.(1992)Synthetic Comm.22,2417。
其他可用的修饰包括但不限于酰化，其使用如美国专利6,251,856和WO 00/55119所述的方法和化合物。
治疗剂施用
本发明的抗体可单独施用或与其他药理学上具有活性的制剂组合施用。应当理解，此类组合疗法包括不同的治疗方案，包括但不限于以单一剂型或不同的单个剂型一起施用多种治疗剂。如果治疗剂以不同剂型存在，则施用可以同时或近乎同时进行，或者可以遵循包括施用不同治疗剂的任何预定方案。
例如，当用于治疗癌症时，本发明的抗体可以有利地以组合治疗方案的形式与一种或多种治疗剂(包括免疫治疗剂)一起施用。
施用方法
本发明的抗体可以作为药物组合物施用或通过基因疗法施用，该药物组合物包含本领域已知的用于递送蛋白质和肽的标准载体。优选地，药物组合物以混合物的形式包括药学上(即，生理学上)可接受的载体、赋形剂或稀释剂、以及靶向CEACAM1或CEACAM5或CEACAM6的一种或多种分子，作为活性成分。在一个实施方案中，CEACAM1靶向分子是与CEACAM1特异性结合的抗体。在一个实施方案中，CEACAM5靶向分子是与CEACAM5特异性结合的抗体。在一个实施方案中，CEACAM6靶向分子是与CEACAM6特异性结合的抗体。包含作为活性成分的肽的药物组合物的制备在本领域中是众所周知的。通常，以液体溶液或悬浮液的形式将此类组合物制成注射剂，然而，也可以制备适于在注射前在液体中制成溶液或悬浮液的固体形式。制剂还可以进行乳化。活性治疗成分常常与药学上(即，生理学上)可接受的且与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。另外，如果需要，组合物可以含有微量辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂，它们增强活性成分的效力。
CEACAM靶向分子可作为中和的生理上可接受的盐形式配制成药物组合物。在一个实施方案中，CEACAM靶向分子是与CEACAM特异性结合的抗体。合适的盐包括酸加成盐(即，与肽分子的游离氨基形成)并且用无机酸(例如，盐酸或磷酸)或者诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁，以及诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。
药物组合物可通过口服或肠胃外途径全身施用。非限制性肠胃外施用途径包括皮下、肌内、腹膜内、静脉内、透皮、吸入、鼻内、动脉内、鞘内、肠内、舌下或直肠。由于氨基酸序列的不稳定性，肠胃外施用是优选的。优选的施用模式包括用于鼻腔或支气管吸收的气溶胶；用于静脉内、肌内、胸骨内或皮下注射的悬浮液；以及用于口服施用的化合物。
例如，可以通过注射单位剂量来执行静脉内施用。当涉及本发明的药物组合物使用时，术语“单位剂量”是指适于人类的单一剂量的物理离散单元，每个单元含有预定量的活性物质，该活性物质经计算为与所需的稀释剂相结合产生期望的治疗效果；即，用于稀释浓缩物质或纯物质(液体或固体)、使得该物质可以正确(稀释)的浓度使用的液体。对于注射剂施用，组合物在无菌溶液或悬浮液中，或者可以在药学上和生理学上可接受的水性或油性媒剂中乳化，其可以含有防腐剂、稳定剂和用于使溶液或悬浮液与受体的体液(即，血液)等渗的物质。
适用的赋形剂是水、磷酸盐缓冲盐水、pH 7.4、0.15M的氯化钠水溶液、右旋糖、甘油、稀释乙醇等、以及它们的混合物。示例性的稳定剂为聚乙二醇、蛋白质、糖类、氨基酸、无机酸和有机酸，它们可以单独使用或作为混合物使用。使用的量或数量以及施用途径是基于个体确定的，并且对应于在本领域技术人员已知的类似类型的应用或适应症中使用的量。
药物组合物以与剂型相容的方式施用，并且以治疗有效量施用。待施用的量取决于待治疗的个体和受治疗者的免疫系统利用活性成分的能力。需要施用的活性成分的精确量取决于从业者的判断，并且对于每个个体为特异性的。
制备药物制剂的另外的指导可见于例如Gilman等人(编辑),1990,Goodman andGilman's:The Pharmacological Basis of Therapeutics，第8版，Pergamon Press；以及Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版，1990,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.；Avis等人(编辑),1993,Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Dekker,New York；Lieberman等人(编辑),1990,Pharmaceutical Dosage Forms:DisperseSystems,Dekker,New York。
