KR20210091212A - 항-pd-1 항체에 불응성인 nsclc 환자의 치료 - Google Patents

항-pd-1 항체에 불응성인 nsclc 환자의 치료 Download PDF

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KR20210091212A
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마리아 파르디스
아르바인드 나타라잔
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이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 비-소세포 폐 암종(NSCLC)의 치료를 위해 증가된 치료 효능을 갖는 TIL의 치료 집단을 제조하기 위해 TIL을 제조하는 개선되고/개선되거나 단축된 과정 및 방법을 제공하고, 상기 NSCLC는 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성이다.

Description

항-PD-1 항체에 불응성인 NSCLC 환자의 치료
관련 출원의 교차 참조
본원은 2018년 11월 5일자로 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/756,025호, 및 2019년 9월 20일자로 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/903,627호의 우선권을 주장하며, 상기 출원들은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
종양 침윤 림프구(TIL)의 입양 전달(adoptive transfer)을 사용하는 부피가 크고 난치성인 암의 치료는 예후가 좋지 않은 환자를 위한 요법에 대한 강력한 접근법을 나타낸다. 문헌[Gattinoni, 등, Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393]. 성공적인 면역요법을 위해서는 다수의 TIL이 요구되고, 상업화를 위해서는 강건하고 신뢰할 수 있는 공정이 필요하다. 이는 세포 확장과 관련된 기술적, 물류적, 및 규제적 사안 때문에 달성하는 것이 곤란했었다. IL-2-기반 TIL 확장과 그것에 뒤따르는 "급속 확장 공정(rapid expansion process)"(REP)은 그의 속도 및 효율로 인해 TIL 확장을 위한 바람직한 방법이 되었다. 문헌[Dudley, 등, Science 2002, 298, 850-54]; 문헌[Dudley, 등, J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57]; 문헌[Dudley, 등, J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39]; 문헌[Riddell, 등, Science 1992, 257, 238-41]; 문헌[Dudley, 등, J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. REP는 14일 기간에 걸쳐 TIL의 1,000배 확장을 초래할 수 있지만, 이는 종종 다수의 공여체로부터의, 피더 세포(feeder cell)로서의 조사된 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC, 단핵 세포(MNC)로도 공지됨), 뿐만 아니라 항-CD3 항체 (OKT3) 및 높은 용량의 IL-2를 크게 (예를 들어, 200배) 필요로 한다. 문헌[Dudley, 등, J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. REP 절차를 거친 TIL은 흑색종 환자에서 숙주 면역억제 후 성공적인 입양 세포 요법을 생성하였다. 현재의 주입 허용 파라미터는 TIL의 조성(예를 들어, CD28, CD8, 또는 CD4 양성)의 판독 및 REP 생성물의 접힘 확장 및 생존력에 의존한다.
현재의 TIL 제조 및 치료 과정은 길이, 비용, 멸균 문제, 및 본원에 기재된 다른 인자에 의해 제한되어, 항-PD1에 불응성인 환자를 치료할 가능성이 매우 제한되었다. 생존가능한 치료 옵션이 거의 없거나 전혀 없는 환자를 치료하는데 사용하기에 적합한 TIL 제조 방법 및 이러한 방법에 기초한 요법을 제공할 긴급한 필요성이 있다. 본 발명은 항-PD-1 치료에 불응성인 비소세포 폐 암종 (NSCLC) 환자의 치료에 사용될 수 있는 TIL의 생성에 사용하기 위한 단축된 제조 방법을 제공함으로써 이러한 필요를 충족시킨다.
본 발명은 항-PD-1 치료에 불응성인 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 환자의 치료에 사용하기 위해 TIL을 확장시키고 TIL의 치료 집단을 생성하는 개선되고/개선되거나 단축된 방법을 제공한다.
본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단으로 비-소세포 폐 암종 (NSCLC)을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 외과적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소규모 생검, 또는 환자의 NSCLC 종양으로부터의 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 얻기 위한 다른 수단으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하고/수득하거나 수용하는 단계;
(c) 상기 종양 단편을 제1 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계;
(d) 상기 제1 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하는 단계로서, 상기 TIL의 제2 집단은 그 수가 상기 TIL의 제1 집단보다 적어도 5-배 초과이고, 상기 제1 세포 배양 배지는 IL-2를 포함하는 단계;
(e) 제2 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하는 단계로서, 상기 TIL의 제3 집단은 그 수가 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 상기 TIL의 제2 집단보다 적어도 50-배 초과이고; 상기 제2 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 (항-CD3 항체), 및 선택적으로 조사된 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하고; 그리고 상기 급속 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 단계;
(f) 상기 TIL의 제3 집단을 수확하는 단계; 및
(g) 상기 TIL의 제3 집단의 치료적 유효 부분을 NSCLC 환자에게 투여하는 단계;
상기 NSCLC는 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성이다.
일부 실시형태에서, "수득하는(obtaining)"은 방법 및/또는 공정에 사용된 TIL이 방법 및/또는 공정 단계의 일부로서 샘플(수술적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소형 생검, 또는 다른 샘플을 포함함)로부터 직접 유래될 수 있음을 나타낸다. 일부 실시형태에서, "수용하는(receiving)"은 방법 및/또는 공정에 사용된 TIL이 (수술적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소형 생검, 또는 다른 샘플을 포함하는) 샘플로부터 간접적으로 유래될 수 있고, 이어서 상기 방법 또는 공정에서 사용될 수 있음을 나타낸다(예를 들어, 단계 (a)가 시작되는 경우, 부분 (a)에 포함되지 않은 별도의 공정에 의해 샘플로부터 이미 유래된 TIL은 "수용된"으로 지칭될 수 있다).
일부 실시형태에서, TIL의 제1 집단은 다병변 샘플링 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-PD-L2 항체로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 화학요법제로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 화학요법제로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 화학요법제로 치료되고 있지 않고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 기준선에서 큰 부피의 질환(bulky disease)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 화학요법제로 치료되고 있지 않고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 횡단면이나 관상면에서 측정된 최대 종양 직경이 7 cm 초과이거나 팽윤된 림프절이 20 mm 이상의 단축 직경을 가질 때 큰 부피의 질환이 나타난다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 네오아쥬반트(neo-adjuvant) 또는 아쥬반트 요법을 포함하지 않는 적어도 2개의 이전(prior) 전신 치료 과정에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 이필리무맙, JS001, TSR-042, 피딜리주맙, BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, 클론으로부터의 항-PD-1: RMP1-14, 미국 특허 제8,008,449호에 개시된 항-PD-1 항체, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 그의 단편, 유도체, 변이체뿐만 아니라 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택된 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 더발루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 아테졸리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 아벨루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 21일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, IL-2는 제1 세포 배양 배지에서 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지에서 약 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고 OKT-3 항체는 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 급속 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 제1 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 TIL의 제3 집단을 환자에게 투여하기 전에 비-골수절제 림프구고갈 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 비-골수절제 림프구고갈 레지멘은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드를 투여한 다음, 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 추가로 TIL의 제3 집단을 환자에게 투여한 다음 날에 시작하는 IL-2 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-2 레지멘은 허용 범위(tolerance)까지 8시간마다 15분 볼러스 정맥내 주입(bolus intravenous infusion)으로 투여되는, 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 높은 용량 IL-2 레지멘이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단으로 비-소세포 폐 암종 (NSCLC)을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 환자로부터 종양을 절제하는 단계로서, 종양은 TIL의 제1 집단을 포함하는 단계;
(b) 상기 종양을 종양 단편으로 단편화하는 단계;
(c) 상기 종양 단편을 제1 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계;
(d) 상기 제1 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하는 단계로서, 상기 TIL의 제2 집단은 그 수가 상기 TIL의 제1 집단보다 적어도 5-배 초과이고, 상기 제1 세포 배양 배지는 IL-2를 포함하는 단계;
(e) 제2 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하는 단계로서, 상기 TIL의 제3 집단은 그 수가 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 상기 TIL의 제2 집단보다 적어도 50-배 초과이고; 상기 제2 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 (항-CD3 항체), 및 선택적으로 조사된 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하고; 그리고 상기 급속 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 단계;
(f) 상기 TIL의 제3 집단을 수확하는 단계; 및
(g) 상기 TIL의 제3 집단의 치료적 유효 부분을 암 환자에게 투여하는 단계;
상기 암은 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 화학요법제로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 화학요법제로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 화학요법제로 치료되고 있지 않고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 화학요법제로 치료되고 있지 않고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 횡단면이나 관상면에서 측정된 최대 종양 직경이 7 cm 초과이거나 팽윤된 림프절이 20 mm 이상의 단축 직경을 가질 때, 큰 부피의 질환이 나타난다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 네오아쥬반트 또는 아쥬반트 요법을 포함하지 않는 적어도 2개의 이전 전신 치료 과정에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, JS001, TSR-042, 피딜리주맙, (BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, 클론으로부터의 항-PD-1: RMP1-14, 미국 특허 제8,008,449호에 개시된 항-PD-1 항체, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 그의 단편, 유도체, 변이체뿐만 아니라 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택된 항-PD-1 항체 또는 항체-PD-L1 항체에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 더발루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 아테졸리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 아벨루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 21일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, IL-2는 제1 세포 배양 배지에서 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지에서 약 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고 OKT-3 항체는 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 급속 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 제1 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 TIL의 제3 집단을 환자에게 투여하기 전에 비-골수절제 림프구고갈 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 비-골수절제 림프구고갈 레지멘은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드를 투여한 다음, 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 추가로 TIL의 제3 집단을 환자에게 투여한 다음 날에 시작하는 IL-2 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-2 레지멘은 허용 범위까지 8시간마다 15분 볼러스 정맥내 주입으로 투여되는, 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 높은 용량 IL-2 레지멘이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 비-소세포 폐 암종(NSCLC)을 가지고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 암은 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성이고, 상기 방법은 확장된 종양 침윤 림프구 (TIL)을 투여하는 것을 포함하고, 상기의 단계를 포함한다:
(a) 상기 대상체로부터 수득된 종양 샘플을 다수의 종양 단편으로 가공함으로써 대상체에서 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하고/수득하거나 수용하는 단계;
(b) 상기 종양 단편을 폐쇄 시스템에 추가하는 단계;
(c) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제1 집단을 배양함으로써 상기 제1 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 생성하는 단계로서, 상기 제1 확장은 폐쇄된 용기에서 수행되어 제1 기체 투과성 표면적을 제공하고, 상기 제1 확장은 약 3-11
Figure pct00001
일 동안 수행되어 TIL의 제2 집단을 얻고, 상기 TIL의 제2 집단은 그 수가 TIL의 제1 집단보다 적어도 50-배 초과이고, 단계 (b)로부터 단계 (c)로의 이행(transition)는 시스템을 개방하지 않고 일어나는 단계;
(d) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여, TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 상기 제2 확장은 약 7-11
Figure pct00002
일 동안 수행하여 TIL의 제3 집단을 얻고, 상기 TIL의 제3 집단은 TIL의 제2 집단에 비해 효과기(effector) T 세포 및/또는 중앙 기억 T 세포의 증가된 하위집단을 포함하는 TIL의 치료 집단이고, 상기 제2 확장은 폐쇄된 용기에서 수행되어 제2 기체 투과성 표면적을 제공하고, 단계 (c)로부터 단계 (d)로의 이행은 시스템을 개방하지 않고 일어나는 단계;
(e) 단계 (d)로부터 수득된 TIL의 치료 집단을 수확하는 단계로서, 단계 (d)로부터 단계 (e)로의 이행은 시스템을 개방하지 않고 일어나는 단계; 및
(f) 단계 (e)로부터 수확된 TIL 집단을 주입 백으로 이동시키는 단계로서, 단계 (e)로부터 (f)로의 이동은 시스템을 개방하지 않고 일어나는 단계;
(g) 동결보존 과정을 사용하여 단계 (f)로부터 수확된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존하는 단계; 및
(h) 단계 (g)에서의 주입 백으로부터의 TIL의 제3 집단의 치료 효과적인 투여량을 상기 대상체에게 투여하는 단계.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 화학요법제로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 화학요법제로 이전에 치료되었다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 화학요법제로 치료되고 있지 않고 저발현의 PD-L1을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 화학요법제로 치료되고 있지 않고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 횡단면이나 관상면에서 측정된 최대 종양 직경이 7 cm 초과이거나 팽윤된 림프절이 20 mm 이상의 단축 직경을 가질 때 큰 부피의 질환이 나타난다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 네오아쥬반트 또는 아쥬반트 요법을 포함하지 않는 적어도 2개의 이전 전신 치료 과정에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, JS001, TSR-042, 피딜리주맙, BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, 클론: RMP1-14로부터의 항-PD-1, 미국 특허 제8,008,449호에 기재된 항-PD-1 항체, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 그의 단편, 유도체, 변이체뿐만 아니라 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택된 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 더발루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 아테졸리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 불응성 NSCLC는 아벨루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 21일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, IL-2는 제1 세포 배양 배지에서 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지에서 약 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고 OKT-3 항체는 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 초기 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 급속 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 제1 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 TIL의 제3 집단을 환자에게 투여하기 전에 비-골수절제 림프구고갈 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 비-골수절제 림프구고갈 레지멘은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드를 투여한 다음, 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 추가로 TIL의 제3 집단을 환자에게 투여한 다음 날에 시작하는 IL-2 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-2 레지멘은 허용 범위까지 8시간마다 15분 볼러스 정맥내 주입으로 투여되는, 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 높은 용량 IL-2 레지멘이다.
일부 실시형태에서, NSCLC는 항-PD-1과 화학요법제를 포함하는 병용 치료에 불응성이다.
일부 실시형태에서, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, JS001, TSR-042, 피딜리주맙, (BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, 클론: RMP1-14로부터의 항-PD-1, 미국 특허 제8,008,449호에 기재된 항-PD-1 항체, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 그의 단편, 유도체, 변이체뿐만 아니라 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 항PD-1는 펨브롤리주맙이다.
일부 실시형태에서, 화학요법제(들)는 백금 더블릿(platinum doublet) 화학요법제이다.
일부 실시형태에서, 백금 더블릿 요법은 다음을 포함한다:
i) 시스플라틴 및 카보플라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 화학요법제,
ii) 및 비노렐빈, 젬시타빈 및 탁산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 화학요법제 (예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 nab-파클리탁셀을 포함함).
일부 실시형태에서, 화학요법제는 페메트렉세드와 조합된다.
일부 실시형태에서, NSCLC는 카보플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 및 시스플라틴을 포함하는 병용 요법에 불응성이다.
일부 실시형태에서, NSCLC는 카보플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 시스플라틴, 니볼루맙, 및 이필리무맙을 포함하는 병용 요법에 불응성이다.
도 1: 단계 A 내지 F의 개요를 제공하는 예시적인 공정 2A 챠트.
도 2: 공정 2A의 공정 흐름도.
도 3: 동결보존된 TIL의 예시적인 제조 공정의 실시형태의 다이어그램을 도시한다(-22일).
도 4: 공정 2A, TIL 제조를 위한 22-일 공정의 실시형태의 다이어그램을 도시한다.
도 5: 공정 1C 및 공정 2A의 예시적인 실시형태로부터의 단계 A 내지 F의 비교 표.
도 6: 공정 1C의 실시형태와 공정 2A의 실시형태의 상세한 비교.
도 7: NSCLC 종양에 대한 예시적인 GEN 3 유형 공정.
도 8a-8b: A) 2A 공정 (대략 22-일 공정)과 및 TIL 제조를 위한 Gen 3 공정 (대략 14-일 내지 16-일 공정) 사이의 비교를 도시한다. B) 단계들 A 내지 F의 개요를 제공하는 예시적인 공정 Gen3 챠트 (대략 14-일 내지 16-일 공정). C) 각각의 3개의 공정 변형에 대한 단계 A 내지 F의 개요를 갖는 3개의 예시적인 Gen 3 공정 (대략 14-일 내지 16-일 공정)을 제공하는 챠트.
도 9: GEN 2(공정 2A) 대 GEN 3 사이의 호환성에 대한 실험 흐름도를 제공한다.
도 10a-10c: A) L4054 - Gen 2와 Gen 3 공정에 대한 TIL 생성물의 단표현형 특성화. B) L4055- Gen 2와 Gen 3 공정에 대한 TIL 생성물의 단표현형 특성화. C) M1085T- Gen 2와 Gen 3 공정에 대한 TIL 생성물의 단표현형 특성화.
도 11A-11C: A) L4054 - Gen 2 및 Gen 3 공정의 TIL 생성물에 대한 기억 마커 분석. B) L4055 - Gen 2 및 Gen 3 공정의 TIL 생성물에 대한 기억 마커 분석. C) M1085T- Gen 2 및 Gen 3 공정의 TIL 생성물에 대한 기억 마커 분석.
도 12: L4054 활성화 및 고갈 마커 (A)는 CD4+ 상에서 게이팅되고, (B) CD8+ 상에서 게이팅된다.
도 13: L4055 활성화 및 고갈 마커 (A)는 CD4+ 상에서 게이팅되고, (B) CD8+ 상에서 게이팅되고.
도 14: IFNγ 생산 (pg/mL): Gen 2 및 Gen 3 공정에 대한 (A) L4054, (B) L4055, 및 (C) M1085T: 본원에 제시된 각각의 막대는 자극된, 자극되지 않은, 및 배지 대조군의 IFNγ 수준에 대한 + SEM을 의미한다. 450 nm에서 측정된 광학 밀도.
도 15: 세포 배양 상청액에서 IL-2 농도의 ELISA 분석: (A) L4054 및 (B) L4055. 본원에 제시된 각각의 막대는 소비된 배지의 IL-2 수준에 대한 + SEM을 의미한다. 450 nm에서 측정된 광학 밀도.
도 16: 소비된 배지에서 글루코스 및 락테이트 (g/L)의 정량화: (A) 글루코스 및 (B) 락테이트: 2개의 종양계에서, 그리고 두 과정 모두에서, 글루코스의 감소가 REP 확장 전반에 걸쳐 관찰되었다. 반대로, 예상대로, 락테이트의 증가가 관찰되었다. 글루코스의 감소 및 락테이트의 증가 둘 다는 Gen 2 및 Gen 3 공정 사이에 비교가능하였다.
도 17: A) L4054 및 L4055에 대한 소비된 배지에서 L-글루타민의 정량화. B) L4054 및 L4055에 대한 소비된 배지에서 GlutaMAX의 정량화. C) L4054 및 L4055에 대한 소비된 배지에서 암모니아의 정량화.
도 18: 텔로미어 길이 분석. 상대 텔로미어 길이 (RTL: relative telomere length) 값은 DAKO 키트를 사용하여 대조군 세포주 (1301 백혈병 세포주)에서 염색체/게놈 당 텔로미어 형광의 Gen 2 및 Gen 3 공정에서 염색체/게놈 당 평균 텔로미어 형광을 나타낸다.
도 19: Gen 2 및 Gen 3 공정 하의 L4054 및 L4055 상의 TIL 최종 생성물에 대한 고유한 CDR3 서열 분석. 칼럼은 수확 날 Gen 2 (예를 들어, 22일째) 및 Gen 3 공정 (예를 들어, 14 내지 16일째)에 수집된 1 × 106 세포로부터 확인된 고유한 TCR B 클론형의 수를 나타낸다. Gen 3은 샘플 내의 고유한 펩티드 CDR의 수에 기초하여 Gen 2에 비해 더 높은 클론 다양성을 나타낸다.
도 20: L4054 IL 수확된 최종 세포 생성물 (Gen 2 (예를 들어, 22일째) 및 Gen 3 공정 (예를 들어, 14 내지 16일째))에 대한 고유한 CDR3 서열의 빈도.
도 21: L4055 TIL 수확된 최종 세포 생성물 (Gen 2 (예를 들어, 22일째) 및 Gen 3 공정 (예를 들어, 14 내지 16일째))에 대한 고유한 CDR3 서열의 빈도.
도 22: Gen 2 및 Gen 3 공정 하의 L4054 및 L4055 상의 TIL 최종 생성물에 대한 다양성 지수. 샤논 엔트로피 다양성 지수는 비교를 위해 더 신뢰성 있고 공통 메트릭이다. Gen 3 L4054 및 L4055는 Gen 2보다 약간 더 높은 다양성을 나타내었다.
도 23: 세포에 대한 원시 데이터는 표 45에 제시된 7일째-Gen 3 REP 개시를 카운트한다 (하기 실시예 8 참조).
도 24: 세포에 대한 원시 데이터는 표 45에 제시된 11일째-Gen 2 REP 개시 및 Gen 3 확대를 카운트한다 (하기 실시예 8 참조).
도 25: 세포에 대한 원시 데이터는 표 46에 제시된 16일째-Gen 2 확대 및 Gen 3 수확 (예를 들어, 16일째)을 카운트한다 (하기 실시예 8 참조).
도 26: 세포에 대한 원시 데이터는 표 46에 제시된 22일째-Gen 2 수확 (예를 들어, 22일째)을 카운트한다 (하기 실시예 8 참조). L4054 Gen 2에 대해, LOVO 후 카운트를 4개의 플라스크로 외삽하한 것은, 연구의 총 수였기 때문이었다. 1개의 플라스크를 오염시키고, 외삽을 총 = 6.67E + 10에 대해 수행하였다.
도 27: 도 10a, 10a, 및 10b에 도시된 유세포측정 결과에 대한 원시 데이터.
도 28: 도 10c 및 10c에 도시된 유세포측정 결과에 대한 원시 데이터.
도 29: 도 12 및 13에 도시된 유세포측정 결과에 대한 원시 데이터.
도 30: 도 14에 도시된 L4054 샘플의 IFNγ 생산 검정 결과에 대한 원시 데이터.
도 31: 도 14에 도시된 L4055 샘플의 IFNγ 생산 검정 결과에 대한 원시 데이터.
도 32: 도 14에 도시된 M1085T 샘플의 IFNγ 생산 검정 결과에 대한 원시 데이터.
도 33: 도 15에 도시된 IL-2 ELISA 검정 결과애 대한 원시 데이터.
도 34: 도 16 및 17에 제공된 대사 기질 및 대사 분석 결과에 대한 원시 데이터.
도 35: 도 18에 제공된 상대 텔로미어 길이 분석 결과에 대한 원시 데이터.
도 36: 도 19 및 22에 제공된 고유한 CD3 서열 및 클론 다양성 분석 결과에 대한 원시 데이터.
도 37: 다양한 Gen 2 (2A 공정)와 Gen 3.1 공정 실시형태 사이의 비교를 도시한다.
도 38: Gen 2, Gen 2.1 및 Gen 3.0 공정의 실시형태의 다양한 특징을 기재하는 표.
도 39: Gen 3.1로 지칭된 Gen 3 공정의 실시형태에 대한 배지 조건의 개요.
도 40: Gen 2, Gen 2.1 및 Gen 3.0 공정의 실시형태의 다양한 특징을 기재하는 표.
도 41: Gen 2 및 Gen 3.0 공정의 실시형태의 다양한 특징을 비교하는 표.
도 42: 배지를 제공하는 표는 기재된 확장 공정의 다양한 실시형태를 사용한다.
도 43: 표현형 비교: 공정의 Gen 3.0 및 Gen 3.1 실시형태는 비교가능한 CD28, CD27 및 CD57 발현을 나타낸다.
도 44: Gen 3 최종 산물에 대한 IFNγ의 더 높은 생산. IFNγ 분석 (by ELISA)은 공정 둘 다와 비교하여 배양 냉동된 상청액에서 평가되었다. 각각의 종양에 대해, 각각의 Gen 2 (예를 들어, 22일째) 및 Gen 3 공정 (예를 들어, 16일째)에 대한 새로운 TIL 생성물을 사용하여 코팅된 항-CD3 플레이트를 사용하여 밤새 자극한다. 여기서 각각의 막대는 자극, 비자극 및 배지 대조군의 IFNγ 수준이다.
도 45: 최상부: TIL 최종 생성물에 대한 독특한 CDR3 서열 분석: 컬럼은 Gen 2 (예를 들어, 22일째) 및 Gen 3 공정 (예를 들어, 14 내지 16일째)에 대해 수집된 1 × 106 세포로부터 확인된 고유한 TCR B 클론형의 수를 나타낸다. Gen 3은 샘플 내의 고유한 펩티드 CDR의 수에 기초하여 Gen 2에 비해 더 높은 클론 다양성을 나타낸다. 바닥: TIL 최종 생성물에 대한 다양성 지수: 샤논 엔트로피 다양성 지수는 비교를 위한 더 신뢰할 수 있는 공통 메트릭이다. Gen 3은 Gen 2보다 약간 더 높은 다양성을 나타내었다.
도 46: 199개의 서열은 Gen 3 및 Gen 2 최종 산물 사이에 공유되며, 이는 Gen 3 최종 산물과 공유된 Gen 2 로부터의 고유한 CDR3 서열의 상위 80%의 97.07%에 상응한다.
도 47: 1833개의 서열은 Gen 3 및 Gen 2 최종 산물 사이에 공유되며, 이는 Gen 3 최종 산물과 공유된 Gen 2 로부터의 고유한 CDR3 서열의 상위 80%의 99.45%에 상응한다.
도 48: Gen 3 공정 (16-일 공정)의 예시적인 실시형태의 개략도.
도 49: Gen 3 확장 플랫폼을 사용하여 조혈 악성종양으로부터 T 세포를 확장시키는 방법의 예시적인 실시형태의 개략도.
도 50: 구조 I-A 및 I-B를 제공하고, 실린더는 개별 폴리펩티드 결합 도메인을 지칭한다. 구조 I-A 및 I-B는 예를 들어, 4-1BBL로부터 유래된 3개의 선형-연결된 TNFRSF 결합 도메인, 또는 4-1BB에 결합하는 항체를 포함하고, 이는 폴딩되어 3가 단백질을 형성하고, 이어서 IgG1-Fc를 통해 제2 3가 단백질 (CH3 및 CH2 도메인을 포함함)에 연결되고, 이어서 디술피드 결합 (작은 긴 계란형)을 통해 3가 단백질의 2개를 함께 연결하는데 사용되어, 구조를 안정화시키고, 6개의 수용체의 세포내 신호전달 도메인 및 신호전달 단백질을 합쳐서 신호전달 복합체를 형성할 수 있는 효능제를 제공한다. 실린더로 표시된 TNFRSF 결합 도메인은 예를 들어, 가요성을 위한 Gly 및 Ser 서열과 친수성 잔기뿐만 아니라 용해도를 위한 Glu 및 Lys를 포함할 수 있는 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함하는 scFv 도메인일 수 있다.
도 51: Gen 3 공정 (16-일 공정)의 예시적인 실시형태의 개략도.
도 52: Gen 3.1 공정 (16 일 공정)의 예시적인 실시형태 (Gen 3.1 테스트)에 대한 공정 개요를 제공한다.
도 53: Gen 3 공정의 예시적인 실시형태 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, Gen 3.1 테스트)에 대한 수확 날에 TIL 증식, 종양 단편 당 평균 총 생존가능 세포수 (total viable cell counts; TVC), 수확 날에서의 퍼센트 생존력 및 수확 날에서의 총 생존가능 세포수로부터의 데이터를 제공한다. Gen 3.1 테스트 (0일째에 OKT-3 및 공급기의 첨가를 포함함)은 수확 시에 플라스크의 최대 수용력에 도달했다. 최대 4개의 플라스크가 0일에 개시되면, 각각의 TVC 수확에 4를 곱해야 한다.
도 54: Gen 3 공정의 예시적인 실시형태 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, Gen 3.1 테스트), 16-일 공정에 대한 총 생존가능 세포수 (TVC) 및 퍼센트 생존력을 도시하는 막대 그래프.
도 55: Gen 3 공정의 예시적인 실시형태 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트)가 비교가능한 CD28, CD27 및 CD57 발현을 나타내는 세포를 산출함을 나타내는 데이터를 제공한다.
도 56: TIL 기억 상태가 Gen 3 공정의 예시적인 실시형태 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, 및 Gen 3.1 테스트)에 의해 산출된 세포에 걸쳐 비교가능함을 나타내는 데이터를 제공한다. REP TIL의 기억 상태는 아래와 같이 도시된다: CD4+ 또는 CD8+ TIL 기억 하위세트는 상이한 기억 하위세트로 나누어졌다. 미접촉 (CD45RA+CD62L+), CM: 중앙 기억 (CD45RA-CD62L+), EM: 효과기 기억 (CD45RA-CD62L-), TEMRA/TEFF: RA+ 효과기 기억/효과기 (CD45RA+CD62L+). 제시된 막대 그래프는 CD4+ 또는 CD8+ 상에 게이팅될 때 백분율 양성 CD45+/-CD62L +/-이다.
도 57: TIL 활성화/고갈 마커가 CD4+ 상에서 게이팅될 때 Gen 3 공정의 예시적인 실시형태 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, 및 Gen 3.1 테스트)에 의해 산출된 세포에 걸쳐 비교가능함을 나타내는 데이터를 제공한다. REP TIL의 활성화 및 고갈은 다색 유세포측정으로 결정되었다. 수확된 TIL 샘플은 유세포측정 항체 (CD3-BUV395, PD-1-BV421, 2B4/CD244-PB, CD8-BB515, CD25-BUV563, BTLA-PE, KLRG1-PE-Dazzle 594, TIM-3-BV650, CD194/CCR4-APC, CD4-VioGreen, TIGIT-PerCP-eFluor 710, CD183-BV711, CD69-APC-R700, CD95-BUV737, CD127-PE-Cy7, CD103-BV786, LAG-3-APC-eFluor 780)로 염색되었다. 제시된 막대 그래프는 REP TIL의 CD4+ 또는 CD8+ TIL의 백분율이다.
도 58: TIL 활성화/고갈 마커가 CD8+ 상에서 게이팅될 때 Gen 3 공정의 예시적인 실시형태 (Gen 3.0, Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1)에 의해 산출된 세포에 걸쳐 비교가능함을 나타내는 데이터를 제공한다. REP TIL의 활성화 및 고갈은 다색 유세포측정으로 결정되었다. 수확된 샘플은 유세포측정 항체 (CD3-BUV395, PD-1-BV421, 2B4/CD244-PB, CD8-BB515, CD25-BUV563, BTLA-PE, KLRG1-PE-Dazzle 594, TIM-3-BV650, CD194/CCR4-APC, CD4-VioGreen, TIGIT-PerCP-eFluor 710, CD183-BV711, CD69-APC-R700, CD95-BUV737, CD127-PE-Cy7, CD103-BV786, LAG-3-APC-eFluor 780)로 염색되었다. 제시된 막대 그래프는 REP TIL의 CD4+ 또는 CD8+ TIL의 백분율이다.
도 59: Gen 3.1 최종 산물에 의해 나타난 IFN-γ의 더 높은 생산을 나타내는 데이터를 제공한다. IFNγ 분석 ELISA를 배양 냉동 상청액에서 평가하여 두 과정을 비교하였다. 각각의 종양에 대해, 각각의 수확 날에 새로운 TIL 생성물을 사용하여 코팅된 항-CD3 플레이트를 사용하여 밤새 자극한다. 각각의 막대는 여기서 자극, 미자극 및 배지 대조군의 IFN-γ 수준을 나타낸다.
도 60: 상청액 상의 IL-2 농도가 표준 배지를 사용한 Gen 3 공정의 예시적인 실시형태 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, Gen 3.1 테스트)에 걸쳐 비교가능함을 나타내는 데이터를 제공한다. 왼쪽 패널: L4063- Gen 2 표준 배지. 오른쪽 패널: L4064- CTS Optimizer 배지. * AIM V 희석제로 수행된 ELISA
도 61: 대사물질 농도가 Gen 3 공정의 예시적인 실시형태 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, Gen 3.1 테스트)에 걸쳐 상청액 상등액에 비교가능함을 나타내는 데이터를 제공한다. L4063 TIL은 표준 배지에서 확장되었다. L4064 TIL은 CTS Optimizer 배지에서 확장되었다.
도 62: Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, Gen 3.1 테스트)의 예시적인 실시형태에 대한 텔로미어 길이 분석. 종양 식별 번호 L4063 및 L4064에 의해 산출된 세포에 대한 텔로미어 길이 분석: 상대 텔로미어 길이 (RTL) 값은 DAKO 키트를 사용하여 대조군 세포주 (1301 백혈병 세포주)에서 염색체/게놈 당 텔로미어 형광에 대한 Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트 과정에 의해 생산된 세포에서 염색체/게놈 당 평균 텔로미어 형광을 나타낸다.
도 63: Gen 3.1 테스트 (Gen 3.1 최적화된) 공정 (16-17 일 공정)의 예시적인 실시형태의 개략도.
도 64: Gen 3 공정 (16-일 공정)의 예시적인 실시형태의 개략도.
도 65A-65B: 강조된 예시적인 차이를 갖는 예시적인 Gen 2 및 예시적인 Gen 3 공정에 대한 비교 표.
도 66: Gen 3 공정 (16/17 일 공정) 제조 시각표의 예시적인 실시형태의 개략도.
도 67: Gen 3 공정 (14-16 일 공정의 예시적인 실시형태의 개략도).
도 68: 예시적인 Gen 3 공정 실시형태의 3개의 엔지니어링 실행의 16/17일째로부터의 데이터의 요약.
도 69: TIL의 연장된 표현형에 관한 데이터: 예시적인 Gen 3 공정 실시형태의 2개의 엔지니어링 실행에 의해 생산된 세포에 대한 TIL 동일성(ID) 사양에 대한 분화 특징이 도시되어 있다.
도 70: 폐 종양으로부터 확장된 TIL의 확장된 표현형에 관한 데이터는 폐 종양 조직을 사용하는 예시적인 Gen 3 공정 실시형태의 2개의 공정 개발(PD) 실행에 의해 생산된 세포에 대한 TIL 동일성(ID) 사양에 대한 분화 특징이 도시되어 있다.
도 71: 난소 종양으로부터 확장된 TIL의 확장된 표현형(순도, 동일성 및 기억)에 관한 데이터는: 예시적인 Gen 2, Gen 3.1, 및 FR ER(냉동된 종양, 조기 REP) 공정 실시형태를 사용하여 난소 종양로부터 확장된 세포의 순도, 동일성, 및 기억 표현형 특징을 나타내고; *는 시험되지 않은 조건을 나타내고; Y는 해동 시 샘플링 문제, 낮은 TVC 카운트 또는 비-생존가능 세포를 나타낸다.
도 72: TIL의 특성화를 위한 게이팅 전략(게이팅 계층이 도시됨) 및 예시적인 Gen 3 공정 실시양태의 2개의 엔지니어링 실행에 의해 생성된 세포의 연장된 표현형 특징에 관한 데이터가 도시되어 있다.
도 73: TIL(게이팅 계층이 도시됨)의 특성화를 위한 게이팅 전략 및 예시적인 Gen 3 공정 실시형태의 2개의 엔지니어링 실행에 의해 생성된 세포의 CD4+ 하위집단 및 CD8+ 하위집단의 연장된 표현형 특성에 관한 데이터가 도시된다.
도 74: 예시적인 Gen 3 공정 실시형태의 2개의 엔지니어링 실행에 의해 생성된 세포의 그란자임 B ELISA 분석에 관한 데이터가 도시되어 있다.
도 75A-75B: Gen 3 공정 (16 일 공정)의 예시적인 실시형태의 개략도.
도 76: Gen 3 공정 (16 일 공정)의 예시적인 실시형태의 개략도.
도 77: Gen 3 공정 (16 일 공정)의 Gen 2, Gen 2.1 및 실시형태의 비교.
도 78: Gen 3 공정 (16 일 공정)의 Gen 2, Gen 2.1 및 실시형태의 비교.
도 79: Gen 3 실시형태 구성요소.
도 80: Gen 3 실시형태 흐름도 비교 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, Gen 3.1 테스트).
도 81: 총 생존가능 세포수 및 배수 확장은 표준 세포 배양 배지 및 무혈청 세포 배양 배지를 사용하여 예시적인 Gen 3 실시형태 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트)에 대해 제시된다.
도 82: 재활성화, 배양 확대 및 TIL 수확 시의 생존력 점수 %는 표준 세포 배양 배지 및 무혈청 세포 배양 배지를 사용하여 예시적인 Gen 3 실시형태 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트)에 대해 제시된다.
도 83: 표준 세포 배양 배지 및 CTS 무혈청 세포 배양 배지를 사용하여 예시적인 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트)에서 L4063 및 L4064 종양 샘플의 처리에 의해 생성된 TIL 생성물의 표현형 특성화가 제시된다.
도 84: 표준 세포 배양 배지 및 CTS 무혈청 세포 배양 배지를 사용하여 예시적인 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트)에서 L4063 및 L4064 종양 샘플의 처리에 의해 생성된 TIL 생성물의 기억 마커 분석이 제시된다.
도 85: 표준 세포 배양 배지 및 CTS 무혈청 세포 배양 배지, 그 다음 CD4+ 게이팅된 세포 분류를 사용하여 예시적인 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트)에서 L4063 및 L4064 종양 샘플의 처리에 의해 생성된 TIL의 활성화 및 고갈 마커가 제시된다.
도 86: 표준 세포 배양 배지 및 CTS 무혈청 세포 배양 배지, 그 다음 CD8+ 게이팅된 세포 분류를 사용하여 예시적인 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트)에서 L4063 및 L4064 종양 샘플의 처리에 의해 생성된 TIL의 활성화 및 고갈 마커가 제시된다.
도 87: 표준 세포 배양 배지 및 CTS 무혈청 세포 배양 배지를 사용하여 예시적인 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트)에서 L4063 및 L4064 종양 샘플의 처리에 의해 생성된 최종 TIL 생성물에 대한 IFN-γ 생성 (pg/mL) 점수가 제시된다.
도 88: 표준 세포 배양 배지 및 CTS 무혈청 세포 배양 배지를 사용하여 예시적인 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트)에서 L4063 및 L4064 종양 샘플의 처리로부터 소비된 배지 (재활성화, 배양 확대 및 TIL 수확에서 수집됨)의 IL-2 농도 (pg/mL) 분석이 제시된다.
도 89: 표준 세포 배양 배지 및 CTS 무혈청 세포 배양 배지를 사용하여 예시적인 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트)에서 L4063 및 L4064 종양 샘플의 처리로부터 소비된 배지 (재활성화, 배양 확대 및 TIL 수확에서 수집됨)에서 글루코스 (g/L)의 농도가 제시된다.
도 90: 표준 세포 배양 배지 및 CTS 무혈청 세포 배양 배지를 사용하여 예시적인 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트)에서 L4063 및 L4064 종양 샘플의 처리로부터 소비된 배지 (재활성화, 배양 확대 및 TIL 수확에서 수집됨)에서 락테이트 (g/L)의 농도가 제시된다.
도 91: 표준 세포 배양 배지 및 CTS 무혈청 세포 배양 배지를 사용하여 예시적인 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트)에서 L4063 및 L4064 종양 샘플의 처리로부터 소비된 배지 (재활성화, 배양 확대 및 TIL 수확에서 수집됨)에서 글루타민 (mmol/L)의 농도가 제시된다.
도 92: 표준 세포 배양 배지 및 CTS 무혈청 세포 배양 배지를 사용하여 예시적인 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트)에서 L4063 및 L4064 종양 샘플의 처리로부터 소비된 배지 (재활성화, 배양 확대 및 TIL 수확에서 수집됨)에서 GlutaMAX (mmol/L)의 농도가 제시된다.
도 93: 표준 세포 배양 배지 및 CTS 무혈청 세포 배양 배지를 사용하여 예시적인 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트)에서 L4063 및 L4064 종양 샘플의 처리로부터 소비된 배지 (재활성화, 배양 확대 및 TIL 수확에서 수집됨)에서 암모니아 (mmol/L)의 농도가 제시된다. Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, Gen 3.1 테스트)의 예시적인 실시형태에 대한 텔로미어 길이 분석. 종양 식별 번호 L4063 및 L4064에 의해 산출된 세포에 대한 텔로미어 길이 분석: 상대 텔로미어 길이 (RTL) 값은 DAKO 키트를 사용하여 대조군 세포주 (1301 백혈병 세포주)에서 염색체/게놈 당 텔로미어 형광에 대한 Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트 과정에 의해 생산된 세포에서 염색체/게놈 당 평균 텔로미어 형광을 나타낸다.
도 94: 표준 세포 배양 배지 및 CTS 무혈청 세포 배양 배지를 사용하여 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, Gen 3.1 테스트)의 예시적인 실시형태에 의해 생성된 TIL에 대한 텔로미어 길이 분석. 종양 식별 번호 L4063 및 L4064에 의해 산출된 세포에 대한 텔로미어 길이 분석: 상대 텔로미어 길이 (RTL) 값은 DAKO 키트를 사용하여 대조군 세포주 (1301 백혈병 세포주)에서 염색체/게놈 당 텔로미어 형광에 대한 Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트 과정에 의해 생산된 세포에서 염색체/게놈 당 평균 텔로미어 형광을 나타낸다.
도 95: 표준 세포 배양 배지 및 CTS 무혈청 세포 배양 배지를 사용하여 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, Gen 3.1 테스트)의 예시적인 실시형태에 의해 생성된 TIL에 대한 TCR Vβ 레퍼토리 요약. 고유한 CDR3 서열의 TCR Vβ 레퍼토리에 의해 측정된 바와 같이 Gen 3.0, Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.1 테스트 과정에 의해 생성된 종양 식별 번호 L4063 및 L4064에 의해 생성된 최종 TIL 생성물에 대한 TIL의 클론형성능이 기재된다.
도 96: L4063 종양 샘플의 처리로부터의 TIL 수확된 생성물에서 고유한 CDR3 서열의 빈도에 대한 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, Gen 3.1 테스트)의 예시적인 실시형태에 의해 생성된 TIL의 비교.
도 97: L4063 종양 샘플의 처리로부터의 TIL 수확된 세포 생성물에서의 백분율 공유 고유한 CDR3 서열에 대한 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, Gen 3.1 테스트)의 예시적인 실시형태에 의해 생성된 TIL의 비교: 975 서열은 Gen 3.0과 Gen 3.1 테스트 최종 생성물 사이에 공유되며, Gen-3.1 시험 최종 생성물과 공유된 Gen 3.0으로부터의 독특한 CDR3 서열의 상위 80%의 88%에 상응한다.
도 98: L4064 종양 샘플의 처리로부터의 TIL 수확된 세포 생성물에서의 백분율 공유 고유한 CDR3 서열에 대한 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, Gen 3.1 테스트)의 예시적인 실시형태에 의해 생성된 TIL의 비교: 2163 서열은 Gen 3.0과 Gen 3.1 테스트 최종 생성물 사이에 공유되며, Gen-3.1 시험 최종 생성물과 공유된 Gen 3.0으로부터의 독특한 CDR3 서열의 상위 80%의 87%에 상응한다.
도 99: L4064 종양 샘플의 처리로부터 TIL 수확된 생성물에서 고유한 CDR3 서열의 빈도와 관련하여 Gen 3 공정 (Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, Gen 3.1 테스트)의 예시적인 실시형태에 의해 생성된 TIL의 비교.
도 100: Gen 3 공정 (Gen 3-최적화된, 16-17 일 공정)의 예시적인 실시형태의 구성요소가 도시된다.
도 101: 허용 기준 표.
도 102: 세포수 재활성화 일.
도 103: 세포수 확대 일.
도 104: 세포수 수확 L4063.
도 105: 세포수 수확 L4064.
도 106: 플로우 데이터.
도 107: 플로우 데이터.
도 108: 플로우 데이터.
도 109: 플로우 데이터.
도 110: IFN-γ 생성 데이터 도 7-L4063.
도 111: 데이터 IFN-γ 생성 도 7-L4064.
도 112: IL-2 농도 데이터의 ELISA 분석.
도 113: 대사 데이터 요약 표.
도 114: 요약 데이터.
도 115: 요약 데이터.
도 116: 샤논(Shannon) 다양성 지수.
서열 목록의 간단한 설명
서열번호:1은 무로모납의 중쇄의 아미노산 서열이다.
서열번호:2은 무로모납의 경쇄의 아미노산 서열이다.
서열번호:3은 재조합 인간 IL-2 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호:4은 알데스류킨의 아미노산 서열이다.
서열번호:5은 재조합 인간 IL-4 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호:6은 재조합 인간 IL-7 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호:7은 재조합 인간 IL-15 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호:8은 재조합 인간 IL-21 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호:9은 인간 4-1BB의 아미노산 서열이다.
서열번호:10은 쥣과 4-1BB의 아미노산 서열이다.
서열번호:11은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 중쇄이다.
서열번호:12은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 경쇄이다.
서열번호:13은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:14은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:15은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 중쇄 CDRl이다.
서열번호:16은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호:17은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호:18은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호:19은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호:20은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 유토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호:21은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 중쇄이다.
서열번호:22은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 경쇄이다.
서열번호:23은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:24은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:25은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열번호:26은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호:27은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호:28은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호:29은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호:30은 4-1BB 효능제 단클론성 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호:31은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 Fc 도메인이다.
서열번호:32은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:33은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:34은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:35은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:36은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:37은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:38은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:39은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:40은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:41은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:42은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 Fc 도메인이다.
서열번호:43은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:44은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:45은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호:46은 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 아미노산 서열.
서열번호:47은 4-1BBL 폴리펩티드의 가용성 부분이다.
서열번호:48은 4-1BB 효능제 항체 4B4-1-1 버전 1에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:49은 4-1BB 효능제 항체 4B4-1-1 버전 1에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:50은 4-1BB 효능제 항체 4B4-1-1 버전 2에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:51은 4-1BB 효능제 항체 4B4-1-1 버전 2에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:52은 4-1BB 효능제 항체 H39E3-2에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:53은 4-1BB 효능제 항체 H39E3-2에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:54은 인간 OX40의 아미노산 서열이다.
서열번호:55은 쥣과 OX40의 아미노산 서열이다.
서열번호:56은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 중쇄이다.
서열번호:57은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 경쇄이다.
서열번호:58은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:59은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:60은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 중쇄 CDRl이다.
서열번호:61은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호:62은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호:63은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호:64은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호:65은 OX40 효능제 단클론성 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호:66은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 중쇄이다.
서열번호:67은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 경쇄이다.
서열번호:68은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:69은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:70은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 중쇄 CDRl이다.
서열번호:71은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호:72은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호:73은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호:74은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호:75은 OX40 효능제 단클론성 항체 11D4에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호:76은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 중쇄이다.
서열번호:77은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 경쇄이다.
서열번호:78은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:79은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:80은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 중쇄 CDRl이다.
서열번호:81은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호:82은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호:83은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호:84은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호:85은 OX40 효능제 단클론성 항체 18D8에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호:86은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:87은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:88은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 CDRl이다.
서열번호:89은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호:90은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호:91은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호:92은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호:93은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호:94은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:95은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:96은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 CDRl이다.
서열번호:97은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호:98은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호:99은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호:100은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호:101은 OX40 효능제 단클론성 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호:102은 OX40 리간드 (OX40L) 아미노산 서열이다.
서열번호:103은 OX40L 폴리펩티드의 가용 부분이다.
서열번호:104은 OX40L 폴리펩티드의 대안적인 가용 부분이다.
서열번호:105은 OX40 효능제 단클론성 항체 008에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:106은 OX40 효능제 단클론성 항체 008에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:107은 OX40 효능제 단클론성 항체 011에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:108은 OX40 효능제 단클론성 항체 011에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:109은 OX40 효능제 단클론성 항체 021에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:110은 OX40 효능제 단클론성 항체 021에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:111은 OX40 효능제 단클론성 항체 023에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:112은 OX40 효능제 단클론성 항체 023에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:113은 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:114은 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:115은 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:116은 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:117은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:118은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:119은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:120은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:121은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:122은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:123은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:124은 인간화된 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:125은 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호:126은 OX40 효능제 단클론성 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호:127-462는 현재 할당되지 않는다.
서열번호:463는 PD-1 억제제 니볼루맙의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:464는 PD-1 억제제 니볼루맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:465는 PD-1 억제제 니볼루맙의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열이다.
서열번호:466는 PD-1 억제제 니볼루맙의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열이다.
서열번호:467는 PD-1 억제제 니볼루맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:468는 PD-1 억제제 니볼루맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:469는 PD-1 억제제 니볼루맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:470는 PD-1 억제제 니볼루맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:471는 PD-1 억제제 니볼루맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:472는 PD-1 억제제 니볼루맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:473는 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:474는 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:475는 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열이다.
서열번호:476는 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열이다.
서열번호:477는 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:478는 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:479는 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:480는 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:481는 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:482는 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:483는 PD-L1 억제제 더발루맙의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:484는 PD-L1 억제제 더발루맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:485는 PD-L1 억제제 더발루맙의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열이다.
서열번호:486는 PD-L1 억제제 더발루맙의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열이다.
서열번호:487는 PD-L1 억제제 더발루맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:488는 PD-L1 억제제 더발루맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:489는 PD-L1 억제제 더발루맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:490는 PD-L1 억제제 더발루맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:491는 PD-L1 억제제 더발루맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:492는 PD-L1 억제제 더발루맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:493는 PD-L1 억제제 아벨루맙의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:494는 PD-L1 억제제 아벨루맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:495는 PD-L1 억제제 아벨루맙의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열이다.
서열번호:496는 PD-L1 억제제 아벨루맙의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열이다.
서열번호:497는 PD-L1 억제제 아벨루맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:498는 PD-L1 억제제 아벨루맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:499는 PD-L1 억제제 아벨루맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:500는 PD-L1 억제제 아벨루맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:501는 PD-L1 억제제 아벨루맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:502는 PD-L1 억제제 아벨루맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:503는 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:504는 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호:505는 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열이다.
서열번호:506는 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열이다.
서열번호:507는 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:508는 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:509는 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호:510는 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호:511는 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호:512는 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
발명의 상세한 설명
I. 도입
급속 확장 프로토콜 (Rapid Expansion Protocol; REP)에 의해 생체외에서 배양된 TIL을 사용하는 입양 세포 요법은 흑색종과 같은 암을 갖는 환자에서 숙주 면역억제에 이어서 성공적인 입양 세포 요법을 생성하였다. 현재의 주입 허용 파라미터는 TIL의 조성(예를 들어, CD28, CD8, 또는 CD4 양성)의 판독 및 REP 생성물의 팽창 및 생존력의 수치 폴드에 의존한다.
현재의 REP 프로토콜은 환자에게 주입될 TIL의 건강에 대한 통찰력을 거의 제공하지 않는다. T 세포는 미접촉(naive)에서 효과기 T 세포로의 성숙 과정 동안 상당한 대사 이동을 겪는다(문헌[Chang, 등, Nat. Immunol. 2016, 17, 364]를 참조하고, 이에 의해, 그 전체가, 특히 논의 및 혐기성 및 호기성 대사의 마커를 위해 명시적으로 포함된다). 예를 들어, 미접촉 T 세포는 ATP를 생산하기 위해 미토콘드리아 호흡에 의존하는 반면, TIL과 같은 성숙한 건강한 효과기 T 세포는 증식, 이동, 활성화 및 항-종양 효능을 필요로 하는 생물 에너지 기질을 제공하기 위해 호기성 당분해에 의존하여 고도로 당분해된다.
현재의 TIL 제조 및 치료 과정은 길이, 비용, 멸균 문제, 및 본원에 기재된 다른 인자에 의해 제한되어, 항-PD1에 불응성인 환자를 치료할 가능성이 매우 제한되었다. 생존가능한 치료 옵션이 거의 없거나 전혀 없는 환자를 치료하는데 사용하기에 적합한 TIL 제조 방법 및 이러한 방법에 기초한 요법을 제공할 긴급한 필요성이 있다. 본 발명은 항-PD-1 치료에 불응성인 비소세포 폐 암종 (NSCLC) 환자의 치료에 사용될 수 있는 TIL의 생성에 사용하기 위한 단축된 제조 방법을 제공함으로써 이러한 필요를 충족시킨다.
II. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 특허 및 공보는 그 전체 내용이 인용하여 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "공-투여", "공-투여하는", "과 조합하여 투여된", "와 조합하여 투여하는", "동시에" 및 "동반"은 2종 이상의 활성 약제학적 성분 (본 발명의 바람직한 실시형태에서, 예를 들어, 복수의 TIL)을 대상체에게 투여하여 활성 약제학적 성분 및/또는 그의 대사물 둘 다가 대상체에게 동시에 존재하도록 하는 것을 포함한다. 공-투여는 별도의 조성물에서 동시 투여, 별도의 조성물에서 상이한 시간에 투여, 또는 2종 이상의 활성 제약 성분이 존재하는 조성물에서 투여를 포함한다. 별도의 조성물에서의 동시 투여 및 두 제제가 존재하는 조성물에서의 투여가 바람직하다.
용어 "생체내"는 대상체의 신체에서 일어나는 사건을 지칭한다.
용어 "시험관내"는 대상체의 신체 외부에서 일어나는 사건을 지칭한다. 시험관내 검정은 살아있는 세포 또는 죽은 세포가 사용되는 세포-기반 검정을 포함하고, 또한 무손상 세포가 사용되지 않는 무세포 검정을 포괄할 수 있다.
용어 "생체외"는 대상체의 신체로부터 제거된 세포, 조직 및/또는 기관에 대한 절차를 치료 또는 수행하는 것을 수반하는 사건을 지칭한다. 바람직하게는, 세포, 조직 및/또는 기관은 수술 또는 치료 방법으로 대상체의 신체로 복귀될 수 있다.
용어 "급속 확장"은 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 3-배 (또는 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 또는 9-배), 더 바람직하게는 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 10-배 (또는 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 또는 90-배), 또는 가장 바람직하게는 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 100-배의 항원-특이적 TIL의 수의 증가를 의미한다. 수많은 급속 확장 프로토콜은 본원에 기재되어 있다.
본원에서 "종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"이란 대상체의 혈류를 떠나 종양으로 이동한 백혈구로서 원래 수득된 세포의 집단을 의미한다. TIL은, CD8+ 세포독성 T 세포 (림프구), Th1 및 Th17 CD4+ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포 및 M1 대식세포를 비제한적으로 포함한다. TIL은 1차 및 2차 TIL 둘 다를 포함한다. "1차 TIL"은 본원에 약술된 바와 같은 환자 조직 샘플로부터 수득된 것들(때때로 "새로운 수확"으로 지칭됨)이고, "2차 TIL"은 벌크 TIL 및 확장된 TIL("REP TIL" 또는 "후-REP-TIL")을 비제한적으로 포함하는, 본원에 논의된 바와 같이 확장 또는 증식된 임의의 TIL 세포 집단이다. TIL 세포 집단은 유전적으로 변형된 TIL을 포함할 수 있다.
본원에서 "세포의 집단" (TIL 포함)은 공통 형질을 공유하는 다수의 세포를 의미한다. 일반적으로, 집단은 일반적으로 그 수가 1 X 106 내지 1 X 1010의 범위이고, 상이한 TIL 집단은 상이한 수를 포함한다. 예를 들어, IL-2에서 1차 TIL의 초기 성장은 거의 1 × 108 세포의 벌크 TIL의 집단을 초래한다. REP 확장은 일반적으로 주입을 위해 1.5 × 109 내지 1.5 × 1010개의 세포의 집단을 제공하기 위해 수행된다.
본원에서 "동결보존된 TIL"은 1차, 벌크 또는 확장된 (REP TIL)이 약 -150℃ 내지 -60℃의 범위로 처리 및 저장되는 것을 의미한다. 동결보존을 위한 일반적인 방법은 또한 실시예에 포함되는 본원의 다른 곳에서 기재된다. 명확성을 위해, "동결보존된 TIL"은 1차 TIL의 공급원으로서 사용될 수 있는 냉동된 조직 샘플과 구별될 수 있다.
본원에서 "해동된 동결보존된 TIL"이란 이전에 동결보존되고 이어서 세포 배양 온도 또는 TIL이 환자에게 투여될 수 있는 온도를 비제한적으로 포함하는 실온 이상으로 복귀하도록 처리된 TIL의 집단을 의미한다.
TIL은 일반적으로 세포 표면 마커를 사용하여 생화학적으로, 또는 기능적으로 종양을 침윤시키고 치료를 수행하는 이들의 능력에 의해 정의될 수 있다. TIL은 일반적으로 다음의 바이오마커 중 하나 이상을 발현시킴으로써 분류될 수 있다: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, 및 CD25. 추가로 그리고 대안적으로, TIL은 환자에게 재도입시 고형 종양을 침윤시키는 이들의 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다.
용어 "동결보존 배지" 또는 "동결보존 배지"는 세포의 동결보존을 위해 사용될 수 있는 임의의 배지를 지칭한다. 그와 같은 배지는 7% 내지 10% DMSO를 포함하는 배지를 포함할 수 있다. 예시적인 배지는 CryoStor CS10, 하이퍼써마솔 (Hyperthermasol), 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 용어 "CS10"는 Stemcell Technologies 또는 Biolife Solutions로부터 수득되는 동결보존 배지를 지칭한다. CS10 배지는 상표명 "CryoStor® CS10"으로 지칭될 수 있다. CS10 배지는 DMSO를 포함하는 무혈청, 동물 성분 없는 배지이다.
용어 "중앙 기억 T 세포"는 인간에서 CD45R0+이고 CCR7 (CCR7hi) 및 CD62L (CD62hi)을 구성적으로 발현하는 T 세포의 서브세트를 지칭한다. 중앙 기억 T 세포의 표면 표현형은 또한 TCR, CD3, CD127 (IL-7R), 및 IL-15R을 포함한다. 중앙 기억 T 세포를 위한 전사 인자는 BCL-6, BCL-6B, MBD2, 및 BMI1를 포함한다. 중앙 기억 T 세포 주로 TCR 유발 후 효과기 분자로서 IL-2 및 CD40L를 분비한다. 중앙 기억 T 세포는 혈액에서 CD4 구획에서 우세하고, 인간에서 림프절 및 편도에서 비례적으로 풍부하다.
용어 "효과기 기억 T 세포"는 중앙 기억 T 세포와 같이 CD45R0+이지만, CCR7 (CCR7lo)의 구성적 발현을 상실하고 CD62L 발현 (CD62Llo)에 대해 불균질하거나 낮은 인간 또는 포유동물 T 세포의 서브세트를 지칭한다. 중앙 기억 T 세포의 표면 표현형은 또한 TCR, CD3, CD127 (IL-7R), 및 IL-15R을 포함한다. 중앙 기억 T 세포를 위한 전사 인자는 BLIMP1을 포함한다. 효과기 기억 T 세포는 인터페론-γ, IL-4, 및 IL-5를 포함하는, 항원 자극 후 높은 수준의 염증성 사이토카인을 신속하게 분비한다. 효과기 기억 T 세포는 혈액에서 CD8 구획에서 우세하고, 인간에서 폐, 간 및 장에서 비례적으로 풍부하다. CD8+ 효과기 기억 T 세포는 다량의 페르포린을 보유한다.
용어 "폐쇄 시스템"은 외부 환경에 폐쇄되는 시스템을 지칭한다. 세포 배양 방법에 적합한 임의의 폐쇄 시스템이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 폐쇄 시스템은, 예를 들어, 폐쇄된 G-용기를 비제한적으로 포함한다. 일단 종양 분절이 폐쇄 시스템에 추가되면, 시스템은 TIL이 환자에게 투여될 준비가 될 때까지 외부 환경으로 개방되지 않는다.
종양을 파괴하는 과정을 기술하기 위해 본원에 사용된 용어 "단편화하는", "단편", 및 "단편화된"은 종양 조직을 파쇄, 슬라이싱, 분할, 및 모셀레이팅(morcellating)하는 것과 같은 기계적 단편화 방법뿐만 아니라 종양 조직의 물리적 구조를 파괴하는 임의의 다른 방법을 포함한다.
용어들 "말초 혈액 단핵 세포" 및 "PBMC"는 림프구 (T 세포, B 세포, NK 세포) 및 단핵구를 포함하는 둥근 핵을 가지고 있는 말초 혈액 세포를 지칭한다. 항원 제시 세포 (PBMC는 항원 제시 세포의 유형임)로서 사용될 때, 말초 혈액 단핵 세포는 바람직하게는 조사된 동종이계 말초 혈액 단핵 세포이다.
용어들 "말초 혈액 림프구" 및 "PBL"은 말초 혈액으로부터 확장된 T 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, PBL는 공여체의 전혈 또는 성분채집 생성물로부터 분리된다. 일부 실시형태에서, PBL는 T 세포 표현형, 예컨대 CD3+ CD45+의 T 세포 표현형의 양성 또는 음성 선택에 의해 공여체의 전혈 또는 성분채집 생성물로부터 분리된다.
용어 "항-CD3 항체"는 항체 또는 그의 변이체, 예를 들어, 단클론성 항체를 지칭하고, 성숙 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 지시되는 인간, 인간화, 키메라 또는 쥣과 항체를 포함한다. 항-CD3 항체는 무로모납으로 알려져 있는 OKT-3을 포함한다. 항-CD3 항체는 또한 T3 및 CD3ε로 알려져 있는 UHCT1 클론을 포함한다. 다른 항-CD3 항체는, 예를 들어, 오텔릭시주맙, 테플리주맙, 및 비실리주맙을 포함한다.
용어 "OKT-3" (또한 본원에서 "OKT3"로 지칭됨)은 단클론성 항체 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 지칭하고, 성숙 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 지시되는 인간, 인간화, 키메라 또는 쥣과 항체를 포함하고, 상업적으로 입수가능한 형태 예컨대 OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 순수한, 미국 뉴욕주 샌디에고 소재의 Miltenyi Biotech, Inc.) 및 무로모납 또는 그의 변이체, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 또는 바이오시밀러를 포함한다. 무로모납의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 표 1에 주어진다 (서열번호:1 및 서열번호:2). OKT-3을 생성할 수 있는 하이브리도마는 American Type Culture Collection에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 CRL 8001로 할당된다. OKT-3을 생성할 수 있는 하이브리도마는 또한 European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC)에 기탁되고 카탈로그 번호 86022706로 할당된다.
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용어 "IL-2" (또한 본원에서 "IL2"로 지칭됨)은 인터류킨-2로 알려진 T 세포 성장 인자를 지칭하고, 인간 및 포유류 형태, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 바이오시밀러, 및 그의 변이체를 포함하는 모든 형태의 IL-2를 포함한다. IL-2는 예를 들어, 문헌[Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 및 Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.]에 기재되어 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-2의 아미노산 서열은 표 2에 주어진다 (서열번호:3). 예를 들어, 용어 IL-2는 인간, 재조합 형태의 IL-2 예컨대 알데스류킨 (일회용 바이알당 2천2백만 IU으로 다수의 공급자로부터 상업적으로 입수가능한 프롤류킨), 뿐만 아니라 미국 뉴햄프셔주 포트마우스 소재의 CellGenix, Inc., (CELLGRO GMP) 또는 미국 뉴저지주 이스트 브런스윅 소재의 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd. (Cat. No. CYT-209-b)에 의해 상업적으로 공급된 재조합 IL-2의 형태 및 다른 판매인으로부터 다른 상업적 등가물을 포괄한다. 알데스류킨 (des-알라닐-1, 세린-125 인간 IL-2)은 대략 15 kDa의 분자량을 갖는 IL-2의 비-글리코실화된 인간 재조합 형태이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 알데스류킨의 아미노산 서열은 표 2에 주어진다 (서열번호:4). 용어 IL-2 또한 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 Nektar Therapeutics으로부터 입수가능한 페길화된 IL2 전구약물 NKTR-214를 포함하는, 본원에 기재된 IL-2의 페길화된 형태를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 NKTR-214 및 페길화된 IL-2은 미국 특허출원공개 US 2014/0328791 A1호 및 국제공개 WO 2012/065086 Al호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 대안적인 형태의 접합된 IL-2는 미국 특허 제4,766,106호, 제5,206,344호, 제5,089,261호 및 제4902,502호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2의 제형은 미국 특허 제6,706,289호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
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용어 "IL-4" (또한 본원에서 "IL4"로 지칭됨)은 Th2 T 세포에 의해 그리고 호산구, 호염기구, 및 비만 세포에 의해 생성된 인터류킨 4로서 알려진 사이토카인을 지칭한다. IL-4는 미접촉 헬퍼 T 세포 (Th0 세포)의 Th2 T 세포로의 분화를 조절한다. 문헌[Steinke 및 Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70]. IL-4에 의한 활성화 시, Th2 T 세포는 후속으로 양성 피드백 루프에서 추가의 IL-4를 생성한다. IL-4는 또한 stimulate B 세포 증식 및 클래스 II MHC 발현을 자극하고, B 세포로부터 IgE 및 IgG1 발현의 클래스 전환을 유도한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-4은 미국 뉴저지주 이스트 브런스윅 소재의 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd. (Cat. No. CYT-211) 및 미국 매사추세츠주 월탐 소재의 ThermoFisher Scientific, Inc. (인간 IL-15 재조합 단백질, Cat. No. Gibco CTP0043)를 포함하는 다수의 공급자로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-4의 아미노산 서열은 표 2에 주어진다 (서열번호:5).
용어 "IL-7" (또한 본원에서 "IL7"로 지칭됨)은 기질 및 상피 세포로부터, 뿐만 아니라 수지상 세포로부터 수득될 수 있는, 인터류킨 7로서 알려진 글리코실화된 조직-유래된 사이토카인을 지칭한다. 문헌[Fry 및 Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904]. IL-7은 T 세포의 발달을 자극할 수 있다. IL-7은 IL-7 수용체 알파 및 공통 감마 사슬 수용체로 이루어진 이종이량체인 IL-7 수용체를 결합하는데, 이는 흉선 내의 T 세포 발달 및 말초 내의 생존에 중요한 일련의 신호이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-7은 미국 뉴저지주 이스트 브런스윅 소재의 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., (Cat. No. CYT-254) 및 미국 매사추세츠주 월탐 소재의 ThermoFisher Scientific, Inc. (인간 IL-15 재조합 단백질, Cat. No. Gibco PHC0071)를 포함하는 다수의 공급자로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-7의 아미노산 서열은 표 2에 주어진다 (서열번호:6).
용어 "IL-15" (또한 본원에서 "IL15"로 지칭됨)은 인터류킨-15로서 알려진 T 세포 성장 인자를 지칭하고, 인간 및 포유류 형태, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 바이오시밀러, 및 그의 변이체를 포함하는 모든 형태의 IL-2를 포함한다. IL-15은 예를 들어, 문헌[Fehniger 및 Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32]에 기재되어 있고; 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. IL-15는 β 및 γ 신호전달 수용체 서브유닛을 IL-2와 공유한다. 재조합 인간 IL-15은 12.8 kDa의 분자량을 갖는 114개의 아미노산 (및 N-말단 메티오닌)을 함유하는 단일, 비-글리코실화된 폴리펩티드 사슬이다. 재조합 인간 IL-15은 미국 뉴저지주 이스트 브런스윅 소재의 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd. (Cat. No. CYT-230-b) 및 미국 매사추세츠주 월탐 소재의 ThermoFisher Scientific, Inc. (인간 IL-15 재조합 단백질, Cat. No. 34-8159-82)를 포함하는 다수의 공급자로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-15의 아미노산 서열은 표 2에 주어진다 (서열번호:7).
용어 "IL-21" (또한 본원에서 "IL21"로 지칭됨)은 인터류킨-21로서 알려진 다면발현성 사이토카인 단백질을 지칭하고, 인간 및 포유류 형태, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 바이오시밀러, 및 그의 변이체를 포함하는 모든 형태의 IL-21을 포함한다. IL-21은 예를 들어, 문헌[Spolski 및 Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95]에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. IL-21은 자연 살해 T 세포 및 활성화된 인간 CD4+ T 세포에 의해 주로 생성된다. 재조합 인간 IL-21은 15.4 kDa의 분자량을 갖는 132개의 아미노산을 함유하는 단일, 비-글리코실화된 폴리펩티드 사슬이다. 재조합 인간 IL-21은 미국 뉴저지주 이스트 브런스윅 소재의 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd. (Cat. No. CYT-408-b) 및 미국 매사추세츠주 월탐 소재의 ThermoFisher Scientific, Inc. (인간 IL-21 재조합 단백질, Cat. No. 14-8219-80)를 포함하는 다수의 공급자로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-21의 아미노산 서열은 표 2에 주어진다 (서열번호:8).
"항종양 유효량", "종양 억제 유효량" 또는 "치료량"이 지시되는 경우, 투여되는 본 발명의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 환자(대상체)의 상태의 개별적인 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 원에 기재된 종양 침윤 림프구 (예를 들어, 2차 TIL 또는 유전적으로 변형된 세포독성 림프구)를 포함하는 약제학적 조성물이 범위 내의 모든 정수 값을 포함하여 104 내지 1011 세포/kg 체중 (예를 들어, 105 내지 106, 105 내지 1010, 105 내지 1011, 106 내지 1010, 106 내지 1011,107 내지 1011, 107 내지 1010, 108 내지 1011, 108 내지 1010, 109 내지 1011, 또는 109 내지 1010 세포/kg 체중)의 투여량으로 투여될 수 있음이 일반적으로 언급될 수 있다. 종양 침윤 림프구 (일부 경우에, 유전적으로 변형된 세포독성 림프구 포함) 조성물은 또한 이러한 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 종양 침윤 림프구 (일부 경우에, 유전적으로 포함)는 면역요법에서 통상적으로 공지된 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Rosenberg 등, New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988]를 참조한다). 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 레지멘은 질환의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조정함으로써 의약의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
용어 "혈액학적 악성종양", "혈액성 악성종양" 또는 관련 의미의 용어는 조혈의 포유류 암 및 종양 및 혈액, 골수, 림프절, 및 림프계의 조직을 비제한적으로 포함하는 림프양 조직을 지칭한다. 혈액학적 악성종양은 또한 "액체 종양"로 지칭된다. 혈액학적 악성종양은, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 림프종 (CLL), 소림프구성 림프종 (SLL), 급성 골수형성 백혈병 (AML), 만성 골수형성 백혈병 (CML), 급성 단구성 백혈병 (AMoL), 호지킨 림프종, 및 비-호지킨 림프종을 비제한적으로 포함한다. 용어 "B 세포 혈액학적 악성종양"은 B 세포에 영향을 미치는 혈액학적 악성종양을 지칭한다.
용어 "액체 종양"은 본질적으로 액체인 세포의 비정상적인 덩어리를 지칭한다. 액체 종양 암은 백혈병, 골수종, 및 림프종, 뿐만 아니라 다른 혈액학적 악성종양을 비제한적으로 포함한다. 액체 종양으로부터 수득된 TIL은 또한 골수 침윤 림프구 (MIL)로 지칭될 수 있다. 말초 혈액에서 순환하는 액체 종양을 포함하여 액체 종양으로부터 수득된 TIL은, 또한 본원에서 PBL로 지칭될 수 있다. 용어들 MIL, TIL, 및 PBL는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 세포가 유래가 조직 유형에만 기초하여 상이하다.
본원에 사용된 용어 "미세환경"은 고체 또는 혈액 종양 미세환경을 전체적으로 또는 미세환경 내의 세포의 개별 하위세트를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 종양 미세환경은 문헌[Swartz, 등, Cancer Res., 2012, 72, 2473]에 기재된 바와 같이 "세포, 가용성 인자, 신호전달 분자, 세포외 매트릭스, 및 신생물성 형질전환을 촉진하고, 종양 성장 및 침윤을 지원하고, 숙주 면역으로부터 종양을 보호하고, 치료 내성을 강화하고, 우세 전이에서 성장에 대한 적소를 제공하는 기계적 단서"의 복합 혼합물을 지칭한다. 종양은 T 세포에 의해 인식되어야 하는 항원을 발현시키지만, 면역계에 의한 종양 청소능은 미세환경에 의한 면역 억제 때문에 드물다.
일 실시형태에서, 본 발명은 TIL 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함하고, 여기서 환자는 본 발명에 따른 TIL의 주입 전에 비-골수절제 화학요법으로 전-치료된다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 TIL의 주입 전에 환자가 비골수절제 화학요법으로 예비치료되는 TIL 집단이 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 비-골수절제 화학요법은 2일 동안 시클로포스파미드 60 mg/kg/d (TIL 주입 전 27일째 및 26일째) 및 5일 동안 플루다라빈 25 mg/m2/d (TIL 주입 전 27일째 내지 23일째)이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 비-골수절제 화학요법 및 TIL 주입(0일째) 후, 환자는 생리학적 허용 범위까지 8시간마다 720,000 IU/kg으로 정맥내로 IL-2의 정맥내 주입을 받는다.
실험적 발견은 종양-특이적 T 림프구의 입양 전달 전의 림프구고갈이 조절성 T 세포 및 면역계의 경쟁 요소("사이토카인 싱크")를 제거함으로써 치료 효능을 향상시키는 데 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 일부 실시형태는 본 발명의 rTIL의 도입 전에 환자에게 림프구고갈 단계 (때때로 "면역억제성 컨디셔닝"으로도 지칭됨)를 사용한다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 질환 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 의도된 적용을 달성하기에 충분한 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 화합물의 조합의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 의도된 적용 (시험관내 또는 생체내), 또는 치료되는 대상체 및 질환 상태 (예를 들어, 대상체의 체중, 연령 및 성별), 질환 상태의 중증도, 또는 투여 방식에 따라 달라질 수 있다. 상기 용어는 또한 표적 세포에서 특정 반응(예를 들어, 혈소판 부착 및/또는 세포 이동의 감소)을 유도할 용량에 적용된다. 특정 용량은 선택된 특정 화합물, 후속되는 투여 레지멘, 화합물이 다른 화합물과 조합하여 투여되는지 여부, 투여 시기, 투여되는 조직, 및 화합물이 운반되는 물리적 전달 시스템에 따라 달라질 것이다.
용어들 "치료", "치료하는", "치료한다."등은, 원하는 약리학적 및/또는 생리적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고/있거나 질환에 대한 부분적 또는 완전한 치유 및/또는 질환에 기인하는 부작용의 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서의 질환의 임의의 치료를 포괄하며, (a) 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 걸린 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 그의 발달 또는 진행을 저지하는 것; 및 (c) 질환을 완화시키는 것, 예를 들어 질환의 퇴행을 유발하는 것 및/또는 하나 이상의 질환 증상을 완화시키는 것을 포함한다. "치료"는 또한 심지어 질환 또는 병태의 부재 하에서도 약리학적 효과를 제공하기 위한 제제의 전달을 포괄하는 것을 의미한다. 예를 들어, "치료"는 예를 들어, 백신의 경우, 질환 상태의 부재 하에 면역 반응을 유발하거나 면역을 부여할 수 있는 조성물의 전달을 포괄한다.
핵산 또는 단백질의 부분과 관련하여 사용될 때 용어 "이종성"은 핵산 또는 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 하위서열을 포함함을 나타낸다. 예를 들어, 핵산은 전형적으로 재조합적으로 생산되고, 새로운 기능성 핵산, 예를 들어, 하나의 공급원으로부터의 프로모터 및 다른 공급원으로부터의 코딩 영역, 또는 상이한 공급원으로부터의 암호화 영역을 제조하기 위해 배열된 관련되지 않은 유전자로부터의 2개 이상의 서열을 갖는다. 유사하게, 이종 단백질은 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 하위서열 (예를 들어, 융합 단백질)을 포함함을 나타낸다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서 용어 "서열 동일성", "퍼센트 동일성" 및 "서열 퍼센트 동일성" (또는 그의 동의어, 예를 들어, "99% 동일")은, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않고, 최대 대응을 위해 비교 및 정렬 (필요한 경우, 갭을 도입함)될 때, 동일하거나 또는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 명시된 백분율을 갖는 2종 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 동일성 퍼센트는 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 얻기 위해 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어가 당업계에 공지되어 있다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하기에 적합한 프로그램은 예를 들어, 미국 정부의 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) BLAST 웹 사이트로부터 입수가능한 프로그램의 BLAST 스위트를 포함한다. 2개의 서열 사이의 비교는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하기 위해 사용되지만, BLASTP은 아미노산 서열을 비교하기 위해 사용된다. DNASTAR로부터 입수가능한ALIGN, ALIGN-2 (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 Genentech) 또는 MegAlign은, 서열을 정렬하는데 사용될 수 있는 추가의 공개적으로 사용가능한 소프트웨어 프로그램이다. 당업자는 특정 정렬 소프트웨어에 의한 최대 정렬 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트 파라미터가 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 참조 항체의 아미노산 서열 내 또는 그에 인접한 특정 위치에서 하나 이상의 치환, 결실 및/또는 첨가에 의해 참조 항체의 상기 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 융합 단백질을 비제한적으로 포괄한다. 변이체는 참조 항체의 아미노산 서열과 비교하여 그것의 아미노산 서열에서의 하나 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 보존적 치환은, 예를 들어, 유사하게 충전된 또는 미하전된 아미노산의 치환을 수반할 수 있다. 변이체는 참조 항체의 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다. 용어 변이체는 또한 페길화된 항체 또는 단백질을 포함한다.
본원에서 "종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"이란 대상체의 혈류를 떠나 종양으로 이동한 백혈구로서 원래 수득된 세포의 집단을 의미한다. TIL은, CD8+ 세포독성 T 세포 (림프구), Th1 및 Th17 CD4+ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포 및 M1 대식세포를 비제한적으로 포함한다. TIL은 1차 및 2차 TIL 둘 다를 포함한다. "1차 TIL"은 본원에 약술된 바와 같은 환자 조직 샘플로부터 수득된 것들(때때로 "새로운 수확"으로 지칭됨)이고, "2차 TIL"은 본원에 논의된 벌크 TIL, 확장된 TIL ("REP TIL")뿐만 아니라 본원에 논의된 바와 같은 "reREP TIL"을 비제한적으로 포함하는, 본원에서 논의된 바와 같이 확장되거나 증식된 임의의 TIL 세포 집단이다. reREP TIL은 (예를 들어, reREP TIL로 지칭되는 TIL을 포함하는 도 8의 단계 D에 기재된 것들과 같은) 제2 확장 TIL 또는 제2 추가의 확장 TIL을 포함할 수 있다.
TIL은 일반적으로 세포 표면 마커를 사용하여 생화학적으로, 또는 기능적으로 종양을 침윤시키고 치료를 수행하는 이들의 능력에 의해 정의될 수 있다. TIL은 일반적으로 다음의 바이오마커 중 하나 이상을 발현시킴으로써 분류될 수 있다: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, 및 CD25. 추가로, 및 대안적으로, TIL은 환자에게 재도입 시 고형 종양을 침윤시키는 이들의 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. TILS는 효능에 의해 추가로 특징지어질 수 있으며 - 예를 들어, TILS은, 예를 들어, 인터페론 (IFN) 방출이 약 50 pg/mL 초과, 약 100 pg/mL 초과, 약 150 pg/mL, 또는 약 200 pg/mL 초과, 강력한 것으로 간주될 수 있다.
용어 "데옥시리보뉴클레오티드"는 천연 및 합성, 비변형된 및 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포괄한다. 변형은 당 모이어티, 염기 모이어티 및/또는 올리고뉴클레오티드 내의 데옥시리보뉴클레오티드 사이의 결합에 대한 변화를 포함한다.
용어 "RNA"는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자를 정의한다. 용어 "리보뉴클레오티드"는 b-D-리보푸라노스 모이어티의 2' 위치에 하이드록실기를 갖는 뉴클레오티드를 정의한다. 용어 RNA는 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 RNA, 단리된 RNA 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합으로 생산된 RNA, 뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생 RNA와 상이한 변경된 RNA를 포함한다. 본원에 기재된 RNA 분자의 뉴클레오티드는 또한 비표준 뉴클레오티드, 예컨대 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 자연 발생 RNA의 유사체 또는 유사체들로 지칭될 수 있다.
용어들 "약제학적으로 허용가능한 담체" 또는 "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅물, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 및 불활성 성분을 포함하는 것으로 의도된다. 활성 약제학적 성분에 대한 그와 같은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 약제학적으로 허용가능한 부형제의 용도는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 제약상 허용되는 담체 또는 약제학적으로 허용되는 부형제가 활성 제약 성분과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 치료 조성물에서의 그의 용도가 고려된다. 추가의 활성 약제학적 성분, 예컨대 다른 약물은, 또한 기재된 조성물 및 방법에 혼입될 수 있다.
용어들 "약" 및 "대략"은 값의 통계적으로 유의미한 범위 내인 것을 의미한다. 그와 같은 범위는 주어진 값 또는 범위의 한 자릿수 이내, 바람직하게는 50% 이내, 더 바람직하게는 20% 이내, 더욱 더 바람직하게는 10% 이내, 및 더욱 더 바람직하게는 5% 이내일 수 있다. 용어 "약" 또는 "대략"에 의해 포함되는 허용가능한 변형은 연구 중인 특정 시스템에 의존하며, 당업자에 의해 용이하게 이해될 수 있다. 또한, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "약" 및 "대략"은 치수, 크기, 제형, 파라미터, 형상 및 다른 양 및 특성이 정확할 필요는 없고, 정확할 필요는 없지만 대략적인 그리고/또는 더 크거나 더 작은 것을 의미하고, 필요에 따라, 허용 오차, 변환 인자, 반올림 계수, 측정 오차 등을, 그리고 당업자에게 알려진 다른 요인을 반영한다. 일반적으로, 치수, 크기, 제형, 파라미터, 형상 또는 다른 양 또는 특성은 그러한 것으로 명시적으로 언급되든 아니든 "약" 또는 "대략적인"이다. 매우 상이한 크기, 형상 및 치수의 실시형태가 설명된 배열들을 사용할 수 있다는 것이 주목된다.
전환 용어 "포함하는(comprising)", "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)" 및 "구성되는(consisting of)"은, 첨부된 청구범위에서, 원래 및 수정된 형태로 사용될 때, 인용되지 않은 추가적인 청구항 요소 또는 단계가 있다면, 청구항(들)의 범위로부터 제외되는 것에 대한 청구항 범위를 정의한다. 용어 "포함하는"은 포괄적이거나 개방형인 것으로 의도되며, 임의의 추가의 언급되지 않은 요소, 방법, 단계 또는 물질을 제외하지 않는다. 용어 "로 이루어진"은 청구항에 명시된 것 이외의 임의의 요소, 단계 또는 물질, 및 후자의 경우, 명시된 물질(들)과 통상적으로 관련된 불순물을 제외한다. 용어 "본질적으로 이루어진"은 청구항을 명시된 요소, 단계 또는 물질(들) 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 제한한다. 본 발명을 구현하는 본원에 기재된 모든 조성물, 방법 및 키트는, 대안적인 실시형태에서, 전환 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진" 중 임의의 것에 의해 보다 구체적으로 정의될 수 있다.
용어들 "항체" 및 그것의 복수 형태 "항체"는 전체의 면역글로불린 및 임의의 항원-결합 단편 ("항원-결합부") 또는 그의 단일 사슬을 지칭한다. "항체"는 디설파이드 결합, 또는 그의 항원-결합부에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경 (L)쇄를 포함하는 당단백질을 추가로 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH)로 약칭됨 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. 항체의 VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역 (HVR)으로 지칭되고, 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 보다 보존된 영역이 산재될 수 있는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음의 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원 에피토프 또는 에피토프와 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 "항원"는 면역 반응을 유도하는 물질(substance)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 항원은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시되는 경우 항체 또는 TCR에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 본원에서 사용된 용어 "항원"은, 또한 T 세포 에피토프를 포괄한다. 항원은 추가로 면역계에 의해 인식될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 B 림프구 및/또는 T 림프구의 활성화를 유도하는 체액성 면역 반응 또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 경우에, 이는 항원이 Th 세포 에피토프를 함유하거나 이에 연결되는 것을 필요로 할 수 있다. 항원은 또한 하나 이상의 에피토프 (예를 들어, B- 및 T-에피토프)를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 바람직하게는, 전형적으로 고도로 특이적이고 선택적인 방식으로, 그의 상응하는 항체 또는 TCR과 반응할 것이고, 다른 항원에 의해 유도될 수 있는 다수의 다른 항체 또는 TCR과는 반응하지 않을 것이다.
용어들 "단클론성 항체", "mAb", "단클론성 항체 조성물", 또는 그것의 복수 형태는 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 단클론성 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 특정 수용체에 특이적인 단클론성 항체는 적합한 항원과 함께 시험 대상체를 주입한 후 원하는 서열 또는 기능적 특징을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마를 단리하는 분야의 지식 및 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 단클론성 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 그와 같은 DNA의 바람직한 공급원으로 쓰인다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 배치될 수 있고, 이어서 숙주 세포, 예컨대 E. 콜리 세포, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성을 수득한다. 항체의 재조합 생성은 아래에 더 상세히 기재될 것이다.
본원에서 사용된 항체의 용어들 "항원-결합부" 또는 "항원-결합 단편" (또는 간단히 "항체부" 또는 "단편")은, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 용어 "항원-결합부" 내에 포괄된 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab′)2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 또는 VL 도메인으로 이루어질 수 있는 도메인 항체 (dAb) 단편 (Ward, 등, Nature, 1989, 341, 544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 인코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 단일 쇄 Fv(scFv)로서 공지된 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있고; 예를 들어, 문헌[Bird, 등, Science 1988, 242, 423-426; 및 Huston, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 5879-5883)]를 참조한다. 그와 같은 scFv 항체는 또한 항체의 용어 "항원-결합부" 또는 "항원-결합 단편" 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는, 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하면, 불변 영역은 또한 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 생식계열으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "인간 단클론성 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 일 실시형태에서, 인간 단클론성 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 이식유전자 및 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대한 형질전환 또는 트랜스염색체인 동물 (예컨대 마우스)로부터 단리된 항체 또는 그로부터 제조된 하이브리도마 (하기에 추가로 기재됨), (b) 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 예를 들어, 트랜스펙토마, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열에 대한 인간 면역글로불린 유전자의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되고, 발현되고, 생성되거나 단리된 항체를 포함한다. 그와 같은 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시형태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 형질전환인 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)을 거칠 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 관련되지만, 생체 내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아이소타입"는 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩된 항체 클래스 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "인간 항체 유도체"는 항체와 또 다른 활성 제약 성분 또는 항체의 콘주게이트를 포함하는, 인간 항체의 임의의 변형된 형태를 지칭한다. 용어들 "콘주게이트", "항체-약물 콘주게이트", "ADC", 또는 "면역콘주게이트"는 당업계에 사용가능한 방법을 사용하여 본원에 기재된 항체에 접합될 수 있는 또 다른 치료 모이어티에 접합된 항체, 또는 그의 단편을 지칭한다.
용어들 "인간화된 항체", "인간화된 항체", 및 "인간화된"는 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 추가의 프레임워크 영역 변형은 인간 프레임워크 서열 내에서 행해진다. 인간화된 형태의 비-인간 (예를 들어, 쥣과) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대개, 인간화된 항체는, 수령체의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성, 및 수용력을 갖는 비-인간 종 (공여체 항체) 예컨대 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류의 15개의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다. 일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수령체 항체 또는 공여체 항체에 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 행해진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이고, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화된 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이다. 추가 세부사항에 대해, 문헌[Jones, 등, Nature 1986, 321, 522-525; Riechmann, 등, Nature 1988, 332, 323-329; 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 1992, 2, 593-596]를 참조한다. 본원에 기재된 항체는 또한 효과기 기능 및/또는 FcR 결합의 개선 (예를 들어, 감소)을 부여하는 것으로 공지된 임의의 Fc 변이체를 사용하도록 변형될 수 있다. Fc 변이체는 예를 들어, 국제공개 WO 1988/07089 A1호, WO 1996/14339 A1호, WO 1998/05787 A1호, WO 1998/23289 A1호, WO 1999/51642 A1호, WO 99/58572 A1호, WO 2000/09560 A2호, WO 2000/32767 A1호, WO 2000/42072 A2호, WO 2002/44215 A2호, WO 2002/060919 A2호, WO 2003/074569 A2호, WO 2004/016750 A2호, WO 2004/029207 A2호, WO 2004/035752 A2호, WO 2004/063351 A2호, WO 2004/074455 A2호, WO 2004/099249 A2호, WO 2005/040217 A2호, WO 2005/070963 A1호, WO 2005/077981 A2호, WO 2005/092925 A2호, WO 2005/123780 A2호, WO 2006/019447 A1호, WO 2006/047350 A2호, 및 WO 2006/085967 A2호; 및 미국 특허 제5,648,260호; 제5,739,277호; 제5,834,250호; 제5,869,046호; 제6,096,871호; 제6,121,022호; 제6,194,551호; 제6,242,195호; 제6,277,375호; 제6,528,624호; 제6,538,124호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,998,253호; 및 제7,083,784호에 개시된 아미노산 치환 중 임의의 하나를 포함할 수 있고; 이들의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
용어 "키메라 항체"은 영역 서열은 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열은 또 다른 종으로부터 유래되는 항체, 예컨대 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래되는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
"디아바디"은 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편이다. 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL 또는 VL-VH)에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 짝짓고 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디는, 예를 들어, 유럽 특허 EP 404,097호, 국제 특허 공개 WO 93/11161호; 및 문헌[Bolliger, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6444-6448]에 충분히 기재되어 있다.
용어 "글리코실화" 항체의 변형된 유도체를 지칭한다. 비-글리코실화된 항체는 글리코실화가 결여된다. 글리코실화는 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 그와 같은 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열 내의 글리코실화의 하나 이상의 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환은 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 초래하여 그 부위에서 글리코실화를 제거할 수 있다. 비-글리코실화(aglycosylation)는 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 기재된 바와 같이, 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 푸코실 잔기의 양이 감소된 저푸코실화(hypofucosylated) 항체 또는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 갖는 항체와 같은, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 그와 같은 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 그와 같은 탄수화물 변형은 예를 들어, 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기재되었고 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705, 및 Ms709는 푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8 (알파 (1,6) 푸코실트랜스퍼라제)결여됨으로써, Ms704, Ms705, 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체는 그것의 탄수화물 상의 푸코스가 결여된다. Ms704, Ms705, 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는 2개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자의 표적 파괴에 의해 생성되었다 (예를 들어, 문헌[미국 특허 공보 제2004/0110704호 또는 Yamane-Ohnuki, 등, Biotechnol. Bioeng., 2004, 87, 614-622]를 참조한다). 다른 예로서, 유럽 특허 EP 1,176,195호는 푸코실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주가 기재되어 있어서, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 알파 1,6 결합-관련 효소를 감소시키거나 제거함으로써 저푸코실화를 나타내고, 또한 항체의 Fc 영역에 결합하거나 효소 활성을 갖지 않는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 첨가하기 위한 낮은 효소 활성을 갖는 세포주, 예를 들어, 랫트 골수종 세포주 YB2/0 (ATCC CRL 1662)를 기재한다. 국제 특허 공개 WO 03/035835호는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되고, 또한 그 숙주 세포에서 발현된 항체의 저푸코실화를 초래하는 변이체 CHO 세포주, Lec 13 세포를 기재한다(또한 문헌[Shields, 등, J. Biol. Chem. 2002, 277, 26733-26740]를 참조한다). 국제 특허 공개 WO 99/54342호는 조작된 세포주에서 발현된 항체가 증가된 이등분 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성을 증가시키도록 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재한다(또한 문헌[Umana, 등, Nat. Biotech. 1999, 17, 176-180]을 참조한다). 대안적으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단될 수 있다. 예를 들어, 푸코시다제 알파-L-푸코시다제는 문헌[Tarentino, 등, Biochem. 1975, 14, 5516-5523]에 기재된 바와 같은 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다.
"페길화"는 전형적으로 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응하는 변형된 항체 또는 그의 단편을 지칭한다. 페길화 예를 들어, 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 페길화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌 글라이콜"은 다른 단백질, 예컨대 모노 (C1-C10)알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글라이콜 또는 폴리에틸렌 글라이콜-말레이미드를 유도체화하기 위해 사용된 PEG의 형태를 포괄하는 것으로 의도된다. 페길화될 항체는 비-글리코실화된 항체일 수 있다. 페길화의 방법은 당해 기술에 알려져 있고 예를 들어, 유럽 특허 EP 0154316호 및 EP 0401384호 및 미국 특허 제5,824,778호에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체에 적용될 수 있고, 상기 특허 각각의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
용어 "바이오시밀러"는 임상적으로 불활성인 성분에서의 사소한 차이에도 불구하고 미국 허가 참조 생물학적 제품과 매우 유사하고, 제품의 안전성, 순도 및 효능의 측면에서 생물학적 제품과 참조 제품 사이에 임상적으로 의미있는 차이가 없는 단클론성 항체 또는 단백질을 포함하는 생물학적 제품을 의미한다. 또한, 유사한 생물학적 또는 "바이오시밀러" 의약은 유럽 의약청(European Medicines Agency)에 의해 사용되도록 이미 허가된 다른 생물학적 의약과 유사한 생물학적 의약이다. 용어 "바이오시밀러"는 또한 다른 국가 및 지역 규제 기관들에 의해 동의어로 사용된다. 생물학적 생성물 또는 생물학적 의약은 생물학적 공급원, 예컨대 박테리움 또는 효모에 의해 제조되거나 그로부터 유래된 의약이다. 상대적으로 작은 분자 예컨대 인간 인슐린 또는 에리트로포이에틴, 또는 복합 분자 예컨대 단클론성 항체로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 참조 IL-2 단백질이 알데스류킨 (프롤류킨)인 경우, 알데스류킨을 참조하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 단백질은 알데스류킨에 대한 "바이오시밀러"이거나 또는 알데스류킨의 "바이오시밀러"이다. 유럽에서, 유사한 생물학적 또는 "바이오시밀러" 의약은 유럽 의약청 (EMA)에 의해 사용되도록 이미 허가된 다른 생물학적 의약과 유사한 생물학적 의약이다. 유럽에서 유사한 생물학적 적용에 대한 관련 법적 근거는 개정된 바와 같이 규정(EC) 번호 726/2004의 6항 및 지침 2001/83/EC의 10(4)항이고, 따라서 유럽에서, 바이오시밀러는 허가되고, 허가를 위해 허가되거나 규정(EC) 번호 726/2004의 6항 및 지침 2001/83/EC의 10(4)항에 따른 허가를 위한 적용의 대상이 될 수 있다. 이미 허가된 원래의 생물학적 의약품은 유럽에서 "참조 의약품"으로서 지칭될 수 있다. 바이오시밀러인 것으로 간주되는 제품에 대한 요건의 일부는 유사한 생물학적 의약품에 대한 CHMP 가이드라인에 요약된다. 또한, 단클론성 항체 바이오시밀러에 관한 가이드라인을 포함하는 제품 특이적 가이드라인은 EMA에 의해 제품별로 제공되고 그의 웹사이트에 공개된다. 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 품질 특성, 생물학적 활성, 작용 기전, 안전성 프로파일 및/또는 효능에 의해 참조 의약물과 유사할 수 있다. 또한, 바이오시밀러는 참조 의약품과 동일한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있거나 사용되도록 의도될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사한 또는 매우 유사한 품질 특성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사한 또는 매우 유사한 생물학적 활성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사한 또는 매우 유사한 안전성 프로파일을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사한 또는 매우 유사한 효능을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 유럽의 바이오시밀러는 EMA에 의해 허가된 참조 의약품과 비교된다. 그러나, 일부 사례에서, 바이오시밀러는 특정 연구에서 유럽 경제 영역 밖에서 허가된 생물학적 의약품(비-EEA 허가된 "비교기(comparator)")과 비교될 수 있다. 그와 같은 연구는 예를 들어, 특정 임상 및 생체내 비-임상 연구를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "바이오시밀러"는 또한 비-EEA 허가된 비교기에 비교되거나 비교될 수 있는 생물학적 의약품에 관한 것이다. 특정 바이오시밀러는 단백질 예컨대 항체, 항체 단편 (예를 들어, 항원 결합부) 및 융합 단백질이다. 단백질 바이오시밀러는 폴리펩티드의 기능에 유의한 영향을 미치지 않는 아미노산 구조 (예를 들어, 아미노산의 결실, 첨가 및/또는 치환을 포함함)에 약간의 변형을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바이오시밀러는 그것의 참조 의약품의 아미노산 서열에 대해 97% 또는 그 초과, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바이오시밀러는 하나 이상의 번역후 변형, 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및/또는 절단을 포함할 수 있으며, 이는 참조 의약품의 번역후 변형에 상이하지만, 단 차이는 의약품의 안전성 및/또는 효능의 변화를 초래하지 않는다. 바이오시밀러는 참조 의약품과 동일한 또는 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 특히, 배타적이지는 않지만, 바이오시밀러는 차이가 참조 의약품과 관련된 안전성 우려를 해결하거나 해결하려고 하는 경우 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 추가로, 바이오시밀러는 예를 들어, 그것의 강도, 약제학적 형태, 제형, 부형제 및/또는 제시에 있어서 참조 의약품으로부터 벗어날 수 있으며, 의약품의 안전성 및 효능은 손상되지 않는다. 바이오시밀러는 참조 의약품과 비교하여 예를 들어, 약동학적 (PK) 및/또는 약력학적 (PD) 프로파일의 차이를 포함할 수 있지만, 허가되거나 허가에 적합한 것으로 간주되는 참조 의약품과 충분히 유사한 것으로 여전히 간주된다. 특정 상황에서, 바이오시밀러는 참조 의약품과 비교하여 상이한 결합 특성을 나타내고, 상이한 결합 특성은 EMA와 같은 규제 기관에 의해 유사한 생물학적 생성물로서의 허가에 대한 장벽이 아닌 것으로 간주된다. 용어 "바이오시밀러"는 또한 다른 국가 및 지역 규제 기관들에 의해 동의어로 사용된다.
III. TIL 제조 공정 - 2A
이들 특징 중 일부를 포함하는 공정 2A로서 공지된 예시적인 TIL 공정이 도 2에 도시되어 있고, 공정 1C에 대한 본 발명의 이러한 실시형태의 이점 중 일부가 도 F 및 G에 기재되어 있다. 공정 2A의 실시형태는 도 1에 도시된다.
본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 환자에게 이식하기 전에 이들의 대사 활성 및 이에 따른 상대적 건강을 증가시키기 위해 동결보존된 TIL의 재자극에 관한 단계, 및 상기 대사 건강을 시험하는 방법을 포함할 수 있다. 본원에서 일반적으로 설명된 바와 같이, TIL은 일반적으로 환자 샘플로부터 채취되고 환자에게 이식하기 전에 그 수를 확장하도록 조작된다. 일부 실시형태에서, TIL은 아래에 논의된 바와 같이 선택적으로 유전적으로 조작될 수 있다.
