KR20100014588A - 길항제 ｏｘ40 항체 및 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서의 이의 용도 - Google Patents

길항제 ｏｘ40 항체 및 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서의 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20100014588A
KR20100014588A KR1020097020065A KR20097020065A KR20100014588A KR 20100014588 A KR20100014588 A KR 20100014588A KR 1020097020065 A KR1020097020065 A KR 1020097020065A KR 20097020065 A KR20097020065 A KR 20097020065A KR 20100014588 A KR20100014588 A KR 20100014588A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
xaa xaa
antibody
seq
acid sequence
amino acid
Prior art date
Application number
KR1020097020065A
Other languages
English (en)
Inventor
살라-에딘 라마메디-체라디
쳉빈 야오
산자야 싱
Original Assignee
제넨테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39620235&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20100014588(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 제넨테크, 인크. filed Critical 제넨테크, 인크.
Publication of KR20100014588A publication Critical patent/KR20100014588A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

본 발명은 길항제 항체의 아미노산 서열 및 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는, 인간 OX40 수용체 (CD134) 및 이의 단편에 대해 지시된 길항제 항체에 관한 것이다. 상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역으로부터 유래된 항원 결합 영역 (CDR)이 본 발명에 또한 포함된다. 본 발명의 또다른 양상은 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서의 항-OX40 길항제 항체의 용도이다. 본 발명은 길항제 항체 A10의 인간화 서열, 및 항체의 결합 부위의 에피토프 지도작성에 또한 관련된다.
OX40, 길항제 항-OX40 항체, 염증성 및 자가면역 질환

Description

길항제 ＯＸ40 항체 및 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서의 이의 용도{ANTAGONIST OX40 ANTIBODIES AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF INFLAMMATORY AND AUTOIMMUNE DISEASES}
1. 기술 분야
본원에서는 인간 OX40 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드 단편 또는 기타 OX40 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또한 본 발명은 인간 OX40 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드 단편 또는 OX40 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 인간화 항체에 관한 것이다. OX40 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드 단편 또는 OX40 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 또한 제공된다. 추가로 본 발명은 인간 OX40 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드 단편 또는 OX40 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 뿐만 아니라 이러한 항체의 제조 방법을 제공한다. OX40의 생물학적 활성을 억제하고/하거나 OX40-매개 질환을 치료 또는 예방하기 위한 본원에서 제공된 항-OX40 항체의 사용 방법이 또한 제공된다.
2. 배경 기술
인간의 면역계는 외래 병원체에 대해 신체를 방어하여, 외래 작용제에 대한 면역 활성화와 자가 조직에 대한 허용 간의 균형을 필요로 하는 기능을 한다. 예를 들어, 바이러스성 병원체에 의해 야기되는 급성 감염은 2가지 유형의 장기 메모리(memory)를 유도한다: B-림프구 (B-세포)가 이러한 외래 병원체에 의한 감염을 방지하기 위한 항체를 생산하는 체액성 면역, 및 특정 항원에 의해 활성화된 T-림프구 (T-세포)가 감염된 세포를 사멸시키고 사이토카인을 또한 생산하는 세포성 면역. T-세포는 세포-매개 면역에서 주로 기능하고, 림프구의 약 70％를 이룬다. T-세포의 대다수는 CD4+ "헬퍼(helper)" T-세포이고, B-세포 및 대식세포의 활성화에 주로 수반된다. CD8+ T-세포, 또는 세포독성 T-림프구 (CTL)는 세포-매개 세포독성 반응에서 수반되고, T-세포 집단의 약 35％를 이룬다. T-세포는 3가지 독특한 집단으로 분류될 수 있다: 나이브(naive) 세포, 이펙터(effector) 세포 및 메모리 세포. 나이브 T-세포는 항원의 존재 하에 활성화되어 이펙터 세포가 된다. 침입 병원체의 항원을 T-세포 수용체에 "제시"함으로써 주요 조직접합성 복합체 클래스 I (MHC 클래스 I) 분자가 이러한 이펙터 응답에서 주요 역할을 하고, 차례로 상기 수용체가 병원체를 인식하여 이를 공격한다.
다수의 수용체-리간드 상호작용이 외래 항원에 대해 지시된 면역 응답의 유도, 확립 및 조정에서 수반된다. 2개 이상의 신호가 항원에 대한 CD4+ 또는 CD8+ T-세포 응답을 활성화시키는데 필요하다. 제1 신호는 항원-제시 세포 (APC)의 표면 상의 주요 조직적합성 (MHC) 클래스 I 또는 II 분자에 결합된 항원에 의해 T-세포 수용체 (TCR)를 통해 전달된다. 제2 신호는 APC의 표면 상에 제시된 리간드가 T-세포의 표면 상의 제2 수용체 분자에 결합하는 것을 수반한다. 이러한 제2 신호 는 공동자극으로 칭해지고, APC 리간드는 종종 공동자극성 분자로 지칭된다 ([Lenschow, et al., Annu Rev Immunol 14:233 (1996)]). 공동자극성 신호전달 분자에는 면역글로불린 수퍼패밀리 구성원, 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 수퍼패밀리 구성원, 및 사이토카인 수용체가 포함된다 (리뷰 문헌 [Croft, Cytokine Growth Factor Rev 14:265 (2003)]; [Kroczek, et al., J Allergy Clin Immunol 116:906 (2005)] 참조). 조합되어, 2개의 신호가 T-세포를 활성화시키고, 차례로 T-세포가 사이토카인을 분비하고 증식한다.
공동자극성 분자의 한 예는 TNFR 수퍼패밀리의 구성원인 OX40 수용체 (CD134)이고, 이는 막-결합형이고, 활성화된 CD4+ T-세포 상에서 (즉, 염증 부위에서) 주로 발현된다 ([Paterson, et al., Mol Immunol 24:1281 (1987)]). 이의 리간드 (OX40L)는 TNF 패밀리에 속하는 제II형 막 단백질이고, 항원-제시 세포, 예컨대 활성화된 B 세포, 수지상 세포, 및 내피 세포 상에서 발현된다 ([Stuber, et al., Immunity 2:507 (1995)]; [Weinberg, et al., J Immunol 162:1818 (1999)]; [Nohara, et al., J Immunol 166:2108 (2001)]; [Malmstrom, et al., J Immunol 166:6972 (2001)]). OX40 수용체 (이하 "OX40")를 통한 신호전달은 이펙터 T-세포에 대해 공동자극성이고, T-세포의 증식을 야기한다 ([Weinberg, J Immunol 152:4712 (1994)]; 리뷰 문헌 [Watts, Annu Rev Immunol 23:23 (2005)] 참조). OX40의 연구는 이의 주요 역할이 주요 면역 응답에서 축적되는 이펙터 T-세포의 수를 구술하고, 따라서 후속하여 발달되고 생존하는 메모리 T-세포의 수를 관리하는 것임을 시사한다 (리뷰 문헌 [Croft, Cytokine Growth Factor Rev 14: 265 (2003)] 참조).
다수의 시험관내 연구에서, OX40가 강화된 T-세포 증식 및 사이토카인 생산을 초래하는 공동자극성 신호를 제공하는 것으로 나타났다 (Baum PR et al., EMBO J, 1994]; [Akiba H et al., Biochem. Biophysic Res, 1998]). 특정 상황에서 OX40/OX40L 상호작용이 Th2 세포의 발달에서 우선적인 역할을 할 수 있다는 것이 제안되었다 ([Ohshima, et al., Blood 92:3338 (1998)]; [Flynn, et al., J Exp Med 188:297 (1998)]). 면역 활성화가 과도하거나 제어되지 않은 경우, 병리학적 알러지, 천식, 염증, 자가면역 및 기타 관련 질환이 일어날 수 있다. 이같은 경우에, T-세포의 활성화 및 분화가 중요한 역할을 한다. OX40는 면역 응답을 강화시키는 역할을 하기 때문에, 이는 자가면역 및 염증성 질환을 악화시킬 수 있다. OX40-OX40L의 상호작용은 여러 질환 모델의 발병기전에 연루되었다. 다수의 증거들이 OX40-OX40L 상호작용이 알러지, 천식, 및 자가면역 및 염증과 관련된 질환 (다발성 경화증, 류머티스 관절염, 염증성 장 질환, 이식편-대-숙주 질환, 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE), 실험적 리슈만편모충증, 콜라겐-유도 관절염, 대장염 (예컨대 궤양성 대장염), 접촉성 과민 반응, 당뇨병, 크론(Crohn)병, 및 그레이브(Grave)병이 포함됨)에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다 ([Arestides, et al., Eur J Immunol 32:2874 (2002)]; [Jember, et al., J Exp Med 193:387 (2001)]; [Kroczek, et al., J Allergy Clin Immunol 116:906 (2005)]; [Pakala, et al., Eur J Immunol 34:3039 (2004)]; [Xiaoyan, et al., Clin Exp Immunol 143:110 (2006)]; [Weinberg, et al., J Immunol 152:4712 (1994)]; [Weinberg, et al., Nat Med 2:183 (1996)]; [Malstrom, et al., J Immunol 166:6972 (2001)]; [Higgins, et al., J Immunol 162:486 (1999)]; [Akiba, et al., J Exp Med 191:375 (2000)]; [Stuber, et al., Gastroenterology 115:1205 (1998)]; [Tsukada, et al., Blood 95:2434 (2000)]; [Yoshioka, et al., Eur J Immunol 30:2815 (2000)]; [Stuber, et al., Eur J Clin Invest 30:594 (2000)]; [Bossowski, et al., J Pediatr Endocrinol Metab 18:1365 (2005)]; 리뷰 문헌 [Watts, Annu Rev Immunol 23:23 (2005)] 참조).
자가면역 및 염증성 질환에 대한 현재의 요법은 스테로이드를 단독으로 또는 세포독성 약물 및/또는 생물학적 작용제와 조합하여 장기적으로 투여하는 것을 포함한다. TNF-α에 대한 항체가 류머티스 관절염, 크론병, 및 염증성 장 질환을 포함하는 다수의 질환에 대해 현재 처방되고 있다. 또한, 임상 평가에서의 새로운 실험적 요법은 류머티스 관절염에 대한 융합 단백질 CTLA4-Ig (가용성 형태의 세포독성 T 림프구 관련 항원-4)이다. 이러한 별법들에도 불구하고, 대부분의 면역억제 요법은 환자의 면역손상(immunocompromised) 상태를 포함하는 심각한 부작용을 야기한다. 이상적으로는, T-세포-매개 질환의 치료는 질환을 야기하는 [항원-특이적] 세포를 표적으로 하지만, 나머지 T-세포 레퍼토리는 제외할 것이다 ([Weinberg, Trends Immunol 23:102 (2002)]). 따라서, 자가면역 및 염증성 질환에 대한 별법적인 요법이 강하게 요구된다.
이러한 방법들에 더하여, 수용체를 자극하여 T-세포 집단을 증가시키는 다수의 작동제 항-OX40 항체가 개발되었다. 최초로 공개된 항-OX40 모노클로날 항체 (mAb)인 MRC OX-40은 활성화된 래트 CD4+ T-세포 상의 세포 표면 항원으로서 수용체가 확인된 마우스 항체였다 ([Paterson, et al., Mol Immunol 24:1281 (1987)]). 이 항체는 T-세포 증식을 자극하는 분석법에서 효과가 수수하였다. 그후, 다수의 작동제 항-OX40 mAb들이 생산되어, 면역 응답을 부스팅(boosting)하는데 사용되었다 ([Weatherill, et al., Cell Immunol 209:63 (2001)]; [Banal-Pakala, et al., Nat Med 7:907 (2001)]; [De Smedt, et al., J Immunol 168:661 (2002); [Pan, et al., Mol Ther 6:528 (2002)]; [Curti, et al., Blood 101:568 (2003)]; [Nakae, et al., Proc Natl Acad Sci USA 100:5986 (2003)]; [Lustgarten, et al., Eur J Immunol 34:752 (2004)]; [So, et al., J Immunol 172:4292 (2004)]; [Koga, et al., Cancer Sci 95:411 (2004)]; [Lanthrop, et al., J Immunol 172:6735 (2004)]; [Polymenidou, et al., Proc Natl Acad Sci USA 101 Suppl 2:14670 (2004)]; [Lustgarten, et al., J Immunol 173:4510 (2004)]; [Valzasina, et al., Blood 105:2845 (2005)]; [Cuadros, et al., Int J Cancer 116:934 (2005)]; [Sharma, et al., Exp Gerontol 41:78 (2006)]). 그러나, 앞서 언급된 자가면역 및 염증성 질환에서, T-세포 집단을 자극하는 것은 원하는 효과가 아니다.
OX40-OX40L 신호전달을 차단하기 위한 한가지 요법은 항-OX40L 항체의 사용을 통한 것이다. OX40L을 표적으로 하는 다수의 mAb가 생성되었고, OX40 신호전달 경로, 또다른 경로에 대한 이의 효과, 및 다양한 질환에서의 OX40 역할을 해명하기 위해 테스트되었다 (예를 들어, [Blazar, et al., Blood 101:3741 (2003)]; [Ukyo, et al., Immunology 109:226 (2003)]; [Wang, et al., Tissue Antigens 64:566 (2004)]; [Chou, et al., J Immunol 174:436 (2005)] 참조). OX40 신호를 억제하는 또다른 방법은 항-OX40 면역독소, OX40-IgG 융합 단백질, 및 OX40 리포솜의 사용을 포함한다 ([Weinberg, et al., Nat Med 2:193 (1996)]; [Higgins, et al., J Immunol 162:486 (1999)]; [Satake, et al., Biochem Biophys Res Commun 270:1041 (2000)]; [Taylor, et al., J Leukoc Biol 72:522 (2002)]; [Boot, et al., Arthritis Res Ther 7:R604 (2005)]).
리간드를 표적화하는 것에 대한 별법은 OX40 수용체 (CD134)에 대해 지시된 요법을 개발하는 것이다. 길항제 항-OX40 항체를 생성시키려는 시도들이 있었다. 스투버(Stuber) 및 동료들은 OX40과 OX40L 간의 상호작용을 억제하기 위해 폴리클로날 토끼 항-마우스 OX40 항체를 사용하였다 ([J Exp Med 183:979 (1996)]). Imura 등은 항-마우스 OX40 항체 131 및 315을 생산하였고, 이들은 OX40 경로에 의해 매개되는 프로세스들인 CD4+ T-세포의 혈관 내피 세포에의 부착 및 T-세포의 증식을 억제하였다. Weinberg에 의해 개시된 항-인간 OX40 항체는 활성화된 CD4+ T-세포를 결핍시키는 능력을 나타냈다; 그러나, 이는 항체가 독성 분자, 예컨대 리신(Ricin)-A 사슬에 접합되는 것에 의존하였다 (미국 특허 번호 5,759,546). 개시된 또다른 항-OX40 항체들, 예컨대 시판되는 L106은 기능적인 활성이 없었다.
따라서, OX40 경로를 방해하는 능력이 있는, 인간 OX40을 표적으로 하는 진정한 기능성 길항제 항체가 요구된다. 이같은 항체는 현재 커다란 충족되지 않은 요구사항이 있는 다수의 질환을 치료할 잠재력이 있을 것이다. 본 발명은 이러한 충족되지 않은 의학적 요구사항을 해결한다.
3. 발명의 개요
한 양상에서, 본 발명은 인간 OX40 수용체 (CD134) 및 이의 단편에 대해 지시된 길항제 항체에 관한 것이다. 또다른 실시양태는 길항제 항체의 아미노산 서열, 및 항체를 코딩하는 핵산을 포함한다.
상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역으로부터 유래된 항원 결합 영역 (CDR)이 본 발명에 또한 포함된다. 본 발명의 항체는 재조합 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 모노클로날 항체일 수 있고, 모노클로날 항체는 인간 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체일 수 있다.
본 발명은 서열 17의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및/또는 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열 12, 15 또는 61의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및/또는 서열 14 또는 16의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 17, 18, 또는 19로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 2개의 VH CDR 및/또는 서열 12, 13, 14, 15, 16 또는 61로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 2개의 VL CDR을 포함한다.
본 발명은 서열 17의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열 12의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체를 포함한다.
본 발명은 서열 17의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열 12의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및 서열 16의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체를 포함한다.
본 발명은 서열 17의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열 15의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체를 포함한다.
본 발명은 서열 17의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열 15의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및 서열 16의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체를 포함한다.
본 발명은 서열 10 또는 11 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는 서열 7, 8, 또는 9 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서 열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체를 포함한다.
본 발명은 서열 25, 26 또는 27의 핵산 서열 중 어느 하나에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열 20, 21, 22, 23, 또는 24의 핵산 서열 중 어느 하나에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체를 포함한다.
본 발명은 서열 10에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 7 또는 8 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VL; 서열 11에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 9에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VL; 서열 25의 핵산 서열에 의해 코딩되는 VH 및 서열 20 또는 21의 핵산 서열에 의해 코딩되는 VL; 서열 26의 핵산 서열에 의해 코딩되는 VH 및 서열 22, 23 또는 24의 핵산 서열에 의해 코딩되는 VL; 또는 서열 27의 핵산 서열에 의해 코딩되는 VH 및 서열 22, 23 또는 24의 핵산 서열에 의해 코딩되는 VL을 포함하는 항체를 포함한다.
본 발명은 VH는 서열 10에 나타낸 아미노산 서열을 갖고 VL은 서열 7에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다.
본 발명은 VH는 서열 10에 나타낸 아미노산 서열을 갖고 VL은 서열 8에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다.
본 발명은 VH는 서열 11에 나타낸 아미노산 서열을 갖고 VL은 서열 9에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다.
본 발명은 VH는 엄격한 조건 하에 서열 10, 11, 17, 18, 또는 19의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상보체에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고/되거나 VL은 엄격한 조건 하에 서열 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16 또는 61의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상보체에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 항체를 포함한다.
본 발명은 VH는 엄격한 조건 하에 서열 25, 26, 또는 27 중 어느 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 상보체에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고/되거나 VL은 엄격한 조건 하에 서열 20, 21, 22, 23, 또는 24 중 어느 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 상보체에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 항체를 포함한다.
본 발명은 약 1×10-12 내지 약 1×10-11 M, 1×10-11 내지 약 1×10-10 M, 1×10-10 내지 약 1×10-9 M, 1×10-9 내지 약 1×10-8 M, 1×10-8 내지 약 1×10-7 M 사이의 해리 상수로 인간 OX40 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 길항제 항체를 포함한다.
본 발명은 서열 7에 기재된 서열에 대한 서열 동일성이 95％ 이상인 VL 서열, 및 서열 10에 기재된 서열에 대한 서열 동일성이 95％ 이상인 VH 서열을 포함한다.
본 발명은 서열 8에 기재된 서열에 대한 서열 동일성이 95％ 이상인 VL 서열, 및 서열 10에 기재된 서열에 대한 서열 동일성이 95％ 이상인 VH 서열을 포함한다.
본 발명은 서열 9에 기재된 서열에 대한 서열 동일성이 95％ 이상인 VL 서열, 및 서열 11에 기재된 서열에 대한 서열 동일성이 95％ 이상인 VH 서열을 포함 한다.
본 발명은 서열 17 (CDR-H1), 서열 18 (CDR-H2) 및 서열 19 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 12, 서열 15 또는 서열 61 (CDR-L1); 서열 13 (CDR-L2); 및 서열 14 또는 서열 16 (CDR-L3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 분자를 또한 포함한다.
본 발명은 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일쇄 Fv (scFv), 단일쇄 항체, 디술피드-연결 Fv (sdFv), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 또는 미니바디(minibody)가 포함되지만 이에 한정되지 않는, 본 발명의 항체의 인간 항원-결합 항체 단편을 포함한다. 본 발명은 VL 또는 VH 도메인 중 하나를 포함하는 단일-도메인 항체를 또한 포함한다.
본 발명은 모노클로날 항체 A10(TH)hu336F의 인간화 서열 및 이의 변이체를 포함한다. 이러한 변이체들을 코딩하는 핵산에는 서열 20-27이 포함된다. A10(TH)hu336F는 서열 9를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 11을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 가변 중쇄 영역은 불변 영역의 CH1, CH2 및 CH3 도메인으로부터의 하나 이상의 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG 항체일 수 있고, 이때 IgG 항체는 IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체이다.
본 발명의 항체는 OX40에 대한 결합 활성이 실질적으로 유지되는 한 임의의 적절한 프레임워크(framework) 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 서브그룹 III 중쇄 프레임워크 컨센서스(consensus) 서열을 포함한다. 이러한 항체들의 한 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에서의 치환을 포함한다. 이러한 항체들의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/이거나, 위치 73은 T이고/이거나 위치 78은 A이다. 한 실시양태에서, 이러한 항체들은 huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc. (South San Francisco, CA, USA)) (미국 특허 번호 6,407,213 & 5,821,337, 및 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93]에서 또한 언급됨)의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 항체들은 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 도 12B (IGHV1-46 서열)에 제시된, 서브그룹 V1의 IGHV1-46 (Gene Bank 접속 번호 X92343)과 생식 계통 IGHJ4 (Gene Bank 접속 번호 J00256)의 조합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 프레임워크 서열은 위치 69에서의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 위치 69는 L이다. VL 사슬에 대해 선택된 인간 주형은 도 12A (IGKV4-1 서열)에 제시된, IGKV4-1 (Gene Bank 접속 번호 Z00023)과 생식 계통 J 주형 IGHJ1 (Gene Bank 접속 번호 J00242)의 조합물이었다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 및/또는 48의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 49, 50, 51, 및/또는 52의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도 메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 57, 58, 59 및/또는 60의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 53, 54, 55, 및/또는 60의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 및/또는 48의 서열을 포함하고, HVR H1, H2 및 H3 서열이 각각 서열 17, 18, 및/또는 19인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 49, 50, 51 및/또는 52의 서열을 포함하고, HVR L1, L2 및 L3 서열이 각각 서열 12, 13 및/또는 16인 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 57, 58, 59 및/또는 60의 서열을 포함하고, HVR H1, H2 및 H3 서열이 각각 서열 17, 18, 및/또는 19인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 53, 54, 55 및/또는 56의 서열을 포함하고, HVR L1, L2 및 L3 서열이 각각 서열 12, 13 및/또는 16인 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명은 검출가능한 태그(tag)를 추가로 포함하는 항-OX40 항체를 포함한다. 본 발명은 생체내에서 또는 샘플에서 OX40을 검출하는 방법을 추가로 포함한다. 이같은 방법은 OX40 항체를 대상체 또는 대상체로부터 수득된 샘플과 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명은 표지를 추가로 포함하는 항체를 포함한다.
본 발명은 세포독소 또는 면역독소를 추가로 포함하는 상기 기술된 항-OX40 항체, 및 하기 기술된 질환 또는 상태를 치료하는 것에서의 이의 용도를 포함한다.
본 발명은 항체 A10(TH)hu336F와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 또한 포함한다.
본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)를 포함한다.
본 발명은 뉴클레오티드 서열이 서열 20, 21, 22, 23, 또는 24 중 어느 하나를 포함하는, 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명은 서열 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19의 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명은 서열 10, 11, 17, 18 또는 19 중 어느 하나에 기재된 또는 서열 25, 26, 또는 27의 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열, 및/또는 서열 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 또는 16 중 어느 하나에 기재된 또는 서열 20, 21, 22, 23, 또는 24의 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명은 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 안정화제와 조합된 청구된 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 세포를 항체의 생산 및 항체의 단리에 적절한 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 청구된 발명의 항체를 생산하는 방법을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서의 항-OX40 길항제 항체의 용도이다.
본 발명은 유효량의 본 발명에 따른 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 IgE 항체 생산을 억제함으로써 장애를 예방하는 방법을 포함한다. 장애에는 천식 (예컨대 알러지성 천식), 알러지성 비염, 아토피 피부염, 이식 거부, 및 죽상동맥경화증이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 청구된 발명에 따른 길항제 항-OX40 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 IgE 항체 생산을 억제하는 방법을 포함한다. IgE 항체 생산의 억제는 기관지 천식, 알러지성 비염, 알러지성 피부염, 아나필락시스, 두드러기, 및 아토피 피부염을 예방할 수 있다.
본 발명은 유효량의 청구된 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 OX40L이 OX40에 결합하는 것을 차단하고/하거나 OX40L이 OX40에 결합하는 것과 관련된 하나 이상의 기능을 억제하는 것인, 환자에서 OX-40 매개 장애를 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명은 천식 증후군을 감소시키는데 효과적인 양의 청구된 발명에 따른 항체를 대상체, 예를 들어, 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하 는, 천식 증후군을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명의 항체는 정맥내, 복강내, 흡입, 근육내, 피하 및 경구 경로를 포함하는 경로들 중 하나 이상에 의해 투여될 수 있다. 본 발명은 치료적 유효량의 청구된 발명에 따른 항체를 환자에게 전달하는 흡입 장치를 포함한다.
본 발명은 포유동물에게 약 1×1010 내지 약 1×1012 M 사이의 KD로 인간 OX40에 결합하는 능력; OX40 수용체에 결합하는 것과 관련된 하나 이상의 기능을 억제하고 OX40L이 상기 수용체에 결합하는 것을 억제하는 능력 중 하나 이상의 특성을 갖는 항-OX40 항체를 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 천식의 중증도를 감소시키는 방법을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체는 약 1×10-12 내지 약 1×10-11 M, 1×10-11 내지 약 1×10-10 M, 1×10-10 내지 약 1×10-9 M, 1×10-9 내지 약 1×10-8 M, 1×10-8 내지 약 1×10-7 M 사이의 해리 상수로 인간 OX40에 결합한다.
본 발명은 포유동물에게 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 항체가 (a) 약 1×10-12 내지 약 1×10-8 M 사이의 KD로 인간 OX40에 결합하는 성질; (b) OX40에 결합하는 것과 관련된 하나 이상의 기능을 억제하는 성질; 및 (c) OX40L이 OX40에 결합하는 것을 억제하는 성질 중 하나 이상의 성질을 포함하는 것인, 포유동물에서 천식의 중증도를 감소시키는 방법을 포함한다.
본 발명의 항체는 알러지, 천식, 아토피 피부염, 다발성 경화증, 류머티스 관절염, 건선, 염증성 장 질환, 이식편-대-숙주 질환, 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE), 자가면역 신경병증 (예컨대 길랑-바레(Guillain-Barre)), 자가면역 포도막염, 자가면역 용혈 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 중증 근육무력증, 콜라겐-유도 관절염, 대장염 (예컨대 궤양성 대장염), 접촉성 과민 반응, 당뇨병, 크론병, 및 그레이브병 (그러나 이에 한정되지 않음)의 치료에 또한 유용할 수 있다.
본 발명의 항체는 사르코이드증, 실험적 리슈만편모충증, 악성 빈혈, 측두 동맥염, 항-인지질 증후군, 혈관염 (예컨대 베게너(Wegener) 육아종증), 베체트(Bechet)병, 포진 피부염, 보통 천포창, 백반증, 원발성 담관성 간경화, 자가면역 간염, 하시모토(Hashimoto) 갑상선염, 자가면역 난소염 및 고환염, 부신의 자가면역 질환, 전신성 홍반 루푸스, 공피증, 피부근육염, 다발근육염, 피부근육염, 척추관절병증 (예컨대 강직성 척추염), 라이터(Reiter) 증후군, 쇼그렌(Sjogren) 증후군 등의 치료에 또한 유용할 수 있다.
본 발명은 의약의 제조에서의 본 발명의 항체의 용도를 포함한다.
본 발명은 OX40 관련 질환 또는 장애의 치료를 위한 본 발명의 항체의 용도를 포함한다.
본 발명은 OX40을 검출하기 위한 본 발명의 항체의 용도를 포함한다.
본 발명은 한 용기 내의 미리 정해진 양의 본 발명의 항체, 및 별도의 용기 내의 완충액을 포함하는 키트를 포함한다.
본 발명은 한 용기 내의 미리 정해진 양의 본 발명의 조성물, 및 별도의 용 기 내의 완충액을 포함하는 키트를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 의료 장치를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 의료 장치를 포함한다.
4. 도면의 간단한 설명
도 1A는 인간 OX40 cDNA에 대한 핵산 서열을 나타낸다 (접속 번호 NM 004295).
도 1B는 인간 OX40 단백질에 대한 아미노산 서열을 나타낸다 (접속 번호 NM_003318).
도 2는 시험관내 활성화된 나이브 인간 CD4+ T-세포에 의한 IL-2 (2A) 및 IL-13 (2B)의 생산에 대한 마우스 항-OX40 mAb B66의 억제 효과를 나타낸다.
도 3은 시험관내 활성화된 나이브 인간 CD4+ T-세포에 의한 증식에 대한 마우스 항-OX40 mAb B66의 억제 효과를 나타낸다.