本发明进一步考虑了包含IR激动剂或拮抗肽以及如本文详细描述的生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物。
以下实施例说明了本发明。这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。出于说明的目的包括实施例，并且本发明仅由权利要求限制。
实施例1.抗-CEACAM mAb的制备
1.1使用
Figure BDA0003661755770000281
产生抗-CEACAM mAb
Figure BDA0003661755770000282
含有嵌合人/大鼠IgH基因座(包含22个人VHs，全部的人D和JH片段以天然构型连接至大鼠CH基因座)连同完整人IgL基因座(连接至Jκ-Cκ的12个Vκ和连接至Jλ-Cλ的16个Vλ)。(参见例如Osborn等人，(2013)J Immunol 190(4):1481-1490)。因此，大鼠表现出大鼠免疫球蛋白的表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生具有完全人可变区的高亲和力嵌合人/大鼠IgG单克隆抗体。WO14/093908中描述了
Figure BDA0003661755770000283
的制备和用途以及由这些大鼠携带的基因组修饰。
OmniRats使用人CEACAM1的细胞外结构域进行免疫，融合至10-His标签(R&DSystems，#2244-CM，SEQ ID NO:6)，并且每三天至四天通过在尾部、跗关节、腋窝和耳的底部进行双侧注射，用相同的抗原加强。在48天的免疫方案之后，收获来自大鼠的淋巴结并用于产生杂交瘤，并且如下所述筛选杂交瘤上清液。
SEQ ID NO:6
qlttesmpfnvaegkevlllvhnlpqqlfgyswykgervdgnrqivgyaigtqqatpgpansgretiypnaslliqnvtqndtgfytlqviksdlvneeatgqfhvypelpkpsissnnsnpvedkdavaftcepetqdttylwwinnqslpvsprlqlsngnrtltllsvtrndtgpyeceiqnpvsanrsdpvtlnvtygpdtptispsdtyyrpganlslscyaasnppaqyswlingtfqqstqelfipnitvnnsgsytchannsvtgcnrttvktiivtelspvvakpqikaskttvtgdkdsvnltcstndtgisirwffknqslpssermklsqgnttlsinpvkredagtywcevfnpisknqsdpimlnvnynalpqenglspghhhhhhhhhh
1.2使用噬菌体展示文库产生抗-CEACAM mAb
使用标准方法从两组从头pIX噬菌体展示文库中选择CEACAM1结合Fab，如Shi等人，J Mol Biol 397:385-96,2010，以及WO2009/085462中所述。简而言之，通过使人支架多样化来生成两组文库(称为V3.0和V5.0)，其中种系VH基因IGHV1-69*01、IGHV3-23*01和IGHV5-51*01经由H3环与人IGHJ-4微小基因重新组合(IGHJ-6微小基因也用于V5.0)，并且人种系VLκ基因O12(IGKV1-39*01)、L6(IGKV3-11*01)、A27(IGKV3-20*01)和B3(IGKV4-1*01)与IGKJ-1微小基因重新组合以组装完整的VH和VL结构域。选择在围绕H1、H2、L1、L2和L3环的重链和轻链可变区中的位置用于多样化，这些位置经常与蛋白质和肽抗原接触。在选定位置处的序列多样性限于在各个IGHV或IGLV基因的IGHV或IGLV种系基因家族中的每个位置处出现的残基。通过针对V3.0文库使用长度为7-14个氨基酸的短至中等大小的合成环以及针对V5.0文库使用长度为6-19个氨基酸的合成环而在H3环处产生多样性。设计在H3处的氨基酸分布，以模仿在人抗体中观察到的氨基酸变异。根据它们的人VH和VL种系基因起源，命名用于生成文库的支架。对于V3.0和V5.0两组，将三个重链文库中的每一个文库与四条种系轻链或四个种系轻链文库组合，以产生用于选择实验的每组文库的12种独特VH:VL组合。
V区克隆。按照制造商方案，使用RNeasy 96试剂盒(Qiagen)纯化来自噬菌体的杂交瘤细胞裂解物的总RNA。使用Drop Sense定量所得的RNA，并将其保存在-80℃下或用于使用针对RT-PCR的Invitrogen SuperScript III第一链合成系统(Invitrogen；Carlsbad,CA)合成cDNA。使用分别退火至重链、k链和λ链恒定区的基因特异性引物进行第一链cDNA合成。将由最多3μg纯化RNA、基因特异性引物、dNTP混合物、反应缓冲液、25mM MgCl2、DTT、RNaseOUTTM(40U/μL，Invitrogen)和SuperScriptTM III RT(200U/μL，Invitrogen目录号18080-051)组成的RT-PCR反应混合物在50℃下温育50分钟并在85℃下温育5分钟。将所得单链cDNA保存在-20℃下，或直接用于PCR扩增。使用Platinum Pfx聚合酶(Invitrogen)进行PCR反应。使用优化的PCR条件，通过分别退火至重链、k链和λ链的前导序列和恒定区的正向引物和反向引物扩增v区片段。对所得的PCR片段进行测序，对所回收v区的氨基酸序列进行密码子优化并将其克隆到基于pUnder的表达载体中，该表达载体携带具有F405Lκ突变的IgG2σ恒定区。
