JP2022550067A - 抗ｃｅａｃａｍ抗体及びその使用 - Google Patents

抗ｃｅａｃａｍ抗体及びその使用 Download PDF

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ブイ． ドルフィ，ダグラス
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Abstract

本明細書に提供される開示は、ＣＥＡＣＡＭ１及び任意選択でＣＥＡＣＡＭ５及び／又はＣＥＡＣＡＭ６に結合する単一特異性及び多特異性抗体、並びに記載の抗体を産生及び使用する方法に関する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／９０７，２２４号に対する優先権を主張するものである。前述の出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ファイル名が「ＪＢＩ６１５６ＷＯＰＣＴ１＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、２０２０年８月２９日に作成され、６２ｋｂのサイズを有する、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂにより電子的に提出された配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本明細書に提供される開示は、ＣＥＡＣＡＭ１、並びに、任意選択で、ＣＥＡＣＡＭ５及び／又はＣＥＡＣＡＭ６に特異的な抗体、並びに記載の抗体を産生及び使用する方法に関する。
（発明の背景）
感染又は腫瘍を制御する免疫システムの能力は、多くの場合、免疫システムを抑制するように設計された宿主の機構によって破壊される。これらの免疫チェックポイントは、たとえ適切な状況下であっても免疫活性化を抑える可能性がある。健康な組織及び細胞を保護するために多くの免疫チェックポイントが進化するにつれて、病原体及び腫瘍は、これらの機構を都合よく利用する能力を適応させてきた。これらの免疫チェックポイントの阻害は、腫瘍治療学において有効な戦略となっており、腫瘍が免疫制御を回避する上で役立ち得る免疫制御機構への理解をより深めてきた。
ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１を標的とした治療法は、腫瘍細胞死の誘導に関与するＴ細胞上の受容体を遮断することによって、これをうまく利用している。ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４のリガンドを発現する腫瘍は、これらＴ細胞の免疫応答をそれ以上阻害することができないので、免疫応答によって排除される。免疫チェックポイント阻害のこの新規機構により、疾患の転帰の有意な改善がもたらされたが、この新規機構が機能するのは比較的少数の患者においてのみである。
ＣＥＡＣＡＭファミリーは、Ｉｇスーパーファミリーの高度に保存された糖タンパク質であり、免疫細胞の活性化を妨害する。標準的なファミリーメンバーＣＥＡＣＡＭ１は、複数の癌の種類において過剰発現され、免疫活性化するとＴ細胞によって上方制御される１２。ＣＥＡＣＡＭ１シグナル伝達を妨害することによってＴ細胞の活性を増加させ、Ｔ細胞を放出して腫瘍標的を死滅させることができる。いくつかのＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーは、これが免疫抑制の進化的保存機構であり、ＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４などよりも広範な影響を有していることを示している。この理由から、ＣＥＡＣＡＭを標的にすることが、他の免疫チェックポイントよりも望ましい場合がある。
ＣＥＡＣＡＭ１は、それ自体、並びにＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、及びＣＥＡＣＡＭ８などのＣＥＡＣＡＭファミリーの他のメンバーによりライゲーションされ得る。ＣＥＡＣＡＭ１のみを標的にする現在の技術は、ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現する腫瘍によるＴ細胞の破壊を防止するだけであるが、他のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーを発現する腫瘍を適切にマスキングしない可能性があり、潜在的に免疫抑制の遮断作用が弱くなり、最終的には効果の弱い癌療法となる。
したがって、いくつかのＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーを標的とする追加の治療法を開発する必要がある。
（発明の概要）
本発明は、ＣＥＡＣＡＭ１、及び／又はＣＥＡＣＡＭ５、及び／又はＣＥＡＣＡＭ６に結合する抗体を提供し、それによって腫瘍成長のＴ細胞媒介制御を改善する。本発明の抗体は、普通であれば宿主免疫監視によるクリアランスを回避するはずの感染又は腫瘍標的細胞のいずれかに結合する。これらの抗体はまた、腫瘍又は感染細胞の存在下で活性化されるＴ細胞、ＮＫ細胞、又はマクロファージなどの免疫細胞に結合する。そのような結合は、ＣＥＡＣＡＭ発現標的によるそのような免疫細胞の不活性化を防止する。
複数のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーは、ｃｉｓ又はｔｒａｎｓにおいてライゲーションし、免疫応答を下方制御し得るので、本発明の抗体は、複数のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーに結合し、ブロックする。ＣＥＡＣＡＭファミリーの進化は、冗長であるが遺伝的及び機構的に類似した免疫制御分子をもたらしたため、機能的治療は、これらの複数の分子と交差反応する必要がある。この多重特異性アプローチは、単一のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーに結合する現在の技術よりも、免疫抑制のより強力な遮断及びより広い機能的範囲をもたらし得る。
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号７、８、９、１０、１１、及び１２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ（癌胎児性抗原関連細胞接着分子（Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule））抗体又はその抗原結合断片に関する。別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７９の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号８０の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１３、１４、１５、１６、１７、及び１８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８１のＶＨ及び配列番号８２のＶＬを含む。
別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１９、２０、２１、２２、２３、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、請求項５に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８３のＶＨ及び配列番号８４のＶＬを含む。
別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、請求項７に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８５のＶＨ及び配列番号８６のＶＬを含む。
別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３１、３２、３３、３４、３５、及び３６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、請求項９に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含む。
別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３７、３８、３９、４０、４１、及び４２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、請求項１１に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含む。
別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号４３、４４、４５、４６、４７、及び４８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、請求項１３に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９１のＶＨ及び配列番号９２のＶＬを含む。
別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号４９、５０、５１、５２、５３、及び５４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、請求項１５に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９３のＶＨ及び配列番号９４のＶＬを含む。
別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５５、５６、５７、５８、５９、及び６０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、請求項１７に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９５のＶＨ及び配列番号９６のＶＬを含む。
別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６１、６２、６３、６４、６５、及び６６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、請求項１９に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９７のＶＨ及び配列番号９８のＶＬを含む。
別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６７、６８、６９、７０、７１、及び７２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、請求項２１に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９９のＶＨ及び配列番号１００のＶＬを含む。
別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号７３、７４、７５、７６、７７、及び７８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、請求項２３に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１０１のＶＨ及び配列番号１０２のＶＬを含む。
別の実施形態では、本発明は、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片であって、抗体又はその抗原結合断片が、ＣＥＡＣＡＭ１、及び任意選択でＣＥＡＣＡＭ５又はＣＥＡＣＡＭ６への結合に関して、
配列番号７９の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号８０の軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
配列番号８１のＶＨ及び配列番号８２のＶＬ、
配列番号８３のＶＨ及び配列番号８４のＶＬ、
配列番号８５のＶＨ及び配列番号８６のＶＬ、
配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、
配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、
配列番号９１のＶＨ及び配列番号９２のＶＬ、
配列番号９３のＶＨ及び配列番号９４のＶＬ、
配列番号９５のＶＨ及び配列番号９６のＶＬ、
配列番号９７のＶＨ及び配列番号９８のＶＬ、
配列番号９９のＶＨ及び配列番号１００のＶＬ、又は
配列番号１０１のＶＨ及び配列番号１０２のＶＬ、を含む参考抗体と競合する、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片、に関する。
別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである。
別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、多重特異性抗体である。
別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、二重特異性抗体である。
別の実施形態では、医薬組成物は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体と、を含む。
別の実施形態では、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、１つ又は複数の異種分子にコンジュゲートされる。
別の実施形態では、本発明は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又は抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
別の実施形態では、本発明は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片をコードし、かつ配列番号７９～１０２からなる群から選択される配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号７９～１０２からなる群から選択される配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、ベクターに関する。別の実施形態では、本発明は、当該ベクターを含む宿主細胞に関する。
別の実施形態では、本発明は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、抗体が発現する条件下で宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生された当該抗体を回収することとを含む、方法、に関する。