일부 실시형태에서, TIL은 동결보존될 수 있다. 일단 해동되면, 또한 환자에게 주입하기 전에 그것의 대사를 증가시키기 위해 재자극될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 (preREP로 지칭된 공정뿐만 아니라 단계 A로서 도 1에 도시된 공정 포함)은 3 내지 14일로 단축되고 제2 확장 (REP로 지칭된 공정뿐만 아니라 단계 B로서 도 1에 도시된 공정 포함)은 아래뿐만 아니라 실시예 및 도에도 상세히 논의된 바와 같이 7 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 (예를 들어, 도 1의 단계 B에 기재된 확장)은 11일로 단축되고 제2 확장 (예를 들어, 도 1의 단계 D에 기재된 확장)은 11일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 제1 확장과 제2 확장의 조합 (예를 들어, 도 1의 단계 B 및 단계 D로서 기재된 확장)은 22일로 단축된다.
아래의 "단계" 지정들 A, B, C 등은 도 1을 참조하고 본 명세서에 설명된 특정 실시예를 참조한다. 아래 및 도 1에서의 단계들의 순서는 예시적이고, 단계들의 임의의 조합 또는 순서뿐만 아니라, 추가적인 단계들, 단계의 반복, 및/또는 단계의 생략이 본 출원 및 본 명세서에 개시된 방법에 의해 고려된다.
A. 단계 A: 환자 종양 샘플의 수득
일반적으로, TIL은 초기에 환자 종양 샘플("1차 TIL")로부터 수득된 다음, 본원에 기재된 바와 같은 추가의 조작을 위해 더 큰 집단으로 확장되고, 선택적으로 동결보존되고, 본원에 요약된 바와 같이 재자극되고, TIL 건강의 지표로서 표현형 및 대사 파라미터에 대해 선택적으로 평가된다.
환자 종양 샘플은 일반적으로 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 수득하기 위한 외과적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소규모 생검, 또는 다른 수단을 통해 당해 분야에서 알려진 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 다병변 샘플링이 사용된다. 일부 실시형태에서, 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 수득하기 위한 외과적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소규모 생검, 또는 다른 수단은 다병변 샘플링 (즉, 환자의 하나 이상의 종양 부위 및/또는 위치, 뿐만 아니라 동일한 위치 또는 매우 근접한 하나 이상의 종양으로부터 샘플을 수득함)을 포함한다. 일반적으로, 종양 샘플은 원발성 종양, 침습성 종양 또는 전이성 종양을 비롯하여 임의의 고형 종양으로부터의 것일 수 있다. 종양 샘플은 또한 혈액학적 악성종양에서 수득한 종양과 같은 액체 종양일 수 있다. 고형 종양은 폐 조직의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유용한 TIL은 비-소세포 폐 암종 (NSCLC)로부터 수득된다.
일단 수득되면, 종양 샘플은 일반적으로 날카로운 절개를 사용하여 1 내지 약 8 mm3의 작은 조각으로 단편화되고, 약 2-3 mm3이 특히 유용하다. TIL은 효소적 종양 분해물을 사용하여 이들 단편으로부터 배양된다. 이러한 종양 분해물은 효소적 배지 (예를 들어, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 완충액, 2 mM의 글루타메이트, 10 mcg/mL의 겐타마이신, 30 단위/mL의 DNase 및 1.0 mg/mL의 콜라겐분해효소)에서 인큐베이션에 의해, 그 다음 기계적 해리 (예를 들어, 조직 해리기 사용)에 의해 생성될 수 있다. 종양 분해물은 종양을 효소 배지에 넣고 종양을 대략 1분 동안 기계적으로 해리시킨 후, 37℃에서 5% CO2 중에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 기계적 해리의 반복 사이클 및 작은 조직 조각만이 존재할 때까지 상기 조건 하에서 인큐베이션함으로써 생성될 수 있다. 이 공정의 말기에, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 죽은 세포를 함유하는 경우, FICOLL 분지형 친수성 폴리사카라이드를 사용하여 밀도 구배 분리를 수행하여 이들 세포를 제거할 수 있다. 당해 분야에서 알려진 대안적인 방법이 사용될 수 있고, 그 예는 미국 특허출원공개 2012/0244133 A1호에 기재된 것이고, 상기 출원의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 전술한 방법 중 임의의 것은 TIL을 확장하는 방법 또는 암을 치료하는 방법을 위해 본원에 기재된 실시형태 중 임의의 것에 사용될 수 있다.
상기에서 명시된 바와 같이, 일부 실시형태에서, TIL은 고형 종양에서 유래된다. 일부 실시형태에서, 고형 종양은 단편화되지 않는다. 일부 실시형태에서, 고형 종양은 단편화되지 않고 전체 종양으로 효소 분해(enzymatic digestion)를 거친다. 일부 실시형태에서, 종양은 콜라겐분해효소, DNase, 및 하이알로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 분해(digest)된다. 일부 실시형태에서, 종양은 1 내지 2 시간 동안 콜라겐분해효소, DNase, 및 하이알로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 분해된다. 일부 실시형태에서, 종양은 37℃, 5% CO2에서 1 내지 2 시간 동안 콜라겐분해효소, DNase, 및 하이알로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 분해된다. 일부 실시형태에서, 종양은 회전으로 37℃, 5% CO2에서 1 내지 2 시간 동안 콜라겐분해효소, DNase, 및 하이알로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 분해된다. 일부 실시형태에서, 종양은 일정한 회전으로 밤새 분해된다. 일부 실시형태에서, 종양은 일정한 회전으로 37℃, 5% CO2에서 밤새 분해된다. 일부 실시형태에서, 전체의 종양은 종양 분해 반응 혼합물을 형성하기 위해 효소와 조합된다.
일부 실시형태에서, 종양은 멸균 완충액에서 동결건조된 효소로 재구성된다. 일부 실시형태에서, 완충액은 멸균 HBSS이다.
일부 실시형태에서, 효소 혼합물은 콜라겐분해효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 콜라겐분해효소는 콜라겐분해효소 IV이다. 일부 실시형태에서, 콜라겐분해효소의 작업 스톡은 100 mg/ml의 10X 작업 스톡이다.
일부 실시형태에서, 효소 혼합물은 DNAse를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNAse의 작업 스톡(working stock)은 10,000 IU/ml의 10X 작업 스톡이다.
일부 실시형태에서, 효소 혼합물은 하이알로니다제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이알로니다제의 작업 스톡은 10-mg/ml 10X 작업 스톡이다.
일부 실시형태에서, 효소 혼합물은 10 mg/ml의 콜라겐분해효소, 1000 IU/ml의 DNAse, 및 1 mg/ml의 하이알로니다제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 효소 혼합물은 10 mg/ml의 콜라겐분해효소, 500 IU/ml의 DNAse, 및 1 mg/ml의 하이알로니다제를 포함한다.
일반적으로, 수확된 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새롭게 수확된" 세포 집단으로 칭한다.
일부 실시형태에서, 단편화는 예를 들어, 절개뿐만 아니라 분해를 포함하는 물리적 단편화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단편화는 물리적 단편화이다. 일부 실시형태에서, 단편화는 절개이다. 일부 실시형태에서, 단편화는 분해에 의한 것이다. 일부 실시형태에서, TIL은 환자로부터 수득된 효소적 종양 분해물 및 종양 단편으로부터 초기에 배양될 수 있다. 일 실시형태에서, TIL은 환자로부터 수득된 효소적 종양 분해물 및 종양 단편으로부터 초기에 배양될 수 있다.
일부 실시형태에서, 종양이 고형 종양인 경우, 종양 샘플이, 예를 들어, (도 1에 제공된 바와 같이) 단계 A에서 수득된 후 종양은 물리적 단편화를 겪는다. 일부 실시형태에서, 단편화는 동결보존 전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 단편화는 동결보존 후에 일어난다. 일부 실시형태에서, 단편화는 종양을 수득한 후 그리고 임의의 동결보존의 부재에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 종양은 단편화되고 10, 20, 30, 40 또는 그 초과 개의 단편 또는 조각은 제1 확장을 위해 각 용기에 배치된다. 일부 실시형태에서, 종양은 단편화되고 30 또는 40개의 단편 또는 조각은 제1 확장을 위해 각 용기에 배치된다. 일부 실시형태에서, 종양은 단편화되고 40개의 단편 또는 조각은 제1 확장을 위해 각 용기에 배치된다. 일부 실시형태에서, 다수의 단편은 약 4 내지 약 50 단편을 포함하고 각각의 단편은 약 27 mm3의 부피를 갖는다. 일부 실시형태에서, 다수의 단편은 약 1300 mm3 내지 약 1500 mm3의 총 부피를 갖는 약 30 내지 약 60 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 단편은 약 1350 mm3의 총 부피를 갖는 약 50 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 단편은 약 1 그램 내지 약 1.5 그램의 총 질량을 갖는 약 50 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 단편은 약 4 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, TIL은 종양 단편으로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 날카로운 절개에 의해 수득된다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 10 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 8 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 1 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 2 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 3 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 4 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 5 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 6 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 7 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 8 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 9 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 10 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양은 1-4 mm x 1-4 mm x 1-4 mm이다. 일부 실시형태에서, 종양은 1 mm x 1 mm x 1 mm이다. 일부 실시형태에서, 종양은 2 mm x 2 mm x 2 mm이다. 일부 실시형태에서, 종양은 3 mm x 3 mm x 3 mm이다. 일부 실시형태에서, 종양은 4 mm x 4 mm x 4 mm이다.
일부 실시형태에서, 종양은 각 조각의 출혈성, 괴저성, 및/또는 지방 조직의 양을 최소화하기 위해 절제된다. 일부 실시형태에서, 종양은 각 조각의 출혈성 조직의 양을 최소화하기 위해 절제된다. 일부 실시형태에서, 종양은 각 조각의 괴저성 조직 양을 최소화하기 위해 절제된다. 일부 실시형태에서, 종양은 각 조각의 지방 조직의 양을 최소화하기 위해 절제된다.
일부 실시형태에서, 종양 단편화는 종양 내부 구조를 유지하기 위해 수행된다. 일부 실시형태에서, 종양 단편화는 메스로 톱질 운동을 수행하지 않고 수행된다. 일부 실시형태에서, TIL은 종양 분해물로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 종양 분해물은 효소 배지, 예를 들어, 비제한적으로 RPMI 1640, 2 mM GlutaMAX, 10 mg/mL의 겐타마이신, 30 U/mL DNase, 및 1.0 mg/mL의 콜라겐분해효소, 이어서 기계적 해리 (GentleMACS, 캘리포니아주 아우번 소재의 Miltenyi Biotec)에서 인큐베이션에 의해 생성되었다. 종양을 효소 배지에 넣은 후, 대략 1 분 동안 종양을 기계적으로 해리할 수 있다. 그 다음, 용액을 5% CO2에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 대략 1분 동안 다시 기계적으로 파괴할 수 있다. 5% CO2에서 37℃에서 30분 동안 다시 인큐베이션한 후, 종양을 대략 1분 동안 세 번째로 기계적으로 파괴할 수 있다. 일부 실시형태에서, 큰 조직 조각이 존재하는 경우 세 번째 기계적 파괴 후, 5% CO2에서 37 ℃에서 추가 30분의 인큐베이션과 함께 또는 없이, 1번 또는 2번의 추가적 기계적 해리를 샘플에 적용하였다. 일부 실시형태에서, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 죽은 세포를 함유하는 경우 최종 인큐베이션의 종료 시에, 피콜을 사용한 밀도 구배 분리를 수행하여 이들 세포를 제거할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 단계 이전의 수확된 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새롭게 수확된" 세포 집단으로 지칭한다.
일부 실시형태에서, 세포는 샘플 수확 후 선택적으로 냉동될 수 있고, 도 1에 예시될 뿐만 아니라, 하기에 더욱 상세히 기재되는 단계 B에 기재된 확장으로 진입하기 전에 냉동 저장될 수 있다.
B. 단계 B: 제1 확장
일부 실시형태에서, 본 방법은 대상체/환자에 투여 시 증가된 복제 주기를 가질 수 있는 어린(young) TIL을 수득하는 것을 제공하고, 따라서 더 오래된 TIL(즉, 대상체/환자에게 투여하기 전에 더 많은 복제 라운드를 추가로 거친 TIL)에 비해 추가의 치료적 이점을 제공할 수 있다. 어린 TIL의 특징은 [문헌, 예를 들어, Donia, 등, Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012)]; 문헌[Dudley 등, Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)]; 문헌[Huang 등, J Immunother, 28(3):258-267 (2005)]; 문헌[Besser 등, Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013)]; 문헌[Besser 등, J Immunother 32:415-423 (2009)]; 문헌[Robbins, 등, J Immunol 2004; 173:7125-7130]; 문헌[Shen 등, J Immunother, 30:123-129 (2007)]; 문헌[Zhou, 등, J Immunother, 28:53-62 (2005)]; 및 문헌[Tran, 등, J Immunother, 31:742-751 (2008)]에 기재되었고, 이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
T 및 B 림프구의 다양한 항원 수용체는 제한적이지만 많은 수의 유전자 분절의 체세포 재조합에 의해 생성된다. 이들 유전자 분절: V (가변), D (다양성), J (결합), 및 C (불변)은 결합 특이성 및 면역글로불린 및 T-세포 수용체 (TCR)의 하류 적용을 결정한다. 본 발명은 T-세포 레퍼토리 다양성을 나타내고 증가시키는 TIL을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 새롭게 수확된 TIL 및/또는 TIL들과 비교하여 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 도 5 및/또는 도 6에서 예시된 바와 같이 공정 1C로 지칭된 방법을 사용하여 제조된 새롭게 수확된 TIL 및/또는 TIL들과 비교하여 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 다양성의 증가는 면역글로불린 다양성 및/또는 T-세포 수용체 다양성의 증가이다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 중쇄에 있다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 경쇄에 있다. 일부 실시형태에서, 다양성은 T-세포 수용체에 있다. 일부 실시형태에서, 다양성은 알파, 베타, 감마, 및 델타 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 T-세포 수용체 중 하나에 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파 및/또는 베타의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 베타의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, TCRab (즉, TCRα/β)의 발현의 증가가 있다.
예를 들어, 도 1의 단계 A에 기재된 것과 같은 종양 단편의 절개 또는 분해 후, 생성된 세포는 종양 및 다른 세포에 비해 TIL의 성장을 촉진하는 조건 하에 IL-2를 함유하는 혈청에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 종양 분해물은 6000 IU/mL의 IL-2를 갖는 불활성화된 인간 AB 혈청을 포함하는 배지에서 2 mL 웰들에서 인큐베이션된다. 이러한 1차 세포 집단은 며칠 동안, 일반적으로 3 내지 14일 동안 배양되어, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 이러한 1차 세포 집단은 7 내지 14일의 기간 동안 배양되어, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 이러한 1차 세포 집단은 10 내지 14일의 기간 동안 배양되어, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 이러한 1차 세포 집단은 약 11일의 기간 동안 배양되어, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다.
바람직한 실시형태에서, TIL의 확장은 하기 및 본원에 기재된 초기 벌크 TIL 팽창 단계 (예를 들어, 프리-REP로 지칭되는 공정을 포함할 수 있는, 도 1의 단계 B에 기재된 것과 같음), 이어서 단계 D 및 본원에서 하기 기재된 제2 확장 (급속 확장 프로토콜 (REP) 단계로 지칭되는 공정을 포함하는 단계 D), 후속적으로 선택적 동결보존, 및 이어서 하기 및 본원에 기재되는 제2 단계 D (재자극 REP 단계로 지칭되는 공정 포함)를 사용하여 수행될 수 있다. 이 공정으로부터 수득된 TIL은 본원에 기재된 바와 같이 표현형 특성 및 대사 파라미터에 대해 선택적으로 특성화될 수 있다.
TIL 배양물이 24-웰 플레이트에서, 예를 들어, Costar 24-웰 세포 배양 클러스터, 편평한 바닥 (미국 뉴욕주 코닝 소재의 Corning Incorporated)을 사용하여 개시되는 실시형태에서, IL-2 (6000 IU/mL; 미국 캘리포니아주 에머리빌 소재의 Chiron Corp.)를 갖는 2 mL의 완전 배지 (CM)에서 각각의 웰은 1 × 106 종양 분해 세포 또는 하나의 종양 단편으로 씨딩될 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 10 mm3이다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 배양 배지의 약어인 "CM"으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 단계 B의 CM은 10% 인간 AB 혈청이 보충된 GlutaMAX가 포함된 RPMI 1640, 25 mM Hepes 및 10 mg/mL의 겐타마이신으로 구성된다. 배양이 40 mL 용량 및 10 cm2 기체 투과성 실리콘 저부 (예를 들어, G-Rex10; 미국 미네소타주 뉴브링톤 소재의 Wilson Wolf Manufacturing) (도 1)를 갖는 기체 투과성 플라스크에서 개시되는 실시형태에서, 각각의 플라스크에 IL-2를 갖는 10-40 mL의 CM 중 10-40x106 생존가능한 종양 분해 세포 또는 5-30 종양 단편이 로딩되었다. G-Rex10 및 24-웰 플레이트는 모두 37℃에서 5% CO2 및 배양 개시 5일 후에 가습 인큐베이터에서 인큐베이션되었고, 배지의 절반이 제거되고 새로운 CM 및 IL-2로 대체되고, 5일 후, 배지 절반은 2 내지 3일마다 교체되었다.
종양 단편의 제조 후, 생성된 세포(즉, 단편)는 종양 및 다른 세포에 비해 TIL의 성장을 촉진하는 조건 하에 IL-2를 함유하는 혈청에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 종양 분해물은 6000 IU/mL의 IL-2와 함께 불활성화된 인간 AB 혈청 (또는, 일부 경우에, 본원에 요약된 바와 같이, aAPC 세포 집단의 존재 하에)을 포함하는 배지에서 2 mL 웰에서 인큐베이션된다. 이러한 1차 세포 집단은 며칠 동안, 일반적으로 10 내지 14일 동안 배양되어, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1×108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 동안의 성장 배지는 IL-2 또는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL은 재조합 인간 IL-2 (rhIL-2)이다. 일부 실시형태에서, IL-2 스톡 용액은 1 mg의 바이알에 대해 20-30×106 IU/mg의 고유 활성도(specific activity)를 갖는다. 일부 실시형태에서 IL-2 스톡 용액은 1 mg의 바이알에 대해 20×106 IU/mg의 고유 활성도를 갖는다. 일부 실시형태에서 IL-2 스톡 용액은 1 mg의 바이알에 대해 25×106 IU/mg의 고유 활성도를 갖는다. 일부 실시형태에서 IL-2 스톡 용액은 1 mg의 바이알에 대해 30×106 IU/mg의 고유 활성도를 갖는다. 일부 실시형태에서, IL-2 스톡 용액은 그 최종 농도가 4-8×106 IU/mg의 IL-2이다. 일부 실시형태에서, IL-2 스톡 용액은 그 최종 농도가 5-7×106 IU/mg의 IL-2이다. 일부 실시형태에서, IL-2 스톡 용액은 그 최종 농도가 6×106 IU/mg의 IL-2이다. 일부 실시형태에서, IL-2 스톡 용액은 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조된다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 10,000 IU/mL의 IL-2, 약 9,000 IU/mL의 IL-2, 약 8,000 IU/mL의 IL-2, 약 7,000 IU/mL의 IL-2, 약 6000 IU/mL의 IL-2 또는 약 5,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 9,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 5,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 8,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 7,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-15를 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 5 IU/mL의 IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-21을 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 및 약 1 μg/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, OKT-3 항체는 무로모납이다.
Figure pct00005
일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지에서 하나 이상의 TNFRSF 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제, 및 4-1BB 효능제는 우렐루맙, 유토밀루맙, EU-101, 융합 단백질, 및 단편, 유도체, 변이체, 바이오시밀러, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL의 세포 배양 배지의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 20 μg/mL 내지 40 μg/mL의 세포 배양 배지의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 TNFRSF 효능제에 추가하여, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 초기 농도에서 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도에서 OKT-3 항체를 추가로 포함하고, 하나 이상의 TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 배양 배지의 약어인 "CM"으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, CM1 (배양 배지 1)로 지칭한다. 일부 실시형태에서, CM은 10% 인간 AB 혈청, 25 mM Hepes, 및 10 mg/mL의 겐타마이신으로 보충된, GlutaMAX를 갖는 RPMI 1640으로 구성된다. 배양이 40 mL 용량 및 10 cm2 기체 투과성 실리콘 저부 (예를 들어, G-Rex10; 미국 미네소타주 뉴브링톤 소재의 Wilson Wolf Manufacturing) (도 1)를 갖는 기체 투과성 플라스크에서 개시되는 실시형태에서, 각각의 플라스크에 IL-2를 갖는 10-40 mL의 CM 중 10-40x106 생존가능한 종양 분해 세포 또는 5-30 종양 단편이 로딩되었다. G-Rex10 및 24-웰 플레이트는 모두 37℃에서 5% CO2 및 배양 개시 5일 후에 가습 인큐베이터에서 인큐베이션되었고, 배지의 절반이 제거되고 새로운 CM 및 IL-2로 대체되고, 5일 후, 배지 절반은 2 내지 3일마다 교체되었다. 일부 실시형태에서, CM은 실시예 1을 참조하여 실시예에 기재된 CM1이다. 일부 실시형태에서, 제1 확장은 초기 세포 배양 배지 또는 제1 세포 배양 배지에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 초기 세포 배양 배지 또는 제1 세포 배양 배지는 IL-2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 (예를 들어, 때때로 프리-REP로 지칭되는 것들을 포함할 수 있는 도 1의 단계 B에 기재된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 실시예 및 도면에서 논의된 바와 같이 3 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 (예를 들어, 때때로 프리-REP로 지칭되는 것들을 포함할 수 있는 도 1의 단계 B에 기재된 것들과 같은 공정을 포함함)은 실시예에 논의되고 도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이, 뿐만 아니라 예를 들어, 도 1의 단계 B에 기술된 바와 같은 확장을 포함하여 7 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 단계 B의 제1 확장은 10 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 제1 확장은 예를 들어, 도 1의 단계 B에 기재된 바와 같은 확장에서 논의된 바와 같이 11일로 단축된다.
일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 1일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 2일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 3일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 4일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 5일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 6일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 7일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 8일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 9일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 10일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 11일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 12일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 13일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 1일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 2일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 3일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 4일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 5일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 6일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 7일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 8일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 9일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 10일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 11일 동안 진행될 수 있다.
일부 실시형태에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21의 조합은 제1 확장 동안 조합하여 사용된다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 예를 들어, 본원에 기재될 뿐만 아니라 도 1에 따른 단계 B 공정 동안을 비롯하여 제1 확장 동안 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21의 조합은 제1 확장 동안 조합하여 사용된다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 도 1에 따른 그리고 본원에 기재된 바와 같은 단계 B 공정 동안에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 (프리-REP로 지칭되는 공정; 예를 들어, 도 1에 따른 단계 B를 포함함) 공정은 실시예 및 도면에서 논의된 바와 같이 3 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 단계 B의 제1 확장은 7 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 단계 B의 제1 확장은 10 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 제1 확장은 11일로 단축된다.
일부 실시형태에서, 제1 확장, 예를 들어, 도 1에 따른 단계 B는, 폐쇄 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시형태에서, 사용된 단일 생물반응기는 예를 들어, G-REX -10 또는 G-REX -100이다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
C. 단계 C: 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행
일부 경우에, 예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 단계 B로부터 수득된 TIL 집단을 포함하는, 제1 확장으로부터 수득된 벌크 TIL 집단은, 본원의 아래에 논의된 프로토콜을 사용하여 즉시 동결보존될 수 있다. 대안적으로, 제2 TIL 집단으로 지칭되는 제1 확장으로부터 수득된 TIL 집단은, 제2 확장 (이는 때때로 REP로 지칭된 확장을 포함할 수 있음)을 거칠 수 있고 그 다음 아래에 논의된 바와 같이 동결보존된다. 유사하게, 유전적으로 변형된 TIL이 요법에 사용될 경우, 제1 TIL 집단 (때때로 벌크 TIL 집단을 지칭함) 또는 제2 TIL 집단 (일부 실시형태에서 REP TIL 개체로 지칭되는 집단을 포함할 수 있음)은 확장 전에 또는 제1 확장 후 그리고 제2 확장 전에 적합한 치료를 위해 유전자 변형을 거칠 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 확장으로부터 (예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 단계 B로부터) 수득된 TIL은 선택을 위해 표현형이 될 때까지 저장된다. 일부 실시형태에서, 제1 확장으로부터 (예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 단계 B로부터) 수득된 TIL은 저장되지 않고 제2 확장으로 직접 진행한다. 일부 실시형태에서, 제1 확장으로부터 수득된 TIL은 제1 확장 후 및 제2 확장 전에 동결보존되지 않는다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 약 3일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 약 4일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 약 4일 내지 10일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 약 7일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 약 14일에 일어난다.
일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 1일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 첫 번째 TIL 확장은 2일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 3일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 4일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 5일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 6일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 7일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 8일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 9일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 10일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 11일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 12일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 13일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 14일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 1일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 2일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 3일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 4일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 5일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 6일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 7일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 8일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 9일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 10일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 후 11일에 일어난다.
일부 실시형태에서, TIL은 제1 확장 후 및 제2 확장 전에 저장되지 않고, TIL 제2 확장으로 직접 진행한다(예를 들어, 일부 실시형태에서, 도 1에 도시된 바와 같이 단계 B로부터 단계 D로의 이행 동안 저장이 없다). 일부 실시형태에서, 이행은 본원에 기재된 바와 같이 폐쇄 시스템에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 제1 확장으로부터의 TIL, TIL의 제2 집단은, 이행 기간 없이 제2 확장으로 직접 진행된다.
일부 실시형태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행, 예를 들어, 도 1에 따른 단계 C는, 폐쇄 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시형태에서, 사용된 단일 생물반응기는 예를 들어, G-REX -10 또는 G-REX -100이다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
1. 사이토카인
본원에 기재된 확장 방법은 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같이 높은 용량의 사이토카인, 특히 IL-2를 갖는 배양 배지를 사용한다.
대안적으로, TILS의 급속 확장 및/또는 제2 확장을 위해 사이토카인의 조합을 사용하는 것이 추가적으로 가능하며, 이는 국제공개 WO 2015/189356호 및 국제공개 WO 2015/189357호에 일반적으로 설명된 바와 같은 IL-2, IL-15 및 IL-21 중 둘 이상의 조합이 있으며, 상기 공개들은 명시적으로 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 따라서, 가능한 조합은 IL-2 및 IL-15, IL-2 및 IL-21, IL-15 및 IL-21 및 IL-2, IL-15 및 IL-21을 포함하고, 후자는 많은 실시형태에서 특히 사용된다. 사이토카인의 조합의 사용은 본원에 기재된 바와 같은 림프구, 및 특히 T-세포의 생성에 특이적으로 유리하게 작동한다.
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D. 단계 D: 제2 확장
일부 실시형태에서, TIL 세포 집단은 수확 및 초기 벌크 가공 후, 예를 들어, 단계 A 및 단계 B, 및 도 1에 나타낸 바와 같이 단계 C로 지칭되는 이전 후에 수가 확장된다. 이는 또한 급속 확장 공정 (REP; 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에 나타낸 공정)으로서 당업계의 일반적으로 지칭된 확장 공정을 포함할 수 있는 제2 확장으로서 본원에서 지칭된다. 제2 확장은 일반적으로 기체 투과성 용기에서 피더 세포, 사이토카인 공급원, 및 항-CD3 항체를 포함하는 수많은 구성요소를 포함하는 배양 배지를 사용하여 달성된다.
일부 실시형태에서, TIL의의 제2 확장 또는 두 번째 TIL 확장 (때때로 REP로 지칭되는 확장; 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에 나타낸 공정을 포함할 수 있음)은 당업자에게 알려진 임의의 TIL 플라스크 또는 용기를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 약 7일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 약 8일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 약 9일 내지 약 14일 확장은 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 약 10일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 약 11일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 약 12일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 약 13일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 번째 TIL 확장은 약 14일 동안 진행될 수 있다.
일 실시형태에서, 제2 확장은 본 개시내용의 방법 (예를 들어, REP로 지칭된 확장; 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에 나타낸 공정을 포함함)을 사용하여 기체 투과성 용기에서 수행될 수 있다. 예를 들어, TIL은 인터류킨-2 (IL-2) 또는 인터류킨-15 (IL-15)의 존재에서 비-특이적 T-세포 수용체 자극을 사용하여 급속하게 확장될 수 있다. 비-특이적 T-세포 수용체 자극은, 예를 들어, 항-CD3 항체, 예컨대 약 30 ng/ml의 OKT3, 마우스 단클론성 항-CD3 항체 (뉴저지주 라리탄 소재의 Ortho-McNeil 또는 캘리포니아주 아우번 소재의 Miltenyi Biotech) 또는 UHCT-1 (미국 캘리포니아주 샌디애고 소재의 BioLegend로부터 상업적으로 입수가능)을 포함할 수 있다. TIL은, 선택적으로 T-세포 성장 인자, 예컨대 300 IU/mL IL-2 또는 IL-15의 존재 하에 벡터, 예컨대 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2) 결합 펩티드, 예를 들어, 0.3 μΜ MART-1 :26-35 (27 L) 또는 gpl 00:209-217 (210M)로부터 선택적으로 발현될 수 있는, 암의 에피토프(들)와 같은 항원부를 포함하는 제2 확장 동안 하나 이상의 항원을 포함함으로써 시험관내 TIL의 추가 자극을 유도하기 위해 확장될 수 있다. 다른 적합한 항원은 예를 들어, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 암 항원, MAGE-A3, SSX-2, 및 VEGFR2, 또는 그의 항원부를 포함할 수 있다. TIL은 또한 HLA-A2-발현 항원 제시 세포 상에서 펄스화된 암의 동일한 항원(들)에 의한 재자극에 의해 급속하게 확장될 수 있다. 대안적으로, TIL은 추가로 예를 들어, 조사된, 자가 림프구로 또는 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2로 재자극될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재자극은 제2 확장의 일부로서 일어난다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 조사된, 자가 림프구 또는 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2의 존재에서 일어난다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 및 약 1 μg/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, OKT-3 항체는 무로모납이다.
일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지에서 하나 이상의 TNFRSF 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제, 및 4-1BB 효능제는 우렐루맙, 유토밀루맙, EU-101, 융합 단백질, 및 단편, 유도체, 변이체, 바이오시밀러, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL의 세포 배양 배지의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 20 μg/mL 내지 40 μg/mL의 세포 배양 배지의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 TNFRSF 효능제에 추가하여, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 초기 농도에서 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도에서 OKT-3 항체를 추가로 포함하고, 하나 이상의 TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21의 조합은 제2 확장 동안 조합하여 사용된다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 예를 들어, 도 1에 따른 단계 D 공정, 뿐만 아니라 본원에 기재된 것 동안을 포함하는 제2 확장 동안 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21의 조합은 제2 확장 동안 조합하여 사용된다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 도 1에 따른 단계 D 공정 동안 그리고 본원에 기재된 바와 같이 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 확장은 IL-2, OKT-3, 항원 제시 피더 세포, 및 선택적으로 TNFRSF 효능제를 포함하는 보충된 세포 배양 배지에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 보충된 세포 배양 배지에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 보충된 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 세포 (APC; 또한 항원 제시 피더 세포로 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 피더 세포 (즉, 항원 제시 세포)를 포함하는 세포 배양 배지에서 일어난다.
일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-15를 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 5 IU/mL의 IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-21을 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
일부 실시형태에서 항원 제시 피더 세포 (APC)는 PBMC이다. 일 실시형태에서, 급속 확장 및/또는 제2 확장에서 TIL 대 PBMC 및/또는 항원 제시 세포의 비는 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 일 실시형태에서, 급속 확장 및/또는 제2 확장에서의 TIL 대 PBMC의 비는 1 대 50 내지 1 대 300이다. 일 실시형태에서, 급속 확장 및/또는 제2 확장에서의 TIL 대 PBMC의 비는 1 대 100 내지 1 대 200이다.
일 실시형태에서, REP 및/또는 제2 확장은 플라스크에서 수행되고, 벌크 TIL은 150 ml 배지에서 100- 또는 200-배 과잉의 불활성화된 피더 세포, 30 mg/mL OKT3 항-CD3 항체 및 3000 IU/mL IL-2와 혼합된다. 배지 교체(일반적으로 신선한 배지로의 호흡을 통한 2/3 배지 교체)는 세포가 대안적인 성장 챔버로 이전될 때까지 수행된다. 대안적인 성장 챔버는 아래에 더 충분히 논의된 바와 같이 G-REX 플라스크 및 기체 투과성 용기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 확장 (REP 공정으로 지칭되는 공정을 포함할 수 있음)은 실시예 및 도면에서 논의된 바와 같이 7 내지 14일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 11일로 단축된다.
일 실시형태에서, REP 및/또는 제2 확장은 앞서 기재된 바와 같은 T-175 플라스크 및 기체 투과성 백 (문헌[Tran, 등, J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, 등, J. Immunother. 2003, 26, 332-42]) 또는 기체 투과성 배양기 (G-Rex 플라스크)를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 (급속 확장으로 지칭되는 확장을 포함함)은 T-175 플라스크에서 수행되고, 150 mL의 배지에 현탁된 약 1 x 106 TIL은 각각의 T-175 플라스크에 첨가될 수 있다. TIL은 3000 IU /mL의 IL-2 및 30 ng /mL의 항-CD3로 보충된 CM 및 AIM-V 배지의 1 대 1 혼합물에서 배양될 수 있다. T-175 플라스크는 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션될 수 있다. 배지의 절반은 3000 IU /mL의 IL-2를 갖는 50/50 배지를 사용하여 5일째에 교환될 수 있다. 일부 실시형태에서, 7일째에, 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포는 3 L 백에서 조합될 수 있고 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 300 mL의 AIM-V는 300 ml의 TIL 현탁액에 첨가되었다. 각각의 백 내의 세포의 수는 매일 또는 2회 계수될 수 있고 새로운 배지는 첨가되어 세포수 0.5 내지 2.0 x 106 세포/mL의 세포수를 유지할 수 있다.
일 실시형태에서, 제2 확장 (REP로 지칭된 확장, 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에 언급된 것을 포함할 수 있음)은 100 cm 기체 투과성 실리콘 저부 (미국 미네소타주 뉴브링턴 소재의 Wilson Wolf Manufacturing Corporation로부터 상업적으로 입수가능한 G-Rex 100)를 갖는 500 mL의 수용력 기체 투과성 플라스크에서 수행될 수 있고, 5 × 106 또는 10 × 106 TIL은 5% 인간 AB 혈청, 3000 IU /mL의 IL-2 및 30 ng /mL의 항-CD3 (OKT3)으로 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 PBMC와 함께 배양될 수 있다. G-Rex 100 플라스크는 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션될 수 있다. 5일째에, 250 mL의 상청액은 제거되어 원심분리기 병에 배치되고 10분 동안 1500 rpm (491 × g)에서 원심분리될 수 있다. TIL 펠렛은 5% 인간 AB 혈청, 3000 IU /mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 신선한 배지로 재현탁될 수 있고, 원래의 G-Rex 100 플라스크에 다시 추가된다. TIL이 G-Rex 100 플라스크에서 연속적으로 확장되는 경우, 7일째에 각 G-Lex 100의 TIL은 각 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지에서 현탁될 수 있고, 세포 현탁액은 3개의G-Rx 100 플라스크를 씨딩하는 데 사용될 수 있는 3개의 100 mL 분취액으로 나누어질 수 있다. 그 다음, 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V는 각각의 플라스크에 첨가될 수 있다. G-Rex 100 플라스크는 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션될 수 있고 4일 후 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V는 각각의 G-REX 100 플라스크에 첨가될 수 있다. 세포는 배양 14일째에 수확될 수 있다.
일 실시형태에서, 제2 확장 (REP로 지칭된 확장을 포함함)은 플라스크에서 수행되고, 벌크 TIL은 150 ml 배지에서 100- 또는 200-배 과잉의 불활성화된 피더 세포, 30 mg/mL OKT3 항-CD3 항체 및 3000 IU/mL IL-2와 혼합된다. 일부 실시형태에서, 세포가 대안적인 성장 챔버로 이동될 때까지 배지 대체가 수행된다. 일부 실시형태에서, 배지의 2/3는 새로운 배지를 갖는 호흡으로 대체된다. 일부 실시형태에서, 대안적인 성장 챔버는 아래에 더 충분히 논의된 바와 같은 G-REX 플라스크 및 기체 투과성 용기를 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 확장 (REP로 지칭된 확장을 포함함)은 수행되고 추가로 TIL이 우수한 종양 반응성에 대해 선택된 단계를 포함한다. 당업계에서 알려진 임의의 선택 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 개시내용이 본원에 인용되어 포함된 미국 특허출원공개 제2016/0010058 A1호에 기재된 방법은 우수한 종양 반응성에 대한 TIL의 선택을 위해 사용될 수 있다.
선택적으로, 세포 생존력 검정은 당업계에서 알려진 표준 검정을 사용하여 제2 확장 (REP 확장으로 지칭된 확장을 포함함) 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, 트립판 블루 제외 검정은 벌크 TIL의 샘플에 대해 수행될 수 있으며, 이는 선택적으로 죽은 세포를 표지하고 생존력 평가를 허용한다. 일부 실시형태에서, TIL 샘플 계수될 수 있고 생존력은 Cellometer K2 자동화 세포 계수기 (미국 매사추세츠주 로렌스 소재의 Nexcelom Bioscience)를 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생존력은 표준 Cellometer K2 Image Cytometer Automatic Cell Counter 프로토콜에 따라 결정된다.
일부 실시형태에서, TIL의 제2 확장 (REP로 지칭된 확장을 포함함)은 앞서 기재된 바와 같은 T-175 플라스크 및 기체 투과성 백 (문헌[Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, 등, 2008, J Immunother., 31:742-751, 및 Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, 등 2003, J Immunother., 26:332-342]) 또는 기체 투과성 G-Rex 플라스크를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 플라스크를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 기체 투과성 G-Rex 플라스크를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 T-175 플라스크에서 수행되고, 약 1 x 106 TIL은 약 150 mL의 배지에서 현탁되고 이는 각각의 T-175 플라스크에 첨가된다. TIL은 1 내지 100의 비에서 "공급기" 세포로서 조사된 (50 Gy) 동종이계 PBMC과 함께 배양되고 세포는 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3로 보충된 CM 및 AIM-V 배지 (50/50 배지)의 1 대 1 혼합물에서 배양되었다. T-175 플라스크는 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 배지의 절반은 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 50/50 배지를 사용하여 5일째에 변화된다. 일부 실시형태에서, 7일째에, 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포는 3 L 백에서 조합되고 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 300 mL의 AIM-V는 300 mL의 TIL 현탁액에 첨가된다. 각각의 백 내의 세포의 수는 매일 또는 2회 계수될 수 있고, 새로운 배지는 첨가되어 약 0.5 내지 약 2.0 x 106 세포/mL의 세포수를 유지할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 확장 (REP로 지칭되는 팽창을 포함함)을 100 cm2 기체-투과성 실리콘 저부 (G-Rex 100, Wilson Wolf) (도 1)를 갖는 500 mL 용량 플라스크에서 수행되고, 약 5x106 또는 10x106 TIL은 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/ml의 항-CD3으로 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 1 대 100의 비로 조사된 동종이계 PBMC와 함께 배양한다. G-Rex 100 플라스크는 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 5일째에, 250 mL의 상청액은 제거되어 원심분리기 병에 배치되고 10분 동안 1500 rpm (491g)에서 원심분리된다. 그 다음, TIL 펠렛은 3000 IU/mL의 IL-2와 함께 150 mL의 새로운 50/50 배지로 재현탁되고, 원래의 G-Rex 100 플라스크에 다시 첨가될 수 있다. TIL이 G-Rex 100 플라스크에서 연속적으로 확장되는 실시형태에서, 7일째에 각 G-Lex 100의 TIL은 각 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지에서 현탁되고, 세포 현탁액은 3개의 100 mL 분취액으로 나누고, 이는 3개의G-Rx 100 플라스크를 씨딩하는 데 사용되었다. 그 다음, 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V는 각각의 플라스크에 추가된다. G-Rex 100 플라스크는 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션되고 4일 후 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V는 각각의 G-Rex 100 플라스크에 추가된다. 세포는 배양 14일째 수확된다.
T 및 B 림프구의 다양한 항원 수용체는 제한적이지만 많은 수의 유전자 분절의 체세포 재조합에 의해 생성된다. 이들 유전자 분절: V (가변), D (다양성), J (결합), 및 C (불변)은 결합 특이성 및 면역글로불린 및 T-세포 수용체 (TCR)의 하류 적용을 결정한다. 본 발명은 T-세포 레퍼토리 다양성을 나타내고 증가시키는 TIL을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 제2 확장에서 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 다양성의 증가는 면역글로불린 다양성 및/또는 T-세포 수용체 다양성의 증가이다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 중쇄에 있다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 경쇄에 있다. 일부 실시형태에서, 다양성은 T-세포 수용체에 있다. 일부 실시형태에서, 다양성은 알파, 베타, 감마, 및 델타 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 T-세포 수용체 중 하나에 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파 및/또는 베타의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 베타의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, TCRab (즉, TCRα/β)의 발현의 증가가 있다.
일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지 (예를 들어, 때때로 CM2 또는 제2 세포 배양 배지로 지칭함)는, 아래에 더 상세히 논의된 바와 같이 IL-2, OKT-3, 뿐만 아니라 항원 제시 피더 세포 (APC)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 확장, 예를 들어, 도 1에 따른 단계 D는, 폐쇄 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시형태에서, 사용된 단일 생물반응기는 예를 들어, G-REX -10 또는 G-REX -100이다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
1. 피더 세포 및 항원 제시 세포
일 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차 (예를 들어, 확장 예컨대 도 1의 단계 D에서 기재된 것, 뿐만 아니라 REP로 지칭된 것을 포함함)은 REP TIL 확장 및/또는 제2 확장 동안 과잉의 피더 세포를 필요로 한다. 많은 실시형태에서, 피더 세포는 건강한 혈액 공여체로부터 표준 전혈 단위로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이다. PBMC는 표준 방법 예컨대 피콜-파크(Ficoll-Paque) 구배 분리를 사용하여 수득된다.
일반적으로, 동종 PBMC는 조사 또는 열 처리를 통해 불활성화되고, 실시예에 기재된 바와 같이 REP 절차에서 사용되며, 이는 조사 동종이계 PBMC의 복제 부능력을 평가하기 위한 예시적인 프로토콜을 제공한다.
일부 실시형태에서, 14일째에 생존가능 세포의 총 수가 REP의 0일째 및/또는 제2 확장의 0일째(즉, 제2 확장의 시작일)에 배양된 초기 생존가능 세포 수보다 더 적은 경우, PBMC는 복제 부적합한 것으로 간주되고 본원에 기재된 TIL 확장 절차에의 사용이 허용된다.
일부 실시형태에서, 7일째 및 14일째에 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된 생존가능 세포의 총 수가 REP의 0일째 및/또는 제2 확장의 0 일째(즉, 제2 확장의 시작일)에 배양된 초기 생존가능 세포 수로부터 증가되지 않는 경우, PBMC는 복제 불능으로 간주되고 본원에 기재된 TIL 확장 절차에의 사용이 허용된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 30 ng/ml의 OKT3 항체 및 3000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다.
일부 실시형태에서, 7일째 및 14일째에 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된 생존가능 세포의 총 수가 REP의 0일째 및/또는 제2 확장의 0 일째(즉, 제2 확장의 시작일)에 배양된 초기 생존가능 세포 수로부터 증가되지 않는 경우, PBMC는 복제 불능으로 간주되고 본원에 기재된 TIL 확장 절차에의 사용이 허용된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 5-60 ng/ml의 OKT3 항체 및 1000-6000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 10-50 ng/ml의 OKT3 항체 및 2000-5000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 20-40 ng/ml의 OKT3 항체 및 2000-4000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 25-35 ng/ml의 OKT3 항체 및 2500-3500 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다.
일부 실시형태에서, 항원 제시 피더 세포는 PBMC이다. 일부 실시형태에서, 항원 제시 피더 세포는 인공 항원 제시 피더 세포이다. 일 실시형태에서, 제2 확장에서의 TIL 대 항원 제시 피더 세포의 비는 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 일 실시형태에서, 제2 확장에서의 TIL 대 항원 제시 피더 세포의 비는 1 대 50 내지 1 대 300이다. 일 실시형태에서, 제2 확장에서의 TIL 대 항원 제시 피더 세포의 비는 1 대 100 내지 1 대 200이다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 약 2.5x109 피더 세포 대 약 100x106 TIL의 비를 필요로 한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 약 2.5x109 피더 세포 대 약 50x106 TIL의 비를 필요로 한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 약 2.5x109 피더 세포 대 약 25x106 TIL을 필요로 한다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 제2 확장 동안 과잉의 피더 세포를 필요로 한다. 많은 실시형태에서, 피더 세포는 건강한 혈액 공여체로부터 표준 전혈 단위로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이다. PBMC는 표준 방법 예컨대 피콜-파크 구배 분리를 사용하여 수득된다. 일 실시형태에서, 인공 항원 제시 (aAPC) 세포는 PBMC 대신 사용된다.
일반적으로, 동종 PBMC는 조사 또는 열 처리를 통해 불활성화되고, 도 및 실시예에 기재된 예시적인 절차를 포함하는 본원에 기재된 TIL 확장 절차에서 사용된다.
일 실시형태에서, 인공 항원 제시 세포는 PBMC의 대체물로서 또는 PBMC와 조합하여 제2 확장에서 사용된다.
2. 사이토카인
본원에 기재된 확장 방법은 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같이 높은 용량의 사이토카인, 특히 IL-2를 갖는 배양 배지를 사용한다.
대안적으로, TILS의 급속 확장 및/또는 제2 확장을 위해 사이토카인의 조합을 사용하는 것이 추가적으로 가능하며, 이는 국제공개 WO 2015/189356호 및 국제공개 WO 2015/189357호에 일반적으로 설명된 바와 같은 IL-2, IL-15 및 IL-21 중 둘 이상의 조합이 있으며, 상기 공개들은 명시적으로 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 따라서, 가능한 조합은 IL-2 및 IL-15, IL-2 및 IL-21, IL-15 및 IL-21 및 IL-2, IL-15 및 IL-21을 포함하고, 후자는 많은 실시형태에서 특히 사용된다. 사이토카인의 조합의 사용은 본원에 기재된 바와 같은 림프구, 및 특히 T-세포의 생성에 특이적으로 유리하게 작동한다.
E. 단계 E: TIL의 수확
제2 확장 단계 후에, 세포가 수확될 수 있다. 일부 실시형태에서 TIL은 예를 들어, 도 1에 제공된 바와 같은 1, 2, 3, 4 또는 그 초과의 확장 단계들 후에 수확된다. 일부 실시형태에서 TIL은 예를 들어, 도 1에 제공된 바와 같이 2개의 확장 단계 후에 수확된다.
TIL은 예를 들어, 원심분리를 포함하는 임의의 적절하고 멸균된 방식으로 수확될 수 있다. TIL 수확을 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 임의의 이러한 공지된 방법이 본 공정에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, TILS는 자동화 시스템을 사용하는 수확이다.
세포 수확기 및/또는 세포 가공 시스템은 예를 들어, Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer, 및 Inotech Biosystems International, Inc.를 포함하는 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다. 임의의 세포 기반 수확기는 본 방법으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 수확기 및/또는 세포 가공 시스템은 막 기반 세포 수확기이다. 일부 실시형태에서, 세포 수확은 세포 가공 시스템, 예컨대 LOVO 시스템 (Fresenius Kabi 제조)을 통한 것이다. 용어 "LOVO 세포 가공 시스템"은 또한 멸균 및/또는 폐쇄 시스템 환경에서 막 또는 필터, 예컨대 방사 막 또는 방사 필터를 통해 세포를 포함하는 용액을 펌핑할 수 있는 임의의 판매인에 의해 제조된 임의의 기구 또는 장치를 지칭하며, 펠릿화 없이 상청액 또는 세포 배양 배지를 제거하기 위해 연속 유동 및 세포 가공을 허용한다. 일부 실시형태에서, 세포 수확기 및/또는 세포 가공 시스템은 폐쇄된 멸균 시스템에서 세포 분리, 세척, 유체-교환, 농도, 및/또는 다른 세포 가공 단계를 수행할 수 있다.
일부 실시형태에서, 수확, 예를 들어, 도 1에 따른 단계 E는, 폐쇄 시스템 생물반응기로부터 수행된다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시형태에서, 사용된 단일 생물반응기는 예를 들어, G-REX -10 또는 G-REX -100이다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
일부 실시형태에서, 도 1에 따른 단계 E는, 실시예 G에 기재된 공정에 따라 수행된다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 시스템의 멸균 및 폐쇄 특성을 유지하기 위해 멸균 조건 하에서 주사기를 통해 접근된다. 일부 실시형태에서, 실시예 G에 기재된 바와 같은 폐쇄 시스템이 사용된다.
일부 실시형태에서, TIL은 실시예 G에 기재된 방법에 따라 수확된다. 일부 실시형태에서, 1일째와 11일째 사이의 TIL은 섹션 8.5에 기재된 방법을 사용하여 수확된다(실시예 G에서 11일째의 TIL 수확으로 지칭됨). 일부 실시형태에서, 12일째와 22일째 사이의 TIL은 섹션 8.12에 기재된 방법을 사용하여 수확된다(실시예 G에서 22일째의 TIL 수확으로 지칭됨).
F. 단계 F: 최종 제형/주입 백으로의 이동
도 1에서 예시적인 순서로 제공되고 상기 및 본원에 상세히 약술된 바와 같은 단계 A 내지 E가 완료된 후, 세포는 환자에게 투여 시 사용하기 위해 용기로 이동된다. 일부 실시형태에서, 일단 치료상 충분한 수의 TIL이 상기 기재된 확장 방법을 사용하여 수득되면, 이들은 환자에게 투여 시 사용하기 위한 용기로 이동된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 APC를 사용하여 확장된 TIL은 약제학적 조성물로서 환자에게 투여된다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 멸균 완충액 중의 TIL의 현탁액이다. 본 개시내용의 PBMC를 사용하여 확장된 TIL은 당해 분야에서 알려진 바와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, T-세포는 단일 동맥내 또는 정맥내 주입으로서 투여되고, 바람직하게는 대략 30 내지 60분 지속된다. 다른 적합한 투여 경로는 복강내, 척추강내, 및 림프내를 포함한다.
G. 선택적 세포 배지 구성요소
1. 항-CD3 항체
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 확장 방법에 사용되는 배양 배지 (REP로 지칭되는 것을 포함하고, 예를 들어, 도 1을 참조함)은 또한 항-CD3 항체를 유도한다. IL-2와 조합된 항-CD3 항체는 TIL 집단에서 T 세포 활성화 및 세포 분열을 유도한다. 이 효과는 전장 항체뿐만 아니라 Fab 및 F(ab')2 단편에서 볼 수 있으며, 전자가 일반적으로 바람직하고; 예를 들어, 문헌[Tsoukas 등, J. Immunol. 1985, 135, 1719]을 참조하고, 그 전체 내용은 본원에 인용되어 포함된다.
당업자에 의해 인정되는 바와 같이, 쥣과, 인간, 영장류, 랫트, 및 갯과 항체를 비제한적으로 포함하는 다양한 포유동물로부터의 항-인간 CD3 다클론성 및 단클론성 항체를 비롯하여 본 발명에 사용되는 수많은 적합한 항-인간 CD3 항체가 있다. 특정 실시형태에서, OKT3 항-CD3 항체가 사용된다 (뉴저지주 라리탄 소재의 Ortho-McNeil 또는 캘리포니아주 아우번 소재의 Miltenyi Biotech로부터 상업적으로 입수가능함).
Figure pct00007
2. 4-1BB (CD137) 효능제
일 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB (CD137) 효능제이다. 4-1BB 효능제는 당업계에서 알려진 임의의 4-1BB 결합 분자일 수 있다. 4-1BB 결합 분자는 인간 또는 포유류 4-1BB에 결합할 수 있는 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 4-1BB 효능제 또는 4-1BB 결합 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 아이소타입 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 중쇄를 포함할 수 있다. 4-1BB 효능제 또는 4-1BB 결합 분자는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 가질 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 결합 분자는 또한 항체 (전장 항체 포함), 단클론성 항체 (전장 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 인간, 인간화된 또는 키메라 항체, 및 항체 단편, 예를 들어, Fab 단편, F(ab′) 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편, 및 조작된 형태의 항체, 예를 들어, 4-1BB에 결합하는 scFv 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 완전 인간 항체 인 항원 결합 단백질이다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 인간화된 항체 인 항원 결합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 현재 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 4-1BB 효능제는 항-4-1BB 항체, 인간 항-4-1BB 항체, 마우스 항-4-1BB 항체, 포유류 항-4-1BB 항체, 단클론성 항-4-1BB 항체, 다클론성 항-4-1BB 항체, 키메라 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 아드넥틴, 항-4-1BB 도메인 항체, 단일 사슬 항-4-1BB 단편, 중쇄 항-4-1BB 단편, 경쇄 항-4-1BB 단편, 항-4-1BB 융합 단백질, 및 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 또는 바이오시밀러를 포함한다. 작용적 항-4-1BB 항체는 강한 면역 반응을 포함하는 것으로 알려져 있다. 문헌[Lee, 등, PLOS One 2013, 8, e69677]. 바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 작용적, 항-4-1BB 인간화된 또는 완전 인간 단클론성 항체 (즉, 단세포주에서 유래된 항체)이다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 EU-101 (Eutilex Co. Ltd.), 유토밀루맙, 또는 우렐루맙, 또는 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 또는 바이오시밀러이다. 바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 유토밀루맙 또는 우렐루맙, 또는 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 또는 바이오시밀러이다.
바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제 또는 4-1BB 결합 분자는 또한 융합 단백질일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, (3개 또는 6개의 리간드 결합 도메인을 갖는) 다량체 4-1BB 효능제, 예컨대 삼량체 또는 육량체 4-1BB 효능제는, 전형적으로 2개의 리간드 결합 도메인을 보유하는 작용적 단클론성 항체와 비교하여 우수한 수용체 (4-1BBL) 클러스터링 및 내부 세포 신호전달 착물 형성을 유도할 수 있다. 3개의 TNFRSF 결합 도메인 및 IgG1-Fc를 포함하고 선택적으로 이들 융합 단백질 중 2종 이상을 추가로 연결하는 삼량체 (3가) 또는 육량체 (또는 6가) 또는 그 초과의 융합 단백질은 예를 들어, 문헌[Gieffers, 등, Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47]에 기재되어 있다.
작용적 4-1BB 항체 및 융합 단백질은 강한 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 독성을 감소시키기에 충분한 방식으로 4-1BB 항원에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 항체-의존적 세포 독성 (ADCC), 예를 들어, NK 세포 세포독성을 제거한 작용적 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 항체-의존적 세포 포식작용 (ADCP)을 제거한 작용적 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 제거한 작용적 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 Fc 영역 작용성을 제거한 작용적 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다.
일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 고친화도 및 작용적 활성으로 인간 4-1BB (서열번호:9)에 결합하는 것을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 인간 4-1BB (서열번호:9)에 결합하는 결합 분자이다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 쥣과 4-1BB (서열번호:10)에 결합하는 결합 분자이다. 4-1BB 효능제 또는 결합 분자가 결합하는 4-1BB 항원의 아미노산 서열은 표 6에 요약된다.
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일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 100 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 90 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 80 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 70 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 60 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 50 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 40 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하거나, 또는 약 30 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 8 × 105 l/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 8.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 9 × 105 1/M·s 이상의로 kassoc 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 9.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하거나, 또는 약 1 × 106 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.1 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.4 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.5 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.6 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하거나 또는 약 2.7 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.8 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.9 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하거나, 또는 약 3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 10 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 9 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 8 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 7 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 6 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 5 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 4 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 3 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 또는 약 1 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 PF-05082566 또는 MOR-7480로도 알려져 있는 유토밀루맙, 또는 단편, 유도체, 변이체, 또는 그의 바이오시밀러이다. 유토밀루맙은 Pfizer, Inc로부터 입수 가능하다. 유토밀루맙은 면역글로불린 G2-람다, 항-[호모사피엔스 TNFRSF9 (종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 슈퍼패밀리 멤버 9, 4-1BB, T 세포 항원 ILA, CD137)], 호모사피엔스 (완전 인간) 단클론성 항체이다. 유토밀루맙의 아미노산 서열은 표 EE에 제시된다. 유토밀루맙은 Asn59 및 Asn292에서 글리코실화 부위; 위치 22-96 (VH-VL), 143-199 (CH1-CL), 256-316 (CH2) 및 362-420 (CH3)에서 중쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; 위치 22'-87' (VH-VL) 및 136'-195' (CH1-CL)에서 경쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; IgG2A 동형체 위치 218-218, 219-219, 222-222, 및 225-225에서, IgG2A/B 동형체 위치 218-130, 219-219, 222-222, 및 225-225에서, 그리고 IgG2B 동형체 위치 219-130 (2), 222-222, 및 225-225에서 사슬간 중쇄-중쇄 디설파이드 브릿지; 및 IgG2A 동형체 위치 130-213' (2), IgG2A/B 동형체 위치 218-213' 및 130-213'에서, 그리고 IgG2B 동형체 위치 218-213' (2)에서 사슬간 중쇄-경쇄 디설파이드 브릿지를 포함한다. 유토밀루맙 및 그것의 변이체 및 단편의 제조 및 특성은 미국 특허 제8,821,867; 8,337,850호; 및 제9,468,678호, 및 국제공개 WO 2012/032433 A1호에 기재되어 있고, 이들 각각의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 유토밀루맙의 전임상 특성은 문헌[Fisher, 등, Cancer Immunolog. & Immunother. 2012 , 61, 1721-33]에 기재되어 있다. 다양한 혈액학적 및 고형 종양 징후에서 유토밀루맙의 현재 임상 시험은 미국 국립 보건원 clinicaltrials.gov 식별자 NCT02444793, NCT01307267, NCT02315066, 및 NCT02554812를 포함한다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:11로 제시된 중쇄 및 서열번호:12로 제시된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 콘주게이트를 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 유토밀루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:13에 제시된 서열을 포함하고, 4-1BB 효능제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:14에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 항체를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:15, 서열번호:16, 및 서열번호:17 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:18, 서열번호:19, 및 서열번호:20 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 유토밀루맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 4-1BB 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 유토밀루맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 4-1BB 효능제 항체이고, 4-1BB 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 유토밀루맙이다. 4-1BB 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 유토밀루맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 유토밀루맙이다.
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바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 BMS-663513 및 20H4.9.h4a로도 알려져 있는 단클론성 항체 우렐루맙, 또는 단편, 유도체, 변이체, 또는 그의 바이오시밀러이다. 우렐루맙은 Bristol-Myers Squibb, Inc., 및 Creative Biolabs, Inc.로부터 입수 가능하다. 우렐루맙은 면역글로불린 G4-카파, 항-[호모사피엔스 TNFRSF9 (종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 멤버 9, 4-1BB, T 세포 항원 ILA, CD137)], 호모사피엔스 (완전 인간) 단클론성 항체이다. 우렐루맙의 아미노산 서열은 표 EE에 제시된다. 우렐루맙은 위치 298 (및 298'')에서 N-글리코실화 부위; 위치 22-95 (VH-VL), 148-204 (CH1-CL), 262-322 (CH2) 및 368-426 (CH3)에서 (그리고 위치 22''-95'', 148''-204'', 262''-322'', 및 368''-426''에서) 중쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; 위치 23'-88' (VH-VL) 및 136'-196' (CH1-CL)에서 (그리고 위치 23'''-88''' 및 136'''-196'''에서) 경쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; 위치 227-227'' 및 230-230''에서 사슬간 중쇄-중쇄 디설파이드 브릿지; 및 135-216' 및 135''-216'''에서 사슬간 중쇄-경쇄 디설파이드 브릿지를 포함한다. 우렐루맙 및 그것의 변이체 및 단편의 제조 및 특성은 미국 특허 제7,288,638호 및 제8,962,804호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 우렐루맙의 전임상 및 임상 특성은 문헌[Segal, 등, Clin. Cancer Res. 2016, http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272에서 사용가능함]에 기재되어 있다. 다양한 혈액학적 및 고형 종양 징후에서 우렐루맙의 현재 임상 시험은 미국 국립 보건원 clinicaltrials.gov 식별자 NCT01775631, NCT02110082, NCT02253992, 및 NCT01471210을 포함한다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:21로 제시된 중쇄 및 서열번호:22로 제시된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 콘주게이트를 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 우렐루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:23에 제시된 서열을 포함하고, 4-1BB 효능제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:24에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 항체를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:25, 서열번호:26, 및 서열번호:27 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:28, 서열번호:29, 및 서열번호:30 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 우렐루맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 4-1BB 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 4-1BB 효능제 항체이고, 4-1BB 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다. 4-1BB 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다.
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일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 1D8, 3Elor, 4B4 (BioLegend 309809), H4-1BB-M127 (BD Pharmingen 552532), BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX), 145501 (Leinco Technologies B591), ATCC 번호 HB-11248로 기탁되고 미국 특허 제6,974,863, 5F4 (BioLegend 31 1503), C65-485 (BD Pharmingen 559446)에 기재된 세포주에 의해 생성된 항체, 미국 특허출원공개 US 2005/0095244호에 개시된 항체, 미국 특허 제7,288,638호에 개시된 항체 (예컨대 20H4.9-IgGl (BMS-663031)), 미국 특허 제6,887,673호에 개시된 항체 (예컨대 4E9 또는 BMS-554271), 미국 특허 제7,214,493호에 개시된 항체, 미국 특허 제6,303,121호에 개시된 항체, 미국 특허 제6,569,997호에 개시된 항체, 미국 특허 제6,905,685호에 개시된 항체 (예컨대 4E9 또는 BMS-554271), 미국 특허 제6,362,325호에 개시된 항체 (예컨대 1D8 또는 BMS-469492; 3H3 또는 BMS-469497; 또는 3El), 미국 특허 제6,974,863호에 개시된 항체 (예컨대 53A2); 미국 특허 제6,210,669호에 개시된 항체 (예컨대 1D8, 3B8, 또는 3El), 미국 특허 제5,928,893호에 기재된 항체, 미국 특허 제6,303,121호에 개시된 항체, 미국 특허 제6,569,997호에 개시된 항체, 국제공개 WO 2012/177788호, WO 2015/119923호, 및 WO 2010/042433호에 개시된 항체, 및 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 또는 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각의 전술한 특허 또는 특허 출원 공개의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 국제공개 WO 2008/025516 A1호, WO 2009/007120 A1호, WO 2010/003766 A1호, WO 2010/010051 A1호, 및 WO 2010/078966 A1; 미국 특허출원공개 US 2011/0027218 A1호, US 2015/0126709 A1호, US 2011/0111494 A1호, US 2015/0110734 A1호, 및 US 2015/0126710 A1호; 및 미국 특허 제9,359,420호, 제9,340,599호, 제8,921,519호, 및 제8,450,460호에 기재된 4-1BB 작용적 융합 단백질이고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 구조 I-A (C-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질) 또는 구조 I-B (N-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질)에 도시된 바와 같은 4-1BB 작용적 융합 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 또는 바이오시밀러이다 (도 50 참조). 구조 I-A 및 I-B에서, 실린더(cylinder)는 개별 폴리펩티드 결합 도메인을 지칭한다. 구조 I-A 및 I-B는 예를 들어, 4-1BBL로부터 유래된 3개의 선형-연결된 TNFRSF 결합 도메인, 또는 4-1BB에 결합하는 항체를 포함하고, 이는 폴딩되어 3가 단백질을 형성하고, 이어서 IgG1-Fc를 통해 제2 3가 단백질에 연결되고 (CH3 및 CH2 도메인을 포함함), 이어서 3가 단백질 중 2개를 설파이드 결합 (작은 신장된 계란형)을 통해 함께 연결하는데 사용되어, 구조를 안정화시키고, 6개의 수용체의 세포내 신호전달 도메인 및 신호전달 단백질을 합쳐서 신호전달 복합체를 형성할 수 있는 효능제를 제공한다. 실린더로 표시된 TNFRSF 결합 도메인은 예를 들어, 가요성을 위한 Gly 및 Ser 서열과 친수성 잔기뿐만 아니라 용해도를 위한 Glu 및 Lys를 포함할 수 있는 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함하는 scFv 도메인일 수 있다. 임의의 scFv 도메인 디자인은 문헌[de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44]; 문헌[Ahmad, 등, Clin. & Dev. Immunol. 2012, 980250]; 문헌[Monnier, 등, Antibodies, 2013, 2, 193-208]; 또는 본원의 다른 곳에 포함된 참조문헌에 기재된 것과 같이 사용될 수 있다. 이러한 형태의 융합 단백질 구조는 미국 특허 제9,359,420호, 제9,340,599호, 제8,921,519호, 및 제8,450,460호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
구조 I-A의 다른 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 GG에 주어진다. Fc 도메인은 바람직하게는 완전 불변 도메인 (서열번호:31의 아미노산 17-230), 완전 힌지 도메인 (서열번호:31의 아미노산 1-16) 또는 힌지 도메인의 일부 (예를 들어, 서열번호:31의 아미노산 4-16)를 포함한다. C-말단 Fc-항체를 연결하기 위한 바람직한 링커는 추가의 폴리펩티드의 융합에 적합한 링커를 포함하여 서열번호:32 내지 서열번호:41에 주어진 실시형태로부터 선택될 수 있다.
Figure pct00011
구조 I-B의 다른 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 HH에 주어진다. Fc 항체 단편이 구조 I-B에서와 같이 TNRFSF 융합 단백질의 N-말단에 융합되는 경우, Fc 모듈의 서열은 바람직하게는 서열번호:42에 제시된 것이고, 링커 서열은 바람직하게는 서열번호:43 내지 서열번호:45에 제시된 실시형태로부터 선택된다.
Figure pct00012
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 유토밀루맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 우렐루맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 유토밀루맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 표 GG에 기재된 가변 중쇄 및 가변 경쇄로부터 선택된 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 전술한 가변 중쇄와 가변 경쇄의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인, 및 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 및 바이오시밀러를 포함한다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 4-1BBL 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 서열번호:46에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 가용성 4-1BBL 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 서열번호:47에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함, 이들 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 표 11에 주어진 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다.
Figure pct00013
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 (i) 제1 가용성 4-1BB 결합 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 4-1BB 결합 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, N-말단 및/또는 C-말단에서 추가의 도메인을 추가로 포함하는 4-1BB 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 추가의 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 (i) 제1 가용성 4-1BB 결합 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 4-1BB 결합 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, 추가로 N-말단 및/또는 C-말단에서 추가의 도메인을 포함하는 4-1BB 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 추가의 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이고, 각각의 가용성 4-1BB 도메인은 줄기 영역(삼량체화에 기여하고 세포막에 일정한 거리를 제공하지만 4-1BB 결합 도메인의 일부가 아님)이 결여되고 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3 내지 8개의 아미노산의 길이를 갖는다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 (i) 제1 가용성 종양 괴사 인자 (TNF) 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인을 포함하는 4-1BB 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 각각의 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 줄기 영역이 결여되어 있고 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3 내지 8개의 아미노산의 길이를 가지며, 그리고 각각의 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 4-1BB 결합 도메인이다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 전술한 VL 도메인 중 임의의 것에 연결된 전술한 VH 도메인의 임의의 것을 포함하는 4-1BB 작용적 scFv 항체이다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 BPS Bioscience로부터 상업적으로 입수가능한 BPS Bioscience 4-1BB 효능제 항체 카탈로그 번호 79097-2이다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 미국 뉴욕주 셜리 소재의 Creative Biolabs로부터 상업적으로 입수가능한 Creative Biolabs 4-1BB 효능제 항체 카탈로그 번호 MOM-18179이다.
3. OX40 (CD134) 효능제
일 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 OX40 (CD134) 효능제이다. OX40 효능제는 당업계에서 알려진 임의의 OX40 결합 분자일 수 있다. OX40 결합 분자는 인간 또는 포유류 OX40에 결합할 수 있는 단클론성 항체 또는 융합 단백질일 수 있다. OX40 효능제 또는 OX40 결합 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 아이소타입 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 중쇄를 포함할 수 있다. OX40 효능제 또는 OX40 결합 분자는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 가질 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 결합 분자는 또한 항체 (전장 항체 포함), 단클론성 항체 (전장 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 인간, 인간화된 또는 키메라 항체, 및 항체 단편, 예를 들어, Fab 단편, F(ab′) 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편, 및 조작된 형태의 항체, 예를 들어, OX40에 결합하는 scFv 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 완전 인간 항체 인 항원 결합 단백질이다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 인간화된 항체인 항원 결합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 현재 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 OX40 효능제는 항-OX40 항체, 인간 항-OX40 항체, 마우스 항-OX40 항체, 포유류 항-OX40 항체, 단클론성 항-OX40 항체, 다클론성 항-OX40 항체, 키메라 항-OX40 항체, 항-OX40 아드넥틴, 항-OX40 도메인 항체, 단일 사슬 항-OX40 단편, 중쇄 항-OX40 단편, 경쇄 항-OX40 단편, 항-OX40 융합 단백질, 및 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 또는 바이오시밀러를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, OX40 효능제는 작용적, 항-OX40 인간화된 또는 완전 인간 단클론성 항체 (즉, 단세포주에서 유래된 항체)이다.
바람직한 실시형태에서, OX40 효능제 또는 OX40 결합 분자는 융합 단백질일 수 있다. OX40L에 융합된 Fc 도메인을 포함하는 OX40 융합 단백질은 예를 들어, 문헌[Sadun, 등, J. Immunother. 2009, 182, 1481-89]에 기재되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 다량체 OX40 효능제, 예컨대 (3개 또는 6개의 리간드 결합 도메인을 갖는) 삼량체 또는 육량체 OX40 효능제는, 전형적으로 2개의 리간드 결합 도메인을 보유하는 작용적 단클론성 항체와 비교하여 우수한 수용체 (OX40L) 클러스터링 및 내부 세포 신호전달 착물 형성을 유도할 수 있다. 3개의 TNFRSF 결합 도메인 및 IgG1-Fc를 포함하고 선택적으로 이들 융합 단백질 중 2종 이상을 추가로 연결하는 삼량체 (3가) 또는 육량체 (또는 6가) 또는 그 초과의 융합 단백질은 예를 들어, 문헌[Gieffers, 등, Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47]에 기재되어 있다.
작용적 OX40 항체 및 융합 단백질은 강한 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 문헌[Curti, 등, Cancer Res. 2013, 73, 7189-98]. 바람직한 실시형태에서, OX40 효능제는 독성을 감소시키는 데 충분한 방식으로 OX40 항원에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체-의존적 세포 독성 (ADCC), 예를 들어, NK 세포 세포독성을 제거하는 작용적 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체-의존적 세포 포식작용 (ADCP)을 제거하는 작용적 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 제거하는 작용적 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 Fc 영역 작용성을 제거하는 작용적 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다.
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 고친화도 및 작용적 활성으로 인간 OX40 (서열번호:54)에 결합하는 것을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 인간 OX40 (서열번호:54)에 결합하는 결합 분자이다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 쥣과 OX40 (서열번호:55)에 결합하는 결합 분자이다. OX40 효능제 또는 결합 분자가 결합하는 OX40 항원의 아미노산 서열은 표 12에 요약된다.
Figure pct00014
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 100 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 90 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 80 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 70 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 60 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 50 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 40 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 또는 약 30 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 8 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 8.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 9 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 9.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 또는 약 1 × 106 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.1 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.4 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.5 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.6 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하거나 또는 약 2.7 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.8 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.9 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하거나, 또는 약 3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 10 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 9 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 8 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 7 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 6 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 5 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 4 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 3 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하거나, 또는 약 1 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 MEDI0562 또는 MEDI-0562로도 알려져 있는 타볼릭시주맙이다. 타볼릭시주맙은 AstraZeneca, Inc의 MedImmune 자회사로부터 입수 가능하다. 타볼릭시주맙은 면역글로불린 G1-카파, 항-[호모사피엔스 TNFRSF4 (종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 슈퍼패밀리 멤버 4, OX40, CD134)], 키메라 단클론성 항체이다. 타볼릭시주맙의 아미노산 서열은 표 KK에 제시된다. 타볼릭시주맙은 푸코실화된 복합체 바이-안테너리 CHO-유형 글리칸과 함께 위치 301 및 301''에서 N-글리코실화 부위; 위치 22-95 (VH-VL), 148-204 (CH1-CL), 265-325 (CH2)에서 및 371-429 (CH3) (그리고 위치 22''-95'', 148''-204'', 265''-325'', 및 371''-429''에서) 중쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; 위치 23'-88' (VH-VL) 및 134'-194' (CH1-CL)에서 (그리고 위치 23'''-88''' 및 134'''-194'''에서) 경쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; 위치 230-230'' 및 233-233''에서 사슬간 중쇄-중쇄 디설파이드 브릿지; 및 224-214' 및 224''-214'''에서 사슬간 중쇄-경쇄 디설파이드 브릿지를 포함한다. 다양한 고형 종양 징후에서 타볼릭시주맙의 현재 임상 시험은 미국 국립 보건원 clinicaltrials.gov 식별자 NCT02318394 및 NCT02705482를 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:56로 제시된 중쇄 및 서열번호:57로 제시된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 콘주게이트를 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 타볼릭시주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:58에 제시된 서열을 포함하고, OX40 효능제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:59에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 항체를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:60, 서열번호:61, 및 서열번호:62 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:63, 서열번호:64, 및 서열번호:65 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 타볼릭시주맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 OX40 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 OX40 효능제 항체이고, OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다.
Figure pct00015
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 11D4이고, 이는 Pfizer, Inc.에서 입수가능한 완전 인간 항체이다. 11D4의 제조 및 특성은 미국 특허 제7,960,515호; 제8,236,930호; 및 제9,028,824호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 11D4의의 아미노산 서열은 표 LL에 제시된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:66로 제시된 중쇄 및 서열번호:67로 제시된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 콘주게이트를 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 11D4의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:68에 제시된 서열을 포함하고, OX40 효능제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:69에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:70, 서열번호:71, 및 서열번호:72 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:73, 서열번호:74, 및 서열번호:75 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 11D4와 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 OX40 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 OX40 효능제 항체이고, 상기 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다.
Figure pct00016
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 18D8이고, 이는 Pfizer, Inc.에서 입수가능한 완전 인간 항체이다. 18D8의 제조 및 특성은 미국 특허 제7,960,515호; 제8,236,930호; 및 제9,028,824호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 18D8의 아미노산 서열은 표 MM에 제시된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:76로 제시된 중쇄 및 서열번호:77로 제시된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 콘주게이트를 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 18D8의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:78에 제시된 서열을 포함하고, OX40 효능제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:79에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:80, 서열번호:81, 및 서열번호:82 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:83, 서열번호:84, 및 서열번호:85 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 18D8과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 OX40 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 OX40 효능제 항체이고, 상기 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다.
Figure pct00017
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu119-122이고, 이는 GlaxoSmithKline plc.에서 입수가능한 인간화된 항체이다. Hu119-122의 제조 및 특성은 미국 특허 제9,006,399호 및 제9,163,085호, 및 국제공개 WO 2012/027328호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. Hu119-122의 아미노산 서열은 표 NN에 제시된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu119-122의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:86에 제시된 서열을 포함하고, OX40 효능제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:87에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:88, 서열번호:89, 및 서열번호:90 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:91, 서열번호:92, 및 서열번호:93 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu119-122와 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 OX40 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 OX40 효능제 항체이고, 상기 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다.
Figure pct00018
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu106-222이고, 이는 GlaxoSmithKline plc.에서 입수가능한 인간화된 항체이다. Hu106-222의 제조 및 특성은 미국 특허 제9,006,399호 및 제9,163,085호, 및 국제 특허 공개 WO 2012/027328호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. Hu106-222의 아미노산 서열은 표 OO에 제시된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu106-222의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역(VH)는 서열번호:94에 제시된 서열을 포함하고, OX40 효능제 경쇄 가변 영역(VL)는 서열번호:95에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:96, 서열번호:97, 및 서열번호:98 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:99, 서열번호:100, 및 서열번호:101 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu106-222와 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 OX40 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 OX40 효능제 항체이고, 상기 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다.
Figure pct00019
일부 실시형태에서, OX40 효능제 항체는 MEDI6469 (또한 9B12로 지칭됨)이다. MEDI6469는 쥣과 단클론성 항체이다. 문헌[Weinberg, 등, J. Immunother. 2006, 29, 575-585]. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 문헌[Weinberg, 등, J. Immunother. 2006, 29, 575-585]에 기재된 바와 같이 Biovest Inc. (미국 매사추세츠주 말베른 소재)에 기탁된 9B12 하이브리도마에 의해 생성된 항체이고, 그의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 일부 실시형태에서, 항체는 MEDI6469의 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 MEDI6469의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 L106 BD (Pharmingen Product #340420)이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체 L106 (BD Pharmingen Product #340420)의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체 L106 (BD Pharmingen Product #340420)의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 #20073)이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체 ACT35의 CDR (Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 #20073)를 포함한다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체 ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 #20073)의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 쥣과 단클론성 항체 항-mCD134/mOX40 (클론 OX86)이고, 이는 미국 뉴햄프셔 웨스트 레바논 소재의 InVivoMAb, BioXcell Inc.에서 상업적으로 입수가능하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 국제공개 WO 95/12673호, WO 95/21925호, WO 2006/121810호, WO 2012/027328호, WO 2013/028231호, WO 2013/038191호, 및 WO 2014/148895호; 유럽 특허 출원 EP 0672141호; 미국 특허출원공개 US 2010/136030호, US 2014/377284호, US 2015/190506호, 및 US 2015/132288호 (클론 20E5 및 12H3 포함); 및 미국 특허 제7,504,101호, 제7,550,140호, 제7,622,444호, 제7,696,175호, 제7,960,515호, 제7,961,515호, 제8,133,983호, 제9,006,399호, 및 제9,163,085호에 기재된 OX40 효능제로부터 선택되고, 상기 특허 각각의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 구조 I-A (C-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질) 또는 구조 I-B (N-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질)에 도시된 바와 같은 OX40 작용적 융합 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 또는 바이오시밀러이다. 구조 I-A 및 I-B의 특성은 상기 및 미국 특허 제9,359,420호, 제9,340,599호, 제8,921,519호, 및 제8,450,460호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 구조 I-A의 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 GG에 주어진다. Fc 도메인은 바람직하게는 완전 불변 도메인 (서열번호:31의 아미노산 17-230), 완전 힌지 도메인 (서열번호:31의 아미노산 1-16) 또는 힌지 도메인의 일부 (예를 들어, 서열번호:31의 아미노산 4-16)를 포함한다. C-말단 Fc-항체를 연결하기 위한 바람직한 링커는 추가의 폴리펩티드의 융합에 적합한 링커를 포함하여 서열번호:32 내지 서열번호:41에 주어진 실시형태로부터 선택될 수 있다. 마찬가지로, 구조 I-B의 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 HH에 주어진다. Fc 항체 단편이 구조 I-B에서와 같이 TNRFSF 융합 단백질의 N-말단에 융합되는 경우, Fc 모듈의 서열은 바람직하게는 서열번호:42에 제시된 것이고, 링커 서열은 바람직하게는 서열번호:43 내지 서열번호:45에 제시된 실시형태로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 타볼릭시주맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 11D4의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 18D8의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, Hu119-122의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, Hu106-222의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 표 OO에 기재된 가변 중쇄 및 가변 경쇄로부터 선택된 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 전술한 가변 중쇄와 가변 경쇄의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 OX40 결합 도메인, 및 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 및 바이오시밀러를 포함한다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 OX40L 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 서열번호:102에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 가용성 OX40L 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 서열번호:103에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 서열번호:104에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 표 18에 주어진 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다.
Figure pct00020
Figure pct00021
일 실시형태에서, OX40 효능제는 (i) 제1 가용성 OX40 결합 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 OX40 결합 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 OX40 결합 도메인을 포함하고, N-말단 및/또는 C-말단에서 추가의 도메인을 추가로 포함하는 OX40 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 추가의 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 (i) 제1 가용성 OX40 결합 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 OX40 결합 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 OX40 결합 도메인을 포함하고, N-말단 및/또는 C-말단에서 추가의 도메인을 추가로 포함하는 OX40 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 추가 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이고, 여기서 가용성 OX40 결합 도메인 각각은 줄기 영역이 결여되어 있고 (이는 삼량체화에 기여하고 세포막에 특정 거리를 제공하지만, OX40 결합 도메인의 일부가 아님), 그리고 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3 내지 8개 아미노산의 길이를 갖는다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 (i) 제1 가용성 종양 괴사 인자 (TNF) 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인을 포함하는 OX40 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 각각의 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 줄기 영역이 결여되어 있고 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3 내지 8개의 아미노산의 길이를 가지며, 그리고 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 OX40 결합 도메인이다.
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 MEDI6383이다. MEDI6383은 OX40 작용적 융합 단백질이고 미국 특허 제6,312,700호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있고, 상기 특허의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 전술한 VL 도메인 중 임의의 것에 연결된 전술한 VH 도메인 중 임의의 것을 포함하는 OX40 작용적 scFv 항체이다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 Creative Biolabs OX40 효능제 단클론성 항체 MOM-18455이고, 이는 미국 뉴욕주 셜리 소재의 Creative Biolabs, Inc.로부터 상업적으로 입수가능하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 미국 뉴욕주 샌디에고 소재의 BioLegend, Inc.로부터 상업적으로 입수가능한 OX40 작용적 항체 클론 Ber-ACT35이다.
H. 선택적 세포 생존력 분석
선택적으로, 세포 생존력 검정은 당업계에서 알려진 표준 검정을 사용하여 제1 확장 (때때로 초기 벌크 확장으로 지칭됨) 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, 트립판 블루 제외 검정은 벌크 TIL의 샘플에 대해 수행될 수 있으며, 이는 선택적으로 죽은 세포를 표지하고 생존력 평가를 허용한다. 생존력을 시험하는데 사용하기 위한 다른 검정은 알라마르 블루 검정; 및 MTT 검정을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
1. 세포수, 생존력, 유세포측정
일부 실시형태에서, 세포수 및/또는 생존력이 측정된다. 마커, 예컨대 비제한적으로 CD3, CD4, CD8, 및 CD56, 뿐만 아니라 본원에 개시되거나 기재된 임의의 다른 것의 발현은 항체, 예를 들어, 비제한적으로 FACSCantoTM 유동 세포측정기 (BD Biosciences)를 사용하여 BD Bio-sciences (미국 캘리포니아주 산호세 소재의 BD Bioscience)로부터 시판되는 것을 사용한 유세포측정에 의해 측정될 수 있다. 세포는 일회용 c-칩 혈구계 (VWR, Batavia, IL)를 사용하여 수동으로 계수될 수 있고, 생존력은 트리판 블루 염색을 포함하나 이에 제한되지는 않는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 세포 생존력은 또한 USSN 15/863,634에 기초하여 분석될 수 있으며, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일부 경우에, 벌크 TIL 집단은 아래에 논의된 프로토콜을 사용하여 즉시 동결보존될 수 있다. 대안적으로, 벌크 TIL 집단은 REP를 거칠 수 있고 그 다음 아래에 논의된 바와 같이 동결보존된다. 유사하게, 유전적으로 변형된 TIL이 요법에 사용될 경우, 벌크 또는 REP TIL 집단은 적합한 치료를 위해 유전자 변형을 거칠 수 있다.
본 개시내용에 따르면, TIL을 생존력에 대해 검정하는 방법 및/또는 대상체에게의 투여에서의 추가의 용도가 제공된다. 일부 실시형태에서, 종양 침윤 림프구 (TIL)의 검정 방법은 하기를 포함한다:
(i) TIL의 제1 집단을 수득하는 단계;
(ii) IL-2 및 선택적으로 OKT-3을 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 생성하는 단계; 및
(iii) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여, TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 상기 TIL의 제3 집단은 그 수가 상기 TIL의 제2 집단보다 적어도 50-배 초과인 단계;
(iv) TIL의 제3 집단을 수확, 세정 및 동결보존하는 단계;
(v) 극저온 온도에서 동결보존된 TIL을 저장하는 단계;
(vi) 해동하는 TIL의 제3 집단을 해동하여 TIL의 해동된 제1 집단을 제공하는 단계; 및
(vii) 제3 집단의 세포 배양 배지를 IL-2, OKT-3 및 APC로 적어도 3일의 추가 확장 기간 (때때로 reREP 기간으로 지칭됨) 동안 보충함으로써 해동된 제3 TIL 집단의 일부의 추가 제2 확장을 수행하는 단계로서, 제3 확장은 TIL의 제4 집단을 수득하기 위해 수행되고, TIL의 제4 집단에서의 TIL 수는 TIL의 제3 집단에서의TIL 수와 비교되어 비를 수득하는 단계;
(viii) 단계 (vii)의 비율에 기초하여 해동된 TIL 집단이 환자에게 투여하기에 적합한 지를 결정하는 단계;
(ix) 단계 (viii)에서 제4 집단의 TIL의 수 대 제3 집단의TIL의 다수의 비가 5:1을 초과하는 것으로 결정될 때, 해동된 제3의 TIL을 환자에게 치료학적으로 유효한 투여량으로 투여하는 단계.
일부 실시형태에서, TIL은 단계 (vii) 후 생존력에 대해 검정된다.
본 개시내용은 또한 TIL을 검정하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, TIL을 검정하는 방법을 제공한다:
(i) 동결보존된 TIL의 제1 집단의 일부를 수득하는 단계;
(ii) 동결보존된 TIL의 제1 집단의 일부를 해동하는 단계;
(iii) TIL의 제1 집단의 일부를 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 세포 배양 배지에서 적어도 3일의 추가 확장 기간(때때로, reREP 기간으로 지칭됨) 동안 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 생성하는 단계로서, TIL의 제1 집단의 일부는 TIL의 제2 집단과 비교되어 TIL 수의 비를 수득하고, TIL의 제2 집단 중 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단의 일부 중 TIL의 수의 비가 5:1 초과인 단계;
(iv) 단계 (iii)에서의 비율에 기초하여, TIL의 제1 집단이 환자에게 치료적 투여에 사용하기에 적합한 지를 결정하는 단계;
(v) 단계 (iv)에서 TIL의 제2 집단 중 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단 중 TIL의 수의 비가 5:1 초과인 것으로 결정될 때, TIL의 제1 집단이 치료적 투여에 사용하기에 적합한 지를 결정하는 단계.
일부 실시형태에서, TIL의 제2 집단 중 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단의 부분 중 TIL의 수의 비는 50:1 초과이다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 본원에 제공된 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법에 따라 단계 (i)로부터의 동결보존된 TIL의 전체 제1 집단의 확장을 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 단계 (i)로부터의 동결보존된 TIL의 전체 제1 집단을 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
2. 세포 배양물
일 실시형태에서, 상기에 논의될 뿐만 아니라 도 1에 예시된 것을 포함하는 TIL을 확장시키는 방법은 약 5,000 mL 내지 약 25,000 mL의 세포 배지, 약 5,000 mL 내지 약 10,000 mL의 세포 배지, 또는 약 5,800 mL 내지 약 8,700 mL의 세포 배지를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지는 무혈청 배지이다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서의 배지는 무혈청이다. 일부 실시형태에서, 제2 확장에서의 배지는 무혈청이다. 일부 실시형태에서, 제1 확장 및 제2 확장에서 배지는 둘 다 무혈청이다. 일 실시형태에서, TIL의 수를 확장시키는 것은 단지 하나의 유형의 세포 배양 배지를 사용한다. 임의의 적합한 세포 배양 배지가 사용될 수 있고, 그 예는 AIM-V 세포 배지 (L-글루타민, 50 μM 스트렙토마이신 설페이트, 및 10 μM 겐타마이신 설페이트) 세포 배양 배지 (캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen)이다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 TIL의 수를 확장하는데 필요한 배지의 양 및 배지의 유형의 수를 유리하게 감소시킨다. 일 실시형태에서, TIL의 수를 확장하는 것은 3일 또는 4일마다보다 더 빈번하게 세포를 공급하는 것을 포함할 수 있다. 기체 투과성 용기 중의 세포들의 수를 확장시키는 것은 세포를 확장시키는데 필요한 공급 빈도를 감소시킴으로써 세포의 수를 확장하는 데 필요한 절차를 단순화시킨다.
일 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 중의 세포 배지는 여과되지 않는다. 여과되지 않은 세포 배지의 사용은 세포의 수를 확장하는데 필요한 절차를 단순화할 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 중의 세포 배지는 베타-머캅토에탄올(BME)이 결여된다.
일 실시형태에서, 방법의 지속기간은 상기 포유동물로부터 종양 조직 샘플을 수득하는 단계; 내부에 세포 배지를 함유하는 제1 기체 투과성 용기에서 상기 종양 조직 시료를 배양하는 단계; 상기 종양 조직에서 TIL을 수득하는 단계, 및 약 7 내지 14일, 예를 들어, 약 11일의 지속기간 동안 세포 배지를 함유하는 제2 기체 투과성 용기 내에서 TIL의 수를 확장하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서 프리-REP는 약 7 내지 14일, 예를 들어, 약 11일이다. 일부 실시형태에서, REP는 약 7 내지 14일, 예를 들어, 약 11일이다.
일 실시형태에서, TIL은 기체 투과성 용기에서 확장된다. 기체 투과성 용기는 미국 특허출원공개 2005/0106717 A1호에 기재된 것을 포함하는, 당업계에 공지된 방법, 조성물 및 장치를 사용하여 PBMC를 사용하여 TIL을 팽창시키기 위해 사용되어 왔으며, 상기 특허의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, TIL은 기체 투과성 백에서 확장된다. 일 실시형태에서, TIL은 기체 투과성 백, 예컨대 Xuri 세포 확장 시스템 W25 (GE Healthcare)에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템을 사용하여 확장된다. 일 실시형태에서, TIL은 투과성 백, 예컨대, Xuri 세포 확장 시스템 W5 (GE Healthcare)로도 알려져 있는 WAVE 생물반응기 시스템에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템을 사용하여 확장된다. 일 실시형태에서, 세포 확장 시스템은 약 100 mL, 약 200 mL, 약 300 mL, 약 400 mL, 약 500 mL, 약 600 mL, 약 700 mL, 약 800 mL, 약 900 mL, 약 1 L, 약 2 L, 약 3 L, 약 4 L, 약 5 L, 약 6 L, 약 7 L, 약 8 L, 약 9 L, 및 약 10 L로 이루어진 군으로부터 선택된 부피를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다.
일 실시형태에서, TIL은 G-Rex 플라스크 (Wilson Wolf Manufacturing로부터 상업적으로 입수가능함)에서 확장될 수 있다. 그와 같은 실시형태는 세포 집단이 약 5x105 세포/cm2에서 10x106 및 30x106 세포/cm2로 확장하는 것을 허용한다. 일 실시형태에서 이는 공급되지 않는다. 일 실시형태에서, 이는 배지가 G-Rex 플라스크에서 약 10 cm의 높이에 존재하는 한 공급되지 않는다. 일 실시형태에서 이는 공급하지 않고 하나 이상의 시토카인을 추가한다. 일 실시형태에서, 사이토카인은 사이토카인을 배지와 혼합할 필요 없이 볼러스로서 첨가될 수 있다. 그와 같은 용기, 디바이스, 및 방법은 당해 기술에 알려져 있고 TIL를 확장하는데 사용되어 왔고, 미국 특허출원공개 US 2014/0377739A1호, 국제공개 WO 2014/210036 A1호, 미국 특허 출원 공개us 2013/0115617 A1호, 국제공개 WO 2013/188427 A1호, 미국 특허출원공개 US 2011/0136228 A1호, 미국 특허 US 8,809,050 B2호, 국제공개 WO 2011/072088 A2호, 미국 특허출원공개 US 2016/0208216 A1호, 미국 특허출원공개 US 2012/0244133 A1호, 국제공개 WO 2012/129201 A1호, 미국 특허출원공개 US 2013/0102075 A1호, 미국 특허 US 8,956,860 B2호, 국제공개 WO 2013/173835 A1호, 미국 특허출원공개 US 2015/0175966 A1호에 기재된 것을 포함하고, 이들의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 그와 같은 공정은 또한 문헌[Jin 등, J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292]에 기재되어 있다.
I. TIL의 선택적 유전공학
일부 실시형태에서, TIL은 고친화도 T 세포 수용체(TCR), 예를 들어, MAGE-1, HER2, 또는 NY-ESO-1과 같은 종양-관련 항원을 표적으로 하는 TCR, 또는 종양-연관 세포 표면 분자(예를 들어, 메소텔린) 또는 계통-제한 세포 표면 분자(예를 들어, CD19)에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 기능성을 포함하도록 선택적으로 유전적으로 조작된다.
J. TIL의 선택적 동결보존
상기 논의되고, 도 1에 제공된 바와 같은 단계 A 내지 E에서 예시된 바와 같이, 동결보존은 TIL 확장 공정에 걸쳐 수많은 지점에서 일어날 수 있다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 도 1의 단계 D에 따라 제공된 바와 같은) 제2 확장 후 TIL의 확장된 집단은 동결보존될 수 있다. 동결보존 일반적으로 TIL 집단을 냉동 용액, 예를 들어, 85% 보체 불활성화된 AB 혈청 및 15% 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 배치함으로써 달성될 수 있다. 용액 중의 세포는 극저온 바이알에 배치되고 -80℃에서 24시간 동안 저장되고, 동결보존을 위해 기체 질소 냉동고로 선택적으로 이동된다. 문헌[Sadeghi, 등, Acta Oncologica 2013, 52, 978-986]을 참조한다. 일부 실시형태에서, TIL은 5% DMSO에서 동결보존된다. 일부 실시형태에서, TIL은 세포 배양 배지 플러스 5% DMSO에서 동결보존된다. 일부 실시형태에서, TIL은 실시예 F 및 G에 제공된 방법에 따라 동결보존된다.
적절할 때, 세포는 냉동고에서 제거되고 용액의 대략 4/5가 해동될 때까지 37℃ 수조에서 해동된다. 세포는 일반적으로 완전 배지에 재현탁되고 선택적으로 1회 이상 세정된다. 일부 실시형태에서, 해동된 TIL은 당해 기술에 알려져 있는 바와 같이 생존력에 대해 계수되고 평가될 수 있다.
K. TIL 제조를 위한 폐쇄 시스템
본 발명은 TIL 배양 공정 동안 폐쇄 시스템의 사용을 제공한다. 이러한 폐쇄 시스템은 미생물 오염을 방지 및/또는 감소시키고, 더 적은 플라스크의 사용을 허용하고, 비용 감소를 허용한다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 2개의 용기를 사용한다.
이러한 폐쇄 시스템은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm 및 https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm에서 발견될 수 있다.
멸균 연결 장치(STCD)는 2개의 호환가능한 튜빙 사이에 멸균 용접을 생성한다. 이러한 절차는 다양한 용기 및 튜브 직경의 멸균 연결을 허용한다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 예를 들어 실시예 G에 기재된 바와 같은 루어 로크 및 열 밀봉 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 시스템의 멸균 및 폐쇄 특성을 유지하기 위해 멸균 조건 하에서 주사기를 통해 접근된다. 일부 실시형태에서, 실시예 G에 기재된 바와 같은 폐쇄 시스템이 사용된다. 일부 실시형태에서, TIL은 실시예 G, 섹션 "최종 제형 및 필(fill)"에 기재된 방법에 따라 최종 생성물 제형 용기로 제형화한다.
일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 TIL이 환자에게 투여 또는 동결보존을 위해 준비될 때까지 종양 단편이 얻어지는 시간으로부터 하나의 용기를 사용한다. 일부 실시형태에서 2개의 용기가 사용되는 경우, 제1 용기는 폐쇄된 G-용기이고, TIL의 집단은 원심분리되고 제1 폐쇄 G- 용기를 개방하지 않고 주입 백으로 이송된다. 일부 실시형태에서, 2개의 용기가 사용되는 경우, 주입 백은 HypoThermosol-함유 주입 백이다. 폐쇄 시스템 또는 폐쇄 TIL 세포 배양 시스템은, 일단 종양 샘플 및/또는 종양 단편이 첨가되면, 시스템이 외부로부터 단단히 밀봉되어 박테리아, 진균, 또는 임의의 다른 미생물 오염의 침입이 없는 폐쇄 환경을 형성하는 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5% 내지 약 100%이다. 일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5% 내지 약 95%이다. 일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5% 내지 약 90%이다. 일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 10% 내지 약 90%이다. 일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 15% 내지 약 85%이다. 일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%이다.
폐쇄 시스템은 미생물 오염의 부재 및/또는 상당한 감소와 함께 TIL 성장을 허용한다.
또한, TIL 세포 배양 환경의 pH, 이산화탄소 분압 및 산소 분압은 세포가 배양됨에 따라 각각 변화한다. 결과적으로, 세포 배양에 적합한 배지가 순환되더라도, 폐쇄 환경은 TIL 증식을 위한 최적의 환경으로서 계속 유지될 필요가 있다. 이를 위해, 폐쇄 환경의 배양액 내의 pH, 이산화탄소 분압 및 산소 분압의 물리적 인자가 센서에 의해 모니터링되고, 그 신호가 배양 환경의 입구에 설치된 기체 교환기를 제어하는 데 사용되고, 상기 폐쇄 환경의 기체 분압이 세포 배양 환경을 최적화하기 위해 배양액의 변화에 따라 실시간으로 조정되는 것이 바람직하다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 폐쇄 환경의 pH, 이산화탄소 분압 및 산소 분압을 측정하는 모니터링 장치가 구비된 기체 교환기를 폐쇄 환경의 입구에 통합하고, 모니터링 장치로부터의 신호에 기초하여 기체 농도를 자동으로 조정함으로써 세포 배양 환경을 최적화하는 폐쇄 세포 배양 시스템을 제공한다.