Expi293小规模转染和纯化克隆从免疫运动或噬菌体展示中鉴别的选定抗体并将其表示为IgG2σ，并且经由2mL小规模纯化。将Expi293TM细胞(ThermoFisher Scientific)以1.25×105–2.25×105个活细胞/mL的密度接种在Expi293TM表达培养基中，并在37℃下、7％CO2中在125mL–2L摇瓶中培养。当密度达到具有98％至99％存活率的3×106至5×106个活细胞/mL的对数生长期时，对细胞进行继代培养。
在转染当天，测定活细胞密度和存活率百分比。按照制造商的转染方案(ThermoFisher公布号MAN0007814)，以3×106个活细胞/mL的密度使细胞转染。在转染后第6天通过在纯化前以850×G离心15分钟来收获培养物。使用mAb Select Sure树脂(GEHealthcare)从澄清的上清液中纯化抗体，并透析到PBS中。使用DropSense仪器(Trinean)，通过对滤液进行A280测量来确定蛋白质浓度。
实施例2.抗-CEACAM mAb与CEACAM1结合的表征
2.1与重组CEACAM1结合。通过ELISA筛选杂交瘤上清液和噬菌体展示来源的抗体以结合重组CEACAM1蛋白(R&D Systems,Minneapolis,MN)。
将板涂覆有50μl的1μg/ml CEACAM1(#2244-CM,R&D Systems)在4℃下过夜。第二天，在16小时内，将板用200μl的0.4％牛血清白蛋白(BSA)(σ，A9647)PBS溶液在室温下封闭1小时。将板用300μl的0.02％Tween-20 PBS溶液在Biotek洗板机上洗涤一次。将由10μg/ml起始至0.0001ug/ml的0.4％BSA或仅PBS的CEACAM mAb的1/2对数稀释液针对每种抗体进行铺板。将50μl的每种稀释液添加到涂覆的板中。将板在室温下孵育约30分钟。然后使用Biotek洗板器将板用300μl的0.02％Tween-20PBS溶液洗涤3次。将50ul 1:10,000羊抗huFc'2-HRP(JacksonImmunoResearch，目录号#109-036-098)添加到板中。将板在室温下孵育约30分钟。然后使用Biotek洗板器将板用300ul的PBS/0.02％Tween-20洗涤3次。添加50μL 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB，σT0440)，允许显色，随后添加50ul的4N H2SO4。使用EnVision酶标仪(Microplate Reader)(PerkinElmer)在450nm下分析板。以10μg/ml的浓度将同种型对照(CNTO8939抗体，对RSV病毒具有特异性，具有人IgG2σ主链)铺板在最后3个板上。使用XY散点图分析450nm处的吸光度(图2)，并且在对数转化后产生非线性拟合曲线，并且使用GraphPad Prism(GraphPad Software,San Diego,CA)计算EC50值。对于几种抗体，由于曲线拟合不佳，使用GraphPad Prism不能计算EC50；在这些情况下，在可用曲线的中点处视觉估计EC50值。表1中示出与重组CEACAM1结合的EC50值。
表1.通过ELISA测定的与重组CEACAM1结合的抗-CEACAM1 mAb的EC50值。
mAb ID CEACAM1EC50，μg/mL
CCMB02.004 17.06
CCMB03.004 19.91
CCMB04.004 11.19
CCMB07.004 12.19
CCMB09.004 7.296
CCMB18.004 6.907
CCMB20.004 18.62
CCMB23.004 45.47
CCMB35.004 55.64
CCMB42.004 6.201
CCMB61.004 26.62
CCMB66.004 6.706
2.2抗-CEACAM mAb与过表达CEACAM1的细胞的结合。
评估抗-CEACAM mAb与过表达CEACAM1的HEK293K细胞的结合。
产生过表达CEACAM1的HEK293T细胞。
