EA031006B1 - Антитела против cd134 (ox40) и их применение - Google Patents

Abstract

Согласно настоящему изобретению предложены антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, которые специфически связываются с CD134 человека и содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие последовательности аминокислот SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8 соответственно; и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие последовательности аминокислот SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11 соответственно. Антитела к CD134 человека согласно настоящему изобретению специфически связываются с внеклеточным доменом CD134 человека, включая домены, не связывающие OX40-лиганд (OX40L), на молекуле CD134 человека, которая экспрессируется, например, на активированных традиционных эффекторных CD4 и/или CD8 Т-лимфоцитах человека (Тэфф) и на активированных супрессорных CD4 регуляторных Т-лимфоцитах человека (Трег). Антитела к CD134 человека согласно настоящему изобретению можно применять для лечения рака (например, для усиления противоопухолевой эффекторной функции Тэфф и/или для подавления супрессорной функции Трег).

Description

Настоящее изобретение относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам антител, которые связываются с CD134, а также применению таких антител или их фрагментов, в частности, для лечения рака.

Уровень техники

Усиление противоопухолевой функции Т-лимфоцитов представляет собой уникальный подход к лечению рака. Существует большое количество данных, свидетельствующих о том, что клетки опухоли скрываются от иммунной системы, вызывая активную иммунную толерантность, опосредуемую главным образом регуляторными Т-лимфоцитами (Трег; Quezda et al. Immunol Rev 2011; 241: 104-118). Следовательно, равновесие между эффекторными Т-лимфоцитами (Тэфф) (т.е. прямым или косвенным уничтожением клеток опухоли)и вызывающими иммунную толерантность регуляторными Т-лимфоцитами (Трег) (т.е. подавление эффекторной функции и выживания Тэфф), по-видимому, является критическим для эффективной противоопухолевой иммунотерапии. Иначе говоря, эффективного противоопухолевого иммунного ответа можно достичь путем усиления эффекторной функции опухоль-специфичных Тэфф и/или путем ослабления супрессорной функции Трег. Ключевым рецептором, который, как было показано, опосредует указанные реакции, является рецептор CD134 (ОХ40) (Sugamura, K., Ishii, N., Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40. Nature Rev Imm 2004; 4: 420431).

CD134 (также называемый ОХ40, TNFRSF4 и ACT35) является членом суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли. Данный поверхностный костимулирующий рецептор CD 134 экспрессируется на мембране активированных Т-лимфоцитов и играет важную роль в их выживании и функционировании. Присутствие CD134-экспрессирующих Т-лимфоцитов было продемонстрировано в разных злокачественных опухолях человека и в дренирующих лимфатических узлах пациентов, страдающих раком (Ramstad et al. Am J Surg 2000; 179: 400-406; Vetto et al. Am J Surg 1997; 174: 258-265).

Сшивание рецептора CD 134 мыши in vivo (либо при помощи растворимых гибридных белков, состоящих из лиганда ОХ40 мыши (ОХ40L)-иммуноглобулина, либо при помощи миметиков OX40L мыши, таких как CD134-специфические антитела) у мышей с опухолью усиливает противоопухолевый иммунитет, что приводит к выживанию без опухоли в моделях на мышах с разными линиями клеток злокачественных опухолей мышей, например, лимфомы, меланомы, саркомы, рака толстой и ободочной кишки, рака молочной железы и глиомы (Sugamura et al. Nature Rev Imm 2004; 4: 420-431).

Было предложено усиливать иммунный ответ млекопитающих на антиген путем привлеченияа OX40R посредством применения агента, связывающего OX40R (WO 99/42585; Weinberg, 2000). Хотя указанный документ относится главным образом к OX40R-связывающим агентам, особое внимание уделено применению OX40L или его части; анти-ОХ40 антитела упоминаются в контексте их эквивалентности OX40L. Действительно, когда группа Weinberg перевела научный поиск в рамки исследования на низших приматах, они снова намеренно выбрали антитело, которое связывается с OX40L-связывающим сайтом и в целом имитирует OX40L.

Al-Shamkhani et al. (Eur J Chem 1996; 26: 1695-1699) применяли анти-ОХ40 антитело под названием 0X86, которое не блокировало связывание OX40L, чтобы определить дифференциальную экспрессию ОХ40 в активированных Т-лимфоцитах мыши; а Hirschhorn-Cymerman et al. (J Exp Med 2009; 206: 11031116) применяли OX86 вместе с циклофосфамидом в модели на мышах в качестве потенциальной химиотерапии. Однако нельзя ожидать, что OX86 будет связываться с ОХ40 человека, и, когда предстоит выбор антитела, которое могло бы быть эффективным у человека, в свете работы Weinberg, можно выбрать антитело, которое действительно связывается с OX40L-связывающим сайтом.

Сшивание рецептора CD 134 человека in vivo (при помощи антител, специфически направленных против CD134 человека, которые взаимодействуют с OX40L-связывающим доменом на CD134 человека; патент США 2009/0214560 A1) у мышей с тяжелым сочетанным иммунодефицитом (SCID) приводит к усилению противоопухолевого иммунитета, что ведет к подавлению роста опухолей, полученных из линий клеток разных злокачественных опухолей человека, например, лимфомы, рака предстательной железы, рака толстой и ободочной кишки и рака молочной железы.

Точный механизм противоопухолевого иммунного ответа, опосредуемого сшиванием CD134 человека, у людей еще не выяснен, но предполагается, что он опосредуется трансмембранным сигнальным путем CD134, который стимулируется взаимодействием с OX40L. Такое взаимодействие опосредуется связыванием тримерного OX40L с CD134. В ныне существующих противоопухолевых средствах применение тримеризованного лиганда ОХ40 предлагается в качестве более эффективного агента, чем антитела против ОХ40 (Morris et al. Mol Immunol 2007; 44: 3112-3121).

Сущность изобретения

Авторы настоящей заявки неожиданно выявили, что для индукции опосредуемой Т-лимфоцитами противоопухолевой активности можно применять изолированную связывающую молекулу, которая связываются с CD134, причем указанная связывающая молекула представляет собой антитело, или антигенсвязывающий фрагмент антитела не препятствует связыванию рецептора CD134 человека (CD134) с лигандом ОХ40 (OX40L), что приводит к усилению иммунного ответа, характеризуемому усилением им

- 1 031006 муностимулирующей/эффекторной функции Т-эффекторных клеток и/или пролиферацией указанных клеток и/или подавлением иммуносупрессорной функции регуляторных Т-клеток.

Соответственно согласно настоящему изобретению предложены изолированные антитела, или фрагменты антител, которые связываются с CD 134 человека, причем указанная связывающая молекула не препятствует связыванию рецептора CD134 человека (ОХ40) с лигандом ОХ40 (OX40L).

Подходящие антитела против CD134, антигенсвязывающие фрагменты указанных анти-CD134 антител и производные указанных анти-CD134 антител содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие последовательности аминокислот SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8 соответственно; и вариабельную область легкой цепи, содержащую: CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие последовательности аминокислот SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11 соответственно. Согласно некоторым вариантам реализации указанная связывающая молекула связывается с CD134 человека с K_d 1х10^-7 M или менее. Связывающая молекула обладает агонистической активностью в отношении CD134 на поверхности эффекторных Т-клеток человека и/или антагонистической активностью в отношении CD134 на поверхности регуляторных Т-клеток человека. Согласно некоторым дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения указанная связывающая молекула представляет собой моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с CD 134 человека с K_d of 100 нМоль или менее, предпочтительно менее 50 нМоль, более предпочтительно менее 20 нМоль.

Также согласно настоящему изобретению предложена композиция, которая содержит одну или более указанных связывающих молекул и фармацевтически приемлемую основу. Согласно некоторым вариантам реализации указанная связывающая молекула является моноклональным антитело к CD 134 человека или его антигенсвязывающим фрагментом.

Указанная композиция может также содержать дополнительные фармацевтические агенты, такие как иммунотерапевтический агент, химиотерапевтический агент и агенты для гормональной терапии.

Также согласно настоящему изобретению предложены способы применения указанных связывающих молекул, в частности антител и их антигенсвязывающих фрагментов антител, для диагностики и лечения. Согласно некоторым вариантам реализации предложен способ лечения или профилактики рака у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества связывающей молекулы или композиции, содержащей связывающую молекулу, которая охарактеризована в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации предложен способ усиления иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества такой связывающей молекулы. Согласно конкретным вариантам реализации связывающая молекула, применяемая при реализации указанных способов, представляет собой моноклональное антитело к CD 134 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с CD134 человека, причем указанное антитело не препятствует связыванию рецептора CD134 человека (ОХ40) с лигандом ОХ40 (OX40L).

Также согласно настоящему изобретению предложены молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют последовательность аминокислот указанной связывающей молекулы, векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, содержащие указанные векторы, и способы получения указанных связывающих молекул.

Также настоящее изобретение включает другие аспекты, которые станут очевидны при ознакомлении с настоящим описанием, включая пункты формулы изобретения.

Описание фигур

Настоящее изобретение описано со ссылками на сопутствующие чертежи.

Фиг. 1. Динамика и зависимость доза-эффект для воздействия PHA-M на экспрессию CD134 человека на поверхности Т-лимфоцитов человека.

Фиг. 2. Экспрессия CD134 человека на покоящихся и активированных PHA-M CD4 Т-лимфоцитах.

Фиг. 3. Характеристики связывания антител мыши к CD 134 человека - клон ACT35, клон 12H3 и клон 20E5, на поверхности PHA-M-стимулированных Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих CD134.

Фиг. 4. Связывание антител мыши к CD 134 человека - клон 12H3 и клон 20E5, на поверхности PHA-M-стимулированных Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих CD134, CD4 Т-лимфоцитах и CD8 Т-лимфоцитах.

Фиг. 5. Перекрестная конкуренция немеченых антител мыши к CD 134 человека - клон 12H3 или клон 20E5 - с ПЭ-конъюгированными коммерческими антителами мыши к CD134 человека - клон ACT35 или клон L106 на поверхности PHA-M-стимулированных Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих CD134.

Фиг. 6. Одновременное связывание антител мыши к CD134 человека - клон 12H3 или клон 20E5 - с OX40L человека на поверхности PHA-M-стимулированных Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих CD134.

Фиг. 7. Динамика эффекта при воздействии стимулирующих сфер с антителами к CD3 человека/СВ28 человека на экспрессию CD134 человека на поверхности эффекторных Т-лимфоцитов человека (Тэфф) и регуляторных Т-лимфоцитов (Трег).

- 2 031006

Фиг. 8. Зависимость доза-эффект для воздействия антител мыши к CD 134 человека - клон 12H3 или клон 20E5 - или OX40L человека на пролиферацию PHA-M-стимулированных Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих CD134.

Фиг. 9. Эффект комбинации антител мыши к CD134 человека - клон 12H3 - с OX40L человека, или антител мыши к CD 134 человека - клон 20E5 - с OX40L человека на пролиферацию PHA-M-стимулированных Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих CD134.

Фиг. 10. Эффект от воздействия антител мыши к CD134 человека - клон 12H3 или клон 20E5, или OX40L человека на пролиферацию эффекторных Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих CD134, стимулированных стимулирующими сферами с антителами к CD3 человека/к CB28 человека.

Фиг. 11. Эффект воздействия антител мыши к CD134 человека - клон 12H3 или клон 20E5, или OX40L человека на пролиферацию регуляторных Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих CD134, стимулированных стимулирующими сферами с антителами к CD3 человека/к CB28 человека.

Фиг. 12. Эффект антител мыши к CD134 человека - клон 12H3 на опосредуемую OX40L человека пролиферацию эффекторных (A) и регуляторных (B) Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих CD134, стимулированных стимулирующими сферами с антителами к CD3 человека/CB28 человека.

Фиг. 13. Эффект от воздействия антител мыши к CD134 человека-клон 12H3 или клон 20E5, или OX40L человека на супрессию пролиферации эффекторных Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих CD134, опосредуемую регуляторными Т-лимфоцитами человека, экспрессирующих CD134.

Фиг. 14. Связывание химерного антитела из IgG4K человека и анти-CD134 человека - клон 20E5 - на (минус и плюс IL-2) поверхности CD4 Т-лимфоцитов и CD8 Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD134 человека, стимулированных CD3/CD28 сферами.

Фиг. 15. Влияние химерного антитела из IgG4K человека и анти-CD134 человека - клон 20E5 - или OX40L человека на пролиферацию PHA-M-стимулированных Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих CD134.

Фиг. 16. Зависимость «доза-эффект» для воздействия химерного антитела из IgG4K человека и антиCD134 человека - клон 20E5 - или OX40L человека на пролиферацию PHA-M-стимулированных Тлимфоцитов человека, экспрессирующих CD134.

Фиг. 17. Действие комбинации химерного антитела из IgG4K человека и анти-CD134 человека клон 20E5 - с OX40L человека на пролиферацию PHA-M-стимулированных Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих CD134.

Фиг. 18. Действие химерного антитела из IgG4K человека и анти-CD134 человека - клон 20E5 - или OX40L человека на пролиферацию (минус и плюс IL-2) Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD134 человека, стимулированных CD3/CD28 сферами.

Фиг. 19. Связывание антител мыши к CD134 человека - клоны 12H3 и 20E5 - невосстановленным и восстановленным рекомбинантным белком CD134 человека: Fcy человека. (A) Изучали невосстанавливающие (a, b) и восстанавливающие (с, d) условия. (B) Характер электрофоретической подвижности рекомбинантного белка CD134 человека: Fcy человека (rhuCD134) при невосстанавливающих (a, b) и восстанавливающих (с, d) условиях, определенный при помощи окрашивания Кумасси бриллиантовым голубым. (С) Вестерн-блоттинг рекомбинантного белка CD134 человека: Fcy человека в невосстанавливающих (a, b) и восстанавливающих (с, d) условиях при воздействии контрольного антитела мыши - изотип IgG1K (mIgG1) или антител мыши к CD134 человека - клоны 12H3 и 2Е5 (m12H3 и m20E5 соответственно).

Фиг. 20. Схематическое изображение цистеин-богатых доменов (CRD) в полноразмерном CD 134 человека (обозначен как CRD1) и в разных процессированных формах CD134 человека (обозначены как CRD2, CRD3, CRD4 и процессированный (tc) CRD4).

Фиг. 21. Связывание антител мыши к CD134 человека - клоны 12H3 и 20E5 - на поверхности клеток линии 293-F, временно трансфецированных конструкцией полноразмерного CD134 человека (обозначен как CRD1) или конструкциями разных процессированных форм CD134 человека (обозначены как CRD2, CRD3, CRD4 и процессированный (tc) CRD4).

Фиг. 22. Связывание химерных антител из IgG4K и/или IgG 1k человека и анти-CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 - на поверхности клеток линии 293-F, временно трансфецированных конструкцией полноразмерного CD134 человека (обозначен как CRD1) или конструкциями разных процессированных форм CD134 человека (обозначены как CRD2, CRD3, CRD4 и процессированный (tc) CRD4).

Фиг. 23. Связывание антител мыши к CD 134 человека - клон 12H3 (A) и химерного антитела из IgG4K и/или IgG1K человека и анти-CD134 человека - клона 12H3 (B) с пептидом, полученным из CD134 человека, который соответствует последовательности аминокислот процессированного A1-модуля субдомена CRD3 A1-модуль-CRD4 (в соответствии с определением Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677683).

Описание изобретения

Активация Т-лимфоцитов опосредуется не только стимуляцией антигенами через рецепторы Тлимфоцитов, но также и костимулирующими сигналами через костимулирующие молекулы. Среди не

- 3 031006 скольких костимулирующих молекул ключевую роль в выживании и гомеостазе эффекторных Т-клеток и Т-клеток памяти играет член семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF) - ОХ40 (CD134). В соответствии со сложившимися представлениями о костимуляции ОХ40 взаимодействие между ОХ40 и лигандом ОХ40 (OX40L) возникает, когда активированные Т-лимфоциты связываются с профессиональными антиген-представляющими клетками (АПК). Впоследствии за счет костимулирующего сигнала ОХ40 усиливаются функции Т-лимфоцитов, включая выработку цитокинов, экспансию и выживание. Взаимодействие между ОХ40 и OX40L возникает во время взаимодействия Т-лимфоцитов и дендритных клеток (ДК) - через 2-3 дня после распознавания антигена. Т-лимфоциты, экспрессирующие ОХ40. также могут взаимодействовать с клетками, экспрессирующими OX40L, отличными от ДК, и получают ОХ40сигнал от клеток, которые могут обеспечивать значимые сигналы для генерирования Т-клеток памяти, усиление ответа Th2 и увеличение длительности воспалительных реакций. Таким образом, оптимальное взаимодействие между ОХ40 и OX40L может быть сформировано в два этапа: OX40L, экспрессированный на поверхности активированных CD4 Т-лимфоцитов, взаимодействует с ОХ40, экспрессированным на поверхности других отвечающих CD4 Т-лимфоцитов, что ведет к оптимальному генерированию CD4 Т-клеток памяти (Soroosh et al., 2006), или OX40L, экспрессированный на поверхности CD4+ A-клетках может запускать выживание Th2-клеток за счет взаимодействия с ОХ40 на поверхности Th2-клеток (Kim et al. 2003). Кроме того, для развития in vivo Th2, но не развития Th1 требуется экспрессия OX40L на поверхности B-лимфоцитов (Linton et al. 2003), и экспрессирующие OX40L тучные клетки напрямую усиливают функцию эффекторных Т-лимфоцитов за счет взаимодействия между ОХ40 на Т-лимфоцитах и OX40L на тучных клетках (Kashiwakura et al. J Immunol 2004; 173: 5247-5257; Nakae et al. J Immunol 2006; 176: 2238-2248). Кроме того, клетки эндотелия также экспрессируют OX40L (Imura et al. 1996), связывание ОХ40 с клетками эндотелия может участвовать в сосудистом воспалении. Чрезмерные сигналы ОХ40, как к отвечающим Т-лимфоцитам, так и к регуляторным Т-лимфоцитам (регуляторным Тлимфоцитам), приводят к угнетению Трег-опосредованной иммуносупрессии. Сигналы ОХ40, переходящие в реактивные Т-лимфоциты, придают им устойчивость к Трег-опосредуемой супрессии. С другой стороны, сигналы OX40L, переходящие в Трег-лимфоциты, подавляют Трег-супрессорную функцию, хотя спорным остается вопрос о том, могут ли сигналы ОХ40 контролировать уровень экспрессии Foxp3 в Трег-лимфоцитах. Кроме того, преднамеренная стимуляция ОХ40 приводит к подавлению TGF-бетазависимой дифференцировки Трег-лимфоцитов (включая Трег-лимфоциты). Такое подавление может опосредоваться частично эффекторными цитокинами, такими как IL-4 и IFN-гамма, вырабатываемыми эффекторными Т-лимфоцимтами, стимулированными ОХ40. Важно, что блокирование OX40L явно способствует дифференцировке Трег и вызывает толерантность к трансплантату, которая может быть опосредована Трег-лимфоцитами. Следовательно, ОХ40 является потенциальной молекулярной мишенью для контролирования аутоиммунитета, опосредуемого Т-лимфоцитами. Кроме того, в недавних исследованиях сообщалось, что взаимодействие между OX40L, экспрессируемым тучными клетками, и ОХ40, экспрессируемым Трег-клетками, может взаимно приводить к подавлению функции тучных клеток и супрессорной функции Трег (Gri et al. 2008; Piconese et al. 2009).

Для иммунологов стандартной экспериментальной моделью являются мыши, и исследование их иммунных ответов внесло колоссальный вклад в понимание работы иммунной системы человека. Общая структура иммунной системы у мыши и человека представляется достаточно близкой; однако также существуют значительные различия. Например, у мышей CD 134 экспрессируется Тэфф при активации, тогда как Трег постоянно экспрессируют CD134 (Piconese et al. J Exp Med 2008; 205: 825-839). У людей CD134 экспрессируется на поверхности как Тэфф, так и Трег, но только при активации (см. далее, например, Пример 2 (g), Экспрессия CD134 на поверхности эффекторных и регуляторных Т-лимфоцитов человека после стимуляции стимулирующими сферами с антителом к CD3 человека/CD28 человека). Кроме того, Трег мыши индуцируют апоптоз Тэфф мыши, достигая супрессии (Pandiyan et al. Nat Immunol 2007; 8: 1353; Scheffold et al. Nat Immunol 2007; 8: 1285-1287), тогда как Трег человека не вызывают апоптоза Трег человека, достигая супрессии (Vercoulen et al. Plos ONE 2009; 4: e7183). В совокупности указанные данные показывают, что роль CD134 в осуществлении супрессорной функции Трег в иммунной системе человека и мыши различна.

Термин связывающая молекула включает (1) антитело, (2) антигенсвязывающий фрагмент антитела и (3) производное антитела, согласно определению в настоящей заявке. Термин связывается с CD134 или связывание с CD134 относится к связыванию связывающей молекулы, согласно определению в настоящей заявке, с рецептором CD134 в пробе in vitro, такой как проба BIAcore или Octet (поверхностный плазмонный резонанс). Предпочтительно указанная связывающая молекула обладает сродством связывания (K_d) 1х10^-6 М или менее, более предпочтительно менее 50х10^-7 М, еще более предпочтительно менее 1х10^-7 М.

Термин изолированное антитело или изолирующая связывающая молекула относится к антителу или связывающей молекуле, которая: (1) не связана с ассоциированными с ней в природе компонентами, сопровождающими ее в природном состоянии; (2) не содержит других белков того же вида; (3) экспрессируется клеткой другого вида; или (4) не существует в природе. Примеры изолированных анти

- 4 031006 тел включают антитело к CD134, которое подвергли аффинной очистке с применением CD134, антитело к CD134, которое было получено при помощи гибридом или других линий клеток in vitro, и антитело к CD134 человека, полученное в организме трансгенного животного.

Термин агонист относится к связывающей молекуле, согласно определению в настоящей заявке, которая при связывании с CD134 (1) стимулирует или активирует CD134, (2) усиливает, способствует, индуцирует, повышает или увеличивает время активности, присутствия или функции CD134, или (3) усиливает, способствует, увеличивает или индуцирует экспрессию CD 134. Термин антагонист относится к связывающей молекуле, согласно определению в настоящей заявке, которая при связывании с CD134 (1) подавляет или угнетает CD134, (2) подавляет или угнетает активность, присутствие или функцию CD134, или (3) подавляет или угнетает экспрессию CD134.

Термин антитело относится к молекуле иммуноглобулина, которая обычно состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем в каждой паре есть одна тяжелая (H) цепь и одна легкая (L) цепь. Легкие цепи антител человека классифицируют на каппа (к) и лямбда (λ). Тяжелые цепи классифицируют на мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон, и они определяют изотип антитела - IgM, IgD, IgG, IgA и IgE соответственно. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (здесь сокращенно называется HCVR или VH) и константой области тяжелой цепи. Константные области тяжелой цепи антител IgD, IgG и IgA состоят из трех доменов CH1, CH2 и CH3, а константные области тяжелой цепи IgM и IgE состоят из четырех доменов CH1, CH2, CH3 и CH4. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (здесь сокращенно называется LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами организма-хозяина, включая разные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки). Области VH и VL можно дополнительно подразделить на гипервариабельные области, именуемые участками, определяющими комплементарность (CDR), перемежающиеся с более консервативными областями, которые называют каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит их трех CDR и четырех FR, расположенных в следующем порядке, с N-конца к С-концу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Указанные вариабельные области каждой пары тяжелой/легкой цепи (VH и VL) соответственно, образует связывающий сайт антитела. Соотнесение аминокислот с каждой областью или доменом происходит в соответствии с определением в публикации Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 и 1991)) или в соответствии с определением Chothia et al. Conformations of immunoglobulin hypervariable regions (Nature 1989; 342(6252): 877-83). Термин антитело включает антитело, которое является мультимерной формой антитела, такой как димеры, тримеры или мультимеры более высокого порядка. Также он включает антитело, которое связано или присоединено к фрагменту - не антителу. Кроме того, термин антитело не ограничивается каким-либо конкретным способом получения указанного антитела. Например, он включает моноклональные антитела, рекомбинантные антитела и поликлональные антитела.

Термин производное антитела или производное антитела относится к молекуле, которая способна связываться с тем же антигеном (т.е. CD134 человека), с которым связывается антитело, и включает последовательность аминокислот указанного антитела, связанного с дополнительным молекулярным фрагментом. Последовательность аминокислот антитела, которая содержится в производном указанного антитела, может быть полноразмерным антителом или может быть частью или частями полноразмерного антитела. Указанный дополнительный молекулярный фрагмент может быть биологической или химической молекулой. Примеры дополнительных молекулярных фрагментов включают химические группы, пептиды, белки (такие как ферменты, антитела), аминокислоты и химические соединения. Указанный дополнительный молекулярный фрагмент может быть предназначен для применения в качестве агента для детекции, метки-маркера, терапевтического или фармацевтического агента. Последовательность аминокислот а антителе может быть присоединена или связана с дополнительным фрагментом нековалентной связью, химической связью, путем генетическое слияния или другим путем. Термин производное антитела также включает химерные антитела, гуманизированные антитела и молекулы, которые получены на основе модификаций последовательностей аминокислот антитела CD134, такой как консервативные замены, вставки и добавления аминокислот.

Термин антигенсвязывающий фрагмент антитела относится к одной или более частям полноразмерного антитела, которые сохраняют способность к связыванию с тем же антигеном (т.е. CD134 человека), с которым связывается указанное антитело. Также термин антигенсвязывающий фрагмент включает часть антитела, которая является частью более крупной молекулы, образуемой за счет ковалентного или нековалентного взаимодействия, или часть антитела с одним или более дополнительными молекулярными фрагментами. Примеры дополнительных молекулярных компонентов включают аминокислоты, пептиды или белки, такие как центральная область стрептавидина, которую можно применять для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov et al. Hum Antibodies Hybridomas 1995; 6(3): 93-101).

Термин химерное антитело относится к антителу, которое содержит последовательности аминокислот, полученные из двух или более антител. Указанные два или более антител могут быть из одного и того же вида или из двух или более разных видов.

- 5 031006

Термин эпитоп относится к части антигена, которая способна специфически связываться с антителом или рецептором Т-лимфоцитов, или другим образом взаимодействовать с молекулой. Эпитоп также в технике называют антигенным детерминантом. Как правило, эпитоп состоит из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи углеводов или сахаров. Эпитоп может быть линейным или нелинейным/конформационным. После того как определен желательный эпитоп (например, посредством картирования эпитопов), можно сгенерировать антитело к указанному эпитопу. Получение и описание свойств антител также может дать информацию о желательных эпитопах. На основании такой информации затем возможно провести скрининг антител, чтобы отобрать те антитела, которые связываются с одним и тем же эпитопом, т. е. путем проведения исследований перекрестного конкурирования с целью поиска антител, которые конкурируют за связывание друг с другом, т.е. антитела конкурируют за связывание с антигеном.

