TW201919662A - 對雙重難治性黑色素瘤使用腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示使用腫瘤浸潤性淋巴細胞治療其他療法所難治的黑色素瘤之方法。

Description

對雙重難治性黑色素瘤使用腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法
本發明揭示使用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)治療雙重難治性黑色素瘤之方法。
黑色素瘤的治療仍然具有挑戰性，特別是對於經常使用的第一線療法沒有反應的病患，包括尼沃魯單抗(nivolumab)單一療法、派姆單抗(pembrolizumab)單一療法、使用尼沃魯單抗與伊匹單抗(ipilimumab)之組合的療法、伊匹單抗單一療法、使用達拉菲尼(dabrafenib)與曲美替尼(trametinib)之組合的療法、威羅菲尼(vemurafenib)單一療法、及聚乙二醇化干擾素(預干擾素(preinterferon))α-2b。經核准的用於轉移性黑色素瘤的第一線治療包括阻斷PD-1(派姆單抗、尼沃魯單抗)的免疫治療策略、或組合尼沃魯單抗與抗CTLA4阻斷劑伊匹單抗、或靶向BRAF途徑中之特定活化突變之藥物的化療(例如威羅菲尼、達拉菲尼、曲美替尼)。在疾病進展後，病患可接受抗PD-1單一療法；尼沃魯單抗/伊匹單抗組合療法；伊匹單抗單一療法；如有BRAF突變之靶向療法；高劑量阿地介白素(介白素-2；IL-2)；細胞毒性劑(例如達卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、長春鹼(vinblastine))；或用於KIT-突變黑色素瘤之伊馬替尼(imatinib)的額外治療。2015年，一種活毒溶瘤病毒療法塔利拉維(talimogene laherparepvec)經核准用於局部治療初步手術切除後黑色素瘤復發之病患的無法部分切除的皮膚、皮下及結節病灶。此產品尚未顯示改善整體存活期或對臟器轉移有效。
直到最近，高劑量阿地介白素(aldesleukin)是唯一FDA核准的用於轉移性黑色素瘤的全身性療法，其能夠誘導持久的客觀癌症反應，整體客觀反應率(ORR)為16%，且在至多6%的治療病患觀察到持久的完全腫瘤緩解(CR)(Proleukin®(阿地介白素)標籤，FDA，2012年7月)。Alva,et al.Cancer Immunol.Immunother. 2016, 65, 1533-1544。最近核准的PD-1免疫檢查點抑制劑派姆單抗及尼沃魯單抗大約使轉移性黑色素瘤中的持久的反應率相對於阿地介白素治療加倍。Larkin,et al .,N. Engl. J. Med. 2015, 373, 23-34; Robert,et al., N. Engl. J. Med .2015, 372, 2521-32。在先前治療的病患中，尼沃魯單抗的ORR是32%，其中較高且較持久的反應與腫瘤較高的PD-1配體表現程度有關；且在伊匹單抗現有療法後派姆單抗的ORR為21%(表2)。在治療從未接受過治療的病患中，當尼沃魯單抗與伊匹單抗組合投予時，50%的病患達成持久的客觀反應，雖然CR比率維持低的8.9%(Opdivo®(尼沃魯單抗)標籤，FDA，2016年10月)。
檢查點抑制劑的使用與一系列免疫相關性不良事件有關，包括肺炎、結腸炎、肝炎、腎炎及腎功能異常(Opdivo(尼沃魯單抗)標籤，FDA，2016年10月)。Hofmann,et al. ,Eur.J. Cancer 2016, 60, 190-209。在經尼沃魯單抗與伊匹單抗組合療法治療的病患中觀察到增加的毒性。治療相關性不良事件所導致的治療中斷分別發生於36.4%、7.7%及14.8%接受組合療法、單獨尼沃魯單抗或單獨伊匹單抗的病患。Larkin,et al .,N. Engl. J. Med. 2015, 373, 23-34; Johnson,et al., N. Engl. J. Med. 2016, 375, 1749-1755。
雖然靶向療法及免疫檢查點抑制劑可在轉移性黑色素瘤病患中達成戲劇化的反應，預估此癌症的死亡率仍將維持穩定直到2030年。整體年齡調整黑色素瘤死亡率在2011年為每100000人2.7人，且在2015年維持此水準。Guy,et al., Morbidity Mortality Weekly Rep. 2015, 64, 591-596。
使用授受性自體轉移腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)治療大體積、難治性癌症對於預後不良病患代表一種有力的治療方案。Gattinoni,et al. ,Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393。TIL係以T細胞為主，且基於IL-2的TIL擴增然後「快速擴增過程」(REP)已因其速度及效率而成為TIL擴增的較佳方法。Dudley,et al. ,Science 2002, 298, 850-54; Dudley,et al. ,J. Clin.Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley,et al. ,J. Clin.Oncol. 2008 ,26, 5233-39; Riddell,et al. ,Science 1992, 257, 238-41; Dudley,et al. ,J. Immunother. 2003 ,26, 332-42。已探索一些改善TIL療法對黑色素瘤之反應及擴增TIL療法至其他腫瘤類型的方案但只有有限的成功，因此本領域仍然具有挑戰性。Goff,et al., J. Clin.Oncol. 2016, 34, 2389-97; Dudley,et al. ,J. Clin.Oncol. 2008 ,26, 5233-39; Rosenberg,et al. ,Clin.Cancer Res. 2011, 17, 4550-57。對於標準化TIL產生以及識別最有可能得益於TIL療法之病患族群及特定癌症類型仍有未滿足的需求。
本發明提供令人意外的發現，也就是TIL可用於治療罹患為至少二種現有療法所難治的黑色素瘤之病患子族群，現有療法可包括免疫檢查點抑制劑。
在一實施態樣中，本揭露提供一種治療有需要該治療之病患的雙重難治性轉移性黑色素瘤之方法，該方法包含向該病患投予治療有效群的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
在一實施態樣中且根據上述，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤係皮膚的雙重難治性轉移性黑色素瘤。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該雙重難治性轉移性黑色素瘤為至少二種現有的全身性治療療程所難治，該至少二種現有的全身性治療療程不包括新輔助或輔助療法。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該雙重難治性轉移性黑色素瘤為阿地介白素(aldesleukin)或其生物類似物所難治。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該雙重難治性轉移性黑色素瘤為派姆單抗(pembrolizumab)或其生物類似物所難治。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該雙重難治性轉移性黑色素瘤為尼沃魯單抗(nivolumab)或其生物類似物所難治。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該雙重難治性轉移性黑色素瘤為伊匹單抗(ipilimumab)或其生物類似物所難治。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該雙重難治性轉移性黑色素瘤為伊匹單抗或其生物類似物及派姆單抗或其生物類似物所難治。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該雙重難治性轉移性黑色素瘤為伊匹單抗或其生物類似物及尼沃魯單抗或其生物類似物所難治。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該雙重難治性轉移性黑色素瘤為BRAF抑制劑所難治。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該雙重難治性轉移性黑色素瘤為PD-L1抑制劑所難治。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該PD-L1抑制劑係選自由艾維路單抗(avelumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)及彼等之生物類似物所組成之群組。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該雙重難治性轉移性黑色素瘤為PD-1抑制劑與CTLA-4抑制劑之組合所難治。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該PD-1抑制劑係尼沃魯單抗或其生物類似物且該CTLA-4抑制劑係選自由伊匹單抗、曲美木單抗(tremelimumab)及彼等之生物類似物所組成之群組。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該雙重難治性轉移性黑色素瘤為BRAF抑制劑與MEK抑制劑之組合所難治。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該BRAF抑制劑係達拉菲尼(dabrafenib)或其醫藥上可接受之鹽且該MEK抑制劑係曲美替尼(trametinib)或其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該轉移性黑色素瘤對PD-1抑制劑或PD-L1抑制劑有抗性。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該PD-1或PD-L1抑制劑係選自由尼沃魯單抗、派姆單抗、艾維路單抗、阿特珠單抗、德瓦魯單抗及彼等之生物類似物所組成之群組。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該病患不具有BRAF突變。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該病患在接受該治療有效群的TIL之前，已接受至多4劑之尼沃魯單抗或其生物類似物。
在一實施態樣中且根據上述任一項，該病患經至少二種現有的全身性治療療程已有進展或無反應。
在一實施態樣中，本揭露提供一種治療有需要該治療之病患的雙重難治性轉移性黑色素瘤之方法，該方法包含： 　　(a) 藉由將獲自該病患的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該病患之部分切除的腫瘤獲得第一TIL群； 　　(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； 　　(c) 藉由在包含IL-2及可選地OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL群以執行第一擴增而產生第二TIL群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得該第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於該第一TIL群至少50倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統即可發生； 　　(d) 藉由對該第二TIL群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3及抗原呈現細胞(APC)以執行第二擴增而產生第三TIL群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL群，其中該第三TIL群係治療性TIL群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統即可發生； 　　(e) 收集自步驟(d)獲得的該治療性TIL群以提供經收集的TIL群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統即可發生； 　　(f) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統即可發生，且可選地冷凍保存該經收集的TIL群；及 　　(g) 向該患有雙重難治性轉移性黑色素瘤的病患投予治療有效量之該經收集的TIL群。
在一實施態樣中且根據上述方法，其中該病患先前已經接受PD-1抑制劑或其生物類似物的治療。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該PD-1抑制劑係選自由尼沃魯單抗、派姆單抗及彼等之生物類似物所組成之群組。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該病患先前已經接受PD-L1抑制劑或其生物類似物的治療。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該PD-L1抑制劑係選自由艾維路單抗(avelumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)及彼等之生物類似物所組成之群組。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該PD-1抑制劑或其生物類似物與CTLA-4抑制劑或其生物類似物共同投予。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該PD-L1抑制劑或其生物類似物與CTLA-4抑制劑或其生物類似物共同投予。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該病患先前已經接受一種額外的現有線上全身性療法治療。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該一種額外的現有線上全身性療法係BRAF抑制劑或其醫藥上可接受之鹽。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該BRAF抑制劑係選自由威羅菲尼(vemurafenib)、達拉菲尼及彼等之醫藥上可接受之鹽所組成之群組。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該一種額外的現有線上全身性療法係MEK抑制劑或其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該MEK抑制劑係選自由曲美替尼、考比替尼(cobimetinib)及彼等之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物所組成之群組。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該一種額外的現有線上全身性療法係BRAF抑制劑或其醫藥上可接受之鹽與MEK抑制劑或其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物之組合。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該BRAF抑制劑係選自由威羅菲尼、達拉菲尼及彼等之醫藥上可接受之鹽所組成之群組，且該MEK抑制劑係選自由曲美替尼、考比替尼及彼等之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物所組成之群組。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該一種額外的現有線上全身性療法係CTLA-4抑制劑或其生物類似物。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該CTLA-4抑制劑係選自由伊匹單抗、曲美木單抗及彼等之生物類似物所組成之群組。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該一種額外的現有線上全身性療法係化學治療療法。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該化學治療療法包含氮烯唑胺(dacarbazine)或替莫唑胺(temozolomide)。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該第一擴增執行一段約11天的期間。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該IL-2以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在於該第一擴增步驟(c)的該細胞培養基中。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中在該第二擴增步驟(d)中，該IL-2以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在且該OKT-3抗體以約30 ng/mL的初始濃度存在。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該第一擴增使用氣體可通透容器執行。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該第二擴增使用氣體可通透容器執行。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中在該第一擴增步驟(c)中的該細胞培養基進一步包含選自由IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及彼等之組合所組成之群組的細胞介素。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中在該第二擴增步驟(d)中的該細胞培養基進一步包含選自由IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及彼等之組合所組成之群組的細胞介素。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其進一步包含在向該病患投予該TIL之前用非骨髓清除式淋巴細胞耗盡療法治療該病患的步驟。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡療法包含投予劑量為60 mg/m2/天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2/天之氟達拉濱計五天的步驟。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其進一步包含始於向該病患投予該TIL之後當天使用IL-2療法治療該病患的步驟。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該IL-2療法係高劑量IL-2療法，包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液投予600,000或720,000 IU/kg的阿地介白素或其生物類似物或變體直到耐受為止。
在一實施態樣中且根據上述任一項，其中該治療有效群的TIL包含約2.3×1010至約13.7×1010個TIL。
除非另行定義，此處所使用之所有技術及科學用語具有本發明所屬領域之技藝人士所通常瞭解之相同意義。所有在此處提及之專利及公開案係以參照方式被整體納入。
除非另行定義，此處所使用之所有技術及科學用語具有本發明所屬領域之技藝人士所通常瞭解之相同意義。所有在此處提及之專利及公開案係以參照方式被整體納入。
用語「體內(in vivo)」係指發生在對象身體以內的事件。
用語「體外(in vitro)」係指發生在對象身體以外的事件。體外測定涵蓋基於細胞的測定，其採用活細胞或死細胞，且亦可涵蓋不採用完整細胞的不含細胞測定。
用語「離體(ex vivo)」係指涉及在從對象身體移除之細胞、組織及/或器官上所進行處理或執行程序的事件。適當地，該細胞、組織及/或器官可利用手術或治療的方法回到對象體內。
用語「快速擴增(rapid expansion)」是指抗原特異性TIL於數量上在一週期間增加至少約3倍(或4、5、6、7、8、或9倍)，更佳的是在一週期間增加至少約10倍(或20、30、40、50、60、70、80、或90倍)，或最佳的是在一週期間增加至少約100倍。一些快速擴增規程概述於下。
在本文中的「腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes)」或「TIL」是指一群原本是白血球的細胞，這些細胞離開對象的血流且遷移至腫瘤中。TIL包括但不限於CD8+細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1及Th17 CD4+ T細胞、天然殺手細胞、樹突細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初代及繼代TIL。「初代TIL」是該些如本文概述之獲自病患組織樣本的細胞(有時稱為「新鮮收集(freshly harvested)」)，而「繼代TIL」是任何經本文所述之擴增或增生的TIL細胞群，包括但不限於主體TIL (bulk TIL)及擴增TIL(「REP TIL」或「REP後TIL」)。TIL細胞群可包括基因修飾的TIL。
在本文中的「細胞群(population of cells)」(包括TIL)係指一些具有共同特質的細胞。一般來說，群於數量上通常介於1 X 106 至1 X 1010 ，不同TIL群包含不同數量。例如，初代TIL在IL-2存在下的初始生長導致大約1×108 個細胞的主體TIL群。通常進行REP擴增以提供1.5×109 至1.5×1010 個用於輸注的細胞群。
在本文中的「冷凍保存的TIL」係指在介於約-150℃至-60℃的範圍內處理及儲存的不論是初代、主體、或擴增(REP TIL)的TIL。冷凍保存的常規方法亦描述於本文他處，包括實例中。為了清晰起見，可將「冷凍保存的TIL」與可用來作為初代TIL來源的冷凍組織樣本區別。
在本文中的「解凍的冷凍保存TIL (thawed cryopreserved TILs)」係指先前經冷凍保存且接著經處理以回到室溫或更高溫度下的TIL群，包括但不限於細胞培養溫度或其中TIL可投予至病患的溫度。
TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌)定義，或可藉由彼等浸潤腫瘤及致效治療的能力之功能性定義。TIL通常可藉由表現一或多種下列生物標記來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。此外且替代地，TIL可藉由彼等重新導入病患體內後浸潤實質腫瘤的能力來進行功能性定義。
用語「冷凍保存介質」係指任何可用於冷凍保存細胞的介質。該等介質可包括包含7%至10% DMSO的介質。例示性介質包括CryoStor CS10、Hyperthermasol以及彼等之組合。用語「CS10」係指獲自Stemcell Technologies或Biolife Solutions的冷凍保存介質。CS10介質可以其商品名稱「CryoStor® CS10」稱呼。CS10介質是不含血清、不含動物組分的包含DMSO之介質。
用語「中央記憶T細胞(central memory T cell)」係指T細胞子集，其在人類中為CD45R0+且組成性表現CCR7 (CCR7hi)及CD62L (CD62hi)。中央記憶T細胞的表面表型亦包括TCR、CD3、CD127 (IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞的轉錄因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2及BMI1。中央記憶T細胞在TCR引發後主要分泌IL-2及CD40L作為效應分子。中央記憶T細胞是主要的血中CD4細胞，且在人類的淋巴結及扁桃腺中等比例濃化。
用語「效應記憶T細胞」係指人類或哺乳動物T細胞子集，其就像中央記憶T細胞是CD45R0+，但已經失去組成性表現CCR7的能力(CCR7lo)且表現CD62L的能力異質或低(CD62Llo)。中央記憶T細胞的表面表型亦包括TCR、CD3、CD127 (IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞的轉錄因子包括BLIMP1。效應記憶T細胞在抗原刺激後快速分泌高量的發炎性細胞介素，包括干擾素γ、IL-4及IL-5。效應記憶T細胞是主要的血中CD8細胞，且在人類的肺臟、肝臟及腸道中等比例濃化。CD8+效應記憶T細胞攜帶大量的穿孔素。
用語「密閉系統」係指與外界環境隔離的系統。任何適用於細胞培養方法的密閉系統皆可用於本發明之方法。密閉系統包括例如但不限於密閉G容器。一旦將腫瘤區段添加至密閉系統後，該系統即與外界環境隔離，直到準備將TIL投予至病患為止。
本文中所使用之用語「碎斷(fragmenting)」、「片段(fragment)」及「碎斷的(fragmented)」描述將腫瘤打斷的過程，包括機械碎斷方法諸如破碎、切開、分割及分碎腫瘤組織以及任何其他用於打斷腫瘤組織之物理結構之方法。
用語「周邊血液單核細胞」及「PBMC」係指具有圓形細胞核的周邊血液細胞，包括淋巴細胞(T細胞、B細胞、NK細胞)及單核球。較佳地，周邊血液單核細胞係經輻照的異體周邊血液單核細胞。PBMC是一種抗原呈現細胞。
用語「抗CD3抗體」係指以成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體為目標的抗體或其變體，例如單株抗體，且包括人類、人化、嵌合或鼠抗體。抗CD3抗體包括OKT-3，亦稱為莫羅單抗。抗CD3抗體亦包括UHCT1株，亦稱為T3及CD3ε。其他抗CD3抗體包括例如，奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizumab)及維西珠單抗(visilizumab)。
用語「OKT-3」(在本文中亦稱為「OKT3」)係指以成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體為目標的單株抗體或其生物類似物或變體，包括人類、人化、嵌合或鼠抗體，且包括市售形式諸如OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA)及莫羅單抗或其變體、保守性胺基酸取代、糖化形式或生物類似物。莫羅單抗之重鏈及輕鏈的胺基酸序列在表1中給出(SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)。能夠產生OKT-3的融合瘤寄存於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)，且所指派之ATCC編號為CRL 8001。能夠產生OKT-3的融合瘤亦寄存於歐洲認證細胞培養中心(ECACC)，且所指派之目錄編號為86022706。能夠產生OKT-3的融合瘤寄存於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)，且所指派之ATCC編號為CRL 8001。能夠產生OKT-3的融合瘤亦寄存於歐洲認證細胞培養中心(ECACC)，且所指派之目錄編號為86022706。抗CD3抗體亦包括UHCT1株(BioLegend, San Diego, CA, USA之市售品)，亦稱為T3及CD3ε。
用語「IL-2」(在本文中亦稱為「IL2」)係指稱為介白素-2的T細胞生長因子，且包括所有形式的IL-2，包括其人類及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-2係描述於例如，Nelson, J. Immunol.2004, 172, 3983-88及Malek, Annu.Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79，彼等揭露皆以引用方式併入本文中。適用於本發明之重組人類IL-2的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:3)。例如，用語IL-2涵蓋人類重組形式的IL-2諸如阿地介白素(PROLEUKIN，可購自多個供應商，每單次使用小瓶含22百萬IU)，以及由CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA (CELLGRO GMP)或ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-209-b)供應的重組IL-2形式及來自其他供應商的其他市售相等品。阿地介白素(去丙胺醯基-1、經絲胺酸-125取代的人類IL-2)係非糖基化人類重組形式的IL-2，分子量大約為15 kDa。適用於本發明之阿地介白素的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:4)。用語IL-2亦涵蓋如本文中描述之聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化IL2前藥NKTR-214 (可購自Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USA)。適用於本發明之NKTR-214及聚乙二醇化IL-2係描述於美國專利申請公開案第US 2014/0328791 A1號及國際專利申請公開案WO 2012/065086 Al，彼等揭露以引用方式併入本文中。適用於本發明之替代形式的接合IL-2係描述於美國專利第4,766,106、5,206,344、5,089,261及4902,502號，彼等揭露以引用方式併入本文中。適用於本發明之IL-2配方係描述於美國專利第6,706,289號，其揭露以引用方式併入本文中。
用語「IL-4」(在本文中亦稱為「IL4」)係指稱為介白素4的細胞介素，其係藉由Th2 T細胞及藉由嗜酸性球、嗜鹼性球及肥胖細胞產生。IL-4調節初始(naïve)幫手T細胞(Th0細胞)分化成Th2 T細胞。Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70。在IL-4的活化下，Th2 T細胞後續以正向回饋迴圈產生額外IL-4。IL-4亦刺激B細胞增生及第II型MHC表現，且誘導B細胞類型轉換至表現IgE及IgG1。適用於本發明之重組人類IL-4可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-211)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人類IL-15重組蛋白質，產品編號Gibco CTP0043)。適用於本發明之重組人類IL-4的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:5)。
用語「IL-7」(在本文中亦稱為「IL7」)係指稱為介白素7的糖基化組織衍生性細胞介素，其可獲自基質細胞及上皮細胞以及樹突細胞。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。IL-7可刺激T細胞的發育。IL-7與IL-7受體(由IL-7受體α及常見γ鏈受體組成的異二聚體)結合，其為對於T細胞在胸腺內的發育及在周邊內的存活而言重要的一系列信號。適用於本發明之重組人類IL-7可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-254)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人類IL-15重組蛋白質，產品編號Gibco PHC0071)。適用於本發明之重組人類IL-7的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:6)。
用語「IL-15」(在本文中亦稱為「IL15」)係指稱為介白素-15的T細胞生長因子，且包括所有形式的IL-2，包括其人類及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-15係描述於例如Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32，其揭露以引用方式併入本文中。IL-15與IL-2共用β及γ傳訊受體次單位。重組人類IL-15係含有114個胺基酸(及一個N端甲硫胺酸)的單一、非糖基化多肽鏈，分子量為12.8 kDa。重組人類IL-15可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-230-b)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人類IL-15重組蛋白質，產品編號34-8159-82)。適用於本發明之重組人類IL-15的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:7)。
用語「IL-21」(在本文中亦稱為「IL21」)係指稱為介白素-21的多效性細胞介素蛋白質，且包括所有形式的IL-21，包括其人類及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-21係描述於例如Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95，其揭露以引用方式併入本文中。IL-21主要由天然殺手T細胞及活化的人類CD4+ T細胞產生。重組人類IL-21係含有132個胺基酸的單一、非糖基化多肽鏈，分子量為15.4 kDa。重組人類IL-21可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (產品編號CYT-408-b)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人類IL-21重組蛋白質，產品編號14-8219-80)。適用於本發明之重組人類IL-21的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:8)。
當指示「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，欲投予之本發明之組成物的精確量可由醫師考慮個體之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移範圍及病患(對象)病況差異判定。通常說明本文所述之包含腫瘤浸潤性淋巴細胞(例如繼代TIL或基因修飾的細胞毒性淋巴細胞)的醫藥組成物可以104 至1011 細胞/kg體重(例如105 至106 、105 至1010 、105 至1011 、106 至1010 、106 至1011 ,107 至1011 、107 至1010 、108 至1011 、108 至1010 、109 至1011 或109 至1010 細胞/kg體重)的劑量投予，包括在該些範圍內的所有整數值。腫瘤浸潤性淋巴細胞(在一些情況下包括基因修飾的細胞毒性淋巴細胞)組成物亦可以這些劑量投予多次。腫瘤浸潤性淋巴細胞(在一些情況下包括基因的)可使用在免疫療法中所公知的輸注技術投予(見例如Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988)。對特定病患而言的最佳劑量及治療方案可輕易地由所屬醫學技術領域中具有通常知識者藉由監測病患的疾病徵候且據此調整治療加以判定。
用語「血液惡性病」係指哺乳動物造血及淋巴組織(包括但不限於血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統的組織)的癌症及腫瘤。血液惡性病亦稱為「液體腫瘤」。血液惡性病包括但不限於急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性淋巴瘤(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性單核球性白血病(AMoL)、何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤。用語「B細胞血液惡性病」係指影響B細胞的血液惡性病。
用語「實質腫瘤」係指組織的異常團塊，通常不含囊腫或液體區域。實質腫瘤可為良性或惡性。用語「實質腫瘤癌」係指惡性、腫瘤性或癌性實質腫瘤。實質腫瘤癌包括但不限於肉瘤、癌(carcinoma)及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。實質腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
用語「液體腫瘤」係指具流體本質之細胞的異常團塊。液體腫瘤癌症包括但不限於白血病、骨髓瘤及淋巴瘤以及其他血液惡性病。獲自液體腫瘤的TIL在本文中亦稱為骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)。
如本文中所使用之用語「微環境」可指整個實質或血液腫瘤微環境或可指在微環境中的個別細胞子集。如本文中所使用之腫瘤微環境係指如Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473所描述之一種「促進腫瘤性轉換、支持腫瘤生長及入侵、保護腫瘤不受宿主免疫力影響、鼓勵治療抗性且提供顯性轉移成長空間的細胞、可溶因子、傳訊分子、細胞外基質及機械刺激」的複雜混合物。雖然腫瘤表現出應被T細胞辨識的抗原，但免疫系統因為微環境的免疫抑制作用而很少進行腫瘤廓清。
如本文中所使用之用語「共投」、「共同投予」、「與...組合投予」、「同時」及「併用」涵蓋投予二或更多種活性醫藥成分(在本發明之較佳實施態樣中，例如至少一種鉀通道促效劑與複數個TIL之組合)至對象，以使兩種活性醫藥成分及/或彼等之代謝物同時存在於對象中。共投包括同時投予分開組成物、在不同時間投予分開組成物或投予其中有二或更多種活性醫藥成分存在的組成物。同時投予分開組成物及投予其中有兩種藥劑存在的組成物係為較佳。
用語「有效量」或「治療有效量」係指足以致效意圖應用包括但不限於疾病治療之如本文中描述之化合物或化合物組合的量。治療有效量可依意圖應用(體外或體內)或所欲治療之對象及疾病病況(例如對象的體重、年齡及性別)、疾病病況的嚴重性或投予方式而異。該用語亦適用於將誘導目標細胞中之特定反應(例如減少血小板黏著性及/或細胞遷移)的劑量。明確劑量將視所選之特定化合物、所遵循之給藥方案、化合物是否與其他化合物組合投予、投予時間點、其欲投予之組織及攜帶化合物之物理遞送系統而異。
用語「治療」及類似用語係指獲得所欲藥理學及/或生理學效應。該效應可為預防性，也就是完全或部分預防疾病或其症狀，及/或該效應可為治療性，也就是部分或完全治癒疾病及/或疾病帶來的不良影響。此處使用之用語「治療」及其文法相等用語包含對哺乳動物特別是人的疾病的任何治療，包括：(a)預防疾病發生於好發該疾病但未診斷為發生該疾病之個體；(b)抑制該疾病，即停止其發展或進展；及(c)緩解該疾病，即造成該疾病消退及/或其緩解一或多種疾病症狀。「治療」亦涵蓋遞送藥劑以提供藥理學效應，甚至在疾病或病況不存在下。例如，「治療」涵蓋遞送可在疾病病況不存在下誘發免疫反應或授予免疫力之組成物，例如以疫苗為例。
當用語「異源性」用於指稱核酸或蛋白質的部分時，表示該核酸或蛋白質包含二或更多個在天然中不具有相同相互關係的子序列。舉例而言，該核酸一般為重組產生且具有二或更多個來自不相關基因且經排列以製造新的功能性核酸的序列，例如啟動子來自一個來源且編碼區域來自另一來源，或編碼區域來自不同來源。類似地，異源性蛋白質表示該蛋白質包含二或更多個在天然中不具有相同相互關係的子序列(例如融合蛋白質)。
在提及二或多個核酸或多肽時，用語「序列一致性(sequence identity)」、「一致性百分比(percent identity)」及「序列一致性百分比(sequence percent identity)」(或其同義用語，例如「99%一致性」)係指當二或更多個序列或子序列經比較及排比(需要時導入間格)以達最高對應性且不把任何保守性胺基酸取代當作序列一致性之部分時，該二或多個序列或子序列係相同或具有相同之特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基。一致性百分比可利用序列比較軟體或演算法測量，或藉由目視檢查測量。各種演算法及軟體係所屬技術領域中已知，可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之排比。可判定序列一致性百分比之合適程式包括例如可得自美國政府的國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information) BLAST網站的BLAST套裝程式。兩個序列之間的比較可使用BLASTN或BLASTP演算法進行。BLASTN是用來比較核酸序列，而BLASTP是用來比較胺基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(Genentech, South San Francisco, California)或MegAlign(可得自DNASTAR)是其他可供大眾使用的排比序列軟體程式。所屬技術領域中具有通常知識者可判定用於特定排比軟體以求最大排比的適當參數。在某些實施態樣中，使用排比軟體的內建參數。
如本文中所使用，用語「變體」涵蓋但不限於包含與參考抗體的胺基酸序列不同之胺基酸序列的抗體或融合蛋白質，該不同處在於在該參考抗體的胺基酸序列之內或相鄰的某些位置有一或多個取代、刪除及/或添加。相較於參考抗體的胺基酸序列，變體的胺基酸序列中可包含一或多個保守性取代。保守性取代可涉及例如類似地帶電或不帶電胺基酸的取代。變體保留與參考抗體之抗原特異性結合的能力。用語變體亦包括聚乙二醇化抗體或蛋白質。
在本文中的「腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes)」或「TIL」是指一群原本是白血球的細胞，這些細胞離開對象的血流且遷移至腫瘤中。TIL包括但不限於CD8+細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1及Th17 CD4+ T細胞、天然殺手細胞、樹突細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初代及繼代TIL。「初代TIL」是該些如本文概述之獲自病患組織樣本的細胞(有時稱為「新鮮收集(freshly harvested)」)，而「繼代TIL」是任何經本文所述之擴增或增生的TIL細胞群，包括但不限於主體TIL、擴增TIL(「REP TIL」)以及如此處討論的「reREP TIL」。reREP TIL可包括例如第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖27步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)。
TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌)定義，或可藉由彼等浸潤腫瘤及致效治療的能力之功能性定義。TIL通常可藉由表現一或多種下列生物標記來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。此外且替代地，TIL可藉由彼等重新導入病患體內後浸潤實質腫瘤的能力來進行功能性定義。TILS可進一步藉由效力表徵-例如，如果例如干擾素(IFN)釋放大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL，則TILS可被認為有效。
用語「醫藥上可接受之載劑」或「醫藥上可接受之賦形劑」意圖包括任何及所有溶劑、分散介質、包覆劑、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑、吸收延緩劑及惰性成分。活性醫藥成分所使用的該等醫藥上可接受之載劑或醫藥上可接受之賦形劑係所屬技術領域中廣知的。除非任何習用醫藥上可接受之載劑或醫藥上可接受之賦形劑與活性醫藥成分不相容，彼於本發明之治療組成物中之用途係經考慮。額外活性醫藥成分(諸如其他藥物)亦可併入所述之組成物及方法中。
用語「約」或「大約」係指在一數值之具統計意義之範圍內。該範圍可在給定數值或範圍之一數量級之內，較佳在50%以內，更佳在20%以內，又更佳在10%以內，甚至更佳在5%以內。用語「約」或「大約」所包含之允許偏差依特定研究系統而定，且可被該領域之一般技藝人士輕易地了解。再者，如本文中所使用之用語「約」及「大約」意指尺寸、大小、配方、參數、形狀及其他數量及特徵並不確切而且不需要確切，但可視需要為近似值及/或較大或較小值，反映出公差、轉換因子、四捨五入、測量誤差及類似值及所屬技術領域中具有通常知識者已知之其他因子。一般來說，尺寸、大小、配方、參數、形狀或其他數量或特徵皆為「約」或「大約」，無論是否如此明白說明。已注意到非常不同大小、形狀及尺寸的實施態樣可採用所述的安排。
當轉折語「包含」、「基本上由...組成(consisting essentially of)」及「由...組成(consisting of)」以原始及修改形式用於隨附申請專利範圍中時，其就請求範圍定義有關於哪些未引述之額外請求元件或步驟(若有的話)被排除於請求項之範圍之外。用語「包含」意圖為包括性或開放式且不排除任何額外、未引述元件、方法、步驟或材料。用語「由...組成」排除任何不在請求項中指明之元件、步驟或材料，且在後者情況中排除與所指明之材料尋常相關之雜質。用語「基本上由…組成」將請求項的範圍限制在所指明的元件、步驟或材料及該些實質上不影響所主張發明之基本及新穎特徵者。本文所述之體現本發明之所有組成物、方法及套組可在替代性實施態樣中藉由任何轉折語「包含」、「基本上由...組成」及「由...組成」更具體地定義。 治療癌症之方法
本文所述之涉及TIL(及其群)之組成物及方法可用於治療過度增生性病症之方法。在一較佳實施態樣中，彼等用於治療癌症。在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症係轉移性黑色素瘤。在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症係轉移性雙重難治性黑色素瘤。
根據本發明之治療轉移性雙重難治性黑色素瘤之方法包括向有需要該治療之病患投予衍生自該病患自身腫瘤的治療性TIL群(自體細胞產物)。在某些實施態樣中，細胞產物係由≥90%的CD45+ CD3+ T細胞構成。在一些實施態樣中，細胞產物係由≥80%、≥85%、≥90%、≥96%、≥97%、≥98%或≥99%的CD45+ CD3+ T細胞構成。天然殺手(NK)細胞及B細胞可存在於細胞產物中，但通常代表小於5%、小於4%、小於3%、小於2%或小於1%之細胞產物中的總細胞。
就本文所述之任何治療方法而言，TIL療法之投予途徑通常是靜脈內輸注。如在本文中進一步詳細描述，此TIL之投予是在二或更多次現有的全身性療法之後進行。此TIL療法之投予亦可在非骨髓清除式淋巴細胞耗盡療法諸如環磷醯胺及/或氟達拉濱之後進行。在進一步實施態樣中，IL-2係在TIL療法之後向病患投予。
將會理解，在本文所述之治療方法中使用的TIL可使用所屬技術領域中已知及本文所述之方法獲得及處理。在某些例示性實施態樣中，本發明之治療方法中所使用之治療性TIL群係自轉移性雙重難治性黑色素瘤病患部分切除的腫瘤擴增。因此，治療性TIL群係「衍生自」病患腫瘤的TIL。擴增方法將在進一步實施態樣中描述，包括諸如該些在本文中「擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法」一節中所述之擴增。簡言之，該等方法包括步驟：自病患部分切除腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群；碎斷腫瘤；使腫瘤片段與第一細胞培養基接觸以擴增該第一TIL群成為第二TIL群；使第二TIL群與含有IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)的細胞培養基接觸，以執行該第二TIL群的擴增以獲得第三TIL群，其中治療有效部分的該第三TIL群可投予至病患。一般來說，將第二細胞群擴增為第三(治療性)細胞群係執行一段14天或更少天的期間。在額外實施態樣中，擴增TIL之方法包括該些在同在審查中之申請案WO2018/081473(2017年10月26日提出)、PCT/US2018/012605(2018年1月5日提出)及PCT/US18/12633(2018年1月5日提出)中所例示者，其各者整體以引用方式併入本文中以達所有目的且特別是有關自腫瘤樣本擴增TIL之方法之所有教示。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症係轉移性雙重難治性皮膚黑色素瘤。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症係轉移性雙重難治性葡萄膜(眼睛)黑色素瘤。
如在本文中進一步詳細討論，用語「雙重難治性黑色素瘤」涵蓋為二或更多種現有全身性療法所難治之黑色素瘤。為現有全身性療法所難治係指病患在接受現有全身性療法之後無反應或已進展。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為至少二種現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤，其中該二種現有系統性療法不包括新輔助或輔助療法諸如干擾素α。將會理解，新輔助療法涵蓋作為第一步驟給予以在給予主要治療之前減少腫瘤大小的療法。將會進一步理解的是，輔助療法包括在主要治療之後給予以降低癌症復發風險的額外癌症治療。本揭露發明包含在至少二種現有主要療法之後黑色素瘤無反應或已進展之後作為第三、第四或第五線療法的TIL治療。在進一步實施態樣中，病患在根據本文所述之方法接受TIL治療之前，已接受一種額外的現有線上全身性療法治療。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為至少二種不包括新輔助或輔助療法諸如干擾素α之現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤，其中含有多種藥劑(諸如伊匹單抗及尼沃魯單抗)或併投多種經核准或實驗性療法的現有全身性療法計算為單一種現有全身性療法。換句話說，該二種現有全身性療法可包括涉及二或更多種療法之組合治療的主要療法，該二或更多種療法被認為是單一療法。將會理解，這些組合療法可包括相同類型療法之組合(諸如二種檢查點抑制劑)，或者它們可包括通常一起提供作為單一療法的不同類型療法(諸如輻射及化學治療劑)。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1)檢查點抑制劑及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1) BRAF抑制劑及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤。在一進一步實施態樣中，該至少一種其他現有全身性療法是檢查點抑制劑，且在仍進一步實施態樣中，該檢查點抑制劑是PD-1抑制劑。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1)檢查點抑制劑及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤，其中該一種其他現有全身性療法係療法組合。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1) PD-1抑制劑及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤。在一進一步實施態樣中，病患在根據本發明接受TIL治療之前，接受過不多於4劑的PD-1抑制劑。在仍進一步實施態樣中，病患在根據本發明接受TIL治療之前，接受過不多於10、9、8、7、6、5、4、3或2劑的PD-1抑制劑。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1) PD-L1抑制劑及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1) CTLA-4抑制劑及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1) PD-1抑制劑及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤，其中該一種其他現有全身性療法係療法組合。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1) PD-L1抑制劑及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤，其中該一種其他現有全身性療法係療法組合。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1) CTLA-4抑制劑及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤，其中該一種其他現有全身性療法係療法組合。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1)檢查點抑制劑及(2)阿地介白素或其生物類似物或變體包括聚乙二醇化IL-2所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為作為分開現有療法給予的至少二種檢查點抑制劑所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1)派姆單抗或其生物類似物或變體及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1)尼沃魯單抗或其生物類似物或變體及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1)伊匹單抗或其生物類似物或變體及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1)尼沃魯單抗與伊匹單抗之組合或其生物類似物或變體及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1)檢查點抑制劑及(2)阿地介白素或其生物類似物或變體包括聚乙二醇化IL-2所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1)派姆單抗或其生物類似物或變體及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤，其中該一種其他現有全身性療法係療法組合。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1)尼沃魯單抗或其生物類似物或變體及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤，其中該一種其他現有全身性療法係療法組合。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1)伊匹單抗或其生物類似物或變體及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤，其中該一種其他現有全身性療法係療法組合。
在一較佳實施態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症為(1)尼沃魯單抗與伊匹單抗之組合或其生物類似物或變體及(2)至少一種其他現有全身性療法所難治的轉移性雙重難治性黑色素瘤，其中該一種其他現有全身性療法係療法組合。
在任何前述實施態樣中，轉移性雙重難治性黑色素瘤可為皮膚的轉移性雙重難治性黑色素瘤。
如在本文中進一步詳細描述，在本發明之任何治療方法中使用的治療性TIL群可為冷凍保存或非冷凍保存的。冷凍保存的TIL係根據所屬技術領域中已知之方法或如在本文中所進一步詳細描述者產生。
根據任何上述實施態樣，雙重難治性轉移性黑色素瘤可為PD-1抑制劑所難治，該PD-1抑制劑可包括例如靶向PD-1之抗體，例如但不限於尼沃魯單抗(BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®)、派姆單抗(lambrolizumab, MK03475或MK-3475, Merck; Keytruda®)、人化抗PD-1抗體JS001 (ShangHai JunShi)、單株抗PD-1抗體TSR-042 (Tesaro, Inc.)、匹利珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317 (BeiGene)及/或抗PD-1抗體SHR-1210 (ShangHai HengRui)、人類單株抗體REGN2810 (Regeneron)、人類單株抗體MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb)及/或人化抗PD-1 IgG4抗體PDR001 (Novartis)。在一些實施態樣中，PD-1抗體來自克隆：RMP1-14(大鼠IgG)- BioXcell產品編號BP0146。其他PD-1抗體包括該些揭示於美國專利第8,008,449號者，其以引用方式併入本文中。在一些實施態樣中，抗體或其抗原結合部分與PD-L1特異性結合且抑制其與PD-1的交互作用，藉此增加免疫活性。任何所屬技術領域中已知之與PD-L1結合且打斷PD-1與PD-L1之間的交互作用且刺激抗腫瘤免疫反應的抗體亦可在難治雙重難治性黑色素瘤的全身性療法中。例如，靶向PD-L1且在臨床試驗中或經核准且市售的抗體包括艾維路單抗(EMD Serono, Pfizer, Bavencio®)、德瓦魯單抗(MEDI4736, AstraZeneca, Imfinzi®)、BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)及阿特珠單抗(MPDL3280A, Genentech, Tecentriq®)。其他靶向PD-L1的合適抗體揭示於美國專利第7,943,743號，其以引用方式併入本文中。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，任何與PD-1或PD-L1結合、打斷PD-1/PD-L1交互作用且刺激抗腫瘤免疫反應的抗體皆可當作難治根據本發明之方法所治療的黑色素瘤的療法。
類似地，根據本文所述之方法治療的黑色素瘤可為BRAF抑制劑所難治，該BRAF抑制劑包括但不限於直接影響BRAF蛋白質的抑制劑或影響MEK的抑制劑。BRAF抑制劑包括但不限於威羅菲尼(Zelboraf®)及達拉菲尼(Tafinlar®)，以及GDC-0879、PLX-4720或索拉非尼(Nexavar®)。MEK抑制劑包括但不限於曲美替尼(Mekinist®)及考比替尼(Cotellic®)。
在某些實施態樣中且根據任何本文所述之實施態樣，根據所述發明治療的病患可擁有指示對某種類型的治療具感受性或抗性的基因組成(或具有擁有該基因組成的腫瘤)。例如，病患可顯示低PDL1表現，或他們可能(或可能不)擁有BRAF基因的突變。在特定實施態樣中，本文所述之雙重難治性黑色素瘤的治療對於BRAF狀態(例如在BRAF基因中存在或不存在突變)不敏感/不可知(agnostic)。在一些實施態樣中，病患可展現對PD-1或PD-L1抑制劑具抗性的黑色素瘤。對PD-1及PD-L1抑制劑具抗性的機制係所屬技術領域中已知，包括基於編碼Janus激酶1及Janus激酶2蛋白質突變的基因內突變的抗性及基於編碼β-2-微球蛋白的基因內突變的抗性，以及其他描述於例如Zaretsky,et al., Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma,N. Engl. J. Med. 2016 ,375 , 819-29中的突變，其揭露以引用方式併入本文中。
根據以上討論的任何實施態樣，提供給雙重難治性黑色素瘤病患的TIL療法可包括單獨用治療性TIL群治療或可包括組合治療，該組合治療包括TIL及一或多種其他療法。例如，在一些實施態樣中，如本文中描述產生之TIL可與一或多種免疫檢查點調節劑(諸如以下描述之抗體)組合投予。例如，靶向PD-1且可與本發明之TIL共同投予之抗體包括例如但不限於尼沃魯單抗(BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®)、派姆單抗(lambrolizumab, MK03475或MK-3475, Merck; Keytruda®)、人化抗PD-1抗體JS001 (ShangHai JunShi)、單株抗PD-1抗體TSR-042 (Tesaro, Inc.)、匹利珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317 (BeiGene)及/或抗PD-1抗體SHR-1210 (ShangHai HengRui)、人類單株抗體REGN2810 (Regeneron)、人類單株抗體MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb)及/或人化抗PD-1 IgG4抗體PDR001 (Novartis)。在一些實施態樣中，PD-1抗體來自克隆：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell產品編號BP0146。其他適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中的合適抗體為抗PD-1抗體，其揭示於美國專利第8,008,449號(以引用方式併入本文中)。在一些實施態樣中，抗體或其抗原結合部分與PD-L1特異性結合且抑制其與PD-1的交互作用，藉此增加免疫活性。任何所屬技術領域中已知之與PD-L1結合且打斷PD-1與PD-L1之間的交互作用且刺激抗腫瘤免疫反應的抗體皆適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中。例如，靶向PD-L1且在臨床試驗中或經核准且市售的抗體包括艾維路單抗(EMD Serono, Pfizer, Bavencio®)、德瓦魯單抗(MEDI4736, AstraZeneca, Imfinzi®)、BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb)及阿特珠單抗(MPDL3280A, Genentech, Tecentriq®)。其他靶向PD-L1的合適抗體揭示於美國專利第7,943,743號，其以引用方式併入本文中。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，任何與PD-1或PD-L1結合、打斷PD-1/PD-L1交互作用且刺激抗腫瘤免疫反應的抗體皆適用於與TIL共投之方法中。在一些實施態樣中，當病患對於單獨抗PD-1抗體治療已進展或無反應時，對於投予TIL組合的病患共投抗PD-1抗體。類似地，TIL療法可與其他療法共同投予，諸如CTLA-4抑制劑、BRAF抑制劑及任何其他所屬技術領域中已知可用於治療黑色素瘤之療法。
將會理解且根據任何上述之治療方法，本文所述之任何額外的治療方案(包括BRAF抑制劑、MEK抑制劑、PD-1抑制劑、PD-L1抑制劑及CTLA-4抑制劑)包括該等抑制劑的任何實施態樣以及彼等之任何醫藥上可接受之鹽。
在一實施態樣中，經在本文中揭示之TIL療法治療的病患展現相較於從歷史對照組預期的反應改善的反應，其中改善的反應判定為整體反應率。在一實施態樣中，經在本文中揭示之TIL療法治療的病患展現相較於從歷史對照組預期的反應改善的反應，其中改善的反應判定為整體反應率，其中整體反應率的改善為至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%或至少50%。在一實施態樣中，經在本文中揭示之TIL療法治療的病患展現相較於從歷史對照組預期的反應改善的反應，其中改善的反應判定為反應持續時間。在一實施態樣中，經在本文中揭示之TIL療法治療的病患展現相較於從歷史對照組預期的反應改善的反應，其中改善的反應判定為反應持續時間，其中反應持續時間的改善為至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%或至少50%。 以化療進行非骨髓清除式淋巴細胞耗盡
實驗發現指示在授受性轉移腫瘤特異性T淋巴細胞之前，藉由清除調節T細胞且競爭免疫系統的元件(「細胞介素匯(cytokine sinks)」)進行淋巴細胞耗盡扮演增強治療療效的關鍵角色。因此，本發明之一些實施態樣在導入本發明之TIL之前，對病患進行淋巴細胞耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調理」)。
在一實施態樣中，本發明提供用TIL群治療雙重難治性黑色素瘤之方法，其中病患在輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施態樣中，非骨髓清除式化療包括一或多種化學治療劑。在一實施態樣中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2/d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一實施態樣中，在根據本揭露之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，病患每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2的靜脈內輸注至生理耐受。在進一步實施態樣中，IL-2在TIL輸注後的3到24小時之間投予。在又進一步實施態樣中，IL-2在TIL輸注後的3至30、5至25、7至20、9至15小時後投予。在仍進一步實施態樣中，IL-2在TIL輸注後的5天內每8至12小時投予500,000；550,000；600,000；650,000；700,000；750,000；800,000 IU/kg至生理耐受。
一般來說，淋巴細胞耗盡係使用氟達拉濱或環磷醯胺(活性形式稱為馬磷醯胺)及其組合的投予達成。該等方法描述於Gassner,et al., Cancer Immunol. Immunother .2011 ,60, 75-85、Muranski,et al. ,Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681、Dudley,et al. ,J. Clin. Oncol. 2008 ,26, 5233-5239及Dudley,et al. ,J. Clin. Oncol. 2005 ,23, 2346-2357，所有全文皆以引用方式併入本文中。
在一些實施態樣中，氟達拉濱係以0.5 μg/mL至10 μg/mL氟達拉濱之濃度投予。在一些實施態樣中，氟達拉濱係以1 μg/mL氟達拉濱之濃度投予。在一些實施態樣中，氟達拉濱治療係投予1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施態樣中，氟達拉濱係以10 mg/kg/天、15 mg/kg/天、20 mg/kg/天、25 mg/kg/天、30 mg/kg/天、35 mg/kg/天、40 mg/kg/天或45 mg/kg/天之劑量投予。在一些實施態樣中，氟達拉濱治療係以35 mg/kg/天投予2至7天。在一些實施態樣中，氟達拉濱治療係以35 mg/kg/天投予4至5天。在一些實施態樣中，氟達拉濱治療係以25 mg/kg/天投予4至5天。
在一些實施態樣中，藉由投予環磷醯胺獲得0.5 μg/mL至10 μg/mL之濃度的馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施態樣中，藉由投予環磷醯胺獲得1 μg/mL之濃度的馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施態樣中，環磷醯胺治療係投予1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施態樣中，環磷醯胺係以100 mg/m2 /天、150 mg/m2 /天、175 mg/m2 /天、200 mg/m2 /天、225 mg/m2 /天、250 mg/m2 /天、275 mg/m2 /天或300 mg/m2 /天之劑量投予。在一些實施態樣中，環磷醯胺係經靜脈內投予(即i.v.)。在一些實施態樣中，環磷醯胺治療係以35 mg/kg/天投予2至7天。在一些實施態樣中，環磷醯胺治療係以250 mg/m2 /天i.v.投予4至5天。在一些實施態樣中，環磷醯胺治療係以250 mg/m2 /天i.v.投予4天。
在一些實施態樣中，淋巴細胞耗盡係藉由一起投予氟達拉濱及環磷醯胺至病患執行。在一些實施態樣中，氟達拉濱係以25 mg/m2 /天i.v.投予且環磷醯胺係以250 mg/m2 /天i.v.投予4天。
在一實施態樣中，淋巴細胞耗盡係藉由投予環磷醯胺且劑量為60 mg/m2 /天共二天，隨後投予氟達拉濱且劑量為25 mg/m2 /天共五天執行。 擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法
含有一些這些特徵的例示性TIL過程(稱為過程2A)係描繪於圖19，且本發明之此實施態樣的一些優於過程1C的優點係描述於圖F及G。過程2A之一實施態樣係顯示於圖18。
如本文中所討論，本發明可包括關於再刺激冷凍保存的TIL的步驟，以增加彼等的代謝活性及因此在移植至病患中之前的相對健康，以及測試該代謝健康之方法。如在本文中大致概述，TIL通常取自病患樣本且經操作以在移植至病患中之前擴增彼等之數量。在一些實施態樣中，TIL可選地可經如下討論之基因操作。
在一些實施態樣中，TIL可經冷凍保存。一旦解凍後，彼等亦可經再刺激以在輸注至病患中之前增加彼等之代謝。
在一些實施態樣中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，第一擴增(包括稱為REP前之過程以及圖18步驟A所示之過程)縮短至3至14天且第二擴增(包括稱為REP之過程以及圖18步驟B所示之過程)縮短至7至14天。在一些實施態樣中，第一擴增(例如，圖18步驟B所述之擴增)縮短至11天且第二擴增(例如，圖18步驟D所述之擴增)縮短至11天。在一些實施態樣中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，第一擴增與第二擴增(例如，如圖18步驟B及步驟D所描述之擴增)之組合縮短至22天。
以下的「步驟」代號A、B、C等參照圖18且參照本文所述之某些實施態樣。以下及圖18中的步驟順序為例示性且步驟的任何組合或順序以及額外步驟、重複步驟及/或步驟省略皆在本申請案及在本文中揭示之方法考慮。步驟 A ：獲得病患腫瘤樣本
一般來說，TIL最初獲自病患腫瘤樣本(「初代TIL」)且接著擴增成較大群以進行如本文中描述之進一步操作，可選地冷凍保存、如本文概述之再刺激及可選地評估表型及代謝參數作為TIL健康的指標。
病患腫瘤樣本可使用所屬技術領域中已知之方法獲得，通常經由手術部分切除、針吸活體組織切片或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣本的手段。一般來說，腫瘤樣本可來自任何實質腫瘤，包括原發性腫瘤、侵入性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病的腫瘤。實質腫瘤可為任何癌症種類，包括但不限於乳癌、胰癌、前列腺癌、結直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包括但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。在一些實施態樣中，有用的TIL獲自惡性黑色素瘤腫瘤，因為報告指出這些腫瘤具有特別高含量的TIL。
用語「實質腫瘤」係指組織的異常團塊，通常不含囊腫或液體區域。實質腫瘤可為良性或惡性。用語「實質腫瘤癌」係指惡性、腫瘤性或癌性實質腫瘤。實質腫瘤癌包括但不限於肉瘤、癌(carcinoma)及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、乳癌、三陰性乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。在一些實施態樣中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸癌(包括例如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。實質腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
用語「血液惡性病」係指哺乳動物造血及淋巴組織(包括但不限於血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統的組織)的癌症及腫瘤。血液惡性病亦稱為「液體腫瘤」。血液惡性病包括但不限於急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性淋巴瘤(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性單核球性白血病(AMoL)、何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤。用語「B細胞血液惡性病」係指影響B細胞的血液惡性病。
一旦獲得，腫瘤樣本通常使用銳器分割碎斷成介於1至約8 mm3 之間的小片，且約2至3 mm3 特別有用。TIL係自這些片段使用酶性腫瘤消化物培養。該等腫瘤消化物可藉由在酶性介質(例如Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640緩衝劑、2 mM麩胺酸、10 mcg/mL建它黴素、30單位/mL的DNA酶及1.0 mg/mL的膠原酶)中孵養，隨後機械解離(例如使用組織解離器)產生。腫瘤消化物可藉由將腫瘤放入酶性介質中且機械解離腫瘤大約1分鐘，隨後在37℃下在5% CO2 中孵養30分鐘，隨後在前述條件下重複機械解離及孵養循環直到只有小組織片存在而產生。在此過程結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用FICOLL分支親水性多醣執行密度梯度分離以移除這些細胞。可使用所屬技術領域中已知之替代方法，諸如該些在美國專利申請公開案第2012/0244133 A1號中描述者，其揭露以引用方式併入本文中。任何前述方法可用於本文所述之任何實施態樣中之擴增TIL之方法或治療癌症之方法。
一般來說，將收集到的細胞懸浮液稱為「初代細胞群」或「新鮮收集」細胞群。
在一些實施態樣中，碎斷包括物理碎斷，包括例如分割以及消化。在一些實施態樣中，碎斷係物理碎斷。在一些實施態樣中，碎斷係分割。在一些實施態樣中，碎斷係藉由消化。在一些實施態樣中，TIL最初可自獲自病患的酶性腫瘤消化物及腫瘤片段培養。在一實施態樣中，TIL最初可自獲自病患的酶性腫瘤消化物及腫瘤片段培養。
在一些實施態樣中，當腫瘤是實質腫瘤時，在例如(如圖18中提供的)步驟A中獲得腫瘤樣本後，腫瘤進行物理碎斷。在一些實施態樣中，碎斷發生在冷凍保存之前。在一些實施態樣中，碎斷發生在冷凍保存之後。在一些實施態樣中，碎斷發生在獲得腫瘤之後且不進行任何冷凍保存。在一些實施態樣中，將腫瘤碎斷並將10、20、30、40或更多個片段或片放入各容器進行第一擴增。在一些實施態樣中，將腫瘤碎斷並將30或40個片段或片放入各容器進行第一擴增。在一些實施態樣中，將腫瘤碎斷並將40個片段或片放入各容器進行第一擴增。在一些實施態樣中，多個片段包含約4至約50個片段，其中各片段具有約27 mm3 的體積。在一些實施態樣中，多個片段包含約30至約60個片段，其總體積約為1300 mm3 至約1500 mm3 。在一些實施態樣中，多個片段包含約50個片段，其總體積約為1350 mm3 。在一些實施態樣中，多個片段包含約50個片段，其總質量約為1克至約1.5克。在一些實施態樣中，多個片段包含約4個片段。
在一些實施態樣中，TIL係獲自腫瘤片段。在一些實施態樣中，腫瘤片段係藉由銳器分割獲得。在一些實施態樣中，腫瘤片段係介於約1 mm3 與10 mm3 之間。在一些實施態樣中，腫瘤片段係介於約1 mm3 與8 mm3 之間。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約1 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約2 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約3 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約4 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約5 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約6 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約7 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約8 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約9 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤片段係約10 mm3 。在一些實施態樣中，腫瘤係1-4 mmx 1-4 mm x 1-4 mm。在一些實施態樣中，腫瘤係1 mmx 1 mm x 1 mm。在一些實施態樣中，腫瘤係2 mmx 2 mm x 2 mm。在一些實施態樣中，腫瘤係3 mmx 3 mm x 3 mm。在一些實施態樣中，腫瘤係4 mmx 4 mm x 4 mm。
在一些實施態樣中，腫瘤經部分切除以最小化各片上出血性、壞死及/或脂肪組織的量。在一些實施態樣中，腫瘤經部分切除以最小化各片上出血性組織的量。在一些實施態樣中，腫瘤經部分切除以最小化各片上壞死組織的量。在一些實施態樣中，腫瘤經部分切除以最小化各片上脂肪組織的量。
在一些實施態樣中，腫瘤碎斷的執行是為了維持腫瘤內部結構。在一些實施態樣中，腫瘤碎斷的執行不包括使用解剖刀執行鋸切動作。在一些實施態樣中，TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施態樣中，腫瘤消化物的產製藉由在例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶的酶介質中孵養，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而成。在將腫瘤放入酶介質後，可將腫瘤機械解離大約1分鐘。接著可將溶液在37℃下在5% CO2 中孵養30分鐘，且接著再次機械打斷大約1分鐘。在37℃下在5% CO2 中再孵養30分鐘後，可將腫瘤機械打斷第三次大約1分鐘。在一些實施態樣中，在第三次機械打斷後如果大片組織仍然存在，則施加1或2次額外機械解離至樣本，不論是否再在37℃下在5% CO2 中孵養30分鐘。在一些實施態樣中，在最終孵養結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用Ficoll執行密度梯度分離以移除這些細胞。
在一些實施態樣中，將第一擴增步驟之前收集到的細胞懸浮液稱為「初代細胞群」或「新鮮收集」細胞群。
在一些實施態樣中，細胞可在樣本收集後可選地冷凍且在進入步驟B描述的擴增之前冷凍儲存，該步驟B在以下進一步詳細描述且在圖18中例示。步驟 B ：第一擴增
在一些實施態樣中，本方法提供獲得年輕TIL，該年輕TIL在投予至對象/病患後能夠增加複製循環且因此相較於較老TIL(即在投予至對象/病患之前已進一步進行更多次複製的TIL)可能提供額外治療好處。年輕TIL的特徵已在文獻中描述，例如Donia, at al.,Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012)；Dudley et al.,Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)；Huang et al.,J Immunother , 28(3):258-267 (2005)；Besser et al.,Clin Cancer Res , 19(17):OF1-OF9 (2013)；Besser et al.,J Immunother 32:415-423 (2009)；Robbins, et al.,J Immunol 2004; 173:7125-7130；Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)；Zhou, et al.,J Immunother , 28:53-62 (2005)；及Tran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)，所有全文皆以引用方式併入本文中。
T及B淋巴細胞的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖18中體現之方法以外的方法)製備的TIL，展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用稱為過程1C之方法(如在圖22及/或圖23所例示者)製備的TIL，展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，在第一擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施態樣中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR) α及/或β的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR) α的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR) β的表現增加。在一些實施態樣中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。
在例如諸如圖18步驟A所述之分割或消化腫瘤片段之後，將所得細胞在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下於含有IL-2的血清中培養。在一些實施態樣中，將腫瘤消化物孵養於2 mL孔中的包含去活化人類AB血清及6000 IU/mL IL-2的介質中。將此初代細胞群培養數天期間(通常3至14天)，導致通常約1×108 主體TIL細胞的主體TIL群。在一些實施態樣中，將此初代細胞群培養7至14天，導致通常約1×108 主體TIL細胞的主體TIL群。在一些實施態樣中，將此初代細胞群培養10至14天，導致通常約1×108 主體TIL細胞的主體TIL群。在一些實施態樣中，將此初代細胞群培養約11天，導致通常約1×108 主體TIL細胞的主體TIL群。
在一較佳實施態樣中，TIL的擴增可使用如以下及本文所述的初始主體TIL擴增步驟(例如諸如該些圖18步驟B中所述者，其可包括稱為REP前的過程)執行，隨後執行如以下步驟D及本文所述的第二擴增(步驟D，包括稱為快速擴增規程(REP)步驟的過程)，隨後執行可選的冷凍保存，及隨後執行如以下及本文所述的第二步驟D(包括稱為再刺激REP步驟的過程)。獲自此過程的TIL可如本文所述之可選地以表型特徵及代謝參數表徵。
在TIL培養起始於24孔板(例如使用Costar 24孔平底細胞培養板(Corning Incorporated, Corning, NY))的實施態樣中，各孔可接種1×106 個腫瘤消化細胞或一個腫瘤片段於含IL-2 (6000 IU/mL; Chiron Corp., Emeryville, CA)的2 mL完全培養基(CM)中。在一些實施態樣中，腫瘤片段係介於約1 mm3 與10 mm3 之間。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施態樣中，步驟B的CM係由補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。在培養起始於具有40 mL容量及10 cm2 氣體可通透矽底的氣體可通透培養瓶(例如G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)的實施態樣中(圖1)，各培養瓶裝載10至40×106 存活腫瘤消化細胞或5至30個腫瘤片段於10至40 mL之含IL-2的CM中。G-Rex10及24孔板皆孵養於37℃下5% CO2 的增濕孵養箱中，在培養起始後5天，將半數介質移除並置換新鮮CM及IL-2，且在第5天後，每2至3天更換半數介質。