도 4는 시험관내 프라이밍(priming)된 인간 Th2 세포에 대한 키메라 항-OX40 mAb A10 및 B66의 세포자멸사 효과를 나타낸다.
도 5는 시험관내 프라이밍된 인간 Th2 세포의 증식에 대한 키메라 항-OX40 mAb A10 및 B66의 억제 효과를 나타낸다. 백색 사각형은 나이브 CD4를 나타내고, 백색 삼각형은 나이브 CD4+ + 대조군 L-세포를 나타내며, 흑색 삼각형은 B66 + 나이브 CD4+ 및 OX40L L-세포를 나타내고, 흑색 사각형은 2C4 (IC) + 나이브 CD4+ 및 OX40L L-세포를 나타내고, 흑색 원은 A10 + 나이브 CD4+ 및 OX40L-L-세포를 나타낸 다.
도 6은 시험관내 프라이밍된 인간 Th2 세포에 의한 IL2 (6A) 및 IL-13 (6B)의 생산에 대한 키메라 항-OX40 mAb A10 및 B66의 억제 효과를 나타낸다. 백색 사각형은 나이브 CD4를 나타내고, 백색 삼각형은 나이브 CD4+ + 대조군 L-세포를 나타내며, 흑색 삼각형은 B66 + 나이브 CD4+ 및 OX40L L-세포를 나타내고, 흑색 사각형은 2C4 (IC) + 나이브 CD4+ 및 OX40L L-세포를 나타내고, 흑색 원은 A10 + 나이브 CD4+ 및 OX40L-L-세포를 나타낸다.
도 7: 시험관내 활성화된 나이브 인간 CD4+ T-세포에 의한 IL-2 및 IL-13의 생산에 대한 키메라 항-OX40 mAb B66과 시판되는 항-OX40 mAb L106의 억제 효과의 비교를 나타내는 표.
도 8: 시험관내 활성화된 나이브 인간 CD4+ T-세포의 증식, 뿐만 아니라 이의 IL-2, IL-5, 및 IL-13 생산에 대한 인간화, 키메라 및 마우스 항-OX40 mAb A10의 억제 효과를 나타내는 표.
도 9: 시험관내 프라이밍된 인간 Th1 세포의 증식, 뿐만 아니라 이의 IL-2, IL-5, 및 IL-13 생산에 대한 인간화, 키메라 및 마우스 항-OX40 mAb A10의 억제 효과를 나타내는 표.
도 10: 시험관내 프라이밍된 인간 Th2 세포의 증식, 뿐만 아니라 이의 IL-2, IL-5, 및 IL-13 생산에 대한 인간화, 키메라 및 마우스 항-OX40 mAb A10의 억제 효과를 나타내는 표.
도 11 : 동종 TSLP-활성화 골수 수지상 세포를 사용한, 시험관내 프라이밍된 인간 Th2 세포의 증식, 뿐만 아니라 이의 IL-2, IL-5, 및 IL-13 생산에 대한 인간화, 키메라 및 마우스 항-OX40 mAb A10의 억제 효과를 나타내는 표.
도 12A는 인간 주형 IGKV4-1/IGKJ1과 비교된 뮤린(murine) 항체 A10 및 B66에 대한 가변 경쇄 아미노산 서열, 및 A10(TH)hu336F의 생성된 인간화 서열을 나타낸다. 위쪽의 숫자는 카밧(Kabat)에 따른 아미노산 위치를 가리킨다.
도 12B는 인간 주형 IGHV1-46/IGHJ4와 비교된 뮤린 항체 A10에 대한 가변 중쇄 아미노산 서열, 및 A10(TH)hu336F의 생성된 인간화 서열을 나타낸다. 위쪽의 숫자는 카밧에 따른 아미노산 위치를 가리킨다.
도 13은 어버이 뮤린 항체 A10 (●) 및 이의 키메라 형태 (▲)와 비교하여 인간화 클론 A10(TH)hu336F (■)의 더 높은 결합 활성을 나타낸다.
도 14는 항-OX40의 뮤린 및 인간화 가변 영역의 핵산 서열을 나타낸다: A) 경쇄 카파 가변 252-A10; B) 경쇄 카파 가변 252-B66; C) 인간화 경쇄 가변 A10 (SN), 전체 항체 B 및 E; D) 인간화 경쇄 가변 A10 (SH), 전체 항체 A 및 D; E) 인간화 경쇄 가변 A10(TH)hu336, 전체 항체 C 및 F; F) 중쇄 가변 252-A10; G) 중쇄 가변 A10(TH)hu336, 전체 항체 D-F; H) 중쇄 가변 A10 L70, 전체 항체 A-C.
도 15는 인간화 클론 A10(TH)hu336F (■), 뮤린 A10 (●) 및 이의 키메라 형태 (▲)가 OX40에 대해 똑같이 잘 경쟁한다는 것을 나타낸다.
도 16A,B & 17A,B는 본 발명을 실행하는데 사용하기 위한 예시적인 어셉터 인간 컨센서스 프레임워크 서열들을 나타내고, 이때 서열 식별자는 하기와 같다:
가변 중쇄 (VH) 컨센서스 프레임워크 (도 16A, B) 인간 VH 서브그룹 I 컨센 서스 프레임워크 마이너스 카밧 CDR (서열 30; 인간 VH 서브그룹 I 컨센서스 프레임워크 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 31-33); 인간 VH 서브그룹 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 카밧 CDR (서열 34); 인간 VH 서브그룹 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 35-37); 인간 VH 서브그룹 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 확장된 인간 VH 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크 마이너스 카밧 CDR (서열 38); 인간 VH 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 39-41); 인간 VH 어셉터 프레임워크 마이너스 카밧 CDR (서열 42); 인간 VH 어셉터 프레임워크 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 43-44); 인간 VH 어셉터 2 프레임워크 마이너스 카밧 CDR (서열 45); 인간 VH 어셉터 2 프레임워크 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 46-48); 가변 경쇄 (VL) 컨센서스 프레임워크 (도 17A,B); 인간 VL 카파 서브그룹 I 컨센서스 프레임워크 (서열 49); 인간 VL 카파 서브그룹 II 컨센서스 프레임워크 (서열 50); 인간 VL 카파 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크 (서열 51); 인간 VL 카파 서브그룹 IV 컨센서스 프레임워크 (서열 52).
도 18은 huMAb4D5-8 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 영역 서열을 나타낸다. 위첨자/볼드체의 숫자는 카밧에 따른 아미노산 위치를 가리킨다.
도 19는 huMAb4D5-8 경쇄 및 중쇄의 변형된/변이체 프레임워크 영역 서열을 나타낸다. 위첨자/볼드체의 숫자는 카밧에 따른 아미노산 위치를 가리킨다.
5. 상세한 설명
본 발명은 본원에 기술된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 벡터, 또는 시약에 한정되지 않는데, 이들이 변할 수 있기 때문이다. 또한, 본원에서 사용된 용어법은 단지 특정 실시양태들을 기술하는 목적을 위한 것이고, 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본원 및 첨부된 청구항에서 사용된 단수형의 정관사 및 부정관사("a", "an" 및 "the")는 문맥적으로 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수에 대한 언급을 포함하고, 예를 들어, "숙주 세포(a host cell)"는 다수의 이같은 숙주 세포를 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어 및 임의의 두문자어는 본 발명의 분야에서의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 지닌다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행에서 사용될 수 있지만, 예시적인 방법, 장치 및 물질이 본원에서 기술된다.
본원에서 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 발명과 함께 사용될 수 있는 상기 특허 및 간행물에서 보고된 단백질, 효소, 벡터, 숙주 세포 및 방법론을 기술 및 개시하기 위한 목적으로 법에 의해 허용되는 정도로 거명에 의해 본원에 포함된다. 그러나, 본원에서 어떤 것도 본 발명이 이전의 발명에 의해 이같은 개시내용을 선행할 권리가 없다는 것을 승인하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
5.1 정의
본 출원 전반에 걸쳐 사용된 용어들은 당업자에게 통상적이고 전형적인 의미로 해석된다. 그러나, 출원인은 하기의 용어들에게 하기에 정의된 바와 같은 특정한 정의가 제공되기를 원한다.
항체 사슬 폴리펩티드 서열과 관련하여 "실질적으로 동일한"이라는 구절은 기준 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 70％, 또는 80％, 또는 90％, 또는 95％의 서열 동일성을 나타내는 항체 사슬로 해석될 수 있다. 핵산 서열과 관련하여 이러한 용어는 기준 핵산 서열에 대해 적어도 약 85％, 또는 90％, 또는 95％, 또는 97％의 서열 동일성을 나타내는 뉴클레오티드의 서열로 해석될 수 있다.
용어 "동일성" 또는 "상동성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 전체 서열에 대한 최대 백분율의 동일성을 달성한 후의 후보 서열이 비교되는 상응하는 서열의 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되고, 이때 어떠한 보존성 치환도 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. N- 또는 C-말단 확장 또는 삽입은 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되지 않아야 한다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 주지되어 있다. 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 서열 동일성을 측정할 수 있다.
용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉, 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자을 포함하여 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 및 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)를 포함한다. 항체 (Ab) 및 면역글로불린 (Ig)은 구조적 특성이 동일한 당단백질이다. 항체는 특정 표적에 대한 결합 특이성을 나타내는 한편, 면역글로불린은 항체 및 표적 특이성이 결여된 기타 항체-유사 분자 양쪽 모두를 포함한다. 일반적으로 천연 항체 및 면역글로불린은 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체성(heterotetrameric) 당단백질이다. 각각의 중쇄는 다수의 불변 도메인이 이어지는 가변 도메인 (VH)을 한쪽 말단에 갖는다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고 다른쪽 말단에 불변 도메인을 갖는다. 또한, 용어 "항체" (Ab) 또는 "모노클로날 항체" (mAb)는 무손상 분자, 뿐만 아니라 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단편 (예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편) 양쪽 모두를 포함하도록 의도된다. Fab 및 F(ab')2 단편에는 무손상 항체의 Fc 단편이 없고, 동물 또는 식물의 순환계로부터 더 신속하게 소거되며, 무손상 항체보다 비-특이적 조직 결합이 더 적을 수 있다 ([Wahl, et al., J Nucl Med 24:316 (1983)]).
본원에서 사용된 "항-OX40 항체"는 인간 OX40가 이의 리간드인 OX40 리간드에 결합하는 것을 억제하거나 실질적으로 감소시키는 방식으로 인간 OX40에 결합하는 항체를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "OX40-매개 장애"에는 알러지, 천식, 및 자가면역 및 염증과 관련된 질환 (다발성 경화증, 류머티스 관절염, 염증성 장 질환, 이식편-대-숙주 질환, 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE), 실험적 리슈만편모충증, 콜라겐-유도 관절염, 대장염 (예컨대 궤양성 대장염), 접촉성 과민 반응, 당뇨병, 크론병 및 그레이브병이 포함됨)과 관련된 상태가 포함된다. 사르코이드증, 자가면역 눈 질환, 자가면역 포도막염, 아토피 피부염, 중증 근육무력증, 자가면역 신경병증 (예컨대 길랑-바레), 자가면역 포도막염, 자가면역 용혈 빈혈, 악성 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 측두 동맥염, 항-인지질 증후군, 혈관염 (예컨대 베게너 육아종증), 베체트병, 건선, 포진 피부염, 보통 천포창, 백반증, 원발성 담관성 간경화, 자가면역 간염, 하시모토 갑상선염, 자가면역 난소염 및 고환염, 부신의 자가면역 질환, 전신성 홍반 루푸스, 공피증, 피부근육염, 다발근육염, 피부근육염, 척추관절병증 (예컨대 강직성 척추염), 라이터 증후군, 및 쇼그렌 증후군과 같은 기타 상태 또한 이러한 용어의 범주 하에 포함된다.
항체의 가변 도메인의 정황에서의 용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 간에서 서열이 크게 상이하고 각각의 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 양쪽 모두에서 초가변 영역으로 또한 공지된 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭해지는 3개의 절편에 집중된다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크 (FR)로 칭해진다. 당업계에 공지된 바와 같이, 항체의 초가변 영역의 윤곽을 그리는 아미노산 위치/경계는 정황 및 당업계에 공지된 다양한 정의에 따라 변할 수 있다. 가변 도메인 내의 일부 위치는 이러한 위치들이 한 기준 셋트 하에서는 초가변 영역 내에 있는 것으로 간주될 수 있지만 다른 기준 셋트 하에서는 초가변 영역의 바깥에 있는 것으로 간주될 수 있다는 점에서 하이브리드(hybrid) 초가변 위치로 고려될 수 있다. 이러한 위치들 중 하나 이상은 확장된 초가변 영역 내에서 또한 발견될 수 있다. 본 발명은 이러한 하이브리드 초가변 위치에서의 변형을 포함하는 항체를 제공한다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 β-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된, β-시트 형상을 주로 채택한 4개의 FR 영역을 포함한다. 각각의 사슬 내의 CDR은 FR 영역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 CDR들과 함께 항체의 표적 결합 부위를 형성하는데 기여한다 ([Kabat, et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1987)] 참조). 본원에서 사용된, 면역글로불린 아미노산 잔기의 번호매김은 달리 지시되지 않는 한 Kabat 등의 면역글로불린 아미노산 잔기 번호매김 시스템에 따라 이루어진다.
용어 "항체 단편"은 전장 항체의 일부분, 일반적으로 표적 결합 또는 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편이 포함된다. 항체의 "항원 결합 단편"이라는 구절은 전장 항체와 공통적인 정성적 생물학적 활성이 있는 화합물이다. 예를 들어, 항-OX40 항체의 항원 결합 단편은 OX40 리간드에 결합하는 능력이 있는 것으로부터 OX40 수용체의 능력을 방지하거나 실질적으로 감소시키는 방식으로 OX40 수용체에 결합할 수 있는 것이다. 항체와 관련하여 본원에서 사용된 "기능성 단편"은 Fv, F(ab) 및 F(ab')2 단편을 지칭한다. "Fv" 단편은 완전한 표적 인식 부위 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단한 비공유결합으로 회합되어 있는 이량체 (VH-VL 이량체)로 구성된다. 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 표적 결합 부위를 규정하는 것은 이러한 형상 내이다. 총괄적으로, 6개의 CDR이 표적 결합 특이성을 항체에 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 표적에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도, 비록 전체 결합 부위보다는 낮은 친화력이지만, 표적을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다. "단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 표적 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다.
Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 또한 함유한다. Fab' 단편은, 항체 힌지(hinge) 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기들이 부가되어 있어서 Fab 단편과 다르다. F(ab') 단편은 F(ab')2 펩신 소화 생성물의 힌지 시스테인들에서의 디술피드 결합의 절단에 의해 생산된다. 항체 단편들의 추가적인 화학적 커플링이 당업자에게 공지되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 이루는 개별적인 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 표적 부위에 대해 지시되어 고도로 특이적이다. 또한, 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 여러 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 표적 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체는 다른 면역글로불린으로 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된다는 항체의 특성을 가리키는 것이며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 모노클로날 항체는 주지된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 어버이 모노클로날 항체는 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "키메라" 항체는 비-인간 면역글로불린, 예컨대 래트 또는 마우스 항체로부터 유래된 가변 서열, 및 인간 면역글로불린 불변 영역 (전형적으로 인간 면역글로불린 주형으로부터 선택됨)이 있는 항체를 지칭한다.
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 표적-결합 하위서열)이다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 선택된 인간 면역글로불린 주형의 것을 또한 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "인간 항체"는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 하기에, 그리고, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,939,598 (Kucherlapati 등)에 기술된 바와 같이, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 트랜스제닉(transgenic)이고 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 동물로부터 단리된 항체를 포함한다.
용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 자손을 포함한다. 의도적인 또는 의도적이지 않은 돌연변이로 인해, 모든 자손이 DNA 함량 면에서 정확하게 동일하지 않을 수 있다는 것이 또한 이해된다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성이 있는 변이체 자손이 포함된다. 본 발명에서 사용된 "숙주 세포"는 일반적으로 원핵생물 또는 진핵생물 숙주이다.
DNA로 세포성 생물을 "형질전환"시키는 것은 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합에 의해 DNA가 복제가능하도록 DNA를 생물 내로 도입하는 것을 의미한다. DNA로 세포성 생물을 "형질감염"시키는 것은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되는지 여부와 상관없이 세포 또는 생물에 의한 DNA, 예를 들어, 발현 벡터의 취득(taking up)을 지칭한다. 용어 "형질감염된 숙주 세포" 및 "형질전환된"은 DNA가 도입된 세포를 지칭한다. 세포는 "숙주 세포"로 칭해지고, 이는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 전형적인 원핵생물 숙주 세포에는 대장균의 다양한 계통들이 포함된다. 전형적인 진핵생물 숙주 세포는 포유류, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 또는 인간 기원의 세포이다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종 또는 숙주 세포와 상이한 종으로부터의 것일 수 있거나, 또는 약간의 외래 DNA 및 약간의 동종 DNA를 함유하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.
용어 "벡터"는 적절한 숙주 내에서 DNA의 발현을 실행시킬 수 있는 적절한 제어 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 구축물을 의미한다. 이같은 제어 서열은 전사를 실행시키기 위한 프로모터, 이같은 전사를 제어하기 위한 임의적인 오퍼레이터 서열, 적절한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게는 잠재적인 게놈 삽입물일 수 있다. 일단 적절한 숙주 내로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제되어 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에는, 게놈 자체 내로 삽입될 수 있다. 본 명세서에서, 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로 "플라스미드" 및 "벡터"는 때때로 상호교환가능하게 사용된다. 그러나, 본 발명은 등가의 기능을 수행하고 당업계에 공지되어 있거나 공지될 또다른 형태의 벡터를 포함하도록 의도된다.
치료의 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 비-인간 영장류, 및 동물원, 운동 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하여, 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다.
본원에서 사용된 "표지"라는 단어는 분자 또는 단백질, 예를 들어, 항체에 '직접적 또는 간접적으로 접합될 수 있는, 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 자체가 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
본원에서 사용된 "고체 상"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비-수성 매트릭스를 의미한다. 본원에 포함되는 고체 상의 예로는 유리 (예를 들어, 제어형 다공성 유리), 다당류 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 부분적으로 또는 전체적으로 형성된 것들이 포함된다. 특정 실시양태에서, 환경에 따라, 고체 상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있고, 또한 다르게는 정제 컬럼 (예를 들어, 친화성 크로마토그래피 컬럼)이다.
5.2 면역원
2가지 형태의 OX40 수용체가 본 발명의 항-OX40 항체를 생성시키는데 면역원으로 사용되었다: (1) 한가지는 인간 Fcγ1 및 뉴클레오티드 잔기 105 내지 627에 의해 코딩되는 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질로 발현된, 가용성 형태의 인간 OX40 수용체였고, (2) 두번째는 안정적으로 형질감염된 마우스 섬유모세포 L-세포의 표면 상에서 발현된 전장 OX40을 포함하는 세포-기반 면역원이었다. 가용성 OX40 수용체 또는 이의 단편이 본 발명의 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 생성된 길항제 항체는 OX40에 대해 지시되고, OX40L이 OX40과 상호작용하는 것을 억제함으로써 수용체 활성을 중화시킬 수 있다. 바람직하게는, 면역원은 폴리펩티드이고, 막횡단 분자일 수 있다. 면역원은 재조합에 의해 생산될 수 있거나, 또는 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 또한 천연 공급원으로부터 면역원이 단리될 수 있다.
면역원은 OX40의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 별법으로, 세포외 도메인을 포함하는 막횡단 단백질을 발현하는 세포가 면역원으로 사용될 수 있다. 이같은 세포는 천연 공급원 (예를 들어, T-세포주)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 표면 상에 수용체를 발현하도록 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 항체를 생성시키는데 유용한 기타 면역원 및 이의 형태가 당업자에게 명백할 것이다. 숙주 동물, 예컨대 설치류를 전체 세포 면역원으로 면역화시키는 것은 당업계에 주지되어 있다.
별법으로, OX40을 코딩하는 유전자 또는 cDNA를 플라스미드 또는 기타 발현 벡터 내로 클로닝하고, 당업자에게 주지된 방법에 따라 다수의 발현 시스템 중 임의의 것에서 발현시킬 수 있다. OX40의 클로닝 및 발현 방법, 및 OX40에 대한 핵산 서열이 주지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,821,332 및 5,759,546 참조). 유전자 코드의 동의성(degeneracy)으로 인해, OX40 폴리펩티드를 코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열이 생산될 수 있다. 가능한 코돈 선택을 기초로 조합을 선택함으로써 뉴클레오티드 서열을 변화시킬 수 있다. 이러한 조합은 천연 발생 OX40 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적용된 표준 3문자 유전자 코드에 따라 이루어지고, 모든 이같은 변형물이 고려되어야 한다. 이러한 폴리펩티드들 중 임의의 하나가 OX40에 결합하는 항체를 생성시키기 위한 동물의 면역화에서 사용될 수 있다.
면역원 OX40 폴리펩티드는, 이로운 경우, OX40 폴리펩티드가 또다른 폴리펩티드, 예컨대 면역글로불린 Fc 영역에 융합되어 있는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 융합된 폴리펩티드는, 예를 들어, 융합 단백질이 친화성 크로마토그래피에 의해 단리 및 정제될 수 있도록 함으로써, 종종 단백질 정제를 보조한다. 융합 단백질은 단백질의 카르복실 및/또는 아미노 말단 끝부분에 부착된 융합 절편을 포함하는 단백질을 코딩하는 융합 핵산 서열로 형질전환된 재조합 세포를 배양함으로써 생산될 수 있다. 융합 절편은 면역글로불린 Fc 영역, 글루타티온-S-트랜스페라제, β-갈락토시다제, 2가 금속 이온에 결합할 수 있는 폴리-히스티딘 절편, 및 말토스 결합 단백질을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서, 재조합 OX40이 길항제 항체를 생성시키기 위해 마우스를 면역화시키는데 사용되었다. 재조합 OX40는 다수의 공급원으로부터 시판된다 (예를 들어, R & D Systems (Minneapolis, MN.), PeproTech, Inc.(NJ), 및 Sanofi Bio-Industries, Inc. (Tervose, PA.) 참조). 예시적인 폴리펩티드는 서열 1 및 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함한다.
5.3 항체 생성
당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 본 발명의 항체가 생성될 수 있다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된 [Harlow, et al., Antibodies: a Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988)]).
예를 들어, 상기 기술된 바와 같은 면역원을 토끼, 마우스, 래트 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는 다양한 숙주 동물에 투여하여, 항원에 특이적적인 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청의 생산을 유도할 수 있다. 면역원의 투여는 면역화제 및 필요하다면 애쥬번트(adjuvant)의 1회 이상의 주사를 수반할 수 있다. 다양한 애쥬번트가 숙주 종에 따라 면역학적 응답을 증가시키기 위해 사용될 수 있고, 여기에는 프로인트 (완전 및 불완전), 미네랄 젤 예컨대 수산화알루미늄, 계면활성제 예컨대 라이소레시틴, 플루로닉(pluronic) 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀 및 잠재적으로 유용한 인간 애쥬번트 예컨대 BCG (칼메트-게랑(Calmette-Guerin) 간균) 및 코리네박테리움 파르붐(Corinebacterium parvum)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 애쥬번트의 추가적인 예로는 MPL-TDM 애쥬번트 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)가 포함된다. 면역화 프로토콜은 당업계에 주지되어 있고, 선택된 동물 숙주에서 면역 응답을 도출하는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 애쥬번트 또한 당업계에 주지되어 있다.
전형적으로, 다중 피하 또는 복강내 주사에 의해, 또는 근육 내로 또는 IV를 통해 포유동물 내로 면역원이 (애쥬번트와 함께 또는 애쥬번트 없이) 주사된다. 면역원은 OX40 폴리펩티드, 융합 단백질, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 성질 (즉, 소수성 백분율, 친수성 백번율, 안정성, 순 전하, 등전점 등)에 따라, 면역화될 포유동물에서 면역원성인 것으로 공지된 단백질에 면역원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 이같은 접합은 공유 결합이 형성되도록 하는 접합될 면역원 및 면역원성 단백질 양쪽 모두에 대한 화학적 관능기의 활성 유도체화에 의한 화학적 접합, 융합 단백질을 기초로 하는 방법, 또는 당업자에게 공지된 기타 방법을 포함한다. 이같은 면역원성 단백질의 예로는 키홀 림펫 헤모시아닌, 난 알부민, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 대두 트립신 억제제, 및 다양한 T 헬퍼 펩티드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 다양한 애쥬번트가 상기 기술된 바와 같은 면역학적 응답을 증가시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 모노클로날 항체를 포함한다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위를 인식하는 항체이다. 이의 균일한 특이성은 다양한 여러 항원 부위들 인식하는 항체들을 일반적으로 함유하는 폴리클로날 항체보다 모노클로날 항체가 훨씬 더 유용하도록 한다. 하이브리도마 기술, 예컨대 [Kohler, et al., Nature 256:495 (1975)]; 미국 특허 번호 4,376,110; [Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988)] 및 [Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier (1981)]에 기술된 것들, 재조합 DNA 방법, 또는 당업자에게 공지된 기타 방법을 사용하여 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 방법의 또다른 예로는 인간 B-세포 하이브리도마 기술 ([Kosbor, et al., Immunology Today 4:72 (1983)]; [Cole, et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 (1983)]), 및 EBV-하이브리도마 기술 ([Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss (1985)])이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 이같은 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이의 임의의 서브클래스를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스의 항체일 수 있다. 시험관내에서 또는 생체내에서 본 발명의 mAb를 생산하는 하이브리도마가 배양될 수 있다.
하이브리도마 모델에서, 마우스, 인간화 마우스, 인간 면역계가 있는 마우스, 햄스터, 토끼, 낙타, 또는 임의의 기타 적절한 숙주 동물과 같은 숙주가 면역화되어, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구가 유발된다. 별법으로, 림프구가 시험관내에서 면역화될 수 있다. 그후, 림프구가 적절한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포주와 융합되어, 하이브리도마 세포가 형성된다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp.59-103 (1986)]).
일반적으로, 항체-생산 하이브리도마의 제조에서, 인간 기원의 세포를 원하는 경우 말초혈 림프구 ("PBL")가 사용되거나, 비-인간 포유류 공급원을 원하는 경우 지라 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 그 후, 적절한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 불멸화 세포주와 융합시켜, 하이브리도마 세포가 형성된다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)]). 일반적으로 불멸화 세포주는 형질전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 소 또는 인간 기원의 골수종 세포이다. 전형적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 융합되지 않은 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게는 함유하는 적절한 배양 배지에서 하이브리도마 세포가 배양될 수 있다. 예를 들어, 어버이 세포에 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 ("HAT 배지"), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 불멸화 세포주는 효율적으로 융합되고, 선별된 항체-생산 세포에 의한 안정적인 높은 수준의 항체 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 것이다. 이러한 골수종 세포주에는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 <Salk Institute Cell Distribution Center (San Diego, Calif.)>로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 <American Type Culture Collection (Rockville, Md. USA)>으로부터 입수가능한 SP2/0 또는 X63-Ag8-653 세포가 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기술되어 있다 ([Kozbor, J Immunol 133:3001 (1984)]; 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc, pp.51-63 (1987)]). 마우스 골수종 세포주 NSO 또한 사용될 수 있다 (<European Collection of Cell Cultures (Salisbury, Wilshire, UK)>).
하이브리도마 세포가 성장되는 배양 배지를 OX40에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 분석법, 예컨대 방사선면역분석법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 결정할 수 있다. 이같은 기술은 당업계에 공지되어 있고, 당업자의 기술에 속한다. OX40에 대한 모노클로날 항체의 결합 친화력을, 예를 들어, 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다 ([Munson, et al., Anal Biochem 107:220 (1980)]).
원하는 특이성, 친화력 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론을 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp.59-103 (1986)]). 이러한 목적에 적절한 배양 배지는, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지 (D-MEM) 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 배제 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리 또는 단리된다.
모노클로날 항체의 생산을 위한 다양한 방법이 당업계에 존재하고, 따라서, 본 발명은 이의 하이브리도마에서의 독점적인 생산에 한정되지 않는다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 재조합 DNA 방법, 예컨대 미국 특허 번호 4,816,567에 기술된 것에 의해 제조될 수 있다. 하이브리도마 세포는 이같은 DNA의 공급원으로서 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 그 후 이를 형질감염되지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 대장균 세포, NS0 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 또한, 예를 들어, 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 (미국 특허 번호 4,816,567; [Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)]), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 DNA가 변형될 수 있다. 이같은 비-면역글로불린 폴리펩티드로 본 발명의 항체의 불변 도메인을 치환하거나, 본 발명의 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인을 치환하여, 키메라 2가 항체가 생성될 수 있다.