Термин клетка-хозяин относится к клетке, в которую был введен вектор экспрессии. Указанный термин включает не только клетку конкретного субъекта, но также и потомков такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут возникать определенные модификации либо в связи с влиянием окружающей среды, либо в связи с мутациями, такое потомство может быть не идентичным родительской клетке, но все же включено в термин клетка-хозяин.

Термин антитело человека относится к антителу, состоящему из последовательности аминокислот только из последовательностей иммуноглобулинов человека. Антитело человека может содержать углеводные цепи из антитела мыши, если его получают в организме мыши, в клетках мыши или в гибридоме, полученной из клетки мыши. Антитела человека можно получить разными способами, известными в технике. Термин гуманизированное антитело относится к химерному антителу, которое содержит остатки, происходящие из последовательности антитела человека. Гуманизированное антитело может содержать некоторые или все CDR из антитела животного, отличного от человека, тогда как каркасные и константные области указанного антитела содержат остатки аминокислот, происходящие из последовательностей антитела человека.

Термин млекопитающее относится к любому виду животных из класса млекопитающих. Примеры млекопитающих включают человека; лабораторных животных, таких как крысы, мыши, обезьяны и морские свинки; домашних животных, таких как кролики, корова, овца, кошки, собаки, лошади и свиньи, и т. п.

Термин изолированная нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты геномного происхождения, кДНК или синтетического происхождения, или их комбинации, которая отделена от других молекул нуклеиновых кислот, присутствующих в природном источнике указанной нуклеиновой кислоты. Предпочтительно изолированная нуклеиновая кислота не содержит последовательностей, расположенных на 5'- и З-'концах рассматриваемой нуклеиновой кислоты в геномной ДНК организма, из которого была получена данная нуклеиновая кислота.

Термин скорость диссоциации или K_d относится к равновесной константе диссоциации взаимодействия конкретного антитела-антигена и применяется для описания сродства связывания между лигандом (таким как антитело) и белком (таким как CD134). Чем меньше равновесная константа диссоциации, тем более прочно связывается лиганд, или выше сродство между лигандом и белком. K_d можно измерить при помощи поверхностного плазмонного резонанса, например, с применением системы BIACORE 1 или Octet. Термин антитело к CD134 относится к антителу, согласно определению в настоящей заявке, способному к связыванию с CD134 человека.

Термины рецептор ОХ40 и рецептор CD134 в настоящей заявке применяют взаимозаменяемо, и они включают CD134 человека, а также его варианты, изоформы и гомологи у других видов животных. Следовательно, связывающие молекулы человека, раскрываемые в настоящей заявке, в определенных случаях также могут связываться с CD134 видов, отличных от человека. В других случаях связывающие молекулы могут быть абсолютно специфичны в отношении CD134 человека и могут не проявлять видовую перекрестную реактивность или перекрестную реактивность другого типа. В частности, они не будут связываться с CD134 мыши или крысы.

Термин специфически связывается с CD134 человека обозначает, что K_d связывающей молекулы в отношении связывания с CD134 человека, предпочтительно более чем в 10, более чем в 50, более чем или, наиболее предпочтительно, более чем в 100 раз превышает K_d для связывания, например, с CD40 человека, что определяют при помощи пробы, описанной в настоящей заявке, или известной специалистам в данной области техники (например, проба BIAcore). Определение того, что конкретный агент специфически связывается с рецептором ОХ40, можно в качестве альтернативы без труда провести при помощи стандартных процедур или адаптировав их. Одна подходящая проба in vitro основана на процедуре Вестерн-блоттинга (описан во многих стандартных руководствах, включая Antibodies, A Laboratory Manual Harlow and Lane). Чтобы определить, что определенный агент, связывающийся с рецептором ОХ40, специфически связывается с белком ОХ40 человека, весь белок клетки экстрагируют из клеток млекопитающих, которые не экспрессируют антиген ОХ40, таких как клетки, отличные от лимфоцитов (например, клетки COS или CHO), трансформированных с применением молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей ОХ40. В качестве отрицательного контроля из соответствующих нетрасформированных

- 6 031006 клеток также экстрагируют весь белок клетки. Далее указанные препараты белка подвергают электрофорезу на денатурирующем или неденатурирующем полиакриламидном геле (PAGE). Впоследствии указанные белки переносят на мембрану (например, из нитроцеллюлозы) посредством Вестерн-блоттинга, и агент, который требуется тестировать, инкубируют на указанной мембране. После промывания мембраны с целью удаления неспецифически связавшегося агента наличие связавшегося агента определяют с применением антитела, направленного на тестируемый агент, конъюгированного с агентом для детекции, таким как фермент щелочная фосфатаза; внесение субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата/нитросинего тетразолия приводит к получению плотного синего соединения за счет иммунолокализованной щелочной фосфатазы. При помощи данного способа было показано, что агенты, которые специфически связываются с ОХ40 человека, связываются с полосой ОХ40 человека (которая должна быть локализована в заданном положении геля, определяемом по его молекулярной массе) в экстракте из клеток, трансформированных ОХ40, тогда как в экстракте из нетрансформированных клеток наблюдалась низкая степень связывания или его отсутствие. Может возникать неспецифическое связывание агента с другими белками, и оно может определяться как слабый сигнал на Вестерн-блоттинге. Неспецифическая природа такого связывания может быть выявлена специалистами в данной области техники по слабому сигналу, получаемому на Вестерн-блоттинге, по сравнению с сильным основным сигналом, возникающим вследствие специфического связывания агента/белка ОХ40 человека. В идеальном случае, агент, связывающийся с рецептором, не должен связываться с белком, экстрагированным из нетрансформированных клеток.

Помимо анализа связывания с применением экстрагированных белков предполагаемые агенты, связывающиеся с рецептором ОХ40 можно тестировать с целью подтверждения их способности к связыванию по существу только с рецептором ОХ40 in vivo путем конъюгации указанного агента с флуоресцентной меткой (такой как флуоресциин изотионат (FITC)) и анализа его связывания с популяциями антиген-активированных CD4+ Т-лимфоцитов и неактивированных Т-лимфоцитов посредством сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS). Агент, который связывается по существу только с рецептором ОХ40, может окрашивать только активированные CD4+ Т-лимфоциты.

Термин вектор в настоящей заявке относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую молекулу нуклеиновой кислоты в клетку-хозяин. Примеры векторов включают плазмиды, векторы на основе вирусов, космиды или векторы-фаги, а также векторы на основе оголенной ДНК или РНК. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они были введены. Некоторые векторы могут интегрироваться в геном клетки-хозяина при введении их в клетку-хозяин, и в результате они реплицируются вместе с геномом хозяина. Определенные векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны, и, следовательно, они могут называться векторами экспрессии.

В настоящей заявке двадцать природных аминокислот и их сокращения обозначаются в соответствии с общепринятым употреблением.

Согласно настоящему изобретению предложены связывающие молекулы, которые связываются с CD134 человека, включая антитела против CD134 (анти-ОО134 антитела), антигенсвязывающие фрагменты анти-CD134 антител и производные анти-CD134 антител. Указанные связывающие молекулы характеризуются по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: (a) связываются с CD134 человека с K_d 1х10^-6 М или менее и (b) не препятствуют связыванию рецептора CD134 человека (ОХ40) с лигандом ОХ40 (OX40L); (c) обладают агонистической активностью в отношении CD134 человека на эффекторных Т-клетках и/или антагонистической активностью в отношении CD134 человека на регуляторных Т-клетках; (d) не связываются с рецептором CD40 при концентрации до 500 нМоль; (e) не связываются с рецептором CD137 при концентрации до 500 нМоль; (f) не связываются с рецептором CD271 при концентрации до 500 нМоль; (g) способны усиливать выработку IL-2 изолированными Тлимфоцитами человека; (h) способны усиливать иммунный ответ; (i) способны угнетать рост клеток опухоли; и (j) оказывают терапевтическое действие при раке. Согласно некоторым вариантам реализации указанная связывающая молекула связывается с CD134 человека с Kd 1х10^-7 М или менее, Kd 1х10^-8 М или менее или 5х1х10^-9 М или менее.

Антитела и другие связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно получить при помощи стандартных способов, и затем проводить скрининг с целью выявления и получения связывающих молекул, которые не препятствуют связыванию OX40L с CD134. Например, можно отбирать связывающие молекулы, которые связываются с CD134, даже когда CD134 был подвергнут воздействию насыщающей концентрации OX40L.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложено антитело человека, которое связывается с CD134 человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанное антитело человека является моноклональным антителом, которое специфически связывается с CD134 человека с Kd 100 нМоль или менее, предпочтительно 10 нМоль или менее, и/или обладает агонистической активностью в отношении CD134 человека на поверхности Т-эффекторных клеток и/или антагонистической активностью в отношении CD134 человека на поверхности Т-регуляторных клеток. Одним примером таких

- 7 031006 антител человека является клон 12H3 моноклональных антител человека. Последовательность аминокислот целой вариабельной области тяжелой цепи и последовательности аминокислот трех CDR вариабельной области тяжелой цепи (VH) клона 12H3 антитела приведены под номерами SEQ ID NO:12 и 14-16 соответственно. Последовательность аминокислот целой вариабельной области легкой цепи и последовательности аминокислот трех CDR вариабельной области легкой цепи (VL) клона 12H3 антитела приведены под номерами SEQ ID NO:13 и 17-19 соответственно. Другим иллюстративным антителом согласно настоящему раскрытию является клон 20E5 моноклинального антитела человека. Последовательность аминокислот целой вариабельной области тяжелой цепи и последовательности аминокислот трех CDR вариабельной области тяжелой цепи (VH) клона 20E5 антитела приведены под номерами SEQ ID NO:4 и 6-8 соответственно. Последовательность аминокислот целой вариабельной области легкой цепи и последовательности аминокислот трех CDR вариабельной области легкой цепи (VL) клона 20E5 антитела приведены под номерами SEQ ID NO:5 и 9-11 соответственно.

Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать один или более из указанных CDR или один или более из указанных CDR с 1, 2 или 3 заменами аминокислот на один CDR. Такие замены предпочтительно являются консервативными заменами. Консервативные замены, при которых обеспечивается функциональное сходство аминокислот, хорошо известны в технике и описаны, например, в табл. 1 в WO 2010/019702, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки.

При условии, что клон 12H3 и клон 20E5 связываются с CD134 человека, последовательности VH и VL каждого из них можно сочетать и комбинировать с другими антителами к CD134, образуя дополнительные антитела. Связывание таких сочетанных и комбинированных антител к CD134 человека можно тестировать с применением анализа связывания, известного в технике, включая анализ, описанный в разделе Примеры. В одном случае, когда области VH и VL сочетают и комбинируют, последовательность VH из конкретной пары VH/VL заменяют на последовательность структурно сходной VH. Аналогично, в другом случае последовательность VL из конкретной пары VH/VL заменяют на последовательность структурно сходной VL.

Молекулы, содержащие только один из трех участков CDR (в некоторых случаях, даже только один CDR или его часть, особенно CDR3), способны сохранять антигенсвязывающую активность антитела, из которого был получен данный CDR. См., например, Laune et al. JBC 1997; 272: 30937-44; Monnet et al. JBC 1999; 274 :3789-96; Qiu et al. Nature Biotechnology 2007; 25: 921-9; Ladner et al. Nature Biotechnology 2007; 25: 875-7; Heap et al. J. Gen Virol 2005; 86: 1791-1800; Nicaise et al. Protein Science 2004; 13: 1882-91; Vaughan and Sollazzo Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening 2001; 4:417-430; Quiocho Nature 1993; 362: 293-4; Pessi et al. Nature 1993; 362: 367-9; Bianchi et al. J. Mol Biol 1994; 236: 649-59; and Gao et al. J. Biol Chem 1994; 269: 32389-93.

Соответственно одним вариантом реализации настоящего изобретения является антитело к CD 134 человека, которое содержит: (a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот в соответствии SEQ ID NO:12; (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO:13.

Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения предложена изолированная молекула, связывающаяся с CD134, которая содержит (a) CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO:14; и/или (b) CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO:15; и/или (c) CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO:16.

Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения предложена изолированная молекула, связывающаяся с CD134, которая содержит (a) CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 17; и/или (b) CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 18; и/или (c) CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO:19.

Соответственно, одним вариантом реализации настоящего изобретения является изолированное антитело к CD134 человека, которое содержит: (a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO:4; (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO:5.

Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения предложена изолированная молекула, связывающаяся с CD134, которая содержит (a) CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO:6; и/или (b) CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO:7; и/или (c) CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO:8.

Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения предложена изолированная молекула, связывающаяся с CD134, которая содержит (a) CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO:9; и/или (b) CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 10; и/или (c) CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO:11.

При условии, что клон 12H3 и клон 20E5 связываются с CD134 человека, и антигенсвязывающую

- 8 031006 специфичность обеспечивают главным образом участки CDR1, CDR2 и CDR3, последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL можно сочетать и комбинировать с получением дополнительных антител. Например, CDR из разных антител к CD134 можно сочетать и комбинировать, хотя каждое антитело обычно содержит CDR1, CDR2 и CDR3 VH и CDR1, CDR2 и CDR3 VL. Связывание таких сочетанных и комбинированных антител к CD134 человека можно тестировать с применением анализа связывания, известного в технике, включая анализ, описанный в разделе Примеры (например, ELISA, анализ Biacore). В одном случае, когда сочетают и комбинируют CDR VH, последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 из последовательности конкретного VH заменяют на последовательность(и) структурно сходного CDR. Аналогично, когда сочетают и комбинируют CDR VH, последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 из последовательности конкретного VL обычно заменяют на последовательность(и) структурно сходного CDR. Специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что новые последовательности VH и VL можно создавать путем замены одной или более области CDR VH и/или VL на структурно сходные последовательности из последовательности CDR, раскрываемые в настоящей заявке.

Класс (например, IgG, IgM, IgE, IgA или IgD) и подкласс (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4) антител к CD134 можно определить при помощи подходящих способов, таких как ELISA или Вестернблоттинг, а также при помощи других технологий. В качестве альтернативы, класс и подкласс можно определить посредством секвенирования всех или части константных доменов тяжелых и/или легких цепей указанных антител, сравнивая их последовательности аминокислот с последовательностями аминокислот известных иммуноглобулинов разных классов и подклассов и определяя класс и подкласс указанных антител. Антитела к CD134 могут быть молекулой IgG, IgM, IgE, IgA или IgD. Например, антитела к CD134 могут относиться к IgG из подкласса IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Таким образом, согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ преобразования антитела к CD134 определенного класса или подкласса в антитело другого класса или подкласса.

Связывающие молекулы согласно одному варианту реализации настоящего изобретения включают моноклональные антитела, их фрагменты, пептиды и другие химические группы. Моноклональные антитела можно получить при помощи стандартного способа иммунизации млекопитающего, после которой проводят выделение плазматических D-лимфоцитов, вырабатывающих рассматриваемые моноклональные антитела и слияние их с клетками миеломы.

Согласно разным вариантам реализации связывающий фрагмент может быть не подлинным антителом, а миметиком антитела (например, на основании каркаса, не происходящего от антитела), аптамером РНК, малой молекулой или CovX-телом.

Следует понимать, что миметики антител (например, структуры каркаса, не происходящего от антитела, которые обладают высокой стабильностью, при этом допуская введение вариабельности в определенные положения) можно применять для создания молекулярных библиотек, из которых можно получать связывающие фрагменты. Специалисты в области биохимии должны быть знакомы со многими такими молекулами. Такие молекулы можно применять в качестве связывающего фрагмента в агенте согласно настоящему изобретению.

Примеры миметиков антител обсуждаются у Skerra et al. (2007, Curr. Opin. Biotech., 18: 295-304) и включают белки-миметики антител компании Affibody (также называемые тринектинами; Nygren, 2008, FEBS J, 275, 2668-2676); CTLD (лектиноподобный домен C-типа) (также называемые Innovations Pharmac. Technol. (2006), 27-30); аднектины (также называемые монотелами; Meth. Mol. Biol., 352 (2007), 95-109); антикалины (Drug Discovery Today (2005), 10, 23-33); DAR-шпильки (анкирины; Nat. Biotechnol. (2004), 22, 575-582); авимеры (Nat. Biotechnol. (2005), 23, 1556-1561); микротела (FEBS J, (2007), 274, 8695); аптамеры пептидов (Expert. Opin. Biol. Ther. (2005), 5, 783-797); домены Куница (J. Pharmacol. Exp. Ther. (2006) 318, 803-809); аффилины (Trends. Biotechnol. (2005), 23, 514-522).

Соответственно предпочтительно, чтобы миметик антитела был выбран из группы, включающей или состоящей из белков-миметиков антител компании Affibody, тетранектинов (CTLD), аднектинов (монотел), антикалинов, DAR-шпилек (анкиринов), авимеров, iM-антител, микротел, аптамеров пептидов, доменов Куница, аптамеров и аффилинов.

Под малыми молекулами мы понимаем низкомолекулярное органическое соединение массой 900 Дальтон или менее. Хотя крупные биополимеры, такие как нуклеиновые кислоты, белки и полисахариды (такие как крахмал или целлюлоза) не включены в понятие малые молекулы, составляющие их мономеры (рибо- или дезоксирибонуклеотиды, аминокислоты и моносахариды соответственно) и олигомеры (т.е. короткие полимеры, такие как динуклеотиды, пептиды, такие как антиоксидант глутатион, и дисахариды, такие как сахароза) включены в данное понятие. Получение малых молекул описано у Mayes & Whitcombe, 2005, Adv. Drug Deliv. Rev. 57:1742-78 and Root-Bernstein & Dillon, 2008, Curr. Pharm. Des. 14:55-62. CovX-тела создают путем ковалентного соединения фармакофора через линкер со связывающим сайтом специфически сконструированного антитела, что приводит к эффективному перепрограммированию указанного антитела (Tryder et al., 2007, Bioorg. Med. Chem. Lett., 17:501-6). В результате получают новый класс химических фрагментов, который образуется, когда каждый компонент вносит желаемые признаки в интактное CovX-тело - в частности, такой фрагмент обладает биологической актив

- 9 031006 ностью, характерной для пептида, и увеличенным временем полувыведения, характерным для антитела.

Антитела человека можно получить несколькими разными способами, включая применение библиотеки экспрессируемых последовательностей иммуноглобулинов человека (Stratagene Corp., La Jolla, California; Cambridge Antibody Technology Ltd., London, England) для получения фрагментов антител человека (VH, VL, Fv, Fd, Fab или (Fab')₂) и применения указанных фрагментов для конструирования полного антитела человека путем соединения с ним соответствующей части, с применением технологий, сходных с технологиями получения химерных антител. Антитела человека также можно получить у трансгенных мышей с иммуноглобулином человека в геноме. Таких мышей можно приобрести, например, у компании Abgenix, Inc., Фремонт, Калифорния и Medarex, Inc., Аннандаль, Нью-Джерси. Помимо соединения областей Fv тяжелой и легкой цепи с образованием одноцепочечного пептида, аналогичными способами можно конструировать и экспрессировать Fab (M.J. Evans et al. J Immunol Meth 1995; 184: 123-138).

Антитела Delmmunized™ (деиммунизованные антитела) представляют собой антитела, в которых были исключены потенциально иммуногенные эпитопы Т-лимфоцитов, которые описаны в заявке на Международный PCT/GB 98/01473. Следовательно, ожидается, что иммуногенность у людей будет исключена или существенно снижена, когда такие антитела будут применять in vivo. Такими способами могут быть исключены свои иммуногенные эпитопы Т-лимфоцитов (если таковые присутствуют) в связывающих молекулах на основе иммуноглобулинов.

Все полностью и частично человеческие антитела, описанные выше, менее иммуногенны, чем полностью мышиные антитела, или антитела, полученные не от человека, как и фрагменты, и одноцепочечные антитела. Все указанные молекулы (или их производные), следовательно, с меньшей вероятностью вызывают иммунную или аллергическую реакцию. Следовательно, они больше подходят для введения людям in vivo, чем полностью нечеловеческие антитела, особенно, когда необходимо повторное или длительное введение.

Биспецифические антитела можно применять в качестве агентов для перекрестной сшивки между CD134 человека одной и той же клетки-мишени человека или CD134 человека на двух разных клеткахмишенях человека. Такие биспецифические антитела обладают одной специфичностью к каждому из двух разных эпитопов на CD134 человека. Указанные антитела и способ их получения описаны в патенте США № 5534254 (Creative Biomolecules, Inc.). Разные варианты реализации биспецифических антител, описанные в указанном патенте, включают сшивку одноцепочечного Fv с пептидными сшивающими агентами, включая Ser-Cys, (Gly)₄-Cys, (His)₆-(Gly)₄-Cys, хелатирующие агенты и химические или дисульфидные сшивки, включая бисмалеимидгексан и бисмалеимидкапроил.

Молекулы, отличные от антител, можно выделять или путем скрининга выбирать из библиотек соединений традиционными способами. Автоматизированная система для генерирования и скрининга библиотеки соединений описана в патентах США № 5901069 и 5463564. Более сфокусированный подход подразумевает трехмерное моделирование сайта связывания и последующее получение семейства молекул, которые удовлетворяют модели. Затем их подвергают скринингу с целью отбора молекул с оптимальными характеристиками связывания.

Другой подход состоит в генерировании библиотеки рекомбинантных пептидов и последующем их скрининге с целью отбора пептидов, которые связываются с рассматриваемым эпитопом CD134 человека. См., например, патент США № 5723322. Данный эпитоп - тот же, который связывается с моноклинальными антителами, описанными в примерах далее. Фактически молекулы можно сгенерировать или выделить относительно легко в соответствии с технологиями, хорошо известными в технике, когда эпитоп известен.

Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения предложены производные любого из антител к CD134 человека, описанных выше. Согласно одному конкретному аспекту производное указанного антитела получают на основании модификаций последовательностей аминокислот клона 12H3 и/или клона 20E5. Последовательности аминокислот любых областей цепей антитела можно модифицировать, например, каркасные области, участки CDR или константные области. Указанные модификации можно вводить при помощи стандартных технологий, известных в технике, таких как сайтнаправленный мутагенез и случайный ПЦР-опосредованный мутагенез, и они могут включать природные, а также неприродные аминокислоты. Типы модификаций включают вставки, делеции, замены или их сочетания, одной или более аминокислот антитела к CD134. Согласно некоторым вариантам реализации производное антитела содержит 1, 2, 3 или 4 замены аминокислот в CDR тяжелой цепи и/или одну замену аминокислоты в CDR легкой цепи. Согласно некоторым вариантам реализации производное антитела к CD134 содержит одну или более замен аминокислот по сравнению с последовательностью аминокислот в последовательности гена человека эмбрионального типа. Согласно конкретному варианту реализации одна или более из указанных замен по сравнению с последовательностью эмбрионального типа находится в участке CDR2 тяжелой цепи. Согласно другому конкретному варианту реализации замены аминокислот относительно последовательности эмбрионального типа находятся в одном или более положениях, совпадающих с положениями замен относительно последовательности эмбрионального типа в антителах клона 12H3 и/или клона 20E5. Согласно еще одному варианту реализации замена амино

- 10 031006 кислот является заменой одного или более цистеина в антителе на другой остаток, например, без ограничений аланин или серин. Цистеин может быть каноническим или неканоническим цистеином. Замена может быть произведена в CDR или в каркасной области вариабельного домена или в константном домене антитела. Другим типом замены аминокислот является исключение пар аспарагин-глицин, которые образуют потенциальные сайты дезаминирования, путем замены одного или более из указанных остатков. Еще в других вариантах реализации замена аминокислоты является консервативной заменой аминокислоты. Согласно одному варианту реализации производное антитела содержит 1, 2, 3 или 4 идущих подряд консервативных аминокислот в участках CDR тяжелых цепей по сравнению с последовательностями аминокислот в клоне 12H3 и/или клоне 20E5. Другим типом модификаций антитела к CD134 человека является изменение исходного характера гликозилирования антитела. Термин изменение относится к делеции одного или более углеводных фрагментов, обнаруживаемых в антителе и/или к добавлению одного или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в указанном антителе.

Гликозилирование антител обычно представляет собой N-гликозилирование. N-гликозилирование означает присоединение углеводного фрагмента к боковой цепи остатка аспарагина. Примеры других модификаций включают ацилирование, амидирование, ацетилирование, поперечное сшивание, циклизацию, формилирование, гидроксилирование, иодирование, метилирование, миристиолирование, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных поперечных сшивок, образование цистеина, окисление, фосфорилирование, пренилирование, пегилирование, протеолитический процессинг и сульфатирование.

Согласно дополнительному варианту реализации предложено производное антитела, которое содержит антитело к CD134, или его антигенсвязывающий фрагмент, которые описаны в настоящей заявке, связанные с дополнительным молекулярным фрагментом. Примеры дополнительных молекулярных фрагментов включают фармацевтические агенты, пептиды или белки, а также агенты для детекции или метки. Специфические примеры фармацевтических агентов, которые можно соединять с антителом к CD134, включают цитотоксические агенты или другие противоопухолевые агенты, а также радиоактивные изотопы. Специфические примеры пептидов или белков, которые можно соединять с антителом к CD134, включают антитела, которые могут быть теми же антителами к CD134, или другими антителами. Специфические примеры агентов для детекции или меток, которые можно соединять с антителами к CD134, включают (1) флуоресцентные соединения, такие как флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, фикоэритрин, родамин, 5-диметиламин-1-нафталенсульфонила хлорид и люминофоры на основе комплексов лантанидов; (2) ферменты, такие как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, люцифераза и глюкозоксидаза; (3) биотин; (4) заранее заданный полипептидный эпитоп, который распознается вторичным репортером, такой как парные последовательности лейциновой молнии, металлсвязывающие домены, эпитопные метки и сайты связывания для вторичных антител. Согласно дополнительному варианту реализации предложено производное антитела, которое является мультимерной формой антитела к CD134, такое как димеры, тримеры антител и мультимеры антител более высокого порядка или мономерные антитела. Отдельные мономеры в мультимерном антителе могут быть идентичные или разные, т.е. они могут быть геретомерными или гомомерными мультимерами антител. Мультимеризации антител можно достичь посредством естественной агрегации. Например, некоторый процент очищенных препаратов антител (например, очищенные молекулы IgG1) спонтанно образует агрегаты белков, содержащие гомодимеры антител и другие мультимеры антител более высокого порядка. В качестве альтернативы гомодимеры антител можно сформировать посредством технологий химического соединения, известных в технике. Подходящие сшивающие средства включают средства, которые являются гетеробифункциональными, такими как m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир, N-сукцинимидил Sацеттиоацетат и сукцинимидил-4-(малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат) или гомобифункциональными (такими как дисукцинилимидил-суберат). Такие линкеры имеются в продаже. Также можно вызывать мультимеризацию антител при помощи технологий рекомбинантных ДНК, известных в технике.