使用编码CEACAM1的慢病毒载体(SEQ ID NO:1)和GFP标签(LPP-U0045-Lv105-200，Genecopeoia)产生过表达全长CEACAM1的HEK293T(ATCC,Manassas,VA)细胞。用新鲜培养基洗涤细胞，然后在含有8ug/ml聚凝胺的Opti-MEM(Thermo)中以2×106个细胞/ml悬浮细胞。在12孔组织培养板中，每孔添加0.5ml细胞悬浮液(1×106个细胞)。以0.3、1.0、3.0和5.0单位的感染复数(MOI)添加病毒颗粒。将板轻柔混合并在室温下在罩中孵育20分钟。将板在37℃下以1500g离心90分钟。将0.5ml新鲜Opti-MEM培养基添加到细胞。将板在37℃下孵育48-72小时。在UV光下检查细胞是否存在GFP信号。在80-90％汇合度下，将细胞转移到更大的100mm培养皿或T-75中，并且将培养基替换为含有0.5ug/mL嘌呤霉素的选择培养基。监测细胞并将其保持在选择培养基(补充有0.5μg/mL嘌呤霉素的Opti-MEM)中，持续几天或几周直到大多数细胞在选择培养基中存活。使用标记的抗体对表达蛋白的细胞进行染色，并制备细胞用于FACS分析。当达到足够的表达水平时，将稳定的细胞冷冻或分选为高/中或低表达细胞。使用0.5μg/ml嘌呤霉素进行1周的选择。
流式细胞术
使用流式细胞术用于确认CEACAM-1的表面表达。对于流式细胞术，细胞在含有人Fc阻断剂(Miltenyi Biotech,1:20)的FACS染色缓冲液中进行阻断，并且用LIVE/DEADTMFixable Near-IR Dead Cell Stain Kit(Invitrogen,1:500)在室温下处理15分钟。然后在4℃下，以50ul FACS染色缓冲液/孔将细胞用以下抗人抗体中的一种染色30分钟：藻红蛋白(PE)-缀合的抗-CEACAM-1抗体(R&D Systems，目录号#FAB2244P)，1:50)、藻红蛋白-缀合的小鼠IgG2b同种型对照(Biolegend)、以及未标记的抗-CEACAM-1(对CD66a具有特异性)(Millipore，目录号#MABT65，1:50)。用PE抗-鼠二抗(Jackson ImmunoResearch,1:200)检测抗体和小鼠IgG1同种型。
然后使用标准技术对CEACAM1过表达细胞进行亚克隆和分选，获得纯化的CEACAM1阳性细胞群体(图3)。然后使用这些细胞通过流式细胞术产生结合曲线(图4)。使用羊抗人Fc抗体(JacksonImmunoResearch，目录号#109-606-098)检测与过表达细胞的表面结合的CEACAM抗体。大多数抗体与表达CEACAM-1的HEK293T细胞结合得非常好并且未检出滴度，意味着未达到不能检测到结合的浓度(表2)。
表2.抗-CEACAM-1抗体与表达CEACAM-1的HEK293T细胞结合的EC50计算。
Figure BDA0003661755770000321
Figure BDA0003661755770000331
实施例3.抗-CEACAM mAb与CEACAM5和CEACAM6结合的表征
3.1与重组CEACAM5和CEACAM6的结合。根据实施例2中描述的方案，使用ELISA对重组CEACAM5(R&D Systems#4128-CM)和CEACAM6(R&D Systems#3934-CM)进行纯化的噬菌体和杂交瘤抗体特异性的交叉筛选。mAb与CEACAM5结合的结合曲线显示在图5a上，与CEACAM6结合的结合曲线显示在图5b上。CEACAM1抗体与CEACAM5和CEACAM6蛋白具有可变的结合，证明有一些交叉反应性(表3)。
表3.通过ELISA测定的与重组CEACAM5或CEACAM6结合的抗-CEACAM1 mAb的EC50 值。
mAb ID CEACAM5 EC50,(ug/mL) CEACAM6 EC50,(ug/mL)
CCMB02.004 50 >10000
CCMB03.004 16.44 5
CCMB04.004 6.463 5.571
CCMB07.004 9.773 >10000
CCMB09.004 4.461 5.131
CCMB18.004 4.32 6.054
CCMB20.004 4.268 >10000
CCMB23.004 >10000 >10000
CCMB35.004 >10000 >10000
CCMB42.004 1.141 >10000
CCMB61.004 >10000 1243
CCMB66.004 1688 >10000
3.2与过表达CEACAM5和CEACAM6的细胞的结合。根据实施例2中描述的方案，使用编码CEACAM5的慢病毒载体(LPP-G0056-Lv105-100,Genecopeoia)和编码CEACAM6的慢病毒载体(LPP-G0304-Lv105-100,Genecopeoia)转导产生过表达CEACAM5和CEACAM6的HEK293T细胞。根据实施例2中描述的程序，使用流式细胞术确认CEACAM5或CEACAM6在细胞的表面上的表达(图6a和图6b)。使用FACS Aria对CEACAM-5稳定池进行分选以消除低蛋白表达者。PE-缀合的抗-CEACAM-1,5,6(Biolegend目录号#342358，1:50)和PE缀合的小鼠IgG2b同种型对照(Biolegend)用于CEACAM5和CEACAM6细胞系。mAb与过表达CEACAM5的细胞结合的结合曲线显示在图7a上，并且与过表达CEACAM6的细胞结合的结合曲线显示在图7b上。结果表明，一些CEACAM1抗体具有显著的交叉反应性并且与表达CEACAM5或CEACAM6的细胞结合，但是其他CEACAM1抗体对这些细胞具有很少的结合或没有结合(表4)。