항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체의 제조 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 수반한다. 중쇄 가교를 방지하도록 중쇄가 일반적으로 Fc 영역 내의 임의의 지점에서 말단절단된다. 별법으로, 관련된 시스테인 잔기가 또다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실되어 가교를 방지한다.
특정 에피토프를 인식하는 항체 단편이 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 전통적으로, 이러한 단편들은 무손상 항체의 단백질분해성 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, [Morimoto, et al., J Biochem Biophys Methods 24:107 (1992)] 및 [Brennan, et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 예를 들어, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편이 파파인 (Fab 단편 생산용) 또는 펩신 (F(ab')2 단편 생산용)과 같은 효소를 사용한 면역글로불린 분자의 단백질분해성 절단에 의해 생산될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다. 그러나, 현재 이러한 단편들은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 별법으로, F(ab')2-SH 단편들이 대장균으로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편이 형성될 수 있다 ([Carter, et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편이 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 또다른 기술이 당업자에게 명백할 것이다. 또다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (Fv)이다 (PCT 특허 출원 WO 93/16185).
인간에서의 항체의 생체내 사용 및 시험관내 검출 분석을 포함하는 일부 용도를 위해, 키메라, 인간화, 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메라 항체는 항체의 상이한 부분들이 상이한 동물 종들로부터 유래된 분자, 예컨대 뮤린 모노클로날 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역이 있는 항체이다. 키메라 항체의 생산 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, [Morrison, Science 229:1202 (1985)]; [Oi, et al., BioTechniques 4:214 (1986)]; [Gillies, et al., J Immunol Methods 125:191 (1989)]; 미국 특허 번호 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816397 (전체적으로 거명에 의해 본원에 포함됨) 참조.
인간화 항체는 동물-유래 모노클로날 항체보다 인간 면역글로불린에 대한 상동성이 더 크도록 디자인된다. 인간화는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체를 제조하기 위한 기술이다. 인간화 항체는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 (FR) 영역이 있는, 원하는 항원에 결합하는 비-인간 종에서 생성된 항체 분자이다. 종종, 항원 결합을 변경시키기 위해, 바람직하게는 개선시키기 위해, 인간 프레임워크 영역 내의 프레임워크 잔기가 CDR 도너 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이러한 프레임워크 치환은 당업계에 주지된 방법에 의해, 예를 들어, 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링, 및 특정 위치에서의 일반적이지 않은 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다. 미국 특허 번호 5,585,089; [Riechmann, et al., Nature 332:323 (1988)] (전체적으로 거명에 의해 본원에 포함됨) 참조. CDR-그래프팅(grafting) (EP 239,400; PCT 공개 WO 91/09967; 미국 특허 번호 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 베니어링(veneering) 또는 재포장(resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; [Padlan, Molecular Immunology 28:489 (1991)]; [Studnicka, et al., Protein Engineering 7:805 (1994)]; [Roguska, et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:969 (1994)]), 및 사슬 셔플링(shuffling) (미국 특허 번호 5,565,332)이 예를 들어 포함되는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 항체를 인간화시킬 수 있다.
일반적으로, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로 지칭되고, 이는 전형적으로는 "수입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 비-인간 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써, Winter 및 공동 연구원의 방법 ([Jones, et al., Nature, 321:522 (1986)]; [Riechmann, et al., Nature, 332:323 (1988)]; [Verhoeyen, et al., Science, 239:1534 (1988)])에 따라 인간화를 본질적으로 수행할 수 있다. 따라서, 이같은 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 전형적으로 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체에서의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체가 항원에 대한 더 높은 친화성 및 기타 유리한 생물학적 성질을 유지하는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 이루기 위해, 바람직한 방법에 따라, 어버이 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 어버이 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 프로세스에 의해 인간화 항체가 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 디스플레이들의 정밀검사로 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 특정 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 후보 면역글로불린 서열의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있고, 즉 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 항원 결합에 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 영향을 미치는 것은 CDR 잔기이지만, 원하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화력이 최대화되도록, 수용자 및 수입 서열로부터 FR 잔기들을 선택하고 조합시킬 수 있다.
인간화 항체를 제조하는데 사용되는 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 모두)을 선택하는 것은 항원성을 감소시키는데 중요하다. 소위 "베스트-핏(best-fit)" 방법에 따라, 비-인간 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 그후, 비-인간 어버이 항체의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 FR로서 받아들여진다 ([Sims, et al., J Immunol 151:2296 (1993)]; [Chothia, et al., J Mol Biol 196:901 (1987)]).
또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 ([Carter, et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992)]; [Presta, et al., J Immunol 151:2623 (1993)]). 항체가 원하는 생물학적 특징 (예를 들어, 원하는 결합 친화력)을 나타내는 한, 본 발명의 항체는 임의의 적절한 인간 또는 인간 컨센서스 경쇄 또는 중쇄 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상 (예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 그 이상)의 추가적인 변형이 인간 및/또는 인간 컨센서스 비-초가변 영역 서열 내에 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 경쇄의 프레임워크 서열의 적어도 일부분 (또는 전부)을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 중쇄의 프레임워크 서열의 적어도 일부분 (또는 전부)을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 서브그룹 I 프레임워크 컨센서스 서열의 적어도 일부분 (또는 전부)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 서브그룹 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체의 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에서의 치환을 포함한다. 이러한 항체들의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/이거나, 73은 T이고/이거나 78은 A이다.
완전히 인간형인 항체가 인간 환자의 치료적 처치에 특히 바람직하다. 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 상기 기술된 파지 디스플레이 방법을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 인간 항체를 제조할 수 있다. 미국 특허 번호 4,444,887 및 4,716,111; 및 PCT 공개 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741를 또한 참조하고, 이들 각각은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다. Cole 등 및 Boerner 등의 기술 또한 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능하다 ([Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss (1985)]; 및 [Boerner, et al., J Immunol 147:86 (1991)]).
기능적인 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 인간 항체를 또한 생산할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체를 무작위로 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포 내로 도입할 수 있다. 별법으로, 인간 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역을 인간 중쇄 및 경쇄 유전자에 더하여 마우스 배아 줄기 세포 내로 도입할 수 있다. 상동 재조합에 의해 인간 면역글로불린 유전자좌가 도입되면서 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자가 별도로 또는 동시에 기능적이지 않게 될 수 있다. 특히, JH 영역의 동종접합 결실은 내인성 항체 생산을 방지한다. 변형된 배아 줄기 세포가 확대되고, 주머니배 내로 미세주입되어, 키메라 마우스가 생산된다. 그후, 키메라 마우스가 사육되어, 인간 항체를 발현하는 동종접합 자손이 생산된다. 예를 들어, [Jakobovitis, et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:2551 (1993)]; [Jakobovitis, et al., Nature 362:255 (1993)]; [Bruggermann, et al., Year in Immunol 7:33 (1993)]; [Duchosal, et al., Nature 355:258 (1992)] 참조.
선택된 항원, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 전부 또는 이의 일부분으로 일반적인 방식으로 트랜스제닉 마우스를 면역화시킨다. 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체를 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 은닉(harboring)된 인간 면역글로불린 트랜스진이 B 세포 분화 동안 재배열되고, 이어서 클래스 스위칭(switching) 및 체세포 돌연변이가 진행된다. 따라서, 이같은 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산할 수 있다. 인간 항체를 생산하기 위한 이러한 기술의 개관을 위해, [Lonberg, et al., Int Rev Immunol 13:65-93 (1995)] 참조. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 이러한 기술, 및 이같은 항체를 생산하기 위한 프로토콜의 추가적인 논의를 위해, 예를 들어, PCT 공개 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 유럽 특허 번호 0 598 877; 미국 특허 번호 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; 및 5,939,598을 참조하고, 이들은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다. 또한, 상기 기술된 것과 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대해 지시된 인간 항체를 제공하도록 Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.), Genpharm (San Jose, Calif.), 및 Medarex, Inc. (Princeton, NJ.)와 같은 회사를 고용할 수 있다.
인간 말초혈 림프구, 지라세포 또는 골수가 이식된 마우스를 면역화시킴으로써 인간 mAb를 또한 제조할 수 있다 (예를 들어, XTL의 트리오마(Trioma) 기술). "유도(guided) 선별"로 지칭되는 기술을 사용하여, 선택된 에피토프를 인식하는 완전히 인간형인 항체가 생성될 수 있다. 이러한 접근법에서, 선택된 비-인간 모노클로날 항체, 예를 들어, 마우스 항체가 동일한 에피토프를 인식하는 완전히 인간형인 항체의 선별을 유도하도록 사용된다 ([Jespers, et al., Bio/technology 12:899 (1988)]).
또한, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체가, 이번에는, 당업자에게 주지된 기술을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 "모방"하는 항-이디오타입 항체를 생성시키는데 사용될 수 있다 (예를 들어, [Greenspan, et al., FASEB J 7:437 (1989)]; [Nissinoff, J Immunol 147:2429 (1991)] 참조). 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하고, 폴리펩티드 다량체화 및/또는 본 발명의 폴리펩티드가 리간드에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체를 사용하여, 폴리펩티드 다량체화 및/또는 결합 도메인을 "모방"하고, 결과적으로 폴리펩티드 및/또는 이의 리간드에 결합하여 이를 중화시키는 항-이디오타입을 생성시킬 수 있다. 이같은 중화성 항-이디오타입 또는 이같은 항-이디오타입의 Fab 단편은 치료 요법에서 사용되어 폴리펩티드 리간드를 중화시킬 수 있다. 예를 들어, 이같은 항-이디오타입 항체를 본 발명의 폴리펩티드에 결합하고/하거나 이의 리간드/수용체에 결합하는데 사용함으로써, 이의 생물학적 활성을 차단할 수 있다.
본 발명의 항체는 이중특이적 항체일 수 있다. 이중특이적 항체는 2가지 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성이 있는 모노클로날 항체, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 본 발명에서, 결합 특이성 중 하나는 OX40에 대해 지시될 수 있고, 다른 하나는 임의의 또다른 항원, 바람직하게는 세포-표면 단백질, 수용체, 수용체 서브유닛, 조직-특이적 항원, 바이러스에서 유래된 단백질, 바이러스에 의해 코딩되는 외피 단백질, 박테리아에서 유래된 단백질, 또는 박테리아 표면 단백질 등에 대한 것일 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 주지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동-발현을 기초로 하고, 이때 두 중쇄는 특이성이 상이하다 ([Milstein, et al., Nature 305:537 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열(assortment)로 인해, 이러한 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 올바른 분자의 정제가 일반적으로 달성된다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 [Traunecker, et al., EMBO J 10:3655 (1991)]에 개시되어 있다.
원하는 결합 특이성 (항체-항원 조합 부위)이 있는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 바람직하게는, 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합물 중 적어도 하나에 존재할 수 있다. 면역글로불린 중쇄 융합물, 및 원한다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA들을 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적절한 숙주 생물 내로 공동-형질전환시킨다. 이중특이적 항체를 생성시키는 것의 추가적인 상세사항에 대해서는, 예를 들어, [Suresh, et al., Meth In Enzym 121:210 (1986)]을 참조한다.
이종접합체 항체가 본 발명에 의해 또한 구현된다. 이종접합체 항체는 2개의 공유결합으로 연결된 항체로 구성된다. 이같은 항체는, 예를 들어, 원치 않는 세포에 면역계 세포를 표적화하도록 제안되었다 (미국 특허 번호 4,676,980). 가교제가 수반되는 것들을 포함하여 합성 단백질 화학에서의 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 항체를 제조할 수 있는 것으로 구현된다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 사용하여 또는 티오에스테르 결합을 형성시킴으로써 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적을 위한 적절한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트, 및 미국 특허 번호 4,676,980에 예를 들어 개시된 것들이 포함된다.
또한, OX40에 대한 단일-도메인 항체를 생성시킬 수 있다. 낙타과(Camelidae) 중쇄 Ig로부터 유래된 항체에 대한 WO9425591, 뿐만 아니라 파지 라이브러리로부터 단일 도메인의 완전히 인간형인 항체를 단리하는 것이 기술된 US20030130496에 이러한 기술의 예가 기술되어 있다.
중쇄 및 경쇄 Fv 영역이 연결되어 있는 단일 펩티드 사슬 결합 분자를 또한 생성시킬 수 있다. 단일쇄 항체 ("scFv") 및 이의 구축 방법이 미국 특허 번호 4,946,778에 기술되어 있다. 별법으로, 유사한 수단에 의해 Fab가 구축되어 발현될 수 있다. 모든 전체적으로 인간형인 항체 및 부분적으로 인간형인 항체는 전체적으로 뮤린형인 mAb보다 덜 면역원성이고, 단편 및 단일쇄 항체 또한 덜 면역원성이다.
항체 또는 항체 단편을 [McCafferty, et al., Nature 348:552 (1990)]에 기술된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. [Clackson, et al., Nature 352:624 (1991)] 및 [Marks, et al., J Mol Biol 222:581 (1991)]에는 파지 라이브러리를 사용한 뮤린 및 인간 항체의 단리가 각각 기술되어 있다. 후속 문헌들에는 사슬 셔플링에 의한 고친화력 (nM 범위) 인간 항체의 생산 ([Marks, et al., Bio/Technology, 10:779 (1992)]), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서의 조합형 감염 및 생체내 재조합 ([Waterhouse, et al., Nuc Acids Res 21:2265 (1993)])이 기술되어 있다. 따라서, 이러한 기술들은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 별법이다.
예를 들어, 상동성 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 DNA를 또한 변형시킬 수 있다 (미국 특허 번호 4,816,567; [Morrison, et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)]).
또다른 별법은 화학적 융합보다는 전기적 융합을 사용하여 하이브리도마를 형성시키는 것이다. 이러한 기술은 잘 확립되어 있다. 융합 대신, 예를 들어, 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스 또는 형질전환 유전자를 사용하여, B 세포를 형질전환시켜 이를 불멸성이게 만들 수도 있다. 예를 들어, ["Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity", Zurawaki, et al., Monoclonal Antibodies, ed. by Kennett, et al., Plenum Press, pp.19-33. (1980)] 참조. 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터 및 기니 피그)를 진핵생물 또는 원핵생물 시스템에 의해 발현된 OX40 단백질, 융합 단백질 또는 이의 단편으로 면역화시킴으로써 항-OX40 mAb가 상승될 수 있다. 기타 동물, 예를 들어, 비-인간 영장류, 면역글로불린을 발현하는 트랜스제닉 마우스, 및 인간 B 림프구가 이식된 중증 복합형 면역결핍증 (SCID) 마우스가 면역화에 사용될 수 있다. 종전에 기술된 바와 같이 ([Kohler, et al., Nature 256:495 (1975)]), 면역화된 동물로부터의 B 림프구를 골수종 세포 (예를 들어, Sp2/0 및 NSO)와 융합시킴으로써 통상적인 절차에 의해 하이브리도마가 생성될 수 있다. 또한, 파지-디스플레이 시스템 내의 인간 B 림프구로부터의 재조합 단일쇄 Fv 또는 Fab 라이브러리를 스크리닝함으로써 항-OX40 항체가 생성될 수 있다. OX40에 대한 mAb의 특이성을 ELISA, 웨스턴 면역블롯팅 또는 기타 면역화학 기술에 의해 테스트할 수 있다. CD4+ T 세포 활성화에 대한 항체의 억제 활성을 증식, 사이토카인 방출, 및 세포자멸사 분석법에 의해 평가할 수 있다. 양성 웰 내의 하이브리도마를 제한 희석에 의해 클로닝한다. 상기 기술된 분석법에 의한 인간 OX40에 대한 특이성의 특성화를 위해 항체를 정제한다.
5.4 길항제 항-OX40 항체의 확인
본 발명은 OX40의 작용을 억제 및 중화하는 길항제 모노클로날 항체를 제공한다. 특히, 본 발명의 항체는 OX40에 결합하고 이의 활성화를 억제한다. 본 발명의 항체는 A10 및 B66으로 칭해지는 항체를 포함하고, 이러한 뮤린 항체의 인간화 항체가 개시된다. 본 발명은 이러한 항체들 중 하나와 동일한 에피토프, 예를 들어, 모노클로날 항체 A10(TH)hu336F의 에피토프에 결합하는 항체를 또한 포함한다.
후보 항-OX40 항체를 (1) 형광측정 미세부피 분석 기술 (FMAT) (Applied Biosystem (CA)), (2) 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 및 (3) 유동 세포측정 면역분석법을 사용하여 스크리닝하였다. 선택된 항체를 특성화하기 위해 수행된 분석법에는 (1) Hut-78 분석법; (2) 나이브 CD4+ T-세포 분석법; (3) TH1, TH2 및 TH17 조건; (4) TCR-활성화 나이브 CD4+ T-세포 프로토콜; (5) 세포자멸사 분석법, 및 (6) 교차-반응성 테스트가 포함된다. 실시예에서 실험에 관한 상세사항이 기술된다.
본 발명의 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 1가, 이중특이적, 이종접합체, 다중특이적, 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, 단일-도메인 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 및 상기의 항체들 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 면역글로불린 분자는 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 분자일 수 있다. 항체는 본 발명의 항원-결합 항체 단편일 수 있고, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일쇄 Fv (scFv), 단일쇄 항체, 디술피드-연결 Fv (sdFv), 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단일-도메인 항체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 단일쇄 항체를 포함하는 항원-결합 항체 단편은 가변 영역(들)을 단독으로 또는 하기의 것들 전체 또는 일부분과 조합하여 포함할 수 있다: 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인. 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 임의의 조합물을 포함하는 항원-결합 단편이 본 발명에 또한 포함된다. 본 발명의 항체는 조류 및 포유류를 포함하는 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간, 비-인간 영장류, 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니 피그, 낙타, 말 또는 닭으로부터의 것이다.
본 발명의 항체는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 그 이상의 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 항체는 OX40의 여러 에피토프들에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 OX40, 뿐만 아니라 이종성 에피토프, 예컨대 이종성 폴리펩티드 또는 고체 지지체 물질 양쪽 모두에 대해 특이적일 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; [Tutt, et al., J Immunol 147:60 (1991)]; 미국 특허 번호 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; [Kostelny, et al., J Immunol 148:1547 (1992)] 참조.
본 발명의 항체는 항체가 인식하거나 특이적으로 결합하는 OX40의 에피토프(들) 또는 일부분(들)의 관점에서 기술되거나 구체화될 수 있다. 에피토프(들) 또는 폴리펩티드 부분(들)은 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어, N-말단 및 C-말단 위치에 의해, 연속 아미노산 잔기의 크기에 의해 구체화될 수 있거나, 또는 표 및 도에 열거될 수 있다.
본 발명의 항체는 항체의 교차-반응성의 관점에서 또한 기술되거나 구체화될 수 있다. OX40에 대한 동일성 (당업계에 공지되고 본원에 기술된 방법을 사용하여 계산됨)이 적어도 95％, 적어도 90％, 적어도 85％, 적어도 80％, 적어도 75％, 적어도 70％, 적어도 65％, 적어도 60％, 적어도 55％, 및 적어도 50％인 OX40 폴리펩티드에 결합하는 항체가 본 발명에 또한 포함된다. 항-OX40 항체는 이러한 항-OX40 항체가 지시되는 것 이외의 종으로부터의 항-OX40 항체와 같이 약 10-7 M 미만, 약 10-6 M 미만, 또는 약 10-5 M 미만의 KD로 또다른 단백질에 또한 결합할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 OX40의 또다른 포유류 상동체 및 이의 상응하는 에피토프와 교차-반응할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 기술된 교차-반응성은 임의의 단일한 특정 항원성 또는 면역원성 폴리펩티드, 또는 본원에 개시된 특정 항원성 및/또는 면역원성 폴리펩티드들의 조합물(들)에 관한 것이다.
엄격한 혼성화 조건 하에 OX40를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 결합하는 항체가 본 발명에 추가로 포함된다. 본 발명의 항체는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체의 결합 친화력의 관점에서 기술되거나 구체화될 수 있다. 바람직한 결합 친화력은 평형 해리 상수 또는 KD가 10-8 내지 10-15 M, 10-8 내지 10-12 M, 10-8 내지 10-10 M, 또는 10-10 내지 10-12 M인 것들을 포함한다. 본 발명은 경쟁적 결합을 결정하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 본원에 기술된 면역분석법에 의해 결정되는 바와 같이 항체가 본 발명의 에피토프에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체를 또한 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 에피토프에 대한 결합을 적어도 95％, 적어도 90％, 적어도 85％, 적어도 80％, 적어도 75％, 적어도 70％, 적어도 60％, 또는 적어도 50％만큼 경쟁적으로 억제한다.
5.5 벡터 및 숙주 세포
또다른 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 항체를 코딩하는 단리된 핵산 서열, 본 발명의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 구축물, 이같은 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 항체의 생산을 위한 재조합 기술을 제공한다.
항체의 재조합 생산을 위해, 이를 코딩하는 핵산이 단리되어, 추가적인 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입된다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리 및 서열분석된다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써). 클로닝 및 형질전환을 위한 표준 기술을 본 발명의 항체를 발현하는 세포주의 제조에서 사용할 수 있다.
5.5.1 벡터
다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 신호 서열, 복제 기원, 1가지 이상의 마커 유전자, 인핸서(enhancer) 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나이상을 일반적으로 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 주지된 기술을 사용하여 본 발명의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터를 제조할 수 있다. 발현 벡터는 포유류, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 것들과 같은 적절한 전사 또는 번역 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 조절 서열의 예로는 전사 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서, mRNA 리보솜 결합 부위, 및/또는 전사 및 번역 개시 및 종결을 제어하는 기타 적합한 서열이 포함된다. 뉴클레오티드 서열은 조절 서열이 적합한 폴리펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 관련될 때 "작동가능하게 연결"된다. 따라서, 프로모터 뉴클레오티드 서열이 적합한 뉴클레오티드 서열의 전사를 제어하는 경우에, 프로모터 뉴클레오티드 서열이 예를 들어 항체 중쇄 서열에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 항체를 발현시키기 위한 유용한 발현 벡터의 예를 거명에 의해 본원에 포함된 WO 04/070011 출원에서 확인할 수 있다.
또한, 천연적으로는 항체 중쇄 및/또는 경쇄 서열과 회합되지 않는 적합한 신호 펩티드를 코딩하는 서열이 발현 벡터 내로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 항체가 원형질막 주위공간으로 또는 배지 내로 분비되도록 신호 펩티드 (분비 리더(leader))에 대한 뉴클레오티드 서열이 인-프레임(in-frame)으로 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다. 의도된 숙주 세포에서 기능성인 신호 펩티드는 적합한 항체의 세포외 분비를 강화시킨다. 세포로부터 항체가 분비될 때 신호 펩티드가 폴리펩티드로부터 절단될 수 있다. 이같은 분비 신호의 예는 주지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,698,435; 5,698,417; 및 6,204,023에 기술된 것들이 포함된다.
5.5.2 숙주 세포
본 발명에서 유용한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 고급 진핵생물 세포이고, 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 (예를 들어, 대장균, 바실루스 서브틸리스(B. subtilis))와 같은 미생물; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia)); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 배큘로바이러스(Baculovirus))로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV); 담배 모자이크 바이러스 (TMV))로 감염되었거나 또는 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 우두 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구축물이 은닉된 포유류 세포 시스템 (예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 숙주 세포로 유용한 원핵생물에는 그람(gram) 음성 또는 그람 양성 생물 예컨대 대장균, 바실루스 서브틸리스, 엔테로박테르(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실러스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다. 한 바람직한 대장균 클로닝 숙주는 대장균 294 (ATCC 31,446)이지만, 대장균 B, 대장균 X1776 (ATCC 31,537), 및 대장균 W3110 (ATCC 27,325)와 같은 또다른 균주도 적절하다. 이러한 예들은 제한적이기보다는 예시적이다.
원핵생물 숙주 세포에서 사용하기 위한 발현 벡터는 하나 이상의 표현형 선별성 마커 유전자를 일반적으로 포함한다. 표현형 선별성 마커 유전자는, 예를 들어, 항생제 저항성을 부여하거나 독립영양성 요건을 충족시키는 단백질을 코딩하는 유전자이다. 원핵생물 숙주 세포를 위한 유용한 발현 벡터의 예로는 pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals (Uppsala, Sweden)), pGEM1 (Promega Biotec (Madison, Wisconsin., USA)), 및 pET (Novagen (Madison, Wisconsin, USA)) 및 pRSET (Invitrogen Corporation (Carlsbad, California, USA)) 시리즈의 벡터와 같은 시판되는 플라스미드로부터 유래된 것들이 포함된다 ([Studier, J Mol Biol 219:37 (1991)]; [Schoepfer, Gene 124:83 (1993)]). 재조합 원핵생물 숙주 세포 발현 벡터용으로 통상적으로 사용되는 프로모터 서열에는 T7 ([Rosenberg, et al., Gene 56:125 (1987)]), β-락타마제 (페니실리나제), 락토스 프로모터 시스템 ([Chang, et al., Nature 275:615 (1978)]; [Goeddel, et al., Nature 281:544 (1979)]), 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 ([Goeddel, et al., Nucl Acids Res 8:4057 (1980)]), 및 tac 프로모터 ([Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990)])가 포함된다.
본 발명에서 유용한 효모 또는 필라멘트형 진균에는 사카로마이세스 속, 피치아 속, 악티노마이세테스(Actinomycetes) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속, 칸디다(Candida) 속, 트리코데르마(Trichoderma) 속, 뉴로스포라(Neurospora) 속, 및 필라멘트형 진균 예컨대 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), (Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus)로부터의 것들이 포함된다. 효모 벡터는 2μ 효모 플라스미드로부터의 복제 기원 서열, 자가 복제 서열 (ARS), 프로모터 영역, 폴리아데닐화를 위한 서열, 전사 종결을 위한 서열 및 선별성 마커 유전자를 종종 함유할 것이다. 효모 벡터를 위한 적절한 프로모터 서열에는 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제 ([Hitzeman, et al., J Biol Chem 255:2073 (1980)]) 또는 기타 당분해성 효소 ([Holland, et al., Biochem 17:4900 (1978)]) 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 특히 포함된다. 효모 발현에서 사용하기 위한 기타 적절한 벡터 및 프로모터가 [Fleer, et al., Gene 107:285 (1991)]에 추가로 기술되어 있다. 기타 적절한 효모용 프로모터 및 벡터, 및 효모 형질전환 프로토콜이 당업계에 주지되어 있다. 효모 형질전환 프로토콜이 주지되어 있다. 한 이같은 프로토콜이 [Hinnen, et al., Proc Natl Acad Sci 75:1929 (1978)]에 기술되어 있다. Hinnen의 프로토콜에서는 선별 배지에서 Trp+ 형질전환체가 선별된다.
포유류 또는 곤충 숙주 세포 배양 시스템이 재조합 항체를 발현시키는데 또한 사용될 수 있다. 원칙적으로, 척추동물 또는 무척추동물 배양물 여부와 상관 없이 임의의 고급 진핵생물 세포 배양물이 작업가능하다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다 ([Luckow, et al., Bio/Technology 6:47 (1988)]; [Miller, et al., Genetics Engineering, Setlow, et al., eds. Vol. 8, pp. 277-9, Plenam Publishing (1986)]; [Mseda, et al., Nature 315:592 (1985)]). 예를 들어, 배큘로바이러스 시스템이 이종 단백질의 생산에 사용될 수 있다. 곤충 시스템에서, 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드론형성 바이러스 (AcNPV)가 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로 사용될 수 있다. 이러한 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열을 바이러스의 비-필수 영역 (예를 들어, 폴리헤드린 유전자) 내로 개별적으로 클로닝하고, AcNPV 프로모터 (예를 들어 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 놓을 수 있다. 확인된 기타 숙주에는 아에데스(Aedes), 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)가 포함된다. 다양한 형질감염용 바이러스 균주, 예를 들어, AcNPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능하고, 이같은 바이러스들은, 특히 스포롭테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로 사용될 수 있다. 또한, 면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물 또한 숙주로서 사용될 수 있다.
척추동물 세포, 및 배양물 (조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식이 일상적인 절차가 되었다. [Tissue Culture, Kruse, et al., eds., Academic Press (1973)] 참조. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 원숭이 신장; 인간 배아 신장 세포주; 베이비 햄스터 신장 세포; 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, [Urlaub, et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포; 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포; 인간 폐 세포; 인간 간 세포; 마우스 유방 종양; 및 NS0 세포이다.