Согласно еще одному дополнительному варианту реализации предложено производное антитела, которое является химерным антителом, содержащим последовательность аминокислот антитела к CD134 человека, описанного в настоящей заявке выше. Согласно другому примеру все CDR химерного антитела получены из антител к CD134 человека. Согласно другому примеру в химерном антителе сочетают CDR из более чем одного антитела к CD134 человека. Также химерное антитело может содержать каркасные области, полученные из одного антитела к CD134 человека и один или более CDR из одного или более других антител человека. Химерные антитела можно сгенерировать при помощи стандартных способов, известных в технике. Согласно некоторым другим конкретным вариантам реализации указанные химерные антитела содержат один, два или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи или из вариабельной области легкой цепи антитела, выбранного из антител клона 12H3 и/или клона 20E5.

Примеры других производных антител, предложенных согласно настоящему изобретению, включают одноцепочечные антитела, диатела, доменные антитела, нанотела и унитела. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанными моноклинальными антителами могут быть химерные антитела, гуманизированные антитела, антитела человека, антитела Delmmunized™, одноцепочечные антите

- 11 031006 ла, фрагменты, включая Fab, F(ab')2, Fv или другие фрагменты, которые сохраняют антигенсвязывающую функцию исходного антитела. Одноцепочечные антитела (ScFv) и способ их получения описан в Патенте США № 4946778.

Одноцепочечное антитело (scFv) состоит из одной полипептидной цепи, содержащей домен VL, соединенный с доменом VH, причем домен VL и домен VH спариваются, образуя одновалентную молекулу. Одноцепочечное антитело можно получить в соответствии со способом, известным в технике (см., например, Bird et al., (1988) Science 242: 423-426 and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Диатело состоит из двух цепей, причем каждая цепь состоит из вариабельного домена тяжелой цепи, соединенного с вариабельным доменом легкой цепи на той же полипептидной цепи, соединенной коротким пептидным линкером, причем указанные две области на одной и той же цепи не спариваются друг с другом, а спариваются с комплементарными доменами на другой цепи, образую биспецифическую молекулу. Способы получения диател известны в технике (см., например, Holliger P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 и Poljak R. J. et al., (1994) Structure 2:1121-1123). Доменные антитела (dAb) представляют собой маленькие функциональные связывающие единицы антител, соответствующие вариабельным областям либо тяжелых, либо легких цепей антител. Доменные антитела можно легко экспрессировать в системах на основе бактерий, дрожжей и млекопитающих. В технике известна более подробная информация о доменных антителах (см., например, патенты США № 6291158; 6582915; 6593081; WO 04/003019 и WO 03/002609). Нанотела получают из тяжелых цепей антител. Обычно нанотело содержит вариабельный домен и два константных домена (СН2 и CH3) и сохраняет антигенсвязывающую способность исходного антитела. Нанотела можно получить при помощи способов, известных в технике (см., например, патенты США № 6765087, патент США № 6838254, WO 06/079372). Унитела состоят одной легкой цепи и одной тяжелой цепи антитела IgG4. Унитела можно получить путем удаления шарнирной области антител IgG4. Более подробную информацию об унителах и способах их получения можно найти в WO 2007/059782.

Помимо связывающего фрагмента молекулы согласно настоящему изобретению могут содержать фрагмент для повышения времени полувыведения молекулы in vivo, например, без ограничений полиэтиленгликоль (ПЭГ), сывороточный альбумин человека, группы гликозилирования, жирные кислоты и декстран. Такие дополнительные фрагменты можно конъюгировать или сочетать другим образом со связывающим фрагментом, с применением способов, хорошо известных в технике.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая последовательность аминокислот CD134-связывающей молекулы согласно первому аспекту настоящего изобретения. Последовательность аминокислот, кодируемая указанной молекулой нуклеиновой кислоты, может быть любой частью интактного антитела, такой как CDR, последовательностью, содержащей один, две или три CDR, или вариабельной областью тяжелой цепи или легкой цепи, или может быть полноразмерной тяжелой цепью или легкой цепью. Согласно некоторым вариантам реализации указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует последовательность аминокислот, которая содержит (1) участок CDR3, в частности участок CDR3 тяжелой цепи, антитела клона 12H3 и/или клона 20E5; (2) вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи антитела клона 12H3 и/или клона 20E5; или (3) тяжелую цепь или легкую цепь антител клона 12H3 и/или клона 20Е. Согласно другому варианту реализации указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который содержит последовательность аминокислот, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, или из группы, состоящей из SEQ ID NO:4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11.

Молекулы нуклеиновых кислот, предложенные в настоящем раскрытии, можно получить из любого источника, который вырабатывает антитело к CD134 согласно настоящему изобретению. мРНК из клеток, вырабатывающих антитело к CD134, можно выделить при помощи стандартных технологий, клонировать и/или амплифицировать с применением ПЦР и технологий конструирования библиотек, и провести скрининг согласно стандартным протоколам для получения молекул нуклеиновых кислот, кодирующих последовательность аминокислот антитела к CD134. Указанную мРНК можно применять для получения кДНК для применении полимеразной цепной реакции (ПЦР) или кДНК-клонирования генов антител. Согласно одному варианту реализации молекулу нуклеиновой кислоты получают из гибридомы, которая экспрессирует антитело к CD134, как описано выше, предпочтительно гибридомы, у которой одним из партнеров по слиянию является клетка трансгенного животного - не человека, которая экспрессирует гены иммуноглобулинов человека. Согласно другому варианту реализации указанная гибридома получена из нетрансгенного животного - не человека.

Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь антитела к CD134, можно сконструировать путем объединения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей константную область тяжелой цепи. Аналогично, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь антитела к CD134, можно сконструировать путем объединения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область легкой цепи, с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей константную область легкой цепи. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие VH и VL цепей можно преобразовать в гены полноразмерного антитела путем

- 12 031006 их введения в векторы экспрессии, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и константные области легкой цепи соответственно, так, чтобы сегмент VH был функционально связан с константной областью тяжелой цепи (CH) в пределах вектора, а сегмент VL был функционально связан с сегментом константной области легкой цепи (CL) в пределах вектора. В качестве альтернативы молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие VH и VL цепей преобразуют в гены полноразмерных антител путем соединения, т. е. сшивания, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VH цепи, с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей VL и CL цепи. Того же результата можно достичь, если применять молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие VL и CL цепей. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полноразмерные тяжелые и/или легкие цепи, затем можно экспрессировать из клетки, в которую они были введены, и можно выделять антитело к CD134.

Молекулы нуклеиновых кислот можно применять для рекомбинантной экспрессии больших количеств антител к CD134, как описано ниже. Указанные молекулы нуклеиновых кислот также можно применять для получения других связывающих молекул, предложенных в настоящем раскрытии, таких как химерные антитела, одноцепочечные антитела, иммуноадгезины, диатела, мутированные антитела и производные антител, описанные в других разделах настоящей заявки. Согласно одному варианту реализации молекулу нуклеиновой кислоты применяют в качестве зонда или праймера для ПЦР для последовательностей специфических антител. Например, молекулу нуклеиновой кислоты -зонд можно применять при реализации способов диагностики, или молекулу нуклеиновой кислоты - праймер можно применять для амплификации областей ДНК, которые можно применять, среди прочего, для выделения последовательностей нуклеотидов для применения при получении вариабельных областей антител к CD134.

Когда молекулы ДНК, кодирующие сегменты VH и VL антитела к CD134 уже получены, с указанными молекулами ДНК можно проводить манипуляции при помощи технологий рекомбинантных ДНК, например, преобразовывать гены вариабельных областей в гены полноразмерных цепей антитела, в гены фрагментов Fab или в ген scFv.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, описанную выше в настоящей заявке. Указанная молекула нуклеиновой кислоты может кодировать часть легкой цепи или тяжелой цепи (такую как CDR или вариабельную область), полноразмерную легкую или тяжелую цепи, полипептид, который содержит часть или полноразмерную тяжелую или легкую цепь, или последовательность аминокислот производного или антигенсвязывающего фрагмента антитела.

Примером подходящего вектора экспрессии является вектор, который кодирует последовательность функционально целостной СН или CL иммуноглобулина, с соответствующими сайтами рестрикции, сконструированными так, чтобы могла быть вставлена и экспрессировалась любая последовательность VH или VL. Указанный вектор экспрессии также может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию последовательности аминокислот цепи антитела из клетки-хозяина. ДНК, кодирующую указанную последовательность аминокислот цепи антитела, можно клонировать в вектор так, чтобы сигнальный пептид был связан с N-концом последовательности аминокислот цепи антитела в одной рамке считывания. Указанный сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом (т.е. сигнальным пептидом из белка - не-иммуноглобулина). Помимо последовательности нуклеотидов, кодирующей последовательность аминокислот антитела к CD134 (гены цепей антитела) векторы экспрессии несут в себе регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию указанных генов цепей антитела. Дизайн указанного вектора экспрессии, включая последовательности, предназначенные для селекции, и регуляторные последовательности, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, которую нужно трансформировать, уровень экспрессии желаемого белка и так далее. Регуляторные последовательности для экспрессии в клеткаххозяевах млекопитающих, включают вирусные элементы, которые управляют экспрессией белка высокого уровня в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из длинных концевых повторов ретровирусов, цитомегаловируса (CMV) (такие как промотор/энхансер CMV), вируса обезьян 40 (SV40) (такие как промотор/энхансер SV40), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса (AdMLP)), вируса полиомы, и сильные промоторы млекопитающих, такие как естественные промоторы иммуноглобулинов и актина.

Клеткой-хозяином может быть клетка млекопитающего, насекомого, растения, бактерии или дрожжей. Примеры подходящих линий клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки NSO, клетки PER-C6, клетки SP2, клетки HEK-293L клетки NIH-3T3, клетки HeLa, клетки почки новорожденного хомячка (BHK), клетки почек африканской зеленой мартышки (COS), клетки печеночно-клеточного рака человека (например, Hep G2), клетки легких человека, клетки A549 и целый ряд других линий клеток. Примеры линий клеток насекомых включают клетки Sf9 или Sf21. Примеры клеток растений включают клетки табака обыкновенного, арабидопсиса, мокрицы, кукурузы, пшеницы, картофеля и т.д. Клетки-хозяева бактерий включают Е. coli и виды Streptomyces. Примеры клеток-хозяев дрожжей включают Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris.

Последовательности аминокислот связывающей молекулы, экспрессируемые разными линиями

- 13 031006 клеток или в организме трансгенных животных могут обладать разным профилем гликозилирования. Однако связывающие молекулы, кодируемые молекулами нуклеиновых кислот, предложенных в настоящей заявке, или содержащие последовательности аминокислот, предложенные в настоящей заявке, являются частью настоящего изобретения, независимо от профиля гликозилирования указанных связывающих молекул.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения CD 134связывающей молекулы, согласно определению, данному выше, при помощи фагового отображения. Указанный способ включает (a) синтезирование библиотеки антител человека на основе фага, (b) скрининг библиотеки с применением CD134 или его части, (c) выделение фага, который связывается с CD134 или его частью, и (d) получение антитела с указанного фага. Один пример способа получения библиотеки антител включает этап (a) иммунизации животного, отличного от человека, содержащего локусы иммуноглобулина человека с CD134 или с их антигенными частями для провоцирования иммунного ответа; (b) извлечения антител-вырабатывающих клеток из иммунизированного животного; (c) выделения РНК, кодирующей тяжелую и легкую цепи антител к CD 134 из извлеченных клеток; (d) обратного транскрибирования указанной РНК с получением кДНК; (e) амплификации кДНК; и (f) вставки кДНК в вектор фагового отображения так, что указанные антитела экспрессировались на фаге. Рекомбинантные антитела к CD134 человека или их антигенсвязывающие фрагменты можно выделить посредством скрининга в библиотеке рекомбинантных комбинаторных антител. Указанная библиотека может быть библиотекой фагового отображения scFv, сгенерированной с применением кДНК VL и VH человека, полученных с мРНК, выделенной из B-лимфоцитов. Способы получения и скрининга таких библиотек известны в технике. Наборы для генерирования библиотек отображения фага имеются в продаже.

Согласно одному предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения предложена композиция, например, фармацевтическая композиция, содержащая одну или сочетание связывающих молекул, описываемых в настоящей заявке, и необязательно фармацевтически приемлемую основу. Указанные композиции можно получить стандартными способами, известными в технике. Согласно некоторым вариантам реализации указанные композиции содержат антитело к CD 134 или его антигенсвязывающий фрагмент. Согласно одному конкретному варианту реализации указанная композиция содержит антитело клона 12H3 и/или клона 20E5, или антигенсвязывающий фрагмент какого-либо из данных антител. Согласно другим вариантам реализации указанная композиция содержит производное антитела клона 12H3 и/или клона 20E5. Термин фармацевтически приемлемая основа относится к любому неактивному веществу, которое пригодно для применения в составе лекарственной формы для доставки связывающей молекулы. Основой может быть антиадгезив, связующее вещество, материал покрытия, разрыхлитель, наполнитель или растворитель, консервант (такой как антиоксидант, антибактериальный или противогрибковый агент), подсластитель, агент, замедляющий всасывание, смачивающее вещество, эмульгатор, буфер и т.п.

Непептидные молекулы согласно настоящему изобретению можно вводить перорально, в том числе, в составе суспензий, таблеток и подобных лекарственных форм. Жидкие лекарственные формы можно вводить путем ингаляций лиофилизированных или распыленных микрокапсул. Также можно применять суппозитории. Можно применять дополнительные фармацевтические основы для контролирования длительности действия молекул согласно настоящему изобретению. Дозировку и режим введения для лекарственной формы, которая была выбрана, можно определить посредством стандартных процедур, хорошо известных в технике. Такие процедуры включают экстраполяцию оценочного режима дозирования из моделей, основанных на животных, и последующее определение оптимальной дозировки у человека в клинических исследованиях по подбору оптимальных доз.

Указанные композиции могут быть в любой подходящей форме, такой как жидкие, полужидкие и твердые лекарственные формы. Разные лекарственные формы указанных композиций можно получать при помощи стандартных технологий, известных в технике.

Относительное количество связывающей молекулы, включаемое в композицию, может варьировать в зависимости от целого ряда факторов, таких как желаемые характеристики высвобождения, фармакодинамики, специфическая связывающая молекула и применяемые основы, и лекарственная форма. Количество связывающей молекулы в лекарственной форме для однократного введения, как правило, должно быть таким, которое вызывает терапевтический эффект, но может быть и меньшим количеством. Как правило, указанное количество может варьировать от приблизительно 0,001% до приблизительно 99%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 70%, или от приблизительно 1% до приблизительно 30% от общей массы лекарственной формы.

Помимо указанной связывающей молекулы в композицию или в качестве отдельной части в режим лечения можно включить один или более дополнительных терапевтических агентов. Примеры дополнительных терапевтических агентов раскрываются в настоящей заявке ниже. Специалист в данной области техники может без труда подобрать подходящее количество дополнительного терапевтического агента, который требуется включить в указанную композицию, и оно может варьировать в зависимости от целого ряда факторов, таких как применяемые конкретные агенты и основы, лекарственная форма и желаемые характеристики высвобождения и фармакодинамики. Количество дополнительного терапевтическо

- 14 031006 го агента, включенное в лекарственную форму для однократного введения, как правило, должно быть таким, которое вызывает терапевтический эффект, но может быть также и меньшим количеством.

Связывающие молекулы и фармацевтические композиции, содержащие связывающую молекулу, предложенные в настоящем раскрытии, применимы для терапевтических, диагностических и прочих целей, таких как усиление иммунного ответа, лечение рака, повышение эффективности других противоопухолевых средств или повышение эффективности вакцин, и обладают целым рядом полезных свойств, таких как применение в качестве медикаментов или диагностических агентов. Так, согласно предпочтительному аспекту настоящего изобретения предложены способы применения указанных связывающих молекул или фармацевтических композиций.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен способ модулирования опосредуемого CD134 человека противоопухолевого иммунного ответа, включая усиление эффекторной функции Тэфф. человека, экспрессирующих CD134 человека, и/или ослабление супрессорной функции Трег. человека, экспрессирующих CD134 человека, с применением связывающих молекул, которые связываются с CD134 человека, включая антитела к CD134 человека, которые (1) избегает взаимодействия природного OX40L человека с рецептором CD134 человека и/или (2) не блокирует сигнального пути, опосредуемого CD134 человека, после занятия их природным OX40L человека.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ модулирования опосредуемого CD134 человека противоопухолевого иммунного ответа, причем указанный способ не включает связывающие молекулы, которые связываются с CD 134 человека, включая антитела к CD 134 человека, такие как миметики, которые взаимодействуют со связывающим доменом OX40L человека на рецепторе CD134 человека и/или блокируют сигнальные пути в CD134-клетках человека с OX40L.

В настоящем изобретении раскрываются связывающие молекулы, которые связываются с CD 134 человека, включая антитела к CD 134 человека в целях противоопухолевой терапии. Антитела к CD134 человека связываются с внеклеточным доменом CD134 человека. Более конкретно, антитела к CD134 человека связываются с областями, не связывающими OX40L (т.е. указанные антитела к CD134 человека не полностью блокируют связывание OX40L с CD134 человека) на внеклеточном домене CD 134 человека на активированных Еэфа и Трег человека.

Согласно одному конкретному аспекту предложены способы усиления иммунного ответа у млекопитающих, включающие введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества связывающей молекулы, описываемой в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации указанной связывающей молекулой является антитело к CD134 или его антигенсвязывающий фрагмент, а указанное млекопитающее является человеком. Согласно дополнительному варианту реализации указанная связывающая молекула является антителом клона 12H3 и/или клона 20E5, или антигенсвязывающим фрагментом какого-либо из данных антител. Термин усиление иммунного ответа означает стимулирование, провоцирование, увеличение, усиление или повышение любого ответа иммунной системы млекопитающего. Иммунный ответ может быть клеточным ответом (т.е. клеточно-опосредованным, например, опосредованным цитотоксическими Т-лимфоцитами) или гуморальным ответом (т.е. ответ, опосредуемый антителами) и может быть первичным или вторичным ответом. Примеры усиления иммунного ответа включают повышение активности CD4+-Т-хелперов и генерирование цитотоксических Т-лимфоцитов. Усиление иммунного ответа можно оценивать по целому ряду показателей in vitro или in vivo, известных специалистам в данной области техники, включая, но без ограничений, пробы на цитотоксические Т-лимфоциты, выделение цитокинов (например, выработка IL-2), регрессия опухолей, выживание животных с опухолями, выработка антител, пролиферация иммунных клеток, экспрессия поверхностных маркеров клеток и цитотоксичность. Согласно одному варианту реализации указанные способ приводит к усилению клеточного иммунного ответа, в частности ответа цитотоксических Тлимфоцитов.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула, которая связывается с CD 134 человека, причем при насыщающей концентрации указанной связывающей молекулы или выше, действие на связывание OX40L с CD134 снижается не более чем на 70%, на клетках, экспрессирующих CD134 человека, что измеряют при помощи FACS анализа, описанного в примере 2 (f). Более предпочтительно, действие на связывание OX40L с CD134 снижается, но не более чем приблизительно на 60%, или приблизительно 505, или приблизительно 30%, или приблизительно 20%, или приблизительно 10% или менее, или предпочтительно уменьшения связывания вообще не происходит.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула, причем при концентрации 70 нМоль указанной связывающей молекулы действие на связывание OX40L с CD134 снижается не более чем на 70%, на клетках, экспрессирующих CD134 человека, что измеряют при помощи основанного на флуоресценции проточно-цитометрического анализа, описанного в примере 2 (f). Более предпочтительно, действие на связывание OX40L с CD 134 снижается, но не более чем приблизительно на 60%, или приблизительно 50%, или приблизительно 30%, или приблизительно 20%, или приблизительно 10% или менее, или предпочтительно уменьшения связывания вообще не происходит.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула, которая конкурирует за связывание с CD134 человека с антителом, содержащим (1) вариабельную область тяже

- 15 031006 лой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO:12 и (2) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO:13, на что указывает перекрестное конкурирование между немеченой указанной связывающей молекулой и указанным антителом с флуоресцентной меткой на РНА-стимулированных экспрессирующих CD 134 человека Т-лимфоцитах, что измеряют посредством проточной цитометрии (более подробно описанной в примере 2(e)). Предпочтительно, связывание указанного антитела при насыщающей концентрации или выше снижается по меньшей мере приблизительно на 50%, или приблизительно на 60%, или приблизительно на 70%, или приблизительно на 80%, или приблизительно на 90% или более, и предпочтительно упраздняется, когда проводят анализ перекрестного конкурирования с указанной связывающей молекулой.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула, которая конкурирует за связывание с CD134 человека с антителом, содержащим (1) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO:4 и (2) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 5, на что указывает перекрестное конкурирование между немеченой указанной связывающей молекулой и указанным антителом с флуоресцентной меткой на РНА-стимулированных экспрессирующих CD 134 человека Т-лимфоцитах, что измеряют посредством проточной цитометрии (более подробно описанной в примере 2(e)). Предпочтительно, связывание указанного антитела при насыщающей концентрации или выше снижается по меньшей мере приблизительно на 50%, или приблизительно на 60%, или приблизительно на 70%, или приблизительно на 80%, или приблизительно на 90% или более, и предпочтительно упраздняется, когда проводят анализ перекрестного конкурирования с указанной связывающей молекулой.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула, которая связывается с CD 134 человека, причем действие на связывание OX40L с CD 134 на клетках, экспрессирующих CD 134 человека, уменьшается не более чем приблизительно на 70%, или приблизительно на 60%, или приблизительно 50%, или приблизительно 30%, или приблизительно 20%, или приблизительно 10% или менее, причем указанная связывающая молекула также не препятствует иммуностимулирующему и/или пролиферативному ответу OX40L в эффекторных Т-клетках, экспрессирующих CD134 человека.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула, которая связывается с CD134 человека, причем указывающая связывающая молекула не препятствует связыванию рецептора CD134 человека (ОХ40) с лигандом OX40L, и причем указанная связывающая молекула также не препятствует иммуностимулирующему и/или пролиферативному ответу OX40L в эффекторных Т-клетках, экспрессирующих CD134 человека.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула, которая связывается с CD 134 человека, причем действие на связывание OX40L с CD 134 на Т-лимфоцитах, экспрессирующих CD134 человека, уменьшается не более чем приблизительно на 70%, или приблизительно на 60%, или приблизительно 50%, или приблизительно 30%, или приблизительно 20%, или приблизительно 10% или менее, и причем указанная связывающая молекула усиливает иммуностимулирующий и/или пролиферативный ответ OX40L в эффекторных Т-клетках, экспрессирующих CD134 человека.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула которая связывается с CD134 человека, причем указанная связывающая молекула не препятствует связыванию рецептора CD134 человека (ОХ40) с лигандом OX40L, и причем указанная связывающая молекула усиливает иммуностимулирующий и/или пролиферативный ответ OX40L в эффекторных Т-клетках, экспрессирующих CD134 человека.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула, которая связывается с CD 134 человека, причем действие на связывание OX40L с CD 134 на Т-лимфоцитах, экспрессирующих CD134 человека, уменьшается не более чем приблизительно на 70%, или приблизительно на 60%, или приблизительно 50%, или приблизительно 30%, или приблизительно 20%, или приблизительно 10% или менее, и причем указанная связывающая молекула также не препятствует реакциям, связанным с супрессорной функцией, регуляторных Т-клеток, экспрессирующих CD134 человека, на OX40L человека.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула, которая связывается с CD134 человека, причем указанная связывающая молекула не препятствует связыванию рецептора CD134 человека (ОХ40) с лигандом ОХ40 (OX40L), и причем указанная связывающая молекула также не препятствует реакциям, связанным с супрессорной функции, регуляторных Т-клеток, экспрессирующих CD134 человека, на OX40L человека.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула, которая связывается с CD 134 человека, причем действие на связывание OX40L с CD 134 на Т-лимфоцитах, экспрессирующих CD134 человека, уменьшается не более чем приблизительно на 70%, или приблизительно на 60%, или приблизительно 50%, или приблизительно 30%, или приблизительно 20%, или приблизительно 10% или менее, и причем указанная связывающая молекула усиливает реакции, связанные с супрессорной функцией, регуляторных Т-клеток, экспрессирующих CD134 человека, на OX40L человека.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула, которая

- 16 031006 связывается с CD134 человека, причем указанная связывающая молекула не препятствует связыванию рецептора CD134 человека (ОХ40) с лигандом ОХ40 (OX40L), и причем указанная связывающая молекула усиливает реакции, связанные с супрессорной функцией, регуляторных Т-клеток, экспрессирующих CD134 человека, на OX40L человека.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула, которая связывается с CD 134 человека, причем действие на связывание OX40L с CD 134 на Т-лимфоцитах, экспрессирующих CD134 человека, уменьшается не более чем приблизительно на 70%, или приблизительно на 60%, или приблизительно 50%, или приблизительно 30%, или приблизительно 20%, или приблизительно 10% или менее, и причем указанная связывающая молекула также не препятствует пролиферативным реакциям, регуляторных Т-клеток, экспрессирующих CD134 человека, на OX40L человека.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула, которая связывается с CD134 человека, причем указанная связывающая молекула не ингибирует и не препятствует связыванию рецептора CD134 человека (ОХ40) с лигандом ОХ40 (OX40L) и причем указанная связывающая молекула также не препятствует пролиферативным реакциям регуляторных Т-клеток, экспрессирующих CD134 человека, на OX40L человека.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула которая связывается с CD 134 человека, причем действие на связывание OX40L с CD 134 на Т-лимфоцитах, экспрессирующих CD134 человека, уменьшается не более чем приблизительно на 70%, или приблизительно на 60%, или приблизительно 50%, или приблизительно 30%, или приблизительно 20%, или приблизительно 10% или менее, и причем указанная связывающая молекула подавляет пролиферативные реакции регуляторных Т-клеток, экспрессирующих CD134 человека, на OX40L человека.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена связывающая молекула, которая связывается с CD134 человека, причем указанная связывающая молекула не ингибирует и не препятствует связыванию рецептора CD134 человека (ОХ40) с лигандом ОХ40 (OX40L), и причем указанная связывающая молекула подавляет пролиферативные реакции регуляторных Т-клеток, экспрессирующих CD134 человека, на OX40L человека.