일부 실시형태에서, 폐쇄 환경 내의 압력은 연속적으로 또는 간헐적으로 제어된다. 즉, 폐쇄 환경에서의 압력은 예를 들어, 압력 유지 장치에 의해 변화될 수 있어서, 공간이 양압 상태에서 TIL의 성장에 적합한 것을 보장하거나, 음압 상태에서 유체의 삼출을 촉진하여 세포 증식을 촉진한다. 음압을 간헐적으로 적용함으로써, 폐쇄 환경의 부피에서의 일시적인 수축에 의해 폐쇄 환경에서 순환 액체를 균일하고 효율적으로 교체하는 것이 가능하다.
일부 실시형태에서, TIL의 증식을 위한 최적의 배양 성분이 치환 또는 첨가될 수 있고, IL-2 및/또는 OKT3과 같은 인자뿐만 아니라 조합이 첨가될 수 있다.
L. TIL의 선택적 동결보존
벌크 TIL 집단 또는 TIL의 확장된 집단은 선택적으로 동결보존될 수 있다. 일부 실시형태에서, 동결보존은 치료적 TIL 집단 상에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 동결보존은 제2 확장 후에 수확된 TIL 상에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 동결보존은 도 1의 예시적인 단계 F에서 TIL 상에서 일어난다. 일부 실시형태에서, TIL은 주입 백에서 동결보존된다. 일부 실시형태에서, TIL은 주입 백에 배치하기 전에 동결보존된다. 일부 실시형태에서, TIL은 동결보존되고 주입 백에 배치되지 않는다. 일부 실시형태에서, 동결보존은 동결보존 배지를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 동결보존 배지는 디메틸설폭사이드 (DMSO)를 함유한다. 이는 일반적으로 TIL 집단을 냉동 용액, 예를 들어, 85% 보체 불활성화된 AB 혈청 및 15% 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 넣음으로써 달성된다. 용액 중의 세포는 극저온 바이알에 배치되고 -80℃에서 24시간 동안 저장되고, 동결보존을 위해 기체 질소 냉동고로 선택적으로 이동된다. 문헌[Sadeghi, 등, Acta Oncologica 2013, 52, 978-986]을 참조한다.
적절할 때, 세포는 냉동고에서 제거되고 용액의 대략 4/5가 해동될 때까지 37℃ 수조에서 해동된다. 세포는 일반적으로 완전 배지에 재현탁되고 선택적으로 1회 이상 세정된다. 일부 실시형태에서, 해동된 TIL은 당해 기술에 알려져 있는 바와 같이 생존력에 대해 계수되고 평가될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, TIL의 집단은 CS10 동결보존 배지 (CryoStor 10, BioLife Solutions)를 사용하여 동결보존된다. 바람직한 실시형태에서, TIL의 집단은 디메틸설폭사이드 (DMSO)를 함유하는 동결보존 배지를 사용하여 동결보존된다. 바람직한 실시형태에서, TIL의 집단은 CS10 및 세포 배양 배지의 1:1 (vol:vol) 비를 사용하여 동결보존된다. 바람직한 실시형태에서, TIL의 집단은 추가의 IL-2을 추가로 포함하는 CS10 및 세포 배양 배지의 약 1:1 (vol:vol) 비를 사용하여 동결보존된다.
단계 A 내지 E에서 전술한 바와 같이, 동결보존은 TIL 확장 공정에 걸쳐 수많은 지점에서 일어날 수 있다. 단계 B에 따른 제1 확장 후의 벌크 TIL 집단 또는 단계 D에 따른 하나 이상의 제2 확장 후의 TIL의 확장된 집단은 동결보존될 수 있다. 동결보존 일반적으로 TIL 집단을 냉동 용액, 예를 들어, 85% 보체 불활성화된 AB 혈청 및 15% 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 배치함으로써 달성될 수 있다. 용액 중의 세포는 극저온 바이알에 배치되고 -80℃에서 24시간 동안 저장되고, 동결보존을 위해 기체 질소 냉동고로 선택적으로 이동된다. 문헌[Sadeghi, 등, Acta Oncologica 2013, 52, 978-986]을 참조한다.
적절할 때, 세포는 냉동고에서 제거되고 용액의 대략 4/5가 해동될 때까지 37℃ 수조에서 해동된다. 세포는 일반적으로 완전 배지에 재현탁되고 선택적으로 1회 이상 세정된다. 일부 실시형태에서, 해동된 TIL은 당해 기술에 알려져 있는 바와 같이 생존력에 대해 계수되고 평가될 수 있다.
일부 경우에, 단계 B TIL 집단은 아래에 논의된 프로토콜을 사용하여 즉시 동결보존될 수 있다. 대안적으로, 벌크 TIL 집단은 단계 C 및 단계 D를 거칠 수 있고 그 다음 단계 D 후에 동결보존될 수 있다. 유사하게, 유전적으로 변형된 TIL이 요법에 사용될 경우, 단계 B 또는 단계 D TIL 집단은 적합한 치료를 위해 유전자 변형을 거칠 수 있다.
IV. TIL 제조 공정 (한정 배지를 선택적으로 포함하는 GEN3 공정의 실시형태)
임의의 특정 이론에 제한됨이 없이, 본 발명의 방법에 기재된 바와 같이 T 세포의 활성화를 프라이밍하는 프라이밍 제1 확장에 이어서 T 세포의 활성을 촉진하는 급속 제2 확장은 "젊은(younger)" 표현형을 보유하는 확장된 T 세포의 제조를 가능하게 하는 것으로 여겨지고, 따라서 본 발명의 확장된T 세포는 다른 방법에 의해 확장되는 T 세포보다 암 세포에 대해 더 큰 세포독성을 나타낼 것으로 예상된다. 특히, 본 발명의 방법에 의해 교시된 바와 같이, 항-CD3 항체 (예를 들어, OKT-3), IL-2 및 임의로 항원-제시 세포 (APC)에 대한 노출에 의해 프라이밍되고, 이어서 추가의 항- CD-3 항체 (예를 들어, OKT-3), IL-2, 및 APC에 대한 후속 노출에 의해서 부스팅되는 T 세포의 활성화는 배양에서 T 세포의 성숙을 제한하거나 회피하여, 덜 성숙한 표현형을 갖는 T 세포의 집단을 생성하고, T 세포는 배양에서 증식에 의해 덜 고갈되고 암 세포에 대해 더 큰 세포독성을 나타내는 것으로 여겨진다. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (a) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 T 세포를 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 약 4 내지 7일의 기간 동안 소규모 배양물의 T 세포를 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기로부터 더 큰 제2 용기로 이동시키고, 제2 용기에서 대규모 배양물에서 소규모 배양물로부터의 T 세포를 배양하는 단계. 일부 실시형태에서, 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (a) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 제1 소규모 배양물에서 T 세포를 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 제1 소규모 배양물로부터의 T 세포를 제1 용기의 크기와 동일한 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 그와 같은 제2 용기로 이동된 제1 소규모 배양물로부터의 T 세포는 약 4 내지 7일의 기간 동안 제2 소규모 배양물에서 배양되는, 단계. 일부 실시형태에서, 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (a) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 T 세포를 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 소규모 배양물로부터의 T 세포를 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기보다 크기가 더 큰 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 그와 같은 제2 용기로 이동된 소규모 배양물로부터의 T 세포의 부분은 약 4 내지 7일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계. 일부 실시형태에서, 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (a) 약 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 T 세포를 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 소규모 배양물로부터의 T 세포를 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기보다 크기가 더 큰 2, 3 또는 4개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 그와 같은 제2 용기로 이동된 소규모 배양물로부터의 T 세포의 부분은 약 5 일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계.
일부 실시형태에서, 급속 제2 확장이 프라이밍 제1 확장에 의해 영향을 받는 T 세포의 활성화가 감소, 약화, 붕괴 또는 진정되기 시작한 후에 수행된다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에 의해 영향받은 T 세포의 활성화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 또는 그 근처까지 줄어든 후에 급속 제2 확장이 수행된다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에 의해 영향받은 T 세포의 활성화가 1% 내지 100% 또는 그 근처의 범위로 백분율에 의해 줄어든 후에 급속 제2 확장이 수행된다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에 의해 영향받은 T 세포의 활성화가 1% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90%, 또는 90% 내지 100% 또는 그 근처까지 줄어든 후에 급속 제2 확장이 수행된다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에 의해 영향받은 T 세포의 활성화가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 또는 그 근처까지 줄어든 후에 급속 제2 확장이 수행된다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에 의해 영향받은 T 세포의 활성화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 또는 그 근처까지 줄어든 후에 급속 제2 확장이 수행된다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에 의해 영향을 받는 T 세포의 활성화의 감소는 항원에 의한 자극에 반응하여 T 세포에 의해 방출되는 인터페론 감마의 양의 감소에 의해 결정된다.
일부 실시형태에서, T 세포의 프라이밍 제1 확장은 7일 또는 약 8일 또는 그 근처의 기간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, T 세포의 프라이밍 제1 확장은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 8일 또는 그 근처의 기간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, T 세포의 프라이밍 제1 확장은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 8 일의 기간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, T 세포의 급속 제2 확장은 11일 또는 그 근처의 기간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, T 세포의 급속 제2 확장은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 11일 또는 그 근처의 기간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, T 세포의 급속 제2 확장은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 11 일의 기간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, T 세포의 프라이밍 제1 확장은 1일 또는 그 근처 내지 7일 또는 그 근처의 기간 동안 수행되고 T 세포의 급속 제2 확장은 1일 또는 그 근처 내지 11일 또는 그 근처의 기간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, T 세포의 프라이밍 제1 확장은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 8일 또는 그 근처의 기간 동안 수행되고 T 세포의 급속 제2 확장은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 11일 또는 그 근처의 기간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, T 세포의 프라이밍 제1 확장은 1일 또는 그 근처 내지 8일 또는 그 근처의 기간 동안 수행되고 T 세포의 급속 제2 확장은 1일 또는 그 근처 내지 9일 또는 그 근처의 기간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, T 세포의 프라이밍 제1 확장은 8일의 기간 동안 수행되고 T 세포의 급속 제2 확장은 9 일의 기간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, T 세포의 프라이밍 제1 확장은 1일 또는 그 근처 내지 7일 또는 그 근처의 기간 동안 수행되고 T 세포의 급속 제2 확장은 1일 또는 그 근처 내지 9일 또는 그 근처의 기간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, T 세포의 프라이밍 제1 확장은 7일의 기간 동안 수행되고 T 세포의 급속 제2 확장은의 기간 동안 수행된다 9 일.
일부 실시형태에서, T 세포는 종양 침윤 림프구 (TIL)이다.
일부 실시형태에서, T 세포는 골수 침윤 림프구 (MIL)이다.
일부 실시형태에서, T 세포는 말초 혈액 림프구 (PBL)이다.
일부 실시형태에서, T 세포는 암으로 고통받는 공여체로부터 수득된다.
일부 실시형태에서, T 세포는 암으로 고통받는 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득된 TIL이다.
일부 실시형태에서, T 세포는 혈액성 악성종양으로 고통받는 환자의 골수로부터 수득된 MIL이다.
일부 실시형태에서, T 세포는 공여체의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 수득된 PBL이다. 일부 실시형태에서, 공여체는 암으로 고통받고 있다. 일부 실시형태에서, 암은 상기 암은 흑색종, 난소암, 자궁내막 암, 갑상선암, 자궁경부암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 야기된 암, 두경부 암 (두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 포함), 교모세포종 (GBM 포함), 위장암, 신장암, 및 신장 세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 암은 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 야기된 암, 두경부 암 (두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 포함), 교모세포종 (GBM 포함), 위장암, 신장암, 및 신장 세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 공여체는 종양으로 고통받고 있다. 일부 실시형태에서, 종양은 액체 종양이다. 일부 실시형태에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 실시형태에서, 공여체는 혈액성 악성종양으로 고통받고 있다.
본 개시내용의 특정 양태에서, 면역 효과기 세포, 예를 들어 T 세포는 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술, 예컨대 FICOLL 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 하나의 바람직한 측면에서, 개체의 순환 혈액으로부터 세포는 성분채집에 의해 수득된다. 성분채집 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵의 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 비롯하여 림프구를 함유한다. 일 양태에서, 성분채집에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고, 선택적으로 세포를 후속 처리 단계를 위한 적절한 완충액 또는 배지에 위치시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 세포는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 세척된다. 대안적인 실시형태에서, 세정액은 칼슘이 결여되고 마그네슘이 결여될 수 있거나 또는 모두가 2가 양이온이 아니면 많은 것이 결여될 수 있다. 일 양태에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써, 예를 들어 PERCOLL 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심분리 용리에 의해 말초 혈액 림프구로부터 단리된다.
일부 실시형태에서, T 세포는 전혈로부터 분리된 PBL 또는 공여체로부터의 림프구가 풍부한 성분채집 산물이다. 일부 실시형태에서, 공여체는 암으로 고통받고 있다. 일부 실시형태에서, 암은 상기 암은 흑색종, 난소암, 자궁내막 암, 갑상선암, 자궁경부암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 야기된 암, 두경부 암 (두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 포함), 교모세포종 (GBM 포함), 위장암, 신장암, 및 신장 세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 암은 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 야기된 암, 두경부 암 (두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 포함), 교모세포종 (GBM 포함), 위장암, 신장암, 및 신장 세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 공여체는 종양으로 고통받고 있다. 일부 실시형태에서, 종양은 액체 종양이다. 일부 실시형태에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 실시형태에서, 공여체는 혈액성 악성종양으로 고통받고 있다. 일부 실시형태에서, PBL은 양성 또는 음성 선택 방법, 즉 T 세포 표현형에 대한 마커(들), 예를 들어 CD3+ CD45+를 사용하여 PBL을 제거하거나, 비-T 세포 표현형 세포를 제거하여 PBL를 남기는 것에 의해 전혈 또는 림프구가 풍부한 성분채집 산물로부터 단리된다. 다른 실시형태에서, PBL는 구배 원심분리에 의해 단리된다. 공여체 조직으로부터 PBL의 단리 시, PBL의 프라이밍 1차 확장은 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법의 프라이밍 2차 확장 단계에 따라 프라이밍 제1 확장 배양물에서 적합한 수의 단리된 PBL들 (일부 실시양태에서, 대략 1×107 PBL)을 씨딩함으로써 개시될 수 있다.
이러한 특징들 중 일부를 포함하는 공정 3(본원에서 GEN3으로도 지칭됨)으로 알려진 예시적인 TIL 공정이 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시되어 있고, 공정 2A에 대한 본 발명의 이러한 실시형태의 이점 중 일부는 도 1, 2, 30, 및 31 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 기재되어 있다. 공정 3의 2개의 실시형태는 도 1 및 30 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시되어 있다. 공정 2A 또는 Gen 2는 또한 미국 특허 공개 제2018/0280436호에 기재되어 있고, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. Gen 3 공정은 또한 2018년 11월 5일자로 출원된 USSN 62/755,954 (116983-5045-PR)에 기재되어 있다.
본원에 논의되고 일반적으로 요약된 바와 같이, TIL은 환자 샘플로부터 취해지고, 본원에 기재되고 Gen 3으로 지칭되는 TIL 확장 공정을 사용하여 환자에게 이식하기 전에 그의 수를 확장하도록 조작된다. 일부 실시형태에서, TIL은 아래에 논의된 바와 같이 선택적으로 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL은 확장 전 또는 후에 동결보존될 수 있다. 일단 해동되면, 또한 환자에게 주입하기 전에 그것의 대사를 증가시키기 위해 재자극될 수 있다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (이하에 급속 확장 전 (프리-REP)으로 통칭되는 공정, 뿐만 아니라 단계 B로서 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 보여진 공정 포함)는 단축된 내지 1 내지 8 일 및 급속 제2 확장 (본원에서 급속 확장 프로토콜 (REP)로 지칭된 공정 뿐만 아니라 단계 D로서 도 1 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 보여진 공정 포함)는 실시예 및 도에서 뿐만 아니라 아래에 상세히 논의된 바와 같이 1 내지 9일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (이하에 급속 확장 전 (프리-REP)으로 통칭되는 공정, 뿐만 아니라 단계 B로서 도 1 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 보여진 공정 포함)는 단축된 내지 1 내지 8 일 및 급속 제2 확장 (본원에서 급속 확장 프로토콜 (REP)로 지칭된 공정 뿐만 아니라 단계 D로서 도 1 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 보여진 공정 포함)는 실시예 및 도에서 뿐만 아니라 아래에 상세히 논의된 바와 같이 1 내지 8일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (이하에 급속 확장 전 (프리-REP)으로 통칭되는 공정, 뿐만 아니라 단계 B로서 도 1 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 보여진 공정 포함)는 단축된 내지 1 내지 7일의 기간 동안 및 급속 제2 확장 (본원에서 급속 확장 프로토콜 (REP)로 지칭된 공정 뿐만 아니라 단계 D로서 도 1 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 보여진 공정 포함)는 실시예 및 도에서 뿐만 아니라 아래에 상세히 논의된 바와 같이 1 내지 9일로 단축된다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (이하에 급속 확장 전 (프리-REP)으로 통칭되는 공정, 뿐만 아니라 단계 B로서 도 1 (특히, 예를 들어, 도 1b 및/또는 도 8c)에 기재된 공정 포함)는 1 내지 7일의 기간 동안 및 급속 제2 확장 (본원에서 급속 확장 프로토콜 (REP)로 지칭된 공정뿐만 아니라 단계 D로서 도 1 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 보여진 공정 포함)는 실시예 및 도에서 뿐만 아니라 아래에 상세히 논의된 바와 같이 1 내지 10일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (예를 들어, 도 1 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에서 단계 B로서 기재된 확장)는 단축된 내지 8 일 및 급속 제2 확장 (예를 들어, 도 1 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에서 단계 D에 기재된 확장)는 7 내지 9일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (예를 들어, 도 1 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에서 단계 B로서 기재된 확장)는 8 일 및 급속 제2 확장 (예를 들어, 도 1 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에서 단계 D에 기재된 확장)는 8 내지 9일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (예를 들어, 도 1 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에서 단계 B로서 기재된 확장)는 단축된 내지 7일의 기간 동안 및 급속 제2 확장 (예를 들어, 도 1 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에서 단계 D에 기재된 확장)는 7 내지 8 일. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 기재된 바와 같은 확장)은 단축된 내지 8 일 및 급속 제2 확장 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 D에 기재된 바와 같은 확장)은 8 일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 기재된 바와 같은 확장)은 8 일 및 급속 제2 확장 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 D에 기재된 바와 같은 확장)은 9 일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 기재된 바와 같은 확장)은 8 일 및 급속 제2 확장 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 D에 기재된 바와 같은 확장)은 10 일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 기재된 바와 같은 확장)은 7 일 및 급속 제2 확장 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 D에 기재된 바와 같은 확장)은 7 내지 10일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 기재된 바와 같은 확장)은 7 일 및 급속 제2 확장 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 D에 기재된 바와 같은 확장)은 8 내지 10일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 기재된 바와 같은 확장)은 7 일 및 급속 제2 확장 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 D에 기재된 바와 같은 확장)은 9 내지 10일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 기재된 바와 같은 확장)은 단축된 내지 7일의 기간 동안 및 급속 제2 확장 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 D에 기재된 바와 같은 확장)은 7 내지 9일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장과 급속 제2 확장의 조합 (예를 들어, 도 1 (특히, 예를 들어, 도 1b 및/또는 도 8c)에서 단계 B 및 단계 D로서 기재된 확장)는 아래 및 실시예 및 도에 상세히 논의된 바와 같이 14-16일이다. 특히, 본 발명의 특정 실시형태는 TIL이 IL-2의 존재에서 항-CD3 항체, 예를 들어, OKT-3에의 노출에 의해 또는 적어도 IL-2 및 항-CD3 항체 예를 들어 OKT-3의 존재에서 항원에의 노출에 의해 활성화되는 프라이밍 제1 확장 단계를 포함하는 것으로 간주된다. 특정 실시형태에서, 기재된 바와 같은 프라이밍 제1 확장 단계에서 활성화되는 TIL은 TIL의 제1 집단, 즉 1차 세포 집단이다.
하기 "단계" 지정 A, B, C 등은 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 비제한적인 예를 참조하고, 본원에 기재된 특정 비제한적인 실시형태를 참조한다. 하기 및 도 8에서의 단계(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 순서는 예시적이고, 단계의 임의의 조합 또는 순서, 뿐만 아니라 추가의 단계, 단계의 반복, 그리고/또는 단계의 생략이 본 출원 및 본원에 개시된 방법에 의해 고려된다.
A. 단계 A: 환자 종양 샘플의 수득
일반적으로, TIL은 초기에 환자 종양 샘플 ("1차 TIL")로부터 또는 TIL-유사 특징을 갖는 말초 혈액 림프구를 비롯한 순환 림프구, 예컨대 말초 혈액 림프로부터 수득되고, 이어서 본원에 기재된 바와 같은 추가의 조작을 위해 더 큰 집단으로 증식되고, 임의로 동결보존되고, TIL 건강의 지표로서 표현형 및 대사 파라미터에 대해 임의로 평가된다.
환자 종양 샘플은 일반적으로 외과적 절제, 바늘 생검 또는 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 수득하기 위한 다른 수단을 통해 당해 분야에서 알려진 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 일반적으로, 종양 샘플은 원발성 종양, 침습성 종양 또는 전이성 종양을 비롯하여 임의의 고형 종양으로부터의 것일 수 있다. 종양 샘플은 또한 혈액학적 악성종양에서 수득한 종양과 같은 액체 종양일 수 있다. 고형 종양은 유방, 췌장, 전립선, 결장직장, 폐, 뇌, 신장, 위, 및 피부 (편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 및 흑색종을 비제한적으로 포함함)을 비제한적으로 포함하는 임의의 암 유형일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 자궁경부암, 두경부 암 (예를 들어, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 포함), 교모세포종 (GBM), 위장암, 난소암, 육종, 췌장 암, 방광암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 및 비-소세포 폐 암종으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 유용한 TIL은, 특히 높은 수준의 TIL을 갖는 것으로 보고된 바와 같이 악성 흑색종 종양으로부터 수득된다.
일단 수득되면, 종양 샘플은 일반적으로 날카로운 절개를 사용하여 1 내지 약 8 mm3의 작은 조각으로 단편화되고, 약 2-3 mm3이 특히 유용하다. TIL은 효소적 종양 분해물을 사용하여 이들 단편으로부터 배양된다. 이러한 종양 분해물은 효소적 배지 (예를 들어, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 완충액, 2 mM의 글루타메이트, 10 mcg/mL의 겐타마이신, 30 단위/mL의 DNase 및 1.0 mg/mL의 콜라겐분해효소)에서 인큐베이션에 의해, 그 다음 기계적 해리 (예를 들어, 조직 해리기 사용)에 의해 생성될 수 있다. 종양 분해물은 종양을 효소 배지에 넣고 종양을 대략 1분 동안 기계적으로 해리시킨 후, 37℃에서 5% CO2 중에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 기계적 해리의 반복 사이클 및 작은 조직 조각만이 존재할 때까지 상기 조건 하에서 인큐베이션함으로써 생성될 수 있다. 이 공정의 말기에, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 죽은 세포를 함유하는 경우, FICOLL 분지형 친수성 폴리사카라이드를 사용하여 밀도 구배 분리를 수행하여 이들 세포를 제거할 수 있다. 당해 분야에서 알려진 대안적인 방법이 사용될 수 있고, 그 예는 미국 특허출원공개 2012/0244133 A1호에 기재된 것이고, 상기 출원의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 전술한 방법 중 임의의 것은 TIL을 확장하는 방법 또는 암을 치료하는 방법을 위해 본원에 기재된 실시형태 중 임의의 것에 사용될 수 있다.
상기에서 명시된 바와 같이, 일부 실시형태에서, TIL은 고형 종양에서 유래된다. 일부 실시형태에서, 고형 종양은 단편화되지 않는다. 일부 실시형태에서, 고형 종양은 단편화되지 않고 전체의 종양으로 효소 분해를 거친다. 일부 실시형태에서, 종양은 콜라겐분해효소, DNase, 및 하이알로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 분해된다. 일부 실시형태에서, 종양은 1 내지 2 시간 동안 콜라겐분해효소, DNase, 및 하이알로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 분해된다. 일부 실시형태에서, 종양은 37℃, 5% CO2에서 1 내지 2 시간 동안 콜라겐분해효소, DNase, 및 하이알로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 분해된다. 일부 실시형태에서, 종양은 회전으로 37℃, 5% CO2에서 1 내지 2 시간 동안 콜라겐분해효소, DNase, 및 하이알로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 분해된다. 일부 실시형태에서, 종양은 일정한 회전으로 밤새 분해된다. 일부 실시형태에서, 종양은 일정한 회전으로 37℃, 5% CO2에서 밤새 분해된다. 일부 실시형태에서, 전체의 종양은 종양 분해 반응 혼합물을 형성하기 위해 효소와 조합된다.
일부 실시형태에서, 종양은 멸균 완충액에서 동결건조된 효소로 재구성된다. 일부 실시형태에서, 완충액은 멸균 HBSS이다.
일부 실시형태에서, 효소 혼합물은 콜라겐분해효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 콜라겐분해효소는 콜라겐분해효소 IV이다. 일부 실시형태에서, 콜라겐분해효소의 작업 스톡은 100 mg/ml의 10X 작업 스톡이다.
일부 실시형태에서, 효소 혼합물은 DNAse를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNAse의 작업 스톡은 10,000 IU/ml의 10X 작업 스톡이다.
일부 실시형태에서, 효소 혼합물은 하이알로니다제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이알로니다제의 작업 스톡은 10-mg/ml 10X 작업 스톡이다.
일부 실시형태에서, 효소 혼합물은 10 mg/ml의 콜라겐분해효소, 1000 IU/ml의 DNAse, 및 1 mg/ml의 하이알로니다제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 효소 혼합물은 10 mg/ml의 콜라겐분해효소, 500 IU/ml의 DNAse, 및 1 mg/ml의 하이알로니다제를 포함한다.
일반적으로, 종양에서 수득된 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새롭게 수득된" 또는 "새롭게 단리된" 세포 집단으로 불린다. 특정 실시형태에서, 새롭게 수득된 세포 TIL의 집단은 항원 제시 세포, IL-12 및 OKT-3을 포함하는 세포 배양 배지에 노출된다.
일부 실시형태에서, 단편화는 예를 들어, 절개뿐만 아니라 분해를 포함하는 물리적 단편화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단편화는 물리적 단편화이다. 일부 실시형태에서, 단편화는 절개이다. 일부 실시형태에서, 단편화는 분해에 의한 것이다. 일부 실시형태에서, TIL은 환자로부터 수득된 효소적 종양 분해물 및 종양 단편으로부터 초기에 배양될 수 있다. 일 실시형태에서, TIL은 환자로부터 수득된 효소적 종양 분해물 및 종양 단편으로부터 초기에 배양될 수 있다.
일부 실시형태에서, 종양이 고형 종양인 경우, 종양 샘플이, 예를 들어, (도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 바와 같은) 단계 A에서 수득된 후, 종양은 물리적 단편화를 거친다. 일부 실시형태에서, 단편화는 동결보존 전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 단편화는 동결보존 후에 일어난다. 일부 실시형태에서, 단편화는 종양을 수득한 후 그리고 임의의 동결보존의 부재에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 단편화 단계는 시험관내 또는 생체외 공정이다. 일부 실시형태에서, 종양은 단편화되고 10, 20, 30, 40 또는 그 초과 개의 단편 또는 조각은 프라이밍 제1 확장을 위해 각 용기에 배치된다. 일부 실시형태에서, 종양은 단편화되고 30 또는 40개의 단편 또는 조각은 프라이밍 제1 확장을 위해 각 용기에 배치된다. 일부 실시형태에서, 종양은 단편화되고 40개의 단편 또는 조각은 프라이밍 제1 확장을 위해 각 용기에 배치된다. 일부 실시형태에서, 다수의 단편은 약 4 내지 약 50 단편을 포함하고 각각의 단편은 약 27 mm3의 부피를 갖는다. 일부 실시형태에서, 다수의 단편은 약 1300 mm3 내지 약 1500 mm3의 총 부피를 갖는 약 30 내지 약 60 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 단편은 약 1350 mm3의 총 부피를 갖는 약 50 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 단편은 약 1 그램 내지 약 1.5 그램의 총 질량을 갖는 약 50 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 단편은 약 4 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, TIL은 종양 단편으로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 날카로운 절개에 의해 수득된다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 10 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 8 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 1 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 2 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 3 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 4 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 5 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 6 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 7 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 8 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 9 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 10 mm3이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 1-4 mm x 1-4 mm x 1-4 mm이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 1 mm x 1 mm x 1 mm이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 2 mm x 2 mm x 2 mm이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 3 mm x 3 mm x 3 mm이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 4 mm x 4 mm x 4 mm이다.
일부 실시형태에서, 종양은 각 조각의 출혈성, 괴저성, 및/또는 지방 조직의 양을 최소화하기 위해 단편화된다. 일부 실시형태에서, 종양은 각 조각의 출혈성 조직의 양을 최소화하기 위해 단편화된다. 일부 실시형태에서, 종양은 각 조각의 괴저성 조직의 양을 최소화하기 위해 단편화된다. 일부 실시형태에서, 종양은 각 조각의 지방 조직의 양을 최소화하기 위해 단편화된다. 특정 실시형태에서, 종양 단편화의 단계는 시험관내 또는 생체외 방법이다.
일부 실시형태에서, 종양 단편화는 종양 내부 구조를 유지하기 위해 수행된다. 일부 실시형태에서, 종양 단편화는 메스로 톱질 운동을 수행하지 않고 수행된다. 일부 실시형태에서, TIL은 종양 분해물로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 종양 분해물은 효소 배지, 예를 들어, 비제한적으로 RPMI 1640, 2 mM의 GlutaMAX, 10 mg/mL의 겐타마이신, 30 U/mL DNase, 및 1.0 mg/mL의 콜라겐분해효소, 이어서 기계적 해리 (GentleMACS, 캘리포니아주 아우번 소재의 Miltenyi Biotec)에서 인큐베이션에 의해 생성되었다. 종양을 효소 배지에 넣은 후, 대략 1 분 동안 종양을 기계적으로 해리할 수 있다. 그 다음, 용액을 5% CO2에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 대략 1분 동안 다시 기계적으로 파괴할 수 있다. 5% CO2에서 37℃에서 30분 동안 다시 인큐베이션한 후, 종양을 대략 1분 동안 세 번째로 기계적으로 파괴할 수 있다. 일부 실시형태에서, 큰 조직 조각이 존재하는 경우 세 번째 기계적 파괴 후, 5% CO2에서 37 ℃에서 추가 30분의 인큐베이션과 함께 또는 없이, 1번 또는 2번의 추가적 기계적 해리를 샘플에 적용하였다. 일부 실시형태에서, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 죽은 세포를 함유하는 경우 최종 인큐베이션의 종료 시에, 피콜을 사용한 밀도 구배 분리를 수행하여 이들 세포를 제거할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 단계 이전의 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새롭게 수득된" 또는 "새롭게 단리된" 세포 집단으로 지칭한다.
일부 실시형태에서, 세포는 샘플 단리 후 (예를 들어, 종양 샘플을 수득한 후 및/또는 종양 샘플로부터 세포 현탁액을 수득한 후) 선택적으로 냉동될 수 있고, 하기 더욱 상세하게 기재될 뿐만 아니라 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b)에 예시된 단계 B에 기재된 확장으로 진입하기 전에 냉동 저장될 수 있다.
1. 코어/작은 생검 유래된 TILS
일부 실시형태에서, TIL은 초기에 코어 생검 또는 유사한 절차에 의해 수득된 환자 종양 샘플 ("1차 TIL")로부터 수득한 다음 본원에 기재된 바와 같이 추가 조작을 위해 더 큰 집단으로 확장하고, 선택적으로 동결보존하고, 선택적으로 표현형 및 대사 파라미터에 대해 평가한다.
일부 실시형태에서, 환자 종양 샘플은 일반적으로 작은 생검, 코어 생검, 바늘 생검 또는 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 수득하기 위한 다른 수단을 통해 당해 기술에 알려진 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 일반적으로, 종양 샘플은 원발성 종양, 침습성 종양 또는 전이성 종양을 비롯하여 임의의 고형 종양으로부터의 것일 수 있다. 종양 샘플은 또한 혈액학적 악성종양에서 수득한 종양과 같은 액체 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 다수의 작은 종양 샘플 또는 생검에서 유래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 동일한 환자의 단일 종양으로부터의 다수의 종양 샘플을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 동일한 환자의 1, 2, 3 또는 4개의 종양으로부터의 다수의 종양 샘플을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 동일한 환자의 다수의 종양으로부터의 다수의 종양 샘플을 포함할 수 있다. 고형 종양은 폐 및/또는 비-소세포 폐 암종 (NSCLC)일 수 있다.
일반적으로, 종양 코어 또는 단편에서 수득한 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새롭게 수득된" 또는 "새롭게 단리된" 세포 집단이라고 한다. 특정 실시형태에서, 새롭게 수득된 TIL 세포 집단은 항원 제시 세포, IL-2 및 OKT-3을 포함하는 세포 배양 배지에 노출된다.
일부 실시형태에서, 종양이 전이되고, 원발 병변이 과거에 효율적으로 치료/제거된 경우, 전이성 병변 중 하나를 제거해야 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 최소 침습성 접근법은 가능한 경우 피부 병변 또는 목이나 겨드랑이 부위의 림프절을 제거하는 것이다. 일부 실시형태에서, 피부 병변이 제거되거나 그의 작은 생검이 제거된다. 일부 실시형태에서, 림프절 또는 그의 작은 생검이 제거된다. 일부 실시형태에서, 폐 또는 간 전이성 병변, 또는 복강내 또는 흉부 림프절 또는 그의 작은 생검이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 종양은 흑색종이다. 일부 실시형태에서, 흑색종에 대한 작은 생검은 몰(mole) 또는 그 일부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 작은 생검은 펀치 생검이다. 일부 실시형태에서, 펀치 생검은 피부에 원형 칼날을 눌러서 수득된다. 일부 실시형태에서, 펀치 생검은 의심스러운 몰 주변의 피부에 원형 칼날을 눌러서 수득된다. 일부 실시형태에서, 펀치 생검은 피부에 원형 칼날을 눌러서 수득되고, 피부의 둥근 조각이 제거된다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 펀치 생검이고, 종양의 둥근 부분이 제거된다.
일부 실시형태에서, 작은 생검은 절제 생검이다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 절제 생검이고, 전체 몰 또는 성장이 제거된다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 절제 생검이고, 정상으로 보이는 피부의 작은 경계와 함께 전체 몰 또는 성장이 제거된다.
일부 실시형태에서, 작은 생검은 절개 생검이다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 절개 생검이고, 몰 또는 성장의 가장 불규칙한 부분만을 취한다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 절개 생검이고, 절개 생검은 의심스러운 몰이 매우 큰 경우와 같이 다른 기술이 완전하지 않을 수 있을 때 사용된다.
일부 실시형태에서, 작은 생검은 폐 생검이다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 기관지내시경에 의해 수득된다. 일반적으로, 기관지내시경에서, 환자를 마취하고, 작은 도구가 코 또는 입, 목 아래를 거쳐 기관지 통로로 통과하는데, 여기서 작은 도구는 일부 조직을 제거하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 기관지내시경을 통해 종양 또는 성장에 도달할 수 없는 경우, 경흉부 바늘 생검을 사용할 수 있다. 일반적으로, 경흉부 바늘 생검의 경우, 환자는 또한 마취 상태에 있으며, 바늘을 피부를 통해 의심스러운 반점에 직접 삽입하여 작은 조직 샘플을 제거한다. 일부 실시형태에서, 경흉부 바늘 생검은 개입 방사선학 (예를 들어, 바늘을 가이드하기 위해 X-선 또는 CT 스캔 사용)을 필요로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 바늘 생검에 의해 수득된다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 내시경 초음파 (예를 들어, 조명이 있는 내시경을 입을 통해 식도로 삽입)에 의해 수득된다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 수술로 수득된다.
일부 실시형태에서, 작은 생검은 두경부 생검이다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 절개 생검이다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 절개 생검이며, 비정상적으로 보이는 영역에서 작은 조직 조각을 절단한다. 일부 실시형태에서, 비정상 영역에 쉽게 접근할 수 있는 경우, 입원 없이 샘플을 채취할 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양이 입 또는 목 안쪽 깊숙이 있으면, 수술실에서 전신 마취와 함께 생검을 실시해야 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 절제 생검이다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 전체 영역이 제거되는 절제 생검이다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 세침 흡인 (FNA)이다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 주사기에 부착된 매우 얇은 바늘을 사용하여 종양 또는 덩어리에서 세포를 추출 (흡인)하는 세침 흡인 (FNA)이다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 펀치 생검이다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 펀치 생검으로, 펀치 겸자는 의심스러운 영역의 조각을 제거하는 데 사용된다.
일부 실시형태에서, 작은 생검은 자궁경부 생검이다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 질경검사를 통해 수득된다. 일반적으로, 질경검사 방법은 확대 쌍안경 (질 확대경)에 부착된 조명 확대 기구를 사용하여 자궁경부 표면의 작은 섹션을 생검하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 원뿔절제/원추 생검이다. 일부 실시형태에서, 작은 생검은 원뿔절제/원추 생검으로, 자궁경부에서 더 큰 조직 조각을 제거하기 위해 외래환자 수술이 필요할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원추 생검은 진단을 확인하는 데 도움이 될 뿐만 아니라, 원추 생검을 초기 치료로 사용할 수 있다.
용어 "고형 종양"은 일반적으로 낭포 또는 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상적인 덩어리를 지칭한다. 고형 종양은 양성이거나 악성일 수 있다. 용어 "고형 종양 암은 악성, 신생물성, 또는 암성 고형 종양을 지칭한다. 고형 종양 암은 폐의 암을 포함한다. 일부 실시형태에서, 암은 비-소세포 폐 암종 (NSCLC)이다. 고형 종양의 조직 구조는 실질 (암 세포)을 포함하는 상호의존적인 조직 구획과 암 세포가 분산되어 있고 지원 미세환경을 제공할 수 있는 지지 기질 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양 유래 샘플은 미세 바늘 흡인물 (FNA), 코어 생검, 작은 생검 (예를 들어, 펀치 생검 포함)으로 수득된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 먼저 G-Rex 10에 배치된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 1 또는 2개의 코어 생검 및/또는 작은 생검 샘플이 있을 때 G-Rex 10에 먼저 배치된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 3, 4, 5, 6, 8, 9, 또는 10개 또는 그 초과의 코어 생검 및/또는 작은 생검 샘플이 있을 때 G-Rex 100에 먼저 배치된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 3, 4, 5, 6, 8, 9, 또는 10개 또는 그 초과의 코어 생검 및/또는 작은 생검 샘플이 있을 때 G-Rex 500에 먼저 배치된다.
FNA는, 예를 들어, NSCLC를 포함하는 폐 종양에서 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, FNA는 비-소세포 폐암 (NSCLC) 환자 유래 폐 종양과 같은 폐 종양에서 수득된다. 일부 경우에, NSCLC 환자는 이전에 수술 치료를 받은 적이 있다.
본원에 기재된 TIL은 FNA 샘플에서 수득될 수 있다. 일부 경우에, FNA 샘플은 18 게이지 바늘에서 25 게이지 바늘에 이르는 미세 게이지 바늘을 사용하여 환자로부터 수득되거나 단리된다. 상기 미세 게이지 바늘은 18 게이지, 19 게이지, 20 게이지, 21 게이지, 22 게이지, 23 게이지, 24 게이지, 또는 25 게이지일 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자 유래 FNA 샘플에는 적어도 400,000 TIL, 예를 들어, 400,000 TIL, 450,000 TIL, 500,000 TIL, 550,000 TIL, 600,000 TIL, 650,000 TIL, 700,000 TIL, 750,000 TIL, 800,000 TIL, 850,000 TIL, 900,000 TIL, 950,000 TIL, 또는 그 초과의 TIL이 포함될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 TIL은 코어 생검 샘플에서 수득된다. 일부 경우에, 코어 생검 샘플은 11 게이지 바늘에서 16 게이지 바늘에 이르는 외과용 또는 의료용 바늘을 사용하여 환자로부터 수득되거나 단리된다. 상기 바늘은 11 게이지, 12 게이지, 13 게이지, 14 게이지, 15 게이지, 또는 16 게이지일 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자 유래 코어 생검 샘플에는 적어도 400,000 TIL, 예를 들어, 400,000 TIL, 450,000 TIL, 500,000 TIL, 550,000 TIL, 600,000 TIL, 650,000 TIL, 700,000 TIL, 750,000 TIL, 800,000 TIL, 850,000 TIL, 900,000 TIL, 950,000 TIL, 또는 그 초과의 TIL이 포함될 수 있다.
일반적으로, 수확된 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새롭게 수확된" 세포 집단이라고 한다.
일부 실시형태에서, TIL은 종양 분해물에서 수득되지 않는다. 일부 실시형태에서, 고형 종양 코어는 단편화되지 않는다.
일부 실시형태에서, TIL은 종양 분해물로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 종양 분해물은 효소 배지, 예를 들어 비제한적으로 RPMI 1640, 2 mM GlutaMAX, 10 mg/mL의 겐타마이신, 30 U/mL DNase, 및 1.0 mg/mL의 콜라겐분해효소에서 인큐베이션한 다음 기계적 해리 (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)에 의해 생성되었다. 종양을 효소 배지에 넣은 후, 대략 1분 동안 종양을 기계적으로 해리할 수 있다. 그 다음 상기 용액을 5% CO2에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 대략 1분 동안 다시 기계적으로 파괴할 수 있다. 5% CO2에서 37℃에서 30분 동안 다시 인큐베이션한 후, 종양을 대략 1분 동안 세 번째로 기계적으로 파괴할 수 있다. 일부 실시형태에서, 큰 조직 조각이 존재하는 경우 세 번째 기계적 파괴 후, 5% CO2에서 37 ℃에서 추가 30분의 인큐베이션과 함께 또는 없이, 1번 또는 2번의 추가적 기계적 해리를 샘플에 적용하였다. 일부 실시형태에서, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 죽은 세포를 함유하는 경우 최종 인큐베이션의 종료 시에, 피콜을 사용한 밀도 구배 분리를 수행하여 이들 세포를 제거할 수 있다.
2. 말초 혈액에서 말초 혈액 림프구 (PBL)를 확장하는 방법
PBL 방법 1. 본 발명의 일 실시형태에서, PBL은 본원에 기재된 공정을 사용하여 확장된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 방법은 전혈에서 PBMC 샘플을 수득하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 방법은 비-CD19+ 분획의 음성 선택을 사용하여 PBMC로부터 순수한 T-세포를 단리함으로써 T-세포를 농축하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 방법은 비-CD19+ 분획의 자기 비드-기반 음성 선택을 사용하여 PBMC로부터 순수한 T-세포를 단리함으로써 T-세포를 농축하는 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, PBL 방법 1은 아래와 같이 수행된다: 0일째에, 동결보존된 PBMC 샘플을 해동하고, PBMC를 계수한다. T-세포는 인간 Pan T-세포 단리 키트 및 LS 칼럼 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 단리된다.
PBL 방법 2. 본 발명의 일 실시형태에서, PBL은 전혈에서 PBMC 샘플을 수득하는 것을 포함하는 PBL 방법 2를 사용하여 확장된다. PBMC 유래 T-세포는 37℃에서 적어도 3시간 동안 PBMC를 인큐베이션한 다음 비-부착 세포를 단리하여 농축된다.
본 발명의 일 실시형태에서, PBL 방법 2는 아래와 같이 수행된다: 0일째에, 동결보존된 PMBC 샘플을 해동하고, PBMC 세포를 CM-2 배지에서 6 웰 플레이트에 웰당 6백만 세포로 씨딩하고, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션했다. 3시간 후, PBL인 비-부착 세포를 제거하고 계수한다.
PBL 방법 3. 본 발명의 일 실시형태에서, PBL은 말초 혈액에서 PBMC 샘플을 수득하는 것을 포함하는 PBL 방법 3을 사용하여 확장된다. B-세포는 CD19+ 선택을 사용하여 단리되고, T-세포는 PBMC 샘플의 비-CD19+ 분획의 음성 선택을 사용하여 선택된다.
본 발명의 일 실시형태에서, PBL 방법 3은 아래와 같이 수행된다: 0일째에, 말초 혈액에서 유래된 동결보존된 PBMC를 해동하고 계수한다. CD19+ B-세포는 CD19 다중정렬 키트, 인간 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 분류된다. 비-CD19+ 세포 분획 중 T-세포는 인간 Pan T-세포 단리 키트 및 LS 칼럼 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 정제된다.
일 실시형태에서, PBMC는 전혈 샘플에서 단리된다. 일 실시형태에서, PBMC 샘플은 PBL을 확장하기 위한 출발 물질로 사용된다. 일 실시형태에서, 샘플은 확장 공정 전 동결보존된다. 또 다른 실시형태에서, 신선한 샘플은 PBL을 확장하기 위한 출발 물질로 사용된다. 본 발명의 일 실시형태에서, T-세포는 당해 기술에 알려진 방법을 사용하여 PBMC로부터 단리된다. 일 실시형태에서, T-세포는 인간 Pan T-세포 단리 키트 및 LS 칼럼을 사용하여 단리된다. 본 발명의 일 실시형태에서, T-세포는 당해 기술에 알려진 항체 선택 방법, 예를 들어, CD19 음성 선택을 사용하여 PBMC로부터 단리된다.
본 발명의 일 실시형태에서, PBMC 샘플은 비-부착 세포를 식별하는 데 효과적인 원하는 온도에서 일정 기간 동안 인큐베이션된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 인큐베이션 시간은 약 3 시간이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 온도는 약 37℃이다. 그 다음 상기 기재된 공정을 사용하여 비-부착 세포를 확장시킨다.
일부 실시형태에서, PBMC 샘플은 키나제 억제제 또는 ITK 억제제를 포함하는 레지멘으로 선택적으로 전처리된 피험자 또는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 종양 샘플은 키나제 억제제 또는 ITK 억제제를 포함하는 레지멘으로 전처리된 피험자 또는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, PBMC 샘플은 키나제 억제제 또는 ITK 억제제를 포함하는 레지멘으로 전처리되고, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 또는 1년 또는 그 초과 동안 치료를 받은 피험자 또는 환자의 것이다. 또 다른 실시형태에서, PBMC는 현재 이브루티닙과 같은 ITK 억제제 레지멘을 받고 있는 환자로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, PBMC 샘플은 키나제 억제제 또는 ITK 억제제를 포함하는 레지멘으로 전처리되고, 키나제 억제제 또는 ITK 억제제, 예컨대 이브루티닙으로의 치료에 불응성인 피험자 또는 환자의 것이다.
일부 실시형태에서, PBMC 샘플은 키나제 억제제 또는 ITK 억제제를 포함하는 레지멘으로 전처리되었지만 더 이상 키나제 억제제 또는 ITK 억제제로 치료받고 있지 않은 피험자 또는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, PBMC 샘플은 키나제 억제제 또는 ITK 억제제를 포함하는 레지멘으로 전처리되었지만 더 이상 키나제 억제제 또는 ITK 억제제로 치료받고 있지 않으며, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 또는 적어도 1년 또는 그 초과 동안 치료를 받지 않은 피험자 또는 환자의 것이다. 또 다른 실시형태에서, PBMC는 ITK 억제제에 이전에 노출되었지만, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 또는 적어도 1년 내에 치료를 받지 않은 환자로부터 유래된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 0일째에, CD19+에 대해 세포를 선택하고, 그에 따라 분류한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 선택은 항체 결합 비드를 사용하여 이루어진다. 본 발명의 일 실시형태에서, 순수한 T-세포는 PBMC로부터 0일째에 단리된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 이브루티닙 또는 다른 ITK 억제제로 전처리되지 않은 환자의 경우, 10-15mL의 버피 코트는 약 5×109 PBMC를 생성할 것이며, 이는 차례로 약 5.5×107 PBL을 생성할 것이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 이브루티닙 또는 다른 ITK 억제제로 전처리된 환자의 경우, 확장 공정을 통해 약 20×109 PBL이 생성될 것이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 40.3×106 PBMC는 약 4.7×105 PBL을 생성할 것이다.
임의의 전술한 실시형태에서, PBMC는 전혈 샘플, 성분채집, 버피 코트, 또는 PBMC를 수득하기 위해 당해 기술에 알려진 임의의 다른 방법으로부터 유래될 수 있다.
3. 골수에서 유래된 PBMC에서 골수 침윤 림프구 (MIL)를 확장시키는 방법
MIL 방법 3. 본 발명의 일 실시형태에서, 방법은 골수로부터 PBMC를 수득하는 것을 포함한다. 0일째에, PBMC는 CD3+/CD33+/CD20+/CD14+에 대해 선택되고 분류되며, 비-CD3+/CD33+/CD20+/CD14+ 세포 분획을 초음파처리하고, 초음파처리된 세포 분획의 일부를 선택된 세포 분획에 다시 첨가한다.
본 발명의 일 실시형태에서, MIL 방법 3은 아래와 같이 수행된다: 0일째에, PBMC의 동결보존된 샘플을 해동하고, PBMC를 계수한다. 상기 세포를 CD3, CD33, CD20, 및 CD14 항체로 염색하고, S3e 세포 분류기 (Bio-Rad)를 사용하여 분류된다. 상기 세포는 면역 세포 분획 (또는 MIL 분획) (CD3+CD33+CD20+CD14+) 및 AML 아세포 분획 (비-CD3+CD33+CD20+CD14+)의 두 분획으로 분류된다.
본 발명의 일 실시형태에서, PBMC는 골수로부터 수득된다. 일 실시형태에서, PBMC는 성분채집, 흡인, 바늘 생검, 또는 당업계에서 알려진 다른 유사한 수단을 통해 골수로부터 수득된다. 일 실시형태에서, PBMC는 신선하다. 또 다른 실시형태에서, PBMC는 동결보존된다.
본 발명의 일 실시형태에서, MIL는 10-50 mL의 골수 흡인물으로부터 확장된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 10 mL의 골수 흡인물은 환자로부터 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 20 mL의 골수 흡인물은 환자로부터 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 30 mL의 골수 흡인물은 환자로부터 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 40 mL의 골수 흡인물은 환자로부터 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 50 mL의 골수 흡인물은 환자로부터 수득된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 약 10-50 mL의 골수 흡인물에서 산출된 PBMC의 수는 약 5×107 내지 약 10×107 PBMC이다. 또 다른 실시형태에서, 산출된 PMBC수는 약 7×107 PBMC이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 약 5×107 내지 약 10×107 PBMC는, 약 0.5×106 내지 약 1.5×106 MIL를 산출한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 약 1×106 MIL가 산출된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 골수 흡인물에서 유래된 12×106 PBMC는 대략 1.4×105 MIL을 산출한다.
임의의 전술한 실시형태에서, PBMC는 전혈 샘플로부터, 골수로부터, 성분채집에 의해, 버피 코트로부터, 또는 PBMC를 수득하기 위해 당업계에 알려진 임의의 다른 방법으로부터 유래될 수 있다.
B. 단계 B: 프라이밍 제1 확장
일부 실시형태에서, 본 방법은 보다 어린 TIL에 대해 제공하고, 따라서 더 오래된 TIL(즉, 대상체/환자에게 투여하기 전에 더 많은 복제 라운드를 추가로 거친 TIL)에 비해 추가의 치료적 이점을 제공할 수 있다. 어린 TIL의 특징은 [문헌, 예를 들어, Donia, 등, Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012)]; 문헌[Dudley 등, Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)]; 문헌[Huang 등, J Immunother, 28(3):258-267 (2005)]; 문헌[Besser 등, Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013)]; 문헌[Besser 등, J Immunother 32:415-423 (2009)]; 문헌[Robbins, 등, J Immunol 2004; 173:7125-7130]; 문헌[Shen 등, J Immunother, 30:123-129 (2007)]; 문헌[Zhou, 등, J Immunother, 28:53-62 (2005)]; 및 문헌[Tran, 등, J Immunother, 31:742-751 (2008)]에 기재되었고, 이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
예를 들어 도 1 (특히, 예를 들어, 도 1b 및/또는 도 8c)의 단계 A에 기재된 바와 같이, 종양 단편 및/또는 종양 단편의 절개 또는 분해 후, 생성된 세포는 종양 및 다른 세포보다 TIL의 성장을 선호하는 조건하에 IL-2, OKT-3, 및 피더 세포 (예를 들어, 항원 제시 피더 세포)를 함유하는 혈청에서 배양된다. 일부 실시형태에서, IL-2, OKT-3, 및 피더 세포는 종양 분해물 및/또는 종양 단편과 함께 배양 개시시에 첨가된다 (예를 들어, 0일째). 일부 실시형태에서, 종양 분해물 및/또는 종양 단편은 용기 당 최대 60개의 단편 및 6000 IU/mL의 IL-2와 함께 용기에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 이 1차 세포 집단은 며칠, 일반적으로 1 내지 8일의 기간 동안 배양되어 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 이 1차 세포 집단은 며칠, 일반적으로 1 내지 7일의 기간 동안 배양되어 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장은 1 내지 8일의 기간 동안 발생하여 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장은 1 내지 7일의 기간 동안 발생하여 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 이 프라이밍 제1 확장은 5 내지 8일의 기간 동안 발생하여 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 이 프라이밍 제1 확장은 5 내지 7일의 기간 동안 발생하여 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 이 프라이밍 제1 확장은 약 6 내지 8일의 기간 동안 발생하여 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 이 프라이밍 제1 확장은 약 6 내지 7일의 기간 동안 발생하여 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 이 프라이밍 제1 확장은 약 7 내지 8일의 기간 동안 발생하여 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 이 프라이밍 제1 확장은 약 7일의 기간 동안 발생하여 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 이 프라이밍 제1 확장은 약 8일의 기간 동안 발생하여 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 × 108 벌크 TIL 세포를 생성한다.
바람직한 실시형태에서, TIL의 확장은 아래 및 본원에 기재된 바와 같이 프라이밍 제1 확장 단계 (예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 기재된 것들, 이는 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 공정을 포함할 수 있고, 0일째 및/또는 배양 개시의 피더 세포를 함유함)에 이어 이하 단계 D 아래 및 본원에 기재된 바와 같이 급속 제2 확장 (단계 D, 급속 확장 프로토콜 (REP) 단계로 지칭되는 공정 포함)에 이어 선택적 동결보존, 및 아래 및 본원에 기재된 바와 같이 제2 단계 D (재자극 REP 단계로 지칭되는 공정 포함)를 사용하여 수행될 수 있다. 이 공정으로부터 수득된 TIL은 본원에 기재된 바와 같이 표현형 특성 및 대사 파라미터에 대해 선택적으로 특성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 10 mm3이다.
일부 실시형태에서, 제1 확장 배양 배지는 배양 배지의 약어인 "CM"으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 단계 B의 CM은 10% 인간 AB 혈청이 보충된 GlutaMAX가 포함된 RPMI 1640, 25 mM Hepes 및 10 mg/mL의 겐타마이신으로 구성된다.
일부 실시형태에서, 240개 이하의 종양 단편이 있다. 일부 실시형태에서, 4개 이하의 용기에 240개 이하의 종양 단편이 놓여 있다. 일부 실시형태에서, 용기는 GREX100 MCS 플라스크이다. 일부 실시형태에서, 1개의 용기에 60개 이하의 종양 단편이 배치된다. 일부 실시형태에서, 각각의 용기는 용기 당 500 mL 이하의 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 6000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 항원 제시 피더 세포 (또한 본원에서 "항원 제시 세포"로 지칭됨). 일부 실시형태에서, 배지는 용기 당 2.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 OKT-3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 용기 당 30 ng/mL의 OKT-3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용기는 GREX100 MCS 플라스크이다. 일부 실시형태에서, 배지는 6000 IU/mL의 IL-2, 30 ng의 OKT-3, 및 2.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 용기 당 6000 IU/mL의 IL-2, 30 ng/mL의 OKT-3, 및 2.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다.
종양 단편의 제조 후, 생성된 세포 (즉, 1차 세포 집단인 단편)는 종양 및 다른 세포보다 TIL의 성장을 촉진하고, 0일째에 배양 개시 이후 TIL 프라이밍 및 가속화된 성장을 허용하는 조건 하에 IL-2, 항원 제시 피더 세포 및 OKT-3을 함유하는 배지에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 종양 분해물 및/또는 종양 단편은 6000 IU/mL의 IL-2, 뿐만 아니라 항원 제시 피더 세포 및 OKT-3과 함께 인큐베이션된다. 이 1차 세포 집단은 며칠, 일반적으로 1 내지 8일의 기간 동안 배양되어 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1×108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 동안 성장 배지는 IL-2 또는 그의 변이체, 뿐만 아니라 항원 제시 피더 세포 및 OKT-3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이 1차 세포 집단은 며칠, 일반적으로 1 내지 7일의 기간 동안 배양되어 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1×108 벌크 TIL 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 동안 성장 배지는 IL-2 또는 그의 변이체, 뿐만 아니라 항원 제시 피더 세포 및 OKT-3을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2는 재조합 인간 IL-2 (rhIL-2)이다. 일부 실시형태에서, IL-2 스톡 용액은 1 mg의 바이알에 대해 20-30×106 IU/mg의 고유 활성도를 갖는다. 일부 실시형태에서, IL-2 스톡 용액은 1 mg의 바이알에 대해 20×106 IU/mg의 고유 활성도를 갖는다. 일부 실시형태에서, IL-2 스톡 용액은 1 mg의 바이알에 대해 25×106 IU/mg의 고유 활성도를 갖는다. 일부 실시형태에서, IL-2 스톡 용액은 1 mg의 바이알에 대해 30×106 IU/mg의 고유 활성도를 갖는다. 일부 실시형태에서, IL-2 스톡 용액은 4-8×106 IU/mg의 IL-2의 최종 농도를 갖는다. 일부 실시형태에서, IL-2 스톡 용액은 5-7×106 IU/mg의 IL-2의 최종 농도를 갖는다. 일부 실시형태에서, IL-2 스톡 용액은 6×106 IU/mg의 IL-2의 최종 농도를 갖는다. 일부 실시형태에서, IL-2 스톡 용액은 실시예 C에 기재된 바와 같이 제조된다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 10,000 IU/mL의 IL-2, 약 9,000 IU/mL의 IL-2, 약 8,000 IU/mL의 IL-2, 약 7,000 IU/mL의 IL-2, 약 6000 IU/mL의 IL-2 또는 약 5,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 9,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 5,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 8,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 7,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 IL-15를 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 5 IU/mL의 IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-21을 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
일 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 및 약 1 μg/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 15 ng/ml 내지 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, OKT-3 항체는 무로모납이다.
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일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 세포 배양 배지에서 하나 이상의 TNFRSF 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제, 및 4-1BB 효능제는 우렐루맙, 유토밀루맙, EU-101, 융합 단백질, 및 단편, 유도체, 변이체, 바이오시밀러, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL의 세포 배양 배지의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 20 μg/mL 내지 40 μg/mL의 세포 배양 배지의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 TNFRSF 효능제에 추가하여, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 초기 농도로 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도로 OKT-3 항체를 추가로 포함하고, 하나 이상의 TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 TNFRSF 효능제에 추가하여, 프라이밍 제1 확장 세포 배양 배지는 약 6000 IU/mL의 초기 농도로 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도로 OKT-3 항체를 추가로 포함하고, 하나 이상의 TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지는 배양 배지의 약어인 "CM"으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, CM1 (배양 배지 1)로 지칭한다. 일부 실시형태에서, CM은 10% 인간 AB 혈청, 25 mM Hepes, 및 10 mg/mL의 겐타마이신으로 보충된, GlutaMAX를 갖는 RPMI 1640으로 구성된다. 일부 실시형태에서, CM은 실시예 A를 참조하는 실시예에 기재된 CM1이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장은 초기 세포 배양 배지 또는 제1 세포 배양 배지에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 배양 배지 또는 초기 세포 배양 배지 또는 제1 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 피더 세포 (또한 본원에서 피더 세포로 지칭됨)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 확장 공정에 사용된 배양 배지는 무혈청 배지 또는 한정 배지이다. 일부 실시형태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 기저 세포 배지 및 혈청 보충물 및/또는 혈청 대체물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 부분적으로 혈청 함유 배지의 로트-로트 변형으로 인한 실험 변형을 예방하고/예방하거나 감소시키기 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 기저 세포 배지 및 혈청 보충물 및/또는 혈청 대체물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기저 세포 배지는 CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 기초 배지, CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM, CTS™ AIM-V 배지, CTS™ AIM-V SFM, LymphoONE™ T-세포 확장 Xeno 없는 배지, 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 기초 배지 이글 (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, 최소 필수 배지 (αMEM), 글래스고 최소 필수 배지 (G-MEM), RPMI 성장 배지, 및 이스코브 변형 둘베코 배지를 비제한적으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 혈청 보충물 또는 혈청 대체물은 CTS™ OpTmizer T-세포 확장 혈청 보충물, CTS™ 면역 세포 혈청 대체물, 하나 이상의 알부민 또는 알부민 대체물, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 하나 이상의 항산화제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 하나 이상의 콜라겐 전구체, 하나 이상의 항생제, 및 하나 이상의 미량 원소 중 하나 이상을 비제한적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 한정 배지는 알부민 및 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 티아민, 환원된 글루타티온, L-아스코르브산-2-포스페이트, 철 포화된 트랜스페린, 인슐린, 및 미량 원소 모이어티 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ 및 Zr4+를 함유하는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 한정 배지는 L-글루타민, 중탄산나트륨 및/또는 2-머캅토에탄올을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 면역 세포 혈청 대체물은 CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 기초 배지, CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM, CTS™ AIM-V 배지, CST™ AIM-V SFM, LymphoONE™ T-세포 확장 Xeno 없는 배지, 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 기초 배지 이글 (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, 최소 필수 배지 (αMEM), 글래스고 최소 필수 배지 (G-MEM), RPMI 성장 배지, 및 이스코브 변형 둘베코 배지를 비제한적으로 포함하는 종래의 성장 배지로 사용된다.
일부 실시형태에서, 무혈청 또는 한정 배지 중 총 혈청 대체물 농도 (vol%)는 총 무혈청 또는 한정 배지 부피로 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이다. 일부 실시형태에서, 총 혈청 대체물 농도는 무혈청 또는 한정 배지의 총 부피의 약 3%이다. 일부 실시형태에서, 총 혈청 대체물 농도는 무혈청 또는 한정 배지의 총 부피의 약 5%이다. 일부 실시형태에서, 총 혈청 대체물 농도는 무혈청 또는 한정 배지의 총 부피의 약 10%이다.
일부 실시형태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM (ThermoFisher Scientific)이다. CTS™ OpTmizer™의 임의의 제형은 본 발명에서 유용하다. CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 사용 전에 함께 혼합되는 1L CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 기초 배지와 26 mL의 CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 보충물의 조합이다. 일부 실시형태에서, CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific)로 보충된다. 일부 실시형태에서, CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 55 mM의 2-머캅토에탄올과 함께 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific)로 보충된다. 일부 실시형태에서, CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific)로 보충되고 배지 중의 2-머캅토에탄올의 최종 농도는 55μM이다.
일부 실시형태에서, 한정 배지는 CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM (ThermoFisher Scientific)이다. CTS™ OpTmizer™의 임의의 제형은 본 발명에서 유용하다. CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 사용 전에 함께 혼합되는 1L CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 기초 배지와 26 mL의 CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 보충물의 조합이다. 일부 실시형태에서, CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 55 mM의 2-머캅토에탄올과 함께 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific)로 보충된다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific), 55 mM의 2-머캅토에탄올, 및 2 mM의 L-글루타민으로 보충된다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific), 55 mM의 2-머캅토에탄올, 및 2 mM의 L-글루타민으로 보충되고, 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific), 55 mM의 2-머캅토에탄올, 및 2 mM의 L-글루타민으로 보충되고, 약 3000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific), 55 mM의 2-머캅토에탄올, 및 2 mM의 L-글루타민으로 보충되고, 약 6000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific) 및 55 mM의 2-머캅토에탄올로 보충되고, 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific) 및 55 mM의 2-머캅토에탄올로 보충되고, 약 3000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific) 및 55 mM의 2-머캅토에탄올로 보충되고, 약 1000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific) 및 약 2mM의 글루타민으로 보충되고, 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific) 및 약 2mM의 글루타민으로 보충되고, 약 3000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific) 및 약 2mM의 글루타민으로 보충되고, 약 6000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific)로 보충되고 배지 중의 2-머캅토에탄올의 최종 농도는 55μM이다.
일부 실시형태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 0.5 mM 내지 약 9 mM, 1 mM 내지 약 8 mM, 2 mM 내지 약 7 mM, 3 mM 내지 약 6 mM, 또는 4 mM 내지 약 5 mM의 농도로 글루타민 (즉, GlutaMAX®)으로 보충된다. 일부 실시형태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 2mM의 농도로 글루타민 (즉, GlutaMAX®)으로 보충된다.
일부 실시형태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 5 mM 내지 약 150 mM, 10 mM 내지 약 140 mM, 15 mM 내지 약 130mM, 20 mM 내지 약 120 mM, 25 mM 내지 약 110 mM, 30 mM 내지 약 100 mM, 35 mM 내지 약 95 mM, 40 mM 내지 약 90mM, 45mM 내지 약 85 mM, 50 mM 내지 약 80 mM, 55 mM 내지 약 75 mM, 60 mM 내지 약 70 mM, 또는 약 65 mM의 농도의 2-머캅토에탄올로 보충된다. 일부 실시형태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 55mM 농도의 2-머캅토에탄올로 보충된다. 일부 실시형태에서, 배지 중의 2-머캅토에탄올의 최종 농도는 55μM이다.
일부 실시형태에서, 본원에 인용되어 포함된 국제 PCT 공개 WO/1998/030679호에 기재된 한정 배지가 본 발명에서 유용하다. 상기 공보에서, 무혈청 진핵 세포 배양 배지가 기재된다. 무혈청, 진핵 세포 배양 배지는 무혈청 배양물 중 세포의 성장을 뒷받침할 수 있는 무혈청 보충물로 보충된 기저 세포 배양 배지를 포함한다. 무혈청 진핵 세포 배양 배지 보충물은 하나 이상의 알부민 또는 알부민 대체물, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 하나 이상의 항산화제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 하나 이상의 콜라겐 전구체, 하나 이상의 미량 원소, 및 하나 이상의 항생제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하거나 그 성분들을 조합하여 얻는다. 일부 실시형태에서, 한정 배지는 L-글루타민, 중탄산나트륨 및/또는 베타-머캅토에탄올을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 한정 배지는 알부민 또는 알부민 대체물 및 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 하나 이상의 항산화제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 하나 이상의 콜라겐 전구체, 및 하나 이상의 미량 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 한정 배지는 알부민 및 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 티아민, 환원된 글루타티온, L-아스코르브산-2-포스페이트, 철 포화된 트랜스페린, 인슐린, 및 미량 원소 모이어티 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ 및 Zr4+를 함유하는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기저 세포 배지는 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 기초 배지 이글 (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, 최소 필수 배지 (αMEM), 글래스고 최소 필수 배지 (G-MEM), RPMI 성장 배지, 및 이스코브 변형 둘베코 배지로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 한정 배지에서의 글리신의 농도는 약 5-200 mg/L의 범위에 있고, L-히스티딘의 농도는 약 5-250 mg/L이고, L-이소류신의 농도는 약 5-300 mg/L이고, L-메티오닌의 농도는 약 5-200 mg/L이고, L-페닐알라닌의 농도는 약 5-400 mg/L이고, L-프롤린의 농도는 약 1-1000 mg/L이고, L-하이드록시프롤린의 농도는 약 1-45 mg/L이고, L-세린의 농도는 약 1-250 mg/L이고, L-트레오닌의 농도는 약 10-500 mg/L이고, L-트립토판의 농도는 약 2-110 mg/L이고, L-티로신의 농도는 약 3-175 mg/L이고, L-발린의 농도는 약 5-500 mg/L이고, 티아민의 농도는 약 1-20 mg/L이고, 환원된 글루타티온의 농도는 약 1-20 mg/L이고, L-아스코르브산-2-포스페이트의 농도는 약 1-200 mg/L이고, 철 포화된 트랜스페린의 농도는 약 1-50 mg/L, 인슐린의 농도는 약 1-100 mg/L이고, 나트륨 셀레나이트의 농도는 약 0.000001-0.0001 mg/L이고, 알부민 (예를 들어, AlbuMAX® I)의 농도는 약 5000-50,000 mg/L이다.
일부 실시형태에서, 한정 배지 중의 비-미량 원소 모이어티 성분은 아래의 표 A에서 제목 "1X 배지의 농도 범위" 하에 칼럼에 열거된 농도 범위로 존재한다. 다른 실시형태에서, 한정 배지 중의 비-미량 원소 모이어티 성분은 아래의 표 A의 제목 "1X 배지의 바람직한 실시형태" 하에 칼럼에 열거된 최종 농도로 존재한다. 다른 실시형태에서, 한정 배지는 무혈청 보충물을 포함하는 기저 세포 배지이다. 이들 실시형태 중 일부에서, 무혈청 보충물은 아래의 표 A의 제목 "보충물의 바람직한 실시형태" 하의 칼럼에 열거된 유형 및 농도의 비-미량 모이어티를 포함한다.
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일부 실시형태에서, 한정 배지의 삼투질농도는 약 260 내지 350 mOsmol이다. 일부 실시형태에서, 삼투질농도는 약 280 내지 310 mOsmol이다. 일부 실시형태에서, 한정 배지는 최대 약 3.7 g/L, 또는 약 2.2 g/L 중탄산나트륨으로 보충된다. 한정 배지는 L-글루타민 (약 2 mM의 최종 농도), 하나 이상의 항생제, 비-필수 아미노산 (NEAA; 약 100 μM의 최종 농도), 2-머캅토에탄올 (약 100 μM의 최종 농도)로 추가로 보충될 수 있다.
일부 실시형태에서, 문헌[Smith, 등, "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement," Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)]에 기재된 한정 배지는 본 발명에 유용하다. 간략하게, RPMI 또는 CTS™ OpTmizer™은 기저 세포 배지로서 사용되었고, 0, 2%, 5%, 또는 10% CTS™ 면역 세포 혈청 대체물로 보충되었다.
일 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 중의 세포 배지는 여과되지 않는다. 여과되지 않은 세포 배지의 사용은 세포의 수를 확장하는데 필요한 절차를 단순화할 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 중의 세포 배지는 베타-머캅토에탄올 (BME 또는 βME; 또한 2-머캅토에탄올, CAS 60-24-2로 알려져 있음)가 결여된다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 1 (특히, 예를 들어, 도 1b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 실시예 및 도에서 논의된 바와 같이 1 내지 8일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 1 (특히, 예를 들어, 도 1b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 2 내지 8 일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 1 (특히, 예를 들어, 도 1b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 3 내지 8 일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 1 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 실시예 및 도에서 논의된 바와 같이 4 내지 8일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 실시예 및 도에서 논의된 바와 같이 1 내지 7일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 1 (특히, 예를 들어, 도 1b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 2 내지 8 일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 2 내지 7일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 3 내지 8 일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 3 내지 7일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 4 내지 8 일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 4 내지 7일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 5 내지 8 일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 5 내지 7일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 6 내지 8 일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 6 내지 7일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 1 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 7 내지 8일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 8일이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 (때때로 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 제공된 것들과 같은 공정을 포함함) 공정은 7일이다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 TIL 확장은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 1일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 TIL 확장은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 1일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 TIL 확장은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 1일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 TIL 확장은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 2일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 TIL 확장은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 3일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 TIL 확장은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 3일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 TIL 확장은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 4일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 TIL 확장은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 4일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 TIL 확장은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 5일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 TIL 확장은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 5일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 TIL 확장은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 6일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 TIL 확장은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 6일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 TIL 확장은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 7 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 TIL 확장은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 TIL 확장은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 7일 동안 진행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 TIL의 제1 확장은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 TIL 확장은 1일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 TIL 확장은 1일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 TIL 확장은 2일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 TIL 확장은 2일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 TIL 확장은 3일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 TIL 확장은 3일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 TIL 확장은 4일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 TIL 확장은 4일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 TIL 확장은 5일 내지 8 일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 TIL 확장은 5일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 TIL 확장은 6일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 TIL 확장은 6일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 TIL 확장은 7 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 TIL 확장은 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 TIL 확장은 7일 동안 진행될 수 있다.
일부 실시형태에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21의 조합은 프라이밍 제1 확장 동안 조합하여 사용된다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 예를 들어 본원에 기재될 뿐만 아니라 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 따른 단계 B 공정을 포함하여 during. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21의 조합은 프라이밍 제1 확장 동안 조합하여 사용된다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 따른 그리고 본원에 기재된 바와 같은 단계 B 공정 동안 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장, 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 따른 단계 B는, 폐쇄 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 생물반응기가 사용된다. 일부 실시형태에서, 생물반응기는 용기로서 사용된다. 일부 실시형태에서, 사용된 생물반응기는 예를 들어 G-REX-10 또는 G-REX-100이다. 일부 실시형태에서, 사용된 생물반응기는 G-REX-100이다. 일부 실시형태에서, 사용된 생물반응기는 G-REX-10이다.
1. 피더 세포 및 항원 제시 세포
일 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장 절차 (예를 들어 확장 예컨대 도 1 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 기재된 것, 뿐만 아니라 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함함)는 TIL 확장의 시작 시에 피더 세포 (또한 본원에서 "항원 제시 세포"로 지칭됨)을 필요로 하지 않지만, 오히려 프라이밍 제1 확장 동안 첨가된다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장 절차 (예를 들어 확장 예컨대 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c) 단계 B에 기재된 것, 뿐만 아니라 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함함)는 TIL 확장의 시작 시에 피더 세포 (또한 본원에서 "항원 제시 세포"로 지칭됨)을 필요로 하지 않지만, 오히려 4 내지 8일째 동안 언제든지 프라이밍 제1 확장 동안 첨가된다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장 절차 (예를 들어 확장 예컨대 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c) 단계 B에 기재된 것, 뿐만 아니라 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함함)는 TIL 확장의 시작 시에 피더 세포 (또한 본원에서 "항원 제시 세포"로 지칭됨)을 필요로 하지 않지만, 오히려 4 내지 7일째 동안 언제든지 프라이밍 제1 확장 동안 첨가된다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장 절차 (예를 들어 확장 예컨대 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c) 단계 B에 기재된 것, 뿐만 아니라 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함함)는 TIL 확장의 시작 시에 피더 세포 (또한 본원에서 "항원 제시 세포"로 지칭됨)을 필요로 하지 않지만, 오히려 5 내지 8일째 동안 언제든지 프라이밍 제1 확장 동안 첨가된다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장 절차 (예를 들어 확장 예컨대 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c) 단계 B에 기재된 것, 뿐만 아니라 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함함)는 TIL 확장의 시작 시에 피더 세포 (또한 본원에서 "항원 제시 세포"로 지칭됨)을 필요로 하지 않지만, 오히려 5 내지 7일째 동안 언제든지 프라이밍 제1 확장 동안 첨가된다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장 절차 (예를 들어 확장 예컨대 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c) 단계 B에 기재된 것, 뿐만 아니라 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함함)는 TIL 확장의 시작 시에 피더 세포 (또한 본원에서 "항원 제시 세포"로 지칭됨)을 필요로 하지 않지만, 오히려 6 내지 8일째 동안 언제든지 프라이밍 제1 확장 동안 첨가된다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장 절차 (예를 들어 확장 예컨대 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c) 단계 B에 기재된 것, 뿐만 아니라 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함함)는 TIL 확장의 시작 시에 피더 세포 (또한 본원에서 "항원 제시 세포"로 지칭됨)을 필요로 하지 않지만, 오히려 6 내지 7일째 동안 언제든지 프라이밍 제1 확장 동안 첨가된다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장 절차 (예를 들어 확장 예컨대 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c) 단계 B에 기재된 것, 뿐만 아니라 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함함)는 TIL 확장의 시작 시에 피더 세포 (또한 본원에서 "항원 제시 세포"로 지칭됨)을 필요로 하지 않지만, 오히려 7 또는 8일째 동안 언제든지 프라이밍 제1 확장 동안 첨가된다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장 절차 (예를 들어 확장 예컨대 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c) 단계 B에 기재된 것, 뿐만 아니라 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함함)는 TIL 확장의 시작 시에 피더 세포 (또한 본원에서 "항원 제시 세포"로 지칭됨)을 필요로 하지 않지만, 오히려 7일째 동안 언제든지 프라이밍 제1 확장 동안 첨가된다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장 절차 (예를 들어 확장 예컨대 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c) 단계 B에 기재된 것, 뿐만 아니라 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함함)는 TIL 확장의 시작 시에 피더 세포 (또한 본원에서 "항원 제시 세포"로 지칭됨)을 필요로 하지 않지만, 오히려 8일째 동안 언제든지 프라이밍 제1 확장 동안 첨가된다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장 절차 (예를 들어 확장 예컨대 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b)의 단계 B에 기재된 것, 뿐만 아니라 프리-REP 또는 프라이밍 REP로 지칭되는 것을 포함함)은 TIL 확장의 시작 시에 및 프라이밍 제1 확장 동안 피더 세포 (또한 본원에서 "항원 제시 세포"로 지칭됨)를 필요로 한다. 많은 실시형태에서, 피더 세포는 동종이계 건강한 혈액 공여체의 표준 전혈 단위로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이다. PBMC는 표준 방법 예컨대 피콜-파크 구배 분리를 사용하여 수득된다. 일부 실시형태에서, 2.5 × 108 피더 세포는 프라이밍 제1 확장 동안에 사용된다. 일부 실시형태에서, 용기 당 2.5 × 108 피더 세포는 프라이밍 제1 확장 동안에 사용된다. 일부 실시형태에서, GREX-10 당 2.5 × 108 피더 세포는 프라이밍 제1 확장 동안에 사용된다. 일부 실시형태에서, GREX-100 당 2.5 × 108 피더 세포는 프라이밍 제1 확장 동안에 사용된다.
일반적으로, 동종 PBMC는 조사 또는 열 처리를 통해 불활성화되고, 실시예에 기재된 바와 같이 REP 절차에서 사용되며, 이는 조사 동종이계 PBMC의 복제 부능력을 평가하기 위한 예시적인 프로토콜을 제공한다.
일부 실시형태에서, 14일째에 생존가능 세포의 총 수가 REP의 0일째 및/또는 제2 확장의 0일째(즉, 제2 확장의 시작일)에 배양된 초기 생존가능 세포 수보다 더 적은 경우, PBMC는 복제 부적합한 것으로 간주되고 본원에 기재된 TIL 확장 절차에의 사용이 허용된다.
일부 실시형태에서, 7일째에 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된 생존가능 세포의 총 수가 프라이밍 제1 확장의 0일째에 배양된 초기 생존가능 세포 수로부터 증가되지 않는 경우, PBMC는 복제 불능인 것으로 간주되고 본원에 기재된 TIL 확장 절차에 사용하도록 허용된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 30 ng/ml의 OKT3 항체 및 3000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 30 ng/ml의 OKT3 항체 및 6000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다.
일부 실시형태에서, 7일째에 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된 생존가능 세포의 총 수가 프라이밍 제1 확장의 0일째에 배양된 초기 생존가능 세포 수로부터 증가되지 않는 경우, PBMC는 복제 불능인 것으로 간주되고 본원에 기재된 TIL 확장 절차에 사용하도록 허용된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 5-60 ng/mL의 OKT3 항체 및 1000-6000 IU/mL의 IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 10-50 ng/ml의 OKT3 항체 및 2000-5000 IU/mL의 IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 20-40 ng/mL의 OKT3 항체 및 2000-4000 IU/mL의 IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 25-35 ng/mL의 OKT3 항체 및 2500-3500 IU/mL의 IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 30 ng/mL의 OKT3 항체 및 6000 IU/mL의 IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 15 ng/mL의 OKT3 항체 및 3000 IU/mL의 IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 15 ng/mL의 OKT3 항체 및 6000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다.
일부 실시형태에서, 항원 제시 피더 세포는 PBMC이다. 일부 실시형태에서, 항원 제시 피더 세포는 인공 항원 제시 피더 세포이다. 일 실시형태에서, 제2 확장에서의 TIL 대 항원 제시 피더 세포의 비는 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 일 실시형태에서, 제2 확장에서의 TIL 대 항원 제시 피더 세포의 비는 1 대 50 내지 1 대 300이다. 일 실시형태에서, 제2 확장에서의 TIL 대 항원 제시 피더 세포의 비는 1 대 100 내지 1 대 200이다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장 절차는 약 2.5 × 108 피더 세포 대 약 100 × 106 TIL의 비를 필요로 한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장 절차는 약 2.5 × 108 피더 세포 대 약 50 × 106 TIL의 비를 필요로 한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장은 약 2.5 × 108 피더 세포 대 약 25 × 106 TIL을 필요로 한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장은 약 2.5 × 108 피더 세포를 필요로 한다. 또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장은 급속 제2 확장에 사용된 피더 세포의 수의 4분의 1, 3분의 1, 12분의 5, 또는 2분의 1을 필요로 한다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서의 배지는 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서의 배지는 6000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서의 배지는 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서의 배지는 용기 당 2.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서의 배지는 OKT-3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 용기 당 30 ng의 OKT-3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용기는 GREX100 MCS 플라스크이다. 일부 실시형태에서, 배지는 6000 IU/mL의 IL-2, 30 ng/mL의 OKT-3, 및 2.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 용기 당 6000 IU/mL의 IL-2, 30 ng/mL의 OKT-3, 및 2.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 용기 당 500 mL의 배양 배지 및 15 μg의 OKT-3 per 2.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 용기 당 500 mL의 배양 배지 및 15 μg의 OKT-3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용기는 GREX100 MCS 플라스크이다. 일부 실시형태에서, 배지는 500 mL의 배양 배지, 6000 IU/mL의 IL-2, 30 ng/mL의 OKT-3, 및 2.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 용기 당 500 mL의 배양 배지, 6000 IU/mL의 IL-2, 15 μg의 OKT-3, 및 2.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 용기 당 500 mL의 배양 배지 및 15 μg의 OKT-3 per 2.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장 절차는 제2 확장 동안 TIL에 비해 과잉의 피더 세포를 필요로 한다. 많은 실시형태에서, 피더 세포는 동종이계 건강한 혈액 공여체의 표준 전혈 단위로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이다. PBMC는 표준 방법 예컨대 피콜-파크 구배 분리를 사용하여 수득된다. 일 실시형태에서, 인공 항원 제시 (aAPC) 세포는 PBMC 대신 사용된다.
일반적으로, 동종 PBMC는 조사 또는 열 처리를 통해 불활성화되고, 도 및 실시예에 기재된 예시적인 절차를 포함하는 본원에 기재된 TIL 확장 절차에서 사용된다.
일 실시형태에서, 인공 항원 제시 세포는 PBMC를 대체하거나 조합하여 프라이밍 제1 확장에서 사용된다.
2. 사이토카인
본원에 기재된 확장 방법은 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같이 높은 용량의 사이토카인, 특히 IL-2를 갖는 배양 배지를 사용한다.
대안적으로, TILS의 프라이밍 제1 확장을 위해 사이토카인의 조합을 사용하는 것이 추가적으로 가능하며, 이는 국제공개 WO 2015/189356호 및 WO 2015/189357호에 일반적으로 설명된 바와 같은 IL-2, IL-15 및 IL-21 중 둘 이상의 조합이 있으며, 상기 공개들은 명시적으로 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 따라서, 가능한 조합은 IL-2 및 IL-15, IL-2 및 IL-21, IL-15 및 IL-21, 및 IL-2, IL-15 및 IL-21을 포함하고, 후자 많은 실시형태에서 특히 사용된다. 사이토카인의 조합의 사용은 본원에 기재된 바와 같은 림프구, 및 특히 T-세포의 생성에 특이적으로 유리하게 작동한다.
Figure pct00024
C. 단계 C: 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이행
일부 경우에, 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 표시된 바와 같은 단계 B로부터 수득된 TIL 집단을 포함하는 (때때로 프리-REP로 지칭되는 확장을 포함할 수 있는) 프라이밍 제1 확장으로부터 수득된 벌크 TIL 집단은, (때때로 급속 확장 프로토콜 (REP)로 지칭되는 확장을 포함할 수 있는) 급속 제2 확장을 거칠 수 있고 그 다음 아래에 논의된 바와 같이 동결보존될 수 있다. 유사하게, 유전적으로 변형된 TIL이 요법에 사용될 경우, 프라이밍 제1 확장으로부터의 확장된 TIL 집단 또는 급속 제2 확장으로부터의 확장된 TIL 집단은 확장 단계 전 또는 프라이밍 제1 확장 후 및 급속 제2 확장 전에 적합한 처리를 위해 유전자 변형을 거칠 수 있다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장으로부터 (예를 들어, 도 1 (특히, 예를 들어, 도 1b 및/또는 도 8c)에 표시된 단계 B로부터) 수득된 TIL은 선택을 위해 표현형이 될 때까지 저장된다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장으로부터 (예를 들어, 도 1 (특히, 예를 들어, 도 1b 및/또는 도 8c)에 표시된 단계 B로부터) 수득된 TIL은 저장되지 않고 급속 제2 확장으로 직접 진행한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장으로부터 수득된 TIL은 프라이밍 제1 확장 후 및 급속 제2 확장 전에 동결보존되지 않는다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 제2 확장으로의 이동은 종양 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 8 일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이동은 약 3일 내지 7일에 일어난다. 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이동은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 약 3일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 제2 확장으로의 이동은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 약 4일 내지 7일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 제2 확장으로의 이동은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 약 4일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 제2 확장으로의 이동은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 약 5일 내지 7일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 제2 확장으로의 이동은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 약 5일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 약 6일 내지 7일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 약 6일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 약 7일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 약 7일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 약 8일에 일어난다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 8일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이행은 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 1일 내지 7일에 일어난다 단편화가. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 1일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 2일 내지 7일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 2일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 3일 내지 7일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 3일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 4일 내지 7일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 4일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 5일 내지 7일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 5일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 6일 내지 7일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 6일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 7일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 7일에 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어나고/일어나거나 제1 프라이밍 확장 단계가 시작된 때로부터 8일에 일어난다.
일부 실시형태에서, TIL은 1차 제1 확장 후에 그리고 급속 제2 확장 전에 저장되지 않고, TIL은 급속 제2 확장 (예를 들어, 일부 실시형태에서, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에서 나타낸 바와 같이 단계 B에서 단계 D로의 이행 동안에 저장은 없다)으로 직접 진행된다. 일부 실시형태에서, 이행은 본원에 기재된 바와 같이, 폐쇄 시스템에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장으로부터의 TIL, TIL의 제2 집단은 이행 기간 없이 급속 제2 확장으로 직접 진행된다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이행, 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 따른 단계 C는, 폐쇄 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시형태에서, 단일 사용된 생물반응기는 예를 들어 GREX-10 또는 GREX-100이다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 급속 제2 확장으로의 이행은 용기 크기의 확대를 수반한다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장은 급속 제2 확장보다 더 작은 용기에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장은 GREX-100에서 수행되고 급속 제2 확장은 GREX-500에서 수행된다.
D. 단계 D: 급속 제2 확장
일부 실시형태에서, 단계 A 및 단계 B, 및 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 나타낸 바와 같이, 단계 C로 지칭되는 이행 후에, TIL 세포 집단을 수확 및 프라이밍 제1 확장 후에 수적으로 추가로 확장시킨다. 이러한 추가 확장은 본원에서 급속 제2 확장으로 지칭되고, 이는 급속 확장 공정 (급속 확장 프로토콜 또는 REP; 뿐만 아니라 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b)의 단계 D에 표시된 공정)으로 당업계에서 일반적으로 칭해지는 확장 공정을 포함할 수 있다. 급속 제2 확장은 일반적으로 기체 투과성 용기에서 피더 세포, 사이토카인 공급원, 및 항-CD3 항체를 포함하는 다수의 구성요소를 포함하는 배양 배지를 사용하여 달성된다. 일부 실시형태에서, 1일, 2일, 3일, 또는 4일 동안 진행될 수 있다.급속 제2 확장의 시작 후 (즉, 전반적으로 Gen 3 공정의 8, 9, 10, 또는 11일째에), TIL은 더 큰 부피의 용기로 이동된다.
일부 실시형태에서, TIL의 (때때로 REP로 지칭되는 확장; 뿐만 아니라 도 1 (특히, 예를 들어, 도 1b 및/또는 도 8c)의 단계 D에 표시된 공정을 포함할 수 있는) 급속 제2 확장은 당업자에게 알려진 임의의 TIL 플라스크 또는 용기를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 1일 동안, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 1일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 1일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 2일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 2일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 3일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 3일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 4일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 4일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 5일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 5일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 6일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 6일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 7일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 7일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 8일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 8일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 9일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 1일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 2일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 3일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 4일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 5일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 6일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 TIL 확장은 급속 제2 확장의 시작 후 약 10일 동안 진행될 수 있다.
일 실시형태에서, 급속 제2 확장은 본 개시내용의 방법 (예를 들어, REP로 지칭되는 확장; 뿐만 아니라 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 D에 표시된 공정을 포함함)을 사용하여 기체 투과성 용기에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL은 IL-2, OKT-3, 및 피더 세포 (또한 이하 통칭 "항원 제시 세포")의 존재에서 급속 제2 확장에서 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 IL-2, OKT-3, 및 피더 세포의 존재에서 급속 제2 확장에서 확장되고, 피더 세포는 프라이밍 제1 확장에 존재하는 피더 세포의 농도의 2배, 2.4 배, 2.5배, 3배, 3.5배 또는 4배인 최종 농도에 첨가된다. 예를 들어, TIL은 인터류킨-2 (IL-2) 또는 인터류킨-15 (IL-15)의 존재에서 비-특이적 T-세포 수용체 자극을 사용하여 급속하게 확장될 수 있다. 비-특이적 T-세포 수용체 자극은, 예를 들어, 항-CD3 항체, 예컨대 약 30 ng/ml의 OKT3, 마우스 단클론성 항-CD3 항체 (뉴저지주 라리탄 소재의 Ortho-McNeil 또는 캘리포니아주 아우번 소재의 Miltenyi Biotech) 또는 UHCT-1 (미국 캘리포니아주 샌디애고 소재의 BioLegend로부터 상업적으로 입수가능)을 포함할 수 있다. TIL은, 선택적으로 T-세포 성장 인자, 예컨대 300 IU/mL IL-2 또는 IL-15의 존재 하에, 벡터, 예컨대 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2) 결합 펩티드, 예를 들어, 0.3 μΜ MART-1 :26-35 (27 L) 또는 gpl 00:209-217 (210M)로부터 선택적으로 발현될 수 있는, 암의 에피토프(들)와 같은 항원부를 포함하는, 제2 확장 동안 하나 이상의 항원을 포함함으로써 시험관내 TIL의 추가의 자극을 유도하기 위해 확장될 수 있다. 다른 적합한 항원은, 예를 들어, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 암 항원, MAGE-A3, SSX-2, 및 VEGFR2, 또는 그의 항원부를 포함할 수 있다. TIL은 또한 HLA-A2 발현 항원 제시 세포에 펄스화된 암의 동일한 항원(들)에 의한 재자극에 의해 급속하게 확장될 수 있다. 대안적으로, TIL은 추가로 예를 들어, 조사된, 자가 림프구로 또는 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2로 재자극될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재자극은 제2 확장의 일부로서 일어난다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 조사된, 자가 림프구 또는 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2의 존재에서 일어난다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 및 약 1 μg/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 15 ng/ml 내지 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 30 ng/ml 내지 60 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 60 ng/mL의 OKT-3을 포함한다. 일부 실시형태에서, OKT-3 항체는 무로모납이다.
일부 실시형태에서, 급속 제2 확장에서의 배지는 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 6000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장에서의 배지는 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장에서의 배지는 용기 당 7.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장에서의 배지는 OKT-3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장 배지에 용기 당 500 mL의 배양 배지 및 30 μg의 OKT-3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용기는 GREX100 MCS 플라스크이다. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장에서의 배지는 6000 IU/mL의 IL-2, 60 ng/mL의 OKT-3, 및 7.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 용기 당 500 mL의 배양 배지 및 6000 IU/mL의 IL-2, 30 μg의 OKT-3, 및 7.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 급속 제2 확장에서의 배지는 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 6000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장에서의 배지는 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 용기 당 5 × 108 내지 7.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장에서의 배지는 OKT-3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장에서의 배지는 용기 당 500 mL의 배양 배지 및 30 μg의 OKT-3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용기는 GREX100 MCS 플라스크이다. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장에서의 배지는 6000 IU/mL의 IL-2, 60 ng/mL의 OKT-3, 및 5 × 108 내지 7.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장에서의 배지는 용기 당 500 mL의 배양 배지 및 6000 IU/mL의 IL-2, 30 μg의 OKT-3, 및 5 × 108 내지 7.5 × 108 항원 제시 피더 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지에서 하나 이상의 TNFRSF 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제, 및 4-1BB 효능제는 우렐루맙, 유토밀루맙, EU-101, 융합 단백질, 및 단편, 유도체, 변이체, 바이오시밀러, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL의 세포 배양 배지의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다. 일부 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 20 μg/mL 내지 40 μg/mL의 세포 배양 배지의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 TNFRSF 효능제에 추가하여, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 초기 농도에서 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도에서 OKT-3 항체를 추가로 포함하고, 하나 이상의 TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21의 조합은 제2 확장 동안 조합하여 사용된다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 예를 들어 본원에 기재될 뿐만 아니라 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 따른 단계 D 공정 동안을 포함하는 제2 확장 동안 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21의 조합은 제2 확장 동안 조합하여 사용된다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 따른 그리고 본원에 기재된 바와 같은 단계 D 공정 동안 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 확장은 IL-2, OKT-3, 항원 제시 피더 세포, 및 선택적으로 TNFRSF 효능제를 포함하는 보충된 세포 배양 배지에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 보충된 세포 배양 배지에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 보충된 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 세포 (APC; 또한 항원 제시 피더 세포로 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 피더 세포 (즉, 항원 제시 세포)를 포함하는 세포 배양 배지에서 일어난다.
일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-15를 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 5 IU/mL의 IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 IL-21을 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 제시 피더 세포 (APC)는 PBMC이다. 일 실시형태에서, 급속 확장 및/또는 제2 확장에서의 TIL 대 PBMC 및/또는 항원 제시 세포의 비는 약 1 대 10, 약 1 대 15, 약 1 대 20, 약 1 대 25, 약 1 대 30, 약 1 대 35, 약 1 대 40, 약 1 대 45, 약 1 대 50, 약 1 대 75, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 일 실시형태에서, 급속 확장 및/또는 제2 확장에서의 TIL 대 PBMC의 비는 1 대 50 내지 1 대 300이다. 일 실시형태에서, 급속 확장 및/또는 제2 확장에서의 TIL 대 PBMC의 비는 1 대 100 내지 1 대 200이다.
일 실시형태에서, REP 및/또는 급속 제2 확장은 100- 또는 200-배 과잉의 불활성화된 피더 세포와 혼합되는 벌크 TIL를 갖는 플라스크에서 수행되고, 피더 세포 농도는 150 ml 배지에서 프라이밍 제1 확장, 30 ng/mL의 OKT3 항-CD3 항체 및 6000 IU/mL IL-2에서 적어도 1.1 배 (1.1X), 1.2X, 1.3X, 1.4X, 1.5X, 1.6X, 1.7X, 1.8X, 1.8X, 2X, 2.1X2.2X, 2.3X, 2.4X, 2.5X, 2.6X, 2.7X, 2.8X, 2.9X, 3.0X, 3.1X, 3.2X, 3.3X, 3.4X, 3.5X, 3.6X, 3.7X, 3.8X, 3.9X 또는 4.0X의 피더 세포 농도이다. 배지 대체 (일반적으로 소비된 배지의 2/3의 흡인을 통한 2/3 배지 대체 및 동등 부피의 새로운 배지에 의한 대체)는 세포가 대안적인 성장 챔버로 이동될 때까지 수행된다. 대안적인 성장 챔버는 아래에 더 충분히 논의된 바와 같이 G-REX 플라스크 및 기체 투과성 용기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 급속 제2 확장 (이는 REP 공정으로 지칭되는 공정을 포함할 수 있음)는 실시예 및 도에서 논의된 바와 같이 7 내지 9일이다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 7일이다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 8일이다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 9일이다.
일 실시형태에서, 제2 확장 (REP로 지칭되는 확장, 뿐만 아니라 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c의 단계 D로 지칭되는 것을 포함할 수 있음)은 100 cm 기체 투과성 실리콘 저부 (미국 미네소타주 뉴브링턴 소재의 Wilson Wolf Manufacturing Corporation로부터 상업적으로 입수가능한 G-Rex 100)를 갖는 500 mL의 수용력 기체 투과성 플라스크에서 수행될 수 있고, 5 × 106 또는 10 × 106 TIL은 5% 인간 AB 혈청, 3000 IU /mL의 IL-2 및 30 ng /mL의 항-CD3 (OKT3)으로 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 PBMC와 함께 배양될 수 있다. G-Rex 100 플라스크는 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션될 수 있다. 5일째에, 250 mL의 상청액은 제거되어 원심분리기 병에 배치되고 10분 동안 1500 rpm (491 × g)에서 원심분리될 수 있다. TIL 펠렛은 5% 인간 AB 혈청, 6000 IU /mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 새로운 배지로 재현탁될 수 있고, 원래의 GREX-100 플라스크에 다시 첨가될 수 있다. TIL이 GREX-100 플라스크에서 연속으로 확장되는 경우, 10일 또는 11일째에, TIL은 더 큰 플라스크, 예컨대 GREX-500로 이동될 수 있다. 세포는 배양의 14일째에 수확될 수 있다. 세포는 배양의 15일째에 수확될 수 있다. 세포는 배양의 16일째에 수확될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포가 대안적인 성장 챔버로 이동될 때까지 배지 대체가 수행된다. 일부 실시형태에서, 배지의 2/3는 소비된 배지의 흡인에 의해 대체되고 동등 부피의 새로운 배지로 대체된다. 일부 실시형태에서, 대안적인 성장 챔버는 아래에 더 충분히 논의된 바와 같이 GREX 플라스크 및 기체 투과성 용기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 확장 공정에 사용된 배양 배지는 무혈청 배지 또는 한정 배지이다. 일부 실시형태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 기저 세포 배지 및 혈청 보충물 및/또는 혈청 대체물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 부분적으로 혈청 함유 배지의 로트-로트 변형으로 인한 실험 변형을 예방하고/예방하거나 감소시키기 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 기저 세포 배지 및 혈청 보충물 및/또는 혈청 대체물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기저 세포 배지는 CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 기초 배지, CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM, CTS™ AIM-V 배지, CTS™ AIM-V SFM, LymphoONE™ T-세포 확장 Xeno 없는 배지, 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 기초 배지 이글 (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, 최소 필수 배지 (αMEM), 글래스고 최소 필수 배지 (G-MEM), RPMI 성장 배지, 및 이스코브 변형 둘베코 배지를 비제한적으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 혈청 보충물 또는 혈청 대체물은 CTS™ OpTmizer T-세포 확장 혈청 보충물, CTS™ 면역 세포 혈청 대체물, 하나 이상의 알부민 또는 알부민 대체물, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 하나 이상의 항산화제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 하나 이상의 콜라겐 전구체, 하나 이상의 항생제, 및 하나 이상의 미량 원소 중 하나 이상을 비제한적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 한정 배지는 알부민 및 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 티아민, 환원된 글루타티온, L-아스코르브산-2-포스페이트, 철 포화된 트랜스페린, 인슐린, 및 미량 원소 모이어티 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ 및 Zr4+를 함유하는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 한정 배지는 L-글루타민, 중탄산나트륨 및/또는 2-머캅토에탄올을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 면역 세포 혈청 대체물은 CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 기초 배지, CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM, CTS™ AIM-V 배지, CST™ AIM-V SFM, LymphoONE™ T-세포 확장 Xeno 없는 배지, 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 기초 배지 이글 (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, 최소 필수 배지 (αMEM), 글래스고 최소 필수 배지 (G-MEM), RPMI 성장 배지, 및 이스코브 변형 둘베코 배지를 비제한적으로 포함하는 종래의 성장 배지로 사용된다.