表4.通过流式细胞术测定的与表达CEACAM5或CEACAM6的HEK293T细胞结合的抗- CEACAM1 mAb的EC50值。
mAb ID CEACAM5 EC50，(ng/mL) CEACAM6 EC50，(ng/mL)
CCMB02.004 强结合物，未检出滴度 未结合
CCMB03.004 强结合物，未检出滴度 5.153
CCMB04.004 强结合物，未检出滴度 10.91
CCMB07.004 强结合物，未检出滴度 未结合
CCMB09.004 强结合物，未检出滴度 15.78
CCMB18.004 强结合物，未检出滴度 11.82
CCMB20.004 强结合物，未检出滴度 未结合
CCMB23.004 未结合 未结合
CCMB35.004 未结合 未结合
CCMB42.004 强结合物，未检出滴度 未结合
CCMB61.004 未结合 未结合
CCMB66.004 未结合 未结合
实施例4.抗-CEACAM mAb的结构表征。
使用标准技术获得抗体的cDNA序列和氨基酸翻译。在多肽序列测定中，一些编码可变区或全长抗体的抗体cDNA用标准方法进行密码子优化以大规模表达。
表5示出了选定抗-CEACAM抗体的重链CDR氨基酸序列。
表6示出了选定抗-CEACAM抗体的轻链CDR氨基酸序列。
表7示出了选定抗-CEACAM抗体的VH和VL氨基酸序列。
表5.
Figure BDA0003661755770000341
Figure BDA0003661755770000351
表6.
Figure BDA0003661755770000352
Figure BDA0003661755770000361
表7.
Figure BDA0003661755770000362
Figure BDA0003661755770000371
Figure BDA0003661755770000381
实施例5.通过抗-CEACAM mAb调节T细胞活化和效应功能。
评估抗-CEACAM抗体调节T细胞活化和效应功能的能力。这通过在存在或不存在CEACAM结合抗体的情况下活化具有对CD3有特异性的抗体(OKT3，Janssen，工程化到IgG1主链上)的正常供体T细胞来完成。通过评估分化、增殖和细胞因子分泌来评估T细胞活性。显示T细胞活化参数的可变调节的代表性样本在下文实施例中示出。
外周血单核细胞(PBMC)刺激。将PBMC解冻或从新鲜血液/白细胞层(HemaCare,Northridge,CA)中分离PBMC，并用补充有GlutaMAXTM和10％FBS(Thermo)的RPMI 1640培养基(Thermo)洗涤。使用CellTraceTM Violet细胞增殖试剂盒(Thermo)评估PBMC的增殖。对PBMC进行计数并将其以2×106/ml重悬。将50ul含有用培养基稀释的抗-CEACAM抗体稀释液或者仅培养基添加到96孔圆底板中。将50ul含有抗-CD3或培养基添加到96孔圆底板中。将细胞以100ul或2×105个细胞/孔铺板。将板在37℃孵育3天。
染色和细胞计数分析。在孵育后，将板旋转，并且收获100ul上清液用于细胞因子分析。将细胞沉淀重悬于含有Fc阻断剂和活/死染色剂(Life technologies目录号#L34957)的50ul BD FACS缓冲液(BD Biosciences)中。将板在室温下孵育15分钟，并用150ul BD FACS缓冲液洗涤。将细胞沉淀物重悬于50ul BD FACS缓冲液中30分钟，该缓冲液含有抗体混合物，包括与亮紫(Brilliant Violet，BV)605TM(Biolegend#329923)缀合的抗-PD-1抗体、与BV650(BD#563719)缀合的抗-CD25抗体、与BV7119(Biolegend#317440)缀合的抗-CD4抗体、与BV785(Biolegend#301045)缀合的抗-CD8抗体、以及与别藻蓝蛋白(APC,Biolegend#305312)缀合的抗CEACAM1。用150uL BD FACS缓冲液洗涤细胞，并在50uleBioscence FoxP3缓冲液中透化20分钟。将细胞在150uL eBioscience FoxP3透化/洗涤缓冲液中洗涤，然后重悬于含有流式细胞术抗体的eBioscience FoxP3透化/洗涤缓冲液中30分钟(根据流动面板)。将细胞在150uL eBioscience FoxP3透化/洗涤缓冲液中洗涤，然后在150ul BD cytofix中固定并在BD Fortessa流式细胞仪上分析。使用Meso ScaleDevices Human Th1/Th2组织培养试剂盒(MSD，K15010B)来分析细胞因子。简而言之，将来自T细胞培养物的上清液在预涂覆并封闭的96孔板上孵育1小时，用MSD检测抗体共混物检测1小时，然后洗涤和添加读取缓冲液。然后在MSD Sector读板器上读取板。使用来自同一板的标准曲线来计算细胞因子浓度的荧光值。