Ниже описан подходящий способ измерения одновременного связывания OX40L и антитела к CD134 человека. Флуоресцентный сигнал FITC (среднее геометрическое или средняя интенсивность флуоресценции (MFI)) связывания OX40L на РНА-стимулированных РВМС (мононуклеарных клеток периферической крови), экспрессирующих CD134, в отсутствии антитела к CD134 человека, принимают за 100%. Флуоресцентный сигнал PE (MFI) антитела к CD 134 человека, связывающегося с РНАстимулированными РВМС, экспрессирующими CD134, в отсутствии OX40L человека принимают за 100%. Уменьшение указанного флуоресцентного сигнала FITC и флуоресцентного сигнала PE, когда и OX40L человека, и антитело к CD134 человека добавляют одновременно к РНА-стимулированным PBMC, экспрессирующим CD 134 человека, предпочтительно не должно превышать приблизительно 70%, или приблизительно на 60%, или приблизительно 50%, или приблизительно 30%, или приблизительно 20%, или приблизительно 10% или менее.

Ниже описан подходящий способ измерения отсутствия препятствования OX40L-опосредуемым пролиферативным реакциям Тэфф. Включение меченного тритием тимидина или BrdU в Тэфф, экспрессирующие CD134 человека, после обработки OX40L человека принимают за 100%. Изменение (т.е. спад или нарастание) такого включения меченного тритием тимидина или BrdU, когда и OX40L человека, и антитело к CD 134 человека одновременно добавляют к активированным (например, РНАстимулированным или стимулированным гранулами с антителами к CD3/CD28) Тэфф, экспрессирующим CD134 человека, предпочтительно не должно превышать приблизительно 30%, или приблизительно 20%, или приблизительно 10% или менее.

Ниже описан подходящий способ измерения усиления OX40L-опосредованных пролиферативных реакций Тэфф. Включение меченного тритием тимидина или BrdU в Еэфф, экспрессирующие CD134 человека, после обработки OX40L человека принимают за 100%. Усиление такого включения меченного тритием тимидина или BrdU, когда и OX40L человека, и антитело к CD134 человека одновременно добавляют к активированным (например, РНА-стимулированным или стимулированным гранулами антиCD3/CD28) Тэфф, экспрессирующим CD134 человека, предпочтительно превышает приблизительно 30%, или приблизительно 40%, или приблизительно 50%, или приблизительно 60%, или приблизительно 70% или более.

Ниже описан подходящий способ измерения отсутствия препятствования OX40L-опосредуемой супрессорной функции Трег. Включение меченного тритием тимидина или BrdU в Еэфф, экспрессирующие CD134 человека, которые культивируют совместно с Еэфф, экспрессирующими CD134 человека (например, отношение Тэфф/Трег=1:1), после обработки OX40L человека принимают за 100%. Изменение (т.е. спад или нарастание) такого включения меченного тритием тимидина или BrdU, когда и OX40L человека, и антитело к CD 134 человека одновременно добавляют к активированным (например, РНАстимулированным или стимулированным гранулами анти-CD3/CD28) Тэфф, экспрессирующим CD134 человека, которые культивируют совместно с Тэфф, экмпрессирующими CB134 человека (например, отношение Тэфф/Трег = 1:1) предпочтительно не должно превышать приблизительно 30%, или прибли- 17 031006 зительно 20%, или приблизительно 10% или менее.

Ниже описан подходящий способ измерения усиления OX40L-опосредуемой супрессорной функции Трег. Включение меченного тритием тимидина или BrdU в Еэфф, экспрессирующие CD134 человека, которые культивируют совместно с Еэфф, экспрессирующими CD134 человека (например, отношение Тэфф/Трег = 1:1), после обработки OX40L человека принимают за 100%. Усиление такого включения меченного тритием тимидина или BrdU, когда и OX40L человека, и антитело к CD134 человека одновременно добавляют к активированным (например, РНА-стимулированным или стимулированным гранулами с анти-CD3/CD28) Тэфф, экспрессирующим CD134 человека, которые культивируют совместно с Тэфф, экспрессирующими CB134 человека (например, отношение Тэфф/Трег = 1:1), предпочтительно превышает приблизительно 30%, или приблизительно 40%, или приблизительно 50%, или приблизительно 60%, или приблизительно 70% или более.

Ниже описан подходящий способ измерения отсутствия препятствования OX40L-опосредуемым пролиферативным реакциям Трег. Включение меченного тритием тимидина или BrdU в Трег, экспрессирующие CD134 человека, после обработки OX40L человека принимают за 100%. Изменение (т.е. спад или нарастание) такого включения меченного тритием тимидина или BrdU, когда и OX40L человека, и антитело к CD 134 человека одновременно добавляют к активированным (например, РНА-стимулированным или стимулированным гранулами анти-CD3/CD28) Трег, экспрессирующим CD134 человека, предпочтительно не превышает приблизительно 30%, или приблизительно 20%, или приблизительно 10% или менее.

Ниже описан подходящий способ измерения подавления OX40L-опосредуемых пролиферативных реакций Трег. Включение меченного тритием тимидина или BrdU в Трег, экспрессирующие CD134 человека, после обработки OX40L человека принимают за 100%. Уменьшение такого включения меченного тритием тимидина или BrdU, когда и OX40L человека, и антитело к CD134 человека одновременно добавляют к активированным (например, РНА-стимулированным или стимулированным гранулами антиCD3/D28) Трег, экспрессирующим CD134 человека, предпочтительно превышает приблизительно 30%, или приблизительно 40%, или приблизительно 50%, или приблизительно 60%, или приблизительно 70% или более.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества связывающей молекулы, описываемой в настоящей заявке.

Согласно еще одному предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанная связывающая молекула является антителом из клона 12H3 и/или клона 20E5, или антигенсвязывающим фрагментом одного из указанных антител. Согласно дополнительному варианту реализации указанное млекопитающее является человеком.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ профилактики рака у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества связывающей молекулы, описываемой в настоящей заявке.

Термин предупреждение рака или профилактика рака относится к замедлению, подавлению или предупреждению начала рака у млекопитающего, у которого начало онкогенеза или развития опухоли не явное, но предрасположенность к раку определяется либо, например, посредством генетического скрининга, либо другим путем. Также данный термин включает лечение млекопитающего, страдающего предраковым заболеванием с целью прекращения прогрессирования предракового заболевания с его переходом в рак, или способствования его регрессии. Примеры предракового заболевания включают гиперплазию, дисплазию и метаплазию. Согласно некоторым вариантам реализации указанная связывающая молекула является антителом к CD 134 или его фрагментом, которые описаны в настоящей заявке. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения предложена связывающая молекула, которую выбирают из антитела клона 12H3 и/или клона 20E5, или антигенсвязывающего фрагмента какого-либо из указанных антител. Согласно дополнительному варианту реализации указанное млекопитающее является человеком.

При помощи способа согласно настоящему изобретению можно лечить разные типы опухолей, включая злокачественные или доброкачественные и/или первичные или вторичные. Примеры таких типов рака известны специалистам в данной области техники и перечислены в стандартных справочниках, таких как Merck Manual of Diagnosis and Therapy (опубликован компанией Merck).

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанные связывающие молекулы можно вводить одни в качестве монотерапии, или вводить в сочетании с одним или более дополнительными терапевтическими агентами или средствами. Так, согласно еще одному варианту реализации предложен способ лечения или профилактики рака посредством комбинированной терапии, причем указанный способ включает введение связывающей молекулы, раскрываемой в настоящей заявке, в сочетании с одним или более дополнительными средствами или терапевтическими агентами. Термин дополнительное средство относится к средству, которое не включает связывающую молекулу, предложенную в раскрытии, в качестве терапевтического агента. Термин дополнительный терапевтический агент относится к любому терапевтическому агенту, отличному от связывающей молекулы, предложенной в настоящем

- 18 031006 раскрытии. Согласно некоторым вариантам реализации указанная связывающая молекула является антителом к CD134 человека клона 12H3 и/или клона 20E5, или антигенсвязывающим фрагментом какоголибо из указанных антител. Согласно одному конкретному аспекту настоящего раскрытия предложено комбинированная терапия для лечения рака у млекопитающего, которая включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества связывающей молекулы, предложенной в настоящем раскрытии, в сочетании с одним или более терапевтическими агентами. Согласно дополнительному варианту реализации указанное млекопитающее является человеком.

В сочетании со связывающей молекулой можно применять самые разные противоопухолевые агенты. Специалист в данной области техники способен представить наличие и разработку других противоопухолевых средств, которые можно применять в сочетании со способами и связывающими молекулами согласно настоящему раскрытию и не должны ограничиваться теми формами терапии, которые указаны в настоящей заявке. Примеры категорий дополнительных терапевтических агентов, которые можно применять в сочетанной терапии при лечении рака, включают: (1) химиотерапевтические агенты, (2) иммунотерапевтические агенты и (3) агенты гормональной терапии.

Термин химиотерапевтический агент относится к химическому или биологическому веществу, которое может вызывать гибель раковых клеток, или препятствовать делению, восстановлению, росту и/или функции раковых клеток. Примеры химиотерапевтических агентов включают агенты, раскрываемые в WO 2006/088639, WO 2006/129163 и US 20060153808, раскрытие которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Термин иммунотерапевтический агент относится к химическому или биологическому веществу, который усиливает иммунный ответ млекопитающего. Примеры иммунотерапевтических агентов включают: бациллы Кальметта-Герена (BCG); цитокины, такие как интерфероны; вакцины, такие как персонализированная иммунотерапия MyVax, Onyvax-P, онкофаг, GRNVACI, Favld, Провеген, GVAX, Ловаксин С, BiovaxID, GMXX и NeuVax; и такие антитела, как алемтузумаб (КАМПАТ), бевацизумаб (АВАСТИН), цетуксимаб (ЭРБИТУКС), гемтузумаб озогамицин (МИЛОТАРГ), ибритумомаб тиуксетан (ЗЕВАЛИН), панитумумаб (ВЕКТИБИКС), ритуксимаб (РИТУКСАН, МАБТЕРА), транстузумаб (ГЕРЦЕПТИН), тозитумомаб (БЕККСАР), тремелимумаб, CAT-3888 и антагонистичные антитела к рецепторам CD40, которые раскрываются в WO 2003/040170.

Термин агент для гормональной терапии относится к химическому или биологическому веществу, которое ингибирует или исключает выработку гормона, или ингибирует или нейтрализует действие гормона на рост и/или выживание раковых клеток. Примеры таких агентов, подходящих для реализации способов согласно настоящей заявке, включают агенты, которые раскрываются в US 20070117809. Примеры конкретных агентов для гормональной терапии включают тамоксифен (НОЛВАДЕКС), торемифен (Фарестон), фулвестран (ФАСЛОДЕКС), анастрозол (АРИМИДЕКС), экземестран (АРОМАЗИН), летрозол (ФЕМАРА), мегестрола ацетат (МЕГЭЙК), госелерин (ЗОЛАДЕКС) и лейпролид (ЛЮПРОН). Связывающие молекулы согласно настоящему раскрытию можно также применять в сочетании с нелекарственными гормональными средствами, такими как (1) хирургические способы, которые направлены на удаление части органов или желез, которые участвуют в выработке гормона, таких как яичники, яички, надпочечники и гипофиз, и (2) лучевая терапия, при которой органы или железы пациента подвергают облучению в количестве, достаточном для ингибирования или устранения выработки целевого гормона.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики рака посредством комбинированной терапии, причем указанный способ включает введение связывающей молекулы, раскрываемой в настоящей заявке, и операцию по удалению опухоли. Указанную связывающую молекулу можно вводить млекопитающему перед, во время или после указанной операции.

Комбинированная терапия, направленная на лечение рака, также включает сочетание связывающей молекулы, предложенной в настоящем раскрытии, с лучевой терапией, такой как ионизирующая (электромагнитная) лучевая терапия (например, рентгеновское или гамма-излучение) и лучевая терапия пучком частиц (например, излучение с высокой линейной передачей энергии). Источник излучения может быть внешним или внутренним по отношению к организму млекопитающего. Указанную связывающую молекулу можно вводить млекопитающему перед, во время или после указанной лучевой терапии.

Связывающие молекулы и композиции, предложенные в настоящем раскрытии, можно вводить любым подходящим энтеральным или парентеральным путем введения. Термин энтеральный путь введения относится к введению через любую часть желудочно-кишечного тракта. Примеры энтерального пути включают оральный, введение через слизистые оболочки, буккальный и ректальный путь, или внутрижелудочный путь. Термин парентеральный путь путь введения относится к пути введения, отличному от энтерального. Подходящий путь и способ введения может варьировать в зависимости от целого ряда факторов, таких как специфическое антитело, которое применяют, желаемая скорость всасывания, специфическая лекарственная форма или форма дозирования, которую применяют, тип или тяжесть расстройства, которое лечат, специфический участок действия и состояние пациента, и специалист в данной области техники может легко подобрать такой способ.

Термин терапевтически эффективное количество связывающей молекулы относится к количеству,

- 19 031006 которое эффективно для предназначаемой терапевтической цели. Например, в контексте усиления иммунного ответа терапевтически эффективным количеством является любое количество, которое эффективно стимулирует, провоцирует, увеличивает, повышает или способствует любому ответу иммунной системы млекопитающего. В контексте лечения рака терапевтически эффективным количеством является любое количество, которого достаточно, чтобы вызвать любой желаемое или полезное действие у млекопитающего, которое лечат, например, подавление дальнейшего роста или распространения раковых клеток, гибель раковых клеток, подавление рецидивов рака, уменьшение боли, связанной с раком, или повышение выживаемости млекопитающего. Согласно способу профилактики рака терапевтически эффективным количеством является любое количество, которое эффективно для замедления, подавления или предупреждения начала рака у млекопитающего, которому вводят указанную связывающую молекулу.

Терапевтически эффективное количество связывающей молекулы обычно варьирует в диапазоне от приблизительно 0,001 до приблизительно 500 мг/кг и более, обычно от приблизительно 0,05 до приблизительно 100 мг/кг массы тела указанного млекопитающего. Например, указанное количество может составлять приблизительно 0,3 мг/кг, 1 мг/кг, 5 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 50 мг/кг или 100 мг/кг массы тела указанного млекопитающего. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтически эффективное количество антитела к CD134 человека варьирует в диапазоне от 0,1 до 30 мг/кг массы тела млекопитающего. Специалист в данной области техники может легко подобрать точный уровень доз, который требуется вводить, и такой уровень будет зависеть от целого ряда факторов, таких как тип или тяжесть расстройства, которое лечат, конкретной применяемой связывающей молекулы, пути введения, времени введения, продолжительности лечения, конкретных применяемых дополнительных средств, возраста, пола, патологического состояния, общего состояния здоровья и анамнеза пациента, которого требуется лечить, и подобных факторов, хорошо известных в технике.

Связывающую молекулу или композиция обычно вводят в несколько заходов. Интервалы между однократными дозами могут составлять, например, раз в неделю, раз в месяц, каждые три месяца или раз в год. Примеры режима лечения включают введение раз в неделю, раз в две недели, раз в три недели, раз в четыре недели, раз в месяц, раз в 3 месяца или раз в 3 или 6 месяцев. Обычные режимы дозирования для антитела к CD134 человека включают 1 мг/кг массы тела или 3 мг/кг массы тела внутривенно, с применением одного из следующих графиков дозирования: (i) шесть доз раз в четыре недели, затем раз в три месяца; (ii) раз в три недели; (iii) 3 мг/кг массы тела один раз, затем 1 мг/кг массы тела раз в три недели.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не предназначены, чтобы каким-либо образом ограничить область настоящего изобретения. Напротив, должно быть ясно, что есть место для разных других вариантов реализации, модификаций и эквивалентов, которые после прочтения описания в настоящей заявке, могут представить себе специалисты в данной области техники, не отклоняясь от духа настоящего изобретения и/или области формулы изобретения.

Примеры

Пример 1. Получение моноклональных антител мыши к CD134 человека (=OX40) (a) . Получение клеток насекомых Sf9, экспрессирующих CD134 на своей поверхности кДНК, кодирующую белок CD134 человека (GenBank, идентификационный номер САВ96543.1; см. SEQ ID № 1) оптимизировали для экспрессии в клетках насекомых Sf9 (Spodotera frugiperda) и синтезировали при помощи GENEART, Регенсбург, Германия (см. SEQ ID № 2). Указанную кДНК субклонировали в плазмиду переноса на основе бакуловируса pVL1393 (набор для трансфекции, кат. номер 560129; BD Biosciences). Затем клетки насекомых Sf9 (ATCC) подвергали совместной трансфекции с плазмидой переноса pVL1393, содержащей кДНК, кодирующей CD134 человека, вместе с ДНК бакуловируса BaculoGold (набор для трансфекции BD), а затем инкубировали при 27°C в течение 4-5 дней. После указанного этапа совместной трансфекции надосадочную жидкость отбирали и хранили при 4°C, и применяли ее для инфицирования последующих клеток насекомых Sf9 для амплификации вируса. Для данной цели клетки насекомых Sf9 трансфецировали амплифицированным рекомбинантным бакуловирусом, а затем инкубировали при 27°C в течение 3-5 дней. Указанные клетки насекомых Sf9 отбирали, промывали стерильным ФСБ (фосфатно-солевым буфером), отбирали аликвоты 5х10⁶ клеток/250 мкл в ФСБ и хранили при -80°C с целью получения лизатов клеток. Перед хранением экспрессию CD134 человека на поверхности клеток насекомых Sf9 подтверждали с применением конъюгированного с фикоэритрином (PE) антитела мыши (1:10) К CD134 человека (клон ACT35; BD Biosciences) и проточной цитометрии.

(b) . Иммунизация и получение моноклональных антител мыши к CD134 человека Мышам BALB/c (самки, возраст 6 недель; Charles River Laboratories) подкожно вводили ~ 400 мкл лизата клеток насекомых Sf9, трансфецированных CD 134 человека (аликвота лизата клеток 250 мкл + 250 мкл полного адъюванта Фрейнда; Sigma) в День 0. Аналогичные подкожные инъекции с введением лизатов клеток насекомых Sf9, трансфецированных CD134 человека, и неполного адъюванта Фрейнда (Sigma) проводили в День 21 и День 42. В День 61 и День 62 проводили внутрибрюшинное введение бустер-дозы лизатов клеток насекомых Sf9, трансфецированных CD134 человека, (250 мкл/мышь) без адъюванта. В День

- 20 031006 спленоциты, полученные от иммунизированных мышей, объединяли с клетками миеломы SP2/0 (ATCC) с применением стандартной технологии гибридомы, первоначально описанной Kohler and Milstein (Nature 1975; 256: p495-497). Гибридомы, которые вырабатывали антитела (класс IgG мыши) к CD134 человека (проводили скрининг посредством стандартного ELISA и проточной цитометрии с применением гибридного белка рекомбинантный CD134 человека: Fcy человека (R&D Systems), и бластные CD4 Т-лимфоциты, стимулированные PHA (Roche) и экспрессирующие CD134 человека (см. пример 2 ниже) в качестве мишеней соответственно выращивали, криоконсервировали и клонировали путем предельного разведения. Специфические моноклональные антитела к CD134 человека очищали при помощи колонок с белком G (GE Healthcare), и получали в организме мыши моноклональные антитела к CD134 человека - клон 12H3 (антитело мыши - изотип IgG1 к; определяли при помощи набора определения изотипа моноклональных антител мыши IsoStrip™ компании Roche) и клон 20E5 (антитело мыши изотип IgG1x; то же).

Пример 2. Описание свойств моноклональных антител мыши к CD134 человека из клонов 12H3 и 20E5 при помощи проточной цитометрии (a) . Экспрессия CD134 на Т-лимфоцитах человека, стимулированных PHA

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC), полученные от здоровых доноров (информированное согласие), выделяли посредством центрифугирования в градиенте плотности на Lymphoprep (1,077 г/мл; Nycomed). Затем к 1-2х10⁶ PBMC/мл в питательной среде RPMI-1640(Gibco) содержащей 10% фетальной сыворотки телят (Bodinco) и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco) добавляли 0, 0,1, 1,0 или 10,0 мкг/мл фитогемагглютинина-М (PHA-M; Roche) и инкубировали при 37°C/5% CO2 в течение 1-3 дней. После культивирования PBMC отбирали и помещали при плотности 1-2х10⁶ клеток/мл в охлажденный льдом фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma)/0,05% NaN3 (PBS/BSA/NaN₃) с добавлением 10% смешанной сыворотки людей (HPS; блокирование рецепторов Fcy; BioWhittaker). Клетки инкубировали с 10 мкг/мл коммерческого антитела мыши к CD134 человека - клон ACT35 (антитело мыши, изотип IgG1; BD Biosciences, Альпен-аан-ден-Рийн, Голландия) в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaN клетки дополнительно инкубировали с разведенными 1:200 PE-конъюгированными антителами козы к IgG мыши (Jackson ImmunoResearch) в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaN клетки инкубировали с разведенными 1:20 антителами мыши к CD3 человека, конъюгированными с флуоресцеина изотиоцианатом (FITC) (BD Biosciences) с целью выявления Т-лимфоцитов в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaN клетки фиксировали в 2% формальдегиде в ФСБ/БСА/NaN в течение 30 мин при 4°C. Связывание антител измеряли при помощи проточной цитометрии (FACSCalibur; BD Biosciences).

Как показано на фиг. 1 (n=1 от каждого донора), Т-лимфоциты человека, полученные из периферической крови, не стимулированные/в состоянии покоя, не экспрессируют никаких CD134, однако CD3⁺ Т-лимфоциты человека, стимулированные PHA, экспрессируют на своей поверхности CD 134 с зависимостью от дозы. При воздействии 10мкг/мл PHA уровень экспрессии CD134 на активированных CD3⁺ Тлимфоцитах человека, по-видимому, достигает плато в промежутке между днем 1 и днем 2, однако процент CD1347CD3⁺ T-лимфоцитов человека увеличивается с зависимостью от времени во время эксперимента.

(b) . Экспрессия CD134 на субпопуляции CD4 Т-лимфоцитах человека, стимулированных PHA

Генерировали PHA-стимулированные (в концентрации 0 и 10 мкг/мл в течение 1 дня; см. выше) Тлимфоциты, экспрессирующие CD134 человека. Клетки отбирали и помещали при плотности 1-2х10⁶ клеток/мл в охлажденный льдом ФСБ/БСА/NaN с добавлением 10% HPS (блокирование рецепторов Fcy; BioWhittaker). Клетки инкубировали с разведенными 1:10 FITC-конъюгированными антителами мыши к CD4 (BD Biosciences) или с разведенными 1:10 FITC-конъюгированными антителами мыши к CD8 (BD Biosciences) в сочетании с разведенными 1:10 коммерческими РЕ-конъюгированными антителами мыши к CD134 человека - клон ATC35 (BD Biosciences) в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaN клетки фиксировали в 2% формальдегиде в ФСБ/БСА/NaN в течение 30 мин при 4°C. Связывание антител измеряли при помощи проточной цитометрии (FACSCalibur; BD Biosciences).

Как показано на фиг. 2, экспрессия CD134 наблюдалась на стимулированных PHA Тлимфоцитах человек, но не на покоящихся CD4⁺ Т-лимфоцитах человека. На PHA-активированных CD8⁺ Т-лимфоцитах человека был показан низкий уровень экспрессии CD134, и никакой экспрессии CD134 не наблюдалось на покоящихся CD8⁺ T-лимфоцитах человека (данные не показаны).

(c) . Связывание моноклинальных антител мыши к CD 134 человека клонов 12H3 и 20E5 на PHAстимулированных Т-лимфоцитах, экспрессирующих CD134 человека

Генерировали PHA-стимулированные (в концентрации 10 мкг/мл в течение 2 дней; см. выше) Тлимфоциты, экспрессирующие CD134 человека. Клетки отбирали и помещали при плотности 1-2х10⁶ клеток/мл в охлажденный льдом ФСБ/БСА/NaN с добавлением 10% HPS (блокирование рецепторов Fcy; BioWhittaker). Клетки инкубировали с 0, 0,007, 0,02, 0,07, 0,2, 0,6, 1,9, 5,6, 16,7, 50,0 мкг/мл коммерче

- 21 031006 ского антитела мыши к CD134 человека - клона ACT35 (антитело мыши - изотип IgG1; BD Biosciences) и самостоятельно сгенерированного антитела мыши к CD134 человека - клона 12H3 или клона 20E5 - в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaNз клетки дополнительно инкубировали с разведенными 1:200 PE-конъюгированными антителами козы к IgG мыши (Jackson ImmunoResearch) в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaNз клетки инкубировали с разведенными 1:20 FITC-конъюгированными антителами мыши к CD3 человека (BD Biosciences) для выявления Т-лимфоцитов в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaNз клетки фиксировали в 2% формальдегиде в ФСБ/БСА/NaNз в течение 30 мин при 4°C. Связывание антител измеряли при помощи проточной цитометрии (FACSCalibur; BD Biosciences).

Как показано на фиг. 3 (среднее ± CO; результаты, полученные для двух доноров), антитела мыши к CD134 человека клона ACT35, клона 12H3 и клона 20Н5 насыщали молекулы CD134 человека на поверхности PHA-стимулированных CD3⁺ Т-лимфоцитах приблизительно при 5,0-10,0 мкг/мл. На основании данных для указанных двух доноров половина максимального связывания наблюдалась при ~ 0,5 мкг/мл для антитела мыши к CD134 человека клона 12H3 и при ~ 2,5 мкг/мл для антитела мыши к CD134 человека клона ACT35 и клона 20E5.

(d) . Связывание моноклинальных антител мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 на РНАстимулированных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах, экспрессирующих CD134 человека

Генерировали РНА-стимулированные (в концентрации 20 мкг/мл в течение 1 дня; см. выше) Тлимфоциты, экспрессирующие CD134 человека. Клетки отбирали и помещали при плотности 1-2х10⁶ клеток/мл в охлажденный льдом ФСБ/БСА/NaNз с добавлением 10% HPS (блокирование рецепторов Fcy; BioWhittaker). Клетки инкубировали с 20,0 мкг/мл с контрольным антителом мыши изотипа IgG1K (BD Biosciences) или с 20,0 мкг/мл моноклонального антитела мыши к CD134 человека клона 12H3 или клона 20E5 в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaNз клетки дополнительно инкубировали с разведенными 1:100 PE-конъюгированными антителами козы к IgG мыши (Jackson ImmunoResearch) в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaN клетки инкубировали в течение 30 мин при 4°C с разведенными 1:20 FITC-конъюгированными антителами мыши к CD4 человека (BD Biosciences) или разведенными 1:20 FITC-конъюгированными антителами мыши к CD8 человека (BD Biosciences) для выявления субпопуляций Т-лимфоцитов. После активного промывания в ФСБ/БСА/Ыи^ клетки фиксировали в 2% формальдегиде в ФСБ/БСА/NaN в течение 30 мин при 4°C. Связывание антител измеряли при помощи проточной цитометрии (FACSCalibur; BD Biosciences).