숙주 세포를 항체 생산을 위한 상기 기술된 벡터로 형질전환시키고, 프로모터, 전사 및 번역 제어 서열의 유도, 형질전환체 선별 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적합하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다. 통상적으로 사용되는 프로모터 서열 및 인핸서 서열은 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 원숭이 바이러스 40 (SV40), 및 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV)로부터 유래된다. SV40 바이러스 게놈으로부터 유래된 DNA 서열을 사용하여, 포유류 숙주 세포에서의 구조 유전자 서열의 발현을 위한 또다른 유전자 요소, 예를 들어, SV40 기원, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이스, 및 폴리아데닐화 부위를 제공할 수 있다. 바이러스 초기 및 후기 프로모터가 특히 유용한데, 양쪽 모두가 바이러스 복제 기원을 또한 함유할 수 있는 단편으로서 바이러스 게놈으로부터 쉽게 수득되기 때문이다. 포유류 숙주 세포에서 사용하기 위한 예시적인 발현 벡터가 시판된다.
본 발명의 항체를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판되는 배지 예컨대 햄(Ham) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, Sigma)가 숙주 세포를 배양하는데 적절하다. 또한, [Ham, et al., Meth Enzymol 58:44 (1979)], [Barnes, et al., Anal Biochem 102:255 (1980)], 및 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,560,655; 5,122,469; 5,712,163; 또는 6,048,728에 기술된 배지들 중 임의의 것을 숙주 세포에 대한 배양 배지로 사용할 수 있다. 임의의 이러한 배지에 필요하다면 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 염화칼슘, 마그네슘; 및 포스페이트), 완충액 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 GENTAMYCIN™ 약물), 미량원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 일반적으로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원이 보충될 수 있다. 임의의 또다른 필요한 보충물이 당업자에게 공지된 적합한 농도로 또한 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현에 선택된 숙주 세포와 종전에 사용된 조건들이고, 당업자에게 명백할 것이다.
5.6 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명은 본 발명의 항체 및 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산, 예를 들어, DNA를 추가로 제공한다. 예시적인 폴리뉴클레오티드에는 본원에 기술된 아미노산 서열들 중 하나 이상을 포함하는 항체 사슬을 코딩하는 것들이 포함된다. 본 발명은 엄격한 혼성화 조건 또는 더 낮은 엄격도의 혼성화 조건 하에 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 또한 포함한다.
당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지된 경우, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드들로부터 조립할 수 있고 (예를 들어, [Kutmeier, et al., Bio/Techniques 17:242 (1994)]에 기술된 바와 같이), 간략하게, 이는 항체를 코딩하는 서열의 일부분을 함유하는 중복성 올리고뉴클레오티드들을 합성하고, 이러한 올리고뉴클레오티드들을 어닐링(annealing) 및 결찰시킨 후, 결찰된 올리고뉴클레오티드들을 PCR에 의해 증폭시키는 것을 수반한다.
별법으로, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 공급원으로부터의 핵산으로부터 생성시킬 수 있다. 특정 항체를 코딩하는 핵산을 함유하는 클론이 입수가능하지 않지만 항체 분자의 서열은 공지되어 있는 경우, 면역글로불린을 코딩하는 핵산을 화학적으로 합성할 수 있거나, 또는 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화가능한 합성 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 또는 항체를 코딩하는 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 예를 들어 확인하기 위해 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 클로닝함으로써, 적절한 공급원 (예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예컨대 본 발명의 항체의 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포로부터 생성된 cDNA 라이브러리, 또는 상기와 같은 조직 또는 세포로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리A+ RNA)으로부터 수득할 수 있다. 그후, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산을 복제가능한 클로닝 벡터 내로 당업계에 주지된 임의의 방법을 사용하여 클로닝할 수 있다.
일단 항체의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열이 결정되면, 뉴클레오티드 서열의 조작을 위해 당업계에 주지된 방법, 예를 들어, 재조합 DNA 기술, 부위 지정 돌연변이유발, PCR 등을 사용하여 항체의 뉴클레오티드 서열을 조작하여 (예를 들어, [Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990)]; [Ausubel, et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998)] (양쪽 모두 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함됨)에 기술된 기술을 참조한다), 아미노산 서열이 상이한 항체를 생성시킬 수 있고, 예를 들어 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 생성시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 주지된 방법에 의해, 예를 들어, 서열 초가변성의 영역을 확인하기 위한 다른 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 공지된 아미노산 서열에 대한 비교에 의해, CDR의 서열을 확인하기 위해 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 검사할 수 있다. 일상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여, 상기 기술된 바와 같이, 하나 이상의 CDR을 프레임워크 영역 내에, 예를 들어, 인간 프레임워크 영역 내로 삽입하여 비-인간 항체를 인간화시킬 수 있다. 프레임워크 영역은 천연 발생 프레임워크 영역 또는 컨센서스 프레임워크 영역일 수 있고, 바람직하게는 인간 프레임워크 영역이다 (예를 들어, 인간 프레임워크 영역의 목록에 대해 [Chothia, et al., J Mol Biol 278:457 (1998)] 참조). 바람직하게는, 프레임워크 영역과 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩한다. 바람직하게는, 상기 논의된 바와 같이, 하나 이상의 아미노산 치환이 프레임워크 영역 내에서 이루어질 수 있고, 바람직하게는, 이러한 아미노산 치환은 항체가 이의 항원에 결합하는 것을 개선시킨다. 추가적으로, 이같은 방법을 사용하여 사슬내 디술피드 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기를 아미노산 치환 또는 결실시켜, 하나 이상의 사슬내 디술피드 결합이 없는 항체 분자를 생성시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 기타 변형이 본 발명에 포함되고, 당업계의 기술에 속한다.
또한, 적합한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 적합한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 스플라이싱(splicing)시킴으로써 "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술 ([Morrison, et al., Proc Natl Acad Sci 81:851 (1984)]; [Neuberger, et al., Nature 312:604 (1984)]; [Takeda, et al., Nature 314:452 (1985)])을 사용할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 키메라 항체는 상이한 부분들이 상이한 동물 종들로부터 유래된 분자, 예컨대 뮤린 mAb로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역이 있는 항체, 예를 들어, 인간화 항체이다.
별법으로, 단일쇄 항체의 생산을 위해 기술된 기술 (미국 특허 번호 4,946,778; [Bird, Science 242:423 (1988)]; [Huston, et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879 (1988)]; 및 [Ward, et al., Nature 334:544 (1989)])을 개조하여, 단일쇄 항체를 생산할 수 있다. 단일쇄 항체는 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 아미노산 다리를 통해 연결시켜 단일쇄 폴리펩티드를 생성시킴으로써 형성된다. 대장균에서의 기능성 Fv 단편의 조립을 위한 기술이 또한 사용될 수 있다 ([Skerra, et al., Science 242:1038 (1988)]).
5.7 항-OX40 항체의 생산 방법
항체의 합성을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 특히, 화학적 합성에 의해 또는 바람직하게는 재조합 발현 기술에 의해 본 발명의 항체가 생산될 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이의 단편, 유도체 또는 유사체 (예를 들어, 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 본 발명의 단일쇄 항체)의 재조합 발현은 항체 또는 항체의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 구축을 필요로 한다. 일단 항체 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 항체의 생산을 위한 벡터를 재조합 DNA 기술에 의해 생산할 수 있다. 항체 코딩 서열 및 적합한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터가 구축된다. 이러한 방법에는, 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합이 포함된다.
통상적인 기술에 의해 발현 벡터가 숙주 세포에 전달된 후, 형질감염된 세포가 통상적인 기술에 의해 배양되어, 본 발명의 항체가 생산된다. 본 발명의 한 양상에서, 하기에 상술된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄 양쪽 모두를 코딩하는 벡터들이 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 공동-발현될 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 상기 기술된 바와 같이 본 발명의 항체 분자를 발현시키는데 이용될 수 있다. 이같은 숙주-발현 시스템은 당해 코딩 서열이 이에 의해 생산되고, 이어서 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 적합한 뉴클레오티드로 형질전환 또는 형질감염되는 경우 본 발명의 항체 분자를 계내에서 발현할 수 있는 세포를 또한 나타낸다. 박테리아 세포 예컨대 대장균, 및 진핵생물 세포가 재조합 항체 분자의 발현, 특히 전체적인 재조합 항체 분자의 발현에 통상적으로 사용된다. 예를 들어, 포유류 세포 예컨대 CHO 세포가, 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께, 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다 ([Foecking, et al., Gene 45:101 (1986)]; [Cockett, et al., Bio/Technology 8:2 (1990)]).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 또는 유전자 생성물을 원하는 특이적인 방식으로 변형시키고 프로세싱하는 숙주 세포가 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 이같은 변형 (예를 들어, 글리코실화) 및 프로세싱 (예를 들어, 절단)이 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포들에는 단백질 및 유전자 생성물의 번역후 프로세싱 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 메커니즘들이 있다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 확실하게 하도록 적합한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해, 1차 전사물의 적절한 프로세싱, 글리코실화, 및 유전자 생성물의 인산화를 위한 세포 기계를 지니는 진핵생물 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이같은 포유류 숙주 세포에는 CHO, COS, 293, 3T3 또는 골수종 세포가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
재조합 단백질의 장기간의 고수율 생산을 위해, 안정적인 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 적합한 발현 제어 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등)에 의해 제어되는 DNA, 및 선별성 마커로 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포를 강화 배지에서 1일 내지 2일 동안 성장시킬 수 있고, 그후 선별 배지로 전환시킨다. 재조합 플라스미드 내의 선별성 마커는 선별에 대한 저항성을 부여하고, 세포의 염색체 내로 플라스미드가 안정적으로 통합되어 세포가 포커스(focus)를 형성하도록 성장하게 하며, 차례로 이러한 포커스가 클로닝되어 세포주 내로 확장될 수 있다. 항체 분자를 발현하는 세포주를 조작하도록 이러한 방법이 유리하게 사용될 수 있다. 이같은 조작된 세포주는 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에서 특히 유용할 수 있다.
각각 tk, hgprt 또는 aprt-세포에서 사용될 수 있는 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 ([Wigler, et al., Cell 11:223 (1977)]), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스페라제 ([Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48:202 (1992)]), 및 아데닌 포스포리보실트랜스페라제 ([Lowy, et al., Cell 22:817 (1980)]) 유전자를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다수의 선별 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 저항성이 하기의 유전자들에 대한 선별의 기초로 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr ([Wigler, et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:357 (1980)]; [O'Hare, et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:1527 (1981)]); 마이코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt ([Mulligan, et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코시드 G-418에 대한 저항성을 부여하는 neo ([Wu, et al., Biotherapy 3:87 (1991)]); 및 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro ([Santerre, et al., Gene 30:147 (1984)]). 재조합 DNA 기술 분야에 통상적으로 공지된 방법들이 원하는 재조합 클론을 선별하는데 일상적으로 적용될 수 있고, 이같은 방법들은, 예를 들어, [Ausubel, et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press (1990)]; 및 [Chapters 12 & 13, Dracopoli, et al., eds, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons (1994)]; [Colberre-Garapin, et al., J Mol Biol 150:1 (1981)] (상기 문헌들은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다)에 기술되어 있다.
항체 분자의 발현 수준을 벡터 증폭에 의해 증가시킬 수 있다 (리뷰를 위해 [Bebbington, et al., "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells", DNA Cloning, Vol.3. Academic Press (1987)] 참조). 항체를 발현하는 벡터 시스템 내의 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양물 내에 존재하는 억제제의 수준 증가는 마커 유전자의 카피수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역이 항체 유전자와 회합되기 때문에, 항체의 생산이 또한 증가될 것이다 ([Crouse, et al., Mol Cell Biol 3:257 (1983)]).
제1 벡터는 중쇄에서 유래된 폴리펩티드를 코딩하고 제2 벡터는 경쇄에서 유래된 폴리펩티드를 코딩하는 2개의 본 발명의 발현 벡터로 숙주 세포를 공동-형질감염시킬 수 있다. 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 허용하는 동일한 선별성 마커를 함유할 수 있다. 별법으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 양쪽 모두를 코딩하고 이를 발현시킬 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이같은 상황에서, 과량의 독성 유리(free) 중쇄를 피하기 위해 경쇄가 중쇄 앞에 놓여야 한다 ([Proudfoot, Nature 322:52 (1986)]; [Kohler, Proc Natl Acad Sci USA 77:2197 (1980)]). 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
일단 본 발명의 항체 분자가 동물에 의해 생산되거나, 화학적으로 합성되거나, 또는 재조합에 의해 발현되면, 면역글로불린의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 (특히, 단백질 A 후의 특정 항원에 대한 친화력에 의한 것), 및 크기-배제 크로마토그래피), 원심분리, 차별적 용해도에 의해, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 기타 표준 기술에 의해 항체 분자를 정제할 수 있다. 또한, 정제를 용이하게 하기 위해, 본 발명의 항체 또는 이의 단편이 본원에 기술되었거나 당업계에 공지된 이종성 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다.
본 발명은 폴리펩티드에 재조합에 의해 융합되었거나 또는 화학적으로 접합 (공유결합에 의한 접합 및 비-공유결합에 의해 접합 양쪽 모두를 포함함)된 항체를 포함한다. 융합 또는 접합된 본 발명의 항체는 정제에서의 용이성을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 93/21232; EP 439,095; [Naramura, et al., Immunol Lett 39:91 (1994)]; 미국 특허 번호 5,474,981; [Gillies, et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:1428 (1992)]; [Fell, et al., J Immunol 146:2446 (1991)]을 참조하고, 이들은 전체적으로 거명에 의해 포함된다.
또한, 본 발명의 항체 또는 이의 단편이 마커 서열, 예컨대 정제를 용이하게 하기 위한 펩티드에 융합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예컨대 pQE 벡터 (QIAGEN, Inc. (9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif, 91311))에서 제공되는 태그이고, 다수가 시판된다. [Gentz, et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:821 (1989)]에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 기타 펩티드 태그에는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 "HA" 태그 ([Wilson, et al., Cell 31:161 (1984)]) 및 "flag" 태그가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
5.8 항체 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체가 세포 내에서 생산되거나, 원형질막 주위공간 내에서 생산되거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되는 경우, 첫번째 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 입상물질 잔해물을, 예를 들어, 원심분리 또는 초여과에 의해 제거할 수 있다. [Carter, et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 대장균의 원형질막 주위공간으로 분비된 항체를 단리하는 절차가 기술되어 있다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 잔해물을 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 일반적으로 이같은 발현 시스템으로부터의 상등액을 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 초여과 유닛을 사용하여 먼저 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제 예컨대 PMSF가 임의의 상기 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물을 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 예를 들어 사용하여 정제할 수 있고, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제할 수 있다 ([Lindmark, et al., J Immunol Meth 62:1 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 IgG3에 대해 권장된다 ([Guss, et al., EMBO J 5:1567 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 거의 대부분 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정적인 매트릭스 예컨대 제어형 다공성 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 유속이 더 빠르게 하고 처리 시간이 더 짧게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지 (J. T. Baker (Phillipsburg, NJ))가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라 기타 단백질 정제 기술 예컨대 이온-교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대 폴리아스파르트산 컬럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 이용가능하다. 임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 당해 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물을 pH 약 2.5-4.5의 용출 완충액을 사용하는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시킬 수 있고, 이는 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행된다.
5.9 제약 제형
폴리펩티드 또는 항체의 치료적 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 폴리펩티드를 당업계에서 전형적으로 사용되는 임의적인 "제약상 허용가능한" 담체, 부형제 또는 안정화제 (모두 "부형제"로 칭해짐), 즉 완충제, 안정화제, 방부제, 등장화제, 비-이온성 세제, 항산화제 및 기타 각종 첨가제와 혼합함으로써 동결건조 제형 또는 수용액으로 보관용으로 제조될 수 있다. [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, Ed. (1980)] 참조. 이같은 첨가제들은 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이어야 한다.
완충제는 생리적 조건에 가까운 범위로 pH를 유지하는 것을 돕는다. 바람직하게는 이는 약 2 mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 존재한다. 본 발명에서 사용하기 위한 적절한 완충제에는 유기 및 무기 산 및 이의 염 예컨대 시트레이트 완충액 (예를 들어, 시트르산1나트륨-시트르산2나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산3나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산1나트륨 혼합물 등), 숙시네이트 완충액 (예를 들어, 숙신산-숙신산1나트륨 혼합물, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-숙신산2나트륨 혼합물 등), 타르트레이트 완충액 (예를 들어, 타르타르산-타르타르산나트륨 혼합물, 타르타르산-타르타르산칼륨 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마레이트 완충액 (예를 들어, 푸마르산-푸마르산1나트륨 혼합물 등), 푸마레이트 완충액 (예를 들어, 푸마르산-푸마르산1나트륨 혼합물, 푸마르산-푸마르산2나트륨 혼합물, 푸마르산1나트륨-푸마르산2나트륨 혼합물 등), 글루코네이트 완충액 (예를 들어, 글루콘산-글루콘산나트륨 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-글루콘산칼륨 혼합물 등), 옥살레이트 완충액 (예를 들어, 옥살산-옥살산나트륨 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산칼륨 혼합물 등), 락테이트 완충액 (예를 들어, 락트산-락트산나트륨 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-락트산칼륨 혼합물 등) 및 아세테이트 완충액 (예를 들어, 아세트산-아세트산나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등)이 포함된다. 추가적으로, 포스페이트 완충액, 히스티딘 완충액 및 트리메틸아민 염 예컨대 트리스(Tris)가 언급될 수 있다.
방부제가 미생물 성장을 지연시키기 위해 첨가될 수 있고, 0.2％-1％ (w/v) 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 적절한 방부제에는 페놀, 벤질 알콜, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤즈알코늄 할라이드 (예를 들어, 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 및 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥사놀, 및 3-펜타놀이 포함된다. 때때로 "안정화제"로 공지된 등장화제가 본 발명의 액체 조성물의 등장성을 확실히 하기 위해 첨가될 수 있고, 이는 다가 당 알콜, 바람직하게는 3가 또는 더 고급의 당 알콜, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.
안정화제는 기능면에서 벌크화제부터 치료제를 가용화시키거나 변성 또는 용기 벽에의 부착을 방지하는 것을 돕는 첨가제까지의 범위에 이를 수 있는 광범위한 카테고리의 부형제를 지칭한다. 전형적인 안정화제는 다가 당 알콜 (상기 열거됨); 아미노산 예컨대 아르기닌, 라이신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등, 유기 당 또는 당 알콜, 예컨대 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락시톨, 글리세롤 등 (사이클리톨 예컨대 이노시톨 포함); 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 당 함유 환원제, 예컨대 우레아, 글루타티온, 티옥트산, 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, 알파-모노티오글리세롤 및 소듐 티오술페이트; 저분자량 폴리펩티드 (즉 10개 미만의 잔기); 단백질 예컨대 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 단당류, 예컨대 자일로스, 만노스, 프룩토스, 글루코스; 이당류 예컨대 락토스, 말토스, 수크로스 및 삼당류 예컨대 라피노스; 및 다당류 예컨대 덱스트란이다. 안정화제는 활성 단백질 1 중량부 당 0.1 내지 10,000 중량부의 범위로 존재할 수 있다.
비-이온성 계면활성제 또는 세제 ("습윤화제"로 또한 공지됨)가 치료제를 가용화시키는 것을 도울 뿐만 아니라 진탕에 의해 유도된 응집에 대해 치료 단백질을 보호하기 위해 첨가될 수 있고, 또한 이는 제형이 단백질의 변성을 야기하지 않으면서 응력을 받은 전단 표면에 노출되도록 한다. 적절한 비-이온성 계면활성제에는 폴리소르베이트 (20, 80 등), 폴리옥사머 (184, 188 등), 플루로닉(Pluronic) 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르 (TWEEN®-20, TWEEN®-80 등)가 포함된다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 ㎎/㎖ 내지 약 1.0 ㎎/㎖, 바람직하게는 약 0.07 ㎎/㎖ 내지 약 0.2 ㎎/㎖ 범위로 존재할 수 있다.
추가적인 각종 부형제에는 벌크화제 (예를 들어, 전분), 킬레이팅제 (예를 들어, EDTA), 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 및 공용매가 포함된다. 본원에서의 제형은 치료될 특정 적응증에 필요하다면 한가지를 초과하는 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 보완적인 활성이 있는 것들을 또한 함유할 수 있다. 예를 들어, 면역억제제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이같은 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적절하게 존재한다. 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐) 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀젼 내에 활성 성분이 또한 포획될 수 있다. 이같은 기술이 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osal, Ed. (1980)]에 기술되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제형은 반드시 무균성이어야 한다. 이는 예를 들어 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로젤 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일을 초과하여 분자를 방출할 수 있는 한편, 특정 히드로젤은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 신체 내에서 장기간 동안 유지되는 경우, 37℃에서 수분에 노출된 결과로 항체가 변성 또는 응집되어, 생물학적 활성의 손실 및 면역원성에서의 가능한 변화가 초래될 수 있다.
수반된 메커니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되면, 술프히드릴 잔기를 변화시킴, 산성 용액으로부터 동결건조시킴, 수분 함량을 제어함, 적합한 첨가제를 사용함, 및 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발함에 의해 안정화가 달성될 수 있다.
특정 장애 또는 상태의 치료에서 효과적인 치료적 폴리펩티드, 항체, 또는 이의 단편의 양은 장애 또는 상태의 성질에 좌우될 것이고, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 가능한 경우, 인간에서 테스트하기 전에, 본 발명의 제약 조성물의 용량 응답 곡선을 먼저 시험관내에서, 그후 유용한 동물 모델 시스템에서 결정하는 것이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 치료적 폴리펩티드, 항체 또는 이의 단편의 수용액은 피하 주사에 의해 투여된다. 각각의 용량은 체중 1 ㎏ 당 약 0.5 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 더욱 바람직하게는 체중 1 ㎏ 당 약 3 ㎍ 내지 약 30 ㎍ 범위일 수 있다.
피하 투여를 위한 투약 일정은 질환의 유형, 질환의 중증도 및 치료제에 대한 대상체의 감수성이 포함되는 다수의 임상 요인에 따라 1개월에 1번 투여에서 매일 투여까지로 변할 수 있다.
5.10 항-OX40 항체에 대한 진단 용도
본 발명의 항체는 변형된 유도체, 즉 공유결합 부착이 OX40에 대한 결합을 방해하지 않도록 임의 유형의 분자가 항체에 공유결합으로 부착되어 변형된 유도체를 포함한다. 예를 들어, 그러나 비제한적으로, 항체 유도체는 비오틴화, HRP 또는 임의의 기타 검출가능한 모이어티(moiety)에 의해 예를 들어 변형된 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 시험관내 및 생체내 진단 방법을 포함하여 OX40을 정제 또는 검출하는데 예를 들어 사용될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 생물학적 샘플 내의 OX40의 수준을 정성적으로 및 정량적으로 측정하기 위한 면역분석법에서 항체가 사용된다. 예를 들어, 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된 [Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988)] 참조.
하기에 더욱 상세하게 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체는 단독으로 또는 또다른 조성물과 조합되어 사용될 수 있다. 추가로 항체가 N- 또는 C-말단에서 이종성 폴리펩티드에 재조합에 의해 융합될 수 있거나, 또는 폴리펩티드 또는 또다른 조성물에 화학적으로 접합 (공융결합에 의한 접합 및 비-공유결합에 의한 접합 포함)될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체가 검출 분석법에서 표지로 유용한 분자에 재조합에 의해 융합되거나 접합될 수 있다.
본 발명은 진단제에 접합된 항체 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 항체는 진단적으로, 예를 들어, 특정 세포, 조직 또는 혈청에서의 당해 표적의 발현을 검출하기 위해; 또는 제공된 치료 요법의 효능을 예를 들어 결정하기 위한 임상 테스트 절차의 일부로서 면역학적 응답의 발달 또는 진행을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 항체를 검출가능한 물질에 커플링시킴으로써 검출이 용이해질 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보결기(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 방사성 물질, 다양한 양전자 방출 단층촬영술을 사용하는 양전자 방출 금속, 및 비-방사성 상자성 금속 이온이 포함된다. 검출가능한 물질은 직접적으로, 또는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 중간체 (예를 들어, 당업계에 공지된 링커)를 통해 간접적으로 항체 (또는 이의 단편)에 커플링 또는 접합될 수 있다. 효소 표지의 예로는 루시퍼라제 (예를 들어, 개똥벌레 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제; 미국 특허 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 탈수소효소, 요소분해효소, 과산화효소 예컨대 양고추냉이 과산화효소 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 산화효소 (예를 들어, 글루코스 산화효소, 갈락토스 산화효소, 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소), 헤테로시클릭 산화효소 (예를 들어 요산분해효소 및 잔틴 산화효소), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 포함된다.
효소를 항체에 접합시키는 기술이 [O'Sullivan, et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", Methods in Enzymology, Langone, et al., eds. pp.147-66, Academic Press (1981)]에 기술되어 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 진단제로 사용하기 위한 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해 미국 특허 번호 4,741,900을 참조한다. 적절한 효소의 예로는 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되고, 적절한 보결기 복합체의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되며, 적절한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 파이코에리트린이 포함되고, 발광 물질의 예로는 루미놀이 포함되고, 생체발광 물질의 예로는 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린(aequorin)이 포함되며, 적절한 방사성 물질의 예로는 125I, 131I, 111In 또는 99Tc가 포함된다.
때때로, 표지가 항체와 간접적으로 접합된다. 당업자는 이를 달성하기 위한 다양한 기술을 알 것이다. 예를 들어, 항체가 비오틴과 접합될 수 있고, 상기 언급된 표지의 광범위한 3가지 카테고리 중 임의의 것이 아비딘과 접합될 수 있거나, 또는 반대로 접합될 수 있다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하고, 따라서 표지가 이러한 간접적인 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 별법으로, 표지와 항체의 간접적인 접합을 달성하기 위해서, 항체가 소형 합텐 (예를 들어 디곡신)과 접합되고, 상기 언급된 여러 유형의 표지들 중 하나가 항-합텐 항체 (예를 들어 항-디곡신 항체)와 접합된다. 따라서, 표지와 항체의 간접적인 접합을 달성할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 항체가 표지될 필요가 없고, 이의 존재를 이러한 항체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 항체는 임의의 공지된 분석 방법, 예컨대 경쟁적 결합 분석법, 직접적 및 간접적 샌드위치 분석법, 및 면역침전 분석법에서 사용될 수 있다. [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press (1987)] 참조.
경쟁적 결합 분석법은 제한된 양의 항체와의 결합에 대해 테스트 샘플 분석물과 경쟁하는 표지된 기준물의 능력에 의존한다. 테스트 샘플 내의 표적의 양은 항체에 결합되는 기준물의 양에 반비례한다. 결합되는 기준물의 양을 결정하는 것을 용이하게 하기 위해, 일반적으로 항체는 경쟁 전 또는 후에 불용성이다. 그 결과, 항체에 결합된 기준물 및 분석물이 결합되지 않은 기준물 및 분석물로부터 편리하게 분리될 수 있다.
샌드위치 분석법은 검출될 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 2개의 항체를 사용하는 것을 수반한다. 샌드위치 분석법에서, 분석될 테스트 샘플이 고체 지지체 상에 고정된 제1 항체에 결합된 후, 제2 항체가 테스트 샘플에 결합하여, 불용성의 3-부분 복합체가 형성된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,376,110 참조. 제2 항체 자체가 검출가능한 모이어티로 표지될 수 있거나 (직접적 샌드위치 분석법), 또는 검출가능한 모이어티로 표지된 항-면역글로불린 항체를 사용하여 이를 측정할 수 있다 (간접적 샌드위치 분석법). 예를 들어, 샌드위치 분석법의 한가지 유형은 ELISA 분석법이고, 이러한 경우 검출가능한 모이어티는 효소이다.
면역분석법 또는 표적 항원의 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 항체가 부착될 수 있다. 이같은 고체 지지체에는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이 포함된다. 이러한 프로세스에서, 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 항체를 SEPHADEX™ 수지 또는 여과지와 같은 고체 지지체 상에 고정시킨다. 고정된 항체를 정제될 표적을 함유하는 샘플과 접촉시킨 후, 고정된 항체에 결합된 정제될 표적 이외의 샘플 내의 모든 물질을 실질적으로 제거할 적절한 용매로 지지체를 세정한다. 마지막으로, 지지체를 항체로부터 표적을 방출시킬 또다른 적절한 용매, 예컨대 글리신 완충액으로 세정한다.
OX40에 특이적으로 결합하는 표지된 항체, 및 이의 유도체 및 유사체를 OX40의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 질환, 장애 및/또는 상태를 검출, 진단 또는 모니터링하기 위해 진단 목적으로 사용할 수 있다. 본 발명은 (a) OX40에 대해 특이적인 하나 이상의 본 발명의 항체를 사용하여 개체의 세포 또는 체액에서의 OX40의 발현을 분석하는 단계 및 (b) 유전자 발현 수준을 표준 유전자 발현 수준과 비교함으로써, 표준 발현 수준에 비해 분석된 OX40 발현 수준에서의 증가 또는 감소는 비정상적인 발현을 가리키는 단계를 포함하는, OX40의 비정상적인 발현의 검출을 제공한다.