结果表明CEACAM结合抗体调节所有三种类型的T细胞活化。首先，响应于暴露于CEACAM1抗体与抗-CD3抗体的组合，在T细胞上诱导表面标记物表达(图8)。将T细胞表面上的PD-1表达用作T细胞活化的标记物(图8)。与单独的CD3相比，在存在CEACAM结合抗体的情况下，CD4和CD8T细胞均具有增加最多两倍的PD-1水平(p<0.0001,ANOVA)。其次，对T细胞增殖的分析表明，通过稀释细胞微量紫(CTV)的来增加分裂的细胞(p<0.0001,ANOVA)(图9)。最后，在存在CD3刺激的情况下，CEACAM对T细胞的连接增加细胞因子IFNγ(图10a,p＝0.0105,ANOVA)和TNFα(图10b,p＝0.0146,ANOVA)的产生。
实施例6.通过抗-CEACAM1抗体调节小鼠模型中对肿瘤的T细胞应答。
抗-CEACAM抗体也可用于展示在人源化小鼠模型中的功效。阻断T细胞上的CEACAM相互作用改善了T细胞上的活化和功能，并且因此可以在人源化小鼠模型中对肿瘤的生长抑制或消退起到作用。将抗-CECAM抗体与T细胞移植同时、在其之前或之后施用于患有肿瘤的小鼠可以增加那些T细胞控制肿瘤生长的能力，该肿瘤来自血液恶性肿瘤如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤，或实体瘤如黑素瘤、前列腺癌或非小细胞肺癌细胞系。
Figure IDA0003661755810000011
Figure IDA0003661755810000021
Figure IDA0003661755810000031
Figure IDA0003661755810000041
Figure IDA0003661755810000051
Figure IDA0003661755810000061
Figure IDA0003661755810000071
Figure IDA0003661755810000081
Figure IDA0003661755810000091
Figure IDA0003661755810000101
Figure IDA0003661755810000111
Figure IDA0003661755810000121
Figure IDA0003661755810000131
Figure IDA0003661755810000141
Figure IDA0003661755810000151
Figure IDA0003661755810000161
Figure IDA0003661755810000171
Figure IDA0003661755810000181
Figure IDA0003661755810000191
Figure IDA0003661755810000201
Figure IDA0003661755810000211
Figure IDA0003661755810000221
Figure IDA0003661755810000231
Figure IDA0003661755810000241
Figure IDA0003661755810000251
Figure IDA0003661755810000261
Figure IDA0003661755810000271
Figure IDA0003661755810000281
Figure IDA0003661755810000291
Figure IDA0003661755810000301
Figure IDA0003661755810000311
Figure IDA0003661755810000321
Figure IDA0003661755810000331
Figure IDA0003661755810000341
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Figure IDA0003661755810000381
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Figure IDA0003661755810000491
Figure IDA0003661755810000501

Claims (39)

1.一种分离的抗-CEACAM(癌胚抗原相关细胞粘附分子)抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:79的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:80的轻链可变区(VL)。