Как показано на фиг. 4, моноклональное антитело мыши к CD134 человека клона 12H3 или клона 20E5 демонстрировало положительное окрашивание на субпопуляции активированных CD4⁺ Тлимфоцитов человека, и слабое окрашивание на субпопуляции активированных CD8⁺ Т-лимфоцитов человека.

(e) . Перекрестная конкуренция немеченых антител мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 с РЕ-конъюгированными коммерческими антителами мыши к CD134 на стимулированных T-лимфоцитах, экспрессирующих CD134 человека

Генерировали РНА-стимулированные (в концентрации 10 или 20 мкг/мл в течение 4 дней или 1 дня соответственно; см. выше) Т-лимфоциты, экспрессирующие CD 134 человека. Клетки отбирали и помещали при плотности 1-2х10⁶ клеток/мл в охлажденный льдом ФСБ/БСА/NaNs с добавлением 10% HPS (блокирование рецепторов Fcy; BioWhittaker). Клетки инкубировали с 20 мкг/мл немеченого моноклонального антитела мыши к CD134 человека клона 12H3 или с 10 мкг/мл немеченого клона 20E5 в течение 30 мин при 4°C. Затем клетки инкубировали с разведенными 1:20 PE-конъюгированными коммерческими антителами мыши к CD134 человека клона ACT35 (BD Biosciences) или клона L106 (BD Biosciences; см. Также патент Godfrey) в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaNs клетки фиксировали в 2% формальдегиде в ФСБ/БСА/NaN в течение 30 мин при 4°C. Связывание PE-конъюгированных коммерческих антител к CD134 измеряли при помощи проточной цитометрии (FACSCalibur; BD Biosciences).

Как показано на фиг. 5, предварительная инкубация с немеченым антителом мыши к CD134 человека блокирует связывание коммерческого PE-конъюгированного антитела мыши к CD134 человека клона L106 с CD134 человека на PHA-стимулированных Т-лимфоцитах. Предварительная инкубация с немеченым антителом мыши к CD 134 человека клона 20E5 в малой степени блокирует связывание коммерческого PE-конъюгированного антитела мыши к CD 134 человека клона L106 с CD 134 человека на РНА-стимулированных Т-лимфоцитах. Предварительная инкубация с немеченым антителом мыши к CD134 человека клона 20E5 не демонстрировала действия на связывание коммерческого PE-конъюгированного антитела мыши к CD134 человека клона ACT35 с CD134 человека на РНА-стимулированных Т-лимфоцитах.

Указанные результаты продемонстрировали, что антитело мыши к CD 134 человека клона 12H3 специфически распознавало CD134 человека (частичное блокирование связывания клона L106) на РНАстимулированных Т-лимфоцитах и связывалось (ii) с эпитопом на CD134 человека, несходным с эпито

- 22 031006 пом, который распознавался коммерческим антителом мыши к CD134 человека клона L106. Указанные результаты также продемонстрировали, что антитело мыши к CD134 человека клона 20E5 (i) специфически распознавало CD134 человека (слабое блокирование связывания клона L106) на РНА-стимулированных Т-лимфоцитах и связывалось (ii) с эпитопом на CD134 человека, несходным с эпитопом, который распознавался коммерческим антителом мыши к CD134 человека клона L106. Кроме того, указанные результаты продемонстрировали, что антитела мыши к CD134 человека клона 12H3 и клона 20Е, по-видимому, распознавали эпитопы CD134 человека на РНА-стимулированных Т-лимфоцитах, которые отличались от эпитопа, распознаваемого коммерческим антителом мыши к CD 134 человека клона ACT35. Кроме того, указанные результаты продемонстрировали, что антитела мыши к CD134 человека клона 12H3 и клона 20Е, по-видимому, распознавали несхожие эпитопы CD134 человека (что подтверждается частичным блокированием по сравнению со слабым блокированием связывания L106 соответственно) на РНА-стимулированных Т-лимфоцитах.

(f) . Одновременное связывание рекомбинантного лиганда ОХ40 человека и антител мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 на РНА-стимулированных Т-лимфоцитах, экспрессирующих CD134 человека

Генерировали РНА-стимулированные (в концентрации 10 мкг/мл в течение 1 дня; см. выше) Тлимфоциты, экспрессирующие CD134 человека. Клетки отбирали и помещали при плотности 1-2х10⁶ клеток/мл в охлажденный льдом ФСБ/БСА/NaNз с добавлением 10% HPS (блокирование рецепторов Fcy; BioWhittaker). Клетки инкубировали с 10,0 мкг/мл рекомбинантного лиганда ОХ40 человека с полигистидиновой меткой (OX40L; R&D Systems) в сочетании с 50,0 мкг/мл антитела к полигистидину (IgG1, мыши - клон AD1.1.10; R&D Systems) в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaNз клетки затем инкубировали с разведенными 1:100 FITC-конъюгированными антителами козы к IgG мыши (Jackson ImmunoResearch) в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaNs, клетки инкубировали с 10,0 мкг/мл биотинилированного (с применением Nгидроксисукцинимидо-биотина от компании Pierce) моноклонального антитела мыши к CD134 человека клона 12H3 или клона 20E5 в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaNs клетки инкубировали с разведенным 1:100 PE-конъюгированным стрептавидином (Jackson ImmunoResearch) в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaNs клетки фиксировали в 2% формальдегиде в ФСБ/БСА/ШХ в течение 30 мин при 4°C. Связывание ОХ40 человека с антителами к CD134 человека измеряли при помощи проточной цитометрии (FACSCalibur; BD Biosciences).

Как показано на фиг. 6, и моноклональное антитело мыши к CD134 человека клона 12H3, и моноклональное антитело мыши к CD134 человека клона 20E5 одновременно связывались с OX40L человека на РНА-стимулированных Т-лимфоцитах, экспрессирующих CD134 человека. Это указывает на то, что моноклональное антитело мыши к CD134 человека клона 12H3 и клона 20E5 не взаимодействуют с эпитопами в пределах области связывания OX40L на рецепторах CD134 человека. Данный результат отличается от результата для коммерческого моноклонального антитела мыши к CD134 человека клона L106 (Стэнфордский университет/патент Godfrey ЕР 0726952 В1), которое распознавало эпитоп в пределах области связывания OX40L рецепторов CD134 человека (Taylor and Schwarz. J Immunol Methods 2001; 255: 67-72; Kirin & La Jolla Institute/ патент Croft WO 2007/062235 A2).

(g) . Экспрессия CD134 на эффекторных и регуляторных Т-лимфоцитах человека после стимуляции стимулирующими гранулами с антителами мыши против CD3 человека/ CD28 человека.

CD4 Т-лимфоциты человека очищали из совокупности PBMC посредством позитивного отбора с применением конъюгированных с микрогранулами антител мыши к CD4 человека (Miltenyi Biotec) и магнита VarioMACS™/колонок LS (Miltenyi Biotec). Затем указанные CD4 Т-лимфоциты окрашивали FITC-конъюгированными антителами мыши к CD4 человека (Dako) и PE-конъюгированными антителами мыши к CD25 человека (BD Biosciences). CD4⁺ /cD25^{негативные} традиционные эффекторные Тлимфоциты (Тэфф) и CD4⁺/CD25^{богаlЪIе} регуляторные Т-лимфоциты (Трег) сортировали при помощи проточно-цитометрического клеточного сортера (Beckman-Coulter). Это приводило к обогащению >95% Тэфф и >95% Трег. Тэфф и Трег помещали при плотности 2,5х10⁵ клеток/мл в питательную вреду RPMI1640/глутамакс (Gibco) с добавлением 0,02 М пирувата (Gibco), 100 Е/мл пенициллина (Gibco), 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco) и 10% термоинактивированной HPS (HPS,; из LMI). Затем клетки рассевали при плотности 2,5х10⁴ клеток/200 мкл/лунку в планшеты на 96 лунок с круглым дном (Greiner) и стимулировали стимулирующими гранулами с антителами мыши на CD3 человека/CD28 человека (гранулы анти-CD3/CD28; Invitrogen) в соотношении 1 гранула/2 клетки в присутствии 25 Е/мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека (Proleukin® от компании Novartis Pharmaceuticals UK Ltd), и культивировали при 37°C/5% CO₂ в течение 2-8 дней. После культивирования клетки отбирали и помещали при плотности 1-2х10⁶ клеток/мл в охлажденный льдом ФСБ/0,2% БСА и одновременно окрашивали разведенными 1:50 FITC-конъюгированными антителами мыши к CD4 человека (Dako), разведенными 1:10 PE-конъюгированными антителами мыши к CD25 человека (BD Biosciences), разведенными 1:50 ECD™-конъюгированными антителами мыши к CD3 человека (Beckman-Coulter), разведенными 1:10 PE-Cy™5-конъюгированными антителами мыши к CD 134 человека (клон ATC35; BD Biosciences) и

- 23 031006 разведенными 1:10 PE-Cy™7-конъюгированными антителами мыши к CD127 человека (eBiosciences). Связывание антител измеряли при помощи проточной цитометрии (FACSCalibur; BD Biosciences).

Как показано на фиг. 7 (n=1 от каждого донора), Тэфф и Трег периферической крови человека, очищенные и нестимулированные/покоящиеся (день 0), не экспрессируют CD134, однако Тэфф и Трег человека, стимулированные анти-CD3/анти-CD28-гранулами экспрессируют на своей поверхности CD134. Экспрессия CD134 на активированных Тэфф и Трег человека достигают максимума после 2 дней культивирования и снижается после 5 и 8 дней культивирования.

Пример 3. Описание биологических свойств моноклональных антител мыши к CD 134 человека клонов 12H3 и 20E5 (a) . Пролиферация РНА-стимулированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD134 человека, после обработки антителами мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5

Генерировали РНА-стимулированные (в концентрации 0 и 10 мкг/мл в течение 1 дня; см. выше) Тлимфоциты, экспрессирующие CD134 человека. Клетки отбирали и суспендировали с плотностью 12х10⁶ клеток/мл в питательной среде RPMI (Gibco), содержащей 10% фетальной сыворотки телят (Bodinco) и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco). Затем клетки рассевали при плотности 0,1х10⁶ клеток/100 мкл/лунку в планшеты на 96 лунок с плоским дном (Corning) и воздействовали на них 0, 0,025, 0,25, 2,5, или 25,0 мкг/мл моноклонального антитела мыши к CD134 человека клона 12H3 или моноклонального антитела мыши к CD134 человека клона 20E5, и/или в сочетании с 0, 0,01, 0,1 или 1,0 мкг/мл рекомбинантного OX40L человека с полигистидиновой меткой (в присутствии антитела мыши к полилизину в мольном отношении 1:5; R&D Systems) при 37°C/5% CO₂ в течение 6 дней. Спустя 6 дней пролиферацию клеток измеряли при помощи колориметрического ELISA™ для оценки пролиферации клеток (с включением BrdU) (Roche) и ридера для ELISA (BioRad) на длине волны 450 нм.

Как показано на фиг. 8 (среднее ± СО, n=4 от одного донора), моноклональное антитело мыши к CD134 человека клона 12H3 и моноклональное антитело мыши к CD134 человека клона 20E5 дозозависимо вызывали пролиферацию PHA-стимулированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD134 человека. Моноклональное антитело мыши к CD 134 человека клона 12H3 вызывало пролиферацию при концентрации 0,25, 2,5 и 25 мкг/мл. Моноклональное антитело мыши к CD134 человека клона 12H3 вызывало пролиферацию при концентрации 2,5 и 25 мкг/мл. Кроме того, OX40L человека дозозависимым образом вызывал пролиферацию РНА-стимулированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD 134 человека. OX40L человека вызывал пролиферацию при концентрациях 0,1 и 1,0 мкг/мл. Покоящиеся (без стимуляции PHA) £0134™™™' Т-лимфоциты человека не демонстрировали никаких реакций пролиферации после обработки моноклональным антителом мыши к CD134 человека клона 12H3, моноклональным антителом мыши к CD134 человека клона 20E5 или OX40L человека (данные не показаны).

Как показано на фиг. 9 (среднее ± CO, n=2 от одного донора), моноклональное антитело мыши к CD134 человека клона 12H3 (при концентрации 2,5 и 25 мкг/мл) и моноклональное антитело мыши к CD134 человека клона 20E5 (при концентрации 2,5 и 25 мкг/мл), а также OX40L человека (при концентрации 1,0 мкг/мл) вызывали пролиферацию РНА-стимулированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD134 человека. Необработанный контроль (только среда) или контроль, обработанный антителом мыши изотипа IgG1K (при концентрации 2,5 и 25 мкг/мл; BD Biosciences), не демонстрировали никакого действия на пролиферацию PHA-стимулированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD 134 человека. Сочетание моноклонального антитела мыши к CD134 человека клона 12H3 в концентрации 2,5 и 25 мкг/мл (или при более низких концентрациях; данные не показаны) или моноклонального антитела мыши к CD134 человека клона 20E5 в концентрации 2,5 и 25 мкг/мл (или при более низких концентрациях; данные не показаны) с OX40L человека в концентрации 1,0 мкг/мл (или при более низких концентрациях; данные не показаны) не демонстрирует никаких взаимных воздействий (т.е. синергетического или аддитивного, или даже ингибирующего действия) на пролиферацию PHA-стимулированных Тлимфоцитов, экспрессирующих CD134 человека.

(b) . Пролиферация стимулированных гранулами с антителами к CD3/CD28 человека эффекторных и регуляторных Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD134 человека, после обработки антителами мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5

CD4 Т-лимфоциты человека очищали из совокупности PBMC посредством негативного отбора с применением коктейля антител мыши (BD Biosciences), направленных на CD8 (клон RPA-T8), CD14 (клон M5E2), CD16 (клон 3G8), CD19 (клон 4G7), CD33 (клон Р67.6), CD56 (клон В159) и CD235a человека (HIR2). После инкубации с Dynabeads®-конъюгированными антителами овцы к IgG мыши (Invitrogen) не связавшиеся CD4 Т-лимфоциты отбирали из концентратора магнитных частиц для динамического анализа MCP™-6 (Invitrogen). Из указанной совокупности обогащенных CD4 Т-лимфоцитов CD25^{богаlЪIе} Трег и Тэфф выделяли посредством MACS-сортировки с применением 10 мкл конъюгированных с микрогранулами антител мыши к CD25 человека (Miltenyi Biotec)/10⁷ клеток и магнита MiniMACS™/колонок MS (Miltenyi Biotec) и VarioMACS™ магнита/колонок LS (Miltenyi Biotec). Это приводило к обогащению >90% Тэфф и >90% Трег. Тэфф и Трег помещали при плотности 0,25х10⁶ клеток/мл в питательную вреду RPMI-1640/глутамакс (Gibco) с добавлением 0,02 М пирувата

- 24 031006 (Gibco),100 Е/мл пенициллина (Gibco), 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco) и 10% термоинактивированной HPSi. Затем Тэфф и Трег рассевали при плотности 2,5х10⁴ клеток/200 мкл/лунку (т.е. 0,125х10⁶ клеток/мл) в планшеты на 96 лунок с круглым дном (Greiner) и стимулировали анти-CD3/CD28 гранулами (Invitrogen) в соотношении 1 гранула/5 клеток с добавлением или без добавления 5,0 мкг/мл моноклонального антитела мыши к CD 134 человека клона 12H3, 5,0 мкг/мл моноклонального антитела мыши к CD134 человека клона 20E5, 1,0 мкг/мл рекомбинантного OX40L человека с полигистидиновой меткой (в присутствии антитела мыши к полилизину в мольном отношении 1:5; R&D Systems), сочетания 5,0 мкг/мл моноклонального антитела мыши к CD134 человека клона 12H3 с 1,0 мкг/мл рекомбинантного OX40L человека с полигистидиновой меткой (в присутствии антитела мыши к полилизину в мольном отношении 1:5) или сочетания 5,0 мкг/мл моноклонального антитела мыши к CD134 человека клона 20E5 с 1,0 мкг/мл рекомбинантного OX40L человека с полигистидиновой меткой (в присутствии антитела мыши к полилизину в мольном отношении 1:5) при 37°C/5% CO₂ в течение 4 или 5 дней. Спустя 4 или 5 дней пролиферацию клеток измеряли по включению тимидина, меченного тритием 0,5 мкКю, (Perkin & Elmer) при помощи β-счетчика (Canberra-Packard).

Как показано на фиг. 10 (среднее ± CO), хотя анти-CD3/CD28 стимулирующие гранулы сами по себе вызывали значительную пролиферацию Тэфф человека, экспрессирующих CD134 человека (т.е. среда), моноклональное антитело мыши к CD134 человека клона 12H3 или OX40L человека вызывали дополнительную пролиферацию стимулированных анти-CD3/CD28 гранулами Тэфф человека, экспрессирующих CD 134 человека. Моноклональное антитело мыши к CD 134 человека клона 20E5 не вызывало дополнительной пролиферации стимулированных анти-CD3/CD28 гранулами Тэфф человека, экспрессирующих CD134 человека.

Как показано на фиг. 11 (среднее ± стандартная ошибка среднего для 5 доноров), моноклональное антитело мыши к CD134 человека клона 12H3 и моноклональное антитело мыши к CD134 человека клона 20E5 не вызывали или вызывали лишь незначительную пролиферацию стимулированных антиCD3/CD28 гранулами Трег человека, экспрессирующих CD134 человека, тогда как OX40L человека вызывал очень сильную пролиферацию стимулированных анти-CD3/CD28 гранулами Трег человека, экспрессирующих CD134 человека.

Как показано на фиг. 12A (среднее ± СО), моноклональное антитело мыши к CD134 человека клона 12H3 в сочетании с OX40L человека не демонстрировали никаких взаимных воздействий (т.е. синергичного или аддитивного, или даже ингибирующего действия) на стимулированные анти-CD3/CD28 гранулами Трег человека, экспрессирующие CD134 человека. Кроме того, моноклональное антитело мыши к CD134 человека клона 20E5 в сочетании с OX40L человека не демонстрировали никаких взаимных воздействий (т. е. синергичного или аддитивного, или даже ингибирующего действия) на стимулированные анти-CD3/CD28 гранулами Трег человека, экспрессирующие CD134 человека (данные не показаны).

Как показано на фиг. 12В (среднее ± СО), в отличие от действия, наблюдаемого с пролиферативными реакциями, опосредуемыми OX40L человека, в стимулированных анти-CD3/CD28 гранулами Тэфф, экспрессирующих CD134 человека, моноклональные антитела мыши к CD134 человека клона 12H3 существенно подавляют опосредуемые OX40L человека пролиферативные пролиферативными реакциями, опосредуемыми OX40L человека, в стимулированных анти-CD3/CD28 гранулами Трег, экспрессирующих CD134 человека.

(c). Супрессорная функция стимулированных гранулами с антителами к CD3/CD28 человека Трегуляторных лимфоцитов, экспрессирующих CD134 человека, после обработки антителами мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 CD4 Т-лимфоциты человека очищали из совокупности PBMC, и Тэфф и Трег обогащали, как описано в примере 3(b) выше. Тэфф и Трег помещали при плотности 0,25х10⁶ клеток/мл в питательную вреду RPMI-1640/глутамакс (Gibco) с добавлением 0,02 М пирувата (Gibco), 100 Е/мл пенициллина (Gibco), 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco) и 10% HPS,. Затем Тэфф рассевали при плотности 2,5х10⁴ клеток/200 мкл/лунку (т.е. 0,125х10⁶ Тэфф/мл) и культивировали их совместно с супрессорными Трег с плотностью 0,25х10⁴ супрессорных Трег/200 мкл/лунку (т.е. 0,125х10⁶ Трег/мл; отношение Тэфф/Трег = 1:1) в планшетах на 96 лунок с круглым дном (Greiner). Указанные совместные культуры Тэфф/Трег стимулировали гранулами анти-CD3/CD28 (Invitrogen) в концентрации 1 гранула/10 клеток с добавлением или без добавления 5,0 мкг/мл моноклонального антитела мыши к CD134 человека клона 12H3, 5,0 мкг/мл моноклонального антитела мыши к CD134 человека клона 20E5 и 1,0 мкг/мл рекомбинантного OX40L человека с полигистидиновой меткой (в присутствии антитела мыши к полилизину в мольном отношении 1:5; R&D Systems) при 37°C/5% CO₂ в течение 5 дней. Спустя 5 дней пролиферацию клеток измеряли по включению тимидина, меченного тритием 0,5 мкКю, (Perkin & Elmer) при помощи р-счетчика (Canberra-Packard).

Как показано на фиг. 13 (среднее ± CO), Трег человека подавляли пролиферативные реакции в Тэфф человека, индуцируемые анти-CD3/CD28 гранулами (т.е. средой). Указанная супрессорная функция Трег человека ослаблялась в присутствии моноклональных антител мыши к CD 134 человека клона 12H3 или в присутствии OX40L человека. Моноклональные антитела мыши к CD 134 человека клона 20E5 не демонстрировали никакого действия на супрессорную функцию Трег человека.

- 25 031006

Пример 4. Описание молекулярно-генетических свойств моноклональных антител мыши к CD134 человека клонов 20E5 и 12H3 (a) . Изотипирование и расщепление белков по Эдману

Класс иммуноглобулинов мыши и тип легких цепей в моноклональных антителах мыши к CD 134 человека клонов 20E5 и 12H3, очищенных при помощи белка G, определяли при помощи набора для изотипирования моноклональных антител мыши IsoStrip™, и было показано, что оба моноклональных антитела мыши к CD134 человека клонов 20E5 и 12H3 являются IgG1 мыши с легкими цепями к.

После стандартного электрофореза LDS-PAGE с применением системы NuPage® Novex® заводского геля (Invitrogen) при восстановленных условиях (дитиотреитол и нагревание до 70°C) моноклональное антитело мыши к CD134 человека клона 2Е5 подвергали электроблоттингу в мембрану из поливиниледена фторида для переноса (PDVF/Immobilon-P) и окрашивали Кумасси бриллиантовым голубым (BioRad). Затем полосы тяжелых и легких цепей (50 и 25 кДа соответственно) вырезали из PVDF мембраны и применяли для анализа на основе расщепления белков по Эдманду (проводимому компанией Eurosequence, Гронинген, Нидерланды) с целью определения последовательностей аминокислот с N-конца. Результаты показаны под номерами SEQ ID № 3 и SEQ ID № 61 для моноклинального антитела мыши к CD134 человека клона 20E5. Было определено одиннадцать аминокислот на N-конце тяжелых цепей и 11 аминокислот на N-конце легких цепей.

(b) . ПЦР-РВ

Клетки гибридомы клона 20E5 и 12H3 отбирали из культуры клеток. Клетки отмывали ФСБ, отбирали аликвоты во флаконы, содержащие 5х10⁶ клеток, и хранили в виде гранул при -80°C. Гранулы с клетками применяли для выделения РНК при помощи набора RNeasy Mini Isolation (QIAGEN). Определяли концентрацию РНК (длина волны 260 нм), и РНК хранили при -80°C. Суммарный выход выделенной РНК: 27,3 мкг и 58,4 мкг для клона 20E5 и клона 12H3 соответственно (отношение на A260/A280 для обоих клонов 1,9). Из 1 мкг РНК при помощи обратной транскриптазы синтезировали кДНК, с применением набора для синтеза кДНК RevertAid™ H Minus First Strand (Fermentas) и хранили ее при -20°C. На основании изотипа (каппа/IgG! мыши) и данных, полученных при расщеплении по Эдманду моноклонального антитела к CD 134 человека клона 20E5, для амплификации V-областей моноклонального антитела к CD134 человека клона 20E5 были разработаны следующие праймеры:

№	Последовательность**	SEQ ID	Направление	Ген
праймера*		№
201	GACAGTTGGTGCAGCATCAG	39	антисмысловое	mkappa
266	CACTGGATGGTGGGAAGATG	40	антисмысловое	mkappa
203	GGCCAGTGGATAGACAGATG	41	антисмысловое	mlgG1
204	TGGACAGGGATCCAGAGTTC	42	антисмысловое	mlgG1
259	GCGAAGTACAAYTNCARCARWSNGG	43	кодирующее	20E5HC
260	GCGTACAATTACARCARWSNGGNCC	44	кодирующее	20E5HC
265	GCGATATACARATGACNCARAC	45	кодирующее	20E5LC

* номер в соответствии с внутренней системой кодирования Bioceros;

** вырожденные праймеры: N = A, C, G или T, Y = C или T, R = A или G, W = A или T, a S = G или C.

На основании изотипа (каппа/IgG! мыши) моноклонального антитела к CD134 человека клона 12H3 и кодирующих праймеров, отжигаемых с кДНК, кодирующей сигнальные пептиды мыши (частично на основании Antibody Engineering Volume 1 Kontermann, Roland E.; Dubel, Stefan (Eds.), Springer Lab Manuals, 2nd ed., 2010), для амплификации V-областей моноклонального антитела к CD134 человека клона 12H3 были разработаны следующие праймеры:

№ праймера*	Последовательность**	SEQ ID №	Направление	Ген
416	CAGTGGATAGACAGATGGGGG	46	антисмысловое	mlgG1
394	ACTGGATGGTGGGAAGATGG	47	антисмысловое	mkappa
405	ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT	48	кодирующее	сигнальный
410	ATGGRATGGAGCKGGGTCTTTMTCTT	49	кодирующее	пептид сигнальный

пептид

389	ATGGGCWTCAAAGATGGAGTCACA	50	кодирующее	сигнальный
				пептид

* номер в соответствии с внутренней системой кодирования Bioceros;

** вырожденные праймеры: N = A, C, G или T, Y = C или T, R = A или G, W = A или T, S =G или C, M = C или A, а K = G или T.

Праймеры 201 и 266 являются антисмысловыми и разработаны для отжига в пределах константной области гена kappa мыши в положении 214-232 и 236-255 соответственно (на основании номера доступа

- 26 031006

V00807 [версия V00807.1]).

Праймеры 203 и 204 являются антисмысловыми и разработаны для отжига в пределах константной области IgG1 мыши в положении 115-134 и 221-240 соответственно (на основании номера доступа J00453 [версия J00453.1]).

Праймеры 259 и 260 являются кодирующими вырожденными праймерами (вырождение соответственно 512 и 256) и отжигаются на N-конце (аминокислоты 1-8 и 2-9 соответственно) тяжелой цепи антитела мыши к CD134 человека клона 20E5 на основании данных расщепления по Эдману.