샘플, 예를 들어, 체액 또는 조직 샘플 내의 OX40의 존재 및/또는 수준을 검출하기 위해 항체가 사용될 수 있다. 검출 방법은 샘플을 OX40 항체와 접촉시키는 단계 및 샘플에 결합된 항체의 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 면역조직화학을 위해, 혈액 또는 조직 샘플은 신선하거나 동결된 것일 수 있거나, 또는 파라핀에 매립되어 방부제 예컨대 포르말린으로 고정될 수 있다.
본 발명은 (a) 하나 이상의 본 발명의 항체를 사용하여 개체의 세포 또는 체액에서의 OX40의 발현을 분석하는 단계 및 (b) 유전자 발현 수준을 표준 유전자 발현 수준과 비교함으로써, 표준 발현 수준에 비해 분석된 유전자 발현 수준에서의 증가 또는 감소는 특정 장애를 가리키는 단계를 포함하는, 장애를 진단하기 위한 진단 분석법을 제공한다.
본 발명의 항체는 당업자에 공지된 전통적인 면역조직학적 방법을 사용하여 생물학적 샘플 내의 단백질 수준을 분석하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, [Jalkanen, et al., J Cell Biol 101:976 (1985)]; [Jalkanen, et al., J Cell Biol 105:3087 (1987)] 참조). 단백질 유전자 발현을 검출하는데 유용한, 또다른 항체-기반 방법에는 면역분석법, 예컨대 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA) 및 방사성 면역분석법 (RIA)이 포함된다. 적절한 항체 분석법 표지는 당업계에 공지되어 있고, 효소 표지, 예컨대 글루코스 산화효소; 방사성 동위원소, 예컨대 요오드 (131I, 125I, 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중 수소 (3H), 인듐 (112In, 111In), 및 테크네튬 (99Tc); 발광 표지, 예컨대 루미놀; 및 형광 표지, 예컨대 플루오레세인, 로다민, 및 비오틴을 포함한다. 방사성 동위원소가 결합된 동위원소는 면역섬광조영술을 사용하여 국소화될 수 있다.
본 발명의 한 양상은 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간에서의 OX40의 비정상적인 발현과 관련된 질환 또는 장애의 검출 및 진단이다. 한 실시양태에서, 진단은 a) OX40에 특이적으로 결합하는 표지된 분자를 유효량으로 대상체에게 투여 (예를 들어, 경구 투여, 피하 투여, 또는 복강내 투여)하는 단계 ; b) 표지된 분자가 폴리펩티드가 발현되는 대상체 내의 부위에 우선적으로 농축되도록 (그리고, 결합되지 않은 표지된 분자는 배경 수준으로 소거되도록) 하는 투여 후의 시간 간격 동안 기다리는 단계; c) 배경 수준을 결정하는 단계; 및 d) 배경 수준을 초과하는 표지된 분자의 검출은 대상체에게 OX40의 비정상적인 발현과 관련된 특정 질환 또는 장애가 있다는 것을 가리키도록, 대상체 내의 표지된 분자를 검출하는 단계를 포함한다. 배경 수준은 검출된 표지된 분자의 양을 특정 시스템에 대해 이전에 결정된 기준값에 비교하는 것을 포함하는 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다.
대상체의 크기 및 사용된 영상화 시스템이 진단 영상을 생성시키는데 필요한 영상화 모이어티의 품질을 결정할 것으로 당업계에서 이해될 것이다. 방사성동위원소 모이어티의 경우, 인간 대상체에 대해, 주입된 방사능의 양은 일반적으로 약 5 내지 20 밀리퀴리의 99Tc일 것이다. 그후, 표지된 항체 또는 항체 단편이 특정 단백질을 함유하는 세포의 위치에 우선적으로 축적될 것이다. [Burchiel, et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments", Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, Burchiel, et al., eds., Masson Publishing (1982)]에 생체내 영상화가 기술되어 있다.
사용된 표지의 유형 및 투여 방식을 포함하는 여러 변수에 따라, 표지된 분자가 대상체 내의 부위에 우선적으로 농축되도록 하고 결합되지 않은 표지된 분자는 배경 수준으로 소거되도록 하기 위한 투여 후의 시간 간격은 6 내지 48시간, 6 내지 24시간, 또는 6 내지 12시간이다. 또다른 실시양태에서, 투여 후의 시간 간격은 5 내지 20일 또는 5 내지 10일이다.
한 실시양태에서, 예를 들어, 최초의 진단 1개월 후, 최초의 진단 6개월 후, 최초의 진단 1년 후에, 질환 또는 장애의 진단 방법을 반복함으로써 질환 또는 장애의 모니터링이 수행된다.
생체내 스캐닝을 위해 당업계에 공지된 방법을 사용하여 표지된 분자의 존재를 환자 내에서 검출할 수 있다. 이러한 방법은 사용된 표지의 유형에 좌우된다. 당업자는 특정 표지를 검출하기 위한 적합한 방법을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 진단 방법에서 사용될 수 있는 방법 및 장치에는 컴퓨터 단층촬영술 (CT), 전신 스캔 예컨대 양전자 방출 단층촬영술 (PET), 자기 공명 영상화 (MRI), 및 초음파촬영술이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 분자가 방사성동위원소로 표지되고, 방사선 응답성 외과 기구 (미국 특허 번호 5,441,050)를 사용하여 이를 환자에서 검출한다. 또다른 실시양태에서, 분자가 형광 화합물로 표지되고, 형광 응답성 스캐닝 기구를 사용하여 이를 환자에서 검출한다. 또다른 실시양태에서, 분자가 양전자 방출 금속으로 표지되고, 양전자 방출 단층촬영술을 사용하여 이를 환자에서 검출한다. 또다른 실시양태에서, 분자가 상자성 표지로 표지되고, 자기 공명 영상화 (MRI)를 사용하여 이를 환자에서 검출한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 사이토카인의 조절되지 않은 발현에 의해 야기되는 질환이 발달될 환자의 소질을 진단하는 방법을 제공한다. 특정 환자 세포, 조직 또는 체액에서의 OX40의 증가된 양은 환자가 특정 질환에 걸리기 쉽다는 것을 가리킬 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 OX40의 수준이 낮거나 정상인 것으로 공지된 대상체로부터 세포, 조직 또는 체액 샘플을 수집하는 단계, 조직 또는 체액을 조직 내의 OX40의 존재에 대해 분석하는 단계, 및 조직 또는 체액 내의 OX40의 발현 수준을 기초로 특정 질환에 대한 환자의 소질을 예측하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 상기 방법은 환자로부터 규정된 수준의 OX40을 함유하는 것으로 공지된 세포, 조직 또는 체액 샘플을 수집하는 단계, 조직 또는 체액을 OX40의 양에 대해 분석하는 단계, 및 정상 세포, 조직 또는 체액에 대해 확립된 규정된 또는 테스트된 수준과 비교하여 OX40의 양에서의 변화를 기초로 특정 질환에 대한 환자의 소질을 예측하는 단계를 포함한다. OX40의 규정된 수준은 문헌의 값을 기초로 하는 공지된 양일 수 있거나, 또는 정상 세포, 조직 또는 체액 내의 양을 측정함으로써 미리 결정될 수 있다. 특히, 특정 조직 또는 체액 내의 OX40 수준의 결정은 환자에서 질환을 특이적으로, 그리고 조기에, 바람직하게는 질환이 발생하기 전에 검출하는 것을 허용한다. 본 발명의 방법을 사용하여 진단될 수 있는 질환에는 본원에 기술된 질환들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 조직 또는 체액은 말초혈, 말초혈 백혈구, 생검 조직 예컨대 폐 또는 피부 생검, 및 조직이다.
본 발명의 항체는 진단 분석법을 수행하기 위한 지침서와 함께 키트, 즉 미리 정해진 양의 시약들의 포장된 조합물로 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 경우, 키트는 효소가 필요로 하는 기질 및 보조인자 (예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 수 있다. 또한, 기타 첨가제 예컨대 안정화제, 완충액 (예를 들어, 차단 완충액 또는 용해 완충액) 등이 포함될 수 있다. 각종 시약들의 상대적인 양은 분석법의 감도를 실질적으로 최적화하는 시약들의 용액 내 농도를 제공하기 위해 광범위하게 변할 수 있다. 특히, 시약은 용해 시 적합한 농도의 시약 용액을 제공할 부형제를 포함하는 건조 분말 (일반적으로 동결건조됨)로서 제공될 수 있다.
5.11 항-OX40 항체의 치료 용도
본 발명의 항체가 포유동물을 치료하는데 사용될 수 있다는 것이 구현된다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 임상전 데이터를 수득하기 위한 목적으로 항체가 비-인간 포유동물에게 투여된다. 예시적인 치료될 비-인간 포유동물에는 비-인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 및 임상전 연구가 수행되는 기타 포유동물이 포함된다. 이같은 포유동물은 항체로 치료될 질환에 대한 확립된 동물 모델일 수 있거나, 또는 당해 항체의 독성을 연구하기 위해 사용될 수 있다. 각각의 이러한 실시양태에서, 용량 에스컬레이션(escalation) 연구가 포유동물에 대해 수행될 수 있다.
단독으로 또는 세포독성제(들)과 조합되어 투여되는, 치료적 모이어티가 접합되었거나 접합되지 않은 항체가 치료제로서 사용될 수 있다. 본 발명은 OX40-매개 질환, 장애 또는 상태를 치료하기 위해 본 발명의 항체를 동물, 포유동물 또는 인간에게 투여하는 것을 수반하는 항체-기반 치료법에 관한 것이다. 동물 또는 대상체는 특정 치료를 필요로 하는 동물, 예컨대 특정 장애, 예를 들어 OX40과 관련된 장애가 있는 것으로 진단된 동물일 수 있다. OX40에 대해 지시된 항체는 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개, 비-인간 영장류 등, 뿐만 아니라 인간이 포함되지만 이에 한정되지 않는 동물에서 알러지, 천식, 자가면역 및 염증성 질환에 대해 유용하다. 예를 들어, 치료적으로 허용가능한 용량의 본 발명의 항체 또는 항체들, 또는 본 발명의 항체들의 칵테일을 투여하거나, 또는 다양한 공급원의 또다른 항체들과 조합하여 투여함으로써, 치료된 동물에서 자가면역 또는 염증성 질환 증상이 감소 또는 제거될 수 있다.
본 발명의 치료적 화합물에는 본 발명의 항체 (본원에 기술된 바와 같은 이의 단편, 유사체 및 유도체 포함) 및 하기에 기술된 바와 같은 본 발명의 항체 (본원에 기술된 바와 같은 이의 단편, 유사체 및 유도체 및 항-이디오타입 항체 포함)를 코딩하는 핵산이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체는 본원에 기술된 질환, 장애 또는 상태들 중 임의의 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는, OX40의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 질환, 장애 또는 상태를 치료, 억제 또는 예방하는데 사용될 수 있다. OX40의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 질환, 장애 또는 상태의 치료 및/또는 예방은 이러한 질환, 장애 또는 상태와 관련된 하나 이상의 증상을 경감시키는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 바와 같은 또는 본원에 기술된 바와 같은 제약상 허용가능한 조성물에서 제공될 수 있다.
본 발명의 항-OX40 항체는 다양한 질환에서 치료적으로 사용될 수 있다. 본 발명은 포유동물에서 OX40-매개 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 질환을 예방하거나 치료하는 양의 항-OX40 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 항-OX40 항체가 OX40에 결합하고 사이토카인 및 세포성 수용체 발현을 조절하여, 비-질환 상태의 특징적인 사이토카인 수준이 초래된다. OX40 신호전달은 알러지, 천식, 및 자가면역 및 염증과 관련된 질환 (다발성 경화증, 류머티스 관절염, 염증성 장 질환, 이식편-대-숙주 질환, 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE), 실험적 리슈만편모충증, 콜라겐-유도 관절염, 대장염 (예컨대 궤양성 대장염), 접촉성 과민 반응, 당뇨병, 크론병, 및 그레이브병이 포함됨)과 같은 다양한 질환에 연결되었다.
본 발명의 항체는 사르코이드증, 자가면역 눈 질환, 자가면역 포도막염, 아토피 피부염, 중증 근육무력증, 자가면역 신경병증 (예컨대 길랑-바레), 자가면역 포도막염, 자가면역 용혈 빈혈, 악성 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 측두 동맥염, 항-인지질 증후군, 혈관염 (예컨대 베게너 육아종증), 베체트병, 건선, 포진 피부염, 보통 천포창, 백반증, 원발성 담관성 간경화, 자가면역 간염, 하시모토 갑상선염, 자가면역 난소염 및 고환염, 부신의 자가면역 질환, 전신성 홍반 루푸스, 공피증, 피부근육염, 다발근육염, 피부근육염, 척추관절병증 (예컨대 강직성 척추염), 라이터 증후군, 쇼그렌 증후군 등이 포함되는 또다른 질환들을 예방 및 치료하는데 또한 유용할 수 있다.
숙주 대상체에서 사용하기 위한 치료제는 바람직하게는 상기 대상체에서 치료제에 대한 면역원성 응답을 거의 유발하지 않거나 유발하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명은 이같은 치료제를 제공한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 숙주 대상체에서 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 비교하여 실질적으로 감소된 수준으로 인간 항-마우스 항체 응답 (HAMA)을 유발하고/하거나 유발할 것으로 예상되는 인간화 항체를 제공한다. 또다른 예에서, 본 발명은 최소의 인간 항-마우스 항체 응답 (HAMA)을 유발하거나 응답을 유발하지 않고/않거나 최소의 응답을 유발하거나 응답을 유발하지 않을 것으로 예상되는 인간화 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명의 항체는 임상적으로 허용가능한 수준 이하인 항-마우스 항체 응답을 유발한다.
OX40의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 또는 장애의 치료, 억제 및 예방에서 효과적일 항체의 양은 표준 임상 기술을 의해 결정될 수 있다. 투여량은 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 기존의 치료법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 응답, 및 주치의의 재량에 좌우될 것이다. 항체는 질환에 부합하는 치료 요법으로, 예를 들어, 질환 상태를 경감시키기 위해 1일 내지 수일에 걸친 단일 또는 수회의 용량으로 또는 알러지 또는 천식을 방지하기 위해 연장된 기간에 걸쳐 주기적인 용량으로 투여될 수 있다. 또한, 최적 투여량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 시험관내 분석법이 임의적으로 사용될 수 있다. 제형에서 사용될 정확한 용량은 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 심각한 정도에 또한 좌우될 것이고, 개업의의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 시험관내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 용량 응답 곡선으로부터 유효 용량이 외삽될 수 있다.
항체에 대해서, 환자에게 투여되는 투여량은 전형적으로 환자의 체중 1 ㎏ 당 0.1 ㎎/kg 내지 150 ㎎/kg이다. 바람직하게는, 환자에게 투여되는 투여량은 환자의 체중 1 ㎏ 당 0.1 ㎎/kg 내지 20 ㎎/kg 사이, 더욱 바람직하게는 1 ㎎/kg 내지 10 ㎎/kg이다. 일반적으로, 인간 항체는 외래 폴리펩티드에 대한 면역 응답으로 인해 다른 종으로부터의 항체보다 인체 내에서의 반감기가 더 길다. 따라서, 더 낮은 투여량의 인간 항체 및 덜 빈번한 투여가 종종 가능하다. 또한, 예를 들어 지질화와 같은 변형에 의해 항체의 흡수 및 조직 투과 (예를 들어, 뇌 내로의 투과)를 강화시킴으로써 본 발명의 항체의 투여량 및 투여 빈도가 감소될 수 있다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 상태에 따라, 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 치료가 지속된다. 그러나, 또다른 투약 요법이 유용할 수 있다. 통상적인 기술 및 분석법에 의해 이러한 치료법의 진행이 쉽게 모니터링된다. 항-LFA-1 또는 항-ICAM-1 항체에 대한 예시적인 투약 요법이 WO 94/04188에 개시되어 있다.
조성물의 형태일 수 있는 본 발명의 항체는 우수한 의료 업무에 부합하는 방식으로 제형, 조제 및 투여되어야 한다. 이러한 정황에서 고려되는 인자에는 치료될 특정 장애, 치료될 특정 포유동물, 개별적인 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투약 일정, 및 의료인에게 공지된 기타 인자들이 포함된다. 투여될 항체 조성물의 "치료적 유효량"은 이같은 고려사항에 의해 좌우될 것이고, 질환 또는 장애를 예방하거나 경감시키거나 치료하기 위해 필요한 최소량이다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의적으로는 문제의 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형된다. 이같은 또다른 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 기타 상기 논의된 인자들에 좌우된다. 일반적으로 이들은 본원에서 상기 기술된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 지금까지 사용된 투여량의 약 1 내지 99 ％로 사용된다.
본 발명의 항체는 또다른 모노클로날 또는 키메라 항체와, 또는 림포카인 또는 조혈 성장 인자 (예를 들어, IL-2, IL-3, IL-7, 및 IFN-γ)와 조합되어 유리하게 사용될 수 있고, 예를 들어, 이들은 항체와 상호작용하는 이펙터 세포의 수 또는 활성을 증가시키는 작용을 한다.
본 발명의 항체는 단독으로 또는 또다른 유형의 치료, 예컨대 항-염증성 치료법, 면역억제성 약물, 면역요법, 화학요법, 기관지확장제, 항-IgE 분자, 항-히스타민 또는 항-류코트리엔과 조합되어 투여될 수 있다.
바람직한 양상에서, 항체가 실질적으로 정제된다 (예를 들어, 항체의 효과를 제한하거나 원치 않는 부작용을 일으키는 물질이 실질적으로 없다). 주사, 예를 들어, 리포솜, 미세입자, 마이크로캡슐 내의 캡슐화, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 세포내이입 (예를 들어, [Wu, et al., J Biol Chem 262:4429 (1987)] 참조), 레트로바이러스 벡터 또는 기타 벡터의 일부로서의 핵산의 구축이 포함되는 다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 본 발명의 항체를 투여하는데 사용될 수 있다.
임의의 허용가능한 방식으로 항-OX40 항체가 포유동물에게 투여될 수 있다. 도입 방법에는 경구, 피하, 복강내, 폐내, 비강내, 경막외, 흡입 및 경구 경로, 및 면역억제 치료를 위해 원하는 경우의 병변내 투여가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 비경구 주입에는 근육내, 피내, 정맥내, 동맥내, 또는 복강내 투여가 포함된다. 항체 또는 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 볼루스(bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내층 (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 또다른 생물학적으로 활성인 작용제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 또한, 본 발명의 치료적 항체 또는 조성물을 뇌실내 및 경막내 주사가 포함되는 임의의 적절한 경로에 의해 중추 신경계 내로 도입하는 것이 바람직할 수 있다; 뇌실내 카테터 (저장소, 예컨대 오마야(Ommaya) 저장소에 예를 들어 부착됨)에 의해 뇌실내 주사가 용이해질 수 있다. 또한, 펄스(pulse) 주입, 특히 항체의 용량이 감소되는 펄스 주입에 의해 항체가 적절하게 투입된다. 바람직하게는, 주사에 의해 투약이 제공되고, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공되며, 이는 투여가 단기간인지 장기간인지 여부에 부분적으로 좌우된다.
예를 들어, 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제가 있는 제형을 사용함으로써 폐 투여가 또한 사용될 수 있다. 건식 분말 조성물의 형태로 환자의 폐 내로 항체가 또한 투여될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,514,496 참조).
특정 실시양태에서, 본 발명의 치료적 항체 또는 조성물을 치료를 필요로 하는 영역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다; 이는, 예를 들어, 비제한적으로, 국소 주입, 국부 도포, 주사, 카테터, 좌약, 또는 이식물에 의해 달성될 수 있고, 이때 상기 이식물은 섬유, 또는 막, 예컨대 시알라스틱(sialastic) 막이 포함되는 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 물질이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 투여할 때, 단백질이 흡수되지 않는 물질을 사용하도록 주의하여야 한다.
또다른 실시양태에서, 항체가 소포, 특히 리포솜에서 전달될 수 있다 ([Langer, Science 249:1527 (1990)]; [Treat, et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein, et al., eds., pp. 353-365 (1989)]; [Lopez-Berestein, 동일 문헌, pp. 317-27] 참조; 동일 문헌을 일반적으로 참조한다).
또다른 실시양태에서, 항체가 제어 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 한 실시양태에서, 펌프가 사용될 수 있다 ([Langer, Science 249: 1527 (1990)]; [Sefton, CRC Crit Ref Biomed Eng 14:201 (1987)]; [Buchwald, et al., Surgery 88:507 (1980)]; [Saudek, et al., N Engl J Med 321:574 (1989)] 참조). 또다른 실시양태에서, 중합체성 물질이 사용될 수 있다 ([Medical Applications of Controlled Release, Langer, et al., eds., CRC Press (1974)], [Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen, et al., eds., Wiley (1984)], [Ranger, et al., J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23:61 (1983)] 참조; [Levy, et al., Science 228:190 (1985)]; [During, et al., Ann Neurol 25:351 (1989)]; [Howard, et al., J Neurosurg 71:105 (1989)]를 또한 참조). 또다른 실시양태에서, 제어 방출 시스템이 치료 표적 부근에 놓일 수 있다.
본 발명은 제약 조성물을 또한 제공한다. 이같은 조성물은 치료적 유효량의 항체 및 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용어 "생리학적으로 허용가능한"은 동물, 더욱 특히 인간에서의 사용에 대해, 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 허가되었거나, 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거되었음을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제가 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이같은 생리학적 담체는 무균성 액체, 예컨대 물 및 오일 (석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일 및 참기름 등 포함)일 수 있다. 제약 조성물이 정맥내로 투여되는 경우 물이 바람직한 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이, 특히 주사용 용액에 대해, 액체 담체로서 또한 사용될 수 있다. 적절한 제약 부형제에는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 석회분말, 실리카 젤, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건식 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 원하는 경우, 조성물은 미량의 습윤화제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체 예컨대 트리글리세라이드와 함께 좌제로 제형될 수 있다. 경구 제형은 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적절한 담체의 예가 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", E. W. Martin]에 기술되어 있다. 이같은 조성물은 환자에게 알맞게 투여하기 위한 형태를 제공하도록 적절한 양의 담체와 함께 유효량의 항체 (바람직하게는 정제된 형태)를 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 적절하여야 한다.
한 실시양태에서, 인간에게의 정맥내 투여를 위해 개조된 제약 조성물로서 일상적인 절차에 따라 조성물이 제형된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 무균성 등장성 수성 완충액 내의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 가용화제 및 주사 부위에서의 통증을 완화시키기 위한 리그노카인과 같은 국소 마취제를 또한 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분들은 개별적으로 또는 단위 투여 제형 내에 함께 혼합되어, 예를 들어, 활성 작용제의 양이 표시된 앰풀 또는 새쉐이(sachette)와 같은 밀봉 밀폐된 용기 내의 건식 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 제약 등급의 무균성 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 이를 디스펜싱(dispensing)할 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 주사용 무균수 또는 염수의 앰풀이 제공될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 제약 조성물의 성분들 중 하나 이상이 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 또는 키트를 또한 제공한다. 임의적으로, 약품 또는 생물학적 제품의 제작, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 처방된 형태의 주의사항이 이같은 용기(들)에 결합될 수 있고, 이러한 주의사항은 이같은 기관에 의해 인간 투여에 대해 제작, 사용 또는 판매가 승인되었음을 반영한다.
또한, 본 발명의 항체는 다양한 이펙터 분자 예컨대 이종성 폴리펩티드, 약물, 방사성뉴클레오티드, 또는 독소에 접합될 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국 특허 번호 5,314,995; 및 EP 396,387 참조. 항체 또는 이의 단편은 치료적 모이어티 예컨대 세포독소 (예를 들어, 세포정지 또는 세포사멸 작용제), 치료제, 또는 방사성 금속 이온 (예를 들어, 알파-방출제 예컨대 213Bi)에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제에는 세포에 해로운 임의의 작용제가 포함된다. 예로는 파클리탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 푸로마이신, 및 이의 유사체 또는 상동체가 포함된다. 치료제에는 항대사물질 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예를 들어, 다우노루비신 (기존의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (기존의 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
이같은 치료적 모이어티를 항체에 접합시키기 위한 기술은 주지되어 있고, 예를 들어, [Arnon, et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld, et al. (eds.), pp. 243-56 Alan R. Liss (1985)]; [Hellstrom, et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery, 2nd ed., Robinson, et al., eds., pp. 623-53, Marcel Dekker (1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera, et al., eds., pp. 475-506 (1985)]; ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin, et al., eds., pp. 303-16, Academic Press (1985)]; 및 [Thorpe, et al., Immunol Rev 62:119 (1982)]를 참조한다. 별법으로, 항체 이종접합체가 형성되도록 항체가 제2의 항체에 접합될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980 참조.
소정의 생물학적 응답을 변형시키기 위해 본 발명의 접합체가 사용될 수 있고, 치료제 또는 약물 모이어티는 전통적인 화학적 치료제에 한정되는 것으로 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 지니는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이같은 단백질에는, 예를 들어, 아브린, 리신 A, 슈모모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소와 같은 독소; 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노젠 활성화제, 세포자멸사성 작용제, 예를 들어, TNF-α, TNF-β, AIM I (국제 공개 WO 97/33899 참조), AIM II (국제 공개 WO 97/34911 참조), Fas 리간드 ([Takahashi, et al., Int Immunol, 6:1567 (1994)]), VEGI (국제 공개 WO 99/23105 참조)와 같은 단백질; 혈전증 작용제; 항-혈관생성 작용제, 예를 들어, 안지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-I"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF") 또는 기타 성장 인자와 같은 생물학적 응답 변형제가 포함될 수 있다.
5.12 항체-기반 유전자 요법
본 발명의 또다른 양상에서, 유전자 요법에 의해, 항체 또는 이의 기능성 유도체를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 OX40의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 치료, 억제 또는 방지하기 위해 투여된다. 유전자 요법은 발현된 또는 발현가능한 핵산을 대상체에게 투여함으로써 수행되는 요법을 지칭한다. 본 발명의 이러한 실시양태에서, 핵산은 치료 효과를 매개하는 자신이 코딩하는 단백질을 생성시킨다. 이용가능한 유전자 요법에 대한 방법들 중 임의의 것이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예시적인 방법이 하기에 기술된다.
유전자 요법의 방법의 일반적인 리뷰를 위해, [Goldspiel, et al., Clinical Pharmacy 12:488 (1993)]; [Wu, et al., Biotherapy 3:87 (1991)]; [Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 32:573 (1993)]; [Mulligan, Science 260:926 (1993)]; [Morgan, et al., Ann Rev Biochem 62:191 (1993)]; [May, TIBTECH 11:155 (1993)]을 참조한다.
한 양상에서, 화합물은 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열은 적절한 숙주 내에서 항체 또는 이의 단편 또는 키메라 단백질 또는 중쇄 또는 경쇄를 발현하는 발현 벡터의 일부분이다. 특히, 이같은 핵산 서열에는 항체 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 프로모터가 있고, 상기 프로모터는 유도성이거나 또는 구성적이며, 임의적으로는 조직-특이적이다.
또다른 특정 실시양태에서, 게놈 내의 원하는 부위에서의 상동 재조합을 촉진하여 항체 코딩 핵산의 염색체내 발현을 제공하는 영역이 항체 코딩 서열 및 임의의 또다른 원하는 서열에 플랭킹(flanking)된 핵산 분자가 사용된다 ([Koller, et al., Proc Natl AcadSci USA 86:8932 (1989)]; [Zijlstra, et al., Nature 342:435 (1989)]). 특정 실시양태에서, 발현된 항체 분자는 단일쇄 항체이다; 별법으로, 핵산 서열은 항체의 중쇄 및 경쇄 양쪽 모두, 또는 이들의 단편들을 코딩하는 서열들을 포함한다.