別の実施形態では、本発明は、ＣＥＡＣＡＭ陽性癌の治療を必要とする対象においてＣＥＡＣＡＭ陽性癌を治療する方法であって、治療的に有効な量の本発明の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体若しくはその抗原結合断片、又は本発明の医薬組成物を、対象に投与して、ＣＥＡＣＡＭ陽性癌を治療することを含む、方法、に関する。別の実施形態では、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片が、第２の治療剤と組み合わせて投与される方法。別の実施形態では、方法は、第２の治療剤が、手術、化学療法、アンドロゲン遮断療法、若しくは放射線、又はこれらの任意の組み合わせである場合である。
別の実施形態では、方法は、本発明の抗体を含むキットに関する。
代表的なフローサイトメトリーグラフを示す図であり、黒線は、抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞に対するＣＥＡＣＡＭ１の発現を示し、灰色線は、活性化前の休止Ｔ細胞に対するベースラインＣＥＡＣＡＭの発現を示す。 ＣＥＡＣＡＭ抗体の組み換えＣＥＡＣＡＭ１への結合を示す図である。 代表的なフローサイトメトリーグラフを示す図であり、黒線は、ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示し、灰色線はＣＥＡＣＡＭ１を発現しなかった親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示す。 フローサイトメトリーによる、ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の結合曲線を示す図である。 ＥＬＩＳＡによる固定化組み換えＣＥＡＣＡＭ５に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の結合を示す図である。 ＥＬＩＳＡによる固定化組み換えＣＥＡＣＡＭ６に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の結合を示す図である。 代表的なフローサイトメトリーグラフを示す図であり、黒線はＣＥＡＣＡＭ５を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示し、灰色線はＣＥＡＣＡＭ５を発現しなかった細胞を示す。 代表的なフローサイトメトリーグラフを示す図であり、黒線はＣＥＡＣＡＭ６を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示し、灰色線はＣＥＡＣＡＭ６を発現しなかった親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示す。 ＣＥＡＣＡＭ５過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の結合を示す図である。 ＣＥＡＣＡＭ６過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の結合を示す図である。 抗ＣＤ３抗体（暗灰色）、又は抗ＣＤ３抗体と抗ＣＥＡＣＡＭ抗体であるＣＣＭＢ１８との組み合わせ（黒色）、又は抗ＣＤ３抗体と抗ＣＥＡＣＡＭ抗体であるＣＣＭＢ６１との組み合わせ（淡灰色）のいずれかによる刺激時のＰＤ－１陽性Ｔ細胞（ＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれか）のパーセントを示す図である。 抗ＣＤ３抗体（暗灰色）、又は抗ＣＤ３抗体と抗ＣＥＡＣＡＭ抗体であるＣＣＭＢ１８との組み合わせ（黒色）、又は抗ＣＤ３抗体と抗ＣＥＡＣＡＭ抗体であるＣＣＭＢ６１との組み合わせ（淡灰色）のいずれかによる刺激時のＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ＶｉｏｌｅｔネガティブＴ細胞（ＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれか）のパーセントを示す図である。 抗ＣＥＡＣＡＭ結合抗体（ＣＣＭＢ１８又はＣＣＭＢ６１）の存在下又は非存在下で抗ＣＤ３抗体で刺激されたＴ細胞からのインターフェロン（ＩＦＮ）ガンマの分泌を示す図である。 抗ＣＥＡＣＡＭ結合抗体（ＣＣＭＢ１８又はＣＣＭＢ６１）の存在下又は非存在下で抗ＣＤ３抗体で刺激されたＴ細胞からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファの分泌を示す図である。
（発明の詳細な記述）
本明細書に引用されている特許及び特許出願を含む（但しそれらに限定されない）全ての刊行物は、完全に記載されているかのように、参照により本明細書に援用される。
開示される内容は、本開示の一部を形成する、添付の図面に関連してなされる以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。開示される内容は、本明細書に記載及び／又は表示の内容に限定されないこと、更に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を例によって説明することのみを目的とし、請求項に記載の内容に限定することを意図しないことを理解されたい。
特別な記述がない限り、動作に関する可能なメカニズム又は形態、あるいは改善の理由についての説明は、説明のみを意図したものである。本開示の内容は、提案されている動作に関するメカニズム又は形態、あるいは改善の理由の是非によって制限されない。
値の範囲が表されている場合、別の実施形態においては、ある特定の値から、及び／又は他の特定の値までが含まれる。更に、範囲で記述される値に関する言及は、その範囲内のあらゆる値を含む。範囲はいずれも包括的であり、組み合わせであってもよい。値が、先行詞「約」を用いて近似値として表現される場合、その特定の値は、別の実施形態を形成することが理解される。特定の数値に関する言及は、文脈上その他に明記されない限り、少なくともその特定の値を含むものとする。
本明細書において、明確性のために、別々の実施形態の文脈において記載される、開示された内容の複数の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことを理解されたい。逆に、簡潔のために単一の実施形態として記載された開示される内容の様々な特徴はまた、別個に、又は任意の下位の組み合わせで提供されてもよい。
定義
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数を含むものとする。
本明細書及び特許請求の範囲を通して本明細書の諸態様に関する種々の用語が使用される。特に指示がない限り、このような用語には、当該技術分野におけるそれらの通常の意味が与えられるものとする。その他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と一致する様式で解釈されるものとする。
数値範囲、カットオフ、又は特定の値に言及するときに用いる場合、「約」という用語は、引用した値が、記載値から最大１０％変動し得ることを示すために用いる。したがって、用語「約」とは、規定値からの±１０％以下の変動、±５％以下の変動、±１％以下の変動、±０．５％以下の変動、又は±０．１％以下の変動を包含するために使用される。
「抗体」は、広義の意味を有し、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性、三重特異性、四重特異性などの多特異性抗体、二量体、四量体、又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、並びに必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された形態を含む免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された、２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えばＩｇＭ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。
「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗原に結合する抗体の領域である。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１－５０）（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－１７）、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７）、及びＡｂＭ（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６）Ｊ Ｂｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６３：８００－１５）などの、様々な記述を使用して定義することができる。様々な記述と、可変領域の付番との対応が記載されている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７；Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，（２００１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０９：６５７－７０；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース；ウェブリソース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇを参照のこと）。ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＣＤＲを描写することができる。本明細書で使用する場合、用語「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」は、明細書で別途明示的に記載のない限り、上述したＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、又はＡｂＭの方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。
免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて５つの主なクラスである、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。いずれの脊椎動物種の抗体軽鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つの明確に異なるタイプ、すなわちカッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てられ得る。
「抗原結合断片」とは、抗原に結合する免疫グロブリン分子の一部を意味する。抗原結合断片は合成ポリペプチド、酵素により入手可能なポリペプチド、又は遺伝子組み換えされたポリペプチドであってよく、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片、１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）、サメ可変性ＩｇＮＡＲドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４部分などの、抗体のＣＤＲを再現したアミノ酸残基からなる最小の認識単位、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３が挙げられる。ＶＨ及びＶＬドメインは互いに、合成リンカーを介して結合し、様々なタイプの一本鎖抗体設計を形成することができ、ＶＨ及びＶＬドメインが、個別の一本鎖抗体構築物により発現される場合では、ＶＨ／ＶＬドメインが分子内、又は分子間で対形成し、一価の抗原結合部位、例えば一本鎖Ｆｖ（single chain Fv、ｓｃＦｖ）又は二重特異性抗体を形成することができ、これらは、例えば国際公開第１９９８／４４００１号、同第１９８８／０１６４９号、同第１９９４／１３８０４号、及び同第１９９２／０１０４７号に記載されている。
抗体可変領域は、３つの「抗原結合部位」によって中断された「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、様々な用語を用いて定義される：（ｉ）ＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列多様性に基づいている（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する（Ｗｕ ａｎｄ Ｋａｂａｔ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１－５０，１９７０；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の「超可変性領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－１７，１９８７）により定義される通り、構造において超可変性である、抗体可変ドメインの領域を指す。他の用語には、「ＩＭＧＴ－ＣＤＲ」（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐａｒａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７，２００３）及び「Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｕｓａｇｅ」（ＳＤＲＵ）（Ａｌｍａｇｒｏ、Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ １７：１３２－４３，２００４）が含まれる。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位についての標準的番号及び定義を提供する。ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴ概要説明の対応が、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐａｒａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７，２００３に記載されている。