3.一种分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
4.根据权利要求3所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:81的VH和SEQ ID NO:82的VL。
5.一种分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:24的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
6.根据权利要求5所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:83的VH和SEQ ID NO:84的VL。
7.一种分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
8.根据权利要求7所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:85的VH和SEQ ID NO:86的VL。
9.一种离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35和SEQ ID NO:36的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
10.根据权利要求9所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:87的VH和SEQ ID NO:88的VL。
11.一种分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQID NO:41和SEQ ID NO:42的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
12.根据权利要求11所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:89的VH和SEQ ID NO:90的VL。
13.一种分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47和SEQ ID NO:48的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
14.根据权利要求13所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:91的VH和SEQ ID NO:92的VL。
15.一种分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQID NO:53和SEQ ID NO:54的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
16.根据权利要求15所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:93的VH和SEQ ID NO:94的VL。
17.一种分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQID NO:59和SEQ ID NO:60的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
18.根据权利要求17所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:95的VH和SEQ ID NO:96的VL。
19.一种分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQID NO:65和SEQ ID NO:66的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
20.根据权利要求19所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:97的VH和SEQ ID NO:98的VL。
21.一种分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQID NO:71和SEQ ID NO:72的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
22.根据权利要求21所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:99的VH和SEQ ID NO:100的VL。
23.一种分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQID NO:77和SEQ ID NO:78的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
