JP2022514023A - 操作されたサイトカイン受容体対を使用して腫瘍浸潤リンパ球を拡大培養する方法及びその使用 - Google Patents

操作されたサイトカイン受容体対を使用して腫瘍浸潤リンパ球を拡大培養する方法及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2022514023A
JP2022514023A JP2021535083A JP2021535083A JP2022514023A JP 2022514023 A JP2022514023 A JP 2022514023A JP 2021535083 A JP2021535083 A JP 2021535083A JP 2021535083 A JP2021535083 A JP 2021535083A JP 2022514023 A JP2022514023 A JP 2022514023A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
til
population
expansion culture
cancer
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021535083A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020131547A5 (ja
Inventor
シャルティエ－クルト，セシル
ファーディス，マリア
Original Assignee
アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド filed Critical アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド
Publication of JP2022514023A publication Critical patent/JP2022514023A/ja
Publication of JPWO2020131547A5 publication Critical patent/JPWO2020131547A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464499—Undefined tumor antigens, e.g. tumor lysate or antigens targeted by cells isolated from tumor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

本発明は、より短期間でＴＩＬの改善された有効性、改善された表現型及び増加した代謝的健康をもたらす一方、低減された微生物汚染及び削減されたコスト削減を可能にする、閉鎖系においてＴＩＬ集団を拡大培養する新規の方法を含む、ＴＩＬを拡大培養し、且つ治療用ＴＩＬ集団を生じさせる改善及び／又は短縮された方法を提供する。直交性サイトカイン受容体を発現するＴＩＬを拡大培養する方法が提供される。かかるＴＩＬは、治療用処置レジメンでの使用を見出す。