在製備腫瘤片段後，將所得細胞(即片段)在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2的血清中。在一些實施態樣中，將腫瘤消化物孵養於2 mL孔中的包含去活化人類AB血清(或在一些如本文概述之情況下，在aAPC細胞群存在下)及6000 IU/mL IL-2的介質中。將此初代細胞群培養數天期間(通常10至14天)，導致通常約1×108 主體TIL細胞的主體TIL群。在一些實施態樣中，在第一擴增期間的生長介質包含IL-2或其變體。在一些實施態樣中，該IL係重組人類IL-2 (rhIL-2)。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有20至30×106 IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有20×106 IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有25×106 IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有30×106 IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液具有4至8×106 IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液具有5至7×106 IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施態樣中，IL- 2儲備溶液具有6×106 IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液係如實例9所述製備。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約10,000 IU/mL的IL-2、約9,000 IU/mL的IL-2、約8,000 IU/mL的IL-2、約7,000 IU/mL的IL-2、約6000 IU/mL的IL-2或約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約9,000 IU/mL的IL-2至約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約8,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約7,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約6,000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-2。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或約8000 IU/mL的IL-2。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15、約400 IU/mL的IL-15、約300 IU/mL的IL-15、約200 IU/mL的IL-15、約180 IU/mL的IL-15、約160 IU/mL的IL-15、約140 IU/mL的IL-15、約120 IU/mL的IL-15或約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約400 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約300 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約200 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-15。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21、約15 IU/mL的IL-21、約12 IU/mL的IL-21、約10 IU/mL的IL-21、約5 IU/mL的IL-21、約4 IU/mL的IL-21、約3 IU/mL的IL-21、約2 IU/mL的IL-21、約1 IU/mL的IL-21或約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約15 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約12 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約10 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約5 IU/mL的IL-21至約1 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約2 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL的IL-21。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-21。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。
在一實施態樣中，細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約30 ng/mL的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一些實施態樣中，細胞培養基不包含OKT-3抗體。在一些實施態樣中，OKT-3抗體係莫羅單抗。
在一些實施態樣中，細胞培養基包含一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑係4-1BB促效劑，且4-1BB促效劑係選自由烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白質及彼等之片段、衍生物、變體、生物類似物及組合所組成之群組。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於0.1 µg/mL與100 µg/mL之間的濃度。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於20 µg/mL與40 µg/mL之間的濃度。
在一些實施態樣中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包含初始濃度約3000 IU/mL的IL-2及初始濃度約30 ng/mL的OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施態樣中，其稱為CM1 (培養基1)。在一些實施態樣中，CM係由補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。在培養起始於具有40 mL容量及10 cm2 氣體可通透矽底的氣體可通透培養瓶(例如G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)的實施態樣中(圖1)，各培養瓶裝載10至40x 106 存活腫瘤消化細胞或5至30個腫瘤片段於10至40mL之含IL-2的CM中。G-Rex10及24孔板皆孵養於37℃下5% CO2 的增濕孵養箱中，在培養起始後5天，將半數介質移除並置換新鮮CM及IL-2，且在第5天後，每2至3天更換半數介質。在一些實施態樣中，CM係實例中所述的CM1。在一些實施態樣中，第一擴增在初始細胞培養基或第一細胞培養基中發生。在一些實施態樣中，初始細胞培養基或第一細胞培養基包含IL-2。
在一些實施態樣中，第一擴增(包括諸如例如該些在圖18步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前者)過程縮短至3至14天，如實例及圖式中所討論。在一些實施態樣中，第一擴增(包括諸如例如該些在圖18步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前者)過程縮短至7至14天，如實例中所討論且顯示於圖4及5，以及包括例如圖18步驟B所述之擴增。在一些實施態樣中，步驟B的第一擴增縮短至10至14天。在一些實施態樣中，第一擴增縮短至11天，如在例如圖18步驟B所述之擴增中所討論。
在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行1天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行3天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行4天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行5天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行6天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行7天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行8天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行9天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行10天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行11天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行12天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行13天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行1天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行2天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行3天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行4天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行5天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行6天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行7天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行8天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行9天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行10天至11天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行11天。
在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第一擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何彼等之組合可被包括在第一擴增期間，包括例如在根據圖18步驟B過程期間以及如本文所述者。在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第一擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何彼等之組合可被包括在根據圖18步驟B過程期間以及如本文所述者。
在一些實施態樣中，第一擴增(包括稱為REP前的過程；例如根據圖18之步驟B)過程縮短至3至14天，如實例及圖式中所討論。在一些實施態樣中，步驟B的第一擴增縮短至7至14天。在一些實施態樣中，步驟B的第一擴增縮短至10至14天。在一些實施態樣中，第一擴增縮短至11天。
在一些實施態樣中，第一擴增(例如根據圖18之步驟B)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用單一生物反應器。在一些實施態樣中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX -10或G-REX -100。在一些實施態樣中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。步驟 C ：第一擴增至第二擴增的轉變
在一些情況下，獲自第一擴增的主體TIL群包括例如獲自例如圖18所示之步驟B的TIL群可使用本文以下討論的規程立即冷凍保存。替代地，獲自第一擴增的TIL群(稱為第二TIL群)可進行第二擴增(其可包括有時稱為REP的擴增)且接著如以下討論進行冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，第一TIL群(有時稱為主體TIL群)或第二TIL群(其在一些實施態樣中可包括稱為REP TIL群的群)可在擴增之前或在第一擴增之後且在第二擴增之前進行基因修飾以用於合適治療。
在一些實施態樣中，獲自第一擴增(例如圖18所示之步驟B)的TIL係經儲存直到為了選擇而測定表型。在一些實施態樣中，獲自第一擴增(例如圖18所示之步驟B)的TIL不經儲存且直接進行第二擴增。在一些實施態樣中，獲自第一擴增的TIL在第一擴增之後且在第二擴增之前不經冷凍保存。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約3天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約4天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約4天至10天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約7天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約14天。
在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的一天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的1天至14天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的3天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的4天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的5天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的6天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的7天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的8天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的9天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的10天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的11天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的12天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的13天至14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的14天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的1天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的2天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的3天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的4天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的5天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的6天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的7天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的8天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的9天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的10天至11天。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的11天。
在一些實施態樣中，TIL在第一擴增之後且在第二擴增之前不經儲存，且TIL直接進行第二擴增(例如在一些實施態樣中，在如圖18所示的從步驟B至步驟D的轉變期間並不經儲存)。在一些實施態樣中，轉變在如本文所述之密閉系統中發生。在一些實施態樣中，來自第一擴增的TIL(第二TIL群)直接進行第二擴增而無轉變期。
在一些實施態樣中，從第一擴增至第二擴增的轉變(例如根據圖18之步驟C)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用單一生物反應器。在一些實施態樣中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX -10或G-REX -100。在一些實施態樣中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。細胞介素
本文所述之擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)的培養基，如所屬技術領域中所知。
替代地，使用細胞介素之組合以進行TIL的快速擴增及/或第二擴增是額外可能的，如同大致上在國際專利公開號WO 2015/189356及國際專利公開號WO 2015/189357中概述的二或更多種IL-2、IL-15及IL-21的組合，特此明白將全文以引用方式併入本文中以達所有目的且特別是與在細胞擴增方法中使用細胞介素有關的所有教示。因此，可能的組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施態樣中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於淋巴細胞產製，且特別是如其中所述的T細胞。 步驟 D ：第二擴增
在一些實施態樣中，TIL細胞群於數量上在收集及初始主體處理(例如圖18所示之步驟A及步驟B)及轉變(稱為步驟C)之後擴增。此進一步擴增在本文中稱為第二擴增，其可包括在所屬技術領域中通常稱為快速擴增過程(REP；如圖18步驟D所示之過程)的擴增過程。第二擴增通常使用包含一些組分(包括餵養細胞、細胞介素來源及抗CD3抗體)的培養基在氣體可通透容器中完成。
在一些實施態樣中，TIL的第二擴增或第二TIL擴增(其可包括有時稱為REP的擴增；如圖18步驟D所示之過程)可使用任何所屬技術領域中具有通常知識者所知之TIL培養瓶或容器執行。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約7天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約8天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約9天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約10天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約11天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約12天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約13天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約14天。
在一實施態樣中，第二擴增可在氣體可通透容器中使用本揭露之方法(包括例如稱為REP之擴增；以及如圖18步驟D所示之過程)執行。例如，TIL可在介白素2 (IL-2)或介白素15 (IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激快速擴增。非特異性T細胞受體刺激可包括例如抗CD3抗體諸如約30 ng/ml的OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA)或UHCT-1(可購自BioLegend, San Diego, CA, USA)。TIL可藉由在第二擴增期間包括一或多種癌症的抗原(包括彼等之抗原性部分諸如表位)來擴增以誘導進一步TIL體外刺激，該等抗原可選地在T細胞生長因子諸如300 IU/mL IL-2或IL-15存在下可選地自載體表現，諸如人類白血球抗原A2 (HLA-A2)結合肽，例如0.3 μM MART-1: 26-35 (27 L)或gpl 00:209-217 (210M)。其他合適抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或彼等之抗原性部分。TIL亦可藉由用脈衝至HLA-A2表現性抗原呈現細胞上的癌症相同抗原再刺激來快速擴增。替代地，TIL可進一步用例如經輻照的自體淋巴細胞或用經輻照的HLA-A2+異體淋巴細胞及IL-2再刺激。在一些實施態樣中，再刺激發生為第二擴增的一部分。在一些實施態樣中，第二擴增在經輻照的自體淋巴細胞或經輻照的HLA-A2+異體淋巴細胞及IL-2的存在下發生。
在一實施態樣中，第二擴增步驟的細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或介於8000 IU/mL的IL-2。
在一實施態樣中，細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約30 ng/mL的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一些實施態樣中，細胞培養基不包含OKT-3抗體。在一些實施態樣中，OKT-3抗體係莫羅單抗。
在一些實施態樣中，細胞培養基包含一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑係4-1BB促效劑，且4-1BB促效劑係選自由烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白質及彼等之片段、衍生物、變體、生物類似物及組合所組成之群組。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於0.1 µg/mL與100 µg/mL之間的濃度。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於20 µg/mL與40 µg/mL之間的濃度。
在一些實施態樣中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包含初始濃度約3000 IU/mL的IL-2及初始濃度約30 ng/mL的OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何彼等之組合可被包括在第二擴增期間，包括例如在根據圖18步驟D過程期間以及如本文所述者。在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何彼等之組合可被包括在根據圖18步驟D過程期間以及如本文所述者。
在一些實施態樣中，第二擴增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈現餵養細胞及可選地TNFRSF促效劑的經補充的細胞培養基中進行。在一些實施態樣中，第二擴增在經補充的細胞培養基中發生。在一些實施態樣中，經補充的細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC；亦稱為抗原呈現餵養細胞)。在一些實施態樣中，第二擴增在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞(即抗原呈現細胞)的細胞培養基中發生。
在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15、約400 IU/mL的IL-15、約300 IU/mL的IL-15、約200 IU/mL的IL-15、約180 IU/mL的IL-15、約160 IU/mL的IL-15、約140 IU/mL的IL-15、約120 IU/mL的IL-15或約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約400 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約300 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約200 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-15。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。
在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21、約15 IU/mL的IL-21、約12 IU/mL的IL-21、約10 IU/mL的IL-21、約5 IU/mL的IL-21、約4 IU/mL的IL-21、約3 IU/mL的IL-21、約2 IU/mL的IL-21、約1 IU/mL的IL-21或約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約15 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約12 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約10 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約5 IU/mL的IL-21至約1 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約2 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL的IL-21。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-21。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。
在一些實施態樣中，抗原呈現餵養細胞(APC)係PBMC。在一實施態樣中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC及/或抗原呈現細胞的比例係約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施態樣中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施態樣中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施態樣中，REP及/或第二擴增係在培養瓶中執行，其中主體TIL與100或200倍過量的去活化餵養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2在150 ml介質中混合。置換介質(通常經由抽吸新鮮介質置換2/3介質)直到細胞轉移至替代性生長室。替代性生長室包括G-REX培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透容器。
在一些實施態樣中，第二擴增(其可包括稱為REP過程的過程)縮短至7至14天，如實例及圖式中所討論。在一些實施態樣中，第二擴增縮短至11天。
在一實施態樣中，REP及/或第二擴增可使用T-175培養瓶及如先前描述之氣體可通透袋子(Tran,et al. ,J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley,et al. ,J. Immunother. 2003, 26, 332-42)或氣體可通透培養器皿(G-Rex培養瓶)執行。在一些實施態樣中，第二擴增(包括稱為快速擴增之擴增)係於T-175培養瓶中執行，且可將懸浮於150 mL的介質中之約1 x 106 TIL添加至各T-175培養瓶中。TIL可培養於CM及AIM-V介質的1比1混合物中，補充有每mL 3000 IU的IL-2及每ml 30 ng的抗CD3。T-175培養瓶可在37° C下在5% CO2 中孵養。一半的介質可在第5天使用含有每mL 3000 IU的IL-2之50/50介質交換。在一些實施態樣中，在第7天可將來自二個T-175培養瓶的細胞組合於3 L袋子中並將300 mL含有5%人類AB血清及每mL 3000 IU的IL-2之AIM V添加至300 ml的TIL懸浮液。各袋中的細胞數量每天或每二天計算一次，且添加新鮮介質以保持細胞計數介於0.5與2.0 x 106 個細胞/mL。
在一實施態樣中，第二擴增(其可包括稱為REP之擴增，以及該些於圖18步驟D中指稱者)可在500 mL容量的具有100 cm氣體可通透矽底之氣體可通透培養瓶(G-Rex 100，可購自Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)中執行，5×106 或10×106 TIL可與PBMC在400 mL的補充有5%人類AB血清、每mL 3000 IU的IL-2及每ml 30 ng的抗CD3 (OKT3)之50/50介質中培養。G-Rex 100培養瓶可在37℃下在5% CO2 中孵養。在第5天，可將250 mL的上清液移除並放入離心瓶且在1500 rpm (491×g)下離心10分鐘。可將TIL團塊用150 mL的含有5%人類AB血清、每mL 3000 IU的IL-2之新鮮介質再懸浮，並添加回原始G-Rex 100培養瓶。當TIL在G-Rex 100培養瓶中連續擴增時，在第7天可將各G-Rex 100中之TIL懸浮於存在於各培養瓶中之300 mL的介質中，且可將細胞懸浮液分成可用於接種3個G-Rex 100培養瓶之3個100 mL等分試樣。接著可將150 mL之含有5%人類AB血清及每mL 3000 IU的IL-2的AIM-V添加至各培養瓶。G-Rex 100培養瓶可在37° C下在5% CO2 中孵養，且在4天之後可將150 mL之含有每mL 3000 IU的IL-2的AIM-V添加至各G-REX 100培養瓶。細胞可在培養的第14天收集。
在一實施態樣中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)係在培養瓶中執行，其中主體TIL與100或200倍過量的去活化餵養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2在150 ml介質中混合。在一些實施態樣中，進行置換介質直到細胞轉移至替代性生長室。在一些實施態樣中，2/3的介質經由抽吸新鮮介質置換。在一些實施態樣中，替代性生長室包括G-REX培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透容器。
在一實施態樣中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)係經執行且進一步包含其中選擇優異腫瘤反應性之TIL的步驟。可使用任何所屬技術領域中已知之選擇方法。例如，美國專利申請公開案第2016/0010058 A1號(其揭露以引用方式併入本文中)所述之方法可用於選擇優異腫瘤反應性之TIL。
可選地，在第二擴增(包括稱為REP擴增之擴增)之後可使用所屬技術領域中已知之標準測定執行細胞存活性測定。例如，可在主體TIL的樣本上進行台盼藍排除測定，其選擇性標示死亡細胞且允許存活性評估。在一些實施態樣中，TIL樣本可使用Cellometer K2自動細胞計數器(Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)計算及判定存活性。
在一些實施態樣中，TIL之第二擴增(包括稱為REP之擴增)可使用如先前描述之T-175培養瓶及氣體可通透袋子(Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al.,2008 ,J Immunother. , 31:742-751及Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003,J Immunother. , 26:332-342)或氣體可通透G-Rex培養瓶執行。在一些實施態樣中，第二擴增使用培養瓶執行。在一些實施態樣中，第二擴增使用氣體可通透G-Rex培養瓶執行。在一些實施態樣中，第二擴增係於T-175培養瓶中執行，且約1 x 106 TIL懸浮於150 mL的介質中且將其添加至各T-175培養瓶中。將TIL與作為「餵養」細胞之經輻照(50 Gy)的異體PBMC以1比100的比例培養，且將細胞培養於補充有3000 IU/mL的IL-2及30 ng/mL的抗CD3之CM與AIM-V介質的1比1混合物(50/50介質)中。T-175培養瓶在37° C下在5% CO2 中孵養。在一些實施態樣中，一半的介質在第5天使用含有3000 IU/mL的IL-2之50/50介質更換。在一些實施態樣中，在第7天將來自2個T-175培養瓶的細胞組合於3 L袋子中，並將300 mL含有5%人類AB血清及3000 IU/mL的IL-2之AIM-V添加至300 mL的TIL懸浮液。各袋中的細胞數量可每天或每二天計算一次，且可添加新鮮介質以保持細胞計數介於約0.5與約2.0 x 106 個細胞/mL。
在一些實施態樣中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)在500 mL容量的具有100 cm2 氣體可通透矽底之培養瓶(G-Rex 100, Wilson Wolf)中執行(圖1)，將約5x106 或10x106 TIL與經輻照的異體PBMC以1至100的比例培養於400 mL的補充有3000 IU/mL的IL-2及30 ng/ mL的抗CD3之50/50介質中。G-Rex 100培養瓶在37℃下在5% CO2 中孵養。在一些實施態樣中，在第5天將250mL的上清液移除並放入離心瓶且在1500 rpm (491g)下離心10分鐘。接著可將TIL團塊用150 mL的含有3000 IU/mL的IL-2之新鮮50/50介質再懸浮，並添加回原始G-Rex 100培養瓶。在將TIL在G-Rex 100培養瓶中連續擴增的實施態樣中，在第7天將各G-Rex 100中之TIL懸浮於存在於各培養瓶中之300 mL的介質中，且將細胞懸浮液分成用於接種3個G-Rex 100培養瓶之三個100 mL等分試樣。接著將150 mL之含有5%人類AB血清及3000 IU/mL的IL-2的AIM-V添加至各培養瓶。G-Rex 100培養瓶在37℃下在5% CO2 中孵養，且在4天之後將150 mL之含有3000 IU/mL的IL-2的AIM-V添加至各G-Rex 100培養瓶。細胞在培養的第14天收集。
T及B淋巴細胞的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，在第二擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施態樣中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR) α及/或β的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR) α的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR) β的表現增加。在一些實施態樣中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。
在一些實施態樣中，第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及如以下更詳細討論之抗原呈現餵養細胞(APC)。
在一些實施態樣中，第二擴增(例如根據圖18之步驟D)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用單一生物反應器。在一些實施態樣中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX -10或G-REX -100。在一些實施態樣中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。 餵養細胞及抗原呈現細胞
在一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序(例如包括諸如該些圖18步驟D所述以及該些稱為REP之擴增)在REP TIL擴增期間及/或在第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施態樣中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。
一般來說，異體PBMC係經由輻照或熱處理去活化，且如實例所述用於REP程序，其提供用於評估輻照異體PBMC的複製不能之例示性規程。
在一些實施態樣中，如果第14天存活細胞總數小於在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量，則認為PBMC是複製不能且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。
在一些實施態樣中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施態樣中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施態樣中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施態樣中，PBMC在5至60 ng/ml OKT3抗體及1000至6000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在10至50 ng/ml OKT3抗體及2000至5000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在20至40 ng/ml OKT3抗體及2000至4000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在25至35 ng/ml OKT3抗體及2500至3500 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施態樣中，抗原呈現餵養細胞係PBMC。在一些實施態樣中，抗原呈現餵養細胞係人工抗原呈現餵養細胞。在一實施態樣中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施態樣中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施態樣中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序需要約2.5x109 餵養細胞對約100x106 TIL的比例。在另一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序需要約2.5x109 餵養細胞對約50x106 TIL的比例。在又一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序需要約2.5x109 餵養細胞對約25x106 TIL。
在一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序在第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施態樣中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一實施態樣中，使用人工抗原呈現(aAPC)細胞代替PBMC。
一般來說，異體PBMC經由輻照或熱處理去活化，且用於本文所述之TIL擴增程序，包括在圖式及實例中所述之例示性程序。
在一實施態樣中，在第二擴增中使用人工抗原呈現細胞置換PBMC或與PBMC組合使用。 細胞介素
本文所述之擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)的培養基，如所屬技術領域中所知。
替代地，使用細胞介素之組合以進行TIL的快速擴增及或第二擴增是額外可能的，如同大致上在國際專利公開號WO 2015/189356及W國際專利公開號WO 2015/189357中概述的二或更多種IL-2、IL-15及IL-21的組合，特此明白將全文以引用方式併入本文中。因此，可能的組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施態樣中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於淋巴細胞產製，且特別是如其中所述的T細胞。步驟 E ：收集 TIL
在第二擴增步驟之後，可收集細胞。在一些實施態樣中，在例如圖18所提供之一、二、三、四或更多個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施態樣中，在例如圖18所提供之二個擴增步驟之後收集TIL。
TIL可以任何適當且無菌之方式收集，包括例如離心。收集TIL之方法係所屬技術領域中廣知的且本過程可採用任何該等已知之方法。在一些實施態樣中，使用自動化系統收集TIL。
細胞收集器及/或細胞處理系統可購自多個來源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及Inotech Biosystems International, Inc.。本方法可採用任何基於細胞的收集器。在一些實施態樣中，細胞收集器及/或細胞處理系統是基於膜的細胞收集器。在一些實施態樣中，細胞收集是經由細胞處理系統諸如LOVO系統(由Fresenius Kabi製造)進行。用語「LOVO細胞處理系統」亦指由任何供應商製造的任何可將包含細胞的溶液泵送通過無菌及/或密閉系統環境中的膜或過濾器諸如旋轉膜或旋轉過濾器的儀器或裝置，允許連續流動及細胞處理以在無需團塊化下移除上清液或細胞培養基。在一些實施態樣中，細胞收集器及/或細胞處理系統可在密閉無菌系統中執行細胞分離、洗滌、流體交換、濃縮及/或其他細胞處理步驟。
在一些實施態樣中，收集(例如根據圖18之步驟E)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用單一生物反應器。在一些實施態樣中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX -10或G-REX -100。在一些實施態樣中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。