「抗体断片」とは、重鎖及び／又は軽鎖抗原結合部位、例えば、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２及び３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２及び３、重鎖可変領域（ＶＨ）、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を保持する免疫グロブリン分子の一部を指す。抗体断片としては、よく知られているＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及びＦｖ断片、並びに１つのＶＨドメインを構成するドメイン抗体（ｄＡｂ）が挙げられる。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、合成リンカーを介して１つに連結されることにより様々な種類の一本鎖抗体の設計を形成可能であり、ここでＶＨ／ＶＬドメインは、分子内で対形成するか、又はＶＨドメイン及びＶＬドメインが別々の一本鎖抗体構築物によって発現される場合には分子間で対形成して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などの一価の抗原結合部位又は二重特異性抗体を形成する。これは、例えば、国際公開第１９９８／４４００１号、同第１９８８／０１６４９号、同第１９９４／１３８０４号、同第１９９２／０１０４７号に記載されている。
「モノクローナル抗体」とは、抗体分子の実質的に均質な母集団（即ち、母集団を含む個別の抗体が、抗体重鎖からＣ末端リジンを除去する、又は、アミノ酸異性化若しくはアミド分解、メチオニン酸化若しくはアスパラギン若しくはグルタミンアミド分解などの翻訳後修飾といった、可能な周知の変更を除いて同一である）から入手される抗体を意味する。モノクローナル抗体は、典型的には、１つの抗原性エピトープに結合する。二重特異性モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原性エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団内で不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性であってよく、又は、二重特異性などの多特異性であってよく、一価、二価、又は多価であってよい。
「キメラ抗体」は、ネズミｍＡｂ由来の可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの等、分子の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。実質的にヒト抗体からの可変領域フレームワーク残基（アクセプター抗体と呼ばれる）、及び実質的にマウス抗体からの相補性決定領域（ドナー抗体と呼ばれる）を有する抗体は、ヒト化抗体とも呼ばれる。キメラ抗体は、主に、適用時の免疫原性を低減させるため、及び産生時の生産量を増加させるために使用され、例えば、ネズミｍＡｂがハイブリドーマからより高い生産量を有するが、ヒトにおいてより高い免疫原性を有する場合、ヒト／ネズミキメラｍＡｂが使用される。キメラ抗体、及びそれらの産生方法は、当該技術分野で既知である（例えば、ＰＣＴ特許出願国際公開第８６／０１５３３号、同第９７／０２６７１号、及び同第９０／０７８６１号、並びに米国特許第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、及び同第５，２２５，５３９号）。更に、ＣＤＲグラフティングは、親和性又は特異性を含む抗体分子の特定の特性を変更するために実施され得る。ＣＤＲグラフティングの非限定的な例は、米国特許第５，２２５，５３９号に開示されている。
「ヒト化抗体」は、少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来し、少なくとも１つのフレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を意味する。ヒト化抗体は、フレームワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。
「ヒト抗体」は、ヒト対象に投与されるときに、最小の免疫応答を有するように最適化された抗体を意味する。ヒト抗体の可変領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、当該定常領域もヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、ヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。このような例示的な系は、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばマウス又はラットを含む。「ヒト抗体」は、典型的には、ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために使用した系の違い、フレームワーク若しくはＣＤＲへの体細胞変異の導入若しくは置換の意図的な導入、又はこれらの両方により、ヒトで発現した免疫グロブリンと比較したときにアミノ酸の違いを含有する。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７－８６に記載されるヒトフレームワーク配列分析から得られたコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ ＭｏｌＢｉｏｌ ３９７：３８５－９６及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含有し得る。
「二重特異性」は、２つの異なる抗原、又は同じ抗原中の２つの異なるエピトープと特異的に結合する抗体を指す。二重特異性抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、カニクイザル（Macaca cynomolgus）（例えば、カニクイザル（cynomolgus、cyno）又はチンパンジーなどの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有し得る、あるいは２つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合し得る。
「多特異性」とは、同じ抗原内の２つ以上の異なる抗原、又は２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する抗体を意味する。多特異性抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、カニクイザル（Macaca cynomolgus）（例えば、カニクイザル（cynomolgus、cyno）又はチンパンジーなどの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有し得る、あるいは２つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合し得る。
「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する抗原の部分を指す。エピトープは、典型的には、化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）部分の表面集団、例えばアミノ酸又は多糖側鎖からなり、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、立体配座上の空間単位を形成する連続的な及び／又は不連続なアミノ酸によって構成され得る。不連続なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部分にあるアミノ酸が、タンパク質分子の折り畳みにより三次元空間でごく近接するようになる。
「有効量」は、必要な投薬量及び期間で所望の結果を得るための有効量を指す。有効量は、個体の病態、年齢、性別、及び体重、並びに個体における所望の応答を引き出す抗体の能力などの要因に従って変動し得る。有効量はまた、有益な効果が、薬剤の任意の毒性又は有害効果を上回る量でもある。
「単離された細胞又は組織試料」は、対象又は個体の組織から得られた細胞の集合である。細胞又は組織試料の供給源は、例えば、新鮮、凍結、及び／又は保存臓器、組織試料、生検、又は吸引液からの固形組織；血液、又は血漿などの何らかの血液成分；脳脊髄液、羊水、腹水、又は間質液などの体液；対象の妊娠又は発育の任意の時点の細胞、とすることができる。細胞又は組織試料はまた、一次又は培養細胞又は細胞株であり得る。任意選択で、組織試料又は組織断片は、疾患組織／臓器から得られる。組織試料は、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定液、栄養素、抗生物質などの、組織と本来は自然に混合されない化合物を含有し得る。
「単離された」とは、組み換え細胞などの分子が産生されるシステムに関係する他の成分から実質的に分離及び／又は精製されている、分子の均質な集団（例えば、合成ポリヌクレオチド又は抗体などのタンパク質）に加えて、少なくとも１つの精製又は単離工程に供されたタンパク質を指す。「単離抗体」とは、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない抗体を指し、より高い純度、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度まで単離された抗体を包含する。
「組み換え物」は、異なる供給源由来のセグメントが結合されて組み換えＤＮＡ、抗体、又はタンパク質を産生するときに、組み換え手段によって調製、発現、作製、又は単離されるＤＮＡ、抗体、及び他のタンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、抗原標的に「特異的に結合する」、又は「抗原特異的」、又は抗原標的「に対して特異的」、又は抗原と「免疫反応性」である抗体は、同様の配列の他の抗原よりも高い親和性で抗原に結合する本発明の抗体又はポリペプチド結合剤を指す。一態様では、本発明のポリペプチド結合剤、又はそれらの断片、変異体、若しくは誘導体は、他の（すなわち非ヒト）種の同様の抗原に対するその結合親和性と比較してヒト抗原に対してより親和性で結合するが、標的のオルソログを認識して結合するポリペプチド結合剤は、本発明の範囲内である。
「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を意味し、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類を意味する。記載された内容の多くの実施形態では、対象はヒトである。
「治療すること」又は「治療」は、損傷、病態、又は病状の減弱又は改善における、何らかの成功又は成功の兆候を指すが、これには、症状の寛解、緩解、減少、病状を患者にとってより許容できるものにすること、変性又は減退速度を遅くすること、変性による最終的な衰弱を和らげること、対象の肉体的又は精神的健康を改善すること、あるいは生存期間の長さを延ばすこと等の、何らかの客観的又は主観的パラメータを含む。治療は、身体検査、神経学的検査、又は精神医学的評価の結果等客観的又は主観的パラメータに基づいて評価されてよい。
「変異体」は、１つ又は複数の改変、例えば、１つ又は複数の置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
「ベクター」は、生物系内で複製可能な、又はそのような系間を移動することができる、ポリヌクレオチドを指す。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、ベクターを複製することができる生物学的要素を利用して生物系（例えば、細胞、ウイルス、動物、植物）及び再構成された生物系におけるこれらポリヌクレオチドの複製又は維持を促進する機能を有する、複製起点、ポリアデニル化シグナル、又は選択マーカーなどの要素を含有する。ベクターポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又はこれらのハイブリッドであり得る。
「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指令するために、生物系又は再構成された生物系において利用できるベクターを指す。
「ポリヌクレオチド」とは、糖－ホスフェート主鎖により共有結合した、又は他の等価な共有化学反応により結合した、ヌクレオチド鎖を含む合成分子を意味する。ｃＤＮＡは、例示的な合成ポリヌクレオチドである。
「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されてポリペプチドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を指す。５０個未満のアミノ酸からなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。
「ＣＥＡＣＡＭ１」（癌胎児性抗原関連細胞接着分子１）は、ＣＥＡＣＡＭ１遺伝子のタンパク質生成物、例えば、ＮＰ－００１０２００８３．１、ＮＰ－００１７０３．２を指す。完全長ヒトＣＥＡＣＡＭ１のアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＣＥＡＣＡＭ１の細胞外ドメインを配列番号２に示し、完全長ＣＥＡＣＡＭ１の残基３５～４２８に及ぶ。ヒトにおいて、１１個の異なるＣＥＡＣＡＭ１スプライスバリアントが既知である。個々のＣＥＡＣＡＭ１アイソフォームは、細胞外免疫グロブリン様ドメインの数、又は膜固定及び／又はそれらの細胞質尾部の長さに関して異なる。これらのスプライスバリアントを含む全ての変異体は、「ＣＥＡＣＡＭ１」という用語に含まれる。
配列番号１（完全長ヒトＣＥＡＣＡＭ１）：ＭＧＨＬＳＡＰＬＨＲＶＲＶＰＷＱＧＬＬＬＴＡＳＬＬＴＦＷＮＰＰＴＴＡＱＬＴＴＥＳＭＰＦＮＶＡＥＧＫＥＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦＧＹＳＷＹＫＧＥＲＶＤＧＮＲＱＩＶＧＹＡＩＧＴＱＱＡＴＰＧＰＡＮＳＧＲＥＴＩＹＰＮＡＳＬＬＩＱＮＶＴＱＮＤＴＧＦＹＴＬＱＶＩＫＳＤＬＶＮＥＥＡＴＧＱＦＨＶＹＰＥＬＰＫＰＳＩＳＳＮＮＳＮＰＶＥＤＫＤＡＶＡＦＴＣＥＰＥＴＱＤＴＴＹＬＷＷＩＮＮＱＳＬＰＶＳＰＲＬＱＬＳＮＧＮＲＴＬＴＬＬＳＶＴＲＮＤＴＧＰＹＥＣＥＩＱＮＰＶＳＡＮＲＳＤＰＶＴＬＮＶＴＹＧＰＤＴＰＴＩＳＰＳＤＴＹＹＲＰＧＡＮＬＳＬＳＣＹＡＡＳＮＰＰＡＱＹＳＷＬＩＮＧＴＦＱＱＳＴＱＥＬＦＩＰＮＩＴＶＮＮＳＧＳＹＴＣＨＡＮＮＳＶＴＧＣＮＲＴＴＶＫＴＩＩＶＴＥＬＳＰＶＶＡＫＰＱＩＫＡＳＫＴＴＶＴＧＤＫＤＳＶＮＬＴＣＳＴＮＤＴＧＩＳＩＲＷＦＦＫＮＱＳＬＰＳＳＥＲＭＫＬＳＱＧＮＴＴＬＳＩＮＰＶＫＲＥＤＡＧＴＹＷＣＥＶＦＮＰＩＳＫＮＱＳＤＰＩＭＬＮＶＮＹＮＡＬＰＱＥＮＧＬＳＰＧＡＩＡＧＩＶＩＧＶＶＡＬＶＡＬＩＡＶＡＬＡＣＦＬＨＦＧＫＴＧＲＡＳＤＱＲＤＬＴＥＨＫＰＳＶＳＮＨＴＱＤＨＳＮＤＰＰＮＫＭＮＥＶＴＹＳＴＬＮＦＥＡＱＱＰＴＱＰＴＳＡＳＰＳＬＴＡＴＥＩＩＹＳＥＶＫＫＱ
配列番号２（ヒトＣＥＡＣＡＭ１の細胞外ドメイン）：