환자에게 핵산을 전달하는 것은 직접적 (이러한 경우, 환자가 핵산 또는 핵산을 보유하는 벡터에 직접적으로 노출된다), 또는 간접적 (이러한 경우, 세포가 먼저 시험관내에서 핵산으로 형질전환된 후, 환자에게 이식된다)일 수 있다. 이러한 2가지 접근법은 각각 생체내 또는 생체외 유전자 요법으로 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 핵산 서열이 직접적으로 생체내에 투여되어, 코딩된 생성물을 생산하도록 발현된다. 이는 당업계에 공지된 수많은 방법들 중 임의의 것에 의해, 예를 들어, 핵산 서열을 적합한 핵산 발현 벡터의 일부분으로서 구축하고, 서열이 세포내 서열이 되도록 벡터를 투여함으로써, 예를 들어, 결손성 또는 약독화된 레트로바이러스 또는 기타 바이러스 벡터를 사용한 감염 (미국 특허 번호 4,980,286 참조)에 의해, 또는 네이키드(naked) DNA의 직접적인 주입에 의해, 또는 미세입자 포격 (예를 들어, 유전자 총; Biolistic, Dupont), 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로의 코팅, 리포솜, 미세입자 또는 마이크로캡슐 내의 캡슐화의 사용에 의해, 또는 핵에 진입하는 것으로 공지된 펩티드에 연결시켜 투여함으로써, 수용체-매개 세포내이입에 적용되는 리간드(예를 들어, [Wu, et al., J Biol Chem 262:4429 (1987)] 참조) (수용체를 특이적으로 발현하는 세포 유형을 표적화하는데 사용될 수 있음)에 연결시켜 투여함으로써 달성될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 핵산-리간드 복합체가 형성될 수 있고, 이때 리간드가 엔도솜을 파괴하는 융합원성(fusogenic) 바이러스 펩티드를 포함하여, 핵산이 라이소솜성(lysosomal) 분해를 피하도록 한다. 또다른 실시양태에서, 특이적 수용체를 표적화함으로써, 핵산이 세포 특이적 흡수 및 발현을 위해 생체내에서 표적화될 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 WO 92/06180; WO 92/22635; WO92/20316; WO93/14188, WO 93/20221 참조). 별법으로, 상동 재조합에 의해, 핵산이 세포내로 도입되고 발현을 위해 숙주 세포 DNA 내로 혼입될 수 있다 ([Koller, et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:8932 (1989)]; [Zijlstra, et al., Nature 342:435 (1989)]).
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 바이러스 벡터가 사용된다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있다 ([Miller, et al., Meth Enzymol 217:581 (1993)] 참조). 이러한 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 정확한 패키징(packaging) 및 숙주 세포 DNA 내로의 통합에 필요한 성분들을 함유한다. 유전자 요법에 사용될 항체를 코딩하는 핵산 서열이 하나 이상의 벡터 내로 클로닝되고, 이러한 벡터는 환자 내로의 유전자의 전달을 용이하게 한다. 레트로바이러스 벡터에 관한 더욱 상세한 사항을 [Boesen, et al., Biotherapy 6:291 (1994)]에서 확인할 수 있고, 상기 문헌에는 줄기 세포를 화학요법에 더욱 저항성이도록 하기 위해 mdrl 유전자를 조혈 줄기 세포에 전달하도록 레트로바이러스 벡터를 사용하는 것이 기술되어 있다. 유전자 요법에서 레트로바이러스 벡터를 사용하는 것을 설명하는 기타 참고문헌에는 [Clowes, et al., J Clin Invest 93:644 (1994)]; [Kiem, et al., Blood 83:1467 (1994)]; [Salmons, et al., Human Gene Therapy 4:129 (1993)]; 및 [Grossman, et al., Curr Opin Gen and Dev 3:110 (1993)]이 있다.
아데노바이러스가 본 발명에서 또한 사용될 수 있다. 아데노바이러스는 항체를 호흡 상피에 항체를 전달하기 위해 본 발명에서 특히 매력적인 비히클이다. 아데노바이러스는 본래 호흡 상피를 감염시킨다. 아데노바이러스-기반 전달 시스템의 또다른 표적은 간, 중추신경계, 내피 세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 분열하고 있지 않은 세포를 감염시킬 수 있다는 장점이 있다. [Kozarsky, et al., Curr Opin Gen Dev 3:499 (1993)]는 아데노바이러스-기반 유전자 요법의 리뷰를 제시한다. [Bout, et al., Human Gene Therapy 5:3 (1994)]에서는 유전자를 붉은털 원숭이의 호흡 상피에 전달하기 위해 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것이 실연되었다. 유전자 요법에서 아데노바이러스를 사용하는 것의 또다른 예를 [Rosenfeld, et al., Science 252:431 (1991)]; [Rosenfeld, et al., Cell 68:143 (1992)]; [Mastrangeli, et al., J Clin Invest 91:225 (1993)]; PCT 공개 WO94/12649; [Wang, et al., Gene Therapy 2:775 (1995)]에서 확인할 수 있다. 아데노-관련 바이러스 (AAV)가 유전자 요법에서의 사용에 대해 또한 제안되었다 ([Walsh, et al., Proc Soc Exp Biol Med 204:289 (1993)]; 미국 특허 번호 5,436,146; 6,632,670; 및 6,642,051).
유전자 요법에 대한 또다른 접근법은 전기천공, 리포펙션(lipofection), 인산칼슘 매개 형질감염 또는 바이러스 감염과 같은 방법에 의해 유전자를 조직 배양 중인 세포에 전달하는 것을 수반한다. 일반적으로, 전달 방법은 선별성 마커를 세포에 전달하는 것을 포함한다. 그후, 세포를 선별하여, 전달된 유전자를 받아들였고 이를 발현하고 있는 세포를 단리한다. 그후, 이러한 세포를 환자에게 전달한다.
이러한 실시양태에서, 핵산이 세포 내로 도입된 후, 생성된 재조합 세포가 생체 내로 투여된다. 이같은 도입은 형질감염, 전기천공, 미세주사, 핵산 서열을 함유하는 바이러스 벡터 또는 박테리오파지 벡터로의 감염, 세포 융합, 염색체-매개 유전자 전달, 마이크로셀-매개 유전자 전달, 스페로플라스트(spheroplast) 융합 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 외래 유전자를 세포 내로 도입하기 위해 수많은 기술이 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, [Loeffler, et al., Meth Enzymol 217:599 (1993)]; [Cohen, et al., Meth Enzymol 217:618 (1993)]; [Cline, Pharmac Ther 29:69 (1985)] 참조), 수용자 세포의 필요한 발달 기능 및 생리학적 기능이 파괴되지 않는 한, 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 핵산이 세포에 의해 발현가능하고, 바람직하게는 이의 세포 자손에 의해 유전될 수 있고 발현가능하도록, 이러한 기술은 핵산을 세포에 안정적으로 전달하여야 한다.
생성된 재조합 세포를 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 환자에게 전달 수 있다. 바람직하게는 재조합 혈액 세포 (예를 들어, 조혈 줄기 또는 전구 세포)는 정맥 내로 투여된다. 구현되는 세포의 사용량은 원하는 효과, 환자의 상태 등에 좌우되고, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
유전자 요법의 목적을 위해 핵산이 도입될 수 있는 세포는 임의의 원하는 이용가능한 세포 유형을 포함하고, 여기에는 상피 세포, 내피 세포, 각질세포, 섬유모세포, 근육 세포, 간세포; 혈액 세포 예컨대 T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거대핵세포, 과립구; 각종 줄기 또는 전구 세포, 특히 조혈 줄기 또는 전구 세포, 예를 들어, 골수, 제대혈, 말초혈, 태아의 간 등으로부터 수득된 것들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
한 실시양태에서, 유전자 요법용으로 사용되는 세포는 환자의 자가 세포이다. 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 서열이 세포 또는 이의 자손에 의해 발현가능하도록 세포 내로 도입된 후, 재조합 세포가 치료 효과를 위해 생체내로 투여된다. 특정 실시양태에서, 줄기 또는 전구 세포가 사용된다. 시험관내에서 단리 및 유지될 수 있는 임의의 줄기 및/또는 전구 세포가 본 발명의 이러한 실시양태에 따라 가능하게 사용될 수 있다 (예를 들어 PCT 공개 WO 94/08598; [Stemple, et al., Cell 71:973 (1992)]; [Rheinwald, Meth Cell Bio 21A:229 (1980)]; [Pittelkow, et al., Mayo Clinic Proc 61:771 (1986)] 참조).
6. 실시예
본 발명이 하기의 본 발명의 바람직한 실시양태들의 예들에 의해 추가로 설명될 수 있지만, 이러한 예들은 설명의 목적을 위해서만 포함되고, 달리 명확하게 지시되지 않는 한 본 발명의 범주를 한정하도록 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다.
실시예 1: 인간 OX40/FC 면역원의 제조
2가지 형태의 OX40 수용체가 본 발명의 길항제 항-OX40 항체를 생성시키기 위해 면역원으로 사용되었다. 첫번째 형태는 인간 Fcγ1 및 서열 1의 뉴클레오티드 잔기 105 내지 627에 의해 코딩되는 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질로서 발현되는 가용성 형태의 인간 OX40 수용체였다. 두번째 형태는 안정적으로 형질감염된 마우스 섬유모세포 L-세포의 표면 상에서 발현된 전장 OX40을 포함하는 세포-기반 면역원이었다.
가용성 형태의 OX40을 TCR-활성화 인간 CD4 T-세포로부터 단리된 OX40 cDNA 클론으로부터 클로닝하였다. 2개의 프라이머가 OX40 cDNA 클론을 생성시키는데 사용되었다: (1) HindIII 부위를 함유하는 뉴클레오티드 서열 cccaagctttaccccagcaacgaccggtgctgc (서열 3)의 센스 프라이머, 및 (2) 인간 Fcγ1과 인-프레임으로 XhoI 부위를 함유하는 뉴클레오티드 서열 cgcctcgaggacctccacgggccgggtgg (서열 4)의 안티센스 프라이머. 생성된 540 bp PCR 단편을 5' 말단에 분비 신호 펩티드 서열을, 3' 말단에 인간 Fcγ1 서열 (힌지 및 불변 영역 CH2 및 CH3)을 함유한 시판되는 벡터 내로 서브클로닝하였다. 구축물의 조성을 서열분석에 의해 확인하였다.
일시적인 발현을 위해, OX40/Fcγ1 DNA를 제조업자의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000 (Invitrogen (Carlsbad, CA))에 의해 293T-세포 (Invitrogen (Carlsbad, CA)) 내로 형질감염시켰다. 형질감염 72시간 후, 형질감염된 세포로부터의 배양 상등액을 정제를 위해 수집하였다. OX40/Fcγ1의 안정적인 발현이 293T-세포주에서 또한 확립되었다. 발현을 확인하기 위해, 배양 상등액을 소듐 도 데실 술페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분석하였다. 분리된 단백질들을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 양고추냉이 과산화효소 (HRP)가 접합된 마우스 항-인간 IgG (Fc) 모노클로날 항체 (Sigma (St. Louis, MO)) 또는 폴리클로날 염소 항-OX40 항체 (R&D Systems (Minneapolis, MN)) (HRP-당나귀 항-염소 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA))로 검출됨)로 검출하였다. 강화된 화학발광 검출 (Pierce (Rockford, IL))을 사용하여 필름 상에서 면역반응성 단백질이 확인되었다. OX40/Fcγ1을 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 평형화된 단백질-A 친화성 컬럼 (Invitrogen (Carlsbad, CA))으로 정제하였다. 세포 배양 상등액을 컬럼에 적용한 후, 수지를 컬럼 부피의 약 20배의 PBS로 세정하고 나서 SCC 완충액 (0.05 M 시트르산나트륨, 0.5 M 염화나트륨, pH 6.0)으로 세정하여, 결합되지 않은 단백질을 제거하였다. OX40 융합 단백질을 0.05 M 시트르산나트륨, 0.15 M 염화나트륨 (pH 3.0)을 사용하여 용출시킨 후, PBS (pH 7.0)에서 투석하였다. OX40/Fcγ1을 함유하는 친화성 컬럼으로부터의 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 단백질의 순도를 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색에 의해 분석하고, 단백질의 신원을 상기 기술된 바와 같이 염소 항-인간 IgG (Fc) 항체 (Sigma (St Louis, MO)) 및 염소 항-인간 OX40 항체 (R&D Systems (Minneapolis, MN))를 사용하여 웨스턴 면역블롯팅에 의해 분석하였다.
TCR-활성화 인간 CD4 T-세포로부터 클로닝된 전장 인간 OX40 cDNA를 사용하여 두번째 형태의 면역원을 구축하였다. 사용된 2개의 프라이머는 하기와 같은 뉴클레오티드 서열의 OX40-특이적 프라이머였다: caccatgtgcgtgggggctcggcggctggg (서열 5) 및 gatcttggccagggtggagtgggcgtcggcc (서열 6). 고수준의 OX40의 발현을 위해 생성된 PCR 산물을 시판되는 벡터 내로 직접 클로닝하고 마우스 L 섬유모세포 내로 안정적으로 형질감염시켰다. 투여 전에, 세포-기반 면역원 L-세포에 GammaCell 1000 Elite 모델 A (MDS Nordion (Ottawa Canada))를 사용하여 6800 그레이로 방사선을 조사하여, 면역원의 증식을 억제하였다.
실시예 2: 항-OX40 모노클로날 항체의 생성
약 20 ㎍의 가용성 OX40/ Fcγ1 면역원을 프로인트 애쥬번트와 조합시키고 (1:1), 7일 간격의 3회의 피하 주사에 이은 1회의 복강내 주사 (애쥬번트 없음)로 2마리의 6주령 A/J 마우스 (Harlan (Houston, Tex.))에 투여하였다. 최종 주사 3일 후에, 면역화된 마우스의 지라세포를 하기에 기술된 바와 같이 [Groth and Scheidegger, J Immunol Methods, 1980]의 방법에 따라 뮤린 골수종 SP2/0 세포와 융합시켰다.
세포-기반 면역원에 대해서는, 감마선이 조사된, OX40으로 안정적으로 형질감염된 L-세포 3×106개를 7일 간격의 3회의 PBS 내의 피하 주사에 이은 1회의 복강내 주사에 의해 6주령 A/J 마우스 (Harlan (Houston, Tex.))에 투여하였다. 최종 주사 3일 후에, 면역화된 마우스의 지라세포를 하기에 기술된 바와 같이 뮤린 골수종 SP2/0 세포와 융합시켰다.
항-OX40 mAb의 생성에 이르는 융합에서, 단일 세포 현탁액을 면역화된 마우스의 지라로부터 제조하여, 적절한 융합제, 폴리에틸렌 글리콜 (분자량 1450) (Kodak (Rochester, NY)) 및 5％ 디메틸 술폭시드 (Sigma (St Louis, MO))을 사용하는 불멸화된 Sp2/0 골수종 세포와의 융합에 사용하여 (1:1의 비율), 하이브리도마 세포를 형성시켰다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp.59-103 (1986]). 10일 후, 하이브리도마 세포주를 적절한 DMEM 완전 배양 배지 (Invitrogen (Carlsbad, CA))에서 배양하였고, 바람직하게는 상기 배지는 융합되지 않은 불멸화된 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 물질인 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘 (HAT)을 함유하였다. 2회의 융합 실험으로써, 효율적으로 융합되었고, 안정적이고 높은 수준의 항체 생산을 지지하였으며, HAT 배지에 감수성인 24,000개의 바람직한 불멸화된 세포주가 수득되었다.
실시예 3: 길항제 항-OX-40 항체에 대한 스크리닝
하이브리도마 세포가 성장된 배양 배지를 OX40에 대해 지시된 모노클로날 항체 (mAb)의 생산에 대해 분석하였다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 mAb의 결합 특이성을 3가지 상이한 접근법에 의해 결정하였다: FMAT, ELISA, 및 유동 세포측정 면역분석법.
A. FMAT 스크리닝
FMAT 접근법을 사용하여, 마우스 항-인간 OX40 mAb를 분비하는 220개의 하이브리도마 세포주가 OX40으로 일시적으로 형질감염된 L-세포와는 반응성이 강력하지만 형질감염되지 않은 모조 L-세포와는 그렇지 않은 것에 의해 확인되었다. 매크로콘포컬(macroconfocal) 스캐닝 플랫폼을 사용하는 FMAT을 사용하여 항-OX40 하이브리도마 상등액을 스크리닝하여, 96웰 미량역가 플레이트 형식으로 영상화하고 세 포 개수 및 형광 양쪽 모두를 정량하였다. OX40 항원을 발현하는 L-세포를 5 ㎕의 항-OX40 하이브리도마 상등액과 함께 인큐베이션하고, 스크리닝 완충액에서 0.125 ㎍/㎖으로 희석된, Cy-5-접합 염소 항-마우스 IgG-Fcγ 항체 (Jackson Laboratories (PA))로 형광-표지시켰다. 인큐베이션 2시간 후, FMAT 8100 HTS 시스템 (Applied Biosystem (CA))을 사용하여 플레이트를 스캐닝하였다. 하기 표 1의 결과는 클론 B24 및 B39에 양성 대조군에 필적하는 활성이 있음을 나타낸다.
B. ELISA 스크리닝
폴리비닐 클로라이드 96웰 플레이트 (Nunc (Roskilde, Denmark))를 하룻밤 동안 4℃에서 OX40/Fcγ1 (5 ng/웰) 또는 스크리닝 대조군으로서의 인간 Fcγ1 (25 ng/웰)로 코팅한 후, 1시간 동안 PBS 내의 2％ BSA와 함께 인큐베이션하여, 비-특이적 결합을 차단하였다. 약 50 ㎕의 하이브리도마 상등액을 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 0.05％ TWEEN®-PBS로 4회 세정한 후, 약 0.2 ㎍의 HRP-염소 항-마우스 IgG Fcγ (Jackson ImmunoResearch Laboratories (PA))를 실온에서 1시간 동안 첨가하여, 결합된 항-OX40 항체의 존재를 검출하였다. 신선하게 제조된 100 ㎕의 1 mM TMB (Sigma) 기질 용액을 각각의 웰에 30분 동안 첨가하고, 50 ㎖의 0.2M H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시키고, 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices (CA))를 사용하여 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 24,000개의 웰 중에서, 220개가 FMAT 및 ELISA에 의해 양성으로 간주되었다. 대표적인 결과가 표 1에서 보고된다.
Figure 112009059007554-PCT00001
C. 유동 세포측정 스크리닝
FMAT 및 ELISA에 의해 선별된 220개의 양성 하이브리도마를 5 ㎕의 항-OX40 하이브리도마 상등액을 사용하여 염색되고 FITC-접합 염소 항-마우스 IgG-Fcγ 항체 (Jackson Laboratories (PA))에 의해 형광-표지된, OX40으로 안정적으로 형질감염된 L-세포를 사용하여 유동 세포측정에 의해 또한 테스트하였다. 표 2에 제시된 데이터는 항-OX40 하이브리도마 상등액을 사용하여 염색된 전체 OX40-형질감염 L-세포의 백분율에 상응한다.
Figure 112009059007554-PCT00002
표 1 및 2에서 확인된 220개의 항-OX40 mAb로부터, 항-OX40 mAb 클론 B2, B24, B36, B37, 및 B39가 OX40L L-세포에 대해 양성 결합을 나타냈지만, 형질감염되지 않은 L-세포에 대해서는 그렇지 않았다. OX40L L-세포에 대한 결합을 나타내지 않았기 때문에 B-17은 거부되었다.
실시예 4: 길항제 항-OX40 모노클로날 항체의 초기 특성화
인간 OX40에 특이적인 항체를 생산하는 220개의 하이브리도마를 확인한 후, 클론들을 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시켰다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp.59-103 (1986)]). 서브클론에 의해 분비된 220개의 항-OX40 mAb들을 단백질 A-세파로스를 사용하여 통상적인 정제 절차에 의해 배양 배지로부터 정제하였다.
A. 세포주 제조
인간 CD4+ T-세포 발달에 대한 OX40 공동자극의 효과를 특이적 세포주 및 신선한 단리된 인간 나이브 CD4+ T-세포를 사용하여 시험하여, 220개의 항-OX40 mAb 결합제를 특성화하였다. 이러한 세포주에는 (1) OX40으로 형질감염된 인간 Hut-78 백혈병 CD4+ T-세포주, (2) OX40L로 형질감염된 L 섬유모세포 마우스 L-세포 및 이의 어버이 세포주 (M.D. Anderson Cancer Center (Houston, TX)의 Dr. Yong-Jun Liu 제공), (3) 인간 나이브 CD4+ T-세포, 및 (4) 인간 IL-4 및 GM-CSF의 존재 하에 배양되고, 단리된 CD14+ 단핵구로부터 분화된 인간 수지상 세포 (DC)가 포함되었다. 건강한 성인 개체로부터 수집된 혈액의 백혈구 연층 분획이 자기 결핍에 의해 단리된 인간 나이브 T-세포 (CD4+, CD45RA+, CD45RO- 및 CD14- 표현형)의 공급원으로서; 세포 분류에 의해 단리된 CD11c+ 수지상 세포 (DC)의 공급원으로서; 또는 미성숙 DC로 분화된 단리된 CD14+ 단핵구의 공급원으로서 작용하였다.
B. 기능 분석법
1. Hut-78 분석법
OX40으로 형질감염된 인간 Hut-78 백혈병 CD4+ T-세포를 48시간 동안 96웰 플레이트에서 4:1 (OX40-Hut78 세포/L-세포) 비율의 방사선이 조사된 (6800 cGray) OX40L-형질감염 L-세포 또는 형질감염되지 않은 L-세포의 존재 하에 5 ㎍/㎖ 항-CD3 (OKT3, BD Bioscences (CA)) 및 1 ㎍/㎖ 항-CD28 mAb (CD28.2, BD Bioscences (CA))로 프라이밍(priming)시켰다. 실시예 3에서 확인된 220개의 항-OX40 mAb를 분석법을 시작할 때 첨가하여, CD4+ T-세포 사이토카인 방출의 억제로 정의된 길항제 활성에 대해 스크리닝하였다. 동일한 프로토콜을 사용하여 분석법을 3회 반복하였다. 표 3에 요약된 실험은 3가지 대표적인 항-OX40 mAb (B66, B76, 및 B86)의 예이고, OX40L-형질감염 세포의 존재 하에 활성화된 T-세포가 형질감염되지 않은 L-세포의 존재 하에 활성화된 것들 (IL-2에 대해 22 pg/㎖ 및 IL-13 70 pg/㎖의 생산)보다 10배 이상 더 많은 IL-2 (138 pg/㎖) 및 IL-13 (620 pg/㎖)을 생산하였음을 나타낸다. 세포 배양물에 정제된 항-OX40 mAb B66 및 B76을 첨가하면, Hut-78 CD4+ T-세포주 사이토카인 생산이 용량 응답성 방식으로 차단되었다. 클론 B66은 최고 농도에서 88％의 IL-2 및 92％의 IL-13 사이토카인 생산을 억제하였다 (표 3). 테스트된 220개의 항-OX40 mAb로부터, IL-2 및 IL-13 사이토카인 생산의 60％를 초과하는 억제를 나타내는 10개의 클론을 선별하였다 (데이터 제시되지 않음).
Figure 112009059007554-PCT00003
C. 나이브 CD4+ T-세포 분석법
T-세포 증식 및 사이토카인 생산의 OX40 공동자극을 차단하기 위해, 사이토카인 생산, 증식을 억제하고 인간 CD4+ T-세포에서 세포자멸사를 유도하는 능력에 대해 220개의 항-OX40 mAb를 기능적으로 스크리닝하였다. 나이브 인간 CD4+ T-세포를 시판되는 나이브 CD4+ T-세포 단리 키트 (Miltenyi Biotec (Auburn, CA))를 사용하여 건강한 성인 자원자 (Gulf Coast Regional Blood Center (Houston, TX))로부터의 인간 혈액의 백혈구 연층으로부터 단리하였다. 단리된 나이브 인간 CD4+ T-세포를 1:4 (L-세포/나이브 CD4+ T-세포) 비율의 방사선이 조사된 OX40L-형질감염 L-세포 또는 어버이 L-세포의 존재 하에 5 ㎍/㎖ 항-CD3 (OKT3, BD Biosciences (CA)) 및 1 ㎍/㎖ 항-CD28 mAb (CD28.2, BD Biosciences (CA))로 활성화시켰다. 7일 배양 후, OX40L 형질감염체의 존재 하에 활성화된 나이브 CD4+ T-세포는 L-세포의 존재 하에 프라이밍된 것들보다 10배 이상 더 많은 IL-2 및 IL-13을 생산하였다 (도 2). 사이토카인 생산 수준을 R&D Systems (Minneapolis, MN)의 ELISA-키트를 사용하여 측정하였다. 도 3에 제시된 바와 같이 OX40 공동자극의 존재 하에 세포가 또한 훨씬 더 많이 증식하였다. 도 2 및 3에서, 백색 사각형은 나이브 CD4를 나타내고, 백색 삼각형은 나이브 CD4+ + 대조군 L-세포를 나타내며, 흑색 삼각형은 B66 + 나이브 CD4+ 및 OX40L L-세포를 나타내고, 흑색 사각형은 2C4 (이소타입 대조군) + 나이브 CD4+ 및 OX40L L-세포를 나타내고, 흑색 원은 관련되지 않은 G3-519 mAb 대조군 + 나이브 CD4+ 및 OX40L-L-세포를 나타낸다.
항-OX40 mAb B66을 배지에 첨가하면, 사이토카인 방출이 억제되었고 (도 2), 세포 증식이 억제되었으며 (도 3), 2C4 또는 G3-519 대조군과 비교하여 프라이밍된 CD4+ T-세포에서 용량 의존적인 방식으로 세포자멸사가 유도되었다 (표 4).
Figure 112009059007554-PCT00004
실시예 5: 선별된 길항제 항-OX40 모노클로날 항체의 추가적인 특성화
사이토카인은 나이브 CD4+ T-세포의 분화를 제어하여, 사이토카인 생산 프로파일에 의해 정의되는 T-세포의 부분집합을 생성시킬 수 있다. IL-12는 IFN-γ 및 IL-2를 주로 생산하고 세포-매개 면역 및 전-염증성(proinflammatory) 응답을 제어하는 것을 담당하는 Th1 세포의 분화를 구동시킨다. IL-4는 IL-4 및 IL-5를 주로 생산하고 체액성 면역 및 항-염증성 응답의 제어를 담당하는 Th2 세포를 향하도록 나이브 CD4+ T-세포를 분극화시킨다. 초기 특성화로부터 선별된 2개의 항-OX40 mAb인 A10 및 B66을 Th1 및 Th2 세포 양쪽 모두에서 증식, 생존 및 사이토카인 방출을 차단하는 능력에 대해 테스트하였다. 이를 위해, 먼저 항체들을 뮤린 어버이 항체의 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 형태로 변환시켰다. 모든 시판 항체 및 사이토카인은 BD Biosciences (CA)에서 구입하였다.
A. Th1 분석법
인간 나이브 CD4+ T-세포를 상기 실시예 4 (B)(2)에 기술된 바와 같은 키트를 사용하여 인간 혈액의 백혈구 연층으로부터 단리하였다. 50 ng/㎖ IL-12 사이토카인이 보충된 배지에서 5 ㎍/㎖ 항-CD3 (OKT3), 1 ㎍/㎖ 항-CD28 (CD28.2), 및 10 ㎍/㎖ 항-IL-4 중화 항체 (MP4-25D2)를 사용하여 세포를 7일 동안 프라이밍시켜, Th1-사이토카인 생산 프로파일을 유도하였다. 세포를 1:4 (L-세포/나이브 CD4+ T-세포) 비율의 방사선이 조사된 OX40L-형질감염 L-세포 또는 어버이 L-세포의 존재 하에 항-CD3 및 항-CD28 mAb와 함께 배양하였다. 아넥신 염색에 대해 양성인 CD4+ 세포의 개수에서의 감소에 의해 나타나는 바와 같이 OX40 공동자극은 Th1 이펙터 세포의 생존을 증가시켰다 (표 5). 방사선이 조사된 L-세포의 공동 배양을 시작할 때 키메라 항-OX40 mAb B66을 첨가하면, 이러한 생존이 억제되었다. OX40 공동자극은 IFN-γ 생산을 또한 증가시켰고, B66의 첨가는 이의 생산을 용량 의존적인 방식으로 억제하였다 (표 6).
Figure 112009059007554-PCT00005
Figure 112009059007554-PCT00006
B. Th2 분석법
인간 나이브 CD4+ T-세포를 상기 기술된 바와 같이 단리하였다. 50 ng/㎖ IL-4 사이토카인이 보충된 배지에서 5 ㎍/㎖ 항-CD3, 1 ㎍/㎖ 항-CD28 및 10 ㎍/㎖ 항-IFN-γ 중화 항체를 사용하여 세포를 7일 동안 프라이밍시켜, Th2-사이토카인 생산 프로파일을 유도하였다. 세포를 1:4 (L-세포/나이브 CD4+ T-세포) 비율의 방사선이 조사된 OX40L-형질감염 L-세포 또는 어버이 L-세포의 존재 하에 항-CD3 및 항-CD28 mAb와 함께 배양하였다. 아넥신 염색에 대해 양성인 CD4+ 세포의 개수에서의 감소에 의해 나타나는 바와 같이 OX40 공동자극은 Th2 이펙터 세포의 생존을 증가시켰다 (도 4). 방사선이 조사된 L-세포의 공동 배양을 시작할 때 항-OX40 mAb A10 및 B66을 첨가하면, 이러한 생존 (도 4)을 억제하였고, 뿐만 아니라 Th2 세포의 증식 (도 5) 및 IL-2 (도 6A) 및 IL-13 (도 6B)의 사이토카인 생산을 용량 의존적인 방식으로 억제하였다.