Description

関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、２０１８年１２月１９日に提出された米国仮特許出願第６２／７８２，３３０号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。
発明の背景
[0002] 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移植を用いたかさ高い抵抗性の癌の処置は、予後不良の患者に対する治療への強力なアプローチとなる。Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393。免疫療法の成功には多量のＴＩＬが必要であり、商業化に向けてロバストで信頼性のある方法が求められている。これは、細胞拡大培養に伴う技術上、物流上及び規制上の問題に起因して実現が課題となっている。ＩＬ－２ベースのＴＩＬ拡大培養、それに続く「急速拡大培養法」（ＲＥＰ）は、その速さ及び効率から、ＴＩＬ拡大培養に好ましい方法となりつつある。Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39；Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41；Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。ＲＥＰは、１４日の期間でＴＩＬの１，０００倍の拡大をもたらすことができるが、それには、フィーダー細胞として、多くの場合に複数のドナーからの大過剰の（例えば、２００倍の）照射した同種異系末梢血単核球（ＰＢＭＣ、単核球（ＭＮＣ）としても知られる）並びに抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）及び高用量のＩＬ－２が必要である。Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。ＲＥＰ手順を経たＴＩＬは、黒色腫患者において宿主免疫抑制後に養子細胞療法の成功をもたらしている。現行の注入適合パラメータは、ＴＩＬの組成（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８又はＣＤ４陽性）の読み取り並びにＲＥＰ産物の拡大倍数及び生存率に依存するものである。
[0003] 現在のＴＩＬ処置プロトコルは、患者にＴＩＬを注入した後のＩＬ－２（アルデスロイキン）投与を利用している。アルデスロイキンの安全性プロファイルは、ＴＩＬ療法の全体的な安全性に悪影響を与え得る。しかし、いかなる理論にも拘束されるものではないが、受容体に結合するために、操作されたＩＬ－２受容体及び変異ＩＬ－２タンパク質を含む修飾されたＴＩＬの使用により、アルデスロイキンの全体的な免疫系効果を回避することができ、ＴＩＬ療法の処置結果を改善する可能性がある。
発明の概要
[0004] 本発明は、ＴＩＬを拡大培養し、且つ治療用ＴＩＬ集団を生じさせる改善及び／又は短縮された方法を提供する。
[0005] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）対象から得られた腫瘍サンプルを処理して複数の腫瘍断片にすることにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、第１の初回刺激拡大培養は、第１のガス透過性表面積を含む容器内で実施され、第１の初回刺激拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１～７日間の第１の期間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、数において第１のＴＩＬ集団よりも多い；
（ｃ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを補充することにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数の少なくとも２倍であり、第２の急速拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約１～１１日間の第２の期間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の急速拡大培養は、第２のガス透過性表面積を含む容器内で実施される；
（ｄ）直交性(orthogonal)ＩＬ－２Ｒβを発現するように、ステップ（ｃ）で生じられたＴＩＬを操作すること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと
を含む。
[0006] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）対象から得られた腫瘍サンプルを処理して複数の腫瘍断片にすることにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３を含み、且つ任意選択により抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、第１の初回刺激拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１～７日間の第１の期間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、数において第１のＴＩＬ集団よりも多い；
（ｃ）第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む細胞培養培地と接触させることにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、第２の急速拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約１～１１日間の第２の期間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である；
（ｄ）直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように、ステップ（ｃ）で生じられたＴＩＬを操作すること；及び
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収すること
を含む。
[0007] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含み、ステップ（ｃ）の培養培地中のＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）の培養培地中のＡＰＣの数よりも大きい。
[0008] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中において、第１のＴＩＬ集団であって、対象から切除された腫瘍からの腫瘍サンプルを処理して複数の腫瘍断片にすることによって得ることができる第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、第１の初回刺激拡大培養は、第１のガス透過性表面積を含む容器内で実施され、第１の初回刺激拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１～７日間の第１の期間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、数において第１のＴＩＬ集団よりも多い；
（ｂ）第２のＴＩＬ集団を、追加的なＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを有する第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に接触させることにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、ステップ（ａ）におけるＡＰＣの数の少なくとも２倍であり、第２の急速拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約１～１１日間の第２の期間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の急速拡大培養は、第２のガス透過性表面積を含む容器内で実施される；
（ｃ）直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように、ステップ（ｂ）で生じられたＴＩＬを操作すること；及び
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収すること
を含む。
[0009] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ａ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３を含み、且つ任意選択により抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の初回刺激拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１～７日間の第１の期間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、数において第１のＴＩＬ集団よりも多い、生じさせること；
（ｂ）直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように、ステップ（ａ）で生じられたＴＩＬを操作すること；
（ｃ）第２のＴＩＬ集団を、直交性ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む細胞培養培地と接触させることにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の急速拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約１～１１日間の第２の期間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、生じさせること；及び
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収すること
を含む。
[0010] 一部の実施形態において、ステップ（ｂ）において、細胞培養培地は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含み、ステップ（ｃ）の培養培地中のＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）の培養培地中のＡＰＣの数よりも大きい。
[0011] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数との比は、約１．５：１～約２０：１の範囲である。
[0012] 一部の実施形態において、比は、約１．５：１～約１０：１の範囲内である。
[0013] 一部の実施形態において、比は、約２：１～約５：１の範囲内である。
[0014] 一部の実施形態において、比は、約２：１～約３：１の範囲内である。
[0015] 一部の実施形態において、比は、２：１である。
[0016] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数は、約１．０×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２～約４．５×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２の範囲であり、第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、約２．５×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２～約７．５×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２の範囲である。
[0017] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数は、約１．５×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２～約３．５×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２の範囲であり、第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、約３．５×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２～約６．０×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２の範囲である。
[0018] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数は、約２．０×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２～約３．０×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２の範囲であり、第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、約４．０×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２～約５．５×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２の範囲である。
[0019] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数は、約１×１０８個のＡＰＣ～約３．５×１０８個のＡＰＣの範囲であり、第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、約３．５×１０８個のＡＰＣ～約１×１０９個のＡＰＣの範囲である。
[0020] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数は、約１．５×１０８個のＡＰＣ～約３×１０８個のＡＰＣの範囲であり、第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、約４×１０８個のＡＰＣ～約７．５×１０８個のＡＰＣの範囲である。
[0021] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数は、約２×１０８個のＡＰＣ～約２．５×１０８個のＡＰＣの範囲であり、第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、約４．５×１０８個のＡＰＣ～約５．５×１０８個のＡＰＣの範囲である。
[0022] 一部の実施形態において、約２．５×１０８個のＡＰＣは、第１の初回刺激拡大培養に添加され、及び５×１０８個のＡＰＣは、第２の急速拡大培養に添加される。
[0023] 一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数と、第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数との比は、約１．５：１～約１００：１である。
[0024] 一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数と、第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数との比は、約５０：１である。
[0025] 一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数と、第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数との比は、約２５：１である。
[0026] 一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数と、第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数との比は、約２０：１である。
[0027] 一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数と、第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数との比は、約１０：１である。
[0028] 一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団は、数において第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍多い。
[0029] 一部の実施形態において、方法は、治療用ＴＩＬ集団を回収するステップ後、回収された治療用ＴＩＬ集団を輸注バッグに移す追加的なステップを実施することを含む。
[0030] 一部の実施形態において、複数の腫瘍断片は、複数の別個の容器に分配され、その別個の容器のそれぞれにおいて、第２のＴＩＬ集団は、第１の初回刺激拡大培養のステップで第１のＴＩＬ集団から得られ、及び第３のＴＩＬ集団は、第２の急速拡大培養のステップで第２のＴＩＬ集団から得られ、第３のＴＩＬ集団から得られた治療用ＴＩＬ集団は、複数の容器のそれぞれから収集され、且つ組み合わされて、回収されたＴＩＬ集団をもたらす。
[0031] 一部の実施形態において、複数の別個の容器は、少なくとも２つの別個の容器を含む。
[0032] 一部の実施形態において、複数の別個の容器は、少なくとも２～２０個の別個の容器を含む。
[0033] 一部の実施形態において、複数の別個の容器は、少なくとも２～１０個の別個の容器を含む。
[0034] 一部の実施形態において、複数の別個の容器は、少なくとも２～５個の別個の容器を含む。
[0035] 一部の実施形態において、別個の容器のそれぞれは、第１のガス透過性表面積を含む。
[0036] 一部の実施形態において、複数の腫瘍断片は、単一の容器内に分配される。
[0037] 一部の実施形態において、単一の容器は、第１のガス透過性表面積を含む。
[0038] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップにおいて、細胞培養培地は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み、及びＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に約１つの細胞層～約３つの細胞層の平均厚さで積層される。
[0039] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップにおいて、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に約１．５の細胞層～約２．５の細胞層の平均厚さで積層される。
[0040] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップにおいて、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に約２つの細胞層の平均厚さで積層される。
[0041] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップにおいて、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に約３つの細胞層～約５つの細胞層の厚さで積層される。
[0042] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップにおいて、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に約３．５の細胞層～約４．５の細胞層の厚さで積層される。
[0043] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップにおいて、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に約４つの細胞層の厚さで積層される。
[0044] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップにおいて、第１の初回刺激拡大培養は、第１のガス透過性表面積を含む第１の容器内で実施され、及び第２の急速拡大培養のステップにおいて、第２の急速拡大培養は、第２のガス透過性表面積を含む第２の容器内で実施される。
[0045] 一部の実施形態において、第２の容器は、第１の容器よりも大きい。
[0046] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップにおいて、細胞培養培地は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み、及びＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に約１つの細胞層～約３つの細胞層の平均厚さで積層される。
[0047] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップにおいて、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に約１．５の細胞層～約２．５の細胞層の平均厚さで積層される。
[0048] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップにおいて、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に約２つの細胞層の平均厚さで積層される。
[0049] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップにおいて、ＡＰＣは、第２のガス透過性表面積上に約３つの細胞層～約５つの細胞層の平均厚さで積層される。
[0050] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップにおいて、ＡＰＣは、第２のガス透過性表面積上に約３．５の細胞層～約４．５の細胞層の平均厚さで積層される。
[0051] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップにおいて、ＡＰＣは、第２のガス透過性表面積上に約４つの細胞層の平均厚さで積層される。
[0052] 一部の実施形態において、第１のＴＩＬ集団に対して第１の初回刺激拡大培養が実施される各容器について、第２の急速拡大培養は、そのような第１のＴＩＬ集団から生じられた第２のＴＩＬ集団に対して同じ容器で実施される。
[0053] 一部の実施形態において、各容器は、第１のガス透過性表面積を含む。
[0054] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップにおいて、細胞培養培地は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み、及びＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に約１つの細胞層～約３つの細胞層の平均厚さで積層される。
[0055] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップにおいて、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に約１．５の細胞層～約２．５の細胞層の平均厚さで積層される。
[0056] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップにおいて、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に約２つの細胞層の平均厚さで積層される。
[0057] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップにおいて、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に約３つの細胞層～約５つの細胞層の平均厚さで積層される。
[0058] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップにおいて、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に約３．５の細胞層～約４．５の細胞層の平均厚さで積層される。
[0059] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップにおいて、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に約４つの細胞層の平均厚さで積層される。
[0060] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップで第１のＴＩＬ集団に対して第１の初回刺激拡大培養が実施される各容器について、第１の容器は、第１の表面積を含み、細胞培養培地は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み、及びＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に積層され、第１の初回刺激拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、第２の急速拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．１～約１：１０の範囲である。
[0061] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、第２の急速拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．２～約１：８の範囲である。
[0062] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、第２の急速拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．３～約１：７の範囲である。
[0063] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、第２の急速拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．４～約１：６の範囲である。
[0064] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、第２の急速拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．５～約１：５の範囲である。
[0065] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、第２の急速拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．６～約１：４の範囲である。
[0066] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、第２の急速拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．７～約１：３．５の範囲である。
[0067] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、第２の急速拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．８～約１：３の範囲である。
[0068] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、第２の急速拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．９～約１：２．５の範囲である。
[0069] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、第２の急速拡大培養のステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：２である。
[0070] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップにおける２～３日後、細胞培養培地は、追加的なＩＬ－２を補充される。
[0071] 一部の実施形態において、凍結保存プロセスを使用して、治療用ＴＩＬ集団を回収するステップにおける回収されたＴＩＬ集団を凍結保存することをさらに含む。
[0072] 一部の実施形態において、輸注バッグを凍結保存するステップをさらに含む。
[0073] 一部の実施形態において、本明細書における凍結保存プロセスは、回収されたＴＩＬ集団対凍結保存培地の１：１比を使用して実施される。
[0074] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。
[0075] 一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、照射され、且つ同種異系である。
[0076] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップにおいて、細胞培養培地は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含み、第１の初回刺激拡大培養のステップにおける細胞培養培地中のＰＢＭＣの総数は、２．５×１０８個である。
[0077] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップにおいて、細胞培養培地中の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり、第２の急速拡大培養のステップで細胞培養培地に添加されたＰＢＭＣの総数は、５×１０８個である。
[0078] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は、人工抗原提示細胞である。
[0079] 一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団を回収するステップにおける回収は、膜ベースの細胞処理系を使用して実施される。
[0080] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される。
[0081] 一部の実施形態において、複数の断片は、第１の初回刺激拡大培養のステップにおいて、１容器あたり約６０個の断片を含み、各断片は、約２７ｍｍ３の体積を有する。
[0082] 一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３～約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０～約６０個の断片を含む。
[0083] 一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。
[0084] 一部の実施形態において、複数の断片は、約１グラム～約１．５グラムの総質量を有する約５０個の断片を含む。
[0085] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される。
[0086] 一部の実施形態において、ＩＬ－２濃度は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ＩＵ／ｍＬである。
[0087] 一部の実施形態において、ＩＬ－２濃度は、約６，０００ＩＵ／ｍＬである。
[0088] 一部の実施形態において、回収された治療用ＴＩＬ集団を輸注バッグに移すステップにおける輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
[0089] 一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
[0090] 一部の実施形態において、凍結保存培地は、７％～１０％のＤＭＳＯを含む。
[0091] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップにおける第１の期間及び第２の急速拡大培養のステップにおける第２の期間は、５日間、６日間又は７日間の期間内にそれぞれ個別に実施される。
[0092] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップにおける第１の期間は、５日間、６日間又は７日間の期間内に実施される。
[0093] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップにおける第２の期間は、７日間、８日間又は９日間の期間内に実施される。
[0094] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養のステップにおける第１の期間及び第２の急速拡大培養のステップにおける第２の期間は、７日間の期間内にそれぞれ個別に実施される。
[0095] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から治療用ＴＩＬ集団の回収までのステップは、約１４日間～約１６日間の期間内に実施される。
[0096] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から治療用ＴＩＬ集団の回収までのステップは、約１５日間～約１６日間の期間内に実施される。
[0097] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から治療用ＴＩＬ集団の回収までのステップは、約１４日間の期間内に実施される。
[0098] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から治療用ＴＩＬ集団の回収までのステップは、約１５日間の期間内に実施される。
[0099] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から治療用ＴＩＬ集団の回収までのステップは、約１６日間の期間内に実施される。
[00100] 一部の実施形態において、方法は、凍結保存プロセスを使用して、回収された治療用ＴＩＬ集団を凍結保存するステップをさらに含み、第１の初回刺激拡大培養から治療用ＴＩＬ集団の回収及び凍結保存までのステップは、１６日間以下で実施される。
[00101] 一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団を回収するステップで回収された治療用ＴＩＬ集団は、治療有効投与量のＴＩＬのための十分なＴＩＬを含む。
[00102] 一部の実施形態において、治療有効投与量のための十分なＴＩＬの数は、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である。
[00103] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップにおける第３のＴＩＬ集団は、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生及び／又は増加したポリクローナル性を提供する。
[00104] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップにおける第３のＴＩＬ集団は、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍以上のインターフェロンガンマ産生を提供する。
[00105] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップにおける第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第１の初回刺激拡大培養のステップにおける第２のＴＩＬ集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、増加したＣＤ８及びＣＤ２８発現を呈する。
[00106] 一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団を回収のステップからの治療用ＴＩＬ集団は、患者に注入される。
[00107] 一部の実施形態において、本発明は、癌を有する対象を処置する方法であって、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む方法を提供し、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することは、
（ａ）対象から得られた腫瘍サンプルを処理して複数の腫瘍断片にすることにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の初回刺激拡大培養は、第１のガス透過性表面積を含む容器内で実施され、第１の初回刺激拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１～７日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、数において第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍多い、生じさせること；
（ｃ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを補充することにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の急速拡大培養に添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数の少なくとも２倍であり、第２の急速拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約１～１１日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の急速拡大培養は、第２のガス透過性表面積を含む容器内で実施される、生じさせること；
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収すること；
（ｅ）直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するようにＴＩＬを操作すること；
（ｆ）ステップ（ｄ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと；及び
（ｇ）治療有効投与量の、ステップ（ｆ）からのＴＩＬを対象に投与すること
を含む。
[00108] 一部の実施形態において、ステップ（ｇ）における治療有効投与量を投与するために十分なＴＩＬの数は、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である。
[00109] 一部の実施形態において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＰＢＭＣである。
[00110] 一部の実施形態において、ステップ（ｇ）で治療有効投与量のＴＩＬ細胞を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、患者に投与されている。
[00111] 一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間にわたってシクロホスファミドを投与し、続いて２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間にわたってフルダラビンを投与するステップを含む。
[00112] 一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｇ）で患者にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ－２レジメンで患者を処置するステップを更に含む。
[00113] 一部の実施形態において、高用量ＩＬ－２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。
[00114] 一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｇ）で患者にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ－２レジメンで患者を処置するステップを更に含み、ＩＬ－２は、直交性ＩＬ－２である。
[00115] 一部の実施形態において、高用量ＩＬ－２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇの直交性ＩＬ－２を含む。
[00116] 一部の実施形態において、高用量直交性ＩＬ－２は、ステップ（ｇ）における治療用集団の投与の翌日から投与される。一部の実施形態において、高用量直交性ＩＬ－２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。
[00117] 一部の実施形態において、ステップ（ｂ）における第３のＴＩＬ集団は、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生及び／又は増加したポリクローナル性を提供する。
[00118] 一部の実施形態において、ステップ（ｃ）における第３のＴＩＬ集団は、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍以上のインターフェロンガンマ産生を提供する。
[00119] 一部の実施形態において、ステップ（ｃ）における第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、ステップ（ｂ）における第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、増加したＣＤ８及びＣＤ２８発現を呈する。
[00120] 一部の実施形態において、癌は、固形腫瘍である。
[00121] 一部の実施形態において、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。
[00122] 一部の実施形態において、癌は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、癌は、黒色腫である。一部の実施形態において、癌は、ＨＮＳＣＣである。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌である。一部の実施形態において、癌は、ＮＳＣＬＣである。一部の実施形態において、癌は、膠芽腫（ＧＢＭを含む）である。一部の実施形態において、癌は、胃腸癌である。一部の実施形態において、癌は、高頻度変異癌である。一部の実施形態において、癌は、小児の高頻度変異癌である。
[00123] 一部の実施形態において、容器は、閉鎖型容器である。一部の実施形態において、容器は、Ｇコンテナである。一部の実施形態において、容器は、GREX-10である。一部の実施形態において、閉鎖型容器は、GREX-100を含む。一部の実施形態において、閉鎖型容器は、GREX-500を含む。
[00124] 一部の実施形態において、本発明は、前述の請求項のいずれかの方法によって作製された治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供する。
[00125] 一部の実施形態において、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、治療用ＴＩＬ集団は、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生及び／又は増加したポリクローナル性を提供する。
[00126] 一部の実施形態において、増加したインターフェロンガンマ産生を提供する、上記及び本明細書に記載の治療用ＴＩＬ集団である。
[00127] 一部の実施形態において、増加したポリクローナル性を提供する、上記及び本明細書に記載の治療用ＴＩＬ集団である。
[00128] 一部の実施形態において、増加した有効性を提供する、上記及び本明細書に記載の治療用ＴＩＬ集団である。
[00129] 一部の実施形態において、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、上記及び本明細書に記載される治療用ＴＩＬ集団である。
[00130] 一部の実施形態において、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、上記及び本明細書に記載される治療用ＴＩＬ集団である。
[00131] 一部の実施形態において、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、上記及び本明細書に記載される治療用ＴＩＬ集団である。
[00132] 一部の実施形態において、本発明は、治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、治療用ＴＩＬ集団は、ＴＩＬの第１の拡大培養が、いかなる添加された抗原提示細胞（ＡＰＣ）もなしに実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である。
[00133] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第１の拡大培養が、いかなる添加されたＡＰＣもなしに実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、上記及び本明細書に記載される治療用ＴＩＬ集団である。
[00134] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第１の拡大培養が、いかなる添加されたＡＰＣもなしに実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、上記及び本明細書に記載される治療用ＴＩＬ集団である。
[00135] 一部の実施形態において、本発明は、治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、治療用ＴＩＬ集団は、ＴＩＬの第１の拡大培養が、いかなる添加されたＯＫＴ３もなしに実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である。
[00136] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第１の拡大培養が、いかなる添加されたＯＫＴ３もなしに実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、上記及び本明細書に記載される治療用ＴＩＬ集団である。
[00137] 一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団は、ＴＩＬの第１の拡大培養が、いかなる添加されたＯＫＴ３もなしに実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である。
[00138] 一部の実施形態において、本発明は、治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、治療用ＴＩＬ集団は、ＴＩＬの第１の拡大培養が、添加された抗原提示細胞（ＡＰＣ）なし及び添加されたＯＫＴ３なしで実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である。
[00139] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第１の拡大培養が、添加された抗原提示細胞（ＡＰＣ）の添加なし及び添加されたＯＫＴ３なしで実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、上記及び本明細書に記載される治療用ＴＩＬ集団である。
[00140] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第１の拡大培養をが、添加された抗原提示細胞（ＡＰＣ）なし及び添加されたＯＫＴ３なしで実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、上記及び本明細書に記載される治療用ＴＩＬ集団である。
[00141] 一部の実施形態において、本発明は、上記及び本明細書に記載されるような治療用ＴＩＬ集団及び薬学的に許容される担体を含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を提供する。
[00142] 一部の実施形態において、本発明は、上記及び本明細書に記載されるようなＴＩＬ組成物を含む滅菌輸注バッグを提供する。
[00143] 一部の実施形態において、本発明は、上記及び本明細書に記載されるような治療用ＴＩＬ集団の凍結保存調製物を提供する。
[00144] 一部の実施形態において、本発明は、上記及び本明細書に記載されるような治療用ＴＩＬ集団及び凍結保存培地を含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を提供する。
[00145] 一部の実施形態において、凍結保存培地は、ＤＭＳＯを含有する、上記及び本明細書に記載のＴＩＬ組成物。
[00146] 一部の実施形態において、凍結保存培地は、７～１０％のＤＭＳＯを含有する、上記及び本明細書に記載のＴＩＬ組成物。
[00147] 一部の実施形態において、本発明は、上記及び本明細書に記載されるようなＴＩＬ組成物の凍結保存調製物を提供する。
[00148] 一部の実施形態において、医薬としての使用のための、上記及び本明細書に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物。
[00149] 一部の実施形態において、癌の処置における使用のための、上記及び本明細書に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物。
[00150] 一部の実施形態において、固形腫瘍癌の処置における使用のための、上記及び本明細書に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物。
[00151] 一部の実施形態において、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌から選択される癌の処置における使用のための、上記及び本明細書に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物。
[00152] 一部の実施形態において、上記及び本明細書に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌からなる群から選択される癌の処置における使用のためのものである。
[00153] 一部の実施形態において、上記及び本明細書に記載のＴＩＬ組成物は、癌の処置における使用のためのものであり、癌は、黒色腫である。
[00154] 一部の実施形態において、上記及び本明細書に記載のＴＩＬ組成物は、癌の処置における使用のためのものであり、癌は、ＨＮＳＣＣである。
[00155] 一部の実施形態において、上記及び本明細書に記載のＴＩＬ組成物は、癌の処置における使用のためのものであり、癌は、子宮頸癌である。
[00156] 一部の実施形態において、上記及び本明細書に記載のＴＩＬ組成物は、癌の処置における使用のためのものであり、癌は、ＮＳＣＬＣである。
[00157] 一部の実施形態において、上記及び本明細書に記載のＴＩＬ組成物は、癌の処置における使用のためのものであり、癌は、膠芽腫（ＧＢＭを含む）である。
[00158] 一部の実施形態において、上記及び本明細書に記載のＴＩＬ組成物は、癌の処置における使用のためのものであり、癌は、胃腸癌である。
[00159] 一部の実施形態において、上記及び本明細書に記載のＴＩＬ組成物は、癌の処置における使用のためのものであり、癌は、高頻度変異癌である。
[00160] 一部の実施形態において、上記及び本明細書に記載のＴＩＬ組成物は、癌の処置における使用のためのものであり、癌は、小児の高頻度変異癌である。
[00161] 一部の実施形態において、本発明は、上記及び本明細書に記載されたＴＩＬ組成物の、対象における癌を処置する方法であって、治療有効投与量の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を対象に投与することを含む方法における使用を提供する。
[00162] 一部の実施形態において、本発明は、上記及び本明細書に記載されるようなＴＩＬ組成物の使用を提供し、癌は、固形腫瘍である。
[00163] 一部の実施形態において、本発明は、上記及び本明細書に記載されるようなＴＩＬ組成物の使用を提供し、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。
[00164] 一部の実施形態において、本発明は、上記及び本明細書に記載のＴＩＬ組成物の使用を提供し、癌は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、癌は、黒色腫である。一部の実施形態において、本発明は、癌がＨＮＳＣＣであることを提供する。一部の実施形態において、本発明は、癌が子宮頸癌であることを提供する。一部の実施形態において、本発明は、癌がＮＳＣＬＣであることを提供する。一部の実施形態において、本発明は、癌が膠芽腫（ＧＢＭを含む）であることを提供する。一部の実施形態において、本発明は、癌が胃腸癌であることを提供する。一部の実施形態において、本発明は、癌が高頻度変異癌であることを提供する。一部の実施形態において、本発明は、癌が小児の高頻度変異癌であることを提供する。
[00165] 一部の実施形態において、本発明は、対象の癌を処置する方法であって、治療有効投与量の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を対象に投与することを含む方法における使用のための、上記及び本明細書に記載されたＴＩＬ組成物を提供する。一部の実施形態において、癌は、固形腫瘍である。一部の実施形態において、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、癌は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌からなる群から選択される。
[00166] 一部の実施形態において、本発明は、対象の癌を処置する方法であって、治療有効投与量の、上記及び本明細書に記載される腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、癌は、固形腫瘍である。一部の実施形態において、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。
[00167] 一部の実施形態において、癌は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、癌は、黒色腫である。一部の実施形態において、癌は、ＨＮＳＣＣである。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌である。一部の実施形態において、癌は、ＮＳＣＬＣである。一部の実施形態において、癌は、膠芽腫（ＧＢＭを含む）である。一部の実施形態において、癌は、胃腸癌である。一部の実施形態において、癌は、高頻度変異癌である。一部の実施形態において、癌は、小児の高頻度変異癌である。
[00168] 一部の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞を拡大培養する方法であって、（ａ）ドナーから得られた第１のＴ細胞集団の第１の初回刺激拡大培養を、第１のＴ細胞集団を培養して、増殖をもたらし、且つ第１のＴ細胞集団の活性化を初回刺激することによって実施すること；（ｂ）ステップ（ａ）で初回刺激された第１のＴ細胞集団の活性化が減衰し始めた後、第２のＴ細胞集団を得るために、第１のＴ細胞集団を培養して、増殖をもたらし、且つ第１のＴ細胞集団の活性化を追加刺激することにより、第１のＴ細胞集団の第２の急速拡大培養を実施すること；及び（ｃ）第２のＴ細胞集団を回収することを含む方法を提供する。
[00169] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）の第１の初回刺激拡大培養は、最大で７日間の期間中に実施される。
[00170] 一部の実施形態において、ステップ（ｂ）の第２の急速拡大培養は、最大で１１日間の期間中に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｂ）の第２の急速拡大培養は、最大で９日間の期間中に実施される。
[00171] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）の第１の初回刺激拡大培養は、７日間の期間中に実施され、及びステップ（ｂ）の第２の急速拡大培養は、９日間の期間中に実施される。
[00172] 一部の実施形態において、本明細書に記載の方法のステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団は、ＯＫＴ－３及びＩＬ－２を含む第１の培養培地中で培養される。
[00173] 一部の実施形態において、第１の培養培地は、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む。
[00174] 一部の実施形態において、本明細書に記載の方法のステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団は、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む第２の培養培地中で培養される。
[00175] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）における第１のＴ細胞集団は、第１のガス透過性表面を含む容器内の第１の培養培地中で培養され、第１の培養培地は、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団は、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、及び第１のＡＰＣ集団は、第１のガス透過性表面上に積層され、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団は、容器内の第２の培養培地中で培養され、第２の培養培地は、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団は、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、及び第２のＡＰＣ集団は、第１のガス透過性表面上に積層され、第２のＡＰＣ集団は、第１のＡＰＣ集団よりも大きい。
[00176] 一部の実施形態において、第２のＡＰＣ集団におけるＡＰＣの数と、第１のＡＰＣ集団におけるＡＰＣの数との比は、約２：１である。
[00177] 一部の実施形態において、第１のＡＰＣ集団のＡＰＣにおける数は、約２．５×１０８個であり、及び第２のＡＰＣ集団におけるＡＰＣの数は、約５×１０８個である。
[00178] 一部の実施形態において、本明細書に記載の方法のステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団は、第１のガス透過性表面上にＡＰＣの２つの層の平均厚さで積層される。
[00179] 一部の実施形態において、本明細書に記載の方法のステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団は、第１のガス透過性表面上にＡＰＣの４～８つの層の範囲の平均厚さで積層される。
[00180] 一部の実施形態において、ステップ（ｂ）において第１のガス透過性表面上に積層されたＡＰＣの層の平均数と、ステップ（ａ）において第１のガス透過性表面上に積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、２：１である。
[00181] 一部の実施形態において、ＡＰＣは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。
[00182] 一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、照射され、且つ第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性である。
[00183] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
[00184] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は、骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）である。
[00185] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である。
[00186] 前述の実施形態のいずれかにおいて、第１の初回刺激拡大培養におけるＯＫＴ－３濃度は、約３０ｎｇ／ｍＬであり、第２の急速拡大培養におけるＯＫＴ－３濃度は、約３０ｎｇ／ｍＬである。前述の実施形態のいずれかにおいて、第１の初回刺激拡大培養におけるＯＫＴ－３濃度は、約３０ｎｇ／ｍＬであり、第２の急速拡大培養におけるＯＫＴ－３濃度は、約６０ｎｇ／ｍＬである。
図面の簡単な説明
[00187]２Ａプロセス（約２２日のプロセス）及びＴＩＬ製造のためのＧｅｎ３プロセスの実施形態（約１４日～１６日プロセス）の比較を示す。 [00187]ステップＡ～Ｆの概要を提供する例示的なプロセスＧｅｎ３チャート（約１４日～１６日のプロセス）。 [00187]ステップＡ～Ｆの概要を提供する例示的なプロセスＧｅｎ３チャート（約１４日～１６日のプロセス）。 [00188]ＧＥＮ２（プロセス２Ａ）対ＧＥＮ３を比較するための実験的なフローチャートを提供する。 [00189]Ｍ１０８５Ｔ－Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスにおけるＴＩＬ製品の表現型の特性評価。 [00190]Ｍ１０８５Ｔ－Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスからのＴＩＬ製品のメモリーマーカー分析。 [00191]Ｌ４０５４活性化及び疲弊マーカー、ＣＤ４＋でゲーティング。 [00191]Ｌ４０５４活性化及び疲弊マーカー、ＣＤ８＋でゲーティング。 [00192]Ｌ４０５５活性化及び疲弊マーカー、ＣＤ４＋でゲーティング。 [00192]Ｌ４０５５活性化及び疲弊マーカー、ＣＤ８＋でゲーティング。 [00193]ＩＦＮγ産生（ｐｇ／ｍＬ）：Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスのためのＬ４０５４：ここで表される各バーは、刺激、無刺激及び培地対照のＩＦＮγレベルの平均＋ＳＥＭである。４５０ｎｍで測定された光学密度。 [00193]ＩＦＮγ産生（ｐｇ／ｍＬ）：Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスのためのＬ４０５５：ここで表される各バーは、刺激、無刺激及び培地対照のＩＦＮγレベルの平均＋ＳＥＭである。４５０ｎｍで測定された光学密度。 [00193]ＩＦＮγ産生（ｐｇ／ｍＬ）：Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスのためのＭ１０８５Ｔ：ここで表される各バーは、刺激、無刺激及び培地対照のＩＦＮγレベルの平均＋ＳＥＭである。４５０ｎｍで測定された光学密度。 [00194]細胞培養上清中のＩＬ－２濃度のＥＬＩＳＡ分析：Ｌ４０５４。ここで表される各バーは、使用済み培地のＩＬ－２レベルの平均値＋ＳＥＭである。４５０ｎｍで測定された光学密度。 [00194]細胞培養上清中のＩＬ－２濃度のＥＬＩＳＡ分析：Ｌ４０５５。ここで表される各バーは、使用済み培地のＩＬ－２レベルの平均値＋ＳＥＭである。４５０ｎｍで測定された光学密度。 [00195]使用済み培地中のグルコース及び乳酸（ｇ／Ｌ）の定量：グルコース：２つの腫瘍系統及び両方のプロセスでＲＥＰ拡大培養全体を通じてグルコースの減少が観察された。逆に、予想通り、乳酸の増加が観察された。グルコースの減少及び乳酸の増加の両方がＧｅｎ２及びＧｅｎ３プロセス間で同等であった。 [00195]使用済み培地中のグルコース及び乳酸（ｇ／Ｌ）の定量：乳酸：２つの腫瘍系統及び両方のプロセスでＲＥＰ拡大培養全体を通じてグルコースの減少が観察された。逆に、予想通り、乳酸の増加が観察された。グルコースの減少及び乳酸の増加の両方がＧｅｎ２及びＧｅｎ３プロセス間で同等であった。 [00196]Ｌ４０５４及びＬ４０５５の使用済み培地中のＬ－グルタミンの定量。 [00196]Ｌ４０５４及びＬ４０５５の使用済み培地におけるGlutaMAXの定量。 [00196]Ｌ４０５４及びＬ４０５５について使用済み培地中のアンモニアの定量。 [00197]テロメア長分析。相対テロメア長（ＲＴＬ）値は、DAKOキットを使用した対照細胞株（１３０１白血病細胞株）の１染色体／ゲノムあたりのテロメア蛍光のＧｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスにおける１染色体／ゲノムあたりの平均テロメア蛍光を示唆する。 [00198]Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３におけるＬ４０５４及びＬ４０５５のＴＩＬ最終産物のユニークＣＤＲ３配列分析。Ｇｅｎ２（例えば、２２日目）及びＧｅｎ３プロセス（例えば、１４～１６日目）の回収日に収集された１×１０６個の細胞から識別されたユニークＴＣＲＢクローン型の数を列に示す。Ｇｅｎ３は、サンプル内のユニークペプチドＣＤＲの数に基づき、Ｇｅｎ２と比較して高いクローン多様性を示している。 [00199]Ｌ４０５４ ＩＬで回収された最終細胞産物（Ｇｅｎ２（例えば、２２日目）及びＧｅｎ３プロセス（例えば、１４～１６日目））のユニークＣＤＲ３配列の頻度。 [00200]Ｌ４０５５ ＴＩＬで回収された最終細胞産物（Ｇｅｎ２（例えば、２２日目）及びＧｅｎ３プロセス（例えば、１４～１６日目））のユニークＣＤＲ３配列の頻度。 [00201]Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３におけるＬ４０５４及びＬ４０５５のＴＩＬ最終産物の多様性指数。シャノンエントロピー多様性インデックスは、比較についてより信頼性が高く、一般的な指標である。Ｇｅｎ３Ｌ４０５４及びＬ４０５５は、Ｇｅｎ２よりわずかに高い多様性を示した。 [00202]表２２に示されている７日目－Ｇｅｎ３ＲＥＰ開始の細胞数の生データ（下記の実施例５を参照されたい）。 [00203]表２２に示されている１１日目－Ｇｅｎ２ＲＥＰ開始及びＧｅｎ３スケールアップの細胞数の生データ（下記の実施例５を参照されたい）。 [00204]表２３に示されている１６日目－Ｇｅｎ２スケールアップ及びＧｅｎ３回収（例えば、１６日目）の細胞数の生データ（下記の実施例５を参照されたい）。 [00205]表２３に示されている２２日目－Ｇｅｎ２回収（例えば、２２日目）の細胞数の生データ（下記の実施例５を参照されたい）。Ｌ４０５４ Ｇｅｎ２の場合、研究の合計数であったため、LOVO後の数は、４つのフラスコに外挿された。１つのフラスコは、汚染されており、合計＝６７Ｅ＋１０で推定された。 [00206]図３Ａ、４Ａ及び４Ｂに示されたフローサイトメトリーの結果の生データ。 [00207]図３Ｃ及び４Ｃに示されたフローサイトメトリーの結果の生データ。 [00208]図５及び６に示されたフローサイトメトリーの結果の生データ。 [00209]図７に示されたＬ４０５４サンプルのＩＦＮγ生成アッセイ結果の生データ。 [00209]図７に示されたＬ４０５４サンプルのＩＦＮγ生成アッセイ結果の生データ。 [00210]図７に示されたＬ４０５５サンプルのＩＦＮγ生成アッセイ結果の生データ。 [00210]図７に示されたＬ４０５５サンプルのＩＦＮγ生成アッセイ結果の生データ。 [00211]図７に示されたＭ１０８５ＴサンプルのＩＦＮγ生成アッセイ結果の生データ。 [00211]図７に示されたＭ１０８５ＴサンプルのＩＦＮγ生成アッセイ結果の生データ。 [00212]図８に示されたＩＬ－２ＥＬＩＳＡアッセイ結果の生データ。 [00212]図８に示されたＩＬ－２ＥＬＩＳＡアッセイ結果の生データ。 [00213]図９及び図１０に示された代謝基質及び代謝分析の結果の生データ。 [00214]図１１に示された相対テロメア長分析結果の生データ。 [00215]図１２及び図１５に示されたユニークＣＤ３配列及びクローン多様性分析の結果の生データ。 [00216]さまざまなＧｅｎ２（２Ａプロセス）及びＧｅｎ３．１プロセスの実施形態の比較を示す。 [00217]Ｇｅｎ２、Ｇｅｎ２．１及びＧｅｎ３．０プロセスの実施形態のさまざまな特徴を説明する表。 [00218]Ｇｅｎ３．１と称される、Ｇｅｎ３プロセスの実施形態の培地条件の概要。 [00219]Ｇｅｎ２、Ｇｅｎ２．１及びＧｅｎ３．０プロセスの実施形態のさまざまな特徴を説明する表。 [00220]Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３．０プロセスの実施形態のさまざまな特徴を比較する表。 [00221]説明された拡大培養プロセスのさまざまな実施形態における培地の用途を提供する表。 [00222]表現型の比較：プロセスのＧｅｎ３．０及びＧｅｎ３．１の実施形態は、同等のＣＤ２８、ＣＤ２７及びＣＤ５７発現を示した。 [00223]Ｇｅｎ３の最終産物でのＩＦＮγのより高い生産量。両方のプロセスを比較するために、ＩＦＮγ分析（ＥＬＩＳＡによる）を凍結培養上清で評価した。各Ｇｅｎ２（例えば、２２日目）及びＧｅｎ３プロセス（例えば、１６日目）で新鮮なＴＩＬ産物を使用し、各腫瘍について、コーティングされた抗ＣＤ３プレートで一晩刺激である。ここで表される各バーは、刺激、無刺激及び培地対照のＩＦＮγレベルである。Ｌ４０５５を示す。 [00224]ＴＩＬ最終産物のユニークＣＤＲ３配列分析：Ｇｅｎ２（例えば、２２日目）及びＧｅｎ３プロセス（例えば、１４～１６日目）で収集された１×１０６個の細胞から識別されたユニークＴＣＲ Ｂクローン型の数を列に示す。Ｇｅｎ３は、サンプル内のユニークペプチドＣＤＲの数に基づき、Ｇｅｎ２と比較して高いクローン多様性を示している。 [00224]ＴＩＬ最終産物の多様性指数：シャノンエントロピー多様性指数は、比較についてより信頼性の高い一般的な指標である。Ｇｅｎ３は、Ｇｅｎ２よりわずかに高い多様性を示した。 [00225]１９９配列は、Ｇｅｎ３及びＧｅｎ２の最終産物間で共有され、Ｇｅｎ３の最終産物と共有されるＧｅｎ２からのユニークＣＤＲ３配列の上位８０％の９７．０７％に対応する。 [00226]１８３３配列は、Ｇｅｎ３及びＧｅｎ２の最終産物で共有され、Ｇｅｎ３最終産物と共有されるＧｅｎ２からのユニークＣＤＲ３配列の上位８０％の９９．４５％に対応する。 [00227]Ｇｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 [00228]Ｇｅｎ３プロセスを使用して、造血器腫瘍からＴＩＬを拡大培養する例示的な実施形態の概略図。０日目に、ポジティブ若しくはネガティブ選択方法、即ちＴ細胞マーカー（ＣＤ２、ＣＤ３など、又はＴ細胞を残した他の細胞の除去）を用いたＴ細胞の除去又は勾配遠心を使用して、リンパ球、全血又は腫瘍消化物（新鮮又は解凍）に富んだアフェレーシス産物からＴ細胞画分（ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋）を分離する。 [00229]プロセス２Ａに対するプロセス１Ｃの比較及びプロセス２Ａに従ってＴＩＬを拡大培養するための例示的な実施形態の概略図。 [00230]小生検プロセスに従ってＴＩＬを拡大培養するための異なるバージョンの概略図。（Ａ）はバージョン１を表し、拡大培養プロセスはステップＡ～Ｅから約２１～３３日間である。 [00230]小生検プロセスに従ってＴＩＬを拡大培養するための異なるバージョンの概略図。（Ｂ）はバージョン２を表し、拡大培養プロセスはステップＡ～Ｅから約１７～２４日間である。 [00230]小生検プロセスに従ってＴＩＬを拡大培養するための異なるバージョンの概略図。（Ｃ）は、バージョン１及び２のプロセス２Ａとの比較を表す。 [00231]リンパ腫腫瘍の病理情報を示す。 [00232]リンパ腫及び黒色腫ＴＩＬの異なるサブセットの比較を示し、これはリンパ腫ＴＩＬのエフェクターメモリー（ＥＭ）サブセットが黒色腫ＴＩＬのＥＭサブセットよりも有意に高いことを示している。ＴＥＭＲＡのＣＤ８＋サブセットを示す。 [00233]リンパ腫及び黒色腫ＴＩＬの異なるサブセットの比較を示し、これはリンパ腫ＴＩＬのＣＤ２８＋ＣＤ４＋サブセットが黒色腫ＴＩＬのこれらのサブセットよりも有意に高いことを示している。ＣＤ２８＋ＣＤ８＋サブセットを示す。 [00234]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬと黒色腫ＴＩＬのＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは分化マーカーを示している。グラフの赤線は中央値を表す。ＣＭはセントラルメモリーＴ細胞を指し、ＥＭはエフェクターメモリーＴ細胞を指し、ＴＥＭＲＡはエフェクターメモリーＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を指す。 [00235]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬと黒色腫ＴＩＬのＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは分化マーカーを示している。グラフの赤線は中央値を表す。ＣＭはセントラルメモリーＴ細胞を指し、ＥＭはエフェクターメモリーＴ細胞を指し、ＴＥＭＲＡはエフェクターメモリーＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を指す。 [00236]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬと黒色腫ＴＩＬのＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは枯渇マーカーを示している。グラフの赤線は中央値を表す。ＬＡＧ３はリンパ球活性化遺伝子３を指し、ＰＤ１はプログラム死１を指し、ＴＩＧＩＴはＩｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体を指す。 [00237]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬと黒色腫ＴＩＬのＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは枯渇マーカーを示している。グラフの赤線は中央値を表す。ＬＡＧ３はリンパ球活性化遺伝子３を指し、ＰＤ１はプログラム死１を指し、ＴＩＧＩＴはＩｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体を指す。 [00238]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬと黒色腫ＴＩＬとの間の細胞型の比較を示す。ＮＫはナチュラルキラー細胞を指し、ＴＣＲａｂはアルファ及びベータ鎖を有するＴ細胞受容体を発現する細胞を指す。 [00239]生物発光リダイレクト溶解アッセイ（ＢＲＬＡ）の結果を示す。 [00240]リンパ腫ＴＩＬ対黒色腫ＴＩＬのインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す。 [00241]リンパ腫ＴＩＬの酵素結合免疫スポット（ELIspot）アッセイの結果を示す。 [00242]黒色腫ＴＩＬのELIspotアッセイ結果を示す。 [00243]NANOSTRING NCOUNTER分析の結果を示し、これはリンパ腫ＴＩＬが、黒色腫ＴＩＬと比較して、より高いレベルのＲＯＲＣ ＩＬ１７Ａ（ＴＨ１７表現型）及びＧＡＴＡ３（Ｔｈ２表現型）を発現することを示している。各遺伝子は、ヒートマップの赤枠で強調表示される。 [00244]４－１ＢＢアゴニスト性融合タンパク質の構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂを示す。円柱は個々のポリペプチド結合ドメインを指す。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂは、例えば、４－１ＢＢＬ又は４－１ＢＢに結合する抗体に由来する３つの直鎖状に連結されたＴＮＦＲＳＦ結合ドメインを含み、これは折り畳まれて三価タンパク質を形成し、次いで、ＩｇＧ１－Ｆｃ（ＣＨ３及びＣＨ２ドメインを含む）を介して第２の三価タンパク質に連結され、次いで、これはジスルフィド結合（小さい細長い楕円形）を介して２つの三価タンパク質を連結するために使用され、構造を安定化し、６つの受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン及びシグナル伝達タンパク質をあわせてシグナル伝達複合体を形成できるアゴニストを提供する。円柱として示されるＴＮＦＲＳＦ結合ドメインは、例えば、親水性残基並びに柔軟性のためのＧｌｙ及びＳｅｒ配列並びに溶解性のためのＧｌｕ及びＬｙｓを含み得るリンカーにより接続されたＶＨ及びＶＬ鎖を含む、ｓｃＦｖドメインであり得る。
配列表の簡単な説明
[00245] 配列番号１は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
[00246] 配列番号２は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
[00247] 配列番号３は、組換えヒトＩＬ－２タンパク質のアミノ酸配列である。
[00248] 配列番号４は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
[00249] 配列番号５は、組換えヒトＩＬ－４タンパク質のアミノ酸配列である。
[00250] 配列番号６は、組換えヒトＩＬ－７タンパク質のアミノ酸配列である。
[00251] 配列番号７は、組換えヒトＩＬ－１５タンパク質のアミノ酸配列である。
[00252] 配列番号８は、組換えヒトＩＬ－２１タンパク質のアミノ酸配列である。
[00253] 配列番号９は、ヒト４－１ＢＢのアミノ酸配列である。
[00254] 配列番号１０は、マウス４－１ＢＢのアミノ酸配列である。
[00255] 配列番号１１は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖である。
[00256] 配列番号１２は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖である。
[00257] 配列番号１３は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00258] 配列番号１４は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00259] 配列番号１５は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ１である。
[00260] 配列番号１６は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ２である。
[00261] 配列番号１７は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ３である。
[00262] 配列番号１８は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00263] 配列番号１９は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00264] 配列番号２０は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00265] 配列番号２１は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖である。
[00266] 配列番号２２は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖である。
[00267] 配列番号２３は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00268] 配列番号２４は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00269] 配列番号２５は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ１である。
[00270] 配列番号２６は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ２である。
[00271] 配列番号２７は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ３である。
[00272] 配列番号２８は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00273] 配列番号２９は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00274] 配列番号３０は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00275] 配列番号３１は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のＦｃドメインである。
[00276] 配列番号３２は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00277] 配列番号３３は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00278] 配列番号３４は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00279] 配列番号３５は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00280] 配列番号３６は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00281] 配列番号３７は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00282] 配列番号３８は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00283] 配列番号３９は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00284] 配列番号４０は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00285] 配列番号４１は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00286] 配列番号４２は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のＦｃドメインである。
[00287] 配列番号４３は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00288] 配列番号４４は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00289] 配列番号４５は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00290] 配列番号４６は、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）アミノ酸配列である。
[00291] 配列番号４７は、４－１ＢＢＬポリペプチドの可溶性部分である。
[00292] 配列番号４８は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00293] 配列番号４９は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00294] 配列番号５０は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00295] 配列番号５１は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00296] 配列番号５２は、４－１ＢＢアゴニスト抗体Ｈ３９Ｅ３－２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00297] 配列番号５３は、４－１ＢＢアゴニスト抗体Ｈ３９Ｅ３－２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00298] 配列番号５４は、ヒトＯＸ４０のアミノ酸配列である。
[00299] 配列番号５５は、マウスＯＸ４０のアミノ酸配列である。
[00300] 配列番号５６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖である。
[00301] 配列番号５７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖である。
[00302] 配列番号５８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00303] 配列番号５９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00304] 配列番号６０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖ＣＤＲ１である。
[00305] 配列番号６１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖ＣＤＲ２である。
[00306] 配列番号６２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖ＣＤＲ３である。
[00307] 配列番号６３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00308] 配列番号６４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00309] 配列番号６５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00310] 配列番号６６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖である。
[00311] 配列番号６７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖である。
[00312] 配列番号６８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00313] 配列番号６９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00314] 配列番号７０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ１である。
[00315] 配列番号７１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ２である。
[00316] 配列番号７２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ３である。
[00317] 配列番号７３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00318] 配列番号７４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00319] 配列番号７５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00320] 配列番号７６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖である。
[00321] 配列番号７７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖である。
[00322] 配列番号７８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00323] 配列番号７９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00324] 配列番号８０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ１である。
[00325] 配列番号８１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ２である。
[00326] 配列番号８２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ３である。
[00327] 配列番号８３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00328] 配列番号８４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00329] 配列番号８５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00330] 配列番号８６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00331] 配列番号８７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00332] 配列番号８８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖ＣＤＲ１である。
[00333] 配列番号８９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖ＣＤＲ２である。
[00334] 配列番号９０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖ＣＤＲ３である。
[00335] 配列番号９１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00336] 配列番号９２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00337] 配列番号９３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00338] 配列番号９４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00339] 配列番号９５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00340] 配列番号９６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖ＣＤＲ１である。
[00341] 配列番号９７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖ＣＤＲ２である。
[00342] 配列番号９８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖ＣＤＲ３である。
[00343] 配列番号９９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00344] 配列番号１００は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00345] 配列番号１０１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00346] 配列番号１０２は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）アミノ酸配列である。
[00347] 配列番号１０３は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドの可溶性部分である。
[00348] 配列番号１０４は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドの代替的可溶性部分である。
[00349] 配列番号１０５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体００８の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00350] 配列番号１０６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体００８の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00351] 配列番号１０７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０１１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00352] 配列番号１０８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０１１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00353] 配列番号１０９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00354] 配列番号１１０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00355] 配列番号１１１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２３の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00356] 配列番号１１２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２３の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00357] 配列番号１１３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00358] 配列番号１１４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00359] 配列番号１１５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00360] 配列番号１１６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00361] 配列番号１１７は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00362] 配列番号１１８は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00363] 配列番号１１９は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00364] 配列番号１２０は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00365] 配列番号１２１は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00366] 配列番号１２２は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00367] 配列番号１２３は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00368] 配列番号１２４は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00369] 配列番号１２５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00370] 配列番号１２６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00371] 配列番号１２７ ヒトＩＬ－２Ｒβの部分配列、残基１～２３５。
[00372] 配列番号１２８ マウスＩＬ－２Ｒβの部分配列、残基１～２３８。
[00373] 配列番号１２９ マウスＩＬ－２。
[00374] 配列番号１３０ ヒトＩＬ－２。
[00375] 配列番号１３１ 直交性ヒトＩＬ－２の例。
[00376] 配列番号１３２ 直交性ヒトＩＬ－２の例。
[00377] 配列番号１３３ 直交性ヒトＩＬ－２の例。
[00378] 配列番号１３４ 直交性ヒトＩＬ－２の例。
[00379] 配列番号１３５ ヒトＩＬ２－Ｒβサブユニット。
[00380] 配列番号１３６～配列番号１５２ 部位特異的変異体ＩＬ－２ライブラリーの生成に有用なＰＣＲプライマー。
[00381] 配列番号１５３ ヒトＩＬ２－Ｒβサブユニット。
[00382] 配列番号１５４ ヒトＩＬ２－Ｒαサブユニット。
[00383] 配列番号１５５ ヒトＩＬ２－Ｒγサブユニット。
[00384] 配列番号１５６ ヒトＩＬ－２。
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
[00385] 他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及された全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に援用される。
[00386] 用語「インビボ」は、対象の体内で起こる事象を指す。
[00387] 用語「インビトロ」は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生細胞又は死細胞を利用した細胞ベースのアッセイを包含し、また、インタクトな細胞を利用しない無細胞アッセイも包含し得る。
[00388] 用語「エキソビボ」は、対象の体から摘出された細胞、組織及び／又は臓器の処置又は処置の実施を含む事象を指す。適切には、細胞、組織及び／又は臓器は、手術又は処置の方法で対象の体に戻される。
[00389] 用語「急速拡大培養」は、１週間の期間にわたって少なくとも約３倍（又は４倍、５倍、６倍、７倍、８倍又は９倍）、より好ましくは、１週間の期間にわたって少なくとも約１０倍（又は２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍又は９０倍）又は最も好ましくは、１週間の期間にわたって少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬの数の増加を意味する。複数の急速拡大培養プロトコルを以下に概説する。
[00390] 本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定はされないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬは、初代及び二次ＴＩＬの両方を含む。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説される通り患者組織サンプルから得られるものであり（「新鮮に得られた」又は「新鮮に回収された」と称されることもある）、及び「二次ＴＩＬ」は、限定はされないが、バルクＴＩＬ及び拡大培養ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」又は「ポストＲＥＰ ＴＩＬ」）を含め、本明細書で考察する通り拡大培養された又は成長した任意のＴＩＬ細胞集団である。ＴＩＬ細胞集団は、遺伝子改変ＴＩＬを含み得る。
[00391] 本明細書において「細胞集団」（ＴＩＬを含む）は、共通の形質を共有する多数の細胞を意味する。一般に、集団は、概して数が１×１０６～１×１０１０個の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は異なる数を含む。例えば、ＩＬ－２の存在下での初代ＴＩＬの初期成長は、およそ１×１０８個の細胞のバルクＴＩＬ集団をもたらす。ＲＥＰ拡大培養は、概して１．５×１０９～１．５×１０１０個の注入のための細胞集団が提供されるように行われる。一部の実施形態において、ＲＥＰ拡大培養は、２．３×１０１０～１３．７×１０１０個の集団を提供するために行われる。
[00392] 本明細書において「凍結保存ＴＩＬ」とは、初代、バルク又は拡大培養（ＲＥＰ ＴＩＬ）のいずれかのＴＩＬが約－１５０℃～－６０℃の範囲で処理及び保存されることを意味する。一般的な凍結保存方法は、実施例を含め、本明細書の他の部分にも記載される。明確にするために言えば、「凍結保存ＴＩＬ」は、初代ＴＩＬの供給源として用いられ得る凍結組織サンプルと区別可能なものである。
[00393] 本明細書において「解凍した凍結保存ＴＩＬ」とは、かつて凍結保存されていたが、次に処理により、限定はされないが細胞培養温度又はＴＩＬを患者に投与し得る温度を含め、室温以上に戻されたＴＩＬ集団を意味する。
[00394] ＴＩＬは、一般的に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に浸潤し処置に影響を及ぼすそれらの能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、一般に、以下のバイオマーカーの１つ以上を発現することによって分類することができる：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ αβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１及びＣＤ２５。加えて及び代わりに、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。
[00395] 用語「凍結保存培地（cryopreservation media）」又は「凍結保存培地（cryopreservation medium）」は、細胞の凍結保存に使用できる任意の培地を指す。かかる培地には、７％～１０％のＤＭＳＯを含む培地が含まれ得る。例示的培地には、CryoStor CS10、Hyperthermasol及びそれらの組み合わせが含まれる。用語「ＣＳ１０」は、Stemcell Technologies又はBiolife Solutionsから入手した凍結保存培地を指す。ＣＳ１０倍地は、商品名「CryoStor（登録商標）CS10」と称される場合がある。ＣＳ１０培地は、ＤＭＳＯを含む無血清、無動物成分培地である。
[00396] 用語「セントラルメモリーＴ細胞」は、ヒトではＣＤ４５Ｒ０＋であり、且つＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｈｉ）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２ｈｉ）を構成的に発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型には、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）及びＩＬ－１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ－６Ｂ、ＭＢＤ２及びＢＭＩ１が含まれる。セントラルメモリーＴ細胞はＴＣＲ惹起後にエフェクター分子としてＩＬ－２及びＣＤ４０Ｌを主に分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ４区画において優勢であり、ヒトではリンパ節及び扁桃腺において比例的に濃縮されている。
[00397] 用語「エフェクターメモリーＴ細胞」は、セントラルメモリーＴ細胞と同様にＣＤ４５Ｒ０＋であるが、ＣＣＲ７の構成的発現が欠損しており（ＣＣＲ７ｌｏ）、且つＣＤ６２Ｌ発現が不均一であるか又は低い（ＣＤ６２Ｌｌｏ）、ヒト又は哺乳類Ｔ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型には、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）及びＩＬ－１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＬＩＭＰ１が含まれる。エフェクターメモリーＴ細胞は、抗原刺激後に、インターフェロン－γ、ＩＬ－４及びＩＬ－５を含む、高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ８区画において優勢であり、ヒトでは肺、肝臓及び腸において比例的に濃縮されている。ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞は多量のパーフォリンを有する。
[00398] 用語「閉鎖系」は、外部環境に対して閉鎖されている系を指す。本発明の方法では、細胞培養方法に適切な任意の閉鎖系を用いることができる。閉鎖系としては、例えば、限定はされないが、閉鎖型Ｇコンテナが挙げられる。閉鎖系に腫瘍セグメントが加えられた後は、ＴＩＬの患者への投与直前までこの系は外部環境に対して開放されない。
[00399] 腫瘍を破砕するプロセスを説明するために本明細書で使用される「断片化」、「断片」及び「断片化された」という用語には、腫瘍組織の破砕、スライス、分割及び細切並びに腫瘍組織の物理的構造を破砕する任意の他の方法などの機械的断片化方法が含まれる。
[00400] 用語「末梢血単核球」及び「ＰＢＭＣ」は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球を含めた、円形の核を有する末梢血細胞を指す。抗原提示細胞（ＰＢＭＣは、抗原提示細胞の一種である）として使用される場合、末梢血単核球は、照射された同種異系末梢血単核球である。
[00401] 「末梢血リンパ球」及び「ＰＢＬ」という用語は、末梢血から拡大培養したＴ細胞を指す。一部の実施形態において、ＰＢＬは、ドナーからの全血又はアフェレーシス産物から分離される。一部の実施形態において、ＰＢＬは、ＣＤ３＋ＣＤ４５＋のＴ細胞表現型など、Ｔ細胞表現型のポジティブ選択又はネガティブ選択により、ドナーからの全血又はアフェレーシス産物から分離される。
[00402] 用語「抗ＣＤ３抗体」は、抗体又はその変異体、例えばモノクローナル抗体であって、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含むものを指す。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ－３が含まれる。抗ＣＤ３抗体には、Ｔ３及びＣＤ３εとしても知られるＵＨＣＴ１クローンも含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ及びビジリズマブが含まれる。
[00403] 用語「ＯＫＴ－３」（本明細書では「ＯＫＴ３」とも称される）は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体中のＣＤ３受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含む、モノクローナル抗体若しくはバイオシミラー又はその変異体を指し、ＯＫＴ－３（３０ｎｇ／ｍＬ、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA）及びムロモナブ又はそれらの変異体、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム若しくはバイオシミラーなどの市販の形態を含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表１に示す（配列番号１及び配列番号２）。ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマは、American Type Culture Collectionに寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ ８００１が割り当てられている。ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマもEuropean Collection of Authenticated Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）に寄託されており、カタログ番号８６０２２７０６が割り当てられている。
Figure 2022514023000001
[00404] 用語「ＩＬ－２」（本明細書では「ＩＬ２」とも称される）は、インターロイキン－２として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びそれらの変異体を含む全ての形態のＩＬ－２を含む。ＩＬ－２は、例えば、Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88及びMalek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79に記載され、その開示は参照により本明細書に援用される。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－２のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号３）。例えば、ＩＬ－２という用語は、アルデスロイキン（PROLEUKIN、１単回使用バイアルあたり２２００万ＩＵで複数の供給元から市販されている）並びにCellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA（CELLGRO GMP）又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２０９－ｂ）から市販で供給される組換えＩＬ－２の形態及び他の販売業者からの他の市販の同等物などのＩＬ－２のヒト組換え型を包含する。アルデスロイキン（デス－アラニル－１、セリン－１２５ヒトＩＬ－２）は、分子量およそ１５ｋＤａの非グリコシル化ヒト組換え型ＩＬ－２である。本発明における使用に適したアルデスロイキンのアミノ酸配列を表２に示す（配列番号４）。ＩＬ－２という用語は、本明細書に記載されているように、Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USAから入手可能なペグ化ＩＬ２プロドラッグＮＫＴＲ－２１４も含む、ペグ化形態のＩＬ－２も包含する。本発明での使用に好適なＮＫＴＲ－２１４及びペグ化ＩＬ－２が米国特許出願公開第２０１４／０３２８７９１ Ａ１号及び国際公開第２０１２／０６５０８６ Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。本発明での使用に適したコンジュゲートＩＬ－２の代替形態は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号及び同第４９０２，５０２号に記載され、その開示は参照により本明細書に援用される。本発明における使用に適したＩＬ－２の製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
[00405] 直交性ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２と等しい単位で投与される。直交性ＩＬ－２が野生型ＩＬ－２に対し代替される場合、直交性ＩＬ－２の国際単位（ＩＵ）に関して同じ用量が使用される。
Figure 2022514023000002
[00406] 「ＩＬ－２Ｒ」という用語は、ヘテロ三量体ＩＬ－２サイトカイン受容体を指す。ＩＬ－２Ｒは、α（アルファ）（ＩＬ－２Ｒα、ＣＤ２５又はＴａｃ抗原とも呼ばれる）、β（ベータ）（ＩＬ－２Ｒβ又はＣＤ１２２とも呼ばれる）及びγ（ガンマ）（ＩＬ－２Ｒγ、γｃ、共通ガンマ鎖又はＣＤ１３２とも呼ばれる）を含み；これらのサブユニットは、他のサイトカインの受容体の一部でもある。ヒトＩＬ－２Ｒβの成熟（即ちシグナルペプチドが切断された）５２５アミノ酸配列を以下の表に示す。ヒトＩＬ－２Ｒα及びヒトＩＬ－２Ｒγの標準配列も示される。
Figure 2022514023000003
[00407] 用語「ＩＬ－４」（本明細書では「ＩＬ４」とも称される）は、インターロイキン４として知られるサイトカインを指し、これは、Ｔｈ２ Ｔ細胞により、且つ好酸球、好塩基球及び肥満細胞により産生される。ＩＬ－４は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）からＴｈ２ Ｔ細胞への分化を調節する。Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70。ＩＬ－４によって活性化されると、Ｔｈ２ Ｔ細胞は続いてポジティブフィードバックループにおいて、更なるＩＬ－４を産生する。ＩＬ－４はまた、Ｂ細胞拡大培養及びクラスＩＩ ＭＨＣ発現を刺激し、Ｂ細胞からのＩｇＥ及びＩｇＧ１発現へのクラス切り替えを誘導する。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－４は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２１１）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＣＴＰ００４３）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－４のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号５）。
[00408] 用語「ＩＬ－７」（本明細書では「ＩＬ７」とも称される）は、インターロイキン７として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは間質及び上皮細胞並びに樹状細胞から入手し得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。ＩＬ－７は、Ｔ細胞の発生を刺激することができる。ＩＬ－７は、胸腺内のＴ細胞発生及び末梢内での生存に重要な一連のシグナルにおいて、ＩＬ－７受容体アルファ及び一般的なガンマ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるＩＬ－７受容体に結合する。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－７は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２５４）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＰＨＣ００７１）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－７のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号６）。
[00409] 用語「ＩＬ－１５」（本明細書では「ＩＬ１５」とも称される）は、インターロイキン－１５として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びそれらの変異体を含む全ての形態のＩＬ－２を含む。ＩＬ－１５は、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32に記載され、その開示は参照により本明細書に援用される。ＩＬ－１５は、β及びγシグナル伝達受容体サブユニットをＩＬ－２と共有する。組換えヒトＩＬ－１５は、分子量１２．８ｋＤａの１１４個のアミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－１５は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２３０－ｂ）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号３４－８１５９－８２）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－１５のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号７）。
[00410] 用語「ＩＬ－２１」（本明細書では「ＩＬ２１」とも称される）は、インターロイキン－２１として知られる多面発現性サイトカインタンパク質を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びそれらの変異体を含む全ての形態のＩＬ－２１を含む。ＩＬ－２１は、例えば、Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95に記載され、その開示は参照により本明細書に援用される。ＩＬ－２１は、主にナチュラルキラーＴ細胞及び活性化ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞によって産生される。組換えヒトＩＬ－２１は、分子量１５．４ｋＤａの１３２個のアミノ酸を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－２１は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－４０８－ｂ）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ－２１組換えタンパク質、カタログ番号１４－８２１９－８０）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－２１のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号８）。
[00411] 「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」又は「治療量」が指示されるとき、本発明の組成物の正確な量は、医師が、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度及び患者（対象）の状態の個体差を考慮して決定することができる。概して、本明細書に記載される腫瘍浸潤リンパ球（例えば、二次ＴＩＬ又は遺伝子改変された細胞傷害性リンパ球）を含む医薬組成物は１０４～１０１１細胞／ｋｇ体重（例えば、１０５～１０６、１０５～１０１０、１０５～１０１１、１０６～１０１０、１０６～１０１１、１０７～１０１１、１０７～１０１０、１０８～１０１１、１０８～１０１０、１０９～１０１１又は１０９～１０１０細胞／ｋｇ体重）（これらの範囲内にある全ての整数値を含む）の投与量で投与され得ると言うことができる。腫瘍浸潤リンパ球（場合によっては遺伝子改変された細胞傷害性リンパ球を含む）組成物はまた、これらの投与量で複数回投与され得る。腫瘍浸潤リンパ球（ある場合には、遺伝子改変された細胞傷害性リンパ球を含む）は、免疫療法で一般に公知の注入技法を用いることにより投与し得る（例えば、Rosenberg et al., New Eng.J.of Med.319: 1676, 1988を参照のこと）。特定の患者に対する最適な投与量及び処置レジメンは、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて処置を調整することにより、医学の当業者によって容易に決定され得る。
[00412] 「血液悪性腫瘍（hematological malignancy）」、「血液悪性腫瘍（hematologic malignancy）」という用語又は相関する意味の用語は、血液、骨髄、リンパ節及びリンパ系の組織を含むが、これらに限定されない、哺乳動物の癌及び造血系及びリンパ系組織の腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液性腫瘍」とも称される。血液悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。「Ｂ細胞血液悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。
[00413] 用語「固形腫瘍」は、嚢胞又は液体領域を通常含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。用語「固形腫瘍癌」は、悪性、新生物性又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌及び膀胱癌などの肉腫、癌腫及びリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（癌細胞）を含む相互依存的組織コンパートメント及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
[00414] 「液性腫瘍」という用語は、本来流動性である異常な細胞塊を指す。液性腫瘍癌としては、白血病、骨髄腫及びリンパ腫並びに他の血液悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。液性腫瘍から得られたＴＩＬは、本明細書では骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）とも称される。末梢血中を循環する液性腫瘍を含む液性腫瘍から得られたＴＩＬは、本明細書ではＰＢＬとも称され得る。ＭＩＬ、ＴＩＬ及びＰＢＬという用語は、本明細書において互換的に使用され、細胞が由来する組織タイプによってのみ異なる。
[00415] 本明細書で使用される「微小環境」という用語は、全体としての固形若しくは血液腫瘍微小環境又は微小環境内の細胞の個々のサブセットを指し得る。本明細書で使用される腫瘍微小環境は、Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473に記載されているように、「新生物性形質転換を促進し、腫瘍の成長及び浸潤をサポートし、腫瘍を宿主の免疫から保護し、治療抵抗性を培い、優勢な転移を成功させるニッチを提供する、細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス及び機械的手がかり」の複合的な混合物を指す。腫瘍はＴ細胞によって認識されるべき抗原を発現するが、免疫系による腫瘍の排除は、微小環境による免疫抑制のため、希少である。
[00416] 一実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を治療する方法を含み、ここで、患者は、本発明に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一部の実施形態において、ＴＩＬ集団が提供され得、ここで、患者は、本発明に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入の２７～２３日前）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本発明に係るｒＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２の静脈内注入を受ける。
[00417] 実験的知見は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素（「サイトカインシンク」）を排除することによって処置効果を高めるのに重要な役割を果たすことを示す。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のｒＴＩＬを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。
[00418] 本明細書で使用される「共投与」、「共投与すること」、「～と組み合わせて投与される」、「～と組み合わせて投与すること」、「同時（simultaneous）」及び「同時（concurrent）」という用語は、両方の活性医薬成分及び／又はそれらの代謝産物が同時に対象内に存在するための、２つ以上の活性医薬成分（本発明の好ましい実施形態において、例えば、複数のＴＩＬと組み合わせた少なくとも１つのカリウムチャネルアゴニスト）の対象への投与を包含する。共投与には、別々の組成物中での同時投与、別々の組成物中での異なる時点における投与又は２つ以上の活性医薬成分が存在する組成物での投与が含まれる。別々の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。
[00419] 用語「有効量」又は「治療有効量」は、疾患処置を含むが、これに限定されない、意図された用途を達成するのに十分な、本明細書に記載の化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図される用途（インビトロ又はインビボ）又は処置されている対象及び疾患状態（例えば、対象の体重、年齢及び性別）、疾患状態の重症度又は投与方法によって変動し得る。この用語は、標的細胞において特定の応答（例えば、血小板接着及び／又は細胞遊走の減少）を誘発する用量にも適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織及び化合物が運ばれる物理的送達システムによって変動する。
[00420] 用語「処置」、「処置している」、「処置する」などは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を達成することを指す。効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に防ぐという意味で予防的であり得、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用を部分的に又は完全に治癒するという意味で治療的であり得る。「処置」は、本明細書で使用されるとき、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、まだそれを有するとは診断されてない対象において疾患の発生を防ぐこと；（ｂ）疾患を阻害すること、即ちその発症又は進行を止めること；及び（ｃ）疾患を軽減すること、即ち疾患の退縮を生じさせること及び／又は１つ以上の疾患症状を軽減することが含まれる。「処置」は、疾患又は病態がない場合でも、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達を包含することも意図される。例えば、「処置」は、例えばワクチンの場合、疾患状態がない中で免疫応答を誘発し又は免疫を付与することのできる組成物の送達を包含する。
[00421] 核酸又はタンパク質の部分に関して使用される場合の「異種」という用語は、その核酸又はタンパク質が、天然には互いに同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換え的に産生され、新しい機能性核酸を作成するように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列、例えば、１つの供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコーディング領域又は異なる供給源からのコーディング領域を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、天然には互いに同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
[00422] ２つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈における「配列同一性」、「パーセント同一性」及び「配列パーセント同一性」（又はそれらの同義語、例えば「９９％同一」）という用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大限の対応について比較し、整合させた場合に（必要であればギャップを導入する）、同じであるか、同じヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する、２つ以上の配列又は部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用するか、又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを入手するために使用することができる様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当技術分野において公知である。パーセント配列同一性を決定するための適切なプログラムには、例えば、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のＢＬＡＳＴウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴプログラム一式が含まれる。２つの配列間の比較は、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用される一方、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。ALIGN、ALIGN-2（Genentech, South San Francisco, California）又はDNASTARから入手可能なMegAlignは、配列を整合するために使用することができる、公に入手可能な更なるソフトウェアプログラムである。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによって最大アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
[00423] 本明細書で使用される「変異体」という用語は、参照抗体、タンパク質又は融合タンパク質のアミノ酸配列内又はそれに隣接する特定の位置での１つ以上の置換、欠失及び／又は付加により、参照タンパク質、抗体又は融合タンパク質のアミノ酸配列と異なる、アミノ酸配列を含むタンパク質、抗体又は融合タンパク質を包含するが、これに限定されるものではない。変異体は、参照抗体、タンパク質又は融合タンパク質のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列中に１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電又は非荷電であるアミノ酸の置換を含み得る。変異体は、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。変異体という用語は、ペグ化抗体又はタンパク質も含む。
[00424] 本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定はされないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬは、初代及び二次ＴＩＬの両方を含む。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説される通り患者組織サンプルから得られるものであり（「新鮮に得られた」又は「新鮮に回収された」と称されることもある）、及び「二次ＴＩＬ」は、限定はされないが、バルクＴＩＬ、拡大培養ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」）並びに本明細書で考察する通りの「ｒｅＲＥＰ ＴＩＬ」を含め、本明細書で考察する通り拡大培養された又は成長した任意のＴＩＬ細胞集団である。ｒｅＲＥＰ ＴＩＬは、例えば、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含む、図１のステップＤに記載されたものなど）を含み得る。
[00425] ＴＩＬは、一般的に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に浸潤し処置に影響を及ぼすそれらの能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、一般的に、次のバイオマーカー：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ αβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１及びＣＤ２５の１つ以上を発現することによって分類することができる。加えて及び代わりに、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、更に効力によって特徴付けられ得 － 例えば、ＴＩＬは、例えばインターフェロン（ＩＦＮ）遊離が約５０ｐｇ／ｍＬより高い、約１００ｐｇ／ｍＬより高い、約１５０ｐｇ／ｍＬより高い又は約２００ｐｇ／ｍＬより高い場合に効力があるとみなすことができる。
[00426] 用語「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」は、ありとあらゆる溶媒、分散剤、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤並びに不活性成分を含むものとする。活性医薬成分のためのかかる薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤が活性医薬成分と適合しない場合を除いて、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の活性医薬成分も記載の組成物及び方法に組み込むことができる。
[00427] 「オルソログ」、「オルソログサイトカイン／受容体対」、「直交性サイトカイン／受容体対」又は「操作されたサイトカイン／受容体対」は、（ａ）天然サイトカイン又は同族受容体への結合の欠如；及び（ｂ）対応する操作された（直交性）リガンド又は受容体に特異的に結合することに対するアミノ酸変化によって修飾される遺伝子操作されたタンパク質の対を指す。結合すると、直交性受容体は、天然の細胞要素を介して伝達されるシグナル伝達を活性化して、その天然の応答を模倣する生物学的活性を提供するが、これは、直交性受容体を発現する操作された細胞に特異的なものである。直交性受容体は、直交性サイトカインの天然の対応物を含む内因性の対応するサイトカインに結合しない一方、直交性サイトカインは、直交性受容体の天然の対応物を含むいかなる内因性受容体にも結合しない。一部の実施形態において、直交性受容体に対する直交性サイトカインの親和性は、天然受容体に対する天然サイトカインの親和性と同等であり、例えば、天然サイトカイン受容体対の親和性の少なくとも約１％である親和性を有し、天然受容体に対する天然サイトカインの親和性の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％及びそれより高いことができる（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍又はそれを超える）。
[00428] 本明細書で使用される場合、「結合しない」又は「結合できない」は、検出可能な結合がないか、又は有意でない結合、即ち天然リガンドの結合親和性よりもはるかに低い結合親和性を有することを指す。親和性は、様々な濃度の非標識リガンドの存在下で、単一濃度の標識リガンドとの受容体の結合を測定する競合的結合実験で決定することができる。典型的には、非標識リガンドの濃度は少なくとも６桁を超える振れ幅で変化する。競合的結合実験を通じて、ＩＣ５０を決定することができる。本明細書で使用される場合、「ＩＣ５０」は、受容体と標識リガンドとの間の会合の５０％阻害に必要とされる非標識リガンドの濃度を指す。ＩＣ５０は、リガンド－受容体結合親和性の指標である。低ＩＣ５０は高親和性を表し、高ＩＣ５０は低親和性を表す。
[00429] 用語「約」及び「およそ」は、統計的に意味のある値の範囲内を指す。かかる範囲は、所定の値又は範囲の一桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、更により好ましくは１０％以内、更により好ましくは５％以内であり得る。用語「約」又は「およそ」に含まれる許容変動は、研究中の特定の系に依存し、当業者に容易に理解できる。更に、本明細書で使用される場合、用語「約」及び「およそ」は、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状及び他の量及び特性が正確ではなく、且つ正確である必要がないことを意味するが、近似及び／又はより大きい又はより小さい場合があり、必要に応じて、公差、変換係数、四捨五入、測定誤差など、及び当業者に公知の他の因子を反映する。一般に、寸法、サイズ、製剤、パラメータ、形状又は他の量若しくは特性は、明示的にそうであると明記されているか否かにかかわらず、「約」又は「およそ」である。大きく異なるサイズ、形状及び寸法の実施形態が、記載された用語を引用する場合があることに留意されたい。
[00430] 添付の特許請求の範囲で使用される場合、「を含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という移行用語は、記載されていない追加の請求要素又はステップがある場合、それらが特許請求の範囲から除外されることに関して、元の形式及び修正された形式で、特許請求の範囲を定義する。用語「を含む」は、包括的又は無制限であることを意図しており、追加の、引用されていない要素、方法、ステップ又は材料を除外するものではない。用語「からなる」は、特許請求の範囲で指定されたもの以外の任意の要素、ステップ又は材料を除外し、後者の場合、指定された材料に関連する通常の不純物を除外する。用語「から本質的になる」は、特許請求の範囲を特定の要素、ステップ又は材料及び請求された発明の基本的及び新規の特性に実質的に影響しないものに限定する。本発明を具体化する本明細書に記載の全ての組成物、方法及びキットは、代替実施形態において、「を含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という移行用語のいずれかによってより具体的に定義され得る。
ＩＩ．ＴＩＬ製造プロセス
[00431] いかなる特定の理論にも限定されるものではないが、Ｔ細胞の活性化を初回刺激する第１の初回刺激拡大培養と、それに続く本発明の方法に記載されているようにＴ細胞の活性化を追加刺激する第２の急速拡大培養は、「より幼若な」表現型を保持する拡大培養されたＴ細胞の調製を可能にすると考えられ、従って、本発明の拡大培養されたＴ細胞は、他の方法によって拡大培養されたＴ細胞よりも、癌細胞に対してより大きい細胞傷害性を示すことが予想される。特に、本発明の方法によって教示されるように、抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ－３）、ＩＬ－２及び任意選択により抗原提示細胞（ＡＰＣ）への曝露により初回刺激され、次いで、追加の抗ＣＤ－３抗体（例えば、ＯＫＴ－３）、ＩＬ－２及びＡＰＣへのその後の曝露によって追加刺激される、Ｔ細胞の活性化は、培養中のＴ細胞の成熟を制限又は回避し、成熟度の低い表現型を有するＴ細胞集団を生成し、このＴ細胞は培養物中で拡大培養による枯渇が少なく、癌細胞に対してより高い細胞傷害性を示すと考えられる。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップは、（ａ）Ｔ細胞を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ内の小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）小スケール培養物中のＴ細胞を第１の容器よりも大きい第２の容器、例えばG-REX 500MCSコンテナに移し、小スケール培養物からのＴ細胞を、第２の容器内のより大きいスケールの培養物中で、約４～７日間の期間にわたり培養することにより、培養物のスケールアップを達成するために複数のステップに分割される。一部の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（ａ）Ｔ細胞を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、第１の小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）第１の小スケール培養物からのＴ細胞を、サイズが第１の容器と同じである、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することであって、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された第１の小スケール培養物からのＴ細胞の一部は、約４～７日間の期間にわたり、第２の小スケール培養物中で培養されることにより、培養物のスケールアウトを達成するために複数のステップに分割される。一部の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（ａ）Ｔ細胞を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）小スケール培養物からのＴ細胞を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することであって、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された小スケール培養物からのＴ細胞の一部は、約４～７日間の期間にわたり、より大きいスケール培養物中で培養されることにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割される。一部の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（ａ）Ｔ細胞を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）小スケール培養物からのＴ細胞を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、２、３又は４個の第２の容器に移し、配分することであって、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された小スケール培養物からのＴ細胞の一部は、約５日間の期間にわたり、より大きいスケール培養物中で培養されることにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割される。
[00432] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養によってもたらされるＴ細胞の活性化が減少、減弱、減衰又は鎮静し始めた後に、第２の急速拡大培養が実施される。
[00433] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養によってもたらされるＴ細胞の活性化が１若しくは約１、２若しくは約２、３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９、１０若しくは約１０、１１若しくは約１１、１２若しくは約１２、１３若しくは約１３、１４若しくは約１４、１５若しくは約１５、１６若しくは約１６、１７若しくは約１７、１８若しくは約１８、１９若しくは約１９、２０若しくは約２０、２１若しくは約２１、２２若しくは約２２、２３若しくは約２３、２４若しくは約２４、２５若しくは約２５、２６若しくは約２６、２７若しくは約２７、２８若しくは約２８、２９若しくは約２９、３０若しくは約３０、３１若しくは約３１、３２若しくは約３２、３３若しくは約３３、３４若しくは約３４、３５若しくは約３５、３６若しくは約３６、３７若しくは約３７、３８若しくは約３８、３９若しくは約３９、４０若しくは約４０、４１若しくは約４１、４２若しくは約４２、４３若しくは約４３、４４若しくは約４４、４５若しくは約４５、４６若しくは約４６、４７若しくは約４７、４８若しくは約４８、４９若しくは約４９、５０若しくは約５０、５１若しくは約５１、５２若しくは約５２、５３若しくは約５３、５４若しくは約５４、５５若しくは約５５、５６若しくは約５６、５７若しくは約５７、５８若しくは約５８、５９若しくは約５９、６０若しくは約６０、６１若しくは約６１、６２若しくは約６２、６３若しくは約６３、６４若しくは約６４、６５若しくは約６５、６６若しくは約６６、６７若しくは約６７、６８若しくは約６８、６９若しくは約６９、７０若しくは約７０、７１若しくは約７１、７２若しくは約７２、７３若しくは約７３、７４若しくは約７４、７５若しくは約７５、７６若しくは約７６、７７若しくは約７７、７８若しくは約７８、７９若しくは約７９、８０若しくは約８０、８１若しくは約８１、８２若しくは約８２、８３若しくは約８３、８４若しくは約８４、８５若しくは約８５、８６若しくは約８６、８７若しくは約８７、８８若しくは約８８、８９若しくは約８９、９０若しくは約９０、９１若しくは約９１、９２若しくは約９２、９３若しくは約９３、９４若しくは約９４、９５若しくは約９５、９６若しくは約９６、９７若しくは約９７、９８若しくは約９８、９９若しくは約９９又は１００若しくは約１００％減少した後に、第２の急速拡大培養が実施される。
[00434] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養によってもたらされるＴ細胞の活性化が１％又は約１％～１００％又は約１００％の範囲のパーセンテージで減少した後に、第２の急速拡大培養が実施される。
[00435] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養によってもたらされるＴ細胞の活性化が１％若しくは約１％～１０％若しくは約１０％、１０％若しくは約１０％～２０％若しくは約２０％、２０％若しくは約２０％～３０％若しくは約３０％、３０％若しくは約３０％～４０％若しくは約４０％、４０％若しくは約４０％～５０％若しくは約５０％、５０％若しくは約５０％～６０％若しくは約６０％、６０％若しくは約６０％～７０％若しくは約７０％、７０％若しくは約７０％～８０％若しくは約８０％、８０％若しくは約８０％～９０％若しくは約９０％又は９０％若しくは約９０％～１００％若しくは約１００％の範囲のパーセンテージで減少した後に、第２の急速拡大培養が実施される。
[00436] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養によってもたらされるＴ細胞の活性化が、少なくとも１若しくは約１、２若しくは約２、３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９、１０若しくは約１０、１１若しくは約１１、１２若しくは約１２、１３若しくは約１３、１４若しくは約１４、１５若しくは約１５、１６若しくは約１６、１７若しくは約１７、１８若しくは約１８、１９若しくは約１９、２０若しくは約２０、２１若しくは約２１、２２若しくは約２２、２３若しくは約２３、２４若しくは約２４、２５若しくは約２５、２６若しくは約２６、２７若しくは約２７、２８若しくは約２８、２９若しくは約２９、３０若しくは約３０、３１若しくは約３１、３２若しくは約３２、３３若しくは約３３、３４若しくは約３４、３５若しくは約３５、３６若しくは約３６、３７若しくは約３７、３８若しくは約３８、３９若しくは約３９、４０若しくは約４０、４１若しくは約４１、４２若しくは約４２、４３若しくは約４３、４４若しくは約４４、４５若しくは約４５、４６若しくは約４６、４７若しくは約４７、４８若しくは約４８、４９若しくは約４９、５０若しくは約５０、５１若しくは約５１、５２若しくは約５２、５３若しくは約５３、５４若しくは約５４、５５若しくは約５５、５６若しくは約５６、５７若しくは約５７、５８若しくは約５８、５９若しくは約５９、６０若しくは約６０、６１若しくは約６１、６２若しくは約６２、６３若しくは約６３、６４若しくは約６４、６５若しくは約６５、６６若しくは約６６、６７若しくは約６７、６８若しくは約６８、６９若しくは約６９、７０若しくは約７０、７１若しくは約７１、７２若しくは約７２、７３若しくは約７３、７４若しくは約７４、７５若しくは約７５、７６若しくは約７６、７７若しくは約７７、７８若しくは約７８、７９若しくは約７９、８０若しくは約８０、８１若しくは約８１、８２若しくは約８２、８３若しくは約８３、８４若しくは約８４、８５若しくは約８５、８６若しくは約８６、８７若しくは約８７、８８若しくは約８８、８９若しくは約８９、９０若しくは約９０、９１若しくは約９１、９２若しくは約９２、９３若しくは約９３、９４若しくは約９４、９５若しくは約９５、９６若しくは約９６、９７若しくは約９７、９８若しくは約９８又は９９若しくは約９９％減少した後に、第２の急速拡大培養が実施される。
[00437] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養によってもたらされるＴ細胞の活性化が最大１若しくは約１、２若しくは約２、３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９、１０若しくは約１０、１１若しくは約１１、１２若しくは約１２、１３若しくは約１３、１４若しくは約１４、１５若しくは約１５、１６若しくは約１６、１７若しくは約１７、１８若しくは約１８、１９若しくは約１９、２０若しくは約２０、２１若しくは約２１、２２若しくは約２２、２３若しくは約２３、２４若しくは約２４、２５若しくは約２５、２６若しくは約２６、２７若しくは約２７、２８若しくは約２８、２９若しくは約２９、３０若しくは約３０、３１若しくは約３１、３２若しくは約３２、３３若しくは約３３、３４若しくは約３４、３５若しくは約３５、３６若しくは約３６、３７若しくは約３７、３８若しくは約３８、３９若しくは約３９、４０若しくは約４０、４１若しくは約４１、４２若しくは約４２、４３若しくは約４３、４４若しくは約４４、４５若しくは約４５、４６若しくは約４６、４７若しくは約４７、４８若しくは約４８、４９若しくは約４９、５０若しくは約５０、５１若しくは約５１、５２若しくは約５２、５３若しくは約５３、５４若しくは約５４、５５若しくは約５５、５６若しくは約５６、５７若しくは約５７、５８若しくは約５８、５９若しくは約５９、６０若しくは約６０、６１若しくは約６１、６２若しくは約６２、６３若しくは約６３、６４若しくは約６４、６５若しくは約６５、６６若しくは約６６、６７若しくは約６７、６８若しくは約６８、６９若しくは約６９、７０若しくは約７０、７１若しくは約７１、７２若しくは約７２、７３若しくは約７３、７４若しくは約７４、７５若しくは約７５、７６若しくは約７６、７７若しくは約７７、７８若しくは約７８、７９若しくは約７９、８０若しくは約８０、８１若しくは約８１、８２若しくは約８２、８３若しくは約８３、８４若しくは約８４、８５若しくは約８５、８６若しくは約８６、８７若しくは約８７、８８若しくは約８８、８９若しくは約８９、９０若しくは約９０、９１若しくは約９１、９２若しくは約９２、９３若しくは約９３、９４若しくは約９４、９５若しくは約９５、９６若しくは約９６、９７若しくは約９７、９８若しくは約９８、９９若しくは約９９又は１００若しくは約１００％減少した後に、第２の急速拡大培養が実施される。
[00438] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養によってもたらされるＴ細胞の活性化の減少は、抗原による刺激に応答してＴ細胞によって放出されるインターフェロンガンマの量の減少によって決定される。
[00439] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、最大で７日間又は約７日間の期間中に実施される。
[00440] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、最大で１日間若しくは約１日間、２日間若しくは約２日間、３日間若しくは約３日間、４日間若しくは約４日間、５日間若しくは約５日間、６日間若しくは約６日間、７日間若しくは約７日間又は８日間若しくは約８日間の期間中に実施される。
[00441] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間又は８日間の期間中に実施される。
[00442] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、最大で１１日間又は約１１日間の期間中に実施される。
[00443] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、最大で１日間若しくは約１日間、２日間若しくは約２日間、３日間若しくは約３日間、４日間若しくは約４日間、５日間若しくは約５日間、６日間若しくは約６日間、７日間若しくは約７日間、８日間若しくは約８日間、９日間若しくは約９日間、１０日間若しくは約１０日間又は１１日間若しくは約１１日間の期間中に実施される。
[00444] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間又は１１日間の期間中に実施される。
[00445] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、１日間又は約１日間～７日間又は約７日間の期間中に実施され、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、１日間又は約１日間～１１日間又は約１１日間の期間中に実施される。
[00446] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、最大で１日間若しくは約１日間、２日間若しくは約２日間、３日間若しくは約３日間、４日間若しくは約４日間、５日間若しくは約５日間、６日間若しくは約６日間又は７日間若しくは約７日間の期間中に実施され、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、最大で１日間若しくは約１日間、２日間若しくは約２日間、３日間若しくは約３日間、４日間若しくは約４日間、５日間若しくは約５日間、６日間若しくは約６日間、７日間若しくは約７日間、８日間若しくは約８日間、９日間若しくは約９日間、１０日間若しくは約１０日間又は１１日間若しくは約１１日間の期間中に実施される。
[00447] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、１日間又は約１日間～８日間又は約８日間の期間中に実施され、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、１日間又は約１日間～９日間又は約９日間の期間中に実施される。
[00448] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、８日間の期間中に実施され、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、９日間の期間中に実施される。
[00449] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、１日間又は約１日間～７日間又は約７日間の期間中に実施され、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、１日間又は約１日間～９日間又は約９日間の期間中に実施される。
[00450] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、７日間の期間中に実施され、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、９日間の期間中に実施される。
[00451] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
[00452] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）である。
[00453] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である。
[00454] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は、癌に罹患しているドナーから入手される。
[00455] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は、癌に罹患している患者から切除された腫瘍から得られるＴＩＬである。
[00456] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は、血液悪性腫瘍に罹患している患者の骨髄から得られるＭＩＬである。
[00457] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ドナーからの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から入手したＰＢＬである。一部の実施形態において、ドナーは癌に罹患している。一部の実施形態において、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、大腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、ドナーは腫瘍に罹患している。一部の実施形態において、腫瘍は液性腫瘍である。一部の実施形態において、腫瘍は固形腫瘍である。一部の実施形態において、ドナーは血液悪性腫瘍に罹患している。
[00458] 本開示の特定の態様では、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、FICOLL分離などの当業者に知られる任意の数の技術を使用して、対象から収集された血液の単位から入手することができる。好ましい一態様では、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球及び血小板を含む、リンパ球を含有する。一態様では、アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄して血漿画分を除去し、任意選択により、後続の処理ステップのために、細胞を適切な緩衝液又は培地に入れ得る。一実施形態において、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の実施形態において、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、且つマグネシウムを欠き得るか又は全てではなくとも多くの二価カチオンを欠き得る。一態様では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることにより、例えばPERCOLL勾配による遠心分離又は向流遠心水簸により末梢血リンパ球から分離される。
[00459] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ドナーからのリンパ球が濃縮された全血又はアフェレーシス産物から分離されたＰＢＬである。一部の実施形態において、ドナーは癌に罹患している。一部の実施形態において、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、ドナーは腫瘍に罹患している。一部の実施形態において、腫瘍は液性腫瘍である。一部の実施形態において、腫瘍は固形腫瘍である。一部の実施形態において、ドナーは血液悪性腫瘍に罹患している。一部の実施形態において、ＰＢＬは、ポジティブ又はネガティブ選択方法を使用することにより、即ちＴ細胞表現型について、マーカー、例えばＣＤ３＋ＣＤ４５＋を使用してＰＢＬを除去することにより、又は非Ｔ細胞表現型細胞を除去し、ＰＢＬを残すことにより、リンパ球が濃縮された全血又はアフェレーシス産物から分離される。他の実施形態において、ＰＢＬは、勾配遠心分離によって分離される。ドナー組織からＰＢＬを単離する際、ＰＢＬの第１の初回刺激拡大培養は、本明細書に記載の方法のいずれかの第１の初回刺激拡大培養ステップに従って、第１の初回刺激拡大培養の培養物に適切な数の分離されたＰＢＬ（一部の実施形態において、およそ１×１０７ＰＢＬ）を播種することによって開始することができる。
[00460] これらの特徴のいくつかを含むプロセス３（本明細書ではＧＥＮ３とも称される）として知られる例示的なＴＩＬプロセスを図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に示し、プロセス２Ａに対する本発明の本実施形態の利点のいくつかを、図１、２、３０及び３１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に示す。プロセス３の２つの実施形態が図１及び３０（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に示される。プロセス２Ａ又はＧｅｎ２は、全体として参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１８／０２８０４３６Ａ１号にも記載される。
[00461] 一般的に本明細書で考察及び概説される通り、ＴＩＬは患者サンプルから採取し、本明細書に記載され、Ｇｅｎ３と称される、ＴＩＬ拡大培養プロセスを使用して操作することにより、患者への移植前にその数が拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択により、以下に考察する通り、遺伝的に操作され得る。一部の実施形態において、ＴＩＬは、拡大培養前又は後に凍結保存され得る。解凍後、ＴＩＬはまた、患者への注入前にその代謝を高めるために再刺激され得る。
[00462] 一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察する通り、第１の初回刺激拡大培養（本明細書でプレ急速拡大培養（プレＲＥＰ）と称されるプロセス及び図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、１～８日間に短縮され、第２の急速拡大培養（本明細書で急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）と称されるプロセス及び図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）にステップＤとして示されるプロセスを含む）は、１～９日間に短縮される。一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察する通り、第１の初回刺激拡大培養（本明細書でプレ急速拡大培養（プレＲＥＰ）と称されるプロセス及び図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、１～８日間に短縮され、第２の急速拡大培養（本明細書で急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）と称されるプロセス及び図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）にステップＤとして示されるプロセスを含む）は、１～８日間に短縮される。一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察する通り、第１の初回刺激拡大培養（本明細書でプレ急速拡大培養（プレＲＥＰ）と称されるプロセス及び図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、１～７日間に短縮され、第２の急速拡大培養（本明細書で急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）と称されるプロセス及び図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）にステップＤとして示されるプロセスを含む）は、１～９日間に短縮される。一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察する通り、第１の初回刺激拡大培養（本明細書でプレ急速拡大培養（プレＲＥＰ）と称されるプロセス及び図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、１～７日間であり、第２の急速拡大培養（本明細書で急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）と称されるプロセス及び図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）にステップＤとして示されるプロセスを含む）は、１～１０日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢとして記載される拡大培養）は８日間に短縮され、第２の急速拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＤに記載される拡大培養）は７～９日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢとして記載される拡大培養）は８日間であり、第２の急速拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＤに記載される拡大培養）は８～９日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢとして記載される拡大培養）は７日間に短縮され、第２の急速拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＤに記載される拡大培養）は７～８日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢとして記載される拡大培養）は８日間に短縮され、第２の急速拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＤに記載される拡大培養）は８日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢとして記載される拡大培養）は８日間であり、第２の急速拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＤに記載される拡大培養）は９日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢとして記載される拡大培養）は８日間であり、第２の急速拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＤに記載される拡大培養）は１０日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢとして記載される拡大培養）は７日間であり、第２の急速拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＤに記載される拡大培養）は７～１０日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢとして記載される拡大培養）は７日間であり、第２の急速拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＤに記載される拡大培養）は８～１０日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢとして記載される拡大培養）は７日間であり、第２の急速拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＤに記載される拡大培養）は９～１０日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢとして記載される拡大培養）は７日間に短縮され、第２の急速拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＤに記載される拡大培養）は７～９日間である。一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察する通り、第１の初回刺激拡大培養（本明細書でプレ急速拡大培養（プレＲＥＰ）と称されるプロセス及び図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、１～７日間に短縮され、第２の急速拡大培養（本明細書で急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）と称されるプロセス及び図８５（特に例えば図８５Ｂ）にステップＤとして示されるプロセスを含む）は、１～９日間に短縮される。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、図８５（特に例えば図８５Ｂ）のステップＢとして記載される拡大培養）は７日間に短縮され、第２の急速拡大培養（例えば、図８５（特に例えば図８５Ｂ）のステップＤに記載される拡大培養）は７～９日間である。一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察するように、第１の初回刺激拡大培養及び第２の急速拡大培養（例えば、図８５（特に例えば図８５Ｂ）のステップＢ及びステップＤとして記載される拡大培養）の組み合わせは、１４～１６日間である。特に、本発明の特定の実施形態は、ＴＩＬがＩＬ－２の存在下での抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ－３への曝露又は少なくともＩＬ－２及び抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ－３の存在下での抗原への曝露により活性化される、第１の初回刺激拡大培養ステップを含むと考えられる。特定の実施形態において、上記の第１の初回刺激拡大培養ステップで活性化されるＴＩＬは、第１のＴＩＬ集団、即ち初代細胞集団である。
[00463] 以下の「ステップ」の名称Ａ、Ｂ、Ｃ等は、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）の非限定的な例を参照し、本明細書に記載の特定の非限定的な実施形態を参照している。以下及び図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）におけるステップの順序は例示であり、ステップの任意の組み合わせ又は順序並びに追加のステップ、ステップの繰り返し及び／又はステップの省略が、本願及び本明細書に開示される方法によって企図される。
Ａ．ステップＡ：患者の腫瘍サンプルを入手
[00464] 一般に、ＴＩＬは、最初に、患者腫瘍サンプル又は末梢血リンパ球（ＴＩＬ様の特徴を有する末梢血リンパ球を含む）などの循環リンパ球から入手され（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためより大きい集団へと拡大培養され、任意選択で凍結保存され、任意選択でＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
[00465] 患者腫瘍サンプルは当技術分野において公知の方法を用いて、概して、外科的切除、針生検又は腫瘍とＴＩＬ細胞との混合物を含む他のサンプルを入手するための手段によって入手され得る。一般に、腫瘍サンプルは、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含めた任意の固形腫瘍からのものであり得る。腫瘍サンプルは、血液悪性腫瘍から得られた腫瘍など、液性腫瘍でもあり得る。固形腫瘍は、限定はされないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌及び皮膚癌（限定はされないが、扁平上皮癌、基底細胞癌及び黒色腫を含む）を含めた任意の癌型のものであり得る。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、膠芽腫（ＧＢＭ）、胃腸癌、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌及び非小細胞肺癌から選択される。一部の実施形態において、有用なＴＩＬは、特に高レベルのＴＩＬを有すると報告されているように悪性黒色腫腫瘍から得られる。
[00466] 入手後、腫瘍サンプルは一般的に鋭的な切離を用いて１～約８ｍｍ３の小片に断片化され、約２～３ｍｍ３が特に有用である。ＴＩＬは酵素的腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。そのような腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640緩衝液、２ｍＭグルタメート、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮアーゼ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーション、続いて機械的分離（例えば、組織分離剤を使用）によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍をおよそ１分間機械的に分離した後、続いて５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片のみが存在するまで前述の条件下で機械的分離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製され得る。このプロセスの終わりに、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにFICOLL分岐親水性多糖を用いた密度勾配分離を行うことができる。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号に記載されているものなどの、当技術分野で公知の代替的方法を使用し得、その開示は、参照により本明細書に援用される。前述の任意の方法は、ＴＩＬを拡大培養する方法又は癌を処置する方法のために、本明細書に記載の任意の実施形態において使用され得る。
[00467] 上記のように、一部の実施形態において、ＴＩＬは固形腫瘍から得られる。一部の実施形態において、固形腫瘍は断片化されていない。一部の実施形態において、固形腫瘍は断片化されず、腫瘍全体として酵素消化に供される。一部の実施形態において、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮアーゼ及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で消化される。一部の実施形態において、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮアーゼ及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間にわたって消化される。一部の実施形態において、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮアーゼ及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間にわたり、３７℃、５％ＣＯ２で消化される。一部の実施形態において、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮアーゼ及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間にわたり、３７℃、５％ＣＯ２で、回転しながら消化される。一部の実施形態において、腫瘍は、一定の回転で一晩消化される。一部の実施形態において、腫瘍は、一定の回転で、３７℃、５％ＣＯ２で一晩消化される。一部の実施形態において、腫瘍全体は、酵素と組み合わされて、腫瘍消化反応混合物を形成する。
[00468] 一部の実施形態において、腫瘍は、無菌緩衝液中の凍結乾燥酵素で再構成される。一部の実施形態において、緩衝液は無菌ＨＢＳＳである。
[00469] 一部の実施形態において、酵素混合物はコラゲナーゼを含む。一部の実施形態において、コラゲナーゼはコラゲナーゼＩＶである。一部の実施形態において、コラゲナーゼの作業ストックは、１００ｍｇ／ｍＬの１０Ｘ作業ストックである。
[00470] 一部の実施形態において、酵素混合物はＤＮアーゼを含む。一部の実施形態において、ＤＮアーゼの作業ストックは、１０，０００ＩＵ／ｍＬの１０Ｘ作業ストックである。
[00471] 一部の実施形態において、酵素混合物はヒアルロニダーゼを含む。一部の実施形態において、ヒアルロニダーゼの作業ストックは、１０ｍｇ／ｍＬの１０Ｘ作業ストックである。
[00472] 一部の実施形態において、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、１０００ＩＵ／ｍＬのＤＮアーゼ及び１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼを含む。
[00473] 一部の実施形態において、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、５００ＩＵ／ｍＬのＤＮアーゼ及び１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼを含む。
[00474] 一般に、腫瘍から得られた細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に入手した」若しくは「新鮮に分離した」細胞集団と呼ばれる。特定の実施形態において、新鮮に入手したＴＩＬの細胞集団は、抗原提示細胞、ＩＬ－１２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地に曝露される。
[00475] 一部の実施形態において、断片化は、例えば切離並びに消化を含めた物理的断片化を含む。一部の実施形態において、断片化は物理的断片化である。一部の実施形態において、断片化は切離である。一部の実施形態において、断片化は消化による。一部の実施形態において、ＴＩＬは初めに、患者から入手された酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。一実施形態において、ＴＩＬは初めに、患者から入手された酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。
[00476] 一部の実施形態において、腫瘍が固形腫瘍である場合、例えばステップＡ（図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に提供される）における腫瘍サンプルの入手後、腫瘍は、物理的断片化を受ける。一部の実施形態において、断片化は凍結保存前に行われる。一部の実施形態において、断片化は凍結保存後に行われる。一部の実施形態において、断片化は、腫瘍の入手後、いかなる凍結保存もなしに行われる。一部の実施形態において、断片化のステップは、インビトロ又はエクスビボのプロセスである。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の初回刺激拡大培養用の各容器に１０、２０、３０、４０個又はそれを超える数の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の初回刺激拡大培養用の各容器に３０又は４０個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の初回刺激拡大培養用の各容器に４０個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、複数の断片は、約４～約５０個の断片を含み、各断片は約２７ｍｍ３の容積を有する。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３～約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０～約６０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１ｇ～約１．５ｇの総質量を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。
[00477] 一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍断片から入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は鋭的な切離によって入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３～１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３～８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約２ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約３ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約４ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約５ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約６ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約７ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約９ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は１～４ｍｍ×１～４ｍｍ×１～４ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍断片は１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍断片は２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍断片は３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍断片は４ｍｍ×４ｍｍ×４ｍｍである。
[00478] 一部の実施形態において、各断片上の出血、壊死及び／又は脂肪組織の量を最小限にするために、腫瘍が断片化される。一部の実施形態において、各断片上の出血組織の量を最小限にするために、腫瘍が断片化される。一部の実施形態において、各断片上の壊死組織の量を最小限にするために、腫瘍が断片化される。一部の実施形態において、各断片上の脂肪組織の量を最小限にするために、腫瘍が断片化される。特定の実施形態において、腫瘍の断片化のステップは、インビトロ又はエクスビボの方法である。
[00479] 一部の実施形態において、腫瘍の内部構造を維持するために、腫瘍の断片化が実施される。一部の実施形態において、腫瘍の断片化は、メスでの鋸引き運動を実施することなく実施される。一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍消化物から入手される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、酵素培地中、例えば限定はされないが、ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭ GlutaMAX、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮアーゼ及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的解離（GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA）によって作成した。腫瘍を酵素培地に置いた後、腫瘍を約１分間機械的に分離し得る。次に溶液を５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、次にそれを再び約１分間機械的に破壊し得る。再び５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍を３度目に約１分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、３度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、５％ＣＯ２下３７℃での更に３０分間のインキュベーションを伴う又は伴わない１回又は２回の更なる機械的分離をサンプルに適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、フィコールを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
[00480] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養ステップ前の細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に入手した」若しくは「新鮮に分離した」細胞集団と呼ばれる。
[00481] 一部の実施形態において、細胞は、以下に更に詳細に記載し、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に例示する、ステップＢに記載の拡大培養に進む前に、任意選択によりサンプル分離後（例えば、腫瘍サンプルを取得した後及び／又は腫瘍サンプルから細胞懸濁液を取得した後）に凍結され、凍結貯蔵され得る。
１．末梢血から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養する方法
[00482] ＰＢＬ方法１．本発明の一実施形態において、本明細書で説明するプロセスを使用して、ＰＢＬを拡大培養する。本発明の一実施形態において、方法は、全血からＰＢＭＣサンプルを入手することを含む。一実施形態において、方法は、非ＣＤ１９＋画分のネガティブ選択を使用してＰＢＭＣから純粋なＴ細胞を分離することによりＴ細胞を濃縮することを含む。一実施形態において、方法は、非ＣＤ１９＋画分の磁気ビーズに基づくネガティブ選択を使用してＰＢＭＣから純粋なＴ細胞を分離することによりＴ細胞を濃縮することを含む。
[00483] 本発明の一実施形態において、ＰＢＬ方法１は、以下のように実施される：０日目に、凍結保存されたＰＢＭＣサンプルが解凍され、ＰＢＭＣがカウントされる。Ｔ細胞は、Human PanＴ細胞分離キット及びＬＳカラム（Miltenyi Biotec）を使用して分離される。
[00484] ＰＢＬ方法２．本発明の一実施形態において、ＰＢＬは、全血からＰＢＭＣサンプルを入手することを含むＰＢＬ方法２を使用して拡大培養される。ＰＢＭＣからのＴ細胞は、ＰＢＭＣを３７℃で少なくとも３時間インキュベートし、次いで非接着細胞を分離することにより、濃縮される。
[00485] 本発明の一実施形態において、ＰＢＬ方法２は、以下のように実施される：０日目に、凍結保存したＰＢＭＣサンプルを解凍し、ＰＢＭＣ細胞をＣＭ－２培地中の６ウェルプレートに１ウェルあたり６００万細胞で播種し、３７℃で３時間インキュベートする。３時間後、ＰＢＬである非接着細胞を取り出し、カウントする。
[00486] ＰＢＬ方法３．本発明の一実施形態において、ＰＢＬは、末梢血からＰＢＭＣサンプルを入手することを含むＰＢＬ方法３を使用して拡大培養される。Ｂ細胞はＣＤ１９＋選択を使用して分離され、Ｔ細胞はＰＢＭＣサンプルの非ＣＤ１９＋画分のネガティブ選択を使用して選択される。
[00487] 本発明の一実施形態において、ＰＢＬ方法３は、以下のように実施される：０日目に、末梢血に由来する凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、カウントする。ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、CD19 Multisort Kit、Human（Miltenyi Biotec）を使用して選別される。非ＣＤ１９＋細胞画分のうち、Ｔ細胞は、Human PanＴ細胞分離キット及びＬＳカラム（Miltenyi Biotec）を使用して精製される。
[00488] 一実施形態において、ＰＢＭＣは、全血サンプルから分離される。一実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、ＰＢＬを拡大培養するための出発材料として使用される。一実施形態において、サンプルは、拡大培養プロセス前に凍結保存される。別の実施形態において、新鮮なサンプルは、ＰＢＬを拡大培養するための出発材料として使用される。本発明の一実施形態において、Ｔ細胞は、当技術分野で公知の方法を使用してＰＢＭＣから分離される。一実施形態において、Ｔ細胞は、Human PanＴ細胞分離キット及びＬＳカラムを使用して分離される。本発明の一実施形態において、Ｔ細胞は、当技術分野で公知の抗体選択方法、例えばＣＤ１９ネガティブ選択を使用してＰＢＭＣから分離される。
[00489] 本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、非接着細胞を識別するのに有効な所望の温度で一定期間インキュベートされる。本発明の一実施形態において、インキュベーション時間は約３時間である。本発明の一実施形態において、温度は摂氏約３７℃である。次いで、非接着細胞は、上記のプロセスを使用して拡大培養される。
[00490] 一部の実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで任意選択により前処置された対象又は患者からのものである。一部の実施形態において、腫瘍サンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前処置された対象又は患者からのものである。一部の実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前処置され、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月又は１年以上、処置を受けた、対象又は患者からのものである。別の実施形態において、ＰＢＭＣは、イブルチニブなどのＩＴＫ阻害剤レジメンを現在受けている患者に由来する。
[00491] 一部の実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前処置されており、キナーゼ阻害剤又はイブルチニブなどのＩＴＫ阻害剤での処置に抵抗性である対象又は患者からのものである。
[00492] 一部の実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前処置されているが、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤での処置をもう受けていない対象又は患者からのものである。一部の実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前処置されているが、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤での処置をもう受けておらず、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月若しくは少なくとも１年又はそれを超えて処置を受けていない、対象又は患者からのものである。別の実施形態において、ＰＢＭＣは、ＩＴＫ阻害剤への以前の曝露を有するが、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月又は少なくとも１年処置されていない患者に由来する。
[00493] 本発明の実施形態において、０日目に、ＣＤ１９＋について細胞が選択され、適宜選別される。本発明の一実施形態において、選択は抗体結合ビーズを使用して行われる。本発明の一実施形態において、純粋Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから０日目に分離される。
[00494] 本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置されていない患者については、１０～１５ｍｌのバフィーコートは約５×１０９個のＰＢＭＣを生成し、これは、したがって、約５．５×１０７個のＰＢＬを生成する。
[00495] 本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置された患者については、拡大培養プロセスは、約２０×１０９個のＰＢＬを生成する。本発明の一実施形態において、４０．３×１０６個のＰＢＭＣから、約４．７×１０５個のＰＢＬが得られる。
[00496] 前述の実施形態のいずれにおいても、ＰＢＭＣは、全血サンプルから、アフェレーシスにより、バフィーコートから又はＰＢＭＣを入手するための当技術分野で公知の任意の他の方法から得られ得る。
２．骨髄由来のＰＢＭＣから骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する方法
[00497] ＭＩＬ方法３．本発明の一実施形態において、方法は、骨髄からＰＢＭＣを入手することを含む。０日目に、ＣＤ３＋／ＣＤ３３＋／ＣＤ２０＋／ＣＤ１４＋につきＰＢＭＣが選択され、選別され、非ＣＤ３＋／ＣＤ３３＋／ＣＤ２０＋／ＣＤ１４＋細胞画分が超音波処理され、超音波処理された細胞画分の一部が選択された細胞画分に戻される。
[00498] 本発明の一実施形態において、ＭＩＬ方法３は、以下のように実施される：０日目に、凍結保存されたＰＢＭＣのサンプルが解凍され、ＰＢＭＣが計数される。細胞をＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ２０及びＣＤ１４抗体で染色し、Ｓ３ｅ細胞選別（Bio-Rad）を使用して選別する。細胞は、免疫細胞画分（又はＭＩＬ画分）（ＣＤ３＋ＣＤ３３＋ＣＤ２０＋ＣＤ１４＋）とＡＭＬ芽細胞画分（非ＣＤ３＋ＣＤ３３＋ＣＤ２０＋ＣＤ１４＋）の２つの画分に選別される。
[00499] 本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣは骨髄から入手される。一実施形態において、ＰＢＭＣは、アフェレーシス、吸引、針生検又は当技術分野で公知の他の同様の手段を通じて骨髄から入手される。一実施形態において、ＰＢＭＣは新鮮である。別の実施形態において、ＰＢＭＣは凍結保存されている。
[00500] 本発明の一実施形態において、ＭＩＬは、１０～５０ｍｌの骨髄吸引液から拡大培養される。本発明の一実施形態において、１０ｍｌの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、２０ｍｌの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、３０ｍｌの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、４０ｍｌの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、５０ｍｌの骨髄吸引液が患者から入手される。
[00501] 本発明の一実施形態において、約１０～５０ｍｌの骨髄吸引液から得られるＰＢＭＣの数は、約５×１０７～約１０×１０７個のＰＢＭＣである。別の実施形態において、得られるＰＢＭＣの数は、約７×１０７個のＰＢＭＣである。
[00502] 本発明の一実施形態において、約５×１０７～約１０×１０７個のＰＢＭＣから、約０．５×１０６～約１．５×１０６個のＭＩＬが得られる。本発明の一実施形態において、約１×１０６個のＭＩＬが得られる。
[00503] 本発明の一実施形態において、骨髄吸引液に由来する１２×１０６個のＰＢＭＣから、およそ１．４×１０５個のＭＩＬが得られる。
[00504] 前述の実施形態のいずれにおいても、ＰＢＭＣは、全血サンプルから、骨髄から、アフェレーシスにより、バフィーコートから又はＰＢＭＣを入手するための当技術分野で公知の任意の他の方法から得られ得る。
Ｂ．ステップＢ：第１の初回刺激拡大培養
[00505] 一部の実施形態において、本方法は、より幼若なＴＩＬを提供し、これは、より成熟したＴＩＬ（即ち対象／患者への投与前に更に多くの回数の複製を受けたＴＩＬ）を超える追加の治療上の利点を提供し得る。溶着ＴＩＬの特徴が、文献に記載されている。例えば、Donia, et al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012)；Dudley at al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)；Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005)；Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013)；Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009)；Robbins, et al., J Immunol 2004; 173:7125-7130；Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)；Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005)；及びTran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)であり、これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される。
[00506] 腫瘍断片及び／又は腫瘍断片の解剖又は消化後、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＡに記載されたように、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びフィーダー細胞（例えば、抗原提示フィーダー細胞）において培養される。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びフィーダー細胞は、腫瘍消化物及び／又は腫瘍断片と共に培養開始時に（例えば、０日目に）添加される。一部の実施形態において、腫瘍消化物及び／又は腫瘍断片は、１容器あたり最大６０個の断片及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と共に容器中でインキュベートされる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、数日、概して１～８日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、数日、概して１～７日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養は、１～８日の期間にわたって起こり、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この第１の初回刺激拡大培養は、１～７日の期間にわたって起こり、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この第１の初回刺激拡大培養は、約５～８日の期間にわたって起こり、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この第１の初回刺激拡大培養は、５～７日の期間にわたって起こり、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この第１の初回刺激拡大培養は、約６～８日の期間にわたって起こり、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この第１の初回刺激拡大培養は、約６～７日の期間にわたって起こり、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この第１の初回刺激拡大培養は、約７～８日の期間にわたって起こり、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この第１の初回刺激拡大培養は、約７日の期間にわたって起こり、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この第１の初回刺激拡大培養は、約８日の期間にわたって起こり、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。
[00507] 好ましい実施形態において、以下及び本明細書で説明するように、第１の初回刺激拡大培養ステップ（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称され、０日目及び／又は培養開始からフィーダー細胞を含有するプロセスを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢで説明したものなど）、その後の、以下ステップＤの下及び本明細書に記載されているように、第２の急速拡大培養（ステップＤ、急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるプロセスを含む）、以下及び本明細書に記載されているように、その後の、任意選択の凍結保存及びその後の第２ステップＤ（再刺激ＲＥＰステップと称されるプロセスを含む）を使用してＴＩＬの拡大培養を実施することができる。このプロセスによって入手したＴＩＬは、任意選択により、本明細書に記載される通り表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられ得る。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３～１０ｍｍ３である。
[00508] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、ステップＢのＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充したGlutaMAX含有RPMI 1640からなる。
[00509] 一部の実施形態において、２４０個以下の腫瘍断片が存在する。一部の実施形態において、４つ以下の容器に入れられた２４０個以下の腫瘍断片が存在する。一部の実施形態において、容器はGREX100 MCSフラスコである。一部の実施形態において、６０個以下の腫瘍断片が１つの容器に入れられる。一部の実施形態において、各容器は、１容器あたり５００ｍＬ以下の培地を含む。一部の実施形態において、培地はＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、培地は６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、培地は、抗原提示フィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり２．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地はＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、容器はGREX100 MCSフラスコである。一部の実施形態において、培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇのＯＫＴ－３及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。
[00510] 腫瘍断片の調製後、得られた細胞（即ち初代細胞集団である断片）は、ＩＬ－２、抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３を含有する培地で、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの増殖に有利であり、ＴＩＬ初回刺激及び０日目の培養開始からの増殖の加速を可能にする条件下で培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物及び／又は腫瘍断片は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２並びに抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３と共にインキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して１～８日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の間の成長培地はＩＬ－２又はその変異体並びに抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、数日、概して１～７日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養中の成長培地はＩＬ－２又はその変異体並びに抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－２は組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）である。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルについて２０～３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルについて２０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルについて２５×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルについて３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は４～８×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は５～７×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は６×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は実施例Ｃに記載される通り調製される。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２又は約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２を更に含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地はＩＬ－２を更に含む。好ましい一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
[00511] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地はＩＬ－１５を更に含む。好ましい一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
[00512] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２１を更に含む。好ましい一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
[00513] 一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地はＯＫＴ－３抗体を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１５ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一部の実施形態において、ＯＫＴ－３抗体はムロモナブである。
Figure 2022514023000004
[00514] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質並びにその断片、誘導体、変異体、バイオシミラー及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
[00515] 一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地は、初期濃度約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を更に含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地は、初期濃度約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を更に含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。
[00516] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、これはＣＭ１（培養培地１）と称される。一部の実施形態において、ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス及び１０ｍｇ／μＬゲンタマイシンを補充したGlutaMAX含有RPMI 1640からなる。一部の実施形態において、ＣＭは、実施例に記載されるＣＭ１であり、実施例Ａを参照されたい。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養は初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地中で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地又は初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示フィーダー細胞（フィーダー細胞とも称される）を含む。
[00517] 一部の実施形態において、本明細書に開示される拡大培養プロセスで使用される培養培地は、無血清培地又は限定培地である。一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、基礎細胞培地及び血清補充物及び／又は血清代替物を含む。一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、部分的に血清含有培地のロット間の変動に起因する実験的変動を防止及び／又は減少させるために使用される。
[00518] 一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、基礎細胞培地及び血清補充物及び／又は血清代替物を含む。一部の実施形態において、基礎細胞培地は、これらに限定されないが、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖基礎培地、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖ＳＦＭ、CTS（商標）AIM-V培地、CST（商標）AIM-V ＳＦＭ、LymphoONE（商標）Ｔ細胞増殖異種フリー培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴーの最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ増殖培地、イスコーブの改良ダルベッコ培地を含む。
[00519] 一部の実施形態において、血清補充物又は血清代替物は、これらに限定されないが、１つ以上のCTS（商標）OpTmizerＴ細胞拡大培養血清補充物、CTS（商標）免疫細胞血清代替物、１つ以上のアルブミン又はアルブミン代替物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリン又はインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の抗生物質及び１つ以上の微量元素を含む。一部の実施形態において、限定培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸、鉄飽和トランスフェリン、インスリン並びに微量元素部分Ａｇ＋、Ａｌ３＋、Ｂａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３”、Ｇｅ４＋、Ｓｅ４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ２＋、Ｐ、Ｓｉ４＋、Ｖ５＋、Ｍｏ６＋、Ｎｉ２＋、Ｒｂ＋、Ｓｎ２＋及びＺｒ４＋を含む化合物からなる群から選択される１つ以上の成分とを含む。一部の実施形態において、限定培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム及び／又は２－メルカプトエタノールをさらに含む。
[00520] 一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞免疫細胞血清代替物は、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖基礎培地、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖ＳＦＭ、CTS（商標）AIM-V培地、CST（商標）AIM-V ＳＦＭ、LymphoONE（商標）Ｔ細胞増殖異種フリー培地、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴーの最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ増殖培地、イスコーブの改良ダルベッコ培地を含むがこれらに限定されない従来の増殖培地と共に使用される。
[00521] 一部の実施形態において、無血清又は限定培地中の総血清代替物濃度（体積％）は、無血清又は限定培地全体の総体積の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％である。一部の実施形態において、総血清代替物濃度は、無血清又は限定培地の総体積の約３％である。一部の実施形態において、総血清代替物濃度は、無血清又は限定培地の総体積の約５％である。一部の実施形態において、総血清代替物濃度は、無血清又は限定培地の総体積の約１０％である。
[00522] 一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭ（ThermoFisher Scientific）である。CTS（商標）OpTmizer（商標）の任意の製剤は、本発明において有用である。CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、１ＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養基礎培地と２６ｍＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養補充剤を組み合わせたものであり、使用前に混合される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールと共に約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充され、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は５５μＭである。
[00523] 一部の実施形態において、限定培地は、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭ（ThermoFisher Scientific）である。CTS（商標）OpTmizer（商標）の任意の製剤は、本発明において有用である。CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、１ＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養基礎培地と２６ｍＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養補充剤を組み合わせたものであり、使用前に混合される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールと共に約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充され、さらに、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充され、さらに、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充され、さらに、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールで補充され、さらに、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールで補充され、さらに、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールで補充され、さらに、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び約２ｍＭのグルタミンで補充され、さらに、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び約２ｍＭのグルタミンで補充され、さらに、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び約２ｍＭのグルタミンで補充され、さらに、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充され、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は５５μＭである。
[00524] 一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、０．５ｍＭ～約９ｍＭ、１ｍＭ～約８ｍＭ、２ｍＭ～約７ｍＭ、３ｍＭ～約６ｍＭ又は４ｍＭ～約５ｍＭの濃度のグルタミン（即ちGlutaMAX（登録商標））が補充される。一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、２ｍＭの濃度のグルタミン（即ちGlutaMAX（登録商標））が補充される。
[00525] 一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、約５ｍＭ～約１５０ｍＭ、１０ｍＭ～約１４０ｍＭ、１５ｍＭ～約１３０ｍＭ、２０ｍＭ～約１２０ｍＭ、２５ｍＭ～約１１０ｍＭ、３０ｍＭ～約１００ｍＭ、３５ｍＭ～約９５ｍＭ、４０ｍＭ～約９０ｍＭ、４５ｍＭ～約８５ｍＭ、５０ｍＭ～約８０ｍＭ、５５ｍＭ～約７５ｍＭ、６０ｍＭ～約７０ｍＭ又は約６５ｍＭの濃度の２－メルカプトエタノールが補充される。一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、５５ｍＭの濃度の２－メルカプトエタノールが補充される。一部の実施形態において、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は５５μＭである。
[00526] 一部の実施形態において、参照により本明細書に援用される国際公開第１９９８／０３０６７９号に記載されている限定培地は、本発明において有用である。その刊行物には、無血清真核細胞培養培地が記載されている。無血清真核細胞培養培地には、無血清培養での細胞の増殖をサポートすることができる無血清補充物が補充された基礎細胞培養培地が含まれる。無血清真核細胞培養培地補充物は、１つ以上のアルブミン又はアルブミン代替物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリン又はインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の微量元素及び１つ以上の抗生物質からなる群から選択される１つ以上の成分を含むか、又はそれらを組み合わせることによって得られる。一部の実施形態において、限定培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム及び／又はβ－メルカプトエタノールをさらに含む。一部の実施形態において、限定培地は、アルブミン又はアルブミン代替物と、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリン又はインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体及び１つ以上の微量元素からなる群から選択される１つ以上の成分とを含む。一部の実施形態において、限定培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸、鉄飽和トランスフェリン、インスリン並びに微量元素部分Ａｇ＋、Ａｌ３＋、Ｂａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３”、Ｇｅ４＋、Ｓｅ４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ２＋、Ｐ、Ｓｉ４＋、Ｖ５＋、Ｍｏ６＋、Ｎｉ２＋、Ｒｂ＋、Ｓｎ２＋及びＺｒ４＋を含む化合物からなる群から選択される１つ以上の成分とを含む。一部の実施形態において、基礎細胞培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴーの最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ増殖培地、イスコーブの改良ダルベッコ培地からなる群から選択される。
[00527] 一部の実施形態において、限定培地中のグリシンの濃度は約５～２００ｍｇ／Ｌの範囲であり、Ｌ－ヒスチジンの濃度は約５～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－イソロイシンの濃度は約５～３００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－メチオニンの濃度は約５～２００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－フェニルアラニンの濃度は約５～４００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－プロリンの濃度は約１～１０００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－ヒドロキシプロリンの濃度は約１～４５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－セリンの濃度は約１～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－スレオニンの濃度は約１０～５００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－トリプトファンの濃度は約２～１１０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－チロシンの濃度は約３～１７５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－バリンの濃度は約５～５００ｍｇ／Ｌであり、チアミンの濃度は約１～２０ｍｇ／Ｌであり、還元型グルタチオンの濃度は約１～２０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸の濃度は約１～２００ｍｇ／Ｌであり、鉄飽和トランスフェリンの濃度は約１～５０ｍｇ／Ｌであり、インスリンの濃度は約１～１００ｍｇ／Ｌであり、亜セレン酸ナトリウムの濃度は約０．０００００１～０．０００１ｍｇ／Ｌであり、アルブミン（AlbuMAX（登録商標）Iなど）の濃度は約５０００～５０，０００ｍｇ／Ｌである。
[00528] 一部の実施形態において、限定培地中の非微量元素部分成分は、以下の表Ａ１の「１Ｘ培地中の濃度範囲」という見出しの下の欄に列挙された濃度範囲に存在する。他の実施形態において、限定培地中の非微量元素部分成分は、以下の表Ａ１の「１Ｘ培地の好ましい実施形態」という見出しの下の欄に列挙された最終濃度に存在する。他の実施形態において、限定培地は、無血清サプリメントを含む基礎細胞培地である。これらの実施形態の一部において、無血清補充物は、以下の表Ａ１の「補充物の好ましい実施形態」という見出しの下の欄に列挙されたタイプ及び濃度の非微量部分成分を含む。
Figure 2022514023000005
[00529] 一部の実施形態において、限定培地の容積オスモル濃度は、約２６０～３５０ｍＯｓｍｏｌである。一部の実施形態において、容積オスモル濃度は、約２８０～３１０ｍＯｓｍｏｌである。一部の実施形態において、限定培地は、最大約３．７ｇ／Ｌ又は約２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムで補充される。限定培地には、Ｌ－グルタミン（最終濃度約２ｍＭ）、１つ以上の抗生物質、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；最終濃度約１００μＭ）、２－メルカプトエタノール（最終濃度約１００μＭ）をさらに補充できる。
[00530] 一部の実施形態において、Smith, et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement,” Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)に記載されている限定培地は、本発明において有用である。簡単に説明すると、ＲＰＭＩ又はCTS（商標）OpTmizer（商標）を基礎細胞培地として使用し、０、２％、５％又は１０％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物を補充した。
[00531] 一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地は濾過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地は、ベータ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ又はβＭＥ；２－メルカプトエタノール、CAS 60-24-2としても知られる）を欠いている。
[00532] 一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは１～７日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは２～８日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは３～８日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは４～８日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは５～７日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは２～８日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは２～７日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは３～８日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは３～７日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは４～８日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは４～７日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは５～８日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは５～７日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは６～８日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは６～７日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに提供されるプロセスなどを含む）プロセスは７～８日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに提供されるプロセスなどを含む）プロセスは８日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに提供されるプロセスなどを含む）プロセスは７日間である。
[00533] 一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、２日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、３日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、３日間～８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、３日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、４日間～８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、４日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、５日間～８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、５日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、６日間～８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、６日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、７～８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、７日間続行され得る。
[00534] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第１の初回刺激拡大培養は１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間又は８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日間～８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は３日間～８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は３日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は４日間～８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は４日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は５日間～８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は５日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は６日間～８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は６日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は７日間続行され得る。
[00535] 一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１の組み合わせが、第１の初回刺激拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）による並びに本明細書に記載されている通り、ステップＢプロセス中を含む、第１の初回刺激拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の組み合わせが、第１の初回刺激拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）による及び本明細書に記載されている通りステップＢプロセス中に含められ得る。