ＱＬＴＴＥＳＭＰＦＮＶＡＥＧＫＥＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦＧＹＳＷＹＫＧＥＲＶＤＧＮＲＱＩＶＧＹＡＩＧＴＱＱＡＴＰＧＰＡＮＳＧＲＥＴＩＹＰＮＡＳＬＬＩＱＮＶＴＱＮＤＴＧＦＹＴＬＱＶＩＫＳＤＬＶＮＥＥＡＴＧＱＦＨＶＹＰＥＬＰＫＰＳＩＳＳＮＮＳＮＰＶＥＤＫＤＡＶＡＦＴＣＥＰＥＴＱＤＴＴＹＬＷＷＩＮＮＱＳＬＰＶＳＰＲＬＱＬＳＮＧＮＲＴＬＴＬＬＳＶＴＲＮＤＴＧＰＹＥＣＥＩＱＮＰＶＳＡＮＲＳＤＰＶＴＬＮＶＴＹＧＰＤＴＰＴＩＳＰＳＤＴＹＹＲＰＧＡＮＬＳＬＳＣＹＡＡＳＮＰＰＡＱＹＳＷＬＩＮＧＴＦＱＱＳＴＱＥＬＦＩＰＮＩＴＶＮＮＳＧＳＹＴＣＨＡＮＮＳＶＴＧＣＮＲＴＴＶＫＴＩＩＶＴＥＬＳＰＶＶＡＫＰＱＩＫＡＳＫＴＴＶＴＧＤＫＤＳＶＮＬＴＣＳＴＮＤＴＧＩＳＩＲＷＦＦＫＮＱＳＬＰＳＳＥＲＭＫＬＳＱＧＮＴＴＬＳＩＮＰＶＫＲＥＤＡＧＴＹＷＣＥＶＦＮＰＩＳＫＮＱＳＤＰＩＭＬＮＶＮＹＮＡＬＰＱＥＮＧＬＳＰＧ
「抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体」、「ＣＥＡＣＡＭ１を認識する抗体」、「ＣＥＡＣＡＭ１に対する抗体（antibody against）」、又は「ＣＥＡＣＡＭ１に対する抗体（antibody to）」は、十分な親和性及び特異性でＣＥＡＣＡＭ１タンパク質に結合する抗体である。典型的には、本教示による抗体は、約１０－８又は１０－９Ｍ又はそれ以上の最小親和性でＣＥＡＣＡＭ１と結合することができる。
「ＣＥＡＣＡＭ５」（癌胎児性抗原関連細胞接着分子５）は、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のタンパク質生成物を指す。完全長ヒトＣＥＡＣＡＭ５のアミノ酸配列を配列番号３に示す。代替スプライシングによって産生された２つのアイソフォームは、これまでにヒトにおいて記載されている。これらのスプライスバリアントを含む全てのアイソフォームは、「ＣＥＡＣＡＭ５」という用語に含まれる。
配列番号３（完全長ヒトＣＥＡＣＡＭ５）：
ＭＥＳＰＳＡＰＰＨＲＷＣＩＰＷＱＲＬＬＬＴＡＳＬＬＴＦＷＮＰＰＴＴＡＫＬＴＩＥＳＴＰＦＮＶＡＥＧＫＥＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＨＬＦＧＹＳＷＹＫＧＥＲＶＤＧＮＲＱＩＩＧＹＶＩＧＴＱＱＡＴＰＧＰＡＹＳＧＲＥＩＩＹＰＮＡＳＬＬＩＱＮＩＩＱＮＤＴＧＦＹＴＬＨＶＩＫＳＤＬＶＮＥＥＡＴＧＱＦＲＶＹＰＥＬＰＫＰＳＩＳＳＮＮＳＫＰＶＥＤＫＤＡＶＡＦＴＣＥＰＥＴＱＤＡＴＹＬＷＷＶＮＮＱＳＬＰＶＳＰＲＬＱＬＳＮＧＮＲＴＬＴＬＦＮＶＴＲＮＤＴＡＳＹＫＣＥＴＱＮＰＶＳＡＲＲＳＤＳＶＩＬＮＶＬＹＧＰＤＡＰＴＩＳＰＬＮＴＳＹＲＳＧＥＮＬＮＬＳＣＨＡＡＳＮＰＰＡＱＹＳＷＦＶＮＧＴＦＱＱＳＴＱＥＬＦＩＰＮＩＴＶＮＮＳＧＳＹＴＣＱＡＨＮＳＤＴＧＬＮＲＴＴＶＴＴＩＴＶＹＡＥＰＰＫＰＦＩＴＳＮＮＳＮＰＶＥＤＥＤＡＶＡＬＴＣＥＰＥＩＱＮＴＴＹＬＷＷＶＮＮＱＳＬＰＶＳＰＲＬＱＬＳＮＤＮＲＴＬＴＬＬＳＶＴＲＮＤＶＧＰＹＥＣＧＩＱＮＫＬＳＶＤＨＳＤＰＶＩＬＮＶＬＹＧＰＤＤＰＴＩＳＰＳＹＴＹＹＲＰＧＶＮＬＳＬＳＣＨＡＡＳＮＰＰＡＱＹＳＷＬＩＤＧＮＩＱＱＨＴＱＥＬＦＩＳＮＩＴＥＫＮＳＧＬＹＴＣＱＡＮＮＳＡＳＧＨＳＲＴＴＶＫＴＩＴＶＳＡＥＬＰＫＰＳＩＳＳＮＮＳＫＰＶＥＤＫＤＡＶＡＦＴＣＥＰＥＡＱＮＴＴＹＬＷＷＶＮＧＱＳＬＰＶＳＰＲＬＱＬＳＮＧＮＲＴＬＴＬＦＮＶＴＲＮＤＡＲＡＹＶＣＧＩＱＮＳＶＳＡＮＲＳＤＰＶＴＬＤＶＬＹＧＰＤＴＰＩＩＳＰＰＤＳＳＹＬＳＧＡＮＬＮＬＳＣＨＳＡＳＮＰＳＰＱＹＳＷＲＩＮＧＩＰＱＱＨＴＱＶＬＦＩＡＫＩＴＰＮＮＮＧＴＹＡＣＦＶＳＮＬＡＴＧＲＮＮＳＩＶＫＳＩＴＶＳＡＳＧＴＳＰＧＬＳＡＧＡＴＶＧＩＭＩＧＶＬＶＧＶＡＬＩ
「ＣＥＡＣＡＭ６」（癌胎児性抗原関連細胞接着分子６）は、ＣＥＡＣＡＭ６遺伝子のタンパク質生成物を指す。完全長ヒトＣＥＡＣＡＭ６のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
配列番号４（完全長ヒトＣＥＡＣＡＭ６）：
ＭＧＰＰＳＡＰＰＣＲＬＨＶＰＷＫＥＶＬＬＴＡＳＬＬＴＦＷＮＰＰＴＴＡＫＬＴＩＥＳＴＰＦＮＶＡＥＧＫＥＶＬＬＬＡＨＮＬＰＱＮＲＩＧＹＳＷＹＫＧＥＲＶＤＧＮＳＬＩＶＧＹＶＩＧＴＱＱＡＴＰＧＰＡＹＳＧＲＥＴＩＹＰＮＡＳＬＬＩＱＮＶＴＱＮＤＴＧＦＹＴＬＱＶＩＫＳＤＬＶＮＥＥＡＴＧＱＦＨＶＹＰＥＬＰＫＰＳＩＳＳＮＮＳＮＰＶＥＤＫＤＡＶＡＦＴＣＥＰＥＶＱＮＴＴＹＬＷＷＶＮＧＱＳＬＰＶＳＰＲＬＱＬＳＮＧＮＭＴＬＴＬＬＳＶＫＲＮＤＡＧＳＹＥＣＥＩＱＮＰＡＳＡＮＲＳＤＰＶＴＬＮＶＬＹＧＰＤＧＰＴＩＳＰＳＫＡＮＹＲＰＧＥＮＬＮＬＳＣＨＡＡＳＮＰＰＡＱＹＳＷＦＩＮＧＴＦＱＱＳＴＱＥＬＦＩＰＮＩＴＶＮＮＳＧＳＹＭＣＱＡＨＮＳＡＴＧＬＮＲＴＴＶＴＭＩＴＶＳＧＳＡＰＶＬＳＡＶＡＴＶＧＩＴＩＧＶＬＡＲＶＡＬＩ
「抗ＣＥＡＣＡＭ抗体」は、少なくともＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６タンパク質、及び任意選択で任意の他のＣＥＡＣＡＭファミリータンパク質に結合することができる抗体である。
「ＣＤ３」は、多分子Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の一部としてＴ細胞上で発現され、２つ又は４つの受容体鎖：ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ゼータ、及びＣＤ３ガンマの会合から形成されたホモ二量体又はヘテロ二量体からなる抗原を指す。ヒトＣＤ３イプシロンは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、及びタンパク質断片に対する全ての言及は、非ヒト種由来のものであると明示的に指定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、又はタンパク質断片のヒトバージョンを指すことを意図する。したがって、「ＣＤ３」は、非ヒト種、例えば、「マウスＣＤ３」「サルＣＤ３」などからのものとして指定されない限り、ヒトＣＤ３を意味する。
配列番号５（ヒトＣＤ３イプシロン）：
ＭＱＳＧＴＨＷＲＶＬＧＬＣＬＬＳＶＧＶＷＧＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤＶＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩ
「二重特異性抗ＣＥＡＣＡＭ１／抗ＣＤ３抗体」、ＣＥＡＣＡＭ１／ＣＤ３抗体、ＣＥＡＣＡＭ１×ＣＤ３抗体などは、ＣＥＡＣＡＭ１及びＣＤ３に結合する抗体を指す。
「二重特異性抗ＣＥＡＣＡＭ／抗ＣＤ３抗体」、ＣＥＡＣＡＭ／ＣＤ３抗体、ＣＥＡＣＡＭ×ＣＤ３抗体などは、ＣＤ３並びに少なくともＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６タンパク質、及び任意選択で任意の他のＣＥＡＣＡＭファミリータンパク質に結合することができる抗体を指す。
「～と組み合わせて」とは、２つ以上の治療薬を、混合物の状態で一緒に、単剤として同時に、又は単剤として任意の順序で逐次、対象に投与することを意味する。
「ＣＥＡＣＡＭ陽性癌」は、測定可能なレベルのＣＥＡＣＡＭ１及び／又はＣＥＡＣＡＭ５及び／又はＣＥＡＣＡＭ６及び／又は任意の他のＣＥＡＣＡＭファミリータンパク質を示す癌組織又は癌細胞を指す。タンパク質のレベルは、生細胞又は溶解細胞で、例えばＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、フローサイトメトリー又はラジオイムノアッセイを使用する周知のアッセイを使用して測定することができる。一実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ陽性癌は、測定可能なレベルのＣＥＡＣＡＭ１を示す癌組織又は癌細胞を指す。別の実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ陽性癌は、測定可能なレベルのＣＥＡＣＡＭ５を示す癌組織又は癌細胞を指す。別の実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ陽性癌は、測定可能なレベルのＣＥＡＣＡＭ６を示す癌組織又は癌細胞を指す。
「癌細胞」又は「腫瘍細胞」とは、インビボ、エクスビボ、又は組織培養のいずれかにおいて、自然発生的な又は導入された表現型の変化を有する癌性、前癌性、又は形質転換細胞を指す。これらの変化は、必ずしも新たな遺伝物質の取り込みを伴うものではない。形質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の取り込み、又は外因性の核酸の取り込みにより発生し得るが、自然に又は発癌物質に対する暴露後にも発生して、それによって内因性の遺伝子を変異させ得る。形質転換／癌は、インビトロ、インビボ、及びエクスビボにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、増殖、悪性度、腫瘍特異的マーカーレベルの変化、浸潤性、ヌードマウスなどの適した動物宿主における腫瘍の増殖などによって例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ．１９９４））。
「治療する」、又は「治療」とは、治療的処置、及び予防的（prophylactic）若しくは予防的（preventative）手段の両方を意味し、対象は、望ましくない生理学的変化又は疾患を予防する、又は低減させる（少なくする）予定である。有益な又は所望の臨床結果としては、検出可能であろうと又は検出不可能であろうと、症状の緩和、疾患の程度の軽減、安定した（すなわち、悪化しない）疾患状態、疾患の進行の遅延又は鈍化、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的であろうと又は全体的であろうと）が挙げられる。「治療」はまた、対象が治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長させることを意味し得る。処置を要する者には、既に状態若しくは疾患を有している者、及び、状態若しくは疾患を有しやすい者、又は状態若しくは疾患を予防しようとする者が含まれる。
抗体の生成
キメラ及びヒト化抗体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体はキメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載されている。一実施例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる実施例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチされた」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
特定の実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減するために、ヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意選択的で、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換されている。
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法については、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）に概説されており、また、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）移植を記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（「表面再生」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（ＦＲシャッフリングを記載）；及びＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）ａｎｄ Ｋｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記載）に更に記載されている。
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域は、これらに限定されないが、「ベストフィット」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照のこと）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照のこと）；ヒト成熟（体細胞変異した）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照のこと）；及びスクリーニングＦＲライブラリ由来のフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）ａｎｄ Ｒｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照のこと）を含み得る。
ヒト抗体
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は、概して、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。
ヒト抗体は、抗原投与に応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されているトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより調製され得る。そのような動物は、典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有しており、その遺伝子座は内在性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わる、又は染色体外に存在する若しくは動物の染色体中に無作為に取り込まれる。そのようなトランスジェニックマウスでは、内在性免疫グロブリン遺伝子座は一般的には不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載している米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号、及びＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい）。そのような動物により産生されるインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより更に改変され得る。
ヒト抗体はハイブリドーマベースの方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞系は記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照のこと。）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されたヒト抗体はまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５） ａｎｄ Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）に記載されている。