在一些實施態樣中，根據圖18之步驟E係根據實例7所述之過程執行。在一些實施態樣中，密閉系統係在無菌條件下經由針筒進入以維持系統的無菌性及密閉特性。在一些實施態樣中，採用如實例7所述的密閉系統。
在一些實施態樣中，根據實例所述之方法收集TIL。步驟 F ：最終調配 / 轉移至輸注袋
在如圖18以例示性順序提供且如以上及本文詳細概述之步驟A至E完成之後，將細胞轉移至容器以用於投予至病患。在一些實施態樣中，一旦使用上述之擴增方法獲得治療足夠數量的TIL後，將彼等轉移至容器以用於投予至病患。
在一實施態樣中，使用本揭露之APC擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至病患。在一實施態樣中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。本揭露之使用PBMC擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施態樣中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內。可選的細胞介質組分 1.　　抗CD3抗體
在一些實施態樣中，用於本文所述之擴增方法(包括該些稱為REP者，見例如圖18)中之培養基亦包括抗CD3抗體。抗CD3抗體與IL-2之組合誘導TIL群中之T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab’)2片段，前者通常較佳；見例如 Tsoukaset al. ,J. Immunol. 1985, 135, 1719，全文特此以引用方式併入本文中。
所屬技術領域中具有通常知識者將會理解，一些合適的抗人類CD3抗體可用於本發明，包括來自各種哺乳動物的抗人類CD3多株及單株抗體，包括但不限於鼠、人類、靈長動物、大鼠及犬抗體。在具體實施態樣中，使用OKT3抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA)。2.　　4-1BB (CD137)促效劑
在一實施態樣中，TNFRSF促效劑係4-1BB (CD137)促效劑。4-1BB促效劑可為任何所屬技術領域中已知之4-1BB結合分子。4-1BB結合分子可為能夠與人類或哺乳動物4-1BB結合之單株抗體或融合蛋白質。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可包含免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞型的免疫球蛋白重鏈。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文中所使用，用語結合分子亦包括抗體(包括全長抗體)、單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人類、人化或嵌合抗體及抗體片段例如Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表現庫產生的片段、任何上述者之表位結合片段、及抗體之經工程改造形式例如與4-1BB結合之scFv分子。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係一種全人類抗體的抗原結合蛋白質。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係一種人化抗體的抗原結合蛋白質。在一些實施態樣中，用於本揭示方法及組成物中之4-1BB促效劑包括抗4-1BB抗體、人類抗4-1BB抗體、小鼠抗4-1BB抗體、哺乳動物抗4-1BB抗體、單株抗4-1BB抗體、多株抗4-1BB抗體、嵌合抗4-1BB抗體、抗4-1BB粘連蛋白、抗4-1BB結構域抗體、單鏈抗4-1BB片段、重鏈抗4-1BB片段、輕鏈抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白質、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體、或生物類似物。已知促效性抗4-1BB抗體可誘導強烈免疫反應。Lee,et al. ,PLOS One 2013 ,8, e69677。在一較佳實施態樣中，4-1BB促效劑係促效性抗4-1BB人化或全人類單株抗體(即衍生自單一細胞系之抗體)。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係EU-101 (Eutilex Co. Ltd.)、烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。在較佳實施態樣中，4-1BB促效劑係烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。
在一較佳實施態樣中，4-1BB促效劑或4-1BB結合分子亦可為融合蛋白質。在一較佳實施態樣中，相較於一般擁有二個配體結合結構域的促效性單株抗體而言，多聚體4-1BB促效劑諸如三聚體或六聚體4-1BB促效劑(具有三個或六個配體結合結構域)可誘導優異的受體(4-1BBL)叢聚及內部細胞性傳訊複合物形成。包含三個TNFRSF結合結構域及IgG1-Fc且可選地進一步連接二或更多個這些融合蛋白質的三聚體(三價)或六聚體(或六價)或更大融合蛋白質係描述於例如Gieffers,et al. ,Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47中。
已知促效性4-1BB抗體及融合蛋白質可誘導強烈免疫反應。在一較佳實施態樣中，4-1BB促效劑係以足以減少毒性之方式與4-1BB抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，4-1BB促效劑係廢除抗體依賴性細胞性毒性(ADCC)例如NK細胞細胞毒性之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，4-1BB促效劑係廢除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，4-1BB促效劑係廢除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，4-1BB促效劑係廢除Fc區功能性之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。
在一些實施態樣中，4-1BB促效劑係由以高親和性及促效性活性與人類4-1BB (SEQ ID NO:9)結合來表徵。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係與人類4-1BB (SEQ ID NO:9)結合之結合分子。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係與鼠4-1BB (SEQ ID NO:10)結合之結合分子。4-1BB促效劑或結合分子所結合之4-1BB抗原的胺基酸序列係總結於表6中。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約100 pM或較低之KD 結合人類或鼠4-1BB、以約90 pM或較低之KD 結合人類或鼠4-1BB、以約80 pM或較低之KD 結合人類或鼠4-1BB、以約70 pM或較低之KD 結合人類或鼠4-1BB、以約60 pM或較低之KD 結合人類或鼠4-1BB、以約50 pM或較低之KD 結合人類或鼠4-1BB、以約40 pM或較低之KD 結合人類或鼠4-1BB或以約30 pM或較低之KD 結合人類或鼠4-1BB之4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人類或鼠4-1BB結合、以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人類或鼠4-1BB結合、以約8×105 l/M·s或更快之k締合 與人類或鼠4-1BB結合、以約8.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人類或鼠4-1BB結合、以約9×105 1/M·s或更快之k締合 與人類或鼠4-1BB結合、以約9.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人類或鼠4-1BB結合或以約1×106 1/M·s或更快之k締合 與人類或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠4-1BB結合、以約2.1×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠4-1BB結合、以約2.2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠4-1BB結合、以約2.3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠4-1BB結合、以約2.4×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠4-1BB結合、以約2.5×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠4-1BB結合、以約2.6×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠4-1BB結合或以約2.7×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠4-1BB結合、以約2.8×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠4-1BB結合、以約2.9×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠4-1BB結合或以約3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約10 nM或較低之IC50 與人類或鼠4-1BB結合、以約9 nM或較低之IC50 與人類或鼠4-1BB結合、以約8 nM或較低之IC50 與人類或鼠4-1BB結合、以約7 nM或較低之IC50 與人類或鼠4-1BB結合、以約6 nM或較低之IC50 與人類或鼠4-1BB結合、以約5 nM或較低之IC50 與人類或鼠4-1BB結合、以約4 nM或較低之IC50 與人類或鼠4-1BB結合、以約3 nM或較低之IC50 與人類或鼠4-1BB結合、以約2 nM或較低之IC50 與人類或鼠4-1BB結合或以約1 nM或較低之IC50 與人類或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在較佳實施態樣中，4-1BB促效劑係烏圖木單抗(亦稱為PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏圖木單抗可得自Pfizer, Inc.。烏圖木單抗係免疫球蛋白G2-λ抗[智人 TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]智人 (全人類)單株抗體。烏圖木單抗之胺基酸序列係如表7所示。烏圖木單抗包含位於Asn59及Asn292之醣化位點；位於位置22至96 (VH -VL )、143至199 (CH 1-CL )、256至316 (CH 2)及362至420 (CH 3)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置22’至87’ (VH -VL )及136’至195’ (CH 1-CL )之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於IgG2A異構體位置218至218、219至219、222至222及225至225、位於IgG2A/B異構體位置218至130、219至219、222至222及225至225、及位於IgG2B異構體位置219至130 (2)、222至222及225至225之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於IgG2A異構體位置130至213’ (2)、IgG2A/B異構體位置218至213’及130至213’及位於IgG2B異構體位置218至213’ (2)之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏圖木單抗及其變體及片段之製備及特性係描述於美國專利第8,821,867、8,337,850及9,468,678號及國際專利申請公開案WO 2012/032433 A1，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。烏圖木單抗之臨床前特徵係描述於Fisher,et al. ,Cancer Immunolog. & Immunother. 2012, 61, 1721-33。目前烏圖木單抗在多種血液及實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health) clinicaltrials.gov識別號NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066及NCT02554812。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含由SEQ ID NO:11給出之重鏈及由SEQ ID NO:12給出之輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含烏圖木單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，4-1BB促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:13所示之序列且4-1BB促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:14所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:20所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係藥物管理機構參照烏圖木單抗所核准的4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含4-1BB抗體，該4-1BB抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。4-1BB促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。
在較佳實施態樣中，4-1BB促效劑係單株抗體烏瑞魯單抗(亦稱為BMS-663513及20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏瑞魯單抗可得自Bristol-Myers Squibb, Inc.及Creative Biolabs, Inc.。烏瑞魯單抗係免疫球蛋白G4-κ抗[智人 TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]智人 (全人類)單株抗體。烏瑞魯單抗之胺基酸序列係如表7所示。烏瑞魯單抗包含位於位置298(及298’’)之N-醣化位點；位於位置22至95 (VH -VL )、148至204 (CH 1-CL )、262至322 (CH 2)及368至426 (CH 3)(及位於位置22’’至95’’、148’’至204’’、262’’至322’’及368’’至426’’)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置23’至88’ (VH -VL )及136’至196’ (CH 1-CL )(及位於位置23’’’至88’’’及136’’’至196’’’)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於位置227至227’’及230至230’’之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於135至216’及135’’至216’’’之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏瑞魯單抗及其變體及片段之製備及特性係描述於美國專利第7,288,638及8,962,804號，彼等揭露以引用方式併入本文中。烏瑞魯單抗之臨床前及臨床特徵係描述於Segal,et al. ,Clin. Cancer Res. 2016, available at http:/dx.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-16-1272。目前烏瑞魯單抗在多種血液及實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health) clinicaltrials.gov識別號NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992及NCT01471210。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含由SEQ ID NO:21給出之重鏈及由SEQ ID NO:22給出之輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含烏瑞魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，4-1BB促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:23所示之序列且4-1BB促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:24所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係藥物管理機構參照烏瑞魯單抗所核准的4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含4-1BB抗體，該4-1BB抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。4-1BB促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係選自由下列所組成之群組：1D8、3Elor、4B4 (BioLegend 309809)、H4-1BB-M127 (BD Pharmingen 552532)、BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX)、145501 (Leinco Technologies B591)、由寄存編號ATCC No. HB-11248之細胞系產生且揭示於美國專利第6,974,863號之抗體、5F4 (BioLegend 31 1503)、C65-485 (BD Pharmingen 559446)、揭示於美國專利申請公開案第US 2005/0095244號之抗體、揭示於美國專利第7,288,638號之抗體(諸如20H4.9-IgGl (BMS-663031))、揭示於美國專利第6,887,673號之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、揭示於美國專利第7,214,493號之抗體、揭示於美國專利第6,303,121號之抗體、揭示於美國專利第6,569,997號之抗體、揭示於美國專利第6,905,685號之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、揭示於美國專利第6,362,325號之抗體(諸如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3El)、揭示於美國專利第6,974,863號之抗體(諸如53A2)；揭示於美國專利第6,210,669號之抗體(諸如1D8、3B8或3El)、描述於美國專利第5,928,893號之抗體、揭示於美國專利第6,303,121號之抗體、揭示於美國專利第6,569,997號之抗體、揭示於國際專利申請公開案WO 2012/177788、WO 2015/119923及WO 2010/042433之抗體、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物，其中前述專利或專利申請公開案各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係國際專利申請公開案號WO 2008/025516 A1、WO 2009/007120 A1、WO 2010/003766 A1、WO 2010/010051 A1及WO 2010/078966 A1；美國專利申請公開案號US 2011/0027218 A1、US 2015/0126709 A1、US 2011/0111494 A1、US 2015/0110734 A1及US 2015/0126710 A1；及美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號所述之4-1BB促效性融合蛋白質，彼等揭露以引用方式併入本文中。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係如結構I-A(C端Fc-抗體片段融合蛋白質)或結構I-B(N端Fc-抗體片段融合蛋白質)所描繪之4-1BB促效性融合蛋白質、或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物：
在結構I-A及I-B中，圓柱體係指個別多肽結合結構域。結構I-A及I-B包含三個線性連接的衍生自例如4-1BBL或結合4-1BB之抗體的TNFRSF結合結構域，該TNFRSF結合結構域摺疊以形成三價蛋白質，其接著與第二三價蛋白質經由IgG1-Fc(包括CH 3及CH 2結構域)連接，接著用於經由雙硫鍵(小長橢圓形)將二個三價蛋白質連接在一起，穩定結構且提供能夠將六個受體的細胞內傳訊結構域與傳訊蛋白質集合在一起以形成傳訊複合物的促效劑。表示為圓柱體的TNFRSF結合結構域可為scFv結構域，其包含例如由連接子連接的VH 及VL 鏈，該連接子可包含親水性殘基及提供柔軟度的Gly及Ser序列以及提供溶解度的Glu及Lys。可使用任何scFv結構域設計，諸如該些描述於de Marco,Microbial Cell Factories ,2011, 10 , 44；Ahmad,et al. ,Clin. & Dev. Immunol. 2012, 980250；Monnier,et al. ,Antibodies, 2013, 2, 193-208；或在本文中他處參照併入者。此形式的融合蛋白質結構係描述於美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號，彼等揭露以引用方式併入本文中。
結構I-A之其他多肽結構域之胺基酸序列係在表9中給出。Fc結構域較佳地包含完整恆定結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸17至230)、完整絞鏈結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸1至16)或絞鏈結構域之一部分(例如SEQ ID NO:31之胺基酸4至16)。用於連接C端Fc抗體之較佳連接子可選自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41給出之實施態樣，包括適用於融合額外多肽之連接子。
結構I-B之其他多肽結構域之胺基酸序列係在表10中給出。如果Fc抗體片段如結構I-B中融合至TNRFSF融合蛋白質的N端，則Fc模組的序列較佳地顯示於SEQ ID NO:42，且連接子序列較佳地選自如SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:45所示之該些實施態樣。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個選自由下列所組成之群組的4-1BB結合結構域：烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏瑞魯單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、選自表9所述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述可變重鏈及可變輕鏈之任何組合、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體及生物類似物。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含4-1BBL序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含根據SEQ ID NO:46之序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含可溶性4-1BBL序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含根據SEQ ID NO:47之序列。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自與表11給出之VH 及VL 序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性4-1BB結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性4-1BB結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，且其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性4-1BB結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性4-1BB結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域，其中該可溶性4-1BB結構域之各者缺乏莖區域(其促成三聚作用且提供距離細胞膜的某些距離，但不是4-1BB結合結構域的一部分)且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素結構域，其中可溶性TNF超家族細胞介素結構域之各者缺乏莖區域且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度，且其中各TNF超家族細胞介素結構域係4-1BB結合結構域。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性scFv抗體，其包含任何前述者之VH 結構域連接至任何前述者之VL 結構域。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係BPS Bioscience的4-1BB促效劑抗體(產品編號79097-2，可購自BPS Bioscience, San Diego, CA, USA)。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係Creative Biolabs的4-1BB促效劑抗體(產品編號MOM-18179，可購自Creative Biolabs, Shirley, NY, USA)。 3.　　OX40 (CD134)促效劑
在一實施態樣中，TNFRSF促效劑係OX40 (CD134)促效劑。OX40促效劑可為任何所屬技術領域中已知之OX40結合分子。OX40結合分子可為能夠與人類或哺乳動物OX40結合之單株抗體或融合蛋白質。OX40促效劑或OX40結合分子可包含免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞型的免疫球蛋白重鏈。OX40促效劑或OX40結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文中所使用，用語結合分子亦包括抗體(包括全長抗體)、單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人類、人化或嵌合抗體及抗體片段例如Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表現庫產生的片段、任何上述者之表位結合片段、及抗體之經工程改造形式例如與OX40結合之scFv分子。在一實施態樣中，OX40促效劑係一種全人類抗體的抗原結合蛋白質。在一實施態樣中，OX40促效劑係一種人化抗體的抗原結合蛋白質。在一些實施態樣中，用於本揭示方法及組成物中之OX40促效劑包括抗OX40抗體、人類抗OX40抗體、小鼠抗OX40抗體、哺乳動物抗OX40抗體、單株抗OX40抗體、多株抗OX40抗體、嵌合抗OX40抗體、抗OX40粘連蛋白、抗OX40結構域抗體、單鏈抗OX40片段、重鏈抗OX40片段、輕鏈抗OX40片段、抗OX40融合蛋白質、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體、或生物類似物。在一較佳實施態樣中，OX40促效劑係促效性抗OX40人化或全人類單株抗體(即衍生自單一細胞系之抗體)。
在一較佳實施態樣中，OX40促效劑或OX40結合分子亦可為融合蛋白質。包含與OX40L融合之Fc結構域的OX40融合蛋白質係描述於例如Sadun,et al. ,J. Immunother. 2009, 182, 1481-89。在一較佳實施態樣中，相較於一般擁有二個配體結合結構域的促效性單株抗體而言，多聚體OX40促效劑諸如三聚體或六聚體OX40促效劑(具有三個或六個配體結合結構域)可誘導優異的受體(OX40L)叢聚及內部細胞性傳訊複合物形成。包含三個TNFRSF結合結構域及IgG1-Fc且可選地進一步連接二或更多個這些融合蛋白質的三聚體(三價)或六聚體(或六價)或更大融合蛋白質係描述於例如Gieffers,et al. ,Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47中。
已知促效性OX40抗體及融合蛋白質可誘導強烈免疫反應。Curti,et al. ,Cancer Res. 2013 ,73, 7189-98。在一較佳實施態樣中，OX40促效劑係以足以減少毒性之方式與OX40抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，OX40促效劑係廢除抗體依賴性細胞性毒性(ADCC)例如NK細胞細胞毒性之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，OX40促效劑係廢除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，OX40促效劑係廢除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，OX40促效劑係廢除Fc區功能性之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係由以高親和性及促效性活性與人類OX40 (SEQ ID NO:54)結合來表徵。在一實施態樣中，OX40促效劑係與人類OX40 (SEQ ID NO:54)結合之結合分子。在一實施態樣中，OX40促效劑係與鼠OX40 (SEQ ID NO:55)結合之結合分子。OX40促效劑或結合分子所結合之OX40抗原的胺基酸序列係總結於表12中。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約100 pM或較低之KD 結合人類或鼠OX40、以約90 pM或較低之KD 結合人類或鼠OX40、以約80 pM或較低之KD 結合人類或鼠OX40、以約70 pM或較低之KD 結合人類或鼠OX40、以約60 pM或較低之KD 結合人類或鼠OX40、以約50 pM或較低之KD 結合人類或鼠OX40、以約40 pM或較低之KD 結合人類或鼠OX40或以約30 pM或較低之KD 結合人類或鼠OX40之OX40促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人類或鼠OX40結合、以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人類或鼠OX40結合、以約8×105 1/M·s或更快之k締合 與人類或鼠OX40結合、以約8.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人類或鼠OX40結合、以約9×105 1/M·s或更快之k締合 與人類或鼠OX40結合、以約9.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人類或鼠OX40結合或以約1×106 1/M·s或更快之k締合 與人類或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠OX40結合、以約2.1×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠OX40結合、以約2.2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠OX40結合、以約2.3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠OX40結合、以約2.4×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠OX40結合、以約2.5×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠OX40結合、以約2.6×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠OX40結合或以約2.7×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠OX40結合、以約2.8×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠OX40結合、以約2.9×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠OX40結合或以約3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人類或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約10 nM或較低之IC50 與人類或鼠OX40結合、以約9 nM或較低之IC50 與人類或鼠OX40結合、以約8 nM或較低之IC50 與人類或鼠OX40結合、以約7 nM或較低之IC50 與人類或鼠OX40結合、以約6 nM或較低之IC50 與人類或鼠OX40結合、以約5 nM或較低之IC50 與人類或鼠OX40結合、以約4 nM或較低之IC50 與人類或鼠OX40結合、以約3 nM或較低之IC50 與人類或鼠OX40結合、以約2 nM或較低之IC50 與人類或鼠OX40結合或以約1 nM或較低之IC50 與人類或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係塔伏利西單抗，亦稱為MEDI0562或MEDI-0562。塔伏利西單抗可得自AstraZeneca, Inc.的子公司MedImmune。塔伏利西單抗係免疫球蛋白G1-κ抗[智人 TNFRSF4(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員4，OX40，CD134)]人化及嵌合單株抗體。塔伏利西單抗之胺基酸序列係如表13所示。塔伏利西單抗包含位於位置301及301’’之N-醣化位點，附接岩藻糖基化複合物雙觸角CHO型聚醣；位於位置22至95 (VH -VL )、148至204 (CH 1-CL )、265至325 (CH 2)及371至429 (CH 3)(及位於位置22’’至95’’、148’’至204’’、265’’至325’’及371’’至429’’)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置23’至88’ (VH -VL )及134’至194’ (CH 1-CL )(及位於位置23’’’至88’’’及134’’’至194’’’)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於位置230至230’’及233至233’’之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於224至214’及224’’至214’’’之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。目前塔伏利西單抗在多種實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health) clinicaltrials.gov識別號NCT02318394及NCT02705482。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:56給出之重鏈及由SEQ ID NO:57給出之輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含塔伏利西單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:58所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:59所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61及SEQ ID NO:62所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:65所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，OX40促效劑係藥物管理機構參照塔伏利西單抗所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係11D4，其係可得自Pfizer, Inc.的全人類抗體。11D4之製備及特性係描述於美國專利第7,960,515、8,236,930及9,028,824號，彼等揭露以引用方式併入本文中。11D4之胺基酸序列係如表14所示。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:66給出之重鏈及由SEQ ID NO:67給出之輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含11D4之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:68所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:69所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:72所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:75所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，OX40促效劑係藥物管理機構參照11D4所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係18D8，其係可得自Pfizer, Inc.的全人類抗體。18D8之製備及特性係描述於美國專利第7,960,515、8,236,930及9,028,824號，彼等揭露以引用方式併入本文中。18D8之胺基酸序列係如表15所示。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:76給出之重鏈及由SEQ ID NO:77給出之輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含18D8之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:78所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:79所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81及SEQ ID NO:82所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84及SEQ ID NO:85所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，OX40促效劑係藥物管理機構參照18D8所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係Hu119-122，其係可得自GlaxoSmithKline plc.的人化抗體。Hu119-122之製備及特性係描述於美國專利第9,006,399及9,163,085號及國際專利公開號WO 2012/027328號，彼等揭露以引用方式併入本文中。Hu119-122之胺基酸序列係如表16所示。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含Hu119-122之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:86所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:87所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92及SEQ ID NO:93所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，OX40促效劑係藥物管理機構參照Hu119-122所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係Hu106-222，其係可得自GlaxoSmithKline PLC之人化抗體。Hu106-222之製備及特性係描述於美國專利第9,006,399及9,163,085號及國際專利公開案WO 2012/027328，彼等揭露以引用方式併入本文中。Hu106-222之胺基酸序列係如表17所示。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含Hu106-222之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:94所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:95所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100及SEQ ID NO:101所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，OX40促效劑係藥物管理機構參照Hu106-222所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。