[00536] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）によるステップＢは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが容器として用いられる。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-100である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-10である。
１．フィーダー細胞及び抗原提示細胞
[00537] 一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載された拡大培養並びにプレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＴＩＬ拡大培養の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要としないが、第１の初回刺激拡大培養中に添加される。一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載された拡大培養並びにプレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＴＩＬ拡大培養の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要としないが、４～８日目の任意の時点で第１の初回刺激拡大培養中に添加される。一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載された拡大培養並びにプレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＴＩＬ拡大培養の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要としないが、４～７日目の任意の時点で第１の初回刺激拡大培養中に添加される。一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載された拡大培養並びにプレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＴＩＬ拡大培養の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要としないが、５～８日目の任意の時点で第１の初回刺激拡大培養中に添加される。一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載された拡大培養並びにプレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＴＩＬ拡大培養の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要としないが、５～７日目の任意の時点で第１の初回刺激拡大培養中に添加される。一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載された拡大培養並びにプレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＴＩＬ拡大培養の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要としないが、６～８日目の任意の時点で第１の初回刺激拡大培養中に添加される。一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載された拡大培養並びにプレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＴＩＬ拡大培養の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要としないが、６～７日目の任意の時点で第１の初回刺激拡大培養中に添加される。一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載された拡大培養並びにプレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＴＩＬ拡大培養の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要としないが、７又は８日目の任意の時点で第１の初回刺激拡大培養中に添加される。一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載された拡大培養並びにプレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＴＩＬ拡大培養の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要としないが、７日目の任意の時点で第１の初回刺激拡大培養中に添加される。一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載された拡大培養並びにプレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＴＩＬ拡大培養の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要としないが、８日目の任意の時点で第１の初回刺激拡大培養中に添加される。
[00538] 一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＢに記載された拡大培養並びにプレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＴＩＬ拡大培養の開始時及び第１の初回刺激拡大培養中に、フィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、同種異系健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。一部の実施形態において、２．５×１０８個のフィーダー細胞が第１の初回刺激拡大培養中に用いられる。一部の実施形態において、１容器あたり２．５×１０８個のフィーダー細胞が第１の初回刺激拡大培養中に用いられる。一部の実施形態において、１つのGREX-10あたり２．５×１０８個のフィーダー細胞が第１の初回刺激拡大培養中に用いられる。一部の実施形態において、１つのGREX-100あたり２．５×１０８個のフィーダー細胞が第１の初回刺激拡大培養中に用いられる。
[00539] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかにより不活性化され、同種異系ＰＢＭＣの複製能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用される。
[00540] 一部の実施形態において、１４日目の生細胞の総数が、第１の初回刺激拡大培養の０日目に培養物に入れられた初期生細胞数より少ない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。
[00541] 一部の実施形態において、７日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、第１の初回刺激拡大培養の０日目に培養物に入れられた初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
[00542] 一部の実施形態において、７日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、第１の初回刺激拡大培養の０日目に培養物に入れられた初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、５～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１０～５０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２０～４０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２５～３５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
[00543] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞はＰＢＭＣである。一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は人工抗原提示フィーダー細胞である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００又は約１：５００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１：５０～１：３００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１：１００～１：２００である。
[00544] 一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順は、約２．５×１０８個のフィーダー細胞と約１００×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順は、約２．５×１０８個のフィーダー細胞と約５０×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養は、約２．５×１０８個のフィーダー細胞と約２５×１０６個のＴＩＬを必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養は、約２．５×１０８個のフィーダー細胞を必要とする。更に別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養は、第２の急速拡大培養で使用されるフィーダー細胞の数の４分の１、３分の１、１２分の５又は半分を必要とする。
[00545] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養における培地は、ＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養における培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養における培地は、抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養における培地は、１容器あたり２．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養における培地は、ＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり３０ｎｇのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、容器はGREX100 MCSフラスコである。一部の実施形態において、培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞あたり、５００ｍＬの培養培地及び１５μｇのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり５００ｍＬの培養培地及び１５μｇのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、容器はGREX100 MCSフラスコである。一部の実施形態において、培地は、５００ｍＬの培養培地及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬ ｎｇのＯＫＴ－３及び２．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり、５００ｍＬの培養培地及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、１５μｇのＯＫＴ－３及び２．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞あたり、５００ｍＬの培養培地及び１５μｇのＯＫＴ－３を含む。
[00546] 一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順は、第２の拡大培養中に、ＴＩＬに対して過剰量のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、同種異系健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。一実施形態において、ＰＢＭＣの代わりに人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が使用される。
[00547] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載された例示的な手順を含む、本明細書に記載されたＴＩＬ拡大培養手順で使用される。
[00548] 一実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替として又はそれと組み合わせて、第１の初回刺激拡大培養で使用される。
２．サイトカイン
[00549] 本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。
[00550] 代わりに、ＴＩＬの第１の初回刺激拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することが更に可能であり、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の２つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（その全体が参照により明示的に本明細書に援用される）に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－２とＩＬ－２１、ＩＬ－１５とＩＬ－２１とＩＬ－２、ＩＬ－１５とＩＬ－２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
Figure 2022514023000006
Ｃ．ステップＣ：第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行
[00551] 一部の場合、例えば、例えば図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）に示されるステップＢから得られる、ＴＩＬ集団を含む、第１の初回刺激拡大培養から得られたバルクＴＩＬ集団（プレＲＥＰと称されることがある拡大培養を含み得る）は、第２の急速拡大培養（急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）と称されることがある拡大培養を含み得る）に供し、その後、以下で考察するように凍結保存し得る。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬが治療に使用される場合、初回刺激拡大培養からの拡大培養されたＴＩＬ集団又は第２の急速拡大培養からの拡大培養されたＴＩＬ集団は、拡大培養ステップ前又は第１の初回刺激拡大培養後且つ第２の急速拡大培養前に適切な処置のために遺伝子修飾に供し得る。
[00552] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）に示される通りのステップＢから）入手されたＴＩＬは、選択のためのフェノタイピングまで貯蔵される。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）に示される通りのステップＢから）入手されたＴＩＬは貯蔵されず、第２の急速拡大培養に直接進む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から入手されたＴＩＬは、第１の初回刺激拡大培養後、第２の急速拡大培養前に凍結保存されない。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、腫瘍断片が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約２日、３日、４日、５日、６日、７日又は８日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約３日～７日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約３日～７日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約３日～８日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約４日～７日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約４日～８日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約５日～７日の時点で行われる。
[00553] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約６日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約６日～７日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約６日～８日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約７日～８日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約７日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約８日の時点で行われる。
[00554] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日又は８日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１日～７日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１日～８日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、２日～７日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、２日～８日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、３日～７日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、３日～８日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、４日～７日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、４日～８日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、５日～７日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、５日～８日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、６日～７日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、６日～８日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、７日～８日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、７日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、断片化が発生したとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、８日で行われる。
[00555] 一部の実施形態において、ＴＩＬは、第１の初回刺激拡大培養後、第２の急速拡大培養前に貯蔵されず、ＴＩＬは第２の急速拡大培養に直接進む（例えば、一部の実施形態において、図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）に示すように、ステップＢからステップＤへの移行中に貯蔵は行われない）。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、移行は閉鎖系で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養からのＴＩＬは、第２のＴＩＬ集団からのＴＩＬであり、移行期間を伴わず第２の急速拡大培養に直接進む。
[00556] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）によるステップＣは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、容器サイズのスケールアップを伴う。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養は、第２の急速拡大培養よりも小さい容器内で実施される。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養はGREX-100で実施され、第２の急速拡大培養はGREX-500で実施される。
Ｄ．ステップＤ：第２の急速拡大培養
[00557] 一部の実施形態において、ＴＩＬ細胞集団は、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）に示されるように、ステップＡ及びステップＢ並びにステップＣと称される移行後、回収及び第１の初回刺激拡大培養後、数が更に増加する。この更なる増加は、本明細書では第２の急速拡大培養と称され、これは、当技術分野で一般に急速拡大培養法と称される拡大培養プロセス（急速拡大培養プロトコル又はＲＥＰ並びに図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）のステップＤに示されるプロセス）を含み得る。第２の急速拡大培養は、概して、フィーダー細胞、サイトカイン源及び抗ＣＤ３抗体を含め、幾つもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養の開始後１日、２日、３日又は４日（即ちＧｅｎ３プロセス全体の８、９、１０又は１１日目）で、ＴＩＬは、より大きい容量の容器に移される。
[00558] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の急速拡大培養（これはＲＥＰと称されることもある拡大培養；並びに図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）のステップＤに示されるプロセスを含み得る）は、当業者に公知の任意のＴＩＬフラスコ又は容器を使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間又は１０日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約１日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約１日間～約１０日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約２日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約２日間～約１０日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約３日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約３日間～約１０日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約４日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約４日間～約１０日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約５日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約５日間～約１０日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約６日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約６日間～約１０日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約７日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約７日間～約１０日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約８日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約８日間～約１０日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約９日間～約１０日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約１日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約２日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約３日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約５日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約６日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約７日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約８日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約１０日間続行し得る。
[00559] 一実施形態において、第２の急速拡大培養は、本開示の方法（例えば、ＲＥＰと称される膨張並びに図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）のステップＤに示されるプロセスを含む）を使用して、ガス透過性容器内で実施することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）の存在下で、第２の急速拡大培養で拡大培養される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びフィーダー細胞の存在下で、第２の急速拡大培養で拡大培養され、ここで、フィーダー細胞は、第１の初回刺激拡大培養で存在するフィーダー細胞の濃度の２倍、２．４倍、２．５倍、３倍、３．５倍又は４倍である最終濃度まで添加される。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）又はインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて急速に拡大培養することができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激としては、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）又はＵＨＣＴ－１（BioLegend、San Diego, CA, USAから市販されている）を挙げることができる。ＴＩＬは、任意選択で３００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２又はＩＬ－１５など、Ｔ細胞成長因子の存在下で、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば、０．３μΜ ＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）又はｇｐｌ ００：２０９－２１７（２１０Ｍ）など、任意選択でベクターから発現させることのできる、１つ又は複数のエピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の１つ以上の抗原を、第２の拡大培養中に誘導することにより、インビトロでのＴＩＬの更なる刺激を誘発するように拡大培養することができる。他の好適な抗原としては、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２及びＶＥＧＦＲ２又はその抗原性部分を挙げることができる。ＴＩＬは、ＨＬＡ－Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ１つ又は複数の抗原による再刺激によっても急速に拡大培養し得る。代わりに、ＴＩＬは、例えば照射自己リンパ球によるか、又は照射ＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２によって更に再刺激することができる。一部の実施形態において、再刺激は、第２の拡大培養の一部として生じる。一部の実施形態において、照射された自己リンパ球の存在下において、又は照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種リンパ球及びＩＬ－２と共に第２の拡大培養が発生する。
[00560] 一実施形態において、細胞培養培地は、ＩＬ－２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ又は８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
[00561] 一実施形態において、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、３０ｎｇ／ｍＬ～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は約６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、ＯＫＴ－３抗体はムロモナブである。
[00562] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、ＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、培地は６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、１容器あたり７．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、ＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養培地は、１容器あたり５００ｍＬの培養培地及び３０μｇのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、容器はGREX100 MCSフラスコである。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３及び７．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり、５００ｍＬの培養培地及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０μｇのＯＫＴ－３及び７．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。
[00563] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、ＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、培地は６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり５×１０８～７．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、ＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、１容器あたり５００ｍＬの培養培地及び３０μｇのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、容器はGREX100 MCSフラスコである。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３及び５×１０８～７．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、１容器あたり、５００ｍＬの培養培地及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０μｇのＯＫＴ－３及び５×１０８～７．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。
[00564] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質並びにそれらの断片、誘導体、変異体、バイオシミラー及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
[00565] 一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、細胞培養培地は、初期濃度約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を更に含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。
[00566] 一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）による並びに本明細書に記載されている通り、ステップＤプロセス中を含む、第２の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）による及び本明細書に記載されている通りステップＤプロセス中に含められ得る。
[00567] 一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、抗原提示フィーダー細胞及び任意選択によりＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む添加細胞培養培地で実施され得る。一部の実施形態において、第２の拡大培養は添加細胞培養培地で行われる。一部の実施形態において、添加細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ；抗原提示フィーダー細胞とも称される）を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示フィーダー細胞を含む細胞培養培地で生じる（即ち抗原提示細胞）。
[00568] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、乃至約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、乃至約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、乃至約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－１５を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
[00569] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、乃至約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２１を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
[00570] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣである。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣ及び／又は抗原提示細胞との比は、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：２５、約１：３０、約１：３５、約１：４０、約１：４５、約１：５０、約１：７５、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００又は約１：５００である。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：５０～１：３００である。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：１００～１：２００である。
[00571] 一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の急速拡大培養は、バルクＴＩＬを１５０ｍＬ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞（ここで、フィーダー細胞の濃度は、第１の初回刺激拡大培養におけるフィーダー細胞濃度の少なくとも１．１倍（１．１Ｘ）、１．２Ｘ、１．３Ｘ、１．４Ｘ、１．５Ｘ、１．６Ｘ、１．７Ｘ、１．８Ｘ、１．８Ｘ、２Ｘ、２．１Ｘ２．２Ｘ、２．３Ｘ、２．４Ｘ、２．５Ｘ、２．６Ｘ、２．７Ｘ、２．８Ｘ、２．９ Ｘ、３．０Ｘ、３．１Ｘ、３．２Ｘ、３．３Ｘ、３．４Ｘ、３．５Ｘ、３．６Ｘ、３．７Ｘ、３．８Ｘ、３．９Ｘ又は４．０Ｘ）、３０ｍｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバーに移すまで培地補充が行われる（一般的に、使用済み培地の２／３の吸引及び等しい体積の新鮮培地での置換による、２／３の培地補充）。別の成長チャンバーには、以下に更に十分に考察する通りのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[00572] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養（ＲＥＰプロセスと称されるプロセスを含み得る）は、実施例及び図で考察されるように、７～９日間である。一部の実施形態において、第２の拡大培養は７日間である。一部の実施形態において、第２の拡大培養は８日間である。一部の実施形態において、第２の拡大培養は９日間である。
[00573] 一実施形態において、第２の拡大培養（これはＲＥＰと称される拡大培養；並びに図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）のステップＤに参照されるものを含み得る）は、１００ｃｍガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量ガス透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USAから市販されている）において実施され得、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を補充した４００ｍＬの５０／５０培地中で５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬをＰＢＭＣと培養し得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。５日目、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心し得る。５％ヒトＡＢ血清、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のGREX-100フラスコに戻し加え得る。GREX-100フラスコでＴＩＬを連続的に拡大培養する場合、１０又は１１日目に、ＴＩＬは、GREX-500などのより大きいフラスコに移動され得る。細胞は培養１４日目に回収し得る。細胞は培養１５日目に回収し得る。細胞は培養１６日目に回収し得る。一部の実施形態において、細胞が別の成長チャンバーに移されるまで培地交換が行われる。一部の実施形態において、培地の２／３は、使用済み培地の吸引及び等しい体積の新鮮培地での置換によって置き換えられる。一部の実施形態において、別の成長チャンバーには、以下に更に十分に考察する通りのGREXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[00574] 一部の実施形態において、本明細書に開示される拡大培養プロセスで使用される培養培地は、無血清培地又は限定培地である。一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、基礎細胞培地及び血清補充物及び／又は血清代替物を含む。一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、部分的に血清含有培地のロット間の変動に起因する実験的変動を防止及び／又は減少させるために使用される。
[00575] 一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、基礎細胞培地及び血清補充物及び／又は血清代替物を含む。一部の実施形態において、基礎細胞培地は、これらに限定されないが、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖基礎培地、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖ＳＦＭ、CTS（商標）AIM-V培地、CST（商標）AIM-V ＳＦＭ、LymphoONE（商標）Ｔ細胞増殖異種フリー培地、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴーの最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ増殖培地、イスコーブの改良ダルベッコ培地を含む。
[00576] 一部の実施形態において、血清補充物又は血清代替物は、これらに限定されないが、１つ以上のCTS（商標）OpTmizerＴ細胞拡大培養血清補充物、CTS（商標）免疫細胞血清代替物、１つ以上のアルブミン又はアルブミン代替物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリン又はインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の抗生物質及び１つ以上の微量元素を含む。一部の実施形態において、限定培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸、鉄飽和トランスフェリン、インスリン並びに微量元素部分Ａｇ＋、Ａｌ３＋、Ｂａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３”、Ｇｅ４＋、Ｓｅ４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ２＋、Ｐ、Ｓｉ４＋、Ｖ５＋、Ｍｏ６＋、Ｎｉ２＋、Ｒｂ＋、Ｓｎ２＋及びＺｒ４＋を含む化合物からなる群から選択される１つ以上の成分とを含む。一部の実施形態において、限定培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム及び／又は２－メルカプトエタノールをさらに含む。
[00577] 一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞免疫細胞血清代替物は、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖基礎培地、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖ＳＦＭ、CTS（商標）AIM-V培地、CST（商標）AIM-V ＳＦＭ、LymphoONE（商標）Ｔ細胞増殖異種フリー培地、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴーの最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ増殖培地、イスコーブの改良ダルベッコ培地を含むがこれらに限定されない従来の増殖培地と共に使用される。
[00578] 一部の実施形態において、無血清又は限定培地中の総血清代替物濃度（体積％）は、無血清又は限定培地全体の総体積の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％である。一部の実施形態において、総血清代替物濃度は、無血清又は限定培地の総体積の約３％である。一部の実施形態において、総血清代替物濃度は、無血清又は限定培地の総体積の約５％である。一部の実施形態において、総血清代替物濃度は、無血清又は限定培地の総体積の約１０％である。
[00579] 一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭ（ThermoFisher Scientific）である。CTS（商標）OpTmizer（商標）の任意の製剤は、本発明において有用である。CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、１ＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養基礎培地と２６ｍＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養補充剤を組み合わせたものであり、使用前に混合される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールと共に約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充され、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は５５μＭである。
[00580] 一部の実施形態において、限定培地は、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭ（ThermoFisher Scientific）である。CTS（商標）OpTmizer（商標）の任意の製剤は、本発明において有用である。CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、１ＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養基礎培地と２６ｍＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養補充剤を組み合わせたものであり、使用前に混合される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールと共に約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充され、さらに、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充され、さらに、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充され、さらに、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールで補充され、さらに、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールで補充され、さらに、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールで補充され、さらに、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び約２ｍＭのグルタミンで補充され、さらに、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び約２ｍＭのグルタミンで補充され、さらに、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び約２ｍＭのグルタミンで補充され、さらに、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充され、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は５５μＭである。
[00581] 一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、０．５ｍＭ～約９ｍＭ、１ｍＭ～約８ｍＭ、２ｍＭ～約７ｍＭ、３ｍＭ～約６ｍＭ又は４ｍＭ～約５ｍＭの濃度のグルタミン（即ちGlutaMAX（登録商標））が補充される。一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、２ｍＭの濃度のグルタミン（即ちGlutaMAX（登録商標））が補充される。
[00582] 一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、約５ｍＭ～約１５０ｍＭ、１０ｍＭ～約１４０ｍＭ、１５ｍＭ～約１３０ｍＭ、２０ｍＭ～約１２０ｍＭ、２５ｍＭ～約１１０ｍＭ、３０ｍＭ～約１００ｍＭ、３５ｍＭ～約９５ｍＭ、４０ｍＭ～約９０ｍＭ、４５ｍＭ～約８５ｍＭ、５０ｍＭ～約８０ｍＭ、５５ｍＭ～約７５ｍＭ、６０ｍＭ～約７０ｍＭ又は約６５ｍＭの濃度の２－メルカプトエタノールが補充される。一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、５５ｍＭの濃度の２－メルカプトエタノールが補充される。
[00583] 一部の実施形態において、参照により本明細書に援用される国際公開第１９９８／０３０６７９号に記載されている限定培地は、本発明において有用である。その刊行物には、無血清真核細胞培養培地が記載されている。無血清真核細胞培養培地には、無血清培養での細胞の増殖をサポートすることができる無血清補充物が補充された基礎細胞培養培地が含まれる。無血清真核細胞培養培地補充物は、１つ以上のアルブミン又はアルブミン代替物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリン又はインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の微量元素及び１つ以上の抗生物質からなる群から選択される１つ以上の成分を含むか、又はそれらを組み合わせることによって得られる。一部の実施形態において、限定培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム及び／又はβ－メルカプトエタノールをさらに含む。一部の実施形態において、限定培地は、アルブミン又はアルブミン代替物と、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリン又はインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体及び１つ以上の微量元素からなる群から選択される１つ以上の成分とを含む。一部の実施形態において、限定培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸、鉄飽和トランスフェリン、インスリン並びに微量元素部分Ａｇ＋、Ａｌ３＋、Ｂａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３”、Ｇｅ４＋、Ｓｅ４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ２＋、Ｐ、Ｓｉ４＋、Ｖ５＋、Ｍｏ６＋、Ｎｉ２＋、Ｒｂ＋、Ｓｎ２＋及びＺｒ４＋を含む化合物からなる群から選択される１つ以上の成分とを含む。一部の実施形態において、基礎細胞培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴーの最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ増殖培地、イスコーブの改良ダルベッコ培地からなる群から選択される。
[00584] 一部の実施形態において、限定培地中のグリシンの濃度は約５～２００ｍｇ／Ｌの範囲であり、Ｌ－ヒスチジンの濃度は約５～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－イソロイシンの濃度は約５～３００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－メチオニンの濃度は約５～２００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－フェニルアラニンの濃度は約５～４００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－プロリンの濃度は約１～１０００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－ヒドロキシプロリンの濃度は約１～４５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－セリンの濃度は約１～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－スレオニンの濃度は約１０～５００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－トリプトファンの濃度は約２～１１０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－チロシンの濃度は約３～１７５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－バリンの濃度は約５～５００ｍｇ／Ｌであり、チアミンの濃度は約１～２０ｍｇ／Ｌであり、還元型グルタチオンの濃度は約１～２０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸の濃度は約１～２００ｍｇ／Ｌであり、鉄飽和トランスフェリンの濃度は約１～５０ｍｇ／Ｌであり、インスリンの濃度は約１～１００ｍｇ／Ｌであり、亜セレン酸ナトリウムの濃度は約０．０００００１～０．０００１ｍｇ／Ｌであり、アルブミン（AlbuMAX（登録商標）Iなど）の濃度は約５０００～５０，０００ｍｇ／Ｌである。
[00585] 一部の実施形態において、限定培地中の非微量元素部分成分は、以下の表Ａ２の「１Ｘ培地中の濃度範囲」という見出しの下の欄に列挙された濃度範囲に存在する。他の実施形態において、限定培地中の非微量元素部分成分は、以下の表Ａ２の「１Ｘ培地の好ましい実施形態」という見出しの下の欄に列挙された最終濃度に存在する。他の実施形態において、限定培地は、無血清サプリメントを含む基礎細胞培地である。これらの実施形態の一部において、無血清補充物は、以下の表Ａ２の「補充物の好ましい実施形態」という見出しの下の欄に列挙されたタイプ及び濃度の非微量部分成分を含む。
Figure 2022514023000007
[00586] 一部の実施形態において、限定培地の容積オスモル濃度は、約２６０～３５０ｍＯｓｍｏｌである。一部の実施形態において、容積オスモル濃度は、約２８０～３１０ｍＯｓｍｏｌである。一部の実施形態において、限定培地は、最大約３．７ｇ／Ｌ又は約２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムで補充される。限定培地には、Ｌ－グルタミン（最終濃度約２ｍＭ）、１つ以上の抗生物質、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；最終濃度約１００μＭ）、２－メルカプトエタノール（最終濃度約１００μＭ）をさらに補充できる。
[00587] 一部の実施形態において、Smith, et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement,” Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)に記載されている限定培地は、本発明において有用である。簡単に説明すると、ＲＰＭＩ又はCTS（商標）OpTmizer（商標）を基礎細胞培地として使用し、０、２％、５％又は１０％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物を補充した。
[00588] 一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地は濾過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地は、ベータ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ又はβＭＥ；２－メルカプトエタノール、CAS 60-24-2としても知られる）を欠いている。
[00589] 一実施形態において、第２の急速拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）が実施され、これは優れた腫瘍応答性に関してＴＩＬを選択するステップを更に含む。当技術分野において公知の任意の選択方法を用いることができる。例えば、その開示が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号に記載されている方法は、優れた腫瘍反応性に関するＴＩＬの選択に使用され得る。
[00590] 任意選択で、第２の急速拡大培養（ＲＥＰ拡大培養と称される拡大培養を含む）後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。一部の実施形態において、Cellometer K2自動セルカウンター（Nexcelom Bioscience、Lawrence, MA）を使用してＴＩＬサンプルをカウントし、生存率を決定することができる。一部の実施形態において、生存率は、標準的なCellometer K2 Image Cytometer自動セルカウンタープロトコルに従い決定される。
[00591] Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメントＶ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）及びＣ（定数）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第２の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性はＴ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（即ちＴＣＲα／β）の発現が増加する。
[00592] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下でさらに詳細に考察する通り、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３並びに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下で更に詳細に考察する通り、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｕｇ／フラスコのＯＫＴ－３並びに７．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下でさらに詳細に考察する通り、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３並びに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下で更に詳細に考察する通り、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｕｇ／フラスコのＯＫＴ－３並びに５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。
[00593] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが容器として用いられる。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、例えば、G-REX-100又はG-REX-500である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-100である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-500である。
１．フィーダー細胞及び抗原提示細胞
[00594] 一実施形態において、本明細書に記載の第２の急速拡大培養手順（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）のステップＤに記載された拡大培養並びにＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＲＥＰ ＴＩＬ拡大培養中及び／又は第２の急速拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。
[00595] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかにより不活性化され、同種異系ＰＢＭＣの複製能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用される。
[00596] 一部の実施形態において、７又は１４日目の生細胞の総数がＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目に培養（即ち第２の拡大培養の開始日）に移行した初期生細胞数より少ない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。
[00597] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められ得る。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
[00598] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められ得る。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
[00599] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞はＰＢＭＣである。一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は人工抗原提示フィーダー細胞である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は、約１：１０、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００又は約１：５００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１：５０～１：３００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１：１００～１：２００である。
[00600] 一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約５×１０８個のフィーダー細胞と約１００×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約７．５×１０８個のフィーダー細胞と約１００×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約５×１０８個のフィーダー細胞と約５０×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約７．５×１０８個のフィーダー細胞と約５０×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約５×１０８個のフィーダー細胞から約２５×１０６個のＴＩＬを必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約７．５×１０８個のフィーダー細胞と約２５×１０６個のＴＩＬを必要とする。更に別の実施形態において、第２の急速拡大培養は、第２の急速拡大培養の２倍の数のフィーダー細胞を必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養が約２．５×１０８個のフィーダー細胞を必要とする場合、第２の急速拡大培養は、約５×１０８個のフィーダー細胞を必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養が約２．５×１０８個のフィーダー細胞を必要とする場合、第２の急速拡大培養は、約７．５×１０８個のフィーダー細胞を必要とする。更に別の実施形態において、第２の急速拡大培養は、第１の初回刺激拡大培養の２倍（２．０Ｘ）、２．５Ｘ、３．０Ｘ、３．５Ｘ又は４．０Ｘの数のフィーダー細胞を必要とする。
[00601] 一実施形態において、本明細書に記載の第２の急速拡大培養手順は、第２の急速拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、同種異系健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。一実施形態において、ＰＢＭＣの代わりに人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が使用される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、第１の初回刺激拡大培養に添加されたＰＢＭＣの濃度の２倍で第２の急速拡大培養に添加される。
[00602] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載された例示的な手順を含む、本明細書に記載されたＴＩＬ拡大培養手順で使用される。
[00603] 一実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替として又はそれと組み合わせて、第２の急速拡大培養で使用される。
２．サイトカイン
[00604] 本明細書に記載の第２の急速拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。
[00605] 代わりに、ＴＩＬの第２の急速拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することが更に可能であり、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の２つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（参照により全体として明示的に本明細書に援用される）に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－２とＩＬ－２１、ＩＬ－１５とＩＬ－２１とＩＬ－２、ＩＬ－１５とＩＬ－２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
Ｅ．ステップＥ：ＴＩＬの回収
[00606] 第２の急速拡大培養ステップ後、細胞は回収することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）に提供される通り、１、２、３、４回又はそれ以上の拡大培養ステップ後に回収される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）に提供される通り、２つの拡大培養ステップ後に回収される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）に提供される通り、２つの拡大培養ステップ（１つの第１の初回刺激拡大培養及び１つの第２の急速拡大培養）後に回収される。
[00607] ＴＩＬは、例えば遠心によることを含め、任意の適切な且つ無菌の方法で回収することができる。ＴＩＬ回収方法は、当技術分野において周知であり、本プロセスと共に任意のかかる公知の方法を用いることができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは自動化系を使用して回収される。
[00608] セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、例えば、Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及びInotech Biosystems International, Inc.を含む様々な供給源から市販されている。任意選択の細胞ベースのハーベスターを本方法で使用することができる。一部の実施形態において、セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、膜ベースの細胞ハーベスターである。一部の実施形態において、細胞回収は、LOVO系（Fresenius Kabi製）などの細胞処理系を介して行われる。用語「LOVO細胞処理系」は、滅菌及び／又は閉鎖系環境で、回転膜又は回転フィルターなどの膜又はフィルターを通して細胞を含む溶液を送り出すことができ、ペレット化せず上清又は細胞培地を除去する連続フロー及び細胞処理を可能にする、あらゆる販売業者によって製造された機器又は装置も指す。一部の実施形態において、セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、閉鎖、無菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮及び／又は他の細胞処理ステップを実施することができる。
[00609] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが容器として用いられる。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、例えば、G-REX-100又はG-REX-500である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-100である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-500である。
[00610] 一部の実施形態において、図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）によるステップＥは、本明細書に記載のプロセスに従って実施される。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような閉鎖系が使用される。
[00611] 一部の実施形態において、本明細書に記載された方法に従ってＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような方法を使用して、１４日目～１６日目にＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような方法を使用して、１４日目にＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような方法を使用して、１５日目にＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような方法を使用して、１６日目にＴＩＬが回収される。
Ｆ．ステップＦ：最終的な製剤化／輸注バッグへの移動
[00612] 図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）に例示的順序で提供される通りの、且つ上記及び本明細書に詳細に概説される通りのステップＡ～Ｅが完了した後、細胞は患者への投与における使用のため容器に移される。一部の実施形態において、上記に記載される拡大培養方法を用いて治療上十分な数のＴＩＬが入手されると、ＴＩＬは患者への投与における使用のため容器に移される。
[00613] 一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養したＴＩＬは医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本明細書に開示されるように拡大培養したＴＩＬは、当技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、ＴＩＬは単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約３０～６０分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内及びリンパ内が挙げられる。
Ｇ．ＰＢＭＣフィーダー細胞比
[00614] 一部の実施形態において、本明細書に記載の拡大培養方法（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／図１Ｃ）を参照されたい）で使用される培養培地は、抗ＣＤ３抗体、例えば、ＯＫＴ－３を含む。抗ＣＤ３抗体をＩＬ－２と併用すると、ＴＩＬ集団においてＴ細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は完全長抗体並びにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見ることができ、前者が概して好ましい；例えば、Tsoukas et al., J.Immunol. 1985, 135, 1719（参照により全体として本明細書に援用される）を参照されたい。
[00615] 一実施形態において、ＰＢＭＣフィーダー層の数は以下のように計算される。
Ａ．Ｔ細胞の容積（直径１０μｍ）：Ｖ＝（４／３）πｒ３＝５２３．６μｍ３
Ｂ．高さ４０μｍ（４細胞）のG-Rex 100（Ｍ）の円柱フラスコ：Ｖ＝（４／３）πｒ３＝４×１０１２μｍ３
Ｃ．円柱フラスコＢを満たすために必要な細胞数：４×１０１２μｍ３／５２３．６μｍ３＝７．６×１０８μｍ３＊０．６４＝４．８６×１０８
Ｄ．４Ｄ空間で最適に活性化できる細胞数：４．８６×１０８／２４＝２０．２５×１０６
Ｅ．G-Rex 500に外挿されたフィーダー及びＴＩＬの数：ＴＩＬ：１００×１０６及びフィーダー：２．５×１０９
この計算では、１００ｃｍ２ベースのシリンダー内でＴＩＬを活性化するための正二十面体ジオメトリを提供するために必要な単核細胞の数の概算が使用される。この計算は、ＮＣＩの実験データを厳密に反映したＴ細胞の閾値活性化の約５×１０８の実験結果を導き出す。（１）（Ｃ）乗数（０．６４）は、１９９２年にJaeger及びNagelによって計算された等価球のランダムデータ密度である（２）。（Ｄ）除数２４は、４次元空間の「ニュートン数」（３）で同様のオブジェクトに接触する可能性のある等価球の数である。
（１）Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother. 2012 Apr; 35(3):283-292。
（２）Jaeger HM, Nagel SR. Physics of the granular state. Science. 1992 Mar 20; 255(5051):1523-31。
（３）O. R.Musin (2003).“The problem of the twenty-five spheres”. Russ. Math. Surv. 58 (4):794-795。
[00616] 一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給された抗原提示フィーダー細胞の数は、第２の急速拡大培養中に外因的に供給された抗原提示フィーダー細胞の数のおよそ半分である。特定の実施形態において、方法は、第２の急速拡大培養の細胞培養培地と比較して、およそ５０％少ない抗原提示細胞を含む細胞培養培地において、第１の初回刺激拡大培養を実施することを含む。
[00617] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給された抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）の数は、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数より大きい。
[00618] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の間に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養の間に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２０：１又は約２０：１の範囲である。
[00619] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～１０：１又は約１０：１の範囲である。
[00620] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～９：１又は約９：１の範囲である。
[00621] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～８：１又は約８：１の範囲である。
[00622] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～７：１又は約７：１の範囲である。
[00623] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～６：１又は約６：１の範囲である。
[00624] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～５：１又は約５：１の範囲である。
[00625] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～４：１又は約４：１の範囲である。
[00626] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の間に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養の間に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～３：１又は約３：１の範囲である。
[00627] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の間に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養の間に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．９：１又は約２．９：１の範囲である。
[00628] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．８：１又は約２．８：１の範囲である。
[00629] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．７：１又は約２．７：１の範囲である。
[00630] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．６：１又は約２．６：１の範囲である。
[00631] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．５：１又は約２．５：１の範囲である。
[00632] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．４：１又は約２．４：１の範囲である。
[00633] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．３：１又は約２．３：１の範囲である。
[00634] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．２：１又は約２．２：１の範囲である。
[00635] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．１：１又は約２．１：１の範囲である。
[00636] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２：１又は約２：１の範囲である。
[00637] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～１０：１又は約１０：１の範囲である。
[00638] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～５：１又は約５：１の範囲である。
[00639] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～４：１又は約４：１の範囲である。
[00640] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～３：１又は約３：１の範囲である。
[00641] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．９：１又は約２．９：１の範囲である。
[00642] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．８：１又は約２．８：１の範囲である。
[00643] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．７：１又は約２．７：１の範囲である。
[00644] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．６：１又は約２．６：１の範囲である。
[00645] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．５：１又は約２．５：１の範囲である。
[00646] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．４：１又は約２．４：１の範囲である。
[00647] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．３：１又は約２．３：１の範囲である。
[00648] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．２：１又は約２．２：１の範囲である。
[00649] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．１：１又は約２．１：１の範囲である。
[00650] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１である。
[00651] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１若しくは約１．１：１、１．２：１若しくは約１．２：１、１．３：１若しくは約１．３：１、１．４：１若しくは約１．４：１、１．５：１若しくは約１．５：１、１．６：１若しくは約１．６：１、１．７：１若しくは約１．７：１、１．８：１若しくは約１．８：１、１．９：１若しくは約１．９：１、２：１若しくは約２：１、２．１：１若しくは約２．１：１、２．２：１若しくは約２．２：１、２．３：１若しくは約２．３：１、２．４：１若しくは約２．４：１、２．５：１若しくは約２．５：１、２．６：１若しくは約２．６：１、２．７：１若しくは約２．７：１、２．８：１若しくは約２．８：１、２．９：１若しくは約２．９：１、３：１若しくは約３：１、３．１：１若しくは約３．１：１、３．２：１若しくは約３．２：１、３．３：１若しくは約３．３：１、３．４：１若しくは約３．４：１、３．５：１若しくは約３．５：１、３．６：１若しくは約３．６：１、３．７：１若しくは約３．７：１、３．８：１若しくは約３．８：１、３．９：１若しくは約３．９：１、４：１若しくは約４：１、４．１：１若しくは約４．１：１、４．２：１若しくは約４．２：１、４．３：１若しくは約４．３：１、４．４：１若しくは約４．４：１、４．５：１若しくは約４．５：１、４．６：１若しくは約４．６：１、４．７：１若しくは約４．７：１、４．８：１若しくは約４．８：１、４．９：１若しくは約４．９：１又は５：１若しくは約５：１である。
[00652] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に補充されたＡＰＣの数は、１×１０８若しくは約１×１０８、１．１×１０８若しくは約１．１×１０８、１．２×１０８若しくは約１．２×１０８、１．３×１０８若しくは約１．３×１０８、１．４×１０８若しくは約１．４×１０８、１．５×１０８若しくは約１．５×１０８、１．６×１０８若しくは約１．６×１０８、１．７×１０８若しくは約１．７×１０８、１．８×１０８若しくは約１．８×１０８、１．９×１０８若しくは約１．９×１０８、２×１０８若しくは約２×１０８、２．１×１０８若しくは約２．１×１０８、２．２×１０８若しくは約２．２×１０８、２．３×１０８若しくは約２．３×１０８、２．４×１０８若しくは約２．４×１０８、２．５×１０８若しくは約２．５×１０８、２．６×１０８若しくは約２．６×１０８、２．７×１０８若しくは約２．７×１０８、２．８×１０８若しくは約２．８×１０８、２．９×１０８若しくは約２．９×１０８、３×１０８若しくは約３×１０８、３．１×１０８若しくは約３．１×１０８、３．２×１０８若しくは約３．２×１０８、３．３×１０８若しくは約３．３×１０８、３．４×１０８若しくは約３．４×１０８又は３．５×１０８若しくは約３．５×１０８ＡＰＣであり、第２の急速拡大培養中に外因的に補充されたＡＰＣの数は、３．５×１０８若しくは約３．５×１０８、３．６×１０８若しくは約３．６×１０８、３．７×１０８若しくは約３．７×１０８、３．８×１０８若しくは約３．８×１０８、３．９×１０８若しくは約３．９×１０８、４×１０８若しくは約４×１０８、４．１×１０８若しくは約４．１×１０８、４．２×１０８若しくは約４．２×１０８、４．３×１０８若しくは約４．３×１０８、４．４×１０８若しくは約４．４×１０８、４．５×１０８若しくは約４．５×１０８、４．６×１０８若しくは約４．６×１０８、４．７×１０８若しくは約４．７×１０８、４．８×１０８若しくは約４．８×１０８、４．９×１０８若しくは約４．９×１０８、５×１０８若しくは約５×１０８、５．１×１０８若しくは約５．１×１０８、５．２×１０８若しくは約５．２×１０８、５．３×１０８若しくは約５．３×１０８、５．４×１０８若しくは約５．４×１０８、５．５×１０８若しくは約５．５×１０８、５．６×１０８若しくは約５．６×１０８、５．７×１０８若しくは約５．７×１０８、５．８×１０８若しくは約５．８×１０８、５．９×１０８若しくは約５．９×１０８、６×１０８若しくは約６×１０８、６．１×１０８若しくは約６．１×１０８、６．２×１０８若しくは約６．２×１０８、６．３×１０８若しくは約６．３×１０８、６．４×１０８若しくは約６．４×１０８、６．５×１０８若しくは約６．５×１０８、６．６×１０８若しくは約６．６×１０８、６．７×１０８若しくは約６．７×１０８、６．８×１０８若しくは約６．８×１０８、６．９×１０８若しくは約６．９×１０８、７×１０８若しくは約７×１０８、７．１×１０８若しくは約７．１×１０８、７．２×１０８若しくは約７．２×１０８、７．３×１０８若しくは約７．３×１０８、７．４×１０８若しくは約７．４×１０８、７．５×１０８若しくは約７．５×１０８、７．６×１０８若しくは約７．６×１０８、７．７×１０８若しくは約７．７×１０８、７．８×１０８若しくは約７．８×１０８、７．９×１０８若しくは約７．９×１０８、８×１０８若しくは約８×１０８、８．１×１０８若しくは約８．１×１０８、８．２×１０８若しくは約８．２×１０８、８．３×１０８若しくは約８．３×１０８、８．４×１０８若しくは約８．４×１０８、８．５×１０８若しくは約８．５×１０８、８．６×１０８若しくは約８．６×１０８、８．７×１０８若しくは約８．７×１０８、８．８×１０８若しくは約８．８×１０８、８．９×１０８若しくは約８．９×１０８、９×１０８若しくは約９×１０８、９．１×１０８若しくは約９．１×１０８、９．２×１０８若しくは約９．２×１０８、９．３×１０８若しくは約９．３×１０８、９．４×１０８若しくは約９．４×１０８、９．５×１０８若しくは約９．５×１０８、９．６×１０８若しくは約９．６×１０８、９．７×１０８若しくは約９．７×１０８、９．８×１０８若しくは約９．８×１０８、９．９×１０８若しくは約９．９×１０８又は１×１０９若しくは約１×１０９ＡＰＣである。
[00653] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数は、１．５×１０８又は約１．５×１０８ＡＰＣ～３×１０８又は約３×１０８ＡＰＣの範囲であり、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数は、４×１０８又は約４×１０８ＡＰＣ～７．５×１０８又は約７．５×１０８ＡＰＣの範囲である。
[00654] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数は、２×１０８又は約２×１０８ＡＰＣ～２．５×１０８又は約２．５×１０８ＡＰＣの範囲であり、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数は、４．５×１０８又は約４．５×１０８ＡＰＣ～５．５×１０８又は約５．５×１０８ＡＰＣの範囲である。
[00655] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数は、２．５×１０８又は約２．５×１０８ＡＰＣであり、第２の急速拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数は、５×１０８又は約５×１０８ＡＰＣである。
[00656] 一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目に添加されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、第１の初回刺激拡大培養の７日目（例えば、方法の７日目）に添加されたＰＢＭＣの数のおよそ半分である。特定の実施形態において、方法は、第１のＴＩＬ集団に第１の初回刺激拡大培養の０日目に抗原提示細胞を追加すること及び第２のＴＩＬ集団に７日目に抗原提示細胞を追加することを含み、ここで、０日目に添加された抗原提示細胞の数は、第１の初回刺激拡大培養の７日目（例えば、方法の７日目）に添加された抗原提示細胞の数のおよそ５０％である。
[00657] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＰＢＭＣの数より大きい。
[00658] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、１．０×１０６又は約１．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～４．５×１０６又は約４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の密度で培養フラスコに播種される。
[00659] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、１．５×１０６又は約１．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～３．５×１０６又は約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の密度で培養フラスコに播種される。
[00660] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２×１０６又は約２×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～３×１０６又は約３×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の密度で培養フラスコに播種される。
[00661] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２×１０６又は約２×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で培養フラスコに播種される。
[00662] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、１．０×１０６若しくは約１．０×１０６、１．１×１０６若しくは約１．１×１０６、１．２×１０６若しくは約１．２×１０６、１．３×１０６若しくは約１．３×１０６、１．４×１０６若しくは約１．４×１０６、１．５×１０６若しくは約１．５×１０６、１．６×１０６若しくは約１．６×１０６、１．７×１０６若しくは約１．７×１０６、１．８×１０６若しくは約１．８×１０６、１．９×１０６若しくは約１．９×１０６、２×１０６若しくは約２×１０６、２．１×１０６若しくは約２．１×１０６、２．２×１０６若しくは約２．２×１０６、２．３×１０６若しくは約２．３×１０６、２．４×１０６若しくは約２．４×１０６、２．５×１０６若しくは約２．５×１０６、２．６×１０６若しくは約２．６×１０６、２．７×１０６若しくは約２．７×１０６、２．８×１０６若しくは約２．８×１０６、２．９×１０６若しくは約２．９×１０６、３×１０６若しくは約３×１０６、３．１×１０６若しくは約３．１×１０６、３．２×１０６若しくは約３．２×１０６、３．３×１０６若しくは約３．３×１０６、３．４×１０６若しくは約３．４×１０６、３．５×１０６若しくは約３．５×１０６、３．６×１０６若しくは約３．６×１０６、３．７×１０６若しくは約３．７×１０６、３．８×１０６若しくは約３．８×１０６、３．９×１０６若しくは約３．９×１０６、４×１０６若しくは約４×１０６、４．１×１０６若しくは約４．１×１０６、４．２×１０６若しくは約４．２×１０６、４．３×１０６若しくは約４．３×１０６、４．４×１０６若しくは約４．４×１０６又は４．５×１０６若しくは約４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で培養フラスコに播種される。
[00663] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２．５×１０６又は約２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～７．５×１０６又は約７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の密度で培養フラスコに播種される。
[00664] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、３．５×１０６又は約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約６．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の密度で培養フラスコに播種される。
[00665] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、４．０×１０６又は約４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約６．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の密度で培養フラスコに播種される。
[00666] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、４．０×１０６又は約４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約５．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の密度で培養フラスコに播種される。
[00667] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、４．０×１０６又は約４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の密度で培養フラスコに播種される。
[00668] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２．５×１０６若しくは約２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２、２．６×１０６若しくは約２．６×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２、２．７×１０６若しくは約２．７×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２、２．８×１０６若しくは約２．８×１０６、２．９×１０６若しくは約２．９×１０６、３×１０６若しくは約３×１０６、３．１×１０６若しくは約３．１×１０６、３．２×１０６若しくは約３．２×１０６、３．３×１０６若しくは約３．３×１０６、３．４×１０６若しくは約３．４×１０６、３．５×１０６若しくは約３．５×１０６、３．６×１０６若しくは約３．６×１０６、３．７×１０６若しくは約３．７×１０６、３．８×１０６若しくは約３．８×１０６、３．９×１０６若しくは約３．９×１０６、４×１０６若しくは約４×１０６、４．１×１０６若しくは約４．１×１０６、４．２×１０６若しくは約４．２×１０６、４．３×１０６若しくは約４．３×１０６、４．４×１０６若しくは約４．４×１０６、４．５×１０６若しくは約４．５×１０６、４．６×１０６若しくは約４．６×１０６、４．７×１０６若しくは約４．７×１０６、４．８×１０６若しくは約４．８×１０６、４．９×１０６若しくは約４．９×１０６、５×１０６若しくは約５×１０６、５．１×１０６若しくは約５．１×１０６、５．２×１０６若しくは約５．２×１０６、５．３×１０６若しくは約５．３×１０６、５．４×１０６若しくは約５．４×１０６、５．５×１０６若しくは約５．５×１０６、５．６×１０６若しくは約５．６×１０６、５．７×１０６若しくは約５．７×１０６、５．８×１０６若しくは約５．８×１０６、５．９×１０６若しくは約５．９×１０６、６×１０６若しくは約６×１０６、６．１×１０６若しくは約６．１×１０６、６．２×１０６若しくは約６．２×１０６、６．３×１０６若しくは約６．３×１０６、６．４×１０６若しくは約６．４×１０６、６．５×１０６若しくは約６．５×１０６、６．６×１０６若しくは約６．６×１０６、６．７×１０６若しくは約６．７×１０６、６．８×１０６若しくは約６．８×１０６、６．９×１０６若しくは約６．９×１０６、７×１０６若しくは約７×１０６、７．１×１０６若しくは約７．１×１０６、７．２×１０６若しくは約７．２×１０６、７．３×１０６若しくは約７．３×１０６、７．４×１０６若しくは約７．４×１０６又は７．５×１０６若しくは約７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で培養フラスコに播種される。
[00669] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、１．０×１０６若しくは約１．０×１０６、１．１×１０６若しくは約１．１×１０６、１．２×１０６若しくは約１．２×１０６、１．３×１０６若しくは約１．３×１０６、１．４×１０６若しくは約１．４×１０６、１．５×１０６若しくは約１．５×１０６、１．６×１０６若しくは約１．６×１０６、１．７×１０６若しくは約１．７×１０６、１．８×１０６若しくは約１．８×１０６、１．９×１０６若しくは約１．９×１０６、２×１０６若しくは約２×１０６、２．１×１０６若しくは約２．１×１０６、２．２×１０６若しくは約２．２×１０６、２．３×１０６若しくは約２．３×１０６、２．４×１０６若しくは約２．４×１０６、２．５×１０６若しくは約２．５×１０６、２．６×１０６若しくは約２．６×１０６、２．７×１０６若しくは約２．７×１０６、２．８×１０６若しくは約２．８×１０６、２．９×１０６若しくは約２．９×１０６、３×１０６若しくは約３×１０６、３．１×１０６若しくは約３．１×１０６、３．２×１０６若しくは約３．２×１０６、３．３×１０６若しくは約３．３×１０６、３．４×１０６若しくは約３．４×１０６、３．５×１０６若しくは約３．５×１０６、３．６×１０６若しくは約３．６×１０６、３．７×１０６若しくは約３．７×１０６、３．８×１０６若しくは約３．８×１０６、３．９×１０６若しくは約３．９×１０６、４×１０６若しくは約４×１０６、４．１×１０６若しくは約４．１×１０６、４．２×１０６若しくは約４．２×１０６、４．３×１０６若しくは約４．３×１０６、４．４×１０６若しくは約４．４×１０６又は４．５×１０６若しくは約４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で培養フラスコに播種され、第２の急速拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２．５×１０６若しくは約２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２、２．６×１０６若しくは約２．６×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２、２．７×１０６若しくは約２．７×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２、２．８×１０６若しくは約２．８×１０６、２．９×１０６若しくは約２．９×１０６、３×１０６若しくは約３×１０６、３．１×１０６若しくは約３．１×１０６、３．２×１０６若しくは約３．２×１０６、３．３×１０６若しくは約３．３×１０６、３．４×１０６若しくは約３．４×１０６、３．５×１０６若しくは約３．５×１０６、３．６×１０６若しくは約３．６×１０６、３．７×１０６若しくは約３．７×１０６、３．８×１０６若しくは約３．８×１０６、３．９×１０６若しくは約３．９×１０６、４×１０６若しくは約４×１０６、４．１×１０６若しくは約４．１×１０６、４．２×１０６若しくは約４．２×１０６、４．３×１０６若しくは約４．３×１０６、４．４×１０６若しくは約４．４×１０６、４．５×１０６若しくは約４．５×１０６、４．６×１０６若しくは約４．６×１０６、４．７×１０６若しくは約４．７×１０６、４．８×１０６若しくは約４．８×１０６、４．９×１０６若しくは約４．９×１０６、５×１０６若しくは約５×１０６、５．１×１０６若しくは約５．１×１０６、５．２×１０６若しくは約５．２×１０６、５．３×１０６若しくは約５．３×１０６、５．４×１０６若しくは約５．４×１０６、５．５×１０６若しくは約５．５×１０６、５．６×１０６若しくは約５．６×１０６、５．７×１０６若しくは約５．７×１０６、５．８×１０６若しくは約５．８×１０６、５．９×１０６若しくは約５．９×１０６、６×１０６若しくは約６×１０６、６．１×１０６若しくは約６．１×１０６、６．２×１０６若しくは約６．２×１０６、６．３×１０６若しくは約６．３×１０６、６．４×１０６若しくは約６．４×１０６、６．５×１０６若しくは約６．５×１０６、６．６×１０６若しくは約６．６×１０６、６．７×１０６若しくは約６．７×１０６、６．８×１０６若しくは約６．８×１０６、６．９×１０６若しくは約６．９×１０６、７×１０６若しくは約７×１０６、７．１×１０６若しくは約７．１×１０６、７．２×１０６若しくは約７．２×１０６、７．３×１０６若しくは約７．３×１０６、７．４×１０６若しくは約７．４×１０６又は７．５×１０６若しくは約７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で培養フラスコに播種される。
[00670] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、１．０×１０６又は約１．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～４．５×１０６又は約４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の密度で培養フラスコに播種され、第２の急速拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２．５×１０６又は約２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～７．５×１０６又は約７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の密度で培養フラスコに播種される。
[00671] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、１．５×１０６又は約１．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～３．５×１０６又は約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の密度で培養フラスコに播種され、第２の急速拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、３．５×１０６又は約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～６×１０６又は約６×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の密度で培養フラスコに播種される。
[00672] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２×１０６又は約２×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～３×１０６又は約３×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の密度で培養フラスコに播種され、第２の急速拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、４×１０６又は約４×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～５．５×１０６又は約５．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の密度で培養フラスコに播種される。
[00673] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２×１０６又は約２×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で培養フラスコに播種され、第２の急速拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、４×１０６又は約４×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で培養フラスコに播種される。
[00674] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＰＢＭＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２０：１又は約２０：１の範囲である。
[00675] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＰＢＭＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～１０：１又は約１０：１の範囲である。
[00676] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＰＢＭＣの数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～９：１又は約９：１の範囲である。
[00677] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～８：１又は約８：１の範囲である。
[00678] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～７：１又は約７：１の範囲である。
[00679] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～６：１又は約６：１の範囲である。
[00680] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～５：１又は約５：１の範囲である。
[00681] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～４：１又は約４：１の範囲である。
[00682] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～３：１又は約３：１の範囲である。
[00683] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．９：１又は約２．９：１の範囲である。
[00684] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．８：１又は約２．８：１の範囲である。
[00685] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．７：１又は約２．７：１の範囲である。
[00686] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．６：１又は約２．６：１の範囲である。
[00687] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．５：１又は約２．５：１の範囲である。
[00688] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．４：１又は約２．４：１の範囲である。
[00689] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．３：１又は約２．３：１の範囲である。
[00690] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．２：１又は約２．２：１の範囲である。
[00691] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．１：１又は約２．１：１の範囲である。
[00692] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２：１又は約２：１の範囲である。
[00693] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～１０：１又は約１０：１の範囲である。
[00694] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～５：１又は約５：１の範囲である。
[00695] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１～４：１又は約２：１～約４：１の範囲である。
[00696] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１～３：１又は約２：１～約３：１の範囲である。
[00697] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．９：１又は約２．９：１の範囲である。
[00698] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．８：１又は約２．８：１の範囲である。
[00699] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．７：１又は約２．７：１の範囲である。
[00700] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．６：１又は約２．６：１の範囲である。
[00701] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．５：１又は約２．５：１の範囲である。
[00702] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．４：１又は約２．４：１の範囲である。
[00703] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．３：１又は約２．３：１の範囲である。
[00704] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．２：１又は約２．２：１の範囲である。
[00705] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．１：１又は約２．１：１の範囲である。
[00706] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１である。
[00707] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１若しくは約１．１：１、１．２：１若しくは約１．２：１、１．３：１若しくは約１．３：１、１．４：１若しくは約１．４：１、１．５：１若しくは約１．５：１、１．６：１若しくは約１．６：１、１．７：１若しくは約１．７：１、１．８：１若しくは約１．８：１、１．９：１若しくは約１．９：１、２：１若しくは約２：１、２．１：１若しくは約２．１：１、２．２：１若しくは約２．２：１、２．３：１若しくは約２．３：１、２．４：１若しくは約２．４：１、２．５：１若しくは約２．５：１、２．６：１若しくは約２．６：１、２．７：１若しくは約２．７：１、２．８：１若しくは約２．８：１、２．９：１若しくは約２．９：１、３：１若しくは約３：１、３．１：１若しくは約３．１：１、３．２：１若しくは約３．２：１、３．３：１若しくは約３．３：１、３．４：１若しくは約３．４：１、３．５：１若しくは約３．５：１、３．６：１若しくは約３．６：１、３．７：１若しくは約３．７：１、３．８：１若しくは約３．８：１、３．９：１若しくは約３．９：１、４：１若しくは約４：１、４．１：１若しくは約４．１：１、４．２：１若しくは約４．２：１、４．３：１若しくは約４．３：１、４．４：１若しくは約４．４：１、４．５：１若しくは約４．５：１、４．６：１若しくは約４．６：１、４．７：１若しくは約４．７：１、４．８：１若しくは約４．８：１、４．９：１若しくは約４．９：１又は５：１若しくは５：１である。
[00708] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、１×１０８個若しくは約１×１０８個、１．１×１０８個若しくは約１．１×１０８個、１．２×１０８個若しくは約１．２×１０８個、１．３×１０８個若しくは約１．３×１０８個、１．４×１０８個若しくは約１．４×１０８個、１．５×１０８個若しくは約１．５×１０８個、１．６×１０８個若しくは約１．６×１０８個、１．７×１０８個若しくは約１．７×１０８個、１．８×１０８個若しくは約１．８×１０８個、１．９×１０８個若しくは約１．９×１０８個、２×１０８個若しくは約２×１０８個、２．１×１０８個若しくは約２．１×１０８個、２．２×１０８個若しくは約２．２×１０８個、２．３×１０８個若しくは約２．３×１０８個、２．４×１０８個若しくは約２．４×１０８個、２．５×１０８個若しくは約２．５×１０８個、２．６×１０８個若しくは約２．６×１０８個、２．７×１０８個若しくは約２．７×１０８個、２．８×１０８個若しくは約２．８×１０８個、２．９×１０８個若しくは約２．９×１０８個、３×１０８個若しくは約３×１０８個、３．１×１０８個若しくは約３．１×１０８個、３．２×１０８個若しくは約３．２×１０８個、３．３×１０８個若しくは約３．３×１０８個、３．４×１０８個若しくは約３．４×１０８個又は３．５×１０８個若しくは約３．５×１０８個のＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）であり、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、３．５×１０８個若しくは約３．５×１０８個、３．６×１０８個若しくは約３．６×１０８個、３．７×１０８個若しくは約３．７×１０８個、３．８×１０８個若しくは約３．８×１０８個、３．９×１０８個若しくは約３．９×１０８個、４×１０８個若しくは約４×１０８個、４．１×１０８個若しくは約４．１×１０８個、４．２×１０８個若しくは約４．２×１０８個、４．３×１０８個若しくは約４．３×１０８個、４．４×１０８個若しくは約４．４×１０８個、４．５×１０８個若しくは約４．５×１０８個、４．６×１０８個若しくは約４．６×１０８個、４．７×１０８個若しくは約４．７×１０８個、４．８×１０８個若しくは約４．８×１０８個、４．９×１０８個若しくは約４．９×１０８個、５×１０８個若しくは約５×１０８個、５．１×１０８個若しくは約５．１×１０８個、５．２×１０８個若しくは約５．２×１０８個、５．３×１０８個若しくは約５．３×１０８個、５．４×１０８個若しくは約５．４×１０８個、５．５×１０８個若しくは約５．５×１０８個、５．６×１０８個若しくは約５．６×１０８個、５．７×１０８個若しくは約５．７×１０８個、５．８×１０８個若しくは約５．８×１０８個、５．９×１０８個若しくは約５．９×１０８個、６×１０８個若しくは約６×１０８個、６．１×１０８個若しくは約６．１×１０８個、６．２×１０８個若しくは約６．２×１０８個、６．３×１０８個若しくは約６．３×１０８個、６．４×１０８個若しくは約６．４×１０８個、６．５×１０８個若しくは約６．５×１０８個、６．６×１０８個若しくは約６．６×１０８個、６．７×１０８個若しくは約６．７×１０８個、６．８×１０８個若しくは約６．８×１０８個、６．９×１０８個若しくは約６．９×１０８個、７×１０８個若しくは約７×１０８個、７．１×１０８個若しくは約７．１×１０８個、７．２×１０８個若しくは約７．２×１０８個、７．３×１０８個若しくは約７．３×１０８個、７．４×１０８個若しくは約７．４×１０８個、７．５×１０８個若しくは約７．５×１０８個、７．６×１０８個若しくは約７．６×１０８個、７．７×１０８個若しくは約７．７×１０８個、７．８×１０８個若しくは約７．８×１０８個、７．９×１０８個若しくは約７．９×１０８個、８×１０８個若しくは約８×１０８個、８．１×１０８個若しくは約８．１×１０８個、８．２×１０８個若しくは約８．２×１０８個、８．３×１０８個若しくは約８．３×１０８個、８．４×１０８個若しくは約８．４×１０８個、８．５×１０８個若しくは約８．５×１０８個、８．６×１０８個若しくは約８．６×１０８個、８．７×１０８個若しくは約８．７×１０８個、８．８×１０８個若しくは約８．８×１０８個、８．９×１０８個若しくは約８．９×１０８個、９×１０８個若しくは約９×１０８個、９．１×１０８個若しくは約９．１×１０８個、９．２×１０８個若しくは約９．２×１０８個、９．３×１０８個若しくは約９．３×１０８個、９．４×１０８個若しくは約９．４×１０８個、９．５×１０８個若しくは約９．５×１０８個、９．６×１０８個若しくは約９．６×１０８個、９．７×１０８個若しくは約９．７×１０８個、９．８×１０８個若しくは約９．８×１０８個、９．９×１０８個若しくは約９．９×１０８個又は１×１０９個若しくは約１×１０９個のＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）である。
[00709] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、１×１０８又は約１×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～３．５×１０８又は約３．５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲であり、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、３．５×１０８又は約３．５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～１×１０９又は約１×１０９ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲である。
[00710] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、１．５×１０８又は約１．５×１０８ＡＰＣ～３×１０８又は約３×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲であり、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、４×１０８又は約４×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～７．５×１０８又は約７．５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲である。
[00711] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、２×１０８又は約２×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～２．５×１０８又は約２．５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲であり、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、４．５×１０８又は約４．５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～５．５×１０８又は約５．５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲である。
[00712] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、２．５×１０８又は約２．５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）であり、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、５×１０８又は約５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）である。
[00713] 一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目に添加されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の層数は、第２の急速拡大培養の７日目に添加されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の層数のおよそ半分である。一定の実施形態において、方法は、第１のＴＩＬ集団に第１の初回刺激拡大培養の０日目に抗原提示細胞層を追加すること及び第２のＴＩＬ集団に７日目に抗原提示細胞層を追加することを含み、ここで、０日目に添加された抗原提示細胞層の数は、７日目に添加された抗原提示細胞層の数のおよそ５０％である。
[00714] 別の実施形態において、第２の急速拡大培養の７日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の層数は、第１の初回刺激拡大培養の０日目に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の層数より大きい。
[00715] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、２又は約２細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、４又は約４細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。
[00716] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、１又は約１細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、３又は約３細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。
[00717] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、１．５又は約１．５細胞層～２．５又は約２．５細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、３又は約３細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。
[00718] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、１又は約１細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、２又は約２細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。
[00719] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、１若しくは約１、１．１若しくは約１．１、１．２若しくは約１．２、１．３若しくは約１．３、１．４若しくは約１．４、１．５若しくは約１．５、１．６若しくは約１．６、１．７若しくは約１．７、１．８若しくは約１．８、１．９若しくは約１．９、２若しくは約２、２．１若しくは約２．１、２．２若しくは約２．２、２．３若しくは約２．３、２．４若しくは約２．４、２．５若しくは約２．５、２．６若しくは約２．６、２．７若しくは約２．７、２．８若しくは約２．８、２．９若しくは約２．９又は３若しくは約３細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、３．１若しくは約３．１、３．２若しくは約３．２、３．３若しくは約３．３、３．４若しくは約３．４、３．５若しくは約３．５、３．６若しくは約３．６、３．７若しくは約３．７、３．８若しくは約３．８、３．９若しくは約３．９、４若しくは約４、４．１若しくは約４．１、４．２若しくは約４．２、４．３若しくは約４．３、４．４若しくは約４．４、４．５若しくは約４．５、４．６若しくは約４．６、４．７若しくは約４．７、４．８若しくは約４．８、４．９若しくは約４．９、５若しくは約５、５．１若しくは約５．１、５．２若しくは約５．２、５．３若しくは約５．３、５．４若しくは約５．４、５．５若しくは約５．５、５．６若しくは約５．６、５．７若しくは約５．７、５．８若しくは約５．８、５．９若しくは約５．９、６若しくは約６、６．１若しくは約６．１、６．２若しくは約６．２、６．３若しくは約６．３、６．４若しくは約６．４、６．５若しくは約６．５、６．６若しくは約６．６、６．７若しくは約６．７、６．８若しくは約６．８、６．９若しくは約６．９、７若しくは約７、７．１若しくは約７．１、７．２若しくは約７．２、７．３若しくは約７．３、７．４若しくは約７．４、７．５若しくは約７．５、７．６若しくは約７．６、７．７若しくは約７．７、７．８若しくは約７．８、７．９若しくは約７．９又は８若しくは約８細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。
[00720] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、１又は約１細胞層～２又は約２細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、３又は約３細胞層～１０又は約１０細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。
[00721] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、２又は約２細胞層～３又は約３細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、４又は約４細胞層～８又は約８細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。
[00722] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、２又は約２細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、４又は約４細胞層～８又は約８細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。
[00723] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、１若しくは約１、２若しくは約２又は３若しくは約３細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９又は１０若しくは約１０細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。
[00724] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：１０又は約１：１０の範囲である。
[00725] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：８又は約１：８の範囲である。
[00726] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：７又は約１：７の範囲である。
[00727] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：６又は約１：６の範囲である。
[00728] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：５又は約１：５の範囲である。
[00729] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：４又は約１：４の範囲である。
[00730] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：３又は約１：３の範囲である。
[00731] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：２又は約１：２の範囲である。
[00732] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．２又は約１：１．２～１：８又は約１：８の範囲である。
[00733] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．３又は約１：１．３～１：７又は約１：７の範囲である。
[00734] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．４又は約１：１．４～１：６又は約１：６の範囲である。
[00735] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．５又は約１：１．５～１：５又は約１：５の範囲である。
[00736] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．６又は約１：１．６～１：４又は約１：４の範囲である。
[00737] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．７又は約１：１．７～１：３．５又は約１：３．５の範囲である。
[00738] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．８又は約１：１．８～１：３又は約１：３の範囲である。
[00739] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．９又は約１：１．９～１：２．５又は約１：２．５の範囲である。
[00740] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：２又は約１：２である。
[00741] 別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の急速拡大培養の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ここで、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１若しくは約１：１．１、１：１．２若しくは約１：１．２、１：１．３若しくは約１：１．３、１：１．４若しくは約１：１．４、１：１．５若しくは約１：１．５、１：１．６若しくは約１：１．６、１：１．７若しくは約１：１．７、１：１．８若しくは約１：１．８、１：１．９若しくは約１：１．９、１：２若しくは約１：２、１：２．１若しくは約１：２．１、１：２．２若しくは約１：２．２、１：２．３若しくは約１：２．３、１：２．４若しくは約１：２．４、１：２．５若しくは約１：２．５、１：２．６若しくは約１：２．６、１：２．７若しくは約１：２．７、１：２．８若しくは約１：２．８、１：２．９若しくは約１：２．９、１：３若しくは約１：３、１：３．１若しくは約１：３．１、１：３．２若しくは約１：３．２、１：３．３若しくは約１：３．３、１：３．４若しくは約１：３．４、１：３．５若しくは約１：３．５、１：３．６若しくは約１：３．６、１：３．７若しくは約１：３．７、１：３．８若しくは約１：３．８、１：３．９若しくは約１：３．９、１：４若しくは約１：４、１：４．１若しくは約１：４．１、１：４．２若しくは約１：４．２、１：４．３若しくは約１：４．３、１：４．４若しくは約１：４．４、１：４．５若しくは約１：４．５、１：４．６若しくは約１：４．６、１：４．７若しくは約１：４．７、１：４．８若しくは約１：４．８、１：４．９若しくは約１：４．９、１：５若しくは約１：５、１：５．１若しくは約１：５．１、１：５．２若しくは約１：５．２、１：５．３若しくは約１：５．３、１：５．４若しくは約１：５．４、１：５．５若しくは約１：５．５、１：５．６若しくは約１：５．６、１：５．７若しくは約１：５．７、１：５．８若しくは約１：５．８、１：５．９若しくは約１：５．９、１：６若しくは約１：６、１：６．１若しくは約１：６．１、１：６．２若しくは約１：６．２、１：６．３若しくは約１：６．３、１：６．４若しくは約１：６．４、１：６．５若しくは約１：６．５、１：６．６若しくは約１：６．６、１：６．７若しくは約１：６．７、１：６．８若しくは約１：６．８、１：６．９若しくは約１：６．９、１：７若しくは約１：７、１：７．１若しくは約１：７．１、１：７．２若しくは約１：７．２、１：７．３若しくは約１：７．３、１：７．４若しくは約１：７．４、１：７．５若しくは約１：７．５、１：７．６若しくは約１：７．６、１：７．７若しくは約１：７．７、１：７．８若しくは約１：７．８、１：７．９若しくは約１：７．９、１：８若しくは約１：８、１：８．１若しくは約１：８．１、１：８．２若しくは約１：８．２、１：８．３若しくは約１：８．３、１：８．４若しくは約１：８．４、１：８．５若しくは約１：８．５、１：８．６若しくは約１：８．６、１：８．７若しくは約１：８．７、１：８．８若しくは約１：８．８、１：８．９若しくは約１：８．９、１：９若しくは約１：９、１：９．１若しくは約１：９．１、１：９．２若しくは約１：９．２、１：９．３若しくは約１：９．３、１：９．４若しくは約１：９．４、１：９．５若しくは約１：９．５、１：９．６若しくは約１：９．６、１：９．７若しくは約１：９．７、１：９．８若しくは約１：９．８、１：９．９若しくは約１：９．９又は１：１０若しくは約１：１０である。
[00742] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数は、約１．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲であり、第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、約２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲である。
[00743] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数は、約１．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲であり、第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約６．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲である。
[00744] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数は、約２．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約３．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲であり、第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、約４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約５．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲である。
Ｈ．任意選択の細胞培地成分
１．抗ＣＤ３抗体
[00745] 一部の実施形態において、本明細書に記載の拡大培養方法で使用される培養培地（例えば、図１を参照されたい（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ））は、抗ＣＤ３抗体を含む。抗ＣＤ３抗体をＩＬ－２と併用すると、ＴＩＬ集団においてＴ細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は完全長抗体並びにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見ることができ、前者が概して好ましい；例えば、Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719（参照により全体として本明細書に援用される）を参照されたい。
[00746] 当業者が理解し得る通り、本発明において使用が見出される好適な抗ヒトＣＤ３抗体は、限定はされないが、ネズミ科動物、ヒト、霊長類、ラット及びイヌ科動物抗体を含めた、様々な哺乳類からの抗ヒトＣＤ３ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含め、幾つも存在する。詳細な実施形態において、ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体が使用される（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）。
Figure 2022514023000008
２．４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト
[00747] 一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養及び／又は第２の急速拡大培養の細胞培養培地は、ＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストである。４－１ＢＢアゴニストは、当技術分野で公知の任意の４－１ＢＢ結合分子であり得る。４－１ＢＢ結合分子は、ヒト又は哺乳類４－１ＢＢに結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。４－１ＢＢアゴニスト又は４－１ＢＢ結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。４－１ＢＢアゴニスト又は４－１ＢＢ結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体（全長抗体を含む）、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体並びに抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片及び４－１ＢＢに結合する抗体の操作された形態、例えばｓｃＦｖ分子も含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のための４－１ＢＢアゴニストは、抗４－１ＢＢ抗体、ヒト抗４－１ＢＢ抗体、マウス抗４－１ＢＢ抗体、哺乳動物抗４－１ＢＢ抗体、モノクローナル抗４－１ＢＢ抗体、ポリクローナル抗４－１ＢＢ抗体、キメラ抗４－１ＢＢ抗体、抗４－１ＢＢアドネクチン、抗４－１ＢＢドメイン抗体、単鎖抗４－１ＢＢ断片、重鎖抗４－１ＢＢ断片、軽鎖抗４－１ＢＢ断片、抗４－１ＢＢ融合タンパク質及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーを含む。アゴニスト性抗４－１ＢＢ抗体は、強い免疫応答を誘導することが知られている。Lee, et al., PLOS One 2013, 8, e69677。好ましい実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、アゴニスト性、抗４－１ＢＢヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体（即ち単一細胞株に由来する抗体）である。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ＥＵ－１０１（Eutilex Co. Ltd.）、ウトミルマブ若しくはウレルマブ又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。好ましい一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブ又はウレルマブ又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。
[00748] 好ましい実施形態において、４－１ＢＢアゴニスト又は４－１ＢＢ結合分子は、融合タンパク質でもあり得る。好ましい実施形態において、三量体又は六量体４－１ＢＢアゴニスト（３つ又は６つのリガンド結合ドメインを有する）などの多量体４－１ＢＢアゴニストは、典型的には２つのリガンド結合ドメインを保有するアゴニスト性モノクローナル抗体と比較して、優れた受容体（４－１ＢＢＬ）のクラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。３つのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン及びＩｇＧ１－Ｆｃを含み、任意選択によりこれらの融合タンパク質の２つ以上を更に連結する、三量体（三価）又は六量体（又は六価）又はそれより大きい融合タンパク質は、例えば、Gieffers, et al., Mol.Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47に記載される。
[00749] アゴニスト性４－１ＢＢ抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘導することが知られている。好ましい実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、毒性を低減するのに十分な方法で４－１ＢＢ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、例えばＮＫ細胞の細胞傷害性を抑制する、アゴニスト性４－１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を抑制する、アゴニスト性４－１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を抑制する、アゴニスト性４－１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ領域機能性を抑制する、アゴニスト性４－１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。
[00750] 一部の実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、高い親和性及びアゴニスト活性でヒト４－１ＢＢ（配列番号９）に結合することを特徴とする。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ヒト４－１ＢＢ（配列番号９）に結合する結合分子である。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、マウス４－１ＢＢ（配列番号１０）に結合する結合分子である。４－１ＢＢアゴニスト又は結合分子が結合する４－１ＢＢ抗原のアミノ酸配列を表６に概括する。
Figure 2022514023000009
[00751] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約１００ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約９０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約８０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約７０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約６０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約５０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約４０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、又は約３０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合する、４－１ＢＢアゴニストを含む。
[00752] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約８×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約８．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約９×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約９．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、又は約１×１０６ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合する、４－１ＢＢアゴニストを含む。
[00753] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約２×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．１×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．２×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．３×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．４×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．５×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．６×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、又は約２．７×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．８×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．９×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、又は約３×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合する、４－１ＢＢアゴニストを含む。
[00754] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約９ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約８ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約７ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約６ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約５ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約４ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約３ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、又は約１ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合する、４－１ＢＢアゴニストを含む。
[00755] 好ましい実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ＰＦ－０５０８２５６６又はＭＯＲ－７４８０としても知られるウトミルマブ又はその断片、誘導体、変異体若しくはバイオシミラーである。ウトミルマブはPfizer, Inc.から入手できる。ウトミルマブは、免疫グロブリンＧ２－ラムダ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー９、４－１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ヒト（Homo sapiens）（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウトミルマブのアミノ酸配列を表７に示す。ウトミルマブは、Ａｓｎ５９及びＡｓｎ２９２のグリコシル化部位；位置２２－９６（ＶＨ－ＶＬ）、１４３－１９９（ＣＨ１－ＣＬ）、２５６－３１６（ＣＨ２）及び３６２－４２０（ＣＨ３）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２２’－８７’（ＶＨ－ＶＬ）及び１３６’－１９５’（ＣＨ１－ＣＬ）の軽鎖内ジスルフィド架橋；ＩｇＧ２Ａアイソフォーム位置２１８－２１８、２１９－２１９、２２２－２２２及び２２５－２２５、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム位置２１８－１３０、２１９－２１９、２２２－２２２及び２２５－２２５並びにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム位置２１９－１３０（２）、２２２－２２２及び２２５－２２５の鎖内重鎖－重鎖ジスルフィド架橋；ＩｇＧ２Ａアイソフォーム位置１３０－２１３’（２）、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム位置２１８－２１３’及び１３０－２１３’並びにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム位置２１８－２１３’（２）の鎖内重鎖－軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウトミルマブ並びにその変異体及び断片の調製並びに特性は、米国特許第８，８２１，８６７号；第８，３３７，８５０号；及び第９，４６８，６７８号並びに国際公開第２０１２／０３２４３３ Ａ１号に記載され、これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に援用される。ウトミルマブの前臨床的特徴は、Fisher, et al., Cancer Immunolog. & Immunother.2012, 61, 1721-33に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウトミルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０２４４４７９３、ＮＣＴ０１３０７２６７、ＮＣＴ０２３１５０６６及びＮＣＴ０２５５４８１２が含まれる。
[00756] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号１１で示される重鎖及び配列番号１２で示される軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00757] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号１３に示される配列を含み、４－１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号１４に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
[00758] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにそれらの保存的アミノ酸置換を含む。
[00759] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブに関して薬物規制当局によって承認された４－１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む４－１ＢＢ抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出された４－１ＢＢアゴニスト抗体であり、４－１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。４－１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。
Figure 2022514023000010
[00760] 好ましい実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ＢＭＳ－６６３５１３及び２０Ｈ４．９．ｈ４ａとしても知られるモノクローナル抗体ウレルマブ又はその断片、誘導体、変異体若しくはバイオシミラーである。ウレルマブは、Bristol-Myers Squibb, Inc.及びCreative Biolabs, Inc.から入手できる。ウレルマブは、免疫グロブリンＧ４－カッパ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９、４－１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ヒト（Homo sapiens）（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウレルマブのアミノ酸配列を表ＥＥに示す。ウレルマブは、位置２９８（及び２９８’’）のＮ－グリコシル化部位；位置２２－９５（ＶＨ－ＶＬ）、１４８－２０４（ＣＨ１－ＣＬ）、２６２－３２２（ＣＨ２）及び３６８－４２６（ＣＨ３）（並びに位置２２’’－９５’’、１４８’’－２０４’’、２６２’’－３２２’’及び３６８’’－４２６’’）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２３’－８８’（ＶＨ－ＶＬ）及び１３６’－１９６’（ＣＨ１－ＣＬ）（並びに位置２３’’’－８８’’’及び１３６’’’－１９６’’’）の軽鎖内ジスルフィド架橋；位置２２７－２２７’’及び２３０－２３０’’の鎖内重鎖－重鎖ジスルフィド架橋；並びに位置１３５－２１６’及び１３５’’－２１６’’’の鎖内重鎖－軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウレルマブ並びにその変異体及び断片の調製及び特性は、米国特許第７，２８８，６３８号及び第８，９６２，８０４号に記載され、その開示は参照により本明細書に援用される。ウレルマブの前臨床的及び臨床的特徴は、http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272で入手可能なSegal, et al., Clin.Cancer Res.2016に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウレルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０１７７５６３１、ＮＣＴ０２１１００８２、ＮＣＴ０２２５３９９２及びＮＣＴ０１４７１２１０が含まれる。
[00761] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号２１で示される重鎖及び配列番号２２で示される軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00762] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号２３に示される配列を含み、４－１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号２４に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
[00763] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00764] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブに関して薬物規制当局によって承認された４－１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む４－１ＢＢ抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出された４－１ＢＢアゴニスト抗体であり、４－１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。４－１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。
Figure 2022514023000011
[00765] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、１Ｄ８、３Ｅｌｏｒ、４Ｂ４（BioLegend 309809）、Ｈ４－１ＢＢ－Ｍ１２７（BD Pharmingen 552532）、ＢＢＫ２（Thermo Fisher MS621PABX）、１４５５０１（Leinco Technologies B591）、ＡＴＣＣ番号ＨＢ－１１２４８として寄託され、米国特許第６，９７４，８６３号に開示されている細胞株によって産生される抗体、５Ｆ４（BioLegend 31 1503）、Ｃ６５－４８５（BD Pharmingen 559446）、米国特許出願公開第２００５／００９５２４４号に開示されている抗体、米国特許第７，２８８，６３８号に開示されている抗体（２０Ｈ４．９－ＩｇＧｌ（ＢＭＳ－６６３０３１）など）、同第６，８８７，６７３号に開示されている抗体（４Ｅ９又はＢＭＳ－５５４２７１など）、同第７，２１４，４９３号に開示されている抗体、同第６，３０３，１２１号に開示されている抗体、同第６，５６９，９９７号に開示されている抗体、同第６，９０５，６８５号に開示されている抗体（４Ｅ９又はＢＭＳ－５５４２７１など）、同第６，３６２，３２５号に開示されている抗体（１Ｄ８又はＢＭＳ－４６９４９２；３Ｈ３又はＢＭＳ－４６９４９７；又は３Ｅｌなど）、同第６，９７４，８６３号に開示されている抗体（５３Ａ２など）；同第６，２１０，６６９号に開示されている抗体（１Ｄ８、３Ｂ８又は３Ｅ１など）、同第５，９２８，８９３号に記載されている抗体、同第６，３０３，１２１号に開示されている抗体、同第６，５６９，９９７号に開示されている抗体、国際公開第２０１２／１７７７８８号、同第２０１５／１１９９２３号及び同第２０１０／０４２４３３号に開示されている抗体並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体又はバイオシミラー、からなる群から選択され、ここで、前述の特許又は特許出願公開のそれぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。
[00766] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、国際公開第２００８／０２５５１６ Ａ１号、同第２００９／００７１２０ Ａ１号、同第２０１０／００３７６６ Ａ１号、同第２０１０／０１００５１ Ａ１号及び同第２０１０／０７８９６６ Ａ１号；米国特許出願公開第２０１１／００２７２１８ Ａ１号、同第２０１５／０１２６７０９ Ａ１号、同第２０１１／０１１１４９４ Ａ１号、同第２０１５／０１１０７３４ Ａ１号及び同第２０１５／０１２６７１０ Ａ１号；並びに米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号及び同第８，４５０，４６０号に記載されている４－１ＢＢアゴニスト性融合タンパク質であり、その開示は参照により本明細書に援用される。
[00767] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、図５８に提供されるように、構造Ｉ－Ａ（Ｃ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）又は構造Ｉ－Ｂ（Ｎ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）に示される４－１ＢＢアゴニスト性融合タンパク質又はその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂにおいて、円柱は個々のポリペプチド結合ドメインを指す。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂは、例えば、４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢリガンド、ＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ）若しくは腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＳＦ９））又は４－１ＢＢに結合する抗体に由来する３つの直鎖状に連結されたＴＮＦＲＳＦ結合ドメインを含み、これは折り畳まれて三価タンパク質を形成し、次いで、ＩｇＧ１－Ｆｃ（ＣＨ３及びＣＨ２ドメインを含む）を介して第２の三価タンパク質に連結され、次いで、これはジスルフィド結合（小さい細長い楕円形）を介して２つの三価タンパク質を連結するために使用され、構造を安定化し、６つの受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン及びシグナル伝達タンパク質をあわせてシグナル伝達複合体を形成できるアゴニストを提供する。円柱として示されるＴＮＦＲＳＦ結合ドメインは、例えば、親水性残基並びに柔軟性のためのＧｌｙ及びＳｅｒ配列並びに溶解性のためのＧｌｕ及びＬｙｓを含み得るリンカーにより接続されたＶＨ及びＶＬ鎖を含む、ｓｃＦｖドメインであり得る。de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44；Ahmad, et al., Clin. & Dev.Immunol.2012, 980250；Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208；又は本明細書の別の箇所に組み込まれた参考文献に記載されているものなどの任意のｓｃＦｖドメイン設計が使用され得る。この形態の融合タンパク質構造は、米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号及び同第８，４５０，４６０号に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
[00768] 構造Ｉ－Ａの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表９に示す。Ｆｃドメインは、好ましくは、完全定常ドメイン（配列番号３１のアミノ酸１７～２３０）、完全ヒンジドメイン（配列番号３１のアミノ酸１～１６）又はヒンジドメインの一部（例えば、配列番号３１のアミノ酸４～１６）を含む。Ｃ末端Ｆｃ抗体を接続するための好ましいリンカーは、追加的ポリペプチドの融合に適したリンカーを含む、配列番号３２～配列番号４１に示される実施形態から選択され得る。
Figure 2022514023000012
[00769] 構造Ｉ－Ｂの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表１０に示す。構造Ｉ－ＢのようにＦｃ抗体断片がＴＮＲＦＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合、Ｆｃモジュールの配列は好ましくは配列番号４２に示されるものであり、リンカー配列は好ましくは配列番号４３～配列番号４５に示される実施形態から選択される。
Figure 2022514023000013
[00770] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウレルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、表１０に記載されている可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、上記の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ並びにその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体及びバイオシミラーからなる群から選択される１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。
[00771] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、４－１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号４６による配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、可溶性４－１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号４７による配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。
[00772] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、表１１に示されるＶＨ及びＶＬ配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。
Figure 2022514023000014
[00773] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４－１ＢＢ結合ドメインを含む４－１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインである。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４－１ＢＢ結合ドメインを含む４－１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインであり、可溶性４－１ＢＢドメインのそれぞれは、ストーク領域（三量体化に寄与し、細胞膜まで一定の距離を提供するが、４－１ＢＢ結合ドメインの一部ではない）を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３～８アミノ酸長を有する。
[00774] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインを含む４－１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、ここで、可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインのそれぞれは、ストーク領域を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３～８アミノ酸長を有し、各ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインは４－１ＢＢ結合ドメインである。
[00775] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、前述のＶＬドメインのいずれかに連結された前述のＶＨドメインのいずれかを含む４－１ＢＢアゴニスト性ｓｃＦｖ抗体である。
[00776] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、BPS Bioscience４－１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号７９０９７－２であり、これはBPS Bioscience, San Diego, CA, USAから市販されている。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、Creative Biolabs４－１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号ＭＯＭ－１８１７９であり、これはCreative Biolabs, Shirley, NY, USAから市販されている。
３．ＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニスト
[00777] 一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニストである。ＯＸ４０アゴニストは、当技術分野で公知の任意のＯＸ４０結合分子であり得る。ＯＸ４０結合分子は、ヒト又は哺乳類ＯＸ４０に結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。ＯＸ４０アゴニスト又はＯＸ４０結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。ＯＸ４０アゴニスト又はＯＸ４０結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体（全長抗体を含む）、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体並びに抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片及びＯＸ４０に結合する抗体の操作された形態、例えばｓｃＦｖ分子も含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のためのＯＸ４０アゴニストは、抗ＯＸ４０抗体、ヒト抗ＯＸ４０抗体、マウス抗ＯＸ４０抗体、哺乳動物抗ＯＸ４０抗体、モノクローナル抗ＯＸ４０抗体、ポリクローナル抗ＯＸ４０抗体、キメラ抗ＯＸ４０抗体、抗ＯＸ４０アドネクチン、抗ＯＸ４０ドメイン抗体、単鎖抗ＯＸ４０断片、重鎖抗ＯＸ４０断片、軽鎖抗ＯＸ４０断片、抗ＯＸ４０融合タンパク質及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーを含む。好ましい実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、アゴニスト性、抗ＯＸ４０ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体（即ち単一細胞株に由来する抗体）である。
[00778] 好ましい実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト又はＯＸ４０結合分子は、融合タンパク質でもあり得る。ＯＸ４０Ｌに融合したＦｃドメインを含むＯＸ４０融合タンパク質は、例えば、Sadun, et al., J. Immunother.2009, 182, 1481-89に記載されている。好ましい実施形態において、三量体又は六量体ＯＸ４０アゴニスト（３つ又は６つのリガンド結合ドメインを有する）などの多量体ＯＸ４０アゴニストは、典型的には２つのリガンド結合ドメインを保有するアゴニスト性モノクローナル抗体と比較して、優れた受容体（ＯＸ４０Ｌ）のクラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。３つのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン及びＩｇＧ１－Ｆｃを含み、任意選択によりこれらの融合タンパク質の２つ以上を更に連結する、三量体（三価）又は六量体（又は六価）又はそれより大きい融合タンパク質は、例えば、Gieffers, et al., Mol.Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47に記載される。
[00779] アゴニスト性ＯＸ４０抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘発することが知られている。Curti, et al., Cancer Res.2013, 73, 7189-98。好ましい実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、毒性を低減するのに十分な方法でＯＸ４０抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、例えばＮＫ細胞の細胞傷害性を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｆｃ領域機能性を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。
[00780] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、高い親和性及びアゴニスト活性でヒトＯＸ４０（配列番号５４）に結合することを特徴とする。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、ヒトＯＸ４０（配列番号５４）に結合する結合分子である。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、マウスＯＸ４０（配列番号５５）に結合する結合分子である。ＯＸ４０アゴニスト又は結合分子が結合するＯＸ４０抗原のアミノ酸配列を表１２に概括する。
Figure 2022514023000015
[00781] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約１００ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約７０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約６０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約５０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約４０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約３０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
[00782] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約１×１０６ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
[00783] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約２×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．１×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．２×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．３×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．４×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．５×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．６×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約２．７×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．８×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．９×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約３×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
[00784] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約７ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約６ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約５ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約４ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約３ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約１ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
[00785] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、ＭＥＤＩ０５６２又はＭＥＤＩ－０５６２としても知られるタボリキシズマブである。タボリキシズマブは、AstraZeneca, Incの子会社MedImmuneから入手できる。タボリキシズマブは、免疫グロブリンＧ１－カッパ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ４（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー４、ＯＸ４０、ＣＤ１３４）］、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体である。タボリキシズマブのアミノ酸配列を表１３に示す。タボリキシズマブは、フコシル化複合二分岐ＣＨＯ型グリカンを伴い位置３０１及び３０１’’のＮ－グリコシル化部位；位置２２－９５（ＶＨ－ＶＬ）、１４８－２０４（ＣＨ１－ＣＬ）、２６５－３２５（ＣＨ２）及び３７１－４２９（ＣＨ３）（並びに位置２２’’－９５’’、１４８’’－２０４’’、２６５’’－３２５’’及び３７１’’－４２９’’）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２３’－８８’（ＶＨ－ＶＬ）及び１３４’－１９４’（ＣＨ１－ＣＬ）（並びに位置２３’’’－８８’’’及び１３４’’’－１９４’’’）の軽鎖内ジスルフィド架橋；位置２３０－２３０’’及び２３３－２３３’’の鎖内重鎖－重鎖ジスルフィド架橋；並びに位置２２４－２１４’及び２２４’’－２１４’’’の鎖内重鎖－軽鎖ジスルフィド架橋を含む。様々な固形腫瘍の適応症におけるタボリキシズマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０２３１８３９４及びＮＣＴ０２７０５４８２が含まれる。
[00786] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号５６で示される重鎖及び配列番号５７で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00787] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、タボリキシズマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号５８に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号５９に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
[00788] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６０、配列番号６１及び配列番号６２に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00789] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、タボリキシズマブに関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。
Figure 2022514023000016
[00790] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは１１Ｄ４であり、これはPfizer, Inc.から入手可能な完全ヒト抗体である。１１Ｄ４の調製及び特性は、米国特許第７，９６０，５１５号；同第８，２３６，９３０号；及び同第９，０２８，８２４号に記載され、その開示は参照により本明細書に援用される。１１Ｄ４のアミノ酸配列を表１４に示す。
[00791] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号６６で示される重鎖及び配列番号６７で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00792] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１１Ｄ４の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号６８に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号６９に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00793] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号７３、配列番号７４及び配列番号７５に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00794] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１１Ｄ４に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。
Figure 2022514023000017
[00795] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは１８Ｄ８であり、これはPfizer, Inc.から入手可能な完全ヒト抗体である。１８Ｄ８の調製及び特性は、米国特許第７，９６０，５１５号；同第８，２３６，９３０号；及び同第９，０２８，８２４号に記載され、その開示は参照により本明細書に援用される。１８Ｄ８のアミノ酸配列を表１５に示す。
[00796] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号７６で示される重鎖及び配列番号７７で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00797] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１８Ｄ８の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号７８に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号７９に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00798] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８０、配列番号８１及び配列番号８２に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号８３、配列番号８４及び配列番号８５に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00799] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１８Ｄ８に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。
Figure 2022514023000018
[00800] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＨｕ１１９－１２２であり、これはGlaxoSmithKline plc.から入手可能なヒト化抗体である。Ｈｕ１１９－１２２の調製及び特性は、米国特許第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号並びに国際公開第２０１２／０２７３２８号に記載され、その開示は参照により本明細書に援用される。Ｈｕ１１９－１２２のアミノ酸配列を表１６に示す。
[00801] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１１９－１２２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号８６に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号８７に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00802] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８８、配列番号８９及び配列番号９０に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号９１、配列番号９２及び配列番号９３に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00803] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１１９－１２２に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９－１２２である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９－１２２である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９－１２２である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９－１２２である。
Figure 2022514023000019
[00804] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＨｕ１０６－２２２であり、これはGlaxoSmithKline PLC.から入手可能なヒト化抗体である。Ｈｕ１０６－２２２の調製及び特性は、米国特許第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号並びに国際公開第２０１２／０２７３２８号に記載され、その開示は参照により本明細書に援用される。Ｈｕ１０６－２２２のアミノ酸配列を表１７に示す。
[00805] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１０６－２２２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号９４に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号９５に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00806] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９６、配列番号９７及び配列番号９８に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号９９、配列番号１００及び配列番号１０１に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00807] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１０６－２２２に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６－２２２である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６－２２２である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６－２２２である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６－２２２である。
Figure 2022514023000020
[00808] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト抗体はＭＥＤＩ６４６９（９Ｂ１２とも称される）である。ＭＥＤＩ６４６９はマウスモノクローナル抗体である。Weinberg, et al., J. Immunother.2006, 29, 575-585。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Weinberg, et al., J. Immunother.2006, 29, 575-585に記載されているように、Biovest Inc.（Malvern, MA, USA）に寄託された、９Ｂ１２ハイブリドーマによって産生される抗体であり、その開示は参照により全体として本明細書に援用される。一部の実施形態において、抗体は、ＭＥＤＩ６４６９のＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、抗体は、ＭＥＤＩ６４６９の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。
[00809] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｌ１０６ ＢＤ（Pharmingen Product #340420）である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体Ｌ１０６（BD Pharmingen Product #340420）のＣＤＲを含む。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体Ｌ１０６（BD Pharmingen Product #340420）の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＡＣＴ３５（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号２００７３）である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体ＡＣＴ３５（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号２００７３）のＣＤＲを含む。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体ＡＣＴ３５（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号２００７３）の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、マウスモノクローナル抗体抗ｍＣＤ１３４／ｍＯＸ４０（クローンＯＸ８６）であり、InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NHから市販されている。
[00810] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、国際公開第９５／１２６７３号、同第９５／２１９２５号、同第２００６／１２１８１０号、同第２０１２／０２７３２８号、同第２０１３／０２８２３１号、同第２０１３／０３８１９１号及び同第２０１４／１４８８９５号；欧州特許第０６７２１４１号；米国特許出願公開第２０１０／１３６０３０号、同第２０１４／３７７２８４号、同第２０１５／１９０５０６号及び同第２０１５／１３２２８８号；並びに米国特許第７，５０４，１０１号、同第７，５５０，１４０号、同第７，６２２，４４４号、同第７，６９６，１７５号、同第７，９６０，５１５号、同第７，９６１，５１５号、同第８，１３３，９８３号、同第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号（２０Ｅ５及び１２Ｈ３を含む）に記載されるＯＸ４０アゴニストから選択され、それぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
[00811] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、構造Ｉ－Ａ（Ｃ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）又は構造Ｉ－Ｂ（Ｎ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）に示されるＯＸ４０アゴニスト性融合タンパク質又はその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂの特性は、上記並びに米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号及び同第８，４５０，４６０号に記載され、その開示は参照により本明細書に援用される。構造Ｉ－Ａのポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表９に示す。Ｆｃドメインは、好ましくは、完全定常ドメイン（配列番号３１のアミノ酸１７～２３０）、完全ヒンジドメイン（配列番号３１のアミノ酸１～１６）又はヒンジドメインの一部（例えば、配列番号３１のアミノ酸４～１６）を含む。Ｃ末端Ｆｃ抗体を接続するための好ましいリンカーは、追加的ポリペプチドの融合に適したリンカーを含む、配列番号３２～配列番号４１に示される実施形態から選択され得る。同様に、構造Ｉ－Ｂのポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表１０に示す。構造Ｉ－ＢのようにＦｃ抗体断片がＴＮＲＦＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合、Ｆｃモジュールの配列は好ましくは配列番号４２に示されるものであり、リンカー配列は好ましくは配列番号４３～配列番号４５に示される実施形態から選択される。
[00812] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、タボリキシズマブの可変重鎖及び可変軽鎖、１１Ｄ４の可変重鎖及び可変軽鎖、１８Ｄ８の可変重鎖及び可変軽鎖、Ｈｕ１１９－１２２の可変重鎖及び可変軽鎖、Ｈｕ１０６－２２２の可変重鎖及び可変軽鎖、表１７に記載されている可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、上記の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体及びバイオシミラーからなる群から選択される１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。
[00813] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、ＯＸ４０Ｌ配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１０２による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、可溶性ＯＸ４０Ｌ配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１０３による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１０４による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。
[00814] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、表１４に示されるＶＨ及びＶＬ配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。
Figure 2022514023000021
Figure 2022514023000022
[00815] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＯＸ４０結合ドメインを含むＯＸ４０アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインである。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＯＸ４０結合ドメインを含むＯＸ４０アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインであり、可溶性ＯＸ４０結合ドメインのそれぞれは、ストーク領域（三量体化に寄与し、細胞膜まで一定の距離を提供するが、ＯＸ４０結合ドメインの一部ではない）を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３～８アミノ酸長を有する。
[00816] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインを含むＯＸ４０アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、ここで、可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインのそれぞれは、ストーク領域を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３～８アミノ酸長を有し、ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインはＯＸ４０結合ドメインである。
[00817] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＭＥＤＩ６３８３である。ＭＥＤＩ６３８３はＯＸ４０アゴニスト性融合タンパク質であり、米国特許第６，３１２，７００号に記載されているように調製することができ、その開示は参照により本明細書に援用される。
[00818] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、前述のＶＬドメインのいずれかに連結された前述のＶＨドメインのいずれかを含むＯＸ４０アゴニスト性ｓｃＦｖ抗体である。
[00819] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Creative BiolabsＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体ＭＯＭ－１８４５５であり、これはCreative Biolabs, Inc., Shirley, NY, USAから市販されている。
[00820] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、BioLegend, Inc., San Diego, CA, USAから市販されているＯＸ４０アゴニスト性抗体クローンＢｅｒ－ＡＣＴ３５である。
Ｉ．任意選択の細胞生存率分析
[00821] 任意選択で、第１の初回刺激拡大培養（初めのバルク拡大培養と称されることがある）後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。したがって、特定の実施形態において、方法は、第１の初回刺激拡大培養に続いて細胞生存率アッセイを実施することを含む。例えば、バルクＴＩＬのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。生存率の試験に用いられる他のアッセイとしては、限定はされないが、アラマーブルーアッセイ；及びＭＴＴアッセイを挙げることができる。
１．細胞数、生存率、フローサイトメトリー
[00822] 一部の実施形態において、細胞数及び／又は生存率が測定される。限定はされないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ５６などのマーカー並びに本明細書に開示又は記載される任意の他のものの発現を抗体によるフローサイトメトリー、例えば限定はされないが、FACSCanto（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）を使用してBD Bio-sciences（BD Biosciences、San Jose, CA）から市販されているものによって測定することができる。細胞は、ディスポーザブルc-chip血球計算盤（VWR、Batavia, IL）を使用して手動でカウントすることができ、及び生存率は、限定はされないがトリパンブルー染色を含め、当技術分野において公知の任意の方法を用いて評価することができる。細胞生存率は、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許出願第１５／８６３，６３４号に基づいてアッセイすることもできる。細胞生存率は、米国特許出願公開第２０１８／０２８０４３６号又は国際公開第２０１８／０８１４７３号に基づいてアッセイすることもでき、これらは、両方とも全ての目的のためにその全体が本明細書に援用される。
[00823] ある場合には、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直ちに凍結保存することができる。代わりに、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察する通り、ＲＥＰに供し、次に凍結保存することができる。同様に、療法において遺伝子修飾ＴＩＬが使用されることになる場合、バルク又はＲＥＰ ＴＩＬ集団を好適な処置のための遺伝子修飾に供することができる。
２．細胞培養
[00824] 一実施形態において、ＴＩＬの拡大培養方法は、上記で考察され、図１、特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃで例示されているものを含み、約５，０００ｍＬ～約２５，０００ｍＬの細胞培地、約５，０００ｍＬ～約１０，０００ｍＬの細胞培地又は約５，８００ｍＬ～約８，７００ｍＬの細胞培地を使用することを含み得る。一部の実施形態において、培地は無血清培地である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の培地は無血清である。一部の実施形態において、第２の拡大培養の培地は無血清である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養及び第２の拡大培養（第２の急速拡大培養とも称される）における培地は両方、無血清である。一実施形態において、ＴＩＬ数の拡大には１種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地は、例えば、AIM-V細胞培地（Ｌ－グルタミン、５０μＭ硫酸ストレプトマイシン及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Invitrogen、Carlsbad CA）を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、ＴＩＬ数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。一実施形態において、ＴＩＬ数の拡大は、２日又は３日おき以下の頻度で細胞をフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内の細胞数を増やすことは、細胞を拡大培養するのに必要なフィード頻度を減らすことによって細胞数を増やすのに必要な手順を単純化する。
[00825] 一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培養培地は濾過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地は、ベータ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を欠いている。
[00826] 一実施形態において、方法の期間は、哺乳動物から腫瘍組織サンプルを入手すること；腫瘍組織サンプルを、ＩＬ－２、１Ｘ抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第１のガス透過性容器中で、約１～８日間、例えば、約８日間、第１の初回刺激拡大培養として培養すること；ＴＩＬを第２のガス透過性容器に移すこと、及びＴＩＬの数を、ＩＬ－２、２Ｘ抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第２のガス透過性容器中で、約７～９日間、例えば、約７日間、約８日間又は約９日間、拡大することを含む。
[00827] 一実施形態において、方法の期間は、哺乳動物から腫瘍組織サンプルを入手すること；腫瘍組織サンプルを、ＩＬ－２、１Ｘ抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第１のガス透過性容器中で、約１～７日間、例えば、約７日間、第１の初回刺激拡大培養として培養すること；ＴＩＬを第２のガス透過性容器に移すこと、及びＴＩＬの数を、ＩＬ－２、２Ｘ抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第２のガス透過性容器中で、約７～９日間、例えば、約７日間、約８日間又は約９日間、拡大することを含む。
[00828] 一実施形態において、方法の期間は、哺乳動物から腫瘍組織サンプルを入手すること；腫瘍組織サンプルを、ＩＬ－２、１Ｘ抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第１のガス透過性容器中で、約１～７日間、例えば、約７日間、第１の初回刺激拡大培養として培養すること；ＴＩＬを第２のガス透過性容器に移すこと、及びＴＩＬの数を、ＩＬ－２、２Ｘ抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第２のガス透過性容器中で、約７～１０日間、例えば、約７日間、約８日間、約９日間又は約１０日間、拡大することを含む。
[00829] 一実施形態において、ＴＩＬはガス透過性容器内で拡大培養する。ガス透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものを含め、当技術分野において公知の方法、組成物及び装置を用いたＰＢＭＣを使用したＴＩＬの拡大培養に用いられている。一実施形態において、ＴＩＬはガス透過性バッグ内で拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）など、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ及び約１０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。
[00830] 一実施形態において、ＴＩＬはG-Rexフラスコ（Wilson Wolf Manufacturingから市販されている）において拡大培養することができる。そのような実施形態は、細胞集団が約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６～３０×１０６細胞／ｃｍ２に拡大培養することを可能にする。一実施形態において、これは、フィードなしである。一実施形態において、これは、G-Rexフラスコ内に約１０ｃｍの高さの培地がある限りフィードなしである。一実施形態において、これにフィードはないが、１つ以上のサイトカインが加えられる。一実施形態において、サイトカインを培地と混合する必要なく、サイトカインをボーラスとして添加することができる。かかる容器、装置及び方法は、当技術分野において公知で、ＴＩＬの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７ Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８ Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０ Ｂ２号、国際公開第２０１１／０７２０８８ Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３ Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５ Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０ Ｂ２号、国際公開第２０１３／１７３８３５ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６ Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものが含まれる。かかるプロセスは、Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292にも記載されている。
Ｊ．任意選択のＴＩＬ遺伝子改変
[00831] 一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたＴＩＬは、一過性の方法でタンパク質発現を変化させるために、それぞれ本明細書で提供されるように、閉鎖無菌製造プロセス中を含む、拡大培養ステップ前、その間又はその後に更に操作される。一部の実施形態において、一過性に変化したタンパク質発現は、一過性の遺伝子編集によるものである。一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたＴＩＬは、転写因子（ＴＦ）及び／又はＴＩＬにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子で処置される。一部の実施形態において、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の発現の変化及び／又はＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する。
[00832] 特定の実施形態において、方法は、ＴＩＬ集団を遺伝子編集することを含む。特定の実施形態において、方法は、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団及び／又は第３のＴＩＬ集団を遺伝子編集することを含む。
[00833] 一態様では、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、直交性サイトカイン受容体の産生のための操作可能な遺伝子モジュールを導入するステップを含む。一部の実施形態において、操作可能な遺伝子モジュールは、直交性ＩＬ－２Ｒβを産生する。一部の態様では、方法は、ＴＩＬ集団を遺伝子改変して、直交性サイトカイン受容体を産生する方法をさらに含む。一部の態様では、直交性サイトカイン受容体は、ＩＬ－２Ｒβである。
[00834] 一部の態様では、直交性サイトカイン受容体ＩＬ－２Ｒβは、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス法により、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団若しくは回収されたＴＩＬ集団又はそれらの組み合わせに挿入される。
[00835] 一部の実施形態において、本発明は、１つ以上のタンパク質の発現の促進又は１つ以上のタンパク質の発現の阻害及び１セットのタンパク質の促進と、別のセットのタンパク質の阻害との両方の同時の組み合わせのための、ＴＩＬ集団への、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又は小分子（短鎖）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の挿入を含む、リボ核酸（ＲＮＡ）挿入などのヌクレオチド挿入による遺伝子編集を含む。
[00836] 一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたＴＩＬは、タンパク質発現の一過性の変化を受ける。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、第１の拡大培養前に、例えば、例えば図１（特に図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に示されるステップＡから得られる、ＴＩＬ集団におけるものを含む、バルクＴＩＬ集団で発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えば図１（例えば、図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に示されるステップＢで、拡大培養されるＴＩＬ集団におけるものを含む、第１の拡大培養中に発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、第１と第２の拡大培養中の移行中のＴＩＬ集団（例えば、本明細書に記載の第２のＴＩＬ集団）、図１に示される、例えばステップＢから取得され、ステップＣに含まれるＴＩＬ集団におけるものを含む、第１の拡大培養後に発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えばステップＣから得られる、ＴＩＬ集団におけるものを含む、第２の拡大培養前及び図１に示されるステップＤにおけるその拡大培養前にバルクＴＩＬ集団で発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えば図１に示されるステップＤで、拡大培養されるＴＩＬ集団（例えば、第３のＴＩＬ集団）におけるものを含む、第２の拡大培養中に発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えば図１に示されるステップＤにおける、拡大培養から得られるＴＩＬ集団におけるものを含む、第２の拡大培養後に発生する。
[00837] 一実施形態において、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、エレクトロポレーションのステップを含む。エレクトロポレーション法は、当技術分野で公知であり、例えば、Tsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306及び米国特許出願公開第２０１４／０２２７２３７ Ａ１号に記載され、そのそれぞれの開示は参照により本明細書に援用される。一実施形態において、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションのステップを含む。リン酸カルシウムトランスフェクション法（リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿、細胞表面コーティング及びエンドサイトーシス）は、当技術分野で公知であり、例えば、Graham and van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467；Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376；及びChen and Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752；並びに米国特許第５，５９３，８７５号に記載され、そのそれぞれの開示は参照により本明細書に援用される。一実施形態において、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、リポソームトランスフェクションのステップを含む。濾過水中のカチオン性脂質Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－ｎ，ｎ，ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）及びジオレオイルホスフォチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤を使用する方法などのリポソームトランスフェクション法は、当技術分野で公知であり、例えば、Rose, et al., Biotechniques 1991, 10, 520-525及びFelgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417並びに米国特許第５，２７９，８３３号；同第５，９０８，６３５号；同第６，０５６，９３８号；同第６，１１０，４９０号；同第６，５３４，４８４号；及び同第７，６８７，０７０号に記載され、そのそれぞれの開示は参照により本明細書に援用される。一実施形態において、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、米国特許第５，７６６，９０２号；同第６，０２５，３３７号；同第６，４１０，５１７号；同第６，４７５，９９４号；及び同第７，１８９，７０５号（そのそれぞれの開示は参照により本明細書に援用される）に記載される方法を使用したトランスフェクションのステップを含む。
[00838] 別の態様では、ＴＩＬは、直交性サイトカイン受容体を発現するように操作され得る。直交性サイトカイン受容体は、直交性サイトカインに特異的に結合するように設計される。直交性サイトカインは、対応する操作された（直交性）受容体に特異的に結合する。結合すると、直交性受容体は、天然の細胞要素を介して伝達されるシグナル伝達を活性化して、その天然の応答を模倣する生物学的活性を提供するが、これは、直交性受容体を発現する操作された細胞に特異的なものである。直交性受容体は、直交性サイトカインの天然の対応物を含む内因性の対応するサイトカインに結合しない一方、直交性サイトカインは、直交性受容体の天然の対応物を含むいかなる内因性受容体にも結合しない。一部の実施形態において、直交性受容体に対する直交性サイトカインの親和性は、天然受容体に対する天然サイトカインの親和性と同等である。
[00839] 直交性サイトカイン受容体は、上記の方法のいずれか又は当技術分野で公知の任意の方法によってＴＩＬに導入され得る。
[00840] 特定の実施形態において、方法は、直交性サイトカイン受容体を発現するようにＴＩＬ集団を遺伝的に編集することを含む。特定の実施形態において、方法は、ＴＩＬ、ＭＩＬ及び／又はＰＢＬの第１の集団、ＴＩＬの第２の集団及び／又はＴＩＬの第３の集団を遺伝子編集して、直交性サイトカイン受容体を発現させることを含む。一態様では、直交性サイトカイン受容体は、ＩＬ－２Ｒβである。別の態様では、直交性サイトカイン受容体は、ＣＤ１２２である。
[00841] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増加をもたらす。ＴＳＣＭは、抗原経験のあるセントラルメモリーＴ細胞の初期の前駆細胞である。ＴＳＣＭは、一般に、幹細胞を定義する長期生存、自己再生及び多能性能力を示し、効果的なＴＩＬ産物の生成に一般的に望ましい。ＴＳＣＭは、養子細胞移入のマウスモデルで他のＴ細胞サブセットと比較して強化された抗腫瘍活性を示している（Gattinoni et al. Nat Med 2009, 2011；Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012；Cieri et al. Blood 2013）。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、高い割合のＴＳＣＭを含む組成物を伴うＴＩＬ集団をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のＴＳＣＭパーセンテージの増加をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＬ集団における、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍又は１０倍のＴＳＣＭの増加をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のＴＳＣＭを伴うＴＩＬ集団をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のＴＳＣＭを伴う治療用ＴＩＬ集団をもたらす。
[00842] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、抗原経験のあるＴ細胞の若返りをもたらす。一部の実施形態において、若返りには、例えば、増殖の増加、Ｔ細胞活性化の増加及び／又は抗原認識の増加が含まれる。
[00843] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを保存するために、Ｔ細胞の大部分における発現を変化させる。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを変化させない。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを維持する。
[00844] 一部の実施形態において、タンパク質の一過性の変化は、特定の遺伝子の変化した発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１（ＰＤＣＤ１又はＣＣ２７９とも称される）、ＴＧＦＢＲ２、ＣＣＲ４／５、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１及び／又はｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を含むが、これらに限定されない遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＣＲ４／５、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１及び／又はｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）からなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＧＦＢＲ２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ４／５を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－１２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－１５を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－２１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＧＩＴを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＧＦβを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ４を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ５を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＲ１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＲ２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＳＣＲ３を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＬ１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＬ８を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ２２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ１７を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＶＨＬを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＤ４４を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＩＫ３ＣＤを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＳＯＣＳ１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を標的とする。
[00845] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ケモカイン受容体の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、一過性のタンパク質発現によって過剰発現されるケモカイン受容体は、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２及び／又はＣＣＬ１７を含むが、これらに限定されないリガンドを有する受容体を含む。
[00846] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲ２及び／又はＴＧＦβの減少及び／又は発現低下をもたらす（例えば、ＴＧＦβ経路の遮断をもたらすことを含む）。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ－Ｂ）の減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨの減少及び／又は発現低下をもたらす。
[00847] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、腫瘍部位へのＴＩＬ輸送又は移動を改善するために、ケモカイン受容体の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２及び／又はＣＳＣＲ３からなる群から選択されるケモカイン受容体の増加及び／又は過剰発現をもたらす。
[00848] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、インターロイキンの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１からなる群から選択されるインターロイキンの増加及び／又は過剰発現をもたらす。
[00849] 別の態様では、タンパク質発現の一過性の変化は、操作された（直交性）インターロイキンの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の態様では、タンパク質発現の一過性の変化は、直交性ＩＬ－２、直交性ＩＬ－１２、直交性ＩＬ－１５及び／又は直交性ＩＬ－２１からなる群から選択される直交性インターロイキンの増加及び／又は過剰発現をもたらす。
[00850] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＶＨＬの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＤ４４の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＩＫ３ＣＤの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＳＯＣＳ１の増加及び／又は過剰発現をもたらす。
[00851] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の減少及び／又は発現低下をもたらす。
[00852] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）からなる群から選択される１つの分子及びそれらの組み合わせの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）からなる群から選択される２つの分子及びそれらの組み合わせの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１と、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）からなる群から選択される１つの分子及びそれらの組み合わせとの、減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びそれらの組み合わせの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１と、ＬＡＧ－３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びそれらの組み合わせの１つとの、減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＬＡＧ３の減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＣＩＳＨの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３及びＣＩＳＨの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＰＤ－１の減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＬＡＧ３の減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＣＩＳＨの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現低下をもたらす。
[00853] 一部の実施形態において、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス法により、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団又は回収されたＴＩＬ集団に挿入される（例えば、接着分子の発現が増加する）。