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技術を以下に説明する。
ライブラリ由来抗体
本発明の抗体は、１種又は複数の所望の活性を有する抗体を求めてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離し得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し所望の結合特徴を有する抗体を求めてそのようなライブラリをスクリーニングするための種々の方法は当技術分野では既知である。そのような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００１）に概説されており、また、例えば、ｔｈｅ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）；Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）に更に記述されている。
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３－４５５（１９９４）に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：７２５－７３４（１９９３）に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原、更に自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１－３８８（１９９２）に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞からの未再構成Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号を含む。
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
多特異性抗体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、多特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多特異的抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、結合特異性の１つは、ＣＥＡＣＡＭ１に対するものであり、他は、任意の他の抗原に対するものである。特定の実施形態では、結合特異性の１つは、ＣＥＡＣＡＭ５に対するものであり、他は、任意の他の抗原に対するものである。特定の実施形態では、結合特異性の１つは、ＣＥＡＣＡＭ６に対するものであり、他は、任意の他の抗原に対するものである。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ１又はＣＥＡＣＡＭ５又はＣＥＡＣＡＭ６の２つの異なるエピトープに結合することができる。また、二重特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ１又はＣＥＡＣＡＭ５又はＣＥＡＣＡＭ６を発現する細胞に細胞傷害性薬物を局在化するためにも使用され得る。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
抗体変異体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成により調製することができる。そのような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達するために行われ得る。
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を高める又は減じるために変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作り出される又は取り除かれるようにアミノ酸配列を変化させることにより都合よく実現し得る。
特定の実施形態では、１つ又は複数のアミノ酸改変を本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによってＦｃ領域変異体を産生することができる。Ｆｃ領域の変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸改変（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
特定の実施形態では、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を企図する。インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイを行えば、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行えば、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）が、ＦｃＲｎ結合能は保持していることを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４ページ表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。代替えとして、非放射アッセイ法を用いることもある（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を参照のこと）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的に、又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイも実施して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、したがってＣＤＣ活性を欠くことを確認することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び同第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ，ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照のこと）。また、ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定は、当該技術分野で既知の方法を用いて行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照のこと）。
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ又は複数の置換を有するものを含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２つ以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ＦｃＲへの改善された又は減少した結合を有する特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照のこと。）
特定の実施形態では、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／又は３３４位での置換を有するＦｃ領域を含む（残基のＥＵ番号付け）。
いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されているように、変化した（すなわち、改善された又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす変化がＦｃ領域においてなされ得る。
母性ＩｇＧの胎児への移行の原因となる、半減期が増加し、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）ａｎｄ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４（Ａ１）号（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ又は複数の置換がその中にあるＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の１つ又は複数の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
特定の実施形態では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば、「チオＭＡｂ」を作り出すのが望ましいことがある。特定の実施形態では、置換される残基は抗体の接触可能部位に存在する。更に本明細書で説明されるように、それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基はそれにより抗体の接触可能部位に位置付けられ、この基を使用して抗体を、薬物部分又はリンカー薬物部分などの他の部分にコンジュゲートさせて、免疫コンジュゲートを作り出すことができる。特定の実施形態では、以下の残基の１つ又は複数がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載される通りに産生することができる。
組み換え法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されている組み換え法及び組成物を使用して産生することができる。一実施形態では、本明細書に記載する抗ＣＤ１２２抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードすることができる。更なる実施形態では、そのような核酸を含む１つ又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。１つのそのような実施形態では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクター、を含む（例えば、これらのベクターで形質転換されている）。一実施形態では、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、抗ＣＤ１２２抗体を作製する方法が提供され、当該方法は、抗体の発現に適した条件下で、上記のように、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、任意選択で宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
抗ＣＤ１２２抗体の組み換え産生のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入される。そのような核酸は従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離され配列決定される。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に好適な宿主細胞には、本明細書に記載される原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、細菌中で産生され得る。細菌中の抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照のこと。（また、Ｅ．ｃｏｌｉ内での抗体断片の発現を記載するＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照されたい。）発現後、抗体は、可溶性画分中で細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核生物が、抗体をコードするベクターに好適なクローニング又は発現宿主であり、これには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌及び酵母株が含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４），ａｎｄ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６）を参照のこと。
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併用され得る、多数のバキュロウイルス株が特定されている。
植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物中で抗体を産生させるためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について記載する）を参照のこと。
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で成長するように適合される哺乳類細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；ヒト胚性腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞、である。他の有用な哺乳類宿主細胞株には、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びにＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に好適な特定の哺乳類宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照のこと。
抗体の修飾
本発明の抗体は、例えば、効力、選択性、及び薬物相互作用などのペプチドの生物活性の貯蔵安定性、薬物動態、及び／又は任意の態様を操作するのに有用であり得る、当該技術分野で既知の１つ又は複数の修飾に供され得る。ペプチドを供することができる化学的修飾には、限定するものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ－（Ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、及びポリビニルアルコール、コリン酸若しくは他の炭水化物系ポリマー、アミノ酸のポリマー、並びにビオチン誘導体のうちの１つ又は複数のペプチドへのコンジュゲートが含まれる。Ｃｙｓ残基のタンパク質のＰＥＧコンジュゲートは、例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．＆ Ｋａｔｒｅ，Ｎ．Ｖ．（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８，３４３ ａｎｄ Ｋｏｇａｎ，Ｔ．Ｐ．（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍ．２２，２４１７に開示されている。
他の有用な修飾には、限定するものではないが、例えば、米国特許第６，２５１、８５６号及び国際公開第００／５５１１９号に記載されているような方法及び組成物を使用するアシル化が含まれる。
治療的投与