在一些實施態樣中，OX40促效劑抗體係MEDI6469(又稱為9B12)。MEDI6469係鼠單株抗體。Weinberg,et al. ,J. Immunother .2006 ,29 , 575-585。在一些實施態樣中，OX40促效劑係由9B12融合瘤產生之抗體(由Biovest Inc. (Malvern, MA, USA)寄存)，其描述於Weinberg,et al. ,J. Immunother .2006 ,29 , 575-585，其揭露全文特此以引用方式併入本文中。在一些實施態樣中，抗體包含MEDI6469之CDR序列。在一些實施態樣中，抗體包含MEDI6469之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。
在一實施態樣中，OX40促效劑係L106 BD (Pharmingen Product #340420)。在一些實施態樣中，OX40促效劑包含抗體L106 (BD Pharmingen Product #340420)之CDR。在一些實施態樣中，OX40促效劑包含抗體L106 (BD Pharmingen Product #340420)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一實施態樣中，OX40促效劑係ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)。在一些實施態樣中，OX40促效劑包含抗體ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)之CDR。在一些實施態樣中，OX40促效劑包含抗體ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一實施態樣中，OX40促效劑係鼠單株抗體抗mCD134/mOX40(克隆OX86)，其可購自InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NH。
在一實施態樣中，OX40促效劑係選自描述於國際專利申請公開案號WO 95/12673、WO 95/21925、WO 2006/121810、WO 2012/027328、WO 2013/028231、WO 2013/038191及WO 2014/148895；歐洲專利申請案EP 0672141；美國專利申請公開案號US 2010/136030、US 2014/377284、US 2015/190506及US 2015/132288(包括克隆20E5及12H3)；及美國專利第7,504,101、7,550,140、7,622,444、7,696,175、7,960,515、7,961,515、8,133,983、9,006,399及9,163,085號中之OX40促效劑，彼等各者之揭露全文以引用方式併入本文中以達所有目的且特別是與OX40促效劑及彼等之用途有關的所有教示。
在一實施態樣中，OX40促效劑係如結構I-A(C端Fc-抗體片段融合蛋白質)或結構I-B(N端Fc-抗體片段融合蛋白質)所描繪之OX40促效性融合蛋白質、或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。結構I-A及I-B之特性係描述於以上及美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號，彼等揭露以引用方式併入本文中。結構I-A之多肽結構域之胺基酸序列係在表9中給出。Fc結構域較佳地包含完整恆定結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸17至230)、完整絞鏈結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸1至16)或絞鏈結構域之一部分(例如SEQ ID NO:31之胺基酸4至16)。用於連接C端Fc抗體之較佳連接子可選自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41給出之實施態樣，包括適用於融合額外多肽之連接子。類似地，結構I-B之多肽結構域之胺基酸序列係在表10中給出。如果Fc抗體片段如結構I-B中融合至TNRFSF融合蛋白質的N端，則Fc模組的序列較佳地顯示於SEQ ID NO:42，且連接子序列較佳地選自如SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:45所示之該些實施態樣。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個選自由下列所組成之群組的OX40結合結構域：塔伏利西單抗之可變重鏈及可變輕鏈、11D4之可變重鏈及可變輕鏈、18D8之可變重鏈及可變輕鏈、Hu119-122之可變重鏈及可變輕鏈、Hu106-222之可變重鏈及可變輕鏈、選自表17所述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述可變重鏈及可變輕鏈之任何組合、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體及生物類似物。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含OX40L序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:102之序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含可溶性OX40L序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:103之序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:104之序列。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自與表18給出之VH 及VL 序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。
在一實施態樣中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性OX40結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性OX40結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，且其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域。在一實施態樣中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性OX40結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性OX40結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域，其中該可溶性OX40結合結構域之各者缺乏莖區域(其促成三聚作用且提供距離細胞膜的某些距離，但不是OX40結合結構域的一部分)且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度。
在一實施態樣中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素結構域，其中可溶性TNF超家族細胞介素結構域之各者缺乏莖區域且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度，且其中TNF超家族細胞介素結構域係OX40結合結構域。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係MEDI6383。MEDI6383係OX40促效性融合蛋白質且可如美國專利第6,312,700號所述製備，其揭露以引用方式併入本文中。
在一實施態樣中，OX40促效劑係OX40促效性scFv抗體，其包含任何前述者之VH 結構域連接至任何前述者之VL 結構域。
在一實施態樣中，OX40促效劑係Creative Biolabs的OX40促效劑單株抗體MOM-18455，可購自Creative Biolabs, Inc., Shirley, NY, USA。
在一實施態樣中，OX40促效劑係OX40促效性抗體克隆Ber-ACT35，可購自BioLegend, Inc., San Diego, CA, USA。可選的細胞存活性分析
可選地，在第一擴增(有時稱為初始主體擴增)之後可使用所屬技術領域中已知之標準測定執行細胞存活性測定。例如，可在主體TIL的樣本上進行台盼藍排除測定，其選擇性標示死亡細胞且允許存活性評估。其他用於測試存活性之測定可包括但不限於阿爾瑪藍測定及MTT測定。 1.　　細胞計數、存活性、流動式細胞測量術
在一些實施態樣中，測量細胞計數及/或存活性。標誌之表現(諸如但不限於CD3、CD4、CD8及CD56以及任何其他本文揭示或描述者)可藉由流動式細胞測量術，使用FACSCantoTM 流動式細胞測量儀(BD Biosciences)以抗體(例如但不限於該些可購自BD Bio-sciences (BD Biosciences, San Jose, CA)者)測量。細胞可使用拋棄式c-晶片血球計(VWR, Batavia, IL)手動計數且存活性可使用任何所屬技術領域中已知之方法包括但不限於台盼藍染色評估。細胞存活性亦可基於USSN 15/863,634測定，其全文以引用方式併入本文中。
在一些情況下，主體TIL群可使用以下討論之規程立即冷凍保存。替代地，主體TIL群可如以下討論進行REP且接著冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，主體或REP TIL群可進行基因修飾以用於合適治療。
根據本揭露，一種用於測定TIL存活性及/或投予至對象之進一步用途的方法。在一些實施態樣中，用於測定腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之方法包含： 　　(i)獲得第一TIL群； 　　(ii)執行第一擴增，其藉由在包含IL-2及可選地OKT-3之細胞培養基中培養第一TIL群，以產生第二TIL群；及 　　(iii)執行第二擴增，其藉由將第二TIL群的細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)以產生第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上高於第二TIL群至少50倍； 　　(iv)收集、洗滌及冷凍保存第三TIL群； 　　(v)儲存冷凍保存TIL在冷凍溫度下； 　　(vi)解凍第三TIL群以提供解凍的第三TIL群；及 　　(vii)執行一部分解凍的第三TIL群的額外第二擴增，其藉由將第三群的細胞培養基補充IL-2、OKT-3及APC一段至少3天的額外擴增期間(有時稱為reREP期間)，其中執行第三擴增以獲得第四TIL群，其中比較第四TIL群中的TIL數量與第三TIL群中的TIL數量以獲得比例； 　　(viii)基於步驟(vii)中的比例判定解凍的TIL群是否適用於投予至病患； 　　(ix)當步驟(viii)中之第四TIL群中的TIL數量對第三TIL群中的TIL數量之比例判定為大於5:1，投予治療有效劑量的解凍的第三TIL群至病患。
在一些實施態樣中，在步驟(vii)後測定TIL存活性。
本揭露亦提供測定TIL之進一步方法。在一些實施態樣中，本揭露提供一種測定TIL之方法，其包含： 　　(i)獲得一部分的第一冷凍保存TIL群； 　　(ii)將該部分的第一冷凍保存TIL群解凍； 　　(iii)執行第一擴增，其藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該部分的第一TIL群一段至少3天的額外擴增期間(有時稱為reREP期間)以產生第二TIL群，其中比較來自第一TIL群的該部分與第二TIL群以獲得TIL數量的比例，其中第二TIL群中的TIL數量對第一TIL群的該部分中的TIL數量的比例係大於5:1； 　　(iv)基於步驟(iii)中的比例判定第一TIL群是否適用於治療性投予至病患； 　　(v)當步驟(iv)中之第二TIL群中的TIL數量對第一TIL群中的TIL數量之比例判定為大於5:1，判定該第一TIL群適用於治療性投予。
在一些實施態樣中，第二TIL群中的TIL數量對第一TIL群的該部分中的TIL數量之比例係大於50:1。
在一些實施態樣中，該方法進一步包含根據本文提供之任何實施態樣所述之方法，執行來自步驟(i)之整個第一冷凍保存TIL群的擴增。
在一些實施態樣中，該方法進一步包含投予來自步驟(i)之整個第一冷凍保存TIL群至病患。 2.　　細胞培養
在一實施態樣中，用於擴增TIL之方法(包括該些以上討論以及圖18例示者)可包括使用約5,000 mL至約25,000 mL的細胞介質、約5,000 mL至約10,000 mL的細胞介質或約5,800 mL至約8,700 mL的細胞介質。在一些實施態樣中，介質係不含血清介質。在一些實施態樣中，在第一擴增中之介質係不含血清。在一些實施態樣中，在第二擴增中之介質係不含血清。在一些實施態樣中，在第一及第二擴增中之介質皆不含血清。在一實施態樣中，擴增TIL數量使用不超過一種細胞培養基。可使用任何合適的細胞培養基，例如AIM-V細胞介質(L-麩醯胺酸、50 μM鏈黴素硫酸鹽及10 μM硫酸建它黴素)細胞培養基(Invitrogen, Carlsbad CA)。就此而言，本發明方法有利地減少擴增TIL數量所需的介質的量及介質類型的數量。在一實施態樣中，擴增TIL數量可包含餵養細胞不頻繁超過每三或四天一次。在氣體可通透容器中擴增細胞數量藉由減少擴增細胞所需的餵養頻率，簡化擴增細胞數量所需之程序。
在一實施態樣中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞介質係未經過濾。使用未經過濾細胞介質可簡化擴增細胞數量所需的程序。在一實施態樣中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞介質缺乏β-巰乙醇(BME)。
在一實施態樣中，該方法的期間包含自哺乳動物獲得腫瘤組織樣本；在其中含有細胞介質之第一氣體可通透容器中培養腫瘤組織樣本；自腫瘤組織樣本獲得TIL；在含有細胞介質之第二氣體可通透容器中擴增TIL數量一段約7至14天例如約11天的期間。在一些實施態樣中，REP前係約7至14天，例如約11天。在一些實施態樣中，REP係約7至14天，例如約11天。
在一實施態樣中，TIL係在氣體可通透容器中擴增。已使用氣體可通透容器來擴增TIL，且使用PBMC、使用所屬技術領域中已知之方法、組成物及裝置，包括該些描述於美國專利申請公開案第2005/0106717 A1號者，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，TIL係在氣體可通透袋子中擴增。在一實施態樣中，TIL使用在氣體可通透袋子中擴增TIL的細胞擴增系統擴增，諸如Xuri細胞擴增系統W25 (GE Healthcare)。在一實施態樣中，TIL使用在氣體可通透袋子中擴增TIL的細胞擴增系統擴增，諸如WAVE生物反應器系統，亦稱為Xuri細胞擴增系統W5 (GE Healthcare)。在一實施態樣中，細胞擴增系統包括氣體可通透細胞袋子，該袋子的體積選自由約100 mL、約200 mL、約300 mL、約400 mL、約500 mL、約600 mL、約700 mL、約800 mL、約900 mL、約1 L、約2 L、約3 L、約4 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L及約10 L所組成之群組。
在一實施態樣中，TIL可在G-Rex培養瓶(可購自Wilson Wolf Manufacturing)中擴增。該等實施態樣允許細胞群自約5x105 細胞/cm2 擴增至介於10x106 與30x106 細胞/cm2 之間。在一實施態樣中，此係未進行餵養。在一實施態樣中，此係未進行餵養，只要G-Rex培養瓶中的介質位在約10 cm的高度。在一實施態樣中，此係未進行餵養，但進行添加一或多種細胞介素。在一實施態樣中，細胞介素可為作為推注添加，不需要將細胞介素與介質混合。該等容器、裝置及方法係所屬技術領域中已知且已用於擴增TIL，且包括該些描述於美國專利申請公開案第US 2014/0377739A1號、國際專利公開號WO 2014/210036 A1、美國專利申請公開案第 us 2013/0115617 A1號、國際專利公開號WO 2013/188427 A1、美國專利申請公開案第US 2011/0136228 A1號、美國專利第US 8,809,050 B2號、國際專利公開號WO 2011/072088 A2、美國專利申請公開案第US 2016/0208216 A1號、美國專利申請公開案第US 2012/0244133 A1號、國際專利公開號WO 2012/129201 A1、美國專利申請公開案第US 2013/0102075 A1號、美國專利第US 8,956,860 B2號、國際專利公開號WO 2013/173835 A1、美國專利申請公開案第US 2015/0175966 A1號，彼等揭露以引用方式併入本文中。該等過程亦描述於Jinet al. ,J. Immunotherapy, 2012 , 35:283-292。可選的 TIL 基因工程改造
在一些實施態樣中，TIL可選地經基因工程改造以包括額外功能性，包括但不限於高親和性T細胞受體(TCR)，例如靶向腫瘤相關抗原(諸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)之TCR，或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或細胞系限制細胞表面分子(例如CD19)結合之嵌合抗原受體(CAR)。可選的 TIL 冷凍保存
如上所討論且例示於如圖18中提供的步驟A至E，冷凍保存可發生在TIL擴增過程中的許多時點。在一些實施態樣中，在第二擴增(例如根據圖18步驟D所提供)後的經擴增TIL群可經冷凍保存。冷凍保存通常可藉由將TIL群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在-80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986。在一些實施態樣中，TIL係冷凍保存於5% DMSO中。在一些實施態樣中，TIL係冷凍保存於細胞培養基加5% DMSO中。在一些實施態樣中，TIL係根據實例10所提供之方法冷凍保存。
當適當時，將細胞自冷凍器移出並在37℃水浴中解凍，直到大約4/5的溶液解凍。將細胞大致上重懸於完全培養基中且可選地洗滌一或多次。在一些實施態樣中，解凍的TIL可經計數且依所屬技術領域中已知之方式評估存活性。用於 TIL 製造的密閉系統
本發明提供在TIL培養過程期間使用密閉系統。該等密閉系統允許預防及/或減少微生物汙染、允許使用較少培養瓶且允許成本降低。在一些實施態樣中，密閉系統使用二個容器。
該等密閉系統係所屬技術領域中廣為周知且可見於例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm。
無菌連接裝置(STCD)在二件可相容管之間產生無菌接合。此程序允許無菌連接多種容器及管直徑。在一些實施態樣中，密閉系統包括魯爾鎖及熱封系統。在一些實施態樣中，密閉系統係在無菌條件下經由針筒進入以維持系統的無菌性及密閉特性。在一些實施態樣中，採用如實例所述的密閉系統。在一些實施態樣中，將TIL根據實例所述之方法調配到最終產物配方容器中。
在一些實施態樣中，密閉系統從獲得腫瘤片段之時開始一直到準備將TIL投予至病患或冷凍保存為止，僅使用一個容器。在一些使用二個容器之實施態樣中，第一容器係密閉G容器，且TIL群在無需打開第一密閉G容器下離心及轉移至輸注袋。在一些使用二個容器之實施態樣中，輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。密閉系統或密閉TIL細胞培養系統的特徵在於，一旦添加了腫瘤樣本及/或腫瘤片段，該系統即可從外面緊密密封以形成密閉環境，不受細菌、真菌及/或任何其他微生物汙染入侵。
在一些實施態樣中，微生物汙染減少介於約5%與約100%之間。在一些實施態樣中，微生物汙染減少介於約5%與約95%之間。在一些實施態樣中，微生物汙染減少介於約5%與約90%之間。在一些實施態樣中，微生物汙染減少介於約10%與約90%之間。在一些實施態樣中，微生物汙染減少介於約15%與約85%之間。在一些實施態樣中，微生物汙染減少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%或約100%。
密閉系統允許TIL在無微生物汙染存在下及/或在微生物汙染顯著減少下生長。
再者，TIL細胞培養環境的pH、二氧化碳分壓及氧分壓各隨細胞培養而異。因此，即使適用於細胞培養之介質係經循環，該密閉環境仍需要持續維持為適合TIL增生的最佳環境。為達此目的，所欲的是藉由感測器監測密閉環境的培養液體內之pH、二氧化碳分壓及氧分壓物理因子，其信號用於控制安裝在培養環境入口的氣體交換器，且密閉環境的氣體分壓根據培養液體中的變化即時調整，以最佳化細胞培養環境。在一些實施態樣中，本發明提供密閉細胞培養系統，其在到密閉系統的入口處包含配備有監測裝置的氣體交換器，該監測裝置測量該密閉環境的pH、二氧化碳分壓及氧分壓，且藉由基於來自該監測裝置的信號自動調整氣體濃度來最佳化細胞培養環境。
在一些實施態樣中，在密閉環境中的壓力係經連續或間歇控制。也就是說，在密閉環境中的壓力可藉由例如壓力維持裝置而異，因此確保空間適合TIL在正壓狀態下生長，或促進流體在負壓狀態下滲出且因此促進細胞增生。再者藉由間歇性施加負壓，有可能藉由暫時性收縮密閉環境的體積而一致地且有效地置換在密閉環境中循環的液體。
在一些實施態樣中，用於TIL增生的最佳培養組分可經取代或添加，且可添加包括諸如IL-2及/或OKT3的因子以及組合。可選的 TIL 冷凍保存
主體TIL群或經擴增TIL群可選地可經冷凍保存。在一些實施態樣中，冷凍保存發生於治療性TIL群。在一些實施態樣中，冷凍保存發生於在第二擴增後經收集的TIL。在一些實施態樣中，冷凍保存發生於圖18的例示性步驟F中的TIL。在一些實施態樣中，TIL係冷凍保存於輸注袋中。在一些實施態樣中，TIL係經冷凍保存然後放入輸注袋中。在一些實施態樣中，TIL係經冷凍保存且不放入輸注袋中。在一些實施態樣中，冷凍保存使用冷凍保存介質執行。在一些實施態樣中，冷凍保存介質含有二甲亞碸(DMSO)。此通常可藉由將TIL群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在-80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986。
當適當時，將細胞自冷凍器移出並在37℃水浴中解凍，直到大約4/5的溶液解凍。將細胞大致上重懸於完全培養基中且可選地洗滌一或多次。在一些實施態樣中，解凍的TIL可經計數且依所屬技術領域中已知之方式評估存活性。
在一較佳實施態樣中，TIL群係使用CS10冷凍保存介質(CryoStor 10, BioLife Solutions)冷凍保存。在一較佳實施態樣中，TIL群係使用含有二甲亞碸(DMSO)的冷凍保存介質冷凍保存。在一較佳實施態樣中，TIL群係使用1:1(體積:體積)比例的CS10及細胞培養基冷凍保存。在一較佳實施態樣中，TIL群係使用約1:1(體積:體積)比例的CS10及細胞培養基冷凍保存，進一步包含額外的IL-2。
如上於步驟A至E所討論，冷凍保存可發生在TIL擴增過程中的許多時點。在一些實施態樣中，在根據步驟B之第一擴增後的主體TIL群或在一或多個根據步驟D之第二擴增後的經擴增TIL群可經冷凍保存。冷凍保存通常可藉由將TIL群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在-80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986。
當適當時，將細胞自冷凍器移出並在37℃水浴中解凍，直到大約4/5的溶液解凍。將細胞大致上重懸於完全培養基中且可選地洗滌一或多次。在一些實施態樣中，解凍的TIL可經計數且依所屬技術領域中已知之方式評估存活性。
在一些情況下，步驟B的TIL群可使用以下討論之規程立即冷凍保存。替代地，主體TIL群可進行步驟C及步驟D且接著在步驟D後冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，步驟B或步驟D的TIL群可進行基因修飾以用於合適治療。 醫藥組成物、劑量及給藥方案
在一實施態樣中，使用本揭露之方法擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至病患。在一實施態樣中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。本揭露之使用PBMC擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施態樣中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內投予。
可投予任何合適劑量的TIL。在一些實施態樣中，投予約2.3×1010 至約13.7×1010 的TIL，平均約7.8×1010 的TIL，特別是如果癌症係黑色素瘤。在一實施態樣中，投予約1.2×1010 至約4.3×1010 的TIL。在一些實施態樣中，投予約3×1010 至約12×1010 的TIL。在一些實施態樣中，投予約4×1010 至約10×1010 的TIL。在一些實施態樣中，投予約5×1010 至約8×1010 的TIL。在一些實施態樣中，投予約6×1010 至約8×1010 的TIL。在一些實施態樣中，投予約7×1010 至約8×1010 的TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約2.3×1010 至約13.7×1010 。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約7.8×1010 的TIL，特別是癌症係黑色素瘤。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約1.2×1010 至約4.3×1010 的TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約3×1010 至約12×1010 的TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約4×1010 至約10×1010 的TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約5×1010 至約8×1010 的TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約6×1010 至約8×1010 的TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約7×1010 至約8×1010 的TIL。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、2×1012 、3×1012 、4×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、2×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、7×1013 、8×1013 及9×1013 。在一實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係在1×106 至5×106 、5×106 至1×107 、1×107 至5×107 、5×107 至1×108 、1×108 至5×108 、5×108 至1×109 、1×109 至5×109 、5×109 至1×1010 、1×1010 至5×1010 、5×1010 至1×1011 、5×1011 至1×1012 、1×1012 至5×1012 及5×1012 至1×1013 的範圍內。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係小於例如100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係大於90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1%至約10% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量等於或小於10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6 g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007 g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002 g或0.0001 g。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量大於0.0001 g、0.0002 g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85 g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5、3 g、3.5、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g或10 g。
提供於本發明之醫藥組成物中的TIL在寬廣劑量範圍內有效。確切劑量將取決於投予途徑、化合物的投予形式、所欲治療之對象的性別及年齡、所欲治療之對象的體重及主治醫師的偏好及經驗。若適當亦可使用TIL的臨床建立劑量。使用在本文中之方法所投予之醫藥組成物的量(諸如TIL的劑量)將取決於所欲治療之人類或哺乳動物、病症或病況的嚴重性、投予速率、活性醫藥成分的體內配置(disposition)及處方醫師的考量。
在一些實施態樣中，TIL可以單一劑量投予。該投予可為注射，例如靜脈注射。在一些實施態樣中，TIL可以多個劑量投予。給藥可為每年一次、二次、三次、四次、五次、六次或多於六次。給藥可為一個月一次、每二週一次、每週一次或每二天一次。TIL的投予可視需要持續進行。
在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、2×1012 、3×1012 、4×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、2×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、7×1013 、8×1013 及9×1013 。在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係在1×106 至5×106 、5×106 至1×107 、1×107 至5×107 、5×107 至1×108 、1×108 至5×108 、5×108 至1×109 、1×109 至5×109 、5×109 至1×1010 、1×1010 至5×1010 、5×1010 至1×1011 、5×1011 至1×1012 、1×1012 至5×1012 及5×1012 至1×1013 的範圍內。
在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係在約0.01 mg/kg至約4.3 mg/kg、約0.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約0.3 mg/kg至約3.2 mg/kg、約0.35 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.15 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.3 mg至約2.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1.7 mg/kg、約0.15 mg/kg至約1.3 mg/kg、約0.3 mg/kg至約1.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1 mg/kg、約0.55 mg/kg至約0.85 mg/kg、約0.65 mg/kg至約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg至約0.75 mg/kg、約0.7 mg/kg至約2.15 mg/kg、約0.85 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約1.85 mg/kg、約1.15 mg/kg至約1.7 mg/kg、約1.3 mg/kg mg至約1.6 mg/kg、約1.35 mg/kg至約1.5 mg/kg、約2.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約2.3 mg/kg至約3.4 mg/kg、約2.4 mg/kg至約3.3 mg/kg、約2.6 mg/kg至約3.15 mg/kg、約2.7 mg/kg至約3 mg/kg、約2.8 mg/kg至約3 mg/kg或約2.85 mg/kg至約2.95 mg/kg的範圍內。
在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係在約1 mg至約500 mg、約10 mg至約300 mg、約20 mg至約250 mg、約25 mg至約200 mg、約1 mg至約50 mg、約5 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約20 mg至約30 mg、約23 mg至約28 mg、約50 mg至約150 mg、約60 mg至約140 mg、約70 mg至約130 mg、約80 mg至約120 mg、約90 mg至約110 mg或約95 mg至約105 mg、約98 mg至約102 mg、約150 mg至約250 mg、約160 mg至約240 mg、約170 mg至約230 mg、約180 mg至約220 mg、約190 mg至約210 mg、約195 mg至約205 mg或約198至約207 mg的範圍內。
有效量的TIL可以單一或多個劑量經由任何具有類似效用的可接受的藥劑投予模式投予，包括鼻內及經皮途徑、經由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、腸胃外、肌肉內、皮下、局部、經由移植或經由吸入。 某些例示性實施態樣
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤係皮膚的雙重難治性轉移性黑色素瘤。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為至少二種現有的全身性治療療程所難治，該至少二種現有的全身性治療療程不包括新輔助或輔助療法。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為阿地介白素或其生物類似物所難治。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為派姆單抗或其生物類似物所難治。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為尼沃魯單抗或其生物類似物所難治。 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸；
(d) 執行初始擴增。在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　在第一細胞培養基中之第一TIL群，以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為伊匹單抗或其生物類似物所難治。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為伊匹單抗或其生物類似物及派姆單抗或其生物類似物所難治。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為伊匹單抗或其生物類似物及尼沃魯單抗或其生物類似物所難治。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該初始擴增執行一段21天或更少天的期間。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該初始擴增執行一段11天或更少天的期間。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該IL-2係以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在於該第一細胞培養基中。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該IL-2係以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在於該第二細胞培養基中且該OKT-3抗體係以約30 ng/mL的初始濃度存在。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該初始擴增使用氣體可通透容器執行。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該快速擴增使用氣體可通透容器執行。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該第一細胞培養基進一步包含選自由IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及彼等之組合所組成之群組的細胞介素。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該第二細胞培養基進一步包含選自由IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及彼等之組合所組成之群組的細胞介素。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其進一步包含在向該病患投予該第三TIL群之前用非骨髓清除式淋巴細胞耗盡療法治療該病患的步驟。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡療法包含投予劑量為60 mg/m2 /天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2 /天之氟達拉濱計五天的步驟。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其進一步包含始於向該病患投予該第三TIL群之後當天使用IL-2療法治療該病患的步驟。
在一實施態樣中，本發明提供一種用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含下列步驟： 　　(a) 部分切除病患的腫瘤，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b) 碎斷該腫瘤為腫瘤片段； 　　(c) 將該等腫瘤片段與第一細胞培養基接觸； 　　(d) 在第一細胞培養基中執行第一TIL群的初始擴增以獲得第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於第一TIL群至少5倍，其中該第一細胞培養基包含IL-2； 　　(e) 在第二細胞培養基中執行第二TIL群的快速擴增以獲得第三TIL群，其中該第三TIL群於數量上在該快速擴增開始7天後高於該第二TIL群至少50倍；其中該第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經輻照的異體周邊血液單核細胞(PBMC)；且其中該快速擴增執行一段14天或更少天的期間； 　　(f) 收集該第三TIL群；及 　　(g) 投予治療有效部分的該第三TIL群至癌症病患； 　　其中該癌症係雙重難治性轉移性黑色素瘤，其中該IL-2療法係高劑量IL-2療法，包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液投予600,000或720,000 IU/kg的阿地介白素或其生物類似物或變體直到耐受為止。實例
在本文中涵蓋的實施態樣現在參照下列實例描述。這些實例僅為說明之目的而提供，在本文中涵蓋的本揭露不應被視為受到這些實例之限制，反而應視為包含任何及所有因此處所提供之教示而變得明顯之變異。 實例1：製造適用於療法之TIL的過程
TIL可使用所屬技術領域中已知之方法及本文所述之任何方法製造。例如，用於擴增TIL之例示性方法描繪於圖1。根據圖1之過程製造TIL及用擴增TIL治療癌症病患的例示性時間表顯示於圖2。手術(及腫瘤部分切除)在開始時進行，且淋巴細胞耗盡化療係指用本文他處所述之化療進行非骨髓清除式淋巴細胞耗盡。
圖3繪示TIL擴增及治療性治療過程，包括「直接進行REP」步驟，其中將REP前TIL直接放進REP過程。總處理時間大約22天，此時的TIL可輸注至病患體內。圖4繪示當第6天的細胞計數大於250×106 時，用於根據本揭露及圖3之過程製備TIL的治療及製造時間表。在此情況下，TIL產品被認為非常有可能成功，且在預期獲得合適最終TIL產物下進行病患淋巴細胞耗盡所冒之風險合理。圖5繪示當第6天的細胞計數小於250×106 時，用於根據本揭露及圖3之過程製備TIL的治療及製造時間表，且其中淋巴細胞耗盡較晚開始以允許在做出進行病患的淋巴細胞耗盡的決定之前評估TIL產物的存活性。圖6顯示根據圖3之TIL製造過程的詳細示意圖。 實例2：TIL療法於雙重難治性黑色素瘤之臨床試驗1