일부 실시형태에서, 무혈청 또는 한정 배지 중 총 혈청 대체물 농도 (vol%)는 총 무혈청 또는 한정 배지 부피로 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이다. 일부 실시형태에서, 총 혈청 대체물 농도는 무혈청 또는 한정 배지의 총 부피의 약 3%이다. 일부 실시형태에서, 총 혈청 대체물 농도는 무혈청 또는 한정 배지의 총 부피의 약 5%이다. 일부 실시형태에서, 총 혈청 대체물 농도는 무혈청 또는 한정 배지의 총 부피의 약 10%이다.
일부 실시형태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM (ThermoFisher Scientific)이다. CTS™ OpTmizer™의 임의의 제형은 본 발명에서 유용하다. CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 사용 전에 함께 혼합되는 1L CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 기초 배지와 26 mL의 CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 보충물의 조합이다. 일부 실시형태에서, CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 55 mM의 2-머캅토에탄올과 함께 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific)로 보충된다.
일부 실시형태에서, 한정 배지는 CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM (ThermoFisher Scientific)이다. CTS™ OpTmizer™의 임의의 제형은 본 발명에서 유용하다. CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 사용 전에 함께 혼합되는 1L CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 기초 배지와 26 mL의 CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 보충물의 조합이다. 일부 실시형태에서, CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 55 mM의 2-머캅토에탄올과 함께 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific)로 보충된다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific), 55 mM의 2-머캅토에탄올, 및 2 mM의 L-글루타민으로 보충된다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific), 55 mM의 2-머캅토에탄올, 및 2 mM의 L-글루타민으로 보충되고, 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific), 55 mM의 2-머캅토에탄올, 및 2 mM의 L-글루타민으로 보충되고, 약 3000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific), 55 mM의 2-머캅토에탄올, 및 2 mM의 L-글루타민으로 보충되고, 약 6000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific) 및 55 mM의 2-머캅토에탄올로 보충되고, 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific) 및 55 mM의 2-머캅토에탄올로 보충되고, 약 3000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific) 및 55 mM의 2-머캅토에탄올로 보충되고, 약 1000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific) 및 약 2mM의 글루타민으로 보충되고, 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific) 및 약 2mM의 글루타민으로 보충되고, 약 3000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (ThermoFisher Scientific) 및 약 2mM의 글루타민으로 보충되고, 약 6000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 0.5 mM 내지 약 9 mM, 1 mM 내지 약 8 mM, 2 mM 내지 약 7 mM, 3 mM 내지 약 6 mM, 또는 4 mM 내지 약 5 mM의 농도로 글루타민 (즉, GlutaMAX®)으로 보충된다. 일부 실시형태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 2mM의 농도로 글루타민 (즉, GlutaMAX®)으로 보충된다.
일부 실시형태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 5 mM 내지 약 150 mM, 10 mM 내지 약 140 mM, 15 mM 내지 약 130 mM, 20 mM 내지 약 120 mM, 25 mM 내지 약 110 mM, 30 mM 내지 약 100 mM, 35 mM 내지 약 95 mM, 40 mM 내지 약 90 mM, 45 mM 내지 약 85 mM, 50 mM 내지 약 80 mM, 55 mM 내지 약 75 mM, 60 mM 내지 약 70 mM, 또는 약 65 mM 농도의 2-머캅토에탄올로 보충된다. 일부 실시형태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 55mM 농도의 2-머캅토에탄올로 보충된다.
일부 실시형태에서, 본원에 인용되어 포함된 국제 PCT 공개 WO/1998/030679호에 기재된 한정 배지가 본 발명에서 유용하다. 상기 공보에서, 무혈청 진핵 세포 배양 배지가 기재된다. 무혈청, 진핵 세포 배양 배지는 무혈청 배양물 중 세포의 성장을 뒷받침할 수 있는 무혈청 보충물로 보충된 기저 세포 배양 배지를 포함한다. 무혈청 진핵 세포 배양 배지 보충물은 하나 이상의 알부민 또는 알부민 대체물, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 하나 이상의 항산화제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 하나 이상의 콜라겐 전구체, 하나 이상의 미량 원소, 및 하나 이상의 항생제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하거나 그 성분들을 조합하여 얻는다. 일부 실시형태에서, 한정 배지는 L-글루타민, 중탄산나트륨 및/또는 베타-머캅토에탄올을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 한정 배지는 알부민 또는 알부민 대체물 및 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 하나 이상의 항산화제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 하나 이상의 콜라겐 전구체, 및 하나 이상의 미량 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 한정 배지는 알부민 및 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 티아민, 환원된 글루타티온, L-아스코르브산-2-포스페이트, 철 포화된 트랜스페린, 인슐린, 및 미량 원소 모이어티 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ 및 Zr4+를 함유하는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기저 세포 배지는 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 기초 배지 이글 (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, 최소 필수 배지 (αMEM), 글래스고 최소 필수 배지 (G-MEM), RPMI 성장 배지, 및 이스코브 변형 둘베코 배지로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 한정 배지에서의 글리신의 농도는 약 5-200 mg/L의 범위에 있고, L-히스티딘의 농도는 약 5-250 mg/L이고, L-이소류신의 농도는 약 5-300 mg/L이고, L-메티오닌의 농도는 약 5-200 mg/L이고, L-페닐알라닌의 농도는 약 5-400 mg/L이고, L-프롤린의 농도는 약 1-1000 mg/L이고, L-하이드록시프롤린의 농도는 약 1-45 mg/L이고, L-세린의 농도는 약 1-250 mg/L이고, L-트레오닌의 농도는 약 10-500 mg/L이고, L-트립토판의 농도는 약 2-110 mg/L이고, L-티로신의 농도는 약 3-175 mg/L이고, L-발린의 농도는 약 5-500 mg/L이고, 티아민의 농도는 약 1-20 mg/L이고, 환원된 글루타티온의 농도는 약 1-20 mg/L이고, L-아스코르브산-2-포스페이트의 농도는 약 1-200 mg/L이고, 철 포화된 트랜스페린의 농도는 약 1-50 mg/L, 인슐린의 농도는 약 1-100 mg/L이고, 나트륨 셀레나이트의 농도는 약 0.000001-0.0001 mg/L이고, 알부민 (예를 들어, AlbuMAX® I)의 농도는 약 5000-50,000 mg/L이다.
일부 실시형태에서, 한정 배지 중의 비-미량 원소 모이어티 성분은 아래의 표 A에서 제목 "1X 배지의 농도 범위" 하에 칼럼에 열거된 농도 범위로 존재한다. 다른 실시형태에서, 한정 배지 중의 비-미량 원소 모이어티 성분은 아래의 표 A의 제목 "1X 배지의 바람직한 실시형태" 하에 칼럼에 열거된 최종 농도로 존재한다. 다른 실시형태에서, 한정 배지는 무혈청 보충물을 포함하는 기저 세포 배지이다. 이들 실시형태 중 일부에서, 무혈청 보충물은 아래의 표 A의 제목 "보충물의 바람직한 실시형태" 하의 칼럼에 열거된 유형 및 농도의 비-미량 모이어티를 포함한다.
Figure pct00025
일부 실시형태에서, 한정 배지의 삼투질농도는 약 260 내지 350 mOsmol이다. 일부 실시형태에서, 삼투질농도는 약 280 내지 310 mOsmol이다. 일부 실시형태에서, 한정 배지는 최대 약 3.7 g/L, 또는 약 2.2 g/L 중탄산나트륨으로 보충된다. 한정 배지는 L-글루타민 (약 2 mM의 최종 농도), 하나 이상의 항생제, 비-필수 아미노산 (NEAA; 약 100 μM의 최종 농도), 2-머캅토에탄올 (약 100 μM의 최종 농도)로 추가로 보충될 수 있다.
일부 실시형태에서, 문헌[Smith, 등, "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement," Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)]에 기재된 한정 배지는 본 발명에 유용하다. 간략하게, RPMI 또는 CTS™ OpTmizer™은 기저 세포 배지로서 사용되었고, 0, 2%, 5%, 또는 10% CTS™ 면역 세포 혈청 대체물로 보충되었다.
일 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 중의 세포 배지는 여과되지 않는다. 여과되지 않은 세포 배지의 사용은 세포의 수를 확장하는데 필요한 절차를 단순화할 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 중의 세포 배지는 베타-머캅토에탄올 (BME 또는 βME; 또한 2-머캅토에탄올, CAS 60-24-2로 알려져 있음)가 결여된다.
일 실시형태에서, 급속 제2 확장 (REP로 지칭된 확장을 포함함)이 수행되고 TIL이 우수한 종양 반응성을 위해 선택된 단계를 포함한다. 당업계에서 알려진 임의의 선택 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 개시내용이 본원에 인용되어 포함된 미국 특허출원공개 제2016/0010058 A1호에 기재된 방법은 우수한 종양 반응성에 대한 TIL의 선택을 위해 사용될 수 있다.
선택적으로, 세포 생존력 검정은 당업계에서 알려진 표준 검정을 사용하여 급속 제2 확장 (REP 확장으로 지칭된 확장을 포함함) 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, 트립판 블루 제외 검정은 벌크 TIL의 샘플에 대해 수행될 수 있으며, 이는 선택적으로 죽은 세포를 표지하고 생존력 평가를 허용한다. 일부 실시형태에서, TIL 샘플 계수될 수 있고 생존력은 Cellometer K2 자동화 세포 계수기 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)를 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생존력은 표준 Cellometer K2 Image Cytometer Automatic Cell Counter 프로토콜에 따라 결정된다.
T 및 B 림프구의 다양한 항원 수용체는 제한적이지만 많은 수의 유전자 분절의 체세포 재조합에 의해 생성된다. 이들 유전자 분절: V (가변), D (다양성), J (결합), 및 C (불변)은 결합 특이성 및 면역글로불린 및 T-세포 수용체 (TCR)의 하류 적용을 결정한다. 본 발명은 T-세포 레퍼토리 다양성을 나타내고 증가시키는 TIL을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 제2 확장에서 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 다양성의 증가는 면역글로불린 다양성 및/또는 T-세포 수용체 다양성의 증가이다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 중쇄에 있다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 경쇄에 있다. 일부 실시형태에서, 다양성은 T-세포 수용체에 있다. 일부 실시형태에서, 다양성은 알파, 베타, 감마, 및 델타 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 T-세포 수용체 중 하나에 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파 및/또는 베타의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 베타의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, TCRab (즉, TCRα/β)의 발현의 증가가 있다.
일부 실시형태에서, 급속 제2 확장 배양 배지 (예를 들어, 때때로 CM2 또는 제2 세포 배양 배지로 지칭됨)는, 아래에 더 상세히 논의된 바와 같이 IL-2, OKT-3, 뿐만 아니라 항원 제시 피더 세포 (APC)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장 배양 배지 (예를 들어, 때때로 CM2 또는 제2 세포 배양 배지로 지칭됨)는, 아래에 더 상세히 논의된 바와 같이 6000 IU/mL IL-2, 30 ug/플라스크 OKT-3, 뿐만 아니라 7.5 × 108 항원 제시 피더 세포 (APC)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장 배양 배지 (예를 들어, 때때로 CM2 또는 제2 세포 배양 배지로 지칭됨)는, 아래에 더 상세히 논의된 바와 같이 IL-2, OKT-3, 뿐만 아니라 항원 제시 피더 세포 (APC)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장 배양 배지 (예를 들어, 때때로 CM2 또는 제2 세포 배양 배지로 지칭됨)는, 아래에 더 상세히 논의된 바와 같이 6000 IU/mL IL-2, 30 ug/플라스크 OKT-3, 뿐만 아니라 5 × 108 항원 제시 피더 세포 (APC)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 급속 제2 확장, 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 따른 단계 D는, 폐쇄 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 생물반응기가 사용된다. 일부 실시형태에서, 생물반응기는 용기로서 사용된다. 일부 실시형태에서, 사용된 생물반응기는 예를 들어 G-REX-100 또는 G-REX-500이다. 일부 실시형태에서, 사용된 생물반응기는 G-REX-100이다. 일부 실시형태에서, 사용된 생물반응기는 G-REX-500이다.
1. 피더 세포 및 항원 제시 세포
일 실시형태에서, 본원에 기재된 급속 제2 확장 절차 (예를 들어 확장 예컨대 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 D에 기재된 것, 뿐만 아니라 REP로 지칭된 것을 포함함)은 REP TIL 확장 동안 및/또는 급속 제2 확장 동안의 과잉의 피더 세포를 필요로 한다. 많은 실시형태에서, 피더 세포는 건강한 혈액 공여체로부터 표준 전혈 단위로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이다. PBMC는 표준 방법 예컨대 피콜-파크 구배 분리를 사용하여 수득된다.
일반적으로, 동종 PBMC는 조사 또는 열 처리를 통해 불활성화되고, 실시예에 기재된 바와 같이 REP 절차에서 사용되며, 이는 조사 동종이계 PBMC의 복제 부능력을 평가하기 위한 예시적인 프로토콜을 제공한다.
일부 실시형태에서, 7일째 또는 14일째에 생존가능 세포의 총 수가 REP의 0일째 및/또는 제2 확장의 0일째(즉, 제2 확장의 시작일)에 배양된 초기 생존가능 세포 수보다 더 적은 경우, PBMC는 복제 불능이고 본원에 기재된 TIL 확장 절차에 사용 가능한 것으로 간주된다.
일부 실시형태에서, 7일째 및 14일째에 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된 생존가능 세포의 총 수가 REP의 0일째 및/또는 제2 확장의 0일째 (즉, 제2 확장의 시작일)에 배양된 초기 생존가능 세포 수로부터 증가되지 않는 경우, PBMC는 복제 불능이고 본원에 기재된 TIL 확장 절차에 사용 가능한 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 30 ng/ml의 OKT3 항체 및 3000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 배 60 ng/ml의 OKT3 항체 및 6000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 60 ng/ml의 OKT3 항체 및 3000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 30 ng/ml의 OKT3 항체 및 6000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다.
일부 실시형태에서, 7일째 및 14일째에 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된 생존가능 세포의 총 수가 REP의 0일째 및/또는 제2 확장의 0일째 (즉, 제2 확장의 시작일)에 배양된 초기 생존가능 세포 수로부터 증가되지 않는 경우, PBMC는 복제 불능이고 본원에 기재된 TIL 확장 절차에 사용 가능한 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 30-60 ng/ml의 OKT3 항체 및 1000-6000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 30-60 ng/ml의 OKT3 항체 및 2000-5000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 30-60 ng/ml의 OKT3 항체 및 2000-4000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 30-60 ng/ml의 OKT3 항체 및 2500-3500 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 30-60 ng/ml의 OKT3 항체 및 6000 IU/ml IL-2의 존재에서 배양된다.
일부 실시형태에서, 항원 제시 피더 세포는 PBMC이다. 일부 실시형태에서, 항원 제시 피더 세포는 인공 항원 제시 피더 세포이다. 일 실시형태에서, 제2 확장에서의 TIL 대 항원 제시 피더 세포의 비는 약 1 대 10, 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 일 실시형태에서, 제2 확장에서의 TIL 대 항원 제시 피더 세포의 비는 1 대 50 내지 1 대 300이다. 일 실시형태에서, 제2 확장에서의 TIL 대 항원 제시 피더 세포의 비는 1 대 100 내지 1 대 200이다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 약 5 × 108 피더 세포 대 약 100 × 106 TIL의 비를 필요로 한다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 약 7.5 × 108 피더 세포 대 약 100 × 106 TIL의 비를 필요로 한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 약 5 × 108 피더 세포 대 약 50 × 106 TIL의 비를 필요로 한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 약 7.5 × 108 피더 세포 대 약 50 × 106 TIL의 비를 필요로 한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 약 5 × 108 피더 세포 대 약 25 × 106 TIL의 비를 필요로 한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 약 7.5 × 108 피더 세포 대 약 25 × 106 TIL의 비를 필요로 한다. 또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장은 급속 제2 확장으로 피더 세포의 수의 2배를 필요로 한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장이 약 2.5 × 108 피더 세포를 필요로 하는 경우, 급속 제2 확장은 약 5 × 108 피더 세포를 필요로 하다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 프라이밍 제1 확장이 약 2.5 × 108 피더 세포를 필요로 하는 경우, 급속 제2 확장은 약 7.5 × 108 피더 세포를 필요로 하다. 또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장은
Figure pct00026
프라이밍 제1 확장으로서 피더 세포의 수
Figure pct00027
2배 (2.0X), 2.5X, 3.0X, 3.5X 또는 4.0X를 필요로 한다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 급속 제2 확장 절차는 급속 제2 확장 동안 과잉의 피더 세포를 필요로 한다. 많은 실시형태에서, 피더 세포는 동종이계 건강한 혈액 공여체의 표준 전혈 단위로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이다. PBMC는 표준 방법 예컨대 피콜-파크 구배 분리를 사용하여 수득된다. 일 실시형태에서, 인공 항원 제시 (aAPC) 세포는 PBMC 대신 사용된다. 일부 실시형태에서, PBMC는 프라이밍 제1 확장에 첨가된 PBMC의 농도의 2배로 급속 제2 확장에 첨가된다.
일반적으로, 동종 PBMC는 조사 또는 열 처리를 통해 불활성화되고, 도 및 실시예에 기재된 예시적인 절차를 포함하는 본원에 기재된 TIL 확장 절차에서 사용된다.
일 실시형태에서, 인공 항원 제시 세포는 인공 항원 제시 세포는 PBMC를 대체하거나 조합하여 프라이밍 급속 제2 확장에서 사용된다.
2. 사이토카인
본원에 기재된 급속 제2 확장 방법은 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같이 높은 용량의 사이토카인, 특히 IL-2를 갖는 배양 배지를 사용한다.
대안적으로, TILS의 급속 제2 확장을 위해 사이토카인의 조합을 사용하는 것이 추가적으로 가능하며, 이는 국제공개 WO 2015/189356호 및 국제공개 WO 2015/189357호에 일반적으로 설명된 바와 같은 IL-2, IL-15 및 IL-21 중 둘 이상의 조합이 있으며, 상기 공개들은 명시적으로 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 따라서, 가능한 조합은 IL-2 및 IL-15, IL-2 및 IL-21, IL-15 및 IL-21, 및 IL-2, IL-15 및 IL-21을 포함하고, 후자 많은 실시형태에서 특히 사용된다. 사이토카인의 조합의 사용은 본원에 기재된 바와 같은 림프구, 및 특히 T-세포의 생성에 특이적으로 유리하게 작동한다.
E. 단계 E: TIL의 수확
급속 제2 확장 단계 후에, 세포가 수확될 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL은 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 바와 같이 1, 2, 3, 4 또는 그 초과 개의 확장 단계 후에 수확된다. 일부 실시형태에서, TIL은 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 바와 같이 2개의 확장 단계 후에 수확된다. 일부 실시형태에서, TIL은 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 바와 같이 2개의 확장 단계, 하나의 프라이밍 제1 확장 및 하나의 급속 제2 확장 후에 수확된다.
TIL은 예를 들어 원심분리에 의한 것을 포함하는 임의의 적절한 및 멸균 방식으로 수확될 수 있다. TIL 수확 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 있고 임의의 그와 같은 알려진 방법은 본 공정으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, TILS는 자동화 시스템을 사용하여 수득된다.
세포 수확기 및/또는 세포 가공 시스템은 예를 들어, Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer, 및 Inotech Biosystems International, Inc.를 포함하는 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다. 임의의 세포 기반 수확기는 본 방법으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 수확기 및/또는 세포 가공 시스템은 막 기반 세포 수확기이다. 일부 실시형태에서, 세포 수확은 세포 가공 시스템, 예컨대 LOVO 시스템 (Fresenius Kabi 제조)을 통한 것이다. 용어 "LOVO 세포 가공 시스템"은 또한 멸균 및/또는 폐쇄 시스템 환경에서 막 또는 필터, 예컨대 방사 막 또는 방사 필터를 통해 세포를 포함하는 용액을 펌핑할 수 있는 임의의 판매인에 의해 제조된 임의의 기구 또는 장치를 지칭하며, 펠릿화 없이 상청액 또는 세포 배양 배지를 제거하기 위해 연속 유동 및 세포 가공을 허용한다. 일부 실시형태에서, 세포 수확기 및/또는 세포 가공 시스템은 폐쇄된, 멸균 시스템에서 세포 분리, 세척, 유체-교환, 농도, 및/또는 다른 세포 가공 단계를 수행할 수 있다.
일부 실시형태에서, 급속 제2 확장, 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 따른 단계 D는, 폐쇄 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 생물반응기가 사용된다. 일부 실시형태에서, 생물반응기는 용기로서 사용된다. 일부 실시형태에서, 사용된 생물반응기는 예를 들어 G-REX-100 또는 G-REX-500이다. 일부 실시형태에서, 사용된 생물반응기는 G-REX-100이다. 일부 실시형태에서, 사용된 생물반응기는 G-REX-500이다.
일부 실시형태에서, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 따른 단계 E는, 본원에 기재된 공정에 따라 수행된다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 시스템의 멸균 및 폐쇄 특성을 유지하기 위해 멸균 조건 하에서 주사기를 통해 접근된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 폐쇄 시스템이 사용된다.
일부 실시형태에서, TIL은 본원에 기재된 방법에 따라 수확된다. 일부 실시형태에서, 14일째 내지 16일째의 TIL은 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 수확된다. 일부 실시형태에서, TIL은 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 14일에 수확된다. 일부 실시형태에서, TIL은 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 15일에 수확된다. 일부 실시형태에서, TIL은 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 16일에 수확된다.
F. 단계 F: 최종 제형/주입 백으로의 이동
도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b)에서 예시적인 순서로 제공되고 상기 및 본원에 상세히 약술된 바와 같은 단계 A 내지 E가 완료된 후, 세포는 환자에게 투여 시 사용하기 위해 용기로 이동된다. 일부 실시형태에서, 일단 치료상 충분한 수의 TIL이 상기 기재된 확장 방법을 사용하여 수득되면, 이들은 환자에게 투여 시 사용하기 위한 용기로 이동된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 확장된 TIL은 약제학적 조성물로서 환자에게 투여된다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 멸균 완충액 중의 TIL의 현탁액이다. 본원에 개시된 TIL은 당해 분야에서 알려진 바와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL은 단일 동맥내 또는 정맥내 주입으로서 투여되고, 바람직하게는 대략 30 내지 60분 지속된다. 다른 적합한 투여 경로는 복강내, 척추강내, 및 림프내를 포함한다.
G. PBMC 피더 세포 비
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 확장 방법 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c) 참고)에 사용된 배양 배지는 항-CD3 항체 예를 들어 OKT-3을 포함한다. IL-2와 조합된 항-CD3 항체는 TIL 집단에서 T 세포 활성화 및 세포 분열을 유도한다. 이 효과는 전장 항체뿐만 아니라 Fab 및 F(ab')2 단편에서 볼 수 있으며, 전자가 일반적으로 바람직하고; 예를 들어, 문헌[Tsoukas 등, J. Immunol. 1985, 135, 1719]을 참고하며, 그 전체 내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, PBMC 피더 층의 수는 아래와 같이 계산된다:
A. T-세포 (10 μm 직경)의 부피: V = (4/3) πr3 =523.6 μm3
B. 높이가 40 μm (4 세포)인 G-Rex 100 (M)의 컬럼: V = (4/3) πr3 = 4×1012 μm3
C. 컬럼 B를 채우는 데 필요한 세포 수: 4×1012 μm3 / 523.6 μm3 = 7.6×108 μm3 * 0.64 = 4.86×108
D. 4D 공간에서 최적으로 활성화될 수 있는 세포 수: 4.86×108 / 24 = 20.25×106
E. G-Rex 500으로 외삽된 TIL 및 피더 수: TIL: 100×106 및 공급기: 2.5×109
이 계산에서는, 100 cm2 염기가 있는 실린더에서 TIL의 활성화를 위한 이십면체 기하학을 제공하는 데 필요한 단핵 세포 수의 근사치가 사용된다. 계산은 NCI 실험적 데이터를 거의 반영하는 T-세포의 역치 활성화에 대한 ~5×108의 실험 결과를 도출한다.(1) (C) 승수 (0.64)는 1992년에 Jaeger 및 Nagel에 의해 계산된 등가 구에 대한 랜덤 팩킹 밀도이다 (2). (D) 제수 24는 4차원 공간 "뉴턴 수"에서 유사한 물체와 접촉할 수 있는 등가 구의 수이다(3).
(1) Jin, Jianjian, 등, Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother. 2012 Apr; 35(3): 283-292.
(2) Jaeger HM, Nagel SR. Physics of the granular state. Science. 1992 Mar 20;255(5051):1523-31.
(3) O. R. Musin (2003). "The problem of the twenty-five spheres". Russ. Math. Surv. 58 (4): 794-795.
일 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 동안 외인성으로 공급된 항원 제시 피더 세포의 수는 급속 제2 확장 동안 외인성으로 공급된 항원 제시 피더 세포의 수의 대략 절반이다. 특정 실시형태에서, 방법은 급속 제2 확장의 세포 배양 배지와 비교하여 대략 50% 더 적은 항원 제시 세포를 포함하는 세포 배양 배지에서 프라이밍 제1 확장을 수행하는 것을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 외인성으로 공급된 항원 제시 피더 세포 (APC)의 수는 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수보다 더 크다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 20:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 10:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 9:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 8:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 7:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 6:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 5:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 4:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비)는 1.1:1 또는 그 근처 내지 3:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.9:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.8:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.7:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.6:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.5:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.4:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.3:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.2:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.1:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 10:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 5:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 4:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 3:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.9:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.8:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.7:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.6:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.5:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.4:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.3:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 약 2:1 또는 그 근처 내지 2.2:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.1:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 약 2:1 또는 그 근처이다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수 대 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수의 비는 약 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 2.6:1, 2.7:1, 2.8:1, 2.9:1, 3:1, 3.1:1, 3.2:1, 3.3:1, 3.4:1, 3.5:1, 3.6:1, 3.7:1, 3.8:1, 3.9:1, 4:1, 4.1:1, 4.2:1, 4.3:1, 4.4:1, 4.5:1, 4.6:1, 4.7:1, 4.8:1, 4.9:1, 또는 5:1 또는 그 근처이다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수는 1×108, 1.1×108, 1.2×108, 1.3×108, 1.4×108, 1.5×108, 1.6×108, 1.7×108, 1.8×108, 1.9×108, 2×108, 2.1×108, 2.2×108, 2.3×108, 2.4×108, 2.5×108, 2.6×108, 2.7×108, 2.8×108, 2.9×108, 3×108, 3.1×108, 3.2×108, 3.3×108, 3.4×108 또는 3.5×108 또는 그 근처 개의 APC이고, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수는 3.5×108, 3.6×108, 3.7×108, 3.8×108, 3.9×108, 4×108, 4.1×108, 4.2×108, 4.3×108, 4.4×108, 4.5×108, 4.6×108, 4.7×108, 4.8×108, 4.9×108, 5×108, 5.1×108, 5.2×108, 5.3×108, 5.4×108, 5.5×108, 5.6×108, 5.7×108, 5.8×108, 5.9×108, 6×108, 6.1×108, 6.2×108, 6.3×108, 6.4×108, 6.5×108, 6.6×108, 6.7×108, 6.8×108, 6.9×108, 7×108, 7.1×108, 7.2×108, 7.3×108, 7.4×108, 7.5×108, 7.6×108, 7.7×108, 7.8×108, 7.9×108, 8×108, 8.1×108, 8.2×108, 8.3×108, 8.4×108, 8.5×108, 8.6×108, 8.7×108, 8.8×108, 8.9×108, 9×108, 9.1×108, 9.2×108, 9.3×108, 9.4×108, 9.5×108, 9.6×108, 9.7×108, 9.8×108, 9.9×108 또는 1×109 또는 그 근처 개의 APC이다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수는 1.5×108 또는 그 근처 개의 APC 내지 3×108 또는 그 근처 개의 APC의 범위로부터 선택되고, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수는 4×108 또는 그 근처 개의 APC 내지 7.5×108 또는 그 근처 개의 APC의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수는 2×108 또는 그 근처 개의 APC 내지 2.5×108 또는 그 근처 개의 APC의 범위로부터 선택되고, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수는 4.5×108 또는 그 근처 개의 APC 내지 5.5×108 또는 그 근처 개의 APC의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 동안에 외인성으로 공급된 APC의 수는 2.5×108 또는 그 근처 개의 APC이고, 급속 제2 확장 동안에 공급된 APC의 수는 5×108 또는 그 근처 개의 APC이고.
일 실시형태에서, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 첨가된 at 프라이밍 제1 확장의 0일째는 프라이밍 제1 확장의 7일째 (예를 들어, 방법의 7일째)에 첨가된 PBMC의 수의 대략 2분의 1이다. 특정 실시형태에서, 방법은 프라이밍 제1 확장의 0일째의 항원 제시 세포를 TIL의 제1 집단에 첨가하고 7일째의 항원 제시 세포를 TIL의 제2 집단에 첨가하는 것을 포함하고, 0일째에 첨가된 항원 제시 세포의 수는 프라이밍 제1 확장의 7일째 (예를 들어, 방법의 7일째)에 첨가된 항원 제시 세포의 수의 대략 50%이다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수는 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 PBMC의 수보다 더 크다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 1.0×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 4.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에서 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 1.5×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 3.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에서 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 2×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 3×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에서 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 2×106 APC/cm2 또는 그 근처의 밀도에서 배양 플라스크에서 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 1.0×106, 1.1×106, 1.2×106, 1.3×106, 1.4×106, 1.5×106, 1.6×106, 1.7×106, 1.8×106, 1.9×106, 2×106, 2.1×106, 2.2×106, 2.3×106, 2.4×106, 2.5×106, 2.6×106, 2.7×106, 2.8×106, 2.9×106, 3×106, 3.1×106, 3.2×106, 3.3×106, 3.4×106, 3.5×106, 3.6×106, 3.7×106, 3.8×106, 3.9×106, 4×106, 4.1×106, 4.2×106, 4.3×106, 4.4×106 또는 4.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 밀도에서 배양 플라스크에서 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 2.5×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 7.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에서 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 3.5×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 약 6.0×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에서 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 4.0×106 APC/cm2 또는 그 근처내지 약 5.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에서 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 4.0×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에서 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 2.5×106 APC/cm2, 2.6×106 APC/cm2, 2.7×106 APC/cm2, 2.8×106, 2.9×106, 3×106, 3.1×106, 3.2×106, 3.3×106, 3.4×106, 3.5×106, 3.6×106, 3.7×106, 3.8×106, 3.9×106, 4×106, 4.1×106, 4.2×106, 4.3×106, 4.4×106, 4.5×106, 4.6×106, 4.7×106, 4.8×106, 4.9×106, 5×106, 5.1×106, 5.2×106, 5.3×106, 5.4×106, 5.5×106, 5.6×106, 5.7×106, 5.8×106, 5.9×106, 6×106, 6.1×106, 6.2×106, 6.3×106, 6.4×106, 6.5×106, 6.6×106, 6.7×106, 6.8×106, 6.9×106, 7×106, 7.1×106, 7.2×106, 7.3×106, 7.4×106 또는 7.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 밀도에서 배양 플라스크에서 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 1.0×106, 1.1×106, 1.2×106, 1.3×106, 1.4×106, 1.5×106, 1.6×106, 1.7×106, 1.8×106, 1.9×106, 2×106, 2.1×106, 2.2×106, 2.3×106, 2.4×106, 2.5×106, 2.6×106, 2.7×106, 2.8×106, 2.9×106, 3×106, 3.1×106, 3.2×106, 3.3×106, 3.4×106, 3.5×106, 3.6×106, 3.7×106, 3.8×106, 3.9×106, 4×106, 4.1×106, 4.2×106, 4.3×106, 4.4×106 또는 4.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 밀도에서 배양 플라스크에서 씨딩되고 급속 제2 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 2.5×106 APC/cm2, 2.6×106 APC/cm2, 2.7×106 APC/cm2, 2.8×106, 2.9×106, 3×106, 3.1×106, 3.2×106, 3.3×106, 3.4×106, 3.5×106, 3.6×106, 3.7×106, 3.8×106, 3.9×106, 4×106, 4.1×106, 4.2×106, 4.3×106, 4.4×106, 4.5×106, 4.6×106, 4.7×106, 4.8×106, 4.9×106, 5×106, 5.1×106, 5.2×106, 5.3×106, 5.4×106, 5.5×106, 5.6×106, 5.7×106, 5.8×106, 5.9×106, 6×106, 6.1×106, 6.2×106, 6.3×106, 6.4×106, 6.5×106, 6.6×106, 6.7×106, 6.8×106, 6.9×106, 7×106, 7.1×106, 7.2×106, 7.3×106, 7.4×106 또는 7.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 밀도에서 배양 플라스크에서 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 약 1.0×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 4.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에서 씨딩되고, 급속 제2 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 2.5×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 7.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에서 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 1.5×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 3.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에서 씨딩되고, 급속 제2 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 3.5×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 6×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에서 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 2×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 3×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에서 씨딩되고, 급속 제2 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 약 4×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 5.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에서 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 2×106 APC/cm2 또는 그 근처의 밀도에서 배양 플라스크에서 씨딩되고 급속 제2 확장에서 외인성으로 공급된 APC는 4×106 APC/cm2 또는 그 근처의 밀도에서 배양 플라스크에서 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 PBMC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 20:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 PBMC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 10:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 PBMC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 9:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 8:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 7:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 6:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 5:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 4:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 3:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.9:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.8:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.7:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.6:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.5:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.4:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.3:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.2:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.1:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 1.1:1 또는 그 근처 내지 2:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 10:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 5:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 4:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 3:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.9:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.8:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.7:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.6:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.5:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.4:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.3:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 약 2:1 또는 그 근처 내지 2.2:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 2:1 또는 그 근처 내지 2.1:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 약 2:1 또는 그 근처이다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수 대 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수의 비는 약 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 2.6:1, 2.7:1, 2.8:1, 2.9:1, 3:1, 3.1:1, 3.2:1, 3.3:1, 3.4:1, 3.5:1, 3.6:1, 3.7:1, 3.8:1, 3.9:1, 4:1, 4.1:1, 4.2:1, 4.3:1, 4.4:1, 4.5:1, 4.6:1, 4.7:1, 4.8:1, 4.9:1, 또는 5:1 또는 그 근처이다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수는 1×108, 1.1×108, 1.2×108, 1.3×108, 1.4×108, 1.5×108, 1.6×108, 1.7×108, 1.8×108, 1.9×108, 2×108, 2.1×108, 2.2×108, 2.3×108, 2.4×108, 2.5×108, 2.6×108, 2.7×108, 2.8×108, 2.9×108, 3×108, 3.1×108, 3.2×108, 3.3×108, 3.4×108 또는 3.5×108 또는 그 근처 개의 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC이고, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수는 3.5×108, 3.6×108, 3.7×108, 3.8×108, 3.9×108, 4×108, 4.1×108, 4.2×108, 4.3×108, 4.4×108, 4.5×108, 4.6×108, 4.7×108, 4.8×108, 4.9×108, 5×108, 5.1×108, 5.2×108, 5.3×108, 5.4×108, 5.5×108, 5.6×108, 5.7×108, 5.8×108, 5.9×108, 6×108, 6.1×108, 6.2×108, 6.3×108, 6.4×108, 6.5×108, 6.6×108, 6.7×108, 6.8×108, 6.9×108, 7×108, 7.1×108, 7.2×108, 7.3×108, 7.4×108, 7.5×108, 7.6×108, 7.7×108, 7.8×108, 7.9×108, 8×108, 8.1×108, 8.2×108, 8.3×108, 8.4×108, 8.5×108, 8.6×108, 8.7×108, 8.8×108, 8.9×108, 9×108, 9.1×108, 9.2×108, 9.3×108, 9.4×108, 9.5×108, 9.6×108, 9.7×108, 9.8×108, 9.9×108 또는 1x109 또는 그 근처 개의 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC이다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수는 1×108 또는 그 근처 개의 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC 내지 3.5×108 또는 그 근처 개의 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 범위로부터 선택되고, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수는 3.5×108 또는 그 근처 개의 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC 내지 1×109 또는 그 근처 개의 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수는 1.5×108 또는 그 근처 개의 APC 내지 3×108 또는 그 근처 개의 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 범위로부터 선택되고, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수는 4×108 또는 그 근처 개의 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC 내지 7.5×108 또는 그 근처 개의 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수는 2×108 또는 그 근처 개의 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC 내지 2.5×108 또는 그 근처 개의 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 범위로부터 선택되고, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수는 4.5×108 또는 그 근처 개의 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC 내지 5.5×108 또는 그 근처 개의 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수는 2.5×108 또는 그 근처 개의 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC이고, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 수는 약 5×108 또는 그 근처 개의 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC이다.
일 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째에서 첨가된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 층 수는 급속 제2 확장의 7일째에 첨가된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 층 수의 대략 2분의 1이다. 특정 실시형태에서, 방법은 프라이밍 제1 확장의 0일째에서의 항원 제시 세포 층을 TIL의 제1 집단에 첨가하고 7일째에서의 항원 제시 세포 층을 TIL의 제2 집단에 첨가하는 것을 포함하고, 0일째에 첨가된 항원 제시 세포 층의 수는 7일째에 첨가된 항원 제시 세포 층의 수의 대략 50%이다.
또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 7일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 층 수는 프라이밍 제1 확장의 0일째에 외인성으로 공급된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 층 수보다 더 크다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 2 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어나고 급속 제2 확장의 7일째는 4 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어난다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 하나 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어나고 급속 제2 확장의 7일째는 3 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어난다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 1.5 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 2.5 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어나고 급속 제2 확장의 7일째는 3 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어난다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 하나 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어나고 급속 제2 확장의 7일째는 2 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어난다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어나고 급속 제2 확장의 7일째는 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어난다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 1 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 2 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어나고 급속 제2 확장의 7일째는 3 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 10 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어난다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 2 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 3 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어나고 급속 제2 확장의 7일째는 4 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 8 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어난다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 2 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어나고 급속 제2 확장의 7일째는 4 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 8 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어난다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 1, 2 또는 3 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어나고 급속 제2 확장의 7일째는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC에서 일어난다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:10 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:8 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:7 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:6 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:5 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:4 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:3 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.2 또는 그 근처 내지 1:8 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.3 또는 그 근처 내지 1:7 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.4 또는 그 근처 내지 1:6 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.5 또는 그 근처 내지 1:5 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.6 또는 그 근처 내지 1:4 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.7 또는 그 근처 내지 1:3.5 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.8 또는 그 근처 내지 1:3 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.9 또는 그 근처 내지 1:2.5 또는 그 근처의 범위로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1: 2 또는 그 근처이다.
또 다른 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장의 0일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, 급속 제2 확장의 7일째는 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상화된 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 존재에서 일어나고, (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제1 층 수 대 (예를 들어, PBMC를 포함하는) APC의 제2 층 수의 비는 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3.6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4, 1:4.1, 1:4.2, 1:4.3, 1:4.4, 1:4.5, 1:4.6, 1:4.7, 1:4.8, 1:4.9, 1:5, 1:5.1, 1:5.2, 1:5.3, 1:5.4, 1:5.5, 1:5.6, 1:5.7, 1:5.8, 1:5.9, 1:6, 1:6.1, 1:6.2, 1:6.3, 1:6.4, 1:6.5, 1:6.6, 1:6.7, 1:6.8, 1:6.9, 1:7, 1:7.1, 1:7.2, 1:7.3, 1:7.4, 1:7.5, 1:7.6, 1:7.7, 1:7.8, 1:7.9, 1:8, 1:8.1, 1:8.2, 1:8.3, 1:8.4, 1:8.5, 1:8.6, 1:8.7, 1:8.8, 1:8.9, 1:9, 1:9.1, 1:9.2, 1:9.3, 1:9.4, 1:9.5, 1:9.6, 1:9.7, 1:9.8, 1:9.9 또는 1:10 또는 그 근처로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 중의 APC의 수는 약 1.0×106 APC/cm2 내지 약 4.5×106 APC/cm2의 범위로부터 선택되고, 급속 제2 확장 중의 APC의 수는 약 2.5×106 APC/cm2 내지 약 7.5×106 APC/cm2의 범위로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 중의 APC의 수는 약 1.5×106 APC/cm2 내지 약 3.5×106 APC/cm2의 범위로부터 선택되고, 급속 제2 확장 중의 APC의 수는 약 3.5×106 APC/cm2 내지 약 6.0×106 APC/cm2의 범위로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 중의 APC의 수는 약 2.0×106 APC/cm2 내지 약 3.0×106 APC/cm2의 범위로부터 선택되고, 급속 제2 확장 중의 APC의 수는 약 4.0×106 APC/cm2 내지 약 5.5×106 APC/cm2의 범위로부터 선택된다.
H. 선택적 세포 배지 구성요소
1. 항-CD3 항체
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 확장 방법에 사용되는 배양 배지 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b)를 참조함)는 항-CD3 항체를 포함한다. IL-2와 조합된 항-CD3 항체는 TIL 집단에서 T 세포 활성화 및 세포 분열을 유도한다. 이 효과는 전장 항체뿐만 아니라 Fab 및 F(ab')2 단편에서 볼 수 있고, 전자가 일반적으로 바람직하고; 예를 들어, 문헌[Tsoukas 등, J. Immunol. 1985, 135, 1719]을 참조하고, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
당업자에 의해 인정되는 바와 같이, 쥣과, 인간, 영장류, 랫트, 및 갯과 항체를 비제한적으로 포함하는 다양한 포유동물로부터의 항-인간 CD3 다클론성 및 단클론성 항체를 비롯하여 본 발명에 사용되는 수많은 적합한 항-인간 CD3 항체가 있다. 특정 실시형태에서, OKT3 항-CD3 항체가 사용된다 (뉴저지주 라리탄 소재의 Ortho-McNeil 또는 캘리포니아주 아우번 소재의 Miltenyi Biotech로부터 상업적으로 입수가능함).
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2. 4-1BB (CD137) 효능제
일 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 및/또는 급속 제2 확장의 세포 배양 배지는 TNFRSF 효능제를 포함한다. 일 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB (CD137) 효능제이다. 4-1BB 효능제는 당업계에서 알려진 임의의 4-1BB 결합 분자일 수 있다. 4-1BB 결합 분자는 인간 또는 포유류 4-1BB에 결합할 수 있는 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 4-1BB 효능제 또는 4-1BB 결합 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 아이소타입 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 중쇄를 포함할 수 있다. 4-1BB 효능제 또는 4-1BB 결합 분자는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 가질 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 결합 분자는 또한 항체 (전장 항체 포함), 단클론성 항체 (전장 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 인간, 인간화된 또는 키메라 항체, 및 항체 단편, 예를 들어, Fab 단편, F(ab′) 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편, 및 조작된 형태의 항체, 예를 들어, 4-1BB에 결합하는 scFv 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 완전 인간 항체 인 항원 결합 단백질이다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 인간화된 항체 인 항원 결합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 현재 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 4-1BB 효능제는 항-4-1BB 항체, 인간 항-4-1BB 항체, 마우스 항-4-1BB 항체, 포유류 항-4-1BB 항체, 단클론성 항-4-1BB 항체, 다클론성 항-4-1BB 항체, 키메라 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 아드넥틴, 항-4-1BB 도메인 항체, 단일 사슬 항-4-1BB 단편, 중쇄 항-4-1BB 단편, 경쇄 항-4-1BB 단편, 항-4-1BB 융합 단백질, 및 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 또는 바이오시밀러를 포함한다. 작용적 항-4-1BB 항체는 강한 면역 반응을 포함하는 것으로 알려져 있다. 문헌[Lee, 등, PLOS One 2013, 8, e69677]. 바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 작용적, 항-4-1BB 인간화된 또는 완전 인간 단클론성 항체 (즉, 단세포주에서 유래된 항체)이다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 EU-101 (Eutilex Co. Ltd.), 유토밀루맙, 또는 우렐루맙, 또는 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 또는 바이오시밀러이다. 바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 유토밀루맙 또는 우렐루맙, 또는 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 또는 바이오시밀러이다.
바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제 또는 4-1BB 결합 분자는 또한 융합 단백질일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, (3개 또는 6개의 리간드 결합 도메인을 갖는) 다량체 4-1BB 효능제, 예컨대 삼량체 또는 육량체 4-1BB 효능제는, 전형적으로 2개의 리간드 결합 도메인을 보유하는 작용적 단클론성 항체와 비교하여 우수한 수용체 (4-1BBL) 클러스터링 및 내부 세포 신호전달 착물 형성을 유도할 수 있다. 3개의 TNFRSF 결합 도메인 및 IgG1-Fc를 포함하고 선택적으로 이들 융합 단백질 중 2종 이상을 추가로 연결하는 삼량체 (3가) 또는 육량체 (또는 6가) 또는 그 초과의 융합 단백질은 예를 들어, 문헌[Gieffers, 등, Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47]에 기재되어 있다.
작용적 4-1BB 항체 및 융합 단백질은 강한 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 독성을 감소시키기에 충분한 방식으로 4-1BB 항원에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 항체-의존적 세포 독성 (ADCC), 예를 들어, NK 세포 세포독성을 제거한 작용적 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 항체-의존적 세포 포식작용 (ADCP)을 제거한 작용적 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 제거한 작용적 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 Fc 영역 작용성을 제거한 작용적 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다.
일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 고친화도 및 작용적 활성으로 인간 4-1BB (서열번호:9)에 결합하는 것을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 인간 4-1BB (서열번호:9)에 결합하는 결합 분자이다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 쥣과 4-1BB (서열번호:10)에 결합하는 결합 분자이다. 4-1BB 효능제 또는 결합 분자가 결합하는 4-1BB 항원의 아미노산 서열은 표 22에 요약된다.
Figure pct00029
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 100 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 90 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 80 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 70 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 60 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 50 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 40 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하거나, 또는 약 30 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 8 × 105 l/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 8.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 9 × 105 1/M·s 이상의로 kassoc 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 9.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하거나, 또는 약 1 × 106 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.1 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.4 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.5 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.6 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하거나 또는 약 2.7 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.8 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2.9 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하거나, 또는 약 3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 10 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 9 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 8 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 7 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 6 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 5 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 4 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 3 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 약 2 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하고, 또는 약 1 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 PF-05082566 또는 MOR-7480로도 알려져 있는 유토밀루맙, 또는 단편, 유도체, 변이체, 또는 그의 바이오시밀러이다. 유토밀루맙은 Pfizer, Inc로부터 입수 가능하다. 유토밀루맙은 면역글로불린 G2-람다, 항-[호모사피엔스 TNFRSF9 (종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 슈퍼패밀리 멤버 9, 4-1BB, T 세포 항원 ILA, CD137)], 호모사피엔스 (완전 인간) 단클론성 항체이다. 유토밀루맙의 아미노산 서열은 표 7에 제시된다. 유토밀루맙은 Asn59 및 Asn292에서 글리코실화 부위; 위치 22-96 (VH-VL), 143-199 (CH1-CL), 256-316 (CH2) 및 362-420 (CH3)에서 중쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; 위치 22'-87' (VH-VL) 및 136'-195' (CH1-CL)에서 경쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; IgG2A 동형체 위치 218-218, 219-219, 222-222, 및 225-225에서, IgG2A/B 동형체 위치 218-130, 219-219, 222-222, 및 225-225에서, 그리고 IgG2B 동형체 위치 219-130 (2), 222-222, 및 225-225에서 사슬간 중쇄-중쇄 디설파이드 브릿지; 및 IgG2A 동형체 위치 130-213' (2), IgG2A/B 동형체 위치 218-213' 및 130-213'에서, 그리고 IgG2B 동형체 위치 218-213' (2)에서 사슬간 중쇄-경쇄 디설파이드 브릿지를 포함한다. 유토밀루맙 및 그것의 변이체 및 단편의 제조 및 특성은 미국 특허 제8,821,867; 8,337,850호; 및 제9,468,678호, 및 국제공개 WO 2012/032433 A1호에 기재되어 있고, 이들 각각의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 유토밀루맙의 전임상 특성은 문헌[Fisher, 등, Cancer Immunolog. & Immunother. 2012 , 61, 1721-33]에 기재되어 있다. 다양한 혈액학적 및 고형 종양 징후에서 유토밀루맙의 현재 임상 시험은 미국 국립 보건원 clinicaltrials.gov 식별자 NCT02444793, NCT01307267, NCT02315066, 및 NCT02554812를 포함한다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:11로 제시된 중쇄 및 서열번호:12로 제시된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 콘주게이트를 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:11 및 서열번호:12 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 유토밀루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제 중쇄 가변 영역 (VH)는 서열번호:13에 제시된 서열을 포함하고 4-1BB 효능제 경쇄 가변 영역 (VL)는 서열번호:14에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 항체를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:15, 서열번호:16, 및 서열번호:17, 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:18, 서열번호:19, 및 서열번호:20 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 유토밀루맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 4-1BB 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 유토밀루맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 4-1BB 효능제 항체이고, 4-1BB 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 유토밀루맙이다. 4-1BB 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 유토밀루맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 유토밀루맙이다.
Figure pct00030
바람직한 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 BMS-663513 및 20H4.9.h4a로도 알려져 있는 단클론성 항체 우렐루맙, 또는 단편, 유도체, 변이체, 또는 그의 바이오시밀러이다. 우렐루맙은 Bristol-Myers Squibb, Inc., 및 Creative Biolabs, Inc.로부터 입수 가능하다. 우렐루맙은 면역글로불린 G4-카파, 항-[호모사피엔스 TNFRSF9 (종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 멤버 9, 4-1BB, T 세포 항원 ILA, CD137)], 호모사피엔스 (완전 인간) 단클론성 항체이다. 우렐루맙의 아미노산 서열은 표 EE에 제시된다. 우렐루맙은 위치 298 (및 298'')에서 N-글리코실화 부위; 위치 22-95 (VH-VL), 148-204 (CH1-CL), 262-322 (CH2) 및 368-426 (CH3)에서 (그리고 위치 22''-95'', 148''-204'', 262''-322'', 및 368''-426''에서) 중쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; 위치 23'-88' (VH-VL) 및 136'-196' (CH1-CL)에서 (그리고 위치 23'''-88''' 및 136'''-196'''에서) 경쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; 위치 227-227'' 및 230-230''에서 사슬간 중쇄-중쇄 디설파이드 브릿지; 및 135-216' 및 135''-216'''에서 사슬간 중쇄-경쇄 디설파이드 브릿지를 포함한다. 우렐루맙 및 그것의 변이체 및 단편의 제조 및 특성은 미국 특허 제7,288,638호 및 제8,962,804호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 우렐루맙의 전임상 및 임상 특성은 문헌[Segal, 등, Clin. Cancer Res. 2016, http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272에서 사용가능함]에 기재되어 있다. 다양한 혈액학적 및 고형 종양 징후에서 우렐루맙의 현재 임상 시험은 미국 국립 보건원 clinicaltrials.gov 식별자 NCT01775631, NCT02110082, NCT02253992, 및 NCT01471210을 포함한다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:21로 제시된 중쇄 및 서열번호:22로 제시된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 콘주게이트를 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:21 및 서열번호:22 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 우렐루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제 중쇄 가변 영역 (VH)는 서열번호:23에 제시된 서열을 포함하고 4-1BB 효능제 경쇄 가변 영역 (VL)는 서열번호:24에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 항체를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 서열번호:25, 서열번호:26, 및 서열번호:27 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:28, 서열번호:29, 및 서열번호:30 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 우렐루맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 4-1BB 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 4-1BB 효능제 항체이고, 4-1BB 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다. 4-1BB 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다.
Figure pct00031
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 1D8, 3Elor, 4B4 (BioLegend 309809), H4-1BB-M127 (BD Pharmingen 552532), BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX), 145501 (Leinco Technologies B591), ATCC 번호 HB-11248로 기탁되고 미국 특허 제6,974,863, 5F4 (BioLegend 31 1503), C65-485 (BD Pharmingen 559446)에 기재된 세포주에 의해 생성된 항체, 미국 특허출원공개 US 2005/0095244호에 개시된 항체, 미국 특허 제7,288,638호에 개시된 항체 (예컨대 20H4.9-IgGl (BMS-663031)), 미국 특허 제6,887,673호에 개시된 항체 (예컨대 4E9 또는 BMS-554271), 미국 특허 제7,214,493호에 개시된 항체, 미국 특허 제6,303,121호에 개시된 항체, 미국 특허 제6,569,997호에 개시된 항체, 미국 특허 제6,905,685호에 개시된 항체 (예컨대 4E9 또는 BMS-554271), 미국 특허 제6,362,325호에 개시된 항체 (예컨대 1D8 또는 BMS-469492; 3H3 또는 BMS-469497; 또는 3El), 미국 특허 제6,974,863호에 개시된 항체 (예컨대 53A2); 미국 특허 제6,210,669호에 개시된 항체 (예컨대 1D8, 3B8, 또는 3El), 미국 특허 제5,928,893호에 기재된 항체, 미국 특허 제6,303,121호에 개시된 항체, 미국 특허 제6,569,997호에 개시된 항체, 국제공개 WO 2012/177788호, WO 2015/119923호, 및 WO 2010/042433호에 개시된 항체, 및 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 또는 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각의 전술한 특허 또는 특허 출원 공개의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 국제공개 WO 2008/025516 A1호, WO 2009/007120 A1호, WO 2010/003766 A1호, WO 2010/010051 A1호, 및 WO 2010/078966 A1; 미국 특허출원공개 US 2011/0027218 A1호, US 2015/0126709 A1호, US 2011/0111494 A1호, US 2015/0110734 A1호, 및 US 2015/0126710 A1호; 및 미국 특허 제9,359,420호, 제9,340,599호, 제8,921,519호, 및 제8,450,460호에 기재된 4-1BB 작용적 융합 단백질이고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 도 10에 제공된 바와 같은 구조 I-A (C-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질) 또는 구조 I-B (N-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질)에 도시된 바와 같은 4-1BB 작용적 융합 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 또는 바이오시밀러이다 (도 50 참조). 구조 I-A 및 I-B에서, 실린더(cylinder)는 개별 폴리펩티드 결합 도메인을 지칭한다. 구조 I-A 및 I-B는 예를 들어, 4-1BBL(4-1BB 리간드, CD137 리간드 (CD137L), 또는 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 멤버 9(TNFSF9))로부터 유래된 3개의 선형-연결된 TNFRSF 결합 도메인, 또는 4-1BB에 결합하는 항체를 포함하고, 이는 폴딩되어 3가 단백질을 형성하고, 이어서 IgG1-Fc를 통해 제2 3가 단백질에 연결되고 (CH3 및 CH2 도메인을 포함함), 이어서 3가 단백질 중 2개를 설파이드 결합 (작은 신장된 계란형)을 통해 함께 연결하는데 사용되어, 구조를 안정화시키고, 6개의 수용체의 세포내 신호전달 도메인 및 신호전달 단백질을 합쳐서 신호전달 복합체를 형성할 수 있는 효능제를 제공한다. 실린더로 표시된 TNFRSF 결합 도메인은 예를 들어, 가요성을 위한 Gly 및 Ser 서열과 친수성 잔기뿐만 아니라 용해도를 위한 Glu 및 Lys를 포함할 수 있는 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함하는 scFv 도메인일 수 있다. 임의의 scFv 도메인 디자인은 문헌[de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44]; 문헌[Ahmad, 등, Clin. & Dev. Immunol. 2012, 980250]; 문헌[Monnier, 등, Antibodies, 2013, 2, 193-208]; 또는 본원의 다른 곳에 포함된 참조문헌에 기재된 것과 같이 사용될 수 있다. 이러한 형태의 융합 단백질 구조는 미국 특허 제9,359,420호, 제9,340,599호, 제8,921,519호, 및 제8,450,460호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
구조 I-A의 다른 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 9에 주어진다. Fc 도메인은 바람직하게는 완전 불변 도메인 (서열번호:31의 아미노산 17-230), 완전 힌지 도메인 (서열번호:31의 아미노산 1-16) 또는 힌지 도메인의 일부 (예를 들어, 서열번호:31의 아미노산 4-16)를 포함한다. C-말단 Fc-항체를 연결하기 위한 바람직한 링커는 추가의 폴리펩티드의 융합에 적합한 링커를 포함하여 서열번호:32 내지 서열번호:41에 주어진 실시형태로부터 선택될 수 있다.
Figure pct00032
구조 I-B의 다른 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 10에 주어진다. Fc 항체 단편이 구조 I-B에서와 같이 TNRFSF 융합 단백질의 N-말단에 융합되는 경우, Fc 모듈의 서열은 바람직하게는 서열번호:42에 제시된 것이고, 링커 서열은 바람직하게는 서열번호:43 내지 서열번호:45에 제시된 실시형태로부터 선택된다.
Figure pct00033
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 유토밀루맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 우렐루맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 유토밀루맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 표 10에 기재된 가변 중쇄 및 가변 경쇄로부터 선택된 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 전술한 가변 중쇄와 가변 경쇄의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인, 및 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 및 바이오시밀러를 포함한다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 4-1BBL 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 서열번호:46에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 가용성 4-1BBL 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 서열번호:47에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:13 및 서열번호:14 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함, 이들 각각은 서열번호:23 및 서열번호:24 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 표 11에 주어진 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다.
Figure pct00034
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 (i) 제1 가용성 4-1BB 결합 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 4-1BB 결합 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, N-말단 및/또는 C-말단에서 추가의 도메인을 추가로 포함하는 4-1BB 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 추가의 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 (i) 제1 가용성 4-1BB 결합 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 4-1BB 결합 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, 추가로 N-말단 및/또는 C-말단에서 추가의 도메인을 포함하는 4-1BB 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 추가의 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이고, 각각의 가용성 4-1BB 도메인은 줄기 영역(삼량체화에 기여하고 세포막에 일정한 거리를 제공하지만 4-1BB 결합 도메인의 일부가 아님)이 결여되고 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3 내지 8개의 아미노산의 길이를 갖는다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 (i) 제1 가용성 종양 괴사 인자 (TNF) 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인을 포함하는 4-1BB 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 각각의 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 줄기 영역이 결여되어 있고 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3 내지 8개의 아미노산의 길이를 가지며, 그리고 각각의 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 4-1BB 결합 도메인이다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 전술한 VL 도메인 중 임의의 것에 연결된 전술한 VH 도메인의 임의의 것을 포함하는 4-1BB 작용적 scFv 항체이다.
일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 BPS Bioscience로부터 상업적으로 입수가능한 BPS Bioscience 4-1BB 효능제 항체 카탈로그 번호 79097-2이다. 일 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 미국 뉴욕주 셜리 소재의 Creative Biolabs로부터 상업적으로 입수가능한 Creative Biolabs 4-1BB 효능제 항체 카탈로그 번호 MOM-18179이다.
3. OX40 (CD134) 효능제
일 실시형태에서, TNFRSF 효능제는 OX40 (CD134) 효능제이다. OX40 효능제는 당업계에서 알려진 임의의 OX40 결합 분자일 수 있다. OX40 결합 분자는 인간 또는 포유류 OX40에 결합할 수 있는 단클론성 항체 또는 융합 단백질일 수 있다. OX40 효능제 또는 OX40 결합 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 아이소타입 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 중쇄를 포함할 수 있다. OX40 효능제 또는 OX40 결합 분자는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 가질 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 결합 분자는 또한 항체 (전장 항체 포함), 단클론성 항체 (전장 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 인간, 인간화된 또는 키메라 항체, 및 항체 단편, 예를 들어, Fab 단편, F(ab′) 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편, 및 조작된 형태의 항체, 예를 들어, OX40에 결합하는 scFv 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 완전 인간 항체 인 항원 결합 단백질이다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 인간화된 항체 인 항원 결합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 현재 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 OX40 효능제는 항-OX40 항체, 인간 항-OX40 항체, 마우스 항-OX40 항체, 포유류 항-OX40 항체, 단클론성 항-OX40 항체, 다클론성 항-OX40 항체, 키메라 항-OX40 항체, 항-OX40 아드넥틴, 항-OX40 도메인 항체, 단일 사슬 항-OX40 단편, 중쇄 항-OX40 단편, 경쇄 항-OX40 단편, 항-OX40 융합 단백질, 및 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 또는 바이오시밀러를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, OX40 효능제는 작용적, 항-OX40 인간화된 또는 완전 인간 단클론성 항체 (즉, 단세포주에서 유래된 항체)이다.
바람직한 실시형태에서, OX40 효능제 또는 OX40 결합 분자는 융합 단백질일 수 있다. OX40L에 융합된 Fc 도메인을 포함하는 OX40 융합 단백질은 예를 들어, 문헌[Sadun, 등, J. Immunother. 2009, 182, 1481-89]에 기재되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 다량체 OX40 효능제, 예컨대 (3개 또는 6개의 리간드 결합 도메인을 갖는) 삼량체 또는 육량체 OX40 효능제는, 전형적으로 2개의 리간드 결합 도메인을 보유하는 작용적 단클론성 항체와 비교하여 우수한 수용체 (OX40L) 클러스터링 및 내부 세포 신호전달 착물 형성을 유도할 수 있다. 3개의 TNFRSF 결합 도메인 및 IgG1-Fc를 포함하고 선택적으로 이들 융합 단백질 중 2종 이상을 추가로 연결하는 삼량체 (3가) 또는 육량체 (또는 6가) 또는 그 초과의 융합 단백질은 예를 들어, 문헌[Gieffers, 등, Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47]에 기재되어 있다.
작용적 OX40 항체 및 융합 단백질은 강한 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 문헌[Curti, 등, Cancer Res. 2013, 73, 7189-98]. 바람직한 실시형태에서, OX40 효능제는 독성을 감소시키는 데 충분한 방식으로 OX40 항원에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체-의존적 세포 독성 (ADCC), 예를 들어, NK 세포 세포독성을 제거하는 작용적 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체-의존적 세포 포식작용 (ADCP)을 제거하는 작용적 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 제거하는 작용적 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 Fc 영역 작용성을 제거하는 작용적 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다.
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 고친화도 및 작용적 활성으로 인간 OX40 (서열번호:54)에 결합하는 것을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 인간 OX40 (서열번호:54)에 결합하는 결합 분자이다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 쥣과 OX40 (서열번호:55)에 결합하는 결합 분자이다. OX40 효능제 또는 결합 분자가 결합하는 OX40 항원의 아미노산 서열은 표 12에 요약된다.
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일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 100 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 90 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 80 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 70 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 60 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 50 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 40 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 또는 약 30 pM 이하의 KD로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 8 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 8.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 9 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 9.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 또는 약 1 × 106 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.1 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.4 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.5 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.6 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하거나 또는 약 2.7 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.8 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2.9 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하거나, 또는 약 3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 10 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 9 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 8 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 7 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 6 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 5 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 4 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 3 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하고, 약 2 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하거나, 또는 약 1 nM 이하의 IC50로 인간 또는 쥣과 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 MEDI0562 또는 MEDI-0562로도 알려져 있는 타볼릭시주맙이다. 타볼릭시주맙은 AstraZeneca, Inc의 MedImmune 자회사로부터 입수 가능하다. 타볼릭시주맙은 면역글로불린 G1-카파, 항-[호모사피엔스 TNFRSF4 (종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 슈퍼패밀리 멤버 4, OX40, CD134)], 키메라 단클론성 항체이다. 타볼릭시주맙의 아미노산 서열은 표 13에 제시된다. 타볼릭시주맙은 푸코실화된 복합체 바이-안테너리 CHO-유형 글리칸과 함께 위치 301 및 301''에서 N-글리코실화 부위; 위치 22-95 (VH-VL), 148-204 (CH1-CL), 265-325 (CH2)에서 및 371-429 (CH3) (그리고 위치 22''-95'', 148''-204'', 265''-325'', 및 371''-429''에서) 중쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; 위치 23'-88' (VH-VL) 및 134'-194' (CH1-CL)에서 (그리고 위치 23'''-88''' 및 134'''-194'''에서) 경쇄 사슬내 디설파이드 브릿지; 위치 230-230'' 및 233-233''에서 사슬간 중쇄-중쇄 디설파이드 브릿지; 및 224-214' 및 224''-214'''에서 사슬간 중쇄-경쇄 디설파이드 브릿지를 포함한다. 다양한 고형 종양 징후에서 타볼릭시주맙의 현재 임상 시험은 미국 국립 보건원 clinicaltrials.gov 식별자 NCT02318394 및 NCT02705482를 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:56로 제시된 중쇄 및 서열번호:57로 제시된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 콘주게이트를 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:56 및 서열번호:57 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 타볼릭시주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역 (VH)는 서열번호:58에 제시된 서열을 포함하고 OX40 효능제 경쇄 가변 영역 (VL)는 서열번호:59에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 항체를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:60, 서열번호:61, 및 서열번호:62 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:63, 서열번호:64, 및 서열번호:65 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 타볼릭시주맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 OX40 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 OX40 효능제 항체이고, OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다.
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일부 실시형태에서, OX40 효능제는 11D4이고, 이는 Pfizer, Inc.에서 입수가능한 완전 인간 항체이다. 11D4의 제조 및 특성은 미국 특허 제7,960,515호; 제8,236,930호; 및 제9,028,824호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 11D4의 아미노산 서열은 표 14에 제시된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:66로 제시된 중쇄 및 서열번호:67로 제시된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 콘주게이트를 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:66 및 서열번호:67 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 11D4의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역 (VH)는 서열번호:68에 제시된 서열을 포함하고 OX40 효능제 경쇄 가변 영역 (VL)는 서열번호:69에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:70, 서열번호:71, 및 서열번호:72 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:73, 서열번호:74, 및 서열번호:75 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 11D4와 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 OX40 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 OX40 효능제 항체이고, 상기 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다.
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일부 실시형태에서, OX40 효능제는 18D8이고, 이는 Pfizer, Inc.에서 입수가능한 완전 인간 항체이다. 18D8의 제조 및 특성은 미국 특허 제7,960,515호; 제8,236,930호; 및 제9,028,824호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 18D8의 아미노산 서열은 표 15에 제시된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:76로 제시된 중쇄 및 서열번호:77로 제시된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 콘주게이트를 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:76 및 서열번호:77 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 18D8의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역 (VH)는 서열번호:78에 제시된 서열을 포함하고 OX40 효능제 경쇄 가변 영역 (VL)는 서열번호:79에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:80, 서열번호:81, 및 서열번호:82 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:83, 서열번호:84, 및 서열번호:85 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 18D8과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 OX40 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 OX40 효능제 항체이고, 상기 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다.
Figure pct00038
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu119-122이고, 이는 GlaxoSmithKline plc.에서 입수가능한 인간화된 항체이다. Hu119-122의 제조 및 특성은 미국 특허 제9,006,399호 및 제9,163,085호, 및 국제 특허 공개 WO 2012/027328호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. Hu119-122의 아미노산 서열은 표 16에 제시된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu119-122의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역 (VH)는 서열번호:86에 제시된 서열을 포함하고 OX40 효능제 경쇄 가변 영역 (VL)는 서열번호:87에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:88, 서열번호:89, 및 서열번호:90 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:91, 서열번호:92, 및 서열번호:93 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu119-122와 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 OX40 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 OX40 효능제 항체이고, 상기 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다.
Figure pct00039
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu106-222 이고, 이는 GlaxoSmithKline plc.에서 입수가능한 인간화된 항체이다. Hu106-222의 제조 및 특성은 미국 특허 제9,006,399호 및 제9,163,085호, 및 국제 특허 공개 WO 2012/027328호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. Hu106-222의 아미노산 서열은 표 17에 제시된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu106-222의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역 (VH)는 서열번호:94에 제시된 서열을 포함하고 OX40 효능제 경쇄 가변 영역 (VL)는 서열번호:95에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 서열번호:96, 서열번호:97, 및 서열번호:98 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:99, 서열번호:100, 및 서열번호:101 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 Hu106-222와 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 OX40 효능제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 OX40 효능제 항체이고, 상기 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다.
Figure pct00040
일부 실시형태에서, OX40 효능제 항체는 MEDI6469 (또한 9B12로 지칭됨)이다. MEDI6469는 쥣과 단클론성 항체이다. 문헌[Weinberg, 등, J. Immunother. 2006, 29, 575-585]. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 문헌[Weinberg, 등, J. Immunother. 2006, 29, 575-585]에 기재된 바와 같이 Biovest Inc. (미국 매사추세츠주 말베른 소재)에 기탁된 9B12 하이브리도마에 의해 생성된 항체이고, 그의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 일부 실시형태에서, 항체는 MEDI6469의 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 MEDI6469의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 L106 BD (Pharmingen Product #340420)이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체 L106 (BD Pharmingen Product #340420)의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체 L106 (BD Pharmingen Product #340420)의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 #20073)이다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체 ACT35의 CDR (Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 #20073)를 포함한다. 일부 실시형태에서, OX40 효능제는 항체 ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 #20073)의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 쥣과 단클론성 항체 항-mCD134/mOX40 (클론 OX86)이고, 이는 미국 뉴햄프셔 웨스트 레바논 소재의 InVivoMAb, BioXcell Inc.에서 상업적으로 입수가능하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 국제공개 WO 95/12673호, WO 95/21925호, WO 2006/121810호, WO 2012/027328호, WO 2013/028231호, WO 2013/038191호, 및 WO 2014/148895호; 유럽 특허 출원 EP 0672141호; 미국 특허출원공개 US 2010/136030호, US 2014/377284호, US 2015/190506호, 및 US 2015/132288호 (클론 20E5 및 12H3 포함); 및 미국 특허 제7,504,101호, 제7,550,140호, 제7,622,444호, 제7,696,175호, 제7,960,515호, 제7,961,515호, 제8,133,983호, 제9,006,399호, 및 제9,163,085호에 기재된 OX40 효능제로부터 선택되고, 상기 특허 각각의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 구조 I-A (C-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질) 또는 구조 I-B (N-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질)에 도시된 바와 같은 OX40 작용적 융합 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 또는 바이오시밀러이다. 구조 I-A 및 I-B의 특성은 상기 및 미국 특허 제9,359,420호, 제9,340,599호, 제8,921,519호, 및 제8,450,460호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 구조 I-A의 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 9에 주어진다. Fc 도메인은 바람직하게는 완전 불변 도메인 (서열번호:31의 아미노산 17-230), 완전 힌지 도메인 (서열번호:31의 아미노산 1-16) 또는 힌지 도메인의 일부 (예를 들어, 서열번호:31의 아미노산 4-16)를 포함한다. C-말단 Fc-항체를 연결하기 위한 바람직한 링커는 추가의 폴리펩티드의 융합에 적합한 링커를 포함하여 서열번호:32 내지 서열번호:41에 주어진 실시형태로부터 선택될 수 있다. 마찬가지로, 구조 I-B의 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 10에 주어진다. Fc 항체 단편이 구조 I-B에서와 같이 TNRFSF 융합 단백질의 N-말단에 융합되는 경우, Fc 모듈의 서열은 바람직하게는 서열번호:42에 제시된 것이고, 링커 서열은 바람직하게는 서열번호:43 내지 서열번호:45에 제시된 실시형태로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 타볼릭시주맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 11D4의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 18D8의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, Hu119-122의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, Hu106-222의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 표 17에 기재된 가변 중쇄 및 가변 경쇄로부터 선택된 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 전술한 가변 중쇄와 가변 경쇄의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 OX40 결합 도메인, 및 그의 단편, 유도체, 콘주게이트, 변이체, 및 바이오시밀러를 포함한다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 OX40L 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 서열번호:102에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 가용성 OX40L 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 서열번호:103에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 서열번호:104에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:58 및 서열번호:59 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:68 및 서열번호:69 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:78 및 서열번호:79 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:86 및 서열번호:87 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:94 및 서열번호:95 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 표 14에 주어진 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하고, VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다.
Figure pct00041
Figure pct00042
일 실시형태에서, OX40 효능제는 (i) 제1 가용성 OX40 결합 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 OX40 결합 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 OX40 결합 도메인을 포함하고, N-말단 및/또는 C-말단에서 추가의 도메인을 추가로 포함하는 OX40 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 추가의 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이다. 일 실시형태에서, OX40 효능제는 (i) 제1 가용성 OX40 결합 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 OX40 결합 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 OX40 결합 도메인을 포함하고, N-말단 및/또는 C-말단에서 추가의 도메인을 추가로 포함하는 OX40 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 추가 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이고, 여기서 가용성 OX40 결합 도메인 각각은 줄기 영역이 결여되어 있고 (이는 삼량체화에 기여하고 세포막에 특정 거리를 제공하지만, OX40 결합 도메인의 일부가 아님), 그리고 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3 내지 8개 아미노산의 길이를 갖는다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 (i) 제1 가용성 종양 괴사 인자 (TNF) 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (ii) 제1 펩티드 링커, (iii) 제2 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (iv) 제2 펩티드 링커, 및 (v) 제3 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인을 포함하는 OX40 작용적 단쇄 융합 폴리펩티드이고, 각각의 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 줄기 영역이 결여되어 있고 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3 내지 8개의 아미노산의 길이를 가지며, 그리고 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 OX40 결합 도메인이다.
일부 실시형태에서, OX40 효능제는 MEDI6383이다. MEDI6383은 OX40 작용적 융합 단백질이고 미국 특허 제6,312,700호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있고, 상기 특허의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 전술한 VL 도메인 중 임의의 것에 연결된 전술한 VH 도메인 중 임의의 것을 포함하는 OX40 작용적 scFv 항체이다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 Creative Biolabs OX40 효능제 단클론성 항체 MOM-18455이고, 이는 미국 뉴욕주 셜리 소재의 Creative Biolabs, Inc.로부터 상업적으로 입수가능하다.
일 실시형태에서, OX40 효능제는 미국 뉴욕주 샌디에고 소재의 BioLegend, Inc.로부터 상업적으로 입수가능한 OX40 작용적 항체 클론 Ber-ACT35이다.
I. 선택적 세포 생존력 분석
선택적으로, 세포 생존력 검정은 당업계에서 알려진 표준 검정을 사용하여 프라이밍 제1 확장 (때때로 초기 벌크 확장으로 지칭됨) 후에 수행될 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 방법은 프라이밍 제1 확장에 후속하여 세포 생존력 검정을 수행하는 것을 포함한다. 예를 들어, 트립판 블루 제외 검정은 벌크 TIL의 샘플에 대해 수행될 수 있으며, 이는 선택적으로 죽은 세포를 표지하고 생존력 평가를 허용한다. 생존력을 시험하는데 사용하기 위한 다른 검정은 알라마르 블루 검정; 및 MTT 검정을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
1. 세포수, 생존력, 유세포측정
일부 실시형태에서, 세포수 및/또는 생존력이 측정된다. 마커, 예컨대 비제한적으로 CD3, CD4, CD8, 및 CD56, 뿐만 아니라 본원에 개시되거나 기재된 임의의 다른 것의 발현은 항체, 예를 들어, 비제한적으로 FACSCantoTM 유동 세포측정기 (BD Biosciences)를 사용하여 BD Bio-sciences (미국 캘리포니아주 산호세 소재의 BD Bioscience)로부터 시판되는 것을 사용한 유세포측정에 의해 측정될 수 있다. 세포는 일회용 c-칩 혈구계 (VWR, Batavia, IL)를 사용하여 수동으로 계수될 수 있고, 생존력은 트리판 블루 염색을 포함하나 이에 제한되지는 않는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 세포 생존력은 또한 USSN 15/863,634에 기초하여 분석될 수 있으며, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 세포 생존력은 또한 미국 특허 공개 제2018/0280436호 또는 국제 특허 공개 WO/2018/081473호를 기반으로 검정될 수 있고, 이 둘 모두는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 포함된다.
일부 경우에, 벌크 TIL 집단은 아래에 논의된 프로토콜을 사용하여 즉시 동결보존될 수 있다. 대안적으로, 벌크 TIL 집단은 REP를 거칠 수 있고 그 다음 아래에 논의된 바와 같이 동결보존된다. 유사하게, 유전적으로 변형된 TIL이 요법에 사용될 경우, 벌크 또는 REP TIL 집단은 적합한 치료를 위해 유전자 변형을 거칠 수 있다.
2. 세포 배양물
일 실시형태에서, 상기에 논의될 뿐만 아니라 도 8, 특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c에 예시된 것을 포함하는 TIL을 확장시키는 방법은 약 5,000 mL 내지 약 25,000 mL의 세포 배지, 약 5,000 mL 내지 약 10,000 mL의 세포 배지, 또는 약 5,800 mL 내지 약 8,700 mL의 세포 배지를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지는 무혈청 배지이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장에서의 배지는 무혈청이다. 일부 실시형태에서, 제2 확장에서의 배지는 무혈청이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 제1 확장 및 제2 확장 (또한 급속 제2 확장으로 지칭됨) 둘 모두에서의 배지는 무혈청이다. 일 실시형태에서, TIL의 수를 확장시키는 것은 단지 하나의 유형의 세포 배양 배지를 사용한다. 임의의 적합한 세포 배양 배지가 사용될 수 있고, 그 예는 AIM-V 세포 배지 (L-글루타민, 50 μM 스트렙토마이신 설페이트, 및 10 μM 겐타마이신 설페이트) 세포 배양 배지 (캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen)이다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 TIL의 수를 확장하는데 필요한 배지의 양 및 배지의 유형의 수를 유리하게 감소시킨다. 일 실시형태에서, TIL의 수를 확장하는 것은 3일 또는 4일마다보다 더 빈번하게 세포를 공급하는 것을 포함할 수 있다. 기체 투과성 용기 중의 세포들의 수를 확장시키는 것은 세포를 확장시키는데 필요한 공급 빈도를 감소시킴으로써 세포의 수를 확장하는 데 필요한 절차를 단순화시킨다.
일 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 중의 세포 배양 배지는 여과되지 않는다. 여과되지 않은 세포 배지의 사용은 세포의 수를 확장하는데 필요한 절차를 단순화할 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 중의 세포 배지는 베타-머캅토에탄올(BME)이 결여된다.
일 실시형태에서, 포유동물로부터 종양 조직 샘플을 수득하는 단계; 약 1 내지 8일, 예를 들어, 프라이밍 제1 확장으로서 약 7 일, 또는 프라이밍 제1 확장으로서 약 8일의 지속기간 동안 IL-2, 1X 항원 제시 피더 세포를 함유하는 제1 기체 투과성 용기에서 종양 조직 샘플을 배양하는 단계, 및 TIL을 제2 기체 투과성 용기로 이동시키고 OKT-3을 포함하는 세포 배지; 약 7 내지 9일, 예를 들어, 약 7일, 약 8일, 또는 약 9 일의 지속기간 동안 IL-2, 2X 항원 제시 피더 세포, 및 OKT-3을 포함하는 세포 배지를 함유하는 제2 기체 투과성 용기에서 TIL의 수를 확장시키는 단계를 포함하는 방법의 지속기간.
일 실시형태에서, 포유동물로부터 종양 조직 샘플을 수득하는 단계; 프라이밍 제1 확장으로서 약 1 내지 7일의 기간 동안, 예를 들어, 약 7일 동안 IL-2, 1X 항원 제시 피더 세포 및 OKT-3을 포함하는 세포 배지를 함유하는 제1 기체 투과성 용기에서 종양 조직 샘플을 배양하는 단계; TIL을 제2 기체 투과성 용기로 이동시키고 약 7 내지 9일, 예를 들어, 약 7일, 약 8일, 또는 약 9 일의 지속기간 동안 IL-2, 2X 항원 제시 피더 세포, 및 OKT-3을 포함하는 세포 배지를 함유하는 제2 기체 투과성 용기에서 TIL의 수를 확장시키는 단계를 포함하는 방법의 지속기간.
일 실시형태에서, 포유동물로부터 종양 조직 샘플을 수득하는 단계; 프라이밍 제1 확장으로서 약 1 내지 7일의 기간 동안, 예를 들어, 약 7일의 지속기간 동안 IL-2, 1X 항원 제시 피더 세포 및 OKT-3을 포함하는 세포 배지를 함유하는 제1 기체 투과성 용기에서 종양 조직 샘플을 배양하는 단계; TIL을 제2 기체 투과성 용기로 이동시키고 약 7 내지 10일, 예를 들어, 약 7일, 약 8일, 약 9일 또는 약 10 일의 지속기간 동안, IL-2, 2X 항원 제시 피더 세포, 및 OKT-3을 포함하는 세포 배지를 함유하는 제2 기체 투과성 용기에서 TIL의 수를 확장시키는 단계를 포함하는 방법의 지속기간.
일 실시형태에서, TIL은 기체 투과성 용기에서 확장된다. 기체 투과성 용기는 미국 특허출원공개 제2005/0106717 A1호에 기재된 것을 포함하는, 당업계에 공지된 방법, 조성물 및 장치를 사용하여 PBMC를 사용하여 TIL을 팽창시키기 위해 사용되어 왔으며, 상기 특허의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, TIL은 기체 투과성 백에서 확장된다. 일 실시형태에서, TIL은 기체 투과성 백, 예컨대 Xuri 세포 확장 시스템 W25 (GE Healthcare)에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템을 사용하여 확장된다. 일 실시형태에서, TIL은 투과성 백, 예컨대, Xuri 세포 확장 시스템 W5 (GE Healthcare)로도 알려져 있는 WAVE 생물반응기 시스템에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템을 사용하여 확장된다. 일 실시형태에서, 세포 확장 시스템은 약 100 mL, 약 200 mL, 약 300 mL, 약 400 mL, 약 500 mL, 약 600 mL, 약 700 mL, 약 800 mL, 약 900 mL, 약 1 L, 약 2 L, 약 3 L, 약 4 L, 약 5 L, 약 6 L, 약 7 L, 약 8 L, 약 9 L, 및 약 10 L로 이루어진 군으로부터 선택된 부피를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다.
일 실시형태에서, TIL은 G-Rex 플라스크 (Wilson Wolf Manufacturing로부터 상업적으로 입수가능함)에서 확장될 수 있다. 그와 같은 실시형태는 세포 집단이 약 5x105 세포/cm2에서 10x106 및 30x106 세포/cm2로 확장하는 것을 허용한다. 일 실시형태에서 이는 공급되지 않는다. 일 실시형태에서, 이는 배지가 G-Rex 플라스크에서 약 10 cm의 높이에 존재하는 한 공급되지 않는다. 일 실시형태에서 이는 공급하지 않고 하나 이상의 시토카인을 추가한다. 일 실시형태에서, 사이토카인은 사이토카인을 배지와 혼합할 필요 없이 볼러스로서 첨가될 수 있다. 그와 같은 용기, 디바이스, 및 방법은 당해 기술에 알려져 있고 TIL를 확장하는데 사용되어 왔고, 미국 특허출원공개 US 2014/0377739A1호, 국제공개 WO 2014/210036 A1호, 미국 특허출원공개 us 2013/0115617 A1호, 국제공개 WO 2013/188427 A1호, 미국 특허출원공개 US 2011/0136228 A1호, 미국 특허 US 8,809,050 B2호, 국제공개 WO 2011/072088 A2호, 미국 특허출원공개 US 2016/0208216 A1호, 미국 특허출원공개 US 2012/0244133 A1호, 국제공개 WO 2012/129201 A1호, 미국 특허출원공개 US 2013/0102075 A1호, 미국 특허 US 8,956,860 B2호, 국제공개 WO 2013/173835 A1호, 미국 특허출원공개 US 2015/0175966 A1호에 기재된 것을 포함하고, 이들의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 그와 같은 공정은 또한 문헌[Jin 등, J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292]에 기재되어 있다.
J. TIL의 선택적 유전공학
일부 실시형태에서, 본 발명의 확장된 TIL은 각각 본원에 제공된 바와 같은 폐쇄 멸균 제조 공정 동안을 비롯한 확장 단계 전에, 중에 또는 후에 추가로 조작되어 단백질 발현을 일시적인 방식으로 변경시킨다. 일부 실시형태에서, 일시적으로 변경된 단백질 발현은 일시적 유전자 편집으로 인한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 확장된 TIL은 전사 인자 (TF) 및/또는 TIL에서 단백질 발현을 일시적으로 변경할 수 있는 다른 분자로 처리된다. 일부 실시형태에서, TF 및/또는 단백질 발현을 일시적으로 변경할 수 있는 다른 분자는 종양 항원의 변경된 발현 및/또는 TIL의 집단에서 종양 항원-특이적 T 세포의 변경을 제공한다.
특정 실시형태에서, 방법은 유전적 편집을 포함한다TIL의 집단. 특정 실시형태에서, 방법은 TIL의 제1 집단, TIL의 제2 집단 및/또는 TIL의 제3 집단의 유전적 편집을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 단백질의 발현 촉진 또는 하나 이상의 단백질 발현의 억제를 위해 TIL의 집단 내로의 메신저 RNA(mRNA) 또는 작은(또는 짧은) 간섭 RNA(siRNA)의 삽입을 포함하는, 뉴클레오티드 삽입을 통한, 예컨대 리보핵산(RNA) 삽입을 통한 유전자 편집, 뿐만 아니라 단백질의 한 세트의 촉진과 단백질의 다른 세트의 억제의 동시 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 확장된 TIL은 단백질 발현의 일시적 변경을 겪는다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 예를 들어, 도 8 (특히 도 8b 및/또는 도 8c)에서 표시된 단계 A로부터 수득된 TIL 집단에서를 포함하는, 제1 확장 전에 벌크 TIL 집단에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 예를 들어, 도 8 (예를 들어 도 8b 및/또는 도 8c)에 표시된 단계 B에서 확장된 TIL 집단을 포함하는 제1 확장 동안 일어난다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 예를 들어 제1 확장과 제2 확장 사이의 전이에서의 TIL 집단(예를 들어, TIL의 제2 집단 본원에 기재된 바와 같이), 예를 들어, 단계 B로부터 수득되고 도 8에 표시된 단계 C에 포함된 TIL 집단에서를 포함하는, 제1 확장 후에 일어난다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 예를 들어 단계 C로부터 수득된 TIL 집단을 포함하는, 제2 확장 전에 벌크 TIL 집단에서, 및 도 8에 나타낸 바와 같이 단계 D에서의 그의 확장 전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 도 8에 나타낸 단계 D에서 확장된 TIL 집단 (예를 들어 TIL의 제3 집단)을 비롯한 단백질 발현의 일시적인 변경은 제2 확장 동안 일어난다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은, 예를 들어 도 8에 나타낸 바와 같은 단계 D에서의 확장으로부터 수득된 TIL 집단을 비롯한 제2 확장 후에 일어난다.
일 실시형태에서, TIL의 집단에서 단백질 발현을 일시적으로 변경하는 방법은 전기천공의 단계를 포함한다. 전기천공 방법은 당해 기술에 알려져 있고 예를 들어, 문헌[Tsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306], 및 미국 특허출원공개 2014/0227237 A1호에 기재되어 있고, 이들 각각의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, TIL의 집단에서 단백질 발현을 일시적으로 변경하는 방법은 인산칼슘 형질감염의 단계를 포함한다. 인산칼슘 형질감염 방법 (인산칼슘 DNA 침전, 세포 표면 코팅, 및 세포내이입)는 당해 기술에 알려져 있고 Graham 및 van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467; Wigler, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376; 및 Chen 및 Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752; 및 미국 특허 제5,593,875호에 기재되어 있RH, 이들 각각의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, TIL의 집단에서 단백질 발현을 일시적으로 변경하는 방법은 리포좀 형질감염의 단계를 포함한다. 리포좀 형질감염 방법, 예컨대 여과된 물 중 양이온성 지질 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-n,n,n-트리메틸염화암모늄 (DOTMA) 및 디올레오일 포스포티딜에탄올아민 (DOPE)의 1:1 (w/w) 리포좀 제형을 이용하는 방법은 당해 기술에 알려져 있고 문헌[Rose, 등, Biotechniques 1991, 10, 520-525 및 Felgner, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417] 및 미국 특허 제5,279,833호; 제5,908,635호; 제6,056,938호; 제6,110,490호; 제6,534,484호; 및 제7,687,070호에 기재되어 있고, 이들 각각의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, TIL의 집단에서 단백질 발현을 일시직으로 변경하는 방법은 미국 특허 제5,766,902호; 제6,025,337호; 제6,410,517호; 제6,475,994호; 및 제7,189,705호에 기재된 방법을 사용하는 형질감염의 단계를 포함하고; 이들 각각의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 줄기 기억 T 세포 (TSCM)의 증가를 초래한다. TSCM은 항원-경험 중앙 기억 T 세포의 조기 선조체이다. TSCM은 일반적으로 줄기 세포를 정의하는 장기 생존, 자가 재생 및 다분화 능력을 나타내고, 일반적으로 효과적인 TIL 생성물의 생성에 바람직하다. TSCM은 입양 세포 전달의 마우스 모델에서 다른 T 세포 하위세트와 비교된 향상된 항종양 활성을 나타내었다 (Gattinoni 등 Nat Med 2009, 2011; Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012; Cieri 등 Blood 2013). 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 높은 비율의 TSCM을 포함하는 조성물로 TIL 집단을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 TSCM 백분율에서 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 증가율을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 TIL 집단의 TSCM에서 적어도 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배수 증가를 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% TSCM를 갖는 TIL 집단을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% TSCM를 갖는 치료적 TIL 집단을 초래한다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 항원-경험있는 T-세포의 회춘을 초래한다. 일부 실시형태에서, 회춘은, 예를 들어, 증가된 증식, 증가된 T-세포 활성화, 및/또는 증가된 항원 인식을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 종양-유래된 TCR 레퍼토리를 보존하기 위해 T-세포의 큰 분획의 발현을 변경시킨다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 종양-유래된 TCR 레퍼토리를 변경시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 종양-유래된 TCR 레퍼토리를 유지한다.
일부 실시형태에서, 단백질의 일시적 변경은 특정 유전자의 변경된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PD-1 (또한 PDCD1 또는 CC279로 지칭됨), TGFBR2, CCR4/5, CBLB (CBL-B), CISH, CCRs (키메라 공동자극 수용체), IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, 노치 1/2 ICD, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFβ, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP1-β), CCL5 (RANTES), CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, CD44, PIK3CD, SOCS1, 및/또는 cAMP 단백질 키나제 A (PKA)를 비제한적으로 포함하는 유전자를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PD-1, TGFBR2, CCR4/5, CBLB (CBL-B), CISH, CCRs (키메라 공동자극 수용체), IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, 노치 1/2 ICD, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFβ, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP1-β), CCL5 (RANTES), CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, CD44, PIK3CD, SOCS1, 및/또는 cAMP 단백질 키나제 A (PKA)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PD-1을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 TGFBR2을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CCR4/5을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CBLB을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CISH을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CCRs (키메라 공동자극 수용체)을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 IL-2을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 IL-12을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 IL-15을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 IL-21을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 노치 1/2 ICD을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 TIM3을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 LAG3을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 TIGIT을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 TGFβ을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CCR1을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CCR2을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CCR4을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CCR5을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CXCR1을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CXCR2을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CSCR3을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CCL2 (MCP-1)을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CCL3 (MIP-1α)을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CCL4 (MIP1-β)을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CCL5 (RANTES)을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CXCL1을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CXCL8을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CCL22을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CCL17을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 VHL을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CD44을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PIK3CD을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 SOCS1을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 cAMP 단백질 키나제 A (PKA)을 표적으로 한다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 케모카인 수용체의 증가되고/거나 과발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 일시적 단백질 발현에 의해 과발현된 케모카인 수용체는 CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP1-β), CCL5 (RANTES), CXCL1, CXCL8, CCL22, 및/또는 CCL17를 비제한적으로 포함하는 리간드를 갖는 수용체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, TIGIT, TGFβR2, 및/또는 TGFβ의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다 (예를 들어, TGFβ 경로 차단의 초래를 포함한다). 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CBLB (CBL-B)의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CISH의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 예를 들어 TIL 이동조절(trafficking) 또는 종양 부위로의 이동을 개선시키기 위해 케모카인 수용체의 증가 및/또는 과발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CCR (키메라 공동자극 수용체)의 증가되고/거나 과발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, 및/또는 CSCR3으로 이루어진 군으로부터 선택된 케모카인 수용체의 증가되고/거나 과발현을 초래한다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 인터류킨의 증가되고/거나 과발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 IL-2, IL-12, IL-15, 및/또는 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택된 인터류킨의 증가되고/거나 과발현을 초래한다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 노치 1/2 ICD의 증가되고/거나 과발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 VHL의 증가되고/거나 과발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CD44의 증가되고/거나 과발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PIK3CD의 증가되고/거나 과발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 SOCS1의 증가되고/거나 과발현을 초래한다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 cAMP 단백질 키나제 A (PKA)의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 분자의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PD-1 및 LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 분자의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PD-1, LAG-3, CISH, CBLB, TIM3, 및 이들의 조합의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PD-1 및 LAG3, CISH, CBLB, TIM3, 및 이들의 조합 중 하나의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PD-1 및 LAG3의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PD-1 및 CISH의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PD-1 및 CBLB의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 LAG3 및 CISH의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 LAG3 및 CBLB의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 CISH 및 CBLB의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 TIM3 및 PD-1의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 TIM3 및 LAG3의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 TIM3 및 CISH의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 TIM3 및 CBLB의 줄어들고/거나 감소된 발현을 초래한다.
일부 실시형태에서, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 접착 분자는 감마레트로바이러스 또는 렌티바이러스 방법에 의해 TIL의 제1 집단, TIL의 제2 집단, 또는 TIL의 수확된 집단에 삽입된다 (예를 들어, 접착 분자의 발현이 증가된다).
일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 줄어들고/거나 감소된 발현, 및 CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, 및 이들의 조합의 증가되고/거나 향상된 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 PD-1, LAG3, TIM3, CISH, CBLB, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 줄어들고/거나 감소된 발현, 및 CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, 및 이들의 조합의 증가되고/거나 향상된 발현을 초래한다.
일부 실시형태에서, 약 5%, 약 10%, 약 10%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 80%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 85%의 발현 감소가 있고, 일부 실시형태에서, 적어도 약 90%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 95%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 99%의 발현 감소가 있다.