[00854] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）からなる群から選択される１つの分子及びそれらの組み合わせの減少及び／又は発現低下並びにＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１及びそれらの組み合わせの増加及び／又は発現の増強をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢからなる群から選択される１つの分子及びそれらの組み合わせの減少及び／又は発現低下並びにＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１及びそれらの組み合わせの増加及び／又は発現の増強をもたらす。
[00855] 一部の実施形態において、約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９０％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９９％の発現の低下が存在する。
[00856] 一部の実施形態において、約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９０％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９９％の発現の増加が存在する。
[00857] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、転写因子（ＴＦ）及び／又はＴＩＬにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子でのＴＩＬの処置によって誘導される。一部の実施形態において、ＳＱＺベクターを含まないマイクロ流体プラットフォームは、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子の細胞内送達のために使用される。転写因子を含むタンパク質を、Ｔ細胞を含む様々な初代ヒト細胞に送達する能力を実証するそのような方法（Sharei et al. PNAS 2013並びにSharei et al. PLOS ONE 2015及びGreisbeck et al. J. Immunology vol. 195, 2015）が説明されている。例えば、国際公開第２０１３／０５９３４３Ａ１号、国際公開第２０１７／００８０６３Ａ１号及び国際公開第２０１７／１２３６６３Ａ１号（これらの全ては、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。国際公開第２０１３／０５９３４３Ａ１号、国際公開第２０１７／００８０６３Ａ１号及び国際公開第２０１７／１２３６６３Ａ１号に記載されるそのような方法は、転写因子（ＴＦ）及び／又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子にＴＩＬ集団を曝露するために、本発明と共に使用することができ、ここで、前記ＴＦ及び／又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子は、腫瘍抗原の発現の増加及び／又はＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の増加を提供し、従ってＴＩＬ集団の再プログラミング及び再プログラミングされたＴＩＬ集団の治療効果の再プログラミングされていないＴＩＬ集団と比較した増加をもたらす。一部の実施形態において、再プログラミングは、本明細書に記載されるように、ＴＩＬの開始集団又は前の（即ち再プログラミング前の）集団と比較して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団をもたらす。
[00858] 一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、ＴＣＦ－１、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤ及び／又はＭＹＢを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、ＴＣＦ－１である。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤである。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、ＭＹＢである。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、市販のKNOCKOUT血清代替物（Gibco/ThermoFisher）などの人工多能性幹細胞培養物（ｉＰＳＣ）と共に投与されて、追加のＴＩＬ再プログラミングを誘導する。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、追加のＴＩＬ再プログラミングを誘導するために、ｉＰＳＣカクテルと共に投与される。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、ｉＰＳＣカクテルなしで投与される。一部の実施形態において、再プログラミングは、ＴＳＣＭのパーセンテージの増加をもたらす。一部の実施形態において、再プログラミングは、ＴＳＣＭのパーセンテージの約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％ ＴＳＣＭの増加をもたらす。
[00859] 一部の実施形態において、上記のように一過性に変化するタンパク質発現の方法は、ＴＩＬ集団を遺伝子改変する方法と組み合わされ得、１つ以上のタンパク質の産生のための遺伝子の安定した組み込みのステップを含む。特定の実施形態において、方法は、ＴＩＬ集団を遺伝子改変するステップを含む。特定の実施形態において、方法は、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団及び／又は第３のＴＩＬ集団を遺伝子改変することを含む。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、レトロウイルス形質導入のステップを含む。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、レンチウイルス形質導入のステップを含む。レンチウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えば、Levine, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77；Zufferey, et al., Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75；Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71及び米国特許第６，６２７，４４２号に記載され、そのそれぞれの開示は参照により本明細書に援用される。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入のステップを含む。ガンマレトロウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えば、Cepko and Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16に記載され、その開示は参照により本明細書に援用される。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、トランスポゾン媒介遺伝子導入のステップを含む。トランスポゾン媒介遺伝子導入システムは、当技術分野で公知であり、トランスポサーゼの長期発現がトランスジェニック細胞では発生しないように、トランスポサーゼがＤＮＡ発現ベクターとして又は発現可能なＲＮＡ若しくはタンパク質として提供されるシステム、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、キャップとポリＡテールを含むｍＲＮＡ）として提供されるトランスポサーゼを含む。ＳＢ１０、ＳＢ１１、ＳＢ１００ｘなどのサケ科のＴｅｌ様トランスポサーゼ（ＳＢ又はSleeping Beautyトランスポサーゼ）を含む適切なトランスポゾン媒介遺伝子導入システム及び酵素活性が向上した人工酵素は、例えば、Hackett, et al., Mol. Therapy 2010, 18, 674-83及び米国特許第６，４８９，４５８号に記載され、そのそれぞれの開示は参照により本明細書に援用される。
[00860] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、自己送達ＲＮＡ干渉（ｓｄＲＮＡ）によって誘導される発現の低下であり、これは、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーを使用してその３’末端でコレステロールにコンジュゲートした２０ヌクレオチドのアンチセンス（ガイド）鎖及び１３～１５塩基のセンス（パッセンジャー）鎖を含む、２’－ＯＨ置換（典型的にはフッ素又は－ＯＣＨ３）の高いパーセンテージを有する化学合成された非対称ｓｉＲＮＡ二重鎖である。一部の実施形態において、方法は、自己送達ＲＮＡ干渉（ｓｄＲＮＡ）の使用を含む、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現の一過性の変化を含み、これは、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーを使用してその３’末端でコレステロールにコンジュゲートした２０ヌクレオチドのアンチセンス（ガイド）鎖及び１３～１５塩基のセンス（パッセンジャー）鎖を含む、２’－ＯＨ置換（典型的にはフッ素又は－ＯＣＨ３）の高いパーセンテージを有する化学合成された非対称ｓｉＲＮＡ二重鎖である。ｓｄＲＮＡの使用方法は、Khvorova and Watts, Nat. Biotechnol. 2017, 35, 238-248；Byrne, et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2013, 29, 855-864；及びLigtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018（近刊）に記載され、その開示は参照により本明細書に援用される。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、エレクトロポレーション、ＳＱＺ又は他の方法を使用せずに達成され、代わりに、ＴＩＬ集団が培地中１μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される、１～３日の期間を使用する。特定の実施形態において、方法は、ＴＩＬ集団を、培地中１μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で、ｓｄＲＮＡに１～３日の期間曝露することを含む、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達を含む。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中１０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される、１～３日の期間を使用して達成される。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中５０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される、１～３日の期間を使用して達成される。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中０．１μＭ／１０，０００ＴＩＬ～５０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される、１～３日の期間を使用して達成される。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中０．１μＭ／１０，０００ＴＩＬ～５０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される、１～３日の期間を使用して達成され、ここで、ｓｄＲＮＡへの曝露は、培地に新鮮なｓｄＲＮＡを添加することにより、２、３、４又は５回行われる。他の適切なプロセスは、例えば、米国特許出願公開第２０１１／００３９９１４ Ａ１号、同第２０１３／０１３１１４１ Ａ１号及び同第２０１３／０１３１１４２ Ａ１号並びに米国特許第９，０８０，１７１号に記載され、その開示は参照により本明細書に援用される。
[00861] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは製造中にＴＩＬの集団に挿入される。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４ ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＴＧＦＢＲ２、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、ＢＡＦＦ ＢＲ３、ＣＩＳＨ及び／又はＣＢＬＢに干渉するＲＮＡをコードする。一部の実施形態において、発現の低下は、例えば、フローサイトメトリー及び／又はｑＰＣＲによって評価されるような遺伝子サイレンシングのパーセンテージに基づいて決定される。一部の実施形態において、約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９０％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９９％の発現の低下が存在する。
[00862] 本明細書に記載されるように、ｓｉＲＮＡの化学修飾に基づく自己送達可能なＲＮＡｉ技術を本発明の方法と共に使用して、ｓｄＲＮＡを問題なくＴＩＬに送達することができる。骨格修飾と非対称ｓｉＲＮＡ構造及び疎水性リガンドの組み合わせ（例えば、Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018及び米国特許出願公開第２０１６０３０４８７３号を参照されたい）は、ｓｄＲＮＡのヌクレアーゼ安定性を利用して、培養培地に単純に添加することにより、追加の製剤及び方法なしで、ｓｄＲＮＡを培養した哺乳動物細胞に浸透させることを可能にする。この安定性は、単に培地中のｓｄＲＮＡの活性濃度を維持することで、ＲＮＡｉを介した標的遺伝子活性の一定レベルの低下のサポートを可能にする。理論に拘束されるものではないが、ｓｄＲＮＡの骨格安定化は、非分裂細胞において数ヶ月間続き得る、遺伝子発現効果の長期低下を提供する。
[00863] 一部の実施形態において、９５％を超えるＴＩＬのトランスフェクション効率及び様々な特定のｓｄＲＮＡによる標的の発現の低下が生じる。一部の実施形態において、いくつかの未修飾リボース残基を含有するｓｄＲＮＡを、完全に修飾された配列で置換して、ＲＮＡｉ効果の効力及び／又は寿命を増加させた。一部の実施形態において、発現効果の低下は、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、５日間、６日間、７日間又は８日間以上維持される。一部の実施形態において、発現効果の低下は、ＴＩＬのｓｄＲＮＡ処置後、１０日以上で減少する。一部の実施形態において、標的発現の発現において７０％を超える低下が維持される。一部の実施形態において、標的発現の発現において７０％を超える低下は維持されたＴＩＬである。一部の実施形態において、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路における発現の減少により、ＴＩＬがより強力なインビボ効果を示すことが可能となり、これは、一部の実施形態において、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路の抑制効果の回避による。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡによるＰＤ－１の発現の低下は、ＴＩＬ増殖の増加をもたらす。
[00864] 低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、短鎖干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとして知られる場合もあり、一般に長さが１９～２５塩基対の二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現に干渉する、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）で使用される。
[00865] 二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、一般にセンス（パッセンジャー）及びアンチセンス（ガイド）鎖であり、一本鎖オーバーハング領域を含み得る、ＲＮＡの相補鎖の対を含む任意の分子を定義するために、一般的に使用できる。ｓｉＲＮＡと対比されるｄｓＲＮＡという用語は、ダイサーを含む切断酵素システムの作用により、より大きいｄｓＲＮＡ分子から放出されるｓｉＲＮＡ分子の配列を含む前駆体分子を一般的に指す。
[00866] ｓｄＲＮＡ（自己送達可能なＲＮＡ）は、細胞に侵入するのに送達ビヒクルを必要とせず、従来のｓｉＲＮＡと比較して向上した薬理を有する、共有結合修飾されたＲＮＡｉ化合物の新しいクラスである。「自己送達可能なＲＮＡ」又は「ｓｄＲＮＡ」は、疎水性修飾されたＲＮＡ干渉アンチセンスハイブリッドであり、初代細胞ではインビトロで、局所投与ではインビボで、非常に効果的であることが実証されている。毒性のない強力な取り込み及び／又はサイレンシングが実証されている。ｓｄＲＮＡは、一般に、最小の二本鎖領域を有する、化学的に修飾された非対称の核酸分子である。ｓｄＲＮＡ分子は、典型的には、一本鎖領域及び二本鎖領域を含み、分子の一本鎖領域及び二本鎖領域の両方に様々な化学修飾を含み得る。更に、ｓｄＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるように、従来の及び先端的なステロール型分子などの疎水性コンジュゲートに結合させることができる。ｓｄＲＮＡ及びそのようなｓｄＲＮＡを作製するための関連する方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１６０３０４８７３号、国際公開第２０１００３３２４６号、国際公開第２０１７０７０１５１号、国際公開第２００９１０２４２７号、国際公開第２０１１１１９８８７号、国際公開第２０１００３３２４７Ａ２号、国際公開第２００９０４５４５７号、国際公開第２０１１１１９８５２号にも広範に記載され、これら全ては、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。ｓｄＲＮＡの構造、化学、標的位置、配列の優先傾向などを最適化するために、独自のアルゴリズムが開発され、ｓｄＲＮＡの効力予測に利用されている（例えば、米国特許出願公開第２０１６０３０４８７３号を参照されたい）。これらの分析に基づいて、機能的ｓｄＲＮＡ配列は、一般に、４０％を超える確率で、１μＭの濃度で７０％を超える発現の低下を有すると定義されている。
[00867] 一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７０％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７５％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８０％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８５％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９０％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９５％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９９％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ～約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。
[00868] 一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、治療剤の安定性及び／又は有効性を増加させ、処置される細胞又は組織へのオリゴヌクレオチドの効率的な送達をもたらすための、１つ以上の修飾を含む。そのような修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－フルオロ修飾、ジホスホロチオエート修飾、２’Ｆ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾及び／又は２’デオキシヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、ステロール、コレステロール、ビタミンＤ、ナフチル、イソブチル、ベンジル、インドール、トリプトファン及び／又はフェニルを含む１つ以上の疎水性修飾を含むように修飾される。更なる特定の実施形態において、化学修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート、２’－Ｏ－メチル、２’デオキシ、疎水性修飾及びホスホロチオエートの組み合わせである。一部の実施形態において、糖は修飾され得、修飾された糖は、Ｄ－リボース、２’－Ｏ－アルキル（２’－Ｏ－メチル及び２’－Ｏ－エチルを含む）、即ち２’－アルコキシ、２’－アミノ、２’－Ｓ－アルキル、２’－ハロ（２’－フルオロを含む）、Ｔ－メトキシエトキシ、２’－アリルオキシ（－ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’－プロパルギル、２’－プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル及びシアノなどを含み得るが、これらに限定されない。一実施形態において、糖部分は、ヘキソースであり得、記載されるようにオリゴヌクレオチドに組み込まれる（Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res. 18:4711 (1992)）。
[00869] 一部の実施液体において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖である、即ち分子のいずれかの末端にオーバーハングする一本鎖配列を有しない、即ち平滑末端である。一部の実施形態において、個々の核酸分子は、異なる長さであり得る。換言すれば、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖ではない。例えば、２つの別個の核酸分子が使用される場合、分子の１つ、例えば、アンチセンス配列を含む第１の分子は、それにハイブリダイズする第２の分子より長いものであり得る（分子の一部が一本鎖のまま残る）。一部の実施形態において、単一の核酸分子が使用される場合、いずれかの末端の分子の一部は一本鎖のままであり得る。
[00870] 一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ミスマッチ及び／又はループ又はバルジを含有するが、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約７０％にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約８０％にわたって二本鎖である。別の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９０％～９５％にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９６％～９８％にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも又は最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のミスマッチを含有する。
[00871] 一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、３’又は５’結合を修飾することにより、ヌクレアーゼから実質的に保護され得る（例えば、米国特許第５，８４９，９０２号及び国際公開第９８／１３５２６号）。例えば、オリゴヌクレオチドは、「ブロッキング基」を含めることによって耐性とすることができる。本明細書で使用される「ブロッキング基」という用語は、合成のための保護基又はカップリング基のいずれかとして、オリゴヌクレオチド又はヌクレオモノマーに結合することができる置換基（例えば、ＯＨ基以外）を指す（例えば、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３）、グリコール（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）リン酸（ＰＯ３ ２＋）、ホスホン酸水素又はホスホルアミダイト）。「ブロッキング基」は、修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ耐性構造を含む、オリゴヌクレオチドの５’及び３’末端を保護する「末端ブロッキング基」又は「エキソヌクレアーゼブロッキング基」も含み得る。
[00872] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ内の隣接するポリヌクレオチドの少なくとも一部は、置換結合、例えば、ホスホロチオエート結合によって結合される。
[00873] 一部の実施形態において、化学修飾は、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００の細胞取り込みの強化を導き得る。一部の実施形態において、Ｃ又はＵ残基の少なくとも１つは、疎水性修飾を含む。一部の実施形態において、複数のＣ及びＵが疎水性修飾を含む。一部の実施形態において、Ｃ及びＵの少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は少なくとも９５％が疎水性修飾を含み得る。一部の実施形態において、Ｃ及びＵの全てが疎水性修飾を含む。
[00874] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ又はｓｄ－ｒｘＲＮＡは、プロトン化可能なアミンの組み込みにより、ｓｄ－ｒｘＲＮＡ分子のエンドソーム放出の増強を示す。一部の実施形態において、プロトン化可能なアミンは、センス鎖に組み込まれる（ＲＩＳＣ充填後に廃棄される分子の部分において）。一部の実施形態において、本発明のｓｄＲＮＡ化合物は、二重鎖領域（長さが１０～１５塩基の効率的なＲＩＳＣエントリーに必要）及び４～１２ヌクレオチド長の一本鎖領域と；１３ヌクレオチドの二重鎖とを含む、非対称化合物を含む。一部の実施形態において、６ヌクレオチドの一本鎖領域が使用される。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡの一本鎖領域は、２～１２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合（ホスホロチオエート修飾と称される）を含む。一部の実施形態において、６～８個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合が使用される。一部の実施形態において、本発明のｓｄＲＮＡ化合物は、ユニークな化学修飾パターンも含み、これは、安定性を提供し、ＲＩＳＣエントリーと適合性である。
[00875] 例えば、ガイド鎖は、ＲＩＳＣエントリーに干渉することなく安定性を確認する、任意の化学修飾によっても修飾され得る。一部の実施形態において、ガイド鎖における化学修飾パターンは、２’Ｆ修飾されているＣ及びＵヌクレオチドの大部分と、リン酸化されている５’末端とを含む。
[00876] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ又はｓｄ－ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも３０％が修飾されている。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ又はｓｄ－ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が修飾されている。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ又はｓｄ－ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの１００％が修飾されている。
[00877] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ分子は、最小の二本鎖領域を有する。一部の実施形態において、二本鎖である分子の領域は、８～１５ヌクレオチド長の範囲である。一部の実施形態において、二本鎖である分子の領域は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、二本鎖領域は１３ヌクレオチド長である。ガイド鎖とパッセンジャー鎖間には１００％の相補性があり得るか、又はガイド鎖とパッセンジャー鎖間に１つ以上のミスマッチがあり得る。一部の実施形態において、二本鎖分子の１つの末端において、分子は、平滑末端であるか、又は１ヌクレオチドのオーバーハングを有する。分子の一本鎖領域は、一部の実施形態において、４～１２ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、一本鎖領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、一本鎖領域は、４ヌクレオチド長未満又は１２ヌクレオチド長超でもあり得る。特定の実施形態において、一本鎖領域は、６又は７ヌクレオチド長である。
[00878] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ分子は、増加した安定性を有する。一部の場合、化学修飾されたｓｄＲＮＡ又はｓｄ－ｒｘＲＮＡ分子は、任意の中間値を含む、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間又は２４時間を超える培地中での半減期を有する。一部の実施形態において、ｓｄ－ｒｘＲＮＡは、１２時間より長い培地中での半減期を有する。
[00879] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、効力の増加及び／又は毒性の低下のために最適化される。一部の実施形態において、ガイド及び／又はパッセンジャー鎖のヌクレオチド長、及び／又はガイド及び／又はパッセンジャー鎖におけるホスホロチオエート修飾の数は、一部の態様において、ＲＮＡ分子の効力に影響を与えることができ、一方で、２’－フルオロ（２’Ｆ）修飾の２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾による置換は、一部の態様において、分子の毒性に影響を与えることができる。一部の実施形態において、分子の２’Ｆ含有量の低減は、分子の毒性を低減すると予測される。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子におけるホスホロチオエート修飾の数は、細胞への分子の取り込み、例えば、細胞への分子の受動的取り込みの効率に影響を及ぼし得る。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは２’Ｆ修飾を有しないが、細胞取り込み及び組織浸透において同等の効力を特徴とする。
[00880] 一部の実施形態において、ガイド鎖は、長さがおよそ１８～１９ヌクレオチドであり、およそ２～１４個のリン酸修飾を有する。例えば、ガイド鎖は、リン酸修飾された２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１４を超えるヌクレオチドを含み得る。ガイド鎖は、ＲＩＳＣエントリーに干渉することなく安定性の向上を付与する１つ以上の修飾を含み得る。ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドなどのリン酸修飾ヌクレオチドは、３’末端、５’末端にあるか、又はガイド鎖全体に広がり得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の３’末端の１０ヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含む。ガイド鎖は、２’Ｆ及び／又は２’ＯＭｅ修飾も含むことができ、これは分子全体に位置し得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の１位のヌクレオチド（ガイド鎖の最も５’位のヌクレオチド）は、２’ＯＭｅ修飾及び／又はリン酸化されている。ガイド鎖内のＣ及びＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾され得る。例えば、１９ヌクレオチドガイド鎖の２～１０位（又は異なる長さのガイド鎖の対応する位置）のＣ及びＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾され得る。ガイド鎖内のＣ及びＵヌクレオチドも２’ＯＭｅ修飾することができる。例えば、１９ヌクレオチドガイド鎖の１１～１８位（又は異なる長さのガイド鎖の対応する位置）のＣ及びＵヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾され得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の最も３’末端のヌクレオチドは修飾されていない。特定の実施形態において、ガイド鎖内のＣ及びＵの大部分は２’Ｆ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の実施形態において、１位及び１１～１８位のＣ又はＵは２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の実施形態において、１位及び１１～１８位のＣ又はＵは２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されており、２～１０位のＣ又はＵは２’Ｆ修飾されている。
[00881] 自己送達可能なＲＮＡｉ技術は、追加の製剤又は技術を必要とすることなく、ＲＮＡｉ剤で細胞を直接トランスフェクションする方法を提供する。トランスフェクションが困難な細胞株をトランスフェクトする能力、高いインビボ活性及び使用の単純さは、従来のｓｉＲＮＡベースの手法と比べて有意な機能的利点を提供する組成物及び方法の特徴であり、従って、ｓｄＲＮＡ法は、本発明のＴＩＬにおける標的遺伝子の発現を低下させる方法に関するいくつかの実施形態において使用される。ｓｄＲＮＡｉ法により、化学合成された化合物を、エクスビボ及びインビボの両方で、広範な初代細胞及び組織に直接送達することが可能となる。本明細書の本発明の一部の実施形態に記載されているｓｄＲＮＡは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販されている。
[00882] ｓｄＲＮＡは、疎水的に修飾されたｓｉＲＮＡ－アンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッド構造として形成され、例えば、全体として参照により本明細書に援用されるByrne et al., December 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10):855-864に開示される。
[00883] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドは、無菌エレクトロポレーションを使用して、本明細書に記載されるＴＩＬに送達することができる。特定の実施形態において、方法は、ｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドを送達するためのＴＩＬ集団の無菌エレクトロポレーションを含む。
[00884] 一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、膜貫通送達システムと組み合わせて細胞に送達することができる。一部の実施形態において、この膜貫通送達システムは、脂質、ウイルスベクターなどを含む。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、いかなる送達剤も必要としない自己送達ＲＮＡｉ剤である。特定の実施形態において、方法は、ｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドをＴＩＬ集団に送達するための膜貫通送達システムの使用を含む。
[00885] オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド組成物は、本明細書に記載のＴＩＬと接触し（例えば、接触させ、本明細書では投与又は送達とも称される）、ＴＩＬにより取り込まれる（ＴＩＬによる受動的取り込みを含む）。ｓｄＲＮＡは、第１の拡大培養中、例えばステップＢ、第１の拡大培養後、例えば、ステップＣ中、第２の拡大培養前又はその間、例えば、ステップＤ前又はその間、ステップＤ後且つステップＥにおける回収前、ステップＦの回収中又はその後、ステップＦの最終的な製剤化及び／又は輸注バッグへの移動前又はその間及びステップＦのいずれかの任意選択による凍結保存ステップ前に、本明細書に記載されるようにＴＩＬに添加することができる。更に、ｓｄＲＮＡは、ステップＦの任意の凍結保存ステップから解凍した後に添加することができる。一実施形態において、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄＲＮＡは、１００ｎＭ～２０ｍＭ、２００ｎＭ～１０ｍＭ、５００ｎｍ～１ｍＭ、１μＭ～１００μＭ、１μＭ～１００μＭからなる群から選択される濃度で、ＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄＲＮＡは、０．１μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地又は１０μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地からなる群から選択される量で、ＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄＲＮＡは、プレＲＥＰ又はＲＥＰ段階中に、１日２回、１日１回、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと又は７日ごとに、ＴＩＬ培養物に添加され得る。
[00886] ｓｄＲＮＡを含む本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、例えば、細胞培養培地中に高濃度でｓｄＲＮＡを溶解し、受動的取り込みが発生するのに十分な時間を与えることにより、拡大培養プロセス中に本明細書に記載されるようにＴＩＬと接触させることができる。特定の実施形態において、本発明の方法は、ＴＩＬ集団を本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチド組成物と接触させることを含む。特定の実施形態において、方法は、オリゴヌクレオチド、例えば、ｓｄＲＮＡを、細胞培養培地に溶解すること及び細胞培養培地をＴＩＬ集団と接触させることを含む。ＴＩＬは、本明細書に記載されるように、第１の集団、第２の集団及び／又は第３の集団であり得る。
[00887] 一部の実施形態において、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達は、リン酸カルシウム、ＤＭＳＯ、グリセロール若しくはデキストラン、エレクトロポレーションを含む、適切な当技術分野で認められた方法により、又は例えばカチオン性、アニオン性若しくは中性脂質組成物若しくはリポソームを使用するトランスフェクションにより、当技術分野で公知の方法を使用して増強され得る（例えば、国際公開第９０／１４０７４号；国際公開第９１／１６０２４号；国際公開第９１／１７４２４号；米国特許第４，８９７，３５５号；Bergan et a 1993. Nucleic Acids Research. 21:3567）。
[00888] 一部の実施形態において、標的遺伝子の発現を低下させるために、１つを超えるｓｄＲＮＡが使用される。一部の実施形態において、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及び／又はＣＩＳＨを標的とするｓｄＲＮＡの１つ以上が一緒に使用される。一部の実施形態において、ＰＤ－１ ｓｄＲＮＡは、１つを超える遺伝子標的の発現を低下させるために、ＴＩＭ－３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及び／又はＣＩＳＨの１つ以上と共に使用される。一部の実施形態において、ＬＡＧ３ ｓｄＲＮＡは、ＣＩＳＨ標的化ｓｄＲＮＡと組み合わせて使用されて、両方の標的の遺伝子発現を低下させる。一部の実施形態において、本明細書のＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及び／又はＣＩＳＨの１つ以上を標的とするｓｄＲＮＡは、Advirna LLC、Worcester, MA, USAから市販されている。
[00889] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）からなる群から選択される遺伝子及びそれらの組み合わせを標的とする。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）からなる群から選択される遺伝子及びそれらの組み合わせを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、別のｓｄＲＮＡは、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）からなる群から選択される遺伝子及びそれらの組み合わせを標的とする。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びそれらの組み合わせから選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１から選択される遺伝子と、ＬＡＧ－３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びそれらの組み合わせの１つとを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＬＡＧ３を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＣＩＳＨを標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＰＤ－１を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＬＡＧ３を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＢＬＢを標的とする。
[00890] 上記のように、本発明の実施形態は、それらの治療効果を増強するために遺伝子編集を介して遺伝子改変されている腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を提供する。本発明の実施形態は、１つ以上のタンパク質の発現の促進及び１つ以上のタンパク質の発現の阻害並びにそれらの組み合わせの両方のための、ＴＩＬ集団へのヌクレオチド挿入（ＲＮＡ又はＤＮＡ）による遺伝子編集を包含する。本発明の実施形態は、ＴＩＬを治療用集団に拡大培養する方法も提供し、ここで、方法は、ＴＩＬを遺伝子編集することを含む。本発明に従う使用に適した、ＴＩＬ集団を遺伝子改変するために使用され得るいくつかの遺伝子編集技術が存在する。
[00891] 一部の実施形態において、方法は、１つ以上のタンパク質の産生のための遺伝子の安定した組み込みのステップを含むＴＩＬ集団を遺伝子改変する方法を含む。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、レトロウイルス形質導入のステップを含む。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、レンチウイルス形質導入のステップを含む。レンチウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えば、Levine, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77；Zufferey, et al., Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75；Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71及び米国特許第６，６２７，４４２号に記載され、そのそれぞれの開示は参照により本明細書に援用される。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入のステップを含む。ガンマレトロウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えば、Cepko and Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16に記載され、その開示は参照により本明細書に援用される。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、トランスポゾン媒介遺伝子導入のステップを含む。トランスポゾン媒介遺伝子導入システムは、当技術分野で公知であり、トランスポサーゼの長期発現がトランスジェニック細胞では発生しないように、トランスポサーゼがＤＮＡ発現ベクターとして又は発現可能なＲＮＡ若しくはタンパク質として提供されるシステム、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、キャップとポリＡテールを含むｍＲＮＡ）として提供されるトランスポサーゼを含む。ＳＢ１０、ＳＢ１１、ＳＢ１００ｘなどのサケ科のＴｅｌ様トランスポサーゼ（ＳＢ又はSleeping Beautyトランスポサーゼ）を含む適切なトランスポゾン媒介遺伝子導入システム及び酵素活性が向上した人工酵素は、例えば、Hackett, et al., Mol.Therapy 2010, 18, 674-83及び米国特許第６，４８９，４５８号に記載され、そのそれぞれの開示は参照により本明細書に援用される。
[00892] 一態様では、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、直交性サイトカイン受容体の産生のための操作可能な遺伝子モジュールを導入するステップを含む。一部の実施形態において、操作可能な遺伝子モジュールは、直交性ＩＬ－２Ｒβを産生する。一部の態様では、方法は、ＴＩＬ集団を遺伝子改変して、直交性サイトカイン受容体を産生する方法をさらに含む。一部の態様では、直交性サイトカイン受容体は、ＩＬ－２Ｒβである。
[00893] 一実施形態において、方法は、ＴＩＬ集団、例えば、本明細書に記載されるように、第１の集団、第２の集団及び／又は第３の集団を遺伝子改変する方法を含む。一実施形態において、ＴＩＬ集団を遺伝子改変する方法は、１つ以上のタンパク質の産生又は阻害（例えば、サイレンシング）のための遺伝子の安定した組み込みのステップを含む。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、エレクトロポレーションのステップを含む。エレクトロポレーション法は、当技術分野で公知であり、例えば、Tsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306及び米国特許出願公開第２０１４／０２２７２３７ Ａ１号に記載され、そのそれぞれの開示は参照により本明細書に援用される。米国特許第５，０１９，０３４号；同第５，１２８，２５７号；同第５，１３７，８１７号；同第５，１７３，１５８号；同第５，２３２，８５６号；同第５，２７３，５２５号；同第５，３０４，１２０号；同第５，３１８，５１４号；同第６，０１０，６１３号及び同第６，０７８，４９０号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載のものなど、他の当技術分野で公知のエレクトロポレーション法を使用し得る。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、無菌エレクトロポレーション法である。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、パルスエレクトロポレーション法である。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、パルス電場でＴＩＬを処置して、ＴＩＬの定義され制御された恒久的又は一過性の変化を、変更、操作又は引き起こすステップを含む、パルスエレクトロポレーション法であり、これは、１００Ｖ／ｃｍ以上の電場強度を有する、少なくとも３つの単一のオペレーター制御の独立してプログラムされた一連のＤＣ電気パルスをＴＩＬに適用するステップを含み、ここで、一連の少なくとも３つのＤＣ電気パルスは、以下の特徴の１つ、２つ又は３つを有する。（１）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス振幅が互いに異なる；（２）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス幅が互いに異なる：及び（３）少なくとも３つのパルスの２つの第１のセットの第１のパルス間隔は、少なくとも３つのパルスの２つの第２のセットの第２のパルス間隔と異なる。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、パルス電場でＴＩＬを処置して、ＴＩＬの定義され制御された恒久的又は一過性の変化を、変更、操作又は引き起こすステップを含む、パルスエレクトロポレーション法であり、これは、１００Ｖ／ｃｍ以上の電場強度を有する、少なくとも３つの単一のオペレーター制御の独立してプログラムされた一連のＤＣ電気パルスをＴＩＬに適用するステップを含み、ここで、少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス振幅が互いに異なる。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、パルス電場でＴＩＬを処置して、ＴＩＬの定義され制御された恒久的又は一過性の変化を、変更、操作又は引き起こすステップを含む、パルスエレクトロポレーション法であり、これは、１００Ｖ／ｃｍ以上の電場強度を有する、少なくとも３つの単一のオペレーター制御の独立してプログラムされた一連のＤＣ電気パルスをＴＩＬに適用するステップを含み、ここで、少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス幅が互いに異なる。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、パルス電場でＴＩＬを処置して、ＴＩＬの定義され制御された恒久的又は一過性の変化を、変更、操作又は引き起こすステップを含む、パルスエレクトロポレーション法であり、これは、１００Ｖ／ｃｍ以上の電場強度を有する、少なくとも３つの単一のオペレーター制御の独立してプログラムされた一連のＤＣ電気パルスをＴＩＬに適用するステップを含み、ここで、少なくとも３つのパルスの２つの第１のセットの第１のパルス間隔は、少なくとも３つのパルスの２つの第２のセットの第２のパルス間隔と異なる。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、パルス電場でＴＩＬを処置して、ＴＩＬにおける孔形成を誘導するステップを含む、パルスエレクトロポレーション法であり、これは、１００Ｖ／ｃｍ以上の電場強度を有する、少なくとも３つの一連のＤＣ電気パルスをＴＩＬに適用するステップを含み、ここで、一連の少なくとも３つのＤＣ電気パルスは、誘導された細孔が比較的長期間持続するように、且つＴＩＬの生存率が維持されるように、以下の特徴の１つ、２つ又は３つを有する。（１）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス振幅が互いに異なる；（２）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス幅が互いに異なる：及び（３）少なくとも３つのパルスの２つの第１のセットの第１のパルス間隔は、少なくとも３つのパルスの２つの第２のセットの第２のパルス間隔と異なる。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションのステップを含む。リン酸カルシウムトランスフェクション法（リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿、細胞表面コーティング及びエンドサイトーシス）は、当技術分野で公知であり、例えば、Graham and van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467；Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376；並びにChen and Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752；並びに米国特許第５，５９３，８７５号に記載され、そのそれぞれの開示は参照により本明細書に援用される。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、リポソームトランスフェクションのステップを含む。濾過水中のカチオン性脂質Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－ｎ，ｎ，ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）及びジオレオイルホスフォチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤を使用する方法などのリポソームトランスフェクション法は、当技術分野で公知であり、例えば、Rose, et al., Biotechniques 1991, 10, 520-525及びFelgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417並びに米国特許第５，２７９，８３３号；同第５，９０８，６３５号；同第６，０５６，９３８号；同第６，１１０，４９０号；同第６，５３４，４８４号；及び同第７，６８７，０７０号に記載され、そのそれぞれの開示は参照により本明細書に援用される。一実施形態において、ＴＩＬ集団を遺伝子改変する方法は、米国特許第５，７６６，９０２号；同第６，０２５，３３７号；同第６，４１０，５１７号；同第６，４７５，９９４号；及び同第７，１８９，７０５号（そのそれぞれの開示は参照により本明細書に援用される）に記載される方法を使用したトランスフェクションのステップを含む。ＴＩＬは、本明細書に記載されるように、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団及び／又は第３のＴＩＬ集団であり得る。
[00894] 一実施形態によると、遺伝子編集プロセスは、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子における二本鎖又は一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能なヌクレアーゼの使用を含み得る。そのようなプログラム可能なヌクレアーゼは、特定のゲノム遺伝子座に切断を導入することにより、正確なゲノム編集を可能にする、即ち、それらは、ゲノム内の特定のＤＮＡ配列の認識に依存して、ヌクレアーゼドメインをこの位置に標的化し、標的配列での二本鎖切断の生成を媒介する。ＤＮＡにおける二本鎖切断により、その後、内因性修復機構が切断部位に動員されて、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同性指向修復（ＨＤＲ）によるゲノム編集が媒介される。従って、切断の修復は、標的遺伝子産物を破壊する（例えば、サイレンシング、抑制又は増強する）挿入／欠失変異の導入をもたらし得る。
[00895] 部位特異的なゲノム編集を可能にするために開発されたヌクレアーゼの主要なクラスには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が含まれる。これらのヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡ認識のモードに基づいて、大きく２つのカテゴリに分類できる。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮはタンパク質－ＤＮＡ相互作用を介して特定のＤＮＡ結合を実現する一方、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲシステムは、標的ＤＮＡと直接塩基対を形成する短鎖ＲＮＡガイド分子により、且つタンパク質－ＤＮＡ相互作用により、特定のＤＮＡ配列を標的化する。例えば、Cox et al., Nature Medicine, 2015, Vol. 21, No. 2を参照されたい。
[00896] 本発明のＴＩＬ拡大培養方法に従って使用され得る遺伝子編集方法の非限定的な例には、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法及びＺＦＮ法が含まれ、これらは以下により詳細に記載される。一実施形態によると、ＴＩＬを治療用集団に拡大培養する方法は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態（例えば、ＧＥＮ３プロセス）に従い、又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５８６１０号、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６０５号若しくはＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６３３号に記載されているように実施され得、ここで、方法は、強化された治療効果を提供することができるＴＩＬを生成するために、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法又はＺＦＮ法の１つ以上によってＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することを更に含む。一実施形態によると、遺伝子編集されたＴＩＬは、それらをインビトロで改変されていないＴＩＬと比較することにより、例えば、インビトロエフェクター機能、サイトカインプロファイルなどを未改変のＴＩＬと比較して評価することにより、改善された治療効果について評価され得る。特定の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥ及び／又はＺＦＮ法を使用して、ＴＩＬ集団を遺伝子編集することを含む。
[00897] 本発明の一部の実施形態において、エレクトロポレーションは、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ及びＺＦＮシステムなどの遺伝子編集システムの送達に使用される。本発明の一部の実施形態において、エレクトロポレーションシステムは、フローエレクトロポレーションシステムである。本発明の一部の実施形態での使用に適した、適切なフローエレクトロポレーションシステムの例は、市販のMaxCyte STXシステムである。BTX-Harvard Apparatusから入手できるAgilePulseシステム又はECM 830、Cellaxess Elektra（Cellectricon）、Nucleofector（Lonza／Amaxa）、GenePulser MXcell（BIORAD）、iPorator-96（Primax）又はsiPORTer96（Ambion）など、本発明での使用に適する可能性のあるいくつかの代替の市販のエレクトロポレーション機器が存在する。本発明の一部の実施形態において、エレクトロポレーションシステムは、残りのＴＩＬ拡大培養方法により、閉鎖無菌システムを形成する。本発明の一部の実施形態において、エレクトロポレーションシステムは、本明細書に記載されるようなパルスエレクトロポレーションシステムであり、残りのＴＩＬ拡大培養方法により、閉鎖無菌システムを形成する。
[00898] ＴＩＬを治療用集団に拡大培養する方法は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態（例えば、プロセスＧＥＮ３）に従い、又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５８６１０号、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６０５号若しくはＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６３３号に記載されているように実施され得、ここで、方法は、ＣＲＩＳＰＲ法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）によってＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することを更に含む。特定の実施形態によると、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のＣＲＩＳＰＲ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現の、治療用ＴＩＬ集団の少なくとも一部におけるサイレンシング又は低下を引き起こす。代わりに、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のＣＲＩＳＰＲ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現の、治療用ＴＩＬ集団の少なくとも一部における増強を引き起こす。
[00899] ＣＲＩＳＰＲは、「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート」を表す。遺伝子編集のためにＣＲＩＳＰＲシステムを使用する方法は、本明細書ではＣＲＩＳＰＲ法とも称される。ＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を組み込み、本発明に従って使用され得る３つのタイプのＣＲＩＳＰＲシステム：タイプＩ、ＩＩ及びＩＩＩが存在する。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ（Ｃａｓ９により例示される）は、最もよく特徴付けられたシステムの１つである。
[00900] ＣＲＩＳＰＲ技術は、細菌及び古細菌（単細胞微生物のドメイン）の天然の防御機構から適応された。これらの生物は、ＣＲＩＳＰＲ由来ＲＮＡ及びＣａｓ９を含む様々なＣａｓタンパク質を使用して、外来の侵入者のＤＮＡを切り刻んで破壊することにより、ウイルス及び他の異物による攻撃を阻止する。ＣＲＩＳＰＲは、ヌクレオチド反復及びスペーサーの存在という２つの別個の特徴を有するＤＮＡの特殊な領域である。ヌクレオチドの反復配列は、反復配列間に散在した外来ＤＮＡ（スペーサー）の短いセグメントを伴い、ＣＲＩＳＰＲ領域全体に分布する。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサーがＣＲＩＳＰＲゲノム遺伝子座内に組み込まれ、転写され、短鎖ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へと処理される。これらのｃｒＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニーリングし、Ｃａｓタンパク質による病原性ＤＮＡの配列特異的な切断及びサイレンシングを指示する。Ｃａｓ９タンパク質による標的認識には、ｃｒＲＮＡ内の「シード」配列及びｃｒＲＮＡ結合領域の上流の保存されたジヌクレオチド含有プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を要する。これにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ｃｒＲＮＡを再設計することにより、実質的にあらゆるＤＮＡ配列を切断するために再標的化され得る。天然系におけるｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、遺伝子工学での使用のために、およそ１００ヌクレオチドの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）へと単純化できる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと必要なｃｒＲＮＡ成分とを発現するプラスミドの共送達により、ヒト細胞へ直接移植できる。標的化の制限を減少させるために、Ｃａｓタンパク質の異なるバリアントを使用し得る（例えば、Ｃｐｆ１などのＣａｓ９のオルソログ）。
[00901] ＣＲＩＳＰＲ法を介してＴＩＬを恒久的に遺伝子編集することによりサイレンシング又は阻害され得る遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ－３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３が含まれる。
[00902] ＣＲＩＳＰＲ法を介してＴＩＬを恒久的に遺伝子編集することにより強化され得る遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１が含まれる。
[00903] ＣＲＩＳＰＲ法により標的遺伝子配列の発現を変化させるための、本発明の実施形態に従って使用され得るシステム、方法及び組成物の例は、参照により本明細書に援用される米国特許第８，６９７，３５９号；同第８，９９３，２３３号；同第８，７９５，９６５号；同第８，７７１，９４５号；同第８，８８９，３５６号；同第８，８６５，４０６号；同第８，９９９，６４１号；同第８，９４５，８３９号；同第８，９３２，８１４号；同第８，８７１，４４５号；同第８，９０６，６１６号；及び同第８，８９５，３０８号に記載される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１を発現するためのプラスミドなど、ＣＲＩＳＰＲ法を実行するための資源は、GenScriptなどの企業から市販されている。
[00904] 一実施形態において、本明細書に記載されているようなＴＩＬ集団の遺伝子改変は、その開示が参照により本明細書に援用される米国特許第９７９０４９０号に記載されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを使用して実施され得る。
[00905] ＴＩＬを治療用集団に拡大培養する方法は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態（例えば、プロセス２Ａ）に従い、又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５８６１０号、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６０５号若しくはＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６３３号に記載されているように実施され得、ここで、方法は、ＴＡＬＥ法によってＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することを更に含む。特定の実施形態によると、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のＴＡＬＥ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現の、治療用ＴＩＬ集団の少なくとも一部におけるサイレンシング又は低下を引き起こす。代わりに、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のＴＡＬＥ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現の、治療用ＴＩＬ集団の少なくとも一部における増強を引き起こす。
[00906] ＴＡＬＥは、ＴＡＬＥＮ（「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」）を含む、「転写活性化因子様エフェクター」タンパク質を表す。遺伝子編集のためにＴＡＬＥシステムを使用する方法は、本明細書ではＴＡＬＥ法とも称され得る。ＴＡＬＥは、植物病原菌キサントモナス（Xanthomonas）属からの天然に存在するタンパク質であり、それぞれが単一の塩基対を認識する一連の３３～３５アミノ酸の反復ドメインで構成されるＤＮＡ結合ドメインを含有する。ＴＡＬＥの特異性は、反復可変二残基（ＲＶＤ）として知られる２つの超可変アミノ酸によって決定される。モジュラーＴＡＬＥリピートは、隣接するＤＮＡ配列を認識するために一緒に結合される。ＤＮＡ結合ドメインにおける特定のＲＶＤは、標的遺伝子座の塩基を認識し、予測可能なＤＮＡ結合ドメインを組み立てるための構造的特徴を提供する。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、タイプＩＩＳ ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合され、標的化可能なＴＡＬＥヌクレアーゼが作製される。部位特異的変異を誘発するために、１４～２０塩基対のスペーサー領域で分離された２つの個々のＴＡＬＥＮアームがＦｏｋＩモノマーを近接させて、二量体化し、標的化された二本鎖切断を生成する。
[00907] 様々な組み立て方法を利用したいくつかの大規模で体系的な研究は、ＴＡＬＥ反復を組み合わせて、実質的に任意のユーザー定義の配列を認識できることを示唆している。カスタム設計のＴＡＬＥアレイは、Cellectis Bioresearch（Paris, France）、Transposagen Biopharmaceuticals（Lexington, KY, USA）及びLife Technologies（Grand Island, NY, USA）からも市販されている。本発明における使用に適したＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮ法は、米国特許出願公開第２０１１／０２０１１１８ Ａ１号；第２０１３／０１１７８６９ Ａ１号；第２０１３／０３１５８８４ Ａ１号；第２０１５／０２０３８７１ Ａ１号及び第２０１６／０１２０９０６ Ａ１号に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
[00908] ＴＡＬＥ法を介してＴＩＬを恒久的に遺伝子編集することによりサイレンシング又は阻害され得る遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ－３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３が含まれる。
[00909] ＴＡＬＥ法を介してＴＩＬを恒久的に遺伝子編集することにより強化され得る遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１が含まれる。
[00910] ＴＡＬＥ法により標的遺伝子配列の発現を変化させるための、本発明の実施形態に従って使用され得るシステム、方法及び組成物の例は、参照により本明細書に援用される米国特許第８，５８６，５２６号に記載される。
[00911] ＴＩＬを治療用集団に拡大培養する方法は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態（例えば、プロセスＧＥＮ３）に従い、又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５８６１０号、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６０５号若しくはＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６３３号に記載されているように実施され得、ここで、方法は、ジンクフィンガー又はジンクフィンガーヌクレアーゼ法によってＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することを更に含む。特定の実施形態によると、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のジンクフィンガー法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現の、治療用ＴＩＬ集団の少なくとも一部におけるサイレンシング又は低下を引き起こす。代わりに、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のジンクフィンガー法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現の、治療用ＴＩＬ集団の少なくとも一部における増強を引き起こす。
[00912] 個々のジンクフィンガーは、保存されたββα構造中におよそ３０のアミノ酸を含有する。α－ヘリックスの表面上のいくつかのアミノ酸は、典型的には、様々な選択性のレベルで、ＤＮＡの主要な溝の３ｂｐに接触する。ジンクフィンガーは２つのタンパク質ドメインを有する。第１のドメインは、真核生物の転写因子を含み、ジンクフィンガーを含有する、ＤＮＡ結合ドメインである。第２のドメインはヌクレアーゼドメインであり、ＦｏｋＩ制限酵素を含み、ＤＮＡの触媒的切断の原因となっている。
[00913] 個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、３～６個の個々のジンクフィンガー反復を含み、それぞれ９～１８塩基対を認識できる。ジンクフィンガードメインが目的の標的部位に特異的である場合、合計１８塩基対を認識する１組の３フィンガーＺＦＮであっても、理論的には、哺乳動物ゲノムにおける単一の遺伝子座を標的とすることができる。新しいジンクフィンガーアレイを生成する１つの方法は、既知の特異性を有する、より小さいジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。最も一般的なモジュラー組み立てプロセスは、３塩基対のＤＮＡ配列をそれぞれ認識できる、３つの別個のジンクフィンガーを組み合わせて、９塩基対の標的部位を認識できる３フィンガーアレイを生成することを含む。代わりに、オリゴマー化プールエンジニアリング（ＯＰＥＮ）などの選択ベースのアプローチを使用して、隣接するフィンガー間の状況依存的な相互作用を考慮した無作為化ライブラリーから新しいジンクフィンガーアレイを選択できる。操作されたジンクフィンガーは市販されている。Sangamo Biosciences（Richmond, CA, USA）は、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）と協力して、ジンクフィンガー構築のための適切なプラットフォーム（CompoZr（登録商標））を開発した。
[00914] ジンクフィンガー法を介してＴＩＬを恒久的に遺伝子編集することによりサイレンシング又は阻害され得る遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ－３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３が含まれる。
[00915] ジンクフィンガー法を介してＴＩＬを恒久的に遺伝子編集することにより強化され得る遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１が含まれる。
[00916] ジンクフィンガー法により標的遺伝子配列の発現を変化させるための、本発明の実施形態に従って使用され得るシステム、方法及び組成物の例は、参照により本明細書に援用される米国特許第６，５３４，２６１号、第６，６０７，８８２号、第６，７４６，８３８号、第６，７９４，１３６号、第６，８２４，９７８号、第６，８６６，９９７号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号、第７，０３０，２１５号、第７，２２０，７１９号、第７，２４１，５７３号、第７，２４１，５７４号、第７，５８５，８４９号、第７，５９５，３７６号、第６，９０３，１８５号及び第６，４７９，６２６号に記載される。
[00917] ジンクフィンガー法により標的遺伝子配列の発現を変化させるための、本発明の実施形態に従って使用され得るシステム、方法及び組成物の他の例は、Beane, et al., Mol. Therapy, 2015, 23 1380-1390に記載され、その開示は参照により本明細書に援用される。
[00918] 一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択により、限定はされないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ又は腫瘍関連細胞表面分子（例えばメソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えばＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、追加の機能性を含むように遺伝子改変される。特定の実施形態において、方法は、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ又は腫瘍関連細胞表面分子（例えばメソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えばＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴＩＬ集団を遺伝子改変することを含む。適切には、ＴＩＬ集団は、本明細書に記載されるように、第１の集団、第２の集団及び／又は第３の集団であり得る。
Ｋ．ＴＩＬ製造用閉鎖系
[00919] 本発明は、ＴＩＬ培養プロセス中の閉鎖系の使用を提供する。かかる閉鎖系は、微生物汚染の防止及び／又は削減を可能にし、使用するフラスコの数が少なくなり、コスト削減が可能となる。一部の実施形態において、閉鎖系は２つの容器を使用する。
[00920] かかる閉鎖系は、当技術分野で公知であり、例えば、http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及びhttps://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm.に記載されている。
[00921] 滅菌接続装置（ＳＴＣＤ：Sterile Connecting Device）は、互換性のある２つの配管間に滅菌溶接を産生する。この手順により、様々な直径の容器及びチューブを滅菌接続できる。一部の実施形態において、閉鎖系は、例えば、実施例Ｇに記載されるようなルアーロック及びヒートシール系を含む。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、実施例Ｇに記載されるような閉鎖系が使用される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、実施例Ｇの「最終製剤化及び充填」セクションに記載される方法に従って最終製品製剤容器中に製剤化される。
[00922] 一部の実施形態において、閉鎖系は、腫瘍断片が得られた時点からＴＩＬが患者への投与又は凍結保存の準備が整うまで１つの容器を使用する。一部の実施形態において、２つの容器が使用される場合、第１の容器は閉鎖型Ｇコンテナであり、ＴＩＬ集団は遠心され、第１の閉鎖型Ｇコンテナを開かずに輸注バッグに移される。一部の実施形態において、２つの容器が使用される場合、輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。閉鎖系又は閉鎖ＴＩＬ細胞培養系は、腫瘍サンプル及び／又は腫瘍断片が追加されると、系が外側から確実に密閉され、細菌、真菌及び／又は他の微生物汚染がない閉鎖環境を形成することを特徴とする。
[00923] 一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約５％～約１００％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約５％～約９５％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約５％～約９０％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約１０％～約９０％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約１５％～約８５％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％である。
[00924] 閉鎖系は、微生物汚染の不在下及び／又は大幅に減少させＴＩＬを成長させる。
[00925] 更に、ＴＩＬ細胞培養環境のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧は、細胞が培養されるにつれてそれぞれ変化する。従って、たとえ細胞培養に適した培地が流通していても、ＴＩＬ成長に最適な環境として閉鎖環境を常に維持する必要がある。このため、閉鎖環境の培地内のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧の物理的要因は、センサーによって監視され、そのセンサーの信号は、培養環境の入口に設置されたガス交換器の制御に使用され、閉鎖環境のガス分圧は、細胞培養環境を最適化するため、培地の変化に従ってリアルタイムで調整されることが望ましい。一部の実施形態において、本発明は、閉鎖環境への入口に、閉鎖環境のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧を測定し、監視装置からの信号に基づいてガス濃度を自動的に調整することにより、細胞培養環境を最適化する監視装置を備えたガス交換器を一体化した閉鎖細胞培養系を提供する。
[00926] 一部の実施形態において、閉鎖環境内の圧力は連続的又は断続的に制御される。即ち、閉鎖環境内の圧力は、例えば、圧力維持装置によって変化させることができ、即ち、空間が、陽圧状態のＴＩＬの成長に適していることを保証するか、又は陰圧状態の流体の滲出を促進し、従って細胞成長を促進することを確実にする。更に、断続的に負圧を加えることにより、閉鎖環境の容積の一時的な収縮によって閉鎖環境内の循環液を均一且つ効率的に交換することが可能である。
[00927] 一部の実施形態において、ＴＩＬの成長に最適な培養成分を置換又は追加することができ、ＩＬ－２及び／又はＯＫＴ３などの要因並びに組み合わせを追加し得る。
Ｌ．任意選択のＴＩＬ凍結保存
[00928] バルクＴＩＬ集団（例えば、第２のＴＩＬ集団）又は拡大培養されたＴＩＬ集団（例えば、第３のＴＩＬ集団）は、任意選択により凍結保存できる。一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団で凍結保存が行われる。一部の実施形態において、凍結保存は、第２の拡大培養後に回収したＴＩＬで生じる。一部の実施形態において、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）の例示的ステップＦのＴＩＬで凍結保存が行われる。一部の実施形態において、ＴＩＬは輸注バッグ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、輸注バッグでの置換前に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、凍結保存されるが輸注バッグ中には置かれない。一部の実施形態において、凍結保存は凍結保存培地を使用して実施される。一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する。これは、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中にＴＩＬ集団を入れることにより達成される。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、－８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択で凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。
[00929] 適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は概して完全培地中に再懸濁され、任意選択で１回以上洗浄される。一部の実施形態において、当技術分野において公知の通り解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
[00930] 好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団はＣＳ１０凍結保存培地（CryoStor 10、BioLife Solutions）を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は凍結保存培地（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する）を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は、１：１（容積：容積）の比のＣＳ１０及び細胞培養培地を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は、約１：１（容積：容積）の比のＣＳ１０及び細胞培養培地を使用し、更に追加のＩＬ－２を含んで凍結保存される。
[00931] 上記で考察し、且つ図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に提供されるステップＡ～Ｅにおいて例示した通り、ＴＩＬ拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）のステップＤに従って提供される）第２の拡大培養後の拡大培養されたＴＩＬ集団は、凍結保存することができる。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中にＴＩＬ集団を置くことにより達成し得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、－８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択により凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。一部の実施形態において、ＴＩＬは５％ＤＭＳＯ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは細胞培養培地＋５％ＤＭＳＯ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、実施例Ｄに提供される方法に従い凍結保存される。
[00932] 適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は概して完全培地中に再懸濁され、任意選択で１回以上洗浄される。一部の実施形態において、当技術分野において公知の通り解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
[00933] ある場合には、ステップＢのＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直ちに凍結保存することができる。代わりに、バルクＴＩＬ集団にステップＣ及びステップＤを施し、ステップＤ後に凍結保存することができる。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬを治療に使用する場合、ステップＢ又はステップＤのＴＩＬ集団は、適切な処置のため遺伝子修飾の対象となり得る。
Ｍ．拡大培養したＴＩＬの表現型特徴
[00934] 一部の実施形態において、ＴＩＬは拡大培養後に、本明細書及び実施例に記載されるものを含め、多数の表現型マーカーの発現に関して分析される。一実施形態において、１つ以上の表現型マーカーの発現が調べられる。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＢの第１の拡大培養後に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＣの移行中に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＣに係る移行中且つ凍結保存後に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＤに係る第２の拡大培養後に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＤに係る２回以上の拡大培養後に分析される。
[00935] 一部の実施形態において、マーカーは、ＣＤ８及びＣＤ２８からなる群から選択される。一部の実施形態において、ＣＤ８の発現が調べられる。一部の実施形態において、ＣＤ２８の発現が調べられる。一部の実施形態において、ＣＤ８及び／又はＣＤ２８の発現は、他のプロセスと比較して、本発明のプロセスに従って産生したＴＩＬにおいて、より高い（例えば、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に提供される、２Ａプロセスと比較して、例えば図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に提供される、Ｇｅｎ３プロセス）。一部の実施形態において、ＣＤ８の発現は、他のプロセスと比較して、本発明のプロセスに従って産生したＴＩＬにおいて、より高い（例えば、例えば図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に提供される、２Ａプロセスと比較して、例えば図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に提供される、Ｇｅｎ３プロセス）。一部の実施形態において、ＣＤ２８の発現は、他のプロセスと比較して、本発明のプロセスに従って産生したＴＩＬにおいて、より高い（例えば、例えば図１（特に例えば図１Ａ）に提供される、２Ａプロセスと比較して、例えば図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に提供される、Ｇｅｎ３プロセス）。一部の実施形態において、高ＣＤ２８発現は、より幼若で、より持続性のＴＩＬ表現型を示す。一実施形態において、１つ以上の調節マーカーの発現が測定される。
[00936] 一実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団又はＣＤ８及び／又はＣＤ２８発現に基づく回収ＴＩＬの選択は、本明細書に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法のいずれのステップ中も実施されない。
[00937] 一部の実施形態において、セントラルメモリー細胞のパーセンテージは、他のプロセスと比較して、本発明のプロセスに従って産生したＴＩＬにおいて、より高い（例えば、例えば図１（特に例えば図１Ａ）に提供される、２Ａプロセスと比較して、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に提供される、Ｇｅｎ３プロセス）。一部の実施形態において、セントラルメモリー細胞のメモリーマーカーは、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌからなる群から選択される。
[00938] 一部の実施形態において、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋ＴＩＬメモリーサブセットは、異なるメモリーサブセットに分割することができる。一部の実施形態において、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋ＴＩＬは、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）ＴＩＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋ＴＩＬは、セントラルメモリー（ＣＭ；ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋）ＴＩＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋ＴＩＬは、エフェクターメモリー（ＥＭ；ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－）ＴＩＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋ＴＩＬは、ＲＡ＋エフェクターメモリー／エフェクター（ＴＥＭＲＡ／ＴＥＦＦ；ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）ＴＩＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ４＋集団と比較して、より高い％のＣＤ８＋が存在する。
[00939] 一部の実施形態において、ＴＩＬは、グランザイムＢ、パーフォリン及びグラニュライシンからなる群から選択されるもう１つのマーカーを発現する。一部の実施形態において、ＴＩＬはグランザイムＢを発現する。一部の実施形態において、ＴＩＬはパーフォリンを発現する。一部の実施形態において、ＴＩＬはグラニュライシンを発現する。
[00940] 一実施形態において、再刺激ＴＩＬは、サイトカイン遊離アッセイを用いてサイトカイン遊離に関しても判定することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）分泌について評価され得る。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、例えば図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に提供されるように、ステップＤ後の第２の急速拡大培養後のＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。一部の実施形態において、ＴＩＬの健康はＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）分泌によって測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能のもう１つの尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ１３７／４－１ＢＢに対する抗体で刺激されたＴＩＬの培地中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することで測定できる。これらの刺激したＴＩＬからの培地中のＩＦＮ－γレベルは、ＩＦＮ－γ遊離を測定することにより決定できる。一部の実施形態において、図１（特に例えば図１Ａ）で提供される２Ａプロセスの、例えばステップＤと比較した、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）ＴＩＬで提供されるＧｅｎ３プロセスの、例えばステップＤにおける、ＩＦＮ－γ産生の増加は、ステップＤのＴＩＬの細胞傷害性の可能性の増加を示す。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以上増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は１倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は２倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は３倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は４倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は５倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γはQuantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γはＴＩＬエキソビボで測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、本発明の方法（例えば、図１の方法を含む）により作製されたＴＩＬを含む、ＴＩＬエキソビボにおいて測定される。
[00941] 一部の実施形態において、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以上のＩＦＮ－γを分泌できるＴＩＬは、本発明の拡大培養方法（例えば、図１Ｂ及び又は図１Ｃの方法を含む）により産生されたＴＩＬである。一部の実施形態において、少なくとも１倍多くのＩＦＮ－γを分泌できるＴＩＬは、本発明の拡大培養方法（例えば、図１Ｂ及び又は図１Ｃの方法を含む）により産生されたＴＩＬである。一部の実施形態において、少なくとも２倍多くのＩＦＮ－γを分泌できるＴＩＬは、本発明の拡大培養方法（例えば、図１Ｂ及び又は図１Ｃの方法を含む）により産生されたＴＩＬである。一部の実施形態において、少なくとも３倍多くのＩＦＮ－γを分泌できるＴＩＬは、本発明の拡大培養方法（例えば、図１Ｂ及び又は図１Ｃの方法を含む）により産生されたＴＩＬである。一部の実施形態において、少なくとも４倍多くのＩＦＮ－γを分泌できるＴＩＬは、本発明の拡大培養方法（例えば、図１Ｂ及び又は図１Ｃの方法を含む）により産生されたＴＩＬである。一部の実施形態において、少なくとも５倍多くのＩＦＮ－γを分泌できるＴＩＬは、本発明の拡大培養方法（例えば、図１Ｂ及び又は図１Ｃの方法を含む）により産生されたＴＩＬである。
[00942] Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）及びＣ（定数）の遺伝子セグメントは、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、本方法によって得られたＴＩＬは、新たに回収したＴＩＬ及び／又は例えば、図１（特に例えば図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、図１（特に例えば図１Ａ）に例示されているように、本方法によって得られたＴＩＬは、新たに回収したＴＩＬ及び／又はプロセス２Ａと称される方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第１の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性はＴ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（即ちＴＣＲα／β）の発現が増加する。一部の実施形態において、本明細書に記載されるプロセス（例えば、Ｇｅｎ３プロセス）は、他のプロセス、例えば、サンプル内のユニークなペプチドＣＤＲの数に基づいてＧｅｎ２と称されるプロセス（例えば、図１２～１４を参照されたい）と比較して、より高いクローン多様性を示す。
[00943] 一部の実施形態において、ＴＩＬの活性化及び枯渇は、１つ以上のマーカーを調べることによって決定することができる。一部の実施形態において、活性化及び枯渇は、多色フローサイトメトリーを使用して決定することができる。一部の実施形態において、マーカーの活性化及び枯渇は、限定されないが、ＣＤ３、ＰＤ－１、２Ｂ４／ＣＤ２４４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＢＴＬＡ、ＫＬＲＧ、ＴＩＭ－３、ＣＤ１９４／ＣＣＲ４、ＣＤ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１８３、ＣＤ６９、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、ＣＤ１０３及び／又はＬＡＧ－３からなる群から選択される１つ以上のマーカーを含む。一部の実施形態において、マーカーの活性化及び枯渇は、限定されないが、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ及び／又はＴＩＭ－３からなる群から選択される１つ以上のマーカーを含む。一部の実施形態において、マーカーの活性化及び枯渇は、限定されないが、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ－３、ＣＤ１０３＋／ＣＤ６９＋、ＣＤ１０３＋／ＣＤ６９－、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ及び／又はＴＩＭ－３からなる群から選択される１つ以上のマーカーを含む。一部の実施形態において、Ｔ細胞マーカー（活性化及び枯渇マーカーを含む）は、Ｔ細胞の活性化、阻害又は機能を調べるために決定及び／又は分析され得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞マーカーは、限定されないが、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ３、ＦｏｘＰ３、Ｔｉｍ－３、ＰＤ－１、ＣＤ１０３、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ４及び／又はＣＤ５９からなる群から選択される１つ以上のマーカーを含み得る。
[00944] 一部の実施形態において、表現型の特徴付けは、凍結保存後に調べられる。
Ｎ．追加的なプロセス実施形態
[00945] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、（ａ）対象から得られた腫瘍サンプルを処理して複数の腫瘍断片にすることにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；（ｂ）ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施することであって、第１の初回刺激拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１～８日間にわたって実施され、ＴＩＬの第２の集団は、数においてＴＩＬの第１の集団よりも多い、実施すること；（ｃ）第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び外因性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地と接触させることにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の急速拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約１日間～１０日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、生じさせること；及び（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することを含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ内の小スケール培養物中で約２～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（２）第２のＴＩＬ集団を小スケール培養物から第１の容器よりも大きい第２の容器、例えばG-REX 500MCSコンテナに移すことにより、培養物のスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、ここで、第２の容器において、小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団は、より大きいスケールの培養物中で、約４～８日間の期間にわたり培養される。一部の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、第１の小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器と同じである、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウトを達成するために複数のステップに分割され、ここで、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団の一部は、約４～８日間の期間にわたり、第２の小スケール培養物中で培養される。一部の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約２～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、ここで、各第２の容器において、小スケール培養物からそのような第２の容器へ移された第２のＴＩＬ集団の一部は、約４～８日間の期間にわたり、より大きいスケールの培養物中で培養される。一部の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、２、３又は４個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、ここで、各第２の容器において、小スケール培養物からそのような第２の容器へ移された第２のＴＩＬ集団の一部は、約５～７日間の期間にわたり、より大きいスケールの培養物中で培養される。
[00946] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、（ａ）対象から得られた腫瘍サンプルを処理して複数の腫瘍断片にすることにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；（ｂ）ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施することであって、第１の初回刺激拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１～８日間にわたって実施され、ＴＩＬの第２の集団は、数においてＴＩＬの第１の集団よりも多い、実施すること；（ｃ）第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び外因性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地と接触させることにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の急速拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約１日間～８日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、生じさせること；及び（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することを含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ内の小スケール培養物中で約２～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（２）第２のＴＩＬ集団を小スケール培養物から第１の容器よりも大きい第２の容器、例えばG-REX 500MCSコンテナに移すことにより、培養物のスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、ここで、第２の容器において、小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団は、より大きいスケールの培養物中で、約４～８日間の期間にわたり培養される。一部の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、第１の小スケール培養物中で約２～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器と同じである、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウトを達成するために複数のステップに分割され、ここで、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団の一部は、約４～６日間の期間にわたり、第２の小スケール培養物中で培養される。一部の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約２～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、ここで、各第２の容器において、小スケール培養物からそのような第２の容器へ移された第２のＴＩＬ集団の一部は、約４～６日間の期間にわたり、より大きいスケールの培養物中で培養される。一部の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、２、３又は４個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、ここで、各第２の容器において、小スケール培養物からそのような第２の容器へ移された第２のＴＩＬ集団の一部は、約４～５日間の期間にわたり、より大きいスケールの培養物中で培養される。
[00947] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、（ａ）対象から得られた腫瘍サンプルを処理して複数の腫瘍断片にすることにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；（ｂ）ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施することであって、第１の初回刺激拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１～７日間にわたって実施され、ＴＩＬの第２の集団は、数においてＴＩＬの第１の集団よりも多い、実施すること；（ｃ）第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び外因性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地と接触させることにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の急速拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約１～１１日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、生じさせること；及び（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することを含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ内の小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（２）第２のＴＩＬ集団を小スケール培養物から第１の容器よりも大きい第２の容器、例えばG-REX 500MCSコンテナに移すことにより、培養物のスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、ここで、第２の容器において、小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団は、より大きいスケールの培養物中で、約４～７日間の期間にわたり培養される。一部の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、第１の小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器と同じである、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウトを達成するために複数のステップに分割され、ここで、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団の一部は、約４～７日間の期間にわたり、第２の小スケール培養物中で培養される。一部の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、ここで、各第２の容器において、小スケール培養物からそのような第２の容器へ移された第２のＴＩＬ集団の一部は、約４～７日間の期間にわたり、より大きいスケールの培養物中で培養される。一部の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、少なくとも２、３又は４個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、ここで、各第２の容器において、小スケール培養物からそのような第２の容器へ移された第２のＴＩＬ集団の一部は、約５日間の期間にわたり、より大きいスケールの培養物中で培養される。
[00948] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、最初の第１の拡大培養が、第１のＴＩＬ集団を、外因性の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を更に含む培養培地に接触させることによって実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）の培養培地中のＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）の培養培地中のＡＰＣの数よりも大きい。
[00949] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において培養培地に追加の外因性のＡＰＣが補充されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00950] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～２０：１又は約２０：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00951] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～１０：１又は約１０：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00952] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～９：１又は約９：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00953] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～８：１又は約８：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00954] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～７：１又は約７：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00955] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～６：１又は約６：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00956] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～５：１又は約５：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00957] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～４：１又は約４：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00958] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～３：１又は約３：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00959] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～２．９：１又は約２．９：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00960] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～２．８：１又は約２．８：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00961] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～２．７：１又は約２．７：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00962] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～２．６：１又は約２．６：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00963] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～２．５：１又は約２．５：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00964] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～２．４：１又は約２．４：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00965] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～２．３：１又は約２．３：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00966] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～２．２：１又は約２．２：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00967] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～２．１：１又は約２．１：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00968] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１又は約１．１：１～２：１又は約２：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00969] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、２：１又は約２：１～１０：１又は約１０：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00970] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、２：１又は約２：１～５：１又は約５：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00971] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、２：１又は約２：１～４：１又は約４：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00972] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、２：１又は約２：１～３：１又は約３：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00973] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、２：１又は約２：１～２．９：１又は約２．９：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00974] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、２：１又は約２：１～２．８：１又は約２．８：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00975] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、２：１又は約２：１～２．７：１又は約２．７：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00976] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、２：１又は約２：１～２．６：１又は約２．６：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00977] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、２：１又は約２：１～２．５：１又は約２．５：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00978] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、２：１又は約２：１～２．４：１又は約２．４：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00979] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、２：１又は約２：１～２．３：１又は約２．３：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00980] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、２：１又は約２：１～２．２：１又は約２．２：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00981] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、２：１又は約２：１～２．１：１又は約２．１：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00982] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、２：１又は約２：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00983] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が、１．１：１若しくは約１．１：１、１．２：１若しくは約１．２：１、１．３：１若しくは約１．３：１、１．４：１若しくは約１．４：１、１．５：１若しくは約１．５：１、１．６：１若しくは約１．６：１、１．７：１若しくは約１．７：１、１．８：１若しくは約１．８：１、１．９：１若しくは約１．９：１、２：１若しくは約２：１、２．１：１若しくは約２．１：１、２．２：１若しくは約２．２：１、２．３：１若しくは約２．３：１、２．４：１若しくは約２．４：１、２．５：１若しくは約２．５：１、２．６：１若しくは約２．６：１、２．７：１若しくは約２．７：１、２．８：１若しくは約２．８：１、２．９：１若しくは約２．９：１、３：１若しくは約３：１、３．１：１若しくは約３．１：１、３．２：１若しくは約３．２：１、３．３：１若しくは約３．３：１、３．４：１若しくは約３．４：１、３．５：１若しくは約３．５：１、３．６：１若しくは約３．６：１、３．７：１若しくは約３．７：１、３．８：１若しくは約３．８：１、３．９：１若しくは約３．９：１、４：１若しくは約４：１、４．１：１若しくは約４．１：１、４．２：１若しくは約４．２：１、４．３：１若しくは約４．３：１、４．４：１若しくは約４．４：１、４．５：１若しくは約４．５：１、４．６：１若しくは約４．６：１、４．７：１若しくは約４．７：１、４．８：１若しくは約４．８：１、４．９：１若しくは約４．９：１又は５：１若しくは５：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00984] 別の実施形態において、本発明は、第１の初回刺激拡大培養で添加されたＡＰＣの数が、１×１０８若しくは約１×１０８、１．１×１０８若しくは約１．１×１０８、１．２×１０８若しくは約１．２×１０８、１．３×１０８若しくは約１．３×１０８、１．４×１０８若しくは約１．４×１０８、１．５×１０８若しくは約１．５×１０８、１．６×１０８若しくは約１．６×１０８、１．７×１０８若しくは約１．７×１０８、１．８×１０８若しくは約１．８×１０８、１．９×１０８若しくは約１．９×１０８、２×１０８若しくは約２×１０８、２．１×１０８若しくは約２．１×１０８、２．２×１０８若しくは約２．２×１０８、２．３×１０８若しくは約２．３×１０８、２．４×１０８若しくは約２．４×１０８、２．５×１０８若しくは約２．５×１０８、２．６×１０８若しくは約２．６×１０８、２．７×１０８若しくは約２．７×１０８、２．８×１０８若しくは約２．８×１０８、２．９×１０８若しくは約２．９×１０８、３×１０８若しくは約３×１０８、３．１×１０８若しくは約３．１×１０８、３．２×１０８若しくは約３．２×１０８、３．３×１０８若しくは約３．３×１０８、３．４×１０８若しくは約３．４×１０８又は３．５×１０８若しくは約３．５×１０８ＡＰＣであり、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数が、３．５×１０８若しくは約３．５×１０８、３．６×１０８若しくは約３．６×１０８、３．７×１０８若しくは約３．７×１０８、３．８×１０８若しくは約３．８×１０８、３．９×１０８若しくは約３．９×１０８、４×１０８若しくは約４×１０８、４．１×１０８若しくは約４．１×１０８、４．２×１０８若しくは約４．２×１０８、４．３×１０８若しくは約４．３×１０８、４．４×１０８若しくは約４．４×１０８、４．５×１０８若しくは約４．５×１０８、４．６×１０８若しくは約４．６×１０８、４．７×１０８若しくは約４．７×１０８、４．８×１０８若しくは約４．８×１０８、４．９×１０８若しくは約４．９×１０８、５×１０８若しくは約５×１０８、５．１×１０８若しくは約５．１×１０８、５．２×１０８若しくは約５．２×１０８、５．３×１０８若しくは約５．３×１０８、５．４×１０８若しくは約５．４×１０８、５．５×１０８若しくは約５．５×１０８、５．６×１０８若しくは約５．６×１０８、５．７×１０８若しくは約５．７×１０８、５．８×１０８若しくは約５．８×１０８、５．９×１０８若しくは約５．９×１０８、６×１０８若しくは約６×１０８、６．１×１０８若しくは約６．１×１０８、６．２×１０８若しくは約６．２×１０８、６．３×１０８若しくは約６．３×１０８、６．４×１０８若しくは約６．４×１０８、６．５×１０８若しくは約６．５×１０８、６．６×１０８若しくは約６．６×１０８、６．７×１０８若しくは約６．７×１０８、６．８×１０８若しくは約６．８×１０８、６．９×１０８若しくは約６．９×１０８、７×１０８若しくは約７×１０８、７．１×１０８若しくは約７．１×１０８、７．２×１０８若しくは約７．２×１０８、７．３×１０８若しくは約７．３×１０８、７．４×１０８若しくは約７．４×１０８、７．５×１０８若しくは約７．５×１０８、７．６×１０８若しくは約７．６×１０８、７．７×１０８若しくは約７．７×１０８、７．８×１０８若しくは約７．８×１０８、７．９×１０８若しくは約７．９×１０８、８×１０８若しくは約８×１０８、８．１×１０８若しくは約８．１×１０８、８．２×１０８若しくは約８．２×１０８、８．３×１０８若しくは約８．３×１０８、８．４×１０８若しくは約８．４×１０８、８．５×１０８若しくは約８．５×１０８、８．６×１０８若しくは約８．６×１０８、８．７×１０８若しくは約８．７×１０８、８．８×１０８若しくは約８．８×１０８、８．９×１０８若しくは約８．９×１０８、９×１０８若しくは約９×１０８、９．１×１０８若しくは約９．１×１０８、９．２×１０８若しくは約９．２×１０８、９．３×１０８若しくは約９．３×１０８、９．４×１０８若しくは約９．４×１０８、９．５×１０８若しくは約９．５×１０８、９．６×１０８若しくは約９．６×１０８、９．７×１０８若しくは約９．７×１０８、９．８×１０８若しくは約９．８×１０８、９．９×１０８若しくは約９．９×１０８又は１×１０９若しくは約１×１０９ＡＰＣである。ように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00985] 別の実施形態において、本発明は、第１の初回刺激拡大培養で添加されたＡＰＣの数が、１×１０８又は約１×１０８ＡＰＣ～３．５×１０８又は約３．５×１０８ＡＰＣの範囲であり、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数が、３．５×１０８又は約３．５×１０８ＡＰＣ～１×１０９又は約１×１０９ＡＰＣの範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00986] 別の実施形態において、本発明は、第１の初回刺激拡大培養で添加されたＡＰＣの数が、１．５×１０８又は約１．５×１０８ＡＰＣ～３×１０８又は約３×１０８ＡＰＣの範囲であり、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数が、４×１０８又は約４×１０８ＡＰＣ～７．５×１０８又は約７．５×１０８ＡＰＣの範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00987] 別の実施形態において、本発明は、第１の初回刺激拡大培養で添加されたＡＰＣの数が、２×１０８又は約２×１０８ＡＰＣ～２．５×１０８又は約２．５×１０８ＡＰＣの範囲であり、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数が、４．５×１０８又は約４．５×１０８ＡＰＣ～５．５×１０８又は約５．５×１０８ＡＰＣの範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00988] 別の実施形態において、本発明は、２．５×１０８又は約２．５×１０８個のＡＰＣが、第１の初回刺激拡大培養に添加され、５×１０８又は約５×１０８個のＡＰＣが、第２の急速拡大培養に添加されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00989] 別の実施形態において、本発明は、抗原提示細胞が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00990] 別の実施形態において、本発明は、複数の腫瘍断片が複数の別個の容器に分配され、そのそれぞれの容器において第１のＴＩＬ集団がステップ（ａ）で得られ、第２のＴＩＬ集団がステップ（ｂ）で得られ、第３のＴＩＬ集団がステップ（ｃ）で得られ、ステップ（ｃ）の複数の容器からの治療用ＴＩＬ集団を併せて、ステップ（ｄ）から回収されるＴＩＬ集団が得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00991] 別の実施形態において、本発明は、複数の腫瘍が複数の別個の容器に均一に分配されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00992] 別の実施形態において、本発明は、複数の別個の容器が、少なくとも２個の別個の容器を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00993] 別の実施形態において、本発明は、複数の別個の容器が、２～２０個の別個の容器を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00994] 別の実施形態において、本発明は、複数の別個の容器が、２～１５個の別個の容器を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00995] 別の実施形態において、本発明は、複数の別個の容器が、２～１０個の別個の容器を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00996] 別の実施形態において、本発明は、複数の別個の容器が、２～５個の別個の容器を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00997] 別の実施形態において、本発明は、複数の別個の容器が、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個の別個の容器を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00998] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）で第１のＴＩＬ集団に対して第１の初回刺激拡大培養が実施される各容器について、ステップ（ｃ）における第２の急速拡大培養が、そのような第１のＴＩＬ集団から産生された第２のＴＩＬ集団に対して同じ容器内で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[00999] 別の実施形態において、本発明は、別個の容器がそれぞれ第１のガス透過性表面積を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001000] 別の実施形態において、本発明は、複数の腫瘍断片が単一の容器に分配されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001001] 別の実施形態において、本発明は、単一の容器が第１のガス透過性表面積を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001002] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、最初の第１の拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に、１又は約１の細胞層～３又は約３の細胞層の厚さ平均で積層される。
[001003] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、１．５又は約１．５の細胞層～２．５又は約２．５の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001004] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、２又は約２の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001005] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、１若しくは約１、１．１若しくは約１．１、１．２若しくは約１．２、１．３若しくは約１．３、１．４若しくは約１．４、１．５若しくは約１．５、１．６若しくは約１．６、１．７若しくは約１．７、１．８若しくは約１．８、１．９若しくは約１．９、２若しくは約２、２．１若しくは約２．１、２．２若しくは約２．２、２．３若しくは約２．３、２．４若しくは約２．４、２．５若しくは約２．５、２．６若しくは約２．６、２．７若しくは約２．７、２．８若しくは約２．８、２．９若しくは約２．９又は３若しくは約３の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001006] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、３又は約３の細胞層～１０又は約１０の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001007] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、４又は約４の細胞層～８又は約８の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001008] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９又は１０若しくは約１０の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001009] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、４若しくは約４、４．１若しくは約４．１、４．２若しくは約４．２、４．３若しくは約４．３、４．４若しくは約４．４、４．５若しくは約４．５、４．６若しくは約４．６、４．７若しくは約４．７、４．８若しくは約４．８、４．９若しくは約４．９、５若しくは約５、５．１若しくは約５．１、５．２若しくは約５．２、５．３若しくは約５．３、５．４若しくは約５．４、５．５若しくは約５．５、５．６若しくは約５．６、５．７若しくは約５．７、５．８若しくは約５．８、５．９若しくは約５．９、６若しくは約６、６．１若しくは約６．１、６．２若しくは約６．２、６．３若しくは約６．３、６．４若しくは約６．４、６．５若しくは約６．５、６．６若しくは約６．６、６．７若しくは約６．７、６．８若しくは約６．８、６．９若しくは約６．９、７若しくは約７、７．１若しくは約７．１、７．２若しくは約７．２、７．３若しくは約７．３、７．４若しくは約７．４、７．５若しくは約７．５、７．６若しくは約７．６、７．７若しくは約７．７、７．８若しくは約７．８、７．９若しくは約７．９又は８若しくは約８の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001010] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のガス透過性表面積を含む第１の容器内で実施され、ステップ（ｃ）において、第２の急速拡大培養が、第２のガス透過性表面積を含む第２の容器内で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001011] 別の実施形態において、本発明は、第２の容器が第１の容器よりも大きくなるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001012] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に、１又は約１の細胞層～３又は約３の細胞層の厚さ平均で積層される。
[001013] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、１．５又は約１．５の細胞層～２．５又は約２．５の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001014] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、２又は約２の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001015] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、１若しくは約１、１．１若しくは約１．１、１．２若しくは約１．２、１．３若しくは約１．３、１．４若しくは約１．４、１．５若しくは約１．５、１．６若しくは約１．６、１．７若しくは約１．７、１．８若しくは約１．８、１．９若しくは約１．９、２若しくは約２、２．１若しくは約２．１、２．２若しくは約２．２、２．３若しくは約２．３、２．４若しくは約２．４、２．５若しくは約２．５、２．６若しくは約２．６、２．７若しくは約２．７、２．８若しくは約２．８、２．９若しくは約２．９又は３若しくは約３の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001016] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、第２のガス透過性表面積上に、３又は約３の細胞層～１０又は約１０の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001017] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、第２のガス透過性表面積上に、４又は約４の細胞層～８又は約８の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001018] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、第２のガス透過性表面積上に、３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９又は１０若しくは約１０の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001019] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、第２のガス透過性表面積上に、４若しくは約４、４．１若しくは約４．１、４．２若しくは約４．２、４．３若しくは約４．３、４．４若しくは約４．４、４．５若しくは約４．５、４．６若しくは約４．６、４．７若しくは約４．７、４．８若しくは約４．８、４．９若しくは約４．９、５若しくは約５、５．１若しくは約５．１、５．２若しくは約５．２、５．３若しくは約５．３、５．４若しくは約５．４、５．５若しくは約５．５、５．６若しくは約５．６、５．７若しくは約５．７、５．８若しくは約５．８、５．９若しくは約５．９、６若しくは約６、６．１若しくは約６．１、６．２若しくは約６．２、６．３若しくは約６．３、６．４若しくは約６．４、６．５若しくは約６．５、６．６若しくは約６．６、６．７若しくは約６．７、６．８若しくは約６．８、６．９若しくは約６．９、７若しくは約７、７．１若しくは約７．１、７．２若しくは約７．２、７．３若しくは約７．３、７．４若しくは約７．４、７．５若しくは約７．５、７．６若しくは約７．６、７．７若しくは約７．７、７．８若しくは約７．８、７．９若しくは約７．９又は８若しくは約８の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001020] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のガス透過性表面積を含む第１の容器内で実施され、ステップ（ｃ）において、第２の急速拡大培養が、第１の容器内で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001021] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、最初の第１の拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に、１又は約１の細胞層～３又は約３の細胞層の厚さ平均で積層される。
[001022] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、１．５又は約１．５の細胞層～２．５又は約２．５の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001023] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、２又は約２の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001024] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、１若しくは約１、１．１若しくは約１．１、１．２若しくは約１．２、１．３若しくは約１．３、１．４若しくは約１．４、１．５若しくは約１．５、１．６若しくは約１．６、１．７若しくは約１．７、１．８若しくは約１．８、１．９若しくは約１．９、２若しくは約２、２．１若しくは約２．１、２．２若しくは約２．２、２．３若しくは約２．３、２．４若しくは約２．４、２．５若しくは約２．５、２．６若しくは約２．６、２．７若しくは約２．７、２．８若しくは約２．８、２．９若しくは約２．９又は３若しくは約３の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001025] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、３又は約３の細胞層～１０又は約１０の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001026] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、４又は約４の細胞層～８又は約８の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001027] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９又は１０若しくは約１０の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001028] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、第１のガス透過性表面積上に、４若しくは約４、４．１若しくは約４．１、４．２若しくは約４．２、４．３若しくは約４．３、４．４若しくは約４．４、４．５若しくは約４．５、４．６若しくは約４．６、４．７若しくは約４．７、４．８若しくは約４．８、４．９若しくは約４．９、５若しくは約５、５．１若しくは約５．１、５．２若しくは約５．２、５．３若しくは約５．３、５．４若しくは約５．４、５．５若しくは約５．５、５．６若しくは約５．６、５．７若しくは約５．７、５．８若しくは約５．８、５．９若しくは約５．９、６若しくは約６、６．１若しくは約６．１、６．２若しくは約６．２、６．３若しくは約６．３、６．４若しくは約６．４、６．５若しくは約６．５、６．６若しくは約６．６、６．７若しくは約６．７、６．８若しくは約６．８、６．９若しくは約６．９、７若しくは約７、７．１若しくは約７．１、７．２若しくは約７．２、７．３若しくは約７．３、７．４若しくは約７．４、７．５若しくは約７．５、７．６若しくは約７．６、７．７若しくは約７．７、７．８若しくは約７．８、７．９若しくは約７．９又は８若しくは約８の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001029] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの層の平均数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：１０又は約１：１０の範囲である。
[001030] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの層の平均数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：９又は約１：９の範囲である。
[001031] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの層の平均数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：８又は約１：８の範囲である。
[001032] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの層の平均数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：７又は約１：７の範囲である。
[001033] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの層の平均数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：６又は約１：６の範囲である。
[001034] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの層の平均数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：５又は約１：５の範囲である。
[001035] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの層の平均数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：４又は約１：４の範囲である。
[001036] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの層の平均数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：３又は約１：３の範囲である。
[001037] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：２又は約１：２の範囲である。
[001038] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．２又は約１：１．２～１：８又は約１：８の範囲である。
[001039] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．３又は約１：１．３～１：７又は約１：７の範囲である。
[001040] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．４又は約１：１．４～１：６又は約１：６の範囲である。
[001041] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初回刺激拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．５又は約１：１．５～１：５又は約１：５の範囲である。
[001042] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、初回刺激第１の拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．６又は約１：１．６～１：４又は約１：４の範囲である。
[001043] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、初回刺激第１の拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．７又は約１：１．７～１：３．５又は約１：３．５の範囲である。
[001044] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、初回刺激第１の拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．８又は約１：１．８～１：３又は約１：３の範囲である。
[001045] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、初回刺激第１の拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．９又は約１：１．９～１：２．５又は約１：２．５の範囲である。
[001046] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、初回刺激第１の拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：２又は約１：２の範囲である。
[001047] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、初回刺激第１の拡大培養が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ここで、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３、１：３．１、１：３．２、１：３．３、１：３．４、１：３．５、１：３．６、１：３．７、１：３．８、１：３．９、１：４、１：４．１、１：４．２、１：４．３、１：４．４、１：４．５、１：４．６、１：４．７、１：４．８、１：４．９、１：５、１：５．１、１：５．２、１：５．３、１：５．４、１：５．５、１：５．６、１：５．７、１：５．８、１：５．９、１：６、１：６．１、１：６．２、１：６．３、１：６．４、１：６．５、１：６．６、１：６．７、１：６．８、１：６．９、１：７、１：７．１、１：７．２、１：７．３、１：７．４、１：７．５、１：７．６、１：７．７、１：７．８、１：７．９、１：８、１：８．１、１：８．２、１：８．３、１：８．４、１：８．５、１：８．６、１：８．７、１：８．８、１：８．９、１：９、１：９．１、１：９．２、１：９．３、１：９．４、１：９．５、１：９．６、１：９．７、１：９．８、１：９．９若しくは１：１０又は約１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３、１：３．１、１：３．２、１：３．３、１：３．４、１：３．５、１：３．６、１：３．７、１：３．８、１：３．９、１：４、１：４．１、１：４．２、１：４．３、１：４．４、１：４．５、１：４．６、１：４．７、１：４．８、１：４．９、１：５、１：５．１、１：５．２、１：５．３、１：５．４、１：５．５、１：５．６、１：５．７、１：５．８、１：５．９、１：６、１：６．１、１：６．２、１：６．３、１：６．４、１：６．５、１：６．６、１：６．７、１：６．８、１：６．９、１：７、１：７．１、１：７．２、１：７．３、１：７．４、１：７．５、１：７．６、１：７．７、１：７．８、１：７．９、１：８、１：８．１、１：８．２、１：８．３、１：８．４、１：８．５、１：８．６、１：８．７、１：８．８、１：８．９、１：９、１：９．１、１：９．２、１：９．３、１：９．４、１：９．５、１：９．６、１：９．７、１：９．８、１：９．９若しくは１：１０である。
[001048] 別の実施形態において、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団のＴＩＬ数との比が、１．５：１又は約１．５：１～１００：１又は約１００：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001049] 別の実施形態において、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団のＴＩＬ数との比が、５０：１又は約５０：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001050] 別の実施形態において、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団のＴＩＬ数との比が、２５：１又は約２５：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001051] 別の実施形態において、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団のＴＩＬ数との比が、２０：１又は約２０：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001052] 別の実施形態において、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団のＴＩＬ数との比が、１０：１又は約１０：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001053] 別の実施形態において、本発明は、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団より数が少なくとも５０倍又は約５０倍多くなるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001054] 別の実施形態において、本発明は、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団より数が、少なくとも１倍若しくは約１倍、２倍若しくは約２倍、３倍若しくは約３倍、４倍若しくは約４倍、５倍若しくは約５倍、６倍若しくは約６倍、７倍若しくは約７倍、８倍若しくは約８倍、９倍若しくは約９倍、１０倍若しくは約１０倍、１１倍若しくは約１１倍、１２倍若しくは約１２倍、１３倍若しくは約１３倍、１４倍若しくは約１４倍、１５倍若しくは約１５倍、１６倍若しくは約１６倍、１７倍若しくは約１７倍、１８倍若しくは約１８倍、１９倍若しくは約１９倍、２０倍若しくは約２０倍、２１倍若しくは約２１倍、２２倍若しくは約２２倍、２３倍若しくは約２３倍、２４倍若しくは約２４倍、２５倍若しくは約２５倍、２６倍若しくは約２６倍、２７倍若しくは約２７倍、２８倍若しくは約２８倍、２９倍若しくは約２９倍、３０倍若しくは約３０倍、３１倍若しくは約３１倍、３２倍若しくは約３２倍、３３倍若しくは約３３倍、３４倍若しくは約３４倍、３５倍若しくは約３５倍、３６倍若しくは約３６倍、３７倍若しくは約３７倍、３８倍若しくは約３８倍、３９倍若しくは約３９倍、４０倍若しくは約４０倍、４１倍若しくは約４１倍、４２倍若しくは約４２倍、４３倍若しくは約４３倍、４４倍若しくは約４４倍、４５倍若しくは約４５倍、４６倍若しくは約４６倍、４７倍若しくは約４７倍、４８倍若しくは約４８倍、４９倍若しくは約４９倍又は５０倍若しくは約５０倍多くなるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001055] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）における第２の期間の開始から２日若しくは約２日又は３日又は約３日後に細胞培養培地に追加のＩＬ－２が補充されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001056] 別の実施形態において、本発明は、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｄ）の回収されたＴＩＬ集団を凍結保存するステップを更に含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001057] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｄ）後、（ｅ）ステップ（ｄ）における回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグ（任意選択によりHypothermosolを含有する）に移す追加のステップを実施することを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001058] 別の実施形態において、本発明は、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｅ）における回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001059] 別の実施形態において、本発明は、凍結保存プロセスが、回収されたＴＩＬ集団と凍結保存培地との比は比１：１を使用して実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001060] 別の実施形態において、本発明は、抗原提示細胞が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001061] 別の実施形態において、本発明は、ＰＢＭＣが、照射され、且つ同種異系であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001062] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）で細胞培養物に添加されるＡＰＣの総数が２．５×１０８であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001063] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）で細胞培養物に添加されるＡＰＣの総数が５×１０８であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001064] 別の実施形態において、本発明は、ＡＰＣがＰＢＭＣであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001065] 別の実施形態において、本発明は、ＰＢＭＣが、照射され、且つ同種異系であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001066] 別の実施形態において、本発明は、抗原提示細胞が、人工抗原提示細胞であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001067] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｄ）の回収が、膜ベースの細胞プロセスシステムを使用して実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001068] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｄ）の回収が、LOVO細胞プロセスシステムを使用して実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001069] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が、１容器あたり５又は約５～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001070] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が、１容器あたり１０又は約１０～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001071] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が、１容器あたり１５又は約１５～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001072] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が、１容器あたり２０又は約２０～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001073] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が、１容器あたり２５又は約２５～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001074] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が、１容器あたり３０又は約３０～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001075] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が、１容器あたり３５又は約３５～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001076] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が、１容器あたり４０又は約４０～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001077] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が、１容器あたり４５又は約４５～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001078] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が、１容器あたり５０又は約５０～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001079] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が、１容器あたり、２若しくは約２、３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９、１０若しくは約１０、１１若しくは約１１、１２若しくは約１２、１３若しくは約１３、１４若しくは約１４、１５若しくは約１５、１６若しくは約１６、１７若しくは約１７、１８若しくは約１８、１９若しくは約１９、２０若しくは約２０、２１若しくは約２１、２２若しくは約２２、２３若しくは約２３、２４若しくは約２４、２５若しくは約２５、２６若しくは約２６、２７若しくは約２７、２８若しくは約２８、２９若しくは約２９、３０若しくは約３０、３１若しくは約３１、３２若しくは約３２、３３若しくは約３３、３４若しくは約３４、３５若しくは約３５、３６若しくは約３６、３７若しくは約３７、３８若しくは約３８、３９若しくは約３９、４０若しくは約４０、４１若しくは約４１、４２若しくは約４２、４３若しくは約４３、４４若しくは約４４、４５若しくは約４５、４６若しくは約４６、４７若しくは約４７、４８若しくは約４８、４９若しくは約４９、５０若しくは約５０、５１若しくは約５１、５２若しくは約５２、５３若しくは約５３、５４若しくは約５４、５５若しくは約５５、５６若しくは約５６、５７若しくは約５７、５８若しくは約５８、５９若しくは約５９又は６０若しくは約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001080] 別の実施形態において、本発明は、各断片が、２７ｍｍ３又は約２７ｍｍ３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001081] 別の実施形態において、本発明は、各断片が、２０ｍｍ３又は約２０ｍｍ３～５０ｍｍ３又は約５０ｍｍ３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001082] 別の実施形態において、本発明は、各断片が、２１ｍｍ３又は約２１ｍｍ３～３０ｍｍ３又は約３０ｍｍ３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001083] 別の実施形態において、本発明は、各断片が、２２ｍｍ３又は約２２ｍｍ３～２９．５ｍｍ３又は約２９．５ｍｍ３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001084] 別の実施形態において、本発明は、各断片が、２３ｍｍ３又は約２３ｍｍ３～２９ｍｍ３又は約２９ｍｍ３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001085] 別の実施形態において、本発明は、各断片が、２４ｍｍ３又は約２４ｍｍ３～２８．５ｍｍ３又は約２８．５ｍｍ３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001086] 別の実施形態において、本発明は、各断片が、２５ｍｍ３又は約２５ｍｍ３～２８ｍｍ３又は約２８ｍｍ３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001087] 別の実施形態において、本発明は、各断片が、２６．５ｍｍ３又は約２６．５ｍｍ３～２７．５ｍｍ３又は約２７．５ｍｍ３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001088] 別の実施形態において、本発明は、各断片が、２１ｍｍ３若しくは約２１ｍｍ３、２２ｍｍ３若しくは約２２ｍｍ３、２３ｍｍ３若しくは約２３ｍｍ３、２４ｍｍ３若しくは約２４ｍｍ３、２５ｍｍ３若しくは約２５ｍｍ３、２６ｍｍ３若しくは約２６ｍｍ３、２７ｍｍ３若しくは約２７ｍｍ３、２８ｍｍ３若しくは約２８ｍｍ３、２９ｍｍ３若しくは約２９ｍｍ３、３０ｍｍ３若しくは約３０ｍｍ３、３１ｍｍ３若しくは約３１ｍｍ３、３２ｍｍ３若しくは約３２ｍｍ３、３３ｍｍ３若しくは約３３ｍｍ３、３４ｍｍ３若しくは約３４ｍｍ３、３５ｍｍ３若しくは約３５ｍｍ３、３６ｍｍ３若しくは約３６ｍｍ３、３７ｍｍ３若しくは約３７ｍｍ３、３８ｍｍ３若しくは約３８ｍｍ３、３９ｍｍ３若しくは約３９ｍｍ３、４０ｍｍ３若しくは約４０ｍｍ３、４１ｍｍ３若しくは約４１ｍｍ３、４２ｍｍ３若しくは約４２ｍｍ３、４３ｍｍ３若しくは約４３ｍｍ３、４４ｍｍ３若しくは約４４ｍｍ３、４５ｍｍ３若しくは約４５ｍｍ３、４６ｍｍ３若しくは約４６ｍｍ３、４７ｍｍ３若しくは約４７ｍｍ３、４８ｍｍ３若しくは約４８ｍｍ３、４９ｍｍ３若しくは約４９ｍｍ３又は５０ｍｍ３若しくは約５０ｍｍ３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001089] 別の実施形態において、本発明は、複数の断片が、３０又は約３０～６０又は約６０の断片を含み、総体積が１３００ｍｍ３又は約１３００ｍｍ３～１５００ｍｍ３又は約１５００ｍｍ３であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001090] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が、１容器あたり５０又は約５０の断片を含み、総体積が１３５０ｍｍ３又は約１３５０ｍｍ３であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001091] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が、１容器あたり５０又は約５０の断片を含み、総重量が１ｇ又は約１ｇ～１．５ｇ又は約１．５ｇであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001092] 別の実施形態において、本発明は、細胞培養培地が、Ｇコンテナ又はXuri細胞培養バッグである容器内に提供されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001093] 別の実施形態において、本発明は、細胞培養培地中のＩＬ－２濃度が、約１０，０００ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ＩＵ／ｍＬであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001094] 別の実施形態において、本発明は、細胞培養培地中のＩＬ－２濃度が、約６，０００ＩＵ／ｍＬであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001095] 別の実施形態において、本発明は、凍結保存培地がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001096] 別の実施形態において、本発明は、凍結保存培地が７％～１０％のＤＭＳＯを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001097] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）の第１の期間が、１日間若しくは約１日間、２日間若しくは約２日間、３日間若しくは約３日間、４日間若しくは約４日間、５日間若しくは約５日間、６日間若しくは約６日間又は７日間若しくは約７日間の期間内で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001098] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）の第２の期間が、１日間若しくは約１日間、２日間若しくは約２日間、３日間若しくは約３日間、４日間若しくは約４日間、５日間若しくは約５日間、６日間若しくは約６日間、７日間若しくは約７日間、８日間若しくは約８日間、９日間若しくは約９日間、１０日間若しくは約１０日間又は１１日間若しくは約１１日間の期間内で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001099] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）の第１の期間及びステップ（ｃ）の第２の期間が、それぞれ個別に１日間若しくは約１日間、２日間若しくは約２日間、３日間若しくは約３日間、４日間若しくは約４日間、５日間若しくは約５日間、６日間若しくは約６日間又は７日間若しくは約７日間の期間内で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001100] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）の第１の期間及びステップ（ｃ）の第２の期間が、それぞれ個別に５日間若しくは約５日間、６日間若しくは約６日間又は７日間若しくは約７日間の期間内で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001101] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）の第１の期間及びステップ（ｃ）の第２の期間が、それぞれ個別に７日間若しくは約７日間の期間内で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001102] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１４日又は約１４日～１８日又は約１８日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001103] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１５日若しくは約１５日又は１８日若しくは約１８日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001104] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１６日若しくは約１６日又は１８日若しくは約１８日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001105]
[001106] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１７日若しくは約１７日又は１８日若しくは約１８日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001107] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１４日若しくは約１４日又は１７日若しくは約１７日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001108] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１５日若しくは約１５日又は１７日若しくは約１７日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001109] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１６日若しくは約１６日又は１７日若しくは約１７日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001110] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１４日若しくは約１４日又は１６日若しくは約１６日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001111] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１５日若しくは約１５日又は１６日若しくは約１６日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001112] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１４日又は約１４日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001113] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１５日又は約１５日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001114] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１６日又は約１６日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001115] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１７日又は約１７日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001116] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１８日又は約１８日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001117] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１４日又は約１４日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001118] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１５日又は約１５日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001119] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１６日又は約１６日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001120] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１７日又は約１７日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001121] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が、合計１８日又は約１８日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001122] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｄ）で回収した治療用ＴＩＬ集団中が、治療有効投与量のＴＩＬのために十分なＴＩＬを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001123] 別の実施形態において、本発明は、治療有効投与量のために十分なＴＩＬの数が、２．３×１０１０又は約２．３×１０１０～１３．７×１０１０又は約１３．７×１０１０個であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001124] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）の第３のＴＩＬ集団が、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加及び／又はポリクローナル性の増加を提供するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001125] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）における第３のＴＩＬ集団が、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍多い又はそれを超える、インターフェロンガンマ産生を提供するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001126] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）における第３のＴＩＬ集団が、１７日間より長いプロセスにより調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍多いか又はそれを超える、インターフェロンガンマ産生を提供するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001127] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）における第３のＴＩＬ集団が、１８日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍多い又はそれを超える、インターフェロンガンマ産生を提供するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001128] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）の第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞が、ステップ（ｂ）の第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ８及びＣＤ２８発現の増加を呈するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001129] 別の実施形態において、本発明は、本方法で列挙される各容器が、閉鎖容器であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001130] 別の実施形態において、本発明は、本方法で列挙される各容器が、Ｇ－コンテナであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001131] 別の実施形態において、本発明は、本方法で列挙される各容器が、GREX-10であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001132] 別の実施形態において、本発明は、本方法で列挙される各容器が、GREX-100であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001133] 別の実施形態において、本発明は、本方法で列挙される各容器が、GREX-500であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001134] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法によって作製された治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供する。
[001135] 別の実施形態において、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、治療用ＴＩＬ集団は、いかなる添加された抗原提示細胞（ＡＰＣ）もなしに且ついかなる添加されたＯＫＴ３もなしにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスにより調製されたＴＩＬと比較して、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加及び／又はポリクローナル性の増加を提供する。
[001136] 別の実施形態において、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、治療用ＴＩＬ集団は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加及び／又はポリクローナル性の増加を提供する。
[001137] 別の実施形態において、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、治療用ＴＩＬ集団は、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加及び／又はポリクローナル性の増加を提供する。
[001138] 別の実施形態において、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、治療用ＴＩＬ集団は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加せず、且つＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加及び／又はポリクローナル性の増加を提供する。
[001139] 別の実施形態において、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、治療用ＴＩＬ集団は、１６日間より長いプロセスによるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加及び／又はポリクローナル性の増加を提供する。
[001140] 別の実施形態において、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、治療用ＴＩＬ集団は、１７日間より長いプロセスによるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加及び／又はポリクローナル性の増加を提供する。
[001141] 別の実施形態において、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、治療用ＴＩＬ集団は、１８日間より長いプロセスによるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加及び／又はポリクローナル性の増加を提供する。
[001142] 別の実施形態において、本発明は、インターフェロンガンマ産生の増加を提供する、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。
[001143] 別の実施形態において、本発明は、ポリクローナル性の増加を提供する、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。
[001144] 別の実施形態において、本発明は、有効性の増加を提供する、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。
[001145] 別の実施形態において、本発明は、治療用ＴＩＬ集団が、１６日間より長いプロセスにより調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。別の実施形態において、本発明は、治療用ＴＩＬ集団が、１７日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。別の実施形態において、本発明は、治療用ＴＩＬ集団が、１８日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるか又は上記のステップＡ～Ｆに従う（また、例えば、図１（特に例えば、図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に示される）、本明細書に記載の拡大培養プロセスにより、少なくとも１倍多くのインターフェロンガンマ産生が可能になる。
[001146] 別の実施形態において、本発明は、治療用ＴＩＬ集団が、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。別の実施形態において、本発明は、治療用ＴＩＬ集団が、１７日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。別の実施形態において、本発明は、治療用ＴＩＬ集団が、１８日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるか又は上記のステップＡ～Ｆに従う（また、例えば、図１（特に例えば、図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に示される）、本明細書に記載の拡大培養プロセスにより、少なくとも２倍多くのインターフェロンガンマ産生が可能になる。
[001147] 別の実施形態において、本発明は、治療用ＴＩＬ集団が、１６日間より長いプロセスにより調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。別の実施形態において、本発明は、治療用ＴＩＬ集団が、１７日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。別の実施形態において、本発明は、治療用ＴＩＬ集団が、１８日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるか又は上記のステップＡ～Ｆに従う（また、例えば、図１（特に例えば、図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に示される）、本明細書に記載の拡大培養プロセスにより、少なくとも３倍多くのインターフェロンガンマ産生が可能になる。
[001148] 別の実施形態において、本発明は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるか又は上記のステップＡ～Ｆに従う（また、例えば、図１（特に例えば、図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に示される）、本明細書に記載の拡大培養プロセスにより、少なくとも１倍多くのインターフェロンガンマ産生が可能になる。
[001149] 別の実施形態において、本発明は、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるか又は上記のステップＡ～Ｆに従う（また、例えば、図１（特に例えば、図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に示される）、本明細書に記載の拡大培養プロセスにより、少なくとも１倍多くのインターフェロンガンマ産生が可能になる。
[001150] 別の実施形態において、本発明は、ＡＰＣを添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、治療用ＴＩＬ集団を提供する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるか又は上記のステップＡ～Ｆに従う（また、例えば、図１（特に例えば、図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に示される）、本明細書に記載の拡大培養プロセスにより、少なくとも２倍多くのインターフェロンガンマ産生が可能になる。
[001151] 別の実施形態において、本発明は、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、治療用ＴＩＬ集団を提供する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるか又は上記のステップＡ～Ｆに従う（また、例えば、図１（特に例えば、図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に示される）、本明細書に記載の拡大培養プロセスにより、少なくとも２倍多くのインターフェロンガンマ産生が可能になる。
[001152] 別の実施形態において、本発明は、ＡＰＣを添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、治療用ＴＩＬ集団を提供する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるか又は上記のステップＡ～Ｆに従う（また、例えば、図１（特に例えば、図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に示される）、本明細書に記載の拡大培養プロセスにより、少なくとも２倍多くのインターフェロンガンマ産生が可能になる。
[001153] 別の実施形態において、本発明は、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、治療用ＴＩＬ集団を提供する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるか又は上記のステップＡ～Ｆに従う（また、例えば、図１（特に例えば、図１Ｂ及び／又は図１Ｃ）に示される）、本明細書に記載の拡大培養プロセスにより、少なくとも３倍多くのインターフェロンガンマ産生が可能になる。
[001154] 別の実施形態において、本発明は、腫瘍断片が小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001155] 別の実施形態において、本発明は、腫瘍断片がコア生検であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001156] 別の実施形態において、本発明は、腫瘍断片が細針吸引であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001157] 別の実施形態において、本発明は、腫瘍断片が小生検（例えば、パンチ生検を含む）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001158] 別の実施形態において、本発明は、腫瘍断片がコア針生検であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001159] 別の実施形態において、本発明は、（ｉ）方法が、対象からの腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引から、第１のＴＩＬ集団を入手することを含み、（ｉｉ）方法が、第１の初回刺激拡大培養のステップを実施する前に、約３日間にわたり、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養するステップを実施することを含み、（ｉｉｉ）方法が、約８日間にわたり、第１の初回刺激拡大培養を実施することを含み、（ｉｖ）方法が、約１１日間にわたり、第２の急速拡大培養を実施することを含む、ように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。前述の実施形態の一部において、方法のステップは、約２２日で完了する。
[001160] 別の実施形態において、本発明は、（ｉ）方法が、対象からの腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引から、第１のＴＩＬ集団を入手することを含み、（ｉｉ）方法が、第１の初回刺激拡大培養のステップを実施する前に、約３日間にわたり、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養するステップを実施することを含み、（ｉｉｉ）方法が、約８日間にわたり、第１の初回刺激拡大培養を実施することを含み、（ｉｖ）方法が、第２のＴＩＬ集団の培養物を約５日間培養し、培養物を最大５つの継代培養物に分割し、継代培養物を約６日間培養することにより、第２の急速拡大培養を実施することを含む、ように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。前述の実施形態の一部において、最大５つの継代培養物は、それぞれ、第２のＴＩＬ集団の培養が第２の急速拡大培養で開始される容器と同じかそれより大きい容器で培養される。前述の実施形態の一部において、第２のＴＩＬ集団の培養物は、最大５つの継代培養物間で等しく分割される。前述の実施形態の一部において、方法のステップは、約２２日で完了する。
[001161] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約２０の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001162] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約１０の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001163] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001164] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001165] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約２０のコア生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001166] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約１０のコア生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001167] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のコア生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001168] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のコア生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001169] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約２０の細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001170] 第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約１０の細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落。
[001171] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001172] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001173] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約２０のコア針生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001174] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約１０のコア針生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001175] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のコア針生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001176] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のコア針生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001177] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約２０の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001178] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約１０の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001179] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001180] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001181] 別の実施形態において、本発明は、（ｉ）方法が、対象からの腫瘍組織の１～約１０のコア生検から、第１のＴＩＬ集団を入手することを含み、（ｉｉ）方法が、第１の初回刺激拡大培養のステップを実施する前に、約３日間にわたり、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養するステップを実施することを含み、（ｉｉｉ）方法が、約８日間にわたり、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養ステップを実施して、第２のＴＩＬ集団を入手することを含み、（ｉｖ）方法が、約１１日間にわたり、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む培養培地中で第２のＴＩＬ集団を培養することにより、第２の急速拡大培養ステップを実施することを含む、ように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。前述の実施形態の一部において、方法のステップは、約２２日で完了する。
[001182] 別の実施形態において、本発明は、（ｉ）方法が、対象からの腫瘍組織の１～約１０のコア生検から、第１のＴＩＬ集団を入手することを含み、（ｉｉ）方法が、第１の初回刺激拡大培養のステップを実施する前に、約３日間にわたり、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養するステップを実施することを含み、（ｉｉｉ）方法が、約８日間にわたり、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養ステップを実施して、第２のＴＩＬ集団を入手することを含み、（ｉｖ）方法が、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む培養培地中で第２のＴＩＬ集団の培養物を約５日間培養し、培養物を最大５つの継代培養物に分割し、ＩＬ－２を含む培養培地中で各継代培養物を約６日間培養することにより、第２の急速拡大培養を実施することを含む、ように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。前述の実施形態の一部において、最大５つの継代培養物は、それぞれ、第２のＴＩＬ集団の培養が第２の急速拡大培養で開始される容器と同じかそれより大きい容器で培養される。前述の実施形態の一部において、第２のＴＩＬ集団の培養物は、最大５つの継代培養物間で等しく分割される。前述の実施形態の一部において、方法のステップは、約２２日で完了する。
[001183] 別の実施形態において、本発明は、（ｉ）方法が、対象からの腫瘍組織の１～約１０のコア生検から、第１のＴＩＬ集団を入手することを含み、（ｉｉ）方法が、第１の初回刺激拡大培養のステップを実施する前に、約３日間にわたり、G-Rex 100Mフラスコで、０．５ＬのＣＭ１培養培地中に１ｍｌあたり６０００ＩＵのＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養するステップを実施することを含み、（ｉｉｉ）方法が、６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ－３及び約１０８個のフィーダー細胞を含有する０．５ＬのＣＭ１培地を添加し、約８日間培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施することを含み、（ｉｖ）方法が、（ａ）第２のＴＩＬ集団を３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ－３及び５×１０９個のフィーダー細胞を含有する５ＬのＣＭ２培地を有するG-Rex 500MCSフラスコに移し、約５日間培養すること、（ｂ）３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含む５ＬのAIM-V培地を有する最大５つのG-Rex 500MCSフラスコにそれぞれ１０９個のＴＩＬを移すことにより、培養物を最大５つの継代培養物に分割し、継代培養物を６日間培養することにより、第２の急速拡大培養を実施することを含む、ように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。前述の実施形態の一部において、方法のステップは、約２２日で完了する。
[001184] 別の実施形態において、本発明は、（ａ）第１のＴ細胞集団を培養して、増殖をもたらし、第１のＴ細胞集団の活性化を初回刺激することにより、ドナーから入手した第１のＴ細胞集団の第１の初回刺激拡大培養を実施すること；（ｂ）ステップ（ａ）で初回刺激された第１のＴ細胞集団の活性化が減衰し始めた後、第２のＴ細胞集団を得るために、第１のＴ細胞集団を培養して、増殖をもたらし、第１のＴ細胞集団の活性化を追加刺激することにより、第１のＴ細胞集団の第２の急速拡大培養を実施すること；及び（ｃ）第２のＴ細胞集団を回収することを含む、Ｔ細胞を拡大培養する方法を提供する。別の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップは、（ａ）第１のＴ細胞集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ内の小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）第１のＴ細胞集団を小スケール培養物から第１の容器よりも大きい第２の容器、例えばG-REX 500MCSコンテナに移し、小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団を、第２の容器内のより大きいスケールの培養物中で、約４～７日間の期間にわたり培養することにより、培養物のスケールアップを達成するために複数のステップに分割される。別の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（ａ）第１のＴ細胞集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、第１の小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）第１の小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団を、サイズが第１の容器と同じである、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することであって、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された第１の小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団の一部は、約４～７日間の期間にわたり、第２の小スケール培養物中で培養されることにより、培養物のスケールアウトを達成するために複数のステップに分割される。別の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（ａ）第１のＴ細胞集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することであって、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団の一部は、約４～７日間の期間にわたり、より大きいスケール培養物中で培養されることにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割される。別の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（ａ）第１のＴ細胞集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、２、３又は４個の第２の容器に移し、配分することであって、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団の一部は、約５日間の期間にわたり、より大きいスケール培養物中で培養されることにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割される。
[001185] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養のステップが、（ａ）第１のＴ細胞集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ内の小スケール培養物中で約２～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）第１のＴ細胞集団を小スケール培養物から第１の容器よりも大きい第２の容器、例えばG-REX 500MCSコンテナに移し、小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団を、第２の容器内のより大きいスケールの培養物中で、約５～７日間の期間にわたり培養することにより、培養物のスケールアップを達成するために複数のステップに分割されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載の方法を提供する。
[001186] 別の実施形態において、本発明は、急速拡大培養のステップが、（ａ）第１のＴ細胞集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、第１の小スケール培養物中で約２～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）第１の小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団を、サイズが第１の容器と同じである、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することであって、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された第１の小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団の一部は、約５～７日間の期間にわたり、第２の小スケール培養物中で培養されることにより、培養物のスケールアウトを達成するために複数のステップに分割されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載の方法を提供する。
[001187] 別の実施形態において、本発明は、急速拡大培養のステップが、（ａ）第１のＴ細胞集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約２～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することであって、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団の一部は、約５～７日間の期間にわたり、より大きいスケール培養物中で培養されることにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載の方法を提供する。
[001188] 別の実施形態において、本発明は、急速拡大培養のステップが、（ａ）第１のＴ細胞集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、２、３又は４個の第２の容器に移し、配分することであって、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団の一部は、約５～６日間の期間にわたり、より大きいスケール培養物中で培養されることにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載の方法を提供する。
[001189] 別の実施形態において、本発明は、急速拡大培養のステップが、（ａ）第１のＴ細胞集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、２、３又は４個の第２の容器に移し、配分することであって、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団の一部は、約５日間の期間にわたり、より大きいスケール培養物中で培養されることにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載の方法を提供する。
[001190] 別の実施形態において、本発明は、急速拡大培養のステップが、（ａ）第１のＴ細胞集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、２、３又は４個の第２の容器に移し、配分することであって、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団の一部は、約６日間の期間にわたり、より大きいスケール培養物中で培養されることにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載の方法を提供する。
[001191] 別の実施形態において、本発明は、急速拡大培養のステップが、（ａ）第１のＴ細胞集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、２、３又は４個の第２の容器に移し、配分することであって、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された小スケール培養物からの第１のＴ細胞集団の一部は、約７日間の期間にわたり、より大きいスケール培養物中で培養されることにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載の方法を提供する。
[001192] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）の第１の初回刺激拡大培養が、最大７日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001193] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）の第２の急速拡大培養が、最大８日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001194] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）の第２の急速拡大培養が、最大９日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001195] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）の第２の急速拡大培養が、最大１０日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001196] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）の第２の急速拡大培養が、最大１１日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001197] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）の第１の初回刺激拡大培養が、７日間の期間中に実施され、ステップ（ｂ）の第２の急速拡大培養が、最大９日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001198] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）の第１の初回刺激拡大培養が、７日間の期間中に実施され、ステップ（ｂ）の第２の急速拡大培養が、最大１０日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001199] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）の第１の初回刺激拡大培養が、７日間又は８日間の期間中に実施され、ステップ（ｂ）の第２の急速拡大培養が、最大９日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001200] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）の第１の初回刺激拡大培養が、７日間又は８日間の期間中に実施され、ステップ（ｂ）の第２の急速拡大培養が、最大１０日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001201] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）の第１の初回刺激拡大培養が、８日間の期間中に実施され、ステップ（ｂ）の第２の急速拡大培養が、最大９日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001202] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）の第１の初回刺激拡大培養が、８日間の期間中に実施され、ステップ（ｂ）の第２の急速拡大培養が、最大８日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001203] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団が、ＯＫＴ－３及びＩＬ－２を含む第１の培養培地で培養されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001204] 別の実施形態において、本発明は、第１の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001205] 別の実施形態において、本発明は、第１の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３及びＩＬ－２を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001206] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む第２の培養培地で培養されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001207] 別の実施形態において、本発明は、第１の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001208] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団が、第１のガス透過性表面を含む容器内の第１の培養培地で培養され、第１の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーにとって外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に積層され、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団が、容器内の第２の培養培地で培養され、第２の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーにとって外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に積層され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団よりも大きいように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001209] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団が、第１のガス透過性表面を含む容器内の第１の培養培地中で培養され、第１の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーにとって外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に積層され、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団が、容器内の第２の培養培地中で培養され、第２の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーにとって外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に積層され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団よりも大きいように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001210] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団が、第１のガス透過性表面を含む容器内の第１の培養培地中で培養され、第１の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーにとって外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に積層され、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団が、容器内の第２の培養培地中で培養され、第２の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーにとって外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に積層され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団よりも大きいように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001211] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団が、第１のガス透過性表面を含む容器内の第１の培養培地中で培養され、第１の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーにとって外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に積層され、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団が、容器内の第２の培養培地中で培養され、第２の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーにとって外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に積層され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団よりも大きいように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001212] 別の実施形態において、本発明は、第２のＡＰＣ集団のＡＰＣの数と、第１のＡＰＣ集団のＡＰＣの数との比が、約２：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001213] 別の実施形態において、本発明は、第１のＡＰＣ集団のＡＰＣの数が、２．５×１０８であり、第２のＡＰＣ集団のＡＰＣの数が、５×１０８であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001214] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に、２層のＡＰＣの細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001215] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に、４～８層のＡＰＣの範囲における細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001216] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において第１のガス透過性表面上に積層されたＡＰＣの層の平均数と、ステップ（ａ）において第１のガス透過性表面上に積層されたＡＰＣの層の平均数との比が、２：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001217] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が、１．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約１．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001218] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が、１．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約１．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001219] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が、２．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約２．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～３．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約３．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001220] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が、２．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約２．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001221] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が、２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001222] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が、３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～６．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約６．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001223] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が、４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～５．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約５．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001224] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が、４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001225] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が、１．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約１．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種され、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が、２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001226] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が、１．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約１．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種され、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が、３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～６．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約６．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001227] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が、２．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約２．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～３．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約３．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種され、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が、４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～５．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約５．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001228] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が、２．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約２．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種され、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が、４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２又は約４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の濃度で、第１のガス透過性表面上に播種されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001229] 別の実施形態において、本発明は、ＡＰＣが末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001230] 別の実施形態において、本発明は、ＰＢＭＣが、照射され、且つ第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001231] 別の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞が腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001232] 別の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞が骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001233] 別の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞が末梢血リンパ球（ＰＢＬ）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001234] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団がドナーの全血から分離することによって得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001235] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団がドナーのアフェレーシス産物から分離することによって得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001236] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、Ｔ細胞表現型のポジティブ又はネガティブ選択によってドナーの全血又はアフェレーシス産物から分離されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001237] 別の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞表現型がＣＤ３＋及びＣＤ４５＋であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001238] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団の第１の初回刺激拡大培養を実施する前に、Ｔ細胞がＮＫ細胞から分離されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載の方法を提供する。別の実施形態において、Ｔ細胞は、第１のＴ細胞集団からのＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の除去により、第１のＴ細胞集団におけるＮＫ細胞から分離される。別の実施形態において、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞画分を除去し、陰性画分を回収するゲーティング戦略を使用して、第１のＴ細胞集団を細胞選別に供することにより、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞が第１のＴ細胞集団から除去される。別の実施形態において、前述の方法は、高いパーセンテージのＮＫ細胞によって特徴付けられる第１のＴ細胞集団におけるＴ細胞の拡大培養のために利用される。別の実施形態において、前述の方法は、高いパーセンテージのＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞によって特徴付けられる第１のＴ細胞集団におけるＴ細胞の拡大培養のために利用される。別の実施形態において、前述の方法は、多数のＮＫ細胞の存在によって特徴付けられる腫瘍組織におけるＴ細胞の拡大培養のために利用される。別の実施形態において、前述の方法は、多数のＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞によって特徴付けられる腫瘍組織におけるＴ細胞の拡大培養のために利用される。別の実施形態において、前述の方法は、多数のＮＫ細胞の存在によって特徴付けられる腫瘍に罹患している患者から入手される腫瘍組織におけるＴ細胞の拡大培養のために利用される。別の実施形態において、前述の方法は、多数のＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の存在によって特徴付けられる腫瘍に罹患している患者から入手される腫瘍組織におけるＴ細胞の拡大培養のために利用される。別の実施形態において、前述の方法は、卵巣癌に罹患している患者から得られた腫瘍組織におけるＴ細胞の拡大培養のために利用される。