Праймер 265 является кодирующим вырожденным праймером (вырождение 16) и отжигается на Nконце (аминокислоты 1-7) легкой цепи антитела мыши к CD134 человека клона 20E5 на основании данных расщепления по Эдману.

Праймер 416 является антисмысловым и разработан для отжига в пределах константной области IgG1 в положениях 111-131 (на основании номера доступа J00453 [версия J00453.1]).

Праймер 394 является антисмысловым праймером и разработан для отжига в пределах константной области гена kappa мыши в положении 115-134 и 221-240235-254 (на основании номера доступа V00807 [версия V00807.1]).

Праймеры 389, 405 и 410 являются вырожденными праймерами (вырождение соответственно 2, 8 и 8) и отжигаются с последовательностями сигнальных пептидов антител мыши. Праймер 389 был разработан для легкой цепи, праймеры 405 и 410 - для тяжелой цепи.

Праймеры 201, 266, 203, 204, 259, 260 и 265 применяли в разных сочетаниях для амплификации вариабельных областей антитела мыши к CD134 человека клона 20E5, а праймеры 416, 394, 405, 410 и 389 применяли в разных сочетаниях для амплификации вариабельных областей антитела мыши к CD134 человека клона 12H3. Проводили разные варианты ПЦР с применением сгенерированных кДНК в качестве матрицы.

Для амплификации вариабельных областей тяжелых и легких цепей антител мыши к CD 134 как клона 20E5, так и клона 12H3 применяли ДНК-полимеразу Accuprime™ Pfx (Invitrogen). Продукты ПЦР анализировали на 1% агарозном геле. Продукты ПЦР очищали от геля и клонировали в вектор ПЦР с тупыми концами II-TOPO®для анализа последовательности. Для плазмид, содержащих ПЦР-вставки, клонированные вставки анализировали посредством секвенирования ДНК (проводила компания ServicXS B.V., Лейден, Нидерланды, или компания Macrogen, Амстердам, Нидерланды) с применением Т7 для получения консенсусной последовательности для V-областей антител мыши к CD134 клона 20E5 и клона 12H3. Для антитела мыши к CD134 клона 20E5 было получено одиннадцать реакций информативных последовательностей тяжелой цепи и 3 реакции информативных последовательностей легкой цепи. Для антитела мыши к CD134 клона 12H3 было получено пять реакций информативных последовательностей тяжелой цепи и 3 реакции информативных последовательностей легкой цепи. На основании указанной информации были определены консенсусные последовательности V-областей обоих антител (см. SEQ ID NO:4, 5, 12 и 13).

Перечень или обсуждение очевидно ранее опубликованного документа в данном описании не обязательно должно рассматриваться как признание того, что данный документ является частью уровня техники или общеизвестных фактов.

Пример 5. Получение химерных моноклональных антител к CD134 человека клонов 20E5 и 12H3 с IgG4/каппа человека и IgG1/каппа человека (т.е. с заменой константных доменов мыши на константные домены IgG/каппа человека)

На основании определенных V-областей в антителах мыши (см. пример 4 (b) выше) к CD134 клонов 20E5 и 12H3, был создан дизайн для генерирования химерных версий антител человека. С этой целью в компании GENEART (Регенсбург, Германия) были заказаны последовательности кДНК, оптимизированные для клеток CHO (см. SEQ ID NO:20 (кодирующую химерную тяжелую цепь IgG4 человека клона 20E5), SEQ ID NO:21 (кодирующую химерную легкую цепь к клона 20E5), SEQ ID NO:22 (кодирующую химерную тяжелую цепь IgG1 человека клона 20E5), SEQ ID NO:23 (кодирующую химерную тяжелую цепь IgG4 человека клона 12H3) и SEQ ID NO:24 (кодирующую химерную легкую цепь к клона 12H3)), которые кодировали сигнальный пептид мыши, идущий либо после вариабельной легкой цепи, связанной с константной областью каппа человека, либо после вариабельной тяжелой цепи, связанной с константной областью IgG человека. Такой дизайн был выполнен для обоих антител; для клона 20E5 вариабельная тяжелая цепь была связана с константной областью IgG4 человека или IgG1 человека; для клона 12H3 вариабельная тяжелая цепь была связана с константной областью IgG4 человека. При помощи подходящих рестриктаз сгенерированные кДНК субклонировали в плазмиды экспрессии, полученные из pcDNA3.1. Химерные антитела экспрессировали при помощи системы экспрессии FreeStyle™ MAX CHO (клетки CHO-S) (Invitrogen). Экспрессированые антитела очищали посредством аффинной хроматографии на колонках с белком A (GE Healthcare). Последовательности химерных антител показаны под номерами SEQ ID NO:25, 26, 27, 28 и 29.

Пример 6. Характеристики связывания химерных моноклональных антител к CD134 человека клона 20E5, содержащих IgG4/каппа человека и IgG1/каппа человека

- 27 031006 (a) . Характеристики связывания химерных моноклональных антител к CD134 человека клона 20E5, содержащих IqG4/K, человека на РНА-стимулированных CD4+ Т-лимфоцитах, экспрессирующих CD134 человека

Генерировали РНА-стимулированные (в концентрации 10 мкг/мл в течение 1 дня; см. выше) Тлимфоциты, экспрессирующие CD134 человека. Клетки отбирали и помещали при плотности 1-2х10⁶ клеток/мл в охлажденный льдом ФСБ/БСА/NaN^ Клетки инкубировали с 0, 0,007, 0,02, 0,07, 0,2, 0,6, 1,9, 5,6, 16,7, 50,0 мкг/мл химерного антитела к CD134 человека клона 20E5, содержащего IgG4K человека, в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaN клетки дополнительно инкубировали с разведенными 1:50 FITC-конъюгированными антителами мыши к IgG4 человека (Sigma) в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaN клетки инкубировали с разведенными 1:10 PE-конъюгированными антителами мыши к CD4 человека (BD Biosciences) в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaN клетки фиксировали в 2% формальдегиде в ФСБ/БСА/NaN в течение 30 мин при 4°C. Связывание антител измеряли при помощи проточной цитометрии (FACSCalibur; BD Biosciences).

Химерное антитело с IgG4K человека к CD134 человека клона 20E5 насыщало молекулы CD134 человека на поверхности РНА-стимулированных CD4⁺ Т-лимфоцитов приблизительно при 5,0-10,0 мкг/мл (данные не показаны). Полумаксимальное связывание наблюдалось при концентрации химерного антитела с IgG4K человека к CD134 человека клона 20E5 ~ 1.0 мкг/мл (данные не показаны).

(b) . Связывание химерных моноклональных антител к CD134 человека клона 20E5, содержащих IqG4/K человека, на РНА-стимулированных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах, экспрессирующих CD134 человека

Генерировали РНА-стимулированные (в концентрации 10 мкг/мл в течение 1 дня; см. выше) Тлимфоциты, экспрессирующие CD134 человека. Клетки отбирали и помещали при плотности 1-2х10⁶ клеток/мл в охлажденный льдом ФСБ/БСА/NaN^ Клетки инкубировали с 20,0 мкг/мл химерного антитела к CD134 человека клона 20E5, содержащего IgG4K человека, или без указанного антитела в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaN клетки дополнительно инкубировали в течение 30 мин при 4°C с разведенными 1:200 PE-конъюгированными антителами козы к IgG человека (FcY-специфичными) (Jackson ImmunoResearch). После активного промывания в ФСБ/БСА/NaN клетки инкубировали с разведенными 1:10 FITC-конъюгированными антителами мыши к CD4 человека (BD Biosciences) или разведенными 1:10 FITC-конъюгированными антителами мыши к CD8 человека (BD Biosciences) для выявления субпопуляций Т-лимфоцитов. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaN клетки фиксировали в 2% формальдегиде в ФСБ/БСА/NaN в течение 30 мин при 4°C. Связывание антител измеряли при помощи проточной цитометрии (FACSCalibur; BD Biosciences).

Химерное антитело с IgG4K человека к CD134 человека клона 20E5 демонстрировало положительное окрашивание в субпопуляции РНА-стимулированных CD4⁺ Т-лимфоцитов человека и слабо выраженное положительное окрашивание в субпопуляции РНА-стимулированных CD8⁺ Т-лимфоцитов человека (данные не показаны).

(c) . Связывание химерных моноклинальных антител к CD 134 человека клона 20E5, содержащих IqG4/K человека, на стимулированных стимулирующими гранулами с антителом против CD3/CD28 человека CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах, экспрессирующих CD134 человека

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC), полученные от здоровых доноров (информированное согласие), выделяли посредством центрифугирования в градиенте плотности на Lymphoprep (1.077 г/мл; Nycomed). Затем клетки при плотности 1х10⁶ PBMC/мл в питательной среде RPMI-1640(Gibco), содержащей 10% фетальной сыворотки телят (Bodinco) и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco), стимулировали стимулирующими гранулами с антителами мыши к CD3/CD28 (гранулы антиCD3/CD28; Invitrogen) в количестве 1 гранула/4 клетки в отсутствии или присутствии 25 Е/мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека (PeproTech) при 37°C/5% CO2 в течение 1 дня. После культивирования PBMC отбирали и помещали при плотности 1-2х10⁶ клеток/мл в охлажденный льдом PBS/BSA/NaN3. Клетки инкубировали с добавлением или без добавления 20,0 мкг/мл химерного антитела с IgG4K человека к CD134 человека клона 20E5 в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaN клетки дополнительно инкубировали с разведенными 1:200 РЕ-конъюгированными антителами козы к IgG человека (FcY-специфичными) (Jackson ImmunoResearch). После активного промывания в ФСБ/БСА/NaN клетки в течение 30 мин при 4°C инкубировали с разведенными 1:10 FITCконъюгированными антителами мыши к CD4 человека (BD Biosciences) или разведенными 1:10 FITCконъюгированными антителами мыши к CD8 человека (BD Biosciences) для выявления субпопуляций Т-лимфоцитов. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaN клетки фиксировали в 2% формальдегиде в ФСБ/БСА/NaN в течение 30 мин при 4°C. Связывание антител измеряли при помощи проточной цитометрии (FACSCalibur; BD Biosciences).

Как показано на фиг. 14, химерное антитело с IgG4K человека к CD134 человека клона 20E5 демонстрировало положительное окрашивание в субпопуляции стимулированных анти-CD3/CD28 гранулами CD4⁺ Т-лимфоцитов человека и слабо выраженное положительное окрашивание в субпопуляции стиму

- 28 031006 лированных анти-CD3/CD28 гранулами CD8⁺ Т-лимфоцитов человека. При добавлении рекомбинантного IL-2 человека никакого явного эффекта не наблюдалось.

Пример 7. Описание биологических свойств химерных антител к CD134 человека клона 20E5, содержащих IgG4/каппа человека (a) . Пролиферация РНА-стимулированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD134 человека, после обработки химерными антителами с IqG4K человека к CD134 человека клона 20E5

Генерировали РНА-стимулированные (10 мкг/мл в течение 1 дня; см. выше) Т-лимфоциты, экспрессирующие CD134 человека. Клетки отбирали и суспендировали с плотностью 2х10⁶ клеток/мл в питательной среде RPMI (Gibco), содержащей 10% фетальной сыворотки телят (Bodinco) и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco). Клетки рассевали при плотности 0,1х10⁶ клеток/100 мкл/лунку в планшеты на 96 лунок с плоским дном (Corning) и воздействовали на них 25,0 мкг/мл химерного антитела с IgG4K человека к CD134 человека клона 20E5 или 25,0 мкг/кг контрольного антитела с IgG4K человека к CD40 человека (PG102; Pangenetics), или 1,0 мкг/мл рекомбинантного OX40L человека с полигистидиновой меткой (в присутствии антитела мыши к полилизину в мольном отношении 1:5; R&D Systems) при 37°C/5% CO2 в течение 6 дней. Через 6 дней пролиферацию клеток измеряли при помощи колориметрического ELISA™ для оценки пролиферации клеток (с включением BrdU) (Roche) и ридера для ELISA (BioRad) на длине волны 450 нм.

Как показано на фиг. 15 (среднее ± CO), химерное антитело с IgG4K человека к CD 134 человека клона 20E5 (hu20E5) и OX40L человека вызывали пролиферацию РНА-стимулированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD 134 человека. Отсутствие обработки (только среда) или обработка контрольным антителом с IgG4K к CD40 человека (huIgG4) не демонстрировали никакого действия на РНА-стимулированные Т-лимфоциты, экспрессирующие CD134 человека.

(b) . Пролиферация РНА-стимулированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD134 человека, после обработки химерными моноклинальными антителами с IqG4K человека к CD134 человека клона 20E5 в сочетании с рекомбинантным OX40L человека

Генерировали РНА-стимулированные (10 мкг/мл в течение 1 дня; см. выше) Т-лимфоциты, экспрессирующие CD134 человека. Клетки отбирали и суспендировали с плотностью 2х10⁶ клеток/мл в питательной среде RPMI (Gibco), содержащей 10% фетальной сыворотки телят (Bodinco) и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco). Клетки рассевали при плотности 0,1х10⁶ клеток/100 мкл/лунку (т.е. 1х10⁶ клеток/мл) в планшеты на 96 лунок с плоским дном (Corning) и воздействовали на них 0, 0,025, 0,25, 2,5, или 25,0 мкг/мл химерного антитела с IgG4K человека к CD134 человека клона 20E5 и/или в сочетании с 0, 0,01, 0,1 или 1,0 мкг/мл рекомбинантного OX40L человека с полигистидиновой меткой (в присутствии антитела мыши к полилизину в мольном отношении 1:5; R&D Systems) при 37°C/5% CO₂ в течение 6 дней. Через 6 дней пролиферацию клеток измеряли при помощи колориметрического ELISA™ для оценки пролиферации клеток (с включением BrdU) (Roche) и ридера для ELISA (BioRad) на длине волны 450 нм.

Как показано на фиг. 16 (среднее ± СО), химерное антитело с IgG4K человека к CD 134 человека клона 20E5 (hu20E5) и OX40L человека вызывали дозозависимую пролиферацию РНА-стимулированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD134 человека. Химерное антитело с IgG4K человека к CD134 человека клона 20E5 с зависимостью от донора вызывало пролиферацию при 2,5 и 25 мкг/мл (донор 1) или при 0,25, 2,5 и 25 мкг/мл (донор 2). Кроме того, OX40L человека с зависимостью от донора вызывал пролиферацию при 0,1 и 1,0 мкг/мл (донор 1) или при 0,01, 0,1 и 1,0 мкг/мл (донор 2).

Как показано на фиг. 17 (среднее ± CO), сочетание химерного антитела с IgG4K человека к CD134 человека клона 20E5 (hu20E5) при 2,5 и 25 мкг/мл (или при более низкой концентрации; данные не показаны) с OX40L человека при 0,1 и 1,0 мкг/мл (или при более низкой концентрации; данные не показаны) не оказывало никаких взаимных воздействий (т.е. синергичного или аддитивного, или даже ингибирующего действия) на пролиферацию РНА-стимулированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD 134 человека.

(c) . Пролиферация стимулированных стимулирующими гранулами с антителом к CD3/CD28 человека Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD134 человека, после обработки химерными моноклинальными антителами с lqG4K человека к CD134 человека клона 20E5

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC), полученные от здоровых доноров (информированное согласие), выделяли посредством центрифугирования в градиенте плотности на Lymphoprep (1.077 г/мл; Nycomed). Затем PBMC рассевали с плотностью 0,1х10⁶ клеток/100 мкл/лунку (т.е. 1х10⁶ клеток/мл) в планшеты на 96 лунок с плоским дном в питательной среде RPMI-1640 (Gibco), содержащей 10% фетальной сыворотки телят (Bodinco) и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco), и стимулировали стимулирующими гранулами с антителами мыши к CD3/CD28 (гранулы анти-CD3/CD28; Invitrogen) в количестве 1 гранула/2 клетки в отсутствие или присутствии 25 Е/мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека (PeproTech) при 37°C/5% CO₂. Спустя 1 день или 2 дня указанные стимулированные стимулирующими CD3/CD28 гранулами Т-лимфоциты, экспрессирующие CD134 человека, подвер

- 29 031006 гали воздействию 25,0 мкг/мл химерного антитела с IgG4K человека к CD134 человека клона 20E5 или 1,0 мкг/мл рекомбинантного OX40L человека с полигистидиновой меткой (в присутствии антитела мыши к полилизину в мольном отношении 1:5; R&D Systems) при 37°C/5% CO₂ в течение 6 дней или 5 дней соответственно. Клетки, которые изначально простимулировали сочетанием анти-CD3/CD28 гранул и рекомбинантным интерлейкином-2 человека, повторно стимулировали 25 К/мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека за 1 день до оценки пролиферации. Через 6 дней или 5 дней воздействия химерного антитела с IgG4K человека к CD134 человека клона 20E5 или рекомбинантного OX40L человека пролиферацию клеток измеряли при помощи колориметрического ELISA™ для оценки пролиферации клеток (с включением BrdU) (Roche) и ридера для ELISA (BioRad) на длине волны 450 нм.

Как показано на фиг. 18 (среднее ± CO, n=3 от одного донора), хотя стимулирующие гранулы антиCD3/CD28 сами по себе вызывали значительную пролиферацию Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD134 человека (т.е. среда), химерное антитело с IgG4K человека к CD134 человека клона 20E5 (hu20E5) и OX40L человека вызывали дополнительную пролифреацию стимулированных анти-CD3/CD28 гранулами Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD 134 человека. Добавление только интерлейкина-2, повидимому, усиливало базальную пролиферацию стимулированных анти-CD3/CD28 гранулами Тлимфоцитов, экспрессирующих CD134 человека.

(d). Иммуностимулирующие реакции у обезьян макака резус после лечения антителами человека (химерными) к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5

Низших приматов - макаку резус - можно иммунизировать белком вируса иммунодефицита обезьян, gp130, как описано у Weinberg et al. (J Immunother 2006; 29: 575-585).

Ожидалось, что дренирующие лимфатические узлы от иммунизированных обезьян, обработанные антителами человека (например, химерными, гуманизированными или деиммунизированными антителами; например, подкласса IgG1 или IgG4) к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5, должны демонстрировать увеличение размеров по сравнению с лимфатическими узлами контрольных иммунизированных обезьян. Ожидается, что обезьяны, подвергнутые воздействию антител человека (например, химерных, гуманизированных или деиммунизированных антител) к CD 134 человека клонов 12H3 и 20E5, должны демонстрировать повышение титра др130-специфических антител и повышенные долгосрочные реакции Т-лимфоцитов по сравнению с контролем. Явных признаков токсичности в ответ на антитела (например, химерные, гуманизированные или деиммунизированные антитела) к CD 134 человека клонов 12H3 и 20E5 у обезьян наблюдаться не должно.

Пример 8. Описание свойств доменов и эпитопов CD134 человека, распознаваемых моноклональными антителами к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 (a). Связывание моноклинальных антител мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 с невосстановленным и восстановленным рекомбинантным белком CD 134 человека: Fcy человека (вестернблоттинг)

1300 или 650 нг/дорожку (для окрашивания кумасси бриллиантовым голубым) или 250 нг/дорожку (для вестерн-блоттинга) рекомбинантного белка CD134 человека: Fcy человека (IgG1) (R&D Systems) подвергали электрофорезу с применением 4-12% гелей Tris-Bis и подвижного буфера MOPS (Invitrogen) при разных восстанавливающих и невосстанавливающих условиях (см. фиг. 19) в заводской системе для денатурирующего электрофореза LDS-PAGE NuPage® Novex®. Затем рекомбинантный белок CD134 человека: Fcy человека либо окрашивали кумасси бриллиантовым голубым (BioRad), либо подвергали электроблоттингу с переносом на мембрану из поливинлидена фторида (PDVF) (Millipore). После блокирования ФСБ/0,5% Tween 20/1% БСА фракции V (Roche) в течение 20 мин при комнатной температуре (КТ) мембраны из PDVF инкубировали с 100 нг/мл моноклональных антител мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 в течение 1 ч при КТ. Параллельно в качестве отрицательного контроля применяли 100 нг/мл контрольных антител мыши изотипа IgG1K (BD Biosciences). После активного промывания в ФСБ/0,05% Tween 20 связывание моноклональных антител мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 определяли при помощи инкубации с разведенными 1:5000 антимышиными Fcy-специфичными антителами козы, конъюгированными с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch) в течение 1 ч при КТ, а после этого - с готовым к употреблению раствором субстрата ТМВ (тетраметилбензидина) (Sigma) для колориметрической детекции.

Как показано на фиг. 19-B, рекомбинантный белок CD134 человека: Fcy человека при невосстанавливающих условиях (и с LDS-денатурацией без тепловой денатурации или с ней, условия a и b соответственно) демонстрировал молекулярную массу =130-140 кДа. Отсутствие восстановления без нагревания (условия a) приводили к получению двух полос в близости друг от друга, что указывает на то, что фракция рекомбинантного белка CD134 человека: Fcy человека денатурировала/раскручивалась не полностью. Отсутствие восстановления с нагреванием (условия b) приводили к получению одной полосы, что указывает на то, что рекомбинантный белок CD134 человека: Fcy человека денатурировал/раскручивался полностью. Рекомбинантный белок CD134 человека: Fcy человека при восстанавливающих условиях (и с LDS-денатурацией без тепловой денатурации или с ней, условия c и d соответственно) давал полосы на молекулярной массе =110 кДа (условия c) и =60-65 кДа (условия d). Первый результат указывает на не

- 30 031006 полное восстановление рекомбинантного белка CD134 человека: Fcy человека, а второй результат указывает на полное восстановление/разрыв дисульфидных мостиков, соединяющих два полученных из IgG1 фрагментов в каждой молекуле рекомбинантного белка CD134 человека: Fcy человека.

Как показано на фиг. 19-C, антитела мыши к CD134 человека и клона 12H3, и клона 20E5 распознавали рекомбинантный белок CD134 человека: Fcy человека при невосстанавливающих условиях (и с LDS-денатурацией без тепловой денатурации или с ней, условия a и b соответственно) преимущественно с молекулярной массой =130 кДа. Напротив, антитела мыши к CD134 человека клона 12H3 демонстрировали лишь слабое связывание с рекомбинантным белком CD134 человека: Fcy человека при восстанавливающих условиях (и с LDS-денатурацией без тепловой денатурации или с ней, условия c и d соответственно), тогда как антитела мыши к CD134 человека клона 20E5 демонстрировали сильное связывание с рекомбинантным белком CD 134 человека: Fcy человека при восстанавливающих условиях (и с LDSденатурацией без тепловой денатурации или с ней, условия c и d соответственно).

Указанные результаты демонстрируют, что антитела мыши к CD134 человека и клона 12H3, и клона 20E5 специфически распознавали CD134 человека. Кроме того, указанные результаты демонстрируют, что антитела мыши к CD134 человека клона 12H3 и клона 20E5, по-видимому, распознавали несходные эпитопы CD134 человека, что подтверждалось соответствующим слабым связыванием (клон 12H3) и сильным связыванием (клон 20E5) с рекомбинантным белком CD134 человека: Fcy человека при восстанавливающих условиях (и с LDS-денатурацией без тепловой денатурации или с ней). Данные результаты указывают на то, что антитела мыши к CD134 человека и клона 12H3 распознавали эпитоп CD134 человека, который не чувствителен к денатурации (LDS и воздействие тепла), но чувствителен к восстановлению (т.е. разрыв дисульфидного мостика(ов) - вероятнее всего, связанный с богатыми цистеином ^ИЩ-доменами - дитиотреитолом). Данные результаты указывают на то, что антитела мыши к CD 134 человека и клона 20E5 распознавали эпитоп CD 134 человека, который не чувствителен к денатурации (LDS и воздействие тепла) и не чувствителен к восстановлению (т.е. разрыв дисульфидного мостика(ов) вероятнее всего, связанный с богатыми цистеином ЮК^-доменами - дитиотреитолом).

(b). Связывание моноклинальных антител мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 с полноразмерной конструкцией CD 134 человека и разными процессированными конструкциями CD134 человека, экспрессируемыми линией клеток 293-F (картирование доменов)

Чтобы проанализировать тонкую специфичность моноклональных антител мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 локализацию эпитопа(ов), распознаваемого моноклинальными антителами мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5, определяли путем картирования доменов. Способность моноклональных антител мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 к связыванию с процессированными конструкциями CD134 человека, экспрессируемых на поверхности (полученных из HEK) клеток 297-F, определяли при помощи анализа FACS.

На основании литературных данных (Swiss-Prot: P43489.1; Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677683; Bodmer et al. Trends Biochem Sci 2002; 27: 19-26; Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330; патент США 2011/0028688 A1) были идентифицированы богатые цистеином домены (CRD) и каркасоподобная структура во внеклеточной области CD134 человека. CRD кодируются CRD1, CRD2, (процессированный) CRD3, (процессированный) CRD4 (см. фиг. 20). CRD содержат топологически различные типы модулей, именуемые A-модулем и B-модулем (также см. фиг. 20). A-модули представляют собой структуры C-формы, а B-модули - структуры S-формы. Типичная CRD, как правило, состоит из A1-B2-модулей или A2-B1-модулей (или, реже, другой пары модулей, такой как A1-B1) с 6 консервативными остатками цистеина, где цифры обозначают номер дисульфидных мостиков в каждом модуле (также см. фиг. 20). Как показано на фиг. 20, генерировали и экспрессировали 5 разных конструкций CD134 человека: (1) полноразмерную конструкцию CD134 человека, которая начинается с N-конца CRD1 (т.е. A1-B2-модули CRD1 охватывают аминокислоты 29-65), и, следовательно, обозначается CRD1, и содержит аминокислоты 1277 (см. SEQ ID NO:1), (2) конструкцию CRD2, которая начинается с N-конца CRD2 (т.е. A1-B2модуль CRD2 охватывает аминокислоты 66-107), и содержит аминокислоты 66-277, связанные с аминокислотами сигнального пептида 1-28 (см. SEQ ID N0:30), (3) конструкцию CRD3, которая начинается с N-конца CRD3 (т.е. A1-B 1-модуль CRD3 охватывает аминокислоты 108-146 (согласно Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330) или A1-модуль CRD3 охватывает аминокислоты 108-126 (согласно Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683)) и содержит аминокислоты 108-277, связанные с аминокислотами сигнального пептида 1-28 (см. SEQ ID N0:31), (4) конструкцию CRD4, которая состоит из N-концевого В1-модуля CRD4 или CRD3-субдомена/A1-модуля процессированной CRD4 (т.е. A1-B1-модуль CRD4 охватывает аминокислоты 127-167 (Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683), или сочетание (не показано на фиг. 20) B1-модуля CRD3 с процессированным A1-модулем CRD4 охватывает аминокислоты 127-146 с аминокислотами 147-167 соответственно (Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330)), и содержащую аминокислоты 127-277, связанные с аминокислотами сигнального пептида 1-28 (см. SEQ ID N0:32), и (5) конструкцию процессированного (tc) CRD4, которая состоит из N-концевого процессированного B1-модуля CRD4 или субдомена CRD4 (т.е. A1-модуль процессированной CRD4 охватывает аминокислоты 147-167 (Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330), или B1-модуль субдомена CRD4

- 31 031006 (не показано на фиг. 20; Latza et al. Eur J. Immunol 1994; 24: 677-683) охватывает аминокислоты 147-167), и содержащую аминокислоты 147-277, связанные с аминокислотами сигнального пептида 1-28 (см. SEQ ID NO:33). Указанные 5 конструкций CD134 человека генерировали посредством ПЦР со сборкой с применением ДНК-полимеразы Accuprime™ Pfx (Invitrogen) и праймеров, перечисленных в таблице ниже.