일부 실시형태에서, 약 5%, 약 10%, 약 10%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현 증가가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현 증가가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현 증가가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현 증가가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현 증가가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 80%의 발현 증가가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 85%의 발현 증가가 있고, 일부 실시형태에서, 적어도 약 90%의 발현 증가가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 95%의 발현 증가가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 99%의 발현 증가가 있다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 TIL을 전사 인자 (TF) 및/또는 TIL에서 단백질 발현을 일시적으로 변경할 수 있는 다른 분자로 처리함으로써 유도된다. 일부 실시형태에서, SQZ 벡터가 없는 미세유체 플랫폼은 전사 인자 (TF) 및/또는 단백질 발현을 일시적으로 변경할 수 있는 다른 분자의 세포내 전달에 사용된다. 전사 인자를 포함한 단백질을 T 세포를 포함한 다양한 원발성 인간 세포에 전달하는 능력을 입증하는 이러한 방법 (Sharei 등 PNAS 2013, 및 Sharei 등 PLOS ONE 2015 및 Greisbeck 등 J. Immunology vol. 195, 2015)이 설명되었으며; 예를 들어, 국제 특허 공개 WO 2013/059343A1호, WO 2017/008063A1호, 및 WO 2017/123663A1호를 참고하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 국제 특허 공개 WO 2013/059343A1호, WO 2017/008063A1호, 및 WO 2017/123663A1에 기재된 이러한 방법은 TIL의 집단을 전사 인자 (TF) 및/또는 일시적 단백질 발현을 유도할 수 있는 다른 분자에 노출시키기 위해 본 발명과 함께 사용될 수 있으며, 여기서 상기 TF 및/또는 일시적 단백질 발현을 유도할 수 있는 다른 분자는 종양 항원의 발현을 증가시키고/시키거나 TIL 집단에서 종양 항원-특이적 T 세포의 수를 증가시켜 TIL 집단의 재프로그래밍을 초래하고, 재프로그래밍되지 않은 TIL 집단과 비교하여 재프로그래밍된 TIL 집단의 치료 효능을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍은 본원에 기재된 바와 같이 TIL의 개시 또는 이전 집단 (즉, 재프로그래밍 전)에 비해 효과기 T 세포 및/또는 중앙 기억 T 세포의 하위집단을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 전사 인자 (TF)는 TCF-1, NOTCH 1/2 ICD, 및/또는 MYB를 비제한적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 전사 인자 (TF)는 TCF-1이다. 일부 실시형태에서, 전사 인자 (TF)는 NOTCH 1/2 ICD이다. 일부 실시형태에서, 전사 인자 (TF)는 MYB이다. 일부 실시형태에서, 전사 인자 (TF)는 추가의 TIL 재프로그래밍을 유도하기 위해 상업적으로 입수가능한 녹아웃 혈청 대체물 (Gibco/ThermoFisher)과 같은 유도 다분화능 줄기 세포 배양물 (iPSC)과 함께 투여된다. 일부 실시형태에서, 전사 인자 (TF)는 추가의 TIL 재프로그래밍을 유도하기 위해 iPSC 칵테일과 함께 투여된다. 일부 실시형태에서, 전사 인자 (TF)는 iPSC 칵테일 없이 투여된다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍은 TSCM의 백분율을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍은 TSCM의 백분율을 약 5%, 약 10%, 약 10%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% TSCM만큼 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 상기에 기재된 바와 같이 단백질 발현을 일시적으로 변경하는 방법은 TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 방법과 조합될 수 있으며, 하나 이상의 단백질 생산을 위한 유전자의 안정한 혼입 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은 TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은 제1 TIL 집단, 제2 TIL 집단 및/또는 제3 TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 레트로바이러스 형질도입 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 렌티바이러스 형질도입 단계를 포함한다. 렌티바이러스 형질도입 시스템은 당해 기술에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Levine, 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77; Zufferey, 등, Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75; Dull, 등, J. Virology 1998, 72, 8463-71], 및 미국 특허 제6,627,442에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 감마-레트로바이러스 형질도입 단계를 포함한다. 감마-레트로바이러스 형질도입 시스템은 당해 기술에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Cepko and Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16]에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 트랜스포존-매개된 유전자 전달 단계를 포함한다. 트랜스포존-매개된 유전자 전달 시스템은 당해 기술에 알려져 있고, 전위효소의 장기 발현이 형질전환 세포에서 발생하지 않도록 전위효소가 DNA 발현 벡터 또는 발현성 RNA 또는 단백질로 제공되는, 예를 들어, 전위효소가 mRNA (예를 들어, cap 및 폴리-A 테일을 포함하는 mRNA)로 제공되는 시스템을 포함한다. 살모니드(salmonid)형 Tel-유사 전위효소 (SB 또는 슬리핑 뷰티 전위효소), 예컨대 SB10, SB11, 및 SB100x, 및 증가된 효소 활성을 갖는 조작된 효소를 포함하는 적합한 트랜스포존-매개된 유전자 전달 시스템은, 예를 들어, 각각의 개시내용이 본원에 인용되어 포함된 문헌[Hackett, 등, Mol. Therapy 2010, 18, 674-83] 및 미국 특허 제6,489,458호에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현의 일시적 변경은 자가 전달 RNA 간섭 (sdRNA)에 의해 유도된 발현 감소이며, sdRNA는 20-뉴클레오티드 안티센스 (가이드) 가닥 및 테트라에틸렌글라이콜 (TEG) 링커를 사용하여 3' 말단에서 콜레스테롤에 접합된 13 내지 15개 염기 센스 (패신저) 가닥을 포함하는 2'-OH 치환 (전형적으로 불소 또는 -OCH3) 백분율이 높은 화학적으로-합성된 비대칭 siRNA 이중체이다. 일부 실시형태에서, 방법은 20-뉴클레오티드 안티센스 (가이드) 가닥 및 테트라에틸렌글라이콜 (TEG) 링커를 사용하여 3' 말단에서 콜레스테롤에 접합된 13 내지 15개 염기 센스 (패신저) 가닥을 포함하는 2'-OH 치환 (전형적으로 불소 또는 -OCH3) 백분율이 높은 화학적으로-합성된 비대칭 siRNA 이중체인 자가-전달 RNA 간섭 (sdRNA)의 사용을 포함하는, TIL 집단에서 단백질 발현의 일시적 변경을 포함한다. sdRNA를 사용하는 방법은 문헌[Khvorova and Watts, Nat. Biotechnol. 2017, 35, 238-248; Byrne, 등, J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2013, 29, 855-864; 및 Ligtenberg, 등, Mol. Therapy, 2018, in press]에 기재되었고, 그 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, sdRNA의 TIL 집단으로의 전달은 전기천공, SQZ, 또는 다른 방법을 사용하지 않고, 대신 TIL 집단이 배지에서 1 μM/10,000 TIL의 농도로 sdRNA에 노출되는 1 내지 3일의 기간을 사용하여 달성된다. 특정 실시형태에서, 방법은 TIL 집단을 1 내지 3일의 기간 동안 배지에서 1 μM/10,000 TIL의 농도로 sdRNA에 노출시키는 것을 포함하는 sdRNA를 TIL 집단으로 전달하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, sdRNA의 TIL 집단으로의 전달은 TIL 집단이 배지 중 10 μM/10,000 TIL의 농도에서 sdRNA에 노출되는 1 내지 3일의 기간을 사용하여 달성된다. 일 실시형태에서, sdRNA의 TIL 집단으로의 전달은 TIL 집단이 배지 중 50 μM/10,000 TIL의 농도에서 sdRNA에 노출되는 1 내지 3일의 기간을 사용하여 달성된다. 일 실시형태에서, sdRNA의 TIL 집단으로의 전달은 TIL 집단이 배지 중 0.1 μM/10,000 TIL 내지 50 μM/10,000 TIL의 농도에서 sdRNA에 노출되는 1 내지 3일의 기간을 사용하여 달성된다. 일 실시형태에서, sdRNA의 TIL 집단으로의 전달은 TIL 집단이 배지 중 0.1 μM/10,000 TIL 내지 50 μM/10,000 TIL의 농도에서 sdRNA에 노출되는 1 내지 3일의 기간을 사용하여 달성되고, sdRNA에의 노출은 새로운 sdRNA를 배지에 첨가함으로써 2, 3, 4, 또는 5회 수행된다. 다른 적합한 공정은 예를 들어, 문헌[미국 특허출원공개 US 2011/0039914 A1호, US 2013/0131141 A1호, 및 US 2013/0131142 A1호, 및 미국 특허 제9,080,171호]에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일부 실시형태에서, sdRNA는 제조 동안 TIL의 집단에 삽입된다. 일부 실시형태에서, sdRNA는 노치 1/2 ICD, PD-1, CTLA-4 TIM-3, LAG-3, TIGIT, TGFβ, TGFBR2, cAMP 단백질 키나제 A (PKA), BAFF BR3, CISH, 및/또는 CBLB를 방해하는 RNA를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 발현 감소는 예를 들어 유세포측정 및/또는 qPCR에 의해 평가된 바와 같이 유전자 사일런싱의 백분율을 기반으로 결정된다. 일부 실시형태에서, 약 5%, 약 10%, 약 10%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 80%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 85%의 발현 감소가 있고, 일부 실시형태에서, 적어도 약 90%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 95%의 발현 감소가 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 99%의 발현 감소가 있다.
siRNA의 화학적 변형에 기초한 자가-전달가능한 RNAi 기술은 본원에 기재된 바와 같이 sdRNA를 TIL에 성공적으로 전달하기 위해 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있다. 비대칭 siRNA 구조 및 소수성 리간드를 갖는 골격 변형의 조합(예를 들어, Ligtenberg, 등, Mol. Therapy, 2018 및 US20160304873을 참조한다)은 sdRNA의 뉴클레아제 안정성을 활용하는 배양 배지에의 단순 첨가에 의해 추가의 제형 및 방법 없이 배양된 포유동물 세포에 sdNA가 침투하도록 한다. 이러한 안정성은 단순히 배지에서 sdRNA의 활성 농도를 유지함으로써 표적 유전자 활성의 RNAi-매개된 감소의 일정한 수준의 지지를 허용한다. 이론에 구애됨이 없이, sdRNA의 골격 안정화는 비-분열 세포에서 수개월 동안 지속될 수 있는 유전자 발현 효과의 연장된 감소를 제공한다.
일부 실시형태에서, TIL의 95% 초과의 형질감염 효율 및 다양한 특이적 sdRNA에 의한 표적의 발현 감소가 일어난다. 일부 실시형태에서, 몇 개의 비변형 리보오스 잔기를 함유하는 sdRNA를 완전히 변형된 서열로 대체하여 RNAi 효과의 효능 및/또는 수명을 증가시켰다. 일부 실시형태에서, 발현 감소 효과는 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 5일, 6일, 7일, 또는 8일 또는 그 초과 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 발현 감소 효과는 TIL의 sdRNA 처리 후 10일 이상에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 표적 발현의 70% 초과의 발현 감소가 유지된다. 일부 실시형태에서, 표적 발현의 70 % 초과의 발현 감소가 유지되는 TIL이다. 일부 실시형태에서, PD-1/PD-L1 경로에서의 발현 감소는 TIL이 보다 강력한 생체내 효과를 나타낼 수 있게 하며, 이는 일부 실시형태에서, PD-1/PD-L1 경로의 억제 효과의 회피로 인한 것이다. 일부 실시형태에서, sdRNA에 의한 PD-1의 발현 감소는 TIL 증식의 증가를 초래한다.
때때로 짧은 간섭 RNA 또는 침묵화 RNA로 알려진 작은 간섭 RNA (siRNA)는, 일반적으로 19-25 염기쌍 길이의 이중가닥 RNA 분자이다. siRNA는 상보적 뉴클레오티드 서열을 갖는 특이 유전자의 발현을 방해하는 RNA 간섭 (RNAi)에 사용된다.
이중 가닥 DNA (dsRNA)는 일반적으로 RNA의 한 쌍의 상보성 가닥, 일반적으로 센스 (패신저) 및 안티센스 (가이드) 가닥을 포함하는 임의의 분자를 정의하기 위해 사용될 수 있고, 단일 가닥 오버행 영역을 포함할 수 있다. siRNA와 대조적으로, 용어 dsRNA는 일반적으로 다이서(Dicer)를 포함하는 절단 효소 시스템의 작용에 의해 더 큰 dsRNA 분자로부터 방출되는 siRNA 분자의 서열을 포함하는 전구체 분자를 지칭한다.
sdRNA (자가 전달가능한 RNA)는 전달 비히클이 세포에 들어갈 필요가 없고 전통적인 siRNA와 비교하여 개선된 약리학을 갖는 공유적으로 변형된 RNAi 화합물의 새로운 부류이다. "자가-전달가능한 RNA" 또는 "sdRNA"는 소수성으로 변형된 RNA 간섭-안티센스 하이브리드이며, 이는 1차 세포에서 및 국소 투여 시 생체내에서 매우 효과적인 것으로 입증되었다. 독성 없이 강건한 흡수 및/또는 침묵이 입증되었다. sdRNA는 일반적으로 최소 이중 가닥 영역을 갖는 비대칭 화학적으로 변형된 핵산 분자이다. sdRNA 분자는 전형적으로 단일 가닥 영역 및 이중 가닥 영역을 함유하고, 분자의 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역 둘 다 내에 다양한 화학적 변형을 함유할 수 있다. 추가로, sdRNA 분자는 소수성 콘주게이트, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 통상적이고 진보된 스테롤-유형 분자에 부착될 수 있다. sdRNAs 및 이러한 sdRNA를 제조하기 위한 관련 방법은 또한 예를 들어, US20160304873호, WO2010033246호, WO2017070151호, WO2009102427호, WO2011119887호, WO2010033247A2호, WO2009045457호, WO2011119852호에 광범위하게 기재되었고, 이들 모두는 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. sdRNA 구조, 화학, 표적화 위치, 서열 선호, 등을 최적화하기 위해, 전매 알고리즘이 sdRNA 효능 예측을 위해 개발되고 이용되었다 (예를 들어, US 20160304873호를 참조한다). 이들 분석에 기초하여, 기능성 sdRNA 서열은 일반적으로 1 μM 농도에서 70% 초과의 발현 감소, 40% 초과의 확률을 갖는 것으로 정의되었다.
일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 표적 유전자의 70% 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 표적 유전자의 75% 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 표적 유전자의 80% 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 표적 유전자의 85% 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 표적 유전자의 90% 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 표적 유전자의 95% 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 표적 유전자의 99% 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 0.25 μm 내지 약 4 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 0.25 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 0.5 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 0.75 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 1.0 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 1.25 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 1.5 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 1.75 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 2.0 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 2.25 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 2.5 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 2.75 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 3.0 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 3.25 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 3.5 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 3.75 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용된 sdRNA 서열은 약 4.0 μM의 농도로 전달될 때 표적 유전자의 발현 감소를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 제제는 치료제의 안정성 및/또는 유효성을 증가시키고, 치료될 세포 또는 조직에 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 전달하기 위한 하나 이상의 변형을 포함한다. 이러한 변형은 2'-O-메틸 변형, 2'-O-플루오로 변형, 디포스포로티오에이트 변형, 2' F 변형된 뉴클레오티드, a2'-O-메틸 변형된 및/또는 2'데옥시 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 스테롤, 콜레스테롤, 비타민 D, 나프틸, 이소부틸, 벤질, 인돌, 트립토판, 및/또는 페닐을 포함하는 하나 이상의 소수성 변형을 포함하도록 변형된다. 추가의 특정 실시형태에서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 2'-O-메틸, 2'데옥시, 소수성 변형 및 포스포로티오에이트의 조합이다. 일부 실시형태에서, 당은 변형될 수 있으며, 변형된 당은 비제한적으로 D-리보오스, 2'-O-알킬 (2'-O-메틸 및 2'-0-에틸 포함), 즉, 2'-알콕시, 2'-아미노, 2'-S-알킬, 2'-할로 (2'-플루오로 포함), T- 메톡시에톡시, 2'-알릴옥시 (-OCH2CH=CH2), 2'-프로파르길, 2'-프로필, 에티닐, 에테닐, 프로페닐, 및 시아노 등을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 당 모이어티는 헥소스(hexose)이고, 문헌[Augustyns, K., 등, Nucl. Acids. Res. 18:4711 (1992)]에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드에 혼입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 그것의 전체 길이에 걸쳐 이중-가닥이고, 즉, 분자의 양쪽 말단에 돌출된 단일-가닥 서열이 없고, 즉 둔단이다. 일부 실시형태에서, 개별 핵산 분자는 길이가 다를 수 있다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 그것의 전체 길이에 걸쳐 이중-가닥이 아니다. 예를 들어, 2개의 별도의 핵산 분자가 사용되는 경우, 분자 중 하나, 예를 들어, 안티센스 서열을 포함하는 제1 분자는 이에 혼성화되는 제2 분자보다 더 길 수 있다 (분자의 일부는 단일-가닥으로 남아 있음). 일부 실시형태에서, 단일 핵산 분자가 사용되는 경우 양쪽 말단에서 분자의 일부는 단일-가닥으로 유지될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 미스매치 및/또는 루프 또는 융기를 포함하지만, 올리고뉴클레오티드 길이의 적어도 약 70%에 걸쳐 이중-가닥이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 길이의 적어도 약 80%에 걸쳐 이중-가닥이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 길이의 적어도 약 90%-95%에 걸쳐 이중-가닥이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 길이의 적어도 약 96%-98%에 걸쳐 이중-가닥이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 적어도 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 미스매치를 포함한다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 3' 또는 5' 연결기를 변형시킴으로써 뉴클레아제로부터 실질적으로 보호될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,849,902호 및 WO 98/13526호). 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 "차단기"를 포함시킴으로써 저항성이 되도록 할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "차단기"는 합성을 위한 보호기 또는 커플링기 (예를 들어, FITC, 프로필 (CH2-CH2-CH3), 글라이콜 (-0-CH2-CH2-O-) 포스페이트 (PO3 2"), 수소 포스포네이트, 또는 포스포르아미다이트)로서 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오모노머에 부착될 수 있는 치환체 (예를 들어, OH 기 이외)를 지칭한다. "차단기"는 또한 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드 엑소뉴클레아제 저항성 구조를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단을 보호하는 "말단 차단기" 또는 "엑소뉴클레아제 차단기"를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, sdRNA 내의 인접 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부는 대체 연결, 예를 들어, 포스포로티오에이트 연결에 의해 연결된다.
일부 실시형태에서, 화학적 변형은 세포 흡수에서 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개의 향상을 유발할 수 있다. 일부 실시형태에서, C 또는 U 잔기 중 적어도 하나는 소수성 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다수의 C 및 U는 소수성 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, C 및 U의 적어도 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60% 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 적어도 95%는 소수성 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 모든 C 및 U는 소수성 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, sdRNA 또는 sd-rxRNA는 양성자화성 아민의 혼입을 통해 sd-rxRNA 분자의 향상된 엔도좀 방출을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 양성자화성 아민은 센스 가닥 (RISC 부하 후 폐기되는 분자의 일부)에 혼입된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 sdRNA 화합물은 13개 뉴클레오티드 이중체를 갖는, 이중 영역 (10-15개 염기 길이의 효율적인 RISC 진입에 필요함) 및 4-12개 뉴클레오티드 길이의 단일 가닥 영역을 포함하는 비대칭 화합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 6개 뉴클레오티드 단일 가닥 영역이 사용된다. 일부 실시형태에서, sdRNA의 단일 가닥 영역은 2-12개의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연결기 (포스포로티오에이트 변형으로 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 6-8개의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연결기가 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 sdRNA 화합물은 또한 안정성을 제공하고, RISC 진입과 양립가능한 고유한 화학적 변형 패턴을 포함한다.
가이드 가닥은, 예를 들어, 또한 RISC 진입을 방해하지 않고 안정성을 확인하는 임의의 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 가닥의 화학적 변형 패턴은 다수의 C 및 U 뉴클레오티드가 2' F 변형되고, 5 ' 말단이 인산화되는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, sdRNA 또는 sd-rxRNA에서 뉴클레오티드의 적어도 30%가 변형된다. 일부 실시형태에서, sdRNA 또는 sd-rxRNA에서 뉴클레오티드의 적어도 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 변형된다. 일부 실시형태에서, sdRNA 또는 sd-rxRNA 내 뉴클레오티드 100%가 변형된다.
일부 실시형태에서, sdRNA 분자는 최소 이중가닥 영역을 갖는다. 일부 실시형태에서, 이중가닥인 분자 영역은 8-15개 뉴클레오티드 길이 범위이다. 일부 실시형태에서, 이중가닥인 분자의 영역은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 영역은 13개 뉴클레오티드 길이이다. 가이드와 패신저 가닥 사이에 100% 상보성이 있거나 가이드와 패신저 가닥 사이에 하나 이상의 미스매치가 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 분자의 한쪽 말단에서, 분자는 둔단이거나 1-뉴클레오티드 돌출부를 가지고 있다. 분자의 단일 가닥 영역은 일부 실시형태에서 4-12개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 단일 가닥 영역은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 가닥 영역은 또한 4개 미만 또는 12개 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정 실시형태에서, 단일 가닥 영역은 6 또는 7개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에서, sdRNA 분자는 안정성이 증가되었다. 일부 사례에서, 화학적으로 변형된 sdRNA 또는 sd-rxRNA 분자는 배지에서, 임의의 중간값을 포함하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간보다 길거나 또는 24시간 초과의 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, sd-rxRNA는 배지에서 12시간보다 긴 반감기를 갖는다.
일부 실시형태에서, sdRNA는 효능 증가 및/또는 독성 감소에 최적화되어 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 및/또는 패신저 가닥의 뉴클레오티드 길이, 및/또는 가이드 및/또는 패신저 가닥에서 포스포로티오에이트 변형의 수는 일부 양태에서 RNA 분자의 효능에 영향을 미칠 수 있는 한편, 2'-플루오로 (2'F) 변형을 2'-0-메틸 (2'OMe) 변형으로 대체하면 일부 양태에서 분자의 독성에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시형태에서, 분자의 2'F 함량 감소는 분자의 독성을 감소시킬 것으로 예상된다. 일부 실시형태에서, RNA 분자에서 포스포로티오에이트 변형의 수는 분자의 세포로의 흡수, 예를 들어 분자의 세포로의 수동적인 흡수의 효율에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시형태에서, sdRNA는 2'F 변형이 없지만 세포 흡수 및 조직 침투에서 동일한 효능을 특성으로 한다.
일부 실시형태에서, 가이드 가닥은 대략 18-19개 뉴클레오티드 길이이며, 대략 2-14개의 포스페이트 변형을 갖는다. 예를 들어, 가이드 가닥은 포스페이트-변형된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 또는 14개 초과의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 가이드 가닥은 RISC 진입을 방해하지 않으면서 안정성을 증가시키는 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다. 포스페이트 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드는 3' 말단, 5' 말단에 있거나 가이드 가닥 전체에 퍼져있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 가닥의 3' 말단 10개의 뉴클레오티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드를 함유한다. 가이드 가닥은 또한 분자 전체에 위치할 수 있는 2'F 및/또는 2'OMe 변형을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 가닥의 위치 1에 있는 뉴클레오티드 (가이드 가닥의 가장 5' 위치에 있는 뉴클레오티드)는 2'OMe 변형되고/되거나 인산화된다. 가이드 가닥 내의 C 및 U 뉴클레오티드는 2'F 변형될 수 있다. 예를 들어, 19 nt 가이드 가닥의 위치 2-10에 있는 C 및 U 뉴클레오티드 (또는 상이한 길이의 가이드 가닥에 있는 상응하는 위치)는 2'F 변형될 수 있다. 가이드 가닥 내의 C 및 U 뉴클레오티드는 2'OMe 변형될 수 있다. 예를 들어, l9 nt 가이드 가닥의 위치 11-18에 있는 C 및 U 뉴클레오티드 (또는 상이한 길이의 가이드 가닥에 있는 상응하는 위치)는 2'OMe 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 가닥의 가장 3' 말단에 있는 뉴클레오티드는 비변형된다. 특정 실시형태에서, 가이드 가닥 내의 다수의 C 및 U는 2'F 변형되고, 가이드 가닥의 5' 말단은 인산화된다. 다른 실시형태에서, 위치 1 및 위치 11-18의 C 또는 U는 2'OMe 변형되고, 가이드 가닥의 5' 말단은 인산화된다. 다른 실시형태에서, 위치 1 및 위치 11-18의 C 또는 U는 2'OMe 변형되고, 가이드 가닥의 5' 말단은 인산화되고, 위치 2-10의 C 또는 U는 2'F 변형된다.
자가-전달가능한 RNAi 기술은 추가의 제형 또는 기술을 필요로 하지 않으면서 RNAi 제제로 세포를 직접 형질감염시키는 방법을 제공한다. 형질감염이 어려운 세포주를 형질감염시키는 능력, 높은 생체내 활성, 및 사용의 간편성은 전통적인 siRNA-기반 기술에 비해 상당한 기능적 이점을 제공하는 조성물 및 방법의 특성이고, 이와 같이, sdRNA 방법은 본 발명의 TIL에서 표적 유전자의 발현 감소 방법과 관련된 몇 개의 실시형태에서 사용된다. sdRNAi 방법은 화학적으로 합성된 화합물을 생체외 및 생체내에서 광범위한 1차 세포 및 조직으로 직접 전달할 수 있다. 본원에서 본 발명의 일부 실시형태에 기재된 sdRNA는 미국 매사추세츠주 워세스터 소재의 Advirna LLC로부터 상업적으로 입수가능하다.
sdRNA는 소수성으로-변형된 siRNA-안티센스 올리고뉴클레오티드 하이브리드 구조로 형성되고, 예를 들어 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된 문헌[Byrne 등, December 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10): 855-864]에 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, sdRNA 올리고뉴클레오티드는 멸균 전기천공을 사용하여 본원에 기재된 TIL로 전달될 수 있다. 특정 실시형태에서, 방법은 sdRNA 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위해 TIL의 집단의 멸균 전기천공을 포함한다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 막관통 전달 시스템과 조합하여 세포로 전달될 수 있다. 일부 시형태에서, 이 막관통 전달 시스템은 지질, 바이러스 벡터, 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 제제는 임의의 전달 제제를 필요로 하지 않는 자가-전달 RNAi 제제이다. 특정 실시형태에서, 방법은 sdRNA 올리고뉴클레오티드를 TIL 집단에 전달하기 위한 막관통 전달 시스템의 사용을 포함한다.
올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 조성물은 본원에 기재된 TIL과 접촉되고 (예를 들어, 접촉되게 하고, 또한 본원에서 이로 투여되거나 전달되는 것으로도 지칭됨), TIL에 의한 수동적인 흡수를 포함하여 본원에 기재된 TIL에 의해 흡수된다. sdRNA는 제1 확장 동안, 예를 들어 단계 B 동안, 제1 확장 후, 예를 들어, 단계 C 동안, 제2 확장 전 또는 동안, 예를 들어 단계 D 전 또는 동안, 단계 D 후 및 단계 E에서 수확 전, 단계 F에서 수확 동안 또는 후, 단계 F에서 최종 제형화 및/또는 주입 백으로의 이동 전 또는 동안, 뿐만 아니라 단계 F에서 임의의 선택적 동결보존 단계 전에 본원에 기재된 바와 같이 TIL에 첨가될 수 있다. 또한, sdRNA는 단계 F의 임의의 동결보존 단계에서 해동 후 첨가될 수 있다. 일 실시형태에서, PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, 및 CBLB를 포함하여 본원에 기재된 유전자를 표적화하는 하나 이상의 sdRNA는 TIL 및 다른 제제를 포함하는 세포 배양 배지에 100 nM 내지 20 mM, 200 nM 내지 10 mM, 500 nm 내지 1 mM, 1 μM 내지 100 μM, 및 1 μM 내지 100 μM로 이루어진 군으로부터 선택된 농도로 첨가될 수 있다. 일 실시형태에서, PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, 및 CBLB를 포함하여 본원에 기재된 유전자를 표적화하는 하나 이상의 sdRNA는 TIL 및 다른 제제를 포함하는 세포 배양 배지에 0.1 μM sdRNA/10,000 TIL/100 μL 배지, 0.5 μM sdRNA/10,000 TIL /100 μL 배지, 0.75 μM sdRNA/10,000 TIL /100 μL 배지, 1 μM sdRNA/10,000 TIL /100 μL 배지, 1.25 μM sdRNA/10,000 TIL /100 μL 배지, 1.5 μM sdRNA/10,000 TIL /100 μL 배지, 2 μM sdRNA/10,000 TIL /100 μL 배지, 5 μM sdRNA/10,000 TIL /100 μL 배지, 또는 10 μM sdRNA/10,000 TIL /100 μL 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 양으로 첨가될 수 있다. 일 실시형태에서, PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, 및 CBLB를 포함하여 본원에 기재된 유전자를 표적화하는 하나 이상의 sdRNA는 프리-REP 또는 REP 단계 동안 1일 2회, 1일 1회, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 또는 7일마다 TIL 배양물에 첨가될 수 있다.
sdRNA를 포함하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 조성물은, 예를 들어 세포 배양 배지에 sdRNA를 고농도로 용해시키고 수동적인 흡수가 일어나도록 충분한 시간을 둠으로써 확장 공정 동안 본원에 기재된 TIL과 접촉될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 TIL 집단을 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은 올리고뉴클레오티드 예를 들어 sdRNA를 세포 배양 배지에 용해시키고, 세포 배양 배지를 TIL 집단과 접촉시키는 것을 포함한다. TIL은 본원에 기재된 바와 같이 제1 집단, 제2 집단 및/또는 제3 집단일 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드의 세포로의 전달은 인산칼슘, DMSO, 글리세롤 또는 덱스트란, 전기천공을 포함하는 적합한 당업계에서 인정된 방법에 의해, 또는 예를 들어, 당해 기술에 알려진 방법을 사용하여 양이온성, 음이온성, 또는 중성 지질 조성물 또는 리포좀을 사용한 형질감염에 의해 향상될 수 있다 (예를 들어, 국제공개 WO 90/14074호; WO 91/16024호; WO 91/17424호; 미국 특허 제4,897,355호; Bergan et a 1993. Nucleic Acids Research. 21 :3567 참조한다).
일부 실시형태에서, 하나 초과의 sdRNA가 표적 유전자의 발현을 감소시키는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, PD-1, TIM-3, CBLB, LAG3 및/또는 CISH 표적화 sdRNA 중 하나 이상이 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, PD-1 sdRNA는 하나 초과의 유전자 표적의 발현을 감소시키기 위해 TIM-3, CBLB, LAG3 및/또는 CISH 중 하나 이상과 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, LAG3 sdRNA는 두 표적의 유전자 발현을 감소시키기 위해 CISH 표적화 sdRNA와 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, 본원에서 PD-1, TIM-3, CBLB, LAG3 및/또는 CISH 중 하나 이상을 표적화하는 sdRNA는 미국 매사추세츠주 워세스터 소재의 Advirna LLC로부터 상업적으로 입수가능하다.
일부 실시형태에서, sdRNA는 PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, sdRNA는 PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 하나의 sdRNA는 PD-1을 표적으로 하고, 또 다른 sdRNA는 LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, sdRNA는 PD-1, LAG-3, CISH, CBLB, TIM3, 및 이들의 조합으로부터 선택된 유전자를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, sdRNA는 PD-1 및LAG3, CISH, CBLB, TIM3, 및 이들의 조합 중 하나로부터 선택된 유전자를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 하나의 sdRNA는 PD-1을 표적으로 하고, 하나의 sdRNA는 LAG3을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 하나의 sdRNA는 PD-1을 표적으로 하고, 하나의 sdRNA는 CISH를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 하나의 sdRNA는 PD-1을 표적으로 하고, 하나의 sdRNA는 CBLB를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 하나의 sdRNA는 LAG3을 표적으로 하고, 하나의 sdRNA는 CISH를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 하나의 sdRNA는 LAG3을 표적으로 하고, 하나의 sdRNA는 CBLB를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 하나의 sdRNA는 CISH를 표적으로 하고, 하나의 sdRNA는 CBLB를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 하나의 sdRNA는 TIM3을 표적으로 하고, 하나의 sdRNA는 PD-1을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 하나의 sdRNA는 TIM3을 표적으로 하고, 하나의 sdRNA는 LAG3을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 하나의 sdRNA는 TIM3을 표적으로 하고, 하나의 sdRNA는 CISH를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 하나의 sdRNA는 TIM3을 표적으로 하고, 하나의 sdRNA는 CBLB를 표적으로 한다.
상기에 논의된 바와 같이, 본 발명의 실시형태는 그것의 치료 효과를 향상시키기 위해 유전자 편집을 통해 유전적으로 변형된 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제공한다. 본 발명의 실시형태는 하나 이상의 단백질의 발현 촉진 및 하나 이상의 단백질의 발현 억제, 뿐만 아니라 이들의 조합 모두를 위해 TIL 집단으로의 뉴클레오티드 삽입 (RNA 또는 DNA)을 통한 유전자 편집을 포함한다. 본 발명의 실시형태는 또한, TIL을 치료 집단으로 확장하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 TIL을 유전자 편집하는 것을 포함한다. 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 데 사용될 수 있는 몇 개의 유전자 편집 기술이 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 하나 이상의 단백질의 생산을 위한 유전자의 안정한 혼입 단계를 포함하는 TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 방법을 포함한다. 일 실시형태에서, TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 레트로바이러스 형질도입 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 렌티바이러스 형질도입 단계를 포함한다. 렌티바이러스 형질도입 시스템은 당해 기술에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Levine, 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77; Zufferey, 등, Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75; Dull, 등, J. Virology 1998, 72, 8463-71], 및 미국 특허 제6,627,442에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 감마-레트로바이러스 형질도입 단계를 포함한다. 감마-레트로바이러스 형질도입 시스템은 당해 기술에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Cepko and Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16]에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 트랜스포존-매개된 유전자 전달 단계를 포함한다. 트랜스포존-매개된 유전자 전달 시스템은 당해 기술에 알려져 있고, 전위효소의 장기 발현이 형질전환 세포에서 발생하지 않도록 전위효소가 DNA 발현 벡터 또는 발현성 RNA 또는 단백질로 제공되는, 예를 들어, 전위효소가 mRNA (예를 들어, cap 및 폴리-A 테일을 포함하는 mRNA)로 제공되는 시스템을 포함한다. 살모니드형 Tel-유사 전위효소 (SB 또는 슬리핑 뷰티 전위효소), 예컨대 SB10, SB11, 및 SB100x, 및 증가된 효소 활성을 갖는 조작된 효소를 포함하는 적합한 트랜스포존-매개된 유전자 전달 시스템은, 예를 들어, 각각의 개시내용이 본원에 인용되어 포함된 문헌[Hackett, 등, Mol. Therapy 2010, 18, 674-83] 및 미국 특허 제6,489,458호에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 방법은 TIL 집단 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 제1 집단, 제2 집단 및/또는 제3 집단을 유전적으로 변형시키는 방법을 포함한다. 일 실시형태에서, TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 하나 이상의 단백질의 생산 또는 억제 (예를 들어, 침묵화)를 위한 유전자의 안정한 혼입 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 전기천공 단계를 포함한다. 전기천공 방법은 당해 기술에 알려져 있고 예를 들어, 문헌[Tsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306], 및 미국 특허출원공개 2014/0227237 A1호에 기재되어 있고, 이들 각각의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 당해 분야에서 알려진 다른 전기천공 방법, 예컨대 그 개시내용이 본원에 인용되어 포함된 미국 특허 제5,019,034호; 제5,128,257호; 제5,137,817호; 제5,173,158호; 제5,232,856호; 제5,273,525호; 제5,304,120호; 제5,318,514호; 제6,010,613호 및 제6,078,490호에 기재된 것들이 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 전기천공 방법은 멸균 전기천공 방법이다. 일 실시형태에서, 전기천공 방법은 펄스화된 전기천공 방법이다. 일 실시형태에서, 전기천공 방법은 전계 강도가 100 V/cm 이상인 적어도 3개의 단일, 오퍼레이터-제어된, 독립적으로 프로그래밍된 DC 전기 펄스 시퀀스를 TIL에 적용하는 단계를 포함하는, TIL을 펄스화된 전기장으로 처리하여 TIL에서 정의되고 제어된 영구적 또는 일시적 변화를 변경, 조작 또는 유발하는 단계를 포함하는 펄스화된 전기천공 방법이고, 여기서 적어도 3개의 DC 전기 펄스 시퀀스는 다음의 특성 중 1, 2, 또는 3가지를 갖는다: (1) 적어도 3개의 펄스 중 적어도 2개는 펄스 진폭이 서로 다름; (2) 적어도 3개의 펄스 중 적어도 2개는 펄스 폭이 서로 다름; 및 (3) 적어도 3개의 펄스 중 2개의 제1 세트에 대한 제1 펄스 간격은 적어도 3개의 펄스 중 2개의 제2 세트에 대한 제2 펄스 간격과 다름. 일 실시형태에서, 전기천공 방법은 전계 강도가 100 V/cm 이상인 적어도 3개의 단일, 오퍼레이터-제어된, 독립적으로 프로그래밍된 DC 전기 펄스 시퀀스를 TIL에 적용하는 단계를 포함하는, TIL을 펄스화된 전기장으로 처리하여 TIL에서 정의되고 제어된 영구적 또는 일시적 변화를 변경, 조작 또는 유발하는 단계를 포함하는 펄스화된 전기천공 방법이고, 여기서 적어도 3개의 펄스 중 적어도 2개는 펄스 진폭이 서로 다르다. 일 실시형태에서, 전기천공 방법은 전계 강도가 100 V/cm 이상인 적어도 3개의 단일, 오퍼레이터-제어된, 독립적으로 프로그래밍된 DC 전기 펄스 시퀀스를 TIL에 적용하는 단계를 포함하는, TIL을 펄스화된 전기장으로 처리하여 TIL에서 정의되고 제어된 영구적 또는 일시적 변화를 변경, 조작 또는 유발하는 단계를 포함하는 펄스화된 전기천공 방법이고, 여기서 적어도 3개의 펄스 중 적어도 2개는 펄스 폭이 서로 다르다. 일 실시형태에서, 전기천공 방법은 전계 강도가 100 V/cm 이상인 적어도 3개의 단일, 오퍼레이터-제어된, 독립적으로 프로그래밍된 DC 전기 펄스 시퀀스를 TIL에 적용하는 단계를 포함하는, TIL을 펄스화된 전기장으로 처리하여 TIL에서 정의되고 제어된 영구적 또는 일시적 변화를 변경, 조작 또는 유발하는 단계를 포함하는 펄스화된 전기천공 방법이고, 여기서 적어도 3개의 펄스 중 2개의 제1 세트에 대한 제1 펄스 간격은 적어도 3개의 펄스 중 2개의 제2 세트에 대한 제2 펄스 간격과 다르다. 일 실시형태에서, 전기천공 방법은 전계 강도가 100 V/cm 이상인 적어도 3개의 DC 전기 펄스 시퀀스를 TIL에 적용하는 단계를 포함하는, TIL을 펄스화된 전기장으로 처리하여 TIL에서 기공 형성을 유도하는 방법을 포함하는 펄스화된 전기천공 방법이고, 여기서 적어도 3개의 DC 전기 펄스 시퀀스는 다음의 특성 중 1, 2, 또는 3가지를 갖는다: (1) 적어도 3개의 펄스 중 적어도 2개는 펄스 진폭이 서로 다름; (2) 적어도 3개의 펄스 중 적어도 2개는 펄스 폭이 서로 다름; 및 (3) 유도된 기공이 비교적 긴 기간 동안 유지되고, TIL의 생존력이 유지되도록 적어도 3개의 펄스 중 2개의 제1 세트에 대한 제1 펄스 간격은 적어도 3개의 펄스 중 2개의 제2 세트에 대한 제2 펄스 간격과 다름. 일 실시형태에서, TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 인산칼슘 형질감염 단계를 포함한다. 인산칼슘 형질감염 방법 (인산칼슘 DNA 침전, 세포 표면 코팅, 및 세포내이입)는 당해 기술에 알려져 있고 Graham 및 van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467; Wigler, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376; 및 Chen 및 Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752; 및 미국 특허 제5,593,875호에 기재되어 있RH, 이들 각각의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 리포좀 형질감염 단계를 포함한다. 리포좀 형질감염 방법, 예컨대 여과된 물 중의 양이온성 지질 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-n,n,n-트리메틸염화암모늄 (DOTMA) 및 디올레오일 포스포티딜에탄올아민 (DOPE)의 1:1 (w/w) 리포좀 제형을 사용한 방법이 당해 기술에 알려져 있고, 각각의 개시내용이 본원에 인용되어 포함된, 문헌[Rose, 등, Biotechniques 1991, 10, 520-525 및 Felgner, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417] 및 미국 특허 제5,279,833호; 제5,908,635호; 제6,056,938호; 제6,110,490호; 제6,534,484호; 및 제7,687,070호에 기재되어 있다. 일 실시형태에서, TIL 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 미국 특허 제5,766,902호; 제6,025,337호; 제6,410,517호; 제6,475,994호; 및 제7,189,705호에 기재된 방법을 사용한 형질감염 단계를 포함하며; 이들 각각의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. TIL은 본원에 기재된 바와 같이 제1 집단, 제2 집단 및/또는 TIL의 제3 집단일 수 있다.
일 실시형태에 따르면, 유전자 편집 공정은 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자에서 이중-가닥 또는 단일-가닥 파손의 생성을 매개하는 프로그래밍가능한 뉴클레아제의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 프로그래밍가능한 뉴클레아제는 특정 유전자 좌위에 파손을 도입하여 정확한 게놈 편집을 가능하게 하며, 즉 게놈 내의 특정 DNA 서열의 인식에 의존하여 뉴클레아제 도메인을 이 위치로 표적화하고, 표적 서열에서 이중-가닥 파손의 생성을 매개한다. DNA의 이중-가닥 파손은 이후에 내인성 복구 기구를 파손 부위에 동원하여 비-상동성 말단-결합(NHEJ) 또는 상동 지정 복구 (HDR)에 의한 게놈 편집을 매개한다. 따라서, 파손의 복구는 표적 유전자 산물을 파괴 (예를 들어, 침묵화, 억제 또는 강화)하는 삽입/결실 돌연변이의 도입을 초래할 수 있다.
부위-특이적인 게놈 편집을 가능하게 하기 위해 개발된 주요 부류의 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성제-유사 뉴클레아제 (TALEN), 및 CRISPR-회합된 뉴클레아제 (예를 들어, CRISPR/Cas9)를 포함한다. 이들 뉴클레아제 시스템은 그것의 DNA 인식 방식에 따라 광범위하게 두 가지 카테고리로 분류될 수 있으며: ZFN 및 TALEN은 단백질-DNA 상호작용을 통해 특정 DNA 결합을 달성하는 반면, CRISPR 시스템, 예컨대 Cas9는 표적 DNA와 직접 염기쌍을 이루는 짧은 RNA 가이드 분자 및 단백질-DNA 상호작용에 의해 특이적 DNA 서열에 표적화된다. 예를 들어 문헌[Cox 등, Nature Medicine, 2015, Vol. 21, No. 2]을 참고한다.
본 발명의 TIL 확장 방법에 따라 사용될 수 있는 유전자 편집 방법의 비-제한적인 예는 하기 더 자세히 기재되어 있는 CRISPR 방법, TALE 방법, 및 ZFN 방법을 포함한다. 일 실시형태에 따르면, TIL을 치료 집단으로 확장하는 방법은 본원에 기재된 방법 (예를 들어, GEN 3 공정)의 임의의 실시형태에 따라, 또는 PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605, 또는 PCT/US2018/012633에 기재된 바와 같이 수행될 수 있으며, 여기서 상기 방법은 향상된 치료 효과를 제공할 수 있는 TIL을 생성하기 위해 CRISPR 방법, TALE 방법 또는 ZFN 방법 중 하나 이상에 의해 TIL의 적어도 일부를 유전자 편집하는 것을 추가로 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 유전자 편집된 TIL은, 예를 들어, 비변형된 TIL과 비교하여 시험관내 효과기 기능, 사이토카인 프로파일 등을 평가하여 시험관내에서 비-개질된 TIL과 비교함으로써 개선된 치료 효과에 대해 평가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 방법은 CRISPR, TALE 및/ 또는 ZFN 방법을 사용하여 TIL 집단을 유전자 편집하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 전기천공은 유전자 편집 시스템, 예컨대 CRISPR, TALEN, 및 ZFN 시스템의 전달에 사용된다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 전기천공 시스템은 흐름 전기천공 시스템이다. 본 발명의 일부 실시형태와 함께 사용하기에 적절한 적합한 흐름 전기천공 시스템의 예는 상업적으로-입수가능한 MaxCyte STX 시스템이다. BTX-Harvard Apparatus로부터 입수가능한 AgilePulse 시스템 또는 ECM 830, Cellaxess Elektra (Cellectricon), Nucleofector (Lonza/Amaxa), GenePulser MXcell (BIORAD), iPorator-96 (Primax) 또는 siPORTer96 (Ambion)과 같이 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 몇 개의 대안적인 상업적으로-입수가능한 전기천공 기구가 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 전기천공 시스템은 나머지 TIL 확장 방법을 사용하여 폐쇄된 멸균 시스템을 형성한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 전기천공 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 펄스화된 전기천공 시스템이고, 나머지 TIL 확장 방법을 사용하여 폐쇄된 멸균 시스템을 형성한다.
TIL을 치료 집단으로 확장하는 방법은 본원에 기재된 방법 (예를 들어, 공정 GEN 3)의 임의의 실시형태에 따라 또는 PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605, 또는 PCT/US2018/012633에 기재된 바와 같이 수행될 수 있으며, 여기서 상기 방법은 TIL의 적어도 일부를 CRISPR 방법 (예를 들어, CRISPR/Cas9 또는 CRISPR/Cpf1)에 의해 유전자 편집하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에 따르면, TIL 확장 공정 동안 CRISPR 방법을 사용하여 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자의 발현이 TIL 치료 집단의 적어도 일부에서 침묵화되거나 감소되도록 한다. 대안적으로, TIL 확장 공정 동안 CRISPR 방법을 사용하여 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자의 발현이 TIL 치료 집단의 적어도 일부에서 향상되도록 한다.
CRISPR은 "클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복"을 나타낸다. 유전자 편집을 위해 CRISPR 시스템을 사용하는 방법은 본원에서 CRISPR 방법으로도 지칭된다. RNA 및 Cas 단백질을 포함하고, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 3가지 유형의 CRISPR 시스템이 있다: 유형 I, II, 및 III. 유형 II CRISPR (Cas9로 예시됨)은 가장 잘-특성화된 시스템 중 하나이다.
CRISPR 기술은 박테리아 및 고세균 (단세포 미생물의 영역)의 천연 방어 메커니즘에서 채택되었다. 이들 유기체는 CRISPR-유래된 RNA와 Cas9를 포함한 다양한 Cas 단백질을 사용하여 외래 침입자의 DNA를 자르고 파괴하여 바이러스 및 기타 이물질의 공격을 막는다. CRISPR은 뉴클레오티드 반복 및 스페이서의 존재라는 두 가지 구별되는 특성을 가진 DNA의 특화된 영역이다. 뉴클레오티드의 반복 서열은 반복 서열 사이에 산재된 외래 DNA의 짧은 분절 (스페이서)과 함께 CRISPR 영역 전체에 분포되어 있다. 유형 II CRISPR/Cas 시스템에서, 스페이서는 CRISPR 유전자 좌위 내에 통합되고, 짧은 CRISPR RNA (crRNA)로 전사 및 처리된다. 이들 crRNA는 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)에 어닐링되고, Cas 단백질에 의한 병원성 DNA의 서열-특이적 절단 및 침묵화를 지시한다. Cas9 단백질에 의한 표적 인식은 crRNA 내의 "시드" 서열 및 crRNA-결합 영역의 업스트림에 보존된 디뉴클레오티드-함유 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열을 필요로 한다. 그에 따라 CRISPR/Cas 시스템은 crRNA를 재설계하여 사실상 모든 DNA 서열을 절단하도록 재표적화될 수 있다. 천연 시스템의 crRNA 및 tracrRNA는 유전공학에 사용하기 위해 대략 100개 뉴클레오티드의 단일 가이드 RNA (sgRNA)로 단순화될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas9 엔도-뉴클레아제 및 필요한 crRNA 구성요소를 발현시키는 플라스미드의 공동 전달을 통해 인간 세포에 직접 이식될 수 있다. Cas 단백질의 상이한 변이체를 사용하여 표적화 한계를 감소시킬 수 있다 (예를 들어, Cas9의 오쏘로그, 예컨대 Cpf1).
CRISPR 방법을 통해 TIL을 영구적으로 유전자 편집하여 침묵화되거나 억제될 수 있는 유전자의 비-제한적인 예는 PD-1, CTLA-4, LAG-3, HAVCR2 (TIM-3), Cish, TGFβ, PKA, CBL-B, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, 및 GUCY1B3을 포함한다.
CRISPR 방법을 통해 TIL을 영구적으로 유전자 편집하여 향상될 수 있는 유전자의 비-제한적인 예는 CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, IL-2, IL12, IL-15, 및 IL-21을 포함한다.
본 발명의 실시형태에 따라 사용될 수 있는, CRISPR 방법에 의해 표적 유전자 서열의 발현을 변경하기 위한 시스템, 방법, 및 조성물의 예는 본원에 인용되어 포함된 미국 특허 제8,697,359호; 제8,993,233호; 제8,795,965호; 제8,771,945호; 제8,889,356호; 제8,865,406호; 제8,999,641호; 제8,945,839호; 제8,932,814호; 제8,871,445호; 제8,906,616호; 및 제8,895,308호에 기재되어 있다. CRISPR/Cas9 및 CRISPR/Cpf1을 발현시키기 위한 플라스미드와 같은 CRISPR 방법을 수행하기 위한 리소스는 GenScript와 같은 회사에서 상업적으로 입수가능하다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 TIL 집단의 유전자 변형은 그 개시내용이 본원에 인용되어 포함된 미국 특허 US 9790490호에 기재된 바와 같은 CRISPR/Cpf1 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
TIL을 치료 집단으로 확장하는 방법은 본원에 기재된 방법 (예를 들어, 공정 2A)의 임의의 실시형태에 따라 또는 PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605, 또는 PCT/US2018/012633에 기재된 바와 같이 수행될 수 있으며, 여기서 상기 방법은 TIL의 적어도 일부를 TALE 방법으로 유전자 편집하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에 따르면, TIL 확장 공정 동안 TALE 방법을 사용하여 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자의 발현이 TIL 치료 집단의 적어도 일부에서 침묵화되거나 감소되도록 한다. 대안적으로, TIL 확장 공정 동안 TALE 방법을 사용하여 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자의 발현이 TIL 치료 집단의 적어도 일부에서 향상되도록 한다.
TALE는 TALEN ("전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제")을 포함하는 "전사 활성제-유사 효과기" 단백질을 나타낸다. 유전자 편집을 위해 TALE 시스템을 사용하는 방법은 본원에서 TALE 방법으로도 지칭될 수 있다. TALE는 식물 병원성 박테리아 속 크산토모나스에서 자연적으로 발생하는 단백질이며, 각각 단일 염기쌍을 인식하는 일련의 33-35-아미노산 반복 도메인으로 구성된 DNA-결합 도메인을 포함한다. TALE 특이성은 반복-가변 이잔기 (repeat-variable di-residue; RVD)로 알려진 2개의 초가변 아미노산에 의해 결정된다. 모듈식 TALE 반복은 서로 연결되어 인접 DNA 서열을 인식한다. DNA-결합 도메인의 특정 RVD는 표적 유전자좌 내 염기를 인식하여 예측가능한 DNA-결합 도메인을 조립하는 구조적 특징을 제공한다. TALE의 DNA 결합 도메인은 유형 IIS FokI 엔도뉴클레아제의 촉매 도메인에 융합되어 표적화가능 TALE 뉴클레아제를 만든다. 부위-특이적인 돌연변이를 유도하기 위해, 14-20개 염기쌍 스페이서 영역으로 분리된 2개의 개별 TALEN 암은 FokI 단량체를 근접하게 가져와 이량체화하고 표적화된 이중-가닥 파손을 생성한다.
다양한 조립 방법을 이용한 대규모의 체계적인 여러 연구에서는 TALE 반복을 조합하여 사실상 모든 사용자-정의된 서열을 인식할 수 있음을 보여주었다. 맞춤-설계된 TALE 어레이는 또한 Cellectis Bioresearch (프랑스 파리), Transposagen Biopharmaceuticals (미국 켄터키주 렉싱턴), 및 Life Technologies (미국 뉴욕주 그랜드아일랜드)를 통해 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 TALE 및 TALEN 방법은 그 개시내용이 본원에 인용되어 포함된 미국 특허출원공개 US 2011/0201118 A1; US 2013/0117869 A1; US 2013/0315884 A1; US 2015/0203871 A1 및 US 2016/0120906 A1에 기재되어 있다.
TALE 방법을 통해 TIL을 영구적으로 유전자 편집하여 침묵화되거나 억제될 수 있는 유전자의 비-제한적인 예는 PD-1, CTLA-4, LAG-3, HAVCR2 (TIM-3), Cish, TGFβ, PKA, CBL-B, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, 및 GUCY1B3을 포함한다.
TALE 방법을 통해 TIL을 영구적으로 유전자 편집하여 향상될 수 있는 유전자의 비-제한적인 예는 CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, IL-2, IL12, IL-15, 및 IL-21을 포함한다.
본 발명의 실시형태에 따라 사용될 수 있는, TALE 방법에 의해 표적 유전자 서열의 발현을 변경하기 위한 시스템, 방법, 및 조성물의 예는 본원에 인용되어 포함된 미국 특허 제8,586,526호에 기재되어 있다.
TIL을 치료 집단으로 확장하는 방법은 본원에 기재된 방법 (예를 들어, 공정 GEN 3)의 임의의 실시형태에 따라 또는 국제출원 PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605, 또는 PCT/US2018/012633에 기재된 바와 같이 수행될 수 있으며, 여기서 상기 방법은 TIL의 적어도 일부를 아연 핑거 또는 아연 핑거 뉴클레아제 방법에 의해 유전자 편집하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에 따르면, TIL 확장 공정 동안 아연 핑거 방법을 사용하여 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자의 발현이 TIL 치료 집단의 적어도 일부에서 침묵화되거나 감소되도록 한다. 대안적으로, TIL 확장 공정 동안 아연 핑거 방법을 사용하여 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자의 발현이 TIL 치료 집단의 적어도 일부에서 향상되도록 한다.
개별 아연 핑거는 보존된 ββα 구성으로 대략 30개의 아미노산을 포함한다. α-나선 표면의 몇 개의 아미노산은 전형적으로 다양한 수준의 선택성으로 DNA의 주요 홈에서 3 bp와 접촉한다. 아연 핑거는 2개의 단백질 도메인을 갖는다. 제1 도메인은 DNA 결합 도메인으로, 진핵 전사 인자를 포함하고, 아연 핑거를 포함한다. 제2 도메인은 뉴클레아제 도메인으로, FokI 제한 효소를 포함하고, DNA의 촉매적 절단을 담당한다.
개별 ZFN의 DNA-결합 도메인은 전형적으로 3 내지 6개의 개별 아연 핑거 반복을 포함하며, 각각 9 내지 18개의 염기쌍을 인식할 수 있다. 아연 핑거 도메인이 그것의 의도된 표적 부위에 특이적인 경우, 총 18개의 염기쌍을 인식하는 한 쌍의 3-핑거 ZFN조차도 이론적으로 포유류 게놈에서 단일 유전자좌를 표적으로 할 수 있다. 새로운 아연-핑거 어레이를 생성하는 한 가지 방법은 특이성이 알려진 더 작은 아연-핑거 "모듈"을 조합하는 것이다. 가장 흔한 모듈식 조립 공정은 각각 3개의 염기쌍 DNA 서열을 인식할 수 있는 3개의 개별 아연 핑거를 조합하여 9개 염기쌍 표적 부위를 인식할 수 있는 3-핑거 어레이를 생성하는 것을 포함한다. 대안적으로, 선택-기반 접근법, 예컨대 올리고머화된 풀 조작 (oligomerized pool engineering; OPEN)을 사용하여 인접한 핑거 사이의 상황에 따른 상호작용을 고려하는 랜덤화된 라이브러리로부터 새로운 아연-핑거 어레이를 선택할 수 있다. 조작된 아연 핑거는 상업적으로 입수가능하며; Sangamo Biosciences (미국 캘리포니아주 리치몬드)는 Sigma-Aldrich (미국 미주리주 세인트 루이스)와 협력하여 아연-핑거 구축을 위한 독점 플랫폼 (CompoZr®)을 개발했다.
아연 핑거 방법을 통해 TIL을 영구적으로 유전자 편집하여 침묵화되거나 억제될 수 있는 유전자의 비-제한적인 예는 PD-1, CTLA-4, LAG-3, HAVCR2 (TIM-3), Cish, TGFβ, PKA, CBL-B, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, 및 GUCY1B3을 포함한다.
아연 핑거 방법을 통해 TIL을 영구적으로 유전자 편집하여 향상될 수 있는 유전자의 비-제한적인 예는 CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, IL-2, IL12, IL-15, 및 IL-21을 포함한다.
본 발명의 실시형태에 따라 사용될 수 있는, 아연 핑거 방법에 의해 표적 유전자 서열의 발현을 변경하기 위한 시스템, 방법, 및 조성물의 예는 본원에 인용되어 포함된 미국 특허 제6,534,261호, 제6,607,882호, 제6,746,838호, 제6,794,136호, 제6,824,978호, 제6,866,997제, 제6,933,113호, 제6,979,539호, 제7,013,219호, 제7,030,215호, 제7,220,719호, 제7,241,573호, 제7,241,574호, 제7,585,849호, 제7,595,376호, 제6,903,185호, 및 제6,479,626호에 기재되어 있다.
본 발명의 실시형태에 따라 사용될 수 있는, 아연 핑거 방법에 의해 표적 유전자 서열의 발현을 변경하기 위한 시스템, 방법, 및 조성물의 다른 예는 그 개시내용이 본원에 인용되어 포함된 문헌[Beane, 등, Mol. Therapy, 2015, 23 1380-1390]에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, TIL은 고친화도 T 세포 수용체(TCR), 예를 들어, MAGE-1, HER2, 또는 NY-ESO-1과 같은 종양-관련 항원을 표적으로 하는 TCR, 또는 종양-연관 세포 표면 분자(예를 들어, 메소텔린) 또는 계통-제한 세포 표면 분자(예를 들어, CD19)에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 기능성을 포함하도록 선택적으로 유전적으로 조작된다. 특정 실시형태에서, 방법은 고-친화성 T 세포 수용체 (TCR), 예를 들어, 종양-회합된 항원 예컨대 MAGE-1, HER2, 또는 NY-ESO-1을 표적으로 하는 TCR, 또는 종양-회합된 세포 표면 분자 (예를 들어, 메소텔린) 또는 계통-제한된 세포 표면 분자 (예를 들어, CD19)에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하도록 TIL 집단을 유전적으로 조작하는 것을 포함한다. 적절하게, TIL 집단은 본원에 기재된 바와 같이 제1 집단, 제2 집단 및/또는 제3 집단일 수 있다.
K. TIL 제조를 위한 폐쇄 시스템
본 발명은 TIL 배양 공정 동안 폐쇄 시스템의 사용을 제공한다. 이러한 폐쇄 시스템은 미생물 오염을 방지 및/또는 감소시키고, 더 적은 플라스크의 사용을 허용하고, 비용 감소를 허용한다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 2개의 용기를 사용한다.
이러한 폐쇄 시스템은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm 및 https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm에서 발견될 수 있다.
멸균 연결 장치(STCD)는 2 개의 양립가능한 튜빙 사이에 멸균 용접을 생성한다. 이러한 절차는 다양한 용기 및 튜브 직경의 멸균 연결을 허용한다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 예를 들어 실시예 G에 기재된 바와 같은 루어 로크 및 열 밀봉 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 시스템의 멸균 및 폐쇄 특성을 유지하기 위해 멸균 조건 하에서 주사기를 통해 접근된다. 일부 실시형태에서, 실시예 G에 기재된 바와 같은 폐쇄 시스템이 사용된다. 일부 실시형태에서, TIL은 실시예 G, 섹션 "최종 제형 및 필(fill)"에 기재된 방법에 따라 최종 생성물 제형 용기로 제형화한다.
일부 실시형태에서, 폐쇄 시스템은 TIL이 환자에게 투여 또는 동결보존을 위해 준비될 때까지 종양 단편이 얻어지는 시간으로부터 하나의 용기를 사용한다. 일부 실시형태에서 2개의 용기가 사용되는 경우, 제1 용기는 폐쇄된 G-용기이고, TIL의 집단은 원심분리되고 제1 폐쇄 G- 용기를 개방하지 않고 주입 백으로 이송된다. 일부 실시형태에서, 2개의 용기가 사용되는 경우, 주입 백은 HypoThermosol-함유 주입 백이다. 폐쇄 시스템 또는 폐쇄 TIL 세포 배양 시스템은, 일단 종양 샘플 및/또는 종양 단편이 첨가되면, 시스템이 외부로부터 단단히 밀봉되어 박테리아, 진균, 또는 임의의 다른 미생물 오염의 침입이 없는 폐쇄 환경을 형성하는 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5% 내지 약 100%이다. 일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5% 내지 약 95%이다. 일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5% 내지 약 90%이다. 일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 10% 내지 약 90%이다. 일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 15% 내지 약 85%이다. 일부 실시형태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%이다.
폐쇄 시스템은 미생물 오염의 부재 및/또는 상당한 감소와 함께 TIL 성장을 허용한다.
또한, TIL 세포 배양 환경의 pH, 이산화탄소 분압 및 산소 분압은 세포가 배양됨에 따라 각각 변화한다. 결과적으로, 세포 배양에 적합한 배지가 순환되더라도, 폐쇄 환경은 TIL 증식을 위한 최적의 환경으로서 계속 유지될 필요가 있다. 이를 위해, 폐쇄 환경의 배양액 내의 pH, 이산화탄소 분압 및 산소 분압의 물리적 인자가 센서에 의해 모니터링되고, 그 신호가 배양 환경의 입구에 설치된 기체 교환기를 제어하는 데 사용되고, 상기 폐쇄 환경의 기체 분압이 세포 배양 환경을 최적화하기 위해 배양액의 변화에 따라 실시간으로 조정되는 것이 바람직하다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 폐쇄 환경의 pH, 이산화탄소 분압 및 산소 분압을 측정하는 모니터링 장치가 구비된 기체 교환기를 폐쇄 환경의 입구에 통합하고, 모니터링 장치로부터의 신호에 기초하여 기체 농도를 자동으로 조정함으로써 세포 배양 환경을 최적화하는 폐쇄 세포 배양 시스템을 제공한다.
일부 실시형태에서, 폐쇄 환경 내의 압력은 연속적으로 또는 간헐적으로 제어된다. 즉, 폐쇄 환경에서의 압력은 예를 들어, 압력 유지 장치에 의해 변화될 수 있어서, 공간이 양압 상태에서 TIL의 성장에 적합한 것을 보장하거나, 음압 상태에서 유체의 삼출을 촉진하여 세포 증식을 촉진한다. 음압을 간헐적으로 적용함으로써, 폐쇄 환경의 부피에서의 일시적인 수축에 의해 폐쇄 환경에서 순환 액체를 균일하고 효율적으로 교체하는 것이 가능하다.
일부 실시형태에서, TIL의 증식을 위한 최적의 배양 성분이 치환 또는 첨가될 수 있고, IL-2 및/또는 OKT3과 같은 인자뿐만 아니라 조합이 첨가될 수 있다.
L. TIL의 선택적 동결보존
벌크 TIL 집단 (예를 들어 TIL의 제2 집단) 또는 확장된 TIL의 집단 (예를 들어 TIL의 제3 집단)는 선택적으로 동결보존될 수 있다. 일부 실시형태에서, 동결보존은 치료적 TIL 집단 상에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 동결보존은 제2 확장 후에 수확된 TIL 상에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 동결보존은 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 예시적인 단계 F에서 TIL 상에서 일어난다. 일부 실시형태에서, TIL은 주입 백에서 동결보존된다. 일부 실시형태에서, TIL은 주입 백에 배치하기 전에 동결보존된다. 일부 실시형태에서, TIL은 동결보존되고 주입 백에 배치되지 않는다. 일부 실시형태에서, 동결보존은 동결보존 배지를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 동결보존 배지는 디메틸설폭사이드 (DMSO)를 함유한다. 이는 일반적으로 TIL 집단을 냉동 용액, 예를 들어, 85% 보체 불활성화된 AB 혈청 및 15% 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 넣음으로써 달성된다. 용액 중의 세포는 극저온 바이알에 배치되고 -80℃에서 24시간 동안 저장되고, 동결보존을 위해 기체 질소 냉동고로 선택적으로 이동된다. 문헌[Sadeghi, 등, Acta Oncologica 2013, 52, 978-986]을 참조한다.
적절할 때, 세포는 냉동고에서 제거되고 용액의 대략 4/5가 해동될 때까지 37℃ 수조에서 해동된다. 세포는 일반적으로 완전 배지에 재현탁되고 선택적으로 1회 이상 세정된다. 일부 실시형태에서, 해동된 TIL은 당해 기술에 알려져 있는 바와 같이 생존력에 대해 계수되고 평가될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, TIL의 집단은 CS10 동결보존 배지 (CryoStor 10, BioLife Solutions)를 사용하여 동결보존된다. 바람직한 실시형태에서, TIL의 집단은 디메틸설폭사이드 (DMSO)를 함유하는 동결보존 배지를 사용하여 동결보존된다. 바람직한 실시형태에서, TIL의 집단은 CS10 및 세포 배양 배지의 1:1 (vol:vol) 비를 사용하여 동결보존된다. 바람직한 실시형태에서, TIL의 집단은 추가의 IL-2을 추가로 포함하는 CS10 및 세포 배양 배지의 약 1:1 (vol:vol) 비를 사용하여 동결보존된다.
상기 논의되고 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 바와 같은 단계 A 내지 E에서 예시된 바와 같이, 동결보존은 TIL 확장 공정 전반에 걸쳐 다수의 지점에서 일어날 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 (예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 D에 따라 제공된 바와 같은) 제2 확장 후의 확장된 TIL의 집단은 동결보존될 수 있다. 동결보존 일반적으로 TIL 집단을 냉동 용액, 예를 들어, 85% 보체 불활성화된 AB 혈청 및 15% 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 배치함으로써 달성될 수 있다. 용액 중의 세포는 극저온 바이알에 배치되고 -80℃에서 24시간 동안 저장되고, 동결보존을 위해 기체 질소 냉동고로 선택적으로 이동된다. 문헌[Sadeghi, 등, Acta Oncologica 2013, 52, 978-986]을 참조한다. 일부 실시형태에서, TIL은 5%의 DMSO에서 동결보존된다. 일부 실시형태에서, TIL은 세포 배양 배지 플러스 5%의 DMSO에서 동결보존된다. 일부 실시형태에서, TIL은 실시예 D에 제공된 방법에 따라 동결보존된다.
적절할 때, 세포는 냉동고에서 제거되고 용액의 대략 4/5가 해동될 때까지 37℃ 수조에서 해동된다. 세포는 일반적으로 완전 배지에 재현탁되고 선택적으로 1회 이상 세정된다. 일부 실시형태에서, 해동된 TIL은 당해 기술에 알려져 있는 바와 같이 생존력에 대해 계수되고 평가될 수 있다.
일부 경우에, 단계 B TIL 집단은 아래에 논의된 프로토콜을 사용하여 즉시 동결보존될 수 있다. 대안적으로, 벌크 TIL 집단은 단계 C 및 단계 D를 거칠 수 있고 그 다음 단계 D 후에 동결보존될 수 있다. 유사하게, 유전적으로 변형된 TIL이 요법에 사용될 경우, 단계 B 또는 단계 D TIL 집단은 적합한 치료를 위해 유전자 변형을 거칠 수 있다.
M. 확장된 TIL의 표현형 특성
일부 실시형태에서, IL은 본원에 기재된 것 및 실시예에 기재된 것을 포함하여, 확장 후 다수의 표현형 마커의 발현에 대해 분석된다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 표현형 마커의 발현이 검사된다. 일부 실시형태에서, TIL의 표현형 특성은 단계 B의 제1 확장 후에 분석된다. 일부 실시형태에서, TIL의 표현형 특성은 단계 C의 이행 동안에 분석된다. 일부 실시형태에서, TIL의 표현형 특성은 단계 C에 따른 이행 동안 그리고 동결보존 후에 분석된다. 일부 실시형태에서, TIL의 표현형 특성은 단계 D에 따른 제2 확장 후에 분석된다. 일부 실시형태에서, TIL의 표현형 특성은 단계 D에 따른 2개 이상의 확장 후에 분석된다.
일부 실시형태에서, 마커는 CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CD8의 발현이 검사된다. 일부 실시형태에서, CD28의 발현이 검사된다. 일부 실시형태에서, CD8 및/또는 CD28의 발현은 다른 공정과 비교하여 (예를 들어, 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 Gen 3 공정, 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 2A 공정과 비교하여 본 발명의 공정에 따라 생성된 TIL에 대해 더 높다. 일부 실시형태에서, CD8의 발현은 다른 공정과 비교하여 (예를 들어, 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b)에서 제공된 Gen 3 공정, 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 2A 공정과 비교하여) 본 발명의 공정에 따라 생성된 TIL에 대해 더 높다. 일부 실시형태에서, CD28의 발현은 다른 공정과 비교하여 (예를 들어, 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 Gen 3 공정, 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8a)에 제공된 2A 공정과 비교하여) 본 발명의 공정에 따라 생성된 TIL에 대해 더 높다. 일부 실시형태에서, 높은 CD28 발현은 젊고 더 우세한 TIL 표현형을 나타낸다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 조절성 마커의 발현이 측정된다.
일 실시형태에서, CD8 및/또는 CD28 발현을 기반으로 하는 TIL의 제1 집단, TIL의 제2 집단, 제3 TIL의 집단, 또는 수확된 TIL 집단의 선택은 본원에 기재된 종양 침윤 림프구 (TIL)을 확장시키기 위해 방법의 임의의 단계 동안에 수행되지 않는다.
일부 실시형태에서, 중앙 기억 세포의 백분율은 다른 공정과 비교하여 (예를 들어, 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 Gen 3 공정, 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8a)에 제공된 2A 공정과 비교하여) 본 발명의 공정에 따라 생성된 TIL에 대해 더 높다. 일부 실시형태에서, 중앙 기억 세포에 대한 기억 마커는 CCR7 및 CD62L로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, CD4+ 및/또는 CD8+ TIL 기억 하위세트는 상이한 기억 하위세트로 나누어질 수 있다. 일부 실시형태에서, CD4+ 및/또는 CD8+ TIL은 미접촉 (CD45RA+CD62L+) TILS를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD4+ 및/또는 CD8+ TIL은 중앙 기억 (CM; CD45RA-CD62L+) TIL을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD4+ 및/또는 CD8+ TIL은 효과기 기억 (EM; CD45RA-CD62L-) TIL을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD4+ 및/또는 CD8+ TIL은, RA+ 효과기 기억/효과기 (TEMRA/TEFF; CD45RA+CD62L+) TIL을 포함한다.
일부 실시형태에서, TIL은 그란자임 B, 페르포린, 및 그라눌라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 초과의 마커를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, TIL은 그란자임 B를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, TIL은 페르포린을 발현시킨다. 일부 실시형태에서, TIL은 그라눌라이신을 발현시킨다.
일 실시형태에서, 재자극된 TIL은 또한 사이토카인 방출 검정을 사용하여 사이토카인 방출에 대해 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL은 인터페론-γ (IFN-γ) 분비에 대해 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 ELISA 검정에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 급속 제2 확장 단계, 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 단계 D 후에 ELISA 검정에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, TIL 건강은 IFN-감마 (IFN-γ) 분비에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 활성 TIL을 나타낸다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 생성을 위한 효능 검정이 사용된다. IFN-γ 생성은 세포독성 잠재력의 또 다른 척도이다. IFN-γ 생성은 CD3, CD28, 및 CD137/4-1BB에 대한 항체로 자극된 TIL의 배지에서 사이토카인 IFN-α의 수준을 결정함으로써 측정될 수 있다. 이들 자극된 TIL로부터 배지의 IFN-γ 수준은 IFN-γ 방출을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8a)에 제공된 바와 같은 2A 공정의 단계 D와 비교된 예를 들어 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c) TIL에 제공된 바와 같은 Gen 3 공정의 단계 D에서 IFN-γ 생성의 증가는 단계 D TIL의 세포독성 잠재력의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 증가된 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 또는 5-배 또는 그 초과이다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 1-배 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 2-배 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 3-배 증가된. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 4-배 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 5-배 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ는 Quantikine ELISA 키트를 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ는 생체외 TIL에서 측정된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ는 예를 들어 도 8b 방법을 포함하는 본 발명의 방법에 의해 생성된 TIL을 포함하는 생체외 TIL에서 측정된다.
일부 실시형태에서, 적어도 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 또는 5-배 또는 그 초과 IFN-γ를 분비할 수 있는 TIL은 예를 들어 도 8b 및/또는 도 8c 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1-배 더 많은 IFN-γ를 분비할 수 있는 TIL은 예를 들어 도 8b 및/또는 도 8c 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시형태에서, 적어도 2-배 더 많은 IFN-γ를 분비할 수 있는 TIL은 예를 들어 도 8b 및/또는 도 8c 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시형태에서, 적어도 3-배 더 많은 IFN-γ를 분비할 수 있는 TIL은 예를 들어 도 8b 및/또는 도 8c 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시형태에서, 적어도 4-배 더 많은 IFN-γ를 분비할 수 있는 TIL은 예를 들어 도 8b 및/또는 도 8c 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시형태에서, 적어도 5-배 더 많은 IFN-γ를 분비할 수 있는 TIL은 예를 들어 도 8b 및/또는 도 8c 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다.
T 및 B 림프구의 다양한 항원 수용체는 제한적이지만 많은 수의 유전자 분절의 체세포 재조합에 의해 생성된다. 이들 유전자 분절: V (가변), D (다양성), J (결합), 및 C (불변)은 결합 특이성 및 면역글로불린 및 T-세포 수용체 (TCR)의 하류 적용을 결정한다. 본 발명은 T-세포 레퍼토리 다양성을 나타내고 증가시키는 TIL을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 일부 실시형태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 구현된 것 이외의 방법을 사용하여 제조된 새롭게 수확된 TIL 및/또는 TIL들과 비교하여 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 도 8에 예시된 바와 같이 공정 2A로 지칭되는 방법 (특히, 예를 들어, 도 8a)을 사용하여 제조된 새롭게 수확된 TIL 및/또는 TIL들과 비교하여 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 제1 확장에서 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 다양성의 증가는 면역글로불린 다양성 및/또는 T-세포 수용체 다양성의 증가이다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 중쇄에 있다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린의 다양성은 면역글로불린 경쇄에 있다. 일부 실시형태에서, 다양성은 T-세포 수용체에 있다. 일부 실시형태에서, 다양성은 알파, 베타, 감마, 및 델타 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 T-세포 수용체 중 하나에 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파 및/또는 베타의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 수용체 (TCR) 베타의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, TCRab (즉, TCRα/β)의 발현의 증가가 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 공정 (예를 들어, Gen 3 공정)은 예를 들어 샘플 내의 고유한 펩티드 CDR의 수를 기반으로 하는 Gen 2로 지칭된 공정에 비해 더 높은 클론 다양성을 보여준다 (예를 들어 도 12-14를 참조한다).
일부 실시형태에서, TIL의 활성화 및 고갈은 조사함으로써 하나 이상의 마커를 조합함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 및 고갈은 다색 유세포측정을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 마커의 활성화 및 고갈은 CD3, PD-1, 2B4/CD244, CD8, CD25, BTLA, KLRG, TIM-3, CD194/CCR4, CD4, TIGIT, CD183, CD69, CD95, CD127, CD103, 및/또는 LAG-3)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 비제한적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 마커의 활성화 및 고갈은 BTLA, CTLA-4, ICOS, Ki67, LAG-3, PD-1, TIGIT, 및/또는 TIM-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 비제한적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 마커의 활성화 및 고갈은 BTLA, CTLA-4, ICOS, Ki67, LAG-3, CD103+/CD69+, CD103+/CD69-, PD-1, TIGIT, 및/또는 TIM-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 비제한적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, T-세포 마커 (활성화 및 고갈 마커 포함)는 결정되고/결정되거나 분석되어 T-세포 활성화, 억제, 또는 기능을 조사할 수 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 마커는 TIGIT, CD3, FoxP3, Tim-3, PD-1, CD103, CTLA-4, LAG-3, BTLA-4, ICOS, Ki67, CD8, CD25, CD45, CD4, 및/또는 CD59으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 비제한적으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 표현형 특성화는 동결보존 후에 검사된다.
M. 추가의 공정 실시형태
일부 실시형태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 종양 침윤 림프구 (TIL)를 TIL의 치료 집단으로 확장하는 방법을 제공한다: (a) 종양 대상체로부터 수득된 샘플을 다수의 종양 단편으로 처리함으로써 대상체로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계; (b) IL-2 및 OKT-3을 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양하여 프라이밍 제1 확장을 수행하는 단계로서, 프라이밍 제1 확장은 약 1 내지 7일의 기간 동안 또는 약 1 내지 8일 동안 수행되어 TIL의 제2 집단을 수득하는 단계로서, 상기 TIL의 제2 집단은 TIL의 제1 집단보다 크기가 더 큰, 단계; (c) TIL의 제2 집단을 IL-2, OKT-3 및 외인성 항원 제시 세포 (APC)를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시켜 급속 제2 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 급속 제2 확장은 약 1 내지 11일 또는 약 1 내지 10일 동안 수행되어 TIL의 제3 집단을 수득하고, 상기 TIL의 제3 집단은 TIL의 치료 집단인, 단계; 및 (d) 단계 (c)로부터 수득된 TIL의 치료 집단을 수확하는 단계. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (1) 약 3 내지 4일, 또는 약 2 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 TIL의 제2 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (2) 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기로부터 더 큰 제2 용기로 이동시키는 단계로서, 제2 용기에서, 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단은 약 4 내지 7일, 또는 약 4 내지 8 일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계. 일부 실시형태에서, 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (1) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 제1 소규모 배양물에서 TIL의 제2 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (2) 제1 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단을 제1 용기의 크기와 동일한 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 제2 용기로 이동된 제1 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단의 부분은 약 4 내지 7일의 기간 동안, 또는 약 4 내지 8 일의 기간 동안 제2 소규모 배양물에서 배양되는, 단계. 일부 실시형태에서, 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (1) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 TIL의 제2 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 또는 약 2 내지 4일의 기간 동안, 및 그 다음 (2) 제1 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기보다 크기가 더 큰 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 소규모 배양물로부터 그와 같은 제2 용기로 이동된 TIL의 제2 집단의 부분은 약 4 내지 7일의 기간 동안, 또는 약 4 내지 8 일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계. 일부 실시형태에서, 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (1) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 TIL의 제2 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (2) 제1 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기보다 크기가 더 큰 2, 3 또는 4개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 소규모 배양물로부터 그와 같은 제2 용기로 이동된 TIL의 제2 집단의 부분은 약 5 내지 7일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계.
일부 실시형태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 종양 침윤 림프구 (TIL)를 TIL의 치료 집단으로 확장하는 방법을 제공한다: (a) 종양 대상체로부터 수득된 샘플을 다수의 종양 단편으로 처리함으로써 대상체로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계; (b) IL-2 및 OKT-3을 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양하여 프라이밍 제1 확장을 수행하는 단계로서, 프라이밍 제1 확장은 약 1 내지 8일 동안 수행되어 TIL의 제2 집단을 수득하는 단계로서, 상기 TIL의 제2 집단은 TIL의 제1 집단보다 크기가 더 큰, 단계; (c) TIL의 제2 집단을 IL-2, OKT-3 및 외인성 항원 제시 세포 (APC)를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시켜 급속 제2 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 급속 제2 확장은 약 1 내지 8일 동안 수행되어 TIL의 제3 집단을 수득하는 단계로서, 상기 TIL의 제3 집단은 TIL의 치료 집단인, 단계; 및 (d) 단계 (c)로부터 수득된 TIL의 치료 집단을 수확하는 단계. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (1) 약 2 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 TIL의 제2 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (2) 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기로부터 더 큰 제2 용기로 이동시키는 단계로서, 제2 용기에서, 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단은 약 4 내지 8일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (1) 약 2 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 제1 소규모 배양물에서 TIL의 제2 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (2) 제1 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단을 제1 용기의 크기와 동일한 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 제2 용기로 이동된 제1 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단의 부분은 약 4 내지 6 일의 기간 동안 제2 소규모 배양물에서 배양되는, 단계. 일부 실시형태에서, 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (1) 약 2 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 TIL의 제2 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (2) 제1 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기보다 크기가 더 큰 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 소규모 배양물로부터 그와 같은 제2 용기로 이동된 TIL의 제2 집단의 부분은 약 4 내지 6 일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계. 일부 실시형태에서, 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (1) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 TIL의 제2 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (2) 제1 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기보다 크기가 더 큰 2, 3 또는 4개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 소규모 배양물로부터 그와 같은 제2 용기로 이동된 TIL의 제2 집단의 부분은 약 4 내지 5 일의 기간 동안의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계.
일부 실시형태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 종양 침윤 림프구 (TIL)를 TIL의 치료 집단으로 확장하는 방법을 제공한다: (a) 종양 대상체로부터 수득된 샘플을 다수의 종양 단편으로 처리함으로써 대상체로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계; (b) IL-2 및 OKT-3을 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양하여 프라이밍 제1 확장을 수행하는 단계로서, 프라이밍 제1 확장은 약 1 내지 7일 동안 수행되어 TIL의 제2 집단을 수득하는 단계로서, 상기 TIL의 제2 집단은 TIL의 제1 집단보다 크기가 더 큰, 단계; (c) TIL의 제2 집단을 IL-2, OKT-3 및 외인성 항원 제시 세포 (APC)를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시켜 급속 제2 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 급속 제2 확장은 약 1 내지 11일 동안 수행되어 TIL의 제3 집단을 수득하는 단계로서, 상기 TIL의 제3 집단은 TIL의 치료 집단인, 단계; 및 (d) 단계 (c)로부터 수득된 TIL의 치료 집단을 수확하는 단계. 일부 실시형태에서, 급속 제2 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (1) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 TIL의 제2 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (2) 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기로부터 더 큰 제2 용기로 이동시키는 단계로서, 제2 용기에서, 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단은 약 4 내지 7일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (1) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 제1 소규모 배양물에서 TIL의 제2 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (2) 제1 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단을 제1 용기의 크기와 동일한 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 제2 용기로 이동된 제1 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단의 부분은 약 4 내지 7일의 기간 동안 제2 소규모 배양물에서 배양되는, 단계. 일부 실시형태에서, 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (1) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 TIL의 제2 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (2) 제1 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기보다 크기가 더 큰 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 소규모 배양물로부터 그와 같은 제2 용기로 이동된 TIL의 제2 집단의 부분은 약 4 내지 7일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계. 일부 실시형태에서, 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (1) 약 4일이 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 TIL의 제2 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (2) 제1 소규모 배양물로부터의 TIL의 제2 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기보다 크기가 더 큰 2, 3 또는 4개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 소규모 배양물로부터 그와 같은 제2 용기로 이동된 TIL의 제2 집단의 부분은 약 5일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단을 외인성 항원 제시 세포 (APC)를 추가로 포함하는 배양 배지와 접촉시킴으로써 수행되고, 단계 (c)의 배양 배지에서 APC의 수는 단계 (b)의 배양 배지에서 APC의 수보다 더 크도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)에서, 배양 배지가 추가의 외인성 APC로 보충 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 20:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 10:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 9:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 8:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 7:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 6:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 5:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 4:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 3:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.9:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.8:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.7:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.6:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.5:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.4:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.3:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.2:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 2.1:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 1.1:1 또는 그 근처 내지 2:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 2:1 또는 그 근처 내지 10:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 2:1 또는 그 근처 내지 5:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 2:1 또는 그 근처 내지 4:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 2:1 또는 그 근처 내지 3:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 2:1 또는 그 근처 내지 2.9:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 2:1 또는 그 근처 내지 2.8:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 2:1 또는 그 근처 내지 2.7:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 2:1 또는 그 근처 내지 2.6:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 2:1 또는 그 근처 내지 2.5:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 2:1 또는 그 근처 내지 2.4:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 2:1 또는 그 근처 내지 2.3:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 2:1 또는 그 근처 내지 2.2:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 2:1 또는 그 근처 내지 2.1:1 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 약 2:1 또는 그 근처이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수 대 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수의 비가 약 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 2.6:1, 2.7:1, 2.8:1, 2.9:1, 3:1, 3.1:1, 3.2:1, 3.3:1, 3.4:1, 3.5:1, 3.6:1, 3.7:1, 3.8:1, 3.9:1, 4:1, 4.1:1, 4.2:1, 4.3:1, 4.4:1, 4.5:1, 4.6:1, 4.7:1, 4.8:1, 4.9:1, 또는 5:1 또는 그 근처이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 1차 제1 확장에서 첨가된 APC의 수가 1×108, 1.1×108, 1.2×108, 1.3×108, 1.4×108, 1.5×108, 1.6×108, 1.7×108, 1.8×108, 1.9×108, 2×108, 2.1×108, 2.2×108, 2.3×108, 2.4×108, 2.5×108, 2.6×108, 2.7×108, 2.8×108, 2.9×108, 3×108, 3.1×108, 3.2×108, 3.3×108, 3.4×108 또는 3.5×108 또는 그 근처 개의 APC이고, 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수가 약 3.5×108, 3.6×108, 3.7×108, 3.8×108, 3.9×108, 4×108, 4.1×108, 4.2×108, 4.3×108, 4.4×108, 4.5×108, 4.6×108, 4.7×108, 4.8×108, 4.9×108, 5×108, 5.1×108, 5.2×108, 5.3×108, 5.4×108, 5.5×108, 5.6×108, 5.7×108, 5.8×108, 5.9×108, 6×108, 6.1×108, 6.2×108, 6.3×108, 6.4×108, 6.5×108, 6.6×108, 6.7×108, 6.8×108, 6.9×108, 7×108, 7.1×108, 7.2×108, 7.3×108, 7.4×108, 7.5×108, 7.6×108, 7.7×108, 7.8×108, 7.9×108, 8×108, 8.1×108, 8.2×108, 8.3×108, 8.4×108, 8.5×108, 8.6×108, 8.7×108, 8.8×108, 8.9×108, 9×108, 9.1×108, 9.2×108, 9.3×108, 9.4×108, 9.5×108, 9.6×108, 9.7×108, 9.8×108, 9.9×108 또는 1×109 또는 그 근처 개의 APC 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 되 1차 제1 확장에서 첨가된 APC의 수가 1×108 또는 그 근처 개의 APC 내지 3.5×108 또는 그 근처 개의 APC의 범위로부터 선택되고, 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수는 3.5×108 또는 그 근처 개의 APC 내지 1×109 또는 그 근처 개의 APC의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 1차 제1 확장에서 첨가된 APC의 수가 1.5×108 또는 그 근처 개의 APC 내지 3×108 또는 그 근처 개의 APC의 범위로부터 선택되고, 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수는 4×108 또는 그 근처 개의 APC 내지 7.5×108 또는 그 근처 개의 APC의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 1차 제1 확장에서 첨가된 APC의 수가 2×108 또는 그 근처 개의 APC 내지 2.5×108 또는 그 근처 개의 APC의 범위로부터 선택되고, 급속 제2 확장에서 첨가된 APC의 수는 4.5×108 또는 그 근처 개의 APC 내지 5.5×108 또는 그 근처 개의 APC의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 2.5×108 또는 그 근처 개의 APC는 1차 제1 확장에 첨가되고 5×108 또는 그 근처 개의 APC는 급속 제2 확장에 첨가되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 항원 제시 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 종양 단편이 복수의 별도의 용기에 분배되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공하고, 각각의 별도의 용기에서 TIL의 제1 집단은 단계 (a)에서 수득되고, TIL의 제2 집단은 단계 (b)에서 수득되고, TIL의 제3 집단은 단계 (c)에서 수득되고, 단계 (c)에서 복수의 용기로부터의 TIL의 치료 집단은 조합되어 단계 (d)로부터 수확된 TIL 집단을 수득한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 종양은 복수의 별도의 용기에 고르게 분배되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 복수의 별도의 용기가 적어도 2개의 별도의 용기를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 복수의 별도의 용기가 2 내지 20개의 별도의 용기를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 복수의 별도의 용기가 2 내지 15개의 별도의 용기를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 복수의 별도의 용기가 2 내지 10개의 별도의 용기를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 복수의 별도의 용기가 from 2 내지 5개의 별도의 용기를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 복수의 별도의 용기가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 별도의 용기를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 프라이밍 제1 확장은 단계 (b)의 TIL의 제1 집단 상에서 수행되고, 단계 (c)의 급속 제2 확장은 그와 같은 TIL의 제1 집단으로부터 생성된 TIL의 제2 집단 상에서에서 동일한 용기에서 수행된 각각의 용기에 대해 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각의 별도의 용기는 제1 기체 투과성 표면적을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 종양 단편이 단일 용기에 분포되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단일 용기가 제1 기체 투과성 표면적을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 APC는 1 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 3 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 APC가 1.5 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 2.5 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 APC가 2 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 APC가 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)에서 APC가 3 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 10 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)에서 APC가 4 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 8 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)에서 APC가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)에서 APC가 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서, 프라이밍 제1 확장은 제1 기체 투과성 표면적을 포함하는 제1 용기에서 수행되고 단계 (c)에서, 급속 제2 확장은 제2 기체 투과성 표면적을 포함하는 제2 용기에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 제2 용기가 제1 용기보다 더 크도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 APC는 1 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 3 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 APC가 1.5 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 2.5 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 APC가 2 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 APC가 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화 되도록 변형된 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)에서 APC가 3 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 10 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제2 기체 투과성 표면적 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)에서 APC가 4 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 8 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제2 기체 투과성 표면적 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)에서 APC가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제2 기체 투과성 표면적 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)에서 APC는 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제2 기체 투과성 표면적 상에 층상화 되도록 변형된 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서, 프라이밍 제1 확장은 제1 기체 투과성 표면적을 포함하는 제1 용기에서 수행되고 단계 (c)에서, 급속 제2 확장은 제1 용기에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 APC는 1 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 3 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 APC가 1.5 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 2.5 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 APC가 2 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 APC는 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)에서 APC가 3 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 10 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)에서 APC가 4 또는 그 근처 개의 세포 층 내지 8 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)에서 APC가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)에서 APC가 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8 또는 그 근처 개의 세포 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면적 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:10 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:9 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:8 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:7 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:6 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:5 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:4 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:3 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.1 또는 그 근처 내지 1:2 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.2 또는 그 근처 내지 1:8 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.3 또는 그 근처 내지 1:7 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.4 또는 그 근처 내지 1:6 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.5 또는 그 근처 내지 1:5 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.6 또는 그 근처 내지 1:4 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.7 또는 그 근처 내지 1:3.5 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.8 또는 그 근처 내지 1:3 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.9 또는 그 근처 내지 1:2.5 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:2 또는 그 근처의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 1차 제1 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지를 추가의 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 수행되고, 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 더 크고, 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비는 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3.6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4, 1:4.1, 1:4.2, 1:4.3, 1:4.4, 1:4.5, 1:4.6, 1:4.7, 1:4.8, 1:4.9, 1:5, 1:5.1, 1:5.2, 1:5.3, 1:5.4, 1:5.5, 1:5.6, 1:5.7, 1:5.8, 1:5.9, 1:6, 1:6.1, 1:6.2, 1:6.3, 1:6.4, 1:6.5, 1:6.6, 1:6.7, 1:6.8, 1:6.9, 1:7, 1:7.1, 1:7.2, 1:7.3, 1:7.4, 1:7.5, 1:7.6, 1:7.7, 1:7.8, 1:7.9, 1:8, 1:8.1, 1:8.2, 1:8.3, 1:8.4, 1:8.5, 1:8.6, 1:8.7, 1:8.8, 1:8.9, 1:9, 1:9.1, 1:9.2, 1:9.3, 1:9.4, 1:9.5, 1:9.6, 1:9.7, 1:9.8, 1:9.9 또는 1:10 또는 그 근처로부터 선택 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 제2 집단 중의 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단 중의 TIL의 수의 비는 약 1.5:1 또는 그 근처 내지 100:1 또는 그 근처이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 제2 집단 중의 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단 중의 TIL의 수의 비는 50:1 또는 그 근처이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 제2 집단 중의 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단 중의 TIL의 수의 비는 25:1 또는 그 근처이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 제2 집단 중의 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단 중의 TIL의 수의 비는 20:1 또는 그 근처이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 제2 집단 중의 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단 중의 TIL의 수의 비는 10:1 또는 그 근처이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 제2 집단은 TIL의 제1 집단의 수보다 적어도 50-배 또는 그 근처로 더 크도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 제2 집단은 TIL의 제1 집단의 수보다 적어도 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20-, 21-, 22-, 23-, 24-, 25-, 26-, 27-, 28-, 29-, 30-, 31-, 32-, 33-, 34-, 35-, 36-, 37-, 38-, 39-, 40-, 41-, 42-, 43-, 44-, 45-, 46-, 47-, 48-, 49- 또는 50-배 또는 그 근처로 더 크도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)의 제2 기간의 개시 후 약 2일 또는 그 근처 또는 약 3일 또는 그 근처에서, 세포 배양 배지는 추가의 IL-2로 보충되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 동결보존 과정을 사용하여 단계 (d)에서 수확된 TIL 집단을 동결보존하는 단계를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (d) 후에 단계 (d)로부터의 수확된 TIL 집단을 하이포써모솔을 선택적으로 함유하는 주입 백으로 이동시키는 추가의 단계를 수행하는 것을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 동결보존 과정을 사용하여 단계 (e)의 수확된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존하는 단계를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 동결보존 과정은 수확된 TIL 집단 대 동결보존 배지의 1:1 비를 사용하여 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 항원 제시 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 PBMC가 조사되고 동종이계이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 세포 배양에 첨가된 APC의 총수가 2.5 × 108 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)에서 세포 배양에 첨가된 APC의 총수가 5 × 108 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 APC는 PBMC이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 PBMC가 조사되고 동종이계이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 항원 제시 세포가 인공 항원 제시 세포 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (d)에서의 수확이 막 기반 세포 가공 시스템을 사용하여 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (d)에서의 수확이 LOVO 세포 가공 시스템을 사용하여 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 단편이 단계 (b)에서 용기 당 5 또는 그 근처 내지 60 또는 그 근처 개의 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 단편은 단계 (b)에서 용기 당 10 또는 그 근처 내지 60 또는 그 근처 개의 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 단편이 단계 (b)에서 용기 당 15 또는 그 근처 내지 60 또는 그 근처 개의 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 단편이 단계 (b)에서 용기 당 20 또는 그 근처 내지 60 또는 그 근처 개의 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 단편이 단계 (b)에서 용기 당 25 또는 그 근처 내지 60 또는 그 근처 개의 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 단편이 단계 (b)에서 용기 당 30 또는 그 근처 내지 60 또는 그 근처 개의 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 단편이 단계 (b)에서 용기 당 35 또는 그 근처 내지 60 또는 그 근처 개의 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 단편이 단계 (b)에서 용기 당 40 또는 그 근처 내지 60 또는 그 근처 개의 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 단편이 단계 (b)에서 용기 당 45 또는 그 근처 내지 60 또는 그 근처 개의 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 단편이 단계 (b)에서 용기 당 50 또는 그 근처 내지 60 또는 그 근처 개의 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 단편이 단계 (b)에서 용기 당 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60개의 단편(들)을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각의 단편이 27 mm3의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각의 단편이 20 mm3 또는 그 근처 내지 50 mm3 또는 그 근처의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각의 단편이 21 mm3 또는 그 근처 내지 30 mm3 또는 그 근처의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각의 단편이 22 mm3 또는 그 근처 내지 29.5 mm3 또는 그 근처의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각의 단편이 23 mm3 또는 그 근처 내지 29 mm3 또는 그 근처의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각의 단편이 24 mm3 또는 그 근처 내지 28.5 mm3 또는 그 근처의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각의 단편이 25 mm3 또는 그 근처 내지 28 mm3 또는 그 근처의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각의 단편이 26.5 mm3 또는 그 근처 내지 27.5 mm3 또는 그 근처의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 mm3 또는 그 근처의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 1300 mm3 또는 그 근처 내지 1500 mm3 또는 그 근처의 총 부피를 갖는 30 또는 그 근처 내지 60 또는 그 근처 개의 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 단편이 1350 mm3 또는 그 근처의 총 부피를 갖는 50 또는 그 근처 개의 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다수의 단편이 1 그램 또는 그 근처 내지 1.5 그램 또는 그 근처의 총 질량 갖는 약 50 또는 그 근처 개의 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 배지가 G-용기 또는 Xuri 셀백인 용기에 제공되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 배지에서 IL-2 농도가 약 10,000 IU/mL 내지 약 5,000 IU/mL이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 배지에서 IL-2 농도가 약 6,000 IU/mL이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 동결보존 배지가 디메틸설폭사이드 (DMSO)을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 동결보존 배지가 7% 내지 10%의 DMSO 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)의 제1 기간이 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 또는 그 근처의 기간 내에 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)의 제2 기간이 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 11일 또는 그 근처의 기간 내에 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 제1 기간 단계 (b)에서 및 단계 (c)의 제2 기간 각각이 개별적으로 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 또는 그 근처의 기간 내에 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 제1 기간 단계 (b)에서 및 단계 (c)의 제2 기간 각각이 개별적으로 5일, 6일, 또는 7일 또는 그 근처의 기간 내에 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 제1 기간 단계 (b)에서 및 단계 (c)의 제2 기간 각각이 개별적으로 7일 또는 그 근처의 기간 내에 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가에서 수행된다 총 14일 또는 그 근처 내지 18일 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 15일 또는 그 근처 내지 18일 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 16일 또는 그 근처 내지 18일 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 17일 또는 그 근처 내지 18일 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 14일 또는 그 근처 내지 17일 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 15일 또는 그 근처 내지 17일 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 16일 또는 그 근처 내지 17일 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 14일 또는 그 근처 내지 16일 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 15일 또는 그 근처 내지 16일 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 14일 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 15일 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 16일 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 17일 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 18일 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 14일 이하 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 15일 이하 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 16일 이하 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계들 (a) 내지 (d)가 총 18일 이하 또는 그 근처에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (d)에서 수확된 TIL의 치료 집단이 TIL의 치료적 유효 투여량을 위한 충분한 TIL을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효 투여량에 충분한 TIL의 수가 2.3×1010 또는 그 근처 내지 13.7×1010 또는 그 근처이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)의 TIL의 제3 집단이 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산, 및/또는 증가된 다클론성을 제공하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 하 단계 (c)의 TIL의 제3 집단이 16일보다 더 긴 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 내지 5-배 또는 그 초과의 인터페론-감마 생산을 제공하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)의 TIL의 제3 집단이 17일보다 더 긴 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 내지 5-배 또는 그 초과의 인터페론-감마 생산을 제공하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)의 TIL의 제3 집단이 18일보다 더 긴 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 내지 5-배 또는 그 초과의 인터페론-감마 생산을 제공하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 내 TIL 단계 (c)의 제3 집단로부터 수득된 효과기 T 세포 및/또는 중앙 기억 T 세포가 세포 단계 (b)의 제2 집단로부터 수득된 효과기 T 세포 및/또는 중앙 기억 T 세포에 비해 증가된 CD8 및 CD28 발현을 나타도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다 방법에 언급된 각 용기가 폐쇄된 용기.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 방법에 언급된 각 용기가 G-용기 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 방법에 언급된 각 용기가 GREX-10 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 방법에 언급된 각 용기가 GREX-100 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 방법에 언급된 각 용기가 GREX-500 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법에 의해 만들어진 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 환자의 종양 조직으로부터 제조된 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단을 제공하고, TIL의 치료 집단은 TIL의 제1 확장이 임의의 첨가된 항원 제시 세포 (APC) 또는 OKT3 없이 수행되는 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산, 및/또는 증가된 다클론성을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 환자의 종양 조직으로부터 제조된 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단을 제공하고, TIL의 치료 집단은 TIL의 제1 확장이 임의의 첨가된 항원 제시 세포 (APC) 없이 수행된 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산, 및/또는 증가된 다클론성을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 환자의 종양 조직으로부터 제조된 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단을 제공하고, TIL의 치료 집단은 TIL의 제1 확장이 임의의 첨가된 OKT3 없이 수행된 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산, 및/또는 증가된 다클론성을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 환자의 종양 조직으로부터 제조된 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단을 제공하고, TIL의 치료 집단은 TIL의 제1 확장이 첨가된 항원 제시 세포 (APC) 없이 그리고 첨가된 OKT3 없이 수행된 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산, 및/또는 증가된 다클론성을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 환자의 종양 조직으로부터 제조된 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단을 제공하고, TIL의 치료 집단은 16일보다 더 긴 공정에 의해 제조된 TIL에 비해 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산, 및/또는 증가된 다클론성을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 환자의 종양 조직으로부터 제조된 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단을 제공하고, TIL의 치료 집단은 17일보다 더 긴 공정에 의해 제조된 TIL에 비해 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산, 및/또는 증가된 다클론성을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 환자의 종양 조직으로부터 제조된 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단을 제공하고, TIL의 치료 집단은 18일보다 더 긴 공정에 의해 제조된 TIL에 비해 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산, 및/또는 증가된 다클론성을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 증가된 인터페론-감마 생산을 제공하는 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 TIL의 치료 집단을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 증가된 다클론성을 제공하는 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 TIL의 치료 집단을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 증가된 효능을 제공하는 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 TIL의 치료 집단을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 치료 집단이 16일보다 더 긴 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 TIL의 치료 집단을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 치료 집단이 17일보다 더 긴 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 TIL의 치료 집단을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 치료 집단이 18일보다 더 긴 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 TIL의 치료 집단을 제공한다. 일부 실시형태에서, TIL은, 예를 들어 상기의 단계들 A 내지 F에 기재된 바와 같이 또는 상기의 단계들 A 내지 F에 따라 (또한, 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같이) 본원에 기재된 확장 공정으로 인한 적어도 1-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 치료 집단이 16일보다 더 긴 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 2-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 TIL의 치료 집단을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 치료 집단이 17일보다 더 긴 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 2-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 TIL의 치료 집단을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 치료 집단이 18일보다 더 긴 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 2-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 TIL의 치료 집단을 제공한다. 일부 실시형태에서, TIL은 예를 들어 상기의 단계들 A 내지 F에 기재된 바와 같이 또는 상기의 단계들 A 내지 F에 따라 (또한 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같이) 본원에 기재된 확장 공정으로 인한 적어도 2-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 치료 집단이 16일보다 더 긴 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 3-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 TIL의 치료 집단을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 치료 집단이 17일보다 더 긴 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 3-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 TIL의 치료 집단을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 치료 집단이 18일보다 더 긴 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 3-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 TIL의 치료 집단을 제공한다. 일부 실시형태에서, TIL은 예를 들어 상기의 단계들 A 내지 F에 기재된 바와 같이 또는 상기의 단계들 A 내지 F에 따라 (또한 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같이) 본원에 기재된 확장 공정으로 인한 적어도 3-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 제1 확장이 임의의 첨가된 항원 제시 세포 (APC) 없이 수행된 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능한 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단을 제공한다. 일부 실시형태에서, TIL은 예를 들어 상기의 단계들 A 내지 F에 기재된 바와 같이 또는 상기의 단계들 A 내지 F에 따라 (또한 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같이) 본원에 기재된 확장 공정으로 인한 적어도 1-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 제1 확장이 임의의 첨가된 OKT3 없이 수행된 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능한 종양 침윤 림프구 (TIL)의 치료 집단을 제공한다. 일부 실시형태에서, TIL은 예를 들어 상기의 단계들 A 내지 F에 기재된 바와 같이 또는 상기의 단계들 A 내지 F에 따라 (또한 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같이) 본원에 기재된 확장 공정으로 인한 적어도 1-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 제1 확장이 임의의 첨가된 APC 없이 수행되는 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 2-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능한 TIL의 치료 집단을 제공한다. 일부 실시형태에서, TIL은 예를 들어 상기의 단계들 A 내지 F에 기재된 바와 같이 또는 상기의 단계들 A 내지 F에 따라 (또한 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같이) 본원에 기재된 확장 공정으로 인한 적어도 2-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 제1 확장이 임의의 첨가된 OKT3 없이 수행된 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 2-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능한 TIL의 치료 집단을 제공한다. 일부 실시형태에서, TIL은 예를 들어 상기의 단계들 A 내지 F에 기재된 바와 같이 또는 상기의 단계들 A 내지 F에 따라 (또한 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같이) 본원에 기재된 확장 공정으로 인한 적어도 2-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 제1 확장이 임의의 첨가된 APC 없이 수행되는 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 3-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능한 TIL의 치료 집단을 제공한다. 일부 실시형태에서, TIL은 예를 들어 상기의 단계들 A 내지 F에 기재된 바와 같이 또는 상기의 단계들 A 내지 F에 따라 (또한 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같이) 본원에 기재된 확장 공정으로 인한 적어도 1-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 제1 확장이 임의의 첨가된 OKT3 없이 수행된 공정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 3-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능한 TIL의 치료 집단을 제공한다. 일부 실시형태에서, TIL은 예를 들어 상기의 단계들 A 내지 F에 기재된 바와 같이 또는 상기의 단계들 A 내지 F에 따라 (또한 예를 들어, 도 8 (특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같이) 본원에 기재된 확장 공정으로 인한 적어도 3-배 초과의 인터페론-감마 생산이 가능하다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 T 세포를 확장하는 방법을 제공한다: (a) T 세포의 제1 집단을 배양함으로써 공여제로부터 수득된 T 세포의 제1 집단의 프라이밍 제1 확장을 수행하여 성장시키고 T 세포의 제1 집단의 활성화를 프라이밍하는 단계; (b) 단계 (a)에서 프라이밍된 T 세포의 제1 집단의 활성화가 붕괴되기 시작한 후, T 세포의 제1 집단을 배양함으로써 T 세포의 제1 집단의 급속 제2 확장을 수행하여 성장시키고 T 세포의 제1 집단의 활성화를 촉진하여 T 세포의 제2 집단을 수득하는 단계; 및 (c) T 세포의 제2 집단을 수확하는 단계. 또 다른 실시형태에서, 급속 제2 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (a) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 T 세포의 제1 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기로부터 더 큰 제2 용기로 이동시키고, 약 4 내지 7일의 기간 동안 제2 용기에서 대규모 배양물에서 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단을 배양하는 단계. 또 다른 실시형태에서, 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (a) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 제1 소규모 배양물에서 T 세포의 제1 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 제1 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단을 제1 용기의 크기와 동일한 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 그와 같은 제2 용기로 이동된 제1 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단의 부분은 약 4 내지 7일의 기간 동안 제2 소규모 배양에서 배양되는, 단계. 또 다른 실시형태에서, 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (a) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 T 세포의 제1 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기보다 크기가 더 큰 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 그와 같은 제2 용기로 이동된 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단은 약 4 내지 7일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계. 또 다른 실시형태에서, 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (a) 약 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 T 세포의 제1 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기보다 크기가 더 큰 2, 3 또는 4개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 그와 같은 제2 용기로 이동된 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단은 약 5 일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다 급속 제2 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (a) 약 2 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 T 세포의 제1 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기로부터 더 큰 제2 용기로 이동시키고, 약 5 내지 7일의 기간 동안 제2 용기에서 대규모 배양물에서 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단을 배양하는 단계.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다 급속 확장의 단계는 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할된다: (a) 약 2 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 제1 소규모 배양물에서 T 세포의 제1 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 제1 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단을 제1 용기의 크기와 동일한 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 그와 같은 제2 용기로 이동된 제1 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단의 부분은 약 5 내지 7일의 기간 동안 제2 소규모 배양에서 배양되는, 단계.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 확장의 단계가 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다: (a) 약 2 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 T 세포의 제1 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기보다 크기가 더 큰 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 그와 같은 제2 용기로 이동된 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단은 약 5 내지 7일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 확장의 단계가 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다: (a) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 T 세포의 제1 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기보다 크기가 더 큰 2, 3 또는 4개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 그와 같은 제2 용기로 이동된 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단은 약 5 내지 6 일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 확장의 단계가 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다: (a) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 T 세포의 제1 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기보다 크기가 더 큰 2, 3 또는 4개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 그와 같은 제2 용기로 이동된 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단은 약 5 일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 확장의 단계가 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다: (a) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 T 세포의 제1 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기보다 크기가 더 큰 2, 3 또는 4개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 그와 같은 제2 용기로 이동된 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단은 약 6일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 급속 확장의 단계가 하기에 의해 배양물의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성하기 위해 복수의 단계들로 분할되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다: (a) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어, G-REX 100MCS 용기에서 소규모 배양물에서 T 세포의 제1 집단을 배양함으로써 급속 제2 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어, G-REX 500MCS 용기보다 크기가 더 큰 2, 3 또는 4개의 제2 용기 내로 그리고 그 사이로 이동시키고 할당하는 단계로서, 각각의 제2 용기에서, 그와 같은 제2 용기로 이동된 소규모 배양물로부터의 T 세포의 제1 집단은 약 7일의 기간 동안 대규모 배양물에서 배양되는, 단계.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)의 프라이밍 제1 확장이 최대 7일의 기간 동안 수행되 도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)의 급속 제2 확장이 최대 8일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)의 급속 제2 확장이 최대 9일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)의 급속 제2 확장이 최대 10일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)의 급속 제2 확장이 최대 11일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)의 프라이밍 제1 확장이 7일의 기간 동안 수행되고 단계 (b)의 급속 제2 확장은 최대 9일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)의 프라이밍 제1 확장이 7일의 기간 동안 수행되고 단계 (b)의 급속 제2 확장은 최대 10일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)의 프라이밍 제1 확장이 7일 또는 8일의 기간 동안 수행되고 단계 (b)의 급속 제2 확장은 최대 9일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)의 프라이밍 제1 확장이 7일 또는 8일의 기간 동안 수행되고 단계 (b)의 급속 제2 확장은 최대 10일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)의 프라이밍 제1 확장이 8일의 기간 동안 수행되고 단계 (b)의 급속 제2 확장은 최대 9일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)의 프라이밍 제1 확장이 8일의 기간 동안 수행되고 단계 (b)의 급속 제2 확장은 최대 8일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 T 세포의 제1 집단이 OKT-3 및 IL-2를 포함하는 제1 배양 배지에서 배양되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 제1 배양 배지가 4-1BB 효능제, OKT-3 및 IL-2를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 제1 배양 배지가 OKT-3, IL-2 및 항원 제시 세포 (APC)를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 제1 배양 배지가 4-1BB 효능제, OKT-3, IL-2 및 항원 제시 세포 (APC)를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서, T 세포의 제1 집단이 OKT-3, IL-2 및 항원 제시 세포 (APC)을 포함하는 제2 배양 배지에서 배양되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 제2 배양 배지가 4-1BB 효능제, OKT-3, IL-2 및 항원 제시 세포 (APC)를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 T 세포의 제1 집단은 제1 기체 투과성 표면을 포함하는 용기의 제1 배양 배지에서 배양되고, 제1 배양 배지는 OKT-3, IL-2 및 항원 제시 세포 (APC)의 제1 집단을 포함하고, APC의 제1 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여체에 대해 외인성이고 APC의 제1 집단은 제1 기체 투과성 표면 상에 층상화되고, 단계 (b)에서, T 세포의 제1 집단은 용기의 제2 배양 배지에서 배양되고, 제2 배양 배지는 OKT-3, IL-2 및 APC의 제2 집단을 포함하고, APC의 제2 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여체에 대해 외인성이고 APC의 제2 집단은 제1 기체 투과성 표면 상에 층상화되고, APC의 제2 집단은 APC의 제1 집단보다 더 크도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 T 세포의 제1 집단은 제1 기체 투과성 표면을 포함하는 용기의 제1 배양 배지에서 배양되고, 제1 배양 배지는 4-1BB 효능제, OKT-3, IL-2 및 항원 제시 세포 (APC)의 제1 집단을 포함하고, APC의 제1 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여체에 대해 외인성이고 APC의 제1 집단은 제1 기체 투과성 표면 상에 층상화되고, 단계 (b)에서, T 세포의 제1 집단은 용기의 제2 배양 배지에서 배양되고, 제2 배양 배지는 OKT-3, IL-2 및 APC의 제2 집단을 포함하고, APC의 제2 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여체에 대해 외인성이고 APC의 제2 집단은 제1 기체 투과성 표면 상에 층상화되고, APC의 제2 집단은 APC의 제1 집단보다 더 크도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 T 세포의 제1 집단은 제1 기체 투과성 표면을 포함하는 용기의 제1 배양 배지에서 배양되고, 제1 배양 배지는 OKT-3, IL-2 및 항원 제시 세포 (APC)의 제1 집단을 포함하고, APC의 제1 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여체에 대해 외인성이고 APC의 제1 집단은 제1 기체 투과성 표면 상에 층상화되고, 단계 (b)에서, T 세포의 제1 집단은 용기의 제2 배양 배지에서 배양되고, 제2 배양 배지는 4-1BB 효능제, OKT-3, IL-2 및 APC의 제2 집단을 포함하고, APC의 제2 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여체에 대해 외인성이고 APC의 제2 집단은 제1 기체 투과성 표면 상에 층상화되고, APC의 제2 집단은 APC의 제1 집단보다 더 크도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 T 세포의 제1 집단은 제1 기체 투과성 표면을 포함하는 용기의 제1 배양 배지에서 배양되고, 제1 배양 배지는 4-1BB 효능제, OKT-3, IL-2 및 항원 제시 세포 (APC)의 제1 집단을 포함하고, APC의 제1 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여체에 대해 외인성이고 APC의 제1 집단은 제1 기체 투과성 표면 상에 층상화되고, 단계 (b)에서, T 세포의 제1 집단은 용기의 제2 배양 배지에서 배양되고, 제2 배양 배지는 4-1BB 효능제, OKT-3, IL-2 및 APC의 제2 집단을 포함하고, APC의 제2 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여체에 대해 외인성이고 APC의 제2 집단은 제1 기체 투과성 표면 상에 층상화되고, APC의 제2 집단은 APC의 제1 집단보다 더 크도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 APC의 제2 집단의 APC의 수 대 APC의 제1 집단의 APC의 수의 비가 약 2:1 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 APC의 제1 집단의 APC의 수가 약 2.5 x 108 및 APC의 제2 집단의 APC의 수는 약 5 x 108 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 APC2개의 층의 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면 상에 층상화 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서, APC의 제2 집단이 APC의 4 내지 8개의 층의 범위로부터 선택된 평균 두께로 제1 기체 투과성 표면 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)의 제1 기체 투과성 표면 상에 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (a)의 제1 기체 투과성 표면 상에 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비가 2:1 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 1.0×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 4.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단은 1.5×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 3.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단은 2.0×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 3.0×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 2.0×106 APC/cm2 또는 그 근처의 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서, APC의 제2 집단이 2.5×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 7.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서, APC의 제2 집단이 3.5×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 6.0×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서, APC의 제2 집단이 4.0×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 5.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (b)에서, APC의 제2 집단이 4.0×106 APC/cm2 또는 그 근처의 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 1.0×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 4.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩되고 단계 (b)에서, APC의 제2 집단은 2.5×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 7.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 1.5×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 3.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩되고 단계 (b)에서, APC의 제2 집단은 3.5×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 6.0×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩 되도록 변형된 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 2.0×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 3.0×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩되고 단계 (b)에서, APC의 제2 집단은 4.0×106 APC/cm2 또는 그 근처 내지 5.5×106 APC/cm2 또는 그 근처의 범위로부터 선택된 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 2.0×106 APC/cm2의 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩되고 단계 (b)에서, APC의 제2 집단은 4.0×106 APC/cm2 또는 그 근처의 밀도로 제1 기체 투과성 표면 상에 씨딩된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 APC가 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 PBMC가 조사되고 T 세포의 제1 집단의 공여체에 대해 외인성 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 T 세포가 종양 침윤 림프구 (TIL) 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 T 세포가 골수 침윤 림프구 (MIL) 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 T 세포가 말초 혈액 림프구 (PBL) 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여체의 전혈로부터 분리에 의해 수득 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여체의 성분채집 생성물로부터 분리에 의해 수득 되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 T 세포의 제1 집단이 T 세포 표현형의 양성 또는 음성 선택에 의해 공여체의 전혈 또는 성분채집 생성물로부터 분리되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 T 세포 표현형이 CD3+ 및 CD45+ 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 T 세포의 제1 집단의 프라이밍 제1 확장을 수행하기 전에 T 세포가 NK 세포로부터 분리되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, T 세포는 T 세포의 제1 집단으로부터 CD3- CD56+ 세포의 제거에 의해 T 세포의 제1 집단에서 NK 세포로부터 분리된다. 또 다른 실시형태에서, CD3- CD56+ 세포는 CD3- CD56+ 세포 분획을 제거하고 음성 분획을 회수하는 게이팅 전략을 사용하여 T 세포의 제1 집단을 세포 분류에 적용함으로써 T 세포의 제1 집단으로부터 제거된다. 또 다른 실시형태에서, 전술한 방법은 높은 백분율의 NK 세포를 특징으로 하는 T 세포의 제1 집단에서 T 세포의 확장을 위해 이용된다. 또 다른 실시형태에서, 전술한 방법은 높은 백분율의 CD3- CD56+ 세포를 특징으로 하는 T 세포의 제1 집단에서 T 세포의 확장을 위해 이용된다. 또 다른 실시형태에서, 전술한 방법은 높은 수의 NK 세포를 특징으로 하는 종양 조직에서 T 세포의 확장을 위해 이용된다. 또 다른 실시형태에서, 전술한 방법은 높은 수의 CD3- CD56+ 세포를 특징으로 하는 종양 조직에서 T 세포의 확장을 위해 이용된다. 또 다른 실시형태에서, 전술한 방법은 높은 수의 NK 세포의 존재를 특징으로 하는 종양으로 고통받는 환자로부터 수득된 종양 조직에서 T 세포의 확장을 위해 이용된다. 또 다른 실시형태에서, 전술한 방법은 높은 수의 CD3- CD56+ 세포의 존재를 특징으로 하는 종양으로 고통받는 환자로부터 수득된 종양 조직에서 T 세포의 확장을 위해 이용된다. 또 다른 실시형태에서, 전술한 방법은 난소암으로 고통받는 환자로부터 수득된 종양 조직에서 T 세포의 확장을 위해 이용된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 T 세포의 제1 집단으로부터 1x107 또는 그 근처 개의 T 세포가 그와 같은 용기에서 1차 제1 확장 배양을 개시하기 위해 용기에서 씨딩되도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 T 세포의 제1 집단은 복수의 용기에 분배되고, 각각의 용기에서 T 세포의 제1 집단으로부터 1x107 또는 그 근처 개의 T 세포가 씨딩되어 이러한 용기에서 1차 제1 확장 배양을 개시하도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 단계 (c)에서 수확된 T 세포의 제2 집단이 TIL의 치료 집단 이도록 변형된 상기 적용가능한 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 방법을 제공한다.