[001239] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団からの１×１０７個又は約１×１０７個のＴ細胞を容器中に播種して、そのような容器で第１の初回刺激拡大培養を開始するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001240] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が複数の容器に分配され、各容器中に、第１のＴ細胞集団からの１×１０７個又は約１×１０７個のＴ細胞を播種して、そのような容器で第１の初回刺激拡大培養を開始するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001241] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が直交性サイトカイン受容体を発現するように操作されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001242] 別の実施形態において、本発明は、第２のＴ細胞集団が直交性サイトカイン受容体を発現するように操作されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001243] 別の実施形態において、本発明は、第３のＴ細胞集団が直交性サイトカイン受容体を発現するように操作されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001244] 別の実施形態において、本発明は、治療用Ｔ細胞集団を回収するステップ前又は後、そのようなＴ細胞が直交性サイトカイン受容体を発現するように操作されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001245] 別の実施形態において、本発明は、第１の初回刺激拡大培養のステップ前に、Ｔ細胞が直交性サイトカイン受容体を発現するように操作されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001246] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養のステップ前に、Ｔ細胞が直交性サイトカイン受容体を発現するように操作されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001247] 別の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞を回収するステップ前に、そのようなＴ細胞が直交性サイトカイン受容体を発現するように操作されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001248] 別の実施形態において、本発明は、第１の初回刺激拡大培養のステップ後且つ第２の急速拡大培養のステップ前に、Ｔ細胞が直交性サイトカイン受容体を発現するように操作されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001249] 別の実施形態において、本発明は、第２の急速拡大培養のステップ後且つＴ細胞の回収のステップ前に、そのようなＴ細胞が直交性サイトカイン受容体を発現するように操作されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001250] 別の実施形態において、本発明は、直交性サイトカイン受容体が直交性ＩＬ－２受容体であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001251] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２受容体が直交性ＩＬ－２Ｒβ鎖を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001252] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２受容体が直交性ＩＬ－２Ｒα鎖を含むように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001253] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２受容体が直交性ＩＬ－２Ｒγ鎖を含むように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001254] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２受容体が直交性ＩＬ－２Ｒβ鎖及び直交性ＩＬ－２Ｒγ鎖を含むように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001255] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２受容体が直交性ＩＬ－２Ｒβ鎖及び直交性ＩＬ－２Ｒα鎖を含むように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001256] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２受容体が直交性ＩＬ－２Ｒα鎖及び直交性ＩＬ－２Ｒγ鎖を含むように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001257] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２受容体が直交性ＩＬ－２Ｒβ鎖及び直交性ＩＬ－２Ｒα鎖を含むように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001258] 別の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞が直交性ＩＬ－２受容体で操作された後、後続の培養ステップが、直交性ＩＬ－２受容体に相補的な直交性ＩＬ－２を含む培地で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001259] 別の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞が直交性ＩＬ－２受容体で操作された後、後続の培養ステップが、直交性ＩＬ－２受容体に相補的な直交性ＩＬ－２を含み、培養条件が操作されたＴ細胞の増殖及び拡大培養を選択するように、天然又は野生型ＩＬ－２の添加を含まない、培地で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001260] 別の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞が直交性ＩＬ－２受容体を一過性に発現するように操作されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001261] 別の実施形態において、本発明は、培養物中において又は患者が操作されたＴ細胞を注入された後、患者においてインビボで、最大４週間にわたり、Ｔ細胞が直交性ＩＬ－２受容体を一過性に発現するように操作されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001262] 別の実施形態において、本発明は、培養物中において又は患者が操作されたＴ細胞を注入された後、患者においてインビボで、最大３週間にわたり、Ｔ細胞が直交性ＩＬ－２受容体を一過性に発現するように操作されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001263] 別の実施形態において、本発明は、培養物中において又は患者が操作されたＴ細胞を注入された後、患者においてインビボで、最大２週間にわたり、Ｔ細胞が直交性ＩＬ－２受容体を一過性に発現するように操作されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001264] 別の実施形態において、本発明は、培養物中において又は患者が操作されたＴ細胞を注入された後、患者においてインビボで、最大１週間にわたり、Ｔ細胞が直交性ＩＬ－２受容体を一過性に発現するように操作されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001265] 別の実施形態において、本発明は、患者が操作されたＴ細胞を注入された後、患者においてインビボで、最大４週間にわたり、Ｔ細胞が直交性ＩＬ－２受容体を一過性に発現するように操作されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001266] 別の実施形態において、本発明は、患者が操作されたＴ細胞を注入された後、患者においてインビボで、最大３週間にわたり、Ｔ細胞が直交性ＩＬ－２受容体を一過性に発現するように操作されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001267] 別の実施形態において、本発明は、患者が操作されたＴ細胞を注入された後、患者においてインビボで、最大２週間にわたり、Ｔ細胞が直交性ＩＬ－２受容体を一過性に発現するように操作されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001268] 別の実施形態において、本発明は、患者が操作されたＴ細胞を注入された後、患者においてインビボで、最大１週間にわたり、Ｔ細胞が直交性ＩＬ－２受容体を一過性に発現するように操作されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001269] 別の実施形態において、本発明は、培養物中で、最大４週間にわたり、Ｔ細胞が直交性ＩＬ－２受容体を一過性に発現するように操作されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001270] 別の実施形態において、本発明は、培養物中で、最大３週間にわたり、Ｔ細胞が直交性ＩＬ－２受容体を一過性に発現するように操作されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001271] 別の実施形態において、本発明は、培養物中で、最大２週間にわたり、Ｔ細胞が直交性ＩＬ－２受容体を一過性に発現するように操作されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001272] 別の実施形態において、本発明は、培養物中で、最大１週間にわたり、Ｔ細胞が直交性ＩＬ－２受容体を一過性に発現するように操作されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001273] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２受容体がＱ７０Ｙ；Ｔ７３Ｄ；Ｔ７３Ｙ；Ｈ１３３Ｄ、Ｈ１３３Ｅ；Ｈ１３３Ｋ；Ｙ１３４Ｆ；Ｙ１３４Ｅ；Ｙ１３４Ｒ及びそれらの組み合わせからなる群の１つ以上のアミノ酸置換を含むように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001274] 別の実施形態において、本発明は、相補的な直交性ＩＬ－２が、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ／Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｔ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｓ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｖ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｔ］；［Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｎ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｄ、Ｔ５１Ｉ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｙ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］及び［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ａ］からなる群のアミノ酸置換のセットを含むように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001275] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２受容体が、Ｑ７０Ｙ；Ｔ７３Ｄ；Ｔ７３Ｙ；Ｈ１３３Ｄ、Ｈ１３３Ｅ；Ｈ１３３Ｋ；Ｙ１３４Ｆ；Ｙ１３４Ｅ；Ｙ１３４Ｒ及びそれらの組み合わせからなる群のアミノ酸置換の１つ以上を含み、相補的な直交性ＩＬ－２が、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ／Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｔ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｓ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｖ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｔ］；［Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｎ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｄ、Ｔ５１Ｉ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｙ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］；及び［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ａ］からなる群のアミノ酸置換のセットを含むように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001276] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）で回収された第２のＴ細胞集団が治療用ＴＩＬ集団であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001277] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001278] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～２０の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001279] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～１０の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001280] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001281] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001282] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１つ以上のコア生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001283] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～２０のコア生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001284] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～１０のコア生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001285] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のコア生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001286] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のコア生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001287] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１つ以上の細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001288] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～２０の細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001289] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～１０の細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001290] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001291] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の細針吸引から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001292] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001293] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～２０の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001294] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～１０の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001295] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の小生検（例えば、ドナーからの腫瘍組織を含む）から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001296] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001297] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１つ以上のコア針生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001298] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～２０のコア針生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001299] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～１０のコア針生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001300] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のコア針生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001301] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のコア針生検から入手されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001302] 別の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、ｉ）ＩＬ－２を含む第１の細胞培養培地中で約３日にわたり腫瘍サンプルを培養することにより、対象における腫瘍の１つ以上の小生検、コア生検又は針生検から入手した腫瘍サンプルから、ＴＩＬの第１の集団を入手及び／又は受領すること；（ｉｉ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む第２の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の初回刺激拡大培養が、第１のガス透過性表面積を含む容器内で実施され、第１の初回刺激拡大培養が、第２のＴＩＬ集団を得るために約７又は８日間の第１の期間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、数において第１のＴＩＬ集団よりも多い、生じさせること；（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の第２の細胞培養培地に追加的なＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを補充することにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｉｉ）で添加されたＡＰＣの数の少なくとも２倍であり、第２の急速拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約１１日間の第２の期間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団が治療用ＴＩＬ集団であり、第２の急速拡大培養が、第２のガス透過性表面積を含む容器内で実施される、生じさせること；（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収すること；及び（ｖ）ステップ（ｉｖ）で回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことを含む。
[001303] 別の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、（ｉ）ＩＬ－２を含む第１の細胞培養培地中で約３日にわたり腫瘍サンプルを培養することにより、対象における腫瘍の１つ以上の小生検、コア生検又は針生検から入手した腫瘍サンプルから、ＴＩＬの第１の集団を入手及び／又は受領すること；（ｉｉ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む第２の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の初回刺激拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約７又は８日間の第１の期間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、数において第１のＴＩＬ集団よりも多い、生じさせること；（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む第３の細胞培養培地と接触させることにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の急速拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約１１日間の第２の期間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、生じさせること；及び（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することを含む。
[001304] 別の実施形態において、本発明は、第２の期間の５日目以降に培養物が２つ以上の継代培養物に分割され、各継代培養物にさらなる量の第３の培地を補充し、約６日間培養するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001305] 別の実施形態において、本発明は、第２の期間の５日目以降に培養物が２つ以上の継代培養物に分割され、各継代培養物にＩＬ－２を含む第４の培地を補充し、約６日間培養するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001306] 別の実施形態において、本発明は、第２の期間の５日目以降に培養物が最大５つの継代培養物に分割されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001307] 別の実施形態において、本発明は、本方法の全てのステップが約２２日間で完了するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。
[001308] 別の実施形態において、本発明は、（ｉ）第１のＴ細胞集団を培養して、増殖をもたらし、第１のＴ細胞集団の活性化を初回刺激することにより、ドナーにおける腫瘍の１つ以上の小生検、コア生検又は針生検から入手した腫瘍サンプルからの第１のＴ細胞集団の第１の初回刺激拡大培養を実施すること；（ｉｉ）ステップ（ａ）で初回刺激された第１のＴ細胞集団の活性化が減衰し始めた後、第２のＴ細胞集団を得るために、第１のＴ細胞集団を培養して、増殖をもたらし、第１のＴ細胞集団の活性化を追加刺激することにより、第１のＴ細胞集団の第２の急速拡大培養を実施すること；及び（ｉｖ）第２のＴ細胞集団を回収することを含む、Ｔ細胞を拡大培養する方法を提供する。一部の実施形態において、腫瘍サンプルは、複数のコア生検から入手される。一部の実施形態において、複数のコア生検は、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０のコア生検からなる群から選択される。
ＩＩＩ．他のＴＩＬ拡大培養方法
[001309] 操作されたサイトカイン／受容体対は、当技術分野で公知の様々な拡大培養方法で使用され得る。以下の方法は、非限定的である。本明細書に開示される操作されたサイトカイン／受容体対の特徴は、ＴＩＬ、ＭＩＬ及びＰＢＬの拡大培養、培養及び製造の全ての方法と互換性があることが理解される。本明細書に開示されるように、ＴＩＬ、ＭＩＬ及び／又はＰＢＬは、限定されないが、形質導入、一過性トランスフェクション又はエレクトロポレーションによって操作されて、操作された直交性サイトカイン受容体を発現し得る。このような細胞操作のステップは、第１の拡大培養後；プレＲＥＰ後；第２の拡大培養後；ＲＥＰ後；最終製剤化前；又は製造手順における複数の時点で行われ得る。
[001310] ＴＩＬ、ＭＩＬ及び／又はＰＢＬの集団が直交性サイトカイン受容体を発現するように操作されると、同族野生型サイトカインが、さらなる製造及び／又は培養ステップにおいて直交性サイトカインに代替されることがさらに理解される。同様に、同族のサイトカインは、ヒト対象の癌を処置するための方法において直交性サイトカインの代替となり得る。
Ａ．プロセス１Ｃ及びプロセス２Ａ
[001311] プロセス２Ａとして知られる例示的なＴＩＬプロセスは、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第１０，１３０，６５９号に開示され、プロセス１Ｃをプロセス２Ａと比較する図２及び米国特許第１０，１３０，６５９号に開示されるプロセス２Ａの様々な実施形態が特に注目される。例示的なプロセス２ＡのＴＩＬ製造方法は、米国特許出願公開第２０１８／０２８２６９４Ａ１号として公開されたＵＳ１５／８６３，６３４号に開示されており、これは、その全体が参照により組み込まれる。例示的なプロセス２ＡのＴＩＬ製造方法は、米国特許出願公開第２０１８／０２０７２０１Ａ１号として公開されたＵＳ１５／８７４，７１８号に開示されており、これは、その全体が参照により組み込まれる。ＴＩＬは、上記の方法のいずれかに従って拡大培養され得る。一部の態様では、ＴＩＬは、第１の拡大培養ステップ後、直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように操作される。一部の態様では、ＴＩＬは、第２の拡大培養ステップ後、直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように操作される。一部の態様では、ＴＩＬは、プレＲＥＰ培養ステップ後、直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように操作される。一部の態様では、ＴＩＬは、ＲＥＰ培養ステップ後、直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように操作される。
Ｂ．小生検、コア生検又は細針吸引を含む、ＴＩＬ製造のためのプロセス２Ａ方法
[001312] 一部の実施形態において、本発明は、そのような任意のＧＥＮ２プロセスの第１の拡大培養における拡大培養のためのＴ細胞の供給源として、小生検、コア生検又は細針吸引を使用するように変更された、ＧＥＮ２プロセスのいずれかの方法（例えば、プロセス２Ａプロセス）を提供し、ここで、（１）そのようなＧＥＮ２プロセスの第２の拡大培養後に回収されたＴＩＬ集団で所望のＴＩＬ細胞数を達成するために、第１の拡大培養の期間が延長されるか、又は（２）第２の拡大培養後に回収されたＴＩＬ集団で所望のＴＩＬ細胞数を達成するために、そのようなＧＥＮ２プロセスの第２の拡大培養の期間が延長されるか、又は（３）第２の拡大培養後に回収されたＴＩＬ集団で所望のＴＩＬ細胞数を達成するために、第１の拡大培養の期間が延長され、且つそのようなＧＥＮ２プロセスの第２の拡大培養の期間が延長される。
[001313] 一部の実施形態において、本発明は、そのような任意のＧＥＮ２プロセスの第１の拡大培養における拡大培養のためのＴ細胞の供給源として、小生検、コア生検又は細針吸引を使用するように変更された、ＧＥＮ２プロセスのいずれかの方法（例えば、プロセス２Ａプロセス）により作製されたＴＩＬ集団を提供し、ここで、（１）そのようなＧＥＮ２プロセスの第２の拡大培養後に回収されたＴＩＬ集団で所望のＴＩＬ細胞数を達成するために、第１の拡大培養の期間が延長されるか、又は（２）第２の拡大培養後に回収されたＴＩＬ集団で所望のＴＩＬ細胞数を達成するために、そのようなＧＥＮ２プロセスの第２の拡大培養の期間が延長されるか、又は（３）第２の拡大培養後に回収されたＴＩＬ集団で所望のＴＩＬ細胞数を達成するために、第１の拡大培養の期間が延長され、且つそのようなＧＥＮ２プロセスの第２の拡大培養の期間が延長される。
[001314] これらの特徴のいくつかを含むプロセス２Ａ及び小生検プロセスとして知られるＴＩＬプロセスの例を図１Ａに示し、プロセス１Ｃに対する本発明の本実施形態の利点のいくつかを、図４３に示す。プロセス２Ａの実施形態を図４４Ａに示す。更に、例示的なコア生検に関し、概要及びプロセス２Ａとの比較が図４４Ｂに提供される。プロセス２Ａ（Ｇｅｎ２）、プロセス２ＡからのＴＩＬを使用した処置方法及びプロセス２Ａによって調製されたＴＩＬの組成物は、以下の本明細書及び本出願を通して提供されるように、必要な細胞数を達成するために必要に応じて拡大培養の期間を調整して、小生検／コア生検と併せて使用され得る。
[001315] 本明細書において考察される通り、本発明は、患者への移植前に凍結保存ＴＩＬを再刺激することによりその代謝活性、ひいては相対的健康を増加させること及び代謝的健康の試験方法に関するステップを含み得る。一般的に本明細書に概説される通り、ＴＩＬは一般的に患者サンプルから採取し、操作することにより、患者への移植前にその数が拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択により、以下に考察する通り、遺伝的に操作され得る。
[001316] 一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存され得る。解凍後、ＴＩＬは、患者への注入前に、その代謝を高めるために再刺激され得る。
[001317] 一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察する通り、第１の拡大培養（プレＲＥＰと称されるプロセス及び図４４にステップＡとして示されるプロセスを含む）は、１～１９日であり、第２の拡大培養（ＲＥＰと称されるプロセス及び図４４にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、１１～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、第１の拡大培養（例えば、図４４のステップＢとして記載される拡大培養）は、１～２日間及び３～１９日間、一部の場合では１～２日間及び３～１０日間の２つの期間に分割され、第２の拡大培養（例えば、図４４のステップＤに記載される拡大培養）は１１～１４日間である。一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察するように、第１の拡大培養及び第２の拡大培養（例えば、図７のステップＢ及びステップＤとして記載される拡大培養）の組み合わせは２２日間に短縮される。
[001318] 以下の「ステップ」名Ａ、Ｂ、Ｃ等は、図４４を参照している。以下及び図４４におけるステップの順序は例示であり、ステップの任意の組み合わせ又は順序並びに追加的なステップ、ステップの繰り返し及び／又はステップの省略が、本願及び本明細書に開示される方法によって企図される。
１．ステップＡ：患者の腫瘍サンプルを入手
[001319] 一般に、ＴＩＬは最初にコア生検又は類似の手順で入手された患者腫瘍サンプルから入手され（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためより大きい集団へと拡大培養され、任意選択により凍結保存され、且つ任意選択により表現型及び代謝パラメータにつき評価される。
[001320] 患者腫瘍サンプルは当技術分野において公知の方法を用いて、概して、小生検、コア生検、針生検又は腫瘍とＴＩＬ細胞との混合物を含む他のサンプルを入手するための手段によって入手され得る。一般に、腫瘍サンプルは、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含めた任意の固形腫瘍からのものであり得る。腫瘍サンプルは、血液悪性腫瘍から入手された腫瘍などの液性腫瘍でもあり得る。一部の実施形態において、サンプルは、複数の小さい腫瘍サンプル又は生検からのものであり得る。一部の実施形態において、サンプルは、同じ患者からの単一の腫瘍からの複数の腫瘍サンプルを含み得る。一部の実施形態において、サンプルは、同じ患者からの複数の腫瘍からの１つ、２つ、３つ又は４つの腫瘍サンプルを含み得る。一部の実施形態において、サンプルは、同じ患者からの複数の腫瘍からの複数の腫瘍サンプルを含み得る。固形腫瘍は、限定はされないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌及び皮膚癌（限定はされないが、扁平上皮癌、基底細胞癌及び黒色腫を含む）を含めた任意の癌型のものであり得る。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、膠芽腫（ＧＢＭ）、胃腸癌、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌又は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。一部の実施形態において、有用なＴＩＬは、特に高レベルのＴＩＬを有すると報告されていることに伴い悪性黒色腫腫瘍から入手される。
[001321] 一般に、腫瘍コア又は断片から得られた細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に入手した」若しくは「新鮮に分離した」細胞集団と呼ばれる。特定の実施形態において、新鮮に入手したＴＩＬの細胞集団は、抗原提示細胞、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地に曝露される。
[001322] 一部の実施形態において、腫瘍が転移性であり、過去に原発病変が効率的に処置／除去されている場合、転移性病変の１つの除去が必要になり得る。一部の実施形態において、最も侵襲性の低いアプローチは、利用可能な場合、皮膚病変又は首若しくは腋窩領域のリンパ節を除去することである。一部の実施形態において、皮膚病変が除去されるか、又はその小生検が除去される。一部の実施形態において、リンパ節又はその小生検が除去される。一部の実施形態において、肺若しくは肝臓の転移性病変又は腹腔内若しくは胸部リンパ節又はその小生検を利用することができる。
[001323] 一部の実施形態において、腫瘍は黒色腫である。一部の実施形態において、黒色腫の小生検は、黒子又はその一部を含む。
[001324] 一部の実施形態において、小生検は、パンチ生検である。一部の実施形態において、パンチ生検は、皮膚に押し込まれた円形ブレードを用いて取得される。一部の実施形態において、パンチ生検は、疑わしい黒子の周りの皮膚に押し込まれた円形ブレードを用いて取得される。一部の実施形態において、パンチ生検は、疑わしい黒子の周りの皮膚に押し込まれた円形ブレードを用いて取得され、皮膚の円形片が除去される。一部の実施形態において、小生検は、パンチ生検であり、腫瘍の丸い部分が除去される。
[001325] 一部の実施形態において、小生検は、切除生検である。一部の実施形態において、小生検は切除生検であり、黒子又は腫瘍全体が除去される。一部の実施形態において、小生検は切除生検であり、正常な外観を有する小さい辺縁と共に黒子又は腫瘍全体が除去される。
[001326] 一部の実施形態において、小生検は、切開生検である。一部の実施形態において、小生検は切開生検であり、黒子又は腫瘍の最も不規則な部分のみが採取される。一部の実施形態において、小生検は切開生検であり、切開生検は、疑わしい黒子が非常に大きい場合など、他の技法を完了できない場合に使用される。
[001327] 一部の実施形態において、小生検は、肺生検である。一部の実施形態において、小生検は、気管支鏡により取得される。一般に、気管支鏡では、患者は麻酔下に置かれ、小さい道具が鼻又は口を通り、喉を下って気管支に進み、ここで、いくつかの組織を除去するために小さい道具が使用される。一部の実施形態において、気管支鏡を介して腫瘍又は増殖に到達できない場合、経胸腔針生検を利用することができる。一般に、経胸腔針生検では、患者も麻酔下にあり、針を皮膚から直接疑わしい箇所に挿入して、組織の小さいサンプルを除去する。一部の実施形態において、経胸腔針生検は、介入的画像診断（例えば、針を誘導するためのＸ線又はＣＴスキャンの使用）を必要とする場合がある。一部の実施形態において、小生検は、針生検により取得される。一部の実施形態において、小生検は、超音波内視鏡（例えば、ライトを備えた内視鏡であり、口を通して食道内に配置される）で取得される。一部の実施形態において、小生検は、外科的に取得される。
[001328] 一部の実施形態において、小生検は、頭頸部生検である。一部の実施形態において、小生検は、切開生検である。一部の実施形態において、小生検は切開生検であり、組織の小片が異常に見える領域から切り取られる。一部の実施形態において、異常な領域が容易にアクセスされる場合、入院することなくサンプルが採取され得る。一部の実施形態において、腫瘍が口又は喉の内部のより深い位置にある場合、生検は、全身麻酔を伴い、手術室で行われる必要がある場合がある。一部の実施形態において、小生検は、切除生検である。一部の実施形態において、小生検は切除生検であり、領域全体が除去される。一部の実施形態において、小生検は、細針吸引（ＦＮＡ）である。一部の実施形態において、小生検は、細針吸引（ＦＮＡ）であり、腫瘍又はしこりから細胞を抽出（吸引）するために、シリンジに取り付けられた非常に細い針が使用される。一部の実施形態において、小生検は、パンチ生検である。一部の実施形態において、小生検はパンチ生検であり、疑わしい領域の一片を除去するために、パンチ鉗子が使用される。
[001329] 一部の実施形態において、小生検は、子宮頸部生検である。一部の実施形態において、小生検は、コルポスコピーにより取得される。一般に、コルポスコピー法では、拡大双眼鏡に取り付けられた照明付き拡大鏡（コルポスコープ）の使用が採用され、子宮頸部の表面の小さい部分の生検に使用される。一部の実施形態において、小生検は、円錐切除／錐体生検である。一部の実施形態において、小生検は円錐切除／錐体生検であり、子宮頸部からより大きい組織片を除去するために外来手術が必要になる場合がある。一部の実施形態において、コーン生検は、診断の確認を助けることに加えて、コーン生検が初期処置として役立ち得る。
[001330] 「固形腫瘍」という用語は、嚢胞又は液体領域を通常含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。「固形腫瘍癌」という用語は、悪性、新生物性又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、限定はされないが、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌及び膀胱癌など、肉腫、癌腫及びリンパ腫が挙げられる。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（癌細胞）を含む相互依存的組織コンパートメント及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
[001331] 一部の実施形態において、腫瘍からのサンプルは、細針吸引（ＦＮＡ）、コア生検、小生検（例えば、パンチ生検を含む）として取得される。一部の実施形態において、サンプルは最初にG-Rex 10に入れられる。一部の実施形態において、１つ又は２つのコア生検及び／又は小生検サンプルがある場合、サンプルは最初にG-Rex 10に入れられる。一部の実施形態において、３つ、４つ、５つ、６つ、８つ、９つ又は１０個のコア生検及び／又は小生検サンプルがある場合、サンプルは最初にG-Rex 100に入れられる。一部の実施形態において、３つ、４つ、５つ、６つ、８つ、９つ又は１０個のコア生検及び／又は小生検サンプルがある場合、サンプルは最初にG-Rex 500に入れられる。
[001332] ＦＮＡは、肺、黒色腫、頭頸部、子宮頸部、卵巣、膵臓、神経膠芽腫、結腸直腸及び肉腫からなる群から選択される腫瘍から取得され得る。一部の実施形態において、ＦＮＡは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者からの肺腫瘍などの、肺腫瘍から取得される。一部の場合において、ＮＳＣＬＣを有する患者は、以前に外科的処置を受けたことがある。
[001333] 本明細書に記載されるＴＩＬは、ＦＮＡサンプルから得ることができる。一部の場合において、ＦＮＡサンプルは、１８ゲージ針～２５ゲージ針の範囲のハイゲージの針を使用して患者から取得又は分離される。ハイゲージの針は、１８ゲージ、１９ゲージ、２０ゲージ、２１ゲージ、２２ゲージ、２３ゲージ、２４ゲージ又は２５ゲージであり得る。一部の実施形態において、患者からのＦＮＡサンプルは、少なくとも４００，０００個のＴＩＬ、例えば、４００，０００個のＴＩＬ、４５０，０００個のＴＩＬ、５００，０００個のＴＩＬ、５５０，０００個のＴＩＬ、６００，０００個のＴＩＬ、６５０，０００個のＴＩＬ、７００，０００個のＴＩＬ、７５０，０００個のＴＩＬ、８００，０００個のＴＩＬ、８５０，０００個のＴＩＬ、９００，０００個のＴＩＬ、９５０，０００個のＴＩＬ又はそれを超える数のＴＩＬを含み得る。
[001334] 一部の場合において、本明細書に記載されるＴＩＬは、コア生検サンプルから得られる。一部の場合において、コア生検サンプルは、１１ゲージ針～１６ゲージ針の範囲の外科用又は医療用の針を使用して患者から取得又は分離される。針は、１１ゲージ、１２ゲージ、１３ゲージ、１４ゲージ、１５ゲージ又は１６ゲージであり得る。一部の実施形態において、患者からのコア生検サンプルは、少なくとも４００，０００個のＴＩＬ、例えば、４００，０００個のＴＩＬ、４５０，０００個のＴＩＬ、５００，０００個のＴＩＬ、５５０，０００個のＴＩＬ、６００，０００個のＴＩＬ、６５０，０００個のＴＩＬ、７００，０００個のＴＩＬ、７５０，０００個のＴＩＬ、８００，０００個のＴＩＬ、８５０，０００個のＴＩＬ、９００，０００個のＴＩＬ、９５０，０００個のＴＩＬ又はそれを超える数のＴＩＬを含み得る。
[001335] 一般に、回収された細胞懸濁液は「初代細胞集団」又は「新鮮に回収された」細胞集団と呼ばれる。
[001336] 一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍消化物から入手されない。一部の実施形態において、固形腫瘍コアは断片化されていない。
[001337] 一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍消化物から入手される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、酵素培地中、例えば限定はされないが、ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭ GlutaMAX、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮアーゼ及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的分離（GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA）によって作成した。腫瘍を酵素培地に置いた後、腫瘍を約１分間機械的に分離し得る。次に溶液を５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、次にそれを再びおよそ１分間機械的に破壊し得る。再び５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍を３度目におよそ１分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、３度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、５％ＣＯ２下３７℃でのさらに３０分間のインキュベーションを伴う又は伴わない１回又は２回の更なる機械的分離をサンプルに適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、フィコールを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
[001338] 一部の実施形態において、第１の拡大培養ステップ前の回収された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に回収された」細胞集団と呼ばれる。
[001339] 一部の実施形態において、細胞は、以下に更に詳細に記載し、図４４に例示する、ステップＢに記載の拡大培養に進む前に、任意選択でサンプル回収後に凍結され、凍結貯蔵され得る。
２．ステップＢ 第１の拡大培養
[001340] 一部の実施形態において、本方法は、対象／患者への投与時に複製サイクルを増加させることができる幼若ＴＩＬを得ることを提供し、したがって、成熟ＴＩＬ（即ち被験者／患者への投与前に更に多くの回数の複製を受けたＴＩＬ）を超える追加的な治療上の利点を提供し得る。溶着ＴＩＬの特徴が、文献に記載されている。例えば、Donia, et al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012); Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)、Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005)、Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013)、Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009)、Robbins, et al., J Immunol 2004; 173:7125-7130、Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)、Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005)及びTran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)であり、これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される。
[001341] Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）及びＣ（定数）の遺伝子セグメントは、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、本方法によって得られたＴＩＬは、新たに回収されたＴＩＬ及び／又は例えば、図１に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、図４３及び／又は図４４に例示されているように、本方法によって得られたＴＩＬは、新たに回収されたＴＩＬ及び／又はプロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第１の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性はＴ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（即ちＴＣＲα／β）の発現が増加する。
[001342] 小生検、コア生検又は細針吸引腫瘍断片若しくは断片（「コア」又は「断片」と称され得る）の取得（例えば、図７のステップＡに記載されるように）後、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ－２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と共に含む培地中でインキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して３～１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、７～１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１～１４９日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、約３～１９日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、第１の拡大培養の１～２日目に含まれ、ＯＫＴ３及びフィーダーは、第１の拡大培養の３日目に添加される。一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びフィーダーは、３日目～１９日目にわたって含まれる。一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びフィーダーは、３日目～１８日目にわたって含まれる。一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びフィーダーは、３日目～１７日目にわたって含まれる。一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びフィーダーは、３日目～１６日目にわたって含まれる。一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びフィーダーは、３日目～１５日目にわたって含まれる。一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びフィーダーは、３日目～１４日目にわたって含まれる。一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びフィーダーは、３日目～１３日目にわたって含まれる。一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びフィーダーは、３日目～１２日目にわたって含まれる。一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びフィーダーは、３日目～１１日目にわたって含まれる。一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びフィーダーは、３日目～１０日目にわたって含まれる。一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びフィーダーは、３日目～９日目にわたって含まれる。好ましい実施形態において、以下及び本明細書で説明するように、初期バルクＴＩＬ拡大培養ステップ（例えば、プレＲＥＰと称されるプロセスを含み得る図７のステップＢで説明したものなど）、その後の、以下ステップＤの下及び本明細書に記載されているように、第２の拡大培養（ステップＤ、急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるプロセスを含む）、その後の任意選択による凍結保存及びその後の第２ステップＤ（再刺激ＲＥＰステップと称されるプロセスを含む）を使用してＴＩＬの拡大培養を実施することができる。このプロセスによって入手したＴＩＬは、任意選択により、本明細書に記載される通り表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられ得る。
[001343] 実施形態において、ＴＩＬ培養が２４ウェルプレートで、例えばCostar２４ウェル細胞培養クラスター、平底（Corning Incorporated、Corning, NYを使用して開始される場合、各ウェルには、ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍＬ；Chiron Corp.、Emeryville, CA）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中、１×１０６個の小生検、コア生検若しくは細針吸引腫瘍細胞又は１つの小生検、コア生検若しくは細針吸引腫瘍断片を播種することができる。
[001344] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、ステップＢのＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ １６４０からなる。培養が、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN）内で開始される実施形態において（図１）、各フラスコに、１０～４０ｍＬのＩＬ－２含有ＣＭ中の１０～４０×１０６個の小生検、コア生検若しくは細針吸引腫瘍生細胞又は５～３０個の小生検、コア生検若しくは細針吸引腫瘍断片を充填した。G-Rex10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ－２を補充し、５日目以降は２～３日毎に培地の半分を交換した。
[001345] 小生検、コア生検、細針吸引腫瘍断片の回収後、得られた細胞（即ち断片）は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ－２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍断片は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と共に含む培地中で（又はある場合には、本明細書に概説される通り、ａＡＰＣ細胞集団の存在下で）インキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して１０～１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、第１の拡大培養の間の成長培地はＩＬ－２又はその変異体を含む。一部の実施形態において、ＩＬは組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）である。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２０～３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２０～３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２５×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は４～８×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は５～７×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は６×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は実施例４に記載される通り調製される。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２又は約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
[001346] 一部の実施形態において、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に、ＯＫＴ－３、ＩＬ－１５、ＯＸ４０アゴニスト性抗体及び／又は４－１ＢＢアゴニスト性抗体を更に補充することにより実施される。例えば、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地には、ＯＫＴ－３、ＩＬ－１５、ＯＸ４０アゴニスト性抗体、４－１ＢＢアゴニスト性抗体、ＯＫＴ－３及びＩＬ－１５の組み合わせ、ＯＫＴ－３及びＯＸ４０アゴニスト性抗体の組み合わせ、ＯＫＴ－３及び４－１ＢＢアゴニスト性抗体の組み合わせ、ＩＬ－１５及びＯＸ４０アゴニスト性抗体の組み合わせ、ＩＬ－１５及び４－１ＢＢアゴニスト性抗体の組み合わせ、ＯＸ４０アゴニスト性抗体及び４－１ＢＢアゴニスト性抗体の組み合わせ、ＯＫＴ－３、ＩＬ－１５及びＯＸ４０アゴニスト性抗体の組み合わせ、ＯＫＴ－３、ＩＬ－１５及び４－１ＢＢアゴニスト性抗体の組み合わせ、ＯＫＴ３、ＯＸ４０アゴニスト性抗体及び４－１ＢＢアゴニスト性抗体の組み合わせ、ＩＬ－１５、ＯＸ４０アゴニスト性抗体及び４－１ＢＢアゴニスト性抗体の組み合わせ、ＯＫＴ３、ＩＬ－１５、ＯＸ４０アゴニスト性抗体及び４－１ＢＢアゴニスト性抗体の組み合わせ並びにそれらの任意の組み合わせが補充される。一部の実施形態において、ＩＬ－１５は含まれない。
[001347] 小生検、コア生検、細針吸引腫瘍断片の取得（例えば、図４４ＡのステップＡに記載されるように）後、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ－２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍断片は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と共に含む培地中でインキュベートされる。この初代細胞集団は、一定の期間、概して１～１９日の期間にわたって培養され、それにより、少なくとも１１日目～１９日目までに、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のバルクＴＩＬ集団が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１～１８日の期間にわたって培養され、それにより、少なくとも１８日目までに、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のバルクＴＩＬ集団が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１～１７日の期間にわたって培養され、それにより、少なくとも１７日目までに、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のバルクＴＩＬ集団が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１～１６日の期間にわたって培養され、それにより、少なくとも１６日目までに、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のバルクＴＩＬ集団が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１～１５日の期間にわたって培養され、それにより、少なくとも１５日目までに、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のバルクＴＩＬ集団が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１～１４日の期間にわたって培養され、それにより、少なくとも１４日目までに、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のバルクＴＩＬ集団が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１～１３日の期間にわたって培養され、それにより、少なくとも１３日目までに、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のバルクＴＩＬ集団が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１～１２日の期間にわたって培養され、それにより、少なくとも１２日目までに、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のバルクＴＩＬ集団が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１～１１日の期間にわたって培養され、それにより、少なくとも１１日目までに、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のバルクＴＩＬ集団が得られる。一部の実施形態において、ＴＩＬ集団は、第１の拡大培養ステップの終了までに、少なくとも約５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬ細胞である（例えば、プレＲＥＰと称されるプロセスを含み得る、図４４のステップＢに記載されるものなど）。
[001348] 好ましい実施形態において、以下及び本明細書で説明するように、初期バルクＴＩＬ拡大培養ステップ（例えば、プレＲＥＰと称されるプロセスを含み得る図４４のステップＢで説明したものなど）、その後の、以下ステップＤの下及び本明細書に記載されているように、第２の拡大培養（ステップＤ、急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるプロセスを含む）、その後の任意選択の凍結保存及びその後の第２ステップＤ（再刺激ＲＥＰステップと称されるプロセスを含む）を使用してＴＩＬの拡大培養を実施することができる。このプロセスによって入手したＴＩＬは、任意選択により、本明細書に記載される通り表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられ得る。
[001349] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、ステップＢのＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ １６４０からなる。培養が、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN）内で開始される実施形態において、各フラスコに、１０～４０ｍＬのＩＬ－２含有ＣＭ中の１～２生検コアをロードした。G-Rex10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ－２を補充し、２日目以降は２～３日毎に培地の半分を交換した。一部の実施形態において、コア生検が卵巣腫瘍からのもの（例えば、卵巣起源）である場合、コアは、ＣＭ及びＩＬ－２中で１～２日間にわたりインキュベートされる。一部の実施形態において、コア生検が膵臓腫瘍細胞からのもの（例えば、膵臓起源）である場合、コアは、ＣＭ及びＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１中で１～２日間にわたりインキュベートされる。一部の実施形態において、３日目に、ＯＫＴ３及びフィーダー細胞がコアに添加される。一部の実施形態において、３日目に、３０ｎｇのＯＫＴ３及び１０６個のフィーダー細胞がコアに添加される。
[001350] 小生検断片又はコアは、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ－２において培養される。一部の実施形態において、小生検断片又はコアは、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と共に含む培地中で（又はある場合には、本明細書に概説される通り、ａＡＰＣ細胞集団の存在下で）インキュベートされる。この初代細胞集団は、数日間、概して１～１９日間の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、少なくとも約５×１０７個のバルクＴＩＬ細胞が１１日目に得られ、一部の実施形態において、１×１０８個のＴＩＬが１９～２８日目に得られる。一部の実施形態において、第１の拡大培養の間の成長培地はＩＬ－２又はその変異体を含む。一部の実施形態において、ＩＬは組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）である。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２０～３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２５×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は４～８×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は５～７×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は６×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は実施例Ｅに記載される通り調製される。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２又は約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
[001351] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－１５をさらに含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、コアが膵臓腫瘍からのもの（例えば、膵臓起源）である場合、ＩＬ－１５が含まれる。
[001352] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２１をさらに含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、コアが膵臓腫瘍からのもの（例えば、膵臓起源）である場合、ＩＬ－２１が含まれる。
[001353] 一実施形態において、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地はＯＫＴ－３抗体を含まない。一部の実施形態において、ＯＫＴ－３抗体はムロモナブである。
[001354] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質並びにその断片、誘導体、変異体、バイオシミラー及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
[001355] 一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、細胞培養培地は、初期濃度約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体をさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。
[001356] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、これはＣＭ１（培養培地１）と称される。一部の実施形態において、ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ １６４０からなる。実施形態において、培養は、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN）内で開始される。一部の実施形態において、ＣＭは、実施例に記載されるＣＭ１であり、実施例７を参照のこと。一部の実施形態において、第１の拡大培養は初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地中で行われる。一部の実施形態において、初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地はＩＬ－２を含む。
[001357] 一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の拡大培養（例えば、プレＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図４４のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは、５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを入手するのに十分な期間、約１～１９日間である。一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の拡大培養（例えば、プレＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図４４のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）は、図４４に提供されるように、１～２日間と３～１９日間の２段階に分けられる。一部の実施形態において、ステップＢの第１の拡大培養は、図４４に提供されるように、１～２日間（ＩＬ－２又はＩＬ２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１と共に培養）及び３～１９日間（ＯＫＴ３及びフィーダーと共に培養）の２つの段階に分けられる。
[001358] 一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１４日間、１４日間、１４日間、１４日間、１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、１日間～１９日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、２日間～１９日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、３日間～１９日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、６日間～１９日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、７日間～１９日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、８日間～１９日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、９日間～１９日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、１０日間～１９日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、１１日間～１９日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、１２日間～１９日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、１３日間～１９日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、１６日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、１８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５×１０７個（即ち５０００万個）のＴＩＬを取得するために、１９日間続行され得る。一部の実施形態において、小生検（例えば、コア生検）は、約１、２又は３日目に培養物から取り出される。一部の実施形態において、小生検（例えば、コア生検）は３日目に培養物から取り出される。
[001359] 一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１の組み合わせが、第１の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図４４による且つ本明細書に記載されている通り、ステップＢプロセス中を含む、第１の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の組み合わせが、第１の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図４４による且つ本明細書に記載されている通りステップＢプロセス中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１は、１日目に添加される。一部の実施形態において、コア生検が膵臓腫瘍からのもの（例えば、膵臓起源のもの）である場合、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１は、１日目に添加される。一部の実施形態において、ＩＬ－１５は含まれない。一部の実施形態において、ＩＬ－２１は含まれない。一部の実施形態において、ＩＬ－１５もＩＬ－２１も含まれない。
[001360] 一部の実施形態において、第１の拡大培養、例えば、図４４によるステップＢは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
[001361] 一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、少なくとも５０×１０６個のＴＩＬ、例えば、５０×１０６個（即ち５×１０７個）、５５×１０６個、６０×１０６個、６５×１０６個、７０×１０６個、７５×１０６個、８０×１０６個、８５×１０６個、９０×１０６個、９５×１０６個、１００×１０６個、１０５×１０６個、１１０×１０６個、１１５×１０６個、１２０×１０６個、１２５×１０６個、１５０×１０６個、２００×１０６個、３００×１０６個、４００×１０６個又はそれを超える数のＴＩＬを生成する。
３．ステップＣ：第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行
[001362] ある場合には、例えば、図４４に示されるように、例えばステップＢから得られるＴＩＬ集団を含む、第１の拡大培養から得られるバルクＴＩＬ集団は、以下本明細書で考察されるプロトコルを使用して直ちに凍結保存され得る。代わりに、第２のＴＩＬ集団と称される第１の拡大培養から得られたＴＩＬ集団は、第２の拡大培養（ＲＥＰと呼ばれることがある拡大培養を含み得る）に供し、その後、以下で考察するように凍結保存することができる。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬが治療に使用される場合、第１のＴＩＬ集団（バルクＴＩＬ集団と称されることもある）又は第２のＴＩＬ集団（一部の実施形態において、ＲＥＰ ＴＩＬ集団と称される集団を含み得る）は、拡大培養前又は第１の拡大培養後且つ第２の拡大培養前に、適切な処置のために遺伝子修飾に供され得る。
[001363] 一部の実施形態において、第１の拡大培養から（例えば、図４４に示される通りのステップＢから）入手されたＴＩＬは、選択のためのフェノタイピングまで貯蔵される。一部の実施形態において、第１の拡大培養から（例えば、図４４に示される通りのステップＢから）入手されたＴＩＬは、貯蔵されず第２の拡大培養に直接進む。一部の実施形態において、第１の拡大培養から入手されたＴＩＬは、第１の拡大培養後、第２の拡大培養前に凍結保存されない。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日又は１９日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約３日～１９日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約４日～１９日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約４日～１９日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約７日～１９日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１０日～１９日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１１日～１９日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１２日～１９日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１３日～１９日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１４日～１９日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１５日～１９日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１６日～１９日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１７日～１９日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１８日～１９日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１１日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１２日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１３日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１５日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１６日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１７日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１８日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、第１の拡大培養のためにコアが培養培地に添加されたときから約１９日の時点で行われる。
[001364] 一部の実施形態において、ＴＩＬは、第１の拡大培養後、第２の拡大培養前に貯蔵されず、ＴＩＬは、第２の拡大培養に直接進む（例えば、一部の実施形態において、図４４に示すように、ステップＢからステップＤへの移行中に貯蔵は行われない）。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、移行は閉鎖系で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養からのＴＩＬは、第２のＴＩＬ集団からのＴＩＬであり、移行期間を伴わず第２の拡大培養に直接進む。
[001365] 一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、例えば、図４４によるステップＣは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
４．ステップＤ：第２の拡大培養
[001366] 一部の実施形態において、ＴＩＬ細胞集団は、例えば、図４４に記載の通り、ステップＡ及びステップＢ並びにステップＣと称される移行後、回収及び初期バルク処理後、数が増加する。この更なる増加は、本明細書では第２の拡大培養と称され、これは、当技術分野で一般に急速拡大培養法と称される拡大培養プロセス（ＲＥＰ並びに図４４のステップＤに示されるプロセス）を含み得る。第２の拡大培養は、概して、フィーダー細胞、サイトカイン源及び抗ＣＤ３抗体を含め、幾つもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。
[001367] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養又は第２のＴＩＬ拡大培養（これはＲＥＰと称されることもある拡大培養；並びに図４４のステップＤに示されるプロセスを含み得る）は、当業者に公知の任意のＴＩＬフラスコ又は容器を使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１０日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１１日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１２日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１３日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１４日間続行し得る。
[001368] ある実施形態において、第２の拡大培養は、本開示の方法（例えば、ＲＥＰと呼ばれる膨張並びに図４４のステップＤに示されるプロセスを含む）を使用して、ガス透過性容器内で実施することができる。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）又はインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて急速に拡大培養することができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激としては、例えば、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）を挙げることができる。ＴＩＬは、任意選択により３００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２又はＩＬ－１５など、Ｔ細胞成長因子の存在下で、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば、０．３μΜ ＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）又はｇｐｌ ００：２０９－２１７（２１０Ｍ）など、任意選択によりベクターから発現させることのできる、１つ又は複数のエピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の１つ以上の抗原を、第２の拡大培養の間に誘導することにより、インビトロでのＴＩＬの更なる刺激を誘発するように拡大培養することができる。他の好適な抗原としては、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２及びＶＥＧＦＲ２又はその抗原性部分を挙げることができる。ＴＩＬは、ＨＬＡ－Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ１つ又は複数の抗原による再刺激によっても急速に拡大培養し得る。代わりに、ＴＩＬは、例えば照射自己リンパ球によるか、又は照射ＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２によってさらに再刺激することができる。一部の実施形態において、再刺激は、第２の拡大培養の一部として生じる。一部の実施形態において、照射された自己リンパ球の存在下において又は照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２と共に第２の拡大培養が発生する。一部の実施形態において、１３×１０６個のフィーダー細胞が第２の拡大培養中に添加される。一部の実施形態において、１３×１０６個のフィーダー細胞が第２の拡大培養の開始時に添加される。
[001369] 一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ又は８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
[001370] 一実施形態において、細胞培養培地はＯＫＴ３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。
[001371] 一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図４４によるかつ本明細書に記載されている通り、ステップＤプロセス中を含む、第２の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図４４による且つ本明細書に記載されている通りステップＤプロセス中に含められ得る。
[001372] 一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示フィーダー細胞を含む補充細胞培養培地で実施され得る。一部の実施形態において、第２の拡大培養は補充細胞培養培地で行われる。一部の実施形態において、補充細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ；本明細書では抗原提示フィーダー細胞、フィーダー細胞又はフィーダーとも称される）を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示フィーダー細胞で生じる（即ち抗原提示細胞）。
[001373] 一部の実施形態において、第２の拡大培養は、第２の拡大培養におけるＴＩＬ集団の細胞培養培地に、ＩＬ－１５、ＯＸ４０アゴニスト性抗体及び／又は４－１ＢＢアゴニスト性抗体を更に補充することにより実施される（第２のＴＩＬ集団と称される場合もある）。例えば、第２の拡大培養におけるＴＩＬ集団の細胞培養培地には、ＩＬ－１５、ＯＸ４０アゴニスト性抗体、４－１ＢＢアゴニスト性抗体、ＩＬ－１５及びＯＸ４０アゴニスト性抗体の組み合わせ、ＩＬ－１５及び４－１ＢＢアゴニスト性抗体の組み合わせ、ＯＸ４０アゴニスト性抗体及び４－１ＢＢアゴニスト性抗体の組み合わせ、ＩＬ－１５、ＯＸ４０アゴニスト性抗体及び４－１ＢＢアゴニスト性抗体の組み合わせ並びにそれらの任意の組み合わせが補充される。一部の実施形態において、コアが卵巣腫瘍からのもの（例えば、卵巣起源）である場合、ＯＸ４０が含まれる。一部の実施形態において、ＯＫＴ－３は、第１及び／又は第２の拡大培養中に添加される。一部の実施形態において、ＯＫＴ－３は、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）と共に、３日目に追加される。一部の実施形態において、サンプルがＦＮＡからのものである場合、ＯＫＴ－３は、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）と共に、１日目に追加される。
[001374] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣである。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣ及び／又は抗原提示細胞との比は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００又は約１：５００である。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：５０～１：３００である。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：１００～１：２００である。
[001375] 一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバーに移すまで培地補充が行われる（一般的に新鮮培地による呼吸を介した３分の２の培地補充）。別の成長チャンバーには、以下に更に十分に考察する通りのGREXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[001376] 一部の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰプロセスと称されるプロセスを含み得る）は、実施例及び図で考察されるように、１１～１４日間である。一部の実施形態において、第２の拡大培養は１１日間である。一部の実施形態において、第２の拡大培養は１２日間である。一部の実施形態において、第２の拡大培養は１３日間である。一部の実施形態において、第２の拡大培養は１４日間である。
[001377] 一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、前述のように、（Tran, et al., J. Immunother.2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother.2003, 26, 332-42）Ｔ－１７５フラスコ及び気体透過性バッグ又はガス透過性培養器具（G-Rexフラスコ）を使用して実施され得る。一部の実施形態において、第２の拡大培養（急速拡大培養と称される拡大培養を含む）は、Ｔ－１７５フラスコで実施され、１５０ｍＬの培地に懸濁した約１×１０６個のＴＩＬを各Ｔ－１７５フラスコに加え得る。ＴＩＬは、ＩＬ－２の１ｍＬあたり３０００ＩＵ及び抗ＣＤ３の１ｍｌあたり３０ｎｇを補充したＣＭ及びAIM-V培地の１対１の混合物で培養され得る。Ｔ－１７５フラスコは、５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされ得る。培地の半分は、５日目に、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ－２を含む５０／５０培地を使用して交換され得る。一部の実施形態において、７日目に、２つのＴ－１７５フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせることができ、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含む３００ｍＬのAIM Vを加えた。毎日又は２日毎に各バッグの細胞数を計数し、新鮮培地を加えて細胞数を０．５～２．０×１０６細胞／ｍＬに保った。
[001378] 一実施形態において、第２の拡大培養（これはＲＥＰと称される拡大培養；並びに図４４のステップＤに参照されるものを含み得る）は、１００ｃｍガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量ガス透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USAから市販されている）において実施され得、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を添加した４００ｍＬの５０／５０培地中で５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬをＰＢＭＣと培養し得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。５日目、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心し得る。５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻し加え得る。G-Rex 100フラスコ内でＴＩＬを連続的に拡大培養するとき、７日目に各G-Rex 100のＴＩＬを、各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し得、且つ細胞懸濁液を３～１００ｍＬアリコートに分割し得、それらを３つのG-Rex 100フラスコの播種に使用し得る。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコは、５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされ得、４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを加え得る。細胞は、培養１１日目に回収し得る。細胞は、培養１２日目に回収し得る。細胞は、培養１３日目に回収し得る。細胞は、培養１４日目に回収し得る。一部の実施形態において、培養物は、G-Rex 500中に拡大培養される。
[001379] 一実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と混合してフラスコ内で実施される。一部の実施形態において、細胞が別の成長チャンバーに移されるまで培地交換が行われる。一部の実施形態において、培地の２／３は、使用済み培地の吸引及び同等の体積の新鮮培地での置換によって置き換えられる。一部の実施形態において、別の成長チャンバーには、以下に更に十分に考察する通りのGRexフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[001380] 一実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）が実施され、これは優れた腫瘍応答性に関してＴＩＬを選択するステップを更に含む。当技術分野において公知の任意の選択方法を用いることができる。例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１００５８ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載される方法は、優れた腫瘍応答性に関するＴＩＬの選択に用いられ得る。
[001381] 任意選択で、第２の拡大培養（ＲＥＰ拡大培養と称される拡大培養を含む）後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。一部の実施形態において、Cellometer K2自動セルカウンター（Nexcelom Bioscience、Lawrence, MA）を使用してＴＩＬサンプルを計数し、生存率を決定することができる。一部の実施形態において、生存率は、Cellometer K2 Image Cytometer自動セルカウンタープロトコルに従い決定される。
[001382] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、先述の通りＴ－１７５フラスコ及びガス透過性バッグ（Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751及びDudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342）又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２の拡大培養はフラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、第２の拡大培養はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、Ｔ－１７５フラスコで実施される第２の拡大培養及び約１×１０６個のＴＩＬを約１５０ｍＬの培地中に懸濁し、これを各Ｔ－１７５フラスコに加える。ＴＩＬは、「フィーダー」細胞としての照射（５０Ｇｙ）された同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養し、及び細胞は、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を補充したＣＭとAIM-V培地との１対１混合物（５０／５０培地）で培養した。T-175フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートする。一部の実施形態において、培地は、５日目に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む５０／５０培地を使用して交換される。一部の実施形態において、７日目、２つのT-175フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせ、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む３００ｍＬのAIM-Vを加える。毎日又は２日毎に各バッグの細胞数を計数し得、新鮮培地を加えて細胞数を約０．５～約２．０×１０６細胞／ｍＬに保ち得る。一部の実施形態において、培養物は、G-Rex 500中に拡大培養される。
[001383] 一部の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、１００ｃｍ２ガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf）において実施され、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を補充した４００ｍＬの５０／５０培地中で約５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬを照射同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養する。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされる。一部の実施形態において、５日目に、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心する。次に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮５０／５０培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex100フラスコに加え戻し得る。ＴＩＬがG-Rex100フラスコ内で連続的に拡大培養される実施形態において、７日目に各G-Rex100内のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し、且つ細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割しており、それらを３つのG-Rex100フラスコの播種に使用される。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに加える。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされ、４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを加える。細胞は培養１４日目に回収される。一部の実施形態において、培養物は、G-Rex 500中に拡大培養される。
[001384] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下で更に詳細に考察する通り、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３並びに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。
[001385] 一部の実施形態において、第２の拡大培養、例えば、図４４によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
[001386] 一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順（例えば、図４４のステップＤに記載された拡大培養並びにＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＲＥＰ ＴＩＬ拡大培養中及び／又は第２の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。
[001387] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかにより不活性化され、実施例、特に同種異系ＰＢＭＣの複製能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例６に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用される。
[001388] 一部の実施形態において、１４日目の生細胞の総数がＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目に培養（即ち第２の拡大培養の開始日）に移行した初期生細胞数より少ない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。
[001389] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
[001390] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、５～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１０～５０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２０～４０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２５～３５ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
[001391] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞はＰＢＭＣである。一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は人工抗原提示フィーダー細胞である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は、約１対２５、約１対５０、約１対１００、約１対１２５、約１対１５０、約１対１７５、約１対２００、約１対２２５、約１対２５０、約１対２７５、約１対３００、約１対３２５、約１対３５０、約１対３７５、約１対４００又は約１対５００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対５０～１対３００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対１００～１対２００である。
[001392] ある実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、第２の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。一実施形態において、ＰＢＭＣの代わりに人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が使用される。
[001393] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかによって不活性化され、例えば図４４に記載された例示的な手順を含む、本明細書に記載されたＴＩＬ拡大培養手順で使用される。
[001394] ある実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替として又はそれと組み合わせて、第２の拡大培養で使用される。
[001395] 本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。
[001396] 代わりに、ＴＩＬの急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することが更に可能であり、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の２つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（参照により全体として明示的に本明細書に援用される）に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－２とＩＬ－２１、ＩＬ－１５とＩＬ－２１とＩＬ－２、ＩＬ－１５とＩＬ－２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
５．ステップＥ：ＴＩＬの回収
[001397] 第２の拡大培養ステップ後、細胞は回収することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図４４に提供される通り、１、２、３、４回又はそれ以上の拡大培養ステップ後に回収される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図４４に提供される通り、２回の拡大培養ステップ後に回収される。
[001398] ＴＩＬは、例えば遠心によることを含め、任意の適切な且つ無菌の方法で回収することができる。ＴＩＬ回収方法は当技術分野において周知であり、本プロセスと共に任意のかかる公知の方法を用いることができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは自動化系を使用して回収される。
[001399] 一部の実施形態において、回収、例えば、図４４によるステップＥは、閉鎖系バイオリアクターから実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、GREX-10又はGREX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
６．ステップＦ：最終的な製剤化／輸注バッグへの移動
[001400] 図４４に例示的順序で提供される通りの、且つ上記及び本明細書に詳細に概説される通りのステップＡ～Ｅが完了した後、細胞は患者への投与における使用のため容器に移される。一部の実施形態において、上記に記載される拡大培養方法を用いて治療上十分な数のＴＩＬが入手されると、ＴＩＬは患者への投与における使用のため容器に移される。
[001401] 一実施形態において、本開示のプロセスを使用して拡大培養したＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のプロセスを使用して拡大培養したＴＩＬは、当技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくはおよそ３０～６０分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内及びリンパ内が挙げられる。
[001402] 一実施形態において、前述の開示のプロセスを使用して拡大培養されたＴＩＬは、凍結保存剤を更に含む組成物として投与され得る。一実施形態において、前述の開示のプロセスを使用して拡大培養されたＴＩＬは、凍結保存剤及び等張剤を更に含む組成物として投与され得る。一実施形態において、前述の開示のプロセスを使用して拡大培養されたＴＩＬは、ジメチルスルホキシドを含む凍結保存剤並びに塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムを含む等張剤を更に含む組成物として投与され得る。一実施形態において、前述の開示のプロセスを使用して拡大培養されたＴＩＬは、ジメチルスルホキシド及びデキストラン４０を含む凍結保存剤並びに塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムを含む等張剤を更に含む組成物として投与され得る。一実施形態において、前述の開示のプロセスを使用して拡大培養されたＴＩＬは、滅菌輸注バッグで送達される組成物として投与され得、そのような組成物は、ジメチルスルホキシド及びデキストラン４０を含む凍結保存剤並びに塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムを含む等張剤を更に含む。
医薬組成物、投与量及び投与レジメン
[001403] 一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養したＴＩＬは医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のプロセスを使用して拡大培養したＴＩＬは、当技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくはおよそ３０～６０分間継続される。他の適切な投与経路には、腹腔内投与、髄腔内投与及びリンパ管内投与が含まれる。
[001404] 任意の適切な用量のＴＩＬを投与することができる。一部の実施形態において、好適な投与量には、治療上十分な数のＴＩＬが必要である。一部の実施形態において、特に癌が黒色腫である場合、平均が約７．８×１０１０ＴＩＬである約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０ＴＩＬが投与される。一実施形態において、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約３×１０１０～約１２×１０１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約４×１０１０～約１０×１０１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約５×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約６×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約７×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０である。一部の実施形態において、特に癌が黒色腫である場合、治療有効投与量は約７．８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約３×１０１０～約１２×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約４×１０１０～約１０×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約５×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約６×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約７×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬである。
[001405] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３及び９×１０１３個である。一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２及び５×１０１２～１×１０１３の範囲内である。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３及び９×１０１３個である。
[001406] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、医薬組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖより低い。
[001407] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖより高い。
[001408] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．０００１％～約５０％、約０．００１％～約４０％、約０．０１％～約３０％、約０．０２％～約２９％、約０．０３％～約２８％、約０．０４％～約２７％、約０．０５％～約２６％、約０．０６％～約２５％、約０．０７％～約２４％、約０．０８％～約２３％、約０．０９％～約２２％、約０．１％～約２１％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約１９％、約０．４％～約１８％、約０．５％～約１７％、約０．６％～約１６％、約０．７％～約１５％、約０．８％～約１４％、約０．９％～約１２％又は約１％～約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
[001409] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．００１％～約１０％、約０．０１％～約５％、約０．０２％～約４．５％、約０．０３％～約４％、約０．０４％～約３．５％、約０．０５％～約３％、約０．０６％～約２．５％、約０．０７％～約２％、約０．０８％～約１．５％、約０．０９％～約１％、約０．１％～約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
[001410] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ又は０．０００１ｇ以下である。
[001411] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ又は１０ｇ超である。
[001412] 本発明の医薬組成物において提供されるＴＩＬは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、処置されるべき対象の性別及び年齢、処置されるべき対象の体重並びに担当医の選好及び経験に依存するであろう。臨床的に確立されたＴＩＬの投与量も適切な場合に使用され得る。ＴＩＬの投与量などの、本明細書の方法を使用して投与される医薬組成物の量は、処置されるヒト又は哺乳動物、疾患又は状態の重症度、投与速度、活性医薬成分の性質及び処方医の裁量に依存するであろう。
[001413] 一部の実施形態において、ＴＩＬは単回投与で投与され得る。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ＴＩＬは複数回投与で投与され得る。投与は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回又は６回を超え得る。投与は、月に１回、２週間に１回、週に１回又は隔日に１回であり得る。ＴＩＬの投与は必要な限り継続し得る。
[001414] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３及び９×１０１３個である。一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２及び５×１０１２～１×１０１３の範囲内である。
[001415] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ～約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ～約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇｍｇ～約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ～約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ～約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ又は約２．８５ｍｇ／ｋｇ～約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
[001416] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１ｍｇ～約５００ｍｇ、約１０ｍｇ～約３００ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約４５ｍｇ、約１０ｍｇ～約４０ｍｇ、約１５ｍｇ～約３５ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約２３ｍｇ～約２８ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ～約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ～約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ～約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１１０ｍｇ又は約９５ｍｇ～約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ～約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ～約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ～約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ～約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ～約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ～約２０５ｍｇｖ約１９８～約２０７ｍｇの範囲内である。
[001417] 有効量のＴＩＬは、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射によること、静脈内、腹腔内、非経口的、筋肉内、皮下、局所、移植によること又は吸入によることを含め、同様の有用性を有する薬剤について一般に認められている任意の投与方式により、単回用量又は複数回用量のいずれでも投与され得る。
Ｃ．小生検、コア生検又は細針吸引を含む、ＴＩＬ製造のためのＧｅｎ３方法
[001418] 一部の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞の供給源として、小生検、コア生検又は細針吸引を使用するように変更された、ＧＥＮ３プロセスのいずれかの方法によって作製されたＴＩＬ集団を提供する。一部の実施形態において、本発明は、そのような任意のＧＥＮ３プロセスの第１の初回刺激拡大培養における拡大培養のためのＴ細胞の供給源として、小生検、コア生検又は細針吸引を使用するように変更された、ＧＥＮ３プロセスのいずれかの方法を提供し、ここで、（１）そのようなＧＥＮ３プロセスの第２の急速拡大培養後に回収されたＴＩＬ集団で所望のＴＩＬ細胞数を達成するために、第１の初回刺激拡大培養の期間が延長されるか、又は（２）第２の急速拡大培養後に回収されたＴＩＬ集団で所望のＴＩＬ細胞数を達成するために、そのようなＧＥＮ３プロセスの第２の急速拡大培養の期間が延長されるか、又は（３）第２の急速拡大培養後に回収されたＴＩＬ集団で所望のＴＩＬ細胞数を達成するために、第１の初回刺激拡大培養の期間が延長され、且つそのようなＧＥＮ３プロセスの第２の急速拡大培養の期間が延長される。
[001419] 一部の実施形態において、本発明は、そのような任意のＧＥＮ３プロセスの第１の初回刺激拡大培養における拡大培養のためのＴ細胞の供給源として、小生検、コア生検又は細針吸引を使用するように変更された、ＧＥＮ３プロセスのいずれかの方法により作製されたＴＩＬ集団を提供し、ここで、（１）そのようなＧＥＮ３プロセスの第２の急速拡大培養後に回収されたＴＩＬ集団で所望のＴＩＬ細胞数を達成するために、第１の初回刺激拡大培養の期間が延長されるか、又は（２）第２の急速拡大培養後に回収されたＴＩＬ集団で所望のＴＩＬ細胞数を達成するために、そのようなＧＥＮ３プロセスの第２の急速拡大培養の期間が延長されるか、又は（３）第２の急速拡大培養後に回収されたＴＩＬ集団で所望のＴＩＬ細胞数を達成するために、第１の初回刺激拡大培養の期間が延長され、且つそのようなＧＥＮ３プロセスの第２の急速拡大培養の期間が延長される。
[001420] 特定の理論に限定されるものではないが、ドナーから得られた腫瘍コア又は断片から得られたＴ細胞の活性化を初回刺激する第１の初回刺激拡大培養と、それに続く本発明の一部の方法に記載されているようにＴ細胞の活性化を追加刺激する第２の急速拡大培養は、「より幼若な」表現型を保持する拡大培養されたＴ細胞の調製を可能にすると考えられ、したがって、本発明の拡大培養されたＴ細胞は、他の方法によって拡大培養されたＴ細胞よりも、癌細胞に対してより大きい細胞傷害性を示すことが予想される。特に、本発明の方法によって教示されるように、抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ－３）、ＩＬ－２及び任意選択により抗原提示細胞（ＡＰＣ）への曝露により初回刺激され、次いで、追加的な抗ＣＤ－３抗体（例えば、ＯＫＴ－３）、ＩＬ－２及びＡＰＣへのその後の曝露によって追加刺激される、Ｔ細胞の活性化は、培養中のＴ細胞の成熟を制限又は回避し、成熟度の低い表現型を有するＴ細胞集団を生成し、このＴ細胞は培養物中で拡大培養による枯渇が少なく、癌細胞に対してより高い細胞傷害性を示すと考えられる。したがって、一部の実施形態において、本発明は、（ａ）第１のＴ細胞集団を培養して、増殖をもたらし、第１のＴ細胞集団の活性化を初回刺激することにより、ドナーから得られた腫瘍コア又は断片から得られた第１のＴ細胞集団の第１の初回刺激拡大培養を実施すること；（ｂ）ステップ（ａ）で初回刺激された第１のＴ細胞集団の活性化が減衰し始めた後、第２のＴ細胞集団を得るために、第１のＴ細胞集団を培養して、増殖をもたらし、第１のＴ細胞集団の活性化を追加刺激することにより、第１のＴ細胞集団の第２の急速拡大培養を実施すること；及び（ｃ）第２のＴ細胞集団を回収することを含む、ＴＩＬを拡大培養する方法を提供する。Ｇｅｎ３プロセス、Ｇｅｎ３プロセスからのＴＩＬを使用した処置方法及びＧｅｎ３によって調製されたＴＩＬの組成物は、以下の本明細書及び本出願を通して提供されるように、必要な細胞数を達成するために必要に応じて拡大培養の期間を調整して、小生検／コア生検と併せて使用され得る。
[001421] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養のステップは、（ａ）Ｔ細胞を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ内の小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）小スケール培養物中のＴ細胞を第１の容器よりも大きい第２の容器、例えばG-REX 500MCSコンテナに移し、小スケール培養物からのＴ細胞を、第２の容器内のより大きいスケールの培養物中で、約４～７日間の期間にわたり培養することにより、培養物のスケールアップを達成するために複数のステップに分割される。一部の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（ａ）Ｔ細胞を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、第１の小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）第１の小スケール培養物からのＴ細胞を、サイズが第１の容器と同じである、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することであって、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された第１の小スケール培養物からのＴ細胞の一部は、約４～７日間の期間にわたり、第２の小スケール培養物中で培養されることにより、培養物のスケールアウトを達成するために複数のステップに分割される。一部の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（ａ）Ｔ細胞を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）小スケール培養物からのＴ細胞を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することであって、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された小スケール培養物からのＴ細胞の一部は、約４～７日間の期間にわたり、より大きいスケール培養物中で培養されることにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割される。一部の実施形態において、急速拡大培養のステップは、（ａ）Ｔ細胞を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約４日間の期間にわたり培養することにより、第２の急速拡大培養を実施すること、次いで（ｂ）小スケール培養物からのＴ細胞を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、２、３又は４個の第２の容器に移し、配分することであって、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された小スケール培養物からのＴ細胞の一部は、約５日間の期間にわたり、より大きいスケール培養物中で培養されることにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割される。
[001422] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養によってもたらされるＴ細胞の活性化が減少、減弱、減衰又は鎮静し始めた後、第２の急速拡大培養が実施される。
[001423] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養によってもたらされるＴ細胞の活性化が１若しくは約１、２若しくは約２、３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９、１０若しくは約１０、１１若しくは約１１、１２若しくは約１２、１３若しくは約１３、１４若しくは約１４、１５若しくは約１５、１６若しくは約１６、１７若しくは約１７、１８若しくは約１８、１９若しくは約１９、２０若しくは約２０、２１若しくは約２１、２２若しくは約２２、２３若しくは約２３、２４若しくは約２４、２５若しくは約２５、２６若しくは約２６、２７若しくは約２７、２８若しくは約２８、２９若しくは約２９、３０若しくは約３０、３１若しくは約３１、３２若しくは約３２、３３若しくは約３３、３４若しくは約３４、３５若しくは約３５、３６若しくは約３６、３７若しくは約３７、３８若しくは約３８、３９若しくは約３９、４０若しくは約４０、４１若しくは約４１、４２若しくは約４２、４３若しくは約４３、４４若しくは約４４、４５若しくは約４５、４６若しくは約４６、４７若しくは約４７、４８若しくは約４８、４９若しくは約４９、５０若しくは約５０、５１若しくは約５１、５２若しくは約５２、５３若しくは約５３、５４若しくは約５４、５５若しくは約５５、５６若しくは約５６、５７若しくは約５７、５８若しくは約５８、５９若しくは約５９、６０若しくは約６０、６１若しくは約６１、６２若しくは約６２、６３若しくは約６３、６４若しくは約６４、６５若しくは約６５、６６若しくは約６６、６７若しくは約６７、６８若しくは約６８、６９若しくは約６９、７０若しくは約７０、７１若しくは約７１、７２若しくは約７２、７３若しくは約７３、７４若しくは約７４、７５若しくは約７５、７６若しくは約７６、７７若しくは約７７、７８若しくは約７８、７９若しくは約７９、８０若しくは約８０、８１若しくは約８１、８２若しくは約８２、８３若しくは約８３、８４若しくは約８４、８５若しくは約８５、８６若しくは約８６、８７若しくは約８７、８８若しくは約８８、８９若しくは約８９、９０若しくは約９０、９１若しくは約９１、９２若しくは約９２、９３若しくは約９３、９４若しくは約９４、９５若しくは約９５、９６若しくは約９６、９７若しくは約９７、９８若しくは約９８、９９若しくは約９９又は１００若しくは約１００％減少した後、第２の急速拡大培養が実施される。
[001424] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養によってもたらされるＴ細胞の活性化が１％又は約１％～１００％又は約１００％の範囲のパーセンテージで減少した後、第２の急速拡大培養が実施される。
[001425] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養によってもたらされるＴ細胞の活性化が１％若しくは約１％～１０％若しくは約１０％、１０％若しくは約１０％～２０％若しくは約２０％、２０％若しくは約２０％～３０％若しくは約３０％、３０％若しくは約３０％～４０％若しくは約４０％、４０％若しくは約４０％～５０％若しくは約５０％、５０％若しくは約５０％～６０％若しくは約６０％、６０％若しくは約６０％～７０％若しくは約７０％、７０％若しくは約７０％～８０％若しくは約８０％、８０％若しくは約８０％～９０％若しくは約９０％又は９０％若しくは約９０％～１００％若しくは約１００％の範囲のパーセンテージで減少した後、第２の急速拡大培養が実施される。
[001426] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養によってもたらされるＴ細胞の活性化が、少なくとも１若しくは約１、２若しくは約２、３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９、１０若しくは約１０、１１若しくは約１１、１２若しくは約１２、１３若しくは約１３、１４若しくは約１４、１５若しくは約１５、１６若しくは約１６、１７若しくは約１７、１８若しくは約１８、１９若しくは約１９、２０若しくは約２０、２１若しくは約２１、２２若しくは約２２、２３若しくは約２３、２４若しくは約２４、２５若しくは約２５、２６若しくは約２６、２７若しくは約２７、２８若しくは約２８、２９若しくは約２９、３０若しくは約３０、３１若しくは約３１、３２若しくは約３２、３３若しくは約３３、３４若しくは約３４、３５若しくは約３５、３６若しくは約３６、３７若しくは約３７、３８若しくは約３８、３９若しくは約３９、４０若しくは約４０、４１若しくは約４１、４２若しくは約４２、４３若しくは約４３、４４若しくは約４４、４５若しくは約４５、４６若しくは約４６、４７若しくは約４７、４８若しくは約４８、４９若しくは約４９、５０若しくは約５０、５１若しくは約５１、５２若しくは約５２、５３若しくは約５３、５４若しくは約５４、５５若しくは約５５、５６若しくは約５６、５７若しくは約５７、５８若しくは約５８、５９若しくは約５９、６０若しくは約６０、６１若しくは約６１、６２若しくは約６２、６３若しくは約６３、６４若しくは約６４、６５若しくは約６５、６６若しくは約６６、６７若しくは約６７、６８若しくは約６８、６９若しくは約６９、７０若しくは約７０、７１若しくは約７１、７２若しくは約７２、７３若しくは約７３、７４若しくは約７４、７５若しくは約７５、７６若しくは約７６、７７若しくは約７７、７８若しくは約７８、７９若しくは約７９、８０若しくは約８０、８１若しくは約８１、８２若しくは約８２、８３若しくは約８３、８４若しくは約８４、８５若しくは約８５、８６若しくは約８６、８７若しくは約８７、８８若しくは約８８、８９若しくは約８９、９０若しくは約９０、９１若しくは約９１、９２若しくは約９２、９３若しくは約９３、９４若しくは約９４、９５若しくは約９５、９６若しくは約９６、９７若しくは約９７、９８若しくは約９８又は９９若しくは約９９％減少した後、第２の急速拡大培養が実施される。
[001427] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養によってもたらされるＴ細胞の活性化が最大１若しくは約１、２若しくは約２、３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９、１０若しくは約１０、１１若しくは約１１、１２若しくは約１２、１３若しくは約１３、１４若しくは約１４、１５若しくは約１５、１６若しくは約１６、１７若しくは約１７、１８若しくは約１８、１９若しくは約１９、２０若しくは約２０、２１若しくは約２１、２２若しくは約２２、２３若しくは約２３、２４若しくは約２４、２５若しくは約２５、２６若しくは約２６、２７若しくは約２７、２８若しくは約２８、２９若しくは約２９、３０若しくは約３０、３１若しくは約３１、３２若しくは約３２、３３若しくは約３３、３４若しくは約３４、３５若しくは約３５、３６若しくは約３６、３７若しくは約３７、３８若しくは約３８、３９若しくは約３９、４０若しくは約４０、４１若しくは約４１、４２若しくは約４２、４３若しくは約４３、４４若しくは約４４、４５若しくは約４５、４６若しくは約４６、４７若しくは約４７、４８若しくは約４８、４９若しくは約４９、５０若しくは約５０、５１若しくは約５１、５２若しくは約５２、５３若しくは約５３、５４若しくは約５４、５５若しくは約５５、５６若しくは約５６、５７若しくは約５７、５８若しくは約５８、５９若しくは約５９、６０若しくは約６０、６１若しくは約６１、６２若しくは約６２、６３若しくは約６３、６４若しくは約６４、６５若しくは約６５、６６若しくは約６６、６７若しくは約６７、６８若しくは約６８、６９若しくは約６９、７０若しくは約７０、７１若しくは約７１、７２若しくは約７２、７３若しくは約７３、７４若しくは約７４、７５若しくは約７５、７６若しくは約７６、７７若しくは約７７、７８若しくは約７８、７９若しくは約７９、８０若しくは約８０、８１若しくは約８１、８２若しくは約８２、８３若しくは約８３、８４若しくは約８４、８５若しくは約８５、８６若しくは約８６、８７若しくは約８７、８８若しくは約８８、８９若しくは約８９、９０若しくは約９０、９１若しくは約９１、９２若しくは約９２、９３若しくは約９３、９４若しくは約９４、９５若しくは約９５、９６若しくは約９６、９７若しくは約９７、９８若しくは約９８、９９若しくは約９９又は１００若しくは約１００％減少した後、第２の急速拡大培養が実施される。
[001428] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養によってもたらされるＴ細胞の活性化の減少は、抗原による刺激に応答してＴ細胞によって放出されるインターフェロンガンマの量の減少によって決定される。
[001429] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、最大で７日間又は約７日間の期間中に実施される。
[001430] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、最大で１日間若しくは約１日間、２日間若しくは約２日間、３日間若しくは約３日間、４日間若しくは約４日間、５日間若しくは約５日間、６日間若しくは約６日間又は７日間若しくは約７日間の期間中に実施される。
[001431] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間又は７日間の期間中に実施される。
[001432] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、最大で１１日間又は約１１日間の期間中に実施される。
[001433] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、最大で１日間若しくは約１日間、２日間若しくは約２日間、３日間若しくは約３日間、４日間若しくは約４日間、５日間若しくは約５日間、６日間若しくは約６日間、７日間若しくは約７日間、８日間若しくは約８日間、９日間若しくは約９日間、１０日間若しくは約１０日間又は１１日間若しくは約１１日間の期間中に実施される。
[001434] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間又は１１日間の期間中に実施される。
[001435] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、１日間又は約１日間～７日間又は約７日間の期間中に実施され、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、１日間又は約１日間～１１日間又は約１１日間の期間中に実施される。
[001436] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、最大で１日間若しくは約１日間、２日間若しくは約２日間、３日間若しくは約３日間、４日間若しくは約４日間、５日間若しくは約５日間、６日間若しくは約６日間又は７日間若しくは約７日間の期間中に実施され、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、最大で１日間若しくは約１日間、２日間若しくは約２日間、３日間若しくは約３日間、４日間若しくは約４日間、５日間若しくは約５日間、６日間若しくは約６日間、７日間若しくは約７日間、８日間若しくは約８日間、９日間若しくは約９日間、１０日間若しくは約１０日間又は１１日間若しくは約１１日間の期間中に実施される。
[001437] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、１日間又は約１日間～７日間又は約７日間の期間中に実施され、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、１日間又は約１日間～９日間又は約９日間の期間中に実施される。
[001438] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の第１の初回刺激拡大培養は、７日間の期間中に実施され、Ｔ細胞の第２の急速拡大培養は、９日間の期間中に実施される。
[001439] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
[001440] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は、骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）である。
[001441] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は、癌に罹患しているドナーから得られる。
[001442] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は、癌に罹患している患者の腫瘍から得られるコア生検又は細針吸引から入手されるＴＩＬである。
[001443] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は、血液悪性腫瘍に罹患している患者の骨髄から得られるＭＩＬである。
[001444] 一部の実施形態において、ドナーは癌に罹患している。一部の実施形態において、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、ドナーは腫瘍に罹患している。一部の実施形態において、腫瘍は液性腫瘍である。一部の実施形態において、腫瘍は固形腫瘍である。一部の実施形態において、ドナーは血液悪性腫瘍に罹患している。
[001445] これらの特徴のいくつかを含むプロセス３（本明細書ではＧＥＮ３とも称される）として知られる例示的なＴＩＬプロセスを図１（特に例えば図１Ｂ）に示し、プロセス２Ａに対する本発明の本実施形態の利点のいくつかを、図１、２及び４４（特に例えば図１Ｂ）に示す。プロセス３の２つの実施形態が図１及び４４（特に例えば図１Ｂ）に示される。プロセス２Ａ又はＧｅｎ２は、全体として参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１８／０２８０４３６号にも記載される。Ｇｅｎ３プロセスは、２０１８年１１月５日に提出された米国特許出願第６２／７５５，９５４号（１１６９８３－５０４５－ＰＲ）にも記載される。
[001446] 一般的に本明細書で考察及び概説される通り、ＴＩＬは患者サンプルから採取し、本明細書に記載され、Ｇｅｎ３と称される、ＴＩＬ拡大培養プロセスを使用して操作することにより、患者への移植前にその数が拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択により、以下に考察する通り、遺伝的に操作され得る。一部の実施形態において、ＴＩＬは、拡大培養前又は後に凍結保存され得る。解凍後、ＴＩＬは、患者への注入前に、その代謝を高めるために再刺激され得る。
[001447] 一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察する通り、第１の初回刺激拡大培養（本明細書でプレ急速拡大培養（プレＲＥＰ）と称されるプロセス及び図１（特に例えば図１Ｂ）にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、１～７日間に短縮され、第２の急速拡大培養（本明細書で急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）と称されるプロセス及び図１（特に例えば図１Ｂ）にステップＤとして示されるプロセスを含む）は、１～９日間に短縮される。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＢとして記載される拡大培養）は７日間に短縮され、第２の急速拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＤに記載される拡大培養）は７～９日間である。一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察するように、第１の初回刺激拡大培養及び第２の急速拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＢ及びステップＤとして記載される拡大培養）の組み合わせは、１４～１６日間である。特に、本発明の特定の実施形態は、ＴＩＬがＩＬ－２の存在下での抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ－３への曝露又は少なくともＩＬ－２及び抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ－３の存在下での抗原への曝露により活性化される、第１の初回刺激拡大培養ステップを含むと考えられる。特定の実施形態において、上記の第１の初回刺激拡大培養ステップで活性化されるＴＩＬは、第１のＴＩＬ集団、即ち初代細胞集団である。
[001448] 以下の「ステップ」の名称Ａ、Ｂ、Ｃ等は、図１（特に例えば図１Ｂ）の非限定的な例を参照し、本明細書に記載の特定の非限定的な実施形態を参照している。以下及び図１（特に例えば図１Ｂ）におけるステップの順序は例示であり、ステップの任意の組み合わせ又は順序並びに追加的なステップ、ステップの繰り返し及び／又はステップの省略が、本願及び本明細書に開示される方法によって企図される。
[001449] 一部の実施形態において、腫瘍が転移性であり、過去に原発病変が効率的に処置／除去されている場合、転移性病変の１つの除去が必要になり得る。一部の実施形態において、最も侵襲性の低いアプローチは、利用可能な場合、皮膚病変又は首若しくは腋窩領域のリンパ節を除去することである。一部の実施形態において、皮膚病変が除去されるか、又はその小生検が除去される。一部の実施形態において、リンパ節又はその小生検が除去される。一部の実施形態において、肺若しくは肝臓の転移性病変又は腹腔内若しくは胸部リンパ節又はその小生検を利用することができる。
[001450] 一部の実施形態において、腫瘍は黒色腫である。一部の実施形態において、黒色腫の小生検は、黒子又はその一部を含む。
[001451] 一部の実施形態において、小生検は、パンチ生検である。一部の実施形態において、パンチ生検は、皮膚に押し込まれた円形ブレードを用いて取得される。一部の実施形態において、パンチ生検は、疑わしい黒子の周りの皮膚に押し込まれた円形ブレードを用いて取得される。一部の実施形態において、パンチ生検は、疑わしい黒子の周りの皮膚に押し込まれた円形ブレードを用いて取得され、皮膚の円形片が除去される。一部の実施形態において、小生検は、パンチ生検であり、腫瘍の丸い部分が除去される。
[001452] 一部の実施形態において、小生検は、切除生検である。一部の実施形態において、小生検は切除生検であり、黒子又は腫瘍全体が除去される。一部の実施形態において、小生検は切除生検であり、正常な外観を有する小さい辺縁と共に黒子又は腫瘍全体が除去される。
[001453] 一部の実施形態において、小生検は、切開生検である。一部の実施形態において、小生検は切開生検であり、黒子又は腫瘍の最も不規則な部分のみが採取される。一部の実施形態において、小生検は切開生検であり、切開生検は、疑わしい黒子が非常に大きい場合など、他の技法を完了できない場合に使用される。
[001454] 一部の実施形態において、小生検は、肺生検である。一部の実施形態において、小生検は、気管支鏡により取得される。一般に、気管支鏡では、患者は麻酔下に置かれ、小さいものが鼻又は口を通り、喉を下って気管支に進み、ここで、いくつかの組織を除去するために小さい道具が使用される。一部の実施形態において、気管支鏡を介して腫瘍（tumor）又は腫瘍（growth）に到達できない場合、経胸腔針生検を利用することができる。一般に、経胸腔針生検では、患者も麻酔下にあり、針を皮膚から直接疑わしい箇所に挿入して、組織の小さいサンプルを除去する。一部の実施形態において、経胸腔針生検は、介入的画像診断（例えば、針を誘導するためのＸ線又はＣＴスキャンの使用）を必要とする場合がある。一部の実施形態において、小生検は、針生検により取得される。一部の実施形態において、小生検は、超音波内視鏡（例えば、ライトを備えた内視鏡であり、口を通して食道内に配置される）で取得される。一部の実施形態において、小生検は、外科手術により取得される。
[001455] 一部の実施形態において、小生検は、頭頸部生検である。一部の実施形態において、小生検は、切開生検である。一部の実施形態において、小生検は切開生検であり、組織の小片が異常に見える領域から切り取られる。一部の実施形態において、異常な領域が容易にアクセスされる場合、入院することなくサンプルが採取され得る。一部の実施形態において、腫瘍が口又は喉の内部のより深い位置にある場合、生検は、全身麻酔を伴い、手術室で行われる必要がある場合がある。一部の実施形態において、小生検は、切除生検である。一部の実施形態において、小生検は切除生検であり、領域全体が除去される。一部の実施形態において、小生検は、細針吸引（ＦＮＡ）である。一部の実施形態において、小生検は、細針吸引（ＦＮＡ）であり、腫瘍又はしこりから細胞を抽出（吸引）するために、シリンジに取り付けられた非常に細い針が使用される。一部の実施形態において、小生検は、パンチ生検である。一部の実施形態において、小生検はパンチ生検であり、疑わしい領域の一片を除去するために、パンチ鉗子が使用される。
[001456] 一部の実施形態において、小生検は、子宮頸部生検である。一部の実施形態において、小生検は、コルポスコピーにより取得される。一般に、コルポスコピー法では、拡大双眼鏡に取り付けられた照明付き拡大鏡（コルポスコープ）の使用が採用され、子宮頸部の表面の小さい部分の生検に使用される。一部の実施形態において、小生検は、円錐切除／錐体生検である。一部の実施形態において、小生検は円錐切除／錐体生検であり、子宮頸部からより大きい組織片を除去するために外来手術が必要になる場合がある。一部の実施形態において、コーン生検は、診断の確認を助けることに加えて、コーン生検が初期処置として役立ち得る。
[001457] 「固形腫瘍」という用語は、嚢胞又は液体領域を通常含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。「固形腫瘍癌」という用語は、悪性、新生物性又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、限定はされないが、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌及び膀胱癌など、肉腫、癌腫及びリンパ腫が挙げられる。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（癌細胞）を含む相互依存的組織コンパートメント及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
[001458] 一部の実施形態において、腫瘍からのサンプルは、細針吸引（ＦＮＡ）、コア生検又は小生検（例えば、パンチ生検を含む）として取得される。一部の実施形態において、サンプルは最初にG-Rex 10に入れられる。一部の実施形態において、１つ又は２つのコア生検及び／又は小生検サンプルがある場合、サンプルは最初にG-Rex 10に入れられる。一部の実施形態において、３つ、４つ、５つ、６つ、８つ、９つ若しくは１０個又はそれを超えるコア生検及び／又は小生検サンプルがある場合、サンプルは最初にG-Rex 100に入れられる。一部の実施形態において、３つ、４つ、５つ、６つ、８つ、９つ又は１０個のコア生検及び／又は小生検サンプルがある場合、サンプルは最初にG-Rex 500に入れられる。
[001459] ＦＮＡは、肺、黒色腫、頭頸部、子宮頸部、卵巣、膵臓、神経膠芽腫、結腸直腸及び肉腫からなる群から選択される腫瘍から取得され得る。一部の実施形態において、ＦＮＡは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者からの肺腫瘍などの、肺腫瘍から取得される。一部の場合において、ＮＳＣＬＣを有する患者は、以前に外科的処置を受けたことがある。
[001460] 本明細書に記載されるＴＩＬは、ＦＮＡサンプルから得ることができる。一部の場合において、ＦＮＡサンプルは、１８ゲージ針～２５ゲージ針の範囲のハイゲージの針を使用して患者から取得又は分離される。ハイゲージの針は、１８ゲージ、１９ゲージ、２０ゲージ、２１ゲージ、２２ゲージ、２３ゲージ、２４ゲージ又は２５ゲージであり得る。一部の実施形態において、患者からのＦＮＡサンプルは、少なくとも４００，０００個のＴＩＬ、例えば、４００，０００個のＴＩＬ、４５０，０００個のＴＩＬ、５００，０００個のＴＩＬ、５５０，０００個のＴＩＬ、６００，０００個のＴＩＬ、６５０，０００個のＴＩＬ、７００，０００個のＴＩＬ、７５０，０００個のＴＩＬ、８００，０００個のＴＩＬ、８５０，０００個のＴＩＬ、９００，０００個のＴＩＬ、９５０，０００個のＴＩＬ又はそれを超える数のＴＩＬを含み得る。
[001461] 一部の場合において、本明細書に記載されるＴＩＬは、コア生検サンプルから得られる。一部の場合において、小生検又はコア生検サンプルは、１１ゲージ針～１６ゲージ針の範囲の外科用又は医療用の針を使用して患者から取得又は分離される。針は、１１ゲージ、１２ゲージ、１３ゲージ、１４ゲージ、１５ゲージ又は１６ゲージであり得る。一部の実施形態において、患者からのコア生検サンプルは、少なくとも４００，０００個のＴＩＬ、例えば、４００，０００個のＴＩＬ、４５０，０００個のＴＩＬ、５００，０００個のＴＩＬ、５５０，０００個のＴＩＬ、６００，０００個のＴＩＬ、６５０，０００個のＴＩＬ、７００，０００個のＴＩＬ、７５０，０００個のＴＩＬ、８００，０００個のＴＩＬ、８５０，０００個のＴＩＬ、９００，０００個のＴＩＬ、９５０，０００個のＴＩＬ又はそれを超える数のＴＩＬを含み得る。
[001462] 一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍消化物から入手される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、酵素培地中、例えば限定はされないが、ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭ GlutaMAX、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮアーゼ及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的解離（GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA）によって生成した。腫瘍を酵素培地に置いた後、腫瘍を約１分間機械的に分離し得る。次に溶液を５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、次にそれを再びおよそ１分間機械的に破壊し得る。再び５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍を３度目におよそ１分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、３度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、５％ＣＯ２下３７℃でのさらに３０分間のインキュベーションを伴う又は伴わない１回又は２回の更なる機械的分離をサンプルに適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、フィコールを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
[001463] 一部の実施形態において、第１の拡大培養ステップ前の回収された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に回収された」細胞集団と呼ばれる。
[001464] 一部の実施形態において、細胞は、以下に更に詳細に記載し、図１に例示する、ステップＢに記載の拡大培養に進む前に、任意選択でサンプル回収後に凍結され、凍結貯蔵され得る。
１．ステップＡ：患者の腫瘍サンプルを入手
[001465] 一般に、ＴＩＬは最初にコア生検又は類似の手順で入手された患者腫瘍サンプルから入手され（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためより大きい集団へと拡大培養され、任意選択により凍結保存され、且つ任意選択により表現型及び代謝パラメータにつき評価される。
[001466] 患者腫瘍サンプルは当技術分野において公知の方法を用いて、概して、外科的切除、コア生検、針生検又は腫瘍とＴＩＬ細胞との混合物を含む他のサンプルを入手するための手段によって入手され得る。一般に、腫瘍サンプルは、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含めた任意の固形腫瘍からのものであり得る。一部の実施形態において、サンプルは、複数の小さい腫瘍サンプル又は生検からのものであり得る。一部の実施形態において、サンプルは、同じ患者からの単一の腫瘍からの複数の腫瘍サンプル（複数コアなど）を含み得る。一部の実施形態において、サンプルは、同じ患者からの複数の腫瘍からの１つ、２つ、３つ又は４つの腫瘍サンプル（転移性疾患の複数の病変から得られたコア生検など）を含み得る。一部の実施形態において、サンプルは、同じ患者からの複数の腫瘍からの複数の腫瘍サンプルを含み得る。腫瘍サンプルは、血液悪性腫瘍から入手された腫瘍などの液性腫瘍でもあり得る。固形腫瘍は、限定はされないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌及び皮膚癌（限定はされないが、扁平上皮癌、基底細胞癌及び黒色腫を含む）を含めた任意の癌型のものであり得る。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、膠芽腫（ＧＢＭ）、胃腸癌、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌及び非小細胞肺癌から選択される。一部の実施形態において、有用なＴＩＬは、特に高レベルのＴＩＬを有すると報告されていることに伴い悪性黒色腫腫瘍から入手される。
[001467] 上記のように、一部の実施形態において、ＴＩＬは固形腫瘍コア又は断片から得られる。一部の実施形態において、固形腫瘍コア又は断片は、酵素消化に供される。一部の実施形態において、腫瘍コア又は断片は、コラゲナーゼ、ＤＮアーゼ及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で消化される。一部の実施形態において、腫瘍コア又は断片は、コラゲナーゼ、ＤＮアーゼ及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間にわたり消化される。一部の実施形態において、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮアーゼ及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間にわたり、３７℃、５％ＣＯ２で消化される。一部の実施形態において、腫瘍コア又は断片は、コラゲナーゼ、ＤＮアーゼ及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間にわたり、３７℃、５％ＣＯ２で、回転しながら消化される。一部の実施形態において、腫瘍コア又は断片は、一定の回転で一晩消化される。一部の実施形態において、腫瘍コア又は断片は、一定の回転で、３７℃、５％ＣＯ２で一晩消化される。一部の実施形態において、腫瘍コア又は断片は、酵素と組み合わされて、腫瘍消化反応混合物を形成する。
[001468] 一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍消化物から入手されない。一部の実施形態において、固形腫瘍コアは断片化されていない。
[001469] 一部の実施形態において、腫瘍コア又は断片は、無菌緩衝液中の凍結乾燥酵素で再構成される。一部の実施形態において、緩衝液は無菌ＨＢＳＳである。
[001470] 一部の実施形態において、酵素混合物はコラゲナーゼを含む。一部の実施形態において、コラゲナーゼはコラゲナーゼＩＶである。一部の実施形態において、コラゲナーゼの作業ストックは、１００ｍｇ／ｍＬの１０Ｘ作業ストックである。
[001471] 一部の実施形態において、酵素混合物はＤＮアーゼを含む。一部の実施形態において、ＤＮアーゼの作業ストックは、１０，０００ＩＵ／ｍＬの１０Ｘ作業ストックである。
[001472] 一部の実施形態において、酵素混合物はヒアルロニダーゼを含む。一部の実施形態において、ヒアルロニダーゼの作業ストックは、１０ｍｇ／ｍＬの１０Ｘ作業ストックである。
[001473] 一部の実施形態において、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、１０００ＩＵ／ｍＬのＤＮアーゼ及び１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼを含む。
[001474] 一部の実施形態において、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、５００ＩＵ／ｍＬのＤＮアーゼ及び１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼを含む。
[001475] 一般に、腫瘍コア又は断片から得られた細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に入手した」若しくは「新鮮に分離した」細胞集団と呼ばれる。特定の実施形態において、新鮮に入手したＴＩＬの細胞集団は、抗原提示細胞、ＩＬ－１２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地に曝露される。
[001476] 一部の実施形態において、ＴＩＬは初めに、患者から入手された酵素的腫瘍コア又は断片の消化物及び腫瘍コア又は断片から培養することができる。一実施形態において、ＴＩＬは初めに、患者から入手された酵素的腫瘍コア又は断片の消化物及び腫瘍コア又は断片から培養することができる。
[001477] 一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍断片又はコアの消化物から入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片又はコアの消化物は、酵素培地中、例えば限定はされないが、ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭ GlutaMAX、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮアーゼ及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的解離（GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA）によって生成される。腫瘍断片又はコアを酵素培地に置いた後、腫瘍断片又はコアをおよそ１分間機械的に分離し得る。次に溶液を５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、次にそれを再びおよそ１分間機械的に破壊し得る。再び５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍断片又はコアを３度目におよそ１分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、３度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、５％ＣＯ２下３７℃でのさらに３０分間のインキュベーションを伴う又は伴わない１回又は２回の更なる機械的分離をサンプルに適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、フィコールを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
[001478] 一部の実施形態において、腫瘍が転移性であり、過去に原発病変が効率的に処置／除去されている場合、転移性病変の１つの除去が必要になり得る。一部の実施形態において、最も侵襲性の低いアプローチは、利用可能な場合、皮膚病変又は首若しくは腋窩領域のリンパ節を除去することである。一部の実施形態において、皮膚病変が除去されるか、又はその小生検が除去される。一部の実施形態において、リンパ節又はその小生検が除去される。一部の実施形態において、肺若しくは肝臓の転移性病変又は腹腔内若しくは胸部リンパ節又はその小生検を利用することができる。
[001479] 一部の実施形態において、腫瘍は黒色腫である。一部の実施形態において、黒色腫の小生検は、黒子又はその一部を含む。
[001480] 一部の実施形態において、小生検は、パンチ生検である。一部の実施形態において、パンチ生検は、皮膚に押し込まれた円形ブレードを用いて取得される。一部の実施形態において、パンチ生検は、疑わしい黒子の周りの皮膚に押し込まれた円形ブレードを用いて取得される。一部の実施形態において、パンチ生検は、疑わしい黒子の周りの皮膚に押し込まれた円形ブレードを用いて取得され、皮膚の円形片が除去される。一部の実施形態において、小生検は、パンチ生検であり、腫瘍の丸い部分が除去される。
[001481] 一部の実施形態において、小生検は、切除生検である。一部の実施形態において、小生検は切除生検であり、黒子又は腫瘍全体が除去される。一部の実施形態において、小生検は切除生検であり、正常な外観を有する小さい辺縁と共に黒子又は腫瘍全体が除去される。
[001482] 一部の実施形態において、小生検は、切開生検である。一部の実施形態において、小生検は切開生検であり、黒子又は腫瘍の最も不規則な部分のみが採取される。一部の実施形態において、小生検は切開生検であり、切開生検は、疑わしい黒子が非常に大きい場合など、他の技法を完了できない場合に使用される。
[001483] 一部の実施形態において、小生検は、肺生検である。一部の実施形態において、小生検は、気管支鏡により取得される。一般に、気管支鏡では、患者は麻酔下に置かれ、小さいものが鼻又は口を通り、喉を下って気管支に進み、ここで、いくつかの組織を除去するために小さい道具が使用される。一部の実施形態において、気管支鏡を介して腫瘍（tumor）又は腫瘍（growth）に到達できない場合、経胸腔針生検を利用することができる。一般に、経胸腔針生検では、患者も麻酔下にあり、針を皮膚から直接疑わしい箇所に挿入して、組織の小さいサンプルを除去する。一部の実施形態において、経胸腔針生検は、介入的画像診断（例えば、針を誘導するためのＸ線又はＣＴスキャンの使用）を必要とする場合がある。一部の実施形態において、小生検は、針生検により取得される。一部の実施形態において、小生検は、超音波内視鏡（例えば、ライトを備えた内視鏡であり、口を通して食道内に配置される）で取得される。一部の実施形態において、小生検は、外科手術により取得される。
[001484] 一部の実施形態において、小生検は、頭頸部生検である。一部の実施形態において、小生検は、切開生検である。一部の実施形態において、小生検は切開生検であり、組織の小片が異常に見える領域から切り取られる。一部の実施形態において、異常な領域が容易にアクセスされる場合、入院することなくサンプルが採取され得る。一部の実施形態において、腫瘍が口又は喉の内部のより深い位置にある場合、生検は、全身麻酔を伴い、手術室で行われる必要がある場合がある。一部の実施形態において、小生検は、切除生検である。一部の実施形態において、小生検は切除生検であり、領域全体が除去される。一部の実施形態において、小生検は、細針吸引（ＦＮＡ）である。一部の実施形態において、小生検は、細針吸引（ＦＮＡ）であり、腫瘍又はしこりから細胞を抽出（吸引）するために、シリンジに取り付けられた非常に細い針が使用される。一部の実施形態において、小生検は、パンチ生検である。一部の実施形態において、小生検はパンチ生検であり、疑わしい領域の一片を除去するために、パンチ鉗子が使用される。
[001485] 一部の実施形態において、小生検は、子宮頸部生検である。一部の実施形態において、小生検は、コルポスコピーにより取得される。一般に、コルポスコピー法では、拡大双眼鏡に取り付けられた照明付き拡大鏡（コルポスコープ）の使用が採用され、子宮頸部の表面の小さい部分の生検に使用される。一部の実施形態において、小生検は、円錐切除／錐体生検である。一部の実施形態において、小生検は円錐切除／錐体生検であり、子宮頸部からより大きい組織片を除去するために外来手術が必要になる場合がある。一部の実施形態において、コーン生検は、診断の確認を助けることに加えて、コーン生検が初期処置として役立ち得る。
[001486] 「固形腫瘍」という用語は、嚢胞又は液体領域を通常含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。「固形腫瘍癌」という用語は、悪性、新生物性又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、限定はされないが、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌及び膀胱癌など、肉腫、癌腫及びリンパ腫が挙げられる。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（癌細胞）を含む相互依存的組織コンパートメント及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
[001487] 一部の実施形態において、腫瘍からのサンプルは、細針吸引（ＦＮＡ）、コア生検、小生検（例えば、パンチ生検を含む）として取得される。一部の実施形態において、サンプルは最初にG-Rex 10に入れられる。一部の実施形態において、１つ又は２つのコア生検及び／又は小生検サンプルがある場合、サンプルは最初にG-Rex 10に入れられる。一部の実施形態において、３つ、４つ、５つ、６つ、８つ、９つ又は１０個のコア生検及び／又は小生検サンプルがある場合、サンプルは最初にG-Rex 100に入れられる。一部の実施形態において、３つ、４つ、５つ、６つ、８つ、９つ又は１０個のコア生検及び／又は小生検サンプルがある場合、サンプルは最初にG-Rex 500に入れられる。
[001488] ＦＮＡは、肺、黒色腫、頭頸部、子宮頸部、卵巣、膵臓、神経膠芽腫、結腸直腸及び肉腫。からなる群から選択される腫瘍から取得され得る。一部の実施形態において、ＦＮＡは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者からの肺腫瘍などの、肺腫瘍から取得される。一部の場合において、ＮＳＣＬＣを有する患者は、以前に外科的処置を受けたことがある。
[001489] 本明細書に記載されるＴＩＬは、ＦＮＡサンプルから得ることができる。一部の場合において、ＦＮＡサンプルは、１８ゲージ針～２５ゲージ針の範囲のハイゲージの針を使用して患者から取得又は分離される。ハイゲージの針は、１８ゲージ、１９ゲージ、２０ゲージ、２１ゲージ、２２ゲージ、２３ゲージ、２４ゲージ又は２５ゲージであり得る。一部の実施形態において、患者からのＦＮＡサンプルは、少なくとも４００，０００個のＴＩＬ、例えば、４００，０００個のＴＩＬ、４５０，０００個のＴＩＬ、５００，０００個のＴＩＬ、５５０，０００個のＴＩＬ、６００，０００個のＴＩＬ、６５０，０００個のＴＩＬ、７００，０００個のＴＩＬ、７５０，０００個のＴＩＬ、８００，０００個のＴＩＬ、８５０，０００個のＴＩＬ、９００，０００個のＴＩＬ、９５０，０００個のＴＩＬ又はそれを超える数のＴＩＬを含み得る。
[001490] 一部の場合において、本明細書に記載されるＴＩＬは、コア生検サンプルから得られる。一部の場合において、コア生検又は小生検サンプルは、１１ゲージ針～１６ゲージ針の範囲の外科用又は医療用の針を使用して患者から取得又は分離される。針は、１１ゲージ、１２ゲージ、１３ゲージ、１４ゲージ、１５ゲージ又は１６ゲージであり得る。一部の実施形態において、患者からのコア生検サンプルは、少なくとも４００，０００個のＴＩＬ、例えば、４００，０００個のＴＩＬ、４５０，０００個のＴＩＬ、５００，０００個のＴＩＬ、５５０，０００個のＴＩＬ、６００，０００個のＴＩＬ、６５０，０００個のＴＩＬ、７００，０００個のＴＩＬ、７５０，０００個のＴＩＬ、８００，０００個のＴＩＬ、８５０，０００個のＴＩＬ、９００，０００個のＴＩＬ、９５０，０００個のＴＩＬ又はそれを超える数のＴＩＬを含み得る。
[001491] 一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍コア又は断片の消化物から入手される。一部の実施形態において、腫瘍コア又は断片の消化物は、酵素培地中、例えば限定はされないが、ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭ GlutaMAX、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮアーゼ及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的解離（GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA）によって生成した。腫瘍コア又は断片を酵素培地に置いた後、腫瘍を約１分間機械的に分離し得る。次に溶液を５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、次にそれを再びおよそ１分間機械的に破壊し得る。再び５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍コア又は断片を、３度目におよそ１分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、３度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、５％ＣＯ２下３７℃でのさらに３０分間のインキュベーションを伴う又は伴わない１回又は２回の更なる機械的分離をサンプルに適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、フィコールを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
[001492] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養ステップ前の細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に入手した」若しくは「新鮮に分離した」細胞集団と呼ばれる。
[001493] 一部の実施形態において、細胞は、以下にさらに詳細に記載し、図１（特に例えば図１Ｂ）に例示する、ステップＢに記載の拡大培養に進む前に、任意選択によりサンプル分離後（例えば、腫瘍サンプルを取得した後及び／又は腫瘍サンプルから細胞懸濁液を取得した後）に凍結され、凍結貯蔵され得る。
２．ステップ：Ｂ第１の初回刺激拡大培養
[001494] 一部の実施形態において、本方法は、より幼若なＴＩＬを提供し、これは、より成熟したＴＩＬ（即ち対象／患者への投与前にさらに多くの回数の複製を受けたＴＩＬ）を超える追加的な治療上の利点を提供し得る。溶着ＴＩＬの特徴が、文献に記載されている。例えば、Donia, et al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012)、Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)、Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005)、Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013)、Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009)、Robbins, et al., J Immunol 2004; 173:7125-7130、Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)、Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005)及びTran, et al., J Immunother, 31:742751 (2008)であり、これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される。
[001495] 腫瘍断片及び／又は腫瘍コアの生検又は消化後、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＡに記載されたように、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びフィーダー細胞（例えば、抗原提示フィーダー細胞）において培養される。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びフィーダー細胞は、腫瘍断片若しくはコア消化物及び／又は腫瘍断片若しくはコアと共に培養開始時に（例えば、０日目に）添加される。一部の実施形態において、腫瘍断片若しくはコア消化物及び／又は腫瘍断片若しくはコアは、１容器あたり最大６０個の断片又はコア及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と共に容器中でインキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して１～７日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養は、１～７日の期間にわたって起こり、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この第１の初回刺激拡大培養は、５～７日の期間にわたって起こり、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この第１の初回刺激拡大培養は、約６～７日の期間にわたって起こり、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この第１の初回刺激拡大培養は、約７日の期間にわたって起こり、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。
[001496] 好ましい実施形態において、以下及び本明細書で説明するように、第１の初回刺激拡大培養ステップ（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称され、０日目及び／又は培養開始からフィーダー細胞を含有するプロセスを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＢで説明したものなど）、その後の、以下ステップＤの下及び本明細書に記載されているように、第２の急速拡大培養（ステップＤ、急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるプロセスを含む）、その後の任意選択の凍結保存及びその後の第２ステップＤ（再刺激ＲＥＰステップと称されるプロセスを含む）を使用してＴＩＬの拡大培養を実施することができる。このプロセスによって入手したＴＩＬは、任意選択により、本明細書に記載される通り表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられ得る。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３～１０ｍｍ３である。
[001497] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、ステップＢのＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス及び１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ １６４０からなる。
[001498] 一部の実施形態において、２４０個以下の腫瘍断片又はコアが存在する。一部の実施形態において、４つ以下の容器に入れられた２４０個以下の腫瘍断片又はコアが存在する。一部の実施形態において、容器はGREX100 MCSフラスコである。一部の実施形態において、６０個以下の腫瘍断片又はコアが１つの容器に入れられる。一部の実施形態において、各容器は、１容器あたり５００ｍＬ以下の培地を含む。一部の実施形態において、培地はＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、培地は６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、培地は、抗原提示フィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり２．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地はＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、容器はGREX100 MCSフラスコである。一部の実施形態において、培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。
[001499] 腫瘍断片又はコアの調製後、得られた細胞（即ち断片又はコアから得られ、初代細胞集団を構成する）は、ＩＬ－２、抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３を含有する培地において、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの増殖に有利であり、ＴＩＬ初回刺激及び０日目の培養開始からの増殖の加速を可能にする条件下で培養される。一部の実施形態において、腫瘍断片若しくはコア消化物及び／又は腫瘍断片若しくはコアは、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２並びに抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３と共にインキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して１～７日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養の間の成長培地はＩＬ－２又はその変異体並びに抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－２は組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）である。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２０～３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２５×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は４～８×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は５～７×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は６×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は実施例５に記載される通り調製される。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２又は約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２を更に含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地はＩＬ－２をさらに含む。好ましい一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
[001500] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地はＩＬ－１５をさらに含む。好ましい一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
[001501] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２１をさらに含む。好ましい一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
[001502] 一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地はＯＫＴ－３抗体を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１５ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一部の実施形態において、ＯＫＴ－３抗体はムロモナブである。
[001503] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質並びにその断片、誘導体、変異体、バイオシミラー及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
[001504] 一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地は、初期濃度約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体をさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、第１の初回刺激拡大培養細胞培養培地は、初期濃度約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体をさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。
[001505] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、これはＣＭ１（培養培地１）と称される。一部の実施形態において、ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス及び１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ １６４０からなる。一部の実施形態において、ＣＭは、実施例に記載されるＣＭ１であり、実施例１及び１４を参照のこと。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養は初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地中で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養培地又は初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示フィーダー細胞（フィーダー細胞とも称される）を含む。
[001506] 一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは１～７日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは２～７日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは３～７日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは４～７日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは５～７日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは６～７日間である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養（例えば、プレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＢに提供されるプロセスなどを含む）プロセスは７日間である。
[001507] 一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、２日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、３日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、４日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、５日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、６日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１日間～１０日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、２日間～１０日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、３日間～１０日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、４日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、５日間～１０日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、６日間～１０日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、９日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１０日間続行され得る。一部の実施形態において、小生検（例えば、コア生検）は、約１、２又は３日目に培養物から取り出される。一部の実施形態において、小生検（例えば、コア生検）は３日目に培養物から取り出される。
[001508] 一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養物に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、８日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養物に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、９日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養物に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１０日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養物に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１１日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養物に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１２日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養物に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１３日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養物に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１４日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養物に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１５日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の初回刺激ＴＩＬ拡大培養は、腫瘍コア又は断片が細胞培養物に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１６日間～１７日間続行され得る。
[001509] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第１の初回刺激拡大培養は１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間又は１０日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は３日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は４日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は５日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は６日間～７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１日間～１０日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日間～１０日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は３日間～１０日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は４日間～１０日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は５日間～１０日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は６日間～１０日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は７日間～１０日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は８日間～１０日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は９日間～１０日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は８日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は９日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１０日間続行され得る。
[001510] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第１の初回刺激拡大培養は８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間又は１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は８日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は９日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１０日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１１日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１２日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１３日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１４日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１５日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１６日間～１７日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１７日間続行され得る。
[001511] 一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１の組み合わせが、第１の初回刺激拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）による且つ本明細書に記載されている通り、ステップＢプロセス中を含む、第１の初回刺激拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の組み合わせが、第１の初回刺激拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）による且つ本明細書に記載されている通りステップＢプロセス中に含められ得る。
[001512] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）によるステップＢは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが容器として用いられる。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-100である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-10である。
[001513] 一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＢに記載された拡大培養並びにプレＲＥＰ又は初回刺激ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＴＩＬ拡大培養の開始時及び第１の初回刺激拡大培養中に、フィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、同種異系健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。一部の実施形態において、２．５×１０８個のフィーダー細胞が第１の初回刺激拡大培養中に用いられる。一部の実施形態において、１容器あたり２．５×１０８個のフィーダー細胞が第１の初回刺激拡大培養中に用いられる。一部の実施形態において、GREX-10あたり２．５×１０８個のフィーダー細胞が第１の初回刺激拡大培養中に用いられる。一部の実施形態において、GREX-100あたり２．５×１０８個のフィーダー細胞が第１の初回刺激拡大培養中に用いられる。
[001514] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかにより不活性化され、同種異系ＰＢＭＣの複製能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用される。
[001515] 一部の実施形態において、１４日目の生細胞の総数が、第１の初回刺激拡大培養の０日目に培養物に入れられた初期生細胞数より少ない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。
[001516] 一部の実施形態において、７日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、第１の初回刺激拡大培養の０日目に培養物に入れられた初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
[001517] 一部の実施形態において、７日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、第１の初回刺激拡大培養の０日目に培養物に入れられた初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、５～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１０～５０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２０～４０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２５～３５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
[001518] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞はＰＢＭＣである。一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は人工抗原提示フィーダー細胞である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は、約１対２５、約１対５０、約１対１００、約１対１２５、約１対１５０、約１対１７５、約１対２００、約１対２２５、約１対２５０、約１対２７５、約１対３００、約１対３２５、約１対３５０、約１対３７５、約１対４００又は約１対５００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対５０～１対３００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対１００～１対２００である。
[001519] 一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順は、約２．５×１０８個のフィーダー細胞と約１００×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順は、約２．５×１０８個のフィーダー細胞と約５０×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。さらに別の実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養は、約２．５×１０８個のフィーダー細胞と約２５×１０６個のＴＩＬを必要とする。さらに別の実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養は、約２．５×１０８個のフィーダー細胞を必要とする。さらに別の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養は、第２の急速拡大培養で使用されるフィーダー細胞の数の４分の１、３分の１、１２分の５又は半分を必要とする。
[001520] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養における培地は、ＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養における培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養における培地は、抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養における培地は、１容器あたり２．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養における培地は、ＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり３０ｎｇのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、容器はGREX100 MCSフラスコである。一部の実施形態において、培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞あたり、５００ｍＬの培養培地及び１５ｕｇのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり５００ｍＬの培養培地及び１５ｕｇのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、容器はGREX100 MCSフラスコである。一部の実施形態において、培地は、５００ｍＬの培養培地及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３及び２．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり、５００ｍＬの培養培地及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、１５ｕｇのＯＫＴ－３及び２．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞あたり、５００ｍＬの培養培地及び１５ｕｇのＯＫＴ－３を含む。
[001521] 一実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養手順は、第２の拡大培養中に、ＴＩＬに対して過剰量のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、同種異系健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。一実施形態において、ＰＢＭＣの代わりに人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が使用される。
[001522] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載された例示的な手順を含む、本明細書に記載されたＴＩＬ拡大培養手順で使用される。
[001523] 一実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替として又はそれと組み合わせて、第１の初回刺激拡大培養で使用される。
[001524] 本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。
[001525] 代わりに、ＴＩＬの第１の初回刺激拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することがさらに可能であり、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の２つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（参照により全体として明示的に本明細書に援用される）に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－２とＩＬ－２１、ＩＬ－１５とＩＬ－２１及びＩＬ－２とＩＬ－１５とＩＬ－２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
３．ステップＣ：第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行
[001526] 一部の場合において、例えば、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に示されるステップＢから得られる、ＴＩＬ集団を含む、第１の初回刺激拡大培養から得られたバルクＴＩＬ集団（プレＲＥＰと称されることがある拡大培養を含み得る）は、第２の急速拡大培養（急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）と称されることがある拡大培養を含み得る）に供し、その後、以下で考察するように凍結保存することができる。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬが治療に使用される場合、初回刺激拡大培養からの拡大培養されたＴＩＬ集団又は第２の急速拡大培養からの拡大培養されたＴＩＬ集団は、拡大培養ステップ前又は第１の初回刺激拡大培養後且つ第２の急速拡大培養前に、適切な処置のために遺伝子修飾に供され得る。
[001527] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）に示される通りのステップＢから）入手されたＴＩＬは、選択のためのフェノタイピングまで貯蔵される。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）に示される通りのステップＢから）入手されたＴＩＬは貯蔵されず、第２の急速拡大培養に直接進む。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から入手されたＴＩＬは、第１の初回刺激拡大培養後、第２の急速拡大培養前に凍結保存されない。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、腫瘍コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約２日、３日、４日、５日、６日又は７日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約３日～７日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約４日～７日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約５日～７日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約６日～７日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、約７日の時点で行われる。
[001528] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日、最大１０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、１日～７日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、２日～７日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の拡大培養への移行は、コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、３日～７日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、４日～７日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、５日～７日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、６日～７日で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、コア又は断片が細胞培養培地に添加されたとき及び／又は第１の初回刺激拡大培養ステップが開始されたときから、７日で行われる。
[001529] 一部の実施形態において、ＴＩＬは第１の初回刺激拡大培養後、第２の急速拡大培養前に貯蔵されず、ＴＩＬは第２の急速拡大培養に直接進む（例えば、一部の実施形態において、図１（特に例えば図１Ｂ）に示すように、ステップＢからステップＤへの移行中に貯蔵は行われない）。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、移行は閉鎖系で行われる。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養からのＴＩＬは、第２のＴＩＬ集団からのＴＩＬであり、移行期間を伴わず第２の急速拡大培養に直接進む。
[001530] 一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）によるステップＣは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養から第２の急速拡大培養への移行は、容器サイズのスケールアップを伴う。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養は、第２の急速拡大培養よりも小さい容器で実施される。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養はGREX-100で実施され、第２の急速拡大培養はGREX-500で実施される。
４．ステップＤ：第２の急速拡大培養
[001531] 一部の実施形態において、ＴＩＬ細胞集団は、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）に示されるように、ステップＡ及びステップＢ並びにステップＣと称される移行後、回収及び第１の初回刺激拡大培養後、数がさらに増加する。この更なる増加は、本明細書では第２の急速拡大培養と称され、これは、当技術分野で一般に急速拡大培養法と称される拡大培養プロセス（急速拡大培養プロトコル又はＲＥＰ並びに図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＤに示されるプロセス）を含み得る。第２の急速拡大培養は、概して、フィーダー細胞、サイトカイン源及び抗ＣＤ３抗体を含め、幾つもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養の開始後１日、２日、３日又は４日（即ちＧｅｎ３プロセス全体の８、９、１０又は１１日目）で、ＴＩＬは、より大きい容量の容器に移される。
[001532] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の急速拡大培養（これはＲＥＰと称されることもある拡大培養；並びに図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＤに示されるプロセスを含み得る）は、当業者に公知の任意のＴＩＬフラスコ又は容器を使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間又は９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約１日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約２日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約３日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約４日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約５日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約６日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約７日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約７日間～約１０日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約１日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約２日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約３日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約５日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約６日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約７日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約８日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の急速拡大培養の開始後、約１０日間続行し得る。
[001533] 一実施形態において、第２の急速拡大培養は、本開示の方法（例えば、ＲＥＰと称される膨張並びに図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＤに示されるプロセスを含む）を使用して、ガス透過性容器内で実施することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）の存在下で、第２の急速拡大培養で拡大培養される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びフィーダー細胞の存在下で、第２の急速拡大培養で拡大培養され、ここで、フィーダー細胞は、第１の初回刺激拡大培養で存在するフィーダー細胞の濃度の２倍、２．４倍、２．５倍、３倍、３．５倍又は４倍である最終濃度まで添加される。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）又はインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて急速に拡大培養することができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激としては、例えば、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）又はＵＨＣＴ－１（BioLegend、San Diego, CA, USAから市販されている）を挙げることができる。ＴＩＬは、任意選択により３００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２又はＩＬ－１５など、Ｔ細胞成長因子の存在下で、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば、０．３μΜ ＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）又はｇｐｌ ００：２０９－２１７（２１０Ｍ）など、任意選択によりベクターから発現させることのできる、１つ又は複数のエピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の１つ以上の抗原を第２の拡大培養中に含めることにより、インビトロでのＴＩＬの更なる刺激を誘発するように拡大培養することができる。他の好適な抗原としては、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２及びＶＥＧＦＲ２又はその抗原性部分を挙げることができる。ＴＩＬは、ＨＬＡ－Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ１つ又は複数の抗原による再刺激によっても急速に拡大培養し得る。代わりに、ＴＩＬは、例えば照射自己リンパ球によるか、又は照射ＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２によってさらに再刺激することができる。一部の実施形態において、再刺激は、第２の拡大培養の一部として生じる。一部の実施形態において、照射された自己リンパ球の存在下において又は照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２と共に第２の拡大培養が発生する。
[001534] 一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ又は８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
[001535] 一実施形態において、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、３０ｎｇ／ｍｌ～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含む。一実施形態において、細胞培養培地は約６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、ＯＫＴ－３抗体はムロモナブである。
[001536] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、ＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、培地は６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、１容器あたり７．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、ＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養培地は、１容器あたり５００ｍＬの培養培地及び３０ｕｇのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、容器はGREX100 MCSフラスコである。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３及び７．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり、５００ｍＬの培養培地及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｕｇのＯＫＴ－３及び７．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。
[001537] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、ＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、培地は６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり５×１０８～７．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、ＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、１容器あたり５００ｍＬの培養培地及び３０μｇのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、容器はGREX100 MCSフラスコである。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３及び５×１０８～７．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養における培地は、１容器あたり、５００ｍＬの培養培地及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０μｇのＯＫＴ－３及び５×１０８～７．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。
[001538] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質並びにその断片、誘導体、変異体、バイオシミラー及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
[001539] 一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、細胞培養培地は、初期濃度約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体をさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。
[001540] 一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）による且つ本明細書に記載されている通り、ステップＤプロセス中を含む、第２の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）による且つ本明細書に記載されている通り、ステップＤプロセス中に含められ得る。
[001541] 一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、抗原提示フィーダー細胞及び任意選択によりＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む添加細胞培養培地で実施され得る。一部の実施形態において、第２の拡大培養は補充細胞培養培地で行われる。一部の実施形態において、補充細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ；抗原提示フィーダー細胞とも称される）を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示フィーダー細胞で生じる（即ち抗原提示細胞）。
[001542] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－１５をさらに含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
[001543] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２１をさらに含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
[001544] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣである。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣ及び／又は抗原提示細胞との比は、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：２５、約１：３０、約１：３５、約１：４０、約１：４５、約１：５０、約１：７５、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００又は約１：５００である。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：５０～１：３００である。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：１００～１：２００である。
[001545] 一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の急速拡大培養は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞（ここで、フィーダー細胞の濃度は、第１の初回刺激拡大培養におけるフィーダー細胞濃度の少なくとも１．１倍（１．１Ｘ）、１．２Ｘ、１．３Ｘ、１．４Ｘ、１．５Ｘ、１．６Ｘ、１．７Ｘ、１．８Ｘ、１．８Ｘ、２Ｘ、２．１Ｘ２．２Ｘ、２．３Ｘ、２．４Ｘ、２．５Ｘ、２．６Ｘ、２．７Ｘ、２．８Ｘ、２．９Ｘ、３．０Ｘ、３．１Ｘ、３．２Ｘ、３．３Ｘ、３．４Ｘ、３．５Ｘ、３．６Ｘ、３．７Ｘ、３．８Ｘ、３．９Ｘ又は４．０Ｘ）、３０ｍｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバーに移すまで培地補充が行われる（一般的に、使用済み培地の２／３の吸引及び等しい体積の新鮮培地での置換による、２／３の培地補充）。別の成長チャンバーには、以下にさらに十分に考察する通りのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[001546] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養（ＲＥＰプロセスと称されるプロセスを含み得る）は、実施例及び図で考察されるように、７～１０日間である。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養（ＲＥＰプロセスと称されるプロセスを含み得る）は、実施例及び図で考察されるように、７～９日間である。一部の実施形態において、第２の拡大培養は７日間である。一部の実施形態において、第２の拡大培養は８日間である。一部の実施形態において、第２の拡大培養は９日間である。一部の実施形態において、第２の拡大培養は１０日間である。