№	Последовательность	SEQ	Направление	Ген

праймера*		ID №
362	CTCGGATCCGCCACCATGTGCGTG	51	кодирующее	лидер CD134
363	AGAAT Т С Т ТАТ ТAGAT CTTGGCCA	55	антисмысловое	конец CD134
364	ACTGTCACTGGACCCTGCGGTCCC	52	кодирующее	CRD2
365	GGGACCGCAGGGTCCAGTGACAGT	53	антисмысловое	CRD2
366	ACTGTCACTGGAAGGTGCAGGGCT	54	кодирующее	CRD3
367	AGCCCTGCACCTTCCAGTGACAGT	56	антисмысловое	CRD3
368	ACTGTCACTGGACCCTGCCCCCCT	57	кодирующее	CRD4
369	AGGGGGGCAGGGTCCAGTGACAGT	58	антисмысловое	CRD4
370	ACTGTCACTGGATGCACCCTGGCT	59	кодирующее	процессированная CRD4
371	AGCCAGGGTGCATCCAGTGACAGT	60	антисмысловое	процессированная CRD4

* номер праймера в соответствии с внутренней системой кодирования Bioceros

Если кратко, кДНК, кодирующую аминокислоты 1-28 сигнального пептида, и кДНК, кодирующую аминокислоты 66-277 CD134 человека, амплифицировали с применением пары праймеров 362/365 и 364/363 соответственно, в ПЦР-реакции с полноразмерным CD 134 человека в качестве матрицы. Затем генерировали конструкцию CRD2 с применением указанных двух продуктов ПЦР в ПЦР со сборкой и с применением пары праймеров 362/363. кДНК, кодирующую конструкцию CRD2, субклонировали в плазмиду экспрессии, полученную из pcDNA3.1, с применением соответствующих сайтов рестрикции. Аналогично, генерировали конструкцию CRD3 (аминокислоты 1-28 сигнального пептида, связанные с аминокислотами 108-277 CD134 человека), конструкцию CRD4 (аминокислоты 1-28 сигнального пептида, связанные с аминокислотами 127-277), и конструкцию процессированной CRD4 (аминокислоты 1-28 сигнального пептида, связанные с аминокислотами 147-277), и субклонировали их в плазмиды экспрессии, полученные из pcDNA3.1, с применением соответствующих праймеров, перечисленных в таблице выше. Кроме того, в плазмиду экспрессии, полученную из pcDNA3.1, также повторно клонировали полноразмерный CD134 человека (SEQ ID NO:1).

Клетки 293-F Freestyle™ (Invitrogen) временно трансфецировали 5 сгенерированными вариантами CD134 человека с применением системы экспрессии Freestyle™ 293 (Invitrogen). Через 48-72 ч экспрессию CD134 человека на поверхности трансфецированных клеток оценивали посредством анализа FACS. Для данной цели трансфецированные клетки отбирали и помещали при плотности 1-2х10⁶ клеток/мл в охлажденный льдом PBS/BSA/NaN₃. Клетки инкубировали с 20,0 мкг/мл моноклональных антител мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 в течение 30 мин при 4°C. Параллельно, в качестве отрицательного контроля применяли 20,0 мкг/мл антитела мыши изотипа IqG4K (BD Biosciences). После активного промывания в ФСБ/БСА/NaNs, клетки дополнительно инкубировали с разведенными 1:200 PE-конъюгированными антителами козы к IgG мыши (Fcy-специфичными) (Jackson ImmunoResearch) в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaNs клетки фиксировали в 2% формальдегиде в ФСБ/БСА/NaNs в течение 30 мин при 4°C. Связывание антител измеряли при помощи проточной цитометрии (FACSCalibur; BD Biosciences).

Как показано на фиг. 21, антитела мыши к CD134 человека и клона 12H3, и клона 20E5 распознавали полноразмерный CD134 человека (обозначен как конструкция CRD1) на трансфецированных клетках 293-F, однако антитела мыши к CD134 человека и клона 12H3, и клона 20E5 не демонстрировали связывания на поверхности клеток 293-F, трансфецированных контрольным антителом. Более того, антитела мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 распознавали процессированные варианты CD134 человека, в которых не было CRD1 и CRD1-CRD2 (обозначены как конструкция CRD2 и конструкция CRD3 соответственно) на трансфецированных клетках 293-F. Напротив, связывание антител мыши к CD134 человека клона 12H3 с процессированным вариантом CD134 человека, в котором не было CRD1CRD2-процессированного A1-модуля CRD3 (обозначен как конструкция CRD4), было очень слабым, а связывание антител мыши к CD134 человека клона 12H3 с процессированным вариантом CD134 человека, в котором не было CRD1-CRD2-процессированного А1-модуля CRDS/A1-модуля субдомена CRD4 (согласно определению Latza et al. Eur J. Immunol 1994; 24: 677-683), или, в качестве альтернативы, A1B1-модуля CRD1-CRD2-CRD3 (согласно определению Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330; обозначен как конструкция CRD4), вообще отсутствовало, тогда как антитела мыши к CD 134 человека клона 20E5 демонстрировали сильное связывание с процессированным вариантом CD134 человека, в

- 32 031006 котором не было CRD1-CRD2-процессированного A1-модуля CRD3 (обозначен как конструкция CRD4) и с процессированным вариантом CD134 человека, в котором не было CRD1-CRD2процессированного A1-модуля CRD3- A1-модуля субдомена CRD4 (согласно определению Latza et al. Eur J. Immunol 1994; 24: 677-683), или, в качестве альтернативы, A1-B1-модуля CRD1-CRD2-CRD3 (согласно определению Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330; обозначен как конструкция CRD4).

Указанные результаты демонстрируют, что антитела мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 специфически распознавали CD134 человека (сравнение трансфекции полноразмерного CD134 человека и трансфекции контроля). Кроме того, указанные результаты демонстрируют, что антитела мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 по-видимому распознают несходные эпитопы CD134 человека, что подтверждалось соответствующим слабым связыванием (при применении клона 12H3) и сильным связыванием (при применении клона 20E5) с процессированным вариантом CD 134 человека, у которого не было CRD1-CRD2-процессированного A1-модуля CRD3 (обозначен как конструкция CRD4), и с процессированным вариантом CD134 человека, у которого не было CRD1-CRD2-процессированного A1модуля CRD3- A1-модуля субдомена CRD4 (согласно определению Latza et al. Eur J. Immunol 1994; 24: 677-683), или, в качестве альтернативы, A1-B1-модуля CRD1-CRD2-CRD3 (согласно определению Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330; обозначен как конструкция CRD4). Указанные результаты демонстрируют, что антитела мыши к CD134 человека клона 12H3, по-видимому, не распознавали эпитоп CD134 человека в CRD1 и CRD2, а антитела мыши к CD134 человека клона 20E5, по-видимому, не распознавали эпитоп CD134 человека в CRD1, CRD2 и в A1-модуле процессированной CRD3 - A1-модуле субдомена CRD4 (согласно определению Latza et al. Eur J. Immunol 1994; 24: 677-683) или, в качестве альтернативы, в A1-B1-модуле CRD1-CRD2-CRD3 (согласно определению Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330). Указанные результаты демонстрируют, что антитела мыши к CD 134 человека клона 12H3, по-видимому, распознавали линейный или нелинейный/конформационный эпитоп CD134 человека в A1-модуле процессированной CRD3 (согласно определению Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677683) с последовательностью аминокислот 108-126 (т.е. 19-мерный пептид RCRAGTQPLDSYKPGVDCA; см. SEQ ID NO:34) на внеклеточной части CD 134 человека, или с последовательностью аминокислот 108-126 (т.е. 19-мерный пептид RCRAGTQPLDSYKPGVDCA; см. SEQ ID NO:34), образующими критический участок для связывания с нелинейным/конформационным эпитопом в A1-модуле процессированной CRD3/A1-B1-модуле CRD4 (согласно определению Latza et al. Eur J. Immunol 1994; 24: 677-683), и, возможно, в каркасоподобной структуре с последовательностью аминокислот 108-214 (см. SEQ ID NO:35) на внеклеточной части CD134 человека. Указанные результаты демонстрируют, что антитела мыши к CD134 человека клона 20E5, по-видимому, распознавали линейный или нелинейный/конформационный эпитоп в A1-модуле процессированной CRD4 (согласно определению Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330), и, возможно, в каркасоподобной структуре с последовательностью аминокислот 147-214 (см. SEQ ID NO:36) на внеклеточной части CD134 человека.

При помощи кристаллографии Compaan et al. (Structure 2006; 14: 1321-1330) недавно показали важную роль CRD1, CRD2 (особенно петли А1 и идущих сразу за ней остатков) и CRD3 (главным образом, петли A1) на молекуле CD134 человека во взаимодействии лиганда ОХ40 (CD252)/CD134 (=OX40). Данное открытие хорошо согласуется с нашими результатами относительно того (1, см. выше), что антитела мыши к CD134 человека клона 20E5, по-видимому, не распознавали эпитоп CD134 человека в CRD1, CRD2 и A1-модуле процессированного CRD3 - A1-модуле субдомена CRD4 (согласно определению Latza et al. Eur J. Immunol 1994; 24: 677-683), или в качестве альтернативы, в A1-B1-модуле CRD1-CRD2CRD3 (согласно определению Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330; обозначен как конструкция CRD4) на внеклеточной части CD134 человека, и (2, см. выше) что антитела мыши к CD134 человека клона 20E5 одновременно связывались с OX40L на поверхности РНА-стимулированных Т-лимфоцитах человека, экспрессирующих CD134 человека. Это указывает на то, что антитела мыши к CD134 человека клона 20E5 распознавали эпитоп на CD134 человека, который не играл важной роли во взаимодействии CD134 человека с OX40L человека. Кроме того, наши результаты относительно того (1, см. выше), что антитела мыши к CD 134 человека клона 12H3, по-видимому, распознавали линейный или нелинейный/конформационный эпитоп CD134 человека в A1-модуле процессированной CRD3 (согласно определению Latza et al. Eur J. Immunol 1994; 24: 677-683) с последовательностью аминокислот 108-126 (т.е. 19мерный пептид RCRAGTQPLDSYKPGVDCA; см. SEQ ID № 34) на внеклеточной части CD134 человека, или с последовательностью аминокислот 108-126 (т.е. 19-мерный пептид RCRAGTQPLDSYKPGVDCA; см. SEQ ID NO:34), образующими критический участок для связывания с нелинейным/конформационным эпитопом в A1-модуле процессированной CRD3/A1-B1-модуле CRD4 (согласно определению Latza et al. Eur J. Immunol 1994; 24: 677-683), и, возможно, в каркасоподобной структуре с последовательностью аминокислот 108-214 (см. SEQ ID NO:35) на внеклеточной части CD134 человека, и что (2, см. выше) антитела мыши к CD134 человека клона 12H3 одновременно связывались с OX40L на поверхности РНА-стимулированных Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих CD134 человека, подтверждает идею о том, что эпитоп (описанный выше) на CD134 человека, который распознавался антителами мыши к CD134 человека клона 12H3, не играл важной роли во взаимодействии CD134 человека с OX40L человека.

- 33 031006 (c) . Картирование эпитопов (1) моноклинальных антител мыши к CD134 человека клона 12H3 посредством ELISA с применением пептида, полученного из CD134 человека

Чтобы более подробно проанализировать тонкую специфичность моноклональных антител мыши к CD134 человека клона 12H3 путем картирования эпитопов определяли локализацию эпитопа, распознаваемого антителами мыши к CD134 человека клона 12H3. Способность антител мыши к CD134 человека клона 12H3 связываться с пептидом, полученным из CD134 человека, который соответствует последовательности аминокислот A1-модуля процессированной CRD3- A1-модуля субдомена CRD4 (согласно определению Latza et al. Eur J. Immunol 1994; 24: 677-683), определяли посредством ELISA.

В планшеты на 96 лунок с плоским дном (Corning) наносили по 10 нг/лунку пептида, полученного из CD134 человека (синтезированного Pepscan Presto, Лелистад, Нидерланды), который соответствует последовательности аминокислот A1-модуля процессированной CRD3- A1-модуля субдомена CRD4 (см. SEQ ID NO:38), или 10 нг/лунку контрольного пептида, полученного из фибринонектина человека (синтезированного Pepscan Presto, Лелистад, Нидерланды), который соответствует последовательности аминокислот внеклеточного структурного домена III типа (см. SEQ ID NO :37) в ФСБ и оставляли на одну ночь при 4°C. После активного промывания в ФСБ/0,05% Tween 20 реакцию в планшетах блокировали в ФСБ/0,05% Tween 20/1% фракции V БСА (Roche) в течение 1 ч при КТ. Затем планшеты инкубировали с 0, 0,00005 - 50,0 (этапы 10-кратных разведений в блокирующем буфере) моноклональных антител мыши к CD134 человека клона 12H3 или контрольных антител мыши изотипа IgG1K (BD Biosciences) в течение 1 ч при КТ. После активного промывания в ФСБ/0,05% Tween 20 связывание антител определяли посредством инкубации с разведенными 1:5000 FcY-специфнчными антителами козы против мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch) в течение 1 ч при КТ, а после этого - с готовым к употреблению раствором субстрата ТМВ (Invitrogen) для колориметрической детекции. После добавления 1 М H₂SO₄ оптическую плотность измеряли на длине волны 450 нм (эталонная длина волны 655 нм) при помощи микропланшетного ридера (BioRad).

Как показано на фиг. 23-А (n=1), моноклональные антитела мыши к CD134 человека клона 12H3 дозозависимо и специфически связывались с пептидом, полученным из CD134 человека, а контрольные антитела мыши изотипа IgG1K не демонстрировали связывания с пептидом, полученным из CD134 человека. Ни моноклональные антитела мыши к CD134 человека клона 12H3, ни контрольные антитела мыши изотипа IgG1K не демонстрировали связывания с пептидом, полученным из фибронектина человека.

Указанные результаты демонстрируют, что антитела мыши к CD134 человека клона 12H3 специфически распознавали эпитоп на CD 134 человека (сравнение пептида, полученного из CD 134 человека, и контрольного пептида, полученного из CD134 человека). Кроме того, указанные результаты демонстрируют, что антитела мыши к CD134 человека клона 12H3, по-видимому, распознавали линейный или нелинейный/конформационный эпитоп в A1-модуле процессированной CRDS-A1-модуле субдомена CRD4 (согласно определению Latza et al. Eur J. Immunol 1994; 24: 677-683) с последовательностью аминокислот 108-146 (т.е. 39-мерный пептид RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTN; см. SEQ ID NO:38) на внеклеточной части CD134 человека.

(d) Картирование эпитопов (2) моноклональных антител мыши к CD 134 человека клонов 12H3 и 20E5 посредством технологии картирования эпитопов CLIPS по процедуре Pepscan

Технологию картирования эпитопов CLIPS по процедуре Pepscan (Лелистад, Нидерланды) можно применять для определения эпитопов, распознаваемых антителами мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5. Технология CLIPS позволяет определять линейные, конформационные, прерывистые и составные эпитопы, включающие димерные и мультимерные белковые комплексы. Для данной цели в качестве белка-мишени применяют линейную последовательность аминокислот CD134 человека = ОХ40 (SEQ ID NO:1).

Пример 9. Описание доменов и эпитопов CD 134 человека, распознаваемых химерными моноклональными антителами к CD134 человека, содержащими IgG4/каппа и/или IgG1/каппа, клонов 12H3 и 20E5 (a). Связывание химерных моноклинальных антител к CD134 человека, содержащих IgG4/каппа и/или IgG1/каппа, клонов 12H3 и 20E5 с полноразмерной конструкцией CD134 человека и разными процессированными конструкциями CD134 человека, экспрессируемыми линией клеток 293-F (картирование доменов)

Чтобы проанализировать тонкую специфичность химерных моноклональных антител к CD134 человека, содержащих IgG4K и/или IgG1K, клонов 12H3 и 20E5, локализацию эпитопа(ов), распознаваемого моноклональными химерными антителами к CD134 человека, содержащими IgG4K и/или IgG1K, клонов 12H3 и 20E5 определяли путем картирования доменов. Способность специфичность химерных моноклональных антител к CD134 человека, содержащих IgG4K и/или IgG1K, клонов 12H3 и 20E5 к связыванию с процессированными конструкциями CD134 человека (см. пример 8 (b) выше), экспрессируемых на поверхности (полученных из HEK) клеток 297-F, определяли при помощи анализа FACS.

Клетки 293-F Freestyle™ (Invitrogen) временно трансфецировали 5 сгенерированными вариантами CD134 человека с применением системы экспрессии Freestyle™ 293 (Invitrogen). Через 48-72 ч экспрес

- 34 031006 сию CD134 человека на поверхности трансфецированных клеток оценивали посредством анализа FACS. Для данной цели трансфецированные клетки отбирали и помещали при плотности 1-2х10⁶ клеток/мл в охлажденный льдом PBS/BSA/NaN₃. Клетки инкубировали с добавлением или без добавления 20,0 мкг/мл химерных моноклональных антител к CD134 человека, содержащих IgG4K и/или IgG1K человека, клонов 12H3 и 20E5 в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaNs, клетки дополнительно инкубировали с разведенными 1:200 РЕ-конъюгированными антителами козы к IgG мыши (Fcy-специфичными) (Jackson ImmunoResearch) в течение 30 мин при 4°C. После активного промывания в ФСБ/БСА/NaNз клетки фиксировали в 2% формальдегиде в ФСБ/БСА/№1Н₃, в течение 30 мин при 4°C. Связывание антител измеряли при помощи проточной цитометрии (FACSCalibur; BD Biosciences).

Как показано на фиг. 22, и моноклональные химерные антитела к CD134 человека, содержащие IgG4K и IgG1K, клона 12H3, и химерные антитела к CD134 человека, содержащими IgG4K, клона 20E5 демонстрировали связывание с разными процессированными конструкциями CD134 человека на поверхности трансфецированных клеток, которое по свойством было сходно со связыванием соответствующих им исходных антител мыши к CD134 человека клонов 12H3 и 20E5 (см. пример 8 (b) выше; для сравнения, см. фиг. 22 и 21).

(b). Картирование эпитопов химерных моноклинальных антител, содержащих IqG4K, к CD134 человека клона 12H3 посредством ELISA с применением пептида, полученного из CD134 человека

Чтобы более подробно проанализировать тонкую специфичность химерных моноклональных антител, содержащих IgG4K человека, к CD134 человека клона 12H3 путем картирования эпитопов определяли локализацию эпитопа, распознаваемого химерными антителами, содержащими IgG4K человека. Способность химерных моноклональных антител, содержащих IgG4K человека, к CD 134 человека клона 12H3 связываться с пептидом, полученным из CD134 человека, который соответствует последовательности аминокислот A1-модуля процессированной CRD3 - A1-модуля субдомена CRD4 (согласно определению Latza et al. Eur J. Immunol 1994; 24: 677-683), определяли посредством ELISA.

В планшеты на 96 лунок с плоским дном (Corning) наносили по 10 нг/лунку пептида, полученного из CD134 человека (синтезированного Pepscan Presto, Лелистад, Нидерланды), который соответствует последовательности аминокислот A1-модуля процессированной CRD3- A1-модуля субдомена CRD4 (см. SEQ ID NO:38), или по 10 нг/лунку контрольного пептида, полученного из фибринонектина человека (синтезированного Pepscan Presto, Лелистад, Нидерланды), который соответствует последовательности аминокислот внеклеточного структурного домена III типа (см. SEQ ID NO:37) в ФСБ и оставляли на одну ночь при 4°C. После активного промывания в ФСБ/0,05% Tween 20 реакцию в планшетах блокировали в ФСБ/0,05% Tween 20/ 1% фракции V БСА (Roche) в течение 1 ч при КТ. Затем планшеты инкубировали с 0, 0,00005-50,0 мкг/мл (этапы 10-кратных разведений в блокирующем буфере) химерных моноклональных антител, содержащих IgG4K человека, к CD134 человека клона 12H3 или контрольных антител с IgG4K человека к CD40 человека (Biocult) в течение 1 ч при КТ. После активного промывания в ФСБ/0,05% Tween 20 связывание антител определяли посредством инкубации с разведенными 1:5000 антимышиными FcY-специфичными антителами козы, конъюгированными с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch) в течение 1 ч при КТ, а после этого - с готовым к употреблению раствором субстрата ТМВ (Invitrogen) для колориметрической детекции. После добавления 1 М H₂SO₄ измеряли отическую плотность на длине волны 450 нм (эталонная длина волны 655 нм) при помощи микропланшетного ридера (BioRad).

Как показано на фиг. 23-B (n=1), химерные моноклональные антитела, содержащие IgG4K человека, к CD 134 человека клона 12H3 дозозависимо и специфически связывались с пептидом, полученным из CD134 человека, а контрольные антитела человека изотипа IgG4K к CD40 человека не демонстрировали связывания с пептидом, полученным из CD134 человека. Ни моноклональные антитела, содержащие IgG4K человека, к CD134 человека клона 12H3, ни контрольные антитела человека изотипа IgGaK к CD40 человека не демонстрировали связывания с контрольным пептидом, полученным из фибронектина человека.

Указанные результаты демонстрируют, что химерные моноклональные антитела, содержащие IgG4K человека, к CD 134 человека клона 12H3 специфически распознавали эпитоп на CD 134 человека (сравнение пептида, полученного из CD134 человека, и контрольного пептида, полученного из фибронектина человека). Кроме того, указанные результаты демонстрируют, что химерные моноклональные антитела, содержащие IgG4K человека, к CD134 человека клона 12H3, по-видимому, распознавали линейный или нелинейный/конформационный эпитоп в A1-модуле процессированной CRDS-A1-модуле субдомена CRD4 (согласно определению Latza et al. Eur J. Immunol 1994; 24: 677-683) с последовательностью аминокислот 108-146 (т.е. 39-мерный пептид RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTN; см. SEQ ID NO:38) на внеклеточной части CD134 человека.

Прилагаемый перечень последовательностей является частью настоящего описания.

In SEQ ID NO:1, которая представляет собой последовательность аминокислот CD 134 человека (GenBank ref CAB96543.1; ак 1-277), отдельный пептид составляют аминокислоты (ак) 1-28), и транс

- 35 031006 мембранную область - ак 215-235.

SEQ ID NO:61, которая образует аминокислоты N-конца of SEQ ID NO:5, также представляет интерес. Это легкая цепь 20E5, которая эквивалентна SEQ ID NO:3, и которая представляет собой 11 Nконцевых аминокислот тяжелой цепи 20E5.

SEQ ID NO:37 (TYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGGC), последовательность аминокислот из пептида, полученного из фибронектина человека, соответствует последовательности аминокислот внеклеточного структурного домена III типа (ED1; Peters et al. Am Rev Resp Dis 1988; 138: 167-71).

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> БИОСЕРОКС ПРОДАКТС Б. В.