V. 약제학적 조성물, 투여량, 및 투약 레지멘
일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 확장된 TIL은 약제학적 조성물로서 환자에게 투여된다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 멸균 완충액 중의 TIL의 현탁액이다. 본 개시내용의 PBMC를 사용하여 확장된 TIL은 당해 분야에서 알려진 바와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, T-세포는 단일 동맥내 또는 정맥내 주입으로서 투여되고, 바람직하게는 대략 30 내지 60분 지속된다. 다른 적합한 투여 경로는 복강내, 척추강내, 및 림프내 투여를 포함한다.
TIL의 임의의 적합한 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 특히 암이 흑색종인 경우, 약 2.3×1010 내지 약 13.7×1010 TIL은 평균 약 7.8×1010 TIL로 투여된다. 일 실시형태에서, 약 1.2×1010 내지 약 4.3×1010의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 3×1010 내지 약 12×1010의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 4×1010 내지 약 10×1010의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 5×1010 내지 약 8×1010의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 6×1010 내지 약 8×1010의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 7×1010 내지 약 8×1010의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 2.3×1010 내지 약 13.7×1010이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 7.8×1010의 TIL이고, 특히 상기 암은 흑색종이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 1.2×1010 내지 약 4.3×1010의 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 3×1010 내지 약 12×1010의TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 4×1010 내지 약 10×1010 의TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 5×1010 내지 약 8×1010 의TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 6×1010 내지 약 8×1010 의TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 7×1010 내지 약 8×1010 의TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 수는 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 및 9×1013. 일 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 수는 1×106 내지 5×106, 5×106 내지 1×107, 1×107 내지 5×107, 5×107 내지 1×108, 1×108 내지 5×108, 5×108 내지 1×109, 1×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 5×1012, 및 5×1012 내지 1×1013의 범위이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 예를 들어, 약제학적 조성물의 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v 또는 v/v 미만이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 약제학적 조성물의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v, 또는 v/v 초과이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 약제학적 조성물의 약 0.0001% 내지 약 50%, 약 0.001% 내지 약 40%, 약 0.01% 내지 약 30%, 약 0.02% 내지 약 29%, 약 0.03% 내지 약 28%, 약 0.04% 내지 약 27%, 약 0.05% 내지 약 26%, 약 0.06% 내지 약 25%, 약 0.07% 내지 약 24%, 약 0.08% 내지 약 23%, 약 0.09% 내지 약 22%, 약 0.1% 내지 약 21%, 약 0.2% 내지 약 20%, 약 0.3% 내지 약 19%, 약 0.4% 내지 약 18%, 약 0.5% 내지 약 17%, 약 0.6% 내지 약 16%, 약 0.7% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 14%, 약 0.9% 내지 약 12% 또는 약 1% 내지 약 10% w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 약제학적 조성물의 약 0.001% 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 5%, 약 0.02% 내지 약 4.5%, 약 0.03% 내지 약 4%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.05% 내지 약 3%, 약 0.06% 내지 약 2.5%, 약 0.07% 내지 약 2%, 약 0.08% 내지 약 1.5%, 약 0.09% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 0.9% w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 양은 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g, 또는 0.0001 g 이하이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 양은 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g, 또는 10 g 초과이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL은 넓은 투여 범위에 걸쳐 효과적이다. 정확한 투여량은 투여 경로, 화합물이 투여되는 형태, 치료될 대상체의 성별 및 연령, 치료될 대상체의 체중, 및 주치의의 선호도 및 경험에 좌우될 것이다. TIL의 임상적으로 확립된 투여량은 또한 적절한 경우 사용될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 투여되는 약제학적 조성물의 양, 예컨대 TIL의 투여량은 치료되는 인간 또는 포유동물, 장애 또는 병태의 중증도, 투여 속도, 활성 제약 성분의 배치 및 처방 의사의 판단에 좌우될 것이다.
일부 실시형태에서, TIL은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 그와 같은 투여는 주사, 예를 들어, 정맥내 주사에 의한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL은 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투약은 연간 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 또는 6회 초과일 수 있다. 투약은 1개월에 1회, 2주에 1회, 1주에 1회, 또는 격일로 1회일 수 있다. TIL의 투여는 필요한 만큼 계속될 수 있다.
일부 실시형태에서, TIL의 효과적인 투여량은 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 및 9×1013이다. 일부 실시형태에서, TIL의 효과적인 투여량은 1×106 내지 5×106, 5×106 내지 1×107, 1×107 내지 5×107, 5×107 내지 1×108, 1×108 내지 5×108, 5×108 내지 1×109, 1×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 5×1012, 및 5×1012 내지 1×1013의 범위이다.
일부 실시형태에서, TIL의 효과적인 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 4.3 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 3.2 mg/kg, 약 0.35 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.3 mg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 1.3 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 1.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 0.55 mg/kg 내지 약 0.85 mg/kg, 약 0.65 mg/kg 내지 약 0.8 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 0.75 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.85 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 1.85 mg/kg, 약 1.15 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 1.3 mg/kg mg 내지 약 1.6 mg/kg, 약 1.35 mg/kg 내지 약 1.5 mg/kg, 약 2.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 2.3 mg/kg 내지 약 3.4 mg/kg, 약 2.4 mg/kg 내지 약 3.3 mg/kg, 약 2.6 mg/kg 내지 약 3.15 mg/kg, 약 2.7 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 2.8 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 또는 약 2.85 mg/kg 내지 약 2.95 mg/kg의 범위이다.
일부 실시형태에서, TIL의 효과적인 투여량은 약 1 mg 내지 약 500 mg, 약 10 mg 내지 약 300 mg, 약 20 mg 내지 약 250 mg, 약 25 mg 내지 약 200 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg, 약 5 mg 내지 약 45 mg, 약 10 mg 내지 약 40 mg, 약 15 mg 내지 약 35 mg, 약 20 mg 내지 약 30 mg, 약 23 mg 내지 약 28 mg, 약 50 mg 내지 약 150 mg, 약 60 mg 내지 약 140 mg, 약 70 mg 내지 약 130 mg, 약 80 mg 내지 약 120 mg, 약 90 mg 내지 약 110 mg, 또는 약 95 mg 내지 약 105 mg, 약 98 mg 내지 약 102 mg, 약 150 mg 내지 약 250 mg, 약 160 mg 내지 약 240 mg, 약 170 mg 내지 약 230 mg, 약 180 mg 내지 약 220 mg, 약 190 mg 내지 약 210 mg, 약 195 mg 내지 약 205 mg, 또는 약 198 내지 약 207 mg의 범위이다.
유효량의 TIL은 비강내 및 경피 경로, 동맥내 주사에 의해, 정맥내로, 복강내로, 비경구로, 근육내로, 피하로, 국소적으로, 이식에 의해, 또는 흡입에 의해를 포함하는, 유사한 유용성을 갖는 제제 허용된 투여 방식 중 임의의 것에 의해 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 TIL의 치료 집단을 포함하는 주입 백을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 TIL의 치료 집단 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 종양 침윤 림프구 (TIL) 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 TIL 조성물을 포함하는 주입 백을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 TIL의 치료 집단의 동결보존 제제를 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 TIL의 치료 집단 및 동결보존 배지를 포함하는 종양 침윤 림프구 (TIL) 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 동결보존 배지가 DMSO를 함유하도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 동결보존 배지가 7-10%의 DMSO를 함유하도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 TIL 조성물의 동결보존 제제를 제공한다.
VI. 약제학적 조성물, 투여량, 및 투약 레지멘
일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 확장된 TIL은 약제학적 조성물로서 환자에게 투여된다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 멸균 완충액 중의 TIL의 현탁액이다. 본 개시내용의 PBMC를 사용하여 확장된 TIL은 당해 분야에서 알려진 바와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, T-세포는 단일 동맥내 또는 정맥내 주입으로서 투여되며, 바람직하게는 대략 30 내지 60분 지속된다. 다른 적합한 투여 경로는 복강내, 척추강내, 및 림프내 투여를 포함한다.
TIL의 임의의 적합한 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 특히 상기 암이 NSCLC인 경우, 약 2.3×1010 내지 약 13.7×1010 TIL은 평균 약 7.8×1010 TIL로 투여된다. 일 실시형태에서, 약 1.2×1010 내지 약 4.3×1010의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 3×1010 내지 약 12×1010의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 4×1010 내지 약 10×1010의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 5×1010 내지 약 8×1010의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 6×1010 내지 약 8×1010의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 7×1010 내지 약 8×1010의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 2.3×1010 내지 약 13.7×1010이다. 일부 실시형태에서, 특히 암이 NSCLC인 경우 치료적 유효 투여량은 약 7.8×1010이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 1.2×1010 내지 약 4.3×1010의 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 3×1010 내지 약 12×1010의 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 4×1010 내지 약 10×1010의 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 5×1010 내지 약 8×1010의 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 6×1010 내지 약 8×1010의 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 7×1010 내지 약 8×1010의 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 수는 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 및 9×1013. 일 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 수는 1×106 내지 5×106, 5×106 내지 1×107, 1×107 내지 5×107, 5×107 내지 1×108, 1×108 내지 5×108, 5×108 내지 1×109, 1×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 5×1012, 및 5×1012 내지 1×1013의 범위이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 예를 들어, 약제학적 조성물의 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v 또는 v/v 미만이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 약제학적 조성물의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v, 또는 v/v 초과이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 약제학적 조성물의 약 0.0001% 내지 약 50%, 약 0.001% 내지 약 40%, 약 0.01% 내지 약 30%, 약 0.02% 내지 약 29%, 약 0.03% 내지 약 28%, 약 0.04% 내지 약 27%, 약 0.05% 내지 약 26%, 약 0.06% 내지 약 25%, 약 0.07% 내지 약 24%, 약 0.08% 내지 약 23%, 약 0.09% 내지 약 22%, 약 0.1% 내지 약 21%, 약 0.2% 내지 약 20%, 약 0.3% 내지 약 19%, 약 0.4% 내지 약 18%, 약 0.5% 내지 약 17%, 약 0.6% 내지 약 16%, 약 0.7% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 14%, 약 0.9% 내지 약 12% 또는 약 1% 내지 약 10% w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 약제학적 조성물의 약 0.001% 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 5%, 약 0.02% 내지 약 4.5%, 약 0.03% 내지 약 4%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.05% 내지 약 3%, 약 0.06% 내지 약 2.5%, 약 0.07% 내지 약 2%, 약 0.08% 내지 약 1.5%, 약 0.09% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 0.9% w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 양은 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g, 또는 0.0001 g 이하이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 양은 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g, 또는 10 g 초과이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL은 넓은 투여 범위에 걸쳐 효과적이다. 정확한 투여량은 투여 경로, 화합물이 투여되는 형태, 치료될 대상체의 성별 및 연령, 치료될 대상체의 체중, 및 주치의의 선호도 및 경험에 좌우될 것이다. TIL의 임상적으로 확립된 투여량은 또한 적절한 경우 사용될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 투여되는 약제학적 조성물의 양, 예컨대 TIL의 투여량은 치료되는 인간 또는 포유동물, 장애 또는 병태의 중증도, 투여 속도, 활성 제약 성분의 배치 및 처방 의사의 판단에 좌우될 것이다.
일부 실시형태에서, TIL은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 그와 같은 투여는 주사, 예를 들어, 정맥내 주사에 의한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL은 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투약은 연간 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 또는 6회 초과일 수 있다. 투약은 1개월에 1회, 2주에 1회, 1주에 1회, 또는 격일로 1회일 수 있다. TIL의 투여는 필요한 만큼 계속될 수 있다.
일부 실시형태에서, TIL의 효과적인 투여량은 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 및 9×1013이다. 일부 실시형태에서, TIL의 효과적인 투여량은 1×106 내지 5×106, 5×106 내지 1×107, 1×107 내지 5×107, 5×107 내지 1×108, 1×108 내지 5×108, 5×108 내지 1×109, 1×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 5×1012, 및 5×1012 내지 1×1013의 범위이다.
일부 실시형태에서, TIL의 효과적인 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 4.3 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 3.2 mg/kg, 약 0.35 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.3 mg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 1.3 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 1.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 0.55 mg/kg 내지 약 0.85 mg/kg, 약 0.65 mg/kg 내지 약 0.8 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 0.75 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.85 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 1.85 mg/kg, 약 1.15 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 1.3 mg/kg mg 내지 약 1.6 mg/kg, 약 1.35 mg/kg 내지 약 1.5 mg/kg, 약 2.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 2.3 mg/kg 내지 약 3.4 mg/kg, 약 2.4 mg/kg 내지 약 3.3 mg/kg, 약 2.6 mg/kg 내지 약 3.15 mg/kg, 약 2.7 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 2.8 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 또는 약 2.85 mg/kg 내지 약 2.95 mg/kg의 범위이다.
일부 실시형태에서, TIL의 효과적인 투여량은 약 1 mg 내지 약 500 mg, 약 10 mg 내지 약 300 mg, 약 20 mg 내지 약 250 mg, 약 25 mg 내지 약 200 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg, 약 5 mg 내지 약 45 mg, 약 10 mg 내지 약 40 mg, 약 15 mg 내지 약 35 mg, 약 20 mg 내지 약 30 mg, 약 23 mg 내지 약 28 mg, 약 50 mg 내지 약 150 mg, 약 60 mg 내지 약 140 mg, 약 70 mg 내지 약 130 mg, 약 80 mg 내지 약 120 mg, 약 90 mg 내지 약 110 mg, 또는 약 95 mg 내지 약 105 mg, 약 98 mg 내지 약 102 mg, 약 150 mg 내지 약 250 mg, 약 160 mg 내지 약 240 mg, 약 170 mg 내지 약 230 mg, 약 180 mg 내지 약 220 mg, 약 190 mg 내지 약 210 mg, 약 195 mg 내지 약 205 mg, 또는 약 198 내지 약 207 mg의 범위이다.
유효량의 TIL은 비강내 및 경피 경로, 동맥내 주사에 의해, 정맥내로, 복강내로, 비경구로, 근육내로, 피하로, 국소적으로, 이식에 의해, 또는 흡입에 의해를 포함하는, 유사한 유용성을 갖는 제제 허용된 투여 방식 중 임의의 것에 의해 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
VII. 환자를 치료하는 방법
치료 방법은 초기 TIL 수집 및 TIL의 배양으로 시작한다. 그와 같은 방법은 예를 들어, 문헌[Jin 등, J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨]에 의해 당해 기술에 기재되었다. 치료 방법의 실시형태는 실시예를 비롯한 하기 섹션 전반에 걸쳐 기재되어 있다.
예를 들어, 상기 단계 A 내지 F에 기재된 바와 같은 또는 상기 단계 B 내지 F(또한, 예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같은)에 따른 것을 포함하는, 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 확장된 TIL은 암을 갖는 환자의 치료에서 특정 용도를 발견한다(예를 들어, 문헌[Goff, 등, Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239, 뿐만 아니라 보충적 내용도 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨]). 일부 실시형태에서, TIL은 이전에 기재된 바와 같이 전이성 흑색종의 절제된 침착물로부터 성장되었다 (문헌[Dudley, 등, J Immunother., 2003, 26:332-342]을 참조하고; 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다). 새로운 종양은 멸균 조건 하에서 절개될 수 있다. 대표적인 샘플은 정식 병리적 분석을 위해 수집될 수 있다. 2 mm3 내지 3 mm3의 단일 단편이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자당5, 10, 15, 20, 25 또는 30개 샘플이 수득된다. 일부 실시형태에서, 환자당 20, 25, 또는 30개의 샘플이 수득된다. 일부 실시형태에서, 환자당 20, 22, 24, 26, 또는 28개의샘플이 수득된다. 일부 실시형태에서, 환자당 24개 샘플이 수득된다. 샘플은 24-웰 플레이트의 개별 웰에 배치되고, 높은 용량 IL-2(6,000 IU/mL)를 갖는 성장 배지에서 유지되고, 종양의 파괴 및/또는 TIL의 증식에 대해 모니터링될 수 있다. 가공 후 남아있는 생존가능한 세포를 갖는 임의의 종양은 본원에 기재된 바와 같이 단일 세포 현탁액으로 효소적으로 분해되고 동결보존될 수 있다.
일부 실시형태에서, 성공적으로 성장된 TIL은 표현형 분석 (CD3, CD4, CD8, 및 CD56)을 위해 샘플링될 수 있고 사용가능한 경우 자가 종양에 대해 시험될 수 있다. 오버나잇 공배양이 인터페론-감마(IFN-γ) 수준 > 200 pg/mL 및 2회 배경을 생성하였다면 TIL은 반응성인 것으로 간주될 수 있다. 문헌[(Goff, 등, J Immunother., 2010, 33:840-847; 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨)]. 일부 실시형태에서, 자가 반응성 또는 충분한 성장 패턴의 증거를 갖는 배양물은 때때로 급속 확장(REP)으로 지칭되는 제2 확장을 포함하는 제2 확장 (예를 들어, 도 1의 단계 D에 따라 제공된 바와 같은 제2 확장)을 위해 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 높은 자가 반응성 (예를 들어, 제2 확장 동안의 높은 증식)을 갖는 확장된 TIL 은, 추가의 제2 확장을 위해 선택된다. 일부 실시형태에서, 높은 자가 반응성 (예를 들어, 도 1의 단계 D에 제공된 바와 같은 제2 확장 동안의 높은 증식)을 갖는 증식된 TIL은, 도 1의 단계 D에 따른 추가의 제2 확장을 위해 선택된다.
주입 백 TIL의 동결보존된 샘플의 세포 표현형은 표면 마커 CD3, CD4, CD8, CCR7, 및 CD45RA (BD BioSciences)에 대한 유세포측정 (예를 들어, FlowJo), 뿐만 아니라 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 분석될 수 있다. 혈청 사이토카인은 표준 효소-결합 면역흡착 검정 기술을 사용하여 측정되었다. 혈청 IFN-g의 상승은 100 pg/mL 초과 및 4 3 초과의 기준선 수준으로 정의되었다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법, 예를 들어, 도 1에 예시된 방법에 의해 생성된 TIL은 TIL의 임상 효능에서의 놀라운 개선을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법, 예를 들어, 도 1에 예시된 방법에 의해 생성된 TIL은, 예를 들면 도 1에서 예시된 방법 이외의 방법을 비롯한 본원에 기재된 방법 이외의 방법에 의해 생성된 TIL에 비해 증가된 임상 효능을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 것 이외의 방법은 공정 1C 및/또는 생성 1 (Gen 1)로 지칭된 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 증가된 효능은 DCR, ORR, 및/또는 다른 임상 반응에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법, 예를 들어, 도 1에 예시된 방법에 의해 생성된 TIL은 예를 들어, 도 1에 예시된 것 이외의 방법, 예를 들어, Gen 1 공정을 포함하는, 본원에 기재된 방법 이외의 방법에 의해 제조된 TIL과 비교하여 반응 및 안전성 프로파일과 유사한 시간을 나타낸다.
일부 실시형태에서, IFN-감마 (IFN-γ)은 치료 효능 및/또는 증가된 임상 효능을 나타낸다. 일부 실시형태에서, TIL로 치료된 대상체의 혈액에서 IFN-γ는 활성 TIL을 나타낸다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 생성을 위한 효능 검정이 사용된다. IFN-γ 생성은 세포독성 잠재력의 또 다른 척도이다. IFN-γ 생성은, 예를 들어, 도 1에 기재된 바와 같은 것을 포함하는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료된 대상체의 생체외에서 혈액, 혈청 또는 TIL에서 사이토카인 IFN-γ의 수준을 결정함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, IFN-γ의 증가는 본 발명의 방법에 의해 생성된 TIL로 치료된 환자에서 치료 효능을 나타낸다. 일부 실시형태에서, IFN-γ는 미치료 환자와 비교하여 그리/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 또는 5-배 또는 그 초과 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1-배 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 2-배 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 3-배 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 4-배 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 분비는 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 5-배 증가된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ는 Quantikine ELISA 키트를 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ는 예를 들어, 도 1에 기재된 것들을 사용하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료된 대상체의 생체외 TIL에서 측정된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ는 예를 들어, 도 1에 기재된 것들을 사용하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료된 대상체의 혈액에서 측정된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ는 예를 들어, 도 1에 기재된 것들을 사용하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료된 대상체의 TIL 혈청에서 측정된다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 도 1에 기재된 것들을 포함하는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL은, 예를 들어, 공정 1C 방법으로 지칭되는 방법과 같이 도 1에서 예시되지 않는 것들을 포함하여 다른 방법에 의해 생성된 TIL과 비교하여 증가된 다클론성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 상당히 개선된 다클론성 및/또는 증가된 다클론성은 치료 효능 및/또는 증가된 임상 효능을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 T-세포 레퍼토리 다양성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 다클론성의 증가는 본 발명의 방법에 의해 생성된 TIL의 투여에 관한 치료 효능을 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 방법을 사용하여 제조된 TIL과 비교하여 1-배, 2-배, 10-배, 100-배, 500-배, 또는 1000-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 2-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 10-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 100-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 500-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1000-배 증가된다.
효능의 측정은 본원에 기재된 기재될 뿐만 아니라 당해 분야에서 알려진 바와 같이 질환 통제율 (DCR)뿐만 아니라 전반적으로 반응 속도 (ORR)를 포함할 수 있다.
1. NSCLC를 치료하는 방법
본원에 기재된 조성물 및 방법은 비-소세포 폐암 (NSCLC)을 치료하기 위한 방법에 사용될 수 있고, NSCLC는 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성이다. 일부 실시형태에서 항-PD-1 항체는, 예를 들어 니볼루맙 (BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®), 펨브롤리주맙 (람브롤리주맙, MK03475 또는 MK-3475, Merck; Keytruda®), 인간화된 항-PD-1 항체 JS001 (ShangHai JunShi), 단클론성 항-PD-1 항체 TSR-042 (Tesaro, Inc.), 피딜리주맙 (항-PD-1 mAb CT-011, Medivation), 항-PD-1 단클론성 항체 BGB-A317 (BeiGene), 및/또는 항-PD-1 항체 SHR-1210 (ShangHai HengRui), 인간 단클론성 항체 REGN2810 (Regeneron), 인간 단클론성 항체 MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb), 및/또는 인간화된 항-PD-1 IgG4 항체 PDR001 (Novartis)를 비제한적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-1 항체는 클론: RMP1-14 (랫트 IgG) - BioXcell cat# BP0146으로부터의 것이다. 본원에 기재된 바와 같이 단계 A 내지 F에 따라 생성된 TIL과의 공동-투여 방법에 사용하기에 적합한 다른 적합한 항체는 본원에 인용되어 포함된 미국 특허 제8,008,449호에 개시된 항-PD-1 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 그의 항원-결합부는 PD-L1에 특이적으로 결합하고 PD-1과의 상호작용을 억제하여, 면역 활성을 증가시킨다. PD-L1에 결합하고 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 방해하고, 종양 면역 반응을 자극하는 당업계에서 알려진 임의의 항체가 포함된다. 예를 들어, PD-L1을 표적으로 하고 임상 시험 중인 항체는, BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) 및 MPDL3280A (Genentech)를 포함한다. PD-L1을 표적으로 하는 다른 적합한 항체는 미국 특허 제7,943,743호에 개시되어 있고, 이는 인용하여 본원에 포함되어 있다. PD-1 또는 PD-L1에 결합하고, PD-1/PD-L1 상호작용을 방해하고, 항종양 면역 반응을 자극하는 임의의 항체가 포함된다는 것은 당업자에 의해 인정될 것이다.
일부 실시형태에서, NSCLC는 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및 화학요법제에 불응성이다. 일부 실시형태에서, NSCLC는 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및 화학요법에 불응성이고, 화학요법제는 카보플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 시스플라틴이다. 일부 실시형태에서, 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 (Yervoy®)이다.
일부 실시형태에서, NSCLC는 조합된 PD-1 (예를 들어 펨브롤리주맙을 포함함) 및 화학요법제에 의한 치료에 불응성이다. 일부 실시형태에서, 화학요법제(들)는 백금 더블릿 화학요법제이다. 일부 실시형태에서, 백금 더블릿 요법은 시스플라틴 및 카보플라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 화학요법제 및 비노렐빈, 젬시타빈 및 탁산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 화학요법제 (예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 nab-파클리탁셀을 포함함)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 백금 더블릿 화학요법제는 페메트렉세드와 조합된다.
일부 실시형태에서, NSCLC는 항-PD-1 및 화학요법제를 포함하는 병용 치료 또는 병용 요법에 불응성이다. 일부 실시형태에서, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, JS001, TSR-042, 피딜리주맙, (BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, 클론: RMP1-14로부터의 항-PD-1, 미국 특허 제8,008,449호에 기재된 항-PD-1 항체, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 그의 단편, 유도체, 변이체뿐만 아니라 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항-PD-1는 펨브롤리주맙이다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 백금 더블릿 화학요법제이다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 페메트렉세드와 조합된다. 일부 실시형태에서, NSCLC는 카보플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 및 시스플라틴을 포함하는 병용 요법에 불응성이다. 일부 실시형태에서, NSCLC는 카보플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 시스플라틴, 니볼루맙, 및 이필리무맙을 포함하는 병용 요법에 불응성이다.
일부 실시형태에서, NSCLC는 항-PD-1 또는 항-PD-L1 및 백금 더블릿 요법을 포함하는 병용 요법에 불응성이고, 백금 더블릿 요법은 다음을 포함한다:
i) 시스플라틴 및 카보플라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 화학요법제,
ii) 및 비노렐빈, 젬시타빈 및 탁산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 화학요법제 (예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 nab-파클리탁셀을 포함함).
일부 실시형태에서, NSCLC는 항-PD-1 또는 항-PD-L1, 페메트렉세드를 포함하는 병용 요법, 및 백금 더블릿 요법에 불응성이고, 백금 더블릿 요법은 다음을 포함한다:
i) 시스플라틴 및 카보플라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 화학요법제,
ii) 및 비노렐빈, 젬시타빈 및 탁산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 화학요법제 (예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 nab-파클리탁셀을 포함함).
일부 실시형태에서, NSCLC는 항-PD-1 항체로 치료되었다. 일부 실시형태에서, NSCLC는 항-PD-L1 항체로 치료되었다. 일부 실시형태에서, NSCLC 대상체는 치료 미접촉이다. 일부 실시형태에서, NSCLC는 항-PD-1 항체로 치료되지 않았다. 일부 실시형태에서, NSCLC는 항-PD-L1 항체로 치료되지 않았다. 일부 실시형태에서, NSCLC는 화학요법제로 이전에 치료되었다. 일부 실시형태에서, NSCLC는 화학요법제로 이전에 치료되었지만 더 이상 화학요법제로 치료될 수 없다. 일부 실시형태에서, NSCLC 환자는 항-PD-1/PD-L1 미접촉이다. 일부 실시형태에서, NSCLC 대상체는 저발현의 PD-L1을 갖는다. 일부 실시형태에서, NSCLC 대상체는 치료 미접촉 NSCLC을 갖거나, 또는 화학요법 후 치료이지만, 항-PD-1/PD-L1 미접촉이다. 일부 실시형태에서, NSCLC 대상체는 치료 미접촉 NSCLC 또는 화학요법 후 치료이지만 항-PD-1/PD-L1 미접촉이며 및 저발현의 PD-L1을 갖는다. 일부 실시형태에서, NSCLC 대상체는 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 기준선에서 큰 부피의 질환을 가지며 저발현의 PD-L1을 갖는다. 일부 실시형태에서, NSCLC 대상체는 치료 미접촉 NSCLC 또는 화학요법 후이지만, 저발현의 PD-L1을 갖고/갖거나 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는 항-PD-1/PD-L1 미접촉을 갖는다. 일부 실시형태에서, 최대 종양 직경이 횡단면이나 관상면에서 측정된 7 cm 초과인, 큰 부피의 질환이 나타난다. 일부 실시형태에서, 큰 부피의 질환은 단축 직경이 20 mm 이상인 팽윤된 림프절이 존재할 때 나타난다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 NSCLC에 대한 표준 관리 치료제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 도 1에 기재된 것들을 포함하는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL은, 예를 들어, 공정 1C 방법으로 지칭되는 방법과 같이 도 1에서 예시되지 않는 것들을 포함하여 다른 방법에 의해 생성된 TIL과 비교하여 증가된 다클론성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 상당히 개선된 다클론성 및/또는 증가된 다클론성은 암치료를 위한 치료 효능 및/또는 증가된 임상 효능을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 T-세포 레퍼토리 다양성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 다클론성의 증가는 본 발명의 방법에 의해 생성된 TIL의 투여에 관한 치료 효능을 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 방법을 사용하여 제조된 TIL과 비교하여 1-배, 2-배, 10-배, 100-배, 500-배, 또는 1000-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 2-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 10-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 100-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 500-배 증가된다. 일부 실시형태에서, 다클론성은 미치료 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어, 도 1에서 구현된 것 이외의 방법을 포함하는 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1000-배 증가된다.
a. PD-1 및 PD-L1 억제제
프로그래밍된 사망 1 (PD-1)은 T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) T 세포, 활성화된 단핵구, 및 수지상 세포에 의해 발현된 288-아미노산 막관통 면역체크포인트 수용체 단백질이다. 또한 CD279로 알려져 있는 PD-1은, CD28 계열에 속하고, 인간은 염색체 2 상의 Pdcd1 유전자에 인코딩될 수 있다. PD-1은 하나의 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리 도메인, 막관통 영역, 및 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프 (ITIM) 및 면역수용체 티로신 기반 스위치 모티프 (ITSM)를 함유하는 세포내 도메인으로 이루어진다. PD-1 및 그것의 리간드 (PD-L1 및 PD-L2)는 문헌[Keir, 등, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 677-704]에 기재된 바와 같이 면역 관용에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. PD-1은 T 세포 면역 반응을 부정적으로 조절하는 억제 신호를 제공한다. PD-L1 (또한 B7-H1 또는 CD274로 알려져 있음) 및 PD-L2 (또한 B7-DC 또는 CD273로 알려져 있음)는 종양 세포 및 기질 세포 상에서 발현되며, 이는 PD-1을 발현하는 활성화된 T 세포가 직면할 수 있고, 이는 T 세포의 면역억제를 유도한다. PD-L1은 인간 염색체 9 상의 Cd274 유전자에 의해 인코딩되는 290개의 아미노산 막관통 단백질이다. PD-1 억제제, PD-L1 억제제, 및/또는 PD-L2 억제제의 사용에 의한 PD-1과 그의 리간드 PD-L1과 PD-L2 사이의 상호작용의 차단은 문헌[Topalian, 등, N. Eng. J. Med. 2012, 366, 2443-54]에 기재된 것과 같이 최근의 임상 연구에서 입증된 바와 같이 면역 내성을 극복할 수 있다. PD-L1은 많은 종양 세포주에서 발현되는 반면, PD-L2는 대부분 수지상 세포 및 소수의 종양 세포주 상에서 발현된다. (활성화 후 PD-1을 유도성으로 발현시키는) T 세포에 추가하여, PD-1은 또한 B 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 활성화된 단핵구, 및 수지상 세포 상에서 발현된다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 당업계에서 알려진 임의의 PD-1 억제제 또는 PD-1 차단제일 수 있다. 특히, 다음의 단락에서 더 상세히 기재된 PD-1 억제제 또는 차단제 중의 하나이다. 용어들 "억제제", "길항제", 및 "차단제"는 PD-1 억제제와 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 의심을 피하기 위해, 항체인, 본원에서 PD-1 억제제에 대한 언급은 화합물 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 콘주게이트, 또는 바이오시밀러를 지칭할 수 있다. 의심을 피하기 위해, 본원에서 PD-1 억제제에 대한 언급은 또한 소분자 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 용매화물, 수화물, 공결정, 또는 전구약물을 지칭할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, PD-1 억제제는, 그의 Fab 단편, 또는 단쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하는, 항체 (즉, 항-PD-1 항체), 그의 단편이다. 일부 실시형태에서 PD-1 억제제는 다클론성 항체이다. 바람직한 실시형태에서, PD-1 억제제는 단클론성 항체이다. 일부 실시형태에서, PD-1 억제제는 PD-1과 결합하기 위해 경쟁하고/경쟁하거나 PD-1 상의 에피토프에 결합한다. 일 실시형태에서, 항체는 PD-1과 결합하기 위해 경쟁하고/경쟁하거나 PD-1 상의 에피토프에 결합한다.
일부 실시형태에서, PD-1 억제제는 약 100 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 90 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 80 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 70 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 60 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 50 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 40 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 30 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 20 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 10 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 또는 약 1 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하는 것이다.
일부 실시형태에서, PD-1 억제제는 약 7.5 × 105 l/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 8 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 8.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 9 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 9.5 × 105 l/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 또는 약 1 × 106 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-1에 결합하는 것이다.
일부 실시형태에서, PD-1 억제제는 약 2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.1 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.4 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.5 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.6 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나 또는 약 2.7 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.8 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.9 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 또는 약 3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하는 것이다.
일부 실시형태에서, PD-1 억제제는 약 10 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 9 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 8 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 7 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 6 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 5 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 4 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 3 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 2 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하거나, 또는 약 1 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하는 것이다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 니볼루맙 (Bristol-Myers Squibb Co.로부터 옵티보로서 상업적으로 입수가능함), 또는 그의 바이오시밀러, 항원-결합 단편, 콘주게이트, 또는 변이체이다. 니볼루맙은 PD-1 수용체를 차단하는 완전 인간 IgG4 항체이다. 일 실시형태에서, 항-PD-1 항체는 면역글로불린 G4 카파, 항-(인간 CD274) 항체이다. 니볼루맙은 Chemical Abstracts Service (CAS) 등록번호 946414-94-4로 할당되고 또한 5C4, BMS-936558, MDX-1106, 및 ONO-4538로 알려져 있다. 니볼루맙의 제조 및 특성은 미국 특허 제8,008,449호 및 국제 특허 공개 WO 2006/121168호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 다양한 형태의 암에서 니볼루맙의 임상 안전성 및 효능은 문헌[Wang, 등, Cancer Immunol Res. 2014, 2, 846-56; Page, 등, Ann. Rev. Med., 2014, 65, 185-202; 및 Weber, 등, J. Clin. Oncology, 2013, 31, 4311-4318]에 기재되었고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 니볼루맙의 아미노산 서열은 표 48에 제시된다. 니볼루맙은 22-96,140-196, 254-314, 360-418, 22''-96'', 140''-196'', 254''-314'', 및 360''-418''에서 중쇄내 디설파이드 연결기; 23'-88', 134'-194', 23'''-88''', 및 134'''-194'''에서 경쇄내 디설파이드 연결기; 127-214', 127''-214'''에서 중쇄-경쇄간 디설파이드 연결기, 219-219'' 및 222-222''에서 중쇄-중쇄간 디설파이드 연결기; 및 290, 290''에서 N-글리코실화 부위 (H CH2 84.4)를 갖는다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 서열번호:463로 제시된 중쇄 및 서열번호:464로 제시된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 서열번호:463 및 서열번호:464 각각에 제시된 서열, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 콘주게이트를 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:463 및 서열번호:464 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:463 및 서열번호:464 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:463 및 서열번호:464 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:463 및 서열번호:464 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:463 및 서열번호:464 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 니볼루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제 중쇄 가변 영역 (VH)는 서열번호:465에 제시된 서열을 포함하고, PD-1 억제제 경쇄 가변 영역 (VL)는 서열번호:466에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:465 및 서열번호:466 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:465 및 서열번호:466 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:465 및 서열번호:466 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:465 및 서열번호:466 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:465 및 서열번호:466 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 서열번호:467, 서열번호:468, 및 서열번호:469 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:470, 서열번호:471, 및 서열번호:472 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 결합하기 위해 상기 언급된 항체 중 임의의 것과 동일한 PD-1 상의 에피토프와 경쟁하고/경쟁하거나 상기 에피토프에 결합한다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 니볼루맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 항-PD-1 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-1 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 니볼루맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 항-PD-1 항체이고, 항-PD-1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 니볼루맙이다. 항-PD-1 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 니볼루맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 니볼루맙이다.
Figure pct00043
또 다른 실시형태에서, PD-1 억제제는 펨브롤리주맙 (미국 뉴저지주 케니워스 소재의 Merck & Co., Inc.로부터 키트루다로서 상업적으로 입수가능함), 또는 그의 항원-결합 단편, 콘주게이트, 또는 변이체를 포함한다. 펨브롤리주맙은 CAS 등록번호 1374853-91-4로 할당되고 람브롤리주맙, MK-3475, 및 SCH-900475로도 알려져 있다. 펨브롤리주맙은 면역글로불린 G4, 항-(인간 단백질 PDCD1 (프로그래밍된 세포사 1)) (인간-Mus 무스큘러스 단클론성 중쇄), 인간-Mus 무스큘러스 단클론성 경쇄를 갖는 디설파이드, 이량체 구조를 갖는다. 펨브롤리주맙의 구조는 또한 면역글로불린 G4, 항-(인간 프로그래밍된 세포사 1); 인간화된 마우스 단클론성 κ 경쇄 이량체 (226-226'':229-229'')-비스디설파이드를 갖는 인간화된 마우스 단클론성 [228-L-프롤린(H10-S>P)]γ4 중쇄 (134-218')-디설파이드로서 기재될 수 있다. 펨브롤리주맙의 특성, 용도, 및 제조는 국제 특허 공개 WO 2008/156712 A1호, 미국 특허 제8,354,509호 및 미국 특허출원공개 US 2010/0266617 A1호, US 2013/0108651 A1호, 및 US 2013/0109843 A2호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 다양한 형태의 암에서 펨브롤리주맙의 임상 안전성 및 효능은 문헌[Fuerst, Oncology Times, 2014, 36, 35-36; Robert, 등, Lancet, 2014, 384, 1109-17; 및 Thomas, 등, Exp. Opin. Biol. Ther., 2014, 14, 1061-1064]에 기재되어 있다. 펨브롤리주맙의 아미노산 서열은 표 49에 제시된다. 펨브롤리주맙은 다음의 디설파이드 브릿지를 포함한다: 22-96, 22''-96'', 23'-92', 23'''-92''', 134-218', 134''-218''', 138'-198', 138'''-198''', 147-203, 147''-203'', 226-226'', 229-229'', 261-321, 261''-321'', 367-425, 및 367''-425'', 및 다음의 글리코실화 부위 (N): Asn-297 및 Asn-297''. 펨브롤리주맙은 Fc 영역에서 안정화 S228P 돌연변이를 갖는 IgG4/카파 아이소타입이고; IgG4 힌지 영역에서 이러한 돌연변이의 삽입은 IgG4 항체에 대해 전형적으로 관찰되는 절반 분자의 형성을 방지한다. 펨브롤리주맙은 각 중쇄의 Fc 도메인 내의 Asn297에서 불균질하게 글리코실화되어, 온전한 항체에 대해 대략 149 kDa의 분자량을 산출한다. 우세한 글리코형의 펨브롤리주맙은 푸코실화된 아갈락토 디안테너리 글리칸 형태 (G0F)이다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 서열번호:473로 제시된 중쇄 및 서열번호:474로 제시된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 서열번호:473 및 서열번호:474 각각에 제시된 서열, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 콘주게이트를 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:473 및 서열번호:474 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:473 및 서열번호:474 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:473 및 서열번호:474 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:473 및 서열번호:474 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:473 및 서열번호:474 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 펨브롤리주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제 중쇄 가변 영역 (VH)는 서열번호:475에 제시된 서열을 포함하고 PD-1 억제제 경쇄 가변 영역 (VL)는 서열번호:476에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:475 및 서열번호:476 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:475 및 서열번호:476 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:475 및 서열번호:476 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:475 및 서열번호:476 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:475 및 서열번호:476 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 서열번호:477, 서열번호:478, 및 서열번호:479 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:480, 서열번호:481, 및 서열번호:482 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 결합하기 위해 상기 언급된 항체 중 임의의 것과 동일한 PD-1 상의 에피토프와 경쟁하고/경쟁하거나 상기 에피토프에 결합한다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 펨브롤리주맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 항-PD-1 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-1 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 펨브롤리주맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 항-PD-1 항체이고, 항-PD-1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 펨브롤리주맙이다. 항-PD-1 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 펨브롤리주맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 펨브롤리주맙이다.
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일 실시형태에서, PD-1 억제제는 상업적으로 입수가능한 항-PD-1 단클론성 항체, 예컨대 항-m-PD-1 클론 J43 (Cat # BE0033-2) 및 RMP1-14 (Cat # BE0146) (Bio X Cell, Inc., 미국 뉴햄프셔 웨스트 리바논 소재)이다. 수많은 상업적으로 입수가능한 항-PD-1 항체는 당업자에게 알려져 있다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 미국 특허 제8,354,509 또는 미국 특허출원공개 제2010/0266617 A1호, 제2013/0108651 A1호, 제2013/0109843 A2호에 개시된 항체이고, 상기 특허들의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는 미국 특허 제8,287,856, 8,580,247, 및 제8,168,757호 및 미국 특허출원공개 제2009/0028857 A1호, 제2010/0285013 A1호, 제2013/0022600 A1호, 및 제2011/0008369 A1호에 기재된 항-PD-1 항체이고, 상기 특허의 교시는 인용되어 본원에 포함되어 있다. 또 다른 실시형태에서, PD-1 억제제는 미국 특허 제8,735,553 B1호에 개시된 항-PD-1 항체이고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, PD-1 억제제는, 미국 특허 제8,686,119호 기재되어 있는 CT-011로도 알려져 있는 피딜리주맙이고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, PD-1 억제제는 소분자 또는 펩티드, 또는 펩티드 유도체, 예컨대 미국 특허 제8,907,053호; 제9,096,642호; 및 제9,044,442호 및 미국 특허출원공개 US 2015/0087581호에 기재된 것들; 1,2,4-옥사디아졸 화합물 및 유도체 예컨대 미국 특허출원공개 제2015/0073024호에 기재된 것들; 환형 펩티드모사체 화합물 및 유도체 예컨대 미국 특허출원공개 US 2015/0073042호에기재된 것들; 환형 화합물 및 유도체 예컨대 미국 특허출원공개 US 2015/0125491호에 기재된 것들; 1,3,4-옥사디아졸 및 1,3,4-티아디아졸 화합물 및 유도체 예컨대 국제공개 WO 2015/033301호에 기재된 것들; 펩티드 기반 화합물 및 유도체 예컨대 국제공개 WO 2015/036927호 및 WO 2015/04490호에 기재된 것들, 또는 거대환형 펩티드 기반 화합물 및 유도체 예컨대 미국 특허출원공개 US 2014/0294898호에 기재된 것들일 수 있고; 상기 특허 각각의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 당업계에서 알려진 임의의 PD-L1 또는 PD-L2 억제제, 길항제, 또는 차단제일 수 있다. 특히, 다음의 단락에 더 상세히 기재된 PD-L1 또는 PD-L2 억제제, 길항제, 또는 차단제 중 하나이다. 용어들 "억제제", "길항제", 및 "차단제"는 PD-L1 및 PD-L2 억제제와 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 의심을 피하기 위해, 항체인 PD-L1 또는 PD-L2 억제제에 대한 언급은 화합물 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 콘주게이트, 또는 바이오시밀러를 지칭할 수 있다. 의심을 피하기 위해, PD-L1 또는 PD-L2 억제제에 대한 본원의 언급은 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 용매화물, 수화물, 공결정, 또는 전구약물을 지칭할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물, 공정 및 방법은 PD-L1 또는 PD-L2 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 소분자이다. 바람직한 실시형태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 항체(즉, 항-PD-1 항체), Fab 단편을 포함하는 그의 단편, 또는 그의 단쇄 가변 단편(scFv)이다. 일부 실시형태에서 PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 다클론성 항체이다. 바람직한 실시형태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 단클론성 항체이다. 일부 실시형태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 결합하기 위해 PD-L1 또는 PD-L2와 경쟁하고/경쟁하거나 PD-L1 또는 PD-L2 상의 에피토프에 결합한다. 일 실시형태에서, 항체는 결합하기 위해 PD-L1 또는 PD-L2와 경쟁하고/경쟁하거나 PD-L1 또는 PD-L2 상의 에피토프에 결합한다.
일부 실시형태에서, 화합물이 PD-L2 수용체를 포함하는 다른 수용체에 결합하거나 상호작용하는 것보다 실질적으로 더 낮은 농도에서 PD-L1과 결합하거나 상호작용한다는 점에서, 본원에 제공된 PD-L1 억제제는 PD-L1에 대해 선택적이다. 특정 실시형태에서, 화합물은PD-L2 수용체보다 적어도 약 2-배 초과의 농도, 약 3-배 초과의 농도, 약 5-배 초과의 농도, 약 10-배 초과의 농도, 약 20-배 초과의 농도, 약 30-배 초과의 농도, 약 50-배 초과의 농도, 약 100-배 초과의 농도, 약 200-배 초과의 농도, 약 300-배 초과의 농도, 또는 약 500-배 초과의 농도 인 결합 상수로 PD-L1 수용체에 결합한다.
일부 실시형태에서, 화합물이 PD-L1 수용체를 포함하는 다른 수용체에 결합하거나 상호작용하는 것보다 실질적으로 더 낮은 농도에서 PD-L2와 결합하거나 상호작용한다는 점에서, 본원에 제공된 PD-L2 억제제는 PD-L2에 대해 선택적이다. 특정 실시형태에서, 화합물은 PD-L1 수용체보다 적어도 약 2-배 초과의 농도, 약 3-배 초과의 농도, 약 5-배 초과의 농도, 약 10-배 초과의 농도, 약 20-배 초과의 농도, 약 30-배 초과의 농도, 약 50-배 초과의 농도, 약 100-배 초과의 농도, 약 200-배 초과의 농도, 약 300-배 초과의 농도, 또는 약 500-배 초과의 농도인 결합 상수로 PD-L2 수용체에 결합한다.
임의의 이론에 의한 구속됨 없이, 종양 세포는 PD-L1을 발현시키고 T 세포는 PD-1을 발현시키는 것으로 여겨진다. 그러나, 종양 세포에 의한 PD-L1 발현은 PD-1 또는 PD-L1 억제제 또는 차단제의 효능에 필요하지 않다. 일 실시형태에서, 종양 세포는 PD-L1을 발현시킨다. 또 다른 실시형태에서, 종양 세포는 PD-L1을 발현시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 방법은PD-1 및 PD-L1 항체, 예컨대 본원에 기재된 것의 조합을 TIL와 조합하여 포함할 수 있다. PD-1과 PD-L1 항체와 TIL의 조합의 투여는 동시 또는 순차적일 수 있다.
일부 실시형태에서, PD-L1 및/또는 PD-L2 억제제는 약 100 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 90 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 80 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 70 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 60 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 50 pM 이하의 KD, 약 40 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하거나, 또는 약 30 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 것이다.
일부 실시형태에서, PD-L1 및/또는 PD-L2 억제제는 약 7.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 8 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 8.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 9 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 9.5 × 105 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하거나, 또는 약 1 × 106 1/M·s 이상의 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 것이다.
일부 실시형태에서, PD-L1 및/또는 PD-L2 억제제는 약 2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하고, 약 2.1 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.2 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.3 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.4 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.5 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.6 × 10-5 1/s 이하 이하의 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.7 × 10-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하거나, 또는 약 3 × 10-5 1/s 이하 이하의 kdissoc로 인간 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하는 것이다.
일부 실시형태에서, PD-L1 및/또는 PD-L2 억제제는 약 10 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 9 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 8 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 7 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 6 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 5 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 4 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 3 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 2 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하거나; 또는 약 1 nM 이하의 IC50로 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단하거나 억제하는 것이다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 MEDI4736 (이는 AstraZeneca plc.의 자회사인 머릴랜드주 게티스버그 소재의 Medimmune, LLC로부터 상업적으로 입수가능함)로도 알려져 있는 더발루맙, 또는 그의 항원-결합 단편, 콘주게이트, 또는 변이체이다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 미국 특허 제8,779,108호 또는 미국 특허출원공개 제2013/0034559호에 개시된 항체이고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 더발루맙의 임상 효능은 문헌[Page, 등, Ann. Rev. Med., 2014, 65, 185-202; Brahmer, 등, J. Clin. Oncol. 2014, 32, 5s (보충, 요약 8021); 및 McDermott, 등, Cancer Treatment Rev. 2014, 40, 1056-64]에 기재되었다. 더발루맙의 제조 및 특성은 미국 특허 제8,779,108호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 더발루맙의 아미노산 서열은 표 50에 제시된다. 더발루맙 단클론성 항체는 22-96, 22''-96'', 23'-89', 23'''-89''', 135'-195', 135'''-195''', 148-204, 148''-204'', 215'-224, 215'''-224'', 230-230'', 233-233'', 265-325, 265''-325'', 371-429, 및 371''-429'에서 디설파이드 연결기; 및 Asn-301 및 Asn-301''에서 N-글리코실화 부위를 포함한다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:483로 제시된 중쇄 및 서열번호:484로 제시된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:483 및 서열번호:484 각각에 제시된 서열, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 콘주게이트를 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:483 및 서열번호:484 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:483 및 서열번호:484 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:483 및 서열번호:484 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:483 및 서열번호:484 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:483 및 서열번호:484 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 더발루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제 중쇄 가변 영역 (VH)는 서열번호:485에 제시된 서열을 포함하고 PD-L1 억제제 경쇄 가변 영역 (VL)는 서열번호:486에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:485 및 서열번호:486 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:485 및 서열번호:486 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:485 및 서열번호:486 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:485 및 서열번호:486 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:485 및 서열번호:486 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:487, 서열번호:488, 및 서열번호:489 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:490, 서열번호:491, 및 서열번호:492 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 결합하기 위해 상기 언급된 항체 중 임의의 것과 PD-L1 상의 동일한 에피토프와 경쟁하고/경쟁하거나 상기 에피토프에 결합한다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 더발루맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 항-PD-L1 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 더발루맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 항-PD-L1 항체이고, 항-PD-L1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 더발루맙이다. 항-PD-L1 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 더발루맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 더발루맙이다.
Figure pct00045
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 MSB0010718C (Merck KGaA/EMD Serono에서 상업적으로 입수가능함)로도 알려져 있는 아벨루맙, 또는 그의 항원-결합 단편, 콘주게이트, 또는 변이체이다. 아벨루맙의 제조 및 특성은 미국 특허출원공개 US 2014/0341917 A1호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 구체적으로 본원에 인용되어 포함된다. 아벨루맙의 아미노산 서열은 표 51에 제시된다. 아벨루맙은 22-96, 147-203, 264-324, 370-428, 22''-96'', 147''-203'', 264''-324'', 및 370''-428''에서 중쇄내 디설파이드 연결기 (C23-C104); 22'-90', 138'-197', 22'''-90''', 및 138'''-197'''에서 경쇄내 디설파이드 연결기 (C23-C104); 223-215' 및 223''-215'''에서 중-경쇄내 디설파이드 연결기 (h 5-CL 126); 229-229'' 및 232-232''에서 중-중쇄내 디설파이드 연결기 (h 11, h 14); 300, 300''에서 N-글리코실화 부위 (H CH2 N84.4); 푸코실화된 복합체 바이-안테너리 CHO-유형 글리칸; 및 450 및 450'에서 H CHS K2 C-말단 라이신 클립핑을 갖는다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:493로 제시된 중쇄 및 서열번호:494로 제시된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:493 및 서열번호:494 각각에 제시된 서열, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 콘주게이트를 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:493 및 서열번호:494 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:493 및 서열번호:494 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:493 및 서열번호:494 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:493 및 서열번호:494 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:493 및 서열번호:494 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 아벨루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제 중쇄 가변 영역 (VH)는 서열번호:495에 제시된 서열을 포함하고 PD-L1 억제제 경쇄 가변 영역 (VL)는 서열번호:496에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:495 및 서열번호:496 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:496 및 서열번호:496 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:495 및 서열번호:496 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:495 및 서열번호:496 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:495 및 서열번호:496 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:497, 서열번호:498, 및 서열번호:499 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:500, 서열번호:501, 및 서열번호:502 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 결합하기 위해 상기 언급된 항체 중 임의의 것과 PD-L1 상의 동일한 에피토프와 경쟁하고/경쟁하거나 상기 에피토프에 결합한다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 아벨루맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 항-PD-L1 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아벨루맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 항-PD-L1 항체이고, 항-PD-L1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아벨루맙이다. 항-PD-L1 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아벨루맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아벨루맙이다.
Figure pct00046
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 MPDL3280A 또는 RG7446 (스위스 바젤 소재의 Roche Holding AG의 자회사인 Genentech, Inc.로부터 TECENTRIQ로 상업적으로 입수가능함) 도 알려져 있는 아테졸리주맙, 또는 그의 항원-결합 단편, 콘주게이트, 또는 변이체이다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 미국 특허 제8,217,149호에 개시된 항체이고, 그의 개시내용은 구체적으로 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 미국 특허출원공개 제2010/0203056 A1호, 제2013/0045200 A1호, 2013/0045201 A1호, 제2013/0045202 A1호, 또는 제2014/0065135 A1호에 개시된 항체이고, 그의 개시내용은 구체적으로 본원에 인용되어 포함된다. 아테졸리주맙의 제조 및 특성은 미국 특허 제8,217,149호에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 아테졸리주맙의 아미노산 서열은 표 52에 제시된다. 아테졸리주맙은 22-96, 145-201, 262-322, 368-426, 22''-96'', 145''-201'', 262''-322'', 및 368''-426''에서 중쇄내 디설파이드 연결기 (C23-C104); 23'-88', 134'-194', 23'''-88''', 및 134'''-194'''에서 경쇄내 디설파이드 연결기 (C23-C104); 221-214' 및 221''-214'''에서 중-경쇄내 디설파이드 연결기 (h 5-CL 126); 227-227'' 및 230-230''에서 중-중쇄내 디설파이드 연결기 (h 11, h 14); 및 298 및 298'에서 N-글리코실화 부위 (H CH2 N84.4>A)를 갖는다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:503로 제시된 중쇄 및 서열번호:504로 제시된 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:503 및 서열번호:504 각각에 제시된 서열, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv), 변이체, 또는 콘주게이트를 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:503 및 서열번호:504 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:503 및 서열번호:504 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:503 및 서열번호:504 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:503 및 서열번호:504 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이들 각각은 서열번호:503 및 서열번호:504 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 아테졸리주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제 중쇄 가변 영역 (VH)는 서열번호:505에 제시된 서열을 포함하고 PD-L1 억제제 경쇄 가변 영역 (VL)는 서열번호:506에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:505 및 서열번호:506 각각에 제시된 서열과 적어도 99% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:505 및 서열번호:506 각각에 제시된 서열과 적어도 98% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:505 및 서열번호:506 각각에 제시된 서열과 적어도 97% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:505 및 서열번호:506 각각에 제시된 서열과 적어도 96% 동일하다. 일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 각각은 서열번호:505 및 서열번호:506 각각에 제시된 서열과 적어도 95% 동일하다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 서열번호:507, 서열번호:508, 및 서열번호:509 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호:510, 서열번호:511, 및 서열번호:512 각각에 제시된 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 결합하기 위해 상기 언급된 항체 중 임의의 것과 PD-L1 상의 동일한 에피토프와 경쟁하고/경쟁하거나 상기 에피토프에 결합한다.
일 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 허가된 항-PD-L1 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시형태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아테졸리주맙이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및 절단. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 허가되거나 허가를 위해 제출된 항-PD-L1 항체이고, 항-PD-L1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제형과 다른 제형으로 제공되고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아테졸리주맙이다. 항-PD-L1 항체는 약물 규제 기관 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA에 의해 허가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아테졸리주맙이다. 일부 실시형태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되고, 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제에 동일하거나 상이하고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아테졸리주맙이다.
Figure pct00047
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 미국 특허출원공개 US 2014/0341917 A1호에 기재된 항체를 포함하고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 또 다른 실시형태에서, PD-L1에 대한 결합에 대해 임의의 이들 항체와 경쟁하는 항체가 또한 포함된다. 일 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는, BMS-935559로도 알려져 있는 MDX-1105이며, 이는 그 개시내용은 본원에 인용되어 포함된 미국 특허 제7,943,743호에 개시되어 있다. 일 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 미국 특허 제7,943,743호에 개시된 항-PD-L1 항체로부터 선택되고, 상기 특허는 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, PD-L1 억제제는 상업적으로 입수가능한 단클론성 항체, 예컨대 INVIVOMAB 항-m-PD-L1 클론 10F.9G2 (카탈로그 # BE0101, Bio X Cell, Inc., 미국 뉴햄프셔 웨스트 리바논 소재)이다. 일 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 상업적으로 입수가능한 단클론성 항체, 예컨대 AFFYMETRIX EBIOSCIENCE (MIH1)이다. 수많은 상업적으로 입수가능한 항-PD-L1 항체는 당업자에게 알려져 있다.
일 실시형태에서, PD-L2 억제제는 상업적으로 입수가능한 단클론성 항체, 예컨대 BIOLEGEND 24F.10C12 마우스 IgG2a, κ 아이소타입 (카탈로그 # 329602 Biolegend, Inc., San Diego, CA), SIGMA 항-PD-L2 항체 (카탈로그 # SAB3500395, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich Co.), 또는 당업자에게 알려진 다른 상업적으로 입수가능한 항-PD-L2 항체이다.
2. 환자의 선택적 림프구고갈 전처치
일 실시형태에서, 본 발명은 TIL의 주입으로 암을 치료하는 방법을 포함하고, 본 개시내용에 따른 TIL의 주입 전에 비-골수절제 화학요법으로 전-치료된다. 일 실시형태에서, 본 발명은 비-골수절제 화학요법으로 전치료되었던 환자에서 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 포함한다. 일 실시형태에서, TIL의 집단은 주입에 의한 투여를 위한 것이다. 일 실시형태에서, 비-골수절제 화학요법은 2일 동안 시클로포스파미드 60 mg/kg/d (TIL 주입 전 27일째 및 26일째) 및 5일 동안 플루다라빈 25 mg/m2/d (TIL 주입 전 27일째 내지 23일째)이다. 일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 비-골수절제 화학요법 및 TIL 주입(0일) 후, 환자는 생리학적 내성으로 8시간마다 720,000 IU/kg으로 정맥내로 IL-2(알데스류킨, 프롤류킨으로서 상업적으로 입수가능함)의 정맥내 주입을 받는다. 특정 실시형태에서, TIL의 집단은 IL-2와의 조합으로 암을 치료하는데 사용되고, IL-2는 TIL의 주입 후에 투여된다.
실험적 발견은 종양-특이적 T 림프구의 입양 전달 전의 림프 고갈이 조절성 T 세포 및 면역계의 경쟁 요소 ('사이토카인 싱크')를 제거함으로써 치료 효능을 향상시키는 데 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 일부 실시형태는 본 발명의 TIL의 도입 전에 환자에게 림프구고갈 단계 (때때로 "면역억제성 컨디셔닝"으로도 지칭됨)를 사용한다.
일반적으로, 림프구고갈은 플루다라빈의 투여 또는 사이클로포스파미드 (활성 형태는 마포스파미드로 지칭됨) 및 이들의 조합을 사용하여 달성된다. 그와 같은 방법은 문헌[Gassner, 등, Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, 등, Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, 등, J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239, 및 Dudley, 등, J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357]에 기재되어 있고, 이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일부 실시형태에서, 플루다라빈은 0.5 μg/mL -10 μg/Ml의 플루다라빈의 농도로 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈은 1 μg/mL의 플루다라빈의 농도로 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈 치료는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 또는 그 초과 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈은 10 mg/kg/일, 15 mg/kg/일, 20 mg/kg/일, 25 mg/kg/일, 30 mg/kg/일, 35 mg/kg/일, 40 mg/kg/일, 또는 45 mg/kg/일의 투여량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈 치료는 35 mg/kg/일로 2 내지 7일 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈 치료는 35 mg/kg/일로 4 내지 5일 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈 치료는 25 mg/kg/일로 4 내지 5일 동안 투여된다.
일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드의 활성 형태인 마포스파미드는, 사이클로포스파미드의 투여에 의해 0.5 μg/mL 내지 10 μg/mL의 농도로 수득된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드의 활성 형태인 마포스파미드는, 사이클로포스파미드의 투여에 의해 1 μg/mL의 농도로 수득된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드 치료는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 또는 그 초과 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드는 100 mg/m2/일, 150 mg/m2/일, 175 mg/m2/일, 200 mg/m2/일, 225 mg/m2/일, 250 mg/m2/일, 275 mg/m2/일, 또는 300 mg/m2/일의 투여량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드는 정맥내로 (즉, i.v.) 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드 치료는 35 mg/kg/일로 2 내지 7일 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드 치료는 250 mg/m2/일 i.v.로 4 내지 5일 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파미드 치료는 250 mg/m2/일 i.v.로 4일 동안 투여된다.
일부 실시형태에서, 림프구고갈은 플루다라빈 및 사이클로포스파미드를 함께 환자에게 투여함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈은 25 mg/m2/일 i.v.로 투여되고, 사이클로포스파미드는 4일에 걸쳐 250 mg/m2/일 i.v.로 투여된다.
일 실시형태에서, 림프구고갈은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드의 투여, 이어서 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 의해 수행된다.
3. IL-2 레지멘
일 실시형태에서, IL-2 레지멘은 높은 용량 IL-2 레지멘을 포함하고, 높은 용량 IL-2 레지멘은 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하고, 이는 TIL의 치료 집단의 치료적 유효 부분을 투여한 날에 시작하여 정맥내로 투여되고, 알데스류킨 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체는 최대 14회 투여 동안, 허용 범위까지 8시간마다 15분 볼러스 정맥내 주입을 사용하여 0.037 mg/kg 또는 0.044mg/kg IU/kg (환자 체질량)의 용량으로 투여된다. 휴식 9일 후, 이 스케줄은 또 다른 14회 투여 동안, 총 최대 28회 투여 동안 반복될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-2는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6회 투여로 투여된다. 일부 실시형태에서, IL-2는 최대 6회 투여의 최대 투여량으로 투여된다.
일 실시형태에서, IL-2 레지멘은 점점 약한 IL-2 레지멘을 포함한다. 점점 약한 IL-2 레지멘은 문헌[O'Day, 등, J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61 및 Eton, 등, Cancer 2000, 88, 1703-9]에 기재되었고, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 일 실시형태에서, 점점 약한 IL-2 레지멘은 6시간에 걸쳐 정맥내로 투여된 18 × 106 IU/m2, 이어서 12시간에 걸쳐 정맥내로 투여된 18 × 106 IU/m2, 이어서 24시간에 걸쳐 정맥내로 투여된 18 × 106 IU/m2, 이어서 72시간에 걸쳐 정맥내로 투여된4.5 × 106 IU/m2을 포함한다. 이 치료 주기는 최대 4사이클 동안 28일마다 반복될 수 있다. 일 실시형태에서, 점점 약한 IL-2 레지멘은 1일째에 18,000,000 IU/m2, 2일째에 9,000,000 IU/m2, 및 3일째 및 4일째에 4,500,000 IU/m2를 포함한다.
일 실시형태에서, IL-2 레지멘은 0.10 mg/일 내지 50 mg/일의 용량으로 1, 2, 4, 6, 7, 14 또는 21일마다 페길화된 IL-2의 투여를 포함한다.
4. 추가의 치료 방법
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에게 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단의 치료적 유효 투여량을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에게 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 TIL 조성물의 치료적 유효 투여량을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 및 TIL 조성물 각각의 치료적 유효 투여 전에, 비-골수절제 림프구고갈 레지멘이 대상체에게 투여되도록 변형된 상기 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 비-골수절제 림프구고갈 레지멘이 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드의 투여, 그것에 뒤따르는 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈의 투여의 단계를 포함하도록 변형된 상기 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 대상체에게 TIL 세포를 투여한 후의 날에 시작하는 높은 용량 IL-2 레지멘으로 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함하도록 변형된 상기 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 고-용량 IL-2 레지멘이 허용 범위까지 8시간마다 15-분 볼러스 정맥내 주입으로서 투여된 600,000 또는 720,000 IU/kg을 포함하도록 변형된 상기 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 고형 종양이도록 변형된 상기 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 상기 암이 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 야기된 암, 두경부 암 (두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 포함), 교모세포종 (GBM 포함), 위장암, 신장암, 또는 신장 세포 암종이도록 변형된 상기 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 상기 암이 흑색종, HNSCC, 자궁경부암, NSCLC, 교모세포종 (GBM 포함), 및 위장암 이도록 변형된 상기 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 흑색종 이도록 변형된 상기 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 HNSCC 이도록 변형된 상기 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 자궁경부암 이도록 변형된 상기 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 NSCLC 이도록 변형된 상기 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 교모세포종 (GBM 포함) 이도록 변형된 상기 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 위장암 이도록 변형된 상기 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 과돌연변이된 암 이도록 변형된 상기 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 소아 과돌연변이된 암 이도록 변형된 상기 이전의 단락 중 임의의 것에 기재된 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 있는 대상체를 치료하기 위한 방법에서 사용하기 위한 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단을 제공하고, 상기 방법은 대상체에게 치료 TIL 집단의 치료적 유효 투여량을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 있는 대상체를 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 TIL 조성물을 제공하고, 상기 방법은 대상체에게 TIL 조성물의 치료적 유효 투여량을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 대상체에게 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단의 치료적 유효 투여량을 투여하거나 또는 대상체에게 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 TIL 조성물을 투여하기 전에, 비-골수절제 림프구고갈 레지멘이 투여되도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 비-골수절제 림프구고갈 레지멘이 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드의 투여, 그것에 뒤따르는 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈의 투여 단계를 포함하도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 환자에게 TIL 세포의 투여한 다음 날에 시작하는 고-용량 IL-2 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 고-용량 IL-2 레지멘이 허용 범위까지 8시간마다 15-분 볼러스 정맥내 주입으로서 투여된 600,000 또는 720,000 IU/kg을 포함하도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 고형 종양이도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 야기된 암, 두경부 암 (두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 포함), 교모세포종 (GBM 포함), 위장암, 신장암, 또는 신장 세포 암종이도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 흑색종, HNSCC, 자궁경부암, NSCLC, 교모세포종 (GBM 포함), 및 위장암 이도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 흑색종이도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 HNSCC 이도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 자궁경부암 이도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 NSCLC 이도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 교모세포종 (GBM 포함) 이도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 위장암 이도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 과돌연변이된 암 이도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암이 소아 과돌연변이된 암이도록 변형된 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료 TIL 집단의 치료적 유효 투여량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체의 암의 치료 방법에서 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단의 용도를 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TIL 조성물의 치료적 유효 투여량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체의 암의 치료 방법에서 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 TIL 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 비-골수절제 림프구고갈 레지멘을 대상체에게 투여하고 그리고 그 다음 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단의 치료적 유효 투여량 또는 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 TIL 조성물의 치료적 유효 투여량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체의 암의 치료 방법에서 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 치료 TIL 집단 또는 상기의 임의의 이전의 단락에 기재된 TIL 조성물의 용도를 제공한다.
실시예
본원에 포괄된 실시형태는 이제 다음의 실시예들을 참고하여 설명된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 본원에 포괄된 개시내용은 이러한 실시예들로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로 명백 해지는 임의의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1: PRE-REP 및 REP 프로세스를 위한 배지 제조
본 실시예는 비소세포 폐암종(NSCLC)을 포함한 다양한 종양 유형으로부터 유래된 종양 침윤 림프구(TIL)의 배양을 포괄하는 프로토콜에 사용하기 위한 조직 배양 배지의 제조 절차를 설명한다. 이 배지는 본원 및 실시예에 기재된 임의의 TIL의 제조에 사용될 수 있다.
CM1의 제조
냉장 보관으로부터 다음의 시약을 제거하고, 37℃ 수조에서 가온하였다: (RPMI1640, 인간 AB 혈청, 200mM L-글루타민). 여과하고자 하는 부피에 적절한 0.2 um 필터 유닛의 최상부 섹션에 각각의 성분을 첨가하여 하기 표 18에 따라 CM1 배지를 제조하였다. 4℃에서 저장한다.
Figure pct00048
사용 당일, 필요한 양의 CM1을 37℃ 수조에서 예열하고, 6000 IU/m1 IL-2를 첨가한다.
추가의 보충 - 표 41에 따른 필요에 따라.
Figure pct00049
CM2의 제조
상기 섹션 7.3에 따라, 제조된 CM1을 냉장고에서 제거하거나, 신선한 CM1을 제조한다. 냉장고에서 AIM-V®를 제거하고, 제조된 CM1을 동등 부피의 AIM-V®와 멸균 배지 병에서 혼합하여 필요한 양의 CM2를 제조하였다. 사용 당일, CM2 배지에 3000 IU/ml IL-2를 첨가하였다. 사용 당일, 3000 IU/ml IL-2로 충분한 양의 CM2를 제조하였다. CM2 배지 병에 그것의 명칭, 제조자의 이니셜, 여과일/제조일, 2-주 만료 날짜를 라벨링하고, 조직 배양이 필요할 때까지 4℃에서 보관하였다.
CM3의 제조
사용을 위해 필요한 날에 CM3을 제조하였다. CM3은 사용 당일 3000 IU/ml IL-2이 보충된 AIM-V® 배지와 동일하였다. IL-2 스톡 용액을 AIM-V의 병 또는 백에 직접 첨가하여, 실험 요구에 충분한 양의 CM3을 제조하였다. 부드럽게 셰이킹하여 잘 혼합하였다. AIM-V에 첨가한 직후 병에 "3000 IU/ml IL-2"로 라벨링하였다. CM3이 과잉인 경우, 배지 명칭, 제조자 이니셜, 배지 제조일, 및 그것의 만료일(제조 후 7일)을 라벨링한 병에 4℃에서 저장하였다. 4℃에서 7일 저장한 후, IL-2가 보충된 배지를 폐기하였다.
CM4의 제조
CM4는 2 mM G1utaMAXTM(최종 농도)를 추가로 보충하여, CM3과 동일하였다. CM3 1 L당, 10 ml의 200 mM G1utaMAXTM를 첨가하였다. IL-2 스톡 용액 및 G1utaMAXTM 스톡 용액을 AIM-V의 병 또는 백에 직접 첨가하여, 실험 요구에 충분한 양의 CM4를 제조하였다. 부드럽게 셰이킹하여 잘 혼합하였다. AIM-V에 첨가한 직후 병에 "3000 IL/nil IL-2 및 G1utaMAX "로 라벨링하였다. CM4가 과잉인 경우, 배지 명칭, "G1utaMAX", 및 그것의 만료일(제조 후 7일)을 라벨링한 병에 4℃에서 저장하였다. 4℃에서 7일 저장한 후, IL-2가 보충된 배지를 폐기하였다.
실시예 2: IL-2, IL-15, 및 IL-21 사이토카인 칵테일의 사용
본 실시예는 실시예 A 내지 G의 TIL 공정과 조합하여, 추가의 T 세포 성장 인자로서 작용하는 IL-2, IL-15, 및 IL-21 사이토카인의 사용을 설명한다.
본원에 기재된 공정들을 사용하여, TIL은 배양 시작 시에 실험의 한 군에서 IL-2의 존재 하에, 그리고 IL-2 대신에, 또 다른 군에 IL-2, IL-15, 및 IL-21의 조합의 존재 하에 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 종양으로부터 성장할 수 있다. 프리-REP 완료시에, 확장, 표현형, 기능(CD107a+ 및 IFN-γ) 및 TCR Vβ 레퍼토리에 대하여 배양물을 평가하였다. IL-15 및 IL-21는 본원의 다른 곳 및 문헌[Gruijl, 등]에 기재되어 있으며, IL-21은 조절 T 세포의 높은 세포독성 잠재적 및 낮은 부차적인 확장으로 CD27+CD28+ 종양 침윤 림프구의 확장을 촉진하고, 문헌[Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/)].
결과는 IL-2, IL-15, 및 IL-21 처리된 조건에서의, CD4+ 및 CD8+ 세포 모두에서, 향상된 TIL 확장(>20%)이 IL-2단독 조건과 비교하여 관찰될 수 있음을 보여줄 수 있다. IL-2 단독 배양과 비교하여, IL-2, IL-15, 및 IL-21 처리된 배양물로부터 수득된 TIL에서 왜곡된 TCR Vβ 레퍼토리를 갖는 주로 CD8+ 집단으로 치우침이 있었다. IL-2 단독 처리된 TIL과 비교하여, IL-2, IL-15, 및 IL-21 처리된 TIL에서 IFN-γ 및 CD107a가 상승하였다.
실시예 3: 감마선-조사된 주변 단핵 세포의 개별 로트 적격화
본 실시예는 예시적인 본원에 기재된 예시적인 방법에서 동종이계 피더 세포로 사용하기 위한 감마선-조사된 주변 단핵 세포(PBMC, 또한 MNC로 알려져 있음)의 개별 로트를 적격화하기 위한 새로운 단축된 절차를 설명한다.
각각의 조사된 MNC 피더 로트는 개체 공여체로부터 제조되었다. 정제된 항-CD3(클론 OKT3) 항체 및 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에 REP에서 TIL을 확장하는 그것의 능력에 대해 각각의 로트 또는 공여체를 개별적으로 선별하였다. 또한 피더 세포의 각각의 로트를 TIL 첨가 없이 시험하여, 받은 감마 방사선 선량이 복제 불능시키는데 충분한지 검증하였다.
배경
TIL의 REP를 위해 감마선-조사된, 성장-억제된 MNC 피더 세포가 필요하였다. 피더 MNC 상의 멤브레인 수용체는 항-CD3(클론 OKT3) 항체에 결합하고, REP 플라스크에서 TIL에 교차결합하여, TIL이 확장되도록 자극한다. 개별 공여체로부터 채취한 전혈의 백혈구성분채집술로부터 피더 로트를 제조하였다. 백혈구성분채집술 생성물을 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 상에서 원심분리하고, 세척하고, 조사하고, GMP 조건 하에 동결보존하였다.
이는 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 초래할 수 있으므로, TIL 요법을 받은 환자에게는 실행가능한 피더 세포를 주입하지 않는 것이 중요하다. 따라서 피더 세포는 감마-조사로 세포를 투약하여 성장-억제되어, 이중 가닥 DNA가 절단되고, 재배양 시 MNC 세포의 세포 생존력이 손실된다.
평가 기준 및 실험 설정
피더 로트를 두가지 기준: 1) 공동배양 시 TIL을 >100-배 확장시키는 능력 및 2) 그것의 복제 불능에 따라 평가하였다.
직립 T25 조직 배양 플라스크에서 성장된 2개의 1차 pre-REP TIL 라인을 사용하여 미니-REP 형식으로 피더 로트를 시험하였다. 각각의 TIL 라인은 REP에서의 활성화에 대응하여 증식하는 능력이 고유하기 때문에, 피더 로트는 2개의 별개의 TIL 라인에 대해 시험되었다. 대조군으로서, 이력상 상기 기준을 충족하는 것으로 밝혀진 많은 조사된 MNC 피더 세포는 테스트 로트와 함께 실행되었다.
단일 실험에서 시험된 모든 로트가 동등한 테스트를 받도록 보장하기 위해, 모든 조건 및 모든 피더 로트를 테스트하기 위해 동일한 pre-REP TIL 라인의 충분한 스톡을 사용할 수 있었다.
시험된 피더 세포의 각각의 로트에 대해, 총 6개의 T25 플라스크: Pre-REP TIL 라인 #1(2개의 플라스크); Pre-REP TIL 라인 #2(2개의 플라스크); 및 피더 대조군(2개의 플라스크)이 있었다. TIL 라인 #1 및 #2를 포함하는 플라스크를 TIL을 확장하는 피더 로트의 능력에 대하여 평가하였다. 피더 대조군 플라스크는 피더 로트의 복제 불능에 대하여 평가하였다.
실험 프로토콜
-2/3일째, TIL 라인의 해동
CM2 배지를 제조하였다. 37℃ 수조에서 CM2를 가온하였다. 3000 IU/ml IL-2이 보충된 40 ml의 CM2를 제조하였다. 사용할 때까지 보온시킨다. 사용된 TIL 라인의 명칭이 라벨링된 2개의 50 ml 원뿔형 튜브 각각에 IL-2 없이 미리 데운 CM2 20 ml을 넣었다. LN2 저장소에서 2개의 지정된 프리-REP TIL 라인을 제거하고, 바이알을 조직 배양실로 이동시켰다. 소량의 얼음이 남을 때까지 37℃ 수조의 밀봉된 지퍼 보관백에 넣어 바이알을 해동시켰다.
멸균 이송 피펫을 사용하여, 바이알의 내용물을 제조된, 라벨링된 50 ml 원추형 튜브내 20 ml의 CM2로 즉시 이동시켰다. IL-2 없이 CM2를 사용하여 40 ml로 QS하여, 세포를 세척하였다. 400 x CF에서 5분간 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고, 3000 IU/ml IL-2이 보충된 5 ml 따뜻한 CM2에 재현탁하였다.
자동화 세포 계수기를 사용한 세포 카운팅을 위해 작은 분취액 (20 μl)을 이중으로 제거하였다. 카운트를 기록한다. 계수하는 동안, TIL 세포가 있는 50 ml 원추형 튜브를 가습된 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 넣고, 뚜껑을 느슨하게 풀어서 가스를 교환시켰다. 3000 IU/ml에서 IL-2가 보충된 CM2에서 세포 농도를 결정하고, TIL을 1 x 106 세포/ml로 희석하였다.
mini-REP의 0일까지 가습된 37℃ 인큐베이터에서 필요에 따라 많은 웰들에서 24-웰 조직 배양판의 2 ml/웰에서 배양하였다. 혼란 및 잠재적인 교차-오염을 피하기 위해 별도의 24-웰 조직 배양판에서 상이한 TIL 라인을 배양하였다.
0일째, Mini-REP 개시
시험될 피더 로트의 수에 충분한 CM2 배지를 제조하였다. (예를 들어, 한꺼번에 4개의 피더 로트를 시험하기 위해, 800 ml의 CM2 배지를 제조하였다). 상기 제조된 CM2의 일부를 분취하고, 세포 배양을 위해 3000 IU/ml IL-2를 보충하였다. (예를 들어, 한꺼번에 4개의 피더 로트를 시험하기 위해, 3000 IU/ml IL-2가 포함된 500 ml의 CM2 배지를 제조하였다).
교차-오염을 방지하기 위해 각각의 TIL 라인을 별도로 작업하고, TIL 배양물이 있는 24-웰 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고, BSC로 이동시켰다.
멸균 이송 피펫 또는 100-1000 μl 피펫터 및 팁을 사용하여, 사용할 TIL의 각각의 웰에서 약 1ml의 배지를 제거하고, 24-웰 조직 배양판의 미사용된 웰에 넣었다.
신선한 멸균 이송 피펫 또는 100-1000 μl 피펫터 및 팁을 사용하여, 나머지 배지를 웰들에서TIL과 혼합하고, 세포를 재현탁시킨 다음 세포 현탁액을 TIL 명칭이 라벨링된 50 ml 원추형 튜브로 이동시키고, 부피를 기록하였다.
예비 배지로 웰들을 세척하고, 그 부피를 동일한 50 ml 원추형 튜브로 이동시켰다. 400 x CF에서 세포를 회전시켜 세포 펠렛을 수집하였다. 배지 상청액에서 흡인하고, 3000 IU/ml IL-2를 함유하는 CM2 배지 2~5 ml에 세포 펠렛을 재현탁시키고, 수확된 웰들의 수와 및 펠렛의 크기를 기반으로 사용될 부피 - 부피는 >1.3 x 106 세포/ml의 농도가 보장되는데 충분해야 한다.