本発明の抗体は、個別に、又は他の薬理活性物質と併用して投与され得る。そのような併用療法は、限定するものではないが、複数の薬剤を単一の剤形又は別個の個々の剤形で一緒に投与することを含む異なる治療レジメンを包含することが理解されるであろう。薬剤が異なる剤形中に存在する場合、投与は、同時若しくはほぼ同時であり得るか、又は異なる薬剤の投与を包含する任意の所定のレジメンに従ってもよい。
例えば、癌を治療するために使用される場合、本発明の抗体は、免疫療法薬を含む１つ以上の薬剤を用いて併用治療レジメンで有利に投与され得る。
投与方法
本発明の抗体は、タンパク質及びペプチドを送達するための当該技術分野において既知の標準的な担体を含む薬学的組成物として、及び遺伝子療法によって投与投与され得る。好ましくは、医薬組成物は、医薬的に（すなわち、生理学的に）許容される担体、賦形剤、又は希釈剤、及び、ＣＥＡＣＡＭ１、又はＣＥＡＣＡＭ５、又はＣＥＡＣＡＭ６を標的とする分子のうちの１つ又は複数を有効成分として含む。一実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ１標的分子は、ＣＥＡＣＡＭ１に特異的に結合する抗体である。一実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ５標的分子は、ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する抗体である。一実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ６標的分子は、ＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合する抗体である。有効成分としてペプチドを含有する医薬組成物の調製は、当該技術分野で十分に理解されている。典型的には、そのような組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして注射剤として調製されるが、注入前の液体中の溶液又は懸濁液に好適な固体形態も調製することができる。調製は、更に乳化されてもよい。活性治療成分は、多くの場合、医薬的に（すなわち、生理学的に）許容可能であり、有効成分と適合性である賦形剤と混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ぶどう糖、グリセロール、エタノール等及びこれらの組み合わせである。更に、所望により、組成物は、有効成分の効果を高める湿潤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの、少量の補助剤を含有しても良い。
ＣＥＡＣＡＭ標的分子は、生理学的に許容される中和された塩形態として医薬組成物に配合され得る。一実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ標的分子は、ＣＥＡＣＡＭに特異的に結合する抗体である。好適な塩としては、例えば、塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される酸付加塩（すなわち、ペプチド分子の遊離アミノ基と形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基から形成される塩は更に、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化鉄、及び有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導することができる。
医薬組成物は、経口又は非経口経路によって全身投与され得る。非限定的な非経口投与経路としては、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経皮、吸入、鼻腔内、動脈内、髄腔内、経腸、舌下、又は直腸が挙げられる。アミノ酸配列の不安定な性質により、非経口投与が好ましい。好ましい投与様式としては、鼻腔又は気管支吸収のためのエアロゾル、静脈内、筋肉内、胸骨内又は皮下注射のための懸濁液、及び経口投与用の化合物が挙げられる。
静脈内投与は、例えば、単位用量の注射によって行うことができる。本発明の医薬組成物に関して使用される場合、「単位用量」という用語は、ヒトの単一用量として好適な物理的に離散的な単位を指し、各単位は、所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性物質を、必要な希釈剤、すなわち、濃縮された又は純粋な物質（液体又は固体のいずれか）を希釈するために使用されて、物質を使用のために正確な（希釈された）濃度にする液体と共に含有する。注射用投与について、組成物は、滅菌溶液又は懸濁液中にあるか、又は医薬的に及び生理学的に許容可能な水性又は油性ビヒクルで乳化され得るが、これは、溶液又は懸濁液をレシピエントの体液（すなわち、血液）と等張にするための防腐剤、安定剤、及び材料を含有し得る。
使用に好適な賦形剤は、水、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液、デキストロース、グリセロール、希釈エタノールなど、及びそれらの混合物である。例示的な安定剤は、ポリエチレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機酸、及び有機酸であり、それら自体で又は混合物として使用され得る。使用される量又は分量、並びに投与経路は、個別基準で決定され、当業者に既知の同様の種類の用途又は適応症において使用される量に対応する。
医薬組成物は、投与製剤と適合する方法で、及び治療有効量で投与される。投与されるべき量は、治療される対象と、有効成分を利用する対象の免疫システムの能力に依存する。投与される必要がある有効成分の正確な量は、施術者の判断に依存し、各個体に対して特異的である。
医薬製剤を調製する際の更なるガイダンスは、例えば、Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９９０，Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９９３，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９９０，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出すことができる。
本発明は更に、本明細書で詳細に記載されるように、ＩＲアゴニスト又はアンタゴニストペプチド、及び生理学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤を含む組成物を企図する。
以下の例は、本発明を例示する。これらの例は本発明の範囲を制限するとして解釈されてはならない。例は図示の目的のために含まれ、本発明は請求項によってのみ限定される。
実施例１．抗ＣＥＡＣＡＭ ｍＡｂの生成
１．１ ＯｍｎｉＲａｔｓ（登録商標）を使用した抗ＣＥＡＣＡＭ ｍＡｂの生成
ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）は、キメラヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座（ラットＣＨ遺伝子座に連結された天然立体構造の２２のヒトＶＨ、全てのヒトＤ及びＪＨセグメントを含む）を、完全なヒトＩｇＬ遺伝子座（Ｊκ－Ｃκに連結された１２のＶκ及びＪλ－Ｃλに連結された１６のＶλ）と共に含有する。（例えば、Ｏｓｂｏｒｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９０（４）：１４８１－１４９０を参照のこと）。したがって、このラットは、ラット免疫グロブリンの発現減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子がクラススイッチ及び体細胞変異を受けて、完全にヒトの可変領域を有する高親和性キメラヒト／ラットＩｇＧモノクローナル抗体が生成される。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）の調製及び使用、並びにこのようなラットが有しているゲノム改変は、国際公開第１４／０９３９０８号に記載されている。
ＯｍｎｉラットをヒトＣＥＡＣＡＭ１の細胞外ドメインで免疫化し、１０－Ｈｉｓタグ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃２２４４－ＣＭ、配列番号６）に融合し、尾、膝、腋窩、及び耳の基部の両側注射によって３乃至４日ごとに同じ抗原で追加免疫した。４８日間の免疫レジメンの後、ラットからのリンパ節を採取してハイブリドーマを生成するために使用し、ハイブリドーマ上清を以下に記載されるようにスクリーニングした。
配列番号６
ｑｌｔｔｅｓｍｐｆｎｖａｅｇｋｅｖｌｌｌｖｈｎｌｐｑｑｌｆｇｙｓｗｙｋｇｅｒｖｄｇｎｒｑｉｖｇｙａｉｇｔｑｑａｔｐｇｐａｎｓｇｒｅｔｉｙｐｎａｓｌｌｉｑｎｖｔｑｎｄｔｇｆｙｔｌｑｖｉｋｓｄｌｖｎｅｅａｔｇｑｆｈｖｙｐｅｌｐｋｐｓｉｓｓｎｎｓｎｐｖｅｄｋｄａｖａｆｔｃｅｐｅｔｑｄｔｔｙｌｗｗｉｎｎｑｓｌｐｖｓｐｒｌｑｌｓｎｇｎｒｔｌｔｌｌｓｖｔｒｎｄｔｇｐｙｅｃｅｉｑｎｐｖｓａｎｒｓｄｐｖｔｌｎｖｔｙｇｐｄｔｐｔｉｓｐｓｄｔｙｙｒｐｇａｎｌｓｌｓｃｙａａｓｎｐｐａｑｙｓｗｌｉｎｇｔｆｑｑｓｔｑｅｌｆｉｐｎｉｔｖｎｎｓｇｓｙｔｃｈａｎｎｓｖｔｇｃｎｒｔｔｖｋｔｉｉｖｔｅｌｓｐｖｖａｋｐｑｉｋａｓｋｔｔｖｔｇｄｋｄｓｖｎｌｔｃｓｔｎｄｔｇｉｓｉｒｗｆｆｋｎｑｓｌｐｓｓｅｒｍｋｌｓｑｇｎｔｔｌｓｉｎｐｖｋｒｅｄａｇｔｙｗｃｅｖｆｎｐｉｓｋｎｑｓｄｐｉｍｌｎｖｎｙｎａｌｐｑｅｎｇｌｓｐｇｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈ
１．２ ファージディスプレイライブラリを使用した抗ＣＥＡＣＡＭ ｍＡｂの生成
Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６，２０１０及び国際公開第２００９／０８５４６２号）に記載の通り、２セットのデノボｐＩＸファージディスプレイライブラリから標準的な方法を使用してＣＥＡＣＡＭ１結合Ｆａｂを選択した。簡潔に述べると、Ｖ３．０及びＶ５．０と呼ばれる２セットのライブラリは、ヒトスカフォールドを多様化させることによって作製されたものであり、生殖系列ＶＨ遺伝子ＩＧＨＶ１－６９＊０１、ＩＧＨＶ３－２３＊０１及びＩＧＨＶ５－５１＊０１を、Ｈ３ループを介してヒトＩＧＨＪ－４ミニ遺伝子で組み換え（Ｖ５．０ではＩＧＨＪ－６ミニ遺伝子も用いた）、そして、ヒト生殖系列ＶＬカッパ遺伝子Ｏ１２（ＩＧＫＶ１－３９＊０１）、Ｌ６（ＩＧＫＶ３－１１＊０１）、Ａ２７（ＩＧＫＶ３－２０＊０１）及びＢ３（ＩＧＫＶ４－１＊０１）をＩＧＫＪ－１ミニ遺伝子で組み換えて、完全なＶＨ及びＶＬドメインを構築した。多様化のために、タンパク質及びペプチド抗原と高頻度で接触するＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３ループ周辺の重鎖及び軽鎖可変領域内の位置を選択した。選択した位置における配列多様性は、それぞれのＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ遺伝子のＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ生殖系列遺伝子ファミリーにおいて各々の位置に存在する残基に制限した。Ｈ３ループにおける多様性は、Ｖ３．０ライブラリについては７～１４アミノ酸長、Ｖ５．０ライブラリについては６～１９アミノ酸長の短鎖乃至中鎖の合成ループを使用して作製した。Ｈ３におけるアミノ酸分布は、ヒト抗体において観察されるアミノ酸の変動を再現するよう設計された。ライブラリを作製するために利用したスカフォールドは、そのヒトＶＨ及びＶＬ生殖系列遺伝子の由来に従って命名した。Ｖ３．０及びＶ５．０のセットの両方では、３つの重鎖ライブラリの各々を、４つの生殖系列軽鎖又は生殖系列軽鎖ライブラリと組み合わせて、選択実験に使用されるライブラリの各セットとして、１２通りの固有のＶＨ：ＶＬの組み合わせを生成した。
Ｖ領域クローニング。ファージのハイブリドーマ細胞溶解物からの全ＲＮＡを、製造元のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙ ９６キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。得られたＲＮＡを、Ｄｒｏｐ Ｓｅｎｓｅを使用して定量し、－８０℃で保存したか又はＲＴ－ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いてｃＤＮＡ合成に使用した。それぞれ重鎖、κ鎖、及びλ鎖の定常領域にアニーリングする遺伝子特異的プライマーを使用して、第１の鎖のｃＤＮＡ合成を実施した。ＲＴ－ＰＣＲ反応混合物は、最高３μｇの精製ＲＮＡ、遺伝子特異的プライマー、ｄＮＴＰミックス、反応バッファ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）（４０Ｕ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ ＲＴ（２００Ｕ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１８０８０－０５１）で構成されており、５０℃で５０分間及び８５℃で５分間インキュベートされる。得られた一本鎖ｃＤＮＡを－２０℃で保存した、又はＰＣＲ増幅に直接使用した。ＰＬＡＴＩＮＵＭ Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲ反応を行った。最適化されたＰＣＲ条件を使用して、それぞれ、リーダー配列並びに重鎖、κ及びλ鎖の定常領域に、フォワード及びリバースプライマーをアニーリングさせることによって、ｖ領域断片を増幅させた。得られたＰＣＲ断片を配列決定し、回収したｖ領域のアミノ酸配列のコドンを最適化し、Ｆ４０５Ｌκ変異を有するＩｇＧ２シグマ定常領域を有するｐＵｎｄｅｒベースの発現ベクターにクローニングした。
Ｅｘｐｉ２９３小規模トランスフェクション及び精製。免疫化キャンペーン又はファージディスプレイから同定された選択抗体をクローニングし、ＩｇＧ２シグマとして発現させ、小さい２ｍＬスケールで精製した。Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地に１．２５×１０５－２．２５×１０５生存細胞／ｍＬの密度で播種し、３７℃、７％ＣＯ２で１２５ｍＬ－２Ｌ振盪フラスコ内において培養した。細胞を継代培養し、この場合、生存率９８～９９％で、密度が３×１０６－５×１０６生存細胞／ｍＬで対数増殖に達した。