24.根据权利要求23所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:101的VH和SEQ ID NO:102的VL。
25.一种分离的抗-CEACAM抗体或其所述抗原结合片段，其中所述抗体或其所述抗原结合片段与参考抗体竞争结合至CEACAM1、以及任选的CEACAM5或CEACAM6，所述分离的抗-CEACAM抗体或其所述抗原结合片段包含：
a)SEQ ID NO:79的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:80的轻链可变区(VL)；或者
b)SEQ ID NO:81的VH和SEQ ID NO:82的VL；
c)SEQ ID NO:83的VH和SEQ ID NO:84的VL；
d)SEQ ID NO:85的VH和SEQ ID NO:86的VL；
e)SEQ ID NO:87的VH和SEQ ID NO:88的VL；
f)SEQ ID NO:89的VH和SEQ ID NO:90的VL；
g)SEQ ID NO:91的VH和SEQ ID NO:92的VL；
h)SEQ ID NO:93的VH和SEQ ID NO:94的VL；
i)SEQ ID NO:95的VH和SEQ ID NO:96的VL；
j)SEQ ID NO:97的VH和SEQ ID NO:98的VL；
k)SEQ ID NO:99的VH和SEQ ID NO:100的VL；或者
l)SEQ ID NO:101的VH和SEQ ID NO:102的VL。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的分离的抗-CEACAM抗体或其所述抗原结合片段，其中所述抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的分离的抗-CEACAM抗体，其中所述抗体为多特异性抗体。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的分离的抗-CEACAM抗体，其中所述抗体为双特异性抗体。
29.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-28中任一项所述的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段缀合至一个或多个异源分子。
31.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码根据权利要求1-28中任一项所述的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段。
32.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码所述抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段并且包含编码选自由SEQ ID NO:79-102组成的组的多核苷酸序列。
33.一种载体，所述载体包含根据权利要求32所述的多核苷酸。
34.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求33所述的载体。
35.一种产生根据权利要求1-28中任一项所述的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在表达所述抗体的条件下培养根据权利要求34所述的宿主细胞，并且回收由所述宿主细胞产生的所述抗体。
36.一种治疗对其有需要的受治疗者的CEACAM阳性癌症的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的根据权利要求1-28中任一项所述的分离的抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段或者根据权利要求34所述的药物组合物以治疗所述CEACAM阳性癌症。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述抗-CEACAM抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂组合施用。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述第二治疗剂为外科手术、化学疗法、雄激素阻断疗法或放射疗法、或它们的任何组合。
39.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-28中任一项所述的抗体。
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