혈청학적 피펫을 사용하여, 세포 현탁액을 철저하게 혼합하고, 부피를 기록하였다. 자동화 세포 계수기를 사용하여 세포 카운트를 위해 200 μl를 제거하였다. 계수하는 동안, TIL 세포가 있는 50 ml 원추형 튜브를 가습된, 5% CO2, 37℃인큐베이터에 넣고, 뚜껑을 느슨하게 풀어서 가스를 교환시켰다. 카운트를 기록하였다.
TIL 세포를 함유하는 50 ml 원추형 튜브를 인큐베이터로부터 제거하고, 3000 IU/ml IL-2가 보충된 따뜻한 CM2에 1.3 x106 세포/ml의 농도로 세포를 재현탁시켰다. 50 ml 원추형 튜브를 뚜껑이 느슨한 인큐베이터로 돌려보냈다.
제2 TIL 라인에 대해 상기 단계를 반복하였다.
TIL을 실험용 T25 플라스크에 넣기 직전에, TIL을 하기에 따라 1.3 x 105 세포/ml의 최종 농도로 1:10으로 희석하였다.
MACS GMP CD3 순수한 (OKT3) 작업 용액 제조
4℃ 냉장고에서 OKT3의 스톡 용액(1mg/ml)을 꺼내어, BSC에 넣었다. 30ng/ml의 OKT3의 최종 농도를 mini-REP의 배지에 사용하였다.
실험의 각각의 T25 플라스크에서 20 ml를 위해 600ng의 OKT3이 필요하였으며; 이는 각각의 20 ml에 대해 10 μg/ml 용액 60 μl, 또는 각각의 피더 로트에 대해 시험된 6개의 플라스크 모두에 대해 360 μl에 해당하였다.
시험된 각각의 피더 로트에 대해, 10 μg/ml의 작업 농도로 1mg/ml OKT3의 1:100 희석액 400 μl을 제조한다(예를 들어, 4개의 피더 로트를 한꺼번에 시험하기 위해, 1 mg/ml OKT3: 16 μl의 1 mg/ml OKT3 + 1.584 ml의 CM2 배지(3000 IU/ml IL-2를 가짐)의 1600 μl의 1:100 희석액을 만든다)
T25 플라스크 제조
피더 세포를 제조하기 전에, 각각의 플라스크를 라벨링하고, 플라스크를 CM2 배지로 채웠다. 37℃ 가습된 5% CO2 인큐베이터에 플라스크를 넣고, 나머지 구성요소들을 추가하는 것을 기다리는 동안 배지를 따뜻하게 유지시킨다. 피더 세포가 일단 제조되면, 구성요소가 각각의 플라스크의 CM2에 첨가될 것이다.
Figure pct00050
피더 세포 제조
이 프로토콜에 대해 시험된 로트 당 최소의 78 x 106개의 피더 세포가 필요하였다. SDBB에 의해 냉동된 각각의 1 ml 바이알은 냉동 시 100 x 106개의 생존가능 세포를 가졌다. LN2 저장에서 해동 시 50% 회수율을 가정하면, 로트 당 적어도 2개의 1 ml 피더 세포 바이알을 해동하여 각각의 REP에 대해 추정된 100 x 106개의 생존가능 세포를 제공하는 것이 권고되었다. 대안적으로, 1.8 ml 바이알에 공급하는 경우, 단 하나의 바이알만 충분한 피더 세포를 제공하였다.
피더 세포를 해동하기 전에, 시험될 각각의 피더 로트에 대해 IL-2 없이 대략 50 ml의 CM2를 예열하였다. LN2 저장소에서 지정된 피더 로트 바이알을 제거하고, 지퍼 저장백에 넣고, 바이알을 얼음 위에 놓았다. 37℃ 수조에 침지시켜서, 밀봉된 지퍼 저장백 내부의 바이알을 해동시켰다. 지퍼백으로부터 바이알을 제거하고, 70% EtOH로 분무하거나 닦아내고, 바이알을 BSC로 이동시켰다.
이송 피펫을 사용하여 즉시 피더 바이알의 내용물을 50 ml 원추형 튜브에 있는 30 ml의 따뜻한 CM2로 옮겼다. 작은 부피의 CM2로 바이알을 세척하여, 바이알내 임의의 잔류 세포를 제거하였다. 400 x CF에서 5분간 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고, 4ml의 따뜻한 CM2 플러스 3000 IU/ml IL-2에 재현탁시켰다. 자동화 세포 계수기를 사용하여 세포 카운팅을 위해 200 μl을 제거하였다. 카운트를 기록하였다.
따뜻한 CM2 플러스 3000 IU/ml IL-2에 1.3 x 107 세포/ml로 세포를 재현탁시켰다. 1.3 x 106 세포/ml 내지 1.3 x 105 세포/ml로 TIL 세포를 희석하였다.
공동-배양물 셋업
1.3 x 106 세포/ml 내지 1.3 x 105 세포/ml로 TIL 세포를 희석하였다. 15 ml 원추형 튜브에 4.5ml의 CM2 배지를 첨가하였다. 인큐베이터로부터 TIL 세포를 제거하고, 10 ml 혈청학적 피펫을 사용하여 잘 재현탁시켰다. 1.3 x 106 세포/ml TIL 현탁액으로부터 0.5ml의 세포를 제거하고, 15 ml 원추형 튜브에 있는 4.5ml의 배지에 첨가하였다. TIL 스톡 바이알을 인큐베이터로 반환하였다. 잘 혼합하였다. 제2 TIL 라인에 대해 반복하였다.
인큐베이터에서 BSC로 단일 피더 로트에 대해 사전-가온된 배지가 있는 플라스크로 이동시켰다. 1 ml 피펫 팁으로 상하로 몇 번 피펫팅하여, 피더 세포를 혼합하고, 해당 피더 로트의 각각의 플라스크에 1 ml(1.3 x 107개의 세포) 이동시켰다. 각각의 플라스크에 60 μl의 OKT3 작업 스톡(10 μg/ml)을 첨가하였다. 2개의 대조군 플라스크를 인큐베이터로 돌려보냈다.
1 ml(1.3 x 105)의 각각의 TIL 로트를 상응하여 표지된 T25 플라스크로 이동시켰다. 플라스크를 인큐베이터로 되돌리고, 똑바로 인큐베이션하였다. 5일째까지 방해하지 않았다.
시험된 모든 피더 로트에 대해 반복하였다.
5일째, 배지 변경
3000 IU/ml IL-2로 CM2를 제조하였다. 각각의 플라스크에 10 ml가 필요하다. 10 ml 피펫을 사용하여, 3000 IU/ml IL-2와 함께 10 ml의 따뜻한 CM2를 각각의 플라스크로 이동시켰다. 플라스크를 인큐베이터로 되돌리고, 7일째까지 똑바로 인큐베이션하였다. 시험된 모든 피더 로트에 대해 반복하였다.
7일째, 수확
인큐베이터로부터 플라스크를 제거하고, 플라스크 바닥의 세포층을 방해하지 않도록 주의하면서 BSC로 옮겼다. 플라스크 바닥에서 자라는 세포를 방해하지 않으면서, 각각의 테스트 플라스크에서 10 ml의 배지를 제거하고 각각의 대조군 플라스크에서 15 ml의 배지를 제거하였다.
10 ml 혈청학적 피펫을 사용하여, 세포를 나머지 배지에 재현탁시키고, 잘 혼합하여 임의의 세포 덩어리를 분해하였다. 세포 현탁액을 피펫팅으로 철저하게 혼합한 후, 세포 카운팅을 위해 200 μl 제거하였다. 자동 세포 계수기 장비와 함께 공조하여, 적절한 표준 작동 절차를 사용하여 TIL을 계수하였다. 7일째에 카운트를 기록하였다.
시험된 모든 피더 로트에 대해 반복하였다.
피더 대조군 플라스크를 복제 무능에 대해 평가하고, TIL을 함유하는 플라스크를 하기 표 TT에 따라 0일째부터 배수 확장에 대해 평가하였다.
7일째, 피더 대조군 플라스크를 14일째까지 계속
피더 대조군 플라스크의 7일 카운트를 완료한 후, 3000 IU/ml IL-2를 함유하는 15ml의 신선한 CM2 배지를 각각의 대조군 플라스크에 첨가하였다. 대조군 플라스크를 인큐베이터로 되돌리고, 14일째까지 똑바로 인큐베이션하였다.
14일째, 피더 대조군 플라스크의 연장된 비-증식
인큐베이터로부터 플라스크를 제거하고, 플라스크 바닥의 세포층을 방해하지 않도록 주의하면서 BSC로 옮겼다. 플라스크 바닥에서 자라는 세포를 방해하지 않으면서, 각각의 대조군 플라스크에서 대략 17ml의 배지를 제거하였다. 5 ml 혈청학적 피펫을 사용하여, 세포를 나머지 배지에 재현탁시키고, 잘 혼합하여 임의의 세포 덩어리를 분해하였다. 각각의 플라스크의 부피를 기록하였다.
세포 현탁액을 피펫팅으로 철저하게 혼합한 후, 세포 카운팅을 위해 200 μl 제거하였다. 자동 세포 계수기 장비와 함께 공조하여, 적절한 표준 작동 절차를 사용하여 TIL을 계수하였다. 카운트를 기록하였다.
시험된 모든 피더 로트에 대해 반복하였다.
결과 및 허용 기준
결과
감마 조사 선량은 피더 세포 복제를 불능시키기에 충분하였다. 모든 로트는 평가 기준을 만족시킬 것으로 예상되며, 0일째와 비교하여 REP 배양 7일째에 나머지 피더 세포의 총 생존세포수의 감소를 또한 입증하였다.
모든 피더 로트는 REP 배양 7일까지 TIL 성장의 100-배 확장의 평가 기준을 충족할 것으로 예상되었다.
피더 대조군 플라스크의 14일 카운트는 7일째에 나타난 비-증식성 경향을 계속할 것으로 예상되었다.
허용 기준
다음의 허용 기준은 피더 세포의 각각의 로트에 대해 시험된 각각의 복제 TIL 라인에 대해 충족되었다
허가는 아래와 같이 2-배였다(하기 표 27에 설명됨).
Figure pct00051
30 ng/ml의 OKT3 항체 및 3000 IU/ml IL-2의 존재 하에 배양될 때 방사선 선량이 MNC 피더 세포 복제를 불능시키는데 충분한지 평가하였다. 복제 무능은 REP의 7일 및 14일째에 자동화 세포 카운팅에 의해 결정된 대로 총 생존가능 세포 수(TVC)에 의해 평가하였다.
허용 기준은 "성장 없음"이며, 이는 총 생존가능 세포 수가 REP의 0일째에 배양에 투입된 초기 생존가능 세포 수로부터 7일 및 14일째에 증가되지 않았음을 의미한다.
TIL 확장을 뒷받침하는 피더 세포의 능력을 평가하였다. TIL 성장은 REP의 0일째에 배양 개시로부터 REP의 7일째까지의 생존가능 세포의 배수 확장 관점에서 측정하였다. 7일째에, TIL 배양은 자동화 세포 카운팅에 의해 평가된 바와 같이, 최소 100-배 확장(즉, REP 0일째에 배양에 투입된 총 생존 TIL 세포 수의 100배 이상)을 달성하였다.
허용 기준을 충족하지 않는 MNC 피더 로트의 비상 테스트
MNC 피더 로트가 상기 설명된 허용 기준 중 하나를 충족하지 못한 경우, 간단한 실험자 오류를 그의 원인으로 제외하기 위해 로트를 재시험하기 위해 다음의 단계를 수행할 것이다.
로트의 2개 이상의 위성 테스트 바이알이 남아있는 경우 로트를 재시험하였다. 로트의 남아있는 위성 테스트 바이알이 하나 있거나 없는 경우, 위에 열거된 허용 기준에 따라 로트가 실패한 것이다.
적격화되기 위해서는 해당 로트와 대조군 로트가 위의 허용 기준을 충족해야 하였다. 이들 기준을 충족하면, 로트는 사용을 위해 방출되었다.
실시예 4: 감마선-조사된 말초 혈액 단핵 세포의 개별 로트 적격화
본 실시예는 본원에 기재된 예시적인 방법에서 동종이계 피더 세포로 사용하기 위한 감마선-조사된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 개별 로트를 적격화하기 위한 새로운 단축된 절차를 설명한다. 본 실시예는 TIL의 임상 로트 생산에 사용하기 위한, 조사된 PBMC 세포 로트의 평가를 위한 프로토콜을 제공한다. 각각의 조사된 PBMC 로트는 개체 공여체로부터 제조하였다. 100개 이상의 적격화 프로토콜 과정에서, 모든 경우에, SDBB(San Diego 혈액 은행)로부터의 조사된 PBMC 로트가 REP 7일째에 TIL을 >100-배 확장하는 것으로 나타났다. 이러한 변형된 적격화 프로토콜은 SDBB로부터의 조사된 공여체 PBMC 로트에 적용하기 위한 것으로, 받은 감마 방사선 선량이 그들을 복제 불능시키기에 충분한지 검증하기 위해 추가로 시험하였다. 이들이 14일 동안 복제 불능을 유지한다는 사실이 입증되면, 공여체 PBMC 로트는 TIL의 임상 로트를 생산하는데 사용하기에 "적격화된" 것으로 간주되었다.
배경
감마선-조사된, 성장-억제된 PBMC는 TIL의 현재 표준 REP에 필요하였다. PBMC 상의 멤브레인 수용체는 항-CD3(클론 OKT3) 항체와 결합하고, 배양 시에 TIL에 가교결합하여, TIL이 확장되도록 자극한다. PBMC 로트는 개별 공여체로부터 채취한 전혈의 백혈구성분채집술로부터 제조하였다. 백혈구성분채집술 생성물을 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 상에서 원심분리하고, 세척하고, 조사하고, GMP 조건 하에 동결보존하였다.
이는 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 초래할 수 있으므로, TIL 요법을 받은 환자에게는 실행가능한 PBMC를 주입하지 않는 것이 중요하다. 따라서 공여체 PBMC는 감마-조사로 세포를 투약하여 성장-억제되어, 이중 가닥 DNA가 절단되고, 재배양 시 PBMC의 세포 생존력이 손실된다.
평가 기준
7.2.1 조사된 PBMC 로트에 대한 평가 기준은 그것의 복제 불능이었다.
실험 설정
직립 T25 조직 배양 플라스크를 사용하여, TIL과 공배양되는 것처럼 피더 로트를 미니-REP 형식으로 시험하였다. 대조군 로트: 이력상 7.2.1의 기준을 충족하는 것으로 밝혀진, 조사된 PBMC의 한 로트는, 대조군으로서 실험 로트와 함께 실행되었다. 시험된 조사된 공여체 PBMC의 각각의 로트에 대하여, 중복 플라스크를 실행하였다.
실험 프로토콜
0일째
시험할 공여체 PBMC의 각각의 로트에 대하여 약 90 ml의 CM2 배지를 제조하였다. 37℃ 수조에서 CM2를 따뜻하게 유지하였다. 6 x 106 IU/ml IL-2의 분취약을 해동하였다. 후드에 배치하기 전에 70% EtOH로 닦아, CM2 배지를 BSC로 되돌렸다. 시험된 PBMC의 각각의 로트에 대해, 약 60ml의 CM2를 별도의 멸균 병으로 제거하였다. 해동된 6 x 106 IU/ml 스톡 용액으로부터의 IL-2를 이 배지에 최종 농도 3000 IU/ml로 첨가하였다. 보충되지 않은 CM2와 구별하기 위해 이 병을 "CM2/IL2"(또는 유사한)로 라벨링하였다.
OKT3 제조
4℃ 냉장고에서 항-CD3(OKT3) 스톡 용액을 꺼내어, BSC에 넣었다. 30ng/ml의 OKT3의 최종 농도를 mini-REP의 배지에 사용하였다. 1 mg/ml 스톡 용액으로부터 항-CD3(OKT3)의 10 μg/ml 작업 용액을 제조하였다. 필요할 때까지 냉장고에 보관하였다.
시험된 각각의 PBMC 로트에 대해, 항-CD3(OKT3) 스톡의 1:100 희석액 150 μl을 제조하였다. 예를 들어, 4개의 PBMC 로트를 한꺼번에 시험하기 위해, 3000 IU/ml IL-2이 보충된 594 μl의 CM2에 6 μl의 1 mg/ml 스톡 용액을 첨가하여, 600 μl의 10 μg/ml 항-CD3(OKT3)을 제조하였다.
플라스크 제조
라벨링한 T25 플라스크에 CM2/IL-2의 플라스크당 19 ml를 첨가하고, 37℃로 플라스크를 두고, 가습하고, 세포 제조동안 5% CO2 인큐베이터에 넣었다.
조사 PBMC 제조
시험될 PBMC 로트의 바이알을 LN2 저장소로부터 회수하였다. 해동 전에 이들을 -80℃에 두거나, 드라이아이스 상에서 보관하였다. 해동되는 각각의 로트에 대해 30 ml의 CM2(IL-2 보충물 없음)를 50 ml 원추형 튜브에 넣었다. 해동되는 PBMC의 상이한 로트 번호로 각각의 튜브를 라벨링하였다. 튜브를 단단히 캡핑하고, 사용 전에 37℃ 수조에 두었다. 필요에 따라, 50 ml 원추형 튜브를 BSC로 되돌리고, 후드에 넣기 전에 70% EtOH로 닦았다.
차가운 저장소로부터 바이알 PBMC를 제거하고, 37℃ 수조내 부유 튜브 랙에 넣어 해동하였다. 소량의 얼음이 바이알에 남을 때까지 해동을 진행시켰다. 멸균 이송 피펫을 사용하여, 50 ml 원추형 튜브에 있는 30 ml의 CM2에 바이알의 내용물을 즉시 이동시켰다. 약 1ml의 배지를 튜브로부터 제거하여 바이알을 세정하고; 50 ml 원추형 튜브로 세정을 되돌렸다. 단단히 캡핑하고, 부드럽게 스월링하여 세포를 세척하였다.
실온에서 400 x g에서 5분간 원심분리하였다. 상청액을 흡인시키고, 1000 μl 피펫 팁을 사용하여 따뜻한 CM2/IL-2 1 ml에 세포 펠렛을 재현탁하였다. 대안적으로, 배지를 첨가하기 전에, 캡핑된 튜브를 비어있는 튜브 랙을 따라 끌어서 세포 펠렛을 재현탁하였다. 세포 펠렛을 재현탁한 후, CM2/IL-2 배지를 사용하여 부피를 4ml로 만들었다. 부피를 기록하였다.
자동화 세포 계수기를 사용하여 세포 카운팅을 위해 소량 분취액(예를 들어, 100 μl)을 제거하였다. 특정 자동화 세포 계수기 SOP에 따라 카운트를 이중으로 수행하였다. 세포 카운트를 수행하기 전에 PBMC의 희석을 수행하는 것이 가장 필요하였다. 권고된 시작 희석은 1:10이었지만, 이는 사용된 세포 계수기의 유형에 따라 변화되었다. 카운트를 기록하였다.
CM2/IL-2 배지를 사용하여 PBMC의 농도를 1.3 x 107 세포/ml로 조정하였다. 부드럽게 스월링하거나 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 흡인하여 잘 혼합하였다.
배양 플라스크 셋업
2개의 라벨링된 T25 플라스크를 조직 배양 인큐베이터로부터 BSC로 되돌렸다. 항-CD3/OKT3의 10 μg/ml 바이알을 BSC에 되돌렸다. 1ml의 1.3 x 107 PBMC 세포 현탁액을 각각의 플라스크에 첨가하였다. 60 μl의 10 μg/ml 항-CD3/OKT3을 각각의 플라스크에 첨가하였다. 캡핑된 플라스크를 방해없이 성장 14일 동안 조직 배양 인큐베이터로 되돌렸다. 다음 로트에 필요할 때까지 항-CD3/OKT3 바이알을 냉장고에 다시 넣었다. 평가되는 PBMC의 각각의 로트에 대하여 반복하였다.
14일째, PBMC의 비-증식 측정
중복된 T25 플라스크를 BSC로 되돌렸다. 각각의 플라스크에 대해, 신선한 10 ml 혈청학적 피펫을 사용하여 각각의 플라스크에서 약 17ml를 제거한 다음, 주의하여 나머지 배지를 당겨 플라스크에 남아있는 부피를 측정하였다. 부피를 기록하였다.
동일한 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 샘플을 잘 혼합하였다.
계수를 위해 각 플라스크에서 200 μl 샘플을 제거하였다. 자동화 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하였다. 평가되는 PBMC의 각각의 로트에 대해 단계들 7.4.26 - 7.4.31을 반복하였다.
결과 및 허용 기준
결과
감마 조사 선량은 피더 세포 복제를 불능시키기에 충분할 것으로 예상되었다. 모든 로트는 평가 기준을 만족시킬 것으로 예상되었으며, 0일째와 비교하여 REP 배양 14일째에 나머지 피더 세포의 총 생존세포수의 감소를 또한 입증하였다.
허용 기준
다음의 허용 기준은 시험되는 각각의 조사된 공여체 PBMC 로트에 대해 충족되었으며: "성장 없음" - 14일째 생존가능 세포의 총 수가 REP의 0일째에 배양물에 투입된 초기 생존가능 세포 수보다 적다는 것을 의미한다.
허용 기준을 충족하지 않는 PBMC 로트의 비상 테스트.
조사된 공여체 PBMC 로트가 상기 허용 기준을 충족하지 못한 경우에, 다음의 단계를 취하여 로트를 재시험하여 그 실패의 원인으로서 단순 실험자 오류를 제외하였다. 로트의 2개 이상의 위성 바이알이 남아있는 경우 로트를 재시험하였다. 로트의 남아있는 위성 바이알이 하나 또는 아예 없는 경우, 위에 열거된 허용 기준에 따라 로트가 실패한 것이다.
자격을 부여받기 위해, 비상 테스트를 거치는 PBMC 로트는 대조군 로트와 문제의 로트의 복제 둘 모두가 허용 기준을 달성하였다. 이들 기준을 충족하면, 로트는 사용을 위해 방출되었다.
실시예 5: IL-2 스톡 용액(CELLGENIX)의 제조
본 실시예는 rhIL-2를 사용하는 것을 포함하는 것을 포함하여, 본원 및 실시예에 기재된 모든 것을 포함하는, 정제된, 동결건조된 재조합 인간 인터류킨-2를 추가의 조직 배양 프로토콜에 사용하기에 적합한 스톡 샘플로 용해시키는 방법을 설명한다.
절차
0.2% 아세트산 용액(HAc)을 제조하였다. 이전된 29ㅍmL 멸균수를 50 mL 원추형 튜브에 이동시켰다. lmL 1N 아세트산을 50ㅍmL 원추형 튜브에 첨가하였다. 튜브를 2~3회 뒤집어 잘 혼합하였다. Steriflip 필터를 사용하여 여과하여 HAc 용액을 멸균하였다.
PBS에서 1% HSA를 제조하였다. 150 mL 멸균 필터 유닛의 96 mL PBS에 4mL의 25% HSA 스톡 용액에 첨가하였다. 용액을 여과하였다. 4℃에서 저장하였다. 제조된 rhIL-2의 각각의 바이알에 대해, 양식을 작성하였다.
rhIL-2 스톡 용액(6 x 106 IU/mL 최종 농도)을 제조하였다. rhIL-2의 각각의 로트는 상이하였으며, 및 필요한 정보는 제조업체의 분석증명서(COA)에서 찾았다: 예컨대: 1) 바이알 당 rhIL-2의 질량(mg), 2) rhIL-2의 고유 활성도(IU/mg) 및 3) 권고된 0.2% HAc 재구성 부피(mL).
하기 식을 사용하여 rhIL-2 로트에 필요한 1% HSA의 부피를 계산하였다:
Figure pct00052
예를 들어, CellGenix'의 rhIL-2 로트 10200121 COA에 따르면, lmg의 바이알에 대한 고유 활성도는 25x106 IU/mg이다. 2mL 0.2% HAc에서 rhIL-2를 재구성할 것을 권장한다.
Figure pct00053
IL-2 바이알의 고무 마개를 알코올 와이프로 와이핑하였다. 3mL 주사기에 부착된 16G 바늘을 사용하여, 권고된 부피의 0.2% HAc를 바이알에 주입하였다. 바늘을 뺄 때 스토퍼가 빠지지 않도록 주의하였다. 바이알을 3회 뒤집고, 모든 분말이 용해될 때까지 스월링하였다. 스토퍼를 조심스럽게 제거하고 알코올 와이프 위에 따로 두었다. 1% HSA의 계산된 부피를 바이알에 첨가하였다.
rhIL-2 용액의 저장. 단기 저장(72시간 미만)의 경우, 바이알을 4℃에서 저장하였다. 장기 저장(72시간 초과)의 경우, 바이알을 더 작은 부피로 분취하여, 사용할 준비가 될 때까지 -20℃에서 저온바이알에 보관한다. 냉동/해동 사이클을 피하였다. 제조일로부터 6개월후 만료되었다. Rh-IL-2 라벨에는 공급업체 및 카탈로그 번호, 로트 번호, 만료일, 오퍼레이터 이니셜, 분취액의 농도 및 부피가 포함되었다.
실시예 6: 동결보존 프로세스
본 실시예는 CryoMed 속도 제어 냉동고, 모델 7454(Thermo Scientific)를 사용하여 실시예 G에 기재된 단축된, 폐쇄된 절차로 제조된 TIL의 동결보존 프로세스 방법을 설명한다.
사용된 장비는 아래와 같았다: 알루미늄 카셋트 홀더 랙(CS750 냉동고 백과 호환가능), 750 mL 백용 냉동저장 카셋트, 저압(22 psi) 액체 질소 탱크, 냉장고, 열전쌍 센서 (백용 리본 유형), 및 CryoStore CS750 냉동 백(OriGen Scientific).
동결 프로세스는, 핵생성부터 -20℃까지 분당 0.5℃의 속도로 그리고 -80℃의 최종 온도까지 분당 1℃의 냉각 속도를 제공한다. 프로그램 파라미터는 다음과 같다: 단계 1 - 4℃에서 대기; 2상: 1.0℃/분(샘플 온도) -4℃까지; 단계 3: 20.0℃/분(챔버 온도) -45℃까지; 단계 4: 10.0℃/분(챔버 온도) -10.0℃까지; 단계 5: 0.5℃/분(챔버 온도) -20℃까지; 및 단계 6: 1.0℃/분(샘플 온도) -80℃까지.
실시예 7: 항-PD-1 항체에 의한 NSCLC 치료
환자 집단:
치료경험이 없는 NSCLC 또는 화학요법 후 그러나 항-PD-1/PD-L1 경험이 없는 집단
치료 스케줄:
종양 단편, 최대 4회 투여의 항-PD-1/PD-L1로 치료, 1차 재발 환자를 동결-보존되고 즉각적인 진행 시 사용할 준비가 된 TIL 생성물로 치료. 1차 재발 환자는 2회 투여 후 진행되었을 수 있다.
재발 환자 또한 진행 시 치료받을 수 있다(타이밍은 수개월에서 수년후로 다양할 수 있음).
전체 강도 IL-2 최대 6회 투여.
앞서 언급한 동일한 제조 순열로 추가로 고려할 환자 집단:
ㆍ 치료경험이 없는 NSCLC 또는 화학요법 후 그러나 항-PD-1/PD-L1 경험이 없는 집단.
ㆍ 치료경험이 없는 NSCLC 또는 화학요법 후 그러나, 저발현의 PD-L1을 갖는, 항-PD-1/PD-L1 경험이 없는 집단.
ㆍ 치료경험이 없는 NSCLC 또는 화학요법 후 그러나, 저발현의 PD-L1을 갖고/갖거나, 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 항-PD-1/PD-L1 경험이 없는 집단. (예를 들어, CT 상에서 큰 부피로 정의된, 횡단면이나 관상면에서 측정된 최대 종양 직경이 7 cm 초과이거나 팽윤된 림프절이 20 mm 이상의 단축 직경을 가질 때 큰 부피의 질환이 나타난다; 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌[Samejima, J., Japanese Journal of Clinical Oncology, 45(11): 1050-10541 2015]을 참조한다).
실시예 8: GEN 3 예시적인 공정
실시예는 Gen 2와 Gen 3 공정 사이에 비교를 제공한다. 본 실시예는 강건한 TIL 확장 플랫폼의 개발을 기술한다. Gen 2 공정으로 변형은 오퍼레이터 개입의 수를 감소시킴에 의해 위험을 감소시키고 제조 공정을 간소화하고, 전반적으로 제조 시간을 감소시키고, 시약의 사용을 최적화하고, 상업적 규모로 고-처리량 제조에 순응하는 가요성 반-폐쇄된 및 반-자동화 세포 생산 공정을 용이하게 한다.
공정 Gen 2 및 Gen 3 TIL은 종양의 외과적 절제를 통해 개별 환자로부터 유래된 자가 TIL로 구성되고 그 다음 생체외 확장된다. Gen 3 공정의 프라이밍 제1 확장 단계는 인터류킨-2 (IL-2) 및 단클론성 항체 OKT3의 존재에서 세포 배양으로, 이것은 조사된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 스캐폴드 상에 T-세포 공-수용체 CD3을 표적화한다.
Gen 2 TIL 생성물의 제조는 2개의 상으로 구성된다: 1) 프리-급속 확장 (프리-REP) 및 2) 급속 확장 프로토콜 (REP). 프리-REP 동안 절제된 종양은 각각의 치수에서 ≤ 50 단편 2-3 mm로 절단되었으며 이것은 혈청-함유 배양 배지 (보충된 10% HuSAB를 함유하는 RPMI 1640 배지) 및 6,000 IU/mL의 인터류킨-2 (IL-2)로 11일의 기간 동안 배양되었다. 11일째에 TIL은 수확되었고 대규모 2차 REP 확장 안으로 도입되었다. REP는 5일 동안 3000 IU/mL의 rhIL-2로 보충된 CM2의 5L 부피에서 150ug의 단클론성 항-CD3 항체 (OKT3)가 로딩된 5x109 조사된 동종이계 PBMC 피더 세포의 공-배양에서 프리-REP로부터 ≤200x106의 생존가능 세포의 활성화로 구성된다. 16일째에 배양물은 90% 감소된 부피이고 세포 분획은 ≥ 1x109 생존가능한 림프구/플라스크에서 다수의 G-REX-500 플라스크 및 QS가 CM4를 갖는 5L로 분할되었다. TIL은 추가의 6일 동안 인큐베이션되었다. REP는 22일째에 수확되고, 세척되고, 제형화되고, 동결-보존된 후, 주입을 위해 -150℃에서 임상 현장으로 선적된다.
Gen 3 TIL 생성물의 제조는 3개의 상으로 구성된다: 1) 프라이밍 제1 확장 프로토콜 2) 급속 제2 확장 프로토콜 (또한 급속 확장 상 또는 REP로 지칭됨) 및 3) 계대배양 분할. 프라이밍 제1 확장 TIL 번식을 유효하게 하기 위해, 절제된 종양은 각각의 치수에서 ≤ 120 단편 2-3 mm로 절단되었다. 프라이밍 제1 확장의 0일째에, OKT-3으로 로딩된 대략 2.5x108 동종이계 조사된 PBMC 피더 세포의 공급기 층은 각각 3개의 100 MCS에서 대략 100cm2의 표면적 상에 확립되었다. 종양 단편은 7일의 기간 동안 500 mL 혈청-함유 CM1 배양 배지와 6,000 IU/mL의 인터류킨-2 (IL-2) 및 15 ug OKT-3을 갖는 3개의 100 MCS 용기 각각 중에 분포되고 그 안에서 배양된다. 7일째에, REP는 각각 3개의 100 MCS 용기에서 종양 단편화된 배양 상 안으로 OKT-3이 로딩된 대략 5x108 동종이계 조사된 PBMC 피더 세포의 추가의 피더 세포 층을 합체하고 500 mL CM2 배양 배지와 6,000 IU/mL IL-2 및 30 ug OKT-3으로 배양함에 의해 개시된다. REP 개시는 100MCS 용기 안으로 OKT3 로딩된 피더 세포의 폐쇄 시스템 유체 전달을 사용하여 동일한 용기에서 전체 프라이밍 제1 확장 배양을 활성화함에 의해 향상된다. Gen 3 경우, TIL은 전체의 세포 배양이 폐쇄 시스템 유체 전달을 통해 더 큰 용기로 확장되고 (100 M 플라스크로부터 500 M 플라스크로) 이전되고 추가의 4L의 CM4 배지가 첨가되었던 관여된 공정 단계로 확대하거나 또는 분할한다. REP 세포는 16일째에 수확되고, 세척되고, 제형화되고, 동결-보존된 후, 주입을 위해 -150℃에서 임상 현장으로 선적되었다.
전반적으로, Gen 3 공정은 더 짧고, 보다 확장가능하고, 강건한 제조 및 공정 비교성을 적합하도록 수용할 쉽게 변형가능한 확장 플랫폼이다.
Figure pct00054
0일째에, 양 공정에 대해, 종양이 3회 세척되고 단편은 랜덤추출되고 2개의 풀로 나누어진다; 공정당 1개 풀. Gen 2 공정에 대해, 단편은 6,000 IU/mL rhIL-2를 함유하는 1 L의 CM1 배지를 갖는 하나의 GREX 100MCS 플라스크로 이전된다. Gen 3 공정에 대해, 단편은 6,000 IU/mL rhIL-2, 15 ug OKT-3 및 2.5 x 108 피더 세포를 함유하는 500 mL의 CM1을 갖는 하나의 GREX100MCS 플라스크로 이전된다. Rep 개시 일에 대한 TIL의 씨딩은 각각의 공정에 따른 상이한 날에 일어났다. G-REX 100MCS 플라스크가 90% 부피 감소된, Gen 2 공정에 대해, 수집된 세포 현탁액은 IL-2 (3000 IU/mL), 플러스 5e9 피더 세포 및 OKT-3 (30 ng/mL)을 함유하는 CM2 배지에 11일째에 REP 개시를 시작하도록 새로운 G-REX 500MCS로 이전되었다. 세포는 확장되고 프로토콜 당 IL-2 (3000 IU/mL)를 갖는 CM4 배지를 갖는 다수의 GREX 500 MCS 플라스크 안으로 16일째에 분할되었다. 배양물은 그 다음 수확되고 프로토콜 당 22일째에 동결보존되었다. Gen 3 공정에 대해, REP 개시는 7일째에 발생하였으며, 여기서 동일한 G-REX 100MCS가 REP 개시를 위해 사용되었다. 간략하게, 30ug OKT-3을 갖는 IL-2 (6000 IU/mL) 및 5 x 108 피더 세포를 함유하는 500 mL의 CM2 배지가 각각의 플라스크에 첨가되었다. 9-11일째에 배양물은 확장되었다. 전체 부피의 G-Rex100M (1L)이 G-REX 500MCS로 이전되었고 IL-2 (3000 IU/mL)를 함유하는 4L의 CM4를 첨가하였다. 플라스크는 5일 인큐베이션되었다. 배양물을 수확하고 16일째에 동결보존하였다.
비교에서, 2개의 폐 종양 (L4054 및 L4055) 및 1개의 흑색종 종양 (M1085T)인, 3개의 상이한 종양이 포함되었다.
CM1 (배양 배지 1), CM2 (배양 배지 2), 및 CM4 (배양 배지 4) 배지는 미리 제조되고 L4054 및 L4055를 위해 4℃에서 유지되었다. CM1 및 CM2 배지는 여과 없이 제조되어 배지 여과를 한 것과 하지 않은 것과 세포 성장을 비교했다.
배지는 REP 개시 및 규모확대에 대한 L4055 종양에 대해 미리 37℃에서 최대 24 시간 가온되었다.
결과 요약
Gen 3은 달성된 총 생존가능 세포에 대해 30%의 Gen 2 내로 되었다. Gen 3 최종 산물은 재자극 후 INF-γ의 더 높은 생산을 나타냈다. Gen 3 최종 산물은 존재한 총 고유한 CDR3 서열에 의해 측정될 때 증가된 클론 다양성을 나타냈다. Gen 3 최종 산물은 더 긴 평균 텔로미어 길이를 나타냈다.
달성된 결과
세포수 및 % 생존력:
Gen 2 및 Gen 3 공정 상 프리 REP 및 REP 확장은 상기 기재된 세부사항에 따랐다.
표 45: 프리-REP 세포수. 각각의 종양에 대해, 2개의 풀은 동일한 수의 단편을 함유했다. 종양의 작은 크기에 기인하여, 단편의 최대 수/플라스크는 달성되지 않았다. 총 프리-REP 세포 (TVC)가 수확되고 Gen 2 공정에 대해 11일째 및 Gen 3 공정에 대해 7일째에 계수되었다. 두 프리-REP 암을 비교하기 위해, 세포수는 생존가능 세포의 평균/단편을 계산하기 위해 배양물에 제공된 단편의 수에 걸쳐 분할되었다. 아래 표에 표시된 바와 같이, Gen 2 공정은 Gen 3 공정에 비하여 단편 당 보다 많은 세포가 일관되게 성장했다. TVC의 수의 외삽된 계산은 11일째에 Gen 3 공정에 대해 예상했으며, 이것은 프리-REP TVC를 7로 나누고 그 다음 11로 곱하여 계산되었다.
Figure pct00055
표 46: TIL 최종 생성물에 대한 총 생존가능 세포 카운트 및 배수 확장: Gen 2 및 Gen 3 공정에 대해, TVC가 공정 조건 당 계수되고 퍼센트 생존가능 세포가 매일의 공정에 대해 생성되었다. 수확에서, 22일째 (Gen 2) 및 16일째 (Gen 3) 세포가 수집되었고 TVC 카운트가 확립되었다. TVC는 그 다음 0일째에 제공된 단편의 수로 나누어 단편 당 생존가능 세포의 평균을 계산했다. 배수 확장은 REP 개시 TVC에 걸쳐서 수확 TVC를 나눔에 의해 계산되었다. 표에 나타낸 바와 같이, Gen 2 및 Gen 3을 비교하면, 배수 확장은 L4054에 대해 유사하였고; L4055의 경우에, 배수 확장은 Gen 2 공정에 대해 더 높았다. 구체적으로, 이 경우에, 배지는 REP 개시 일에 앞서 24까지 가온되었다. 더 높은 배수 확장이 또한 M1085T에 대해 Gen 3에서 관찰되었다. TVC의 수의 외삽된 계산은 22일째에 Gen 3 공정에 대해 예상했으며, 이것은 REP TVC를 16으로 나누고 그 다음 22로 곱하여 계산되었다.
Figure pct00056
표 47: TIL 최종 생성물의 %생존력: 수확 시, 최종 TIL REP 생성물은 % 생존력에 대해 방출 기준에 대하여 비교되었다. Gen 2 및 Gen 3 공정에 대한 모든 조건은 70% 생존력 기준을 능가하였고 공정 및 종양에 걸쳐 비교가능하였다.
Figure pct00057
표 48: Gen 3 공정에 대한 추가의 플라스크 당 추정 세포수. 단편의 수 /최대 필요한 수 이하 플라스크에 기인하여, 수확 일에서 추정된 세포수가 각각의 종양에 대해 계산되었다. 추정은 임상 종양이 0일째에 종자 2 또는 3개의 플라스크에 충분히 크다는 기대에 기반하였다.
Figure pct00058
면역표현형검사:
TIL 최종 생성물에 대한 표현형 마커 비교:
3개의 종양 L4054, L4055, 및 M1085T는 Gen 2 및 Gen 3 공정 둘 모두에서 TIL 확장되었다. 수확 시, REP TIL 최종 생성물은 순도, 차별화, 및 기억 마커를 테스트하기 위해 유세포측정 분석을 거쳤다. 모든 조건에 대해 TCR a/b+ 세포의 백분율은 90%를 넘었다.
Gen 3 공정으로부터 수확된 TIL은 Gen 2 공정으로부터 수확된 TIL에 비교하여 CD8 및 CD28의 더 높은 발현을 나타냈다. Gen 2 공정은 CD4+의 더 높은 백분율을 나타냈다. 도 3 (A, B, C) 참조.
TIL 최종 생성물에 대한 기억 마커 비교:
Gen 3 공정으로부터 수확된 TIL은 Gen 2 공정으로부터 TIL에 비교하여 중앙 기억 구획에 대한 더 높은 발현을 나타냈다. 도 4 (A, B, C) 참조.
TIL 최종 생성물에 대한 활성화 및 고갈 마커 비교:
활성화 및 고갈 마커는 2개의 종양 L4054 및 L4055로부터 TIL에서 분석되어 Gen 2 및 Gen 3 TIL 확장 공정으로부터의 최종 TIL 생성물에 비교했다. 활성화 및 고갈 마커는 Gen 2 및 Gen 3 공정 사이에 비교가능하였다. 도 5 (A, B); 도 6 (A, B) 참조.
재자극 시 인터페론 감마 분비:
Gen 2에 대해 22일째 및 Gen 3에 대해 16일째인, 수확 일에, TIL은 L4054 및 L4055에 대해 코팅된 항 -CD3 플레이트로 밤새 재자극되었다. M1085T에 대한 재자극은 항-CD3, CD28, 및 CD137 비드를 사용하여 수행되었다. 상청액은 모든 조건에서 24 시간의 재자극 후 수집되었고 상청액은 냉동되었다. ELISA에 의한 IFNγ 분석은 동일한 ELISA 플레이트를 동시에 사용한 양 공정으로부터의 상청액에 대해 평가되었다. Gen 3 공정으로부터 IFNγ의 더 높은 생산이 분석된 3개의 종양에서 관찰되었다. 도 7 (A, B, C) 참조.
배양 배지에서 IL-2 수준의 측정:
Gen 2 및 Gen 3 공정 사이의 IL-2 소비를 비교하기 위해, 세포 상청액이 종양 L4054 및 L4055에 대해 REP 개시, 확대, 그리고 수확 일에서 수집되었다. 세포 배양 상청액에서 IL-2의 양은 R&D로부터 정량화 ELISA Kit에 의해 측정되었다. 일반적인 경향은 Gen 2 공정에 비교하여 Gen 3 공정에서 IL-2 농도가 더 높게 유지한다는 것을 나타낸다. 이는 공정 전반에 걸쳐 배지의 캐리오버로 커플링된 Gen 3에 대한 REP 개시에서 더 높은 농도의 IL-2 (6000 IU/mL)에 기인하기 쉽다. 도 8 (A, B) 참조.
대사 기질 및 대사산물 분석
대사 기질 예컨대 D-글루코스 및 L-글루타민의 수준은 전체 배지 소비량의 대용으로 측정되었다. 락트산 및 암모니아 같은, 그것의 상응하는 대사산물이 측정되었다. 글루코스는 ATP의 형태로 에너지를 생산하기 위해 미토콘드리아에 의해 이용된 배지에서 단당이다. 글루코스가 산화될 때, 락트산이 생산된다 (락테이트는 락트산의 에스테르임). 락테이트는 세포 지수 성장 단계에서 강하게 생산된다. 높은 수준의 락테이트는 세포 배양 공정에 대해 부정적 영향을 갖는다. 도 9 (A, B) 참조.
L4054 및 L4055에 대해 소비된 배지가 공정 Gen 2 및 Gen 3 둘 모두에 대해 REP 개시, 확대, 및 수확 일에서 수집되었다. 소비된 배지 수집은 Gen 2에 대해 11일째, 16일째 및 22일째였고; Gen 3에 대해 7일째, 11일째 및 16일째였다. 상청액은 글루코스, 락트산, 글루타민, GlutaMAX, 및 암모니아의 농도에 대해 CEDEX Bio-분석기에서 분석되었다.
L-글루타민은 세포 배양 배지 제형에서 필요한 불안정한 필수 아미노산이다. 글루타민은 아민을 함유하고, 이 아미드 구조 그룹은 질소를 세포로 전달 및 배달할 수 있다. L-글루타민이 산화할 때, 독성 암모니아 부산물이 세포에 의해 생산된다. L-글루타민의 분해에 대응하기 위해 Gen 2 및 Gen 3 공정에 대한 배지는 수용액에서 더 안정하고 자발적으로 분해하지 않는 Glutamax로 보충되었다. 2개의 종양 라인에서, Gen 3 암은 상기 공정 동안에 L-글루타민 및 Glutamax에서 감소와 REP 전반에 걸친 암모니아의 증가는 나타냈다. Gen 2 암에서 일정한 농도의 L-글루타민 및 Glutamax, 및 암모니아 생산에서 완만한 증가가 관찰되었다. Gen 2 및 Gen 3 공정은 암모니아에 대해 수확 일에서 비교가능하였고 L-글루타민 분해에서 완만한 차이를 보였다. 도 10 (A, B, C) 참조.
유동(FLOW) - FISH에 의한 텔로미어 반복:
유동-FISH 기술이 Gen 2 및 Gen 3 공정 하에서 L4054 및 L4055에 대한 텔로미어 반복의 평균 길이를 측정하기 위해 사용되었다. 상대 텔로미어 길이 (RTL)의 결정은 DAKO로부터 유세포측정 분석을 위한 텔로미어 PNA 키트/FITC를 사용하여 계산되었다. Gen 3은 Gen 2에 비교가능한 텔로미어 길이를 나타냈다.
CD3 분석
각각의 공정에서 생성된 세포 생성물의 클론 다양성을 결정하기 위해, L4054 및 L4055에 대해 수확된 TIL 최종 생성물이 샘플링되고 T-세포 수용체의 CDR3 부분의 서열분석을 통해 클론 다양성 분석에 대해 검정되었다.
표 50: TIL 수확된 세포 생성물 상의 L4054에 대한 고유한 CDR3 서열을 공유한 백분율의 Gen 2 및 Gen3의 비교. 199 서열은 Gen 3 최종 산물과 공유된 Gen 2로부터 고유한 CDR3 서열의 최상부 80%의 97.07%에 상응하는, Gen 3 및 Gen 2 최종 산물 사이에 공유된다.
Figure pct00059
표 51: TIL 수확된 세포 생성물 상의 L4055에 대한 고유한 CDR3 서열에 공유된 백분율의 Gen 2 및 Gen3의 비교. 1833개의 서열은 Gen 3 및 Gen 2 최종 산물 사이에 공유되며, 이는 Gen 3 최종 산물과 공유된 Gen 2 로부터의 고유한 CDR3 서열의 상위 80%의 99.45%에 상응한다.
Figure pct00060
CM1 및 CM2 배지가 여과 없이 미리 제조되고 Gen 2 및 Gen 3 공정 상에 사용하기 위한 종양 L4055에 대해 사용할 때까지 4도씨에서 유지했다.
배지는 Gen 2 및 Gen 3 공정에 대한 REP 개시 일에 종양 L4055에 앞서 24시간 동안 37도씨로 가온되었다.
LDH는 공정 상 수집된 상청액에서 측정되지 않았다.
M1085T TIL 세포 계수는 K2 셀로미터 세포 계수기로 실행되었다.
종양 M1085T에 대해, 샘플은 대사 분석에 대해 상청액, 활성화 및 고갈 마커 분석을 위한 TIL 생성물, 텔로미어 길이 및 CD3 - TCR vb 분석과 같이 이용불가능하였다.
결론
본 실시예는 Gen 2 및 Gen 3 공정 중에서 기능적 품질 속성, 플러스 연장된 표현형 특성화 및 배지 소비 관점에서 3개의 독립적인 공여체 종양 조직을 비교한다.
Gen 2 및 Gen 3 프리-REP 및 REP 확장 비교는 생성된 총 생존가능 세포 및 총 유핵의 세포 집단의 생존력의 관점에서 평가되었다. 수확 일에서 TVC 세포 용량은 Gen 2 (22일) 및 Gen 3 (16일) 사이에 비교가능하지 않았다. Gen 3 세포 용량은 수확에서 수집된 총 생존가능 세포의 약 40%에서 Gen 2보다 낮았다.
외삽된 세포 수는 7일째 대신 11일째에서 발생한 프리-REP 수확 및 16일째 대신 22일째에서 REP 수확을 가정하는 Gen 3 공정에 대해 계산되었다. 양 경우에서 Gen 2 공정에 비교된 TVC에서 더 가까운 수를 나타내어, 조기 활성화는 TIL 성장에 전반적으로 더 나은 성능을 허용할 수 있다는 것을 나타낸다. 표 4 및 5 최하부 행.
Gen 3 공정에 대한 추가의 플라스크 (2 또는 3)에 대한 외삽된 값의 경우에 더 큰 크기의 종양이 가공되는 것을 가정하고, 기재된 바와 같이 공정 당 필요한 단편의 최대 수에 도달한다. 유사한 용량은, 22일째의 Gen 2 공정에 비하여 Gen 3 공정에 대한 수확 16일째의 TVC에 도달가능할 수 있다는 것이 관찰되었다. 이 관찰은 중요하고 배양물의 조기 활성화가 낮은 처리 시간에서 TIL의 더 나은 성능을 허용할 수 있다는 것을 나타낸다.
Gen 2 및 Gen 3 프리-REP 및 REP 확장 비교는 생성된 총 생존가능 세포 및 총 유핵의 세포 집단의 생존력의 관점에서 평가되었다. 수확 일에서 TVC 세포 용량은 Gen 2 (22일) 및 Gen 3 (16일) 사이에 비교가능하지 않았다. Gen 3 세포 용량은 수확에서 수집된 총 생존가능 세포의 약 40%에서 Gen 2보다 낮았다.
표현형 특성화 관점에서, 더 높은 CD8+ 및 CD28+ 발현이 Gen 2 공정에 비하여 Gen 3 공정에서 3개의 종양에서 관찰되었다. 이 데이터는 Gen 3 공정이 Gen 2에 비하여 최종 TIL 생성물의 개선된 속성을 갖는다는 것을 나타낸다.
Gen 3 공정은 Gen 2 공정에 비하여 약간 더 높은 중앙 기억 구획을 나타냈다.
Gen 2 및 Gen 3 공정은 Gen 3 공정의 더 짧은 지속기간에도 불구하고 비교가능한 활성화 및 고갈 마커를 나타냈다.
IFN 감마 (IFNγ) 생산은 분석된 3개의 종양에서 Gen 2에 비하여 Gen 3 최종 산물에서 3배 더 높았다. 이 데이터는 가능하게는 Gen 3 상에 CD8의 더 높은 발현 및 CD28 발현에 기인하여, Gen 2 공정에 비교할 때 매우 기능적이고 더 강한 TIL 생성물을 생성한 Gen 3 공정을 나타낸다. 표현형 특성화는 Gen 2 공정에 비하여 3개의 종양 상에 CD8+, CD28+ 발현에 대한 Gen 3에서 양성 경향을 제안했다.
Gen 2 및 Gen 3 사이의 TIL 최종 생성물의 텔로미어 길이는 비교가능했다.
글루코스 및 락테이트 수준은 Gen 2 및 Gen 3 최종 산물 사이에 비교가능하여, Gen 3 공정의 배지 상의 영양소의 수준은 공정의 매일 부피 감소 제거의 비-실행과 Gen 2에 비교된 공정애서 전반적으로 낮은 부피 배지에 기인하여 영향을 받지 않았다는 것을 시사한다.
전반적으로 Gen 3 공정은 Gen 2 공정에 비교하여 처리 시간의 거의 2배 감소를 나타냈으며, 이는 Gen 3 공정에 의해 확장된 TIL 생성물에 대해 상품 비용 (COG)에 실질적인 감소를 생성할 것이다.
IL-2 소비는 Gen 2 공정 상에 IL-2 소비의 일반적인 경향을 나타내고, Gen 3 공정에서 IL-2는 오래된 배지의 비-제거에 기인하여 더 높았다.
Gen 3 공정은 CDR3 TCRab 서열 분석에 의해 측정된 더 높은 클론 다양성을 나타냈다.
프리-REP의 0일째에 공급기 및 OKT-3의 첨가는 Gen 3 공정을 사용하여 TIL의 조기 활성화 및 전반적으로 더 나은 성장 TIL 성능을 허용했다.
표 52는 다양한 실시형태 및 현 Gen 2 공정에 비교된 Gen 3 공정의 결과를 기재한다:
Figure pct00061
실시예 9: CLL 환자에서 PBMC로부터 PBL을 선택하고 팽창하는 예시적인 실시형태.
PBMC는 환자로부터 수집되고 나중 사용을 위해 냉동되거나, 또는 신선하게 사용된다. 충분한 부피의 말초 혈액이 수집되어 본 발명의 방법에서 출발 물질에 대해 적어도 약 400,000,000 (400 x 106) PBMC를 생성한다. 방법의 0일째에, 6x106 IU/mL에서 IL-2가 신선하게 준비되거나 해동되고, 사용될 때까지 4℃ 또는 얼음에서 저장되었다. 200 mL의 CM2 배지는 100 mL의 CM1 배지 (GlutaMAX® 함유)를 조합시키고, 그 다음 CM2를 제조하기 위해 AIM-V와 100 mL (1:1)로 희석함에 의해 준비된다. CM2는 광으로부터 보호되고 사용하지 않는 경우 단단히 밀봉된다.
모든 다음의 단계는 멸균 세포 배양 조건 하에서 수행된다. CM2의 분취액은 냉동된 PBMC 샘플을 해동 및/또는 세척하는데 사용하기 위한 37℃ 수조에서 50 mL 원추형 튜브에서 가온된다. 냉동된 PBMC 샘플이 사용되는 경우, 샘플은 냉동고 저장으로부터 제거되고 해동 준비 시까지 드라이아이스 상에 유지한다. 해동 준비가 될 때 PBMC 크라이오바이알, 5 mL의 CM2 배지는 멸균 50 mL 원추형 튜브 내에 배치된다. PBMC 샘플 크라이오바이알은 단지 적은 얼음 결정이 남을 때까지 37℃ 수조 내에 배치된다. 가온된 CM2 배지는 1:1 부피 비의 샘플:배지 (약 1 mL)에서 샘플 바이알에 적가로 첨가된다. 전체 내용물은 크라이오바이알에서 제거되고 50 mL 원추형 튜브에 남아 있는 CM2 배지로 이전된다. 추가의 1-2 mL의 CM2 배지는 크라이오바이알을 린스하기 위해 사용되고 크라이오바이알의 전체 내용물은 제거되고 50 mL 원추형 튜브로 이전된다. 원추형 튜브 내 부피는 그 다음 추가의 CM2 배지로 15 mL로 조정되고, 세포를 린스하기 위해 부드럽게 교반된다. 원추형 튜브는 그 다음 세포 펠렛을 수집하기 위해 실온에서5 분 동안 400g 원심분리된다.
상청액은 펠렛으로부터 제거되고, 원추형 튜브는 캡핑되고, 그 다음 세포 펠렛은, 예를 들어, 거친 표면과 함께 튜브 긁음에 의해 파괴된다. 약 1mL의 CM2 배지는 세포 펠렛에 첨가되고, 펠렛 및 배지는 피펫으로 5-10회 상하로 흡인하여 세포 펠렛을 파괴한다. 추가의 3-5 mL의 CM2 배지는 튜브에 첨가되고 세포를 현탁하기 위해 피펫을 통해 혼합된다. 이 시점에서, 세포 현탁액의 부피는 기록된다. 자동 세포 계수기, 예를 들어, Nexcelom Cellometer K2로 세포 카운팅을 위해 튜브로부터 100 uL의 세포 현탁액을 제거한다. 샘플에서 생존 세포의 수를 결정하고 기록한다.
표현형검사 및 다른 특성화 실험을 위해 최소의 5 x 106 세포를 보전한다. 세포 펠렛을 수집하기 위해 5 분 동안 실온에서400g에서 보전된 세포를 스피닝한다. 동결 배지 (20% DMSO 함유 멸균, 열-불활성화된 FBS)에 세포 펠렛을 재현탁한다. 동결 배지에 재현탁된 세포의 1 또는 2 분취액을 동결하고, -80℃ 냉동고에서 세포동결기 (Mr. Frosty)에서 분취액을 서서히 동결한다. -80℃에서 최소 24 시간 후 액체 질소 저장고로 이동한다.
다음의 단계를 위해, 사전-냉각된 용액을 사용하고, 빠르게 적업하고, 세포를 차갑게 유지한다. 다음 단계는 PBMC 샘플의 T-세포 분획을 정제하기 위한 것이다. 이는 Pan T-세포 단리 Kit (Miltenyi, 카탈로그 # 130-096-535)을 사용하여 완료된다. pH 7.2에서 PBS, 0.5% BSA, 및 2 mM EDTA를 함유하는 멸균-여과된 세정 버퍼로 세포를 세척함에 의해 정제를 위한 세포를 준비한다. PBMC 샘플은 세포 펠렛을 수집하기 위해 400g에서 5 분 동안 원심분리된다. 상청액은 흡인되고 세포 펠렛은 모든 107 세포에 대해 40 uL의 세정 버퍼에서 재현탁된다. 10 uL의 Pan T 세포 바이오틴-항체 칵테일을 모든 107 세포에 대해 부가한다. 잘 혼합하고 냉장고 또는 얼음 상에서 5 분 동안 배양한다. 30 uL의 세정 버퍼를 모든 107 세포에 대해 부가한다. 20 uL의 Pan T-세포 마이크로비드 칵테일을 모든 107 세포에 대해 부가한다. 잘 혼합하고 냉장고 또는 얼음 상에서 10 분 동안 배양한다. LS 칼럼을 준비하고 자기적으로 마이크로비드로부터 세포를 분리한다. LS 칼럼은 QuadroMACS 자기장에 배치된다. LS 칼럼은 3 mL의 차가운 세정 버퍼로 세척되고, 세척물은 수집되고 폐기된다. 세포 현탁액은 칼럼에 적용되고 통과액 (비표지된 세포)은 수집된다. 이 통과액은 농축된 T-세포 분획 (PBL)이다. 칼럼을 3 mL의 세정 버퍼로 세척하고 초기 통과액과 동일한 튜브에 통과액을 수집한다. 튜브를 캡핑하고 얼음 상에 배치한다. 이는 T-세포 분획, 또는 PBL이다. 자기장으로부터 LS 칼럼을 제거하고, 칼럼을 5 mL의 세정 버퍼로 세정하고, 비-T-세포 분획 (자기적으로 표지된 세포)를 또 다른 튜브 안에 수집한다. 양 분획을 400g에서 5 분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 수집한다. 상청액은 양 샘플로부터 흡인되고 펠렛을 파괴하고 각각의 펠렛에 3000 IU/mL IL-2가 보충된 1 mL의 CM2 배지에 세포를 재현탁하고 상하로 5-10회 피펫팅하여 펠렛을 부순다. 1-2 mL의 CM2를 각 시료에 부가하고, 각각의 샘플을 잘 혼합하고 다음 단계를 위해 조직 배양 인큐베이터에 저장한다. 약 50 uL 분취액을 각각의 샘플로부터 제거하고, 세포를 계수하고, 계수 및 생존력을 기록한다.
T-세포 (PBL)는 그 다음 Dunabeads™ 인간 T-익스팬더 CD3/CD28과 함께 배양된다. Dynabeads의 스톡 바이알은 30 초 동안 중간 속도에서 와동된다. 필요한 분취액의 비드는 스톡 바이알로부터 멸균 1.5 mL 마이크로튜브 안으로 제거된다. 비드는 비드를 함유하는 1.5 mL 마이크로튜브에 1 mL의 비드 세정을 부가함에 의해 비드 세정액으로 세척된다. 부드럽게 혼합한다. 튜브를 DynaMag™-2 자석 상에 배치하고 비드가 자석을 향해 끌리는 동안 30분 동안 둔다. 세정액을 비드에서 흡인하고 튜브를 자석으로부터 제거한다. 3000 IU/mL IL-2가 보충된 1mL의 CM2 배지는 비드에 첨가된다. 마이크로튜브의 전체 내용물은 15 또는 50 mL 원추형 튜브로 이동된다. IL-2를 갖는 CM2 배지를 사용하여 비드를 최종 농도 약 500,000/mL로 한다.
T-세포 (PBLs) 및 비드는 아래와 같이 함께 배양된다. 0일째에: G-Rex 24 웰 플레이트 내, 총 7mL /웰로, 500,000 T-세포, 500,000 CD3/CD28 Dynabeads, 및 IL-2가 보충된 CM2를 부가한다. G-Rex 플레이트는 공정에서 다음 단계 (4일째)까지 가습된 37℃, 5% CO2 인큐베이터 안에 배치된다. 남아 있는 세포는 Mr. Frosty 세포 동결기를 사용하여 CS10 동결보존 배지에 냉동된다. 세포의 비-T-세포 분율은 Mr. Frosty 세포 동결기를 사용하여 CS10 동결보존 배지에 냉동된다. 4일째에, 배지는 교환된다. 절반의 배지 (약 3.5mL)는 G-rex 플레이트의 각각의 웰로부터 제거된다. 37℃로 가온된 3000 IU/mL IL-2로 보충된 충분한 부피 (약 3.5mL)의 CM4 배지는 각각의 샘플 웰로부터 제거된 배지를 대체하기 위해 첨가된다. G-rex 플레이트는 인큐베이터로 복귀된다.
7일째에, 세포는 확장을 위해 REP에 의해 제조된다. G-rex 플레이트는 인큐베이터로부터 제거되고 절반의 배지는 각각의 웰로부터 제거되고 폐기된다. 세포는 남아 있는 배지에서 재현탁되고 15 mL 원추형 튜브로 이전된다. 웰들은 37℃로 가온된 3000 IU/mL IL-2로 보충된 각각 1 mL의 CM4로 세척되고 세척 배지는 세포를 갖는 동일한 15 mL 튜브로 이동된다. 대표적인 샘플의 세포는 제거되고 자동화 세포 계수기를 사용하여 계수된다. 1x106 생존 세포 미만이 있는 경우, 0일째에서 Dynabead 확장 공정이 반복된다. 나머지의 세포는 백업 확장을 위해 또는 표현형검사 및 다른 특성화 연구를 위해 냉동된다. 1x106 생존 세포 이상이 있는 경우, REP 확장은 0일째로부터 프로토콜에 따라 반복하도록 설정된다. 대안적으로, 충분한 세포로, 확장은 3000 IU/mL IL-2로 보충된 CM4 배지의 최종 부피 100 mL/웰에서 1:1 비의 Dynabeads:PBL 및 10-15x106 PBL /플라스크를 사용한 G-rex 10M 배양물 플라스크에서 설정될 수 있다. 플레이트 및/또는 플라스크는 인큐베이터로 복귀된다. 과잉 PBL은 -80℃ 냉동고 내 Mr. Frosty 세포 동결기에서 분취되고 느리게-냉동될 수 있고, 최소의 24 시간 후 -80℃에서 액체 질소 저장으로 이전된다. 이들 PBL은 확장을 위해 또는 표현형검사 또는 다른 특성화 연구를 위해 백업 샘플로서 사용될 수 있다.
11일째에, 배지는 교환된다. 절반의 배지는 G-rex 플레이트 또는 플라스크의 각각의 웰로부터 제거되고 37℃에서 3000 IU/mL IL-2로 보충된 신선한 CM4 배지의 동일한 양으로 대체된다.
14일째에, PBL은 수확된다. G-rex 플레이트가 사용된 경우, 약 절반의 배지는 플레이트의 각각의 웰로부터 제거되고 폐기된다. PBL 및 비드는 남아 있는 배지에 현탁되고 멸균 15 mL 원추형 튜브 (튜브 1)로 이전된다. 웰들은 37℃로 가온된 1-2 mL의 신선한 AIM-V 배지로 세척되고 세척액은 튜브 1로 이동된다. 튜브 1은 캡핑되고 비드가 자석으로 끌리도록 1분 동안 DynaMag™-15 자석에 배치된다. 세포 현탁액은 새로운 15 mL 튜브 (튜브 2)로 이전되고, 비드는 2mL의 신선한 AIM-V로 37℃에서 세척된다. 튜브 1은 추가의 1 분 동안 자석 안에 다시 두고 세척 배지는 그 다음 튜브 2로 이전된다. 웰들은 원할 경우 최종 세정 단계 후 조합될 수 있다. 대표적인 샘플의 세포를 제거하고 계수하고 계수 및 생존력을 기록한다. 튜브는 계수 동안 인큐베이터에 배치될 수 있다. 추가의 AIM-V 배지는 세포가 매우 밀집한 것으로 보일 때 튜브 2에 첨가될 수 있다. 플라스크가 사용된 경우, 플라스크에서 부피는 약 10 mL로 감소되어야 한다. 플라스크의 내용물은 혼합되고 15 mL 원추형 튜브 (튜브 A)로 이전된다. 플라스크는 상기에 기재된 바와 같이 2mL의 AIM-V 배지로 세척되고 세척 배지는 또한 튜브 A로 이전된다. 튜브 A는 캡핑되고 비드가 자석으로 끌리도록 DynaMag™-15 자석에 1분 동안 배치된다. 세포 현탁액은 새로운 15 mL 튜브 (튜브 B)로 이전되고, 비드는 2mL의 신선한 AIM-V로 37℃에서 세척된다. 튜브 A는 추가의 1 분 동안 자석 안에 다시 두고 세척 배지는 그 다음 튜브 B로 이전된다. 웰들은 원할 경우 최종 세정 단계 후 조합될 수 있다. 대표적인 샘플의 세포를 제거하고 계수하고 계수 및 생존력을 기록한다. 튜브는 계수 동안 인큐베이터에 배치될 수 있다. 추가의 AIM-V 배지는 세포가 매우 밀집한 것으로 보일 때 튜브 B에 첨가될 수 있다. 세포는 원하는 농도에서 CS10 보존 배지에서 신선하게 또는 냉동되어 사용될 수 있다.
실시예 10: 고형 종양이 있는 환자에서 자가 종양 침윤 림프구의 2상, 다중중심 연구
연구 설계
개요
본 실시예는 펨브롤리주맙과 조합한 TIL을 사용하여, 또는 단일 요법으로서 TIL을 사용하여, 본원뿐만 아니라 이 실시예에 기재된 바와 같이 제조된 TIL을 사용하여, ACT를 평가하는 전향적, 개방 라벨, 다중-코호트, 비-랜덤화된, 다중중심 2상 연구를 설명한다.
목적:
1차:
연구원에 의해 평가된 고형 종양에서의 반응 평가 기준(RECIST 1.1)을 사용하여, 객관적 반응 속도(ORR)에 의해 결정된, MM, HNSCC, 또는 NSCLC 환자에서 펨브롤리주맙과 조합된 자가 TIL의 효능을 평가하기 위해, 이전에 CPI로 치료시에 이미 진행된, 또는 치료 후에 진행된 재발성 또는 불응성(r/r) NSCLC 환자에서 단일 요법으로서 TIL의 효능을 평가하기 위해.
등급 ≥ 3 치료 후 발생한 유해 사례(TEAE)의 발병률에 의해 측정된 바와 같이, MM, HNSCC, 또는 NSCLC 환자에서 펨브롤리주맙과 조합된 TIL 또는 r/r NSCLC 환자에서 단일 요법으로서 TIL의 안전성 프로파일을 특성화하기 위해.
2차:
완전 반응(CR) 속도, 반응의 지속기간(DOR), 질환 통제율(DCR), 연구원에 의해 평가된 바와 같은, RECIST 1.1을 사용한 무진행 생존(PFS), 및 전체 생존(OS)을 사용하여, MM, HNSCC, 또는 NSCLC 환자에서 펨브롤리주맙과 조합된 자가 TIL 또는 r/r NSCLC 환자에서 단일 요법으로서 TIL의 효능을 추가로 평가하기 위해.
코호트:
코호트 1A: 면역요법을 제외한 전신 요법의 3개 이하의 이전 라인으로 IIIC기 또는 IV기 절제불가능 또는 MM을 갖는 환자에서 펨브롤리주맙과 조합한 TIL 요법. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 치료 시 또는 치료 후에 방사선 사진으로 진행이 기록되어 있을 필요가 있다.
코호트 2A: 진행성, 재발성 또는 전이성 HNSCC (예를 들어, T1N1-N2B기, T2-4N0-N2b기)가 있는 환자에서, 면역요법을 제외한 3개 이하의 이전 라인의 전신 요법으로 펨브롤리주맙과 조합한 TIL 요법. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 치료 시 또는 치료 후에 방사선 사진으로 진행이 기록되어 있을 필요가 있다.
코호트 3A: 면역요법을 제외한 전신 요법의 3개 이하의 이전 라인으로 국소진행성 또는 전이성(III기~IV기) NSCLC 환자에서 펨브롤리주맙과 조합한 TIL 요법. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 치료 시 또는 치료 후에 방사선 사진으로 진행이 기록되어 있을 필요가 있다.
코호트 3B: 3개 이하의 이전 라인의 전신 요법의 일부로서 CPI (예를 들어, 항-PD-1/항-PD-L1)로 이전에 전신 요법을 받은 환자 단계 III 또는 단계 IV NSCLC에서 단일 제제로서의 TIL 요법. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 치료 시 또는 치료 후에 방사선 사진으로 진행이 기록되어 있을 필요가 있다.
이용가능한 효과적인 표적 요법에 의한, 종양유전자-유도된 종양을 갖는 코호트 3A 및 3B(NSCLC)의 환자는 표적 요법의 적어도 하나의 라인을 받았어야 한다.
모든 환자는, 사이클로포스파미드 및 플루다라빈으로 구성된 비골수절제 림프구고갈(NMA-LD) 전처치 레지멘에 선행하여, 자가 동결보존된 TIL 요법(코호트 할당에 따라, 펨브롤리주맙과 조합하거나 하지 않음)을 받았다. TIL 주입에 이어, 최대 6 IV 인터류킨-2 (IL-2) 용량 최대가 투여되었다.
달리 명시되지 않는 한, 다음의 일반적인 연구 기간은 4개의 모든 코호트에서 소요되었다.
스크리닝 및 종양 절제: 연구 개시로부터 최대 4 주 (28일); TIL 생성물의 제조: 종양 절제로부터 대략 ≤22일; 및 아래에 논의된 바와 같은 치료 기간.
치료 기간(코호트 1A, 2A, 및 3A): 최대 2년으로, NMA-LD (7 일), TIL 주입 (1 일)과 그것에 뒤따르는 IL-2 투여 (1 내지 4 일)를 포함함. 환자는 TIL 생산 및 기준선 스캔을 위해 그것의 종양 절제의 완료 후이지만 NMA-LD 레지멘의 개시 전에 펨브롤리주맙의 단일 주입을 투여받는다. 다음 용량의 펨브롤리주맙은 IL-2 완료 후보다 빠르지 않고, 그 후 ≤ 2년(24개월) 동안 또는 질환이 진행되거나 허용될 수 없는 독성이 발생할 때까지 Q3W ± 3일동안 지속될 것이다. 치료 종료 (EOT) 방문은 펨브롤리주맙의 마지막 용량 후 30 일 이내에 발생하였다. 적용가능한 경우 해당 방문은 평가 종료(EOA) 방문과 조합될 수 있다(예를 들어, 질환 진행 시 또는 새로운 항암 요법 시작 시 펨브롤리주맙 중단 발생).
치료 기간(코호트 3B): NMA-LD(7일), TIL, 주입(1일)후 IL-2 투여(1 내지 4일)를 포함하여 최대 12일. EOT 방문은 일단 환자가 마지막 용량의 IL-2를 투여받으면 발생한다. EOT 방문은 치료 중단 후 30 일 이내에 수행되었고 평가 기간 동안 이 간격 내에서 발생하는 임의의 계획된 방문과 조합될 수 있다.
평가 기간: 0일째에 TIL 주입 후 시작되고, 새로운 항암 요법의 시작, 연구 평가에 대한 동의의 부분 철회 또는 5년(60개월) 중 먼저 발생한 시점과 함께 질환 진행 시 종료된다. 평가 종료 (EOA) 방문은 일단 환자가 질환 진행에 도달되거나 새로운 항암 요법이 개시된 때에 발생하였다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 TIL로의 TIL 자가 요법은 다음의 단계로 구성되었다:
1. TIL 세포 생성물의 공급원 역할을 하는 자가 조직을 제공하기 위한 종양 절제;
2. 중앙 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준(GMP) 설비에서 생산된 TIL 생성물;
3. 7-일 NMA-LD 전처치 레지멘;
4. 코호트 1A, 2A, 및 3A: 환자는 TIL 생산 및 기준선 스캔을 위한 종양 절제를 완료한 후, NMA-LD 레지멘을 개시하기 전에 펨브롤리주맙을 단일 주입받았다. 다음 용량의 펨브롤리주맙은 IL-2 완료 후보다 빠르지 않고, 그 후 Q3W ± 3일 동안 지속될 것이다.
5. 자가 TIL 생성물의 주입(0일째); 및
6. 최대 6회 투여의 IV IL-2 투여.
코호트 1A, 2A, 및 3A에서, 다음 용량의 펨브롤리주맙은 IL-2 완료 후보다 빠르지 않고, 그 후 ≤ 2년(24개월) 동안 또는 질환이 진행되거나 허용될 수 없는 독성이 발생할 때까지 중 먼저 발생한 시점과 함께 Q3W ± 3일동안 지속될 것이다.
코호트 1A, 2A, 및 3A에 대한 순서도는 도 7에서 찾을 수 있다. 코호트 3B에 대한 순서도는 도 8에서 찾을 수 있다. 환자는 종양 징후에 의해 적절한 코호트로 할당되었다.
TIL 요법 + 펨브롤리주맙(코호트 1A, 2A, 및 3A)
환자는 스크리닝되고 종양 절제에 대한 수술이 계획되었다. 그런 다음 환자는 하나 이상의 종양 병변을 절제받고, 이를 TIL 생산을 위해 중앙 제조 설비로 보냈다.
다음으로, NMA-LD 레지멘을 모방하고, -7일 및 -6일에 메스나(부위 표준 관리마다 또는 USPI/SmPC)와 함께 2일의 IV 사이클로포스파미드(60 mg/kg), 이어서 5일의 IV 플루다라빈(25 mg/m2: -5일부터 -1일)으로 구성되었다.
코호트 1A, 2A, 및 3A의 환자는 TIL 생산 및 기준선 스캔을 위한 종양 절제를 완료한 후, 그리고 NMA-LD 레지멘을 개시하기 전에 펨브롤리주맙의 단일 주입을 받았다. 용량 600,000 IU/kg IV에서의 IL-2 투여는, 0일째의 TIL 주입의 완료 3 시간 후, 단 24 시간 후까지는 개시되었다. 추가의 IL-2 투여는 최대 6회 투여 동안 대략 8 내지 12시간마다 주어질 것이다. 두 번째 용량의 펨브롤리주맙은 IL-2의 완료 후보다 빠르지 않았다. 환자는 제2 펨브롤리주맙 투여 이전에 모든 IL-2-관련된 독성 (등급 ≤2)으로부터 회복되어야 했다. 펨브롤리주맙은 이후 ≤2년(24개월) 동안 또는 질환 진행 또는 허용될 수 없는 독성 중 먼저 발생한 시점까지 Q3W ± 3일 동안 지속될 것이다.
단일 제제로서의 TIL 요법(코호트 3B)
환자는 스크리닝되고 종양 절제에 대한 수술이 계획되었다. 그런 다음 환자는 하나 이상의 종양 병변을 절제받고, 이를 TIL 생산을 위해 중앙 제조 설비로 보냈다.
다음으로, NMA-LD 레지멘은 -7 일 및 -6일째에 메스나 (부위 표준 관리 또는 USPI/SmPC 당)와 함께 2 일의 IV 사이클로포스파미드 (60 mg/kg), 이어서 5 일의 IV 플루다라빈 (25 mg/m2: -5일째 내지 -1일째)으로 구성되었다.
종양-유래된 자가 TIL 생성물의 주입은 플루다라빈의 마지막 투여 후 24시간 이내에 이루어졌다. 600,000 IU/kg IV 용량의 IL-2 투여는 TIL 주입 완료 후 3시간부터 24시간 이내에 시작되었을 수 있다.
추가의 IL-2 투여는 최대 6회 투여 동안 대략 8 내지 12 시간마다 주어졌다.
종양 침윤 림프구의 생산 및 확장
TIL 자가 세포 생성물은 환자의 종양/병변으로부터 유래된 생존가능 세포독성 T 림프구로 구성되었으며, 이는 중앙 GMP 설비에서 생체외에서 제조되었다. 예를 들어, TIL 생산 공정을 도시하는 예시적인 흐름 선도가 도 9에 제공되어 있다.
각각의 개별 환자에서 직경이 ≥1.5 cm인 1차 또는 2차 전이성 종양 병변(들)을 외과적으로 절제한 후 TIL 제조 공정이 임상 현장에서 시작되었다. 다양한 해부상의 위치로부터의 다수의 종양 병변을 절제하여 종양 조직의 전체 응집체를 수집할 수 있지만; 그러나, 응집체는 이송 병에 존재하는 생물보존 매질의 제한된 양으로 인해 직경 4.0 cm 또는 무게 10 g을 초과해서는 안된다.
일단 종양 병변(들)이 생물보존 이송 병에 배치되면, 익스프레스 택배를 사용하여 중앙 GMP 제조 설비로 2℃ 내지 8℃에서 출하된다. 도착하자마자, 종양 시료(들)을 단편으로 절개한 다음, 인간 재조합 IL-2를 사용하여 약 11일 동안 사전-급속 확장 프로토콜(Pre-REP)에서 배양하였다.
그런 다음, 이들 pre-REP 세포를 IL-2, OKT3([무로모납-CD3]으로도 알려져 있는, 인간 CD3에 대한 뮤린 단클론성 항체)의 존재 하에 11일 동안 급속 확장 프로토콜(REP)을 사용하여, 및 피더 세포로서 조사된 동종 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 추가로 확장하였다.
그 다음, 확장된 세포를 수확하고, 세척하고, 제형화하고, 동결보존하고, 익스프레스 택배를 통해 임상 현장으로 출하하였다. TIL 세포 생성물의 투여 형태는 TIL이 유래된 환자에게 주입할 준비가 된 동결보존된 자가 "생세포 현탁액"이었다. 환자는 생성물 사양에 따라 1 x 109 및 150 x 109개의 생존가능 세포를 함유하는, 제조 및 출시된 생성물의 전체 용량을 주입받았다. 임상 경험에 따르면, 이 용량 범위에서 객관적인 종양 반응이 달성되었으며, 이는 또한 안전한 것으로 밝혀졌다 (문헌[Radvanyi L.G., et al, Clin Cancer Res. 2012;18(24):6758-70]). 생성물의 전체 용량은 최대 4개의 주입 백에 제공되었다.
TIL 세포 생성물을 받을 환자의 준비
본 연구에서 사용된 NMA-LD 전처치 레지멘(즉, 사이클로포스파미드 플러스 메스나 2일, 이어서 플루다라빈 5일)은 미국 국립 암 연구소에 의해 개발되고 시험된 방법에 기반을 두고 있었다(문헌[Rosenberg S.A., 등, Clin Cancer Res. 2011;17(13):4550-7]; [Radvanyi L.G., 등, Clin Cancer Res. 2012;18(24):6758-70]; [Dudley M.E., 등, J Clin Oncol. 2008;26(32):5233-9]; [Pilon-Thomas S, 등, J Immunother. 2012;35(8):615-20]; [Dudley M.E., 등, J Clin Oncol. 2005;23(10):2346-57]; 및 [Dudley M.E., 등, Science. 2002;298(5594):850-4]). 7-일 전처치 레지멘 후, 환자에게 TIL 세포 생성물을 주입하였다.
TIL 주입 후 8 내지 12시간마다 IV IL-2(600,000 IU/kg)를 투여하고, TIL 주입 완료 후 3 내지 24시간 사이에 첫 번째 용량을 투여하고, 최대 6회 투여 동안 지속하였다. 기관 표준에 따라, IL-2의 용량을 실제의 중량을 기준으로 계산할 수 있다.
환자 집단의 선택
코호트 1A:
환자는 절제불가능 MM(IIIC기 또는 IV기, 미국 암 합동위원회 [AJCC] 병기 시스템에 따라 조직학적으로 확인됨)의 확진 진단을 받았다. 안구 흑색종 환자는 제외되었다. 환자는 이전에 면역-종양학 표적화된 제제를 받은 적이 없어야 한다. BRAF-돌연변이 양성인 경우, 환자는 이전 BRAF/MEK표적 요법을 받았을 수 있다.
코호트 2A:
환자는 진행성, 재발성 및/또는 전이성 HNSCC를 가졌으며, 치료 경험이 없을 수 있으며; 병리학 보고서를 통해 원발성 종양의 조직학적 진단이 필요하다. 환자는 이전에 면역요법 레지멘을 받은 적이 없어야 한다.
코호트 3A:
환자는 III기 또는 IV기 NSCLC (편평상피, 선암종, 대세포 암종)의 확진 진단을 받았다. 효과적인 표적 요법이 사용가능한 종양유전자-유도된 종양 환자는 표적 요법의 적어도 하나의 라인을 받았다.
코호트 3B:
환자는 III기 또는 IV기 NSCLC(편평상피, 선암종, 대세포 암종)의 확진 진단을 받았으며, 이전에 CPI(예를 들어, 항-PD-1/항-PD-L1)로 전신 요법을 받았다. 효과적인 표적 요법이 사용가능한 종양유전자-유도된 종양 환자는 표적 요법의 적어도 하나의 라인을 받았다.
모든 환자는 코호트 1A, 2A, 및 3A에 대한 면역요법을 제외하고, 최대 3회의 이전 전신 항암 요법(하기의 선택 기준을 참조한다)을 받았다. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 요법에 대해 또는 그 후에 방사선촬영으로 진행을 확인하였다.
포함 기준
환자는 연구 참여를 위해 하기 포함 기준을 모두 충족해야 한다:
1. 모든 환자는 그것의 각각의 조직학의 악성종양을 조직학적으로 또는 병리적으로 확진받았다:
o 절제불가능 또는 전이성 흑색종(코호트 1A)
o 두경부의 진행성, 재발성 또는 전이성 편평 세포 암종(코호트 2A)
o III기 또는 IV기 NSCLC (편평상피, 비편평상피, 선암종, 대세포 암종)(코호트 3A 및 3B).
2. 코호트 1A, 2A, 및 3A 단독: 환자는 면역요법받은 적이 없다. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 요법을 받거나 그 이후에 진행하였다. 코호트 1A, 2A, 및 3A는 최대 3회의 이전 전신 항암 요법을 받았을 수 있으며, 구체적으로 하기와 같다:
o 코호트 1A에서: 절제불가능 또는 전이성 흑색종 (IIIC기 또는 IV기)이 있는 환자; BRAF 돌연변이-양성인 경우, 환자는 BRAF 억제제를 투여받을 수 있었다.
o 코호트 2A에서: 절제불가능 또는 전이성 HNSCC가 있는 환자. 초기 화학-방사선요법을 받은 사람들은 허용되었다.
o 코호트 3A에서: III기 또는 IV기 NSCLC (편평상피, 비편평상피, 선암종, 또는 대세포 암종)가 있고 면역요법 미접촉이었고 국소적 진행성 또는 전이성 셋팅에서 이전 전신 요법의 ≤3 라인 후 진행된 환자. 아쥬반트 또는 네오아쥬반트 환경에서, 또는 최종적인 화학방사선요법의 일부로서, 전신 요법을 받은 환자는 적격이며, 이전 전신 요법 완료 후 12개월 이내에 질환이 진행된 경우, 요법의 한 라인을 받은 것으로 간주되었다. 표적화된 요법에 민감한 돌연변이를 갖는 알려진 종양유전자 동인(예를 들어, EGFR, ALK, ROS)이 있는 환자는 표적 요법의 적어도 1개의 라인후에 진행되어야 한다.
3. 단지 코호트 3B: 전신 요법 중 3개 이하의 이전 라인의 일부로 CPI (예를 들어, 항-PD-1/항-PD-L1)로 이전에 전신 요법을 투여받은 III기 또는 IV기 NSCLC (편평상피, 비편평상피, 선암종, 또는 대세포 암종)가 있는 환자.
o 환자는 가장 최근의 요법을 받거나 그 이후에 진행을 방사선 사진으로 기록하였다.
o 아쥬반트 또는 네오아쥬반트 환경에서, 또는 최종적인 화학방사선요법의 일부로서, 전신 요법을 받은 환자는 적격이며, 이전 전신 요법 완료 후 12개월 이내에 질환이 진행된 경우, 요법의 한 라인을 받은 것으로 간주되었다.
o 표적화된 요법에 민감한 돌연변이를 갖는 알려진 종양유전자 동인(예를 들어, EGFR, ALK, ROS)이 있는 환자는 표적 요법의 적어도 1개의 라인후에 진행되어야 한다.
4. 환자는 TIL 연구용 생성물의 생산을 위해 절제후 직경이 최소 1.5 cm인 적어도 1개의 절제가능 병변(또는 응집 병변)을 가졌다. 외과적 절제술이 환자에게 추가의 위험을 초래하지 않는 한, 종양 조직은 다수의 다양한 전이성 병변에서 수득되는 것이 권장되었다.
o TIL 생성을 위한 절제를 고려한 병변이 이전에 조사된 영역내에 있는 경우, 절제 전에 방사선촬영 진행에서 병변이 입증되어야 한다.
o 환자는 프로토콜-필수 검사를 위한 적절한 조직병리 시료를 가지고 있어야 한다.
5. 환자는 TIL 제조를 위한 종양 절제 후 표준 및 잘 알려진 RECIST 1.1 지침(예를 들어, 문헌[Eisenhauer, European Journal of Cancer 45:228-247 (2009)]을 참조하고, 또한 project.eortc.org/recist/wp-content/uploads/sites/4/2015/03/RECISTGuidelines.pdf의 월드 와이드 웹에서 사용가능함)에 정의된 대로 측정가능한 질환이 남아있었다:
o 이전에 조사된 부위의 병변은 해당 병변에서 질병의 진행이 입증된 경우가 아니면 표적 병변으로 선택되지 않았다;
o RECIST에 따라 여전히 측정가능한 TIL 생성을 위해 부분적으로 절제된 병변은 비표적 병변으로 선택될 수 있지만, 반응 평가를 위한 표적 병변으로 작용할 수 없었다.
6. 환자는 동의 당시 18세 이상이었다.
7. 환자는 0 또는 1의 미 동부 종양학협력그룹(ECOG) 성능 상태, 및 3개월 이상의 추정된 기대 수명을 가졌다.
8. 임신 가능성이 있는 환자 또는 임신 가능성이 있는 파트너가 있는 환자는 치료 기간 동안 허가된 매우 효과적인 피임 방법을 기꺼이 시행하고 모든 프로토콜-관련 치료를 받은 후 12개월 동안 계속해야 한다(주석: 생식 가능성이 있는 여성은 치료 동안, 그리고 마지막 IL-2 투여 후 12개월, 또는 마지막 펨브롤리주맙 투여 후 4개월 동안(마지막 발생시) 효과적인 피임법을 사용하였다). 남성은 연구 동안 또는 치료 중단 후 12개월 중 어느 것이든 나중에 발생하는 것 동안 정자를 기증하지 않을 수 있다.
9. 환자는 다음의 혈액성 파라미터를 가졌다:
o 절대적인 중성구 수 (ANC) ≥1000/mm3;
o 헤모글로빈 ≥9.0 g/dL;
o 혈소판 수 ≥100,000/mm3.
10. 환자는 적절한 기관 기능을 가졌다:
o 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)/혈청 글루탐산-피루브산 아미노전이효소(SGPT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)/SGOT가 정상인 상한치 (ULN)의 3배 이하, 간 전이가 ULN의 5배 이하인 환자.
o 스크리닝 시 Cockcroft Gault 식을 사용하여, 추정된 크레아티닌 청소능 ≥40 mL/분.
o 총 빌리루빈 ≤2 mg/dL.
o 길버트 증후군 환자는 3 mg/dL 이하의 총 빌리루빈을 가져야 한다.
11. 환자는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV1 및 HIV2)에 대해 혈청검사 음성이었다. 급성 또는 만성 감염을 나타내는 B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg), 간염 B 코어 항체 (항 HBc), 또는 간염 C 바이러스 (항-HCV)에 대한 양성 혈청학이 있는 환자는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 특정 바이러스 노출의 국소 유병률을 기반으로 한 바이러스 부하에 따라 등록되었다.
12. 환자는 제1 연구 치료(즉, NMA-LD 또는 펨브롤리주맙 시작) 이전에 하기 상세히 설명된 바와 같이, 최소 지속기간의 이전 항암 요법(들)으로부터의 휴약 기간을 가졌다:
o 표적 요법: 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), MEK, BRAF, ALK, ROS1 또는 다른-표적화된 제제 (예를 들어, 에를로티닙, 아파티닙, 다코미티닙, 오시머티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 롤라티닙)로의 이전 표적 요법은 치료 시작에 앞서 최소의 14 일의 세척이 제공되는 한 허용되었다.
o 화학요법: 아쥬반트, 네오아쥬반트 또는 최종적인 화학요법/화학방사선은 치료 시작에 앞서 최소의 21 일의 세척이 제공되는 한 허용되었다.
o 코호트 3B만을 위한 면역 요법, 항-PD-1, 다른 mAbs, 또는 백신을 사용한 이전 체크포인트-표적 요법은 NMA-LD 시작 전 21일 이상의 휴약 기간으로 허용되었다.
o 고식적 방사선 요법: 이전 외부빔 방사선은 탈모증, 피부 색소침착 변화, 또는 다른 임상적으로 무의미한 이벤트, 예를 들어, 작은 영역 방사선 피부염 또는 대변절박 또는 요절박을 제외한 모든 방사선-관련된 독성이 등급 1 또는 기준선으로 해결되는 한 허용되었다
o RECIST 1.1을 통해 반응 표적으로 평가되는 종양 병변(들)은 방사선 관문 외부에 있었지만; 관문내에 있는 경우, 이들은 진행상황을 입증해야 한다(상기 포함 기준 참고).
o 수술/사전-계획된 절차: 이전의 수술 과정(들)은 상처 치유가 발생하고 모든 합병증이 해결되고, 종양 절제에 앞서 적어도 14 일이 경과된 경우 (주요 수술 절차에 대해)라면 허용되었다.
13. 환자는 코호트 할당 전에 탈모증 또는 백반증을 제외하고 모든 이전 항암 치료-관련된 유해 사례(TRAE)에서 1 등급 이하(유해 사례에 대한 공통 용어 기준[CTCAE])로 회복되었다.
14. 이전 항암 요법으로부터 안정된 2 등급 이상의 독성을 가진 환자는 의료 모니터와 상담한 후 사례별로 고려되었다.
15. 펨브롤리주맙 치료에 의해 악화될 것으로 합리적으로 예상되지 않는 비가역 독성을 가진 코호트 1A, 2A, 및 3A 환자는 의료 모니터와 상담한 후에만 포함되었다. 코호트 3B의 환자에 한해, 면역 체크포인트 억제제 CPI(들)를 사용한 이전 치료의 결과로 2등급 이상의 설사 또는 결장염이 문서로 기록된 환자는 적어도 6개월 동안 무증상이거나, 종양 절제 전 치료 후에 시각적 평가 결장경검사에서 정상이어야 한다.
16. 환자는 보호된 건강 정보의 사용 및 개시에 대한 서면 허가를 제공해야 한다.
제외 기준
다음의 기준 중 하나를 충족하는 환자는 연구에서 제외되었다:
1. 포도막/안구 기원의 흑색종 환자
2. 지난 20년 이내에 비골수절제 또는 골수절제 화학요법 레지멘을 포함하는 기관 동종이식편 또는 이전 세포 전이 요법을 받은 환자. (주석: 이 기준은 그것의 이전의 TIL 치료와 함께 이전에 NMA-LD 레지멘을 받은 경우를 제외하고, TIL로 재치료 중인 환자에게 적용가능하다.)
3. 증상이 있고/있거나 치료되지 않은 뇌 전이를 갖는 환자.
o ㆍ 뇌 전이가 명확하게-치료된 환자는 의료 모니터와의 논의 후 등록이 고려될 것이며; 치료 시작 전 환자가 2주 이상 동안 임상적으로 안정하다면, 자기 공명 영상 (MRI) 후처리를 통해 새로운 뇌 병변이 없으며, 환자는 진행 중인 코르티코스테로이드 치료가 필요하지 않다.
4. 등록 후 21일 이내에 전신 스테로이드 요법을 받고 있는 환자.
5. 임신 중이거나 모유 수유 중인 환자.
6. 연구원의 의견에 따라 연구 참여에 대한 위험이 증가한 활성 의료 질병; 예컨대 전신 감염(예를 들어, 매독 또는 항생제가 필요한 임의의 다른 감염), 응고 장애, 또는 심혈관, 호흡, 또는 면역계의 다른 활성 주요 의료 질병을 앓고 있는 환자.
7. 환자는 활성 또는 이전에 문서로 기록된 자가면역 또는 염증성 장애 (폐렴, 염증성 장 질환 [예를 들어, 결장염 또는 크론병], 게실염 [게실증의 예외 있음], 전신 홍반성 낭창, 유육종증 증후군, 또는 베게너 증후군 [다발성맥관염이 있는 육아종증, 그레이브스병, 류마티스성 관절염, 뇌하수체염, 포도막염, 등])를 가지지 않을 수 있다. 다음은 이 기준에 대한 예외이다:
o 백반증 또는 탈모증 환자.
o 호르몬 대체 시 갑상선기능저하증(예를 들어, 하시모토 증후군 이후)이 안정한 환자.
o 전신 요법이 필요하지 않은 임의의 만성 피부 병태.
o 식이요법만으로 제어된 소아지방변증이 있는 환자.
8. 치료 시작 전 28일 이내에 생 또는 약독화된 백신접종을 받은 환자.
9. 임의의 형태의 1차 면역결핍 (예컨대 중증 복합성 면역결핍 질환 [SCID] 및 획득된 면역 결핍 증후군 [AIDS])이 있는 환자.
10. 임의의 구성요소의 연구 약물에 대해 과민증의 이력이 있는 환자. TIL은 비제한적으로 다음의 임의의 것을 포함한 임의의 구성요소의 TIL 생성물 제형에 대한 알려진 과민증이 있는 환자에 투여되지 않았다:
o ㆍ NMA-LD (사이클로포스파미드, 메스나, 및 플루다라빈)
o ㆍ 프롤류킨®, 알데스류킨, IL-2
o ㆍ 아미노글리코시드 그룹의 항생제 (즉, 스트렙토마이신, 겐타마이신 [겐타마이신 과민증에 대해 피부-테스트 음성인 자는 제외])
o ㆍ 디메틸 설폭사이드 [DMSO], HSA, IL-2, 및 덱스트란-40을 포함하는 TIL 생성물 제형의 임의의 구성요소
o ㆍ 펨브롤리주맙
11. 좌심실 박출률(LVEF)이 45% 미만이거나, 뉴욕 심장 협회 부류 II 이상인 환자. 임의의 환자 ≥60 세 또는 허혈성 심장 질환, 가슴 통증, 또는 임상적으로 상당한 심방 및/또는 심실 부정맥의 이력이 있는 환자에서 임의의 비가역 벽 운동 비정상을 입증하는 심장 스트레스 테스트.
o 비정상 심장 스트레스 테스트를 받은 환자는, 후원자의 의료 모니터의 승인을 받고 적절한 박출률 및 심장병적 클리어런스가 있다면 등록될 수 있다.
12. 폐쇄성 또는 구속성 폐 질환이 있고, 예측 정상치의 60% 이하의 FEV1(1초에 강제된 호기량)이 기록된, 환자.
o ㆍ 환자가 비정상 상부 기도 해부학(즉, 기관절개술)으로 인해 신뢰할 수 있는 폐활량 측정을 수행할 수 없는 경우, 6-분 걷기 테스트를 사용하여 폐 기능을 평가하였다. 연령 및 성별에 대해 예상된 적어도 80%의 거리를 걸을 수 없거나 테스트 동안 임의의 지점에서 저산소증 (SpO2<90%)의 증거를 입증한 환자는 배제된다.
13. 지난 3년 이내에 또 다른 원발성 악성 종양이 있었던 환자(치료가 필요하지 않거나 1년 이상 전에 치유 치료를 받았거나, 연구원의 판단에 따라 비-흑색종 피부암, DCIS, LCIS, 전립선암 글리슨(Gleason) 점수 ≤6 또는 방광암을 포함하는, 심각한 재발 위험이 없었던 환자는 제외함).
14. 치료 개시의 21 일 이내에 연구용 제품으로 또 다른 임상 연구에 참여.
연구 평가변수 및 계획된 분석
1차 및 2차 평가변수는 코호트 별로 별도로 분석되었다.
1차 평가변수:
ORR은 효능 분석 세트 중에서 RECIST 1.1에 따라 연구원에 의해 평가된 최상의 반응으로 확인된 PR 또는 CR을 달성한 환자의 비율로 정의되었다.
객관적 반응은 각각의 질환 평가에 따라 평가되었고 ORR을 상응하는 양측 90% CI로 이항식 비율로 표현되었다. 각각의 코호트에 대한 주 분석은 평가 기간에서 조기에 진행/만료 또는 중단되지 않는 한, 코호트 당 치료받은 모든 환자가 12개월 동안 추적할 기회를 가질 때 발생하였다.
안전성 1차 평가변수는 상응하는 양측 90% CI로 이항식 비율로 표현된 각각의 코호트 내에서 임의의 3등급 이상의 TEAE 발병률에 의해 측정되었다.
2차 평가변수:
효능:
2차 효능 평가변수는 아래와 같이 정의되었다:
연구원에 의해 평가된 바와 같이 확인된 CR을 달성한 반응군에 기반한 CR 비율. DCR은 확인된 PR/CR 또는 지속된 SD(적어도 6주)를 달성한 환자 수의 합계를 효능 분석 세트의 환자 수 × 100%로 나눈 값이다. CR 비 및 DCR은 점추정 및 그것의 양측 90% CI를 사용하여 요약되었다.
DOR은 객관적 반응을 달성한 환자 중에서 정의되었다. 제1 날자까지 충족되는 제1-시간 반응 (PR/CR) 기준으로부터 재발성 또는 진행성 질환이 객관적으로 문서화되거나, 또는 후속 항암 요법을 받거나 환자가 사망한 첫번째 날(둘 중 처음 기록된 날짜)까지 최초 반응(PR/CR) 기준을 충족하는 것으로 측정되었다. PD를 경험하지 않거나 데이터 절단 또는 최종 데이터베이스 잠금의 시간 이전에 죽지 않은 환자는 종양 상태의 적절한 평가가 이루어지는 마지막 날자에 검열받는 그것의 이벤트 시간을 가질 것이다.