トランスフェクションの日に、生存細胞密度及び生存率を求めた。製造元のトランスフェクションプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＭＡＮ０００７８１４）に従って、３×１０６生存細胞／ｍＬの密度で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後６日目に８５０×Ｇで１５分間遠心分離することによって培養物を収集した後、精製した。ｍＡｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ｒｅｓｉｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して清澄化した上清から抗体を精製し、ＰＢＳに透析した。ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使用して、濾液に対するＡ２８０測定により、タンパク質濃度を求めた。
実施例２．ＣＥＡＣＡＭ１への抗ＣＥＡＣＡＭ ｍＡｂの結合の特性評価
２．１ 組み換えＣＥＡＣＡＭ１への結合。ハイブリドーマ上清及びファージディスプレイ由来の抗体を、組み換えＣＥＡＣＡＭ１タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）への結合についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。
プレートを、５０μＬの１μｇ／ｍＬのＣＥＡＣＡＭ１（＃２２４４－ＣＭ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で４℃で一晩コーティングした。翌日、１６時間で、プレートを、ＰＢＳ中の２００μＬの０．４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ、Ａ９６４７）で１時間、室温でブロックした。プレートを、Ｂｉｏｔｅｋプレートウォッシャー上の３００μＬのＰＢＳ中０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０で１回洗浄した。０．４％ＢＳＡ中、又はＰＢＳのみ中の、１０μｇ／ｍＬから開始して０．０００１ｕｇ／ｍＬまでのＣＥＡＣＡＭ ｍＡｂの１／２ｌｏｇ希釈物を、各抗体についてプレーティングした。５０μＬの各希釈物をコーティングされたプレートに添加した。プレートを室温で約３０分間インキュベートした。次いで、Ｂｉｏｔｅｋプレートウォッシャーを使用して、３００μＬのＰＢＳ中０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０でプレートを３回洗浄した。５０μＬの１：１０，０００ヤギ抗ｈｕＦｃ’２－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０３６－０９８）をプレートに添加した。プレートを室温で約３０分間インキュベートした。次いで、Ｂｉｏｔｅｋプレートウォッシャーを使用して、３００μＬのＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０でプレートを３回洗浄した。５０μＬの３，３′，５，５′－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ Ｔ０４４０）を添加し、発色現像を可能にし、続いて５０μＬの４Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、プレートを４５０ｎｍで分析した。アイソタイプ対照（ヒトＩｇＧ２シグマ骨格を有するＲＳＶウイルスに特異的なＣＮＴＯ８９３９抗体）を、１０μｇ／ｍＬの濃度で最後の３プレートにプレーティングした。４５０ｎｍでの吸光度（図２）をＸＹ散布図を使用して分析し、対数変換後に非線形フィット曲線を生成し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してＥＣ５０値を計算した。いくつかの抗体については、曲線フィットが不十分なため、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してＥＣ５０を計算できなかった。この場合は、ＥＣ５０値は、利用可能な曲線の中間点で視覚的に推定された。組み換えＣＥＡＣＡＭ１への結合のＥＣ５０値を表１に示す。
Figure 2022550067000001
２．２ ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現する細胞に対する抗ＣＥＡＣＡＭ ｍＡｂの結合
ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｋ細胞に対する抗ＣＥＡＣＡＭ ｍＡｂの結合を評価した。
ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の生成。
完全長ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）細胞を、ＣＥＡＣＡＭ１をコードするレンチウイルスベクター（配列番号１）及びＧＦＰタグ（ＬＰＰ－Ｕ００４５－Ｌｖ１０５－２００、Ｇｅｎｅｃｏｐｅｏｉａ）を使用して生成した。細胞を新鮮な培地で洗浄し、次いで、８μｇ／ｍＬのポリブレンを含有するＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ）中に２×１０６細胞／ｍＬで懸濁させた。１２ウェル組織培養プレートに、０．５ｍＬの細胞懸濁液（１×１０６細胞）をウェルごとに添加した。ウイルス粒子を、０．３、１．０、３．０及び５．０単位の感染多重度（ＭＯＩ）で添加した。プレートを穏やかに混合し、室温でフード内で２０分間インキュベートした。プレートを３７℃で１５００ｇで９０分間遠心分離した。０．５ｍＬの新鮮なＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を細胞に添加した。プレートを３７℃で４８～７２時間インキュベートした。ＵＶ光下でＧＦＰシグナルの存在について細胞を確認した。８０～９０％のコンフルエントで、細胞をより大きな１００ｍｍの皿又はＴ－７５に移し、培地を０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含む選択培地と交換した。細胞を監視し、ほとんどの細胞が選択培地下で生存可能となるまで、次の数日間又は数週間にわたって、選択培地（０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンで補充されたＯｐｔｉ－ＭＥＭ）に維持した。標識抗体を使用して細胞をタンパク質発現について染色し、ＦＡＣＳ分析の準備をした。十分な発現レベルに達したときに、安定した細胞を凍結させた、又は高／中又は低発現細胞に分類した。選択は、０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを使用して１週間行った。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーを使用して、ＣＥＡＣＡＭ－１の表面発現を確認した。フローサイトメトリー染色のために、細胞を、ヒトＦｃブロック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１：２０）及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：５００）を含むＦＡＣＳ染色緩衝液中で、室温で１５分間ブロッキングした。次いで、細胞を、４℃で３０分間、５０μＬのＦＡＣＳ染色緩衝液／ウェル中で以下の抗ヒト抗体のうちの１つで染色した：フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ＣＥＡＣＡＭ－１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＦＡＢ２２４４Ｐ）、１：５０）、フィコエリトリン結合マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及び非標識抗ＣＥＡＣＡＭ－１（ＣＤ６６ａに特異的）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＡＢＴ６５、１：５０）。抗体及びマウスＩｇＧ１アイソタイプを、ＰＥ抗マウス二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：２００）で検出した。
次いで、標準的な技術を使用して、ＣＥＡＣＡＭ１過剰発現細胞をサブクローニングし、ＣＥＡＣＡＭ１陽性細胞の精製集団について選別した（図３）。次いで、これらの細胞を使用して、フローサイトメトリーによって結合曲線を生成した（図４）。過剰発現細胞の表面に結合するＣＥＡＣＡＭ抗体は、ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－６０６－０９８）を使用して検出された。ほとんどの抗体は、ＣＥＡＣＡＭ－１発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に非常に良好に結合し、力価がなかった、つまり、結合が検出不能である濃度に達しなかった（表２）。
Figure 2022550067000002
実施例３．ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６への抗ＣＥＡＣＡＭ ｍＡｂの結合の特性評価
３．１ 組み換えＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６への結合。組み換えＣＥＡＣＡＭ５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ＃４１２８－ＣＭ）及びＣＥＡＣＡＭ６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ＃３９３４－ＣＭ）に対する精製されたファージ及びハイブリドーマ抗体の特異性のクロススクリーニングを、実施例２に記載のプロトコルに従ってＥＬＩＳＡを使用して実施した。ＣＥＡＣＡＭ５に対するｍＡｂの結合の結合曲線を図５ａに、ＣＥＡＣＡＭ６に対するｍＡｂの結合の結合曲線を図５ｂに示す。ＣＥＡＣＡＭ１抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質及びＣＥＡＣＡＭ６タンパク質への可変結合を有し、いくらかの交差反応性（cross－reativity）を示した（表３）。
Figure 2022550067000003
３．２ ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６を過剰発現する細胞への結合。ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、実施例２に記載のプロトコルに従って、ＣＥＡＣＡＭ５（ＬＰＰ－Ｇ００５６－Ｌｖ１０５－１００、Ｇｅｎｅｃｏｐｅｏｉａ）及びＣＥＡＣＡＭ６（ＬＰＰ－Ｇ０３０４－Ｌｖ１０５－１００、Ｇｅｎｅｃｏｐｅｏｉａ）をコードするレンチウイルスベクターによる形質導入を使用して生成した。実施例２に記載の手順に従って、フローサイトメトリーを使用して、細胞の表面上のＣＥＡＣＡＭ５又はＣＥＡＣＡＭ６の発現を確認した（図６ａ及び６ｂ）。ＣＥＡＣＡＭ－５の安定したプールを、ＦＡＣＳ Ａｒｉａを使用して選別して、低タンパク質発現を除去した。ＰＥコンジュゲート抗ＣＥＡＣＡＭ－１，５，６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３４２３５８、１：５０）及びＰＥコンジュゲートマウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６細胞株に使用した。ＣＥＡＣＡＭ５を過剰発現する細胞に対するｍＡｂの結合の結合曲線を図７ａに、ＣＥＡＣＡＭ６を過剰発現する細胞に対するｍＡｂの結合の結合曲線を図７ｂに示す。結果は、いくつかのＣＥＡＣＡＭ１抗体が有意な交差反応性（cross-reativity）を有し、ＣＥＡＣＡＭ５又はＣＥＡＣＡＭ６を発現する細胞に結合したが、他のＣＥＡＣＡＭ１抗体は、これらの細胞にほとんど又は全く結合しなかったことを示唆した（表４）。
Figure 2022550067000004
実施例４．抗ＣＥＡＣＡＭ ｍＡｂの構造的特性
標準的な技術を用いて、抗体のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳物を得た。ポリペプチド配列の決定後、可変領域又は完全長抗体をコードしているいくつかの抗体ｃＤＮＡを、発現をスケールアップするための標準的な方法を用いてコドンを最適化した。
表５は、選択抗ＣＥＡＣＡＭ抗体の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を示す。
表６は、選択抗ＣＥＡＣＡＭ抗体の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を示す。
表７は、選択抗ＣＥＡＣＡＭ抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を示す。
Figure 2022550067000005
Figure 2022550067000006
Figure 2022550067000007
Figure 2022550067000008
実施例５．抗ＣＥＡＣＡＭ ｍＡｂによるＴ細胞活性化及びエフェクター機能の調節
抗ＣＥＡＣＡＭ抗体を、Ｔ細胞活性化及びエフェクター機能を調節する能力について評価した。これは、ＣＥＡＣＡＭ結合抗体の存在下又は非存在下で、ＣＤ３に特異的な抗体（ＯＫＴ３、Ｊａｎｓｓｅｎ、ＩｇＧ１骨格上に操作）で正常なドナーＴ細胞を活性化することによって行われた。Ｔ細胞の活性を、分化、増殖、及びサイトカイン分泌を評価することによって評価した。Ｔ細胞活性化パラメータの変数調節を示す代表的な試料を、以下の例として示す。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）刺激。ＰＢＭＣを新鮮な血液／ロイコパック（ＨｅｍａＣａｒｅ，Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ，ＣＡ）から解凍又は単離し、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ）で洗浄し、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）及び１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ）を補充した。ＰＢＭＣの増殖を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して評価した。ＰＢＭＣをカウントし、２×１０６／ｍＬで再懸濁した。抗ＣＥＡＣＡＭ抗体培地希釈物又は培地単独のいずれかを含有する５０μＬを、９６ウェル丸底プレートに添加した。抗ＣＤ３又は培地を含有する５０μＬを９６ウェル丸底プレートに添加した。１ウェルあたり１００μＬ又は２×１０５個の細胞で、細胞をプレーティングした。プレートを３７℃で３日間インキュベートした。