<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ CD134 (OX40) И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ <130> BIOBF/P51941PC <150> GB 1116092.6 <151> 2011-09-16 <160> 61 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> СИГНАЛ <222> (1)...(28) <220>

<221> ТРАНСМЕМБРАННЫЙ ДОМЕН <222> (215)...(235) <400> 1

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

5 1015

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val

2530

Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro 35 4045

Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys 50 5560

Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro

70 7580

Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys 85 9095

- 36 031006

Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly

100 105110

Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys 115 120125

Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp

130 135140

Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn

145 150 155160

Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro

165 170175

Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr

180 185190

Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu

195 200205

Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val

210 215220

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu

225 230 235240

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly

245 250255

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

260 265270

Thr Leu Ala Lys Ile

275 <210> 2 <211> 834 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность ДНК для CD134человека, оптимизированная для клеток насекомых Sf9 <400> 2 atgtgcgtgg gcgctcgtcg tctgggtcgt ggtccctgcg ctgctctgct gctgctgggt 60 ctgggcctgt ccactgtcac tggactccac tgcgtgggcg acacctaccc ctccaacgac 120

- 37 031006 cgttgctgcc acgaatgcag gcctggcaac ggcatggtgt cccgttgctc ccgttcccag 180 aacaccgtgt gccgtccctg cggtcccggt ttctacaacg acgtggtgtc ctccaagccc 240 tgcaagcctt gcacttggtg taacctccgc tccggttccg agcgcaagca gctgtgcacc 300 gctacccagg acactgtctg taggtgcagg gctggcaccc agcccctgga ctcctacaag 360 cccggtgtcg actgcgctcc ctgcccccct ggtcacttct ctcccggcga caaccaggct 420 tgcaaaccat ggaccaactg caccctggct ggcaagcaca ccctgcagcc cgcttccaac 480 tcctccgacg ctatctgcga ggaccgtgac ccccctgcta ctcaacctca ggagactcag 540 ggtccccccg ctcgtcccat caccgtgcag cccaccgagg cttggccccg tacctcccaa 600 ggacctagca ctaggcctgt ggaggtgccc ggtggtcgtg ctgtggctgc tatcctgggc 660 ctgggtctgg tgctgggcct gctgggtccc ctggctatcc tgctggctct gtacctcctg 720 cgtcgtgacc agcgtctgcc ccccgacgct cacaagcccc ctggtggtgg ttccttccgt 780 acccccatcc aggaggagca ggctgacgct cactccaccc tggccaagat ctaa 834 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот на N-конце тяжелой цепи клона 20E5 <400> 3

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

5 10 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи клона 20E5 <400> 4

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

5 1015

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 2530

Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 4045

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

- 38 031006

5560

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 5 <211> 108 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи клона 20E5 <400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

5 1015

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 2530

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 4045

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 5560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

70 7580

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

9095

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100105 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Искусственная последовательность

- 39 031006 <220>

<223> Последовательность аминокислот CDR1 тяжелой цепи клона 20E5 <400> 6

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His

5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот CDR2 тяжелой цепи клона 20E5 <400> 7

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

5 10 15

Gly <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот CDR3 тяжелой цепи клона 20E5 <400> 8

Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr

5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот CDR1 легкой цепи клона 20E5 <400> 9

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот CDR2 легкой цепи клона 20E5

- 40 031006 <400> 10

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот CDR3 легкой цепи клона 20E5 <400> 11

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr

5 <210> 12 <211> 121 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи клона 12H3 <400> 12

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

5 1015

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr 20 2530

Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 4045

Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe 50 5560

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

70 7580

Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val Trp Gly

100 105110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro

115120 <210> 13

- 41 031006 <211> 108 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи клона 12H3 <400> 13

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Leu Gly

5 1015

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala 20 2530

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 4045

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 5560

Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

70 7580

Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu 85 9095

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100105 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот CDR1 тяжелой цепи клона 12H3 <400> 14

Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr Thr Met His

5 10 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот CDR2 тяжелой цепи клона 12H3 <400> 15

- 42 031006

Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15

Asp <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот CDR3 тяжелой цепи клона 12H3 <400> 16

Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот CDR1 легкой цепи клона 12H3 <400> 17

Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala Val Ala

5 10 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот CDR2 легкой цепи клона 12H3 <400> 18

Trp Ala Ser Thr Arg His Thr

5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот CDR3 легкой цепи клона 12H3 <400> 19

Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu Thr

5

- 43 031006 <210> 20 <211> 1398 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность оптимизированной для CHO кДНК, кодирующей химерную цепь IgG4 человека клона 20E5 <400> 20 atggagtgga gcggagtgtt tatgttcctg ctgagcgtga ccgctggcgt gcactcagag 60 gtgcagctgc agcagtcagg ccccgagctg gtcaagcctg gcgctagcgt gaagatgagc120 tgtaaagcta gcggctacac cttcactagc tacgtgatgc actgggtcaa gcagaagccc180 ggccagggcc tggagtggat cggctatatt aacccctata acgacggcac taagtataac 240 gagaagttta agggcaaggc taccctgact agcgataagt ctagctctac cgcctatatg300 gaactgtcta gtctgactag tgaagatagc gccgtctact actgcgctaa ctactacggc360 tctagcctgt ctatggacta ctggggccag ggcactagcg tgaccgtgtc tagcgctagc 420 actaagggcc ctagcgtgtt ccccctggcc ccctgctcta gatctactag cgagtctacc 480 gccgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt cagctggaat 540 agcggcgctc tgactagcgg cgtgcacacc ttccctgccg tgctgcagtc tagcggcctg 600 tatagtctgt ctagcgtggt caccgtgcct agttctagcc tgggcactaa gacctacacc 660 tgtaacgtgg accacaagcc ctctaacact aaggtggaca agcgggtgga atctaagtac 720 ggccctccct gccccccctg ccctgcccct gaatttctgg gcggacctag tgtgttcctg 780 ttcccaccta agcctaagga caccctgatg atctctagaa cccccgaagt gacctgcgtg 840 gtggtggacg tgtcacagga agatcccgag gtccagttta attggtacgt ggacggcgtg 900 gaagtgcaca acgctaagac taagcctaga gaggaacagt ttaactctac ctatagggtc 960 gtcagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaagagta taagtgtaaa 1020 gtgtctaaca agggcctgcc tagctctatc gaaaagacta tctctaaggc taagggccag 1080 cctagagaac ctcaggtcta caccctgccc cctagtcagg aagagatgac taagaatcag 1140 gtgtcactga cctgtctggt caagggcttc taccctagcg atatcgccgt cgagtgggag 1200 tctaacggcc agcccgagaa caactataag actacccccc ctgtgctgga tagcgacggt 1260 agcttcttcc tgtactcacg gctgaccgtg gataagtcta ggtggcagga aggcaacgtc 1320 tttagctgta gcgtgatgca cgaggccctg cacaatcact acactcagaa gtcactgagc 1380 ctgagcctgg gcaagtga 1398

- 44 031006 <210> 21 <211> 702 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность оптимизированной для CHO кДНК, кодирующей химерную цепь каппа человека клона 20E5 <400> 21 atggagtgga gcggagtgtt tatgttcctg ctgagcgtga ccgctggcgt gcactcagat 60 attcagatga ctcagactac ctctagcctg agcgctagcc tgggcgatag agtgactatt 120 agctgtagag ctagtcagga tatctctaac tacctgaact ggtatcagca gaaacccgac180 ggcaccgtga agctgctgat ctactacacc tctagactgc actcaggcgt gccctctagg 240 tttagcggta gcggtagtgg caccgactat agcctgacta tctctaacct ggaacaggaa 300 gatatcgcta cctacttctg tcagcagggc aacaccctgc cctggacctt cggcggaggc 360 actaagctgg aaatcaagcg gaccgtggcc gctccctcag tgtttatctt cccacctagc420 gacgagcagc tgaagtccgg caccgctagc gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctaccct 480 agagaagcta aggtgcagtg gaaagtggat aacgccctgc agtcaggcaa ctctcaggaa540 tcagtcaccg agcaggactc taaggatagc acctatagcc tgtctagcac cctgaccctg 600 tctaaggccg actacgagaa gcacaaggtc tacgcctgcg aagtgactca ccagggactg 660 tctagccccg tgactaagtc ctttaataga ggcgagtgct ga702 <210> 22 <211> 1407 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность оптимизированной для CHO кДНК, кодирующей химерную цепь IgG1 человека клона 20E5 <400> 22 atggagtggt caggcgtgtt catgttcctg ctgagcgtga ccgctggcgt gcactcagag 60 gtgcagctgc agcagtcagg ccccgagctg gtcaagcctg gcgctagcgt gaagatgagc120 tgtaaagcta gcggctacac cttcactagc tacgtgatgc actgggtcaa gcagaagccc180 ggtcagggcc tggagtggat cggctatatt aacccctata acgacggcac taagtataac 240 gagaagttta agggtaaagc taccctgact agcgataagt ctagctctac cgcctatatg 300 gaactgtcta gtctgactag tgaagatagc gccgtctact actgcgctaa ctactacggc360

- 45 031006 tctagcctgt ctatggacta ctggggtcag ggcactagcg tgaccgtgtc tagcgctagc 420 actaagggcc ctagcgtgtt ccccctggcc cctagctcta agtctactag cggcggcacc 480 gccgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt cagctggaat 540 agcggcgctc tgactagcgg agtgcacacc ttccccgccg tgctgcagtc tagcggcctg 600 tatagtctgt ctagcgtggt caccgtgcct agttctagcc tgggcactca gacctatatc 660 tgtaacgtga accacaagcc ctctaacact aaggtggaca agaaggtgga acctaagtcc 720 tgcgataaga ctcacacctg tcccccctgc cctgcccctg agctgctggg aggacctagt 780 gtgttcctgt tcccacctaa gcctaaggac accctgatga tctctagaac ccccgaagtg 840 acctgcgtgg tggtggacgt cagtcacgag gaccctgaag tgaagtttaa ttggtacgtg 900 gacggcgtgg aagtgcacaa cgctaagact aagcctagag aggaacagta taactctacc 960 tatagggtcg tcagcgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg taaagagtat 1020 aagtgtaaag tgtctaacaa ggccctgcca gcccctatcg aaaagactat ctctaaggct 1080 aagggtcagc ctagggaacc tcaggtctac accctgcccc ctagtaggga cgagctgact 1140 aagaatcagg tcagcctgac ttgtctggtc aagggcttct accctagcga tatcgccgtc 1200 gagtgggagt ctaacggtca gcccgagaac aactataaga ctaccccccc tgtgctggat 1260 agcgacggta gcttcttcct gtactctaaa ctgaccgtgg ataagtctag gtggcagcag 1320 ggtaacgtgt tcagctgtag cgtgatgcac gaggccctgc acaatcacta cactcagaag 1380 tcactgagcc tgagccccgg taagtga 1407 <210> 23 <211> 1404 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность оптимизированной для CHO кДНК, кодирующей химерную цепь IgG4 человека клона 12H3 <400> 23 atggagtggt ctggtgtctt tatgttcctg ctgtccgtga ccgcgggtgt ccacagcgag 60 gtgcagctgc agcagtccgg ccctgagctg gtgaaacctg gcgcctccgt gaagatctcc 120 tgcaagacct ccggctacac cttcaaggac tacacaatgc actgggtgaa acagtcccac 180 ggcaagtcct tggagtggat cggcggaatc taccccaaca acggcggctc cacctacaac 240 cagaacttca aggacaaggc caccctgacc gtggacaagt cctcctccac cgcctatatg 300 gaatttcggt ccctgacctc cgaggactcc gccgtgtact actgcgcccg gatgggctac 360

- 46 031006 cacggccccc acctggattt cgacgtgtgg ggcgctggca ccaccgtgac cgtgtctcca 420 gctagcacca agggcccctc cgtgttccct ctggcccctt gctcccggtc cacctccgag 480 tctaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtcc 540 tggaactctg gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 600 ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgaca gtgccctcct ccagcctggg caccaagacc 660 tacacctgta acgtggacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 720 aagtacggcc ctccctgccc accttgccct gcccctgaat ttctgggcgg accttccgtg 780 ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 840 tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaagaagat cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac 900 ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa ctccacctac 960 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaggg cctgcccagc tctatcgaaa agacaatctc caaggccaag 1080 ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcctccca gccaagaaga gatgaccaag 1140 aaccaggtgt ccctgacttg tctggtgaaa ggcttctacc cctccgatat cgccgtcgag 1200 tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctgta ctctcggctg acagtggata agtcccggtg gcaagaaggc 1320 aacgtcttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1380 ctgtccctga gcctgggcaa gtag 1404 <210> 24 <211> 702 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность оптимизированной для CHO кДНК, кодирующей химерную цепь каппа человека клона 12H3 <400> 24 atggagtggt ccggtgtctt tatgttcctg ctgtccgtga ccgctggcgt gcactccgat 60 atcgtgatga cccagtccca caagtttatg tccacctccc tgggcgacag agtctctatt 120 acctgcaagg cctcccagga cgtgggcgct gccgtggcct ggtatcagca gaagcccggc 180 cagtccccca agctgctgat ctactgggcc tccaccagac acaccggcgt gcccgacaga 240 ttcaccggcg gaggctctgg caccgacttc accctgacaa tctccaacgt gcagtccgag 300 gacctgaccg actacttctg ccagcagtat atcaactacc ccctgacctt cggcggaggc 360 accaagctgg aaatcaagcg gaccgtggcc gctccctccg tgtttatctt cccaccctcc 420

- 47 031006 gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtggtctgcc tgctgaacaa cttctacccc 480 cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccggcaa ctcccaagaa 540 tccgtgaccg agcaggactc caaggacagc acctactccc tgtcctccac cctgaccctg 600 tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 660 tccagccccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgct aa 702 <210> 25 <211> 465 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот химерной цепь человека IgG4 клона 20E5 <400> 25

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Met Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

5 1015

Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

2530

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 4045

Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 50 5560

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn

70 7580

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser 85 9095

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105110

Tyr Tyr Cys Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp

115 120125

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr

145 150 155160

- 48 031006

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp

210 215220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr

225 230 235240

Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro

245 250255

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

260 265270

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

275 280285

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

290 295300

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

305 310 315320

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

325 330335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

340 345350

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

355 360365

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

370 375380

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

385 390 395400

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

405 410415

- 49 031006

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

420 425430

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440445

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

450 455460

Lys

465 <210> 26 <211> 233 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот химерной цепи каппа человека клона 20E5 <400> 26

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Met Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

5 1015

Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala

2530

Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile 35 4045

Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys 50 5560

Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 7580

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn 85 9095

Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr

100 105110

Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

115 120125

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135140

- 50 031006

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155160

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

165 170175

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

195 200205

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

210 215220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225230 <210> 27 <211> 468 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот химерной цепи IgG1 человека клона 20E5 <400> 27

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Met Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

5 1015

Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

2530

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 4045

Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 50 5560

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn

70 7580

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser 85 9095

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

- 51 031006

100 105110

Tyr Tyr Cys Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp

115 120125

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

225 230 235240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345350

- 52 031006

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

370 375380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455460

Ser Pro Gly Lys

465 <210> 28 <211> 467 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот химерной цепи IgG4 человека клона 12H3 <400> 28

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Met Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

5 1015

Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

2530

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe 35 4045

Lys Asp Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 5560

Glu Trp Ile Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn

70 7580

- 53 031006

Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 9095

Thr Ala Tyr Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp 115 120125

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro Ala Ser Thr Lys

130 135140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 145 150 155160

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn

210 215220

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser

225 230 235240

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly

245 250255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

275 280285

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

305 310 315320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330335

- 54 031006

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

340 345350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

420 425430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455460

Leu Gly Lys

465 <210> 29 <211> 233 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот химерной цепи каппа человека клона 12H3 <400> 29

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Met Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

5 1015

Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr

2530

Ser Leu Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 35 4045

Gly Ala Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys

- 55 031006

5560

Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg 65 70 7580

Phe Thr Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn 85 9095

Val Gln Ser Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Asn

100 105110

Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

115 120125

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

130 135140

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155160

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

165 170175

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

195 200205

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

210 215220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225230 <210> 30 <211> 240 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот CD134_CRD2 человека (ак 1-28 >< 66-277) <220>

<221> СИГНАЛ <222> (1)...(28) <220>

<221> трансмембранный домен <222> (178)...(198)

- 56 031006 <400> 30

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

5 1015

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Pro Cys Gly Pro

2530

Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr 35 4045

Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala 50 5560

Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp

70 7580

Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe 85 9095

Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu

100 105110

Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile

115 120125

Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly 130 135140

Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg

145 150 155160

Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg

165 170175

Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly

180 185190

Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg

195 200205

Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr 210 215220

Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

225 230 235240

- 57 031006 <210> 31 <211> 198 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот CD134_CRD3 человека (ак 1-28 >< 108-277) <220>

<221> СИГНАЛ <222> (1)...(28) <220>

<221> трансмембранный домен <222> (136)...(156) <400> 31

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

5 1015

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Arg Cys Arg Ala 20 2530

Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro 35 4045

Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro 50 5560

Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser

70 7580

Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln 85 9095

Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro

100 105110

Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val

115 120125

Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu 130 135140

Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu

145 150 155160

Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly

165 170175

- 58 031006

Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His

180 185 190

Ser Thr Leu Ala Lys Ile

195 <210> 32 <211> 179 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот CD134_CRD4 человека (ак 1-28 >< 127-277) <220>

<221> СИГНАЛ <222> (1)...(28) <220>

<221> трансмембранный домен <222> (117)...(137) <400> 32

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

5 1015

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Pro Cys Pro Pro

2530

Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn 35 4045

Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser 50 5560

Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu

70 7580

Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala

9095

Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro

100 105110

Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly

115 120125

Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg 130 135140

- 59 031006

Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu

165 170 175

Ala Lys Ile <210> 33 <211> 159 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот процессированного CD134_CRD4 человека (ак 1-28 >< 147-277) <220>

<221> СИГНАЛ <222> (1)...(28) <220>

<221> трансмембранный домен <222> (97)...(117) <400> 33

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

5 1015

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Cys Thr Leu Ala

2530

Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys 35 4045

Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro 50 5560

Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr

70 7580

Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala

9095

Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro

100 105110

Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu

115 120125

- 60 031006

Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro

130 135 140

Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile 145 150 155 <210> 34 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34

Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val

5 10 15

Asp Cys Ala <210> 35 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35

Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val

5 1015

Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln 20 2530

Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu 35 4045

Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro 50 5560

Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile

70 7580

Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser

9095

Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala

100105 <210> 36 <211> 68

- 61 031006 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36

Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser

5 1015

Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu

2530

Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala

4045

Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro 50 5560

Gly Gly Arg Ala <210> 37 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37

Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp Gly Ile His Glu Leu Phe Pro Ala Pro

5 10 15

Asp Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Gly Cys

25 <210> 38 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38

Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val

5 10 15

Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln

25 30

Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn <210> 39 <211> 20 <212> ДНК

- 62 031006 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> антисмысловой праймер mkappa (№ праймера: 201) <400> 39 gacagttggt gcagcatcag 20 <210> 40 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> антисмысловой праймер mkappa (№ праймера: 266) <400> 40 cactggatgg tgggaagatg 20 <210> 41 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> антисмысловой праймер mlgG1 (№ праймера: 203) <400> 41 ggccagtgga tagacagatg 20 <210> 42 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> антисмысловой праймер mlgG1 (№ праймера: 204) <400> 42 tggacaggga tccagagttc 20 <210> 43 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> смысловой праймер 20E5HC (№ праймера: 259) <400> 43 gcgaagtaca aytncarcar wsngg 25 <210> 44 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 63 031006 <220>

<223> смысловой праймер 20E5HC (№ праймера: 260) <400> 44 gcgtacaatt acarcarwsn ggncc <210> 45 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> смысловой праймер 20E5LC (№ праймера: 265) <400> 45 gcgatataca ratgacncar ac <210> 46 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> антисмысловой праймер mlgG1 (№ праймера: 416) <400> 46 cagtggatag acagatgggg g 21 <210> 47 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> антисмысловой праймер mkappa (№ праймера: 394) <400> 47 actggatggt gggaagatgg 20 <210> 48 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> смысловой праймер сигнального пептида (№ праймера: 405) <400> 48 atgggatgga gctrtatcat sytctt 26 <210> 49 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 64 031006 <220>

<223> смысловой праймер сигнального пептида (№ праймера: 410) <400> 49 atggratgga gckgggtctt tmtctt <210> 50 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> смысловой праймер сигнального пептида (№ праймера: 389) <400> 50 atgggcwtca aagatggagt caca 24 <210> 51 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> смысловой праймер лидерной последовательности CD134 (№ праймера: 362) <400> 51 ctcggatccg ccaccatgtg cgtg 24 <210> 52 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> смысловой праймер CRD2 (№ праймера: 364) <400> 52 actgtcactg gaccctgcgg tccc 24 <210> 53 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> антисмысловой праймер CRD2 (№ праймера: 365) <400> 53 gggaccgcag ggtccagtga cagt 24 <210> 54 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> смысловой праймер CRD3 (№ праймера: 366)

- 65 031006 <400> 54 actgtcactg gaaggtgcag ggct 24 <210> 55 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> концевой праймер CD134 (№ праймера: 363) <400> 55 agaattctta ttagatcttg gcca 24 <210> 56 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> антисмысловой праймер CRD3 (№ праймера: 367) <400> 56 agccctgcac cttccagtga cagt 24 <210> 57 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> смысловой праймер CRD4 (№ праймера: 368) <400> 57 actgtcactg gaccctgccc ccct 24 <210> 58 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> антисмысловой праймер CRD4 (№ праймера: 369) <400> 58 aggggggcag ggtccagtga cagt 24 <210> 59 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> процессированный смысловой праймер CRD4 (№ праймера: 370) <400> 59

- 66 031006 actgtcactg gatgcaccct ggct <210> 60 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> процессированный смысловой праймер CRD4 (№ праймера: 371) <400> 60 agccagggtg catccagtga cagt 24 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность аминокислот N-конца легкой цепи клона 20E5 <400> 61

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu 1 5 10

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Связывающая молекула, которая связывается с CD134 человека, представляющая собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:

   (a) CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO:6;

   (b) CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO:7;

   (c) CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO:8; и вариабельную область легкой цепи, содержащую:

   (a) CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO:9;

   (b) CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO:10;

   (c) CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO:11.

   2. Связывающая молекула по п.1, включающая:

   (a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO:4 или вариант указанной последовательности, содержащий 1, 2 или 3 замены аминокислот в каркасных областях; и/или (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO:5 или вариант указанной последовательности, содержащий 1, 2 или 3 замены аминокислот в каркасных областях.

   3. Связывающая молекула по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанная связывающая молекула не препятствует связыванию CD134 (ОХ40) человека с лигандом ОХ40 (OX40L).

   4. Связывающая молекула по п.1 или 2, отличающаяся тем, что при насыщающей концентрации указанной молекулы или выше действие на связывание OX40L с CD134 снижается не более чем на 50% на Т-лимфоцитах, экспрессирующих CD134 человека.

   5. Связывающая молекула по любому из пп.1-4, которая представляет собой антитело человека или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела.

   6. Связывающая молекула по любому из пп.1-4, которая представляет собой химерное, гуманизированное антитело или антитело Delmmunized™ или его фрагмент.

   7. Связывающая молекула по любому из пп.1-6, которая представляет собой антитело IgA, IgD, IgE, IgG или IgM.

   8. Связывающая молекула по п.7, которая представляет собой антитело IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

   9. Связывающая молекула по любому из пп.1-6, представляющая собой антигенсвязывающий

   - 67 031006 фрагмент антитела.

   10. Связывающая молекула по п.9, отличающаяся тем, что указанный антигенсвязывающий фрагмент антитела выбран из группы, состоящей из фрагментов Fv и Fab фрагментов.

   11. Связывающая молекула по п.10, отличающаяся тем, что указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный Fv или Fv, связанный дисульфидными связями.

   12. Связывающая молекула по п.11, отличающаяся тем, что указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой scFv.

   13. Связывающая молекула по п.10, отличающаяся тем, что указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab фрагмент, выбранный из фрагментов Fab, фрагментов Fab' и фрагментов F(ab')2.

   14. Связывающая молекула по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что указанная связывающая молекула представляет собой рекомбинантное антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела.

   15. Связывающая молекула по любому из пп.1-14, отличающаяся тем, что указанная связывающая молекула представляет собой моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела.

   16. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая связывающую молекулу по любому из пп.1-15.

   17. Вектор экспрессии, содержащий по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты по п.16.

   18. Клетка-хозяин для экспрессии связывающей молекулы согласно любому из пп.1-15, содержащая вектор экспрессии по п.17.

   19. Клетка-хозяин по п.18, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин получена из млекопитающего или насекомого.

   20. Применение связывающей молекулы по любому из пп.1-15 при профилактике или лечении рака у нуждающегося в этом субъекта.

   21. Применение связывающей молекулы по п.20, отличающееся тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из рака легких, рака предстательной железы, рака молочной железы, рака головы и шеи, рака пищевода, рака желудка, рака ободочной и толстой кишки, рака мочевого пузыря, рака шейки матки, рака матки, рака яичников, рака печени, рака крови и любого другого заболевания или расстройства, характеризуемого неконтролируемым ростом клеток.

   22. Способ усиления иммунного ответа у субъекта, представляющего собой человека, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающей молекулы по любому из пп.1-15.

   23. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанный усиленный иммунный ответ включает увеличение иммуностимулирующей/эффекторной функции эффекторных Т-лимфоцитов и/или подавление иммуносупрессорной функции регуляторных Т-лимфоцитов.

   24. Способ лечения рака у субъекта, представляющего собой человека, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающей молекулы по любому из пп.1-15.

   25. Способ по п.24, отличающийся тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из рака легких, рака предстательной железы, рака молочной железы, рака головы и шеи, рака пищевода, рака желудка, рака ободочной и толстой кишки, рака мочевого пузыря, рака шейки матки, рака матки, рака яичников, рака печени, рака крови и любого другого заболевания или расстройства, характеризуемого неконтролируемым ростом клеток.

   26. Способ уменьшения размера опухоли или подавления роста раковых клеток у субъекта или уменьшения или подавления развития метастатического рака у субъекта, страдающего раком, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающей молекулы по любому из пп.1-15.

   27. Применение связывающей молекулы по любому из пп.1-15 при получении лекарственного препарата для лечения или профилактики рака.

   28. Фармацевтическая композиция для усиления иммунного ответа у субъекта, представляющего собой человека, содержащая связывающую молекулу по любому из пп.1-15 в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемыми растворителями или вспомогательными веществами.

   29. Композиция по п.28, отличающаяся тем, что указанная композиция подходит для парентерального введения в организм человека.

   30. Композиция по п.29, отличающаяся тем, что указанное парентеральное введение представляет собой внутривенное, внутримышечное, внутрикожное, внутрибрюшинное, внутриопухолевое, внутрипузырное, внутриартериальное, интратекальное, внутрикапсульное, внутриглазничное, внутрисердечное, транстрахеальное, внутрисуставное, подкапсульное, субарахноидальное, внутриспинальное, эпидуральное, внутригрудинное или подкожное введение.

   - 68 031006

   5.0 т⁴⁰ I 3.0 J 2.0 § 1.0 I o.o о

   5.0 I 4.0 I 3.0 S ²⁰

   Q θ 1.0 I o.o

   Фиг. 1 лимфоциты донор2 донор2

   Контроль lgG1

   Контроль lgG1

   10° 10¹ 10² 10³ 10⁴

   CD4

   Фиг. 2

   Фиг. 3

   - 69 031006

   CD4 CD8

   10° 10’ 10² 10³ 10⁴ 10° 10' 10² 10³ 10⁴

   CD4 CD8

   Фиг. 4

   Контроль lgG1

   20Е5 Контроль lgG1

   10° 10¹ 10² 10³ 10⁴ 10° 10¹ 10² 10³ 10

   Контроль lgG1

   Фиг. 5

   29% 12Н 3⁺

   12H37OX40L

   OX40L

   Фиг. 6

   17% 20Е5⁺

   Контроль lgG1

   1 8% 20Е570Х401 ί - .

   OX40L

   - 70 031006

   Фиг. 8 % ОХ40-позитивных клеток

   Фиг. 7

   - 71 031006

   Донор 1 (n=6)

   Донор 2 (n=3)

   Включение ³H-TdR (cp5m)

   Донор 3 (n=3)

   Q. О

   Οί Ό H i ф s T Ф T

   70,000

   60,000

   50,000

   40,000

   30,000

   20,000

   10,000 среда 12H3 20E5 OX40L

   Фиг. 10 _ 1400 1

   8. 1200

   Η τ о

   12НЗ 20Е5 OX40L

   Фиг. 11 среда

   - 72 031006

   Донор1 (η=2)

   Донор2 (η=2)

   Οί σ Η ί φ s τ φ τ 2 Γ

   CQ

   Е ю

   о. о

   100,000

   90,000

   80,000

   70,000

   60,000

   50,000

   30,000

   20,000

   10,000 ο

   Фиг. 12

   Фиг. 13 % подавления роста Тэфф клетками Трег

   ο Ί ο : 3? 1 ю ο ί Ш ν- I О сдвиге.· и όχ40⁺ :=iM =ο ; Ο

   Фиг. 14

   - 73 031006

   Фиг. 15

   Донор 1 (п=2)

   Донор 2 (п=2)

   Включение Brdll OD 450 нм

   Фиг. 16

   - 74 031006

   Включение BrdU (OD 450) Включение BrdU (OD 450)

   Фиг. 17

   Фиг. 18

   - 75 031006

   Фиг. 19

   Внеклеточные богатые цистеином домены *Согласно Latza etal. Eur J. Immunol. 1994 **Согласно Compaan et al. Structure 2006

   Фиг. 20

   - 76 031006

   Фиг. 21

   - 77 031006

   Фиг. 23