PFS는 림프구고갈 시점으로부터 PD, 또는 임의의 원인으로 인한 사망까지의 시간(개월 단위) 중 더 이른 시간으로 정의되었다. PD를 경험하지 않았거나 데이터 컷 시간 또는 최종 데이터베이스 잠금 이전에 사망하지 않은 환자는 종양 상태에 대한 적절한 평가가 이루어진 마지막 날짜에 이벤트 시간을 검열받을 것이다.
OS는 림프구고갈 시점으로부터, 또는 임의의 원인으로 인한 사망까지의 시간(개월 단위)으로 정의되었다. 데이터 컷 시간 또는 최종 데이터베이스 잠금 이전에 사망하지 않은 환자는 그것의 알려진 생존 상태의 마지막 날짜에 이벤트 시간을 검열받았다.
DOR, PFS, 및 OS는 우측 검열을 거쳤다. 카플란-마이어 방법은 시간 대 이벤트 효능 평가변수를 요약하기 위해 사용될 것이다. 종양 평가에 대한 기준선 데이터는 모든 코호트에 대한 림프구고갈 이전의 마지막 스캔이었다.
상기 효능 파라미터는 기준선 질환 특성; BRAF 상태(코호트 1A 단독), HPV 상태(코호트 2A 단독), 편평상피 또는 비-편평상피 폐 질환(코호트 3A 및 3B 단독), 및 항-PD-L1 상태에 의해 정의된 하위세트에 대해 적용가능한 코호트에 대해 추정될 것이다.
실시예 11: 0일째에서 GEN 3 확장 플랫폼의 예시적인 실시형태
종양 세정 배지를 준비했다. 배지는 시작 이전에 가온했다. 5 mL의 겐타마이신 (50 mg/mL)을500 mL 병의 HBSS에 첨가했다. 5 mL의 종양 세정 배지를 OKT3 희석을 위해 사용되는 15 mL 원추형 튜브에 첨가했다. 실온 (RT)에서 저장한다
피더 세포 백을 준비한다. 피더 세포를 피더 세포 백로 멸균으로 이동하고 사용할 때까지 37℃에서 저장하거나 또는 동결했다. 37℃인 경우 피더 세포를 계수했다. 냉동된 경우 피더 세포를 해동하고 그 다음 계수했다.
피더 세포 농도의 최적의 범위는 5x104 내지 5x106 세포/mL이다. 4.5 mL의 AIM-V를 갖는 4개의 원추형 튜브를 준비했다. 각각의 세포수에 대해 0.5 mL의 세포 분획을 첨가했다.
총 생존가능한 공급기 세포 수가 ≥ 1 x 109 세포인 경우, 피더 세포 농도를 조정하기 위해 다음 단계로 진행했다. 1 x 109 세포를 제2 피더 세포 백에 부가하기 위해 제1 피더 세포 백으로부터 제거되는 피더 세포의 부피를 계산했다.
p1000 마이크로피펫을 사용하여, 900 μl의 종양 세정 배지를 OKT3 분취액 (100 μL)으로 이전했다. 주사기 및 멸균 기술을 사용하여, 0.6 mL의 OKT3을 취출하고 제2 피더 세포 백에 첨가했다. 배지 부피를 총 부피 2 L로 조정했다. 제2 피더 세포 백을 인큐베이터로 이전했다.
OKT3 제형 세부사항: OKT3은 100 ul 분취액에서 바이알로부터 원래의 모액 농도 (1 mg/mL)로 분취되고 냉동될 수 있다. ~10X 분취액/1 mL 바이알. -80C에서 저장했다. 0일째: 15 ug/플라스크, 즉 500 mL 내 30 ng/mL- 60 ul 최대 ~ 1 분취액.
종양 샘플을 준비했다. 6-웰 플레이트 및 100 mm 페트리 접시 (총 4개)를 수득했다. 6 웰 플레이트를 '과잉 종양 조각' 표지했다. 4개의 100 mm 페트리 접시 중 각각의 하나에 'Wash_01', 'Wash_02', 'Wash_03', 'Wash_04', 및 'Holding'으로 표지했다.
과잉 종양 조각 표지된 6-웰 플레이트의 모든 웰들 안으로 5 mL의 종양 세척 배지를 첨가했다. 절개 동안 수화된 종양을 유지하는데 추가로 사용하기 위해 이용가능한 종양 세척 배지를 유지했다.
Wash_01, Wash_02, Wash_03, 및 Holding 표지된 각각의 100 mm 페트리 접시에 50 mL의 종양 세척 배지를 첨가했다. 마커를 사용하여, 각각의 페트리 접시를 절개 1 내지 절개 4로 표지했다. Wash_01에서 ≥ 3분 동안 주위 온도에서 종양을 인큐베이션했다. Wash_02에서 ≥ 3분 동안 주위 온도에서 종양을 인큐베이션했다. Wash_03에서 ≥ 3분 동안 주위 온도에서 종양을 인큐베이션했다. 세척이 완료된 후, 수화된 조직 체류를 보장하기 위해 종양을 'Holding' 접시로 옮겼다.
종양 인큐베이션이 진행되는 동안, 종양 선적 배지 표지된 튜브로 10 mL의 종양 선적 배지를 이동했다. 10 mL의 종양 선적 배지를 주사기로 취출하고 5 mL의 종양 선적 배지로 각각 하나의 혐기성 및 호기성 멸균 병에 접종했다.
전체 절개 공정에 대해 페트리 접시 두껑 아래에 자를 둔다. 종양의 길이 및 단편의 수를 측정 및 기록했다. 종양을 4개의 중간 조각으로 또는 그룹을 동등한 부피의 그룹으로 절개하고 각각의 중간 조각의 종양 구조를 보전했다. 종양 조각을 수화되게 유지했다.
활발히 절개되지 않은 임의의 중간 종양 조각을 Holding 접시로 이전하여 조직을 수화되게 유지했다.
종양을 27 mm3 단편 (3x3x3mm)으로, 기준으로 절개 접시 두껑 아래에 있는 자를 사용하여 절개했다. 60개 단편이 도달될 때까지 중간 단편을 절개했다. 최종 단편의 총수를 계수하고 생성된 최종 단편의 수 (일반적으로 60개 단편/플라스크)에 따라 G-Rex 100MCS 플라스크를 준비했다.
유리한 조직 단편을 단편 튜브 1 내지 단편 튜브 4로 표지된 원추형 튜브에 유지했다. 유래된 단편 튜브의 수에 따라 공급기 세포 현탁액을 갖는 종자로 G-Rex 100MCS 플라스크의 수를 계산했다.
피더 세포 백을 인큐베이터로부터 제거하고 G-Rex 100MCS를 접종한다. D0 (0일째)로 표지한다.
G-REX100MCS에서 종양 단편 첨가 배양
멸균 조건 하에서, G-Rex 100MCS 라벨링된 종양 단편 배양 (D0) 1 및 50 mL 원추형 튜브 라벨링된 단편 튜브의 캡을 스크류하지 않았다. 개방된 단편 튜브 1을 교반하고, 동시에, G-Rex100MCS의 캡을 약간 들었다. 교반되는 동안 G-Rex100MCS에 단편을 갖는 배지를 첨가했다. G-Rex100MCS에 이전된 단편의 수를 기록했다.
단편이 GREX 플라스크의 바닥에 위치되면, 7 mL의 배지를 취출하고 연장된 특성화를 위해 7개의 1 mL 분취액 - 5 mL 및 멸균 샘플을 위해 2 mL를 만들었다. 필요할 때까지 -20℃에서 연장된 특성화를 위한 5 분취액 (최종 단편 배양 상청액)을 저장했다.
각각 1mL의 최종 단편 배양 상청액을 갖는, 하나의 혐기성 BacT/Alert 병 및 하나의 호기성 BacT/Alert 병을 접종했다. 각각의 플라스크에 대해 샘플링이 반복되었다.
실시예 12: 7-8일째에서 E GEN 3 확장 플랫폼의 예시적인 실시형태
피더 세포 백을 준비한다. 냉동된 때 37℃ 수조에서 3-5 분 동안 공급기 백을 해동했다. 냉동된 경우 피더 세포를 계수했다.
피더 세포 농도의 최적의 범위는 5x104 내지 5x106 세포/mL이다. 4.5mL의 AIM-V를 갖는 4개의 원추형 튜브를 준비했다. 각각의 세포수에 대해 0.5 mL의 세포 분획을 새로운 크라이오바이알 튜브에 첨가했다. 샘플을 잘 혼합하고 세포 계수로 진행했다.
총 생존가능한 공급기 세포 수가 ≥ 2 x109 세포였다면, 피더 세포 농도를 조정하기 위해 다음 단계로 진행했다. 제2 피더 세포 백에 2 x 109 세포를 부가하기 위해 제1 피더 세포 백으로부터 제거되는 피더 세포의 부피를 계산했다.
p1000 마이크로피펫을 사용하여, 900 μl의 HBSS를 100 μL의 OKT3 분취액으로 이전했다. 상하로 3회 피펫팅함에 의해 혼합한다. 2개의 분취액을 준비한다.
OKT3 제형 세부사항: OKT3는 100ul 분취액에서 바이알로부터 원래의 모액 농도 (1 mg/mL)로 분취 및 냉동될 수 있다. ~10X 분취액/1mL 바이알. -80C에서 저장했다. 7/8일째: 30 ug/플라스크, 즉 500 mL 내 60ng/mL- 120ul 최대 ~ 2 분취액.
주사기 및 멸균 기술을 사용하여, 0.6 mL의 OKT3을 취출하고 피더 세포 백에 첨가하여, 모든 첨가 상태를 보장한다. 배지 부피를 총 부피 2L로 조정했다. 제2 OKT3 분취액으로 반복하고 피더 세포 백에 첨가했다. 제2 피더 세포 백을 인큐베이터로 이전했다.
공급기 세포 현탁액으로 G-REX100MCS 플라스크 준비
0일째에 생성된 G-Rex 플라스크의 수에 따라 공정에 G-Rex 100MCS 플라스크의 수를 기록했다. G-Rex 플라스크를 인큐베이터로부터 제거하고 제2 피더 세포 백을 인큐베이터로부터 제거했다.
공급기 세포 현탁액 첨가 이전에 상청액의 제거:
하나의 10 mL 주사기를 G-Rex100 플라스크에 연결하고 5 mL의 배지를 취출했다. 연장된 특성화를 위해 5개의 1 mL 분취액 - 5 mL를 만들고 후원자에 의해 요청될 때까지 -20℃에서 연장된 특성화를 위해 5개의 분취액 (최종 단편 배양 상청액)을 저장했다. 각각의 G-Rex100 플라스크에 대해 표지하고 반복했다.
플라스크의 수에 의존한, 특성화를 위한 5-20 X 1 mL 샘플:
ㆍ 5mL = 1개의 플라스크
ㆍ 10 mL = 2개의 플라스크
ㆍ 15 mL = 3개의 플라스크
ㆍ 20 mL =4 플라스크
피더 세포를 G-Rex100 MCS에 계속 씨딩하고 각각의 G-Rex100 MCS 플라스크에 대해 반복했다. 멸균 이전 방법을 사용하여, 각각의 G-Rex 100MCS 플라스크 안으로 중량에 의한 500 mL의 제2 피더 세포 백 (1 g = 1 mL 가정)을 중력 이전하고 양을 기록했다. 7일째 배양으로 표지하고 각각의 G-Rex100 플라스크에 대해 반복했다. G-Rex 100MCS 플라스크를 인큐베이터로 이전했다.
실시예 13: 10 내지 11일째에서 GEN 3 확장 플랫폼의 예시적인 실시형태
제1 G-Rex 100MCS 플라스크를 제거하고 멸균 조건을 사용하여 10 mL 주사기를 사용하여 7 mL의 예비-공정 배양 상청액을 제거했다. 연장된 특성화를 위해 7개의 1 mL 분취액 - 5 mL 및 멸균 샘플을 위해 2 mL를 생성했다.
플라스크를 주의하여 혼합하고 새로운 10 mL 주사기를 사용하여 10 mL 상청액을 제거하고 D10/11 마이코플라스마 상청액으로 라벨링된 15 mL 튜브로 이동했다.
플라스크를 주의하여 혼합하고 새로운 주사기를 사용하여 얼마나 많은 플라스크가 가공되는지에 따라 하기 부피를 제거했다:
ㆍ 1개의 플라스크 = 40 mL
ㆍ 2개의 플라스크 = 20 mL/플라스크
ㆍ 3개의 플라스크 = 13.3mL/플라스크
ㆍ 4 플라스크 = 10 mL/플라스크
총 40 mL가 모든 플라스크로부터 인출되고 '일 10/11 QC 샘플'로 표지된 50 mL 원추형 튜브에 풀링되고 필요할 때까지 인큐베이터에 저장되었다. 세포 계수를 수행하고 세포를 할당했다.
필요할 때까지 ≤-20℃에서 연장된 특성화를 위해 5개의 분취액 (예비-공정 배양 상청액)을 저장했다. 각각 1mL의 예비-공정 배양 상청액으로 하나의 혐기성 BacT/Alert 병 및 하나의 호기성 BacT/Alert 병을 접종했다.
G-Rex 500MCS로 세포 현탁액 이동을 계속하고 각각의 G-Rex 100MCS에 대해 반복했다. 멸균 조건을 사용하여, 각 G-Rex 100MCS의 함량을 G-Rex 500MCS 안으로 이전하여, 한 번에 약 100 mL의 유체 이동을 모니터링했다. G-Rex 100MCS의 부피가 500 mL로 감소될 때 이동을 중단했다.
이동 단계 동안, 10 mL 주사기를 사용하고 G-Rex 100MCS로부터 주사기 안으로 10 mL의 세포 현탁액을 취출했다. 배양에서 플라스크의 번호에 따른 설명이 이어졌다. 단지 1개의 플라스크 경우: 총 20 mL를 2개의 주사기를 사용하여 제거했다. 2개의 플라스크 경우: 10 mL /플라스크를 제거했다. 3개의 플라스크 경우: 7 mL /플라스크를 제거했다. 4 플라스크 경우: 5 mL /플라스크를 제거했다. 세포 현탁액을 하나의 일반 50 mL 원추형 튜브로 이전했다. 세포 계수 단계 및 QC 샘플까지 인큐베이터에 유지했다. QC에 필요한 세포의 총수는 ~ 20e6 세포: 4 x 0.5 mL 세포 계수였다 (세포 계수는 처음에 희석되지 않았다).
검정에 필요한 세포:
ㆍ IFN-G 검정에 대해 최소 10e6 세포
ㆍ 마이코플라스마에 대해 1e6 세포
ㆍ 5e6 세포 유동 CD3+/CD45+
G-Rex 500MCS 플라스크를 인큐베이터로 이전했다.
QC 샘플을 준비했다
적어도 15 x 108이 필요했다. 포함된 검정: 세포수 및 생존력; 마이코플라스마 (1 x 106 세포/평균 생존가능한 농도;) 유동 (5 x 106 세포/평균 생존가능한 농도;) 및 IFN-g 검정 (5 x 10 6 세포 - 1 x 10 6 세포; 8-10 x 106 세포가 IFN-γ 검정에 필요하다.
10 x 106 세포/mL에서 동결보존을 위한 세포 분획의 부피를 계산하고 준비하기 위한 바이알의 수를 계산했다.
실시예 14: 16-17일째 GEN 3 확장 플랫폼의 예시적인 실시형태
세정 버퍼 준비 (1% HAS 플라즈마라이트 A)
HAS 및 플라즈마라이트를 5L 백으로 이전하여 LOVO 세정 버퍼를 제조했다. 멸균 조건을 사용하여, 총 부피 125 mL의 25% HAS를 5L 백으로 이전했다. 실온에서 저장했다.
10 mL 또는 40 mL의 세정 버퍼를 'IL-2 6 x 104 IU/mL' 튜브로 제거 및 이전했다 (IL-2가 미리 제조된 경우 10 mL 또는 IL-2가 신선하게 제조된 경우 40 mL).
플라즈마라이트+ 1% HAS에 부가되는 재구성된 IL-2의 부피를 계산했다: 재구성된 IL-2의 부피 = (IL-2의 최종 농도 x 최종 부피)/ IL-2의 고유 활성도 (표준 검정에 기반). IL-2의 최종 농도는 6 x 104 IU/mL였다. 최종 부피는 40 mL였다.
재구성된 IL-2에 필요한 IL-2의 계산된 초기 부피를 제거하고 'IL-2 6x104 IU/mL' 튜브로 이동한다. 10 mL의 LOVO 세정 버퍼를 함유하는 'IL-2 6x104 IU/mL' 라벨링된 튜브에 미리 제조된 분취액으로부터 100 μL의 IL-2 6x106 IU/mL를 첨가했다.
약 4500 mL의 상청액을 G-Rex 500MCS 플라스크로부터 제거했다. 남아 있는 상청액을 교반하고 세포를 세포 수집 풀 백으로 이전했다. 모든 G-Rex 500MCS 플라스크로 반복했다.
60 mL의 상청액을 제거하고 마이코플라스마 검출을 포함한 품질 대조군 검정을 위한 상청액 튜브에 부가한다. +2-8℃에서 저장했다.
세포 수집
세포를 계수했다. 4.5 mL의 AIM-V를 갖는4개의 15 mL 원추형 튜브를 준비한다. 이들은 미리 준비될 수 있다. 최적의 범위 = 5x104 내지 5x106 세포/mL이다. (1:10 희석이 권고된다). 1:10 희석을 위해, 이전에 준비된 4500 μL의 AIM V에 500 μL의 CF를 부가한다. 기록된 희석 인자.
Figure pct00062
Figure pct00063
총 세포 (TC) 수가 > 5 x 109일 때, MDA 정체 샘플로 동결보존되어 지도록 5 x 108 세포를 제거한다. 5 x 108 ÷ avg TC 농도 (단계 14.44) = 제거할 부피
총 세포 (TC) 수가 ≤ 5 x 109일 때, MDA 정체 샘플로 동결보존되어 지도록 4 x 106 세포를 제거한다. 4 x 106 ÷ avg TC 농도 = 제거할 부피.
LOVO 공급원 백으로부터 필요한 부피를 제거하기 위해 적절한 크기의 주사기를 사용했다. 동결보존 단계들까지 인큐베이터에서 유지했다.
총 세포 수가 결정될 때, 제거될 세포의 수는 150x109 생존가능 세포의 정체를 허용해야한다. TVC 예비-LOVO 5 x 108 또는 4 x 106 또는 해당 없음을 확인한다. 제거되는 세포의 부피를 계산했다.
백에 잔존하는 남아 있는 총 세포를 계산했다. TC (총 세포) 예비-LOVO를 계산했다. [Avg. 총 세포 농도 X 남아 있는 부피 = 남아 있는 TC 예비-LOVO]
남아 있는 세포의 총수에 따라, 다음의 표에서 상응하는 공정을 선택했다:
Figure pct00064
사용된 공정에 상응하여 부가되는 IL-2의 부피를 채택한다. 계산된 부피: 보전물 부피 x 2 x 300 IU/mL = 필요한 IL-2 IU. 필요한 IL-2 IU / 6 x104 IU/mL = 포스트 LOVO 백에 부가하는 IL-2의 부피. 첨가된 모든 부피를 기록하였다. 추가 분석을 위해 냉동바이알에서 샘플을 수득했다.
세포 생성물을 잘 혼합했다. 추가 가공을 위해 모든 백을 밀봉하고, 적용가능할 때 동결보존을 포함했다.
수득된 냉동바이알 샘플 상에서 Enodxoton, IFN-γ, 멸균, 및 다른 검정을 필요에 따라 수행했다.
실시예 15: 예시적인 GEN 3 공정 (또한 GEN 3.1로 지칭됨)
목적
본 실시예는 "TIL 확장에 대한 Gen 2 및 Gen 3 공정 사이의 비교가능성"에 관한 추가 연구를 기술한다. Gen 3 공정은 이전에 나타낸 바와 같이 표현형 및 기능적 프로파일을 유지하면서 Gen 2에서의 것에 비교가능한 (또는 더 나은) 최종 총 생존가능 세포 (TVC) 출력을 증가시키는 목표로 공정에서 조기 활성화 단계를 포함하도록 변형되었다.
범위
0일째에 배양된 종양 단편에 활성화 단계의 도입을 통해 TVC 출력을 평가했다.
두 독립적인 환자 종양에 걸쳐서, Gen 3 표준으로 기능적 및 연장된 표현형 특성화뿐만 아니라 대조군 아암 관점에서 비교가능성을 입증했다.
가공 파라미터가 생리적 조건에 유지되었는지를 확인하기 위해 배지 소비 및 대사산물 생산을 분석했다.
본 실시예에 대한 모든 실행은 출발 물질로 상업적 공여체 종양 조직을 사용하여 전체-규모 플랫폼에서 수행되었다.
정보
공정 Gen 3 실시형태는 추가의 실시형태로 변형되었고 여기서 이 실시예에서 Gen 3.1로 언급된다.
Gen 3.1 TIL 제조 개념은 4개의 오퍼레이터 개입을 갖는다:
1. 종양 단편 단리 및 활성화: 공정의 0일째에서 종양은 절개되고 최종 단편은 각각 외경~3x3mm (최대 총 240 단편)를 생성했고 1-4 G-Rex100MCS 플라스크에 배양되었다. 각각의 플라스크는 최대 60 단편, 500 mL의 CM1 또는 DM1 배지를 함유했고, 6,000 IU rhIL-2, 15 μg OKT3, 및 2.5x108 조사된 동종이계 단핵 세포로 보충되었다. 배양물은 37℃에서 6-8일 동안 인큐베이션되었다.
2. TIL 배양물 재활성화: 7-8일째에서 배양물은 양 경우에서 6,000 IU rhIL-2, 30 μg OKT3, 및 5x108 조사된 동종이계 단핵 세포가 보충된 CM2 또는 DM1 배지의 느린 첨가를 통해 보충되었다. 플라스크의 바닥에서 기존의 세포를 교란하지 않도록 주의한다. 배양물은 37℃에서 3-4일 동안 인큐베이션되었다.
3. 배양물 확대: 10 내지 11일째에서 일어난다. 배양물 규모확대 동안, G-Rex100MCS의 전체 내용물이 양 경우에서 3,000 IU/mL의 IL-2로 보충된 4L의 CM4 또는 DM2를 함유하는 G-Rex500MCS 플라스크로 이동되었다. 플라스크는 수확 시까지 37℃에서 5-6일 동안 인큐베이션되었다.
4. 수확/세척/제형화: 16-17일째에서 플라스크는 부피 감소되고 풀링된다. 세포는 농축되고 1% HAS를 함유하는 플라즈마라이트 A pH 7.4로 세척되었다. 세척된 세포 현탁액은 CryoStor10과 1:1 비로 제형화되고 최종 농도 300 IU/mL로 rhIL-2로 보충되었다.
DP는 제어된 속도 동결로 동결보존되고 증기상 액체 질소에 저장되었다. *완전한 표준 TIL 배지 1, 2, 또는 4 (CM1, CM2, CM4)는, 전술한 바와 같이, 한정 배지 (DM1 또는 DM2)로 언급된, CTS™OpTmizer™ T-세포 무혈청 확장 배지에 대해 치환될 수 있다. 공정 개요에 대해, 예를 들어, 도 78 및 79 참고.
공정 설명
0일째에서, 종양은 3회 세척되고 그 다음 3x3x3 최종 단편으로 단편화되었다. 일단 전체의 종양이 단편화되면, 최종 단편은 동등하게 랜덤추출되고 3개의 풀로 나누어진다. 하나의 랜덤화된 단편 풀은 3 실험적 매트릭스 당 동일한 단편의 수를 부가하는 각각의 암에 도입되었다.
종양 L4063 확장은 표준 배지로 수행되었고 종양 L4064 확장은 전체 TIL 확장 공정에 대해 한정 배지 (CTS OpTmizer)로 수행되었다. 배지의 구성요소는 본원에 기재되어 있다.
CM1 완전 배지 1: RPMI+ 2 mM Glutamax로 보충된 글루타민, 10% 인간 AB 혈청, 겐타마이신 (50 ug/mL), 2-머캅토에탄올 (55 uM). 6000 IU/mL IL-2로 보충된 최종 배지 제형
CM2 완전 배지 2: 50% CM1 배지 + 50% AIM-V 배지. 6000 IU/mL IL-2로 보충된 최종 배지 제형
CM4 완전 배지 4: Glutamax (2 mM)으로 보충된 AIM-V. 3000 IU/mL IL-2로 보충된 최종 배지 제형
CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 보충물 (26mL/L)으로 보충된 CTS OpTmizer CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 기초 배지.
DM1: CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 보충물 (26mL/L)으로 보충된 CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 기초 배지, 및 Glutamax (2 mM)를 갖는, CTS™ 면역 세포 SR (3%). 6,000 IU/mL의 IL-2로 보충된 최종 제형.
DM2: CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 보충물 (26mL/L)으로 보충된 CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 기초 배지, 및 Glutamax (2 mM)를 갖는 CTS™ 면역 세포 SR (3%). 3,000 IU/mL의 IL-2로 보충된 최종 제형.
사용된 모든 유형의 배지, 즉, 완전한 (CM) 및 정의된 (DM) 배지는 미리 제조되고 사용 전날까지 4℃에서 유지되었고 공정 일 이전에 미리 최대 24 시간 동안 인큐베이터에서 37℃로 가온되었다.
TIL 배양물 재활성화는 양 종양에 대해 7일째에 발생했다. 규모확대는 L4063에 대해 10일째 및 L4064에 대해 11일째에서 발생했다. 양 배양물을 16일째에서 수확되고 동결보존되었다.
예상된 결과
Gen 3.1은 Gen 3.0에 비교하여 16-17일째에 수확에서 더 높은 총 생존가능 세포 수에 도달할 수 있다.
Gen 3.1은 재자극 후, Gen 3.0에 비하여 유사한 수준의 IFN-를 생산할 수 있다.
Gen 3.1 및 Gen 3.0은 최종 TIL 생성물에 존재하는 총 고유한 CDR3 서열에 의해 측정된, 유사한 클론 다양성을 가질 수 있다.
Gen 3.1 공정에서 표현형 특성은 Gen 3.0에 유사할 수 있다.
달성된 결과
Gen 3.0 및 Gen 3.1 공정에 대해 계수된 세포 및 % 생존력이 결정되었다. 모든 조건에서 확장은 이 실시예에 기재된 세부사항을 따랐다.
총 생존가능 세포 수 및 배수 확장
각각의 종양에 대해, 단편은 동등한 수의 3개의 풀로 나누어진다. 작은 크기의 종양에 기인하여, 최대 수의 단편 /플라스크는 달성되지 않았다. 3개의 상이한 공정에 대해, 총 생존가능 세포 및 세포 생존력은 각각의 조건에 대해 평가되었다. 세포수는 재활성화에 대해 7일째에 TVC, 규모확대에 대해 10일째 (L4064) 또는 11일째 (L4063)에서 TVC, 및 16/17일째에 수확에서 TVC로 결정되었다.
7일째 및 10/11일째에 대한 세포수는 FIO를 취했다. 배수 확장은 수확 16/17일째 TVC를 7일째 재활성화 일 TVC로 나눔에 의해 계산되었다. 3개의 암을 비교하기 위해, 수확 일에서의 TVC는 단편당 생존가능 세포의 평균을 계산하기 위해 0일째에서의 배양물에 첨가된 단편의 수로 나누어졌다.
세포수 및 생존력 검정은 L4063 및 L4064에 대해 수행되었다. 도 89에 표시된 바와 같이, Gen 3.1-테스트 공정은 양 종양에 대해 Gen 3.0 공정보다 단편 당 많은 세포를 생산했다.
도 90: 총 생존가능 세포수 및 배수 확장
상기 공정 동안에% 생존력
재활성화, 확대 및 수확에서 퍼센트 생존력은 모든 조건에 대해 수행되었다. 16/17일째에 수확에서, 최종 TVC는 % 생존력에 대한 방출 기준에 대해 비교되었다. 모든 평가된 조건은 70% 생존력 기준을 능가했고 도 82에 도시된 바와 같은 공정 및 종양에 걸쳐서 비교가능했다.
면역표현형검사
TIL 최종 생성물에 대한 표현형 특성화.
최종 산물은 순도, 차별화, 및 기억 마커를 시험하기 위해 유세포측정 분석을 거쳤다. 퍼센트 집단은 모든 조건에 대해 TCRα/β, CD4+ 및 CD8+ 세포에 대해 일관되었다.
REP TIL의 연장된 표현형 분석이 수행되었다. TIL 생성물은 양 종양에 대해 Gen 3.0에 비교하여 Gen 3.1 조건에 대해 더 높은 백분율의 CD4+ 세포, 및 양 조건에 대해 Gen 3.1에 비교하여 Gen 3.0에 대한 CD8+ 집단으로부터 더 높은 백분율의 CD28+ 세포를 나타냈다.
Gen 3.0 및 Gen 3.1 공정으로부터 수확된 TIL은 CD4+및 CD8+ 세포 상에 CD27 및 CD56 발현으로 비교가능한 표현형 마커, 및 CD4+ 게이팅된 세포 집단 상에 비교가능한 CD28 발현을 나타냈다. 도 83는 Gen 3.0 및 Gen 3.1 공정에 대한 최종 TIL 생성물의 표현형 마커를 도시한다. 도 83: L4063 및 L4064에 대한 최종 TIL 생성물의 표현형 특성화.
TIL 최종 생성물에 대한 기억 마커 비교:
도 84는 다색 유세포측정에 의해 결정된 TIL 최종 생성물의 기억 마커를 도시한다. 16일째에서 수확된 TIL의 냉동된 샘플은 분석을 위해 염색되었다. TIL 기억 상태는 Gen 3.0과 Gen 3.1 공정 사이에 비교가능하였다. 도 84: L4063 및 L4064에 대한 TIL 생성물의 기억 마커 분석.
TIL 최종 생성물에 대한 활성화 및 고갈 마커 비교:
도 85 및 86은 다색 유세포측정에 의해 결정된 TIL의 활성화 및 고갈 최종 생성물을 도시한다. 활성화 및 고갈 마커는 CD4+ (도 85) 및 CD8+ (도 86) 세포 상에 게이팅된 Gen 3.0과 Gen 3.1 공정 사이에 비교가능했다. 도 85: L4063 및 L4064에 대한 CD4+ 세포 상에 게이팅된 활성화 및 고갈 마커. 도 86: L4063 및 L4064에 대해 CD8+ 세포 상에 게이팅된 활성화 및 고갈 마커.
재자극 시 인터페론 감마 분비:
수확된 TIL은 L4063 및 L4064에 대해 코팅된 항-CD3 플레이트로 밤새 재자극을 받았다. Gen 3.1 공정으로부터 IFNγ의 더 높은 생산이 Gen 3.0 공정에 비교하여 분석된 두 종양에서 관찰되었다. 각각의 조건에서 IFNγ 생산은 도 87에 도시되어 있다. 도 87: 공정 Gen 3.0 및 Gen 3.1에서 최종 산물에 대한 IFN-γ 생성 (pg/mL).
배양 배지에서 IL-2 수준의 측정
모든 조건과 공정 사이에 IL-2 소비의 수준을 비교하기 위해, 세포 상청액이 7일째에서 재활성화의 개시, 규모확대 10일째 (L4064) / 11일째 (L4063), 및 수확 16 / 17일째에서 수집되었고, 냉동되었다. 상청액은 후속으로 해동되고 그 다음 분석되었다. 세포 배양 상청액에서 IL-2의 양은 제조자 프로토콜에 의해 측정되었다. 데이터는 도 88에 도시되어 있다.
전반적으로 Gen 3 및 Gen 3.1 공정은 동일한 배지 조건에 걸쳐서 평가된 완전한 공정 동안 IL-2 소비의 관점에서 비교가능했다. 도 88: L4063 및 L4064에 대해 수집된 소비된 배지에 대한 IL-2 농도 (pg/mL) 분석.
대사산물 분석
소비된 배지 상청액은 L4063 및 L4064에 대해, 모든 조건에 대해 7일째에서 재활성화 개시, 10일째 (L4064) 또는 11일째 (L4063)에서 규모확대 및 16/17일째에서 수확에서 L4063 및 L4064로부터 수집되었다. 상청액은 글루코스, 락테이트, 글루타민, GlutaMAX, 및 암모니아의 농도에 대해 CEDEX Bio-분석기 상에서 분석되었다. 도 89는 L4063 및 L4064 종양에 대한 Gen 3.0 및 Gen 3.1 공정에 대해 수집된 소비된 배지에서 글루코스의 농도를 도시한다.
한정 배지는 완전 배지 (2g/L)에 비교하여 4.5 g/L의 더 높은 글루코스 농도를 갖는다. 전반적으로, 글루코스의 농도 및 소비는 각각의 배지 유형 내에서 Gen 3.0 및 Gen 3.1 공정에 대해 비교가능하였다. 도 89: L4063 및 L4064에 대해 소비된 배지에서 글루코스의 농도 (g/L).
락테이트에서 증가는 모든 시험 조건에 대해 양 종양, L4063 및 L4064에 대해 관찰되었다. 락테이트에서 증가는 Gen 3.0과 Gen 3.1 조건 사이와 재활성화 확장에 사용된 두 배지 (L4063에 대해 완전 배지 및 L4064에 대해 한정 배지) 사이에서 비교가능했다.
도 90은 양 종양 L4063 및 L4064에 대한 Gen 3.0 및 Gen 3.1 공정 조건에 대해 수집된 소비된 배지 상의 락테이트의 농도를 도시한다. 도 90: L4063 및 L4064에 대해 소비된 배지에서 락테이트의 농도 (g/L).
L4063의 경우에, 표준 기초 배지는 2 mM L-글루타민을 함유했고 L-글루타메이트 및 암모니아에 대한 배양 조건에서 L-글루타민의 천연 분해를 보상하기 위해 2 mM의 GlutaMAX로 보충되었다.
L4064 종양 경우, 사용된 정의된 (무혈청) 배지는 기초 배지 상에 L-글루타민을 함유하지 않았고, 최종 농도 2 mM로 GlutaMAX 만으로 보충되었다. GlutaMAX는 L-알라닌 및 L-글루타민의 디펩티드이고, 수용액에서 L-글루타민보다 안정하고 글루타메이트 및 암모니아로 자발적으로 분해하지 않았다. 대신에, 디펩티드는 개별 아미노산으로 점진적으로 해리되고, 그에 따라 강건한 세포 성장을 유지하도록 낮지만 충분한 농도의 L-글루타민을 유지했다. 도 91 및 도 92는 양 종양 L4063 및 L4064에 대한 Gen 3.0 및 Gen 3.1 공정 조건에 대해 수집된 소비된 배지 상에 글루타민 및 GlutaMAX 각각의 농도를 도시한다.
L4063 경우, 글루타민 및 GlutaMAX의 농도는 규모확대일에 약간 줄어들었으나, 수확 일에서는 재활성화 일에 비교하여 유사한 또는 근접한 수준으로 증가를 나타냈다. L4064 경우, 글루타민 및 GlutaMAX 농도는 전체의 공정 동안 상이한 조건 간에 유사한 비로 완만한 분해를 나타냈다. 도 91: L4063 및 L4064에 대한 소비된 배지에서 글루타민의 농도 (mmol/L). 도 92: L4063 및 L4064에 대한 소비된 배지에서 GlutaMAX의 농도 (mmol/L).
도 93은 양 종양 L4063 및 L4064에 대한 Gen 3.0 및 Gen 3.1 공정에 대해 수집된 소비된 배지 상에 암모니아의 농도를 도시한다. 예상된 바와 같이, 암모니아 농도는 L4064 (2 mM의 GlutaMAX를 함유하는 한정 배지에서 성장됨)보다 L4063 (2 mM의 글루타민 + 2 mM의 GlutaMAX를 함유하는 표준 배지에서 성장됨)에 대해 더 높았다. 또한, 예상된 바와 같이, 배양의 과정에 걸쳐서 암모니아의 점진적인 증가 또는 축적이 있었다. 3 상이한 시험 조건에 걸쳐서 암모니아 농도에서 차이는 없었다. 도 93: L4063 및 L4064에 대한 소비된 배지에서 암모니아의 농도 (mmol/L).
유동 - FISH에 의한 텔로미어 반복:
유동-FISH 기술은 Gen 3 및 Gen 3.1 공정 하에서 L4063 및 L4064 상의 텔로미어 반복의 평균 길이를 측정하기 위해 사용되었다. 상대 텔로미어 길이 (RTL)의 결정은 DAKO로부터 유세포측정 분석을 위한 텔로미어 PNA 키트/FITC를 사용하여 계산되었다. 텔로미어 검정이 수행되었다.
L4063 및 L4064의 샘플에서 텔로미어 길이는 대조군 세포주 (1301 백혈병)에 비교되었다. 대조군 세포주는 상대 텔로미어 길이의 계산을 허용하는 긴 안정한 텔로미어를 갖는 4배체 세포주이다. 두 종양에서 평가된 Gen 3 및 Gen 3.1 공정은 도 94에서 나타낸 바와 같이 비교가능한 텔로미어 길이를 나타냈다. 도 94: 대조군 (1301) 세포주에 비교된 상대 텔로미어 길이 (RTL)의 요약.
TCR Vβ 레퍼토리 분석
각각의 공정에서 생성된 세포 생성물의 클론 다양성을 결정하기 위해, TIL 최종 생성물을 T-세포 수용체의 CDR3 부분의 서열분석을 통해 클론 다양성 분석에 대해 검정되었다.
3개의 파라미터가 3개 조건 간에 비교되었다:
ㆍ 고유한 CDR3 (uCDR3)의 다양성 지수
ㆍ % 공유된 uCDR3
ㆍ 최상부 경우 80%의 uCDR3:
o % 공유된 uCDR3 카피를 비교한다
o 고유한 클론형의 빈도를 비교한다
도 95: L4063 및 L4064에 대한 TCR Vβ 레퍼토리 요약. TCR Vβ 레퍼토리에 의해 측정된 Gen 3 및 Gen 3.1 조건에 대한 종양 L4063 및 L4064 상의 최종 TIL 생성물에 대한 TIL의 클론형성능을 기술한다.
도 97: Gen 3과 Gen3.1 대조군 간의 비교 및 Gen 3.1 테스트, TIL 수확된 세포 생성물에 대한 L4063 상의 백분율 공유된 고유한 CDR3 서열: 975 서열은 Gen 3과 Gen 3.1 테스트 최종 생성물 사이에 공유되고, Gen 3.1 테스트 최종 생성물과 공유된 Gen 3으로부터 고유한 CDR3 서열의 최상부 80%의 88%에 동등하다.
도 96: Gen 3.0과 Gen 3.1 공정 사이 TIL 수확된 최종 세포 생성물 상의 고유한 CDR3 서열의 L4063 빈도 비교.
도 98: Gen 3과 Gen3.1 대조군 간의 비교 및 Gen 3.1 테스트, TIL 수확된 세포 생성물에 대한 L4064 상의 백분율 공유된 고유한 CDR3 서열: 2163 서열은 Gen 3과 Gen 3.1 테스트 최종 생성물 사이에 공유되고, Gen 3.1 테스트 최종 생성물과 공유된 Gen 3으로부터 고유한 CDR3 서열의 최상부 80%의 87%에 동등하다.
도 99: Gen 3.0과 Gen 3.1 공정 사이 TIL 수확된 최종 세포 생성물 상의 고유한 CDR3 서열의 L4064 빈도 비교.
상이한 공정에 대한 수확 16일째에서 수집된 1x106 세포로부터 확인된 고유한 CD3 서열의 수. Gen 3.1 테스트 조건은 샘플 내에서 고유한 펩티드 CDR의 수를 기준으로 Gen 3.0에 비교하여 약간 더 높은 클론 다양성을 나타냈다.
샤논 엔트로피 다양성 지수는 보다 신뢰할 수 있고 Gen 3 공정보다 약간 더 높은 다양성을 나타낸 양 종양 상에서 Gen 3.1 조건에 대해 비교하기 위해 일반적인 척도이며, Gen 3.1 테스트 조건에 대한 TCR Vβ 레퍼토리는 Gen 3.0 공정보다 다클론성이다는 것을 시사한다.
추가로, Gen 3.1 테스트 조건에 대한 TCR Vβ 레퍼토리는 양 종양 L4063 및 L4064에 대한 Gen 3.0 공정에 대해 상응하는 레퍼토리와 87% 초과 중첩을 나타냈다.
추가의 정보
재활성화 일에서 Gen 3.1 테스트 L4064에 대한 소비된 배지 상의 IL-2 농도의 값은 예상된 값 이하였다 (Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.0 조건에 유사함).
낮은 값은 피펫팅 실수에 기인할 수 있으나, 최소 샘플을 취했기 때문에 검정을 반복하는 것은 불가능하였다.
샘플 L4064에 대해 10/11일째 확대로부터 소비된 배지는 수집되지 않았고, 상청액에 대해 IL-2 농도의 분석 및 대사산물 분석에 포함되지 않았다.
결론
0일째에서 공급기 및 OKT-3을 포함한 Gen 3.1 테스트 조건은 Gen 3.0 및 Gen 3.1 대조군에 비교하여 수확 16일째에서 세포 용량의 더 높은 TVC를 나타냈다. Gen 3.1 테스트 조건에 대한 최종 산물 상의 TVC는 Gen 3.0보다 대략 2.5배 더 높았다.
양 종양 L4063 및 L4064에 대한, 0일째에서 OKT-3 및 공급기의 첨가를 한 Gen 3.1 테스트 조건은 수확에서 플라스크의 최대 수용력에 도달했다. 이들 조건 하에서, 0일째에서 최대 4 플라스크가 개시되면, 최종 세포 용량은 80 - 100E+09 TIL 사이일 수 있다.
모든 품질 속성 예컨대 최종 TIL 생성물에 대한 순도, 고갈, 활성화 및 기억 마커를 포함한 표현형 특성화가 유지되었고 Gen 3.1 테스트 및 Gen 3.0 공정 간에 비교가능하였다. TIL 최종 생성물 상의 텔로미어 길이 및 소비된 배지 상의 IL-2 소비는 Gen 3.0 및 Gen 3.1 공정 간에 비교가능하였다.
최종 TIL 생성물 상의 IFN 감마 생산은 분석된 두 종양에서 Gen 3.0에 비교하여 0일째에서 공급기 및 OKT-3 첨가로 Gen 3.1에 대해 3배 더 높아, Gen 3.1 공정이 강력한 TIL 생성물을 생성했다는 것을 시사한다.
시험 조건에 걸쳐서 글루코스 또는 락테이트 수준에서 차이가 관찰되지 않았다. 배지 조건에 걸쳐서 Gen 3.0 및 Gen 3.1 공정 간에 글루타민 및 암모니아에 대해 차이가 관찰되지 않았다. 배지 상의 저수준의 글루타민은 세포 성장을 제한하지 않고 배지에 단지 GlutaMAX의 첨가가 세포를 증식하기 위해 필요한 영양소를 제공하기에 충분하다는 것을 시사한다.
L4063 및 L4064에 대한 확대 일은 각각 11일째 및 10일째였고 공정의 수확 일에서 도달된 세포 수의 관점에서 주요한 차이를 나타내지 않았고 대사산물 소비는 전체의 공정 동안 양 경우에서 비교가능하였다. 이 관찰은 Gen 3.0 최적화된 공정이 프로세싱 일에 대한 유연성을 가질 수 있고 그에 따라 제조 스케줄에서 유연성을 용이하게 한다는 것을 시사한다.
0일째에서 공급기 및 OKT-3 첨가를 갖는 Gen 3.1 공정은 Gen 3.0에 비교하여 CDR3 TCRab 서열 분석에 의해 측정된 더 높은 클론 다양성을 나타냈다.
도 100은 Gen 3 공정 (Gen 3 최적화된 공정)의 실시형태를 기술한다. 표준 배지 및 CTS Optimizer 무혈청 배지는 Gen 3 최적화된 공정 TIL 확장에 사용될 수 있다. CTS Optimizer 무혈청 배지의 경우에는 최종 농도 4mM로 배지 상에 GlutaMAX를 증가시키는 것이 권고된다.
실행성 및 비교가능성:
실행성:
실행성은 모든 실험에서 모든 연구에 대해 확립되었다. 모든 실험 및 조건에 걸쳐 그리고 공여체 종양 조직 간에, 모든 실험은 중요한 원료 예컨대 IL-2, 인간 혈청-AB, 동종이계 피더 세포, OKT-3의 동일한 분량을 이용하여 수행되었다.
비교가능성:
비교가능성은 도 101에 약술된 바와 같이 22일째에 동결보존된 LFP-002 자가 종양 침윤 림프구 (TIL)에 따른 본 발명자의 임상 생성물의 방출 기준을 충족하는 연구의 임의의 암의 능력에 의해 결정되었다.
실시예 16: 한정 배지로 종양 확장 공정.
실시예 7 내지 15에 개시된 공정은 본 발명에 따른 한정 배지 (예를 들어, CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM, ThermoFisher, 예를 들어 DM1 및 DM2를 포함함)로 CM1 및 CM2 배지를 치환함으로 수행된다.
실시예 17: 고형 종양이 있는 환자에서 자가 종양 침윤 림프구의 2상, 다중중심 연구
연구 설계
개요
본 실시예는 펨브롤리주맙과 조합한 TIL을 사용하여, 또는 단일 요법으로서 TIL을 사용하여, 본원뿐만 아니라 이 실시예에 기재된 바와 같이 제조된 TIL을 사용하여, ACT를 평가하는 전향적, 개방 라벨, 다중-코호트, 비-랜덤화된, 다중중심 2상 연구를 설명한다.
목적:
1차:
연구원에 의해 평가된 고형 종양에서의 반응 평가 기준(RECIST 1.1)을 사용하여, 객관적 반응 속도(ORR)에 의해 결정된, MM, HNSCC, 또는 NSCLC 환자에서 펨브롤리주맙과 조합된 자가 TIL의 효능을 평가하기 위해, 이전에 CPI로 치료 시에 이미 진행된, 또는 치료 후에 진행된 재발성 또는 불응성(r/r) NSCLC 환자에서 단일 요법으로서 TIL의 효능을 평가하기 위해.
등급 ≥ 3 치료 후 발생한 유해 사례(TEAE)의 발병률에 의해 측정된 바와 같이, MM, HNSCC, 또는 NSCLC 환자에서 펨브롤리주맙과 조합된 TIL 또는 r/r NSCLC 환자에서 단일 요법으로서 TIL의 안전성 프로파일을 특성화하기 위해.
2차:
완전 반응(CR) 속도, 반응의 지속기간(DOR), 질환 통제율(DCR), 연구원에 의해 평가된 바와 같은, RECIST 1.1을 사용한 무진행 생존(PFS), 및 전체 생존(OS)을 사용하여, MM, HNSCC, 또는 NSCLC 환자에서 펨브롤리주맙과 조합된 자가 TIL 또는 r/r NSCLC 환자에서 단일 요법으로서 TIL의 효능을 추가로 평가하기 위해.
코호트:
코호트 1A: 면역요법을 제외한 전신 요법의 3개 이하의 이전 라인으로 IIIC기 또는 IV기 절제불가능 또는 MM을 갖는 환자에서 펨브롤리주맙과 조합한 TIL 요법. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 치료 시 또는 치료 후에 방사선 사진으로 진행이 기록되어 있을 필요가 있다.
코호트 2A: 진행성, 재발성 또는 전이성 HNSCC (예를 들어, T1N1-N2B기, T2-4N0-N2b기)가 있는 환자에서, 면역요법을 제외한 3개 이하의 이전 라인의 전신 요법으로 펨브롤리주맙과 조합한 TIL 요법. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 치료 시 또는 치료 후에 방사선 사진으로 진행이 기록되어 있을 필요가 있다.
코호트 3A: 면역요법을 제외한 전신 요법의 3개 이하의 이전 라인으로 국소진행성 또는 전이성(III기~IV기) NSCLC 환자에서 펨브롤리주맙과 조합한 TIL 요법. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 치료 시 또는 치료 후에 방사선 사진으로 진행이 기록되어 있을 필요가 있다.
코호트 3B: 3개 이하의 이전 라인의 전신 요법의 일부로서 CPI (예를 들어, 항-PD-1/항-PD-L1)로 이전에 전신 요법을 받은 환자 단계 III 또는 단계 IV NSCLC에서 단일 제제로서의 TIL 요법. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 치료 시 또는 치료 후에 방사선 사진으로 진행이 기록되어 있을 필요가 있다.
이용가능한 효과적인 표적 요법에 의한, 종양유전자-유도된 종양을 갖는 코호트 3A 및 3B(NSCLC)의 환자는 표적 요법의 적어도 하나의 라인을 받았어야 한다.
모든 환자는 사이클로포스파미드 및 플루다라빈으로 구성된 비골수절제 림프구고갈(NMA-LD) 전처치 레지멘에 선행하여, 자가 동결보존된 TIL 요법(코호트 할당에 따라, 펨브롤리주맙과 조합하거나 하지 않음)을 받았다. TIL 주입에 이어, 최대 6 IV 인터류킨-2 (IL-2) 용량 최대가 투여되었다.
달리 명시되지 않는 한, 다음의 일반적인 연구 기간은 4개의 모든 코호트에서 소요되었다.
스크리닝 및 종양 절제: 연구 개시로부터 최대 4주(28일); TIL 생성물의 제조: 종양 절제로부터 대략 ≤22일; 및 아래에 논의된 바와 같은, 치료 기간.
치료 기간(코호트 1A, 2A, 및 3A): NMA-LD(7 일), TIL 주입(1일)후 IL-2 투여(1 내지 4일)를 포함하여 최대 2년. 환자는 TIL 생산 및 기준선 스캔을 위한 그것의 종양 절제를 완료한 후 NMA-LD 레지멘의 개시 전에 펨브롤리주맙의 단일 주입을 받았다. 다음 용량의 펨브롤리주맙은 IL-2 완료 후보다 빠르지 않고, 그 후 ≤ 2년(24개월) 동안 또는 질환이 진행되거나 허용될 수 없는 독성이 발생할 때까지 Q3W ± 3일동안 지속될 것이다. 치료 종료(EOT) 방문은 펨브롤리주맙의 마지막 투여 후 30일 이내에 발생하였다. 적용가능한 경우 해당 방문은 평가 종료(EOA) 방문과 조합될 수 있다(예를 들어, 질환 진행 시 또는 새로운 항암 요법 시작 시 펨브롤리주맙 중단 발생).
치료 기간(코호트 3B): NMA-LD(7일), TIL, 주입(1일)후 IL-2 투여(1 내지 4일)를 포함하여 최대 12일. EOT 방문은 일단 환자가 마지막 용량의 IL-2를 투여받으면 발생한다. EOT 방문은 치료 중단 후 30일 이내에 수행되었고, 평가 기간 동안 이 간격 내에 발생하는 임의의 계획된 방문과 조합될 수 있다.
평가 기간: 0일째에 TIL 주입 후 시작되고, 새로운 항암 요법의 시작, 연구 평가에 대한 동의의 부분 철회 또는 5년(60개월) 중 먼저 발생한 시점과 함께 질환 진행 시 종료된다. 평가 종료(EOA) 방문은 환자가 질환 진행에 도달하거나 새로운 항암 요법을 개시하면 발생하였다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 TIL로의 TIL 자가 요법은 다음의 단계로 구성되었다:
1. TIL 세포 생성물의 공급원 역할을 하는 자가 조직을 제공하기 위한 종양 절제;
2. 중앙 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준(GMP) 설비에서 생산된 TIL 생성물;
3. 7-일 NMA-LD 전처치 레지멘;
4. 코호트 1A, 2A, 및 3A: 환자는 TIL 생산 및 기준선 스캔을 위한 종양 절제를 완료한 후, NMA-LD 레지멘을 개시하기 전에 펨브롤리주맙을 단일 주입받았다. 다음 용량의 펨브롤리주맙은 IL-2 완료 후보다 빠르지 않고, 그 후 Q3W ± 3일 동안 지속될 것이다.
5. 자가 TIL 생성물의 주입(0일째); 및
6. 최대 6회 투여의 IV IL-2 투여.
코호트 1A, 2A, 및 3A에서, 다음 용량의 펨브롤리주맙은 IL-2 완료 후보다 빠르지 않고, 그 후 ≤ 2년(24개월) 동안 또는 질환이 진행되거나 허용될 수 없는 독성이 발생할 때까지 중 먼저 발생한 시점과 함께 Q3W ± 3일동안 지속될 것이다.
코호트 1A, 2A, 및 3A에 대한 순서도는 도 7에서 찾을 수 있다. 코호트 3B에 대한 순서도는 도 8에서 찾을 수 있다. 환자는 종양 징후에 의해 적절한 코호트로 할당되었다.
TIL 요법 + 펨브롤리주맙(코호트 1A, 2A, 및 3A)
환자는 스크리닝되고 종양 절제에 대한 수술이 계획되었다. 그런 다음 환자는 하나 이상의 종양 병변을 절제받고, 이를 TIL 생산을 위해 중앙 제조 설비로 보냈다.
다음으로, NMA-LD 레지멘을 모방하고, -7일 및 -6일에 메스나(부위 표준 관리마다 또는 USPI/SmPC)와 함께 2일의 IV 사이클로포스파미드(60 mg/kg), 이어서 5일의 IV 플루다라빈(25 mg/m2: -5일부터 -1일)으로 구성되었다.
코호트 1A, 2A, 및 3A의 환자는 TIL 생산 및 기준선 스캔을 위한 종양 절제를 완료한 후, 그리고 NMA-LD 레지멘을 개시하기 전에 펨브롤리주맙의 단일 주입을 받았다. 600,000 IU/kg IV 용량의 IL-2 투여는, 0일째의 TIL 주입의 완료 3시간 후, 단, 24시간 후까지는 개시되었다. 추가의 IL-2 투여는 최대 6회 투여 동안 대략 8 내지 12시간마다 주어질 것이다. 두 번째 용량의 펨브롤리주맙은 IL-2의 완료 후보다 빠르지 않았다. 환자는 제2 펨브롤리주맙 투여 이전에 모든 IL-2-관련된 독성 (등급 ≤2)으로부터 회복되어야 했다. 펨브롤리주맙은 이후 ≤2년(24개월) 동안 또는 질환 진행 또는 허용될 수 없는 독성 중 먼저 발생한 시점까지 Q3W ± 3일 동안 지속될 것이다.
단일 제제로서의 TIL 요법(코호트 3B)
환자는 스크리닝되고 종양 절제에 대한 수술이 계획되었다. 그런 다음 환자는 하나 이상의 종양 병변을 절제받고, 이를 TIL 생산을 위해 중앙 제조 설비로 보냈다.
다음으로, NMA-LD 레지멘은 -7일 및 -6일에 메스나(부위 표준 관리마다 또는 USPI/SmPC)와 함께 2일의 IV 사이클로포스파미드(60 mg/kg), 이어서 5일의 IV 플루다라빈(25 mg/m2: -5일부터 -1일)으로 구성되었다.
종양-유래된 자가 TIL 생성물의 주입은 플루다라빈의 마지막 투여 후 24시간 이내에 이루어졌다. 600,000 IU/kg IV 용량의 IL-2 투여는 TIL 주입 완료 후 3시간부터 24시간 이내에 시작되었을 수 있다.
추가의 IL-2 투여는 최대 6회 투여 동안 대략 8 내지 12시간마다 주어졌다.
종양 침윤 림프구의 생산 및 확장
TIL 자가 세포 생성물은 환자의 종양/병변으로부터 유래된 생존가능 세포독성 T 림프구로 구성되었으며, 이는 중앙 GMP 설비에서 생체외에서 제조되었다. 예를 들어, TIL 생산 공정을 도시하는 예시적인 흐름 선도가 도 9에 제공되어 있다.
각각의 개별 환자에서 직경이 ≥1.5 cm인 1차 또는 2차 전이성 종양 병변(들)을 외과적으로 절제한 후 TIL 제조 공정이 임상 현장에서 시작되었다. 다양한 해부상의 위치로부터의 다수의 종양 병변을 절제하여 종양 조직의 전체 응집체를 수집할 수 있지만; 그러나, 응집체는 이송 병에 존재하는 생물보존 매질의 제한된 양으로 인해 직경 4.0 cm 또는 무게 10 g을 초과해서는 안된다.
일단 종양 병변(들)이 생물보존 이송 병에 배치되면, 익스프레스 택배를 사용하여 중앙 GMP 제조 설비로 2℃ 내지 8℃에서 출하된다. 도착하자마자, 종양 시료(들)을 단편으로 절개한 다음, 인간 재조합 IL-2를 사용하여 약 11일 동안 사전-급속 확장 프로토콜(Pre-REP)에서 배양하였다.
그런 다음, 이들 pre-REP 세포를 IL-2, OKT3([무로모납-CD3]으로도 알려져 있는, 인간 CD3에 대한 뮤린 단클론성 항체)의 존재 하에 11일 동안 급속 확장 프로토콜(REP)을 사용하여, 및 피더 세포로서 조사된 동종 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 추가로 확장하였다.
그 다음, 확장된 세포를 수확하고, 세척하고, 제형화하고, 동결보존하고, 익스프레스 택배를 통해 임상 현장으로 출하하였다. TIL 세포 생성물의 투여 형태는 TIL이 유래된 환자에게 주입할 준비가 된 동결보존된 자가 "생세포 현탁액"이었다. 환자는 생성물 사양에 따라 1 x 109 및 150 x 109개의 생존가능 세포를 함유하는, 제조 및 출시된 생성물의 전체 용량을 주입받았다. 임상 경험에 따르면, 이 용량 범위에서 객관적인 종양 반응이 달성되었으며, 이는 또한 안전한 것으로 밝혀졌다(문헌[Radvanyi L.G., 등, Clin Cancer Res. 2012;18(24):6758-70]). 생성물의 전체 용량은 최대 4개의 주입 백에 제공되었다.
TIL 세포 생성물을 받을 환자의 준비
본 연구에서 사용된 NMA-LD 전처치 레지멘(즉, 사이클로포스파미드 플러스 메스나 2일, 이어서 플루다라빈 5일)은 미국 국립 암 연구소에 의해 개발되고 시험된 방법에 기반을 두고 있었다(문헌[Rosenberg S.A., 등, Clin Cancer Res. 2011;17(13):4550-7]; [Radvanyi L.G., 등, Clin Cancer Res. 2012;18(24):6758-70]; [Dudley M.E., 등, J Clin Oncol. 2008;26(32):5233-9]; [Pilon-Thomas S, 등, J Immunother. 2012;35(8):615-20]; [Dudley M.E., 등, J Clin Oncol. 2005;23(10):2346-57]; 및 [Dudley M.E., 등, Science. 2002;298(5594):850-4]). 7-일 전처치 레지멘 후, 환자에게 TIL 세포 생성물을 주입하였다.
TIL 주입 후 8 내지 12시간마다 IV IL-2(600,000 IU/kg)를 투여하고, TIL 주입 완료 후 3 내지 24시간 사이에 첫 번째 용량을 투여하고, 최대 6회 투여 동안 지속하였다. 기관 표준에 따라, IL-2의 용량을 실제의 중량을 기준으로 계산할 수 있다.
환자 집단의 선택
코호트 1A:
환자는 절제불가능 MM(IIIC기 또는 IV기, 미국 암 합동위원회 [AJCC] 병기 시스템에 따라 조직학적으로 확인됨)의 확진 진단을 받았다. 안구 흑색종 환자는 제외되었다. 환자는 이전에 면역-종양학 표적화된 제제를 받은 적이 없어야 한다. BRAF-돌연변이 양성인 경우, 환자는 이전 BRAF/MEK표적 요법을 받았을 수 있다.
코호트 2A:
환자는 진행성, 재발성 및/또는 전이성 HNSCC를 가졌으며, 치료 경험이 없을 수 있으며; 병리학 보고서를 통해 원발성 종양의 조직학적 진단이 필요하다. 환자는 이전에 면역요법 레지멘을 받은 적이 없어야 한다.
코호트 3A:
환자는 III기 또는 IV기 NSCLC (편평상피, 선암종, 대세포 암종)의 확진 진단을 받았다. 효과적인 표적 요법이 사용가능한 종양유전자-유도된 종양 환자는 표적 요법의 적어도 하나의 라인을 받았다.
코호트 3B:
환자는 III기 또는 IV기 NSCLC(편평상피, 선암종, 대세포 암종)의 확진 진단을 받았으며, 이전에 CPI(예를 들어, 항-PD-1/항-PD-L1)로 전신 요법을 받았다. 효과적인 표적 요법이 사용가능한 종양유전자-유도된 종양 환자는 표적 요법의 적어도 하나의 라인을 받았다.
모든 환자는 코호트 1A, 2A, 및 3A에 대한 면역요법을 제외하고, 최대 3회의 이전 전신 항암 요법(하기의 선택 기준을 참조한다)을 받았다. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 요법에 대해 또는 그 후에 방사선촬영으로 진행을 확인하였다.
포함 기준
환자는 연구 참여를 위해 하기 포함 기준을 모두 충족해야 한다:
1. 모든 환자는 그것의 각각의 조직학의 악성종양을 조직학적으로 또는 병리적으로 확진받았다:
o 절제불가능 또는 전이성 흑색종(코호트 1A)
o 두경부의 진행성, 재발성 또는 전이성 편평 세포 암종(코호트 2A)
o III기 또는 IV기 NSCLC(편평상피, 비편평상피, 선암종, 대세포 암종)(코호트 3A 및 3B).
2. 코호트 1A, 2A, 및 3A 단독: 환자는 면역요법받은 적이 없다. 이전에 치료를 받았다면, 환자는 가장 최근의 요법을 받거나 그 이후에 진행하였다. 코호트 1A, 2A, 및 3A는 최대 3회의 이전 전신 항암 요법을 받았을 수 있으며, 구체적으로 하기와 같다:
o 코호트 1A에서: 절제불가능 또는 전이성 흑색종(IIIC기 또는 IV기)을 가진 환자; BRAF 돌연변이-양성인 경우, 환자는 BRAF 억제제를 받았을 수 있다.
o 코호트 2A에서: 절제불가능 또는 전이성 HNSCC 환자. 초기 화학-방사선요법을 받은 사람들은 허용되었다.
o 코호트 3A에서: III기 또는 IV기 NSCLC(편평상피, 비편평상피, 선암종, 또는 대세포 암종)를 앓고 있고, 면역요법을 받은 적이 없고, 국소적 진행성 또는 전이성 환경에서 이전 전신 요법의 ≤3 라인 후 진행된 환자. 아쥬반트 또는 네오아쥬반트 환경에서, 또는 최종적인 화학방사선요법의 일부로서, 전신 요법을 받은 환자는 적격이며, 이전 전신 요법 완료 후 12개월 이내에 질환이 진행된 경우, 요법의 한 라인을 받은 것으로 간주되었다. 표적화된 요법에 민감한 돌연변이를 갖는 알려진 종양유전자 동인(예를 들어, EGFR, ALK, ROS)이 있는 환자는 표적 요법의 적어도 1개의 라인후에 진행되어야 한다.
3. 코호트 3B 단독: III기 또는 IV기 NSCLC(편평상피, 비편평상피, 선암종, 또는 대세포 암종) 환자는 전신 요법의 ≤ 3의 이전 라인의 일부로서 CPI(예를 들어, 항-PD-1/항-PD-L1)와 함께 전신 요법을 이전에 받은 적이 있다.
o 환자는 가장 최근의 요법을 받거나 그 이후에 진행을 방사선 사진으로 기록하였다.
o 아쥬반트 또는 네오아쥬반트 환경에서, 또는 최종적인 화학방사선요법의 일부로서, 전신 요법을 받은 환자는 적격이며, 이전 전신 요법 완료 후 12개월 이내에 질환이 진행된 경우, 요법의 한 라인을 받은 것으로 간주되었다.
o 표적화된 요법에 민감한 돌연변이를 갖는 알려진 종양유전자 동인(예를 들어, EGFR, ALK, ROS)이 있는 환자는 표적 요법의 적어도 1개의 라인후에 진행되어야 한다.
4. 환자는 TIL 연구용 생성물의 생산을 위해 절제후 직경이 최소 1.5 cm인 적어도 1개의 절제가능 병변(또는 응집 병변)을 가졌다. 외과적 절제술이 환자에게 추가의 위험을 초래하지 않는 한, 종양 조직은 다수의 다양한 전이성 병변에서 수득되는 것이 권장되었다.
o TIL 생성을 위한 절제를 고려한 병변이 이전에 조사된 영역내에 있는 경우, 절제 전에 방사선촬영 진행에서 병변이 입증되어야 한다.
o 환자는 프로토콜-필수 검사를 위한 적절한 조직병리 시료를 가지고 있어야 한다.
5. 환자는 TIL 제조를 위한 종양 절제 후 표준 및 잘 알려진 RECIST 1.1 지침(예를 들어, 문헌[Eisenhauer, European Journal of Cancer 45:228-247 (2009)]을 참조하고, 또한 project.eortc.org/recist/wp-content/uploads/sites/4/2015/03/RECISTGuidelines.pdf의 월드 와이드 웹에서 사용가능함)에 정의된 대로 측정가능한 질환이 남아있었다:
o 이전에 조사된 부위의 병변은 해당 병변에서 질병의 진행이 입증된 경우가 아니면 표적 병변으로 선택되지 않았다;
o RECIST에 따라 여전히 측정가능한 TIL 생성을 위해 부분적으로 절제된 병변은 비표적 병변으로 선택될 수 있지만, 반응 평가를 위한 표적 병변으로 작용할 수 없었다.
6. 환자는 동의 당시 18세 이상이었다.
7. 환자는 0 또는 1의 미 동부 종양학협력그룹(ECOG) 성능 상태, 및 3개월 이상의 추정된 기대 수명을 가졌다.
8. 임신 가능성이 있는 환자 또는 임신 가능성이 있는 파트너가 있는 환자는 치료 기간 동안 허가된 매우 효과적인 피임 방법을 기꺼이 시행하고 모든 프로토콜-관련 치료를 받은 후 12개월 동안 계속해야 한다(주석: 생식 가능성이 있는 여성은 치료 동안, 그리고 마지막 IL-2 투여 후 12개월, 또는 마지막 펨브롤리주맙 투여 후 4개월 동안(마지막 발생시) 효과적인 피임법을 사용하였다). 남성은 연구 동안 또는 치료 중단 후 12개월 중 어느 것이든 나중에 발생하는 것 동안 정자를 기증하지 않을 수 있다.
9. 환자는 다음의 혈액성 파라미터를 가졌다:
o 절대적인 중성구 수(ANC) ≥1000/mm3;
o 헤모글로빈 ≥9.0 g/dL;
o 혈소판 수 ≥100,000/mm3.
10. 환자는 적절한 기관 기능을 가졌다:
o 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)/혈청 글루탐산-피루브산 아미노전이효소(SGPT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)/SGOT가 정상인 상한치 (ULN)의 3배 이하, 간 전이가 ULN의 5배 이하인 환자.
o 스크리닝 시 Cockcroft Gault 식을 사용하여, 추정된 크레아티닌 청소능 ≥40 mL/분.
o 총 빌리루빈 ≤2 mg/dL.
o 길버트 증후군 환자는 3 mg/dL 이하의 총 빌리루빈을 가져야 한다.
11. 환자는 인간 면역결핍 바이러스(HIV1 및 HIV2)에 대해 혈청검사음성이었다. 급성 또는 만성 감염을 나타내는 B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg), 간염 B 코어 항체 (항 HBc), 또는 간염 C 바이러스 (항-HCV)에 대한 양성 혈청학이 있는 환자는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 특정 바이러스 노출의 국소 유병률을 기반으로 한 바이러스 부하에 따라 등록되었다.
12. 환자는 제1 연구 치료(즉, NMA-LD 또는 펨브롤리주맙 시작) 이전에 하기 상세히 설명된 바와 같이, 최소 지속기간의 이전 항암 요법(들)으로부터의 휴약 기간을 가졌다:
o 표적 요법: 표피 성장 인자 수용체(EGFR), MEK, BRAF, ALK, ROS1 또는 다른-표적화된 제제(예를 들어, 에를로티닙, 아파티닙, 다코미티닙, 오시머티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 로라티닙)를 사용한 사전 표적 요법은 치료 시작 전 최소 14일전에 세정을 제공하는 경우 허용하였다.
o 화학요법: 아쥬반트, 네오아쥬반트 또는 최종적인 화학요법/화학방사선은 치료 시작 전 최소 21일전에 세정을 제공하는 경우 허용하였다.
o 코호트 3B만을 위한 면역 요법, 항-PD-1, 다른 mAbs, 또는 백신을 사용한 이전 체크포인트-표적 요법은 NMA-LD 시작 전 21일 이상의 휴약 기간으로 허용되었다.
o 일시적 처방 방사선 요법: 탈모증, 피부 색소침착 변화, 또는 다른 임상적으로 무의미한 이벤트, 예를 들어, 소면적 방사선 피부염 또는 직장 또는 요절박을 제외하고 모든 방사선-관련된 독성이 1등급 또는 기준선으로 해결된 경우 사전 외부빔 방사선이 허용되었다.
o RECIST 1.1을 통해 반응 표적으로 평가되는 종양 병변(들)은 방사선 관문 외부에 있었지만; 관문내에 있는 경우, 이들은 진행상황을 입증해야 한다(상기 포함 기준 참고).
o 수술/사전-계획된 절차: 종양 절제 전에 상처 치유가 발생하고 모든 합병증이 해결되었으며, (주요 수술 절차의 경우) 적어도 14일이 경과한 경우 이전 수술 과정(들)이 허용되었다.
13. 환자는 코호트 할당 전에 탈모증 또는 백반증을 제외하고 모든 이전 항암 치료-관련된 유해 사례(TRAE)에서 1 등급 이하(유해 사례에 대한 공통 용어 기준[CTCAE])로 회복되었다.
14. 이전 항암 요법으로부터 안정된 2 등급 이상의 독성을 가진 환자는 의료 모니터와 상담한 후 사례별로 고려되었다.
15. 펨브롤리주맙 치료에 의해 악화될 것으로 합리적으로 예상되지 않는 비가역 독성을 가진 코호트 1A, 2A, 및 3A 환자는 의료 모니터와 상담한 후에만 포함되었다. 코호트 3B의 환자에 한해, 면역 체크포인트 억제제 CPI(들)를 사용한 이전 치료의 결과로 2등급 이상의 설사 또는 결장염이 문서로 기록된 환자는 적어도 6개월 동안 무증상이거나, 종양 절제 전 치료 후에 시각적 평가 결장경검사에서 정상이어야 한다.
16. 환자는 보호된 건강 정보의 사용 및 개시에 대한 서면 허가를 제공해야 한다.
제외 기준
다음의 기준 중 하나를 충족하는 환자는 연구에서 제외되었다:
1. 포도막/안구 기원의 흑색종 환자
2. 지난 20년 이내에 비골수절제 또는 골수절제 화학요법 레지멘을 포함하는 기관 동종이식편 또는 이전 세포 전이 요법을 받은 환자. (주석: 이 기준은 그것의 이전의 TIL 치료와 함께 이전에 NMA-LD 레지멘을 받은 경우를 제외하고, TIL로 재치료 중인 환자에게 적용가능하다.)
3. 증상이 있고/있거나 치료되지 않은 뇌 전이를 갖는 환자.
o ㆍ 뇌 전이가 명확하게-치료된 환자는 의료 모니터와의 논의 후 등록이 고려될 것이며; 치료 시작 전 환자가 2주 이상 동안 임상적으로 안정하다면, 자기 공명 영상 (MRI) 후처리를 통해 새로운 뇌 병변이 없으며, 환자는 진행 중인 코르티코스테로이드 치료가 필요하지 않다.
4. 등록 후 21일 이내에 전신 스테로이드 요법을 받고 있는 환자.
5. 임신 중이거나 모유 수유 중인 환자.
6. 연구원의 의견에 따라 연구 참여에 대한 위험이 증가한 활성 의료 질병; 예컨대 전신 감염(예를 들어, 매독 또는 항생제가 필요한 임의의 다른 감염), 응고 장애, 또는 심혈관, 호흡, 또는 면역계의 다른 활성 주요 의료 질병을 앓고 있는 환자.
7. 환자는 활성 또는 이전에 문서로 기록된 자가면역 또는 염증성 장애 (폐렴, 염증성 장 질환 [예를 들어, 결장염 또는 크론병], 게실염 [게실증의 예외 있음], 전신 홍반성 낭창, 유육종증 증후군, 또는 베게너 증후군 [다발성맥관염이 있는 육아종증, 그레이브스병, 류마티스성 관절염, 뇌하수체염, 포도막염, 등])를 가지지 않을 수 있다. 다음은 이 기준에 대한 예외이다:
o 백반증 또는 탈모증 환자.
o 호르몬 대체 시 갑상선기능저하증(예를 들어, 하시모토 증후군 이후)이 안정한 환자.
o 전신 요법이 필요하지 않은 임의의 만성 피부 병태.
o 식이요법만으로 제어된 소아지방변증이 있는 환자.
8. 치료 시작 전 28일 이내에 생 또는 약독화된 백신접종을 받은 환자.
9. 임의의 형태의 1차 면역결핍(예컨대 중증 복합성 면역결핍 질환 [SCID] 및 획득된 면역 결핍 증후군 [AIDS])이 있는 환자.
10. 임의의 구성요소의 연구 약물에 대해 과민증의 이력이 있는 환자. TIL은 비제한적으로 다음의 임의의 것을 포함한 임의의 구성요소의 TIL 생성물 제형에 대한 알려진 과민증이 있는 환자에 투여되지 않았다:
o ㆍ NMA-LD(사이클로포스파미드, 메스나, 및 플루다라빈)
o ㆍ 프롤류킨®, 알데스류킨, IL-2
o ㆍ 아미노글리코시드 그룹의 항생제(즉, 스트렙토마이신, 겐타마이신 [겐타마이신 과민증에 대해 피부-테스트 음성인 자는 제외])
o ㆍ 디메틸 설폭사이드 [DMSO], HSA, IL-2, 및 덱스트란-40을 포함하는 TIL 생성물 제형의 임의의 구성요소
o ㆍ 펨브롤리주맙
11. 좌심실 박출률(LVEF)이 45% 미만이거나, 뉴욕 심장 협회 부류 II 이상인 환자. 임의의 환자 ≥60 세 또는 허혈성 심장 질환, 가슴 통증, 또는 임상적으로 상당한 심방 및/또는 심실 부정맥의 이력이 있는 환자에서 임의의 비가역 벽 운동 비정상을 입증하는 심장 스트레스 테스트.
o 비정상 심장 스트레스 테스트를 받은 환자는, 후원자의 의료 모니터의 승인을 받고 적절한 박출률 및 심장병적 클리어런스가 있다면 등록될 수 있다.
12. 폐쇄성 또는 구속성 폐 질환이 있고, 예측 정상치의 60% 이하의 FEV1(1초에 강제된 호기량)이 기록된, 환자.
o ㆍ 환자가 비정상 상부 기도 해부학(즉, 기관절개술)으로 인해 신뢰할 수 있는 폐활량 측정을 수행할 수 없는 경우, 6-분 걷기 테스트를 사용하여 폐 기능을 평가하였다. 연령 및 성별에 대해 예상된 적어도 80%의 거리를 걸을 수 없거나 테스트 동안 임의의 지점에서 저산소증 (SpO2<90%)의 증거를 입증한 환자는 배제된다.
13. 지난 3년 이내에 또 다른 원발성 악성 종양이 있었던 환자(치료가 필요하지 않거나 1년 이상 전에 치유 치료를 받았거나, 연구원의 판단에 따라 비-흑색종 피부암, DCIS, LCIS, 전립선암 글리슨(Gleason) 점수 ≤6 또는 방광암을 포함하는, 심각한 재발 위험이 없었던 환자는 제외함).
14. 치료 개시의 21 일 이내에 연구용 제품으로 또 다른 임상 연구에 참여.
연구 평가변수 및 계획된 분석
1차 및 2차 평가변수는 코호트 별로 별도로 분석되었다.
1차 평가변수:
ORR은 효능 분석 세트 중에서 RECIST 1.1에 따라 연구원에 의해 평가된 최상의 반응으로 확인된 PR 또는 CR을 달성한 환자의 비율로 정의되었다.
객관적 반응은 각각의 질환 평가에 따라 평가되었고 ORR을 상응하는 양측 90% CI로 이항식 비율로 표현되었다. 각각의 코호트에 대한 주 분석은 평가 기간에서 조기에 진행/만료 또는 중단되지 않는 한, 코호트 당 치료받은 모든 환자가 12개월 동안 추적할 기회를 가질 때 발생하였다.
안전성 1차 평가변수는 상응하는 양측 90% CI로 이항식 비율로 표현된 각각의 코호트 내에서 임의의 3등급 이상의 TEAE 발병률에 의해 측정되었다.
2차 평가변수:
효능:
2차 효능 평가변수는 아래와 같이 정의되었다:
연구원에 의해 평가된 바와 같이 확인된 CR을 달성한 반응군에 기반한 CR 비율. DCR은 확인된 PR/CR 또는 지속된 SD(적어도 6주)를 달성한 환자 수의 합계를 효능 분석 세트의 환자 수 × 100%로 나눈 값이다. CR 비 및 DCR은 점추정 및 그것의 양측 90% CI를 사용하여 요약되었다.
DOR은 객관적 반응을 달성한 환자 중에서 정의되었다. 제1 날자까지 충족되는 제1-시간 반응 (PR/CR) 기준으로부터 재발성 또는 진행성 질환이 객관적으로 문서화되거나, 또는 후속 항암 요법을 받거나 환자가 사망한 첫번째 날(둘 중 처음 기록된 날짜)까지 최초 반응(PR/CR) 기준을 충족하는 것으로 측정되었다. PD를 경험하지 않거나 데이터 절단 또는 최종 데이터베이스 잠금의 시간 이전에 죽지 않은 환자는 종양 상태의 적절한 평가가 이루어지는 마지막 날자에 검열받는 그것의 이벤트 시간을 가질 것이다.
PFS는 림프구고갈 시점으로부터 PD, 또는 임의의 원인으로 인한 사망까지의 시간(개월 단위) 중 더 이른 시간으로 정의되었다. PD를 경험하지 않았거나 데이터 컷 시간 또는 최종 데이터베이스 잠금 이전에 사망하지 않은 환자는 종양 상태에 대한 적절한 평가가 이루어진 마지막 날짜에 이벤트 시간을 검열받을 것이다.
OS는 림프구고갈 시점으로부터, 또는 임의의 원인으로 인한 사망까지의 시간(개월 단위)으로 정의되었다. 데이터 컷 시간 또는 최종 데이터베이스 잠금 이전에 사망하지 않은 환자는 그것의 알려진 생존 상태의 마지막 날짜에 이벤트 시간을 검열받았다.
DOR, PFS, 및 OS는 우측 검열을 거쳤다. 카플란-마이어 방법은 시간 대 이벤트 효능 평가변수를 요약하기 위해 사용될 것이다. 종양 평가에 대한 기준선 데이터는 모든 코호트에 대한 림프구고갈 이전의 마지막 스캔이었다.
상기 효능 파라미터는 기준선 질환 특성; BRAF 상태(코호트 1A 단독), HPV 상태(코호트 2A 단독), 편평상피 또는 비-편평상피 폐 질환(코호트 3A 및 3B 단독), 및 항-PD-L1 상태에 의해 정의된 하위세트에 대해 적용가능한 코호트에 대해 추정될 것이다.
실시예 18: 고형 종양이 있는 환자에서 자가 종양 침윤 림프구의 2상, 다중중심 연구
이 실시예에서 연구는 선택 고형 종양 (전이성 흑색종, 두경부 편평 세포 암, 및 비-소세포 폐암 (NSCLC))이 있는 환자에서 자가 종양 침윤 림프구 (TIL)의 2상, 다중중심, 전반적인 개방 표지 연구이다. 본 실시예는 실시예 10-17을 포함하여 본원의 실시예뿐만 아니라, 본원 전반에 걸쳐 기술된 것에 따라 제조된 TIL 생성물을 사용하며, 이는 동결보존되고 22-일 제조 공정을 갖는다. TIL 생산의 단일 주입은 환자가 사이클로포스파미드 (60mg/kg x2 일) 및 플루다라빈 (25mg2/m x 5 일)으로 비-골수절제 림프구고갈의 준비 레지멘이 완료된 후에 주어졌다. 아래에 기재된 바와 같이4개의 환자 코호트가 있다:
ㆍ 코호트 1A (조합 코호트): 전신 요법의 3개 이하의 이전 라인에 면역요법 미접촉인 단계 IIIC 또는 IV 절제불가능 또는 전이성 흑색종 환자. 이들 환자는 펨브롤리주맙과 조합하여 TIL 생성물을 투여받을 것이다.
ㆍ 코호트 2A (조합 코호트): 전신 요법의 3개 이하의 이전 라인에 면역요법 미접촉인 진전된, 재발성 또는 전이성 두경부 편평 세포 암종 환자. 이들 환자는 펨브롤리주맙과 조합하여 TIL 생성물을 투여받을 것이다.
ㆍ 코호트 3A (조합 코호트): 전신 요법의 3개 이하의 이전 라인에 면역요법 미접촉인 국소적 진행성 또는 전이성 (단계 III-IV) NSCLC 환자. 이들 환자는 펨브롤리주맙과 조합하여 TIL 생성물을 투여받을 것이다.
ㆍ 코호트 3B (단일 제제 코호트): 전신 요법의 3개 이하의 이전 라인의 일부로서 체크포인트 억제제 (항-PD-1/항-PD-L1)에 이전에 전신 요법을 투여받은 단계 III- IV NSCLC 환자. 이들 환자는 단일 제제로 TIL 생성물을 투여받을 것이다.
NSCLC가 있는 두 환자는 코호트 3B (TIL 단독 포스트 면역 체크포인트 억제제)에 등록되었으며 이들은 42일째에서 그것의 제1 반응 평가 방문을 완료함)는 아래에 기재되어 있다.
환자 A는 단계 IVA 폐 선암종이 진단된 63-세 여성이다. 그녀는 펨브롤리주맙, 카보플라틴/베바시주맙 및 비노렐빈을 포함한 3개 이전의 라인의 전신 요법을 투여받았다. 이전의 펨브롤리주맙 요법에 대한 그녀의 최상의 반응은 점진적 질환이었고; 카보플라틴/베바시주맙에 대해 부분 반응이었고, 그녀의 비노렐빈 반응은 비-평가가능하였다 (그녀는 반응 평가 이전에 중단했다). 그녀는 TIL 생성에 대해 좌하 엽 폐 절제를 당하였고 3.75 x 109 세포의 TIL 생성물이 주입되었다. 환자는 그의 처음 반응 평가 (42일째) 방문을 하였고, 이때 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캔은 RECIST 1.1에 따라 안정한 질환 반응인, 기준선 스캔에 비교하여 종양 부하에서 4% 감소를 나타냈다.
환자 B는 단계 IVB 기저양 편평 세포 암종이 진단된 70-세 여성이다. 그녀는 카보플라틴/아브락산, 니볼루맙 및 시스플라틴/젬시타빈을 포함한 3개 이전의 라인의 전신 요법을 투여받았다. 이전의 카보/아브락산에 대한 그녀의 최상의 반응은 평가가능하지 않았고 (독성으로 요법 중단됨); 니볼루맙에 대해 점진적 질환이고 시스플라틴/젬시타빈에 대해 부분 반응이었다. 그녀는 TIL 생성에 대해 비장 병변 절제를 당하였고 39 x 109 세포의 TIL 생성물이 주입되었다. 환자는 그의 처음 반응 평가 (42일째) 방문을 하였고, 이때 CT 스캔은 RECIST 1.1에 따라 부분 반응인, 기준선 스캔에 비교하여 종양 부하에서 44% 감소를 나타냈다.
상기 기재된 실시예는 당업자에게 본 발명의 조성물, 시스템 및 방법의 실시양태를 제조 및 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제공되며, 본 발명자가 그의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 전술한 모드의 변형은 다음의 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 발명이 속하는 분야의 당업자의 숙련도를 나타낸다.
모든 표제 및 섹션 명칭은 단지 명확성 및 참조 목적을 위해 사용되며, 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 예를 들어, 당업자들은 본 명세서에 설명된 본 발명의 사상 및 범위에 따라 적절하게 상이한 표제들 및 섹션들로부터의 다양한 양상들을 조합하는 유용성을 인식할 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 참조문헌은, 각각의 개별 공보 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체가 참조에 의해 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것처럼, 그 전체가 및 모든 목적을 위해서 본 명세서에 참조로 포함된다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 본 출원의 많은 수정 및 변형이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 본 명세서에 설명된 특정 실시예들 및 예들은 단지 예로서 제공되며, 본 출원은 청구항들이 권리를 갖는 등가물들의 전체 범위와 함께, 첨부된 청구항들의 용어들에 의해서만 제한된다.
SEQUENCE LISTING <110> Iovance Biotherapeutics, Inc. Fardis, Maria Natarajan, Arvind <120> TREATMENT OF NSCLC PATIENTS REFRACTORY FOR ANTI-PD-1 ANTIBODY <130> 116983-5060 <150> US 62/756,025 <151> 2018-11-05 <150> US 62/903,627 <151> 2019-09-20 <160> 176 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Muromonab heavy chain <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 130 135 140 Gly 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Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Muromonab light chain <400> 2 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 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Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 168 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab light chain <400> 168 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 169 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab variable heavy chain <400> 169 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 170 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab variable light chain <400> 170 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 171 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab heavy chain CDR1 <400> 171 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His 1 5 10 <210> 172 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab heavy chain CDR2 <400> 172 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 173 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab heavy chain CDR3 <400> 173 Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 174 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab light chain CDR1 <400> 174 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 175 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab light chain CDR2 <400> 175 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 176 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab light chain CDR3 <400> 176 Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr 1 5

Claims (128)

  1. 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단으로 비-소세포 폐 암종 (NSCLC)을 치료하는 방법으로서,
    (a) 외과적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소규모 생검, 또는 환자의 NSCLC 종양으로부터의 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 얻기 위한 다른 수단으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하고/수득하거나 수용하는 단계;
    (c) 상기 종양 단편을 제1 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 제1 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하는 단계로서, 상기 TIL의 제2 집단은 그 수가 상기 TIL의 제1 집단보다 적어도 5-배 초과이고, 상기 제1 세포 배양 배지는 IL-2를 포함하는, 단계;
    (e) 제2 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하는 단계로서, 상기 TIL의 제3 집단은 그 수가 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 상기 TIL의 제2 집단보다 적어도 50-배 초과이고; 상기 제2 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 (항-CD3 항체), 및 선택적으로 조사된 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하고; 그리고 상기 급속 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 단계;
    (f) 상기 TIL의 제3 집단을 수확하는 단계; 및
    (g) 상기 TIL의 제3 집단의 치료적 유효 부분을 NSCLC 환자에게 투여하는 단계를 포함하고;
    상기 NSCLC는 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 TIL의 제1 집단을 수득하는 것은 다병변 샘플링 방법을 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-PD-L2 항체로 이전에 치료(treat)되었던, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았던, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었던, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 화학요법제로 이전에 치료되었던, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 화학요법제로 이전에 치료되었던, 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 기준선에서 큰 부피의 질환(bulky disease)을 갖는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만 화학요법제로 치료되고 있지 않고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
  18. 제14항 내지 제17항에 있어서, 횡단면이나 관상면에서 측정된 최대 종양 직경이 7 cm 초과이거나 팽윤된 림프절이 20 mm 이상의 단축 직경을 가질 때 큰 부피의 질환이 나타나는, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 네오아쥬반트(neo-adjuvant) 또는 아쥬반트 요법을 포함하지 않는 적어도 2개의 이전(prior) 전신 치료 과정에 불응성인, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, JS001, TSR-042, 피딜리주맙, BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, 클론으로부터의 항-PD-1: RMP1-14, 미국 특허 제8,008,449호에 개시된 항-PD-1 항체, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 그의 단편, 유도체, 변이체뿐만 아니라 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택된 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체에 불응성인, 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 더발루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 아테졸리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 아벨루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 확장은 21일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 배양 배지에서 상기 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포 배양 배지에서 상기 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고, 상기 OKT-3 항체는 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재하는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 급속 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함하는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함하는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제3 집단을 환자에게 투여하기 전에 비-골수절제 림프구고갈 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 비-골수절제 림프구고갈 레지멘은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드를 투여한 다음, 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제3 집단을 환자에게 투여한 다음 날에 시작하는 IL-2 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 IL-2 레지멘은 허용 범위(tolerance)까지 8시간마다 15분 볼러스 정맥내 주입(bolus intravenous infusion)으로 투여되는, 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 높은 용량 IL-2 레지멘인, 방법.
  41. 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단으로 비-소세포 폐 암종 (NSCLC)을 치료하는 방법으로서,
    (a) 환자로부터 종양을 절제하는 단계로서, 종양은 TIL의 제1 집단을 포함하는, 단계;
    (b) 상기 종양을 종양 단편으로 단편화하는 단계;
    (c) 상기 종양 단편을 제1 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 제1 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하는 단계로서, 상기 TIL의 제2 집단은 그 수가 상기 TIL의 제1 집단보다 적어도 5-배 초과이고, 상기 제1 세포 배양 배지는 IL-2를 포함하는, 단계;
    (e) 제2 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하는 단계로서, 상기 TIL의 제3 집단은 그 수가 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 상기 TIL의 제2 집단보다 적어도 50-배 초과이고; 상기 제2 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 (항-CD3 항체), 및 선택적으로 조사된 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하고; 그리고 상기 급속 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 단계;
    (f) 상기 TIL의 제3 집단을 수확하는 단계; 및
    (g) 상기 TIL의 제3 집단의 치료적 유효 부분을 NSCLC 환자에게 투여하는 단계를 포함하고;
    상기 NSCLC는 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 종양은 하나 이상의 종양 부위에서 절제되는, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-PD-L2 항체로 이전에 치료되었던, 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았던, 방법.
  45. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었던, 방법.
  46. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 화학요법제로 이전에 치료되었던, 방법.
  47. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 화학요법제로 이전에 치료되었던, 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않는, 방법.
  49. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
  50. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
  51. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
  52. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
  53. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
  54. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
  55. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
  56. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
  57. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 횡단면이나 관상면에서 측정된 최대 종양 직경이 7 cm 초과이거나 팽윤된 림프절이 20 mm 이상의 단축 직경을 가질 때 상기 큰 부피의 질환이 나타나는, 방법.
  59. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 네오아쥬반트 또는 아쥬반트 요법을 포함하지 않는 적어도 2개의 이전 전신 치료 과정에 불응성인, 방법.
  60. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, JS001, TSR-042, 피딜리주맙, BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, 클론: RMP1-14로부터의 항-PD-1, 미국 특허 제8,008,449호에 기재된 항-PD-1 항체, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 그의 단편, 유도체, 변이체뿐만 아니라 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택된 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체에 불응성인, 방법.
  61. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  62. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  63. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  64. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  65. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  66. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 더발루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  67. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 아테졸리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  68. 제41항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 아벨루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  69. 제41항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 확장은 21일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
  70. 제41항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
  71. 제41항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 배양 배지에서 상기 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하는, 방법.
  72. 제41항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포 배양 배지에서 상기 약 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고 OKT-3 항체는 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재하는, 방법.
  73. 제41항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는, 방법.
  74. 제41항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 급속 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는, 방법.
  75. 제41항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함하는, 방법.
  76. 제41항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함하는, 방법.
  77. 제41항 내지 제76 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제3 집단을 환자에게 투여하기 전에 비-골수절제 림프구고갈 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 비-골수절제 림프구고갈 레지멘은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드를 투여한 다음, 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  79. 제41항 내지 제78 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제3 집단을 환자에게 투여한 다음 날에 시작하는 IL-2 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 IL-2 레지멘은 허용 범위까지 8시간마다 15분 볼러스 정맥내 주입으로 투여되는, 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 높은 용량 IL-2 레지멘인, 방법.
  81. 비-소세포 폐 암종(NSCLC)을 가지고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 암은 항-PD-1 항체에 의한 치료에 불응성이고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 확장된 종양 침윤 림프구 (TIL)을 투여하는 것을 포함하는, 방법:
    (a) 상기 대상체로부터 수득된 종양 샘플을 다수의 종양 단편으로 가공함으로써 대상체에서 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하고/수득하거나 수용하는 단계;
    (b) 상기 종양 단편을 폐쇄 시스템에 첨가하는 단계;
    (c) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 상기 TIL의 제1 집단을 배양함으로써 상기 제1 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 생성하는 단계로서, 상기 제1 확장은 폐쇄된 용기에서 수행되어 제1 기체 투과성 표면적을 제공하고, 상기 제1 확장은 약 3-14일 동안 수행되어 TIL의 제2 집단을 얻고, 상기 TIL의 제2 집단은 그 수가 TIL의 제1 집단보다 적어도 50-배 초과이고, 단계 (b)로부터 단계 (c)로의 이행은 시스템을 개방하지 않고 일어나는, 단계;
    (d) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3, 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여, TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 상기 제2 확장은 약 7-14일 동안 수행되어 TIL의 제3 집단을 얻고, 상기 TIL의 제3 집단은 TIL의 제2 집단에 비해 효과기(effector) T 세포 및/또는 중앙 기억 T 세포의 증가된 하위집단을 포함하는 TIL의 치료 집단이고, 상기 제2 확장은 폐쇄된 용기에서 수행되어 제2 기체 투과성 표면적을 제공하고, 단계 (c)로부터 단계 (d)로의 이행은 시스템을 개방하지 않고 일어나는, 단계;
    (e) 단계 (d)로부터 수득된 TIL의 치료 집단을 수확하는 단계로서, 단계 (d)로부터 단계 (e)로의 이행은 시스템을 개방하지 않고 일어나는, 단계; 및
    (f) 단계 (e)로부터 수확된 TIL 집단을 주입 백으로 이동시키는 단계로서, 단계 (e)로부터 (f)로의 이동은 시스템을 개방하지 않고 일어나는, 단계;
    (g) 동결보존 과정을 사용하여 단계 (f)로부터 수확된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존하는 단계; 및
    (h) 단계 (g)에서의 주입 백으로부터의 TIL의 제3 집단의 치료 효과적인 투여량을 상기 대상체에게 투여하는 단계.
  82. 제81항에 있어서, 상기 종양 샘플은 다병변 샘플링 방법으로부터 유래되는, 방법.
  83. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었던, 방법.
  84. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았던, 방법.
  85. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었던, 방법.
  86. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 화학요법제로 이전에 치료되었던, 방법.
  87. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 화학요법제로 이전에 치료되었던, 방법.
  88. 제85항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만, 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않는, 방법.
  89. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
  90. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
  91. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
  92. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
  93. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 저발현의 PD-L1을 갖는, 방법.
  94. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되지 않았고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
  95. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체로 이전에 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
  96. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
  97. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 화학요법제로 치료되었지만 현재 화학요법제로 치료되고 있지 않고 기준선에서 큰 부피의 질환을 갖는, 방법.
  98. 제94항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 횡단면이나 관상면에서 측정된 최대 종양 직경이 7 cm 초과이거나 팽윤된 림프절 20 mm 이상의 단축 직경을 가질 때 큰 부피의 질환이 나타나는, 방법.
  99. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 네오아쥬반트 또는 아쥬반트 요법을 포함하지 않는 적어도 2개의 이전 전신 치료 과정에 불응성인, 방법.
  100. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, JS001, TSR-042, 피딜리주맙, (BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, 클론: RMP1-14로부터의 항-PD-1, 미국 특허 제8,008,449호에 기재된 항-PD-1 항체, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 그의 단편, 유도체, 변이체뿐만 아니라 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택된 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체에 불응성인, 방법.
  101. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  102. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  103. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  104. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 펨브롤리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  105. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 항-CLTA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 그의 바이오시밀러 및 니볼루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  106. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 더발루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  107. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 아테졸리주맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  108. 제81항에 있어서, 상기 불응성 NSCLC는 아벨루맙 또는 그의 바이오시밀러에 불응성인, 방법.
  109. 제81항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 확장은 21일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
  110. 제81항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
  111. 제81항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 배양 배지에서 상기 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하는, 방법.
  112. 제81항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포 배양 배지에서 상기 약 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고 OKT-3 항체는 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재하는, 방법.
  113. 제81항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는, 방법.
  114. 제81항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 급속 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는, 방법.
  115. 제81항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함하는, 방법.
  116. 제81항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 추가로 포함하는, 방법.
  117. 제81항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제3 집단을 환자에게 투여하기 전에 비-골수절제 림프구고갈 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  118. 제117항에 있어서, 상기 비-골수절제 림프구고갈 레지멘은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 사이클로포스파미드를 투여한 다음, 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 플루다라빈을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  119. 제81항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제3 집단을 환자에게 투여한 다음 날에 시작하는 IL-2 레지멘으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  120. 제119항에 있어서, 상기 IL-2 레지멘은 허용 범위까지 8시간마다 15분 볼러스 정맥내 주입으로 투여되는, 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 높은 용량 IL-2 레지멘인, 방법.
  121. 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NSCLC는 항-PD-1 및 화학요법제를 포함하는 병용 치료 또는 요법에 불응성인, 방법.
  122. 제121항에 있어서, 상기 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, JS001, TSR-042, 피딜리주맙, (BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, 클론: RMP1-14로부터의 항-PD-1, 미국 특허 제8,008,449호에 기재된 항-PD-1 항체, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 그의 단편, 유도체, 변이체뿐만 아니라 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  123. 제121항에 있어서, 상기 항PD-1는 펨브롤리주맙인, 방법.
  124. 제121항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학요법제는 백금 더블릿(platinum doublet) 화학요법제(들)인, 방법.
  125. 제121항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백금 더블릿 요법은 다음을 포함하는, 방법:
    i) 시스플라틴 및 카보플라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 화학요법제,
    ii) 및 비노렐빈, 젬시타빈 및 탁산으로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 화학요법제 (예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 nab-파클리탁셀을 포함함).
  126. 제121항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학요법제(들)는 페메트렉세드와 조합되는, 방법.
  127. 제121항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NSCLC는 카보플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 및 시스플라틴을 포함하는 병용 요법에 불응성인, 방법.
  128. 제121항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NSCLC는 카보플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 시스플라틴, 니볼루맙, 및 이필리무맙을 포함하는 병용 요법에 불응성인, 방법.
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