染色及びサイトメトリー分析。インキュベート後、プレートをスピンダウンし、サイトカイン分析のために１００μＬの上清を回収した。細胞ペレットを、Ｆｃブロック及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（Ｌｉｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号Ｌ３４９５７）を含有する５０μＬのＢＤ ＦＡＣＳ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁した。プレートを室温で１５分間インキュベートし、１５０μＬのＢＤ ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞ペレットを、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ（ＢＶ）６０５（商標）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３２９９２３）とコンジュゲートした抗ＰＤ－１抗体、ＢＶ６５０（ＢＤ ＃５６３７１９）とコンジュゲートした抗ＣＤ２５抗体、ＢＶ７１１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３１７４４０）とコンジュゲートした抗ＣＤ４抗体、ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３０１０４５）とコンジュゲートした抗ＣＤ８抗体、及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３０５３１２）とコンジュゲートした抗ＣＥＡＣＡＭ１を含む抗体のカクテルを含有する５０μＬのＢＤ ＦＡＣＳ緩衝液に３０分間再懸濁した。細胞を１５０μＬのＢＤ ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、５０μＬのｅＢｉｏｓｃｅｎｃｅ ＦｏｘＰ３緩衝液中で２０分間透過処理した。細胞を１５０μＬのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＦｏｘＰ３ ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液で洗浄し、次いで、フローサイトメトリー抗体を含有するｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＦｏｘＰ３ ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液中に、Ｆｌｏｗ Ｐａｎｅｌごとに３０分間再懸濁した。細胞を１５０μＬのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＦｏｘＰ３ ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液中で洗浄し、次いで１５０μＬのＢＤサイトフィックスに固定し、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで分析した。サイトカインを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｖｉｃｅｓ ヒトＴｈ１／Ｔｈ２組織培養キット（ＭＳＤ、Ｋ１５０１０Ｂ）を実行することによって分析した。簡単に説明すると、Ｔ細胞培養物からの上清を、予め被覆されブロックされた９６ウェルプレート上で１時間インキュベートし、ＭＳＤ検出抗体ブレンドで１時間検出し、続いて、読み取り緩衝液の洗浄及び添加を行った。次いで、プレートをＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒプレートリーダーで読み取った。同じプレートからの標準曲線を使用して、蛍光値を使用してサイトカイン濃度を計算した。
結果は、ＣＥＡＣＡＭ結合抗体が３つのタイプのＴ細胞活性化全てを調節したことを実証した。最初に抗ＣＤ３抗体と組み合わせたＣＥＡＣＡＭ１抗体への曝露に応答して、表面マーカー発現をＴ細胞上で誘導した（図８）。Ｔ細胞の表面上のＰＤ－１の発現を、Ｔ細胞の活性化のマーカーとして使用した（図８）。ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の両方は、ＣＤ３単独と比較して、ＣＥＡＣＡＭ結合抗体の存在下でＰＤ－１のレベルが２倍まで増加した（ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ）。第２に、Ｔ細胞増殖の分析は、細胞トレースバイオレット（ＣＴＶ）の希釈による分裂細胞の増加を示した（ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ）（図９）。最後に、ＣＤ３刺激の存在下でのＴ細胞に対するＣＥＡＣＡＭのライゲーションは、サイトカインＩＦＮγ（図１０ａ、ｐ＝０．０１０５、ＡＮＯＶＡ）及びＴＮＦα（図１０ｂ、ｐ＝０．０１４６、ＡＮＯＶＡ）の産生を増加させた。
実施例６．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体によるマウスモデルにおける腫瘍に対するＴ細胞応答の調節。
抗ＣＥＡＣＡＭ抗体を使用して、ヒト化マウスモデルにおける有効性を実証することもできる。Ｔ細胞上のＣＥＡＣＡＭ相互作用を遮断することは、Ｔ細胞に対する活性化及び機能を改善し、したがって、ヒト化マウスモデルにおける腫瘍の成長阻害又は退縮において役割を果たし得る。白血病、リンパ腫、若しくは骨髄腫などの血液系腫瘍、又は黒色腫、前立腺癌、又は非小細胞肺癌細胞株などの固形腫瘍のいずれか由来の腫瘍を有するマウスに対するＴ細胞の生着と同時に、生着前に、又は生着後に抗ＣＥＣＡＭ抗体を投与することにより、腫瘍成長を制御するためのＴ細胞の能力を高めることができる。

Claims (39)

  1. それぞれ配列番号７、８、９、１０、１１、及び１２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ（癌胎児性抗原関連細胞接着分子）抗体又はその抗原結合断片。
  2. 配列番号７９の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号８０の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  3. それぞれ配列番号１３、１４、１５、１６、１７、及び１８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  4. 配列番号８１のＶＨ及び配列番号８２のＶＬを含む、請求項３に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  5. それぞれ配列番号１９、２０、２１、２２、２３、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  6. 配列番号８３のＶＨ及び配列番号８４のＶＬを含む、請求項５に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  7. それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  8. 配列番号８５のＶＨ及び配列番号８６のＶＬを含む、請求項７に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  9. それぞれ配列番号３１、３２、３３、３４、３５、及び３６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  10. 配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含む、請求項９に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  11. それぞれ配列番号３７、３８、３９、４０、４１、及び４２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  12. 配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含む、請求項１１に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  13. それぞれ配列番号４３、４４、４５、４６、４７、及び４８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  14. 配列番号９１のＶＨ及び配列番号９２のＶＬを含む、請求項１３に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  15. それぞれ配列番号４９、５０、５１、５２、５３、及び５４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  16. 配列番号９３のＶＨ及び配列番号９４のＶＬを含む、請求項１５に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  17. それぞれ配列番号５５、５６、５７、５８、５９、及び６０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  18. 配列番号９５のＶＨ及び配列番号９６のＶＬを含む、請求項１７に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  19. それぞれ配列番号６１、６２、６３、６４、６５、及び６６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  20. 配列番号９７のＶＨ及び配列番号９８のＶＬを含む、請求項１９に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  21. それぞれ配列番号６７、６８、６９、７０、７１、及び７２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  22. 配列番号９９のＶＨ及び配列番号１００のＶＬを含む、請求項２１に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  23. それぞれ配列番号７３、７４、７５、７６、７７、及び７８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  24. 配列番号１０１のＶＨ及び配列番号１０２のＶＬを含む、請求項２３に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  25. 単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又は前記その抗原結合断片が、ＣＥＡＣＡＭ１、及び任意選択でＣＥＡＣＡＭ５又はＣＥＡＣＡＭ６への結合に関して、
    ａ）配列番号７９の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号８０の軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
    ｂ）配列番号８１のＶＨ及び配列番号８２のＶＬ、
    ｃ）配列番号８３のＶＨ及び配列番号８４のＶＬ、
    ｄ）配列番号８５のＶＨ及び配列番号８６のＶＬ、
    ｅ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、
    ｆ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、
    ｇ）配列番号９１のＶＨ及び配列番号９２のＶＬ、
    ｈ）配列番号９３のＶＨ及び配列番号９４のＶＬ、
    ｉ）配列番号９５のＶＨ及び配列番号９６のＶＬ、
    ｊ）配列番号９７のＶＨ及び配列番号９８のＶＬ、
    ｋ）配列番号９９のＶＨ及び配列番号１００のＶＬ、又は
    ｌ）配列番号１０１のＶＨ及び配列番号１０２のＶＬ、を含む参考抗体と競合する、単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  26. 前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１～２５のいずれか一項に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  27. 前記抗体が、多特異性抗体である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体。
  28. 前記抗体が、二重特異性抗体である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体。
  29. 請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  30. １つ又は複数の異種分子にコンジュゲートした、請求項１～２９のいずれか一項に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。
  31. 請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  32. 前記抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又は前記その抗原結合断片をコードし、かつ配列番号７９～１０２からなる群から選択される配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  33. 請求項３２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  34. 請求項３３に記載のベクターを含む宿主細胞。
  35. 請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、前記抗体が発現する条件下で請求項３４に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって産生された前記抗体を回収することとを含む、方法。
  36. ＣＥＡＣＡＭ陽性癌の治療を必要とする対象においてＣＥＡＣＡＭ陽性癌を治療する方法であって、治療的に有効な量の請求項１～２８のいずれか一項に記載の単離された抗ＣＥＡＣＡＭ抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項３４に記載の医薬組成物を、前記対象に投与して、前記ＣＥＡＣＡＭ陽性癌を治療することを含む、方法。
  37. 前記抗ＣＥＡＣＡＭ抗体又は前記その抗原結合断片が、第２の治療剤と組み合わせて投与される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記第２の治療剤が、手術、化学療法、アンドロゲン遮断療法、若しくは放射線、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項３７に記載の方法。
  39. 請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗体を含むキット。
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