此第2期、多中心、三研究世代的試驗係設計來評估根據圖1製造之TIL療法用於治療轉移性黑色素瘤病患的安全性及療效。研究世代一及二各將招募至多30名病患且研究世代三係再治療研究世代，即在至多十名病患進行第二次TIL輸注。前二個研究世代評估二個不同的製造過程(分別為圖1及圖3)。研究世代一的病患接受新鮮、非冷凍保存的TIL(圖1)且研究世代二的病患接受經由較為簡化且快速、產製冷凍保存產物的三週程序(圖3)所製造的產物。試驗設計顯示於圖7。該試驗係第2期、多中心、三研究世代的試驗，評估自體TIL用於治療轉移性黑色素瘤病患子族群之安全性及療效。關鍵納入標準包括：可測量的轉移性黑色素瘤及≥1個可部分切除用於TIL產製之病灶；至少一種現有線上全身性療法；年齡≥18；且ECOG體能狀態為0至1。治療研究世代包括非冷凍保存TIL產物(使用圖1之過程製備)、冷凍保存的TIL產物(使用圖3之過程製備)及用TIL產物再治療無反應或在初始反應後進展的病患。主要終點為安全性且次要終點為療效，定義為客觀反應率(ORR)、完全緩解率(CRR)、無進展存活期(PFS)、反應持續時間(DOR)及整體存活期(OS)。
研究世代一的16名病患的資料呈現於此。這些晚期轉移性黑色素瘤病患的中位年齡為55歲，且為多種現有線上療法所高度難治，在基線具有顯著腫瘤負荷。所有皆接受過現有抗PD-1療法，88%接受過抗CTLA4療法且64%接受過三次或多次現有療法。結果顯示在可評估病患中，報告29%客觀反應率，包括一例單一TIL治療的完全反應(CR)持續超過投予後15個月。另外，77%病患的目標腫瘤大小減少。平均發生第一反應所需時間為1.6個月，其中CR發生在6個月。反應在腫瘤攜帶有野生型或BRAF突變之病患中觀察到。該規程允許投予至多6劑的阿地介白素。阿地介白素投予的中位次數係六。
病患特徵顯示於圖8及圖9。現有療法的中位次數係3(範圍：1至6)。在基線的目標病灶的中位直徑總和為10.2 cm。81%的病患具有第IV期疾病。病患族群為多種現有線上療法所高度難治，在基線具有顯著腫瘤負荷，且在至少一種檢查點抑制劑後已進展。
治療引發嚴重不良事件概述於圖10，且療效結果概述於圖11。14名病患的其中之一因為黑色素瘤相關死亡發生在第一次腫瘤評估之前而無法評估。所有進入試驗的病患皆接受抗PD-1檢查點抑制劑。反應的瀑布圖顯示於圖12。ORR係29%。腫瘤減少見於77%的病患，代表該些目標病灶的腫瘤減少者。所注意到的反應與BRAF突變狀態無關，包括一例長期持續CR(15+個月)。圖13繪示臨床試驗中之發生最佳反應所需時間及期間。平均發生第一反應所需時間為1.6個月。圖13顯示之資料的中位追蹤期為4.1個月。圖14繪示臨床試驗中之直徑總和的百分比變化。圖15繪示完全緩解病患的掃描，顯示腫瘤大小減少。
此外，此試驗的計畫書修改為增加試驗樣本大小以及進一步定義病患族群為患有無法部分切除或轉移性黑色素瘤、在免疫檢查點抑制療法(例如抗PD-1)之後已進展且若為BRAF突變陽性則在BRAF靶向療法之後已進展的病患。
基於這些說明本揭露之TIL療法治療雙重難治性轉移性黑色素瘤之能力的結果，已修正臨床試驗如圖16所示，且另外主要終點已改變成ORR，次要終點改變成CRR、DCR、PFS、DOR、OR、OS及安全性。 實例3：TIL療法於雙重難治性黑色素瘤之臨床試驗2
在一些實施態樣中亦可採用替代性TIL產生過程，諸如描述於Radvanyi,et al. ,Clin. Cancer Res. 2012, 18, 6758-70中之過程(包括支持資訊)，其揭露以引用方式併入本文中。圖17顯示使用藉由此方法產生之TIL治療為抗PD-1(派姆單抗或尼沃魯單抗)及伊匹單抗兩者所難治之病患的結果。 實例4：回溯性臨床試驗
回溯試驗係在無法部分切除、轉移性黑色素瘤病患經過≥2種針對他們疾病的全身性療法之後的評估療效資料執行。此為回溯性病歷回顧試驗。本試驗包括取得在接受≥2線的全身性療法之後進展的復發/難治性無法部分切除轉移性黑色素瘤病患的疾病反應的回溯性資料，其中證實具有BRAF突變陽性疾病病患的全身性療法必須包括至少一線的PD-1及BRAF抑制劑。病患族群的選擇係基於前瞻性判定納入標準，隨後進行回溯性病歷回顧。
此回溯試驗的主要目標係評估依照實質腫瘤反應評估標準(RECIST) 1.1進行當地評估所評估的客觀反應率(ORR)。本試驗的次要目標包括(i)評估療效終點，其由當地評估RECIST 1.1所評估之反應持續時間(DOR)及疾病控制率(DCR)；(ii)基於試驗族群的回溯性資料評估整體存活期(OS)。探察性目標進一步包括評估此試驗族群的治療模式。
劑量及治療係基於個別機構資料，必要條件為曾接受第二或更後線之無法部分切除、轉移性黑色素瘤治療的治療。
回溯性資料將收集來自美國至多3個大型醫學資料庫(例如醫院、學術機構、腫瘤合作組織)。
在此回溯性資料評估試驗中並不對病患進行主動治療。最少約100名病患將基於可得的機構資料評估參加回溯性資料回顧的資格。
病患在≥2線的全身性療法之後具有復發/難治性無法部分切除、轉移性黑色素瘤，該等全身性療法必須包括至少一線用於證實具有BRAF突變陽性疾病病患之抗PD-1及BRAF抑制劑。病患同意時的年齡將≥ 18歲且美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)體能狀態將為0或1。
進一步納入標準包括：病患必須具有適當的造血及器官功能；病患已提供使用及揭露受保護健康資訊的書面授權，或是有符合GCP及當地倫理標準的機構法規允許使用臨床資料。
符合下列標準的病患將自試驗排除：具有葡萄膜/眼睛來源黑色素瘤的病患；具有症狀性及/或未治療腦轉移(不論任何大小及任何數量)的病患；在前3年內具有另一種原發性惡性病(乳房、子宮頸或膀胱原位癌、局部前列腺癌及已經適當治療的非黑色素瘤皮膚癌除外)的病患；已顯示為BRAF突變陽性(V600)但尚未接受現有全身性療法與針對BRAF的激酶抑制劑的病患。
療效將基於將RECIST 1.1應用至根據納入/排除標準所識別之病患的病歷表中可用之資料評估。將計算下列參數：ORR、DOR、DCR。資料將報告為個別機構資料，若可行的話報告為綜合資料。
亦將依可用個別機構資料評估OS摘要。若可行的話，將報告綜合OS資料。
主要統計分析係基於獲自各機構回溯性資料的療效參數且將以每機構個別的回溯性資料組執行。
回溯性資料組之間的統計比較可能執行或不執行。
符合RECIST 1.1標準之證實完全反應(CR)或部分反應(PR)的病患將在ORR分析中歸類為反應者。
所有事件發生所需時間(time-to-event)之療效終點將使用Kaplan-Meier方法概述資料。所有該等分析的時間起點(反應持續時間除外)將為病患開始試驗療法治療的日期。
個別回溯性資料組之間可能有或沒有正式比較。 實例5：製備用於REP前及REP過程的介質
此實例描述用於製備組織培養基之程序，該等組織培養基使用於涉及衍生自各種腫瘤類型包括但不限於轉移性黑色素瘤、頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、卵巢癌、三陰性乳癌及肺腺癌的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)培養之規程。此介質可用於製備本申請案及實例中所述之任何TIL。CM1 之製備
將下列試劑移出冷藏並使彼等在37℃水浴中溫熱：(RPMI1640、人類AB血清、200mM L-麩醯胺酸)。根據下表19，藉由添加各成分至所欲過濾之體積適當的0.2µm過濾器單位的頂部，製備CM1介質。儲存在4℃下。
在使用當天，在37℃水浴中預溫熱所需量的CM1並添加6000 IU/m1 IL-2。
額外補充-根據表20視需要補充。 CM2 之製備
將製備好的CM1自冰箱移出或如上7.3節所示製備新鮮CM1。自冰箱移出AIM-V®，將製備好的CM1與等體積的AIM-V®在無菌介質瓶中混合，製備所需量的CM2。在使用當天添加3000 IU/ml IL-2至CM2介質。在使用當天做足量的含3000 IU/ml IL-2之CM2。將CM2介質瓶標示名稱、製備者首字母、過濾/製備日期、二週到期日並儲存在4℃下直到需用於組織培養時。CM3 之製備
在需要使用的當天製備CM3。CM3與AIM-V®介質相同，在使用當天補充3000 IU/ml IL-2。藉由直接添加IL-2儲備溶液至AIM-V的瓶或袋中，製備足夠實驗需要的CM3量。藉由溫和震盪混合均勻。在添加至AIM-V後，立即在瓶上標示「3000 IU/ml IL-2」。如果有過量的CM3，將其儲存在瓶中在4℃下，並標示介質名稱、製備者首字母、介質製備日期及其到期日(製備後7天)。丟棄在4℃下儲存7天後之補充有IL-2之介質。CM4 之製備
CM4與CM3相同，但具有額外的2mM G1utaMAXTM(最終濃度)補充物。在每1L的CM3中添加10ml的200mM G1utaMAXTM。藉由直接添加IL-2儲備溶液及G1utaMAXTM儲備溶液至AIM-V的瓶或袋中，製備足夠實驗需要的CM4量。藉由溫和震盪混合均勻。在添加至AIM-V後，立即在瓶上標示「3000 IL/nil IL-2 and G1utaMAX」。如果有過量的CM4，將其儲存在瓶中在4℃下，並標示介質名稱、「G1utaMAX」及其到期日(製備後7天)。丟棄在4℃下儲存7天後之補充有IL-2之介質。 實例6：使用IL-2、IL-15及IL-21細胞介素雞尾酒
此實例描述使用IL-2、IL-15及IL-21細胞介素(彼等作為額外的T細胞生長因子)與實例1至10之TIL過程之組合。
使用實例1至10之過程，TIL係在實驗的一組中在IL-2存在下生長自結直腸腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、三陰性乳房腫瘤、肺臟腫瘤及腎臟腫瘤，且在另一組中在培養起始時以IL-2、IL-15及IL-21之組合代替IL-2。在REP前完成時，評估培養的擴增、表型、功能(CD107a+及IFN-g)及TCR Vβ貯庫。IL-15及IL-21係在本文他處及Gruijl, et al., IL-21 promotes the expansion of CD27+CD28+ tumor infiltrating lymphocytes with high cytotoxic potential and low collateral expansion of regulatory T cells,Santegoets, S. J., J Transl Med.,2013, 11: 37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/)中描述。
結果顯示相對於僅IL-2條件下，在IL-2、IL-15及IL-21處理條件下觀察到多個組織中的CD4+ 及CD8+ 兩種細胞中之TIL擴增增強(＞20%)。相對於僅IL-2培養，獲自IL-2、IL-15及IL-21處理培養之TIL中偏向以富含TCR Vβ貯庫之CD8+ 群為主。相較於僅IL-2處理之TIL，IL-2、IL-15及IL-21處理之TIL中的IFN-g及CD107a上升。 實例7：合格化經γ輻照的周邊單核細胞個別批量
此實例描述使經γ輻照的周邊單核細胞(PBMC，亦稱為MNC)個別批量合格的新穎的簡化程序，該等細胞在本文所述之例示性方法用來作為異體餵養細胞。
各批經輻照的MNC餵養細胞係自個別供體製備。各批或供體在經純化的抗CD3(克隆OKT3)抗體及介白素2 (IL-2)存在下在REP中擴增TIL的能力係經個別篩檢。此外，各批餵養細胞在不添加TIL下測試，以驗證所接受的γ輻射劑量足以使彼等複製不能。先前技術
經γ輻照、生長停頓的MNC餵養細胞係TIL之REP所需。餵養細胞MNC上的膜受體與抗CD3(克隆OKT3)抗體結合且與REP培養瓶中的TIL交聯，刺激TIL擴增。餵養細胞批量係從採自個別供體之全血的白血球分離術製備。將白血球分離術產物進行Ficoll-Hypaque離心、洗滌、輻照並在GMP條件下冷凍保存。
重要的是，接受TIL療法的病患不得輸注存活餵養細胞，因為其可導致移植物抗宿主病(GVHD)。因此餵養細胞藉由接受細胞γ-輻照來使生長停頓，導致雙股DNA斷裂且在再培養時喪失MNC細胞的細胞存活性。評估標準及實驗設置
以二個標準評估餵養細胞批量：1)彼等在共培養中擴增TIL的能力＞100倍，及2)彼等之複製不能性。
餵養細胞批量在迷你REP格式中利用二個在直立式T25組織培養培養瓶中生長的初代REP前TIL細胞系測試。餵養細胞批量係以二個不同的TIL細胞系測試，其中各TIL細胞系在REP中因應活化而增生的能力不同。一批過去已顯示符合以上標準的經輻照的MNC餵養細胞在測試批量旁一起運行作為對照組。
為了確保所有單一實驗中的測試批量接受等效測試，相同REP前TIL細胞系的足夠原液可用於測試所有條件及所有餵養細胞批量。
每批測試的餵養細胞總共有六個T25培養瓶：REP前TIL細胞系#1(2個培養瓶)；REP前TIL細胞系#2(2個培養瓶)；及餵養細胞對照組(2個培養瓶)。評估含有TIL細胞系#1及#2的培養瓶中之餵養細胞批量擴增TIL的能力。評估餵養細胞對照組培養瓶中之餵養細胞批量的複製不能性。實驗規程 第 -2/3 天，解凍 TIL 細胞系
製備CM2介質。在37℃水浴中溫熱CM2。製備40 ml的補充有3000IU/ml IL-2之CM2。保持溫熱直到使用。將20 ml不含IL-2的預熱CM2放入二個標示有所使用的TIL細胞系名稱之50ml錐形管中之各者。自LN2儲存移出二個指定的REP前TIL細胞系並將小瓶轉移至組織培養室。將小瓶放在密封夾鏈儲存袋中在37℃水浴中解凍，直到剩下少量的冰。
使用無菌移液吸管，立即將小瓶內容物轉移至經製備、標示的50ml錐形管中的20ml CM2中。使用不含IL-2的CM2補足至40ml以洗滌細胞。在400 x CF下離心5分鐘。抽吸上清液並重懸於補充有3000 IU/ml IL-2之5ml溫熱CM2中。
移出雙份小等分試樣(20µl)，使用自動細胞計數器進行細胞計數。記錄計數。當計數時，將含有TIL細胞的50ml錐形管放入增濕37℃、5% CO2 孵養箱中，且將蓋子鬆開以允許氣體交換。判定細胞濃度並將TIL稀釋至1 x 106 個細胞/ml於補充有3000 IU/ml IL-2之CM2中。
在增濕37℃孵養箱中視需要培養於24孔組織培養板中盡可能多孔的2ml/孔中直到迷你REP的第0天。在分開的24孔組織培養板上培養不同的TIL細胞系，以避免混淆及可能的交叉汙染。第 0 天，起始迷你 REP
為欲測試的餵養細胞批量數製備足夠的CM2介質。(例如為了一次測試4批餵養細胞，製備800ml的CM2介質)。取等分試樣的一部分上述製備之CM2並補充3000 IU/ml IL-2以用於培養細胞。(例如為了一次測試4批餵養細胞，製備500ml的含3000 IU/ml IL-2之CM2介質)。
分開處理各TIL細胞系以預防交叉汙染，自孵養箱移出有TIL培養的24孔板且轉移至BSC。
使用無菌移液吸管或100至1000µl吸量管及吸管尖，自所欲使用的TIL各孔移出約1ml的介質並放入24孔組織培養板之未使用孔中。
使用新的無菌移液吸管或100至1000µl吸量管及吸管尖，將剩餘介質與TIL在孔中混合以重懸細胞，接著將細胞懸浮液轉移至標示TIL名稱且記錄體積的50ml錐形管中。
用儲備介質洗滌孔，並將該體積轉移至相同的50ml錐形管。將細胞在400 x CF下離心以收集細胞團塊。抽吸掉介質上清液並將細胞團塊重懸於含有3000 IU/ml IL-2之2-5ml的CM2介質中，所欲使用的體積基於收集的孔數及團塊大小而定，該體積應足以確保＞1.3 x 106 個細胞/ml的濃度。
使用血清吸管，將細胞懸浮液徹底混合並記錄體積。移出200µl，使用自動細胞計數器進行細胞計數。當計數時，將含有TIL細胞的50ml錐形管放入增濕、5% CO2 、37℃孵養箱中，且將蓋子鬆開以允許氣體交換。記錄計數。
自孵養箱移出含有TIL細胞之50ml錐形管，並將細胞以1.3 x 106 個細胞/ml之濃度重懸於補充有3000IU/ml IL-2之溫熱CM2中。將50ml錐形管放回孵養箱，蓋子鬆開。
第二TIL細胞系重複以上步驟。
在將TIL接種至T25培養瓶進行實驗之前，將TIL如以下所示稀釋1:10以達1.3 x 105 個細胞/ml之最終濃度。製備 MACS GMP CD3 pure (OKT3) 工作溶液
自4℃冰箱取出OKT3儲備溶液(1mg/ml)並放在BSC中。在迷你REP的介質中使用最終濃度30ng/ml的OKT3。
在實驗的各T25培養瓶中，20ml需要600ng的OKT3；此相當於每20ml需要60µl的10µg/ml溶液，或每批餵養細胞的所有6個測試培養瓶需要360µl。
就每批測試的餵養細胞而言，製備400µl的1mg/ml OKT3之1:100稀釋液，工作濃度為10µg/ml(例如為了一次測試4批餵養細胞，製備1600µl的1mg/ml OKT3之1:100稀釋液：16µl的1mg/ml OKT3+1.584ml的含3000IU/ml IL-2之CM2介質)。製備 T25 培養瓶
在製備餵養細胞之前，標示各培養瓶並用CM2介質填充培養瓶。將培養瓶放入37℃增濕5% CO2 孵養箱以保持介質溫熱，等待添加剩餘組分。一旦餵養細胞製備好，將組分添加至各培養瓶中的CM2中。 製備餵養細胞
此規程測試的每批最少需要78 x 106 個餵養細胞。由SDBB冷凍的每1ml小瓶在冷凍時具有100 x 106 個存活細胞。假設自LN2儲存解凍後有50%回收率，建議每批解凍至少二個1ml小瓶的餵養細胞，各REP給出預估100 x 106 個存活細胞。替代地，如果供應1.8ml小瓶，僅一個小瓶提供足夠的餵養細胞。
在解凍餵養細胞之前，為每批欲測試的餵養細胞預熱大約50ml的不含IL-2之CM2。自LN2儲存移出指定的餵養細胞批量小瓶、放入夾鏈儲存袋中並放在冰上。將密封夾鏈儲存袋內的小瓶浸入37℃水浴中解凍。自夾鏈袋移出小瓶、噴灑或擦拭70% EtOH並將小瓶轉移至BSC。
使用移液吸管，立即將餵養細胞小瓶的內容物轉移至50ml錐形管中的30ml溫熱CM2中。用小體積的CM2洗滌小瓶，以移除小瓶中的任何殘餘細胞。在400 x CF下離心5分鐘。抽吸上清液並重懸於4ml溫熱CM2加上3000 IU/ml IL-2中。移出200 µl，使用自動細胞計數器進行細胞計數。記錄計數。
將細胞以1.3 x 107 個細胞/ml重懸於溫熱CM2加上3000 IU/ml IL-2中。將TIL細胞自1.3 x 106 個細胞/ml稀釋至1.3 x 105 個細胞/ml。設置共培養
將TIL細胞自1.3 x 106 個細胞/ml稀釋至1.3 x 105 個細胞/ml。添加4.5ml的CM2介質至15ml錐形管。自孵養箱移出TIL細胞並使用10ml血清吸管重懸均勻。自1.3 x 106 個細胞/ml TIL懸浮液移出0.5ml的細胞並添加至15ml錐形管中4.5ml的介質。將TIL原液小瓶放回孵養箱。混合均勻。第二TIL細胞系重複進行。
將含有預熱介質之單一餵養細胞批量培養瓶從孵養箱轉移至BSC。用1ml吸管尖吸放混合餵養細胞數次並轉移1 ml(1.3 x 107 細胞)的餵養細胞批量至各培養瓶。添加60µl的OKT3工作原液(10µg/ml)至各培養瓶。將二個對照培養瓶放回孵養箱。
將1 ml (1.3 x 105 )的各TIL批量轉移至對應標示的T25培養瓶。將培養瓶放回孵養箱並直立孵養。不要擾動直到第5天。
重複進行於所有測試的餵養細胞批量。第 5 天，介質更換
製備含3000 IU/ml IL-2之CM2。各培養瓶需要10ml。使用10ml吸量管，將含3000 IU/ml IL-2的10ml溫熱CM2轉移至各培養瓶。將培養瓶放回孵養箱並直立孵養直到第7天。重複進行於所有測試的餵養細胞批量。第 7 天，收集
自孵養箱移出培養瓶並轉移至BSC，小心不要擾動培養瓶底部的細胞層。在不擾動生長在培養瓶底部的細胞下，從各測試培養瓶移出10ml的介質且從各對照組培養瓶移出15ml的介質。
使用10ml血清吸管，將細胞重懸於剩餘介質中並混合均勻以打斷任何細胞結塊。在藉由吸量管吸放徹底混合細胞懸浮液之後，移出200µl進行細胞計數。使用適當標準作業程序搭配自動化細胞計數器設備計數TIL。在第7天記錄計數。
重複進行於所有測試的餵養細胞批量。
根據下表22，評估餵養細胞對照組培養瓶中之複製不能性及評估含有TIL之培養瓶自第0天的擴增倍數。第 7 天，持續餵養細胞對照組培養瓶至第 14 天
在完成餵養細胞對照組培養瓶的第7天計數後，添加含有3000 IU/ml IL-2之15ml的新鮮CM2介質至各對照組培養瓶。將對照組培養瓶放回孵養箱並以直立位置孵養直到第14天。第 14 天，餵養細胞對照組培養瓶的延長不增生
自孵養箱移出培養瓶並轉移至BSC，小心不要擾動培養瓶底部的細胞層。在不擾動生長在培養瓶底部的細胞下，從各對照組培養瓶移出大約17ml的介質。使用5ml血清吸管，將細胞重懸於剩餘介質中並混合均勻以打斷任何細胞結塊。記錄各培養瓶的體積。
在藉由吸量管吸放徹底混合細胞懸浮液之後，移出200µl進行細胞計數。使用適當標準作業程序搭配自動化細胞計數器設備計數TIL。記錄計數。
重複進行於所有測試的餵養細胞批量。結果及接受標準 結果
γ輻照的劑量足以使餵養細胞複製不能。預期所有批量皆符合評估標準，且亦證實REP培養第7天剩餘的餵養細胞總存活數量相較於第0天減少。
預期所有餵養細胞批量到REP培養第7天皆符合TIL生長100倍擴增之評估標準。
預期餵養細胞對照組培養瓶的第14天計數持續第7天所見之不增生趨勢。接受標準
每批餵養細胞測試的每個複製TIL細胞系皆符合下列接受標準。
接受如下為兩面向(如下表22所概述)。
評估輻射劑量是否足以使MNC餵養細胞在30ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養時複製不能。複製不能係藉由在REP第7天及第14天的自動化細胞計數判定的總存活細胞計數(TVC)評估。
接受標準為「無生長」，表示在第7天及第14天的總存活細胞數量相較於在REP的第0天放入培養中的初始存活細胞數量並未增加。
評估餵養細胞支持TIL擴增的能力。TIL生長係以存活細胞從REP的第0天開始培養到REP的第7天的擴增倍數測量。在第7天，TIL培養達成最小100倍擴增(即大於在REP第0天放入培養中的總存活TIL細胞數量的100倍)，如自動化細胞計數所評估。不符合接受標準的 MNC 餵養細胞批量之列聯測試 (Contingency Testing)
如果MNC餵養細胞批量不符合上述任一接受標準，將採取下列步驟重新測試批量以排除簡單實驗誤差為其原因。
如果該批量有二或更多個剩餘衛星測試小瓶，則將該批量重新測試。如果該批量有一個或沒有剩餘衛星測試小瓶，則該批量根據上列接受標準為失敗。
為了合格，有問題的批量及對照組批量必須達成上述接受標準。符合這些標準後，該批量才可提供使用。 實例8：合格化經γ輻照的周邊血液單核細胞個別批量
此實例描述使經γ輻照的周邊血液單核細胞(PBMC)個別批量合格的新穎的簡化程序，該等細胞在本文所述之例示性方法用來作為異體餵養細胞。此實例提供評估用於產生TIL臨床批量之經輻照的PBMC細胞批量之規程。各批經輻照的PBMC係自個別供體製備。在超過100個合格化規程期間，顯示在所有情況下，來自SDBB(San Diego Blood Bank)之經輻照的PBMC批量在REP第7天擴增TIL＞100倍。此經改良的合格化規程意圖用於來自SDBB之經輻照的供體PBMC批量，該等批量接著經過進一步測試以驗證接受γ輻射劑量足以使彼等複製不能。一旦證實彼等在14天期間維持複製不能，即認為供體PBMC批量「合格」，可用於產生TIL臨床批量。先前技術
經γ輻照、生長停頓的PBMC係目前TIL之標準REP所需。PBMC上的膜受體與抗CD3(克隆OKT3)抗體結合且與培養中的TIL交聯，刺激TIL擴增。PBMC批量係從採自個別供體之全血的白血球分離術製備。將白血球分離術產物進行Ficoll-Hypaque離心、洗滌、輻照並在GMP條件下冷凍保存。
重要的是，接受TIL療法的病患不得輸注存活PBMC，因為其可導致移植物抗宿主病(GVHD)。因此供體PBMC藉由接受細胞γ-輻照來使生長停頓，導致雙股DNA斷裂且在再培養時喪失PBMC的細胞存活性。評估標準
7.2.1 經輻照的PBMC批量之複製不能性的評估標準。實驗設置
餵養細胞批量在迷你REP格式中如同彼等將與TIL共培養般測試，使用直立式T25組織培養培養瓶。對照組批量：一批過去已顯示符合7.2.1標準的經輻照的PBMC在實驗批量旁一起運行作為對照組。每批測試的經輻照的供體PBMC皆以雙份培養瓶運行。實驗方案 第 0 天
為欲測試的每批供體PBMC製備約90ml的CM2介質。將CM2於37℃水浴中保持溫熱。解凍等分試樣的6 x 106 IU/ml IL-2。將CM2介質放回BSC，在放入通風櫥之前用70% EtOH擦拭。就每批測試的PBMC而言，移出約60ml的CM2至分開的無菌瓶。添加解凍的6 x 106 IU/ml IL-2儲備溶液至此介質以達最終濃度3000 IU/ml。將此瓶標示為「CM2/IL2」(或類似用語)以與未經補充的CM2區別。製備 OKT3
自4℃冰箱取出抗CD3 (OKT3)儲備溶液並放在BSC中。在迷你REP的介質中使用最終濃度30ng/ml的OKT3。從1mg/ml儲備溶液製備10µg/ml的抗CD3 (OKT3)工作溶液。需要前放在冰箱中。
就每批測試的PBMC而言，製備150µl的抗CD3(OKT3)原液之1:100稀釋液。例如，為了一次測試4批PBMC，添加6µl的1mg/ml儲備溶液至594µl的補充有3000 IU/ml IL-2之CM2，製備600µl的10µg/ml 抗CD3 (OKT3)。製備培養瓶
7.4.8 添加每培養瓶19ml的CM2/IL-2至經標示的T25培養瓶，並將培養瓶放入37℃、增濕、5% CO2 孵養箱中，同時製備細胞。製備輻照的 PBMC
自LN2儲存取出欲測試的PBMC批量小瓶。在解凍之前將其等放在-80℃下或保持在乾冰上。對於每個欲解凍的批量，將30ml的CM2(不含IL-2補充物)放入50ml錐形管。在各管標示欲解凍的PBMC之不同批號。在使用前將管的蓋子蓋緊並放入37℃水浴中。視需要，將50ml錐形管放回BSC，在放入通風櫥之前用70% EtOH擦拭。
自冷藏移出PBMC小瓶並放入在37℃水浴中之漂浮式管架以解凍。允許解凍進行，直到小瓶中剩下少量的冰。使用無菌移液吸管，立即將小瓶內容物轉移至50ml錐形管中的30ml CM2中。自管中移出約1ml的介質以潤洗小瓶；將潤洗液放回50ml錐形管中。將蓋子蓋緊並輕柔渦漩以洗滌細胞。
在400 x g下在室溫下離心5min。使用1000µl吸管尖抽吸上清液並將細胞團塊重懸於1ml的溫熱CM2/IL-2中。替代地，在添加介質之前，藉由將加蓋管沿著空管架拖行使細胞團塊重懸。在重懸細胞團塊之後，使用CM2/IL-2介質將體積加至4ml。記錄體積。
移出小等分試樣(例如100µl)，使用自動細胞計數器進行細胞計數。根據特定自動細胞計數器SOP，執行雙份計數。極有可能必須在執行細胞計數之前執行PBMC稀釋。建議起始稀釋為1:10，但此將視所使用的細胞計數器類型而異。記錄計數。
使用CM2/IL-2介質，將PBMC濃度調整至1.3 x 107 個細胞/ml。藉由輕柔渦漩或藉由使用血清吸管輕柔上下抽吸來混合均勻。設置培養瓶
將二個經標示的T25培養瓶從組織培養孵養箱放回BSC。將10µg/ml小瓶的抗CD3/OKT3放回BSC。添加1ml的1.3 x 107 PBMC細胞懸浮液至各培養瓶。添加60µl的10µg/ml抗CD3/OKT3至各培養瓶。將加蓋培養瓶放回組織培養孵養箱，在不擾動下生長14天。將抗CD3/OKT3小瓶放回冰箱中，直到下一批需要時。重複於欲評估的各批PBMC。第 14 天，測量 PBMC 的不增生
將雙份T25培養瓶放回BSC。對於各培養瓶，使用新的10ml血清吸管，自每個培養瓶移出約17ml，接著小心抽起剩餘介質以測量培養瓶中剩餘的體積。記錄體積。
使用同一支血清吸管上下吸放，均勻混合樣本。
自各培養瓶移出200µl樣本進行計數。使用自動細胞計數器計數細胞。重複步驟7.4.26至7.4.31，評估每批PBMC。結果及接受標準 結果
預期γ輻照的劑量足以使餵養細胞複製不能。預期所有批量皆符合評估標準，證實REP培養第14天剩餘的餵養細胞總存活數量相較於第0天減少。
接受標準：每批測試的經輻照的供體PBMC皆符合下列接受標準：「無生長」，表示第14天存活細胞總數小於在REP的第0天放入培養中的初始存活細胞數量。不符合接受標準的 PBMC 批量之列聯測試。
如果經輻照的供體PBMC批量不符合上述接受標準，採取下列步驟重新測試批量以排除簡單實驗誤差為其失敗原因。如果該批量有二或更多個剩餘衛星小瓶，則將該批量重新測試。如果該批量有一個或沒有剩餘衛星小瓶，則該批量根據上述接受標準為失敗。
為了合格，進行列聯測試的PBMC批量中的兩個對照組批量及兩個有問題的批量複製皆需達成接受標準。符合此標準後，該批量才可提供使用。 實例9：製備Il-2儲備溶液(Cellgenix)
此實例描述將經純化、冷凍乾燥的重組人類介白素-2溶解成適用於進一步組織培養規程之原液樣本的過程，包括所有該些於本申請案及實例所述者，包括該些涉及使用rhIL-2者。程序
製備0.2%乙酸溶液(HAc)。將29mL無菌水轉移至50ml錐形管。添加lmL 1N乙酸至50ml錐形管。倒轉管2至3次以混合均勻。將HAc溶液藉由使用Steriflip過濾器過濾滅菌。
製備含1% HSA的PBS。添加4mL的25% HSA儲備溶液至於150mL無菌過濾器單位中之96mL PBS。過濾溶液。儲存在4℃下。對於所製備的各小瓶rhIL-2，填寫表格。
製備rhIL-2儲備溶液(6 x 106 IU/mL最終濃度)。每批rh1L-2皆不同且需要廠商檢驗證明書(COA)中提供的資訊，諸如：1) rhIL-2的每小瓶質量(mg)、2) rhIL-2的比活性(IU/mg)及3)建議0.2% HAc重構體積(mL)。
使用以下公式計算rhIL-2批量所需的1% HSA體積：
例如，根據CellGenix的rhIL-2批量10200121 COA，1mg小瓶的比活性為25x106 lU/mg。建議將rhIL-2重構於2mL 0.2% HAc中。
用酒精棉擦拭IL-2小瓶的橡膠瓶塞。使用附接至3mL注射器的16G針頭，注射建議體積的0.2% HAc至小瓶中。在抽出針頭時，小心不要使瓶塞脫出。倒轉小瓶3次且渦漩直到所有粉末溶解。小心移除瓶塞且放在一旁的酒精棉上。添加經計算體積的1% HSA至小瓶。
儲存rhIL-2溶液。短期儲存時(＜72hrs)，將小瓶儲存在4℃下。長期儲存時(＞72hrs)，將小瓶等分成更小體積且儲存在-20℃冷凍小瓶中，直到準備使用為止。避免冷凍/解凍循環。製備日期後6個月到期。Rh-IL-2標籤包括供應商及目錄編號、批號、到期日、作業者首字母、等分試樣的濃度及體積。 實例10：冷凍保存過程
此實例描述使用CryoMed控速冷凍器型號7454 (Thermo Scientific)，將用上述實例8之簡化密閉程序所製備的TIL冷凍保存的過程方法。
使用的設備(在實例9描述的除外)如下：鋁盒固定架(與CS750冷凍袋相容)、750 mL袋子的冷凍儲存盒、低壓(22 psi)液態氮瓶、冰箱、熱電偶感測器(用於袋子的帶型)及CryoStore CS750冷凍袋(OriGen Scientific)。
冷凍過程提供0.5℃速率從成核到-20℃及每分鐘1℃到-80℃終末溫度的冷卻速率。程式參數如下：步驟1：在4℃下等待；步驟2：1.0℃/min(樣本溫度)到-4℃；步驟3：20.0℃/min(室溫度)到-45℃；步驟4：10.0℃/min(室溫度)到-10.0℃；步驟5：0.5℃/min(室溫度)到-20℃；及步驟6：1.0℃/min(樣本溫度)到-80℃。 實例11：使用密閉系統產生冷凍保存TIL細胞療法
此實例描述Iovance Biotherapeutics, Inc.根據現行人體細胞組織優良操作規範及現行藥品優良製造規範cGMP製造在G-Rex培養瓶中之TIL細胞療法過程。此材料將依照US FDA藥品優良製造規範法規(21 CFR第210、211、1270及1271部分)製造，第I期至商用材料適用ICH Q7標準。
過程摘要提供於下表23。
在此實例中，假設1.0 mL/L = 1.0 g/kg，除非特別指明。一經開封後，下列到期日適用於2℃至8℃下：人類血清AB型(HI) Gemini，1個月；2-巰乙醇，1個月。硫酸建它黴素50mg/ml原液可在室溫下保持1個月。含有10L的AIM-V介質之袋子僅可在使用前至多24小時在室溫下溫熱一次。在第22天收集期間，可使用二個GatherexTM收集來自G-Rex500MCS培養瓶的TIL。第 0 天 CM1 介質製備
製備RPMI 1640介質。在BSC中，使用適當大小的吸量管，自1000 mL RPMI 1640介質中移出100.0 mL並放入標示「廢棄物」的適當大小容器。
在BSC中，添加試劑至RPMI 1640介質瓶。添加表中顯示之下列試劑至RPMI 1640介質瓶。記錄添加的體積。每瓶添加的量：熱去活化人類AB血清(100.0 mL)；GlutaMax (10.0 mL)；硫酸建它黴素50 mg/mL (1.0 mL)；2-巰乙醇(1.0 mL)
將RPMI 1640介質瓶加蓋並將瓶渦漩以確保試劑混合徹底。將來自步驟8.1.6的RPMI 1640介質過濾通過1L 0.22微米過濾器單位。標示過濾介質。無菌地將過濾介質加蓋且標示下列資訊。
解凍一個1.1 mL IL-2等分試樣(6x106 IU/mL) (BR71424)直到所有冰熔化。記錄IL-2：批號及到期日。將IL-2儲備溶液轉移至介質。在BSC中，將1.0 mL的IL-2儲備溶液轉移至在步驟8.1.8中製備的CM1第0天介質瓶。添加CM1第0天介質1瓶及IL-2 (6x106 IU/mL) 1.0 mL。將瓶加蓋並渦漩以混合含有IL-2之介質。重新標示為「完全CM1第0天介質」。
使用適當大小的吸量管移出20.0 mL的介質並分配至50ml錐形管。在BSC中，將25.0 mL的「完全CM1第0天介質」(在步驟8.1.13中製備)轉移至50 mL錐形管。將管標示為「組織片」。將G-Rex100MCS (W3013130)無菌地傳遞至BSC中。在BSC中，關閉所有G-Rex100MCS上的管夾，只剩通氣孔過濾器的管夾打開。將G-Rex100MCS培養瓶的紅色管線經由魯爾連接連接至repeater泵流體轉移組(W3009497)的較大直徑端。將Baxa泵緊鄰BSC放置。將repeater泵流體轉移組的泵管路部分從BSC移出並安裝至repeater泵中。在BSC內，移除Pumpmatic Liquid-Dispensing System (PLDS) (W3012720)的注射器並丟棄。
將PLDS吸量管經由魯爾連接連接至repeater泵流體轉移組的較小直徑端，並將吸量管尖放入「完全CM1第0天介質」中進行抽吸。打開介質與G-Rex100MCS之間的所有管夾。泵送完全CM1介質至G-Rex100MCS培養瓶中。設定泵速至「高」及「9」並將所有完全CM1第0天介質泵送至G-Rex100MCS培養瓶中。一旦所有介質皆轉移後，清除管線並停止泵。
將泵與培養瓶的連接斷開。確保培養瓶上的所有管夾皆關閉，但通氣孔過濾器除外。將repeater泵流體轉移組自紅色介質管線移除，並將紅色蓋子(W3012845)蓋在紅色介質管線上。將G-Rex100MCS培養瓶自BSC移出，加熱封閉紅色管線靠近末端魯爾的紅色蓋子。將G-Rex100MCS培養瓶標示QA提供的過程中「第0天」標籤。將樣本附接以下的「第0天」標籤。孵養箱參數：37.0±2.0 ℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2 。
將50mL錐形管放入孵養箱中≥ 30分鐘進行溫熱。第 0 天腫瘤洗滌介質製備
添加建它黴素至HBSS。在BSC中，添加5.0 mL建它黴素(W3009832或W3012735)至1 x 500 mL HBSS介質(W3013128)瓶中。記錄體積。每瓶添加：HBSS (500.0 mL)；硫酸建它黴素50 mg/ml (5.0 mL)。徹底混合試劑。將步驟8.2.1製備的含建它黴素之HBSS過濾通過1L 0.22微米過濾器單位(W1218810)。無菌地將過濾介質加蓋且標示下列資訊。第 0 天腫瘤處理
獲得腫瘤樣品並立即轉移至在2至8℃下的套件(suite)進行處理並記錄腫瘤資訊。標示三個50ml錐形管：第一個為「鑷子」、第二個為「解剖刀」、第三個為「新鮮腫瘤洗滌介質」。將5個100 mm培養皿標示為「洗滌1」、「洗滌2」、「洗滌3」、「繫留」及「不佳」。將一個6孔板標示為「較佳中間片段」。
使用適當大小吸量管，將5.0 mL的「腫瘤洗滌介質」轉移至一個較佳中間腫瘤片段6孔板的各孔中(總共30.0 mL)。使用適當大小吸量管，將在步驟8.2.4中製備的50.0 mL「腫瘤洗滌介質」轉移至每個「洗滌1」、「洗滌2」、「洗滌3」及「繫留」之100 mm培養皿中(總共200.0 mL)。使用適當大小吸量管，將在步驟8.2.4中製備的20.0 mL「腫瘤洗滌介質」轉移至每個50 mL錐形管中(總共60.0 mL)。無菌地移除二個6孔板的蓋子。將蓋子利用於選定的腫瘤片。將腫瘤無菌地傳遞至BSC中。記錄處理開始時間。
腫瘤洗滌1：使用鑷子，將腫瘤自樣品瓶移出並轉移至「洗滌1」。使用鑷子，輕柔洗滌腫瘤並記錄時間。將20.0 mL(或可用體積)的溶液按照樣本計畫自腫瘤樣品瓶轉移至50mL錐形管。標示並在2至8℃下儲存所收集的生物負載樣本直到提交測試為止。
腫瘤洗滌2：使用一支新的鑷子，將腫瘤自「洗滌1」培養皿移出並轉移至「洗滌2」培養皿。使用鑷子，藉由輕柔攪拌≥3分鐘洗滌腫瘤樣品並允許其靜置。記錄時間。
使用移液吸管，將4滴來自錐形管之腫瘤洗滌介質放入6孔板向上翻轉的蓋子(2個蓋子)上的6個圓圈之各者中。二個圓圈多放一滴，總共50滴。
腫瘤洗滌3：使用鑷子，將腫瘤自「洗滌2」培養皿移出並轉移至「洗滌3」培養皿。使用鑷子，藉由輕柔攪拌洗滌腫瘤樣品並允許其靜置≥ 3分鐘。記錄時間。
在150 mm培養皿蓋子下方放置一支尺。使用鑷子，將腫瘤樣品無菌地轉移至150 mm分割培養皿蓋子。將所有腫瘤樣品片端對端排列並記錄大約整體長度及片段數量。評估腫瘤的壞死/脂肪組織。評估是否觀察到＞30%的整體腫瘤區域為壞死及/或脂肪組織；如果是的話，確保腫瘤如果如此繼續進行的話具有適當大小。評估是否觀察到＜30%的整體腫瘤區域為壞死或脂肪組織；如果是的話，則繼續進行。
清除分割。如果腫瘤大且觀察到＞30%的組織外部為壞死/脂肪，藉由移除壞死/脂肪組織來執行「清除分割」，同時使用解剖刀及/或鑷子的組合保留腫瘤內部結構。為了維持腫瘤內部結構，僅使用垂直切割壓力。不以解剖刀進行鋸切動作來切割。
使用解剖刀及/或鑷子之組合，將腫瘤樣品切割成均勻、適當大小的片段(至多6個中間片段)。為了維持腫瘤內部結構，僅使用垂直切割壓力。不以解剖刀進行鋸切動作來切割。確保保持非分割中間片段完全浸沒在「腫瘤洗滌介質」中。將各中間片段轉移至「繫留」培養皿。
一次操作一個中間片段，將腫瘤中間片段在分割培養皿中分割成大小大約3x3x3mm的片，將每片上的出血、壞死及/或脂肪組織的量最小化。為了維持腫瘤內部結構，僅使用垂直切割壓力。不以解剖刀進行鋸切動作來切割。
選擇至多八(8)個無出血、壞死及/或脂肪組織的腫瘤片。使用尺作為參考。持續分割直到已獲得8個較佳片，或已分割整個中間片段。將各選定片轉移至「腫瘤洗滌介質」液滴中之一者。
在從中間片段選擇至多八(8)片之後，將中間片段的殘留物放入「較佳中間片段」6孔板中的新單一孔。
如果仍有所欲組織，從「較佳中間片段」6孔板選擇額外較佳腫瘤片以最多50片填滿液滴。記錄所產生的分割片的總數。
將「組織片」50mL錐形管從孵養箱移出。確保錐形管加熱≥30 min。將「組織片」50mL錐形管傳遞至BSC中，確保不破壞開放處理表面的無菌性。
使用移液吸管、解剖刀、鑷子或組合，將選定的50個最佳腫瘤片段從較佳培養皿蓋子轉移至「組織片」50 mL錐形管。如果腫瘤片在轉移過程中掉落且仍有所欲組織，則添加來自較佳腫瘤中間片段孔的額外片。記錄片數。
將含有介質的G-Rex100MCS從孵養箱移出。將G-Rex100MCS培養瓶無菌地傳遞至BSC中。當轉移培養瓶時，不要握住容器的蓋子或底部。拿握側邊來轉移容器。在BSC中，將G-Rex100MCS培養瓶蓋子拿掉，確保維持內部管路的無菌性。渦漩含有腫瘤片的錐形管以懸浮，並將內容物快速倒入G-Rex100MCS培養瓶中。確保腫瘤片均勻分布在培養瓶的膜上。如有需要將培養瓶輕柔來回傾斜，以使腫瘤片均勻分布。記錄容器底部膜上的腫瘤片段數量以及所觀察到漂浮在容器中的數量。注意：如果接種片段數量不等於步驟8.3.36H中收集的數量，聯絡地區管理，並記錄在第10.0節。
以下列參數孵養G-Rex100MCS：孵養G-Rex培養瓶：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。執行計算以判定在第11天將G-Rex100MCS移出孵養箱的適當時間。計算：孵養時間；下限=孵養時間+252小時；上限=孵養時間+276小時。第 11 天，介質製備
監測孵養箱。孵養箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。將3個1000 mL RPMI 1640介質(W3013112)瓶及3個1000 mL AIM-V (W3009501)瓶在孵養箱中溫熱≥30分鐘。記錄時間。介質：RPMI 1640及AIM-V。將額外1個1000 ml AIM-V介質瓶(W3009501)放在室溫下以供進一步使用。
當時間到達後，移出RPMI 1640介質。記錄結束孵養時間於步驟8.4.4。確保介質溫熱≥30 min。在BSC中，從三個預熱的1000 mL RPMI 1640介質瓶中的每一瓶移出100.0 mL並放入標示「廢棄物」的適當大小容器。在BSC中，添加下列試劑到三個RPMI 1640介質瓶中的每一瓶，並記錄添加到每一瓶的體積。GemCell熱去活化AB型人類血清(100.0 mL)、GlutaMax (10.0 mL)、硫酸建它黴素50 mg/ml (1.0 mL)、2-巰乙醇(1.0 mL)。
將瓶加蓋並渦漩以確保試劑混合徹底。將每一瓶介質過濾通過分開的1L 0.22微米過濾器單位。將過濾介質無菌地加蓋並將每一瓶標示為CM1第11天介質。解凍3 x 1.1mL等分試樣的IL-2 (6x106 IU/mL) (BR71424)直到所有冰熔化。記錄IL 2批號及到期日。
將三瓶AIM-V介質自孵養箱移出。記錄結束孵養時間。確保介質已溫熱≥ 30分鐘。使用微量吸管，添加3.0mL解凍的IL-2至一瓶1L預熱AIM-V介質中。在分配IL-2後用介質潤洗微量吸管尖端。每個等分試樣使用新的無菌微量吸管尖端。記錄總添加體積。將瓶標示為「含有IL-2的AIM-V」。將10L Labtainer袋子及repeater泵轉移組無菌地轉移至BSC中。關閉10L Labtainer袋子上的所有管線。將repeater泵轉移組的較大直徑管路端經由魯爾鎖連接附接至10L Labtainer袋子的中間母埠。
將Baxa泵緊鄰BSC放置。將轉移組管路裝入Baxa泵。將Baxa泵設定至「高」及「9」。移除Pumpmatic Liquid-Dispensing System (PLDS)的注射器並丟棄。確保不破壞PLDS吸量管的無菌性。
將PLDS吸量管經由魯爾連接連接至repeater泵流體轉移組的較小直徑端，並將吸量管尖放入含有IL-2的AIM-V介質瓶(在步驟8.4.13中製備)中進行抽吸。打開介質瓶與10L Labtainer之間的所有管夾。
使用PLDS，將在步驟8.4.13中製備的含有IL-2的預熱AIM-V介質以及二瓶額外的AIM-V轉移至10L Labtainer袋子中。添加三瓶來自步驟8.4.10之過濾的CM1第11天介質。在添加最終瓶後，清除通往袋子的管線。注意：在添加每瓶介質之間停止泵。將PLDS自轉移組移除並將紅色蓋子蓋在BSC中之管線的魯爾上。輕柔按摩袋子以混合。將介質袋子標示下列資訊。到期日為自製備日期起的24小時。
將60mL注射器附接至「完全CM2第11天介質」袋子的可用母埠。移出20.0mL的介質並放入50mL錐形管中。將紅色蓋子蓋在「完全CM2第11天介質」袋子的母埠上。標示並在2至8℃下儲存介質保留樣本直到提交測試為止。熱封靠近紅色蓋子的轉移組管線上的紅色蓋子。將轉移組保持在袋子上。