C. Th17 분석법
IL-23의 존재 하에 프라이밍된 T-세포의 독특한 부분집합은 IL-17의 생산을 특징으로 하고, 특정 만성 염증성 질환의 발병기전에서 결정적으로 수반된다. Th17 세포가 Th1 및 Th2 계통에서 초기에 갈라지고 Th1 및 Th2 세포의 발달을 지배하는 사이토카인 및 신호전달 경로에 의해 길항되는, 완전히 독립된 계통의 CD4+ T-세포를 나타낸다는 것이 최근의 데이터에서 실연되었다. Th17 T-세포를 프라이밍시켜, OX40 공동자극의 효과 및 Th17 분화를 억제하는 길항제성 항-OX40 mAb의 능력을 연구하였다.
나이브 CD4+ T-세포를 실시예 4(B)(2)에 기술된 바와 같이 백혈구 연층으로부터 단리하였다. 이러한 세포를 100 ng/㎖의 IL-23 사이토카인 (R&D (Minneapolis, MN)), 각각 20 ng/㎖의 hIL-6 및 hTGFβ1, 5 ㎍/㎖의 예비-코팅된 항-CD3 (OKT3, BD Biosciences (CA)), 1 ㎍/㎖의 가용성 항-CD28 (CD28.2), 각각 10 ㎍/㎖의 항-IL4 (MP4-25D2) 및 항-IFN-γ (B27)의 존재 하에 7일 동안 프라이밍시켰다. 프라이밍된 세포를 세정하고, 추가로 3일 동안 1:4 (L-세포/나이브 CD4+ T-세포) 비율의 방사선이 조사된 OX40L-형질감염 L-세포 또는 어버이 L-세포의 존재 하에 항-CD3 및 항-CD28 mAb와 함께 배양하였다. OX40L-L-세포를 통해 OX40 공동자극을 유도하는 것에 의해, Th17 세포는 OX40L 공동자극의 부재 하에 배양된 동일한 세포와 비교하여 4배로 증식하였다. 항-OX40 mAb A10 및 B66은 용량 의존적인 방식으로 Th17 증식을 억제하였다 (표 7).
Figure 112009059007554-PCT00007
표 8의 데이터는 OX40L이 Th-17 생존을 유의하게 강화시켰음을 실연한다 (68％ 대 84％). 이러한 강화된 생존이 항-OX40 mAb A10 및 B66에 의해 용량 의존적인 방식으로 억제되었다 (표 8).
Figure 112009059007554-PCT00008
세포자멸사의 억제제이고 OX40 단백질의 잠재적 표적인 단백질 수르비빈(Survivin)의 세포내 발현을 평가했을 때, OX40 자극은 이의 발현을 강화시켰다. 이러한 강화된 발현이 항-OX40 mAb A10 및 B66에 의해 용량 의존적인 방식으로 억제되었다 (표 9).
Figure 112009059007554-PCT00009
Th1 프라이밍 세포와 비교하여, 나이브 CD4+ T-세포를 프라이밍시키고 나서 7일 후에 Th17 세포는 유의하게 더 높은 수준의 IL-17을 나타냈다. Th17과 방사선이 조사된 OX40L-형질감염 L-세포 또는 어버이 L-세포의 추가적인 공동 배양 후, Th17 세포는 Th1 프라이밍 세포와 비교하여 OX40 공동자극의 존재 하에 상당한 수준의 IL-17을 생산하였다. 이러한 IL17 생산이 이소타입 대조군 G3-519 (IC)과 비교하여 키메라 항-OX40 mAb A10 및 B66에 의해 용량 의존적인 방식으로 억제되었다 (표 10).
Figure 112009059007554-PCT00010
D. L106 비교
실시예 4(B)(2)에서와 동일한 프로토콜을 사용하여, OX40 공동자극의 존재 하에 활성화된 인간 CD4+ T-세포로부터의 사이토카인 IL-2 및 IL-13의 방출을 억제하는 항-OX40 mAb A10 및 B66의 능력을 시판되는 항-OX40 항체 L106 (BD Bioscience (San Jose, CA))과 비교하였다. L106에 의한 사이토카인 생산의 억제는 대조군 항체와 유의하게 상이하지 않았다 (도 7 참조). 따라서, 이러한 항체는 기능성이지 않은 것으로 간주되었다 (즉, 작동제성 또는 길항제성 활성이 없음).
실시예 6: 항-OX40 모노클로날 항체의 인간화
뮤린 mAb A10 및 B66의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)의 핵산 서열이 도 14A-D에서 나타내어져 있다. 도 12는 선택된 인간 경쇄 주형에 비교된 252-B66 및 252-A10의 뮤린 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (DNA 서열로부터 유래됨)을 제공한다. 양쪽 항체 모두 OX40 길항제로 작용하고, 서로 경쟁한다. 이러한 서열들을 공공 데이터베이스에서 입수가능한 인간 항체 생식계열 서열과 비교하였다. 주형 상에서 결정할 때, 전체적인 길이, 프레임워크 내의 유사한 CDR 위치, 전체적인 상동성, CDR의 크기 등을 포함하여 여러 가지 기준이 사용되었다. 모두 합쳐진 이러한 기준들은 도 12A 및 B에 나타내어진 A10 및 B66 mAb 중쇄 및 경쇄 서열과 각각의 인간 주형 서열 간의 서열 정렬에 나타난 바와 같이 최적의 인간 주형을 선택하기 위한 결과를 제공하였다. 뮤린 A10의 가변 영역과 인간 카파 사슬 및 인간 IgG의 CH1의 불변 영역이 조합된, 파지 벡터 내의 키메라 Fab가 대조군으로 구축되었다.
이러한 경우에, 1가지를 초과하는 인간 프레임워크 주형이 이러한 항체를 디자인하는데 사용되었다. VH 사슬에 대해 선택된 인간 주형은 서브그룹 V1의 IGHV1-46 (Gene Bank 접속 번호 X92343)과 생식 계통 IGHJ4 (Gene Bank 접속 번호 J00256)의 조합물이었다 (도 12B 참조). VL 사슬에 대해 선택된 인간 주형은 IGKV4-1 (Gene Bank 접속 번호 Z00023)과 생식 계통 J 사슬 IGHJ1 (Gene Bank 접속 번호 J00242)의 조합물이었다 (도 12A 참조). 도 12B는 뮤린 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (DNA 서열로부터 유래됨), 이러한 서열과 선택된 인간 생식 계열 주형의 정렬, 및 A10(TH)hu336F의 인간화 가변 영역의 서열을 제공한다. 아미노산 서열의 번호는 카밧의 방법에 따라 매겨졌다. A10으로부터의 뮤린 CDR을 인간 가변 프레임워크 상에 그래프팅하였다. 이러한 서열에서, 프레임워크 내의 아미노산 잔기의 총개수는 87개이다; 인간 프레임워크와 뮤린 프레임워크 사이에 상이한 아미노산 잔기의 총개수는 21개였고, 인간화 중쇄의 프레임워크에서 뮤린 잔기가 유지되지 않았다.
서열 비교는 뮤린 항체 B66이 A10과 가변 영역 내의 아미노산 4개만큼만 상이하였음을 나타냈지만, 상기 실시예 4에서 논의된 기능 분석법은 B66이 OX40 결합 및 길항제 활성이 더 높았음을 나타냈다. B66에서의 아미노산 변화 중 2개는 제1 CDR에 위치하였고, 마우스 생식계열 서열로부터의 변화였다. 이러한 변화가 B66의 강화된 활성의 원인일 수 있는 것으로 추론되었다. 그러나, 이러한 항체들로부터의 CDR이 인간 가변 프레임워크 상에 그래프팅되었을 때, B66이 불량하게 분비되었고, 따라서 추가적인 개발에 덜 적절하였다. 따라서, B66의 CDRL1 및 A10의 CDRL2 및 CDRL3를 선택하여 인간 가변 주형 상에 그래프팅시켜서, 인간화 항-OX40 길항제를 제조하였다. 이러한 방법에 의해, 인간화 A10 분자의 결합 친화력 및 길항제 활성이 어버이 뮤린 항체에 비해 증가되었다.
A. BiaCore에 의한 항-OX40 Fab의 동역학 분석
도 13은 원래의 뮤린 분자와 비교하여 생성된 분자의 OX40 결합 활성을 나타낸다. CDRL1이 A10의 원래의 CDRL1 서열을 반영하도록 또한 돌연변이되었다. B66의 CDRL1으로의 A10의 CDRL1의 교체로 '인간화' A10 분자 A10(TH)hu336F의 결합 활성이 증가되었다. 도 15는 인간화 클론 A10(TH)hu336F, 뮤린 A10 및 이의 키메라 형태가 OX40에 똑같이 잘 경쟁한다는 것을 나타낸다.
실시예 7: A10(TH)HU336F의 인간화 변이체의 특성화
인간화 A10 후보물 A10(TH)hu336F의 6개의 변이체를 결합 ELISA, 세포-기반 결합 분석법, 및 이들의 길항제성 활성을 실연하는 추가적인 기능 분석법을 사용하여 스크리닝하였다. 6개의 인간화 A10 중 2개 (변이체 A10-D 및 F)에 6가지 기능성 분석법을 적용하였다.
발현될 때 인간화 가변 영역이 인-프레임으로 인간 불변 영역과 융합되도록 상기 기술된 인간화 가변 영역을 포유류 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 테스트하기 위한 전체 항체가 생산되도록 추가적인 인간화 후보물들을 포유류 발현 벡터 내로 또한 클로닝하였다. 이러한 추가적인 후보물은 원래의 A10 CDRL1이 있는 인간화 A10 VL 영역 (A & D), 카밧 번호 34가 아스파라긴 (N)에서 히스티딘 (H)으로 변화된 인간화 A10 VL 영역 (B & E) (이러한 변이체 내의 CDR-L1은 아미노산 서열 KASQTVDYDGDSYMH (서열 61)을 포함함), 및 순차 번호 70 (A10 L70) (카밧 번호 69)에 뮤린 류신 (L)을 함유하는 별법적인 인간화 VH 영역을 포함한다. 표 11에 제시된 조합으로 항체들이 포유류 세포에서 발현되었다. 표 12는 상응하는 Biacore 데이터를 나타낸다. 이러한 인간화 후보물의 가변 영역, 뿐만 아니라 뮤린 가변 영역의 핵산 서열이 도 14에서 제시된다.
Figure 112009059007554-PCT00011
Figure 112009059007554-PCT00012
A. TCR-활성화 나이브 CD4+ T-세포 분석법
나이브 인간 CD4+ T-세포를 상기 4 (B)(2)에 기술된 것과 동일한 프로토콜에 따라 활성화시켰다. 7일 배양 후, OX40L의 존재 하에 활성화된 나이브 CD4+ T-세포는 L-세포의 존재 하에 프라이밍된 것에 비해 10배 이상 더 많은 IL-2, IL-5 및 IL-13을 생산하였고, 현저하게 더 많이 증식되었다 (도 8).
인간화 변이체 A10-D 및 A10-F는 사이토카인 방출 (IL-2/IL-5/IL-13) 및 CD4+ T-세포 증식을 이소타입 대조군과 비교하여 뮤린 어버이 및 키메라 형태의 A10과 동일한 수준으로 억제하였다 (도 8).
B. 프라이밍된 T-세포 분석법
인간화 변이체 A10-D 및 A10-F를 길항제성 활성에 대해 테스트하였다; 방사선이 조사된 OX40L-형질감염 L-세포 또는 어버이 L-세포의 존재 하에 Th1 프라이밍 T-세포, Th2 프라이밍 T-세포 및 Th17 세포의 증식 및 사이토카인 방출을 억제함 (실시예 5의 프로토콜 참조).
Th1 조건 하에, 인간화 변이체 A10-D 및 A10-F가 IL-2, IL-5, IL-13 사이토카인의 생산 및 세포 증식을 이소타입 대조군과 비교하여 키메라 (CC-A10) 및 어버이 마우스 (M-A10) mAb와 동일한 정도로 억제하였다 (도 9).
Th2 조건 하에, 인간화 변이체 A10-D 및 A10-F가 증식 및 사이토카인 방출 (IL-2, IL-5, 및 IL-13)을 억제함으로써 활성화된 CD4+ T-세포에 대한 길항제성 활성을 나타냈다 (도 10).
Th17 세포 증식, IL-17 사이토카인 생산 및 세포 자멸사에 대한 길항제 활성을 비교하기 위해 인간화 변이체 A10D 및 A10-F를 이들의 키메라 및 마우스 항-OX40 mAb와 병행하여 또한 테스트하였다. 결과가 표 13에 제시된다.
Figure 112009059007554-PCT00013
유동 세포측정 및 아넥신-V 염색에 의한 세포자멸사성 세포의 확인을 통해, OX40L이 Th17 세포자멸사를 유의하게 감소시킨 한편, 이소타입 대조군 G3-519 처리 (IC)와 비교하여, 인간화 변이체 A10-D 및 A10-F는 용량 의존적인 방식으로 세포자멸사를 증가시켰음이 표 12에 제시된 데이터에서 실연되었다 (표 14).
Figure 112009059007554-PCT00014
C. Th2/TSLP-DC
CD11c+ 수지상 세포 (DC)를 건강한 성인 자원자로부터의 인간 혈액의 백혈구 연층으로부터 단리하였다. 계통 마커 CD3 (OKT3), CD14 (M5E2), CD15 (HB78), CD20 (L27), CD56 (B159), 및 CD235α (10F7MN)에 대한 mAb들의 혼합물을 사용하여 음성 면역선별에 의해 DC-강화 집단을 PBMC로부터 수득하였다. 집단을 염소 항-마우스 IgG가 코팅된 자기 비드 (M-450; Miltenyi Biotec (CA))에 통과시켜, 결합된 세포를 제거하였다. CD11c+ 계통 및 CD4+ 세포를 >99％ 순도에 도달하도록 FACS Aria에 의해 단리하였다 (알로피코시아닌 (APC)가 표지된 항-CD11c (B-ly6), FITC가 표지된 mAb CD19 (HIB 19) 및 CD56 (NCAM 16.2)의 혼합물, 및 APC-Cy7가 표지된 CD4 (RPA-T4)를 사용함). CD11c+ DC를 2％ 인간 AB 혈청을 함유하는 이셀(Yssel) 배지 (Gemini Bio-Products (Woodland, CA))에서 배양하였다. 세포를 24시간 동안 15 ng/㎖의 TSLP (일반적으로 M.D. Anderson Cancer Center의 Dr. Yun-Jun Liu가 제공함)의 존재 하에 편평 바닥 96웰 플레이트에 배지 200 ㎖ 당 2×105 개의 세포의 밀도로 파종하였다.
동종이형 CD4+ CD45RA+ 나이브 T-세포 (순도 >99％)를 CD4+ T-세포 단리 키트 II (Miltenyi Biotec (CA))를 사용하여 단리한 후, 세포를 분류하였다 (CD4+ CD45RA+ CD45RO- CD25- 분획). 세포를 세정된 TSLP-자극 골수 수지상 세포 (mDC)와 함께 둥근-바닥 96웰 배양 플레이트에서 7일 동안 공동 배양하였다 (DC/T-세포 비율 1:5). mDC에 의한 한 사이클의 자극 (7일) 후, 프라이밍된 CD4+ T-세포를 수집하여 세정하였다.
배양 상등액에서의 사이토카인 생산을 검출하기 위해, T-세포를 48시간 동안 106 개의 세포/㎖의 농도로 플레이트에 결합된 5 ㎍/㎖의 항-CD3 및 1 ㎍/㎖의 가용성 항-CD28로 다시 자극하였다. IL-5, IL-13 및 TNF-α의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. TSLP-활성화 골수 DC로 프라이밍된 Th2 세포에서의 세포 증식 및 사이토카인 생산이 이소타입 대조군 항체와 비교하여 인간화 변이체 A10-F의 존재 하에 억제되었다 (표 15).
Figure 112009059007554-PCT00015
세포내 사이토카인 생산을 위해, 프라이밍된 CD4+ T-세포를 50 ng/㎖의 PMA + 2 ㎍/㎖의 이오노마이신으로 6시간 동안 자극하였다. 마지막 2시간 동안 10 ㎍/㎖의 브레펠딘 A (eBioscience (San Diego, CA))를 첨가하였다. 세포를 고정 및 투과 완충액 (eBioscience (CA)))을 사용하여 IL-2 및 IL-13에 대한 PE-표지 mAb들의 조합물, 및 FITC-표지 항-IFN-γ 또는 항-TNF-α로 염색하였다. TSLP-활성화 골수 DC로 프라이밍된 Th2 세포에서의 IL-2, IL-13 및 TNF-α 사이토카인 생산이 이소타입 대조군 항체와 비교하여 인간화 변이체 A10-F의 존재 하에 억제되었다 (표 16).
Figure 112009059007554-PCT00016
OX40 공동자극은 아넥신으로 염색된 CD4+ 세포의 개수에서의 감소 및 세포내 수르비빈 단백질 발현이 있는 CD4+ 세포의 증가된 개수에 의해 나타나는 바와 같이 프라이밍된 Th2 세포의 생존을 증가시켰다. 그러나, 인간화 변이체 A10-F이 세포 배양물에 첨가되면, 세포자멸사에서의 현저한 증가 및 수르수빈의 더 낮은 발현이 유도되었다 (표 17).
Figure 112009059007554-PCT00017
D. Th1/LPS-DC 프로토콜
Th1 프로파일을 향한 T-세포 분극화를 분석하기 위해, 나이브 CD4 T-세포를 LPS로 24시간 동안 자극된 동종이형 단핵구-유래 DC와 공동 배양하였다. DC는 당업계에 주지된 표준 프로토콜에 의해 인간 PBMC로부터 생성되었다. 낮은 밀도의 PBMC가 수확되었고, CD14-마이크로비드 및 AutoMacs 기구 (Miltenyi Biotec (Auburn, CA))를 사용하여 CD14+ 세포가 양성으로 선별되었다. DC 분화를 유도하기 위해, 106 개의 세포/㎖의 CD14+ 단핵구를 완전 배지 (RPMI-10％ FBS), 500 IU/㎖ 인간 rGM-CSF (R&D Systems (MN)), 및 400 IU/㎖ 인간 rIL-4 (R&D Systems (MN))에서 37℃에서 5％ CO2 하에 배양하였다. 제2일 또는 제3일에, DC 배양물에 추가적인 용량의 GM-CSF 및 IL-4를 제공하였다. 제5일에, 부드러운 파이펫팅(pipetting)에 의해 비-부착성 DC를 수확하고, 1 ㎍/㎖의 LPS (Sigma-Aldrich (MO))와 함께 다시 배양하였다. LPS-활성화 DC를 수확하고, 세정하여, 나이브 CD4 T-세포를 Th-1 분극화 T-세포로 프라이밍시키는데 사용하였다. 세포를 96웰 플레이트에서 1:4의 DC/T-세포 비율로 인큐베이션하였다. 인간화 변이체 A10-D 및 A10-F를 이들의 길항제성 활성; 및 LPS-활성화 DC의 존재 하에서의 Th1 프라이밍 T-세포의 증식 및 사이토카인 생산을 억제하는 능력에 대해 또한 테스트하였다. 인간화 변이체 A10-D 및 F는 IL-2, IFN-γ, 및 TNF-α 사이토카인 생산 및 세포 증식을 이소타입 대조군과 비교하여 키메라 (CC-A10) 및 마우스 (M-A10) 변이체 mAb와 동일한 정도로 억제하였다 (도 11). LPS-활성화 DC가 OX40 이외의 또다른 공동자극성 신호를 제공할 수 있기 때문에 세포 증식 및 IFN-γ 및 TNF-α 사이토카인 생산의 억제는 절대적이지 않았다.
E. 교차 반응성 분석법
공개된 문헌에 따르면, 인간 OX40 단백질과 마우스 OX40 단백질 간의 공유된 상동성은 낮은 것으로 간주된다. 이에 부합하여, 키메라 A10 및 B66은 ELISA 플랫폼에서 이소타입 대조군 (IC:2C4)와 비교하여 마우스 OX40 단백질에 대해 어떠한 교차 반응성도 나타내지 않았다 (표 18).
Figure 112009059007554-PCT00018
따라서, 유동 세포측정 염색을 사용하여, 원숭이 OX40 단백질과 교차 반응하는지를 결정하기 위해 항-OX40 mAb를 전임상 동물 모델 환경에서 테스트하였다. 전체 CD4+ T-세포를 CD4 마이크로비드 (Miltenyi Biotec (Auburn, CA))를 사용하여 붉은털 원숭이 및 사이노몰구스 원숭이의 전체 혈액 및 인간 백혈구 연층으로부터 단리하였다. 단리된 CD4+ T-세포를 5 ㎍/㎖의 미리-코팅된 항-CD3 mAb (SP34, 인간 CD3 단백질 및 붉은털 원숭이 및 사이노몰구스 원숭이 종 양쪽 모두의 CD3 단백질과 교차 반응할 수 있음) 및 1 ㎍/㎖의 가용성 항-CD28 mAb (CD28.2, 인간 CD28 단백질 및 붉은털 원숭이 및 사이노몰구스 원숭이 종 양쪽 모두의 CD28 단백질과 교차 반응할 수 있음)로 2일 동안 활성화시켰다. 원숭이 및 인간 CD4 (L200) 및 CD25 (M-A251) 단백질과 교차 반응하는 항체를 사용하여 세포의 표면을 염색하였다. OX40 세포 표면 발현에 대해, PE에 접합된 인간화 A10-F OX40 mAb가 사용되었다. 데이터 분석은 A10-F가 인간, 붉은털 원숭이 및 사이노몰구스 원숭이에 의해 활성화된 CD4 T-세포를 쉽게 인식하였음을 나타냈다 (표 19).
인식된 활성화된 CD4+ T-세포의 ％
인간 70
사이노몰구스 원숭이 88
붉은털 원숭이 75
실시예 8: 에피토프 지도작성
에피토프 지도작성에 대한 2가지 표준 접근법인 효모 표면 디스플레이 및 키메라 분자의 구축을 사용하여 A10(TH)hu336F가 결합하는 OX40 에피토프의 지도를 작성하였다. 효모 표면 디스플레이에서, 분비되어 효모의 표면 상에 디스플레이될 수 있는 단백질 융합물로서 OX40의 세포외 도메인이 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에서 발현되었다. OX40 발현 벡터의 무작위 돌연변이유발은 OX40 돌연변이체 단백질의 라이브러리가 효모 표면에 발현되도록 하였다. OX40에 결합하지 못하는 단백질을 발현하는 돌연변이체 (C-말단 태그의 존재에 의해 결정됨)를 형광 항체를 사용하여 염색하고, FACS에 의해 단리할 수 있었다. 구조된(rescued) 효모로부터 돌연변이체 발현 플라스미드를 단리하고, 서열분석하여, 어떤 아미노산 잔기가 A10(TH)hu336F-OX40 결합에 필요한지를 결정하였다.
두번째 에피토프 지도작성 접근법은 A10(TH)hu336F가 인간 OX40에는 결합하지만 뮤린 OX40에는 결합하지 않는다는 관찰을 기초로 하였다. 인간 OX40의 영역이 뮤린 OX40의 상동성 영역으로 교체된 키메라 OX40 분자를 구축하였다. 키메라 분자를 포유류 세포의 표면 상에서 발현시키고, 형광 표지된 A10(TH)hu336F에의 결합을 FACS에 의해 모니터링하였다. 인간 OX40의 어떤 영역이 A10(TH)hu336F 결합에 필요한지를 분석함으로써 OX40 결합 에피토프가 결정되었다.