[001547] 一実施形態において、第２の拡大培養（これはＲＥＰと称される拡大培養；並びに図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＤに参照されるものを含み得る）は、１００ｃｍガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量ガス透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USAから市販されている）において実施され得、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を補充した４００ｍＬの５０／５０培地中で５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬをＰＢＭＣと培養し得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。５日目、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心し得る。５％ヒトＡＢ血清、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のGREX-100フラスコに戻し加え得る。GREX-100フラスコでＴＩＬを連続的に拡大培養する場合、１０又は１１日目に、ＴＩＬは、GREX-500などのより大きいフラスコに移動され得る。細胞は培養１４日目に回収し得る。細胞は培養１５日目に回収し得る。細胞は培養１６日目に回収し得る。一部の実施形態において、細胞が別の成長チャンバーに移されるまで培地交換が行われる。一部の実施形態において、培地の２／３は、使用済み培地の吸引及び等しい体積の新鮮培地での置換によって置き換えられる。一部の実施形態において、別の成長チャンバーには、以下にさらに十分に考察する通りのGREXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[001548] 一実施形態において、第２の急速拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）が実施され、これは優れた腫瘍応答性に関してＴＩＬを選択するステップをさらに含む。当技術分野において公知の任意の選択方法を用いることができる。例えば、その開示が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号に記載されている方法は、優れた腫瘍反応性に関するＴＩＬの選択に使用され得る。
[001549] 任意選択で、第２の急速拡大培養（ＲＥＰ拡大培養と称される拡大培養を含む）後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。一部の実施形態において、Cellometer K2自動セルカウンター（Nexcelom Bioscience、Lawrence, MA）を使用してＴＩＬサンプルを計数し、生存率を決定することができる。一部の実施形態において、生存率は、標準的なCellometer K2 Image Cytometer自動細胞カウンタープロトコルに従い決定される。
[001550] Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）及びＣ（定数）の遺伝子セグメントは、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第２の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性はＴ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（即ちＴＣＲα／β）の発現が増加する。
[001551] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下でさらに詳細に考察する通り、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３並びに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下で更に詳細に考察する通り、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０μｇ／フラスコのＯＫＴ－３並びに７．５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下でさらに詳細に考察する通り、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３並びに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。一部の実施形態において、第２の急速拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下で更に詳細に考察する通り、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０μｇ／フラスコのＯＫＴ－３並びに５×１０８個の抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。
[001552] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが容器として用いられる。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、例えば、G-REX-100又はG-REX-500である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-100である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-500である。
[001553] 一実施形態において、本明細書に記載の第２の急速拡大培養手順（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＤに記載された拡大培養並びにＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＲＥＰ ＴＩＬ拡大培養中及び／又は第２の急速拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。
[001554] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかにより不活性化され、同種異系ＰＢＭＣの複製能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用される。
[001555] 一部の実施形態において、７又は１４日目の生細胞の総数がＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目に培養（即ち第２の拡大培養の開始日）に移行した初期生細胞数より少ない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が許容可能である。
[001556] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められ得る。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
[001557] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められ得る。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
[001558] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞はＰＢＭＣである。一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は人工抗原提示フィーダー細胞である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は、約１対１０、約１対２５、約１対５０、約１対１００、約１対１２５、約１対１５０、約１対１７５、約１対２００、約１対２２５、約１対２５０、約１対２７５、約１対３００、約１対３２５、約１対３５０、約１対３７５、約１対４００又は約１対５００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対５０～１対３００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対１００～１対２００である。
[001559] 一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約５×１０８個のフィーダー細胞と約１００×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約７．５×１０８個のフィーダー細胞と約１００×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約５×１０８個のフィーダー細胞と約５０×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約７．５×１０８個のフィーダー細胞と約５０×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。さらに別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約５×１０８個のフィーダー細胞から約２５×１０６個のＴＩＬを必要とする。さらに別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約７．５×１０８個のフィーダー細胞と約２５×１０６個のＴＩＬを必要とする。さらに別の実施形態において、第２の急速拡大培養は、第２の急速拡大培養の２倍の数のフィーダー細胞を必要とする。さらに別の実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養が約２．５×１０８個のフィーダー細胞を必要とする場合、第２の急速拡大培養は、約５×１０８個のフィーダー細胞を必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第１の初回刺激拡大培養が約２．５×１０８個のフィーダー細胞を必要とする場合、第２の急速拡大培養は、約７．５×１０８個のフィーダー細胞を必要とする。更に別の実施形態において、第２の急速拡大培養は、第１の初回刺激拡大培養の２倍（２．０Ｘ）、２．５Ｘ、３．０Ｘ、３．５Ｘ又は４．０Ｘの数のフィーダー細胞を必要とする。
[001560] 一実施形態において、本明細書に記載の第２の急速拡大培養手順は、第２の急速拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、同種異系健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。一実施形態において、ＰＢＭＣの代わりに人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が使用される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、第１の初回刺激拡大培養に添加されたＰＢＭＣの濃度の２倍で第２の急速拡大培養に添加される。
[001561] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載された例示的な手順を含む、本明細書に記載されたＴＩＬ拡大培養手順で使用される。
[001562] 一実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替として又はそれと組み合わせて、第２の急速拡大培養で使用される。
[001563] 本明細書に記載の第２の急速拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。
[001564] 代わりに、ＴＩＬの第２の急速拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することがさらに可能であり、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の２つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（参照により全体として明示的に本明細書に援用される）に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－２とＩＬ－２１、ＩＬ－１５とＩＬ－２１及びＩＬ－２とＩＬ－１５とＩＬ－２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
５．ステップＥ：ＴＩＬの回収
[001565] 第２の急速拡大培養ステップ後、細胞は回収することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）に提供される通り、１、２、３、４回又はそれ以上の拡大培養ステップ後に回収される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）に提供される通り、２つの拡大培養ステップ後に回収される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）に提供される通り、２つの拡大培養ステップ（１つの第１の初回刺激拡大培養及び１つの第２の急速拡大培養）後に回収される。
[001566] ＴＩＬは、例えば遠心によることを含め、任意の適切な且つ無菌の方法で回収することができる。ＴＩＬ回収方法は当技術分野において周知であり、本プロセスと共に任意のかかる公知の方法を用いることができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは自動化系を使用して回収される。
[001567] セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、例えば、Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及びInotech Biosystems International, Inc.を含む様々な供給源から市販されている。任意の細胞ベースのハーベスターを本方法で使用することができる。一部の実施形態において、セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、膜ベースの細胞ハーベスターである。一部の実施形態において、細胞回収は、LOVO系（Fresenius Kabi製）などの細胞処理系を介して行われる。用語「LOVO細胞処理系」は、滅菌及び／又は閉鎖系環境で、回転膜又は回転フィルターなどの膜又はフィルターを通して細胞を含む溶液を送り出すことができ、ペレット化せず上清又は細胞培養培地を除去する連続フロー及び細胞処理を可能にする、あらゆる販売業者によって製造された機器又は装置も指す。一部の実施形態において、セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、閉鎖、無菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮及び／又は他の細胞処理ステップを実施することができる。
[001568] 一部の実施形態において、第２の急速拡大培養、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが容器として用いられる。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、例えば、G-REX-100又はG-REX-500である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-100である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-500である。
[001569] 一部の実施形態において、図１（特に例えば図１Ｂ）によるステップＥは、本明細書に記載のプロセスに従って実施される。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような閉鎖系が使用される。
[001570] 一部の実施形態において、本明細書に記載された方法に従ってＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような方法を使用して、１４日目と１６日目の間のＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような方法を使用して、１４日目にＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような方法を使用して、１５日目にＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような方法を使用して、１６日目にＴＩＬが回収される。
６．ステップＦ：最終的な製剤化／輸注バッグへの移動
[001571] 図１（特に例えば図１Ｂ）に例示的順序で提供される通りの、且つ上記及び本明細書に詳細に概説される通りのステップＡ～Ｅが完了した後、細胞は患者への投与における使用のため容器に移される。一部の実施形態において、上記に記載される拡大培養方法を用いて治療上十分な数のＴＩＬが入手されると、ＴＩＬは患者への投与における使用のため容器に移される。
[001572] 一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養したＴＩＬは医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本明細書に開示されるように拡大培養したＴＩＬは、当技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、ＴＩＬは単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくはおよそ３０～６０分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内及びリンパ内が挙げられる。
[001573] 一実施形態において、前述の開示のプロセスを使用して拡大培養されたＴＩＬは、凍結保存剤を更に含む組成物として投与され得る。一実施形態において、前述の開示のプロセスを使用して拡大培養されたＴＩＬは、凍結保存剤及び等張剤を更に含む組成物として投与され得る。一実施形態において、前述の開示のプロセスを使用して拡大培養されたＴＩＬは、ジメチルスルホキシドを含む凍結保存剤並びに塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムを含む等張剤を更に含む組成物として投与され得る。一実施形態において、前述の開示のプロセスを使用して拡大培養されたＴＩＬは、ジメチルスルホキシド及びデキストラン４０を含む凍結保存剤並びに塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムを含む等張剤を更に含む組成物として投与され得る。一実施形態において、前述の開示のプロセスを使用して拡大培養されたＴＩＬは、滅菌輸注バッグで送達される組成物として投与され得、そのような組成物は、ジメチルスルホキシド及びデキストラン４０を含む凍結保存剤並びに塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムを含む等張剤を更に含む。
Ｄ．選択方法
１．ＰＤ－１のプレ拡大培養選択
[001574] 本発明の方法によれば、ＴＩＬは、第１の初回刺激拡大培養前に、ＰＤ－１陽性（ＰＤ－１＋）であるように前選択される。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養における使用のためのＴＩＬは、ＰＤ－１陽性（ＰＤ－１＋）である。一部の実施形態において、第１の初回刺激拡大培養における使用のためのＴＩＬは、少なくとも７５％ＰＤ－１陽性、少なくとも８０％ＰＤ－１陽性、少なくとも８５％ＰＤ－１陽性、少なくとも９０％ＰＤ－１陽性、少なくとも９５％ＰＤ－１陽性、少なくとも９８％ＰＤ－１陽性又は少なくとも９９％ＰＤ－１陽性である。
[001575] 一部の実施形態において、ＰＤ－１陽性ＴＩＬの前選択は、初代細胞集団ＴＩＬを抗ＰＤ－１抗体で染色することによって実施される。一部の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ポリクローナル抗体、例えば、マウス抗ヒトＰＤ－１ポリクローナル抗体、ヤギ抗ヒトＰＤ－１ポリクローナル抗体などである。一部の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、例えば、限定されないが、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、Bristol-Myers Squibb；Opdivo（登録商標））、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５又はＭＫ－３４７５、Merck；Keytruda（登録商標））、イピリムマブ（Yervoy（登録商標））、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＪＳ００１（ShangHai JunShi）、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体ＴＳＲ－０４２（Tesaro, Inc.）、ピディリズマブ（抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＣＴ－０１１、Medivation）、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ＢＧＢ－Ａ３１７（BeiGene）及び／又は抗ＰＤ－１抗体ＳＨＲ－１２１０（ShangHai HengRui）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Regeneron）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ－１１０６（Bristol-Myers Squibb）及び／又はヒト化抗ＰＤ１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Novartis）を含む。一部の実施形態において、ＰＤ－１抗体は、クローン：ＲＭＰ１－１４（ラットＩｇＧ）－BioXcellカタログ番号ＢＰ０１４６からのものである。本明細書に記載されるように、ステップＡからＦによって例示される、本発明の方法に従うＴＩＬの拡大培養における使用のためのＰＤ－１陽性ＴＩＬの前選択における使用のための他の適切な抗体は、参照により本明細書に援用される米国特許第８，００８，４４９号に開示される抗ＰＤ－１抗体である。一部の実施形態において、前選択における使用のための抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ（BMS-936558、Bristol-Myers Squibb；Opdivo（登録商標））とは異なるエピトープに結合する。一部の実施形態において、前選択における使用のための抗ＰＤ－１抗体は、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、MK03475又はMK-3475、Merck；Keytruda（登録商標））とは異なるエピトープに結合する。一部の実施形態において、前選択における使用のための抗ＰＤ－１抗体は、イピリムマブ（Yervoy（登録商標））とは異なるエピトープに結合する。一部の実施形態において、前選択における使用のための抗ＰＤ－１抗体は、ヒト化抗ＰＤ－１抗体JS001（ShangHai JunShi）とは異なるエピトープに結合する。一部の実施形態において、前選択における使用のための抗ＰＤ－１抗体は、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体TSR-042（Tesaro, Inc.）とは異なるエピトープに結合する。一部の実施形態において、前選択における使用のための抗ＰＤ－１抗体は、ピディリズマブ（抗ＰＤ－１ｍＡｂ CT-011、Medivation）とは異なるエピトープに結合する。一部の実施形態において、前選択における使用のための抗ＰＤ－１抗体は、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体BGB-A317（BeiGene）とは異なるエピトープに結合する。一部の実施形態において、前選択における使用のための抗ＰＤ－１抗体は、抗ＰＤ－１抗体SHR-1210（ShangHai HengRui）とは異なるエピトープに結合する。一部の実施形態において、前選択における使用のための抗ＰＤ－１抗体は、ヒトモノクローナル抗体REGN2810（Regeneron）とは異なるエピトープに結合する。一部の実施形態において、前選択における使用のための抗ＰＤ－１抗体は、ヒトモノクローナル抗体MDX-1106（Bristol-Myers Squibb）とは異なるエピトープに結合する。一部の実施形態において、前選択における使用のための抗ＰＤ－１抗体は、ヒト化抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体PDR001（Novartis）とは異なるエピトープに結合する。一部の実施形態において、前選択における使用のための抗ＰＤ－１抗体は、RMP1-14（ラットＩｇＧ）－BioXcellカタログ番号ＢＰ０１４６とは異なるエピトープに結合する。ＰＤ－１へのニボルマブの結合及びペンブロリズマブの結合の構造は公知であり、例えば、Tan, S. et al.(Tan, S. et al., Nature Communications, 8:14369 | DOI:10.1038/ncomms14369 (2017)；全ての目的のために全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
[001576] 一部の実施形態において、前選択における使用のための抗ＰＤ－１抗体は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも１００％のＰＤ－１を発言する細胞に結合する。
[001577] 一部の実施形態において、患者は、抗ＰＤ－１抗体で処置されている。一部の実施形態において、対象は、抗ＰＤ－１抗体処置ナイーブである。一部の実施形態において、対象は、抗ＰＤ－１抗体で処置されていない。一部の実施形態において、対象は、以前に化学療法剤で処置されている。一部の実施形態において、対象は、以前に化学療法剤で処置されていたが、もはや化学療法剤で処置されていない。一部の実施形態において、対象は、化学療法後又は抗ＰＤ－１抗体処置後である。一部の実施形態において、対象は、化学療法後且つ抗ＰＤ－１抗体処置後である。一部の実施形態において、患者は、抗ＰＤ－１抗体処置ナイーブである。一部の実施形態において、対象は、処置ナイーブ癌を有するか、又は化学療法後であるが抗ＰＤ－１抗体処置ナイーブである。一部の実施形態において、対象は、処置ナイーブ及び化学療法後であるが抗ＰＤ－１抗体処置ナイーブである。
[001578] 患者が以前に第１の抗ＰＤ－１抗体で処置された一部の実施形態において、前選択は、初代細胞集団ＴＩＬを、初代細胞集団ＴＩＬの表面上のＰＤ－１への結合が第１の抗ＰＤ－１抗体の結合によって遮断されない第２の抗ＰＤ－１抗体で染色することによって実施される。
[001579] 患者が以前に抗ＰＤ－１抗体で処置された一部の実施形態において、前選択は、初代細胞集団ＴＩＬを、初代細胞集団ＴＩＬの表面上の不溶化された抗ＰＤ－１抗体のＦｃ領域に結合する抗体（「抗Ｆｃ抗体」）で染色することによって実施される。一部の実施形態において、抗Ｆｃ抗体は、ポリクローナル抗体、例えば、マウス抗ヒトＦｃポリクローナル抗体、ヤギ抗ヒトＦｃポリクローナル抗体などである。一部の実施形態において、抗Ｆｃ抗体はモノクローナル抗体である。患者が以前に抗ＰＤ－１ヒト又はヒト化ＩｇＧ抗体で処置されている一部の実施形態において、初代細胞集団ＴＩＬは、抗ヒトＩｇＧ抗体で染色されている。患者が以前に抗ＰＤ－１ヒト又はヒト化ＩｇＧ１抗体で処置されている一部の実施形態において、初代細胞集団ＴＩＬは、抗ヒトＩｇＧ１抗体で染色されている。患者が以前に抗ＰＤ－１ヒト又はヒト化ＩｇＧ２抗体で処置されている一部の実施形態において、初代細胞集団ＴＩＬは、抗ヒトＩｇＧ２抗体で染色されている。患者が以前に抗ＰＤ－１ヒト又はヒト化ＩｇＧ３抗体で処置されている一部の実施形態において、初代細胞集団ＴＩＬは、抗ヒトＩｇＧ３抗体で染色されている。患者が以前に抗ＰＤ－１ヒト又はヒト化ＩｇＧ４抗体で処置されている一部の実施形態において、初代細胞集団ＴＩＬは、抗ヒトＩｇＧ４抗体で染色されている。
[001580] 患者が以前に抗ＰＤ－１抗体で処置された一部の実施形態において、前選択は、初代細胞集団ＴＩＬを、同じ抗ＰＤ－１抗体に接触させ、次いで、初代細胞集団ＴＩＬを、初代細胞集団ＴＩＬの表面上の不溶化された抗ＰＤ－１抗体のＦｃ領域に結合する抗Ｆｃ抗体で染色することによって実施される。
[001581] 一部の実施形態において、前選択は、細胞選別法を使用して実施される。一部の実施形態において、細胞選別法は、フローサイトメトリー法、例えば、フロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）である。
２．フルオロフォア
[001582] 一部の実施形態において、初代細胞集団ＴＩＬは、フルオロフォアに連結された抗ＰＤ－１抗体及びフルオロフォアに連結された抗ＣＤ３抗体を含むカクテルで染色される。一部の実施形態において、初代細胞集団ＴＩＬは、フルオロフォア（例えば、ＰＥ、live/deadバイオレット）及び抗ＣＤ３－ＦＩＴＣに連結された抗ＰＤ－１抗体を含むカクテルで染色される。一部の実施形態において、初代細胞集団ＴＩＬは、抗ＰＤ－１－ＰＥ、抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ及びlive/dead青染色（ThermoFisher, MA、カタログ番号Ｌ２３１０５）を含むカクテルで染色される。一部の実施形態において、抗ＰＤ１抗体とのインキュベーション後、ＰＤ－１陽性細胞は、例えば、ステップＢにおいて、本明細書に記載される第１の初回刺激拡大培養に従う拡大培養のために選択される。
[001583] 一部の実施形態において、フルオロフォアは、限定されないが、ＰＥ（フィコエリトリン）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィルタンパク質）、DyLight 405、Alexa Fluor 405、Pacific Blue、Alexa Fluor 488、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、DyLight 550、Alexa Fluor 647、DyLight 650及びAlexa Fluor700を含む。一部の実施形態において、フルオロフォアは、PE-Alexa Fluor（登録商標）647、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、PE-Cy5.5、PE-Alexa Fluor（登録商標）750、PE-Cy7及びAPC-Cy7を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、フルオロフォアは、限定されないが、フルオレセイン色素を含む。フルオレセイン色素の例には、５－カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン－５－イソチオシアネート及び６－カルボキシフルオレセイン、５，６－ジカルボキシフルオレセイン、５－（及び６）－スルホフルオレセイン、スルホンフルオレセイン、スクシニルフルオレセイン、５－（及び６）－カルボキシＳＮＡＲＦ－１、カルボキシフルオレセインスルホネート、カルボキシフルオレセイン双性イオン、カルボキシフルオレセイン第四級アンモニウム、カルボキシフルオレセインホスホネート、カルボキシフルオレセインＧＡＢＡ、５’（６’）－カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセイン－ｃｙｓ－Ｃｙ５及びフルオレセイングルタチオンが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、蛍光部分はローダミン染料である。ローダミン色素の例には、テトラメチルローダミン－６－イソチオシアネート、５－カルボキシテトラメチルローダミン、５－カルボキシローダミン誘導体、カルボキシローダミン１１０、テトラメチル及びテトラエチルローダミン、ジフェニルジメチル及びジフェニルジエチルローダミン、ジナフチルローダミン、ローダミン１０１スルホニルクロリド（TEXAS RED（登録商標）の商品名で販売）が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、蛍光部分はシアニン色素である。シアニン色素の例には、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７が含まれるが、これらに限定されない。
ＩＶ．操作されたサイトカイン／受容体対
[001584] サイトカイン受容体及びサイトカインを操作する方法並びにそのような操作された受容体／サイトカイン対及びそれらの組成物を使用する方法は、当技術分野で知られており、２０１８年３月９日に提出され、米国特許出願公開第２０１８／０２２８８４２Ａ１号として公開されたＵＳ１５／９１６，６８９号の一部継続出願であり、２０１６年９月７日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５０５１１号に記載される。公開されている両出願は、参照によりその全体が組み込まれる。ＵＳ１５／９１６，６８９号、組成物及び方法、例えば、［００９３］～［０１０４］並びに直交性ＩＬ－２及びＩＬ－２Ｒβを一般的に説明する実施例１、［０１２９］～［０１４７］並びに実施例２、ヒトＩＬ－２オルソログ、［０１４８］～［０１５７］に特に注意が向けられる。そのような方法及び組成物は、本開示の拡大培養されたＴＩＬ、ＭＩＬ及びＰＢＬと組み合わせて又は本明細書に記載のＣＡＲ－Ｔ又はＴＣＲ療法などの他のＴ細胞療法と組み合わせて使用され得る。
[001585] Sockolosky et al., Science 359:1037-1042 (2018)も、直交性ＩＬ－２による形質導入細胞の刺激を介した、直交性ＩＬ－２ＲβによるＴ細胞の形質導入によるＩＬ－２シグナル伝達経路の選択的調節を開示しており、http://science.sciencemag.org/content/sci/suppl/2018/02/28/359.6379.1037.DC1で入手可能なこの刊行物は、４８ページの補足資料を含め、その全体が参照により組み込まれる。
[001586] 直交性受容体の選択は、直交性サイトカインの選択によって異なり得る。本明細書で定義される場合、操作されたサイトカイン／受容体対は、アミノ酸の変化（ａ）天然サイトカイン又は同族受容体への結合の欠如；及び（ｂ）対応する操作された（直交性）リガンド又は受容体に特異的に結合することによって修飾される。本明細書に開示される直交性ＩＬ－２サイトカインの実施形態は、本明細書に開示される直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態に結合する。しかし、親和性は、変化し得、一部の対は、他の対よりも高い親和性を有し得ることが理解される。
[001587] １つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態の任意の対が、本明細書に開示される方法のいずれかに組み込まれ得ることが理解される。ＴＩＬ、ＭＩＬ及び／又はＰＢＬの集団が直交性ＩＬ－２Ｒβを発現する場合、細胞の治療用集団を調製するための方法、細胞を拡大培養するための方法及び癌を処置するための方法において、直交性ＩＬ－２が野生型ＩＬ－２に代替されることがさらに理解される。直交性ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２について等しい国際単位（ＩＵ）に基づいて代替されることが理解される。
[001588] 一部の態様では、直交性受容体は、ＩＬ－２受容体：インターロイキン２受容体アルファ（ＩＬ－２Ｒα；ＣＤ２５；配列番号１５４）、インターロイキン２受容体ベータ（ＩＬ－２Ｒβ；ＣＤ１２２）及びインターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ－２Ｒγ；ＣＤ１３２；共通ガンマ鎖；配列番号１５５）から選択されるポリペプチドの鎖である。一部の特定の実施形態において、直交性受容体は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７及びＩＬ－１５からのシグナル伝達に関与するＣＤ１３２である。他の特定の実施形態において、直交性受容体は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５からのシグナル伝達に関与するＣＤ１２２である。直交性受容体は、通常、対応する直交性サイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５などと対になっている。これらのタンパク質のそれぞれにタンパク質配列のバリエーションがあることが理解され；例えば、組換えＩＬ－２のいくつかのバージョン、配列番号３、配列番号４及び配列番号１５６が開示されている。操作された残基は、例えば、CLUSTALW, Larkin et al., Bioinformatics 2007 23(21):2947-2948を使用して、当業者により、例えば異なる長さの組換えＩＬ－２の実施形態にマッピングされ得る。
[001589] 一態様では、直交性サイトカインは、ヒトＩＬ－２（配列番号１５６）である。一部の態様では、ヒトＩＬ－２は、Ｑ１３、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｇ２７、Ｒ８１及びＮ８８から選択される１つ以上の残基において修飾されている。一部の態様では、ヒトＩＬ－２は、［Ｈ１６Ｎ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｎ、Ｑ２２Ｔ、Ｍ２３Ｈ、Ｇ２７Ｋ］；［Ｅ１５Ｄ、Ｈ１６Ｎ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｔ、Ｍ２３Ｈ］；［Ｅ１５Ｄ、Ｈ１６Ｎ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｔ、Ｍ２３Ａ］及び［Ｅ１５Ｄ、Ｈ１６Ｎ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｄ、Ｔ５１１］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｙ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ａ］から選択されるアミノ酸置換のセットを含む。
[001590] 一部の態様では、以下のヒトＩＬ－２の置換のセットの１つを含むアミノ酸置換のセットは、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ／Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｔ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｓ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｖ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｔ］；［Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｎ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｄ、Ｔ５１Ｉ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｙ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ａ］である。
[001591] 一態様では、直交性サイトカインは、以下：［Ｅ１５Ｓ、Ｅ１５Ｔ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ１５Ｈ］；［Ｈ１６Ｑ］；［Ｌ１９Ｖ、Ｌ１９Ｉ］；［Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｓ、Ｄ２０Ｍ、Ｄ２０Ｌ］；［Ｑ２２Ｋ、Ｑ２２Ｎ］；及び［Ｍ２３Ｌ、Ｍ２３Ｓ、Ｍ２３Ｖ、Ｍ２３Ｔ］のアミノ酸置換の１つ以上を含むヒトＩＬ－２である。
[001592] 一態様では、直交性サイトカインは、以下：［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ／Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ／Ｓ］のアミノ酸置換の１つ以上を含むヒトＩＬ－２である。別の態様では、直交性サイトカインは、以下：［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ／Ａ］及び任意選択によりＱ２２Ｋのアミノ酸置換の１つ以上を含むヒトＩＬ－２である。以下の表は、直交性ＩＬ－２の実施形態である野生型ヒトＩＬ－２の修飾を要約したものである。
Figure 2022514023000023
[001593] 一部の態様では、直交性受容体は、ＩＬ－２受容体である。別の態様では、ＩＬ－２受容体は、ヒトＩＬ－２Ｒβである。別の態様では、受容体は、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｑ７０、Ｋ７１、Ｔ７３、Ｔ７４、Ｖ７５、Ｓ１３２、Ｈ１３３、Ｙ１３４、Ｆ１３５、Ｅ１３６及びＱ２１４から選択される１つ以上の残基で修飾されたヒトＣＤ１２２である。一部の実施形態において、アミノ酸置換は、酸性アミノ酸、例えばアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸に対するものである。特定のアミノ酸置換には、ｈＣＤ１２２の変更Ｑ７０Ｙ；Ｔ７３Ｄ；Ｔ７３Ｙ；Ｈ１３３Ｄ、Ｈ１３３Ｅ；Ｈ１３３Ｋ；Ｙ１３４Ｆ；Ｙ１３４Ｅ；及びＹ１３４Ｒが含まれるが、これらに限定されない。直交性サイトカインの選択は、直交性受容体の選択によって異なり得る。
[001594] 一態様では、直交性ヒトＩＬ－２を産生するためのヒトＩＬ－２のアミノ酸置換のセットは、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ／Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｔ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｓ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｖ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｔ］；［Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｎ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｄ、Ｔ５１Ｉ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｙ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］及び［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ａ］からなる群から選択され、相補的な直交性ＩＬ２－Ｒβは、Ｑ７０Ｙ、Ｔ７３Ｄ、Ｔ７３Ｙ、Ｈ１３３Ｄ、Ｈ１３３Ｅ、Ｈ１３３Ｋ、Ｙ１３４Ｆ、Ｙ１３４Ｅ、Ｙ１３４Ｒ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を選択することによって産生される。一態様では、相補的な直交性ＩＬ－２Ｒβは、アミノ酸置換Ｈ１３３Ｄ及びＹ１３４Ｆを含む。一態様では、相補的な直交性ＩＬ－２Ｒβは、アミノ酸置換Ｈ１３３Ｋ及びＹ１３４Ｒを含む。
[001595] 一態様では、直交性ヒトＩＬ－２は、アミノ酸置換［Ｅ１５Ｓ；Ｈ１６Ｑ；Ｌ１９Ｉ；Ｄ２０Ｓ；Ｑ２２Ｋ；Ｍ２３Ｌ］によって産生され、相補的な直交性ヒトＩＬ－２Ｒβは、アミノ酸置換［Ｑ７０Ｙ；Ｔ７３Ｄ；Ｈ１３３Ｋ；及びＹ１３４Ｆ］によって産生される。
[001596] 一部の実施形態において、直交性ＩＬ－２Ｒは、１つ以上の直交性サブユニットを含み得る。例えば、限定されないが、ヘテロ三量体ＩＬ－２Ｒは、野生型ＩＬ－２Ｒα、直交性ＩＬ－２Ｒβ及び直交性ＩＬ－２Ｒγを含み得る。別の態様では、ヘテロ三量体ＩＬ－２Ｒは、野生型ＩＬ－２Ｒα、直交性ＩＬ－２Ｒβ及び野生型ＩＬ－２Ｒγを含み得る。別の態様では、ヘテロ三量体ＩＬ－２Ｒは、野生型ＩＬ－２Ｒα、野生型ＩＬ－２Ｒβ及び直交性ＩＬ－２Ｒγを含み得る。別の態様では、ヘテロ三量体ＩＬ－２Ｒは、直交性ＩＬ－２Ｒα、直交性ＩＬ－２Ｒβ及び直交性ＩＬ－２Ｒγを含み得る。
[001597] ＴＩＬは、直交性ＩＬ－２受容体を発現するように修飾され得る。上記のＩＩ．Ｊ、ＴＩＬの任意選択による遺伝子操作及び直交性ＩＬ－２受容体を発現するようにＴＩＬを修飾するための当技術分野で公知の他の方法に記載されている方法である。一態様では、ＴＩＬは、修飾された受容体が直交性ＩＬ－２に選択的に結合するように構成されるように、１つ以上の残基で修飾された、ＣＤ１２２としても知られるヒトＩＬ－２Ｒβを発現するように修飾される。別の態様では、発現されたヒトＩＬ－２Ｒβは、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｑ７０、Ｋ７１、Ｔ７３、Ｔ７４、Ｖ７５、Ｓ１３２、Ｈ１３３、Ｙ１３４、Ｆ１３５、Ｅ１３６及びＱ２１４から選択される１つ以上の残基での修飾により、直交性ＩＬ－２に結合するよう構成される。
[001598] 一態様では、ＴＩＬは、直交性ＩＬ－２Ｒβ受容体を発現するように改変される。ＩＬ－２のオルソログバージョンとＩＬ－２Ｒβのオルソログバージョンは互いに特異的に結合するが、野生型の対応物には結合しない。直交性ＩＬ－２Ｒβに対する様々な程度の親和性を有する、複数の直交性ＩＬ－２変異体配列が提供される。直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように操作されたＴ細胞の、直交性ＩＬ－２依存性シグナル伝達及びＴ細胞増殖は、そのようなＴＩＬの直交性ＩＬ－２への曝露に起因する。
[001599] 直交性ＩＬ－２は、ＩｇＧ、アルブミン又は他の分子のＦｃドメインに融合して、その半減期を例えばペグ化、グリコシル化などの当技術分野で公知のものによって延長することができる。Ｆｃ融合は、インビボで代替的なＦｃ受容体を介した特性を付与し得る。「Ｆｃ領域」は、パパインによるＩｇＧの消化によって産生されるＩｇＧ Ｃ末端ドメインに相同である天然に存在する又は合成のポリペプチドであり得る。ＩｇＧ Ｆｃは、およそ５０ｋＤａの分子量を有する。オルソログＩＬ－２ポリペプチドは、Ｆｃ領域全体又はそれが一部であるキメラポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持するより小さい部分を含み得る。さらに、完全長又は断片化されたＦｃ領域は、野生型分子の変異体であり得る。つまり、それらは、ポリペプチドの機能に影響を与える可能性がある又はない変異を含み得；以下でさらに説明するように、天然の活性は、全ての場合に必要である又は望ましい、とは限らない。他の態様では、直交性ＩＬ－２は、溶解性、製剤の均一性、安定性又は有効性を高めるために、製薬分野で公知の任意の手段によって改変され得る。
[001600] ＴＩＬは、上記の方法のいずれか、例えば、ＩＩ（ＴＩＬ製造プロセス）及びＩＩＩ（他のＴＩＬ拡大培養方法）に開示されている方法に従って拡大培養することができる。一部の態様では、ＴＩＬは、第１の拡大培養ステップ後、直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように操作される。一部の態様では、ＴＩＬは、第２の拡大培養ステップ後、直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように操作される。一部の態様では、ＴＩＬは、プレＲＥＰ培養ステップ後、直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように操作される。一部の態様では、ＴＩＬは、ＲＥＰ培養ステップ後、直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように操作される。
[001601] 一態様では、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養するための方法は、直交性サイトカイン受容体を発現するＴＩＬを濃縮するために細胞の集団を選別することをさらに含む。一態様では、直交性サイトカイン受容体は、ＩＬ－２Ｒβである。一態様では、選別はフローサイトメトリーを含む。
[001602] 一態様では、直交性受容体をコードするコード配列を含むベクターが提供され、ここで、コード配列は、所望の細胞で活性なプロモーターに作動可能に連結されている。様々なベクターが当技術分野で公知であり、この目的のために使用することができる。例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ミニサークルベクターであり、これらのベクターは、標的細胞ゲノムに組み込むことができるか、又はエピソーム的に維持することができる。一態様では、ベクターは、直交性ＩＬ－２Ｒβタンパク質配列をコードする。別の態様では、ベクターは、直交性ＩＬ－２Ｒαタンパク質配列をコードする。別の態様では、ベクターは、直交性ＩＬ－２Ｒγタンパク質配列をコードする。
[001603] 他の実施形態において、限定されないが、サイトカイン／受容体サブユニット対は、ＩＬ－１様（オーファン受容体）；ＩＬ－１α／ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ；ＩＬ－１β／ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ；ＩＬ－１ＲＡ／ＣＤ１２１ａ；ＩＬ－１８／ＩＬ－１８Ｒα、ＩＬ－１８Ｒβ；ＩＬ－２／ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２；ＩＬ－４／ＣＤ１２４、ＣＤ２１３ａ１３、ＣＤ１３２；ＩＬ－７／ＣＤ１２７、ＣＤ１３２；ＩＬ－９／ＩＬ－９Ｒ、ＣＤ１３２；ＩＬ－１３／ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ１２４３、ＣＤ１３２；ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２；ＩＬ－３／ＣＤ１２３、ＣＤｗ１３１；ＩＬ－５／ＣＤｗ１２５、ＣＤ１３１；ＧＭ－ＣＳＦ／ＣＤ１１６、ＣＤｗ１３１；ＩＬ－６／ＣＤ１２６、ＣＤ１３０；ＩＬ－１１／ＩＬ－１１Ｒａ、ＣＤ１３０；Ｇ－ＣＳＦ／ＣＤ１１４；ＩＬ－１２／ＣＤ２１２；ＬＩＦ／ＬＩＦＲ、ＣＤ１３０；ＯＳＭ／ＯＳＭＲ、ＣＤ１３０；ＩＬ－１０／ＣＤｗ２１０；ＩＬ－２０／ＩＬ－２０Ｒα、ＩＬ－２０Ｒβ；ＩＬ－１４／ＩＬ－１４Ｒ；ＩＬ－１６／ＣＤ４；ＩＬ－１７／ＣＤｗ２１７；ＩＦＮ－α／ＣＤ１１８；ＩＦＮ－β／ＣＤ１１８；ＩＦＮ－γ／ＣＤｗ１１９；ＣＤ１５４／ＣＤ４０；ＬＴ－β／ＬＴβＲ；ＴＮＦ－α／ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ；ＴＮＦ－β／ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ；４－１ＢＢＬ／ＣＤｗ１３７（４－１ＢＢ）；ＡＰＲＩＬ／ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ；ＣＤ７０／ＣＤ２７；ＣＤ１５３／ＣＤ３０；ＣＤ１７８／ＣＤ９５（Ｆａｓ）；ＧＩＴＲＬ／ＧＩＴＲ；ＬＩＧＨＴ／ＬＴｂＲ、ＨＶＥＭ；ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０；ＴＡＬＬ－１／ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ；ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬＲ１－４；ＴＷＥＡＫ／Ａｐｏ３；ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫ、ＯＰＧ；ＴＧＦ－β１／ＴＧＦ－βＲ１；ＴＧＦ－β２／ＴＧＦ－βＲ２；ＴＧＦ－β３／ＴＧＦ－βＲ３；Ｅｐｏ／ＥｐｏＲ；Ｔｐｏ／ＴｐｏＲ；Ｆｌｔ－３Ｌ／Ｆｌｔ－３；ＳＣＦ／ＣＤ１１７；Ｍ－ＣＳＦ／ＣＤ１１５；ＭＳＰ／ＣＤｗ１３６から選択され得る。
[001604] 一部の実施形態において、少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞は、限定されるものではないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えばＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ又は腫瘍関連細胞表面分子（例えばメソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えばＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、追加的な機能性を含むようにさらに遺伝子改変される。特定の実施形態において、方法は、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ又は腫瘍関連細胞表面分子（例えばメソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えばＣＤ１９）に結合するＣＡＲを含むように、ＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞の集団を遺伝子操作することを含む。特定の実施形態において、方法は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１９及びＣＤ２０（二重特異性）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＰＳＭＡ、メソテリン、ＣＥ７、ＨＥＲ２／ｎｅｕ ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２／ＣＭＶ、ＩＬ１３Ｒα２、ヒトＣ４葉酸受容体－アルファ（αＦＲ）又はＧＤ２に特異的なＣＡＲを含むように、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子操作することを含む。
[001605] 一部の実施形態において、少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現を通じて抗原を標的とするように遺伝子修飾される。一部の実施形態において、少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞は、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むＣＡＲをコードする核酸を含む発現ベクターでさらに形質導入される。一部の実施形態において、形質導入ステップは、拡大培養プロセス中のいつでも行われる。一部の実施形態において、形質導入ステップは、拡大培養した細胞が回収された後に行われる。一部の実施形態において、少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞は、本発明の方法に従って拡大培養され、ＣＡＲの発現が可能なポリヌクレオチドを含む。
[001606] 一実施形態において、ＣＡＲ又はＣＡＲをコードするヌクレオチドは、米国特許第９，３２８，１５６号；同第８，３９９，６４５号；同第７，４４６，１７９号；同第６，４１０，３１９号；同第７，４４６，１９０号及び米国特許出願公開第２０１５／００３８６８４号；米国特許出願公開第２０１５／００３１６２４号；米国特許出願公開第２０１４／０３０１９９３Ａ１号；米国特許出願公開第２０１４／０２７１５８２Ａ１号；米国特許出願公開第２０１５／００５１２６６Ａ１号；米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５Ａ１号；及び米国特許出願公開第２０１４／０００４１３２Ａ１号の開示に従って調製及び形質導入され、そのそれぞれの開示は参照により本明細書に援用される。米国特許第９，３２８，１５６号では、Ｂ細胞リンパ腫、特にＣＬＬを有する患者を処置するためにＣＡＲ－Ｔ細胞が調製され、そこで考察されている実施形態は本発明において有用である。例えば、ＣＤ１９抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、本発明において有用である。本発明の実施形態において、ＣＡＲは、標的特異的結合要素又は抗体結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。造血器腫瘍抗原（抗体結合ドメイン用）は当技術分野で周知であり、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲなどを含む。一実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ１５４を含み、合成であり得る。一実施形態において、細胞質又はシグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ６６ｄドメインの一部又は全てを含む。本発明の一実施形態において、細胞質又はシグナル伝達ドメインは、共刺激分子、例えばＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＭＣ又はＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなども含み得る。本発明の一実施形態において、ＣＡＲ改変ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。本発明の一実施形態において、ＣＡＲ改変ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、ＣＤ１９に向けられた抗原結合ドメイン、４－１ＢＢ又はＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。本発明の一実施形態において、ＣＡＲ改変ＴＩＬは、自殺スイッチ（カスパーゼ－９／リミデュシッド（rimiducid）など）又は活性化スイッチ（誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０活性化スイッチなど）を含む。本発明の一実施形態において、ＣＡＲ改変ＴＩＬは、ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターを使用して改変される。
[001607] 本発明の一部の実施形態において、少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞は、本発明の方法に従って拡大培養され、遺伝子改変された改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴＣＲを使用して細胞におけるシグナル伝達を改変する方法において使用される。一部の実施形態において、少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞は、限定されるものではないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＲＴ－１、ＣＥＡ、ｇｐ１００、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＨＥＲ２、ＰＲＡＭＥ、ＣＴ８３、ＳＳＸ２又はＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲを含め、追加的な機能性を含むように改変される。ＴＣＲを改変する方法及び人工ＴＣＲを作製する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，８１１，７８５号；同第７，５６９，６６４号；同第７，６６６，６０４号；同第８，１４３，３７６号；同第８，２８３，４４６号；同第９，１８１，５２７号；同第７，３２９，７３１号；同第７，０７０，９９５号；同第７，２６５，２０９号；同第８，３６１，７９４号；及び同第８，６９７，８５４号；並びに米国特許出願公開第２０１７／００５１０３６Ａ１号；米国特許出願公開第２０１０／００３４８３４Ａ１号；米国特許出願公開第２０１１／００１４１６９Ａ１号；米国特許出願公開第２０１６／０２００８２４Ａ１号；及び米国特許出願公開第２００２／００５８２５３Ａ１号に開示され、そのそれぞれの開示は参照により本明細書に援用される。本発明の一部の実施形態において、少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞は、本発明の方法に従って拡大培養され、腫瘍関連抗原に対して改変ＴＣＲを使用して細胞におけるシグナル伝達を改変する方法において使用される。本発明の一部の実施形態において、少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞は、本発明の方法に従って拡大培養され、少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞が内因性ＴＣＲの存在を低減するように修飾された、遺伝子改変されたＴＣＲを含む改変ＴＣＲを使用して細胞におけるシグナル伝達を改変する方法において使用される。
[001608] 本発明の一部の実施形態において、少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ抗原などの癌精巣抗原に特異的であるように改変されたＴＣＲなどの一過性又は安定的に改変されたＴＣＲを含む。一部の実施形態において、少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞は、改変された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つのＴＣＲを含み得る。一部の実施形態において、少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞は、ＴＣＲ親和性を増加させるためにベータ鎖に野生型配列を保持した、改変ＣＤＲ２を含む少なくとも１つのＴＣＲを含み得る。一部の実施形態において、少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞は、天然のＴＣＲα鎖可変ドメイン及び／又はβ鎖可変ドメインと比較して、少なくとも１つのＣＤＲ（ＣＤＲ２など）、可変ドメインフレームワーク領域又はＴＣＲの可変ドメイン内の他の超可変領域（超可変４（ＨＶ４）領域など）において、変異体が高親和性ＴＣＲを生成するように変異している（図１ｂ及び配列番号２を参照のこと）ＴＣＲを含み得る。少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞は、膜貫通配列によって膜に固定された少なくとも１つのＴＣＲを含み得、米国特許第８，３６１，７９４号（この開示は、参照により本明細書に援用される）に記載されるように、前記ＴＣＲは、天然のＴＣＲには存在しない細胞外定常ドメイン残基間の鎖間ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態において、少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞は、特定のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－Ａ１複合体に結合する特性を有し、親和性を増加させるためにＴＣＲアルファ可変ドメイン及び／又はＴＣＲベータ可変ドメインに特定の変異を有する特定の野生型ＴＣＲを含む、少なくとも１つのＴＣＲを含み得る。本発明の一部の実施形態において、本発明の方法に従って拡大培養された、少なくとも１つの直交性ＩＬ－２の実施形態及び少なくとも１つの直交性ＩＬ－２Ｒβの実施形態で操作されたＴＩＬ、ＰＢＬ、ＭＩＬ又はＴ細胞は、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１、ＣＥＡ、ｇｐ１００、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＨＥＲ２、ＰＲＡＭＥ（メラノーマで優先的に発現される抗原）、ＣＴ８３、ＳＳＸ２、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４又はＭＡＧＥ－Ａ１０への親和性が増加した安定的に改変されたＴＣＲを含む。
Ｖ．医薬組成物、投与量及び投与レジメン
[001609] 一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養したＴＩＬは医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくはおよそ３０～６０分間継続される。他の適切な投与経路には、腹腔内投与、髄腔内投与及びリンパ管内投与が含まれる。
[001610] 任意の適切な用量のＴＩＬを投与することができる。一部の実施形態において、特に癌が黒色腫である場合、平均が約７．８×１０１０個のＴＩＬである約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個のＴＩＬが投与される。一実施形態において、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約３×１０１０～約１２×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約４×１０１０～約１０×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約５×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約６×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約７×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、治療有効投与量は約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、特に癌が黒色腫である場合、治療有効投与量は約７．８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約１．２×１０１０～約４．３×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約３×１０１０～約１２×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約４×１０１０～約１０×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約５×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約６×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約７×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬである。
[001611] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３及び９×１０１３個である。一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、１ｘ１０６～５ｘ１０６、５ｘ１０６～１ｘ１０７、１ｘ１０７～５ｘ１０７、５ｘ１０７～１ｘ１０８、１ｘ１０８～５ｘ１０８、５ｘ１０８～１ｘ１０９、１ｘ１０９～５ｘ１０９、５ｘ１０９～１ｘ１０１０、１ｘ１０１０～５ｘ１０１０、５ｘ１０１０～１ｘ１０１１、５ｘ１０１１～１ｘ１０１２、１ｘ１０１２～５ｘ１０１２及び５ｘ１０１２～１ｘ１０１３個の範囲内である。
[001612] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、医薬組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖより低い。
[001613] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖより高い。
[001614] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．０００１％～約５０％、約０．００１％～約４０％、約０．０１％～約３０％、約０．０２％～約２９％、約０．０３％～約２８％、約０．０４％～約２７％、約０．０５％～約２６％、約０．０６％～約２５％、約０．０７％～約２４％、約０．０８％～約２３％、約０．０９％～約２２％、約０．１％～約２１％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約１９％、約０．４％～約１８％、約０．５％～約１７％、約０．６％～約１６％、約０．７％～約１５％、約０．８％～約１４％、約０．９％～約１２％又は約１％～約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
[001615] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．００１％～約１０％、約０．０１％～約５％、約０．０２％～約４．５％、約０．０３％～約４％、約０．０４％～約３．５％、約０．０５％～約３％、約０．０６％～約２．５％、約０．０７％～約２％、約０．０８％～約１．５％、約０．０９％～約１％、約０．１％～約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
[001616] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ又は０．０００１ｇ以下である。
[001617] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ又は１０ｇ超である。
[001618] 本発明の医薬組成物において提供されるＴＩＬは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、処置されるべき対象の性別及び年齢、処置されるべき対象の体重並びに担当医の選好及び経験に依存するであろう。臨床的に確立されたＴＩＬの投与量も適切な場合には使用され得る。ＴＩＬの投与量など、本明細書の方法を使用して投与される医薬組成物の量は、処置されるヒト又は哺乳動物、疾患又は状態の重症度、投与速度、活性医薬成分の性質及び処方医の裁量に依存するであろう。
[001619] 一部の実施形態において、ＴＩＬは単回投与で投与され得る。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ＴＩＬは複数回投与で投与され得る。投与は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回又は６回を超え得る。投与は、月に１回、２週間に１回、週に１回又は隔日に１回であり得る。ＴＩＬの投与は必要な限り継続し得る。
[001620] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３及び９×１０１３個である。一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、１ｘ１０６～５ｘ１０６、５ｘ１０６～１ｘ１０７、１ｘ１０７～５ｘ１０７、５ｘ１０７～１ｘ１０８、１ｘ１０８～５ｘ１０８、５ｘ１０８～１ｘ１０９、１ｘ１０９～５ｘ１０９、５ｘ１０９～１ｘ１０１０、１ｘ１０１０～５ｘ１０１０、５ｘ１０１０～１ｘ１０１１、５ｘ１０１１～１ｘ１０１２、１ｘ１０１２～５ｘ１０１２及び５ｘ１０１２～１ｘ１０１３個の範囲内である。
[001621] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ～約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ～約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇｍｇ～約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ～約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ～約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ又は約２．８５ｍｇ／ｋｇ～約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
[001622] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１ｍｇ～約５００ｍｇ、約１０ｍｇ～約３００ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約４５ｍｇ、約１０ｍｇ～約４０ｍｇ、約１５ｍｇ～約３５ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約２３ｍｇ～約２８ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ～約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ～約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ～約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１１０ｍｇ又は約９５ｍｇ～約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ～約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ～約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ～約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ～約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ～約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ～約２０５ｍｇ又は約１９８～約２０７ｍｇの範囲内である。
[001623] 有効量のＴＩＬは、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射によること、静脈内、腹腔内、非経口的、筋肉内、皮下、局所、移植によること又は吸入によることを含め、同様の有用性を有する薬剤について一般に認められている任意の投与方式により、単回用量又は複数回用量のいずれで投与され得る。
[001624] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を含む輸注バッグを提供する。
[001625] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載される治療用ＴＩＬ集団及び薬学的に許容される担体を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を提供する。
[001626] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を含む輸注バッグを提供する。
[001627] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団の凍結保存調製物を提供する。
[001628] 別の実施形態において、本発明は、ＴＩＬ組成物が、直交性ＩＬ－２Ｒを発現するように操作されたＴＩＬを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。
[001629] 別の実施形態において、本発明は、ＴＩＬが直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように操作されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。
[001630] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載される治療用ＴＩＬ集団及び凍結保存培地を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を提供する。
[001631] 別の実施形態において、本発明は、凍結保存培地がＤＭＳＯを含有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。
[001632] 別の実施形態において、本発明は、凍結保存培地が７～１０％のＤＭＳＯを含有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。
[001633] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物の凍結保存調製物を提供する。
[001634] 別の実施形態において、本発明は、ＴＩＬが、Ｑ７０Ｙ、Ｔ７３Ｄ、Ｔ７３Ｙ、Ｈ１３３Ｄ、Ｈ１３３Ｅ、Ｈ１３３Ｋ、Ｙ１３４Ｆ、Ｙ１３４Ｅ、Ｙ１３４Ｒ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む直交性ＩＬ２－Ｒβを発現するように操作されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。一態様では、直交性ＩＬ－２Ｒβは、アミノ酸置換Ｈ１３３Ｄ及びＹ１３４Ｆを含む。一態様では、直交性ＩＬ－２Ｒβは、アミノ酸置換Ｈ１３３Ｋ及びＹ１３４Ｒを含む。別の実施形態において、本発明は、ＴＩＬが１つ以上の直交性サブユニットを含む直交性ＩＬ－２Ｒを発現するように操作されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。例えば、限定されないが、ヘテロ三量体ＩＬ－２Ｒは、野生型ＩＬ－２Ｒα、直交性ＩＬ－２Ｒβ及び直交性ＩＬ－２Ｒγを含み得る。別の態様では、ヘテロ三量体ＩＬ－２Ｒは、野生型ＩＬ－２Ｒα、直交性ＩＬ－２Ｒβ及び野生型ＩＬ－２Ｒγを含み得る。別の態様では、ヘテロ三量体ＩＬ－２Ｒは、野生型ＩＬ－２Ｒα、野生型ＩＬ－２Ｒβ及び直交性ＩＬ－２Ｒγを含み得る。別の態様では、ヘテロ三量体ＩＬ－２Ｒは、直交性ＩＬ－２Ｒα、直交性ＩＬ－２Ｒβ及び直交性ＩＬ－２Ｒγを含み得る。
ＶＩ．患者の処置方法
[001635] 処置方法は、最初のＴＩＬ収集及びＴＩＬの培養から始まる。かかる方法については、両方とも当技術分野において例えばJin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292（全体として参照により本明細書に援用される）により記載されている。処置方法の実施形態は、実施例を含む以下のセクション全体で説明される。
[001636] ＴＩＬ、ＭＩＬ及び／又はＰＢＬの治療上有用な集団は、本明細書に記載の方法に従って拡大培養され得る。本明細書に記載の方法、例えば上記のステップＡ～Ｆに記載の方法を含むか、又は上記のステップＡ～Ｆに記載の方法（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）にも示される）に従って作製された拡大培養ＴＩＬは、癌患者の処置における特定の使用（例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される、Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239並びに補足内容）が見出される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、先述の通り転移性黒色腫の寄託切除物から成長させた（Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342を参照されたい；全体として参照により本明細書に援用される）。新鮮腫瘍は無菌条件下で剥離し得る。正式な病理解析のため、代表サンプルを収集し得る。２ｍｍ３～３ｍｍ３の単一の断片が使用され得る。一部の実施形態において、患者１人あたり５、１０、１５、２０、２５又は３０のサンプルを入手する。一部の実施形態において、患者１人あたり２０、２５又は３０のサンプルを入手する。一部の実施形態において、患者１人あたり２０、２２、２４、２６又は２８のサンプルを入手する。一部の実施形態において、患者１人あたり２４のサンプルを入手する。サンプルを２４ウェルプレートの個々のウェルに置き、高用量ＩＬ－２（６，０００ＩＵ／ｍＬ）を含む成長培地中に維持し、腫瘍の破壊及び／又はＴＩＬの増殖に関してモニターし得る。処理後に生細胞が残っている任意の腫瘍を酵素消化して単一細胞懸濁液にし、本明細書に記載される通り凍結保存し得る。
[001637] 一部の実施形態において、表現型分析（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ５６）のため、増殖に成功したＴＩＬをサンプリングし、利用可能な場合には自己腫瘍に対して試験し得る。ＴＩＬは、一晩の共培養によりインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）レベル＞２００ｐｇ／ｍＬ及びバックグラウンドの２倍となった場合に応答性であるとみなすことができる。（Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847；全体として参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態において、自己応答性又は十分な成長パターンのエビデンスを有する培養物が、急速拡大培養（ＲＥＰ）と称されることもある第２の拡大培養を含め、第２の拡大培養（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＤにおいて提供される通りの第２の拡大培養）に選択され得る。一部の実施形態において、高い自己応答性（例えば、第２の拡大培養中の高い増殖）を有する拡大培養ＴＩＬが、追加の第２の拡大培養に選択される。一部の実施形態において、自己応答性（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＤに提供される通りの第２の拡大培養中の高い増殖）を有するＴＩＬが、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＤに係る追加の第２の拡大培養に選択される。
[001638] 一部の実施形態において、患者はＡＣＴ（養子細胞移入）に直接移されず、例えば、一部の実施形態において、腫瘍回収後及び／又は第１の拡大培養後、細胞はすぐには利用されない。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、患者への投与の２日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、患者への投与の１日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、患者への投与の直前に解凍することができる。
[001639] 輸注バッグＴＩＬの凍結保存サンプルの細胞表現型は、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡ（BD BioSciences）に関するフローサイトメトリー（例えば、FlowJo）並びに本明細書に記載される方法のいずれかによって分析することができる。血清サイトカインは標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ法を用いることにより測定した。血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、＞１００ｐｇ／ｍＬ及び４ ３ベースラインレベル超（greater than 4 3 baseline levels）と定義した。
[001640] 一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に例示される方法により作製されるＴＩＬは、ＴＩＬの臨床有効性の驚くべき改善を提供する。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に例示される方法により作製されるＴＩＬは、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に例示される方法以外の方法を含む、本明細書に記載されるもの以外の方法により作製されるＴＩＬに比べて増加した臨床有効性を示す。一部の実施形態において、本明細書に記載されているもの以外の方法は、プロセス１Ｃ及び／又はジェネレーション１（Ｇｅｎ１）と称される方法を含む。一部の実施形態において、有効性の増加は、ＤＣＲ、ＯＲＲ及び／又は他の臨床応答によって測定される。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に例示される方法により作製されるＴＩＬは、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に例示される方法以外の、例えばＧｅｎ１プロセスを含む、本明細書に記載されるもの以外の方法により作製されるＴＩＬと比べて同様の応答時間及び安全プロファイルを示す。
[001641] 一部の実施形態において、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）は、処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された対象の血液中のＩＦＮ－γは、活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能のもう１つの尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、本発明の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液、血清又はＴＩＬエキソビボ中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γの増加は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以上増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、３倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、４倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γはQuantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象のＴＩＬエキソビボで測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液で測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象のＴＩＬ血清で測定される。
[001642] 一部の実施形態において、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に記載されるものを含む本発明の方法により調製されたＴＩＬは、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に例示されない、例えばプロセス１Ｃメソッドと称されるものを含む他の方法により作製されるＴＩＬと比較してポリクローナル性の増加を示す。一部の実施形態において、有意に改善されたポリクローナル性及び／又は増加したポリクローナル性は、処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性とは、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。一部の実施形態において、ポリクローナル性の増加は、本発明の方法に作製されたＴＩＬを投与された患者に関する処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍又は１０００倍が増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０００倍増加する。
[001643] 有効性の尺度には、当技術分野において公知であり、本明細書に記載されるように、疾患制御率（ＤＣＲ）並びに全奏効率（ＯＲＲ）が含まれ得る。
１．癌及び他の疾患の処置方法
[001644] 本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患の処置方法で使用することができる。一実施形態において、それらは過剰成長性障害の処置に使用するためのものである。それらは、本明細書及び以下の段落に記載されている通り他の障害の処置にも使用され得る。
[001645] 一部の実施形態において、過剰成長性障害は癌である。一部の実施形態において、過剰成長性障害は固形腫瘍癌である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、胃腸癌、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、過剰成長性障害は血液学的悪性腫瘍である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。
[001646] 一部の実施形態において、癌は、高頻度変異癌表現型である。高頻度変異癌は、Campbell, et al.に広く記載されている（Cell, 171:1042-1056 (2017)；全ての目的のために全体として参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態において、高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり９～１０個の変異を含む。一部の実施形態において、小児の高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり９．９１個の変異を含む。一部の実施形態において、成人の高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり９個の変異を含む。一部の実施形態において、増強された高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり１０～１００個の変異を含む。一部の実施形態において、増強された小児の高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり１０～１００個の変異を含む。一部の実施形態において、増強された成人の高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり１０～１００個の変異を含む。一部の実施形態において、超高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり１００個を超える変異を含む。一部の実施形態において、小児の超高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり１００個を超える変異を含む。一部の実施形態において、成人の超高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり１００個を超える変異を含む。
[001647] 一部の実施形態において、高頻度変異腫瘍は、複製修復経路に変異を有する。一部の実施形態において、高頻度変異腫瘍は、複製修復関連ＤＮＡポリメラーゼに変異を有する。一部の実施形態において、高頻度変異腫瘍はマイクロサテライト不安定性を有する。一部の実施形態において、超高頻度変異腫瘍は、複製修復関連ＤＮＡポリメラーゼに変異を有し、マイクロサテライト不安定性を有する。一部の実施形態において、腫瘍の高頻度変異は、免疫チェックポイント阻害剤に対する応答と相関している。一部の実施形態において、高頻度変異腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤による処置に耐性である。一部の実施形態において、高頻度変異腫瘍は、本発明のＴＩＬを使用して処置することができる。一部の実施形態において、腫瘍の高頻度変異は、環境要因（外因性曝露）によって引き起こされる。例えば、ＵＶ光線は、悪性黒色腫における多数の変異の主な原因であり得る（例えば、Pfeifer, G.P., You, Y.H.,及びBesaratinia, A.(2005).Mutat.Res.571, 19-31.；Sage, E.(1993).Photochem.Photobiol.57, 163-174を参照されたい)。一部の実施形態において、腫瘍の高頻度変異は、直接の変異誘発物質への曝露により、肺及び喉頭の腫瘍並びに他の腫瘍について、タバコ煙中の６０を超える発癌物質によって引き起こされ得る（例えば、Pleasance, E.D., Stephens, P.J., O’Meara, S., McBride, D.J., Meynert, A., Jones, D., Lin, M.L., Beare, D., Lau, K.W., Greenman, C., et al. (2010). Nature 463, 184-190を参照されたい）。一部の実施形態において、腫瘍における高頻度変異は、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーメンバーの調節不全によって引き起こされ、これは、広範な癌においてＣからＴへの移行のレベルの増加をもたらすことが示されている（例えば、Roberts, S.A., Lawrence, M.S., Klimczak, L.J., Grimm, S.A., Fargo, D., Stojanov, P., Kiezun, A., Kryukov, G.V., Carter, S.L., Saksena, G., et al.(2013). Nat. Genet. 45, 970-976を参照されたい）。一部の実施形態において、腫瘍の高頻度変異は、主要な複製酵素であるＰｏｌ３及びＰｏｌｄ１によって実行される、プルーフリーディングを損なう変異による欠陥のあるＤＮＡ複製修復によって引き起こされる。一部の実施形態において、腫瘍の高頻度変異は、結腸直腸癌、子宮内膜癌及び他の癌の高頻度変異に関連するＤＮＡミスマッチ修復の欠陥によって引き起こされる(例えば、Kandoth, C., Schultz, N., Cherniack, A.D., Akbani, R., Liu, Y., Shen, H., Robertson, A.G., Pashtan, I., Shen, R., Benz, C.C., et al.; (2013). Nature 497, 67-73.；Muzny, D.M., Bainbridge, M.N., Chang, K., Dinh, H.H., Drummond, J.A., Fowler, G., Kovar, C.L., Lewis, L.R., Morgan, M.B., Newsham, I.F., et al.; (2012). Nature 487, 330-337を参照されたい）。一部の実施形態において、ＤＮＡ複製修復変異は、体質性又は両アレル性のミスマッチ修復欠損症（ＣＭＭＲＤ）、リンチ症候群及びポリメラーゼプルーフリーディング関連ポリポーシス（ＰＰＡＰ）などの癌素因症候群にも見られる。
[001648] 一実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団を用いて癌を処置する方法を含み、ここで、癌は、高頻度変異癌である。一実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団を用いて癌を処置する方法を含み、ここで、癌は、増強された高頻度変異癌である。一実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団を用いて癌を処置する方法を含み、ここで、癌は、超高頻度変異癌である。
[001649] 一実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を処置する方法を含み、ここで患者は本開示に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入の２７～２３日前）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。一実施形態において、本開示による骨髄非破壊的化学療法及びＴＩＬ注入（０日目）後、患者は生理学的許容量まで８時間ごとに７２０，０００ＩＵ／ｋｇでＩＬ－２の静脈内注入を受ける。
[001650] 示された疾患又は障害の処置、予防及び／又は管理における本明細書に記載の化合物及び化合物の組み合わせの有効性は、ヒト疾患の処置のためのガイダンスを提供する当技術分野で公知の様々なモデルを使用して試験することができる。例えば、卵巣癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92；及びFong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12に記載がある。膵臓癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294に記載がある。乳癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212に記載がある。黒色腫の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859に記載がある。肺癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664に記載がある。肺癌処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60；及びSano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32に記載がある。
[001651] 一部の実施形態において、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）は、過剰成長性傷害の処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された対象の血液中のＩＦＮ－γは、活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能のもう１つの尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、本発明の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、本方法で得られたＴＩＬは、図１（特に例えば図１Ｂ）及び本出願全体に例示されるように、Ｇｅｎ３プロセスと称される方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された対象と比較して、本方法のＴＩＬで処置された対象の血液中のＩＦＮ－γの増加をもたらす。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γの増加は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以上増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、３倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、４倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γはQuantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γはQuantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者からのＴＩＬエキソビボにおいて測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者の血液において測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者の血清において測定される。
[001652] 一部の実施形態において、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に記載されるものを含む本発明の方法により調製されたＴＩＬは、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に例示されない、例えばプロセス１Ｃメソッドと称されるものを含む他の方法により作製されるＴＩＬと比較してポリクローナル性の増加を示す。一部の実施形態において、有意に改善されたポリクローナル性及び／又は増加したポリクローナル性は、癌処置の処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性とは、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。一部の実施形態において、ポリクローナル性の増加は、本発明の方法によって作製されたＴＩＬの投与に関する処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍又は１０００倍が増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０００倍増加する。
２．共投与方法
[001653] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるように作製されるＴＩＬ（例えば、図１（特に例えば図１Ｂ）のステップＡ～Ｆに記載される方法から得られたＴＩＬを含む）は、以下に記載する抗体など、１つ以上の免疫チェックポイント調節因子と併用して投与することができる。例えば、ＰＤ－１を標的とする、且つ本発明のＴＩＬと共投与し得る抗体としては、例えば、限定はされないが、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、Bristol-Myers Squibb；Opdivo（登録商標））、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５又はＭＫ－３４７５、Merck；Keytruda（登録商標））、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＪＳ００１（ShangHai JunShi）、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体ＴＳＲ－０４２（Tesaro, Inc.）、ピディリズマブ（抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＣＴ－０１１、Medivation）、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ＢＧＢ－Ａ３１７（BeiGene）及び／又は抗ＰＤ－１抗体ＳＨＲ－１２１０（ShangHai HengRui）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Regeneron）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ－１１０６（Bristol-Myers Squibb）及び／又はヒト化抗ＰＤ１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Novartis）が挙げられる。一部の実施形態において、ＰＤ－１抗体は、クローン：ＲＭＰ１－１４（ラットＩｇＧ）－BioXcellカタログ番号BP0146からのものである。本明細書に記載される通りのステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適な他の好適な抗体は、米国特許第８，００８，４４９号（参照により本明細書に援用される）に開示される抗ＰＤ－１抗体である。一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－１とのその相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。ＰＤ－Ｌ１に結合してＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する当技術分野において公知の任意の抗体が、本明細書に記載される通りのステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適である。例えば、ＰＤ－Ｌ１を標的とする臨床試験中の抗体としては、ＢＭＳ－９３６５５９（Bristol-Myers Squibb）及びＭＰＤＬ３２８０Ａ（Genentech）が挙げられる。ＰＤ－Ｌ１を標的とする他の好適な抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号（参照により本明細書に援用される）に開示される。当業者は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に記載される通りのステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適であることを理解するであろう。一部の実施形態において、ステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬの組み合わせを投与される対象は、患者が抗ＰＤ－１抗体単独の投与に不応性の癌型を有するとき抗ＰＤ－１抗体と共投与される。一部の実施形態において、患者が難治性黒色腫を有するとき、患者はＴＩＬを抗ＰＤ－１と併用して投与される。一部の実施形態において、患者が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有するとき、患者はＴＩＬを抗ＰＤ－１と併用して投与される。
３．任意選択による患者のリンパ球枯渇プレコンディショニング
[001654] 一実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を処置する方法を含み、ここで患者は本開示に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、本発明は、骨髄非破壊的化学療法で前処置された患者の癌処置に使用するためのＴＩＬの集団を含む。一実施形態において、ＴＩＬの集団は注入による投与用である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入の２７～２３日前）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本開示に係るＴＩＬ注入（０日目）後、患者は生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２（アルデスロイキン、PROLEUKINとして市販）の静脈内注入を受ける。特定の実施形態において、ＴＩＬの集団は、ＩＬ－２と組み合わせて癌を処置するのに使用され、ＩＬ－２はＴＩＬの集団後に投与される。
[001655] 実験的知見は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素（「サイトカインシンク」）を排除することによって処置効果を高めるのに重要な役割を果たすことを示す。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のＴＩＬを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。
[001656] 一般的に、リンパ球枯渇はフルダラビン又はシクロホスファミド（活性型はマホスファミドと称される）及びその組み合わせの投与を使用して達成される。かかる方法については、Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239及びDudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357（これらは全て、参照により全体として本明細書に援用される）に記載されている。
[001657] 一部の実施形態において、フルダラビンは、０．５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日以上にわたって実施される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日又は４５ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間にわたって実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間にわたって実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、２５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間にわたって実施される。
[001658] 一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により０．５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの濃度で入手される。一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により１μｇ／ｍＬの濃度で入手される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日以上にわたって実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、１００ｍｇ／ｍ２／日、１５０ｍｇ／ｍ２／日、１７５ｍｇ／ｍ２／日、２００ｍｇ／ｍ２／日、２２５ｍｇ／ｍ２／日、２５０ｍｇ／ｍ２／日、２７５ｍｇ／ｍ２／日又は３００ｍｇ／ｍ２／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは静脈内（即ちｉ．ｖ．）投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間にわたって実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で、４～５日間にわたって実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で、４日間にわたって実施される。
[001659] 一部の実施形態において、リンパ球枯渇は、フルダラビン及びシクロホスファミドを共に患者に投与することによって行われる。一部の実施形態において、４日間にわたって、フルダラビンは２５ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与され、シクロホスファミドは、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与される。
[001660] 一実施形態において、リンパ球枯渇は、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与により実施される。
４．ＩＬ－２又は直交性ＩＬ－２レジメン
[001661] 一実施形態において、ＩＬ－２レジメン又は直交性ＩＬ－２レジメンは、治療有効部分の投与の翌日から静脈内投与される高用量ＩＬ－２レジメン又は直交性ＩＬ－２レジメンを含み、治療用ＴＩＬ集団の治療有効部分を投与した１日後から静脈に内投与され始め、高用量ＩＬ－２レジメン又は直交性ＩＬ－２レジメンはアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくはそれらの変異体を含み、アルデロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体が８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入を使用して、最大１４用量で、０．０３７ｍｇ／ｋｇ又は０．０４４ｍｇ／ｋｇ ＩＵ／ｋｇ（患者の体重）の用量で投与される。９日間の休息後、このスケジュールを更に１４回、合計で最大２８回まで繰り返し得る。
[001662] 一実施形態において、ＩＬ－２レジメン又は直交性ＩＬ－２レジメンは、漸減性ＩＬ－２レジメンを含む。漸減性ＩＬ－２レジメンは、O’Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61及びEton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に援用される。一実施形態において、漸減性ＩＬ－２レジメンは、１８×１０６ ＩＵ／ｍ２の６時間にわたる静脈内投、それに続く１８×１０６ ＩＵ／ｍ２の１２時間にわたる静脈内投与、その後、１８×１０６ ＩＵ／ｍ２の２４時間にわたる静脈内投与、その後、４．５×１０６ ＩＵ／ｍ２の７２時間にわたる静脈内投与を含む。この処置サイクルは、最大４サイクル、２８日毎に繰り返し得る。一実施形態において、漸減性ＩＬ－２レジメンは、１日目の１８，０００，０００ＩＵ／ｍ２、２日目の９，０００，０００ＩＵ／ｍ２、３日目及び４日目の４，５００，０００ＩＵ／ｍ２を含む。
[001663] 一実施形態において、ＩＬ－２レジメン又は直交性ＩＬ－２レジメンは、０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の用量で、１、２、４、６、７、１４又は２１日毎にペグ化ＩＬ－２を投与することを含む。
[001664] 直交性ＩＬ－２受容体、例えば本明細書に記載の直交性ＩＬ－２Ｒβを発現する治療用ＴＩＬ集団について、直交性ＩＬ－２は、上記のＩＬ－２レジメンにおいて代替されることが理解される。直交性ＩＬ－２受容体、例えば本明細書に記載の直交性ＩＬ－２Ｒβを発現する治療用ＭＩＬ集団について、直交性ＩＬ－２は、上記のＩＬ－２レジメンにおいて代替されることが理解される。さらに、直交性ＩＬ－２受容体、例えば直交性ＩＬ－２Ｒβを発現する治療用ＰＢＬ集団について、直交性ＩＬ－２は、上記のＩＬ－２レジメンにおいて代替されることが理解される。
[001665] 直交性ＩＬ－２は、等しい国際単位（ＩＵ）に基づいてProleukin（登録商標）（アルデスロイキン）及び野生型ＩＬ－２で代替されることが理解される。
５．養子細胞移入
[001666] 養子細胞移入（ＡＣＴ）は、有効な形態の免疫療法であり、抗腫瘍活性を有する免疫細胞を癌患者に移入することを含む。ＡＣＴは、抗腫瘍活性を有するリンパ球のインビトロ同定、それらの細胞の数を増やすインビトロ拡大培養及び癌担持宿主へのその注入を伴う治療手法である。養子移入に使用されるリンパ球は、切除された腫瘍の間質に由来し得る（腫瘍浸潤リンパ球又はＴＩＬ）。ＡＣＴのためのＴＩＬは、本明細書に記載される通り調製することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば図１（特に例えば図１Ｂ）に記載される通りの方法により調製される。ＴＩＬは、抗腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている場合に血液からも誘導され得るか、混合リンパ球腫瘍細胞培養物（ＭＬＴＣ）でエンリッチされ得るか、又は自己抗原提示細胞及び腫瘍由来ペプチドを使用してクローニングされ得る。注入しようとする癌担持宿主にリンパ球が由来するＡＣＴは、自己ＡＣＴと称される。米国特許出願公開第２０１１／００５２５３０号は、主に転移性黒色腫に罹患している患者の治療に向けた、癌退縮を促進するため養子細胞療法を実施する方法に関する（これらの方法に関して全体として参照により組み込まれる）。一部の実施形態において、ＴＩＬは、本明細書に記載される通り投与することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは単回用量で投与することができる。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ＴＩＬ及び／又は細胞傷害性リンパ球は複数回用量で投与され得る。投与は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回又は６回を超え得る。投与は、月に１回、２週間に１回、週に１回又は隔日に１回であり得る。ＴＩＬ及び／又は細胞傷害性リンパ球の投与は必要な限り継続され得る。
６．追加の処置方法
[001667] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれか１つに記載された治療有効投与量の治療用ＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001668] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療有効投与量のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001669] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団の治療有効投与量又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物の治療有効投与量を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に投与されているように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001670] 別の実施形態において、本発明は、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間シクロホスファミドを投与し、続いて２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間フルダラビンを投与するステップを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001671] 別の実施形態において、本発明は、対象にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ－２レジメンで対象を処置するステップをさらに含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001672] 別の実施形態において、本発明は、高用量ＩＬ－２レジメンが、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001673] 別の実施形態において、本発明は、癌が固形腫瘍であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001674] 別の実施形態において、本発明は、癌が、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌又は腎細胞癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001675] 別の実施形態において、本発明は、癌が黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001676] 別の実施形態において、本発明は、癌が黒色腫であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001677] 別の実施形態において、本発明は、癌がＨＮＳＣＣであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001678] 別の実施形態において、本発明は、癌が子宮頸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001679] 別の実施形態において、本発明は、癌がＮＳＣＬＣであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001680] 別の実施形態において、本発明は、癌が神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001681] 別の実施形態において、本発明は、癌が胃腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001682] 別の実施形態において、本発明は、癌が高頻度変異癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001683] 別の実施形態において、本発明は、癌が小児高頻度変異癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001684] 別の実施形態において、本発明は、治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物が直交性ＩＬ－２Ｒを発現する操作されたＴＩＬ細胞を含み、治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物による対象の処置後、対象が直交性ＩＬ－２Ｒに相補的な直交性ＩＬ－２で処置されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001685] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２Ｒが直交性ＩＬ－２Ｒβを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置するための方法を提供する。
[001686] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２Ｒβが、Ｑ７０Ｙ、Ｔ７３Ｄ、Ｔ７３Ｙ、Ｈ１３３Ｄ、Ｈ１３３Ｅ、Ｈ１３３Ｋ、Ｙ１３４Ｆ、Ｙ１３４Ｅ、Ｙ１３４Ｒ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。
[001687] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２Ｒに相補的な直交性ＩＬ－２が、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ／Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｔ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｓ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｖ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｔ］；［Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｎ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｄ、Ｔ５１Ｉ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｙ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］及び［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ａ］からなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置するための方法を提供する。
[001688] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２Ｒβが、Ｑ７０Ｙ；Ｔ７３Ｄ；Ｔ７３Ｙ；Ｈ１３３Ｄ、Ｈ１３３Ｅ；Ｈ１３３Ｋ；Ｙ１３４Ｆ；Ｙ１３４Ｅ；Ｙ１３４Ｒ及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換の１つ以上を含み、相補的な直交性ＩＬ－２が、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ／Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｔ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｓ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｖ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｔ］；［Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｎ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｄ、Ｔ５１Ｉ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｙ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］及び［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ａ］からなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置するための方法を提供する。
[001689]
[001690] 別の実施形態において、本発明は、治療有効投与量の治療用ＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法における使用のための、上記の該当する先の段落のいずれか１つに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。
[001691] 別の実施形態において、本発明は、治療有効投与量のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法における使用のための、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。
[001692] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物の治療有効投与量を対象に投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に投与されているように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。
[001693] 別の実施形態において、本発明は、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間シクロホスファミドを投与し、続いて２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間フルダラビンを投与するステップを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。
[001694] 別の実施形態において、本発明は、患者にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ－２レジメンで患者を治療するステップを更に含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。
[001695] 別の実施形態において、本発明は、高用量ＩＬ－２レジメンが、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。
[001696] 別の実施形態において、本発明は、癌が固形腫瘍であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。
[001697] 別の実施形態において、本発明は、癌が、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌又は腎細胞癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。
[001698] 別の実施形態において、本発明は、癌が黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。
[001699] 別の実施形態において、本発明は、癌が黒色腫であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。
[001700] 別の実施形態において、本発明は、癌がＨＮＳＣＣであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。
[001701] 別の実施形態において、本発明は、癌が子宮頸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。
[001702] 別の実施形態において、本発明は、癌がＮＳＣＬＣであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。
[001703] 別の実施形態において、本発明は、癌が神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。
[001704] 別の実施形態において、本発明は、癌が胃腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。
[001705] 別の実施形態において、本発明は、癌が高頻度変異癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。
[001706] 別の実施形態において、本発明は、癌が小児高頻度変異癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。
[001707] 別の実施形態において、本発明は、治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物が直交性ＩＬ－２Ｒを発現する操作されたＴＩＬ細胞を含み、治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物による対象の処置後、対象が直交性ＩＬ－２Ｒに相補的な直交性ＩＬ－２で処置されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。
[001708] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２Ｒが直交性ＩＬ－２Ｒβを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。
[001709] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２Ｒβが、Ｑ７０Ｙ；Ｔ７３Ｄ；Ｔ７３Ｙ；Ｈ１３３Ｄ、Ｈ１３３Ｅ；Ｈ１３３Ｋ；Ｙ１３４Ｆ；Ｙ１３４Ｅ；Ｙ１３４Ｒ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。
[001710] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２Ｒに相補的な直交性ＩＬ－２が、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ／Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｔ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｓ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｖ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｔ］；［Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｎ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｄ、Ｔ５１Ｉ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｙ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］及び［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ａ］からなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。
[001711] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２Ｒβが、Ｑ７０Ｙ、Ｔ７３Ｄ、Ｔ７３Ｙ、Ｈ１３３Ｄ、Ｈ１３３Ｅ、Ｈ１３３Ｋ、Ｙ１３４Ｆ、Ｙ１３４Ｅ、Ｙ１３４Ｒ及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換の１つ以上を含み、相補的な直交性ＩＬ－２が、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ／Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｔ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｓ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｖ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｔ］；［Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｎ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｄ、Ｔ５１Ｉ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｙ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］及び［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ａ］からなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。
[001712] 別の実施形態において、本発明は、治療有効投与量の治療用ＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、対象における癌を処置する方法における、上記の該当する先の段落のいずれか１つに記載された治療用ＴＩＬ集団の使用を提供する。
[001713] 別の実施形態において、本発明は、治療有効投与量のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、対象における癌を処置する方法における、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001714] 別の実施形態において、本発明は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンを対象に投与すること、次いで、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団の治療有効投与量又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物の治療有効投与量を対象に投与することを含む、対象における癌を処置する方法における、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001715] 別の実施形態において、本発明は、治療用ＴＩＬ集団の治療有効投与量又はＴＩＬ組成物の治療有効投与量を対象に投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に投与されているように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001716] 別の実施形態において、本発明は、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間シクロホスファミドを投与し、続いて２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間フルダラビンを投与するステップを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001717] 別の実施形態において、本発明は、患者にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ－２レジメンで患者を処置するステップを更に含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団の使用又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001718] 別の実施形態において、本発明は、高用量ＩＬ－２レジメンが、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001719] 別の実施形態において、本発明は、癌が固形腫瘍であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001720] 別の実施形態において、本発明は、癌が、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌又は腎細胞癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001721] 別の実施形態において、本発明は、癌が黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001722] 別の実施形態において、本発明は、癌が黒色腫であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001723] 別の実施形態において、本発明は、癌がＨＮＳＣＣであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001724] 別の実施形態において、本発明は、癌が子宮頸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001725] 別の実施形態において、本発明は、癌がＮＳＣＬＣであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001726] 別の実施形態において、本発明は、癌が神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001727] 別の実施形態において、本発明は、癌が胃腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001728] 別の実施形態において、本発明は、癌が高頻度変異癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001729] 別の実施形態において、本発明は、癌が小児高頻度変異癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001730] 別の実施形態において、本発明は、治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物が直交性ＩＬ－２Ｒを発現する操作されたＴＩＬ細胞を含み、治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物による対象の処置後、対象が直交性ＩＬ－２Ｒに相補的な直交性ＩＬ－２で処置されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001731] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２Ｒが直交性ＩＬ－２Ｒβを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001732] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２Ｒβが、Ｑ７０Ｙ、Ｔ７３Ｄ、Ｔ７３Ｙ、Ｈ１３３Ｄ、Ｈ１３３Ｅ、Ｈ１３３Ｋ、Ｙ１３４Ｆ、Ｙ１３４Ｅ、Ｙ１３４Ｒ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001733] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２Ｒに相補的な直交性ＩＬ－２が、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ／Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｔ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｓ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｖ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｔ］；［Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｎ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｄ、Ｔ５１Ｉ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｙ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］及び［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ａ］からなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001734] 別の実施形態において、本発明は、直交性ＩＬ－２Ｒβが、Ｑ７０Ｙ、Ｔ７３Ｄ、Ｔ７３Ｙ、Ｈ１３３Ｄ、Ｈ１３３Ｅ、Ｈ１３３Ｋ、Ｙ１３４Ｆ、Ｙ１３４Ｅ、Ｙ１３４Ｒ及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換の１つ以上を含み、相補的な直交性ＩＬ－２が、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ／Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｔ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｓ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｖ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｔ］；［Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｎ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｄ、Ｔ５１Ｉ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｙ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］及び［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ａ］からなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。
[001735] 一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養させたＴＩＬは医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示の方法を使用して拡大培養されたＴＩＬは、当技術分野において公知の任意の適切な経路によって投与され得る。好ましくは、ＴＩＬは単一の動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくはおよそ３０～６０分続く。他の適切な投与経路には、腹腔内投与、髄腔内投与及びリンパ管内投与が含まれる。
[001736] 任意の適切な用量のＴＩＬを投与することができる。好ましくは、特に癌が血液悪性腫瘍である場合、平均が約７．８×１０１０ＴＩＬである約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０ＴＩＬが投与される。一実施形態において、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０のＴＩＬが投与される。
[001737] 進行中の実施形態のいずれか１つにおいて、治療用ＴＩＬ集団は、直交性ＩＬ－２サイトカインを認識する直交性ＩＬ－２Ｒを発現するように操作され得る。ＩＬ－２Ｒ操作されたＴＩＬのそのような治療用集団が医薬組成物として患者に投与される場合、直交性ＩＬ－２は、等しい国際単位（ＩＵ）に基づいてProleukin（登録商標）（アルデスロイキン）で代替される。疑念を避けるために、６００，０００ＩＵのアルデスロイキンが示されている場合、６００，０００ＩＵの直交性ＩＬ－２が示されている。
[001738] 一態様では、直交性ヒトＩＬ－２を産生するためのヒトＩＬ－２のアミノ酸置換のセットは、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ／Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｔ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｓ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｖ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｔ］；［Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｎ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｄ、Ｔ５１Ｉ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｙ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］及び［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ａ］からなる群から選択され、相補的な直交性ＩＬ２－Ｒβは、Ｑ７０Ｙ、Ｔ７３Ｄ、Ｔ７３Ｙ、Ｈ１３３Ｄ、Ｈ１３３Ｅ、Ｈ１３３Ｋ、Ｙ１３４Ｆ、Ｙ１３４Ｅ、Ｙ１３４Ｒ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換によって産生される。
７．直交性ＩＬ－２による癌の処置方法
[001739] ＩＬ－２は、エフェクターＴ細胞及び制御性Ｔ細胞の増殖をそれぞれ促進する。しかし、ＩＬ－２のこの多面的発現性及びオフターゲットの毒性により、クリニックでの使用が制限される。ＩＬ－２の免疫刺激性と免疫抑制性を分離する能力は、ＩＬ－２免疫療法の優れた形態を提供することができる。
[001740] ＩＬ－２、例えば、Proleukin（登録商標）による処置には、入院及び熟練の処置チームによる広範な支持療法を要する。実際、集中治療施設及び心肺又は集中治療医学に熟練した専門家は、患者に対する高用量ＩＬ－２の影響を管理するために利用可能でなければならない。他の条件の中でも、投与は、血管緊張の喪失並びに血漿タンパク質及び体液の血管外空間への血管外漏出を特徴とする毛細血管漏出症候群（ＣＬＳ）に関連している。ＣＬＳは、低血圧及び臓器灌流の低下を引き起こし、これは重度である可能性があり、死に至り得る。ＣＬＳは、心不整脈（上室性及び心室性）、狭心症、心筋梗塞、挿管を必要とする呼吸不全、胃腸出血又は梗塞、腎不全、浮腫及び精神状態の変化に関連づけられ得る。中等度から重度の嗜眠又は傾眠も発症し得る。そのような患者において、継続的な投与は昏睡を引き起こし得る。
[001741] 操作された（直交性）ＩＬ－２サイトカインは、野生型ＩＬ－２Ｒβ受容体によって認識されないため、上記の全身毒性は誘発されない。操作された（直交性）サイトカインは、対応する操作された（直交性）受容体に特異的に結合する。結合すると、直交性受容体は、天然の細胞要素を介して伝達されるシグナル伝達を活性化して、その天然の応答を模倣する生物学的活性を提供するが、これは、直交性受容体を発現する操作された細胞に特異的なものである。直交性受容体は、直交性サイトカインの天然の対応物を含む内因性の対応するサイトカインに結合しない一方、直交性サイトカインは、直交性受容体の天然の対応物を含むいかなる内因性受容体にも結合しない。一部の実施形態において、直交性受容体に対する直交性サイトカインの親和性は、天然受容体に対する天然サイトカインの親和性と同等である。
[001742] 一態様では、直交性ヒトＩＬ－２を産生するためのヒトＩＬ－２のアミノ酸置換のセットは、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ／Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｔ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｓ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｑ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｖ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ］；［Ｅ１５Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｉ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｔ］；［Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｍ、Ｑ２２Ｎ、Ｍ２３Ｓ］；［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｄ、Ｔ５１Ｉ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｙ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］及び［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ａ］からなる群から選択され、相補的な直交性ＩＬ２－Ｒβアミノ酸置換は、Ｑ７０Ｙ、Ｔ７３Ｄ、Ｔ７３Ｙ、Ｈ１３３Ｄ、Ｈ１３３Ｅ、Ｈ１３３Ｋ、Ｙ１３４Ｆ、Ｙ１３４Ｅ、Ｙ１３４Ｒ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
[001743] 本明細書に記載の処置方法において使用されるＴＩＬの集団は、直交性ＩＬ－２Ｒβを発現する操作されたＴＩＬが濃縮されているが、直交性ＩＬ－２は、臨床治療において野生型ＩＬ－２を代替し得る。一態様では、癌を有する対象の処置方法であって、方法が、
（ａ）対象から得られた腫瘍サンプルを処理して複数の腫瘍断片にすることにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の初回刺激拡大培養が、第１のガス透過性表面積を含む容器内で実施され、第１の初回刺激拡大培養が、第２のＴＩＬ集団を得るために約１～７日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、数において第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍多い、生じさせること；
（ｃ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に直交性ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを補充することにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の急速拡大培養に添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数の少なくとも２倍であり、第２の急速拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約１～１１日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団が治療用ＴＩＬ集団であり、第２の急速拡大培養が、第２のガス透過性表面積を含む容器内で実施される、生じさせること；
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収すること；
（ｅ）直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するようにＴＩＬを操作すること；
（ｆ）回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと；及び
（ｇ）ステップ（ｆ）からの治療有効投与量のＴＩＬを対象に投与すること
を含む、拡大培養した直交性ＩＬ２－Ｒβ腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む方法である。
[001744] 一態様では、直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するようにＴＩＬを操作することは、ステップ（ｂ）と（ｃ）との間で行われる。別の態様では、直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するようにＴＩＬを操作することは、ステップ（ｃ）後に行われる。
[001745] 別の態様では、癌を有する対象を処置するための方法は、ステップ（ｇ）で患者にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量直交性ＩＬ－２レジメンで患者を処置するステップを更に含む。別の態様では、高用量直交性ＩＬ－２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。別の態様では、最大６用量の直交性ＩＬ－２が、８～１２時間ごとに投与される。一部の態様では、直交性ＩＬ－２の６つの用量は、それぞれ６００，０００～７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。
[001746] 直交性ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２と等しい国際単位（ＩＵ）に基づいて投与されることが理解される。
[001747] 一実施形態において、直交性ＩＬ－２レジメンは、漸減性ＩＬ－２レジメンを含む。漸減性ＩＬ－２レジメンは、O’Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61及びEton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に援用される。一実施形態において、漸減性ＩＬ－２レジメンは、１８×１０６ＩＵ／ｍ２の直交性ＩＬ－２の６時間にわたる静脈内投与、それに続く１８×１０６ＩＵ／ｍ２の直交性ＩＬ－２の１２時間にわたる静脈内投与、その後、１８×１０６ＩＵ／ｍ２の直交性ＩＬ－２の２４時間にわたる静脈内投与、その後、４．５×１０６ＩＵ／ｍ２の直交性ＩＬ－２の７２時間にわたる静脈内投与を含む。この処置サイクルは、最大４サイクル、２８日毎に繰り返され得る。一実施形態において、漸減性ＩＬ－２レジメンは、１日目の１８，０００，０００ＩＵ／ｍ２の直交性ＩＬ－２、２日目の９，０００，０００ＩＵ／ｍ２の直交性ＩＬ－２、３日目及び４日目の４，５００，０００ＩＵ／ｍ２の直交性ＩＬ－２を含む。
[001748] 一実施形態において、直交性ＩＬ－２レジメンは、０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の用量で、１、２、４、６、７、１４又は２１日毎にペグ化直交性ＩＬ－２を投与することを含む。
[001749] ＴＩＬ、ＭＩＬ及び／又はＰＢＬが直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように操作される癌を処置するための方法は、直交性ＩＬ－２が、癌を処置するためにＩＬ－２レジメンを利用するそのような方法において野生型ＩＬ－２を代替することが理解される。
実施例
[001750] 本明細書に包含される実施形態は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は説明のみを目的として提供され、本明細書に包含される開示は決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
実施例１：培地調製
[001751] 本例は、限定はされないが、転移性黒色腫、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、卵巣癌、トリプルネガティブ乳癌及び肺腺癌を含めた様々な腫瘍型に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の培養が関わるプロトコルに用いられる組織培養培地の調製手順について説明する。本願及び実施例に記載される任意のＴＩＬの調製にこの培地を使用することができる。
ＣＭ１の調製
[001752] 低温貯蔵庫から以下の試薬を取り出し、３７℃の水浴中で加温した：（ＲＰＭＩ１６４０、ヒトＡＢ血清、２００ｍＭＬ－グルタミン）。以下の表１９に従い、濾過される容積に適切な０．２μｍフィルターユニットの上部に成分の各々を加えることによりＣＭ１培地を調製した。４℃で保管。
Figure 2022514023000024
[001753] 使用当日、所要量のＣＭ１を３７℃の水浴中で予め加温し、６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を添加した。
[001754] 追加的な補充－必要があれば表２０に準じる。
Figure 2022514023000025
ＣＭ２の調製
[001755] 冷蔵庫から調製済みのＣＭ１を取り出した、又は上記の表１９に従い新鮮ＣＭ１を調製する。AIM-V（登録商標）を冷蔵庫から取り出し、滅菌培地ボトル内に調製済みＣＭ１を等容積のAIM-V（登録商標）と混合することにより、必要な量のＣＭ２を調製した。使用当日、ＣＭ２培地に３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を加えた。使用当日、十分な量の３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２含有ＣＭ２を作成した。ＣＭ２培地ボトルに、その名前、調製者のイニシャル、それが濾過／調製された日付、２週間の有効期限の表示を付し、組織培養に必要になるまで４℃で貯蔵した。
ＣＭ３の調製
[001756] 使用が必要になった当日に、ＣＭ３を調製した。ＣＭ３はAIM-V（登録商標）培地と同じであり、使用当日に３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を添加した。AIM-Vのボトル又はバッグにＩＬ－２ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のＣＭ３を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた後すぐに、ボトルに「３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２」の表示を付した。過剰なＣＭ３がある場合、これを培地名、調製者のイニシャル、培地の調製日及びその有効期限（調製後７日）を表示したボトルに４℃で貯蔵した。ＩＬ－２を添加した培地は４℃で７日間の貯蔵後に廃棄した。
ＣＭ４の調製
[001757] ＣＭ４はＣＭ３と同じであり、加えて２ｍＭのGlutaMAX（商標）（最終濃度）を添加した。１ＬのＣＭ３について１０ｍｌの２００ｍＭ GlutaMAX（商標）を加えた。AIM-Vのボトル又はバッグにＩＬ－２ストック溶液及びGlutaMAX（商標）ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のＣＭ４を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた後すぐに、ボトルに「３０００ＩＬ／ｎｉｌ ＩＬ－２及びGlutaMAX」の表示を付した。過剰なＣＭ４がある場合、これを培地名「GlutaMAX」及び有効期限（調製後７日）とボトルにラベル付けし、４℃で貯蔵した。ＩＬ－２を添加した培地は４℃で７日間の貯蔵後に廃棄した。
実施例２：ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１サイトカインカクテルの使用
[001758] この実施例では、追加のＴ細胞成長因子として機能するＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１サイトカインの使用を、実施例Ａ～ＧのＴＩＬプロセスと組み合わせて説明する。
[001759] 本明細書に記載されるプロセスを使用して、実験の片腕で、ＩＬ－２の存在下で、結腸直腸、黒色腫、子宮頸、三種陰性乳房、肺及び腎臓の腫瘍から、もう一方で、培養の開始時にＩＬ－２の代わりにＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の組み合わせで、ＴＩＬを成長させた。プレＲＥＰの完了時に、培養物の拡大培養、表現型、機能（ＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮ－γ）及びＴＣＲ Ｖβレパートリーを評価した。ＩＬ－１５及びＩＬ－２１は、本明細書の他の箇所及びGruijl et al.に記載されている通り、ＩＬ－２１は、ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋腫瘍浸潤リンパ球の成長を促進し、細胞傷害能が高く、制御性Ｔ細胞の副次的成長が少ない。Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/）。
[001760] 結果は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１で処理した条件のＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の両方で、ＩＬ－２のみの条件と比較して複数の組織でＴＩＬ拡大培養の増強（＞２０％）が観察されたことを示した。ＩＬ－２のみの培養物と比べて、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１で処理した培養物から得られたＴＩＬには、偏ったＴＣＲ Ｖβレパートリーを含むＣＤ８＋集団が主に偏っていた。ＩＦＮγ及びＣＤ１０７ａは、ＩＬ－２のみで処理したＴＩＬと比較して、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１で処理したＴＩＬで上昇した。
ＩＬ－２ストック溶液の調製（Cellgenix）
[001761] この実施例は、精製され凍結乾燥された組換えヒトインターロイキン－２を、ｒｈＩＬ－２の使用を含むものを含む本願及び実施例に記載されたものを全て含む更なる組織培養プロトコルでの使用に適したストックサンプルに溶解するプロセスを説明する。
手順
[001762] ０．２％酢酸溶液（ＨＡｃ）を調製した。２９ｍＬ滅菌水を５０ｍＬコニカルチューブに移した。１ｍＬの１Ｎ酢酸を５０ｍＬのコニカルチューブに加えた。チューブを２～３回反転させることにより十分に混合した。Steriflipフィルターを使用して濾過することによりＨＡｃ溶液を滅菌した。
[001763] ＰＢＳ中で１％ＨＳＡを調製した。１５０ｍＬ滅菌フィルターユニット内の９６ｍＬ ＰＢＳに４ｍＬの２５％ＨＳＡストック溶液を加えた。溶液を濾過した。４℃で貯蔵。調製したｒｈＩＬ－２の各バイアルについて、書式に記入した。
[001764] ｒｈＩＬ－２ストック溶液（６×１０６ＩＵ／ｍＬ最終濃度）を調製した。ｒｈＩＬ－２はロット毎に異なり、製造者の分析証明書（ＣＯＡ）に掲載されている以下のような情報が必要であった：１）１バイアルあたりのｒｈＩＬ－２の質量（ｍｇ）、２）ｒｈＩＬ－２の比活性（ＩＵ／ｍｇ）及び３）推奨０．２％ＨＡｃ再構成容量（ｍＬ）
[001765] ｒｈＩＬ－２ロットに必要な１％ＨＳＡの容積は、以下の式を用いて計算した。
Figure 2022514023000026
[001766] 例えば、CellGenixのｒｈＩＬ－２ロット１０２００１２１ ＣＯＡによれば、１ｍｇバイアルの比活性は２５×１０６ＩＵ／ｍｇである。２ｍＬの０．２％ＨＡｃ中にｒｈＩＬ－２を再構成することが推奨されている。
Figure 2022514023000027
[001767] ＩＬ－２バイアルのゴム栓をアルコールワイプで拭き取った。３ｍＬシリンジに取り付けた１６Ｇ針を使用して、推奨容積の０．２％ＨＡｃをバイアルに注入した。針を引き抜くときに栓が外れないよう注意を払った。バイアルを３回反転させて、粉末が全て溶解するまで回した。栓を慎重に取り外し、アルコールワイプ上に置いておいた。計算した容積の１％ＨＳＡをバイアルに加えた。
[001768] ｒｈＩＬ－２溶液の貯蔵。短期貯蔵（＜７２時間）の場合、バイアルを４℃で貯蔵した。長期貯蔵（＞７２時間）について、バイアルを少量のアリコートに分け、使用直前まで－２０℃でクライオバイアルに貯蔵した。凍結／解凍サイクルを避けた。調製日から６ヵ月後の期限日を記録した。ｒｈ－ＩＬ－２表示には、販売業者及びカタログ番号、ロット番号、有効期限、作業者イニシャル、アリコートの濃度及び容積が含まれた。
実施例４：凍結保存プロセス
[001769] この実施例では、CryoMed Controlled Rate Freezer、Model 7454（Thermo Scientific）を使用して、実施例Ｇで説明した短縮閉鎖手順で調製したＴＩＬの凍結保存プロセス方法について説明する。
[001770] 使用した機器は、アルミニウム製カセットホルダーラック（ＣＳ７５０冷凍バッグと互換性あり）、７５０ｍＬバッグのための低温保存カセット、低圧（２２ｐｓｉ）液体窒素タンク、冷蔵庫、熱電対センサー（バッグのためのリボンタイプ）及びCryoStore ＣＳ７５０凍結バッグ（OriGen Scientific）であった。
[001771] 凍結プロセスは、核形成から－２０℃まで０．５℃の速度及び最終温度－８０℃まで１分間に１℃の冷却速度を提供した。プログラムパラメータ、ステップ１ー４℃で待機；ステップ２：１．０℃／分（サンプル温度）から－４℃；ステップ３：２０．０℃／分（チャンバ温度）から－４５℃；ステップ４：１０．０℃／分（チャンバ温度）から－１０．０℃；ステップ５：０．５℃／分（チャンバ温度）から－２０℃；及びステップ６：１．０℃／分（サンプル温度）－８０℃までであった。
ＧＥＮ３の例示的なプロセス
[001772] この実施例では、Ｇｅｎ２とＧｅｎ３のプロセスの比較を取り扱う。この実施例は、確固としたＴＩＬ拡大培養のプラットフォームの開発を説明する。Ｇｅｎ２プロセスの改良により、作業者の介入回数を減らし、製造時間全体を短縮し、試薬の使用を最適化し、商業規模でのハイスループット製造に適した柔軟な半閉鎖型半自動細胞産生プロセスの受け入れ可能を促進することで、リスクを低減し、製造プロセスを合理化する。
[001773] プロセスＧｅｎ２及びＧｅｎ３ＴＩＬは、腫瘍の外科的切除を通じて個々の患者から得られた自己ＴＩＬで構成され、エクスビボで拡大培養される。Ｇｅｎ３プロセスの第１の初回刺激拡大培養ステップは、インターロイキン２（ＩＬ－２）及び照射された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の足場上のＴ細胞共同受容体ＣＤ３を標的とするモノクローナル抗体ＯＫＴ３の存在下での細胞培養である。
[001774] Ｇｅｎ２ＴＩＬ産物の産生は、２つのフェーズで構成されている。１）プレ急速拡大培養（Ｐｒｅ－ＲＥＰ）及び２）急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）。プレＲＥＰ中に切除された腫瘍は、各寸法で２～３ｍｍの５０個以下の断片に切断され、血清含有培養培地（１０％ＨｕＳＡＢを含むRPMI 1640培地を補充）及び６，０００ＩＵ／ｍＬのインターロイキン－２（ＩＬ－２）で、１１日間培養された。１１日目にＴＩＬは回収され、大規模な第２のＲＥＰ拡大培養に導入された。ＲＥＰは、５日間、３０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を補充したＣＭ２の５Ｌ容量に１５０ｕｇのモノクローナル抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）で充填した５×１０９個の照射した同種異系ＰＢＭＣｓフィーダー細胞の共培養におけるプレＲＥＰからの２００×１０６個以下の生細胞の活性化で構成されている。１６日目に、培養物の容量が９０％減少し、細胞画分が複数のG-REX-500フラスコに１×１０９個を超える生存リンパ球／フラスコで、ＣＭ４でＱＳに５Ｌに分割される。ＴＩＬは、６日間にわたって更にインキュベートする。ＲＥＰは２２日目に回収され、洗浄、製剤化され、凍結保存されてから、注入のために－１５０℃で臨床現場に輸送される。
[001775] Ｇｅｎ３ＴＩＬ産物の産生は、３つのフェーズで構成される。１）第１の初回刺激拡大培養のプロトコル、２）急速第２の拡大培養プロトコル（急速拡大培養フェーズ又はＲＥＰとも称される）及び３）継代培養分割。第１の初回刺激拡大培養ＴＩＬ増殖を行うために、切除された腫瘍を各寸法で２～３ｍｍの１２０個以下の断片に切断された。第１の初回刺激拡大培養の０日目、ＯＫＴ－３で充填した約２．５×１０８個の照射した同種異系ＰＢＭＣフィーダー細胞のフィーダー層を、３つの１００ＭＣＳ容器のそれぞれに約１００ｃｍ２の表面積に築いた。腫瘍の断片は、５００ ｍＬの血清含有ＣＭ１培養培地及び６，０００ＩＵ／ｍＬのインターロイキン－２（ＩＬ－２）並びに１５μｇ ＯＫＴ－３をそれぞれ７日間、３つの１００ＭＣＳ容器に分配して培養した。７日目に、ＯＫＴ－３が充填された約５×１０８の同種異系照射ＰＢＭＣフィーダー細胞の追加のフィーダー細胞層を３つの１００ＭＣＳ容器のそれぞれの腫瘍断片化培養フェーズに組み込み、５００ｍＬ ＣＭ２培養培地及び６，０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２並びに３０μｇ ＯＫＴ－３で培養することにより、ＲＥＰを開始した。ＲＥＰの開始は、１００ＭＣＳ容器へのＯＫＴ３が充填されたフィーダー細胞の閉鎖系流体移送を使用して、同じ容器で第１の初回刺激拡大培養の培養物全体を活性化することにより強化された。Ｇｅｎ３の場合、ＴＩＬのスケールアップ又は分割には、細胞培養全体を、閉鎖系流体移送を介して、より大きい容器に拡大し、移送する（１００Ｍフラスコから５００Ｍフラスコに）プロセスステップを含み、追加で４ＬのＣＭ４培地を添加した。ＲＥＰ細胞は、１６日目に回収され、洗浄、製剤化され、凍結保存されてから、注入のために－１５０℃で臨床現場に輸送される。
[001776] 全体的に、Ｇｅｎ３プロセスは、より短く、測定可能で、簡単に修正できる拡大培養プラットフォームであり、確固とした製造及びプロセスの互換性に適合するように対応する。
Figure 2022514023000028
[001777] ０日目に両方のプロセスについて、腫瘍は３回洗浄され、断片は無作為化され、２つのプール；プロセスごとに１プールに分けた。Ｇｅｎ２プロセスでは、断片を６，０００ＩＵ／ｍＬ ｒｈＩＬ－２を含む１ＬのＣＭ１培地を入れた１つのGREX 100MCSフラスコに移した。Ｇｅｎ３プロセスでは、断片を６，０００ＩＵ／ｍＬ ｒｈＩＬ－２、１５μｇ ＯＫＴ－３及び２．５×１０８フィーダー細胞を含む５００ｍＬのＣＭ１を入れた１つのGREX100MCSフラスコに移した。Ｒｅｐ開始日のＴＩＬの播種は、各プロセスに応じて、異なる日に行った。G-REX 100MCSフラスコの容量が９０％削減されたＧｅｎ２プロセスでは、収集された細胞懸濁液を新しいG-REX 500MCSに移し、ＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）、更に５ｅ９フィーダー細胞及びＯＫＴ－３（３０ｎｇ／ｍＬ）を含むＣＭ２培地で１１日目にＲＥＰ開始を開始した。細胞を増殖し、１６日目に、プロトコルごとにＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を含むＣＭ４培地の入った複数のGREX 500 MCSフラスコに分割した。次に培養物を回収し、プロトコルごとに２２日目に凍結保存した。Ｇｅｎ３プロセスでは、ＲＥＰ開始は、７日目に行われ、ＲＥＰ開始のために同じG-REX 100MCSが使用された。簡潔には、ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍＬ）を含む５００ｍＬのＣＭ２培地及び３０μｇのＯＫＴ－３を含む５×１０８フィーダー細胞を各フラスコに添加した。９～１１日目に培養物をスケールアップした。G-REX 100M（１Ｌ）の全量をG-REX 500MCSに移し、ＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を含む４ＬのＣＭ４を添加した。フラスコを５日間インキュベートした。１６日目に培養物を回収し、凍結保存した。
[001778] ３つの異なる腫瘍、２つの肺腫瘍（Ｌ４０５４及びＬ４０５５）及び１つの黒色腫腫瘍（Ｍ１０８５Ｔ）を比較対象とした。
[001779] ＣＭ１（培養培地１）、ＣＭ２（培養培地２）及びＣＭ４（培養培地４）培地は、事前に調製し、Ｌ４０５４及びＬ４０５５は４℃で保持した。培地濾過の有無で細胞増殖を比較するために濾過なしでＣＭ１及びＣＭ２培地を調製した。
[001780] ＲＥＰの開始及びスケールアップ時に、Ｌ４０５５腫瘍について、培地を事前に３７℃で最大２４時間温めた。
結果要約
[001781] 達成された生細胞の合計について、Ｇｅｎ３はＧｅｎ２の３０％以内に収まった。Ｇｅｎ３の最終産物は、再刺激後に高いＩＮＦ－γの産生を示した。Ｇｅｎ３の最終産物は、存在するユニークなＣＤＲ３配列の合計によって測定されるように、クローン多様性の増加を示した。Ｇｅｎ３最終産物は、より長い平均のテロメア長を示した。
達成した結果
細胞数及び％生存率：
[001782] Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスでのプレＲＥＰ及びＲＥＰ拡大培養は、上記の詳細に従った。
[001783] 表２２．プレＲＥＰ細胞数。各腫瘍について、２つのプールには同数の断片が含まれていた。腫瘍のサイズが小さいため、１フラスコあたりの断片の最大数は達成されなかった。総プレＲＥＰ細胞（ＴＶＣ）を回収し、Ｇｅｎ２プロセスでは１１日目、Ｇｅｎ３プロセスでは７日目に計数した。２つのｐｒｅ－ＲＥＰアームを比較するために、細胞数を培養で提供された断片の数で割って、１断片あたりの生細胞の平均を計算した。下の表に示すように、Ｇｅｎ２プロセスは、Ｇｅｎ３プロセスと比較して、１断片あたりの細胞が一貫してより増殖した。プレＲＥＰのＴＶＣを７で除算してから１１を掛けて計算される外挿計算で、ＴＶＣの数を１１日目のＧｅｎ３プロセスについて予想した。
Figure 2022514023000029
[001784] 表２３．ＴＩＬ最終産物の総生細胞数及び拡大倍数：Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスの場合、ＴＶＣはプロセス条件ごとに計数され、プロセスの各日ごとに生細胞の割合が生成された。回収時に、２２日目（Ｇｅｎ２）及び１６日目（Ｇｅｎ３）の細胞を収集し、ＴＶＣ数を確立した。次に、ＴＶＣを０日目に提供された断片の数で割り、１断片あたりの生細胞の平均を計算した。拡大倍数は、回収されたＴＶＣをＲＥＰ開始ＴＶＣで割ることによって計算された。表に示されているように、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３を比較すると、Ｌ４０５４の拡大倍数は類似しており、Ｌ４０５５の場合、Ｇｅｎ２プロセスの方が、拡大倍数が高かった。具体的には、この場合、ＲＥＰ開始日より事前に２４時間、培地が加温された。Ｍ１０８５ＴのＧｅｎ３では、より高い拡大倍数も観察された。プレＲＥＰのＴＶＣを１６で除算してから２２を掛けて計算される外挿計算で、ＴＶＣの数を２２日目のＧｅｎ３プロセスについて予想した。
Figure 2022514023000030
[001785] 表２４：ＴＩＬ最終産物の％生存率：回収時に、最終ＴＩＬ ＲＥＰ産物を生存率（％）について放出基準を比較した。Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスの全ての条件は、７０％の生存率基準を上回り、プロセス及び腫瘍全体で同等であった。
Figure 2022514023000031
[001786] 表２５：Ｇｅｎ３プロセスの追加フラスコあたりの細胞数の推定。フラスコあたりの断片数が最大必要数を下回ったため、各腫瘍について、回収日の推定細胞数を計数した。推定は、臨床腫瘍が０日目に２つ又は３つのフラスコに播種するのに十分な大きさであるという予想に基づいていた。
Figure 2022514023000032
免疫表現型検査：
ＴＩＬ最終産物の表現型マーカーの比較：
[001787] ３つの腫瘍Ｌ４０５４、Ｌ４０５５及びＭ１０８５Ｔは、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスの両方でＴＩＬ拡大培養を受けた。回収時、ＲＥＰ ＴＩＬの最終産物をフローサイトメトリー分析に供し、純度、分化及びメモリーマーカーを試験した。全ての条件で、ＴＣＲ ａ／ｂ＋細胞のパーセンテージは、９０％以上であった。
[001788] Ｇｅｎ３プロセスから回収されたＴＩＬは、Ｇｅｎ２プロセスから回収されたＴＩＬと比較して、ＣＤ８及びＣＤ２８でより高い発現を示した。Ｇｅｎ２プロセスでは、ＣＤ４＋の高いパーセンテージを示した。図３（Ａ、Ｂ、Ｃ）を参照されたい。
ＴＩＬ最終産物についてメモリーマーカーの比較：
[001789] Ｇｅｎ３プロセスから回収されたＴＩＬは、Ｇｅｎ２プロセスから回収されたＴＩＬと比較して、セントラルメモリーコンパートメントでより高い発現を示した。図４（Ａ、Ｂ、Ｃ）を参照されたい。
ＴＩＬ最終産物について活性化及び疲弊マーカーの比較：
[001790] 活性化及び疲弊マーカーを、腫瘍Ｌ４０５４及びＬ４０５５の２つからのＴＩＬで分析し、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３ ＴＩＬ拡大培養プロセスによる最終ＴＩＬ産物を比較した。活性化及び疲弊マーカーは、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセス間で同等であった。図５（Ａ、Ｂ）；図６（Ａ、Ｂ）を参照されたい。
再刺激によるインターフェロンガンマ分泌：
[001791] Ｇｅｎ２について２２日目、Ｇｅｎ３について１６日目の回収日、ＴＩＬは、Ｌ４０５４及びＬ４０５５のコーティングされた抗ＣＤ３プレートで一晩再刺激された。Ｍ１０８５Ｔの再刺激は、抗ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ１３７ビーズを使用して実行された。全ての条件で２４時間再刺激した後、上清を収集し、上清を凍結した。ＥＬＩＳＡによるＩＦＮγ分析は、同じＥＬＩＳＡプレートを使用して、同時に両方のプロセスからの上清で評価した。分析した３つの腫瘍では、Ｇｅｎ３プロセスからのＩＦＮγのより高い産生が観察された。図７（Ａ、Ｂ、Ｃ）を参照されたい。
培養培地におけるＩＬ－２レベルの測定：
[001792] Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセス間でのＩＬ－２の消費を比較するために、腫瘍のＬ４０５４及びＬ４０５５のＲＥＰの開始、スケールアップ及び回収日に細胞上清を回収した。細胞培養上清中のＩＬ－２の量は、R&DのQuantitate ELISA Kitで測定した。一般的な傾向は、Ｇｅｎ２プロセスと比較した場合、ＩＬ－２濃度がＧｅｎ３プロセスで高いままであることを示している。これは、プロセス全体にわたる培地のキャリーオーバーと相まって、Ｇｅｎ３のＲＥＰ開始時のＩＬ－２の高い濃度（６０００ＩＵ／ｍＬ）のためと考えられる。図８（Ａ、Ｂ）を参照されたい。
代謝基質及び代謝物分析
[001793] Ｄ－グルコース及びＬ－グルタミンなどの代謝基質のレベルは、全体的な培地消費の代理として測定された。乳酸及びアンモニアなどの相互代謝物を測定した。グルコースは、ミトコンドリアがＡＴＰの形でエネルギーを生成するために利用する培地中の単糖である。グルコースが酸化されると、乳酸が生成される（乳酸は乳酸のエステルである）。乳酸は細胞の指数増殖期に大きく生成される。高レベルの乳酸は、細胞培養プロセスに悪影響を及ぼす。図９（Ａ、Ｂ）を参照されたい。
[001794] Ｌ４０５４及びＬ４０５５の使用済み培地は、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３の両方のプロセスでＲＥＰの開始、スケールアップ及び回収日に収集された。Ｇｅｎ２について１１日目、１６日目及び２２日目、Ｇｅｎ３について、７日目、１１日目及び１６日目に使用済み培地を収集した。上清は、CEDEXバイオアナライザーでグルコース、乳酸、グルタミン、GlutaMAX及びアンモニアの濃度を分析した。
[001795] Ｌ－グルタミンは、細胞培養培地の製剤化に必要な不安定な必須アミノ酸である。グルタミンはアミンを含み、このアミド構造グループは、窒素を輸送して、細胞に送達することができる。Ｌ－グルタミンが酸化すると、この細胞によって有毒なアンモニア副産物が生成される。Ｌ－グルタミンの分解に対抗するために、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスのための培地は、水溶液中でより安定で自然に分解しないGlutaMAXを補充された。２つの腫瘍系統では、Ｇｅｎ３アームは、プロセス中にＬ－グルタミン及びGlutaMAXが減少し、ＲＥＰ全体を通してアンモニアが増加したことを示した。Ｇｅｎ２アームでは、一定濃度のＬ－グルタミン及びGlutaMAX並びに微増のアンモニア産生が観察された。Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３のプロセスは、アンモニアの回収日に同等であり、Ｌ－グルタミン分解にわずかな相違を示した。図１０（Ａ、Ｂ、Ｃ）を参照されたい。
フローフィッシュ（FLOW-FISH）によるテロメア測定：
[001796] フローフィッシュ（Flow-FISH）テクノロジーを使用して、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセス下でＬ４０５４及びＬ４０５５のテロメア反復の平均長を測定した。DAKOのフローサイトメトリー分析のためのテロメアＰＮＡキット／ＦＩＴＣを使用して、相対テロメア長（ＲＴＬ）の測定を計算した。Ｇｅｎ３はＧｅｎ２と同等のテロメア長を示した。
ＣＤ３分析
[001797] 各プロセスで生成された細胞産物のクローン多様性を決定するために、Ｌ４０５４及びＬ４０５５から回収されたＴＩＬ最終産物をサンプリングし、Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３部分の配列決定によるクローン多様性分析についてアッセイした。
[001798] 表２６：Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３のパーセンテージの比較は、ＴＩＬで回収した細胞産物のＬ４０５４のユニークＣＤＲ３配列を共有した。１９９配列はＧｅｎ３及びＧｅｎ２の最終産物間で共有され、Ｇｅｎ３の最終産物と共有されるＧｅｎ２からのユニークＣＤＲ３配列の上位８０％の９７．０７％に対応する。
Figure 2022514023000033
[001799] 表２７：Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３のパーセンテージの比較は、ＴＩＬ回収細胞産物においてＬ４０５５でユニークＣＤＲ３配列を共有した。１８３３配列は、Ｇｅｎ３及びＧｅｎ２の最終産物で共有され、Ｇｅｎ３最終産物と共有されるＧｅｎ２からのユニークＣＤＲ３配列の上位８０％の９９．４５％に対応する。
Figure 2022514023000034
[001800] ＣＭ１及びＣＭ２培地は、事前に濾過なしで調製し、腫瘍Ｌ４０５５がＧｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスで使用されるまで、４℃で保持された。
[001801] Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスのＲＥＰ開始日の腫瘍Ｌ４０５５について、事前に培地を３７℃で２４時間加温した。
[001802] ＬＤＨは、プロセスで収集された上清では測定されなかった。
[001803] Ｍ１０８５Ｔ ＴＩＬ細胞数は、Ｋ２セロメーターセルカウンターで実行された。
[001804] 腫瘍Ｍ１０８５Ｔでは、代謝分析のための上清、活性化及び疲弊マーカー分析のためのＴＩＬ産物、テロメア長及びＣＤ３－ＴＣＲ ｖｂ分析などのサンプルは入手できなかった。
結論
[001805] この実施例では、機能的品質の特質と、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセス間の拡張された表現型の特徴付け及び培地消費の観点から、３つの独立したドナー腫瘍組織を比較している。
[001806] Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３のプレREP及びREPの拡大培養比較を、生成された生細胞の総数及び有核細胞集団全体の生存率の観点から評価した。回収日のＴＶＣ細胞の用量は、Ｇｅｎ２（２２日）及びＧｅｎ３（１６日）で同等ではなかった。Ｇｅｎ３細胞の用量は、回収時に収集された全生細胞の約４０％で、Ｇｅｎ２より少なかった。
[001807] プレＲＥＰの回収が７日目でなく１１日目に行われ、ＲＥＰの回収が１６日目ではなく２２日目に行われると仮定して、Ｇｅｎ３プロセスについて外挿した細胞数を計算した。いずれの場合にも、Ｇｅｎ２プロセスと比較して、ＴＶＣの数値が近いことを示しており、早期の活性化は、ＴＩＬ増殖について全体的にパフォーマンスが向上する可能性があることを示唆している。表４及び５の下段。
[001808] 処理された腫瘍のサイズが大きいと仮定して、Ｇｅｎ３プロセスの追加のフラスコ（２又は３）についての外挿値の場合、記載されたように、プロセスごとに必要な断片の最大数に到達する。２２日目のＧｅｎ２プロセスと比較して、Ｇｅｎ３プロセスについて１６日目の回収で類似の用量がＴＶＣで到達可能であることが観察された。この観察は重要であり、培養の早期の活性化により少ない処理時間でＴＩＬのパフォーマンスが向上する可能性を示唆している。
[001809] Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３のプレREP及びREPの拡大培養比較を、生成された生細胞の総数及び有核細胞集団全体の生存率の観点から評価した。回収日のＴＶＣ細胞の用量は、Ｇｅｎ２（２２日）及びＧｅｎ３（１６日）で同等ではなかった。Ｇｅｎ３細胞の用量は、回収時に収集された全生細胞の約４０％で、Ｇｅｎ２より少なかった。
[001810] 表現型の特徴付けに関して、Ｇｅｎ２プロセスと比較して、Ｇｅｎ３プロセスでは３つの腫瘍でより高いＣＤ８＋及びＣＤ２８＋発現が観察された。このデータは、Ｇｅｎ３プロセスがＧｅｎ２と比較して最終ＴＩＬ産物の属性を改善したことを示している。
[001811] Ｇｅｎ３プロセスは、Ｇｅｎ２プロセスと比較して、わずかに高いセントラルメモリーコンパートメントを示した。
[001812] Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスは、Ｇｅｎ３プロセスの期間が短いにも関わらず、同等の活性化及び疲弊マーカーを示した。
[001813] 分析した３つの腫瘍では、Ｇｅｎ２と比較して、Ｇｅｎ３最終産物でのＩＦＮガンマ（ＩＦＮγ）産生が３倍高かった。このデータは、おそらくＧｅｎ３において、ＣＤ８及びＣＤ２８発現の発現が高いために、Ｇｅｎ２と比較して、Ｇｅｎ３プロセスが非常に機能的でより強力なＴＩＬ産物を生成したことを示す。表現型の特徴付けは、Ｇｅｎ２プロセスと比較して、３つの腫瘍でＣＤ８＋、ＣＤ２８＋発現に対するＧｅｎ３のポジティブな傾向を示唆した。
[001814] Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３間のＴＩＬ最終産物のテロメア長は同等であった。
[001815] グルコース及び乳酸レベルは、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３の最終産物間で同等であり、これは、Ｇｅｎ３プロセスの培地上の栄養素レベルが、毎日のプロセスで減量除去が実施されず、Ｇｅｎ２プロセスと比較して、プロセス全体で培地の用量が少なかったために、影響を受けなかったことを示唆している。
[001816] Ｇｅｎ３プロセス全体は、Ｇｅｎ２プロセスと比較して、処理時間のほぼ２分の１の削減を示した。これにより、Ｇｅｎ３プロセスによる拡大培養されたＴＩＬ産物の商品原価（ＣＯＧ）の大幅な削減をもたらすであろう。
[001817] ＩＬ－２消費量は、Ｇｅｎ２プロセスでのＩＬ－２消費量の一般的な傾向を示唆しており、Ｇｅｎ３プロセスでは、古い培地が除去されなかったため、ＩＬ－２が高かった。
[001818] Ｇｅｎ３プロセスは、ＣＤＲ３ ＴＣＲａｂ配列分析により測定された高いクローン多様性を示した。
[001819] プレＲＥＰの０日目にフィーダー及びＯＫＴ－３の添加は、ＴＩＬが早期に活性化され、Ｇｅｎ３プロセスを使用したＴＩＬのパフォーマンスが全体的に向上した。
[001820] 図２８は、現在のＧｅｎ２プロセスと比較したＧｅｎ３プロセスのさまざまな実施形態及び結果を示す。
Figure 2022514023000035
実施例６：ＣＬＬ患者のＰＢＭＣからＰＢＬを選択及び拡大培養する例示的な実施形態
[001821] ＰＢＭＣは患者から収集され、後で使用するために冷凍されるか、又は新鮮に使用される。本発明の方法において、出発物質として少なくとも約４００，０００，０００（４００×１０６）のＰＢＭＣを産生するために十分量の末梢血を収集する。方法の０日目に、６×１０６ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を新鮮に調製するか、又は解凍し、使用できるまで４℃又は氷上で貯蔵した。２００ｍＬのＣＭ２培地は、１００ｍＬのＣＭ１培地（GlutaMAX（登録商標）を含む）を組み合わせ、それを１００ｍＬ（１：１）でAIM-Vで希釈してＣＭ２を作製することによって調製される。ＣＭ２、は光から保護されており、使用しないときには堅く密閉されている。
[001822] 以下のステップは全て滅菌細胞培養条件下で行われる。ＣＭ２のアリコートを凍結したＰＢＭＣサンプルの解凍及び／又は洗浄に使用するために３７℃の水浴中の５０ｍＬコニカルチューブで温める。凍結したＰＢＭＣサンプルを使用する場合、サンプルを冷凍庫から取り出し、解凍の準備ができるまでドライアイスで貯蔵する。ＰＢＭＣクライオバイアルを解凍する準備ができたら、５ｍＬのＣＭ２培地を滅菌５０ｍＬコニカルチューブに入れる。ＰＢＭＣサンプルのクライオバイアルを、氷の結晶がごくわずかにのみ残るまで３７℃の水浴中に入れる。加温したＣＭ２培地を、サンプルバイアルに、サンプル：培地（約１ｍＬ）の体積比１：１で滴下する。内容物全体をクライオバイアルから取り出し、５０ｍＬコニカルチューブ内の残りのＣＭ２培地に移す。さらに１～２ｍＬのＣＭ２培地を使用してクライオバイアルを洗浄し、クライオバイアルの内容物全体を取り出して５０ｍＬのコニカルチューブに移す。次に、コニカルチューブの容量を追加的なＣＭ２培地で１５ｍＬに調整し、穏やかに渦巻かせて細胞を洗浄する。次に、コニカルチューブを室温、４００ｇで５分間遠心分離し、細胞ペレットを収集する。
[001823] 上清をペレットから除去し、コニカルチューブに蓋をし、次に、例えば、粗い表面に沿ってチューブをこすることにより細胞ペレットを破壊する。約１ｍＬのＣＭ２培地を細胞ペレットに添加し、ペレットと培地をピペットで５～１０回上下に吸引して細胞ペレットを分解する。さらに３～５ｍＬのＣＭ２培地をチューブに添加し、ピペットで混合して細胞を懸濁する。この時点で、細胞懸濁液の量を記録する。Nexcelom Cellometer K2などの自動細胞カウンターで細胞を計数するために、チューブから細胞懸濁液１００μＬを取り出す。サンプル中の生細胞の数を測定し、記録する。
[001824] フェノタイピング及び他の特性評価実験のために、最低５×１０６細胞を保存する。細胞ペレットを収集するために、保存された細胞を４００ｇで５分間、室温で回転させる。細胞ペレットを凍結培地（２０％ＤＭＳＯを含む滅菌熱不活化ＦＢＳ）に再懸濁する。保存された細胞の１つ又は２つのアリコートを凍結培地で凍結し、－８０℃の冷凍庫の細胞凍結容器（Mr. Frosty（商標））でゆっくりと凍結する。－８０℃で最低２４時間後、液体窒素貯蔵庫に移す。
[001825] 次のステップでは、事前に冷却した溶液を使用し、すばやく作業して、細胞を低温に保つ。次のステップは、ＰＢＭＣサンプルのＴ細胞分画を精製することである。これは、PanＴ細胞分離キット（Miltenyi、カタログ番号１３０－０９６－５３５）を使用して完了する。ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ及びｐＨ７．２の２ｍＭ ＥＤＴＡを含む滅菌フィルター洗浄緩衝液で細胞を洗浄することにより、細胞を精製用に調製する。ＰＢＭＣサンプルを４００ｇで５分間遠心分離して、細胞ペレットを収集する。上清を吸引除去し、細胞ペレットを細胞１０７個ごとに４０ｕＬの洗浄緩衝液に再懸濁する。細胞１０７個ごとに１０μＬのPanＴ細胞ビオチン抗体カクテルを添加する。よく混合し、冷蔵庫内又は氷上で５分間インキュベートする。細胞１０７個ごとに３０μＬの洗浄緩衝液を添加する。細胞１０７個ごとに２０ｕＬのPanＴ細胞マイクロビーズカクテルを添加する。よく混合し、冷蔵庫内又は氷上で１０分間インキュベートする。ＬＳカラムを調製し、マイクロビーズから細胞を磁気的に分離する。ＬＳカラムをQuadroMACS磁場中に配置する。ＬＳカラムを３ｍＬの冷洗浄緩衝液で洗浄し、洗浄液を収集して廃棄する。細胞懸濁液をカラムに入れ、フロースルー（未標識細胞）を収集する。このフロースルーは濃縮Ｔ細胞分画（ＰＢＬ）である。３ｍＬの洗浄緩衝液でカラムを洗浄し、最初のフロースルーと同じチューブにフロースルーを収集する。チューブに蓋をして、氷の上に置く。これは、Ｔ細胞分画、つまりＰＢＬである。磁場からＬＳカラムを取り外し、５ｍＬの洗浄緩衝液でカラムを洗浄し、非Ｔ細胞分画（磁気標識細胞）を別のチューブに収集する。両分画を４００ｇで５分間遠心分離して、細胞ペレットを収集する。上清を両方のサンプルから吸引し、ペレットを破壊し、各ペレットに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した１ｍＬのＣＭ２培地に細胞を再懸濁し、ピペットで５～１０回上下にピペッティングしてペレットを分解する。各サンプルに１～２ｍＬのＣＭ２を添加し、各サンプルをよく混合し、次のステップのために組織培養インキュベーターに保存する。各サンプルから約５０μＬのアリコートを取り出し、細胞を計数し、数と生存率を記録する。
[001826] 次に、Ｔ細胞（ＰＢＬ）をDynabeads（商標）Human T-Expander CD3/CD28で培養する。Dynabeadsのストックバイアルを中速で３０秒間ボルテックスする。必要とするビーズのアリコートをストックバイアルから取り出し、滅菌１．５ｍＬのマイクロチューブに入れる。ビーズを含む１．５ｍＬマイクロチューブに１ｍＬのビーズ洗浄液を添加することにより、ビーズをビーズ洗浄液で洗浄する。穏やかに混合する。チューブをDynaMag（商標）-2磁石の上に置き、ビーズが磁石に向かって引き寄せられる間、３０分間放置する。ビーズから洗浄液を吸引し、磁石からチューブを取り外す。３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した１ｍＬのＣＭ２培地をビーズに添加する。マイクロチューブの内容物全体を１５又は５０ｍＬのコニカルチューブに移す。ＩＬ－２を含むＣＭ２培地を使用して、ビーズの最終濃度を約５００，０００／ｍＬにする。
[001827] Ｔ細胞（ＰＢＬ）及びビーズは、以下のように一緒に培養される。０日目：G-Rex２４ウェルプレートで、ウェルあたり合計７ｍＬで、５００，０００個のＴ細胞、５００，０００個のＣＤ３／ＣＤ２８Dynabeads及びＩＬ－２が補充されたＣＭ２を添加する。G-Rexプレートをプロセスの次のステップ（４日目）まで加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れる。残りの細胞は、Mr. Frosty（商標）細胞凍結容器を使用して、ＣＳ１０凍結保存培地で凍結される。Mr. Frosty細胞凍結容器を使用して、細胞の非Ｔ細胞分画をＣＳ１０凍結保存培地で凍結する。４日目に培地を交換する。培地の半分（約３．５ｍＬ）をG-rexプレートの各ウェルから取り除く。３７℃に加温した３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した十分な量（約３．５ｍＬ）のＣＭ４培地を添加して、各サンプルウェルから除去した培地を交換する。G-rexプレートをインキュベーターに戻す。
[001828] ７日目に、細胞はＲＥＰによる拡大培養のために調製される。G-rexプレートをインキュベーターから取り出し、培地の半分を各ウェルから取り出して廃棄する。細胞を残りの培地に再懸濁し、１５ｍＬのコニカルチューブに移す。ウェルを、３７℃に温めた３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した各ＣＭ４を１ｍＬで洗浄し、洗浄培地を同じ１５ｍＬチューブに細胞と共に移す。細胞の代表的なサンプルを除去し、自動細胞カウンターを使用して計数する。１×１０６個未満の生細胞がある場合、０日目のDynabead拡大培養プロセスが繰り返される。細胞の残りは、バックアップ拡大培養のため又はフェノタイピング及び他の特性研究のために凍結される。１×１０６個以上の生細胞がある場合、ＲＥＰ拡大培養は、０日目からのプロトコルに従って複製で設定される。代わりに、十分な細胞を用いて、拡大培養は、G-rex１０Ｍ培養フラスコで、フラスコあたり１０～１５×１０６個のＰＢＬを使用し、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した最終容量１００ｍＬ／ウェルのＣＭ４培地で１：１比のDynabeads：ＰＢＬを使用して設定され得る。プレート及び／又はフラスコをインキュベーターに戻す。過剰なＰＢＬは、－８０℃の冷凍庫内のMr. Frosty（商標）細胞凍結容器で小分けにしてゆっくりと凍結し、－８０℃で最低２４時間後に液体窒素貯蔵に移すことができる。これらのＰＢＬは、拡大培養若しくはフェノタイピング又は他の特性研究のためのバックアップサンプルとして使用し得る。
[001829] １１日目に、培地を交換する。培地の半分をG-rexプレートの各ウェル又はフラスコから取り出し、３７℃で３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した同量の新しいＣＭ４培地と交換する。
[001830] １４日目に、ＰＢＬを回収する。G-rexプレートを使用する場合、培地の約半分がプレートの各ウェルから取り除かれ、廃棄される。ＰＢＬとビーズを残りの培地に懸濁し、滅菌された１５ｍＬのコニカルチューブ（チューブ１）に移す。３７℃に温めた１～２ｍＬの新しいAIM-V培地でウェルを洗浄し、洗浄液をチューブ１に移す。チューブ１に蓋をして、DynaMag（商標）-15磁石に１分間入れ、ビーズを磁石に引き寄せる。細胞懸濁液を新しい１５ｍＬチューブ（チューブ２）に移し、ビーズを２ｍＬの新しいAIM-Vで、３７℃で洗浄する。チューブ１をさらに１分間磁石に戻し、その後、洗浄培地をチューブ２に移す。必要に応じて、最終の洗浄のステップ後にウェルを混合し得る。細胞の代表的なサンプルを取り出し、計数し、数と生存率を記録する。計数している間、チューブをインキュベーターに入れ得る。細胞が非常に密に見える場合、追加的なAIM-V培地をチューブ２に添加し得る。フラスコを使用する場合、フラスコの容量を約１０ｍＬに減らすべきである。フラスコの内容物を混合し、１５ｍＬのコニカルチューブ（チューブＡ）に移す。上記のようにフラスコを２ｍＬのAIM-V培地で洗浄し、洗浄培地もチューブＡに移す。チューブＡに蓋をして、DynaMag（商標）-15磁石に１分間入れ、ビーズを磁石に引き寄せる。細胞懸濁液を新しい１５ｍＬチューブ（チューブＢ）に移し、ビーズを２ｍＬの新しいAIM-Vで、３７℃で洗浄する。チューブＡをさらに１分間磁石に戻し、その後、洗浄培地をチューブＢに移す。最後の洗浄ステップ後、必要に応じてウェルを混合し得る。細胞の代表的なサンプルを取り出し、計数し、数と生存率を記録する。計数している間、チューブをインキュベーターに入れ得る。細胞が非常に密に見える場合、追加的なAIM-V培地をチューブＢに添加し得る。細胞は、新鮮な状態で使用するか、又は目的の濃度においてＣＳ１０保存培地で凍結して使用し得る。
実施例７：Ｇｅｎ３拡大培養プラットフォームを使用して、造血器腫瘍からＴ細胞を拡大培養する例示的な実施形態
[001831] ０日目に、ポジティブ若しくはネガティブ選択方法、即ちＴ細胞マーカー（ＣＤ２、ＣＤ３など、又はＴ細胞を残した他の細胞の除去）を用いたＴ細胞の除去又は勾配遠心を使用して、リンパ球、全血又は腫瘍消化物（新鮮又は解凍）に富んだアフェレーシス産物からＴ細胞画分（ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋）を分離する。
[001832] 本明細書に記載のＧｅｎ３プロセスに従って約１×１０７細胞／フラスコを播種することにより、Ｇｅｎ３．１プロセスを開始する。
[001833] ７日目に、Ｇｅｎ３．１プロセスに従って細胞を再活性化する。
[001834] ９～１１日目に、Ｇｅｎ３．１プロセスに従って細胞をスケールアップする。
[001835] １４～１６日目に、Ｇｅｎ３．１プロセスに従って細胞を回収する。
[001836] 図４２は、Ｇｅｎ３プロセスを使用して、造血器腫瘍からＴＩＬを拡大培養する例示的な実施形態の概略図を提供する。
実施例８：非ホジキンリンパ腫からのＴＩＬの拡大培養
[001837] ＴＩＬは、図４５に示される病態を有する５つの非ホジキンリンパ腫腫瘍（１つのマントル細胞リンパ腫腫瘍、３つの濾胞性リンパ腫腫瘍及び１つのＡＢＣ型びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫腫瘍）からプレＲＥＰ段階でＩＬ－２を１１～１４日間使用して拡大培養し、続いてＩＬ－２、マイトジェン抗ＣＤ３抗体及び照射同種異系末梢血単核球（ＰＢＭＣ）フィーダーを使用して１４日間ＲＥＰを行った。ＴＩＬは、５つのリンパ腫腫瘍全てから成功して生成され、最大拡大培養指数は６８０倍であり、これは他の方法を使用して以前に観察されたものよりも有意に高かった。Schwartzentruber, et al., Blood 1993, 82, 1204-1211。更に、平均ＣＤ３＋Ｔ細胞集団は９５％であった（Schwartzentruber, et al., Blood 1993, 82, 1204-1211の方法を使用した７５％に対して）。
[001838] 細胞選別及びフローサイトメトリーは、Becton, Dickinson & Co. (BD) FACS CANTO IIシステムを使用して実施した。フローサイトメトリー分析により、黒色腫ＴＩＬのものと同等のエフェクターメモリー細胞の著しい相対的増加が観察された（図４６）。黒色腫ＴＩＬ培養物と比較して、リンパ腫において、エフェクターメモリーＣＤ４５ＲＡ＋（ＴＥＭＲＡ）細胞（ｐ＝０．００１３；ＣＤ４、ＣＤ８）及びＣＤ２８＋ＣＤ４＋（ｐ＝０．００８）サブセットの有意な増加が観察された（図４７）。
[001839] ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットにおけるＴ細胞分化の表現型マーカーの比較が図４８及び図４９にそれぞれ示されている。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットにおけるＴ細胞枯渇の表現型マーカーの比較が図５０及び図５１にそれぞれ示されている。
[001840] 図５２は、非ホジキンリンパ腫ＴＩＬと黒色腫ＴＩＬとの間の細胞型の比較を示す。黒色腫ＴＩＬと比較したリンパ腫ＴＩＬのＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加傾向が示されている。
[001841] 図５３は、生物発光リダイレクト溶解アッセイ（ＢＲＬＡ）の結果を示す。黒色腫ＴＩＬ（１１～７５ＬＵ５０、４時間）と比較して、リンパ腫ＴＩＬにおいて、ＬＵ５０／１０６としてＢＲＬＡで測定したＴＩＬの最小細胞溶解活性は、４時間で１未満～６ＬＵ５０及び２４時間で１～３９ＬＵ５０の範囲であった。
[001842] 図５４は、リンパ腫ＴＩＬ対黒色腫ＴＩＬのインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す。比較可能な結果を示す。リンパ腫ＴＩＬのELIspotアッセイの結果を図５５に示し、図５６の黒色腫ＴＩＬの同じアッセイの結果と比較する。ELIspotアッセイでは、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート／イオノマイシン、抗ＣＤ３抗体又はＣＤ３／ＣＤ２８／４－１ＢＢビーズで刺激すると、リンパ腫ＴＩＬによる広範なＩＦＮ－γ産生が観察され、これらの条件下で一部のリンパ腫ＴＩＬによって産生されるＩＦＮ－γは、黒色腫ＴＩＬによって産生されるＩＦＮ－γと同等であり、一部の場合ではリンパ腫ＴＩＬにおけるＩＦＮ－γ産生がはるかに高かった。
[001843] 図５７は、NANOSTRING NCOUNTER分析（Nanostring Technologies, Inc., Seattle, WA）の結果を示し、これはリンパ腫ＴＩＬが、黒色腫ＴＩＬと比較して、より高いレベルのＲＯＲＣ ＩＬ１７Ａ（ＴＨ１７表現型）及びＧＡＴＡ３（Ｔｈ２表現型）を発現することを示している。この発見は、リンパ腫反応性Ｔ細胞が主にＴＨ２及びＴＨ１７であるという観察と一致している。
[001844] 全体として、結果は、ＴＩＬ細胞療法がリンパ腫患者の処置に使用され得るという証拠を提供する。
実施例９：エクスビボで直接ＰＤ－１＋細胞を選択及び拡大培養する：行動療法のための腫瘍反応性ＴＩＬを強化するためのプロセス
[001845] 自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いた養子Ｔ細胞療法は、転移性黒色腫の患者のコホートにおいて、持続的な奏効率を実証している［１］。処置に使用されるＴＩＬ産物は、腫瘍特異的抗原、突然変異由来の患者特異的新生抗原及び非腫瘍関連抗原を認識する異種Ｔ細胞で構成される［２、３］。これまでの研究で、新生抗原特異的Ｔ細胞がＴＩＬの抗腫瘍活性に顕著に貢献していることが実証されている［４］。腫瘍反応性につきＴＩＬを強化する戦略は、特に、バイスタンダーＴ細胞の割合が高いことが知られている上皮癌でより強力な治療薬をもたらすことが期待される［５］。いくつかの研究は、ＴＩＬでのＴ細胞枯渇に関連することが多いマーカーであるＰＤ１の発現が、自己腫瘍反応性Ｔ細胞を同定することを実証する［６、７、８］。ここでは、ＰＤ１＋細胞を選択し、自己腫瘍反応性Ｔ細胞につきＴＩＬ産物を強化するように設計された新しいプロトコルの開発について説明する。本実施例は、ＰＤ１＋ＴＩＬを選別及び拡大培養し、得られた産物を特徴づけるプロトコルを提供する。
[001846] このプロトコルには、２－ＲＥＰプロトコルを使用して、黒色腫、肺癌、乳癌（トリプルネガティブ及びＥＲ／ＰＲ腫瘍）及び肉腫からエクスビボで選別されたＰＤ１＋ＴＩＬを拡大培養することが含まれる。拡大培養されたＴＩＬは、成長、生存率、表現型、機能（ＩＦＮγ分泌、ＣＤ１０７ａ動員）、腫瘍殺傷（X-CELLigence）及びＴＣＲ Ｖβレパートリー（フローサイトメトリー及びＲＮＡ配列決定による）について評価される。例示的な方法を、図４４に提供されるチャートに記載する。
[001847] この実施例では、ＴＡＡ特異的ＴＩＬにつきＴＩＬ産物を強化することを目的としたＰＤ１選択プロジェクトを取り扱う。これは、腫瘍／新生抗原特異的Ｔ細胞がＴＩＬ産物の療法活性を担っており、ＴＩＬのＰＤ１＋サブセットが腫瘍反応性Ｔ細胞を含むという考えに基づいている。
Ａ．方法－手順
１．腫瘍の調製
[001848] 新たに切除された腫瘍サンプルは、研究提携（UPMC、Moffitt）及び組織調達供給業者（Biotheme及びＭＴＧグループ）から受け取る。腫瘍は、HypoThermosol（Biolife Solutions, Washington、カタログ番号１０１１０４）（抗生物質付き）又はRPMI 1640（Fisher Scientific, Pennsylvania、カタログ番号１１８７５－０８５）＋男性のヒトＡＢ血清（Access Biologicals, California、Ａ１３０１２）で翌日出荷される。
[001849] 一次及び二次パッケージから腫瘍を取り出し、腫瘍及び輸送用培地を含んだバイアルを秤量し、質量を記録する。バイアルから腫瘍を取り除き、バイアル及び輸送用培地の重量を再秤量する。腫瘍の質量を計算する（バイアルの質量＋輸送用培地＋腫瘍）－（バイアル＋輸送用培地）。
[001850] 腫瘍消化物のために、腫瘍全体をおよそ４～６ｍｍ３の断片に細分化する。腫瘍が十分に大きい場合、４つの３ｍｍ３の断片が処理に配置される。
２．腫瘍消化物のための酵素の調製
[001851] 凍結乾燥酵素を、以下の各消化酵素について示された滅菌ＨＢＳＳの量で再構成する。これらの酵素は１０倍として調製される。ボトルの側面及びボトル開口部の保護フォイルから残留粉末を確実に捕捉する。上下に数回ピペッティングし、完全に再構成するように渦を巻く。
[001852] １ｇのコラゲナーゼＩＶ（Sigma, MO、Ｃ５１３８）を１０ｍＬのＨＢＳＳで再構成する（１００ｍｇ／ｍＬストックを作成するため）。上下にピペッティングすることにより混合し、溶解する。再構成後に溶解しない場合、３７℃のＨ２Ｏ槽に５分間入れる。１ｍＬバイアルにアリコートする。これは、コラゲナーゼの１００ｍｇ／ｍＬの１０倍作業ストックである。
[001853] ＤＮアーゼ（Sigma, MO、Ｄ５０２５）ストック溶液（１０，０００ＩＵ／ｍＬ）を調製する。各ロットのＤＮアーゼの単位は、添付のデータシートに記載されている。ＨＢＳＳの適切な量を計算して、１００ｍｇの凍結乾燥ＤＮアーゼストックを再構成する。例えば、ＤＮアーゼストックが２０００Ｕ／ｍｇの場合、ストック内のＤＮアーゼの合計は２００，０００ＩＵ（２０００ＩＵ／ｍｇ×１００ｍｇ）になる。１０，０００ＩＵの作業ストックに希釈するには、１００ｍｇのＤＮアーゼに、２０ｍＬのＨＢＳＳを追加する（２００，０００ＩＵ／２０ｍＬ＝１０，０００Ｕ／ｍＬ）。１ｍＬバイアルにアリコートする。これは、ＤＮアーゼの１０，０００ＩＵ／ｍＬの１０倍作業ストックである。
[001854] ヒアルロニダーゼ１０ｍｇ／ｍＬ（Sigma, MO、Ｈ２１２６）ストック溶液を調製する。５００ｍｇバイアルを５０ｍＬのＨＢＳＳで再構成して、１０ｍｇ／ｍＬのストック溶液を作成する。１ｍＬバイアルにアリコートする。これは、ヒアルロニダーゼの１０ｍｇ／ｍＬの１０倍作業ストックである。
３．腫瘍処理及び消化
[001855] ストック消化酵素を１倍に希釈する。１倍作業溶液を作成するには、コラゲナーゼ、ＤＮアーゼ及びヒアルロニダーゼをそれぞれ５００μｌずつＨＢＳＳ ３．５ｍＬに添加する。
[001856] GentleMACS OctoDissociatorを使用する場合、腫瘍断片を上記の５ｍＬの消化物カクテル（ＨＢＳＳ中）を含むGentleMACS C-Tube（Ｃチューブ）又は５０ｍＬコニカルチューブに移す。２～３個の断片（４～６ｍｍ）を各Ｃチューブに移す。
[001857] 各Ｃチューブ（Miltenyi Biotec, Germany、１３０－０９６－３３４）をGentleMACS OctoDissociator（Miltenyi Biotec, Germany、１３０－０９５－９３７）に移す。製造元の指示に従って使用する。各腫瘍組織には、腫瘍解離のための推奨プログラムがあることに注意する。それぞれの腫瘍組織に適切なプログラムを選択する。解離はおよそ１時間である。
[001858] GentleMACS OctoDissociatorが利用できない場合、標準のローテイターを使用する。２～３個の腫瘍断片を５０ｍＬコニカルチューブ（漏れを防ぐためにパラフィルムで密封）に入れ、ローテイターに固定する。ローテイターを入れ、３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーターで１～２時間一定回転させる。代わりに、腫瘍断片は、ＲＴで一晩、一定の回転でも消化することができる。
[001859] 消化後、オクトディソシエーター又はローテイターからＣチューブを取り外す。０．２２μｍのストレーナーを滅菌ファルコンコニカルチューブに取り付ける。ピペットを使用して、Ｃチューブ／又は５０ｍＬコニカル（５ｍＬ）の全ての内容物を０．２２μｍフィルターに通して５０ｍＬコニカルに入れる。Ｃチューブ／５０ｍＬコニカルを１０ｍＬのＨＢＳＳで洗浄し、ストレーナーにかける。滅菌シリンジプランジャーの平らな端を使用して、フィルターを通して残りの非消化性の腫瘍を解離する。ＣＭ１又はＨＢＳＳを５０ｍＬまで加え、チューブをキャップする。
[001860] １５００ｒｐｍ、ＲＴで５分間、遠心分離により、サンプルをペレット化する。液体を注意深く取り除き、細胞数を数え、生存率を評価するために、ペレットを５ｍＬのＣＭ１に再懸濁する。
[001861] 以下の場合、全腫瘍消化物を確保する。１．細胞培養（ＰＤ１＋及びＰＤ１－の対照）、２．ＦＭＯフローサイトメトリー対照、３．全腫瘍消化物表現型アッセイを事前に分取する、４．腫瘍反応性／細胞殺傷アッセイのために凍結。確保される細胞の数は、総消化物収量及び腫瘍組織に依存する。
４．細胞数及び生存率
[001862] Nexcelom Cellometer K2（Nexcelom, MA）を使用して、細胞数及び生存率を取得する手順は、ＳＯＰ－ＬＡＢ－００２及びＳＯＰ－ＬＡＢ－００３に記載される。
５．フローサイトメトリー分析及び細胞分取のための消化腫瘍の染色
[001863] 腫瘍消化物は、以下の方法に従って、ニボルマブとのインキュベーション並びに生／死バイオレット、抗ＩｇＧ４ Ｆｃ－ＰＥ（ニボルマブの二次抗体）及びＣＤ３－ＦＩＴＣによる染色を含むカクテルで染色される。
[001864] カウント後、細胞を１０ｍｌＨＢＳＳに再懸濁する。１５００ｒｐｍ、ＲＴで５分間、遠心分離（９の加速と減速）により、細胞をペレット化する。ペレットを５ｍＬＨＢＳＳに再懸濁する。５μＬの生／死ブルー色素（ThermoFisher、MA、カタログ番号Ｌ２３１０５）を添加して、最終濃度を１／１０００にする。氷上で２０～３０分間インキュベートする。１５００ｒｐｍ、ＲＴで５分間、遠心分離により細胞をペレット化する。
[001865] ペレットをFACSバッファー（１×ＨＢＳＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ウシ胎児血清）に再懸濁する。ペレットに添加されるFACSバッファーの量は、ペレットのサイズに基づいている。染色量はペレットの約３倍にする必要がある。したがって、３００μｌの細胞がある場合、バッファーの量は少なくとも９００μｌである必要がある。１μｇ／ｍＬのニボルマブ（Creative Biolabs、NY、カタログ番号ＴＡＢ－７７０）を添加する。希釈は抗体ストックに依存する。４℃で３０分間インキュベートする。ペレットを５ｍＬの冷ＨＢＳＳに再懸濁する。
[001866] １５００ｒｐｍ、ＲＴで５分間、遠心分離（９の加速と減速）により、細胞をペレット化する。洗浄を２回繰り返す。ペレットを５ｍＬの冷ＨＢＳＳに再懸濁する。５μＬの生／死ブルー色素（ThermoFisher、MA、カタログ番号Ｌ２３１０５）を添加して、最終濃度を１／１０００にする。４℃で２０～３０分間インキュベートする。
[001867] １５００ｒｐｍ、ＲＴで５分間、遠心分離（９の加速と減速）により、細胞をペレット化する。上記のように、ペレットをFACSバッファー（１×ＨＢＳＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ウシ胎児血清）に再懸濁する。ペレットに添加されるFACSバッファーの量は、ペレットのサイズに基づいている。染色量はペレットの約３倍にする必要がある。したがって、３００μＬの細胞がある場合、バッファーの量は少なくとも９００μＬである必要がある。
[001868] 抗体を添加する場合、各１００μＬの容量は、１回のテスト（抗体の滴定量）に相当する。つまり、容量が１ｍＬであれば、１０倍の力価抗体量が必要である。サンプル１００μＬあたり、３μＬの抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ（BD Biosciences、NJ、カタログ番号５６１８０７）を添加する。１：５００で抗ＩｇＧ４ Ｆｃ－ＰＥ（Southern Biotech、AL、カタログ番号９２００－０９）を添加する。したがって、５００μＬのFACSバッファーごとに１μＬの抗ＩｇＧ４Ｆｃ－ＰＥを添加する。細胞を氷上で３０分間インキュベートする。インキュベーション中に遮光する。インキュベーション中に２、３回攪拌する。２０ｍＬのFACSバッファーに細胞を再懸濁する。溶液を７０μｍセルストレーナーに通して、新しい５０ｍＬコニカルに入れる。１５００ｒｐｍ、ＲＴで５分間、遠心分離（９の加速と減速）をする。吸引する。FACSバッファーで合計１０ｅ６（生＋死）まで細胞を再懸濁する。最小容量は、３００μＬである。
[001869] 滅菌ポリプロピレンFACSチューブに移す。FACSソーティング用の３ｍＬ／チューブ。
６．ＦＡＣＳソーティング（ＦＸ５００スタートアップ）
[001870] システムをセットアップし、キャリブレーションが完了するのを待つ間に、以下の調製をする。
[001871] １０ｍＬの滅菌脱イオン水を含む５つの滅菌１５ｍＬコニカルチューブを準備する。
[001872] ４ｍＬの滅菌脱イオン水を含む５つの滅菌５ｍＬFACSチューブを準備する。
[001873] １２ｍＬの７０％エタノールを含む５つの滅菌１５ｍＬコニカルチューブを準備する。
[001874] １２ｍＬの１０％次亜塩素酸ナトリウムを含む５つの滅菌１５ｍＬコニカルチューブを準備する。
７．サンプル収集
[001875] サンプル及び収集チャンバーが５℃であり、サンプルの攪拌（Agitate sample）がボルテックスで選択されていることを確認する。必要に応じてＰＤ１ゲートを調整する。
[001876] ゲートに問題がなければ、できるだけ多くの事象を記録する（又は最大２０，０００のＣＤ３事象）。この収集を加速するために、サンプル圧力を１０に設定し得る。収集を停止し、チューブを取り外す。
[001877] サンプルチャンバーのドアを開き、１５ｍｌの収集チャンバーブロックをチャンバーに充填する。収集バッファーを含む収集チューブをチャンバーブロックに充填する。少なくとも８５％の分取効率を維持するために、サンプル圧力を調整する。５０，０００のＣＤ３事象を記録する。いずれかの画分に４．５×１０６を超える細胞が収集されている場合、収集チューブを交換する必要がある。全てのサンプルがサンプルチューブからなくなるまで、分取を続ける。
８．ＲＥＰ１の開始（第１の初回刺激拡大培養ステップの開始）
[001878] 細胞数が最も少ない条件（ＰＤ１＋又はＰＤ１－）を使用して、ＲＥＰ１開始用のＣＤ３＋細胞数を決定する。ＣＤ３細胞の％（分取中に決定）は、ＰＤ１＋及びＰＤ１－サンプルと同数のＣＤ３細胞でＲＥＰ１を開始するために必要な消化物全体の細胞総数を計算するために使用されるだろう。ＲＥＰ１開始のための消化物細胞全体の総数＝ＲＥＰ１／ＣＤ３細胞の％に接種された分取された細胞の数。
[001879] およそ１０００～１００，０００細胞のＣＤ３＋細胞を、それぞれ７ｍＬ又は４０ｍＬのＣＭ２（５０％ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ヒト血清、グルタマックス、ゲンタマイシン及び５０％AimV）と共に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と一緒にG-Rex24又はG-Rex10のいずれかに１１日間入れる。ＰＤ１＋及びＰＤ１－で分取された集団及び腫瘍消化物全体に対して、少なくとも１つのG-Rexフラスコが開始される。抗ＣＤ３（クローン：ＯＫＴ３）（３０ｎｇ／ｍＬ）及びフィーダー（比１：１００、（ＴＩＬ：フィーダー））を培養開始時に各フラスコに添加する。
[001880] プレート／フラスコ内の細胞を１１日間インキュベートする。培地の交換は行われない（ＲＥＰ１）。
[001881] ＲＥＰ１の完了時に、G-Rex24の場合にはおよそ５ｍＬの培地を、G-Rex10の場合には３０ｍＬの培地を取り除く。上下にピペッティングして、残りの培地に細胞を再懸濁する。細胞を５０ｍＬコニカルに入れ、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
[001882] 培地を吸引し、細胞を１０～２０ ｍＬのＣＭ２に再懸濁して、カウントと生存率の評価を行う。
９．ＲＥＰ２の開始（第２の急速拡大培養の開始）
[001883] ミニＲＥＰ２を開始するには、１×１０５細胞を４０ｍＬのＣＭ２培地及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含むG-Rex10に入れる。抗ＣＤ３（クローン：ＯＫＴ３）（３０ｎｇ／ｍＬ）及びフィーダー（比１：１００、ＴＩＬ：フィーダー）を培養開始時に添加する。
[001884] 「フルスケール実行」では、２×１０６～３０×１０６の細胞を１ＬのＣＭ２培地及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２中のG-Rex１００Ｍで拡大培養させる。抗ＣＤ３（クローン：ＯＫＴ３）（３０ｎｇ／ｍＬ）及びフィーダー（比１：１００、ＴＩＬ：フィーダー）を培養開始時に添加する。
[001885] 培地交換（ミニスケールの場合）又は培地交換＋分割（「フルスケール実行の場合）」は、ＲＥＰ２の５日目（プロセスの１６日目）に実行される。フラスコをおよそ１０ｍＬ（G-Rex10）又は１００ｍＬ（G-Rex100M）に減量し、ＣＭ２又はAimV＋３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む４０ｍＬ（G-Rex10）又は１Ｌ（G-Rex100M）に補充する。「フルスケール実行」では、フラスコは、１：２に分割される。
[001886] ＲＥＰ２の１１日目（又はプロセスの２２日目）に、フラスコの容量を減らし、１５００ｒｐｍで、５分間ＲＴで遠心分離する。
[001887] 最終産物は、細胞数、生存率、表現型（ＴＩＬ１、ＴＩＬ２（ＴＩＬの表面抗原染色のＴＩＬ２パネル）、ＴＩＬ３及び機能（ＣＤ１０７ａ（ＣＤ１０７ａ動員によるＴＩＬ機能の評価及びＩＦＮγアッセイ）につき評価される。Ｖβレパートリーは、製造元の指示に従って、２４の特異性（Ｖβファミリー全体の７０％）を評価するFACS（Beckman Coulter、California、カタログ番号ＩＭ３４９７）によって評価される。追加的な細胞（１×１０６～５×１０６）は、ペレット化され、ＲＮＡ配列決定及び分析のために凍結される。最終産物は、共培養アッセイで腫瘍反応性についても評価され、ＩＦＮγについて評価される。可能であれば、解凍した腫瘍消化物全体をＴＩＬと共培養し、xCELLigenceシステム（ACEA Biosciences、CA）を使用して、共培養及び／又は殺傷（細胞溶解％）によって腫瘍反応性を評価する。
Ｂ．材料及び方法
[001888] ＰＤ１陽性（ＰＤ１＋）細胞を新鮮な腫瘍消化物から直接フローサイトメトリーを介して分取し、インビトロで拡大培養した。
[001889] ６つの黒色腫、３つの肉腫、６つの乳癌及び８つの肺癌からのサンプルを評価した。
[001890] ３つの母集団を研究した：ＰＤ１＋で分取されたＴＩＬ、ＰＤ分取されたＴＩＬ；バルクＴＩＬ（腫瘍全体の分取されていない消化物）。ＴＩＬは、収量（細胞数）、表現型（フローサイトメトリー）、ＴＣＲ Ｖβレパートリー（ＲＮＡ－配列決定）、非特異的機能性（抗ＣＤ３及びＰＭＡ）及び腫瘍反応性と殺傷性（共培養アッセイ）について評価した。
[001891] 黒色腫、肺癌、乳癌及び肉腫から臨床的に適切な数にＰＤ１選択ＴＩＬを拡大培養するためのプロトコルが開発された。
[001892] ＰＤ１選択ＴＩＬのインビトロでの拡大培養は、バルクＴＩＬと同等の表現型を有する産物が得られた。
[001893] Ｔ細胞マーカーは、事前分取ＴＩＬと比較してアップレギュレーションされており、高い活性化レベルを示唆している。事前分取ＴＩＬと比較して拡大培養ＰＤ１＋ＴＩＬの表面で調節されるＴ細胞マーカーには、ＰＤ１及びＣＤ２５が含まれ、高い活性化レベルを示唆する。重要なことに、ＰＤ１＋ＴＩＬのインビトロでの拡大培養により、バルクＴＩＬと同等の表現型を有する産物が得られ、強力な治療の可能性が示唆された。拡大培養されたＰＤ１＋ＴＩＬの機能は、非特異的刺激に応答した強力なＩＦＮγ及びＣＤ１０７ａの発現によって確認された。拡大培養されたＰＤ１＋ＴＩＬは、ＰＤ１由来のＴＩＬ及びバルクＴＩＬと比較して、腫瘍部位での抗原駆動型クローン拡大培養の兆候であるオリゴクローナリティを示す。予備データは、ＰＤ １－由来ＴＩＬではなく、ＰＤ１＋による自己腫瘍細胞殺傷を示す。
[001894] ＰＤ１＋由来のＴＩＬは、ＰＤ１由来のＴＩＬ及びバルクＴＩＬと比較して、オリゴクローナリティを示す。
[001895] 全てのＴＩＬ産物は、非特異的刺激によって評価されるように機能する。
[001896] 自己黒色腫細胞の殺傷は、ＰＤ１＋由来ＴＩＬで観察されたが、ＰＤ１由来ＴＩＬ及びバルクＴＩＬでは観察されなかった。
Ｃ．結果及び適合基準
[001897] ＰＤ１＋で分取された細胞は、増殖能の欠陥を示す。最終産物の収量は、１×１０９以上になるだろう。ＰＤ１＋細胞は、ＰＤ１－と比較してオリゴクローナルになるだろう。ＰＤ１＋細胞は、抗原特異的である可能性がより高いという前提に基づいて、ＰＤ１＋細胞は、ＰＤ１対応物と比較して腫瘍特異的殺傷能力の増強を示す可能性がある。
Ｄ．参考文献
[001898] １．Rosenberg, S.A., et al., Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy.Clin Cancer Res, 2011. 17(13): p. 4550-7.
[001899] ２．Kvistborg, P., et al., TIL therapy broadens the tumor-reactive CD8(+) T cell compartment in melanoma patients.Oncoimmunology, 2012. 1(4): p. 409-418.
[001900] ３．Simoni, Y., et al., Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates.Nature, 2018. 557(7706): p. 575-579.
[001901] ４．Schumacher, T.N. and R.D.Schreiber, Neoantigens in cancer immunotherapy.Science, 2015. 348(6230): p. 69-74.
[001902] ５．Turcotte, S., et al., Phenotype and function of T cells infiltrating visceral metastases from gastrointestinal cancers and melanoma: implications for adoptive cell transfer therapy.J Immunol, 2013. 191(5): p. 2217-25.
[001903] ６．Inozume, T., et al., Selection of CD8+PD-1+ lymphocytes in fresh human melanomas enriches for tumor-reactive T cells.J Immunother, 2010. 33(9): p. 956-64.
[001904] ７．Gros, A., et al., PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors.J Clin Invest, 2014. 124(5): p. 2246-59.
[001905] ８．Thommen, D.S., et al., A transcriptionally and functionally distinct PD-1(+) CD8(+) T cell pool with predictive potential in non-small-cell lung cancer treated with PD-1 blockade.Nat Med, 2018.
実施例１０：直交性ＩＬ２－Ｒβによるヒト黒色腫由来ＴＩＬの形質導入
[001906] この実施例では、プレＲＥＰ後及びＲＥＰ後の腫瘍浸潤リンパ球を細胞操作するためのいくつかの方法を評価する。
[001907] 標準的な方法を使用して、少なくとも４つの黒色腫由来のＴＩＬ凍結保存されたプレ－ＲＥＰ後 ＲＥＰ後細胞株を解凍し、休止し、活性化する。活性化されると、細胞は、４つの実験コホートに分けられる。各コホートには、偽改変、ＧＦＰ改変及び直交性ＩＬ－２Ｒβ改変の３つの個別条件を有する。偽コホート細胞は、細胞改変手順を受けるが、核酸ベクターは追加されていない。ＧＦＰコホートは、緑色蛍光タンパク質を操作可能に発現するウイルスベクターを用いて改変されており、これにより、細胞工学の有効性を、例えば、蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリーにより、簡単に監視することができる。最終的なコホートは、直交性ＩＬ－２Ｒサイトカイン受容体を操作可能に発現するウイルスベクターで改変されている。
[001908] 化学トランスフェクション、エレクトロポレーション及びウイルス感染は、プレＲＥＰ後及びＲＥＰＴＩＬを改変する方法として比較される。改変処理に続いて、処置された細胞は、本明細書に開示される方法を使用して、実験室スケールで拡大培養されるであろう。
[001909] 拡大培養に続いて、プレＲＥＰ後及びＲＥＰ後由来細胞を、細胞生存率、ＩＬ－２Ｒの発現、直交性ＩＬ－２Ｒの発現を評価し、形質導入効率を決定する。ＧＦＰ形質導入／改変の有効性は、直交性ＩＬ２－Ｒ形質導入／改変と比較される。
実施例１１：直交性ＩＬ２－Ｒβによる様々なヒト腫瘍由来ＴＩＬの形質導入
[001910] 実施例１０の方法を使用して、直交性ＩＬ－２Ｒの有効性を比較する。
[001911] 上述の実施例は、本発明の組成物、システム及び方法の実施形態を作製及び使用する方法の全面開示及び説明を当業者に与えるために提供され、発明者が、彼らの発明とみなす範囲を限定することを意図するものではない。当業者に明らかである本発明を実施するための上述の態様の修正は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、本発明に属する当業者の技能のレベルを示す。
[001912] 全ての見出し及びセクションの指定は、明確化と参照の目的でのみ使用されており、決して限定とみなされるものではない。例えば、当業者は、本明細書に記載される本発明の趣旨及び範囲に従って、異なる見出し及びセクションからの様々な態様を適切に組み合わせることが有用であることを理解するであろう。
[001913] 本明細書に引用されている全ての参考文献は、個々の出版物若しくは特許又は特許出願が全ての目的についてその全体が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されている場合と同程度に、その全体があらゆる目的について参照により本明細書に援用される。
[001914] 当業者に明らかであるように、本出願の多くの修正形態及び変形形態は、その趣旨及び範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書に記載される特定の実施形態及び実施例は、ごく一実施例としてのみ提供され、本出願は、特許請求の範囲が権利を与えられる均等物の全範囲と共に添付の特許請求の範囲の条項よってのみ限定されるべきである。

Claims (225)

  1. 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
    （ａ）対象から得られた腫瘍サンプルを処理して複数の腫瘍断片にすることにより、前記対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
    （ｂ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の初回刺激拡大培養は、第１のガス透過性表面積を含む容器内で実施され、前記第１の初回刺激拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約１～７日間の第１の期間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、数において前記第１のＴＩＬ集団よりも多い；
    （ｃ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地にＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを補充することにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数の少なくとも２倍であり、前記第２の急速拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約１～１１日間の第２の期間にわたって実施され、前記第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、前記第２の急速拡大培養は、第２のガス透過性表面積を含む容器内で実施される；
    （ｄ）ステップ（ｃ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収すること；
    （ｅ）直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように前記ＴＩＬを操作すること；及び
    （ｆ）前記回収及び操作されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと
    を含む方法。
  2. 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
    （ａ）対象から得られた腫瘍サンプルを処理して複数の腫瘍断片にすることにより、前記対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
    （ｂ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３を含み、且つ任意選択により抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の初回刺激拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約１～７日間の第１の期間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、数において前記第１のＴＩＬ集団よりも多い；
    （ｃ）前記第２のＴＩＬ集団を、直交性ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む細胞培養培地と接触させることにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第２の急速拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約１～１１日間の第２の期間にわたって実施され、前記第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である；
    （ｄ）直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように前記ＴＩＬを操作すること；及び
    （ｅ）ステップ（ｄ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収すること
    を含む方法。
  3. ステップ（ｂ）において、前記細胞培養培地は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含み、ステップ（ｄ）の前記培養培地中のＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）の前記培養培地中のＡＰＣの数よりも大きい、請求項２に記載の方法。
  4. 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
    （ａ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中において、第１のＴＩＬ集団であって、対象から切除された腫瘍からの腫瘍サンプルを処理して複数の腫瘍断片にすることによって得ることができる第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の初回刺激拡大培養は、第１のガス透過性表面積を含む容器内で実施され、前記第１の初回刺激拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約１～７日間の第１の期間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、数において前記第１のＴＩＬ集団よりも多い；
    （ｂ）前記第２のＴＩＬ集団を、追加的なＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを有する前記第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に接触させることにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、ステップ（ａ）におけるＡＰＣの数の少なくとも２倍であり、前記第２の急速拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約１～１１日間の第２の期間にわたって実施され、前記第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、前記第２の急速拡大培養は、第２のガス透過性表面積を含む容器内で実施される；
    （ｃ）ステップ（ｂ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収すること；及び
    （ｄ）直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように、ステップ（ｃ）で生じられた前記ＴＩＬを操作すること
    を含む方法。
  5. 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
    （ａ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３を含み、且つ任意選択により抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の初回刺激拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約１～７日間の第１の期間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、数において前記第１のＴＩＬ集団よりも多い；
    （ｂ）前記第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む細胞培養培地と接触させることにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第２の急速拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約１～１１日間の第２の期間にわたって実施され、前記第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である；
    （ｃ）ステップ（ｂ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収すること；及び
    （ｄ）直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように、ステップ（ｃ）で生じられた前記ＴＩＬを操作すること
    を含む方法。
  6. ステップ（ａ）において、前記細胞培養培地は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含み、ステップ（ｃ）の前記培養培地中のＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）の前記培養培地中のＡＰＣの数よりも大きい、請求項５に記載の方法。
  7. 前記第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数と、前記第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数との比は、約１．５：１～約２０：１の範囲から選択される、請求項１、３又は６に記載の方法。
  8. 前記比は、約１．５：１～約１０：１の範囲から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記比は、約２：１～約５：１の範囲から選択される、請求項１、３又は６に記載の方法。
  10. 前記比は、約２：１～約３：１の範囲から選択される、請求項１、３又は６に記載の方法。
  11. 前記比は、約２：１である、請求項１、３又は６に記載の方法。
  12. 前記第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数は、約１．０×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２～約４．５×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択され、前記第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、約２．５×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２～約７．５×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される、請求項１、３又は６に記載の方法。
  13. 前記第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数は、約１．５×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２～約３．５×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択され、前記第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、約３．５×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２～約６．０×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される、請求項１、３又は６に記載の方法。
  14. 前記第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数は、約２．０×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２～約３．０×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択され、前記第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、約４．０×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２～約５．５×１０６個のＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される、請求項１、３又は６に記載の方法。
  15. 前記第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数は、約１×１０８個のＡＰＣ～約３．５×１０８個のＡＰＣの範囲から選択され、前記第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、約３．５×１０８個のＡＰＣ～約１×１０９個のＡＰＣの範囲から選択される、請求項１、３又は６に記載の方法。
  16. 前記第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数は、約１．５×１０８個のＡＰＣ～約３×１０８個のＡＰＣの範囲から選択され、前記第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、約４×１０８個のＡＰＣ～約７．５×１０８個のＡＰＣの範囲から選択される、請求項１、３又は６に記載の方法。
  17. 前記第１の初回刺激拡大培養におけるＡＰＣの数は、約２×１０８個のＡＰＣ～約２．５×１０８個のＡＰＣの範囲から選択され、前記第２の急速拡大培養におけるＡＰＣの数は、約４．５×１０８個のＡＰＣ～約５．５×１０８個のＡＰＣの範囲から選択される、請求項１、３又は６に記載の方法。
  18. 約２．５×１０８個のＡＰＣは、前記第１の初回刺激拡大培養に添加され、及び５×１０８個のＡＰＣは、前記第２の急速拡大培養に添加される、請求項１、３又は６に記載の方法。
  19. 前記第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数と、前記第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数との比は、約１．５：１～約１００：１である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数と、前記第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数との比は、約５０：１である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数と、前記第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数との比は、約２５：１である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数と、前記第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数との比は、約２０：１である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数と、前記第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数との比は、約１０：１である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記第２のＴＩＬ集団は、数において前記第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍多い、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記治療用ＴＩＬ集団を回収する前記ステップ後、前記回収された治療用ＴＩＬ集団を輸注バッグに移す追加的なステップを実施することを含む、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記複数の腫瘍断片は、複数の別個の容器に分配され、前記別個の容器のそれぞれにおいて、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップで前記第１のＴＩＬ集団から得られ、及び前記第３のＴＩＬ集団は、前記第２の急速拡大培養の前記ステップで前記第２のＴＩＬ集団から得られ、前記第３のＴＩＬ集団から得られた前記治療用ＴＩＬ集団は、前記複数の容器のそれぞれから収集され、且つ組み合わされて、前記回収されたＴＩＬ集団をもたらす、請求項２～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記複数の別個の容器は、少なくとも２つの別個の容器を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記複数の別個の容器は、２～２０個の別個の容器を含む、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記複数の別個の容器は、２～１０個の別個の容器を含む、請求項２６に記載の方法。
  30. 前記複数の別個の容器は、２～５個の別個の容器を含む、請求項２６に記載の方法。
  31. 前記別個の容器のそれぞれは、第１のガス透過性表面積を含む、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記複数の腫瘍断片は、単一の容器内に分配される、請求項２～２５のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記単一の容器は、第１のガス透過性表面積を含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおいて、前記細胞培養培地は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み、及び前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に約１つの細胞層～約３つの細胞層の平均厚さで積層される、請求項３１又は３３に記載の方法。
  35. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおいて、前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に約１．５の細胞層～約２．５の細胞層の平均厚さで積層される、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおいて、前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に約２つの細胞層の平均厚さで積層される、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおいて、前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に約３つの細胞層～約５つの細胞層の厚さで積層される、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおいて、前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に約３．５の細胞層～約４．５の細胞層の厚さで積層される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおいて、前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に約４つの細胞層の厚さで積層される、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおいて、前記第１の初回刺激拡大培養は、第１のガス透過性表面積を含む第１の容器内で実施され、及び前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおいて、前記第２の急速拡大培養は、第２のガス透過性表面積を含む第２の容器内で実施される、請求項２～２５のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記第２の容器は、前記第１の容器よりも大きい、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおいて、前記細胞培養培地は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み、及び前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に約１つの細胞層～約３つの細胞層の平均厚さで積層される、請求項４０又は４１に記載の方法。
  43. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおいて、前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に約１．５の細胞層～約２．５の細胞層の平均厚さで積層される、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおいて、前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に約２つの細胞層の平均厚さで積層される、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおいて、前記ＡＰＣは、前記第２のガス透過性表面積上に約３つの細胞層～約５つの細胞層の平均厚さで積層される、請求項４０～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおいて、前記ＡＰＣは、前記第２のガス透過性表面積上に約３．５の細胞層～約４．５の細胞層の平均厚さで積層される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおいて、前記ＡＰＣは、前記第２のガス透過性表面積上に約４つの細胞層の平均厚さで積層される、請求項４５に記載の方法。
  48. 第１のＴＩＬ集団に対して前記第１の初回刺激拡大培養が実施される各容器について、前記第２の急速拡大培養は、前記第１のＴＩＬ集団から生じられた前記第２のＴＩＬ集団に対して同じ容器で実施される、請求項２～３９のいずれか一項に記載の方法。
  49. 各容器は、第１のガス透過性表面積を含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおいて、前記細胞培養培地は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み、及び前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に約１つの細胞層～約３つの細胞層の平均厚さで積層される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおいて、前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に約１．５の細胞層～約２．５の細胞層の平均厚さで積層される、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおいて、前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に約２つの細胞層の平均厚さで積層される、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおいて、前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に約３つの細胞層～約５つの細胞層の平均厚さで積層される、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおいて、前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に約３．５の細胞層～約４．５の細胞層の平均厚さで積層される、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおいて、前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に約４つの細胞層の平均厚さで積層される、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップで第１のＴＩＬ集団に対して前記第１の初回刺激拡大培養が実施される各容器について、前記第１の容器は、第１の表面積を含み、前記細胞培養培地は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み、及び前記ＡＰＣは、前記第１のガス透過性表面積上に積層され、前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、前記第２の急速拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．１～約１：１０の範囲から選択される、請求項２～３２、４０、４１又は４８のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、前記第２の急速拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．２～約１：８の範囲から選択される、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、前記第２の急速拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．３～約１：７の範囲から選択される、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、前記第２の急速拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．４～約１：６の範囲から選択される、請求項５６に記載の方法。
  60. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、前記第２の急速拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．５～約１：５の範囲から選択される、請求項５６に記載の方法。
  61. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、前記第２の急速拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．６～約１：４の範囲から選択される、請求項５６に記載の方法。
  62. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、前記第２の急速拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．７～約１：３．５の範囲から選択される、請求項５６に記載の方法。
  63. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、前記第２の急速拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．８～約１：３の範囲から選択される、請求項５６に記載の方法。
  64. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、前記第２の急速拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：１．９～約１：２．５の範囲から選択される、請求項５６に記載の方法。
  65. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数と、前記第２の急速拡大培養の前記ステップで積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、約１：２である、請求項５６に記載の方法。
  66. 前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおける２～３日後、前記細胞培養培地は、追加的なＩＬ－２を補充される、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 凍結保存プロセスを使用して、前記治療用ＴＩＬ集団を回収する前記ステップにおける前記回収されたＴＩＬ集団を凍結保存することをさらに含む、請求項１～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記輸注バッグを凍結保存するステップをさらに含む、請求項１又は２５に記載の方法。
  69. 前記凍結保存プロセスは、回収されたＴＩＬ集団対凍結保存培地の１：１比を使用して実施される、請求項６７又は６８に記載の方法。
  70. 前記抗原提示細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記ＰＢＭＣは、照射され、且つ同種異系である、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおいて、前記細胞培養培地は、末梢血単核球（ＰＭＢＣ）を含み、前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップで前記細胞培養培地に添加されたＰＢＭＣの総数は、約２．５×１０８個である、請求項１～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおいて、前記細胞培養培地中の前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、末梢血単核球（ＰＭＢＣ）であり、前記第２の急速拡大培養の前記ステップで前記細胞培養培地に添加されたＰＢＭＣの総数は、約５×１０８個である、請求項１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記抗原提示細胞は、人工抗原提示細胞である、請求項１～６６のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記治療用ＴＩＬ集団を回収する前記ステップにおける前記回収は、膜ベースの細胞処理系を使用して実施される、請求項１～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記治療用ＴＩＬ集団を回収するステップにおける前記回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される、請求項１～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記複数の断片は、前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおいて、１容器あたり約６０個の断片を含み、各断片は、約２７ｍｍ３の体積を有する、請求項１～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記複数の断片は、約１３００ｍｍ３～約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０～約６０個の断片を含み、請求項１～７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記複数の断片は、約１グラム～約１．５グラムの総質量を有する約５０個の断片を含む、請求項１～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される、請求項１～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. ＩＬ－２濃度は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ＩＵ／ｍＬである、請求項１～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記ＩＬ－２濃度は、約６，０００ＩＵ／ｍＬである、請求項１～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記回収された治療用ＴＩＬ集団を輸注バッグに移す前記ステップにおける前記輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである、請求項１又は２５に記載の方法。
  85. 前記凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記凍結保存培地は、７％～１０％のＤＭＳＯを含む、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおける前記第１の期間及び前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおける前記第２の期間は、５日間、６日間又は７日間の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項１～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおける前記第１の期間は、５日間、６日間又は７日間の期間内に実施される、請求項１～８６のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおける前記第２の期間は、７日間、８日間又は９日間の期間内に実施される、請求項１～８６のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおける前記第１の期間及び前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおける前記第２の期間は、７日間の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項１～８６のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記第１の初回刺激拡大培養から前記治療用ＴＩＬ集団の前記回収までのステップは、約１４日間～約１６日間の期間内に実施される、請求項１～８６のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記第１の初回刺激拡大培養から前記治療用ＴＩＬ集団の前記回収までのステップは、約１５日間～約１６日間の期間内に実施される、請求項１～８６のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記第１の初回刺激拡大培養から前記治療用ＴＩＬ集団の前記回収までのステップは、約１４日間の期間内に実施される、請求項１～８６のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記第１の初回刺激拡大培養から前記治療用ＴＩＬ集団の前記回収までのステップは、約１５日間の期間内に実施される、請求項１～８６のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記第１の初回刺激拡大培養から前記治療用ＴＩＬ集団の前記回収までのステップは、約１６日間の期間内に実施される、請求項１～８６のいずれか一項に記載の方法。
  96. 凍結保存プロセスを使用して、前記回収された治療用ＴＩＬ集団を凍結保存するステップをさらに含み、前記第１の初回刺激拡大培養から前記治療用ＴＩＬ集団の前記回収及び凍結保存までのステップは、１６日間以下で実施される、請求項１～８６のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記治療用ＴＩＬ集団を回収する前記ステップで回収された前記治療用ＴＩＬ集団は、治療有効投与量の前記ＴＩＬのための十分なＴＩＬを含む、請求項１～９３のいずれか一項に記載の方法。
  98. 治療有効投与量のために十分なＴＩＬの数は、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおける前記第３のＴＩＬ集団は、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生及び／又は増加したポリクローナル性を提供する、請求項１～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおける前記第３のＴＩＬ集団は、１８日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍以上のインターフェロンガンマ産生を提供する、請求項１～９８のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記第２の急速拡大培養の前記ステップにおける前記第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、前記第１の初回刺激拡大培養の前記ステップにおける前記第２のＴＩＬ集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、増加したＣＤ８及びＣＤ２８発現を呈する、請求項１～９８のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記治療用ＴＩＬ集団の前記回収の前記ステップからの前記治療用ＴＩＬ集団は、患者に注入される、請求項１～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 癌を有する対象を処置する方法であって、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することであって、
    （ａ）対象から得られた腫瘍サンプルを処理して複数の腫瘍断片にすることにより、前記対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
    （ｂ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の初回刺激拡大培養は、第１のガス透過性表面積を含む容器内で実施され、前記第１の初回刺激拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約１～７日間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、数において前記第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍多い；
    （ｃ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加的なＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを補充することにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第２の急速拡大培養に添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数の少なくとも２倍であり、前記第２の急速拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約１～１１日間にわたって実施され、前記第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、前記第２の急速拡大培養は、第２のガス透過性表面積を含む容器内で実施される；
    （ｄ）ステップ（ｃ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収すること；
    （ｅ）直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように、ステップ（ｄ）で生じられた前記ＴＩＬを操作すること；
    （ｆ）ステップ（ｅ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと；
    （ｇ）治療有効投与量の、ステップ（ｆ）からの前記ＴＩＬを前記対象に投与すること；及び
    （ｈ）治療有効投与量の、前記発現された直交性ＩＬ－２Ｒβに結合することができるＩＬ－２オルソログを前記対象に投与すること
    を含む、投与することを含む、方法。
  104. ステップ（ｇ）における治療有効投与量を投与するために十分なＴＩＬの数は、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である、請求項１０３に記載の方法。
  105. 前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＰＢＭＣである、請求項１０３に記載の方法。
  106. ステップ（ｇ）で治療有効投与量のＴＩＬ細胞を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、前記患者に投与されている、請求項１０３～１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間にわたってシクロホスファミドを投与し、続いて２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間にわたってフルダラビンを投与するステップを含む、請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記高用量ＩＬ－２オルソログで前記患者を処置するステップをさらに含み、前記高用量ＩＬ－２オルソログは、ステップ（ｇ）で前記患者に前記ＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量直交性ＩＬ－２レジメンとして投与される、請求項１０３～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記高用量直交性ＩＬ－２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される１００，０００～１，０００，０００ＩＵ／ｋｇを含む、請求項１０８に記載の方法。
  110. ステップ（ｂ）における前記第３のＴＩＬ集団は、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生及び／又は増加したポリクローナル性を提供する、請求項１０３～１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. ステップ（ｃ）における前記第３のＴＩＬ集団は、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍以上のインターフェロンガンマ産生を提供する、請求項１０３～１０９のいずれか一項に記載の方法。
  112. ステップ（ｃ）における前記第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、ステップ（ｂ）における前記第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、増加したＣＤ８及びＣＤ２８発現を呈する、請求項１０３～１０９のいずれか一項に記載の方法。
  113. 前記癌は、固形腫瘍である、請求項１０３～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. 前記癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される、請求項１０３～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記癌は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌からなる群から選択される、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記癌は、黒色腫である、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記癌は、ＨＮＳＣＣである、請求項１１５に記載の方法。
  118. 前記癌は、子宮頸癌である、請求項１１５に記載の方法。
  119. 前記癌は、ＮＳＣＬＣである、請求項１１５に記載の方法。
  120. 前記癌は、膠芽腫（ＧＢＭを含む）である、請求項１１５に記載の方法。
  121. 前記癌は、胃腸癌である、請求項１１５に記載の方法。
  122. 前記癌は、高頻度変異癌である、請求項１０３～１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. 前記癌は、小児の高頻度変異癌である、請求項１０３～１２１のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記容器は、閉鎖型容器である、請求項１０３～１２３のいずれか一項に記載の方法。
  125. 前記容器は、Ｇコンテナである、請求項１０３～１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 前記容器は、GREX-10である、請求項１０３～１２５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記閉鎖型容器は、GREX-100を含む、請求項１０３～１２５のいずれか一項に記載の方法。
  128. 前記閉鎖型容器は、GREX-500を含む、請求項１０３～１２５のいずれか一項に記載の方法。
  129. 請求項１～１２８のいずれか一項に記載の方法によって作製された治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団。
  130. 患者の腫瘍組織から調製された治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団であって、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生及び／又は増加したポリクローナル性を提供する、治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団。
  131. 増加したインターフェロンガンマ産生を提供する、請求項１２９又は１３０に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  132. 増加したポリクローナル性を提供する、請求項１２９又は１３０に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  133. 増加した有効性を提供する、請求項１２９又は１３０に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  134. １６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、請求項１２９～１３３のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  135. １６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、請求項１２９～１３３のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  136. １６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、請求項１２９～１３３のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  137. 治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団であって、ＴＩＬの第１の拡大培養が、いかなる添加された抗原提示細胞（ＡＰＣ）もなしに実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団。
  138. ＴＩＬの第１の拡大培養が、いかなる添加されたＡＰＣもなしに実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、請求項１３７に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  139. ＴＩＬの第１の拡大培養が、いかなる添加されたＡＰＣもなしに実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、請求項１３８に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  140. 治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団であって、ＴＩＬの第１の拡大培養が、いかなる添加されたＯＫＴ３もなしに実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団。
  141. ＴＩＬの第１の拡大培養が、いかなる添加されたＯＫＴ３もなしに実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、請求項１４０に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  142. ＴＩＬの第１の拡大培養が、いかなる添加されたＯＫＴ３もなしに実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、請求項１４０に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  143. 治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団であって、ＴＩＬの第１の拡大培養が、添加された抗原提示細胞（ＡＰＣ）なし及び添加されたＯＫＴ３なしで実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団。
  144. ＴＩＬの第１の拡大培養が、添加された抗原提示細胞（ＡＰＣ）なし及び添加されたＯＫＴ３なしで実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、請求項１４３に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  145. ＴＩＬの第１の拡大培養が、添加された抗原提示細胞（ＡＰＣ）なし及び添加されたＯＫＴ３なしで実施されるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、請求項１４３に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  146. 請求項１２６～１４５のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団及び薬学的に許容される担体を含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物。
  147. 請求項１４３に記載のＴＩＬ組成物を含む滅菌輸注バッグ。
  148. 請求項１２９～１４２のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団の凍結保存調製物。
  149. 請求項１２９～１４５のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団及び凍結保存培地を含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物。
  150. 前記凍結保存培地は、ＤＭＳＯを含有する、請求項１４９に記載のＴＩＬ組成物。
  151. 前記凍結保存培地は、７～１０％のＤＭＳＯを含有する、請求項１５０に記載のＴＩＬ組成物。
  152. 請求項１４６～１５１のいずれか一項に記載のＴＩＬ組成物の凍結保存調製物。
  153. 医薬としての使用のための、請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物。
  154. 癌の処置における使用のための、請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物。
  155. 固形腫瘍癌の処置における使用のための、請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物。
  156. 黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌から選択される癌の処置における使用のための、請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物。
  157. 黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌からなる群から選択される癌の処置における使用のための、請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物。
  158. 癌の処置における使用のためのものであり、癌は、黒色腫である、請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載のＴＩＬ組成物。
  159. 癌の処置における使用のためのものであり、癌は、ＨＮＳＣＣである、請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載のＴＩＬ組成物。
  160. 癌の処置における使用のためのものであり、子宮頸癌である、請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載のＴＩＬ組成物。
  161. 癌の処置における使用のためのものであり、前記癌は、ＮＳＣＬＣである、請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載のＴＩＬ組成物。
  162. 癌の処置における使用のためのものであり、前記癌は、膠芽腫（ＧＢＭを含む）である、請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載のＴＩＬ組成物。
  163. 癌の処置における使用のためのものであり、前記癌は、胃腸癌である、請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載のＴＩＬ組成物。
  164. 癌の処置における使用のためのものであり、前記癌は、高頻度変異癌である、請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載のＴＩＬ組成物。
  165. 癌の処置における使用のためのものであり、前記癌は、小児の高頻度変異癌である、請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載のＴＩＬ組成物。
  166. 請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物の、対象の癌を処置する方法であって、治療有効投与量の前記ＴＩＬ組成物を前記対象に投与することを含む方法における使用。
  167. 前記癌は、固形腫瘍である、請求項１６６に記載のＴＩＬ組成物の使用。
  168. 前記癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される、請求項１６６に記載のＴＩＬ組成物の使用。
  169. 前記癌は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌からなる群から選択される、請求項１６６に記載のＴＩＬ組成物の使用。
  170. 前記癌は、黒色腫である、請求項１６６に記載のＴＩＬ組成物の使用。
  171. 前記癌は、ＨＮＳＣＣである、請求項１６６に記載のＴＩＬ組成物の使用。
  172. 前記癌は、子宮頸癌である、請求項１６６に記載のＴＩＬ組成物の使用。
  173. 前記癌は、ＮＳＣＬＣである、請求項１６６に記載のＴＩＬ組成物の使用。
  174. 前記癌は、膠芽腫（ＧＢＭを含む）である、請求項１６６に記載のＴＩＬ組成物の使用。
  175. 前記癌は、胃腸癌である、請求項１６６に記載のＴＩＬ組成物の使用。
  176. 前記癌は、高頻度変異癌である、請求項１６６に記載のＴＩＬ組成物の使用。
  177. 前記癌は、小児の高頻度変異癌である、請求項１６６に記載のＴＩＬ組成物の使用。
  178. 対象の癌を処置する方法であって、治療有効投与量の前記ＴＩＬ組成物を前記対象に投与することを含む方法における使用のための、請求項１４３～１５２のいずれか一項に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物。
  179. 前記癌は、固形腫瘍である、請求項１７８に記載のＴＩＬ組成物。
  180. 前記癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される、請求項１７８に記載のＴＩＬ組成物。
  181. 前記癌は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌からなる群から選択される、請求項１７８に記載のＴＩＬ組成物。
  182. 対象の癌を処置する方法であって、治療有効投与量の、請求項１４３～１５２のいずれか一項に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を前記対象に投与することを含む方法。
  183. 前記癌は、固形腫瘍である、請求項１８２に記載の方法。
  184. 前記癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される、請求項１８２に記載の方法。
  185. 前記癌は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌からなる群から選択される、請求項１８２に記載の方法。
  186. 前記癌は、黒色腫である、請求項１８２に記載の方法。
  187. 前記癌は、ＨＮＳＣＣである、請求項１８２に記載の方法。
  188. 前記癌は、子宮頸癌である、請求項１８２に記載の方法。
  189. 前記癌は、ＮＳＣＬＣである、請求項１８２に記載の方法。
  190. 前記癌は、膠芽腫（ＧＢＭを含む）である、請求項１８２に記載の方法。
  191. 前記癌は、胃腸癌である、請求項１８２に記載の方法。
  192. 前記癌は、高頻度変異癌である、請求項１８２に記載の方法。
  193. 前記癌は、小児の高頻度変異癌である、請求項１８２に記載の方法。
  194. Ｔ細胞を拡大培養する方法であって、
    （ａ）ドナーから得られた第１のＴ細胞集団の第１の初回刺激拡大培養を、前記第１のＴ細胞集団を培養して、増殖をもたらし、且つ前記第１のＴ細胞集団の活性化を初回刺激することによって実施すること；
    （ｂ）ステップ（ａ）で初回刺激された前記第１のＴ細胞集団の前記活性化が減衰し始めた後、第２のＴ細胞集団を得るために、前記第１のＴ細胞集団を培養して、増殖をもたらし、且つ前記第１のＴ細胞集団の前記活性化を追加刺激することにより、前記第１のＴ細胞集団の第２の急速拡大培養を実施すること；
    （ｃ）前記第２のＴ細胞集団を回収すること；及び
    （ｄ）直交性ＩＬ－２Ｒβを発現するように、ステップ（ｃ）で生じられた前記ＴＩＬを操作すること
    を含む方法。
  195. ステップ（ａ）の前記第１の初回刺激拡大培養は、最大で７日間の期間中に実施される、請求項１９４に記載の方法。
  196. ステップ（ｂ）の前記第２の急速拡大培養は、最大で１１日間の期間中に実施される、請求項１９４又は１９５に記載の方法。
  197. ステップ（ｂ）の前記第２の急速拡大培養は、最大で９日間の期間中に実施される、請求項１９６に記載の方法。
  198. ステップ（ａ）の前記第１の初回刺激拡大培養は、７日間の期間中に実施され、及びステップ（ｂ）の前記第２の急速拡大培養は、９日間の期間中に実施される、請求項１９４～１９７のいずれか一項に記載の方法。
  199. ステップ（ａ）において、前記第１のＴ細胞集団は、ＯＫＴ－３及びＩＬ－２を含む第１の培養培地中で培養される、請求項１９４～１９８のいずれか一項に記載の方法。
  200. 前記第１の培養培地は、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む、請求項１９９に記載の方法。
  201. ステップ（ｂ）において、前記第１のＴ細胞集団は、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む第２の培養培地中で培養される、請求項１９４～１９８のいずれか一項に記載の方法。
  202. ステップ（ａ）において、前記第１のＴ細胞集団は、第１のガス透過性表面を含む容器内の第１の培養培地中で培養され、前記第１の培養培地は、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、前記第１のＡＰＣ集団は、前記第１のＴ細胞集団の前記ドナーに対して外因性であり、及び前記第１のＡＰＣ集団は、前記第１のガス透過性表面上に積層され、ステップ（ｂ）において、前記第１のＴ細胞集団は、前記容器内の第２の培養培地中で培養され、前記第２の培養培地は、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第２のＡＰＣ集団を含み、前記第２のＡＰＣ集団は、前記第１のＴ細胞集団の前記ドナーに対して外因性であり、及び前記第２のＡＰＣ集団は、前記第１のガス透過性表面上に積層され、前記第２のＡＰＣ集団は、前記第１のＡＰＣ集団よりも大きい、請求項１９４～１９８のいずれか一項に記載の方法。
  203. 前記第２のＡＰＣ集団におけるＡＰＣの数と、前記第１のＡＰＣ集団におけるＡＰＣの数との比は、約２：１である、請求項２０２に記載の方法。
  204. 前記第１のＡＰＣ集団におけるＡＰＣの数は、約２．５×１０８個であり、及び前記第２のＡＰＣ集団におけるＡＰＣの数は、５×１０８個である、請求項２０２又は２０３に記載の方法。
  205. ステップ（ａ）において、前記第１のＡＰＣ集団は、前記第１のガス透過性表面上にＡＰＣの２つの層の平均厚さで積層される、請求項２０２～２０４のいずれか一項に記載の方法。
  206. ステップ（ｂ）において、前記第２のＡＰＣ集団は、前記第１のガス透過性表面上に、ＡＰＣの４～８つの層の範囲から選択される平均厚さで積層される、請求項２０２～２０５のいずれか一項に記載の方法。
  207. ステップ（ｂ）において前記第１のガス透過性表面上に積層されたＡＰＣの層の平均数と、ステップ（ａ）において前記第１のガス透過性表面上に積層されたＡＰＣの層の平均数との比は、２：１である、請求項２０２～２０６のいずれか一項に記載の方法。
  208. 前記ＡＰＣは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項２０２～２０７のいずれか一項に記載の方法。
  209. 前記ＰＢＭＣは、照射され、且つ前記第１のＴ細胞集団の前記ドナーに対して外因性である、請求項２０８に記載の方法。
  210. 前記Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、請求項２０２～２０９のいずれか一項に記載の方法。
  211. 前記Ｔ細胞は、骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）である、請求項２０２～２０９のいずれか一項に記載の方法。
  212. 前記Ｔ細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である、請求項２０２～２０９のいずれか一項に記載の方法。
  213. ＩＬ－２Ｒβを発現するための前記操作は、ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）との間で実施される、請求項１又は２に記載の方法。
  214. ＩＬ－２Ｒβを発現するための前記操作は、ステップ（ｃ）とステップ（ｄ）との間で実施される、請求項１又は２に記載の方法。
  215. 直交性ＩＬ－２は、ステップ（ｃ）のＩＬ－２を代替する、請求項１又は２に記載の方法。
  216. 治療用リンパ球集団を生じさせる方法であって、
    （ａ）ドナーから得られた第１のリンパ球集団の第１の初回刺激拡大培養を、前記第１のリンパ球集団を培養して、増殖をもたらし、且つ前記第１のリンパ球集団の活性化を初回刺激することによって実施すること；
    （ｂ）ステップ（ａ）で初回刺激された前記第１のリンパ球集団の前記活性化が減衰し始めた後、第２のリンパ球集団を得るために、前記第１のリンパ球集団を培養して、増殖をもたらし、且つ前記第１のリンパ球集団の前記活性化を追加刺激することにより、前記第１のリンパ球集団の第２の急速拡大培養を実施すること；
    （ｃ）前記第２のリンパ球集団を回収すること；及び
    （ｄ）直交性サイトカイン受容体を発現するように、ステップ（ｃ）で生じられた前記リンパ球を操作すること
    を含む方法。
  217. 前記直交性サイトカイン受容体は、ＩＬ－２Ｒβである、請求項２１６に記載の方法。
  218. 前記リンパ球は、ＭＩＬである、請求項２１６又は２１７に記載の方法。
  219. 前記リンパ球は、ＰＢＬである、請求項２１６又は２１７に記載の方法。
  220. 前記リンパ球は、ＴＩＬである、請求項２１６又は２１７に記載の方法。
  221. 前記リンパ球は、ＴＩＬ及びＭＩＬの混合集団である、請求項２１６又は２１７に記載の方法。
  222. 前記リンパ球は、ＴＩＬであり、及び前記直交性サイトカイン受容体は、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２１Ｒ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１６に記載の方法。
  223. 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
    （ａ）対象から得られた腫瘍サンプルを処理して複数の腫瘍断片にすることにより、前記対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
    （ｂ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の初回刺激拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の初回刺激拡大培養は、第１のガス透過性表面積を含む容器内で実施され、前記第１の初回刺激拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約１～７日間の第１の期間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、数において前記第１のＴＩＬ集団よりも多い；
    （ｃ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地にＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを補充することにより、第２の急速拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第２の急速拡大培養で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数の少なくとも２倍であり、前記第２の急速拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約１～１１日間の第２の期間にわたって実施され、前記第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、前記第２の急速拡大培養は、第２のガス透過性表面積を含む容器内で実施される；
    （ｄ）ステップ（ｃ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収すること；
    （ｅ）ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２１Ｒ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの直交性サイトカイン受容体を発現するように前記ＴＩＬを操作すること；及び
    （ｆ）前記回収及び操作されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと
    を含む方法。
  224. 少なくとも１つの直交性サイトカイン受容体を発現するための前記操作は、ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）との間で実施される、請求項２２３に記載の方法。
  225. 少なくとも１つの直交性サイトカイン受容体を発現するための前記操作は、ステップ（ｃ）とステップ（ｄ）との間で実施される、請求項２２３に記載の方法。
JP2021535083A 2018-12-19 2019-12-12 操作されたサイトカイン受容体対を使用して腫瘍浸潤リンパ球を拡大培養する方法及びその使用 Pending JP2022514023A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862782330P 2018-12-19 2018-12-19
US62/782,330 2018-12-19
PCT/US2019/065892 WO2020131547A1 (en) 2018-12-19 2019-12-12 Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022514023A true JP2022514023A (ja) 2022-02-09
JPWO2020131547A5 JPWO2020131547A5 (ja) 2022-12-02

Family

ID=69591709

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021535083A Pending JP2022514023A (ja) 2018-12-19 2019-12-12 操作されたサイトカイン受容体対を使用して腫瘍浸潤リンパ球を拡大培養する方法及びその使用

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220193131A1 (ja)
EP (1) EP3898949A1 (ja)
JP (1) JP2022514023A (ja)
CA (1) CA3123392A1 (ja)
WO (1) WO2020131547A1 (ja)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201700621D0 (en) 2017-01-13 2017-03-01 Guest Ryan Dominic Method,device and kit for the aseptic isolation,enrichment and stabilsation of cells from mammalian solid tissue
BR112022011513A2 (pt) * 2019-12-13 2022-08-23 Synthekine Inc Ortólogos de il-2 e métodos de uso
CA3164986A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Instil Bio (Uk) Limited Devices and methods for isolating tumor infiltrating lymphocytes and uses thereof
EP4077397A2 (en) * 2019-12-20 2022-10-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel il2 agonists and methods of use thereof
EP4146794A1 (en) * 2020-05-04 2023-03-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
US12012441B2 (en) 2020-10-26 2024-06-18 Neptune Biosciences Llc Engineered human IL-21 cytokines and methods for using the same
TW202237822A (zh) 2020-11-19 2022-10-01 大陸商蘇州沙礫生物科技有限公司 腫瘤浸潤淋巴細胞的培養方法及其用途
JP2024500403A (ja) * 2020-12-17 2024-01-09 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球によるがんの治療
TW202241508A (zh) * 2021-01-29 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 細胞介素相關之腫瘤浸潤性淋巴球組合物及方法
CN117043321A (zh) * 2021-04-23 2023-11-10 苏州沙砾生物科技有限公司 一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途
CA3226163A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Synthekine, Inc. Methods and compositions for use in cell therapy of neoplastic disease
WO2023147488A1 (en) * 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
WO2023201369A1 (en) * 2022-04-15 2023-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018081789A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Engineered artificial antigen presenting cells for tumor infiltrating lymphocyte expansion
WO2018129332A1 (en) * 2017-01-06 2018-07-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (tils) with tumor necrosis factor receptor superfamily (tnfrsf) agonists and therapeutic combinations of tils and tnfrsf agonists
US20180325954A1 (en) * 2017-03-29 2018-11-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US5128257A (en) 1987-08-31 1992-07-07 Baer Bradford W Electroporation apparatus and process
JP2798459B2 (ja) 1988-01-21 1998-09-17 マサチユセツツ・インスチチユート・オブ・テクノロジー エレクトロポレーションを利用した診断装置及び分子の組織内移動装置
US6303121B1 (en) 1992-07-30 2001-10-16 Advanced Research And Technology Method of using human receptor protein 4-1BB
US6362325B1 (en) 1988-11-07 2002-03-26 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Murine 4-1BB gene
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
ZA902710B (en) 1989-05-22 1991-12-24 Univ Georgia Res Found Enzyme luminescence assay
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
CA2019758C (en) 1990-06-25 2001-09-04 Kevin L. Firth Improved electroporation device and method
US5137817A (en) 1990-10-05 1992-08-11 Amoco Corporation Apparatus and method for electroporation
US5173158A (en) 1991-07-22 1992-12-22 Schmukler Robert E Apparatus and methods for electroporation and electrofusion
US5304120A (en) 1992-07-01 1994-04-19 Btx Inc. Electroporation method and apparatus for insertion of drugs and genes into endothelial cells
US5273525A (en) 1992-08-13 1993-12-28 Btx Inc. Injection and electroporation apparatus for drug and gene delivery
US5318514A (en) 1992-08-17 1994-06-07 Btx, Inc. Applicator for the electroporation of drugs and genes into surface cells
PT672141E (pt) 1992-10-23 2003-09-30 Immunex Corp Metodos de preparacao de proteinas oligomericas soluveis
GB9317380D0 (en) 1993-08-20 1993-10-06 Therexsys Ltd Transfection process
US5821332A (en) 1993-11-03 1998-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Receptor on the surface of activated CD4+ T-cells: ACT-4
US6989434B1 (en) 1994-02-11 2006-01-24 Invitrogen Corporation Reagents for intracellular delivery of macromolecules
US5691188A (en) 1994-02-14 1997-11-25 American Cyanamid Company Transformed yeast cells expressing heterologous G-protein coupled receptor
CA2193954A1 (en) 1994-06-27 1996-01-04 Vu L. Truong Targeted gene delivery system
US5908635A (en) 1994-08-05 1999-06-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for the liposomal delivery of nucleic acids
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
WO1996032495A1 (en) 1995-04-08 1996-10-17 Lg Chemicals Ltd. Monoclonal antibody specific for human 4-1bb and cell line producing same
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US6010613A (en) 1995-12-08 2000-01-04 Cyto Pulse Sciences, Inc. Method of treating materials with pulsed electrical fields
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
NZ334691A (en) 1996-10-11 2000-12-22 Bristol Myers Squibb Co Compositions of anti-4-1BB antibody effective for immunomodulation and treatment of T-cell autoimmune disease
JP2001508302A (ja) 1997-01-10 2001-06-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 胚性幹細胞血清置換
AU745049B2 (en) 1997-03-11 2002-03-07 Regents Of The University Of Minnesota DNA-based transposon system for the introduction of nucleic acid into DNA of a cell
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6475994B2 (en) 1998-01-07 2002-11-05 Donald A. Tomalia Method and articles for transfection of genetic material
US6312700B1 (en) 1998-02-24 2001-11-06 Andrew D. Weinberg Method for enhancing an antigen specific immune response with OX-40L
WO1999045132A1 (en) 1998-03-02 1999-09-10 Massachusetts Institute Of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US7189705B2 (en) 2000-04-20 2007-03-13 The University Of British Columbia Methods of enhancing SPLP-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers
US6627442B1 (en) 2000-08-31 2003-09-30 Virxsys Corporation Methods for stable transduction of cells with hiv-derived viral vectors
EP1353701B1 (en) 2000-10-31 2011-12-21 PR Pharmaceuticals, Inc. Methods for producing compositions for enhanced delivery of bioactive molecules
EP1525223B1 (en) 2002-06-13 2007-11-21 Crucell Holland B.V. Ox40 (=cd134) receptor agonists and therapeutic use
PL375144A1 (en) 2002-07-30 2005-11-28 Bristol-Myers Squibb Company Humanized antibodies against human 4-1bb
US9255243B2 (en) 2003-10-08 2016-02-09 Wilson Wolf Manufacturing Corporation Cell culture methods and devices utilizing gas permeable materials
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
WO2006050172A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 University Of Southern California Combination cancer immunotherapy with co-stimulatory molecules
EP1877090B1 (en) 2005-05-06 2014-01-15 Providence Health System Trimeric ox40-immunoglobulin fusion protein and methods of use
US7596024B2 (en) 2006-07-14 2009-09-29 Semiconductor Energy Laboratory Co., Ltd. Nonvolatile memory
EP1894940A1 (en) 2006-08-28 2008-03-05 Apogenix GmbH TNF superfamily fusion proteins
KR20100014588A (ko) 2007-02-27 2010-02-10 제넨테크, 인크. 길항제 ｏｘ40 항체 및 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서의 이의 용도
EP2484691B1 (en) 2007-07-10 2016-01-13 Apogenix GmbH TNF superfamily collectin fusion proteins
CA2702028A1 (en) 2007-10-02 2009-04-09 Rxi Pharmaceuticals Corp. Tripartite rnai constructs
JP5761997B2 (ja) 2007-12-14 2015-08-12 ブリストル−マイヤーズ・スクイブ・カンパニー ヒトｏｘ４０受容体に対する結合分子
CN104975020B (zh) 2008-02-11 2020-01-17 菲奥医药公司 经修饰的RNAi多核苷酸及其用途
EP2540740B1 (en) 2008-06-17 2014-09-10 Apogenix GmbH Multimeric TNF receptors
EP2310509B1 (en) 2008-07-21 2015-01-21 Apogenix GmbH Tnfsf single chain molecules
JP6209309B2 (ja) 2008-09-22 2017-10-04 アールエックスアイ ファーマシューティカルズ コーポレーション サイズが減少した自己送達用ＲＮＡｉ化合物
WO2010042433A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Bristol-Myers Squibb Company Combination of cd137 antibody and ctla-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
JP5844158B2 (ja) 2009-01-09 2016-01-13 アポゲニクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＡｐｏｇｅｎｉｘ ＧｍｂＨ 三量体形成融合タンパク質
EP2698430A3 (en) 2009-12-08 2014-03-05 Wilson Wolf Manufacturing Corporation Methods of cell culture for adoptive cell therapy
US20130115617A1 (en) 2009-12-08 2013-05-09 John R. Wilson Methods of cell culture for adoptive cell therapy
US8956860B2 (en) 2009-12-08 2015-02-17 Juan F. Vera Methods of cell culture for adoptive cell therapy
RU2615143C2 (ru) 2010-03-24 2017-04-04 Адвирна Самодоставляющие PHKi соединения уменьшенного размера
US9340786B2 (en) 2010-03-24 2016-05-17 Rxi Pharmaceuticals Corporation RNA interference in dermal and fibrotic indications
EP3578183B1 (en) 2010-03-24 2021-09-08 Phio Pharmaceuticals Corp. Rna interference in ocular indications
EP3156062A1 (en) 2010-05-17 2017-04-19 Sangamo BioSciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
US20110201118A1 (en) 2010-06-14 2011-08-18 Iowa State University Research Foundation, Inc. Nuclease activity of tal effector and foki fusion protein
ES2630328T3 (es) 2010-08-23 2017-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Anticuerpos anti-OX40 y procedimientos de uso de los mismos
DK2614082T3 (en) 2010-09-09 2018-11-26 Pfizer 4-1BB BINDING MOLECULES
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
CA3144697A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Nektar Therapeutics Conjugates of an il-2 moiety and a polymer
WO2012129201A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of growing tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable containers
KR101982360B1 (ko) 2011-04-05 2019-05-24 셀렉티스 콤팩트 tale-뉴클레아제의 발생 방법 및 이의 용도
US20140234320A1 (en) 2011-06-20 2014-08-21 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Modulators of 4-1bb and immune responses
CA2845810C (en) 2011-08-23 2017-03-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-ox40 antibodies and methods of using the same
SG11201400527XA (en) 2011-09-16 2014-04-28 Univ Pennsylvania Rna engineered t cells for the treatment of cancer
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
CA2852672C (en) 2011-10-17 2021-07-20 Massachusetts Institute Of Technology A microfluidic system and method for delivering a payload into a cell by causing perturbations in a cell membrane of the cell
SG10202111564SA (en) 2012-05-18 2021-12-30 Wilson Wolf Mfg Corporation Improved methods of cell culture for adoptive cell therapy
EP2855666B1 (en) 2012-05-25 2019-12-04 Cellectis Use of pre t alpha or functional variant thereof for expanding tcr alpha deficient t cells
WO2013182910A2 (en) 2012-06-05 2013-12-12 Cellectis New transcription activator-like effector (tale) fusion protein
IL302514A (en) 2012-06-11 2023-07-01 Wilson Wolf Mfg Corporation Improved cell culture methods for stress cell therapy
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
KR20150105633A (ko) 2012-12-12 2015-09-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 시스템, 방법 및 최적화된 가이드 조성물의 조작
EP4286402A3 (en) 2012-12-12 2024-02-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
DK3064585T3 (da) 2012-12-12 2020-04-27 Broad Inst Inc Konstruering og optimering af forbedrede systemer, fremgangsmåder og enzymsammensætninger til sekvensmanipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
US20160010058A1 (en) 2013-03-01 2016-01-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Serv Methods of producing enriched populations of tumor-reactive t cells from tumor
MX2015013288A (es) 2013-03-18 2016-04-07 Biocerox Prod Bv Anticuerpos anti-cd134 (ox40) humanizados y usos de los mismos.
US11311575B2 (en) 2013-05-13 2022-04-26 Cellectis Methods for engineering highly active T cell for immunotherapy
CA2916244A1 (en) 2013-06-24 2014-12-31 Wilson Wolf Manufacturing Corporation Closed system device and methods for gas permeable cell culture process
US10934550B2 (en) 2013-12-02 2021-03-02 Phio Pharmaceuticals Corp. Immunotherapy of cancer
CN106102774A (zh) 2013-12-17 2016-11-09 豪夫迈·罗氏有限公司 包含ox40结合激动剂和pd‑1轴结合拮抗剂的组合疗法
US10899840B2 (en) 2014-02-04 2021-01-26 Pfizer Inc. Combination of a PD-1 antagonist and a 4-1BB agonist for treating cancer
EP3838288A1 (en) 2014-06-11 2021-06-23 polybiocept GmbH Expansion of lymphocytes with a cytokine composition for active cellular immunotherapy
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
EP4257675A3 (en) 2015-07-09 2024-01-03 Massachusetts Institute of Technology Delivery of materials to anucleate cells
CA3002744A1 (en) 2015-10-19 2017-04-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering nucleic acid compounds targeting long non-coding rna
US20190017072A1 (en) 2016-01-12 2019-01-17 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of complexes
IL266209B1 (en) 2016-10-26 2024-10-01 Iovance Biotherapeutics Inc Restimulation of cryopreserved sputum infiltrates lymphocytes

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018081789A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Engineered artificial antigen presenting cells for tumor infiltrating lymphocyte expansion
WO2018129332A1 (en) * 2017-01-06 2018-07-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (tils) with tumor necrosis factor receptor superfamily (tnfrsf) agonists and therapeutic combinations of tils and tnfrsf agonists
US20180325954A1 (en) * 2017-03-29 2018-11-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JONATHAN T. SOCKOLOSKY; ET AL: "SELECTIVE TARGETING OF ENGINEERED T CELLS USING ORTHOGONAL IL-2 CYTOKINE-RECEPTOR COMPLEXES", SCIENCE, vol. VOL:359, NR:6379, JPN5022004719, 2 March 2018 (2018-03-02), pages 1037 - 1042, ISSN: 0005225471 *
RICHARD D. PAUCEK; ET AL: "THE CELLULAR IMMUNOTHERAPY REVOLUTION: ARMING THE IMMUNE SYSTEM FOR PRECISION THERAPY", TRENDS IN IMMUNOLOGY, vol. VOL:40, NR:4, JPN5022004720, April 2018 (2018-04-01), pages 292 - 309, ISSN: 0005225472 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3898949A1 (en) 2021-10-27
CA3123392A1 (en) 2020-06-25
WO2020131547A9 (en) 2020-08-20
WO2020131547A1 (en) 2020-06-25
US20220193131A1 (en) 2022-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7557367B2 (ja) 細針吸引及び小生検からのｔｉｌ拡大培養
US20240228963A1 (en) Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
JP2022514023A (ja) 操作されたサイトカイン受容体対を使用して腫瘍浸潤リンパ球を拡大培養する方法及びその使用
JP2022506508A (ja) Ａｋｔ経路阻害剤を利用したｔｉｌの拡大培養
JP2021521846A (ja) 腫瘍浸潤リンパ球の拡大培養及び遺伝子編集のための閉鎖型プロセス並びに免疫療法におけるその使用
JP2022512915A (ja) 改良された腫瘍反応性ｔ細胞の選択
JP2024016051A (ja) 末梢血からの末梢血リンパ球（ｐｂｌ）の拡大培養
TW202241508A (zh) 細胞介素相關之腫瘤浸潤性淋巴球組合物及方法
KR20210091212A (ko) 항-pd-1 항체에 불응성인 nsclc 환자의 치료
JP2022522473A (ja) 液性腫瘍からの腫瘍浸潤リンパ球の拡大培養及びその治療的使用
JP2023554395A (ja) Ｃｔｌａ－４及びｐｄ－１阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球療法による治療
JP2023506734A (ja) 腫瘍浸潤リンパ球（ｔｉｌ）の産生のためのプロセス及びそれを使用する方法
JP2024519029A (ja) Ｐｄ－１遺伝子編集された腫瘍浸潤リンパ球及び免疫療法におけるその使用
JP2024512029A (ja) Ｔ細胞共培養効力アッセイのための方法及び組成物、ならびに細胞療法製品との使用
TW202323521A (zh) 製備表現嵌合抗原受體的細胞之方法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221124

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20221124

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20231225

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240319

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240520

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240621

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240918