在BSC中，添加4.5mL的已標示「用於細胞計數稀釋」及批號之AIM-V介質至四個15mL錐形管。將管標示批號及管編號(1至4)。將4支冷凍小瓶標示「餵養細胞」及小瓶編號(1至4)。將任何剩餘的2-巰乙醇、GlutaMax及人類血清自BSC轉移至2至8℃。
在BSC外，將1L轉移包接合至附接至經製備的「完全CM2第11天介質」袋子的轉移組。將轉移包標示為「餵養細胞CM2介質」及批號。在1L轉移包管路離袋子幾英寸處的管路上作一個記號。將空的轉移包放在磅秤上，使得該記號處以上的管路在磅秤上。將磅秤歸零，並將空的轉移包留在磅秤上。
將Baxa泵設定至「中」及「4」。將500.0±5.0mL的在步驟8.4.22中製備的「完全CM2第11天」介質泵送至細胞CM2介質轉移包中。測量重量並記錄添加至轉移包的完全CM2介質體積。
一旦填滿，加熱封閉管線。將含轉移組的CM2第11天介質袋與餵養細胞介質轉移包分開，將接合保留在1L轉移包。將所製備的「完全CM2第11天介質」放在孵養箱中直到使用。第 11 天， TIL 收集
孵養箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。將G-Rex100MCS自孵養箱移出前，執行檢查以確保符合孵養參數。下限與上述相同。
記錄自孵養箱移出的時間。小心地將G-Rex100MCS自孵養箱移出並確保所有管夾皆已關閉(大過濾器管線除外)。記錄處理開始時間。
將300mL轉移包標示為「TIL懸浮液」。無菌接合TIL懸浮液轉移(單一管線)與重力血液過濾器。將300mL轉移包放在磅秤上並記錄乾重。將1L轉移包標示為「上清液」。
將來自G-Rex100MCS的紅色介質移除管線無菌接合至「上清液」轉移包。將來自G-Rex100MCS的透明細胞移除管線無菌接合至連接至「TIL懸浮液」轉移包之血液過濾器頂端的二個穿刺針管線的其中之一。將G-Rex100MCS放在GatheRex的左側且將「上清液」及「TIL懸浮液」轉移袋放在右側。
將來自G Rex100MCS的紅色介質移除管線安裝至GatheRex上的頂部管夾(標示紅色管線)及管路導引器。將來自G-Rex100MCS的透明收集管線安裝至GatheRex上的底部管夾(標示藍色管線)及管路導引器。將來自GatheRex的氣體管線附接至G-Rex100MCS培養瓶的無菌過濾器。在從G-Rex100MCS培養瓶移除上清液之前，確保細胞移除管線上的所有管夾皆已關閉。將約900 mL的培養上清液從G-Rex100MCS轉移至1L轉移包。目視檢查G-Rex100MCS培養瓶以確保培養瓶水平且介質減少至抽吸液浸管的末端。
在移除上清液後，將所有至紅色管線的管夾關閉。
劇烈拍打培養瓶並渦漩介質以釋放細胞。檢視培養瓶以確保所有細胞皆已脫附。注意：如果細胞沒有脫附，聯絡地區管理。傾斜培養瓶遠離收集管路並允許腫瘤片沿著邊緣沉降。緩慢地將培養瓶傾向收集管路，使片維持在培養瓶的對側。如果細胞收集吸管不是位在側壁與底膜的交接處，當傾斜45度角時扣擊培養瓶通常足以正確地定位吸管。
釋放所有導向TIL懸浮液轉移包的管夾。使用GatheRex，將細胞懸浮液轉移通過血液過濾器至300mL轉移包中。維持傾斜邊緣直到所有細胞及介質皆已收集。檢視膜上有無附著細胞。潤洗G-Rex100MCS的底部。用潤洗介質覆蓋約1/4的氣體交換膜。確保所有管夾皆已關閉。在TIL懸浮液轉移包盡可能靠近接合處熱封(按照過程注意事項5.12)，以使整體管路長度維持大約相同。將「上清液」轉移包熱封。維持足夠管線以接合。記錄TIL懸浮液轉移包的重量並計算細胞懸浮液的體積。
將4”血漿轉移組接合至「上清液」轉移包，保留在4”血漿轉移組上的魯爾連接，並轉移至BSC中。將4”血漿轉移組接合至300mL「TIL懸浮液」轉移包，保留在4”血漿轉移組上的魯爾連接，並轉移至BSC中。
自1L「上清液」轉移包抽取大約20.0 mL的上清液並分配至標示「Bac-T」的無菌50mL錐形管中。使用適當大小的注射器自標示BacT的50mL錐形管移出1.0 mL樣本並接種厭氧瓶。
將4支冷凍小瓶標示小瓶編號(1至4)。使用分開的3mL注射器，自使用魯爾連接的TIL懸浮液轉移包抽出4x1.0mL細胞計數樣本並放入各別冷凍小瓶。將紅色蓋子(W3012845)蓋在管線上。將TIL轉移包放在孵養箱中直到需要。執行細胞計數及計算。執行未稀釋的初始細胞計數。如果不需要稀釋，「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」= 0。
記錄細胞計數及TIL數量。如果總存活TIL細胞為＜5x106 個細胞，則繼續進行至「第11天G-Rex填充及接種」。如果總存活TIL細胞為＞5x106 ，則繼續進行至「流動式細胞測量術的計算」。流動式細胞測量術的計算。
如果總存活TIL細胞計數為≥4.0x107 ，則計算體積以獲得流動式細胞測量術樣本的1.0x107 個細胞。流動式細胞測量術所需的總存活細胞：1.0x107 個細胞。流動式細胞測量術所需的細胞體積：存活細胞濃度除以1.0x107 個細胞。
若適用：重新計算總存活細胞及體積流。計算在移除以下細胞測量術樣本之後剩餘的總存活細胞及剩餘體積。TIL 冷凍保存樣本
若適用：計算用於冷凍保存的體積。計算要獲得用於冷凍保存的1x107 個細胞所需之細胞體積。
若適用：移出用於冷凍保存之樣本。自TIL懸浮液轉移包移出所計算之體積。放入適當大小的錐形管並標示為「冷凍保存樣本1x107 細胞」、日期及批號。將紅色蓋子(W3012845)蓋在TIL懸浮液轉移包上。
根據下列參數，離心「冷凍保存樣本1x107 細胞」：速度：350 x g，時間：10:00分鐘，溫度：室溫，剎車：完整(9)；加速：完整(9)。
添加CS-10。在BSC中，無菌地抽吸上清液。輕柔拍打管底部以將細胞重懸於剩餘流體中。添加CS-10。緩慢添加0.5mL的CS10。記錄添加的體積。冷凍保存填充約0.5mL的樣本小瓶。第 11 天，餵養細胞
從LN2冷凍器獲得3袋至少二個不同批號的餵養細胞。將細胞保持在乾冰上直到準備解凍為止。記錄餵養細胞的細胞資訊。確認獲得至少二個不同批量的餵養細胞。將餵養細胞細胞袋放入基於批號之個別夾鏈袋中，並在37.0±2.0℃水浴或cytotherm中解凍約3至5分鐘或直到冰開始消失。
餵養細胞細胞制具(harness)製備。將4S-4M60接合至CC2 Cell Connect (W3012820)，將Cell Connect設備的單一穿刺針置換成4S-4M60歧管的4穿刺針端。視需要接合。
附接介質轉移包將「餵養細胞CM2介質」轉移包接合至CC2魯爾。該袋將用無針注射埠附接至制具側邊。將含有完全CM2第11天介質的總成轉移至BSC中。
匯合解凍的餵養細胞。在BSC內，抽取10mL的空氣至100mL注射器中。使用此置換CC2上的60mL注射器。在移除罩蓋之前，用酒精棉擦拭餵養細胞袋上的每個埠。使用CC2的三支穿刺針穿刺三個餵養細胞袋。在將穿刺針轉向一個方向時維持恆壓。確保不要穿刺埠側邊。打開活栓，使得來自餵養細胞袋的管線打開且通往無針注射埠的管線關閉。抽取餵養細胞袋的內容物至注射器中。所有三個袋子同時抽光。一旦餵養細胞袋已抽光，在維持注射器壓力下，將通往餵養細胞袋的管線夾住。不要拔開在制具注射器下方的注射器。記錄注射器中餵養細胞的總體積。
添加餵養細胞至轉移包。轉動活栓，使得通往餵養細胞袋的管線關閉且通往介質轉移包的管線打開。確保通往介質轉移包的管線沒有夾住。自注射器分配餵養細胞至「餵養細胞CM2介質」轉移包。夾住通往含有餵養細胞的轉移包的管線並留下附接至制具的注射器。按摩袋子以混合轉移包中匯合的餵養細胞。將袋子標示為「餵養細胞懸浮液」。
計算餵養細胞懸浮液的總體積。移出細胞計數樣本。每個樣本使用分開的3mL注射器，使用無針注射埠從餵養細胞懸浮液轉移包抽取4x1.0mL細胞計數樣本。將各樣本等分至標示的冷凍小瓶中。
利用NC-200及過程注意事項5.14，執行細胞計數及計算。藉由添加0.5mL的細胞懸浮液至標示批號及「用於細胞計數稀釋」之4.5mL的AIM-V介質中，稀釋細胞計數樣本。此將給出1:10稀釋。
記錄細胞計數及樣本體積。如果總存活細胞＜5 x109 ，繼續進行。如果總存活細胞≥5 x109 ，如上述較高細胞計數繼續進行。視需要獲得額外之餵養細胞且添加至如上所討論之轉移包。計算要獲得5x109 存活餵養細胞所需之餵養細胞懸浮液的體積。計算要移除之過量餵養細胞的體積。向下捨入至最靠近的整數。
移除過量餵養細胞。在新的100mL注射器中，抽取10mL的空氣並將注射器附接至制具。打開通往「餵養細胞懸浮液」轉移包的管線。使用注射器抽取步驟8.6.71C所計算的餵養細胞體積加上來自轉移包之額外的10.0mL至100mL注射器。一旦移除餵養細胞體積，關閉通往餵養細胞懸浮液轉移包的管線。不要移除最終注射器。一旦注射器已填滿，用新的注射器置換。多支注射器可用於移除總體積。使用每支新的注射器時，抽取10mL的空氣。記錄移除餵養細胞的總體積(包括額外10mL)。
添加OKT3。在BSC中，使用1.0mL注射器及16G針頭，抽取0.15mL的OKT3。將注射器的針頭無菌地移除並將注射器附接至無針注射埠。注射OKT3。打開通往「餵養細胞懸浮液」轉移包的活栓並添加步驟8.6.73移除的10mL餵養細胞以將OKT3沖過管線。將注射器由上翻轉向下並推注空氣以清除通往餵養細胞懸浮液轉移包的管線。將剩餘的餵養細胞懸浮液留在注射器中。關閉所有管夾並將制具從BSC移出。將餵養細胞懸浮液轉移包熱封，留下足夠管路以接合。第 11 天， G-Rex 填充及接種
設置G-Rex500MCS。將G-Rex500MCS自包裝移出並檢視培養瓶有無任何裂縫或管路扭結。確保所有魯爾緊密連接及封閉。關閉G-Rex500MCS管線上的所有管夾，但通氣孔過濾器管線除外。使用奇異筆在4.5L刻度處畫一條線。自孵養箱移出「完全CM2第11天介質」。
準備泵送介質。將G-Rex500MCS的紅色管線與附接至完全CM2第11天介質的repeater泵轉移組接合。將「完全CM2第11天介質」袋子吊掛在IV點滴架上。將泵管路裝入Baxa泵。泵送介質至G-Rex500MCS中。將Baxa泵設定至「高」及「9」。泵送4.5L的介質至G-Rex500MCS中，填充至培養瓶4.5L刻度處標示的線。在靠近接合處熱封G-Rex500MCS的紅色管線。將培養瓶標示「第11天」標籤。將餵養細胞懸浮液轉移包接合至培養瓶。將G-Rex500MCS紅色管線無菌接合至「餵養細胞懸浮液」轉移包。
添加餵養細胞至G-Rex500MCS。打開餵養細胞懸浮液與G-Rex500MCS之間的所有管夾並藉由重力饋送添加餵養細胞懸浮液至培養瓶。在靠近接合處熱封紅色管線。將TIL懸浮液轉移包接合至培養瓶。將G-Rex500MCS紅色管線無菌接合至「TIL懸浮液」轉移包。
添加TIL至G-Rex500MCS。打開TIL懸浮液與G-Rex500MCS之間的所有管夾並藉由重力饋送添加TIL懸浮液至培養瓶。在靠近接合處熱封紅色管線，以移除TIL懸浮液袋子。
孵養G-Rex500MCS。檢查G-Rex500MCS的所有管夾皆已關閉(大過濾器管線除外)，並放在孵養箱中。孵養箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5% CO2。
計算孵養窗。執行計算以判定在第16天將G-Rex500MCS移出孵養箱的適當時間。下限：孵養時間+108小時。上限：孵養時間+132小時。第 11 天，過量 TIL 冷凍保存
冷凍過量TIL小瓶。記錄並驗證放入控速冷凍器(CRF)中的小瓶總數。在完成冷凍後，將小瓶從CRF轉移至適當儲存容器。第 16 天，介質製備
預熱AIM-V介質。將三個CTS AIM V 10L介質袋在使用前至少12小時自2至8℃移出並放在室溫下避免光照。標示每一袋。記錄溫熱起始時間及日期。確保所有袋已溫熱一段介於12與24小時之間的期間。
將流體泵轉移組的較大直徑端使用魯爾接頭附接至10L Labtainer袋子的一個母埠。設置10L Labtainer用於上清液。標示為「上清液」。設置10L Labtainer用於上清液。在從BSC移出之前，確保所有管夾關閉。
每袋CTS AIM V介質解凍5x1.1mL等分試樣的IL-2(6x106 IU/mL) (BR71424)直到所有冰熔化。將100.0mL的Glutamax等分至適當大小接受器中。記錄添加至各接受器的體積並將各接受器標示為「GlutaMax」。
添加IL-2至GlutaMax。使用微量吸管，添加5.0mL的IL-2至各GlutaMax接受器。確保按照過程注意事項5.18潤洗吸管尖，並且添加每mL使用新的吸量管尖。記錄添加至各Glutamax接受器的體積並將各接受器標示為「GlutaMax+IL-2」及接受器編號。
製備用於調配之CTS AIM V介質袋。確保CTS AIM V 10L介質袋(W3012717)在使用前12至24小時在室溫下溫熱且避免光照。記錄結束孵養時間。在BSC中，關閉4”血漿轉移組上的管夾，接著使用穿刺針埠連接至該袋。在將穿刺針轉向一個方向時維持恆壓。確保不要穿刺埠側邊。將repeater泵流體轉移組的較大直徑端經由魯爾連接至4”血漿轉移組。
將Baxa泵緊鄰BSC放置。將repeater泵流體轉移組的泵管路部分從BSC移出並安裝至repeater泵中。
準備調配介質。在BSC中，移除Pumpmatic Liquid-Dispensing System (PLDS)的注射器並丟棄。確保不破壞PLDS吸量管的無菌性。將PLDS吸量管經由魯爾連接連接至repeater泵流體轉移組的較小直徑端，並將吸量管尖放入以上製備之「GlutaMax+IL-2」中進行抽吸。打開介於接受器與10L袋子之間的所有管夾。
泵送GlutaMax+IL-2至袋中。設定泵速至「中」及「3」並將所有「GlutaMax+IL-2」泵送至10L CTS AIM V介質袋中。一旦沒有剩餘溶液，清除管線並停止泵。記錄添加至以下每個Aim V袋之含有IL-2之GlutaMax的體積。
移除PLDS。確保所有管夾關閉，並將PLDS吸量管從repeater泵流體轉移組移除。移除repeater泵流體轉移組並將4”血漿轉移組蓋上紅色蓋子。
標示所製備的每袋「完全CM4第16天介質」。
按照樣本計畫移除介質保留。使用30mL注射器，藉由將注射器附接至4”血漿轉移組移除20.0mL的「完全CM4第16天介質」，並分配樣本至50mL錐形管中。在移除注射器後，確保4”血漿轉移組用管夾夾住或用紅色蓋子蓋住。
附接新的repeater泵流體轉移組。將新的流體泵轉移組的較大直徑端附接至連接至「完全CM4第16天介質」袋子的4”血漿轉移組上。用樣本計畫庫存標籤標示並在2至8℃下儲存介質保留樣本直到提交測試為止。
監測孵養箱。若適用，監測所製備的額外袋。孵養箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5% CO2。
溫熱完全CM4第16天介質。在孵養箱中溫熱第一袋完全CM4第16天介質≥30分鐘，直到準備使用為止。若適用，溫熱額外袋。
製備稀釋。在BSC中，添加4.5mL的已標示「用於細胞計數稀釋」之AIM-V介質至各4x15mL錐形管。標示錐形管。標示4個冷凍小瓶。第 16 天 REP 分瓶
監測孵養箱。孵養箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5% CO2
自孵養箱移出G-Rex500MCS。執行以下檢查，以在自孵養箱移出G-Rex500MCS之前確保符合孵養參數：上限、下限、移出時間。自孵養箱移出G-Rex500MCS。
將1L轉移包(W3006645)熱封，留下約12”的管線。將1L轉移包標示為TIL懸浮液。將1L轉移包(包括完整管線)放在磅秤上並記錄乾重。
GatheRex設置。將G-Rex500MCS的紅色介質移除管線無菌接合至以上製備之10L labtainer袋「上清液」上的repeater泵轉移組。將G-Rex500MCS的透明細胞移除管線無菌接合至以上製備的TIL懸浮液轉移包。將G-Rex500MCS培養瓶放在GatheRex的左側。將上清液labtainer袋及TIL懸浮液轉移包放在右側。將來自G-Rex500MCS的紅色介質移除管線安裝至GatheRex上的頂部管夾(標示紅色管線)及管路導引器。將來自G-Rex500MCS的透明收集管線安裝至GatheRex上的底部管夾(標示藍色管線)及管路導引器。將來自GatheRex的氣體管線附接至G-Rex500 MCS的無菌過濾器。注意：在從G-Rex500MCS移除上清液之前，確保細胞移除管線上的所有管夾皆已關閉。
G-Rex500MCS的體積減少。按照SOP-01777，將約4.5L的培養上清液從G-Rex500MCS轉移至10L Labtainer。目視檢查G-Rex500MCS以確保培養瓶水平且介質減少至抽吸液浸管的末端。
製備培養瓶以進行TIL收集。在移除上清液後，將所有至紅色管線的管夾關閉。
起始TIL收集。記錄TIL收集的起始時間。劇烈拍打培養瓶並渦漩介質以釋放細胞。檢視培養瓶以確保所有細胞皆已脫附。傾斜培養瓶以確保管子位在培養瓶邊緣。如果細胞收集吸管不是位在側壁與底膜的交接處，當傾斜45度角時扣擊培養瓶通常足以正確地定位吸管。
TIL收集。釋放所有導向TIL懸浮液轉移包的管夾。使用GatheRex，將細胞懸浮液轉移至TIL懸浮液轉移包中。注意：確定維持傾斜邊緣直到所有細胞及介質皆已收集。檢視膜上有無附著細胞。
潤洗培養瓶膜。潤洗G-Rex500MCS的底部。用潤洗介質覆蓋約1/4的氣體交換膜。關閉G-Rex500MCS上的管夾。確保G-Rex500MCS上的所有管夾皆關閉。
熱封。在含有TIL的轉移包盡可能靠近接合處熱封，以使整體管路長度維持大約相同。將含有上清液之10L Labtainer熱封並傳遞至BSC中進行樣本收集。
記錄含細胞懸浮液之轉移包的重量並計算體積懸浮液。製備轉移包以進行樣本移除。將4”血漿轉移組接合至上述TIL懸浮液轉移包，留下盡量靠近袋子附接的母魯爾端。
移除細胞上清液的測試樣本。在BSC中，使用母魯爾埠及適當大小的注射器，自10L labtainer移出10.0 mL的上清液。放入15mL錐形管中並標示「BacT」且保留該管以用於BacT樣本。使用分開的注射器，移出10.0 mL的上清液並放入15mL錐形管中。保留該管用於黴漿菌測試樣本。標示管為「黴漿菌稀釋劑」。關閉上清液袋。將紅色蓋子蓋在魯爾埠上以關閉袋，並傳遞出BSC。
移出細胞計數樣本。在BSC中，每個樣本使用分開的3mL注射器，自「TIL懸浮液」轉移包的魯爾連接移出4x1.0 mL細胞計數樣本。將樣本放入以上製備的冷凍小瓶中。
移出黴漿菌樣本。使用3mL注射器，自TIL懸浮液轉移包移出1.0 mL並放入以上製備之標示「黴漿菌稀釋劑」的15 mL錐形管中。標示並在2至8℃下儲存黴漿菌樣本直到提交測試為止。
製備用於接種之轉移包。在BSC中，將repeater泵流體轉移組的大直徑管路端附接至含有TIL之轉移包上的魯爾轉接頭。使用止血鉗夾住靠近轉移包的管線。將紅色蓋子蓋在轉移組的端上。
將TIL放入孵養箱中。將細胞懸浮液從BSC移出並放入孵養箱直到需要為止。記錄時間。
執行細胞計數。利用NC-200執行細胞計數及計算。最初藉由添加0.5mL的細胞懸浮液至以上製備的4.5mL的AIM-V介質中稀釋細胞計數樣本。此給出1:10稀釋。
計算培養瓶以進行繼代培養。計算要接種的培養瓶總數。注意：將G-Rex500MCS培養瓶的數量進位以求出最近的整數。
欲接種之G-Rex500MCS培養瓶的最大數量為五。如果計算出的欲接種培養瓶數量超過五，使用可用細胞懸浮液的全部體積僅接種五瓶。
判定需要的額外介質袋數量。計算除了以上製備的袋子之外所需的介質袋數量。將所需的介質袋數量進位至下一個整數。
視需要製備額外介質。步驟8.10.59D中計算之所需的每二個G-Rex-500M培養瓶製備一個10L「CM4第16天介質」袋。繼續進行至步驟8.10.62並接種第一GREX-500M培養瓶，同時製備並溫熱額外介質。
視需要製備額外介質袋。製備並溫熱以上判定之計算數量的額外介質袋。
填充G-Rex500MCS。在檯面上打開G-Rex500MCS並檢視瓶身是否有裂縫或管路是否扭結。確保所有魯爾緊密連接及封閉。用奇異筆在培養瓶外面4500mL刻度處畫一條線。關閉G-Rex500MCS上的所有管夾，但大過濾器管線除外。將G-Rex500MCS的紅色介質管線無菌接合至以上製備之介質袋上的流體轉移組。
準備泵送介質。將「CM4第16天介質」吊掛在IV點滴架上。將泵管路裝入Baxa泵。
泵送介質至G-Rex500MCS中。將Baxa泵設定至「高」及「9」且泵送4500mL的介質至培養瓶中。泵送4.5L的「CM4第16天介質」至G-Rex500MCS中，填充至培養瓶如上標示的線。一旦已轉移4.5L的介質，停止泵。
熱封。在靠近所產生的接合處熱封G-Rex500MCS的紅色介質管線，移除介質袋子。
重複填充。在溫熱及製備供使用的介質時，對以上所計算的每個培養瓶重複進行填充及封閉步驟。可使用重力填充或多個泵，同時填充多個培養瓶。每袋介質僅填充二個培養瓶。
記錄並標示填充的培養瓶。以字母及「第16天」標籤標示每個培養瓶。
視需要孵養培養瓶。在等待接種TIL時，將培養瓶保持在孵養箱中。記錄填充的培養瓶總數。
計算要添加的細胞懸浮液體積。計算要添加至新的G-Rex500MCS培養瓶之TIL懸浮液的目標體積。
如果培養瓶數量超過五個，使用細胞懸浮液的全部體積僅接種五瓶。
製備用於接種之培養瓶。自孵養箱移出步驟8.10.70的G-Rex500MCS。
準備泵送。關閉G-Rex500MCS上的所有管夾，但大過濾器管線除外。將泵管路裝入Baxa泵。
自孵養箱移出TIL。將「TIL懸浮液」轉移包從孵養箱移出並記錄孵養結束時間。
製備用於接種之細胞懸浮液。將上述「TIL懸浮液」轉移包無菌接合至泵入口管線。
將TIL懸浮液袋放在磅秤上。使用設定至「低」及「2」的Baxa泵，自TIL懸浮液袋灌注管線至接合處。將磅秤歸零。
用TIL懸浮液接種培養瓶。將Baxa泵設定至「中」及「5」。泵送以上計算之體積的TIL懸浮液至培養瓶中。記錄添加至每個培養瓶中之TIL懸浮液的體積。
熱封。將「TIL懸浮液」轉移包熱封，留下足夠管路以接合至下一個培養瓶。
填充剩餘培養瓶。在每個接種的培養瓶之間，確保混合「TIL懸浮液」轉移包並重複填充及熱封步驟以接種所有剩餘培養瓶。
監測孵養箱。如果培養瓶必須分至兩個孵養箱，確保監測兩者。孵養箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5% CO2。記錄每個培養瓶放入孵養箱中的時間。
計算孵養窗。執行以下計算以判定在第22天將G-Rex500MCS移出孵養箱的時間範圍。下限：時間+132小時；上限：時間+156小時。第 22 天洗滌緩衝液製備
製備10 L Labtainer袋。在BSC中，經由魯爾連接將4”血漿轉移組附接至10L Labtainer袋。製備10 L Labtainer袋。標示「上清液」、批號及首字母/日期。轉移出BSC之前關閉所有管夾。注意：每二個所欲收集的G-Rex500MCS培養瓶製備一個10L Labtainer袋。
接合流體轉移組。在BSC外，關閉4S-4M60上的所有管夾。將repeater流體轉移組接合至4S-4M60的一個公魯爾端。
將Plasmalyte-A及人類白蛋白25%傳遞至BSC中。將4S-4M60及repeater流體轉移組總成傳遞至BSC中。
將Plasmalyte泵送至3000mL袋子中。將三袋Plasmalyte-A用4S-4M60接頭組穿刺。注意：在移除埠罩蓋之前，用酒精拭子(W3009488)擦拭埠罩蓋。注意：在將穿刺針轉向一個方向時維持恆壓。確保不要穿刺埠側邊。將Origen 3000mL收集袋經由魯爾連接連接至repeater泵轉移組的較大直徑端。關閉3000mL Origen袋之未使用管線上的管夾。將Baxa泵緊鄰BSC放置。將轉移組管路裝入位在BSC外之Baxa泵。將泵設定至「高」及「9」。打開自Plasmalyte-A至3000mL Origen袋的所有管夾。泵送所有Plasmalyte-A至3000 mL Origen袋中。一旦已轉移所有Plasmalyte-A，停止泵。如有需要，藉由逆轉泵及操作袋子的位置，自3000mL Origen袋移除空氣。關閉所有管夾。
將3000mL袋子經由魯爾連接自repeater泵流體轉移組移除並將紅色蓋子(W3012845)蓋在通往袋子的管線上。
添加人類白蛋白25%至3000mL袋子。打開通氣的迷你穿刺針。不破壞穿刺針的無菌性，確保藍色蓋子穩固蓋好。用通氣的迷你穿刺針穿刺人類白蛋白25%瓶子的隔膜。注意：確保不破壞穿刺針的無菌性。重覆二次，總共穿刺三(3)次人類白蛋白25%瓶子。移除一個通氣的迷你穿刺針的藍色蓋子並將60mL注射器附接至人類血清白蛋白25%瓶子。抽取60mL的人類血清白蛋白25%。可能需要使用超過一瓶人類血清白蛋白25%。如有需要，將注射器與通氣的迷你穿刺針去連接並將注射器連接至在人類血清白蛋白25%瓶子中的下一個通氣的迷你穿刺針。一旦獲得60mL，將注射器自通氣的迷你穿刺針移除。將注射器附接至填充Plasmalyte-A之3000mL Origen袋子上的無針注射埠。分配所有人類白蛋白25%。重複以獲得最終體積120.0 mL的人類白蛋白25%。在添加所有人類白蛋白25%後，輕柔混合袋子。標示為「LOVO洗滌緩衝液」並指定24小時到期日。
製備IL-2稀釋劑。使用10mL注射器，使用LOVO洗滌緩衝液袋子上的無針注射埠移出5.0 mL的LOVO洗滌緩衝液。分配LOVO洗滌緩衝液至50mL錐形管中並標示為「IL-2稀釋劑」。
等分CRF空白袋LOVO洗滌緩衝液。使用100mL注射器，自無針注射埠抽取70.0 mL的LOVO洗滌緩衝液。注意：每次使用前用酒精棉擦拭無針注射埠。將紅色蓋子蓋在注射器上並標示為「空白冷凍袋」及批號。注意：將注射器保持在室溫下，直到步驟8.14.3需要為止。
完成洗滌緩衝液製備。關閉LOVO洗滌緩衝液袋上的所有管夾。
解凍IL-2。解凍一個1.1mL的IL-2 (6x106 IU/mL)直到所有冰熔化為止。記錄IL-2批號及到期日。注意：確保IL-2標籤已附接。
IL-2製備。添加50µL IL-2原液(6x106 IU/mL)至標示「IL-2稀釋劑」之50mL錐形管。
IL-2製備。將錐形管重新標示「IL-2 6x104」、日期、批號及24小時到期日。蓋上蓋子並儲存在2至8˚C下。
冷凍保存製備。將5個冷凍卡匣放在2至8℃下前處理，以進行最終產物冷凍保存。
製備細胞計數稀釋。在BSC中，添加4.5mL的已標示批號及「用於細胞計數稀釋」之AIM-V介質至4支分開的15mL錐形管並將管標示。
製備細胞計數。將4支冷凍小瓶標示小瓶編號(1至4)。第 22 天， TIL 收集
監測孵養箱。孵養箱參數溫度LED顯示器：37±2.0℃，CO2百分比：5%±1.5%。
自孵養箱移出G-Rex500MCS培養瓶。檢查培養瓶並在自孵養箱移出G-Rex500MCS之前證實符合孵養參數(孵養時間)。
製備TIL收集袋。標示3000mL收集袋為「TIL懸浮液」、批號及首字母/日期。
密封多餘連接。將收集袋上的二個魯爾連接靠近每個連接末端處熱封。
GatheRex設置。將G-Rex500MCS的紅色介質移除管線(按照過程注意事項5.11)無菌接合至以上製備之10L labtainer袋。注意：參照過程注意事項5.16關於多個GatheRex裝置的使用。將G-Rex500MCS的透明細胞移除管線(按照過程注意事項5.11)無菌接合至以上製備之TIL懸浮液收集袋。將G-Rex500MCS培養瓶放在GatheRex的左側。將上清液Labtainer袋及匯合的TIL懸浮液收集袋放在右側。將來自G-Rex500MCS的紅色介質移除管線安裝至GatheRex上的頂部管夾(標示紅色管線)及管路導引器。將來自G-Rex500MCS的透明收集管線安裝至GatheRex上的底部管夾(標示藍色管線)及管路導引器。將來自GatheRex的氣體管線附接至G-Rex500MCS的無菌過濾器。在從G-Rex500MCS移除上清液之前，確保細胞移除管線上的所有管夾皆已關閉。
體積減少。將約4.5L的上清液從G-Rex500MCS轉移至上清液袋。目視檢查G-Rex500MCS以確保培養瓶水平且介質減少至抽吸液浸管的末端。若有需要重複步驟。
製備培養瓶以進行TIL收集。在移除上清液後，將所有至紅色管線的管夾關閉。
起始TIL的收集。記錄TIL收集的起始時間。劇烈拍打培養瓶並渦漩介質以釋放細胞。檢視培養瓶以確保所有細胞皆已脫附。將「TIL懸浮液」3000mL收集袋放在平坦表面上的乾擦巾上。傾斜培養瓶以確保管子位在培養瓶邊緣。注意：如果細胞收集管子不是位在側壁與底膜的交接處，當傾斜45度角時扣擊培養瓶通常足以正確地定位管子。
TIL收集。釋放所有導向TIL懸浮液收集袋的管夾。使用GatheRex，將TIL懸浮液轉移至3000mL收集袋中。注意：維持傾斜邊緣直到所有細胞及介質皆已收集。檢視膜上有無附著細胞。
潤洗培養瓶膜。潤洗G-Rex500MCS的底部。用潤洗介質覆蓋約1/4的氣體交換膜。
關閉G-Rex500MCS上的管夾。確保所有管夾皆已關閉。
熱封。在含有TIL的收集袋盡可能靠近接合處熱封，以使整體管路長度維持大約相同。將上清液袋子熱封。
完成收集剩餘的G-Rex 500 MCS培養瓶。重複以上步驟，將所有TIL匯合至相同的收集袋。每個2nd培養瓶後必須置換10l上清液袋。
製備LOVO來源袋。獲得新的3000mL收集袋。標示為「LOVO來源袋」、批號及首字母/日期。將「LOVO來源袋」上的管路熱封，移除母魯爾，留下足夠管線以接合。
秤重LOVO來源袋。將適當大小的塑膠籃放在磅秤上並歸零。將LOVO來源袋(包括埠及管線)放在籃中並記錄乾重。
將細胞懸浮液轉移至LOVO來源袋中。關閉170 µm重力血液過濾器的所有管夾。
將細胞懸浮液轉移至LOVO來源袋中。將重力血液過濾器的長形末端無菌接合至LOVO來源袋。將過濾器的二個來源管線其中一個無菌接合至「匯合TIL懸浮液」收集袋。一旦接合完成，將過濾器上未使用的管線熱封以移除。打開所有必要管夾並藉由將收集袋吊掛在IV點滴架上抬高TIL懸浮液，以起始TIL重力-流動轉移通過血液過濾器並進入LOVO來源袋。排放時輕柔轉動或揉捏TIL懸浮液袋以保持TIL為均勻懸浮液。
關閉所有管夾。一旦所有TIL皆轉移至LOVO來源袋，關閉所有管夾。
熱封。在盡可能靠近接合處熱封(按照過程注意事項5.12)，以移除重利血液過濾器。
移出細胞計數樣本。在BSC中，每個樣本使用分開的3mL注射器，自LOVO來源袋的無針注射埠移出4x1.0mL細胞計數樣本。將樣本放入在步驟8.11.36中製備的冷凍小瓶。
執行細胞計數。利用NC-200執行細胞計數及計算。最初藉由添加0.5mL的細胞懸浮液至以上製備的4.5mL的AIM-V介質中稀釋細胞計數樣本。此給出1:10稀釋。
記錄細胞計數及樣本體積。計算總存活TIL細胞。如果總存活細胞≥1.5x109 ，繼續進行。計算總成核細胞。
製備黴漿菌稀釋劑。在BSC中，自一個上清液袋經由魯爾樣本埠移出10.0 mL並放入15mL錐形管。標示15mL錐形管為「黴漿菌稀釋劑」。LOVO
打開LOVO並開始「TIL G-Rex收集」規程並遵守螢幕提示。緩衝劑類型為PlasmaLyte。遵守LOVO觸控螢幕提示。
判定最終產物目標體積。使用總成核細胞(TNC)值及以下表，判定最終產物目標體積並記錄(mL)。
遵守LOVO觸控螢幕提示。
裝載拋棄式套組。在裝載拋棄式套組之前，用酒精棉隨後用無棉絨擦巾擦拭壓力感測器埠。裝載拋棄式套組。遵守螢幕指示裝載拋棄式套組。
移除濾液袋。當已裝載標準LOVO拋棄式套組，觸碰Next鍵。顯示容器資訊及位置螢幕(Container Information and Location Screen)。自磅秤移除濾液袋。
確保濾液容器是新的且離開磅秤(New and Off-Scale)。
輸入濾液容量。將LOVO Ancillary Bag無菌接合至現有濾液袋的公魯爾管線上。確保所有管夾打開且流體路徑為透明。觸碰濾液容器容量(Filtrate Container Capacity)輸入欄位。顯示數字鍵盤。輸入新的總濾液容量(5,000mL)。觸碰按鍵以接受輸入。注意：預估濾液體積不應超過5000 mL。
將濾液容器放在檯面上。注意：如果接合期間將管路移出F管夾，將管路放回管夾。將新的濾液容器放在檯面上。不要將濾液袋吊掛在3號磅秤上。3號磅秤在程序期間將是空的。
在變換至濾液容器後，遵守LOVO觸控螢幕提示。
確保套組裝載正確。顯示拋棄式套組乾式檢查(Disposable Kit Dry Checks)覆蓋。檢查套組裝載正確，且所有管夾皆打開。檢查所有管路有無扭結或其他阻塞且可能的話進行改正。確保套組正確安裝且檢查所有Robert氏管夾。按壓Yes鍵。所有LOVO機械式管夾自動關閉且顯示檢查拋棄式套組安裝(Checking Disposable Kit Installation)螢幕。LOVO進行一系列加壓步驟以檢查套組。
套組檢查結果。如果通過套組檢查，繼續進行至下一步驟。*如果未通過，在檢查完畢後可進行第二次套組檢查。*如果未通過，檢查所有管路有無扭結或其他阻塞且進行改正。*如果未通過，確保套組正確安裝且檢查所有Robert氏管夾。如果第二次套組檢查失敗：聯絡地區管理並準備安裝第10.0節的新套組。重複需要的步驟8.13.23至步驟 8.13.30。
附接PlasmaLyte。顯示連接溶液(Connect Solutions)螢幕。洗滌值將總是為3000 mL。在螢幕上輸入此值。
將PlasmaLyte的3000mL袋子無菌接合至通過管夾1的管路。將PlasmaLyte袋吊掛在IV點滴架上，兩個角落袋環皆掛在鈎上。
驗證PlasmaLyte已附接。打開任何塑膠管夾。驗證溶液體積輸入為3000mL。觸碰「Next」鍵。顯示拋棄式套組灌注(Disposable Kit Prime)覆蓋。驗證PlasmaLyte已附接且導向PlasmaLyte袋的管路上之任何接合及塑膠管夾皆打開，接著觸碰Yes鍵。
觀察PlasmaLyte正在移動。拋棄式套組灌注開始且顯示灌注拋棄式套組螢幕(Priming Disposable Kit Screen)。目視觀察PlasmaLyte正在移動通過連接至PlasmaLyte袋子的管路。如果流體沒有移動，按壓螢幕上的暫停鍵並判定管夾或接合是否仍然關閉。一旦問題已解決，按壓螢幕上的恢復鍵以恢復拋棄式套組灌注(Disposable Kit Prime)。遵守LOVO觸控螢幕提示。
附接來源容器至管路。將在步驟8.12.31中製備之LOVO來源袋按照過程注意事項5.11無菌接合至通過管夾S的管路。可能必須將管路自管夾移除。注意：如果移除，確保將來源管路置換至S管夾。
吊掛來源容器。將來源容器吊掛在IV點滴架上，兩個角落袋環皆掛在鈎上。不要將來源吊掛在1號磅秤上。打開所有通往來源袋的管夾。
驗證來源容器已附接。觸碰Next鍵。顯示來源灌注(Source Prime)覆蓋。驗證來源附接至拋棄式套組，且導向來源的管路上之任何接合及塑膠管夾皆打開。觸碰Yes鍵。
證實PlasmaLyte正在移動。來源灌注開始且顯示灌注來源螢幕(Priming Source Screen)。目視觀察PlasmaLyte正在移動通過附接至來源袋的管路。如果流體沒有移動，按壓螢幕上的暫停鍵並判定管夾或接合是否仍然關閉。一旦問題已解決，按壓螢幕上的恢復鍵以恢復來源灌注(Source Prime)。
開始程序螢幕(Procedure Screen)。當來源灌注成功完成時，顯示開始程序螢幕(Start Procedure Screen)。按壓開始，在按壓開始後立即出現「預洗滌循環1 (Pre-Wash Cycle 1)」暫停螢幕。
倒轉過程中袋子(In Process Bag)。將過程中袋子自2號磅秤移除(亦可自過程中頂埠管路導引器移除管路)且將其手動倒轉以允許在拋棄式套組灌注步驟期間添加的洗滌緩衝液塗佈袋子的所有內部表面。重新將過程中袋子吊掛在2號磅秤上(袋子上的標籤朝向左側)。置換管路導引器中的頂埠管路如果其被移除。
倒轉來源袋。在按下開始鍵之前，在不將來源袋自IV點滴架移除的情況下，藉由按摩袋子角落並輕柔攪拌細胞混合來源袋，以產生均質細胞懸浮液。按壓恢復鍵。LOVO開始處理來自來源袋的流體且顯示洗滌循環1螢幕(Wash Cycle 1 Screen)。
來源潤洗暫停。一旦來源容器排空且LOVO已添加洗滌緩衝液至來源袋，顯示潤洗來源暫停(Rinse Source Pause)螢幕。在不將來源袋自IV點滴架移除的情況下，按摩角落並混合均勻。按壓恢復。
混合過程中袋子暫停。要製備用於另一通過旋轉機之通道的細胞，將過程中袋子用洗滌緩衝液稀釋。在添加洗滌緩衝液至過程中袋子後，LOVO將自動暫停且顯示「混合過程中袋子(Mix In Process Bag)」暫停螢幕。在不將袋子自磅秤移除的情況下，輕柔擠壓袋子將產物混合均勻。按壓恢復。
按摩過程中角落暫停。當過程中袋子清空時，將洗滌緩衝液添加至過程中袋子的底埠以潤洗袋子。在添加潤洗液後，LOVO自動暫停且顯示「按摩IP角落(Massage IP corners)」暫停螢幕。當「按摩IP角落」暫停螢幕顯示時，不要移除2號磅秤上的袋子。當過程中袋子仍然吊掛在2號磅秤上時，按摩袋子角落以將任何殘餘細胞帶入懸浮液中。確保袋子沒有在磅秤上晃動並按壓恢復鍵。
等待移除產物螢幕。在LOVO程序結束時，顯示移除產物螢幕(Remove Products Screen)。當此螢幕顯示時，可操作LOVO套組上的所有袋子。注意：不觸碰任何袋子，直到顯示移除產物(Remove Products)為止。
移除滯留物袋。將止血鉗夾住非常靠近滯留物袋上之埠的管路，以防止細胞懸浮液沉降進入管路中。在止血鉗下方熱封(按照過程注意事項5.12)，確定維持足夠管線以在步驟8.13.48中接合。移除滯留物袋。
製備用於調配之滯留物袋。將4”血漿轉移組之母魯爾鎖端接合至滯留物袋。轉移滯留物袋。
移除產物。遵守移除產物螢幕(Remove Products Screen)上之指示。關閉LOVO套組上之所有管夾以預防流體移動。
移除產物。觸碰Next鍵。所有LOVO機械式管夾打開且顯示移除套組螢幕(Remove Kit Screen)。
記錄資料。遵守移除套組螢幕上之指示。觸碰「Next」鍵。所有LOVO機械式管夾關閉且顯示結果摘要螢幕(Results Summary Screen)。記錄結果摘要螢幕上的資料。關閉所有泵及過濾器支持。當LOVO提示時將套組移除。所記錄的所有時間直接由LOVO記錄。最終調配及填充
目標體積/袋計算。從以下表31，選擇對應以上LOVO滯留物體積的欲填充之CS750袋子數量、每袋之目標填充體積、每袋之移除保留體積及每袋之最終目標體積。
製備CRF空白。計算CS-10及LOVO洗滌緩衝液之體積以調配空白袋。
製備CRF空白。在BSC外，使用以上製備之LOVO洗滌緩衝液的注射器，經由魯爾連接添加經計算之體積至任何空的CS750袋。注意：空白CS750袋調配不需要無菌進行。使用適當大小之注射器，添加經計算之CS-10體積至以上製備之相同的CS750袋。將紅色蓋子蓋在CS750袋上。盡可能移除CS-750袋中盡量多的空氣。在盡可能靠近袋子處熱封CS750袋，移除管路。將CS750袋標示「CRF空白」、批號及首字母/日期。將CRF空白放在冰袋上，直到將其放入CRF中為止。
計算IL-2所需體積。計算欲添加至最終產物之IL-2的體積。
組裝連接設備。將4S-4M60無菌接合至CC2 Cell Connect，將Cell Connect設備的單一穿刺針置換成4S-4M60歧管的4穿刺針端。
組裝連接設備。將CS750冷凍袋無菌接合至以上製備之制具，將四個公魯爾端(E)中之一個置換成各袋。將CS-10袋(按照過程注意事項5.11)接合至4S-4M60的穿刺針。將袋子放在二個在2至8℃下處理的冰袋之間以保持CS-10低溫。
製備含IL-2之TIL。使用適當大小的注射器，自「IL-2 6x104」等分試樣移除以上判定之量的IL-2。將注射器經由魯爾連接連接至以上製備之滯留物袋並注射IL-2。自注射器推注空氣通過管線以清除管線。
標示經調配的TIL袋。關閉轉移組上的管夾並將袋子標示為「經調配的TIL」並將袋傳遞出BSC。
將經調配的TIL袋添加至設備。一旦IL-2已添加，將「經調配的TIL」袋接合至設備上剩餘的穿刺針。
添加CS10。將經組裝的、附接有經調配的TIL、CS-750袋及CS-10之設備傳遞至BSC中。注意：將CS-10袋及所有CS-750袋放在二個在2至8˚C下前處理的冰袋之間。不要將經調配的TIL袋放在冰袋上。確保設備上的所有管夾皆關閉。轉動活栓使注射器關閉。
更換注射器。抽取約10mL的空氣進入100mL注射器並置換設備上的60mL注射器。
添加CS10。轉動活栓使通往CS750袋的管線關閉。打開通往CS-10袋的管夾並抽取以上計算之體積至注射器中。注意：將使用多個注射器以添加適當體積之CS-10。關閉通往CS-10之管夾且打開通往經調配的TIL袋之管夾且添加CS-10。以大約10.0mL/分鐘，添加第一個10.0mL之CS10。以大約1.0mL /sec之速率，添加剩餘的CS-10。注意：使用多個注射器以添加適當體積之CS-10。記錄時間。注意：自第一次添加CS-10至開始冷凍的目標時間為30分鐘。記錄每次CS10添加之體積及總添加體積。關閉所有通往CS10袋的管夾。
製備CS-750袋。轉動活栓使注射器打開。打開通往經調配的TIL袋之管夾且抽取懸浮液到懸浮液即將到達活栓之前停止。關閉通往經調配的TIL袋之管夾。轉動活栓使其打開通往空的CS750最終產物袋。使用新的注射器，藉由將空氣抽出，盡可能移除CS750最終產物袋中盡量多的空氣。在維持注射器柱塞的壓力下，夾住關閉袋子。抽取約20mL空氣進入新的100mL注射器並連接至設備。注意：每個CS-750最終產物袋應在二個冰袋之間以保持經調配的TIL懸浮液低溫。
分配細胞。轉動活栓使通往最終產物袋的管線關閉。自經調配的TIL袋抽取以上計算的體積至注射器中。注意：多支注射器可用於獲得正確體積。轉動活栓使通往經調配的TIL袋的管線關閉。一次處理一個最終產物袋，將細胞分配至最終產物袋。記錄添加至以上每個CS750袋之細胞的體積。用注射器中的空氣清除管線，以使細胞等齊於穿刺針埠的頂部。關閉經填充的袋子上的管夾。每個最終產物袋皆重複步驟，在每袋之間輕柔混合經調配的TIL袋。記錄放入以下每個最終產物袋中之TIL的體積。
移除最終產物袋中的空氣並取出保留。一旦最後的最終產物袋已填充，關閉所有管夾。抽取約10mL的空氣進入新的100mL注射器並置換設備上的注射器。一次操作單一袋子，抽取每個產物袋的所有空氣加上以上判定用於保留之產物體積。注意：當移除樣本體積時，倒轉注射器並使用空氣清除管線至產物袋的頂埠。一旦保留體積及空氣已移除，夾住通往袋子的管線。
記錄自每袋移除之保留體積。
分配保留。將保留分配至50mL錐形管並標示管為「保留」及批號。重複進行於每袋。
製備最終產物以進行冷凍保存。使用止血鉗，靠近袋子夾住管線。移除注射器並將原本安裝注射器的設備上的魯爾連接蓋上紅色蓋子。將設備傳遞出BSC。在F(按照過程注意事項5.12)熱封，移除空的滯留物袋及CS-10袋。注意：保留設備上用於注射器之魯爾連接。丟棄空的滯留物及CS-10袋。
標示最終產物袋。將樣本附接以下的最終產物標籤。
製備最終產物以進行冷凍保存。將冷凍袋保持在冰袋上或2至8℃下，直到冷凍保存為止。
移出細胞計數樣本。使用適當大小的吸量管，移除2.0 mL以上移除的保留並放入欲用於細胞計數之15mL錐形管。
執行細胞計數。利用NC-200執行細胞計數及計算。注意：僅稀釋一個樣本至適當稀釋以驗證稀釋即已足夠。稀釋額外樣本至適當稀釋因數並繼續進行計數。記錄細胞計數及樣本體積。注意：如果不需要稀釋，「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」= 0。判定平均存活細胞濃度且執行細胞計數之存活性。
計算流動式細胞測量術樣本。執行計算以確保用於流動式細胞測量術取樣之足夠細胞濃度。
經計算之IFN-γ樣本。執行計算以確保用於IFN-γ取樣之足夠細胞濃度。
熱封。一旦樣本體積已判定，在盡可能靠近袋子處熱封最終產品袋，以自設備移除。
以黴漿菌樣本而言，將經調配的細胞懸浮液體積添加至上述標示「黴漿菌稀釋劑」之15mL錐形管。無菌性& BacT。測試取樣。在BSC中，使用適當大小的注射器，自上述收集之保留的細胞懸浮液移出1.0mL樣本並接種厭氧瓶。重複上述於好氧瓶。
標示且儲存樣本。用樣本計畫庫存標籤標示所有樣本並適當儲存直到轉移為止。繼續下面步驟進行最終產物及樣本的冷凍保存。最終產物冷凍保存
準備控速冷凍器。驗證CRF已在冷凍之前設置。記錄CRF設備。執行冷凍保存。
設置CRF探針。穿刺CRF空白袋上的隔膜。插入6mL小瓶溫度探針。
將最終產物及樣本放入CRF中。將空白袋放入前處理的卡匣中且轉移至CRF架的大約中間位置。將最終產物卡匣轉移至CRF架中且將小瓶轉移至CRF小瓶架中。將產物架及小瓶架轉移入CRF中。記錄將產物轉移入CRF的時間及室溫度。
判定達到4℃±1.5℃的所需時間且進行CRF運行。一旦室溫度達到4℃±1.5℃，開始運行。記錄時間。
完成及儲存。運行完成後停止CRF。將卡匣及小瓶自CRF移除。將卡匣及小瓶轉移至氣相LN2儲存。 實例12：新穎的冷凍保存腫瘤浸潤性淋巴細胞(LN-144)投予至轉移性黑色素瘤病患在多中心第2期臨床試驗中證實療效及耐受性背景
利用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)進行授受性細胞療法(ACT)的安全性及療效已在數百位轉移性黑色素瘤病患研究，且已證實有意義且持久的客觀反應率(ORR)。1 在一個利用中央化GMP製造TIL的進行中第2期試驗C-144-01中，評估非冷凍保存世代1(第1代)及冷凍保存世代2(第2代)TIL製造過程。
第1代的製造期間大約5至6週(投予C-144-01試驗的研究世代1)，而第2代的製造期間為22天(過程2A，投予C-144-01試驗的研究世代2)。輸注第1代LN-144製造產物之研究世代1病患的初步資料在治療PD-1後轉移性黑色素瘤病患上令人振奮，因為TIL療法產生反應。2 第2代的優點包括：(A)減少病患及醫師等待輸注TIL至病患的時間；(B)冷凍保存允許排程、分布及遞送彈性；及(C)減少製造成本。研究世代2的初步資料呈現在本文中。圖25顯示第2代冷凍保存LN-144製造過程(過程2A)之實施態樣。試驗設計： C-144-01 第 2 期轉移性黑色素瘤試驗
第2期、多中心、3-研究世代試驗評估自體腫瘤浸潤性淋巴細胞(LN-144)用於治療轉移性黑色素瘤病患的療效及安全性。
關鍵納入標準：(1)可測量的轉移性黑色素瘤及≥1個可部分切除用於TIL產製之病灶；(2)至少一種現有線上全身性療法後進展；(3)年齡≥ 18；及(4) ECOG PS 0至1。
治療研究世代：(1)非冷凍保存LN-144產物；(2)冷凍保存LN-144產物；及(3)用LN-144再治療無反應或在初始反應後進展的病患。圖26顯示試驗設計。
終點：(1)主要：定義為ORR之療效及(2)次要：安全性及療效。方法
研究世代2安全性組：13位進行部分切除以達TIL產製之目的且接受試驗治療的任何組分之病患。
研究世代2療效組：9位接受NMA-LD前處理、LN-144輸注及至少一劑的IL-2且具有至少一次療效評估的病患。4位病患在資料截取時不具有療效評估。
生物標記資料已顯示在資料截取日期之前讀取之所有可用資料。結果
圖27提供表格說明研究世代1 (ASCO 2017)與研究世代2之比較性病患特徵。研究世代2具有：4次中位數現有療法；所有病患已接受現有抗PD-1及抗CTLA-4；且具有由較大的目標病灶直徑總和(SOD)及較高的基線平均LDH所反映的較高腫瘤負荷。圖28提供表格顯示治療引發不良事件(≥30%)。
就研究世代2(冷凍保存LN-144)而言，輸注產物及TIL療法特徵為(1)所輸注的TIL細胞平均數量：37×109 ，及(2) IL-2劑量投予次數的中位數為4.5。圖29顯示輸注產物及TIL療法對於病患#1至#8的療效。
圖30顯示有穩定疾病(SD)或較佳反應之反應可評估病患的臨床狀態。病患6的部分反應(PR)未經證實，因為該病患還未達到第二療效評估。一位病患(病患9)在第一次評估之前死亡(仍被考慮為療效組)。
在療效組的9位病患中，一位圖30未表示之病患(病患9)因為黑色素瘤相關死亡發生在第一次腫瘤評估之前而無法評估(NE)。反應見於經第2代治療之病患。疾病控制率(DCR)為78%。發生反應所需時間與研究世代1類似。一位病患(病患3)具有進行性疾病(PD)為最佳反應，未包括在泳池水道圖中。
圖31顯示直徑總和的百分比變化。病患9不具有LN-144後疾病評估，因為黑色素瘤相關死亡發生在第42天之前。第-14天：自篩選至基線(第-14天)的直徑總和%變化。第-14天至第126天：自基線的SOD %變化。第-14天=基線。第0天= LN-144輸注。
在TIL治療時，觀察到HMGB1增加(圖32)。血漿HMGB1水準使用HMGB1 ELISA套組(Tecan US, Inc)測量。顯示的資料代表研究世代1及研究世代2病患在LN-144輸注前(第-7天)及後(第4天及第14天)的HMGB1水準倍數變化(p值基於對數轉換資料使用雙尾成對t檢定計算)。每個時間點的樣本大小(粗體及斜體)及平均(斜體)值顯示在括弧內。HMGB1是由經活化的免疫細胞分泌且由受損的腫瘤細胞釋放。在LN-144治療後觀察到的增加HMGB1水準因此暗示免疫媒介之抗腫瘤活性機制。
血漿IP-10水準使用Luminex測定測量。圖33顯示的資料代表研究世代1及研究世代2病患在LN-144輸注前(第-7天)及後(第4天及第14天)的IP-10水準倍數變化(p值基於對數轉換資料使用雙尾成對t檢定計算)。每個時間點的樣本大小(粗體及斜體)及平均(斜體)值顯示在括弧內。監測IP-10在LN-144輸注後的增加以理解與TIL持久性的可能相關性。
研究世代2 (n=17位病患)的更新資料報告於圖34至圖39。相較於研究世代1及第1代過程的實施態樣(其顯示DCR為64%及整體反應率(ORR)為29% (N=14))，研究世代2及第2代過程的實施態樣顯示DCR為80%及ORR為40% (N=10)。結論
現有資料的初步結果證明第1代與第2代LN-144 TIL產物之間可相比的安全性。投予以第2代過程(如本文所述之過程2A)製造之TIL意外地導致在晚期疾病轉移性黑色素瘤病患(所有病患在抗PD-1及抗CTLA-4現有療法後皆已進展)見到臨床反應增加。研究世代2的DCR為78%。
初步生物標記資料支持TIL療法建議的溶細胞性作用機制。
本文所述之第2代製造過程之實施態樣需時22天。此過程顯著縮短病患必須等待接受他們的TIL之時間期間、提供對病患給藥之時間的彈性且導致製造成本減少，同時提供優於現有方案的其他優點，允許商業化及主管機構查驗登記。使用第2代製造過程實施態樣於轉移性黑色素瘤的初步臨床資料亦指示TIL臨床療效意外的改善，如DCR、ORR及其他臨床反應所測量，相較於使用第1代過程製造的TIL具有類似的發生反應所需時間及安全性特性。
參考文獻
1 Goff, et al. Randomized, Prospective Evaluation Comparing Intensity of Lymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Melanoma.J Clin Oncol . 2016 Jul 10;34(20):2389-97.
2 Sarnaik A, Kluger H, Chesney J, et al. Efficacy of single administration of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) in heavily pretreated patients with metastatic melanoma following checkpoint therapy.J Clin Oncol. 2017; 35 [suppl; abstr 3045]. 實例13：歷史對照組試驗
歷史對照組試驗可用於比較雙重難治性轉移性黑色素瘤病患的治療結果與在本文中揭示之TIL療法的結果，諸如該些在實例2及實例3所述的療法。在一實施態樣中，經在本文中揭示之TIL療法治療的病患展現相較於從歷史對照組預期的反應改善的反應。在一實施態樣中，經在本文中揭示之TIL療法治療的病患展現相較於從歷史對照組預期的反應改善的反應，其中改善的反應判定為整體反應率。在一實施態樣中，經在本文中揭示之TIL療法治療的病患展現相較於從歷史對照組預期的反應改善的反應，其中改善的反應判定為整體反應率，其中整體反應率的改善為至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%或至少50%。在一實施態樣中，經在本文中揭示之TIL療法治療的病患展現相較於從歷史對照組預期的反應改善的反應，其中改善的反應判定為反應持續時間。在一實施態樣中，經在本文中揭示之TIL療法治療的病患展現相較於從歷史對照組預期的反應改善的反應，其中改善的反應判定為反應持續時間，其中反應持續時間的改善為至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%或至少50%。
要判定雙重難治性病患對其他療法的反應之歷史對照組試驗可使用獲自轉移性黑色素瘤病患治療記錄的資料執行。病患在黑色素瘤初始診斷之後必須暴露於3或更多線的黑色素瘤療法。全身性療法的線數按照下列規則計算且考慮各療法的開始及停止日期： 　　‧ 所有在第一線(1L)開始的28天之內所接受的藥劑皆構成1L療法且可能包括單一藥劑或組合多種藥劑；1L結束對應所有1L藥劑＞90天的第一缺口或起始不是1L之一部分的新藥劑(即換成新的線)； 　　‧ 後續線療法識別為下列中之最早者：(a)起始不是在先前治療方案中的藥劑(在識別1L療法的初始28天期間之後)、或(b)在先前治療＞90天的缺口後起始任何藥劑。用於後續線之療法係基於在各別線的療法開始的28天之內所接受的所有藥劑識別 　　‧ 一般來說，伊匹單抗(ipilumimab)與尼沃魯單抗之組合投予被認為是一種療法且BRAF與MEK抑制劑之組合投予(例如達拉菲尼與曲美替尼)被認為是一種療法。 　　‧ 所有病患必須已經用至少一種抗PD-1(或抗PD-L1)療法治療且失敗(即難治或復發)。如果含有抗PD1療法的療法線係較佳的，可取得導致疾病進展的掃描日期。記錄上的最後療法(第3或更晚的療法)需要有按回診及日期出現的疾病進展或死亡(若適用)的整體反應。 　　‧ 記錄上的最後線的療法需要有：i)每次評估的目標及非目標病灶測量值、或ii)按回診的RECIST整體反應。 　　‧ 記錄上需要有起始最後療法之前的某些基線疾病狀態及基線特徵，以允許評估這些病患是否符合本文(包括在實例2及實例3中)所述之其他試驗的類似資格標準。
本發明之前述摘要說明及下列詳細說明搭配隨附圖式一起閱讀時，將更能清楚了解。
圖1繪示TIL擴增及治療性治療過程。步驟1係指添加4個腫瘤片段至10個G-Rex 10培養瓶。在步驟2中，獲得大約40×106 或更多TIL。在步驟3中，分瓶發生至36個進行REP的G-Rex 100培養瓶中。步驟4藉由離心收集TIL。在步驟5大約43天的總處理時間之後獲得新鮮TIL產物，此時的TIL可輸注至病患體內。
圖2繪示用於根據本揭露及圖1過程製備之TIL的治療及製造時間表。手術(及腫瘤部分切除)在開始時進行，且淋巴細胞耗盡化療係指用本文他處所述之化療進行非骨髓清除式淋巴細胞耗盡。
圖3繪示TIL擴增及治療性治療過程，包括「直接進行REP」步驟，其中將REP前TIL直接放進REP過程。總處理時間大約22天，此時的TIL可輸注至病患體內。
圖4繪示當第6天的細胞計數大於250×106 時，用於根據本揭露及圖3之過程製備TIL的治療及製造時間表。
圖5繪示當第6天的細胞計數小於250×106 時，用於根據本揭露及圖3之過程製備TIL的治療及製造時間表，且其中淋巴細胞耗盡較晚開始以允許在進行病患的淋巴細胞耗盡之前評估TIL產物的存活性。
圖6顯示根據圖3之TIL製造過程的詳細示意圖。
圖7描繪臨床試驗的設計，其使用藉由不同方法製備之TIL療法於雙重難治性黑色素瘤。
圖8概述臨床試驗中之病患特徵。
圖9概述臨床試驗中之病患特徵。
圖10概述臨床試驗中之治療引發嚴重不良事件。「*」指示發生在治療後六個月的與療法無關事件。
圖11概述臨床試驗中之療效結果。
圖12繪示反應的瀑布圖，顯示臨床試驗中之療效。反應與BRAF突變狀態無關。
圖13繪示臨床試驗中之發生最佳反應所需時間及期間。
圖14繪示臨床試驗中之直徑總和的百分比變化。
圖15繪示完全緩解病患的掃描。
圖16繪示使用TIL療法之臨床試驗的設計。
圖17繪示使用如Radvanyi,et al. ,Clin. Cancer Res. 2012, 18, 6758-70所述之TIL製造過程所執行的第二臨床試驗之結果。NT係指未測試、WT係指野生型且irRC係指免疫相關反應標準。TIL收集部位指明如下：1：皮膚/SC；2：淋巴結；3：肺臟及4：胃腸道/臟器。
圖18：例示性過程2A之圖提供步驟A至F之概覽。
圖19A至19C：過程2A之程序流程圖。
圖20：顯示冷凍保存TIL例示性製造過程(約22天)之實施態樣的圖。
圖21：顯示過程2A(22天TIL製造過程)之實施態樣的圖。
圖22：過程1C及過程2A之例示性實施態樣的步驟A至F之比較表。
圖23：過程1C的實施態樣與過程2A的實施態樣之詳細比較。
圖24A至24B：來自最終資料截取(data cut)(N=23位病患)的研究世代1更新療效資料。縮寫：PR，部分反應；SD，穩定疾病；PD，進行性疾病。
圖25：第2代冷凍保存LN-144製造過程方案。
圖26：新穎冷凍保存TIL投予至轉移性黑色素瘤病患的多中心第2期臨床試驗之試驗設計方案。
圖27：表格說明研究世代1 (ASCO 2017)與研究世代2之比較性病患特徵。
圖28：表格說明治療引發不良事件(≥30%)。
圖29：輸注產物及TIL療法的療效。
圖30：有SD或較佳反應之反應可評估病患的臨床狀態。
圖31：直徑總和的百分比變化。
圖32：TIL治療時觀察到HMGB1水準增加。
圖33：LN-144輸注後觀察到生物標記IL-10增加。
圖34：來自第二次資料截取(N=17位病患)的第2期轉移性黑色素瘤臨床試驗的研究世代2更新病患特徵。
圖35：來自第二次資料截取(N=17位病患)的研究世代2治療引發不良事件(≥30%)。
圖36：來自第二次資料截取(N=17位病患)的研究世代2可評估病患(穩定疾病或較佳)發生反應所需時間。在療效組的10位病患中，一位圖中未表示之病患(病患10)因為黑色素瘤相關死亡發生在第一次腫瘤評估之前而無法評估。
圖37：來自第二次資料截取(N = 17位病患)的研究世代2更新療效資料。輸注的TIL平均數為34×109 。現有療法的中位次數係4.5。BRAF突變的病患與野生型BRAF的病患皆有反應(*係指BRAF突變的病患)。一位病患(病患10)因為黑色素瘤相關死亡發生在第一次腫瘤評估之前而無法評估，但仍被考慮為療效組。縮寫：PR，部分反應；SD，穩定疾病；PD，進行性疾病。
圖38：來自第二次資料截取(N=17位病患)的研究世代2可評估病患更新療效資料。*指示未達到第一次評估之無法評估的病患。所有療效可評估病患已接受現有抗PD-1及抗CTLA-4檢查點抑制劑療法。
圖39：來自研究世代2第二次資料截取的PR病患(003-015)代表性電腦斷層掃描。序列簡單說明
SEQ ID NO:1係莫羅單抗(muromonab)之重鏈的胺基酸序列。
SEQ ID NO:2係莫羅單抗之輕鏈的胺基酸序列。
SEQ ID NO:3係重組人類IL-2蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:4係阿地介白素之胺基酸序列。
SEQ ID NO:5係重組人類IL-4蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:6係重組人類IL-7蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:7係重組人類IL-15蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:8係重組人類IL-21蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:9係人類4-1BB之胺基酸序列。
SEQ ID NO:10係鼠類4-1BB之胺基酸序列。
SEQ ID NO:11係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(utomilumab) (PF-05082566)之重鏈。
SEQ ID NO:12係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈。
SEQ ID NO:13係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:14係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:15係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:16係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:17係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:18係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:19係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:20係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:21係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(urelumab) (BMS-663513)之重鏈。
SEQ ID NO:22係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈。
SEQ ID NO:23係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:24係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:25係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:26係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:27係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:28係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:29係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:30係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:31係TNFRSF促效劑融合蛋白質之Fc結構域。
SEQ ID NO:32係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:33係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:34係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:35係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:36係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:37係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:38係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:39係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:40係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:41係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:42係TNFRSF促效劑融合蛋白質之Fc結構域。
SEQ ID NO:43係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:44係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:45係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:46係4-1BB配體(4-1BBL)胺基酸序列。
SEQ ID NO:47係4-1BBL多肽之可溶部分。
SEQ ID NO:48係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本1之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:49係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本1之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:50係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本2之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:51係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本2之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:52係4-1BB促效劑抗體H39E3-2之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:53係4-1BB促效劑抗體H39E3-2之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:54係人類OX40之胺基酸序列。
SEQ ID NO:55係鼠類OX40之胺基酸序列。
SEQ ID NO:56係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(tavolixizumab) (MEDI-0562)之重鏈。
SEQ ID NO:57係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈。
SEQ ID NO:58係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:59係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:60係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:61係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:62係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:63係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:64係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:65係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:66係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈。
SEQ ID NO:67係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈。
SEQ ID NO:68係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:69係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:70係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:71係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:72係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:73係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:74係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:75係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:76係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈。
SEQ ID NO:77係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈。
SEQ ID NO:78係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:79係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:80係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:81係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:82係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:83係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:84係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:85係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:86係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:87係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:88係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:89係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:90係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:91係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:92係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:93係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:94係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:95係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:96係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:97係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:98係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:99係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:100係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:101係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:102係OX40配體(OX40L)胺基酸序列。
SEQ ID NO:103係OX40L多肽之可溶部分。
SEQ ID NO:104係OX40L多肽之替代性可溶部分。
SEQ ID NO:105係OX40促效劑單株抗體008之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:106係OX40促效劑單株抗體008之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:107係OX40促效劑單株抗體011之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:108係OX40促效劑單株抗體011之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:109係OX40促效劑單株抗體021之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:110係OX40促效劑單株抗體021之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:111係OX40促效劑單株抗體023之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:112係OX40促效劑單株抗體023之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:113係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:114係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:115係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:116係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:117係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:118係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:119係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:120係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:121係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:122係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:123係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:124係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:125係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:126係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。

Claims (51)

  1. 一種治療有需要該治療之病患的雙重難治性轉移性黑色素瘤之方法，該方法包含向該病患投予治療有效群的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
  2. 如請求項1之方法，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤係皮膚的雙重難治性轉移性黑色素瘤。
  3. 如請求項1之方法，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為至少二種現有的全身性治療療程所難治，該至少二種現有的全身性治療療程不包括新輔助或輔助療法。
  4. 如請求項1之方法，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為阿地介白素(aldesleukin)或其生物類似物所難治。
  5. 如請求項1之方法，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為派姆單抗(pembrolizumab)或其生物類似物所難治。
  6. 如請求項1之方法，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為尼沃魯單抗(nivolumab)或其生物類似物所難治。
  7. 如請求項1之方法，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為伊匹單抗(ipilimumab)或其生物類似物所難治。
  8. 如請求項1之方法，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為伊匹單抗或其生物類似物及派姆單抗或其生物類似物所難治。
  9. 如請求項1之方法，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為伊匹單抗或其生物類似物及尼沃魯單抗或其生物類似物所難治。
  10. 如請求項1之方法，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為BRAF抑制劑所難治。
  11. 如請求項1之方法，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為PD-L1抑制劑所難治。
  12. 如請求項11之方法，其中該PD-L1抑制劑係選自由艾維路單抗(avelumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)及彼等之生物類似物所組成之群組。
  13. 如請求項1之方法，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為PD-1抑制劑與CTLA-4抑制劑之組合所難治。
  14. 如請求項13之方法，其中該PD-1抑制劑係尼沃魯單抗或其生物類似物且該CTLA-4抑制劑係選自由伊匹單抗、曲美木單抗(tremelimumab)及彼等之生物類似物所組成之群組。
  15. 如請求項1之方法，其中該雙重難治性轉移性黑色素瘤為BRAF抑制劑與MEK抑制劑之組合所難治。
  16. 如請求項15之方法，其中該BRAF抑制劑係達拉菲尼(dabrafenib)或其醫藥上可接受之鹽且該MEK抑制劑係曲美替尼(trametinib)或其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物。
  17. 如請求項1之方法，其中該轉移性黑色素瘤對PD-1抑制劑或PD-L1抑制劑具有抗性。
  18. 如請求項17之方法，其中該PD-1或PD-L1抑制劑係選自由尼沃魯單抗、派姆單抗、艾維路單抗、阿特珠單抗、德瓦魯單抗及彼等之生物類似物所組成之群組。
  19. 如請求項1至10中任一項之方法，其中該病患不具有BRAF突變。
  20. 如請求項1之方法，其中該病患在接受該治療有效群的TIL之前，已接受至多4劑之尼沃魯單抗或其生物類似物。
  21. 如請求項1至12之方法，其中該病患經至少二種現有的全身性治療療程已有進展或無反應。
  22. 一種治療有需要該治療之病患的雙重難治性轉移性黑色素瘤之方法，該方法包含： 　　(a) 藉由將獲自該病患的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該病患之部分切除的腫瘤獲得第一TIL群； 　　(b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； 　　(c) 藉由在包含IL-2及可選地OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL群以執行第一擴增而產生第二TIL群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得該第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上高於該第一TIL群至少50倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統即可發生； 　　(d) 藉由對該第二TIL群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3及抗原呈現細胞(APC)以執行第二擴增而產生第三TIL群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL群，其中該第三TIL群係治療性TIL群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統即可發生； 　　(e) 收集自步驟(d)獲得的該治療性TIL群以提供經收集的TIL群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統即可發生； 　　(f) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統即可發生，且可選地冷凍保存該經收集的TIL群；及 　　(g) 向該患有雙重難治性轉移性黑色素瘤的病患投予治療有效量之該經收集的TIL群。
  23. 如請求項20之方法，其中該病患先前已經接受PD-1抑制劑或其生物類似物治療。
  24. 如請求項21之方法，其中該PD-1抑制劑係選自由尼沃魯單抗、派姆單抗及彼等之生物類似物所組成之群組。
  25. 如請求項20之方法，其中該病患先前已經接受PD-L1抑制劑或其生物類似物治療。
  26. 如請求項25之方法，其中該PD-L1抑制劑係選自由艾維路單抗(avelumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)及彼等之生物類似物所組成之群組。
  27. 如請求項23至24中任一項之方法，其中該PD-1抑制劑或其生物類似物與CTLA-4抑制劑或其生物類似物共同投予。
  28. 如請求項25至26中任一項之方法，其中該PD-L1抑制劑或其生物類似物與CTLA-4抑制劑或其生物類似物共同投予。
  29. 如請求項22至28中任一項之方法，其中該病患先前已經接受一種額外的現有線上全身性療法治療。
  30. 如請求項29之方法，其中該一種額外的現有線上全身性療法係BRAF抑制劑或其醫藥上可接受之鹽。
  31. 如請求項30之方法，其中該BRAF抑制劑係選自由威羅菲尼(vemurafenib)、達拉菲尼及彼等之醫藥上可接受之鹽所組成之群組。
  32. 如請求項29之方法，其中該一種額外的現有線上全身性療法係MEK抑制劑或其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物。
  33. 如請求項32之方法，其中該MEK抑制劑係選自由曲美替尼、考比替尼(cobimetinib)及彼等之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物所組成之群組。
  34. 如請求項29之方法，其中該一種額外的現有線上全身性療法係BRAF抑制劑或其醫藥上可接受之鹽與MEK抑制劑或其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物之組合。
  35. 如請求項34之方法，其中該BRAF抑制劑係選自由威羅菲尼、達拉菲尼及彼等之醫藥上可接受之鹽所組成之群組，且該MEK抑制劑係選自由曲美替尼、考比替尼及彼等之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物所組成之群組。
  36. 如請求項29之方法，其中該一種額外的現有線上全身性療法係CTLA-4抑制劑或其生物類似物。
  37. 如請求項36之方法，其中該CTLA-4抑制劑係選自由伊匹單抗、曲美木單抗及彼等之生物類似物所組成之群組。
  38. 如請求項29之方法，其中該一種額外的現有線上全身性療法係化學治療療法。
  39. 如請求項38之方法，其中該化學治療療法包含氮烯唑胺(dacarbazine)或替莫唑胺(temozolomide)。
  40. 如請求項22之方法，其中該第一擴增執行一段約11天的期間。
  41. 如請求項22至40中任一項之方法，其中該IL-2以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在於該第一擴增步驟(c)的該細胞培養基中。
  42. 如請求項22至40中任一項之方法，其中在該第二擴增步驟(d)中，該IL-2以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在且該OKT-3抗體以約30 ng/mL的初始濃度存在。
  43. 如請求項22至42中任一項之方法，其中該第一擴增使用氣體可通透容器執行。
  44. 如請求項22至42中任一項之方法，其中該第二擴增使用氣體可通透容器執行。
  45. 如請求項22至44中任一項之方法，其中在該第一擴增步驟(c)中，該細胞培養基進一步包含選自由IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及彼等之組合所組成之群組的細胞介素。
  46. 如請求項22至44中任一項之方法，其中在該第二擴增步驟(d)中，該細胞培養基進一步包含選自由IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及彼等之組合所組成之群組的細胞介素。
  47. 如請求項22至46中任一項之方法，其進一步包含在向該病患投予該TIL之前使用非骨髓清除式淋巴細胞耗盡療法治療該病患的步驟。
  48. 如請求項47之方法，其中該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡療法包含投予劑量為60 mg/m2 /天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2 /天之氟達拉濱計五天的步驟。
  49. 如請求項22至48中任一項之方法，其進一步包含始於向該病患投予該TIL之後當天使用IL-2療法治療該病患的步驟。
  50. 如請求項49之方法，其中該IL-2療法係高劑量IL-2療法，其包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液投予600,000或720,000 IU/kg的阿地介白素或其生物類似物或變體直到耐受為止。
  51. 如請求項1至50中任一項之方法，其中該治療有效群的TIL包含約2.3×1010 至約13.7×1010 個TIL。
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