당업자는 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시양태들에 대한 다수의 등가물을 인지할 것이거나, 또는 단지 일상적일 뿐인 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이같은 등가물들은 하기의 청구항들에 의해 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. LAMHAMEDI-CHERRADI, Salah-Eddine YAO, Zhengbin SINGH, Sanjaya <120> ANTAGONIST OX40 ANTIBODIES AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF INFLAMMATORY AND AUTOIMMUNE DISEASES <130> 12279-205-228 <140> Unknown <141> <150> 60/903,693 <151> 2007-02-27 <160> 60 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1084 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cgaggatgtg cgtgggggct cggcggctgg gccgcgggcc gtgtgcggct ctgctcctcc 60 tgggcctggg gctgagcacc gtgacggggc tccactgtgt cggggacacc taccccagca 120 acgaccggtg ctgccacgag tgcaggccag gcaacgggat ggtgagccgc tgcagccgct 180 cccagaacac ggtgtgccgt ccgtgcgggc cgggcttcta caacgacgtg gtcagctcca 240 agccgtgcaa gccctgcacg tggtgtaacc tcagaagtgg gagtgagcgg aagcagctgt 300 gcacggccac acaggacaca gtctgccgct gccgggcggg cacccagccc ctggacagct 360 acaagcctgg agttgactgt gccccctgcc ctccagggca cttctcccca ggcgacaacc 420 aggcctgcaa gccctggacc aactgcacct tggctgggaa gcacaccctg cagccggcca 480 gcaatagctc ggacgcaatc tgtgaggaca gggacccccc agccacgcag ccccaggaga 540 cccagggccc cccggccagg cccatcactg tccagcccac tgaagcctgg cccagaacct 600 cacagggacc ctccacccgg cccgtggagg tccccggggg ccgtgcggtt gccgccatcc 660 tgggcctggg cctggtgctg gggctgctgg gccccctggc catcctgctg gccctgtacc 720 tgctccggag ggaccagagg ctgccccccg atgcccacaa gccccctggg ggaggcagtt 780 tccggacccc catccaagag gagcaggccg acgcccactc caccctggcc aagatctgac 840 ctgggcccac caaggtggac gctgggcccc gccaggctgg agcccggagg gtctgctggg 900 cgagcagggc aggtgcaggc cgcctgcccc gccacgctcc tgggccaact ctgcaccgtt 960 ctaggtgccg atggctgcct ccggctctct gcttacgtat gccatgcata cctcctgccc 1020 cgcgggacca caataaaaac cttggcagac gggagtctcc gaccggcaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaa 1084 <210> 2 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val 20 25 30 Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro 35 40 45 Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys 50 55 60 Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro 65 70 75 80 Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys 85 90 95 Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly 100 105 110 Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys 115 120 125 Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp 130 135 140 Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn 145 150 155 160 Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro 165 170 175 Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr 180 185 190 Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu 195 200 205 Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val 210 215 220 Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu 225 230 235 240 Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser 260 265 270 Thr Leu Ala Lys Ile 275 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OLIGONUCLEOTIDE PRIMER FOR OX40 <400> 3 cccaagcttt accccagcaa cgaccggtgc tgc 33 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OLIGONUCLEOTIDE PRIMER FOR OX40 <400> 4 cgcctcgagg acctccacgg gccgggtgg 29 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OLIGONUCLEOTIDE PRIMER FOR OX40 <400> 5 caccatgtgc gtgggggctc ggcggctggg 30 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OLIGONUCLEOTIDE PRIMER FOR OX40 <400> 6 gatcttggcc agggtggagt gggcgtcggc c 31 <210> 7 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VARIABLE LIGHT CHAIN REGION OF MURINE ANTI-OX40 ANTIBODY B66 <400> 7 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Thr Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VARIABLE LIGHT CHAIN REGION OF MURINE ANTI-OX40 ANTIBODY A10 <400> 8 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Thr Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VARIABLE LIGHT CHAIN REGION OF HUMANIZED ANTI-OX40 ANTIBODY A10LC(TH)hu336 <400> 9 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Thr Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VARIABLE HEAVY CHAIN REGION OF MURINE ANTI-OX40 ANTIBODY A10 <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Lys Ser Gly Asn Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Pro Glu Tyr Ser Asn Phe Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 11 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VARIABLE HEAVY CHAIN REGION OF HUMANIZED ANTI-OX40 ANTIBODY A10LC(TH)hu336 <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Lys Ser Gly Asn Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Pro Glu Tyr Ser Asn Phe Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 OF MURINE ANTI-OX40 ANTIBODY B66 <400> 12 Lys Ala Ser Gln Thr Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met His 1 5 10 15 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 OF ANTI-OX40 ANTIBODY A10 AND B66 <400> 13 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 OF ANTI-OX40 ANTIBODY B66 <400> 14 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 OF ANTI-OX40 ANTIBODY A10 <400> 15 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 OF ANTI-OX40 ANTIBODY A10 <400> 16 His Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 OF ANTI-OX40 ANTIBODY A10 AND B66 <400> 17 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 OF ANTI-OX40 ANTIBODY A10 AND B66 <400> 18 Glu Ile His Pro Lys Ser Gly Asn Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 OF ANTI-OX40 ANTIBODY A10 AND B66 <400> 19 Gly Pro Glu Tyr Ser Asn Phe Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VARIABLE LIGHT CHAIN REGION OF MURINE ANTI-OX40 ANTIBODY A10 <400> 20 gacattgtgc tgacccaatc tccaacttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tacaacctat tactgtcacc agagtaatga ggatccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 21 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VARIABLE LIGHT CHAIN REGION OF MURINE ANTI-OX40 ANTIBODY B66 <400> 21 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca aggccagcca aactgttgat tatgatggtg acagttatat gcattggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333 <210> 22 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VARIABLE LIGHT CHAIN REGION OF HUMANIZED ANTI-OX40 ANTIBODY A10B & A10E <400> 22 gacatcgtga tgacccagag cccagacagc ctggccgtga gcctgggcga gcgcgccacc 60 atcaactgca aggccagcca gagcgtggac tacgacggcg acagctacat gaactggtac 120 cagcagaagc caggccagcc accaaagctg ctgatctacg ccgccagcaa cctggagagc 180 ggcgtgccag accgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240 agcctgcagg ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccacc agagcaacga ggacccatgg 300 accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aag 333 <210> 23 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VARIABLE LIGHT CHAIN REGION OF HUMANIZED ANTI-OX40 ANTIBODY A10A & A10D <400> 23 gacatcgtga tgacccagag cccagacagc ctggccgtga gcctgggcga gcgcgccacc 60 atcaactgca aggccagcca gagcgtggac tacgacggcg acagctacat gcactggtac 120 cagcagaagc caggccagcc accaaagctg ctgatctacg ccgccagcaa cctggagagc 180 ggcgtgccag accgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240 agcctgcagg ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccacc agagcaacga ggacccatgg 300 accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aag 333 <210> 24 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VARIABLE LIGHT CHAIN REGION OF HUMANIZED ANTI-OX40 ANTIBODY A10(TH)HU336F & A10C <400> 24 gacatcgtga tgacccagag cccagacagc ctggccgtga gcctgggcga gcgcgccacc 60 atcaactgca aggccagcca gaccgtggac tacgacggcg acagctacat gcactggtac 120 cagcagaagc caggccagcc accaaagctg ctgatctacg ccgccagcaa cctggagagc 180 ggcgtgccag accgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240 agcctgcagg ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccacc agagcaacga ggacccatgg 300 accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aag 333 <210> 25 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VARIABLE HEAVY CHAIN REGION OF MURINE ANTI-OX40 ANTIBODY A10 <400> 25 caggtccaac tgcagcagcc tgggtctgtg ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcattgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gattggagag attcatccta aaagtggtaa tagtaactac 180 aatgagaagt tcaagggcag ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240 gtggatctta gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggtccg 300 gaatatagta atttttggtt tgcttattgg ggccaaggaa ctctggtcac tgtctctgca 360 <210> 26 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VARIABLE HEAVY CHAIN REGION OF HUMANIZED ANTI-OX40 ANTIBODY A10(TH)HU336F & A10D &A10E <400> 26 caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc caggcgccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gcgccaggcc 120 ccaggccagg gcctggagtg gatgggcgag atccacccaa agagcggcaa cagcaactac 180 aacgagaagt tcaagggccg cgtgaccatg acccgcgaca ccagcaccag caccgtgtac 240 atggagctga gcagcctgcg cagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcggccca 300 gagtacagca acttctggtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 <210> 27 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VARIABLE HEAVY CHAIN REGION OF HUMANIZED ANTI-OX40 ANTIBODY A10L70 & A10A-C <400> 27 caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc caggcgccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gcgccaggcc 120 ccaggccagg gcctggagtg gatgggcgag atccacccaa agagcggcaa cagcaactac 180 aacgagaagt tcaagggccg cgtgaccctg acccgcgaca ccagcaccag caccgtgtac 240 atggagctga gcagcctgcg cagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcggccca 300 gagtacagca acttctggtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 <210> 28 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 35, 36, 37, 38, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> Human template Variable Light Chain IGKV4-1/IGKJ1 <400> 28 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 29 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 31, 32, 33, 34, 35, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> Human Template Heavy Chain Region IGHV1-45/IGHJ4 <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 30 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Met Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr 65 70 75 80 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 31 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr 65 70 75 80 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 32 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr 65 70 75 80 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 33 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr 65 70 75 80 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 34 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 34 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 65 70 75 80 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 35 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 35 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 65 70 75 80 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 36 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 36 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 65 70 75 80 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 37 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 37 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 65 70 75 80 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 38 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 65 70 75 80 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 39 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 65 70 75 80 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 40 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 65 70 75 80 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 41 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 65 70 75 80 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 42 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 65 70 75 80 Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 43 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 65 70 75 80 Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 44 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 65 70 75 80 Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 45 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 65 70 75 80 Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 46 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 46 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 65 70 75 80 Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 47 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 47 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 65 70 75 80 Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 48 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> HEAVY CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 65 70 75 80 Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 49 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 24, 40 <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <223> LIGHT CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 49 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 20 25 30 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 50 55 60 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 65 70 75 80 Ile Lys <210> 50 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LIGHT CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 50 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 20 25 30 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp 50 55 60 Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 65 70 75 80 <210> 51 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LIGHT CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 51 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 20 25 30 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp 50 55 60 Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 65 70 75 80 <210> 52 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LIGHT CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 52 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 20 25 30 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp 50 55 60 Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 65 70 75 80 <210> 53 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LIGHT CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 53 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LIGHT CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 54 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 55 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LIGHT CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 55 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LIGHT CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 56 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 57 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LIGHT CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 57 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LIGHT CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 58 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10 <210> 59 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LIGHT CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 59 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LIGHT CHAIN FRAMEWORK REGION <400> 60 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

Claims (48)

  1. a. i. 서열 17의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1;
    ii. 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및/또는
    iii. 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는
    b. i. 서열 12, 15 또는 61의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1;
    ii. 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및/또는
    iii. 서열 14 또는 16의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
    을 포함하는, 인간 OX40 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 길항제 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    a. i. 서열 17의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1;
    ii. 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및
    iii. 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는
    b. i. 서열 12의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1;
    ii. 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및
    iii. 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
    을 포함하는 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    a. i. 서열 17의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1;
    ii. 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및
    iii. 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는
    b. i. 서열 12의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1;
    ii. 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및
    iii. 서열 16의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
    을 포함하는 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    a. i. 서열 17의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1;
    ii. 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및
    iii. 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는
    b. i. 서열 15의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1;
    ii. 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및
    iii. 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
    을 포함하는 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    a. i. 서열 17의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1;
    ii. 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및
    iii. 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는
    b. i. 서열 15의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1;
    ii. 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및
    iii. 서열 16의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
    을 포함하는 항체.
  6. 제1항에 있어서,
    a. 서열 10 또는 11 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는
    b. 서열 7, 8, 또는 9 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가 변 영역 (VL)
    을 포함하는 항체.
  7. 제1항에 있어서,
    a. 서열 25, 26 또는 27의 핵산 서열 중 어느 하나에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는
    b. 서열 20, 21, 22, 23, 또는 24의 핵산 서열 중 어느 하나에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역 (VL)
    을 포함하는 항체.
  8. 제6항에 있어서,
    a. 서열 10에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 7 또는 8 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VL; 또는
    b. 서열 11에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 9에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VL
    을 포함하는 항체.
  9. 제7항에 있어서,
    a. 서열 25의 핵산 서열에 의해 코딩되는 VH 및 서열 20 또는 21의 핵산 서열에 의해 코딩되는 VL;
    b. 서열 26의 핵산 서열에 의해 코딩되는 VH 및 서열 22, 23 또는 24의 핵산 서열에 의해 코딩되는 VL; 또는
    c. 서열 27의 핵산 서열에 의해 코딩되는 VH 및 서열 22, 23 또는 24의 핵산 서열에 의해 코딩되는 VL
    을 포함하는 항체.
  10. 제8항에 있어서, VH가 서열 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열 7에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  11. 제8항에 있어서, VH가 서열 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  12. 제8항에 있어서, VH가 서열 11에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열 9에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 불변 영역을 추가로 포함하는 항체.
  14. 제13항에 있어서, CH1, CH2 또는 CH3 도메인을 포함하는 항체 불변 영역을 추가로 포함하는 항체.
  15. 제14항에 있어서, 불변 영역이 IgG 항체로부터의 것인 항체.
  16. 제15항에 있어서, IgG 항체가 IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체인 항체.
  17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체인 항체.
  18. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체, 인간화 항체, 모노클로날 항체, 또는 재조합 항체인 항체.
  19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일쇄 Fv, 단일쇄 항체, 디술피드-연결 Fv, 단일 도메인 항체, 항원 결합 단편, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 또는 미니바디(minibody)인 항체.
  20. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 표지를 추가로 포함하는 항체.
  21. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독소 또는 면역독소를 추가로 포함하는 항체.
  22. 제1항의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  23. 제22항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  24. 제23항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  25. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체, 및 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제, 및 안정화제 중 하나 이상을 포함하는 조성물.
  26. 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 항체가 OX40L이 OX40에 결합하는 것을 차단하고/하거나 OX40L이 OX40에 결합하는 것과 관련된 하나 이상의 기능을 억제하는 것인, 환자에서 OX-40 매개 장애를 치료하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, OX40 매개 장애가 염증성 또는 자가면역 질환인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 질환이 알러지, 천식, 또는 다발성 경화증, 류머티스 관절염, 염증성 장 질환, 이식편-대-숙주 질환, 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE), 자가면역 신경병증, 자가면역 포도막염, 자가면역 용혈 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 중 증 근육무력증, 실험적 리슈만편모충증, 콜라겐-유도 관절염, 대장염 (예컨대 궤양성 대장염), 접촉성 과민 반응, 당뇨병, 크론(Crohn)병, 그레이브(Grave)병, 사르코이드증, 악성 빈혈, 측두 동맥염, 항-인지질 증후군, 혈관염 (예컨대 베게너(Wegener) 육아종증), 베체트(Bechet)병, 포진 피부염, 보통 천포창, 백반증, 원발성 담관성 간경화, 자가면역 간염, 하시모토(Hashimoto) 갑상선염, 자가면역 난소염 및 고환염, 부신의 자가면역 질환, 전신성 홍반 루푸스, 공피증, 피부근육염, 다발근육염, 피부근육염, 척추관절병증 (예컨대 강직성 척추염), 라이터(Reiter) 증후군 또는 쇼그렌(Sjogren) 증후군과 같은 자가면역 및 염증과 관련된 질환인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 질환이 알러지, 천식, 또는 다발성 경화증, 류머티스 관절염, 염증성 장 질환, 이식편-대-숙주 질환, 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE), 실험적 리슈만편모충증, 콜라겐-유도 관절염, 대장염 (예컨대 궤양성 대장염), 접촉성 과민 반응, 당뇨병, 크론병 또는 그레이브병과 같은 자가면역 및 염증과 관련된 질환인 방법.
  30. 제26항에 있어서, 정맥내, 복강내, 흡입, 근육내, 피하 및 경구 경로를 포함하는 경로들 중 하나 이상을 통해 항체를 환자에게 투여하는 것인 방법.
  31. 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 IgE 항체 생산을 억제함으로써 장애를 치료하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 장애가 기관지 천식, 알러지성 비염, 알러지성 피부염, 아나필락시스, 두드러기 또는 아토피 피부염인 방법.
  33. 포유동물에게 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 항체가 (a) 약 1×10-10 내지 약 1×10-12 M 사이의 KD로 인간 OX40에 결합하는 성질; (b) OX40에 결합하는 것과 관련된 하나 이상의 기능을 억제하는 성질; 및 (c) OX40L이 OX40에 결합하는 것을 억제하는 성질 중 하나 이상의 성질을 포함하는 것인, 포유동물에서 천식의 중증도를 감소시키는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 항체가 약 1×10-12 내지 약 1×10-11 M, 1×10-11 내지 약 1×10-10 M, 1×10-10 내지 약 1×10-9 M, 1×10-9 내지 약 1×10-8 M, 또는 1×10-8 내지 약 1×10-7 M 사이의 KD로 인간 OX40에 결합하는 것인 방법.
  35. 제24항의 세포를 항체의 생산 및 항체의 단리에 적절한 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 항체의 생산 방법.
  36. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma).
  37. 의약의 제조에서의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체의 용도.
  38. OX40 관련 질환 또는 장애의 치료를 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체의 용도.
  39. 제38항에 있어서, 질환이 알러지, 천식, 또는 다발성 경화증, 류머티스 관절염, 염증성 장 질환, 이식편-대-숙주 질환, 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE), 자가면역 신경병증, 자가면역 포도막염, 자가면역 용혈 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 중증 근육무력증, 실험적 리슈만편모충증, 콜라겐-유도 관절염, 대장염 (예컨대 궤양성 대장염), 접촉성 과민 반응, 당뇨병, 크론병, 그레이브병, 사르코이드증, 악성 빈혈, 측두 동맥염, 항-인지질 증후군, 혈관염 (예컨대 베게너 육아종증), 베체트병, 포진 피부염, 보통 천포창, 백반증, 원발성 담관성 간경화, 자가면역 간염, 하시모토 갑상선염, 자가면역 난소염 및 고환염, 부신의 자가면역 질환, 전신성 홍반 루푸스, 공피증, 피부근육염, 다발근육염, 피부근육염, 척추관절병증 (예컨대 강직성 척추염), 라이터 증후군 또는 쇼그렌 증후군과 같은 자가면역 및 염증과 관련된 질환인 용도.
  40. 제39항에 있어서, 질환이 알러지, 천식, 또는 다발성 경화증, 류머티스 관절염, 염증성 장 질환, 이식편-대-숙주 질환, 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE), 실험적 리슈만편모충증, 콜라겐-유도 관절염, 대장염 (예컨대 궤양성 대장염), 접촉성 과민 반응, 당뇨병 또는 크론병과 같은 자가면역 및 염증과 관련된 질환인 용도.
  41. OX40을 검출하기 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체의 용도.
  42. 샘플을 제20항의 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플 내의 OX40의 검출 방법.
  43. 한 용기 내의 미리 정해진 양의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체, 및 별도의 용기 내의 완충액을 포함하는 키트.
  44. 한 용기 내의 미리 정해진 양의 제25항의 조성물, 및 별도의 용기 내의 완충액을 포함하는 키트.
  45. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 의료 장치.
  46. 제45항에 있어서, 흡입 장치인 의료 장치.
  47. 제25항의 조성물을 포함하는 의료 장치.
  48. 제47항에 있어서, 흡입 장치인 의료 장치.
KR1020097020065A 2007-02-27 2008-02-26 길항제 ｏｘ40 항체 및 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서의 이의 용도 KR20100014588A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90369307P 2007-02-27 2007-02-27
US60/903,693 2007-02-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20100014588A true KR20100014588A (ko) 2010-02-10

Family

ID=39620235

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097020065A KR20100014588A (ko) 2007-02-27 2008-02-26 길항제 ｏｘ40 항체 및 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서의 이의 용도

Country Status (20)

Country Link
US (1) US20100136030A1 (ko)
EP (1) EP2125891A2 (ko)
JP (1) JP2010518873A (ko)
KR (1) KR20100014588A (ko)
CN (1) CN101668776A (ko)
AR (1) AR065506A1 (ko)
AU (1) AU2008219666A1 (ko)
BR (1) BRPI0807269A2 (ko)
CA (1) CA2679399A1 (ko)
CL (1) CL2008000578A1 (ko)
CO (1) CO6231009A2 (ko)
CR (1) CR11042A (ko)
EC (1) ECSP099656A (ko)
IL (1) IL200572A0 (ko)
MA (1) MA31246B1 (ko)
MX (1) MX2009009194A (ko)
PE (1) PE20090689A1 (ko)
RU (1) RU2009135824A (ko)
TW (1) TW200846367A (ko)
WO (1) WO2008106116A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140043811A (ko) * 2011-07-11 2014-04-10 그렌마크 파머수티칼스 에스. 아. Ox40에 결합하는 항체 및 이들의 용도

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7291331B1 (en) 2002-09-11 2007-11-06 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Methods of treating OX40 medicated recall immune responses
ZA200804868B (en) 2005-12-16 2009-10-28 Genentech Inc Anti-OX40L antibodies and methods using same
CA2749539C (en) * 2009-01-21 2022-07-19 Amgen Inc. Compositions and methods comprising interleukin-2 mutants for treating inflammatory and autoimmune diseases
SG173620A1 (en) * 2009-02-17 2011-09-29 Ucb Pharma Sa Antibody molecules having specificity for human ox40
NZ629913A (en) 2010-08-23 2016-01-29 Univ Texas Anti-ox40 antibodies and methods of using the same
EP2748199B1 (en) * 2011-08-23 2019-08-28 Board of Regents, The University of Texas System Anti-ox40 antibodies and methods of using the same
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
UA112203C2 (uk) 2011-11-11 2016-08-10 Юсб Фарма С.А. Злитий білок біоспецифічного антитіла, який зв'язується з ox40 людини та сироватковим альбуміном людини
CA2885970C (en) * 2012-09-17 2020-10-20 Peter G. Traber Method for enhancing specific immunotherapies in cancer treatment
ES2687282T3 (es) 2013-03-18 2018-10-24 Biocerox Products B.V. Anticuerpos humanizados ANTI-CD134 (OX40) y sus usos
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
MX2016013372A (es) 2014-04-11 2017-01-26 Novartis Ag Metodos de tratar selectivamente el asma utilizando antagonistas de il-13.
US10155818B2 (en) 2014-05-28 2018-12-18 Agenus Inc. Anti-GITR antibodies and methods of use thereof
EP3191131A4 (en) 2014-08-21 2018-09-05 The General Hospital Corporation Tumor necrosis factor superfamily and tnf-like ligand muteins and methods of preparing and using the same
TW201619200A (zh) * 2014-10-10 2016-06-01 麥迪紐有限責任公司 人類化抗－ｏｘ４０抗體及其用途
US9512229B2 (en) 2015-03-03 2016-12-06 Kymab Limited Synergistic combinations of OX40L antibodies for the treatment of GVHD
AU2016227493B2 (en) 2015-03-03 2022-01-20 Kymab Limited Antibodies, uses & methods
EP3268387A4 (en) * 2015-03-11 2018-10-10 Providence Health & Services - Oregon Compositions and methods for enhancing the efficacy of cancer therapy
US10293059B2 (en) 2015-04-09 2019-05-21 Cornell University Gene therapy to prevent reactions to allergens
UA126270C2 (uk) 2015-04-10 2022-09-14 Емджен Інк. Мутеїни інтерлейкіну-2 для росту регуляторних t-клітин
TWI820377B (zh) 2015-05-07 2023-11-01 美商艾吉納斯公司 抗ｏｘ４０抗體及其使用方法
HUE061253T2 (hu) 2015-05-29 2023-06-28 Bristol Myers Squibb Co Antitestek OX40 ellen és azok felhasználásai
US20190022092A1 (en) 2015-09-15 2019-01-24 Acerta Pharma B.V. Therapeutic Combinations of a BTK Inhibitor and a GITR Binding Molecule, a 4-1BB Agonist, or an OX40 Agonist
CA2999369C (en) * 2015-09-22 2023-11-07 Spring Bioscience Corporation Anti-ox40 antibodies and diagnostic uses thereof
US10624974B2 (en) * 2015-10-15 2020-04-21 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Anti-OX40 antibody and application thereof
MX2018006477A (es) * 2015-12-02 2018-09-03 Agenus Inc Anticuerpos y metodos de uso de estos.
WO2017134292A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anti-ox40 antagonistic antibodies for the treatment of atopic dermatitis
CN109475603B (zh) 2016-06-20 2023-06-13 科马布有限公司 抗pd-l1抗体
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
MA46770A (fr) 2016-11-09 2019-09-18 Agenus Inc Anticorps anti-ox40, anticorps anti-gitr, et leurs procédés d'utilisation
JP7291339B2 (ja) * 2016-12-26 2023-06-15 協和キリン株式会社 ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質に結合する抗体
US11840565B2 (en) 2016-12-29 2023-12-12 University Of Miami Methods and compositions for treating virus-associated inflammation
JP2020503345A (ja) 2016-12-29 2020-01-30 ユニバーシティ オブ マイアミ 肺におけるインフラマソーム活性及び炎症をモジュレートする方法
MX2019007963A (es) 2017-01-06 2019-10-21 Iovance Biotherapeutics Inc Expansion de linfocitos infiltrantes de tumor (til) con agonistas de la superfamilia de recptor de factor de necrosis tumoral (tnfrsf) y combinaciones terapeuticas de til- y agonistas de tnfrsf.
KR102608239B1 (ko) * 2017-02-23 2023-11-30 제리아 신야쿠 고교 가부시키 가이샤 항염증제
CN108623686A (zh) * 2017-03-25 2018-10-09 信达生物制药(苏州)有限公司 抗ox40抗体及其用途
AR112072A1 (es) 2017-06-05 2019-09-18 Iovance Biotherapeutics Inc Métodos de uso de linfocitos infiltrantes de tumor en melanoma doble refractario
BR112020009663A2 (pt) 2017-11-17 2020-11-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. método para a expansão de linfócitos infiltrantes de tumor (tils) em uma população terapêutica de tils, método para o tratamento de um indivíduo com câncer, composição
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
WO2019136459A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
MA51636A (fr) 2018-01-08 2020-11-18 Iovance Biotherapeutics Inc Procédés de génération de produits de til enrichis pour des lymphocytes t spécifiques d'un antigène tumoral
JP2021512962A (ja) 2018-02-13 2021-05-20 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド アデノシンａ２ａ受容体アンタゴニストによる腫瘍浸潤性リンパ球（ｔｉｌ）の拡大培養並びにｔｉｌ及びアデノシンａ２ａ受容体アンタゴニストの治療的組み合わせ
AU2019257749A1 (en) 2018-04-27 2020-10-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Closed process for expansion and gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2020010273A1 (en) * 2018-07-03 2020-01-09 University Of Miami Compositions and methods for treating inflammasome related diseases or conditions
TW202031273A (zh) 2018-08-31 2020-09-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 抗ｐｄ－１抗體難治療性之非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）病患的治療
KR20210064269A (ko) 2018-09-20 2021-06-02 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 동결보존된 종양 샘플로부터의 til의 확장
CN112513088B (zh) * 2018-09-26 2023-05-16 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗ox40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
EP3877511A1 (en) 2018-11-05 2021-09-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors
KR20210099573A (ko) 2018-11-05 2021-08-12 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 개선된 종양 반응성 t-세포의 선택
TW202039831A (zh) 2018-11-05 2020-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 對抗ｐｄ－１抗體呈現難治性之非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）病患之治療
WO2020096988A2 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
WO2020103836A1 (zh) * 2018-11-20 2020-05-28 上海开拓者生物医药有限公司 Ox40抗体及其制备方法和应用
CN109651510B (zh) * 2018-12-04 2023-03-24 上海长征医院 抗Eno1抗体及其用途
WO2020131547A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
US20220110974A1 (en) * 2019-02-01 2022-04-14 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
US20220177841A1 (en) 2019-03-29 2022-06-09 Myst Therapeutics Llc Ex vivo methods for producing a t cell therapeutic and related compositions and methods
US20220249559A1 (en) 2019-05-13 2022-08-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
WO2021081378A1 (en) 2019-10-25 2021-04-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
AU2020391231A1 (en) 2019-11-27 2022-07-14 Myst Therapeutics, Llc Method of producing tumor-reactive T cell composition using modulatory agents
US20230220341A1 (en) 2019-12-11 2023-07-13 lovance Biotherapeutics, Inc. Processes for the production of tumor infiltrating lymphocytes (tils) and methods of using the same
IL295934A (en) 2020-02-27 2022-10-01 Myst Therapeutics Llc Methods for in vitro enrichment and expansion of tumor reactive t cells and related preparations
TW202208617A (zh) 2020-05-04 2022-03-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於產生腫瘤浸潤性淋巴球的過程及其在免疫療法中的用途
WO2021226085A1 (en) 2020-05-04 2021-11-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Selection of improved tumor reactive t-cells
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
JP2023546359A (ja) 2020-10-06 2023-11-02 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球療法によるｎｓｃｌｃ患者の治療
AU2021357841A1 (en) 2020-10-08 2023-06-15 Affimed Gmbh Trispecific binders
TW202241468A (zh) 2020-12-11 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用腫瘤浸潤性淋巴球療法與ｂｒａｆ抑制劑及／或ｍｅｋ抑制劑組合治療癌症患者
EP4262827A1 (en) 2020-12-17 2023-10-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes
JP2023554395A (ja) 2020-12-17 2023-12-27 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｃｔｌａ－４及びｐｄ－１阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球療法による治療
BR112023021665A2 (pt) 2021-04-19 2023-12-19 Iovance Biotherapeutics Inc Método para tratar um câncer, e, composição
CA3226942A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
IL308154A (en) 2021-07-30 2023-12-01 Affimed Gmbh Double structure antibodies
TW202331735A (zh) 2021-10-27 2023-08-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 協調用於患者特異性免疫療法之細胞之製造的系統及方法
WO2023086803A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
WO2023147486A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Tumor infiltrating lymphocytes engineered to express payloads
WO2024030758A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
WO2024056862A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Avidicure Ip B.V. Multispecific antigen binding proteins for tumor-targeting of nk cells and use thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5821332A (en) * 1993-11-03 1998-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Receptor on the surface of activated CD4+ T-cells: ACT-4
US5759546A (en) * 1994-02-04 1998-06-02 Weinberg; Andrew D. Treatment of CD4 T-cell mediated conditions
US6057421A (en) * 1994-11-30 2000-05-02 Immpheron, Inc. Variable heavy and light chain regions of murine monoclonal antibody 1F7
ES2295639T3 (es) * 2002-06-13 2008-04-16 Crucell Holland B.V. Agonistas del receptor ox40=(=cd134) y uso terapeutico descripcion.
WO2004019866A2 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Immunex Corporation Compositions and methods for treating cardiovascular disease
DE602005018325D1 (de) * 2004-02-19 2010-01-28 Genentech Inc Antikörper mit korrigierten cdr
US9296816B2 (en) * 2005-04-15 2016-03-29 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
TWI461436B (zh) * 2005-11-25 2014-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 人類ｃｄ１３４（ｏｘ４０）之人類單株抗體及其製造及使用方法
ZA200804868B (en) * 2005-12-16 2009-10-28 Genentech Inc Anti-OX40L antibodies and methods using same

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140043811A (ko) * 2011-07-11 2014-04-10 그렌마크 파머수티칼스 에스. 아. Ox40에 결합하는 항체 및 이들의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
EP2125891A2 (en) 2009-12-02
CN101668776A (zh) 2010-03-10
CA2679399A1 (en) 2008-09-04
AU2008219666A1 (en) 2008-09-04
CL2008000578A1 (es) 2008-10-10
RU2009135824A (ru) 2011-04-10
US20100136030A1 (en) 2010-06-03
MA31246B1 (fr) 2010-03-01
AR065506A1 (es) 2009-06-10
PE20090689A1 (es) 2009-06-20
ECSP099656A (es) 2009-10-30
JP2010518873A (ja) 2010-06-03
IL200572A0 (en) 2010-05-17
CO6231009A2 (es) 2010-12-20
TW200846367A (en) 2008-12-01
CR11042A (es) 2009-11-03
WO2008106116A2 (en) 2008-09-04
MX2009009194A (es) 2009-10-08
WO2008106116A3 (en) 2008-10-16
BRPI0807269A2 (pt) 2014-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20100014588A (ko) 길항제 ｏｘ40 항체 및 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서의 이의 용도
US9518124B2 (en) Anti-Notch3 agonist antibodies and their use in the treatment of Notch3-related diseases
KR102584675B1 (ko) GUCY2c에 특이적인 항체 및 이의 용도
US7935791B2 (en) Antagonist anti-Notch3 antibodies and their use in the prevention and treatment of Notch3-related diseases
AU2015300787A1 (en) Anti-TREM2 antibodies and methods of use thereof
US11525005B2 (en) Anti-CD40 antibody, antigen binding fragment thereof and medical use thereof
EP2935332B1 (en) Anti-h7cr antibodies
KR101432474B1 (ko) 항-연장된 ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체, 이의 유도체 및 용도
AU2014357450B2 (en) Antibodies targeting B-cell receptor complex membrane bound IgM and uses thereof
IL198079A (en) Anti-3 Notch Agonist Antibodies and Their Use in Preparing Drugs for the Treatment of 3 Notch

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid