CN106074591B - 眼部症候中的rna干扰 - Google Patents

眼部症候中的rna干扰 Download PDF

Info

Publication number
CN106074591B
CN106074591B CN201610414959.9A CN201610414959A CN106074591B CN 106074591 B CN106074591 B CN 106074591B CN 201610414959 A CN201610414959 A CN 201610414959A CN 106074591 B CN106074591 B CN 106074591B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rxrna
seq
nucleotides
strand
modified
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610414959.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106074591A (zh
Inventor
林恩·利伯蒂娜
阿纳斯塔西娅·赫沃罗瓦
威廉·萨洛蒙
琼安·卡门斯
德米特里·萨马尔斯基
托得·M·伍尔夫
詹姆斯·卡尔迪亚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fio Pharmaceutical Co
Original Assignee
Fio Pharmaceutical Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fio Pharmaceutical Co filed Critical Fio Pharmaceutical Co
Publication of CN106074591A publication Critical patent/CN106074591A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106074591B publication Critical patent/CN106074591B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/554—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being a steroid plant sterol, glycyrrhetic acid, enoxolone or bile acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A61K9/0051—Ocular inserts, ocular implants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/313—Phosphorodithioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Abstract

本发明涉及眼部症候中的RNA干扰，具体涉及sd‑rxRNA以及rxRNAori的眼部给予。本发明提供一种方法，用于将一种核酸递送至对其有需要的受试者的眼睛，包括以一种有效量向该受试者的眼睛给予一种sd‑rxRNA，该有效量促进该sd‑rxRNA在该眼睛中的RNA干扰。sd‑rxRNA分子的眼内给予导致该sd‑rxRNA在视网膜中所有细胞层的分布与吸收。对于治疗与眼睛有关的失调与病状，这些分子具有广泛应用。

Description

眼部症候中的RNA干扰
本申请是申请日为2011年3月24日的题为“眼部症候中的RNA干扰”的中国专利申请No.201180025769.3的分案申请。
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2010年3月24日提交的题目为“眼部症候中的RNA干扰”(RNA INTERFERENCE IN OCULAR INDICATIONS)的美国临时申请号61/317,254以及于2010年3月25日提交的题目为“眼部症候中的RNA干扰”(RNA INTERFERENCE INOCULAR INDICATIONS)的美国临时申请号61/317,621的权益，其全部内容以其全文通过引用结合在此。
技术领域
本发明涉及RNA干扰(RNAi)领域。本发明更具体地涉及具有改进的体内递送特性的核酸分子的眼部给予以及它们在有效基因沉默方面的用途。
背景技术
互补寡核苷酸序列是前景光明的治疗剂以及在阐明基因功能方面的有用研究工具。然而，现有技术中寡核苷酸分子罹受一些问题，这些问题可以阻碍它们的临床开发，并且频繁地使得在体内使用此类组合物难以达到预期的有效的基因表达(包括蛋白合成)抑制。
一个主要问题是这类化合物至细胞与组织的递送。常规的双链RNAi化合物(19-29个碱基长)形成一种高度带负电的大约1.5nm乘10-15nm大小的刚性螺旋。这种杆条式分子不能通过细胞膜并且结果是在体外以及体内具有极其有限的效能。结果，所有常规的RNAi化合物都要求某种类型的递送载体以促进其组织分布与细胞吸收。这被认为是RNAi技术的一个主要限制。
已经存在许多尝试来对寡核苷酸应用化学修饰以改进其细胞吸收特性。此种修饰之一是将一种胆固醇分子附接至该寡核苷酸上。这种方法首先由Letsinger等人在1989年报道。之后，ISIS制药公司(ISIS Pharmaceuticals,Inc.)(卡尔斯巴德，加利福尼亚(Carlsbad,CA))报道了在将该胆固醇分子附接至该寡核苷酸方面的更先进的技术(Manoharan，1992)。
随着九十年代后期siRNAs的发现，在这些分子上进行了类似类型的修饰以增强其递送特征曲线(profile)。在文献中出现了共轭至轻度修饰(Soutschek，2004)以及重度修饰(Wolfrum，2007)的siRNAs上的胆固醇分子。Yamada等人,2008还报道了进一步改进胆固醇介导的siRNAs吸收的高级连接物化学物质的用途。尽管所有这类努力，在生物流体的存在下这些类型的化合物的吸收似乎受到抑制，导致体内基因沉默的效能高度受限，由此限制了这些化合物在临床环境中的应用。
发明内容
在此描述了用于向眼睛有效地体内给予sd-rxRNA分子的方法以及组合物。出人意料地，sd-rxRNA分子的眼内(例如，玻璃体内以及视网膜下)给予导致该sd-rxRNA在视网膜中所有细胞层的分布与吸收。对于治疗与眼睛有关的失调与病状，这些分子具有广泛应用。
本发明的多个方面涉及一种用于将核酸递送至对其有需要的受试者的眼睛的方法，这些方法包括以一种有效量向该受试者的眼睛给予一种sd-rxRNA，该有效量促进该sd-rxRNA在该眼睛中的RNA干扰。在一些实施方案中，该sd-rxRNA的给予是玻璃体内。
在一些实施方案中，该方法是用于治疗一种眼部失调。在某些实施方案中，该眼部失调是血管渗漏、新生血管形成、与年龄相关的黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管形成(湿性AMD)、地图状萎缩(晚期干性AMD)、早期至中期干性AMD、术后囊样黄斑水肿(CME)、非增生性糖尿病视网膜病变(NPDR)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、视网膜静脉阻塞继发性黄斑水肿(RVO)、增生性糖尿病视网膜病变(PDR)、青光眼、新生血管性青光眼(NVG)、早产儿视网膜病(ROP)、纤维增生性视网膜疾病、增生性玻璃体视网膜病变(PVR)、视网膜前膜/玻璃体黄斑粘连、视网膜退行性疾病、色素性视网膜炎、视网膜血管阻塞性障碍、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、视网膜母细胞瘤、由于瘢痕的小梁切除术失败或眼色素层炎.在一个实施方案中，该眼部失调是AMD。在另一个实施方案中，该眼部失调是DME。在再另一个实施方案中，该眼部失调是PVR。在又另一个实施方案中，该眼部失调是由于瘢痕的小梁切除术失败。
在某些实施方案中，该sd-rxRNA是针对一种为以下各项进行编码的基因：VEGF、MAP4K4、PDGF-B、SDF-1、IGTA5、ANG2、CTGF、HIF-1α、mTOR、SDF-1、PDGF-B、SPP1、PTGS2(COX-2)、TGFβ1、TGFβ2、补体因子3或5、PDGFRa、PPIB或myc，或其组合。
在一些实施方案中，该sd-rxRNA是针对一种编码VEGF的基因。在某些实施方案中，该sd-rxRNA是针对一种选自表2中各序列的序列。在一个实施方案中，该sd-rxRNA是针对一种序列，该序列包含一种选自表2中各序列的序列的至少12个连续核苷酸。在另一个实施方案中，该sd-rxRNA包含一种选自表3-8或10中各序列的序列的至少12个连续核苷酸。在再另一个实施方案中，该sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:1317或SEQ ID NO:1357的序列的至少12个连续核苷酸。在又另一个实施方案中，该sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1318或SEQ ID NO:1358的序列的至少12个连续核苷酸。在另外的实施方案中，该sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:1317并且该sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1318。在一个实施方案中，该sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:1357并且该sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1358。在另一个实施方案中，该sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:1379并且该sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1380。在再另一个实施方案中，该sd-rxRNA的正义链包含SEQ IDNO:1397并且该sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1398。
在某些实施方案中，该sd-rxRNA是针对一种编码CTGF的基因。在一个实施方案中，该sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:948或SEQ ID NO:964的序列的至少12个连续核苷酸。在另一个实施方案中，该sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:947或SEQ ID NO:963的序列的至少12个连续核苷酸。
在一些实施方案中，将两种或更多种不同的sd-rxRNA给予该受试者的眼，这些sd-rxRNA针对为两种或更多种蛋白进行编码的基因。在一个实施方案中，该sd-rxRNA是针对VEGF以及CTGF。在另一个实施方案中，该sd-rxRNA是针对VEGF以及PTGS2(COX-2)。
在某些方面，以上实施方案任一个中的sd-rxRNA是经过疏水修饰。在一些实施方案中，该sd-rxRNA连接至一种或多种疏水轭合物上。
在某些方面，以上实施方案任一个中的sd-rxRNA包括至少一个5-甲基C或U修饰。
本发明的其他方面涉及用于将一种核酸递送至对其有需要的受试者的眼睛的方法，这些方法包括以一种有效量向该受试者的眼睛给予一种rxRNAori，该有效量促进该rxRNAori在该眼睛中的RNA干扰。在一个实施方案中，该rxRNAori是针对VEGF。在另一个实施方案中，该rxRNAori是针对一种序列，该序列包含一种选自表2中各序列的序列的至少12个连续核苷酸。在再另一个实施方案中，该rxRNAori的正义链包含SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:28的序列的至少12个连续核苷酸。在又另一个实施方案中，该rxRNAori的反义链包含SEQ ID NO:1377或SEQ ID NO:1378的序列的至少12个连续核苷酸。
本发明的一些方面涉及针对一种选自表2中各序列的序列的sd-rxRNA。其他方面涉及针对一种序列的sd-rxRNA，该序列包含一种选自表2中各序列的序列的至少12个连续核苷酸。又其他方面涉及包含选自表3-8或10中各序列的一种序列的至少12个连续核苷酸的sd-rxRNA。在一些实施方案中，该sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:1317、1357、1379或1397的序列的至少12个连续核苷酸。在其他实施方案中，该sd-rxRNA的反义链包含SEQ IDNO:1318、1358、1380或1398的序列的至少12个连续核苷酸。在又其他实施方案中，该sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1318。在再其他实施方案中，该sd-rxRNA的正义链包含SEQID NO:1357并且该sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1358。在另外的实施方案中，该sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:1379并且该sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1380。在再另外的实施方案中，该sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:1397并且该sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1398。在某些实施方案中，该sd-rxRNA是经过疏水修饰。在其他实施方案中，该sd-rxRNA连接至一种或多种疏水轭合物上。在某些其他实施方案中，该sd-rxRNA包含至少一个5-甲基C或U修饰。
本发明的其他方面涉及包含以上各方面或各实施方案任一个中的sd-rxRNA的组合物。在一个实施方案中，该组合物进一步包含一种sd-rxRNA，该sd-rxRNA针对一种为除VEGF以外的蛋白进行编码的基因。在另一个实施方案中，该组合物包含一种sd-rxRNA，该sd-rxRNA针对一种编码CTGF和/或PTGS2(COX-2)的基因。
本发明的方面还涉及一种rxRNAori，该rxRNAori针对一种选自表2中各序列的序列。另一个方面涉及一种rxRNAori，该rxRNAori针对一种序列，该序列包含一种选自表2中各序列的序列的至少12个连续核苷酸。在一个实施方案中，该rxRNAori的正义链包含SEQID NO:13或SEQ ID NO:28的序列的至少12个连续核苷酸。在另一个实施方案中，该rxRNAori的反义链包含SEQ ID NO:1377或SEQ ID NO:1378的序列的至少12个连续核苷酸。
本发明的另一个方面涉及包含以上各方面或实施方案任一个中的rxRNAori的组合物。在一个实施方案中，该组合物包含一种rxRNAori，该rxRNAori针对一种为除VEGF以外的蛋白进行编码的基因。在另外的实施方案中，该组合物包含一种rxRNAori，该rxRNAori针对一种编码CTGF和/或PTGS2(COX-2)的基因。
在一些实施方案中，该组合物之中的sd-rxRNA是经过疏水修饰的。在某些实施方案中，该sd-rxRNA连接至一种或多种疏水轭合物上。在一些实施方案中，该sd-rxRNA连接至一种亲脂性基团上。在某些实施方案中，该亲脂性基团连接至该sd-rxRNA的过客链上。在一些实施方案中，该sd-rxRNA连接至胆固醇、一种长链烷基胆固醇类似物、维生素A或维生素E上。在一些实施方案中，该sd-rxRNA附接至氯甲酸酯上。
该sd-rxRNA包括至少一个2’O甲基或2’氟修饰和/或至少一个5-甲基C或U修饰。在一些实施方案中，该sd-rxRNA具有一种16-28个核苷酸长度的引导链。在某些实施方案中，该sd-rxRNA的核苷酸的至少40％是经过修饰的。该sd-rxRNA可以附接至一种连接物，在某些实施方案中，该连接物是可质子化的。
在一些实施方案中，该sd-rxRNA包含至少两个单链区域，这些单链区域可以包含硫代磷酸酯修饰。在某些实施方案中，这些单链区域是位于该引导链的3’末端以及该过客链的5’末端。
对于本发明的限制各自可以涵盖本发明的不同的实施方案。因此，预期到涉及任何一个要素或要素组合的对于本发明的限制各自可以包括在本发明的各方面中。本发明在其应用方面不限于以下描述中所提出的或附图中所展示的组成部分的构造详情以及安排。本发明可以具有其他实施方案并且能以不同的方法被实行或执行。
附图说明
附图并不是按比例绘制的。在这些附图中，在不同图中示出的各个相似或接近相似的组成部分用一个相同的数字表示。为了简明的目的，不是每一个组成部分都在每一个附图中做了标记。附图中：
图1展示了DIC、DY547以及Hoechst的共聚焦三层叠加，其显示了玻璃体内或视网膜下给药24小时之后，sd-rxRNA已经弥散于整个视网膜。
图2展示sd-rxRNA已经超越rxRNAori改进了视网膜递送。顶部图展示了给药之后立即拍摄的图像，其显示了sd-rxRNA以及rxRNAori的玻璃体内递送。中部图与底部图展示了分别在给药之后24小时与48小时拍摄的荧光图像，其显示了仅sd-rxRNA的视网膜递送。
图3展示了在sd-rxRNA的玻璃体内给药之后检测到遍及视网膜的荧光信号，但是在PBS或rxRNAori的给药之后却没有。
图4展示sd-rxRNA透过视网膜至光感受器的外节。
图5A和图5B展示了跟ARPE-19细胞中rxRNAori的吸收与由其导致的沉默相比，在ARPE-19细胞中sd-rxRNA的强健(robust)吸收与由其引起的沉默。
图6展示了具有眼部潜力(ocular potential)的sd-rxRNA的非限制性实例。图6中经优化的前导分子对应于以下SEQ ID NO，分别表示正义链与反义链：前导21212：SEQ IDNOs 963与964；前导21214：SEQ ID NOs 967与968；前导21215：SEQ ID NOs 969与970；前导21204：SEQ ID NOs 947与948；前导21205：SEQ ID NOs 949与950；前导21227：SEQ ID NOs993与994；前导21381：SEQ ID NOs 1011与1012；前导21382：SEQ ID NOs 1013与1014；前导21429：SEQ ID NOs 1303与1024；前导21430：SEQ ID NOs1025与1026；前导21383：SEQ IDNOs 1015与1016；前导21224：SEQ ID NOs 987与988；前导21228：SEQ ID NOs 1399与1400；前导21229：SEQ ID NOs 1401与1402；前导21230：SEQ ID NOs 1403与1404；前导21393：SEQID NOs 1405与1406；前导21394：SEQ ID NOs 1407与1408；前导21233：SEQ ID NOs 1409与1410；前导21234：SEQ ID NOs 1411与1412；前导21360：SEQ ID NOs 1413与1414；前导21374：SEQ ID NOs 1304与1314；前导21366：SEQ ID NOs 1415与1416；前导21368：SEQ IDNOs1417与1418；前导21379：SEQ ID NOs 1155与1156；前导21380：SEQ ID NOs 1157与1158；前导21352：SEQ ID NOs 1419与1420；与前导21777：SEQ ID NO:1421。
图7展示了VEGF sd-rxRNA的鉴别。
图8展示了在玻璃体内给药之后sd-rxRNA穿透至眼睛的细胞层的进程。给药之后2-3小时sd-rxRNA透过神经节细胞层。给药之后经过24小时sd-rxRNA透过至视网膜色素上皮细胞(RPE)以及光感受器的外节。
图9A和图9B利用共聚焦显微镜展示，在sd-rxRNA透过至RPE以及光感受器的外节时，没有可见的常规RNAi复合物的透过。
图10展示了在给药24小时之后，可以在所有兔视网膜细胞层中检测到荧光sd-rxRNA，但检测不到rxRNAori。
图11展示了高倍放大的共聚焦图像，其显示在给药24小时之后，sd-rxRNA透过所有兔视网膜细胞层。
图12展示了在玻璃体内给予之后，由sd-rxRNA引起的剂量依赖的体内沉默。
图13展示了在小鼠眼睛中由sd-rxRNA引起的PPIB沉默的持续时间。
图14展示了在小鼠眼睛中由sd-rxRNA引起的MAP4K4沉默的持续时间。图15展示了在给药之后三周sd-rxRNA不包括血管渗漏。
图16展示了在给药之后三周sd-rxRNA不包括结构破坏。
图17展示了在给药之后3周sd-rxRNA不损害视网膜功能。
图18展示了可以使用多种sd-rxRNA构建体以同时靶向多种基因。
图19展示了连接物化学物质的变体不影响体外sd-rxRNA的沉默活性。利用被动吸收测试在多种sd-rxRNA上(靶向Map4k4或PPIB)对两种不同的连接物化学物质(羟脯氨酸连接物以及ribo连接物)进行了评估以确定有利于自身递送的连接物。不存在递送载体(被动转染)情况下，用1uM、0.1uM或0.01uM的sd-rxRNA转染海拉细胞(HeLa cell)持续48hrs。任一连接物的使用导致sd-rxRNA的有效递送。
具体实施方式
本发明的多个方面涉及残余基因沉默的方法与组合物。本发明至少部分地基于以下出人意料的发现：sd-rxRNA递送至眼睛，包括其视网膜下与玻璃体内的注射导致在视网膜内的有效分布并被所有细胞层吸收，包括视网膜色素上皮细胞层。观察到sd-rxRNA比常规的RNAi复合物极为更好的视网膜吸收与分布。因此，sd-rxRNA代表了一种新类别的治疗性RNAi分子，它们在治疗眼部病状或失调中具有显著潜力。
sd-rxRNA分子
本发明的多个方面涉及sd-rxRNA分子。如在此使用的，“sd-rxRNA”或“sd-rxRNA分子”指一种自我递送RNA分子，比如描述于2009年9月22日提交的题为“小化的自我递送RNAI复合物”(“REDUCED SIZE SELF-DELIVERING RNAI COMPOUNDS.”)的PCT公开号WO2010/033247(申请号PCT/US2009/005247)中的那些，并将其通过引用结合。简言之，sd-rxRNA(也指作为一种sd-rxRNAnano)是一种分离的不对称双链核酸分子，该分子包含一种长度最小是16个核苷酸的引导链以及一种长度是8-18个核苷酸的过客链，其中该双链核酸分子具有一种双链区域以及一种单链区域，该单链区域在长度上具有4-12个核苷酸并且具有三处核苷酸骨架修饰。在优选的实施方案中，该双链核酸分子具有一个平末端或者包括一种一或二核苷酸的突出端。sd-rxRNA分子可以通过化学修饰以及在一些情况下通过疏水轭合物的附接而进行优化。
在一些实施方案中，sd-rxRNA包括一种分离的包含引导链与过客链双链核酸分子，其中该分子的双链区域长度是8-15个核苷酸，其中该引导链包含一种长度是4-12个核苷酸的单链区域，其中该引导链的单链区域包含3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个硫代磷酸酯修饰，并且其中该双链核酸的核苷酸的至少40％是经过修饰。
本发明的这些多核苷酸在此指本发明的分离的双链或双链体核酸、寡核苷酸或多核苷酸、纳米分子、纳米RNA、sd-rxRNAnano、sd-rxRNA或RNA分子。
sd-rxRNA比常规siRNA更为有效地被细胞吸收。这些分子在目标基因表达的沉默方面非常高效并且提供超越以上所述的RNAi分子的显著优势，包括血清存在时的高活性、有效的自我递送、与广泛的连接物的兼容性以及与毒性有关的化学修饰的减少或完全不存在。
与单链多核苷酸相反，双链体多核苷酸通常难以递送至细胞，因为它们具有刚性结构以及使得膜转移变得困难的大量负电荷。然而，sd-rxRNA(尽管部分是双链)却在体内被识别为单链并且按照这样能够被有效地递送穿过细胞膜。如此，本发明的多核苷酸在许多自我递送的情况下是胜任的。因此，能以类似于常规RNAi试剂的方法来对本发明的多核苷酸进行配制或者可以单独(或与非递送类型的载体)将它们递送至细胞或受试者并且允许其自我递送。在本发明的一个实施方案中，提供了自我递送的不对称双链RNA分子，其中该分子的一部分类似于常规RNA双链体并且该分子的一种第二部分是单链。
在一些方面本发明的寡核苷酸具有一种不对称结构组合(该组合包括一种双链区域以及一种5个核苷酸或更长的单链区域、特定的化学修饰模式)并且共轭至亲脂性或疏水性分子上。这一类别的RNAi类似复合物在体外与体内具有优异的效能。认为该刚性双链体的减小连同对单链区域施加的硫代磷酸酯修饰促成了所观察到的优异效能。
本发明基于(至少部分地)以下出人意料的发现：sd-rxRNA可以通过视网膜下或玻璃体内注射有效地递送至眼睛。基于在多种不同哺乳动物系统(包括小鼠、大鼠以及兔)中产生的结果以及如实例部分所显示的，给予sd-rxRNA之后比给予常规RNAi复合物之后观察到了极为(数个数量级)更好的眼部吸收以及分布。
本发明的另一个出人意料的方面是sd-rxRNA被视网膜中所有细胞层吸收，包括视网膜色素上皮细胞层。有效的sd-rxRNA分布通过视网膜下以及玻璃体内注射而实现并且就本发明而言两种给予方式是兼容的。在一些实施方案中，由于在眼内药物递送中的技术易用性以及广泛使用性，玻璃体内给予是优选的。
如在此使用的，“眼部”指眼睛，包括其任何以及所有细胞(包括肌肉、神经、血管、泪腺管、膜等)以及与该眼睛及其生理功能相连接的各结构。术语眼部和眼睛在本披露通篇可以互换地使用。眼睛中的细胞类型的非限制性实例包括位于神经节细胞层(GCL)、内网状层内部(IPL)、内核层(INL)、外网状层(OPL)、外核层(ONL)、视杆和视锥的外节(OS)、视网膜色素上皮(RPE)、视杆和视锥的内节(IS)、结膜上皮、虹膜、睫状体、角质层、以及眼皮脂腺上皮的细胞。
在一个优选的实施方案中，本发明的RNAi复合物包含一种不对称复合物，该不对称复合物包含一种双链体区域(8-15个碱基长的链有效进入RISC所要求的)以及长度是4-12个核苷酸的单链区域。在一些实施方案中，该双链体区域是13或14个核苷酸长。在一些实施方案中6或7个核苷酸长的单链区域是优选的。该新颖RNAi复合物的单链区域还包含2-12个硫代磷酸酯核苷酸间连接(指硫代磷酸酯修饰)。在一些实施方案中，6-8个硫代磷酸酯核苷酸间连接是优选的。另外，本发明的RNAi复合物还包含一种独特的化学修饰模式，该模式提供稳定性并且与进入RISC相容。这些要素的组合产生意料之外的特性，这些特性对于在体外与体内递送RNAi试剂是非常有用的。
该化学修饰模式(它提供稳定性并且与进入RISC相容)包括对正义(或过客)链以及反义(或引导)链的修饰。例如，该过客链可以用任何保证稳定性并且不干扰活性的化学实体来进行修饰。此类修饰包括2’ribo修饰(O-甲基、2’F、2脱氧以及其他)以及比如硫代磷酸酯修饰的骨架修饰。该过客链的一种优选的化学修饰模式包括该过客链内的C与U核苷酸的O甲基修饰或者可替代地该过客链可以是完全O甲基修饰的。
例如，该引导链可以用任何保证稳定性而不干扰进入RISC的化学修饰来进行修饰。该引导链的一种优选的化学修饰模式包括对大部分C与U核苷酸进行2’F修饰以及对5’末端进行磷酸化。该引导链的另一种优选的化学修饰模式包括11-18位的C/U以及1位的2’O甲基修饰以及5’末端化学磷酸化。该引导链的再另一种优选的化学修饰模式包括11-18位的C/U以及1位的2’O甲基修饰以及5’末端化学磷酸化以及2-10位的C/U的2’F修饰。在一些实施方案中，该过客链和/或该引导链包含至少一个5-甲基C或U修饰。
在一些实施方案中，该sd-rxRNA的核苷酸的至少30％是经过修饰。例如，该sd-rxRNA中至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸是经过修饰。在一些实施方案中，该sd-rxRNA中100％的核苷酸经过修饰。
本发明的寡核苷酸的以上描述的化学修饰模式具有良好容忍性并且事实上地改进了不对称RNAi复合物的效能。在此还实验性的证明，当在一种多核苷酸中一起使用对RNAi的修饰的组合时，结果达到了在被动吸收该RNAi方面的最佳效能。所描述的任何组成部分(引导链稳定、硫代磷酸酯伸展(phosphorothioate stretch)、正义链稳定以及疏水轭合物)的去除或在一些情况下的增加导致次优效能并且在一些情况下完全失去效能。各要素的组合导致一种复合物的开发，该复合物在被动递送至细胞(比如海拉细胞)之后具有完全活性。以下实例中显示的数据证明了眼部给予后本发明的寡核苷酸在体内的高效能。
在一些情况下可以通过利用新颖类型的化学物质改进复合物的疏水性来进一步改进该sd-rxRNA。例如，一种化学性质与疏水性碱基修饰的用途有关。可以对处于任何位置的任何碱基进行修饰，只要修饰使得该碱基的分配系数(partition coefficient)增加。修饰化学物质的优选位置是嘧啶的4位于5位。这些位置的主要优势是(a)易于合成以及(b)无碱基配对干扰以及A型螺旋形成，这些对于RISC复合体装载以及目标识别是必要的。使用一种在其中存在多个脱氧尿嘧啶核苷而不干扰整个复合物效能的sd-rxRNA复合物。此外，可以通过优化该疏水轭合物的结构而获得组织分布以及细胞吸收方面的重大改进。在一些优选的实施方案中，甾醇的结构经过修改以改变(增加/降低)C17附着链。这一类型的修饰使得细胞吸收显著增加以及体内组织吸收特性改进。
根据本发明配制的dsRNA还包括rxRNAori。rxRNAori指一种类别的RNA分子，这些分子描述于2009年2月11日提交的题为“经修饰的RNAI多核苷酸及其用途”(“MODIFIEDRNAI POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF.”)的PCT公开号WO2009/102427(申请号PCT/US2009/000852)，并将其通过引用结合在此。
在一些实施方案中，rxRNAori分子包含一种长度是12-35个核苷酸的双链RNA(dsRNA)构建体，用于抑制一种靶标基因的表达，该构建体包含：一种具有5'-末端以及3'-末端的正义链，其中该正义链经过用2'-修饰的核糖进行高度修饰，并且其中在该正义链的中心部分的3-6个核苷酸不经过用2'-修饰的核糖进行修饰，以及一种具有5'-末端以及3'-末端的反义链，该反义链杂交至该正义链以及该靶标基因的mRNA，其中该dsRNA以一种序列依赖的方式抑制该靶标基因的表达。
rxRNAori可以包含在此描述的任何修饰。在一些实施方案中，该rxRNAori的核苷酸的至少30％是经过修饰。例如，该rxRNAori中至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸是经过修饰。在一些实施方案中，该sd-rxRNA中100％的核苷酸经过修饰。在一些实施方案中，只有该rxRNAori的过客链包含修饰。
本发明在其应用方面不限于以下描述中所提出的或图中所展示的组成部分的构造详情以及安排。本发明可以具有其他实施方案并且能以不同的方法被实行或执行。同样，在此所使用的措辞和术语是出于描述的目的而不应该被看作是限制性的。在此使用的“包括”(“including”)、“包含”(“comprising”)或“具有”(“having”)、“含有”(“containing”)、“参与”(“involving”)及其在此的变体意在囊括下文所列的术语及其等同语以及另外的术语。
因此，本发明的多个方面涉及分离的双链核酸分子，这些分子包含一种引导(反义)链以及一种过客(正义)链。如在此使用的，术语“双链”(“double-stranded”)指一种或多种核酸分子，在其中这些核单体(nucleomonomers)的至少一部分是互补的并且是氢键以形成一种双链区域。在一些实施方案中，该引导链的长度范围是16-29个核苷酸长。在某些实施方案中，该引导链是16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸长。该引导链具有与一种靶标基因的互补性。该引导链与该靶标基因之间的互补性可以在该引导链的任何部分存在。在此使用的互补性可以是完全互补性或次完全互补性，只要该引导链足以与其介导RNAi的靶标互补。在一些实施方案中，互补性指在该引导链以及该靶标之间低于25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的错配。完全互补指100％的互补性。因此本发明具有以下优势：能够容忍由于遗传突变、株系多态性或进化趋异而引起的预期变体。例如，已经发现相对于靶标序列的具有插入、缺失以及单点突变的siRNA序列对于抑制是有效的。而且，不是所有的siRNA位置都对目标识别具有等同的贡献。在该siRNA中心的错配是最关键的并且实质上地取消靶标RNA酶切。该中心上游的错配或参照该反义链的酶切位点的上游的错配是容忍的但是显著降低了靶标RNA酶切。该中心下游的错配或参照该反义链的酶切位点的下游(优选是位于该反义链的近3'末端，例如距该反义链的3'末端1、2、3、4、5或6个核苷酸)的错配是容忍的并且仅是轻微降低了靶标RNA酶切。
虽然不意在受任何具体理论的束缚，但在一些实施方案中，该引导链是至少16个核苷酸长并且锚定RISC中的Argonaute蛋白。在一些实施方案中，当该引导链装载进入RISC，它具有一个指定的种子区域(seed region)并且靶标mRNA酶切发生在该反义链的10-11位置的对面。在一些实施方案中，该引导链的5’末端是磷酸化的或者能够被磷酸化。在此描述的核酸分子可以指最小的引发RNA。
在一些实施方案中，该过客链的长度范围是8-15个核苷酸长。在某些实施方案中，该过客链是8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸长。该过客链具有与该引导链的互补性。该过客链与该引导链之间的互补性可以在该过客链或该引导链的任何部分存在。在一些实施方案中，在分子的双链区域之内该引导链与该过客链之间具有100％的互补性。
本发明的方面涉及具有最小双链区域的双链核酸分子。在一些实施方案中，该分子的双链区域的长度范围是8-15个核苷酸。在某些实施方案中，该分子的双链区域的长度是8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在某些实施方案中，该双链区域是13或14个核苷酸长。该引导链与该过客链之间可以是100％的互补性，或者该引导链与该过客链之间可以存在一个或多个错配。在一些实施方案中，在该双链分子的一个末端，该分子可以是平末端的或者具有一种一核苷酸的突出端。在一些实施方案中，该分子的单链区域是4-12个核苷酸之间长度。例如，该单链区域可以是4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸长。然而，在某些实施方案中，该单链区域还可以是短于4个核苷酸或长于12个核苷酸。在某些实施方案中，该单链区域是至少6个或至少7个核苷酸长。
与本发明有关的RNAi构建体可以具有小于-13kkal/mol的热力学稳定性(ΔG)。在一些实施方案中，该热力学稳定性(ΔG)小于-20kkal/mol。在一些实施方案中，当(ΔG)低于-21kkal/mol时，存在效能损失。在一些实施方案中，高于-13kkal/mol的(ΔG)值与本发明的各方面相容。无意于受任何理论束缚，在一些实施方案中，具有相对较高的(ΔG)值的分子可以在相对较高的浓度下变得具有活性，而具有相对较低的(ΔG)值的分子可以在相对较低的浓度下变得具有活性。在一些实施方案中，该(ΔG)值可以高于-9kkal/mol。由与本发明相关的RNAi构建体(包含最小双链区域)介导的基因沉默是非预期的，因为已经证明设计上几乎一致但具有更低热力学稳定性的分子是无活性的(Rana等人2004)。
无意于受任何理论束缚，在此描述的结果显示，RISC的蛋白质组分或RISC的辅助因子可以结构性的识别dsRNA或dsDNA的8-10bp的一段序列(stretch)。另外，要求自由能来触发一种复合物，该复合物可以被这些蛋白质组分感受到和/或该复合物足够稳定以与此类组分相互作用从而它可以被装载进入Argonaute蛋白。如果存在最佳热力学并且存在优选是至少8个核苷酸的双链部分，则该双链体将被识别并且被装载进入该RNAi机器。
在一些实施方案中，热力学稳定性通过使用LNA碱基得以提高。在一些实施方案中，引入了另外的化学修饰。化学修饰的一些非限制性实例包括：5’磷酸酯、2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-氟、胸腺嘧啶核糖核苷、C-5丙炔基-dC(pdC)与C-5丙炔基-dU(pdU)；C-5丙炔基-C(pC)与C-5丙炔基-U(pU)；5-甲基C、5-甲基U、5-甲基dC、5-甲基dU甲氧基、(2,6-二氨基嘌呤)、5'-二甲氧三苯甲基-N4-乙基-2'-脱氧胞苷乙基MGB(小沟结合物)。应当理解的是，在同一分子中可以结合多于一种的化学修饰。
与本发明相关的分子是经过优化以增加效能和/或降低毒性。例如，引导链和/或过客链的核苷酸长度、和/或引导链和/或过客链的硫代磷酸酯修饰的数目在一些方面可以影响该RNA分子的效能，而用2’-O-甲基(2’OMe)修饰代替2’-氟(2’F)修饰在一些方面可以影响该分子的毒性。具体地，一种分子中2’F含量的降低预期会降低该分子的毒性。实例部分展示了其中2’F已经被清除了的分子，它们由于在毒性方面预期的降低而具有一种超越以上描述的RNAi复合物的优势。此外，一种RNA分子中的硫代磷酸酯修饰的数目可以影响该分子的细胞吸收，例如该分子被动吸收进入细胞的效率。在此描述的分子的优选实施方案不具有2’F修饰并且仍然在细胞吸收与组织穿透方面具有同等效率的特征。此类分子代表了超越现有技术(比如Accell和Wolfrum描述的分子，它们经过大量利用2’F而进行了重度修饰)的一个显著改进。
在一些实施方案中，引导链的长度大约是18-19个核苷酸并且具有大约2-14处磷酸酯化修饰。例如，引导链可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或14个以上的经磷酸酯化修饰的核苷酸。该引导链可以包含一种或多种增强稳定性的修饰而不干扰进入RISC。这些经过磷酸酯化修饰的核苷酸(比如经硫代磷酸酯修饰的核苷酸)可以是在3’末端、5’末端或遍布该引导链。在一些实施方案中，该引导链的3’终端的10核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个经硫代磷酸酯修饰的核苷酸。该引导链还可以包含2’F和/或2’OMe修饰，这些修饰的位置可以遍布该分子。在一些实施方案中，该引导链的位置一(该引导链的最为5’位置的核苷酸)上的核苷酸是经过2’OMe和/或磷酸化修饰的。该引导链中的C与U核苷酸可以是经过2’F修饰的。例如，长度是19nt的引导链的位置2-10(或具有不同长度的引导链的相应位置)中的C与U核苷酸可以是经过2’F修饰的。该引导链中的C与U核苷酸还可以是经过2’OMe修饰的。例如，长度是19nt的引导链的位置11-18(或具有不同长度的引导链的相应位置)中的C与U核苷酸可以是经过2’OMe修饰的。在一些实施方案中，该引导链的最为3’末端的核苷酸是不经修饰的。在某些实施方案中，该引导链之中的大部分C与U是经过2’F修饰的并且该引导链的5’末端是经过磷酸化的。在其他实施方案中，位置11-18中的C或U以及位置1是经过2’OMe修饰的并且该引导链的5’末端是经过磷酸化的。在其他实施方案中，位置11-18中的C或U以及位置1是经过2’OMe修饰的，该引导链的5’末端是经过磷酸化的，并且位置2-10中的C或U是经过2’F修饰的。
在一些方面，最佳的过客链是大约11-14个核苷酸长。该过客链可以包含多种增加稳定性的修饰。该过客链中的一个或多个核苷酸可以是经过2’OMe修饰的。在一些实施方案中，该过客链中的C和/或U核苷酸的一个或多个是经过2’OMe修饰的，或者该过客链中的所有C和/或U核苷酸是经过2’OMe修饰的。在某些实施方案中，该过客链中的所有核苷酸是经过2’OMe修饰的。该过客链中的一个或多个核苷酸还可以是经过磷酸酯化修饰的，比如硫代磷酸酯修饰。该引导链还可以包含2’ribo、2’F以及2脱氧修饰或以上任何组合。如在实例中所证明的，引导链与过客链中的化学修饰模式具有良好的容忍性并且化学修饰的组合在此显示可以导致增加RNA分子的效能以及其自我递送。
本发明的多个方面涉及RNAi构建体，与先前已经用于RNAi的分子相比较，这些构建体具有相对于双链区域而言广泛的单链区域。这些分子的单链区域可以经过修饰以促进细胞吸收或基因沉默。在一些实施方案中，该单链区域的硫代磷酸酯修饰影响细胞吸收和/或基因沉默。该引导链的经硫代磷酸酯修饰的区域可以包括该分子的单链区域以及双链区域之中的核苷酸。在一些实施方案中，该单链区域包含2-12处硫代磷酸酯修饰。例如，该单链区域可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12处硫代磷酸酯修饰。在一些情况下，该单链区域包含6-8处硫代磷酸酯修饰。
与本发明相关的分子还针对细胞吸收而进行了优化。在于此描述的RNA分子中，这些引导链和/或过客链可以附接至一种轭合物上。在某些实施方案中，该轭合物是疏水的。该疏水性轭合物可以是一种具有高于10的分配系数的小分子。该轭合物可以是一种甾醇类分子，比如胆固醇，或一种具有附接至C17的加长聚碳酸酯链的分子，并且轭合物的存在可以影响在利用或不利用液体转染试剂下RNA分子被吸收进入细胞的能力。该轭合物可以通过一种疏水连接物而附接至该过客链或引导链上。在一些实施方案中，疏水连接物是5-12C长，和/或基于羟基吡咯烷。在一些实施方案中，疏水性轭合物附接至该过客链上并且该过客链和/或引导链的CU残基是经过修饰。在一些实施方案中，该过客链和/或该引导链的CU残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％是经过修饰。在一些方面，与本发明有关的分子是自我递送的(sd)。如在此使用的，“自我递送”指一种分子在不需要另外的递送载体(比如一种转染试剂)下递送至细胞的能力。
本发明的多个方面涉及对各分子进行选择用于在RNAi中使用。在一些实施方案中，可以选择具有8-15个核苷酸的双链的分子用于在RNAi中使用。在一些实施方案中，可以基于其热力学稳定性(ΔG)而对分子进行选择。在一些实施方案中，选择具有小于-13kkal/mol的(ΔG)的分子。例如，该(ΔG)值可以是-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-21、-22或小于-22kkal/mol。在其他实施方案中，该(ΔG)值可以高于-13kkal/mol。例如，该(ΔG)值可以是-12、-11、-10、-9、-8、-7或大于-7kkal/mol。应该理解，可以使用本领域内任何已知的方法计算ΔG。在一些实施方案中，使用Mfold(通过Mfold网站(mfold.bioinfo.rpi.edu/ cgi-bin/rna-form1.cgi)可得)来计算ΔG。计算ΔG的方法描述于以下文献中Zuker,M.(2003)《核酸研究》(Nucleic Acids Res.),31(13):3406-15；Mathews,D.H.,Sabina,J.,Zuker,M.以及Turner,D.H.(1999)《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)288:911-940；Mathews,D.H.,Disney,M.D.,Childs,J.L.,Schroeder,S.J.,Zuker,M.,以及Turner,D.H.(2004)《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.)101:7287-7292；Duan,S.,Mathews,D.H.,以及Turner,D.H.(2006)《生物化学》(Biochemistry)45:9819-9832；Wuchty,S.,Fontana,W.,Hofacker,I.L.,以及Schuster,P.(1999)《生物高聚物》(Biopolymers)49:145-165，并且通过引用将其结合于此。
在某些实施方案中，该多核苷酸包含5'-和/或3'-末端突出端。该多核苷酸的一个末端上的核苷酸突出端的数目和/或序列与该多核苷酸的另一末端可以是相同的或不同的。在某些实施方案中，突出端核苷酸中的一个或多个可以包含一种或多种化学修饰，比如硫代磷酸酯或2’-OMe修饰。
在某些实施方案中，该多核苷酸是不经修饰。在其他实施方案中，至少一个核苷酸是修饰的。在另外的实施方案中，该修饰包括从该引导序列的5’-末端的第2核苷酸上的2’-H或2’-修饰的核糖。“第2核苷酸”定义为从该多核苷酸的5’-末端的第2个核苷酸。
如在此使用的，“2’-修饰的核糖”包括那些不具有2’-OH基团的核糖。“2’-修饰的核糖”不包括2’-脱氧核糖(存在于未修饰的标准DNA核苷酸中)。例如，该2’-修饰的核糖可以是2'-O-烷基核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核苷酸、2′-脱氧核苷酸，或其组合。
在某些实施方案中，该2’-修饰的核苷酸是嘧啶核苷酸(例如，C/U)。2’-O-烷基核苷酸的实例包括2’-O-甲基核苷酸或2'-O-烯丙基核苷酸。
在某些实施方案中，当与不具有特异的5'-末端修饰的类似构建体相比时，本发明的具有以上提及的5'-末端修饰的sd-rxRNA多核苷酸显示出显著的(例如，至少大约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更高)更少的“脱靶”(off-target)基因沉默，由此大大改进了该RNAi试剂或疗法的整体特异性。
如在此使用的，“脱靶”基因沉默指由于例如反义(引导)序列与非本意目标mRNA序列之间的伪序列同源性而发生的非本意的基因沉默。
根据本发明的这一方面，某些引导链修饰进一步增加了核酸酶稳定性，和/或降低了干扰素诱导，而没有显著降低RNAi活性(或丝毫没有降低RNAi活性)。
在一些实施方案中，该5'-茎干序列(5'-stem sequence)可以在该多核苷酸的5’-末端的2nd核苷酸处包括2’-修饰的核糖(比如2'-O-甲基修饰的核苷酸)，在一些实施方案中，没有其他的经修饰的核苷酸。与不具有所述位置上的2’-O-甲基修饰的类似构建体相比，具有此种修饰的发夹结构可以具有增强的靶标特异性或降低的脱靶沉默。
特异的5'-茎干序列与3'-茎干序列修饰的某些组合可以产生另外的预期之外的优点，部分地显示为抑制靶标基因表达的能力增强、血清稳定性增强和/或靶标特异性提高，等等。
在某些实施方案中，该引导链在其5’-末端的2nd核苷酸处包括2’-O-甲基修饰的核苷酸并且没有其他的经修饰的核苷酸。
在其他的方面，本发明的sd-rxRNA结构通过一种microRNA机制介导序列依赖性的基因沉默。如在此使用的，术语“microRNA”(“miRNA”)(在本领域内也称作小时序RNA(smalltemporal RNAs，stRNAs))指一种基因编码(例如，由病毒、哺乳动物或植物基因组编码)的小RNA(10-50个核苷酸)，该小RNA能够指导或介导RNA沉默。“miRNA失调”(miRNA disorder)应指一种疾病或失调，其特征是一种miRNA的活性的异常表达。
在小鼠、蠕虫以及哺乳动物中microRNA在关键通路中(例如发育以及癌症)参与下调靶标基因。经由microRNA机制的基因沉默通过miRNA与其靶标新信使RNA(mRNA)之间特性但不完全的碱基配对来实现。在microRNA介导的靶标mRNA表达下调中可以使用不同的机制。
miRNA是大约22个核苷酸的非编码RNA，它们可以于植物与动物发育过程中在转录后或转录水平上调节基因表达。miRNA的一个共同特点是它们都由可能是Dicer(一种RNaseIII类酶)或其同系物切离自一种大约70个核苷酸的称作pre-miRNA的前体RNA茎环。天然发生的miRNA由体内的内源基因表达并且由Dicer或其他RNAse从一种发夹或茎环前体(pre-miRNA或pri-miRNA)进行加工。miRNA在体内可以作为一种双链螺旋短暂地存在但是只有一条链被RISC复合体接纳以指导基因沉默。
在一些实施方案中，描述了一种在细胞吸收以及miRNA活性抑制方面有效的sd-rxRNA复合物。这些复合物基本上类似于进入RISC的变体但是大量链化学修饰模式以阻止酶切并且作为该RISC作用的有效抑制子进行了优化。例如，该复合物可以是完全或大部分地用以上描述的PS内含物(PS content)O甲基修饰的。对于这些类型的复合物而言，5’磷酸化是不必要的。双链区域的存在是优选的，因为它促进了细胞吸收以及有效的RISC装载。
另一条使用小RNA作为序列特异性调节子的通路是RNA干扰(RNAi)通路，该通路是针对细胞内双链RNA(dsRNA)的存在的一种进化上保守的反应。这些dsRNA被Dicer切割成为约20碱基对(bp)的小干扰RNA(siRNA)双链体。这些小RNA被装配进入称作RNA诱导的沉默复合体(RISC)的多蛋白效应物复合体中。然后这些siRNA引导具有完全互补性的靶标mRNA的切割。
在该siRNA通路以及该miRNA通路之间分享生物发生、蛋白复合体以及功能的一些方面。这些受试单链多核苷酸可以在该siRNA机制中模拟dsRNA，或在该miRNA机制中模拟microRNA。
在某些实施方案中，与具有相同序列的未经修饰的RNAi构建体相比较，这些经过修饰的RNAi构建体在血清和/或脑脊髓液中具有改进的稳定性。
在某些实施方案中，该RNAi构建体的结构在原代细胞中(比如哺乳动物原代细胞，包括来自人类、小鼠以及其他啮齿类以及其他非人类哺乳动物的原代细胞)不包括干扰素反应。在某些实施方案中，该RNAi构建体还可以在无脊椎动物有机体中用以抑制一种靶标基因的表达。
为了进一步提高这些受试构建体在体内的稳定性，可以通过一种或多种保护性基团将发夹结构的3’-末端封锁。例如，可以使用的保护性基团比如反向核苷酸、反向脱碱基部分(abasic moieties)或氨基末端经修饰的核苷酸。反向核苷酸可以包括反向的脱氧核苷酸。反向脱碱基部分可以包括反向脱氧脱碱基部分，比如3',3'-连接的或5',5'-连接的脱氧脱碱基部分。
本发明的RNAi构建体能够抑制由一种或多种靶标基因编码的任何靶标蛋白的合成。本发明包括在体外细胞或体内细胞中抑制一种靶标基因的表达的方法。按照这样，本发明的RNAi构建体对于治疗特征是一种靶标基因过表达的疾病的患者是有用的。
该靶标基因对于细胞可以是内源的或外源的(例如，通过一种病毒或利用重组DNA技术引入细胞)。此类方法可以包括将RNA以一种足以抑制该靶标基因表达的量引入细胞。举例而言，这样一种RNA分子可以具有一种与该靶标基因的核苷酸序列互补的引导链，如此该组合物抑制该靶标基因的表达。
本发明还涉及表达本发明的核酸的载体以及包含此类载体或这些核酸的细胞。该细胞可以是一种处于体内或在培养中的哺乳动物细胞，比如人类细胞。
本发明进一步涉及包含这些受试RNAi构建体以及一种药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。
本发明的另一个方面提供一种用于在哺乳动物细胞中抑制靶标基因表达的方法，该方法包括将一种眼细胞与任何这些受试RNAi构建体进行接触。
该方法可以在例如哺乳动物培养细胞(比如人类培养细胞)中于体外、间接体内(ex vivo)或体内进行。
可以在一种递送试剂(比如一种脂(例如，一种阳离子脂)或一种脂质体)的存在下将这些靶标细胞(例如，哺乳动物细胞)进行接触。
本发明的另一个方面提供一种用于在哺乳动物细胞中抑制靶标基因表达的方法，该方法包括将哺乳动物细胞与一种表达这些受试RNAi构建体的载体进行接触。
在本发明的一个方面中，提供了一种更长的双链体多核苷酸，包括一种大小范围是从大约16至大约30个核苷酸的第一多核苷酸；一种大小范围是从大约26至大约46个核苷酸的第二多核苷酸，其中该第一多核苷酸(反义链)与该第二多核苷酸(正义链)以及一种靶标基因互补，并且其中两种多核苷酸形成一种双链体并且其中该第一多核苷酸包含一种长度长于6个碱基的单链区域并且经过用可替代的修饰模式进行修饰，和/或包含一种利于细胞递送的轭合物部分。在这一实施方案中，该过客链的核苷酸的大约40％至大约90％之间、该引导链的核苷酸的大约40％至大约90％之间、以及该第一多核苷酸的单链区域的核苷酸的大约40％至大约90％之间是经化学修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，该多核苷酸双链体中经化学修饰的核苷酸可以是本领域内已知的任何经化学修饰的核苷酸，比如以上详细讨论的那些。在一个具体实施方案中，该经化学修饰的核苷酸是选自下组，该组由以下各项组成：2’F修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸以及2’脱氧核苷酸。在另一个具体实施方案中，这些经化学修饰的核苷酸来自核苷酸碱基的“疏水性修饰”。在另一个实施方案中，这些经化学修饰的核苷酸是硫代磷酸酯。在一个另外的具体实施方案中，经化学修饰的核苷酸是硫代磷酸酯、2’-O-甲基、2’脱氧、疏水性修饰以及硫代磷酸酯的组合。由于这些修饰的基团指核糖环、骨架以及核苷酸的修饰，因此一些经修饰的核苷酸将携带所有三种修饰类型的组合是可行的。
在另一个实施方案中，该化学修饰在该双链体的不同区域是不一的。在一个具体实施方案中，该第一多核苷酸(该过客链)在不同位置具有大量不同的化学修饰。对于这一多核苷酸而言，高达90％的核苷酸可以进行化学修饰和/或具有引入的错配。
在另一个实施方案中，该第一或第二多核苷酸的化学修饰包括但不限于尿嘧啶核苷与胞嘧啶的5’位修饰(4-吡啶基、2-吡啶基、吲哚基、苯基(C6H5OH)；色氨酰基(C8H6N)CH2CH(NH2)CO)、异丁基、丁基、氨基苄基；苯基；萘基、等等)，其中该化学修饰可以改变核苷酸的碱基配对能力。对于该引导链而言，本发明的这一方面的一个重要特点是相对于反义序列的5’末端的化学修饰的位置以及顺序。例如，该引导链的5’末端的化学磷酸化通常有益于效能。该正义链的种子区域(相对于5’的2-7位)的O-甲基修饰通常不具有良好的容许性，但2’F与脱氧具有良好的容许性。在施用的化学修饰的类型方面该引导链的中部以及该引导链3’末端更具允许性。位于该引导链的3’末端的脱氧修饰是不容许的。
本发明的这一方面的一个独特特征包括碱基上疏水修饰的使用。在一个实施方案中，这些疏水修饰优选是位于该引导链的近5’末端，在其他实施方案中，它们位于该引导链的中间，在其他实施方案中，它们位于该引导链的3’末端并且在又另一个实施方案中，它们遍布该多核苷酸的全长分布，相同类型的模式适用于该双链体的过客链。
该分子的另外部分是一种单链区域。预期该单链区域是从7至40个核苷酸的范围。
在一个实施方案中，该第一多核苷酸的单链区域包含选自下组的修饰，该组由以下各项组成：40％与90％之间的疏水碱基修饰、40％-90％之间的硫代磷酸酯、40％-90％之间的核糖部分修饰，及以上的任何组合。
引导链装载进入RISC复合体的效率可以因为重度修饰的多核苷酸而改变，因此在一个实施方案中，该双链体多核苷酸包含引导链(第一多核苷酸)的核苷酸9、11、12、13或14与正义链(第二多核苷酸)的相对应核苷酸之间的错配，以促进有效的引导链装载。
本发明的更多详细方面描述于以下部分。
双链体特征
本发明的双链寡核苷酸可以通过两股分离的互补核酸链来形成。双链体形成可以在含有靶标基因的细胞的内部或外部发生。
如在此使用的，术语“双链体”包括氢键键合至互补序列的该(这些)双链核酸分子的区域。本发明的双链寡核苷酸可以包含一种对于靶标基因是正义的核苷酸序列以及一种对于该靶标基因是反义的互补序列。相应于该靶标基因序列的正义与反义核苷酸序列与该靶标基因序列例如是完全相同的或足够地相同以达到靶标基因抑制(例如，大约至少大约98％相同、96％相同、94％、90％相同、85％相同或80％相同)。
在某些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在其全长都是双链的，即，在该分子的任一末端都没有突出端的单链序列，即，是平末端的。在其他实施方案中，个体的核酸分子可以具有不同的长度。换言之，本发明的双链寡核苷酸在其全长不都是双链的。例如，当使用两个单独的核酸分子时，这些分子中的一个(例如，包含反义序列的第一分子)可以比杂交其上的第二分子更长(使得该分子的一部分是单链)。同样地，当使用一种单一的核酸分子时，该分子在任一端的部分可以保持单链。
在一个实施方案中，本发明的双链寡核苷酸包含错配和/或环或凸起，但是该寡核苷酸长度的至少70％是双链的。在另一个实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在该寡核苷酸长度的至少80％上是双链的。在另一个实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在该寡核苷酸长度的至少90％-95％上是双链的。在另一个实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在该寡核苷酸长度的至少96％-98％上是双链的。在某些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸包含至少或多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个错配。
修饰
本发明的核苷酸可以在不同位置进行修饰，包括糖部分、磷酸二酯键和/或碱基。
在一些实施方案中，核苷的碱基部分可以是经过修饰的。例如，嘧啶碱基可以在嘧啶环的2、3、4、5和/或6位处进行修饰。在一些实施方案中，胞嘧啶的环外胺可以是经过修饰的。嘌呤碱基也可以是经过修饰的。例如，嘌呤碱基可以在1、2、3、6、7或8位处进行修饰。在一些实施方案中，腺嘌呤的环外胺可以是经过修饰的。在一些情况下，碱基部分的环中的氮原子可以用另一种原子(比如碳)来取代。对碱基部分的修饰可以是任何合适的修饰。修饰的实例是本领域的普通技术人员已知的。在一些实施方案中，这些碱基修饰包括烷基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶或者其他杂环。
在一些实施方案中，嘧啶可以在5位处进行修饰。例如，可以用一种烷基基团、炔基基团、链烯基基团、酰基基团或其经取代的衍生物来对嘧啶的5位进行修饰。在其他实例中，可以用一种羟基基团或烷氧基基团或其经取代的衍生物来对嘧啶的5位进行修饰。而且，可以对嘧啶的N4位进行烷基化。在又另外的实例中，嘧啶的5-6键可以是饱和的，嘧啶环中的氮原子可以经碳原子取代，和/或O2与O4原子可以经硫原子取代。应了解，其他修饰也是可能的。
在其他实例中，可以用一种烷基基团或其经取代的衍生物来对嘌呤的N7位和/或N2和/或N3位进行修饰。在另外的实例中，一种第三环可以稠合至该嘌呤双环系统上和/或该嘌呤环系统之中的氮原子可以用碳原子来进行取代。应了解，其他修饰也是可能的。
在5位处经修饰的嘧啶的非限制性实例披露于美国专利5591843、美国专利7,205,297、美国专利6,432,963以及美国专利6,020,483中；在N4位处经修饰的嘧啶的非限制性实例披露于美国专利5,580,731中；在8位处经修饰的嘌呤的非限制性实例披露于美国专利6,355,787以及美国专利5,580,972中；在N6位处经修饰的嘌呤的非限制性实例披露于美国专利4,853,386、美国专利5,789,416以及美国专利7,041,824中；并且在2位处经修饰的嘌呤的非限制性实例披露于美国专利4,201,860以及美国专利5,587,469中，其全部通过引用结合于此。
经修饰的碱基的非限制性实例包括N4,N4-乙醇胞嘧啶、7-脱氮黄嘌呤(deazaxanthosine)、7-脱氮鸟嘌呤、8-氧-N6-甲基腺嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基-腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、假尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、2-硫胞嘧啶以及2,6-二氨基嘌呤。在一些实施方案中，该碱基部分可以是一种杂环碱基而不是一种嘌呤或嘧啶。该杂环碱基可任选地进行修饰和/或取代。
糖部分包括天然的未经修饰的糖(例如单糖(比如戊糖，例如核糖、脱氧核糖))、经修饰的糖以及糖类似物。总体而言，核单体尤其是糖部分的可能修饰包括例如，用一种卤素、杂原子、脂肪族基团替代一个或多个羟基基团，或者将该羟基基团官能化为一种醚、胺、硫醇或类似物。
经修饰的核单体的一个尤其有用的基团是2’-O-甲基核苷酸。此类2’-O-甲基核苷酸可以指作“甲基化的”，并且相应的核苷酸可以从非甲基化的核苷酸随后进行烷基化来制备，或者直接从甲基化的核苷酸试剂来制备。经修饰的核单体可以与未经修饰的核单体组合使用。例如，本发明的寡核苷酸可以包含甲基化的以及未甲基化的核单体。
一些示例性的经修饰的核单体包括糖-或骨架经修饰的核糖核苷酸。经修饰的核糖核苷酸可以包含一种非天然发生的碱基(替代天然发生的碱基)，比如在5’-位经修饰的尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷，例如5’-(2-氨基)丙基丙基以及5’-溴尿嘧啶核苷；在8-位经修饰的腺嘌呤核苷与鸟嘌呤核苷，例如8-溴鸟嘌呤核苷；脱氮核苷酸，例如，7-脱氮-腺嘌呤核苷；以及N-烷基化的核苷酸，例如N6-甲基腺嘌呤核苷。而且，糖-经修饰的核糖核苷酸的2’-OH基团可以由H、烷氧基(或OR)、R或烷基、卤素、SH、SR、氨基(比如NH2、NHR、NR2)或CN基团取代，其中R是低级烷基、链烯基或炔基。
经修饰的核糖核苷酸还可以具有连接至由一种经修饰的基团(例如硫代磷酸酯基团)取代的邻近核糖核苷酸的磷酸二酯基团。更普遍地，可以组合不同的核苷酸修饰。
尽管反义(引导)链与靶标基因(或多种基因)的至少一部分可以是基本上相同的，但至少就碱基配对特性而言，针对有用于抑制靶标基因的表型的表达，该序列不需要是完全相同的。总体而言，可以使用更高的同源性来补偿更短反义基因的使用。在一些情况下，该反义链总体上与该靶标基因基本上相同(尽管是以反义方向)。
2′-O-甲基修饰的RNA的使用还在其中希望使细胞胁迫反应最小化的多种情况下是有益的。被认为是识别未经修饰RNA的细胞机器不识别具有2′-O-甲基核单体的RNA。2′-O-甲基化或部分2′-O-甲基化的RNA的使用可以避免对双链核酸的干扰素反应，同时维持靶标RNA抑制。对于例如在引起干扰素反应的短RNAi(例如，siRNA)序列方面以及在引起干扰素反应的更长RNAi序列方面避免该干扰素或其他细胞胁迫反应，这是有用的。
总体上，经修饰的糖可以包括D-核糖、2′-O-烷基(包括2′-O-甲基以及2′-O-乙基)，即，2′-烷氧基、2′-氨基、2′-S-烷基、2′-卤素(包括2′-氟)、2′-甲氧基乙氧基、2′-烯丙氧基(-OCH2CH＝CH2)、2′-炔丙基、2′-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基以及氰基以及类似物。在一个实施方案中，该糖部分可以是一种己糖并且结合进入一种如所描述的寡核苷酸中(Augustyns,K.,等人,《核酸研究》(Nucl.Acids.Res.)18:4711(1992))。示例性的核单体可以发现于例如美国专利号5,849,902中，通过引用结合在此。
下文更详细地描述特定官能团和化学术语的定义。出于本发明的目的，化学元素是根据元素周期表(Periodic Table of the Elements),CAS版本,化学与物理手册(Handbook of Chemistry and Physics),第75版,封二来鉴别，并且特定官能团总体上如其中所述来定义。另外，有机化学的一般原理以及特定官能部分和反应性描述于《有机化学》，Thomas Sorrell，大学科学书籍，Sausalito公司：1999(Organic Chemistry,ThomasSorrell,University Science Books,Sausalito:1999)中，其全部内容通过引用结合于此。
本发明的某些化合物可以呈特定几何或立体异构形式存在。本发明涵盖所有这些化合物，包括如在本发明的范围内的顺式-和反式-异构体、R-和S-对映异构体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体、其外消旋混合物，以及它们的其他混合物。另外的不对称碳原子可以存在于取代基(如烷基)中。预期所有这些异构体以及其混合物都包括在本发明中。
包含多种异构体比率中任一种的异构混合物都可以根据本发明加以利用。举例来说，在仅组合两种异构体的情况下，包含50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2、99:1或100:0异构体比率的混合物都被本发明所涵盖。本领域的普通技术人员将易于理解，对于更为复杂的异构体混合物，将涵盖类似比率。
举例来说，如果想要本发明化合物的一种特定对映异构体，那么它可以通过不对称合成，或通过用手性助剂进行衍生化来制备，其中分离所得到的非对映异构体混合物，并且裂解辅助性基团以提供纯的所希望的对映异构体。作为替代方案，当分子包含一个碱性官能团(如氨基)或一个酸性官能团(如羧基)时，用适当的光学活性酸或碱形成非对映异构盐，随后通过本领域中众所周知的分步结晶或层析方式拆分由此形成的非对映异构体，并且接着对纯对映异构体进行回收。
在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含3′以及5′末端(除环状寡核苷酸以外)。在一个实施方案中，例如可以通过修饰该3′或5′连接而使寡核苷酸的3′以及5′末端基本上受保护免于核酸酶(例如，美国专利号5,849,902以及WO 98/13526)。例如，可以通过包含一种“封闭基团”(blocking group)而使寡核苷酸具有抗性。如在此使用的术语“封闭基团”指可以作为保护基团或用于合成的偶联基团(例如，FITC、丙基(CH2-CH2-CH3)、乙二醇(-O-CH2-CH2-O-)磷酸酯(PO3 2-)、氢磷酸酯或亚磷酰胺)而附接至寡核苷酸或核单体的取代基(例如，除了OH基团)。“封闭基团”还包括“末端封闭基团”(end blocking group)或核酸外切酶封闭基团”(exonuclease blocking group)，它们保护包括经修饰的核苷酸以及非核苷酸核酸外切酶抗性结构的寡核苷酸5′与3′末端。
示例性的末端封闭基团包括帽结构(例如，7-甲基鸟嘌呤核苷帽)，反向(inverted)核单体，例如具有3′-3′或5′-5′末端反向(参见，例如，Ortiagao等人1992.《反义研究研发》(Antisense Res.Dev.)2:129)，甲基膦酸酯，亚磷酰胺，非核苷酸基团(例如，非核苷酸连接物、氨基连接物、轭合物)以及类似物。3′末端核单体可以包含一种经修饰的糖部分。3′末端核单体包含一种3′-O，该3′-O可任选地经一种封闭基团取代，该封闭基团阻止该寡核苷酸的3′-核酸外切酶降解。例如，可以通过一种3′→3′核苷酸间连接而将3′-羟基酯化为一种核苷酸。例如，该烷氧基残基可以是甲氧基、乙氧基或异丙氧基，并且优选是乙氧基。可任选地，在3′末端经3′→3′连接的核苷酸可以通过一种替代连接而连接。为了降低核酸酶降解，最5′的3′→5′连接可以是一种经修饰的连接，例如一种硫代磷酸酯或一种P-烷氧基磷酸三酯连接。优选地，两个最5′的3′→5′连接是经修饰的连接。可任选地，可以用一种含磷部分(例如，磷酸酯、硫代磷酸酯或P-乙氧基磷酸酯)对该5′末端羟基部分进行酯化。
本领域的普通技术人员将理解如在此所描述的合成方法利用不同的保护基团。如在此使用的术语“保护基团”(protecting group)意为一种具体的官能部分(例如O、S或N)被暂时性的封闭，从而可以在一种多官能化合物中的另一个反应位点选择性地进行反应。在某些实施方案中，保护基团以良好产率地进行选择性反应，给出一种受保护底物，该底物对于该受保护反应是稳定的；该保护基团应该可以通过容易得到、优选是无毒的试剂而以良好产率得以选择性除去，该试剂不攻击其他官能团；该保护基团形成一种容易分离的衍生物(更优选是没有新的手性中心的产生)；并且该保护基团具有最小的官能度以避免另外的反应位点。如在此详述的，可以利用氧、硫、氮以及碳保护基团。羟基保护基包括甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲基硫代甲基(MTM)、叔丁基硫代甲基、(苯基二甲基硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苄氧基甲基(BOM)、对-甲氧基苄氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(对-AOM)、愈创木酚甲基(GUM)、叔丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基(POM)、硅氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2,2,2-三氯乙氧基甲基、双(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基硅烷基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氢吡喃基(THP)、3-溴四氢吡喃基、四氢噻喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基(MTHP)、4-甲氧基四氢噻喃基、4-甲氧基四氢硫代噻喃基S,S-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(CTMP)、1,4-二噁烷-2-基、四氢呋喃、四氢硫代呋喃、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氢-7,8,8-三甲基-4,7-桥亚甲基苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基硅烷基乙基、2-(苯基氢硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、对-氯苯基、对-甲氧基苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、对-甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、邻-硝基苄基、对-硝基苄基、对-卤素苄基、2,6-二氯苄基、对-氰基苄基、对-苯基苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-甲基吡啶N-氧化物(3-methyl-2-picolyl N-oxido)、二苯基甲基、p,p′-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、对-甲氧基苯基二苯基甲基、二(对-甲氧基苯基)苯基甲基、三(对-甲氧基苯基)甲基、4-(4′-溴苯酰氧基苯基)二苯基甲基、4,4′,4″-三(4,5-二氯邻苯二甲酰亚胺苯基)甲基、4,4′,4″-三(乙酰丙酸基氧基苯基)甲基(4,4′,4″-tris(levulinoyloxyphenyl)methyl)、4,4′,4″-三(苯甲酰氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)双(4′,4″-二甲氧基苯基)甲基、1,1-双(4-甲氧基苯基)-1′-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)夹氧杂葸基、9-(9-苯基-10-氧基)蒽基、1,3-苯并二硫杂环戊烷-2-基、苯异噻唑基S,S-二氧化物、三甲基硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、二甲基异丙基甲硅烷基(IPDMS)、二乙基异丙基甲硅烷基(DEIPS)、二甲基己基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三苄基甲硅烷基、三-对-二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲硅烷基(DPMS)、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基(TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对-氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4,4-(亚乙基二硫)戊酸酯(乙酰丙酸基二硫(levulinoyldithio)乙缩醛)、三甲基乙酸盐(酯)、金刚酸盐(酯)(adamantoate)、巴豆酸盐(酯)、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸盐(脂)、对-苯基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸脂(菜酸酯(mesitoate))、烷基甲基碳酸酯、9-芴基甲基碳酸酯(Fmoc)、烷基乙基、烷基2,2,2-三氯乙基碳酸酯(Troc)、2-(三甲基硅烷基)乙基碳酸酯(TMSEC)、2-(苯磺酰基)乙基碳酸酯(Psec)、2-(三苯基磷鎓基)乙基碳酸酯(Peoc)、烷基异丁基碳酸酯、烷基乙烯基碳酸酯烷基烯丙基碳酸酯、烷基对-硝基苯基碳酸酯、烷基苄基碳酸酯、烷基对-甲氧基苄基碳酸酯、烷基3,4-二甲氧基苄基碳酸酯、烷基邻-硝基苄基碳酸酯、烷基对-硝基苄基碳酸酯、烷基S-苄基硫代碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、甲基二硫代碳酸酯、2-碘苯甲酸脂、4-叠氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、邻-(二溴甲基)苯甲酸脂、2-甲酰苯磺酸酯、2-(甲基硫代甲氧基)乙基、4-(甲基硫代甲氧基)丁酸酯、2-(甲基硫代甲氧基甲基)苯甲酸脂、2,6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,4-双(1,1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯联苯基乙酸酯、异丁酸盐(酯)、琥珀酸单酯,(E)-2-甲基-2-巴豆酸酯、邻-(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸盐(酯)、硝酸盐(酯)、烷基N,N,N’,N’-四甲基磷二酰胺、烷基N-苯基氨基甲酸酯、硼酸盐(酯)、二甲基硫膦基、烷基2,4-二硝基苯基磺酸酯、硫酸盐(酯)、甲烷磺酸盐(酯)(甲磺酸盐(酯))、苄基磺酸酯、以及甲苯磺酸盐(酯)(Ts)。为了保护1,2-或1,3-二醇，这些保护基团包括亚甲基乙缩醛、亚乙基乙缩醛、1-叔丁基亚乙基缩酮、1-苯基亚乙基缩酮、(4-甲氧基苯基)亚乙基乙缩醛、2,2,2-三氯亚乙基乙缩醛、丙酮化合物、亚环戊基缩酮、亚环己基缩酮、亚环庚基缩酮、亚苄基乙缩醛、对-甲氧基亚苄基乙缩醛、2,4-二甲氧基亚苄基缩酮、3,4-二甲氧基亚苄基乙缩醛、2-硝基亚苄基乙缩醛、甲氧基亚甲基乙缩醛、乙氧基亚甲基乙缩醛、二甲氧基亚甲基原酸酯、1-甲氧基亚乙基原酸酯、1-乙氧基次乙基原酸酯、1,2-二甲氧基亚乙基原酸酯、α-甲氧基亚苄基原酸酯、1-(N,N-二甲基氨基)亚乙基衍生物、α-(N,N’-二甲基氨基)亚苄基衍生物、2-氧杂亚环戊基原酸酯、二-叔丁基亚甲硅基基团(DTBS)、1,3-(1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷亚基)衍生物(TIPDS)、四叔丁氧基二硅氧烷-1,3-二亚基衍生物(TBDS)、环状碳酸盐(酯)、环状硼酸盐(酯)、硼酸乙酯以及硼酸苯酯。氨基保护基团包括氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、9-芴基甲基氨基甲酸酯(Fmoc)、9-(2-磺酸基)芴基甲基氨基甲酸酯、9-(2,7-二溴)芴基甲基氨基甲酸酯、2,7-二-叔-丁基-[9-(10,10-二氧-10,10,10,10-四氢硫代呫吨基)]甲基氨基甲酸酯(DBD-Tmoc)、4-甲氧基苯甲酰甲基氨基甲酸酯(Phenoc)、2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(Troc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(Teoc)、2-苯乙基氨基甲酸酯(hZ)、1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(Adpoc)、1,1-二甲基-2-卤代乙基氨基甲酸酯、1,1-二甲基-2,2-二溴乙基氨基甲酸酯(DB-叔-BOC)、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(TCBOC)、1-甲基-1-(4-联苯基)乙基氨基甲酸酯(Bpoc)、1-(3,5-二-叔-丁基苯基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(叔-Bumeoc)、2-(2′-和4′-吡啶基)乙基氨基甲酸酯(Pyoc)、2-(N,N-二环己基甲酰胺基)乙基氨基甲酸酯、叔-丁基氨基甲酸酯(BOC)、1-金刚烷基氨基甲酸酯(Adoc)、乙烯基氨基甲酸酯(Voc)、烯丙基氨基甲酸酯(Alloc)、1-异丙基烯丙基氨基甲酸酯(Ipaoc)、肉桂基氨基甲酸酯(Coc)、4-硝基肉桂基氨基甲酸酯(Noc)、8-喹啉基氨基甲酸酯、N-羟基哌啶基氨基甲酸酯、烷基二硫代氨基甲酸酯、苄基氨基甲酸酯(Cbz)、对-甲氧基苄基氨基甲酸酯(Moz)、对-硝基苄基氨基甲酸酯、对-溴苄基氨基甲酸酯、对-氯苄基氨基甲酸酯、2,4-二氯苄基氨基甲酸酯、4-甲基亚硫酰基苄基氨基甲酸酯(Msz)、9-蒽基甲基氨基甲酸酯、联苯基甲基氨基甲酸酯、2-甲基硫代乙基氨基甲酸酯、2-甲基磺酰基乙基氨基甲酸酯、2-(对-甲苯磺酰基)乙基氨基甲酸酯、[2-(1,3-二噻烷基)]甲基氨基甲酸酯(Dmoc)、4-甲基苯硫基氨基甲酸酯(Mtpc)、2,4-二甲基苯硫基氨基甲酸酯(Bmpc)、2-磷鎓基乙基氨基甲酸酯(Peoc)、2-三苯基磷鎓基异丙基氨基甲酸酯(Ppoc)、1,1-二甲基-2-氰基乙基氨基甲酸酯、间-氯-对-酰氧基苄基氨基甲酸酯、对-(二羟基硼基)苄基氨基甲酸酯、5-苯并异噁唑基甲基氨基甲酸酯、2-(三氟甲基)-6-色满基甲基氨基甲酸酯(Tcroc)、间-硝基苯基氨基甲酸酯、3,5-二甲氧基苄基氨基甲酸酯、邻-硝基苄基氨基甲酸酯、3,4-二甲氧基-6-硝基苄基氨基甲酸酯、苯基(邻-硝基苯基)甲基氨基甲酸酯、吩噻嗪基-(10)-羰基衍生物、N′-对-甲苯磺酰基氨基羰基衍生物、N′-苯基氨基硫代羰基衍生物、叔-戊基氨基甲酸酯、S-苄基硫代氨基甲酸酯、对-氰基苄基氨基甲酸酯、环丁基氨基甲酸酯、环己基氨基甲酸酯、环戊基氨基甲酸酯、环丙基甲基氨基甲酸酯、对-癸氧基苄基氨基甲酸酯、2,2-二甲氧基羰基乙烯基氨基甲酸酯、邻-(N,N-二甲基甲酰胺基)苄基氨基甲酸酯、1,1-二甲基-3-(N,N-二甲基甲酰胺基)丙基氨基甲酸酯、1,1-二甲基丙炔基氨基甲酸酯、二(2-吡啶基)甲基氨基甲酸酯、2-呋喃基甲基氨基甲酸酯、2-碘乙基氨基甲酸酯、异冰片基氨基甲酸酯、异丁基氨基甲酸酯、异烟基氨基甲酸酯、对-(p′-甲氧基苯偶氮基)苄基氨基甲酸酯、1-甲基环丁基氨基甲酸酯、1-甲基环己基氨基甲酸酯、1-甲基-1-环丙基甲基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(3,5-二甲氧基苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(对-苯偶氮基苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-苯基乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(4-吡啶基)乙基氨基甲酸酯、苯基氨基甲酸酯、对-(苯偶氮基)苄基氨基甲酸酯、2,4,6-三-叔-丁基苯基氨基甲酸酯、4-(三甲基铵)苄基氨基甲酸酯、2,4,6-三甲基苄基氨基甲酸酯、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯乙酰胺、3-苯基丙酰胺、吡啶酰胺、3-吡啶基甲酰胺、N-苯甲酰基苯内氨酛基(N-benzoylphenylalanyl)衍生物、苯甲酰胺、对-苯基苯甲酰胺、邻-硝基苯基乙酰胺、邻-硝基苯氧基乙酰胺、乙酰基乙酰胺、(N’-二硫苄氧基羰基氨基)乙酰胺、3-(对-羟基苯基)丙酰胺、3-(邻-硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻-硝基苯氧基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻-苯偶氮基苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻-硝基肉桂酰胺、N-乙酰基乙酰蛋氨酸衍生物、邻-硝基苯甲酰胺、邻-(苯甲酰氧基甲基)苯甲酰胺、4,5-联苯基-3-噁唑啉-2-酮、N-邻苯二甲酰亚胺、N-二硫琥珀酰亚胺(N-dithiasuccinimide)(Dts)、N-2,3-联苯基马来酰亚胺、N-2,5-二甲基吡咯、N-1,1,4,4-四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷加合物(STABASE)、5-取代的1,3-二甲基-1,3,5-三氮杂环己烷-2-酮、5-取代的1,3-二苄基-1,3,5-三氮杂环己烷-2-酮、1-取代的3,5-二硝基-4-吡啶酮、N-甲胺、N-烯丙基胺、N-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]甲胺(SEM)、N-3-乙酰氧基丙胺、N-(1-异丙基-4-硝基-2-氧-3-吡咯烷-3-基)胺、季铵盐、N-苄胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲胺、N-5-二苯并环庚胺、N-三苯基甲胺(Tr)、N-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]胺(MMTr)、N-9-苯基芴基胺(PhF)、N-2,7-二氯-9-芴基甲基烯胺、N-二茂铁基甲氨基(Fcm)、N-2-吡啶甲基氨基N’-氧化物、N-1,1-二甲基硫亚甲基胺、N-亚苄基胺、N-对-甲氧基亚苄基胺、N-二苯基亚甲基胺、N-[(2-吡啶基)米基]亚甲基胺、N-(N’,N’-二甲基氨基亚甲基)胺、N,N’-异亚丙基二胺、N-对-硝基亚苄基胺、N-亚水杨基胺、N-5-氯亚水杨基胺、N-(5-氯-2-羟基苯基)苯基亚甲基胺、N-亚环己基胺、N-(5,5-二甲基-3-氧-1-环己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-联苯基硼酸衍生物、N-[苯基(五羰基铬-或钨)羰基]胺、N-铜螯合物、N-锌螯合物、N-硝基胺、N-亚硝胺、胺N-氧化物、联苯基磷酰胺(Dpp)、二甲基硫代磷酰胺(Mpt)、二苯基硫代磷酰胺(Ppt)、二烷基磷酰胺酯、二苄基磷酰胺酯、二苯基磷酰胺酯、苯次磺酰胺、邻-硝基苯次磺酰胺(Nps)、2,4-二硝基苯次磺酰胺、五氯苯次磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯次磺酰胺、三苯基甲基次磺酰胺、3-硝基吡啶次磺酰胺(Npys)、对-甲苯磺酰胺(Ts)、苯磺酰胺、2,3,6,-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mtr)、2,4,6-三甲氧基苯磺酰胺(Mtb)、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Pme)、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mte)、4-甲氧基苯磺酰胺(Mbs)、2,4,6-三甲基苯磺酰胺(Mts)、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺(iMds)、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰胺(Pmc)、甲烷磺酰胺(Ms)、β-三甲基甲硅烷基乙烷磺酰胺(SES)、9-蒽磺酰胺、4-(4′,8′-二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺(DNMBS)、苄基磺酰胺、三氟甲基磺酰胺以及苯甲酰甲基磺酰胺。在此详述了示例性的保护基团。然而，应该理解，本发明并不意在限制于这些保护基团；相反，多种另外的等效保护基团可以使用以上标准来容易地鉴别并且在本发明的方法中利用。另外，多种保护基团描述于《有机合成中的保护性基团第三版》Greene,T.W.与Wuts,P.G.编辑，John Wiley&Sons公司，纽约：1999(Protective Groups in OrganicSynthesis,Third Ed.Greene,T.W.and Wuts,P.G.,Eds.,John Wiley&Sons,New York:1999)，其全部内容通过引用结合于此。
应理解，如在此描述的化合物可以被许多取代基或官能部分取代。总体而言，术语“经取代的”(不管是否前置术语“可任选地”)以及在本发明中包含的取代基指一种指定结构中的氢被一种特定取代基基团替代。当任一给定结构中的超过一个位置可以被超过一个选自指定组的取代基取代时，在每一位置处的取代基可以相同或不同。如在此使用的，术语“经取代的”意在包括有机化合物的所有可允许的取代基。从广义上看，可容许的取代基包括有机化合物的无环和环状、分支和未分支、碳环和杂环、芳香族和非芳香族的取代基。杂原子(如氮)可以具有在此描述的有机化合物的氢取代基和/或任何可容许的取代基，这些取代基满足这些杂原子的价态。此外，本发明不打算以任何方式受限于有机化合物的可容许的取代基。本发明所预想的取代基和变量的组合优选是使得在治疗例如传染病或增生性失调中有用的稳定化合物形成的那些组合。如在此所使用的术语“稳定的”(stable)优选是指拥有稳定性的化合物，该稳定性足以允许该化合物制造并且维持该化合物的完整性一段时间，该时间足以使该化合物被检测到，并且优选是维持一段时间，该时间足以使该化合物对于在此详述的目的是有用的。
在此使用的术语“脂肪族的”(aliphatic)包括饱和以及不饱和的直链(即，未分支的)、支链、非环、环状或多环脂肪族烃，它们可任选地经一个或多个官能团取代。如本领域内的普通技术人员将理解的，“脂肪族的”在此意在包括但不限于烷基、链烯基、炔基、环烷基、环烯基以及环炔基部分。因此，如在此使用的，术语“烷基”(alkyl)包括直链、支链或环状烷基基团。类似的惯例适用于其他通用术语，比如“链烯基”(alkenyl)、“炔基”(alkynyl)等等。而且，如在此使用的，术语“烷基”、“链烯基”、“炔基”以及类似术语囊括经取代或未经取代的基团。在某些实施方案中，如在此使用的，“低级烷基”(lower alkyl)是用以指具有1-6个碳原子的那些烷基基团(环状、非环、经取代、未经取代、分支或未分支)。
在某些实施方案中，本发明中采用的烷基、链烯基以及炔基包含1-20个脂肪族碳原子。在某些其他实施方案中，本发明中采用的烷基、烯基以及炔基包含1-10个脂肪族碳原子。在又其他实施方案中，本发明中采用的烷基、烯基以及炔基包含1-8个脂肪族碳原子。在另其他实施方案中，本发明中采用的烷基、烯基以及炔基包含1-6个脂肪族碳原子。在又其他实施方案中，本发明中采用的烷基、烯基以及炔基包含1-4个碳原子。因此，示意性脂肪族基团包括但不限于，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、-CH2-环丙基、乙烯基、烯丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、-CH2-环丁基、正戊基、仲戊基、异戊基、叔戊基、环戊基、-CH2-环戊基、正己基、仲己基、环己基、-CH2-环己基部分等等，这些基团又可以带有一种或多种取代基。链烯基包括但不限于，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等等。代表性炔基包括但不限于乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等等。
本发明化合物中上述脂肪族(和其他)部分的取代基的一些实例包括但不限于脂肪族基；杂脂肪族基；芳基；杂芳基；芳基烷基；杂芳基烷基；烷氧基；芳氧基；杂烷氧基；杂芳氧基；烷硫基；芳硫基；杂烷硫基；杂芳硫基；-F；-Cl；-Br；-I；-OH；-NO2；-CN；-CF3；-CH2CF3；-CHCl2；-CH2OH；-CH2CH2OH；-CH2NH2；-CH2SO2CH3；-C(O)Rx；-CO2(Rx)；-CON(Rx)2；-OC(O)Rx；-OCO2Rx；-OCON(Rx)2；-N(Rx)2；-S(O)2Rx；-NRx(CO)Rx，其中Rx每次出现时独立地包括但不限于，脂肪族基、杂脂肪族基、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基；其中以上和在此描述的脂肪族基、杂脂肪族基、芳基烷基或杂芳基烷基取代基中的任何一个可以是经取代或未经取代、分支或未分支、环状或非环的，并且其中以上和在此描述的芳基或杂芳基取代基中的任何一个可以经取代或未经取代。总体上可适用的取代基的另外的实例是通过在此描述的具体实施方案说明。
如在此所使用，术语“杂脂肪族”(heteroaliphatic)指包含一个或多个例如替代碳原子的氧、硫、氮、磷或硅原子的脂肪族部分。杂脂肪族部分可以是分支的、未分支的、环状的或非环的并且包括饱和以及不饱和的杂环，比如吗啉基、吡咯烷基，等等。在某些实施方案中，杂脂肪族部分是这样经取代：其上的一个或多个氢原子独立地由一个或多个部分取代，该(这些)部分包括但不限于脂肪族基；杂脂肪族基；芳基；杂芳基；芳基烷基；杂芳基烷基；烷氧基；芳氧基；杂烷氧基；杂芳氧基；烷硫基；芳硫基；杂烷硫基；杂芳硫基；-F；-Cl；-Br；-I；-OH；-NO2；-CN；-CF3；-CH2CF3；-CHCl2；-CH2OH；-CH2CH2OH；-CH2NH2；-CH2SO2CH3；-C(O)Rx；-CO2(Rx)；-CON(Rx)2；-OC(O)Rx；-OCO2Rx；-OCON(Rx)2；-N(Rx)2；-S(O)2Rx；-NRx(CO)Rx，其中Rx每次出现时独立地包括但不限于，脂肪族基、杂脂肪族基、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其中以上和在此描述的脂肪族基、杂脂肪族基、芳基烷基或杂芳基烷基取代基中任一个可以是经取代或未经取代、分支或未分支、环状或非环的，并且其中以上和在此描述的芳基或杂芳基取代基中的任何一个可以经取代或未经取代。过在此描述的具体实施方案说明总体上可适用的取代基的另外的实例。
如在此所使用的术语“卤”(halo)以及“卤素”(halogen)指一种选自氟、氯、溴以及碘的原子。
如在此所使用，术语“烷基”(alkyl)包括饱和的脂肪族基团，这些基团包括直链烷基基团(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基，等等)、支链烷基基团(异丙基、叔丁基、异丁基，等等)、环烷基(脂环族)基团(环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基)、经烷基取代的环烷基基团以及经环烷基取代的烷基基团。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其主链中可以具有6个或更少碳原子(例如，对于直链，C1-C6，对于支链，C3-C6)，并且优选是4个或更少。同样，优选的环烷基在其环结构中可以具有3-8个碳原子，并且更优选是在该环结构中具有5或6个碳。术语C1-C6包括包含1至6个碳原子的烷基基团。
而且，除非另外说明，术语烷基包括“未经取代的烷基”以及“经取代的烷基”，其中后者指在该碳氢化合物骨架的一个或多个碳原子上具有独立选择的替代氢的取代基的烷基部分。此类取代基可以包括例如链烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸盐(酯)、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫羰基、烷氧基、磷酸盐(酯)、膦酸基、亚膦酸基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基以及烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基以及脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸盐(酯)、硫酸盐(酯)、烷基亚磺酰基、磺酸基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或一种芳族或杂芳族部分。环烷基可以进一步经例如以上描述的的取代基取代。“烷基芳基”(alkylaryl)或“芳基烷基”(arylalkyl)部分是一种经芳基取代的烷基(例如，苯基甲基(苄基))。术语“烷基”还包括天然的与非天然的氨基酸的侧链。术语“正-烷基”(n-alkyl)意为一种直链(即，未分支)的未经取代的烷基基团。
术语“链烯基”(alkenyl)包括不饱和的长度相似的脂肪族基团以及对上述烷基的可能的取代，但是该链烯基包含至少一个双键。例如，术语“链烯基”包括直链链烯基基团(例如，乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基，等等)、支链链烯基基团、环链烯基(脂环族)基团(环丙烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基)、烷基或链烯基取代的环链烯基基团以及环烷基或环链烯基取代的链烯基基团。在某些实施方案中，直链或支链链烯基基团在其主链中具有6个或更少碳原子(例如，对于直链，C2-C6，对于支链，C3-C6)。同样，环链烯基基团在其环结构中可以具有3-8个碳原子，并且更优选是在该环结构中具有5或6个碳。术语C2-C6包括包含2至6个碳原子的链烯基基团。
而且，除非另外说明，术语链烯基包括“未经取代的链烯基”以及“经取代的链烯基”，其中后者指在该碳氢化合物骨架的一个或多个碳原子上具有独立选择的替代氢的取代基的链烯基部分。此类取代基可以包括例如烷基基团、炔基基团、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸盐(酯)、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫羰基、烷氧基、磷酸盐(酯)、膦酸基、亚膦酸基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基以及烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基以及脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸盐(酯)、硫酸盐(酯)、烷基亚磺酰基、磺酸基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或一种芳族或杂芳族部分。
术语“炔基”(alkynyl)包括不饱和的长度相似的脂肪族基团以及对上述烷基的可能的取代，但是该炔基包含至少一个三键。例如，术语“炔基”包括直链炔基基团(例如，乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基，等等)、支链炔基基团、以及环烷基或环烯基取代的炔基基团。在某些实施方案中，直链或支链炔基基团在其主链中具有6个或更少碳原子(例如，对于直链，C2-C6，对于支链，C3-C6)。术语C2-C6包括包含2至6个碳原子的炔基基团。
而且，除非另外说明，术语炔基包括“未经取代的炔基”以及“经取代的炔基”，其中后者指在该碳氢化合物骨架的一个或多个碳原子上具有独立选择的替代氢的取代基的炔基部分。此类取代基可以包括例如烷基基团、炔基基团、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸盐(酯)、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫羰基、烷氧基、磷酸盐(酯)、膦酸基、亚膦酸基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基以及烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基以及脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸盐(酯)、硫酸盐(酯)、烷基亚磺酰基、磺酸基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或一种芳族或杂芳族部分。
除非对碳数目另有说明，如在此使用的“低级烷基”意为一种烷基基团，如以上所定义的，但是在其骨架结构上具有一至五个碳原子。“低级链烯基”(Lower alkenyl)以及“低级炔基”(lower alkynyl)具有例如2-5个碳原子的链长。
术语“烷氧基”(alkoxy)包括经取代的以及未经取代的共价键合至氧原子的烷基、链烯基以及炔基基团。烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基、以及戊氧基基团。经取代的烷氧基的实例包括卤代烷氧基基团。这些烷氧基可以经独立地选择的基团取代，这些基团是比如链烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸盐(酯)、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫羰基、烷氧基、磷酸盐(酯)、膦酸基、亚膦酸基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基以及烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基以及脲基)、脒基、亚胺基、硫氢基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸盐(酯)、硫酸盐(酯)、烷基亚磺酰基(alkylsulfmyl)、磺酸基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或一种芳族或杂芳族部分。经卤素取代的烷氧基基团的实例包括但不限于，氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯甲氧基、二氯甲氧基、三氯甲氧基，等等。
术语“杂原子”(heteroatom)包括除碳或氢之外的任何元素的原子。优选的杂原子是氮、氧、硫以及磷。
术语“羟基”(hydroxy)或“氢氧基”(hydroxyl)包括具有-OH或-O-(具有一种适当的平衡离子)的基团。
术语“卤素”包括氟、溴、氯、碘，等等。术语“全卤化的”(perhalogenated)通常指一种其中所有氢都被卤素原子取代的部分。
术语“经取代的”包括独立地选择的取代基，这些取代基可以放置在该部分上并且允许该分子执行其预期的功能。取代基的实例包括烷基、链烯基、炔基、芳基、(CR′R″)0-3NR′R″、(CR′R″)0-3CN、NO2、卤素、(CR′R″)0-3C(卤素)3、(CR′R″)0-3CH(卤素)2、(CR′R″)0-3CH2(卤素)、(CR′R″)0-3CONR′R″、(CR′R″)0-3S(O)1-2NR′R″、(CR′R″)0-3CHO、(CR′R″)0-3O(CR′R″)0-3H、(CR′R″)0-3S(O)0-2R′、(CR′R″)0-3O(CR′R″)0-3H、(CR′R″)0-3COR′、(CR′R″)0-3CO2R′、or(CR′R″)0-3OR′基团；其中每一R′以及R″各自独立的是氢、一种C1-C5烷基、C2-C5链烯基、C2-C5炔基、或芳基基团，或者R′以及R″一起是一种亚苄基基团或一种-(CH2)2O(CH2)2-基团。
术语“胺”(amine)或“氨基”(amino)包括其中氮原子共价键合至至少一个碳或杂原子上的化合物或部分。术语“烷基氨基”(alkyl amino)包括其中该氮键合至至少一个另外的烷基上的基团或化合物。术语“二烷基氨基”(dialkyl amino)包括其中该氮原子键合至至少两个另外的烷基上的基团。
术语“醚”(ether)包括这样的化合物或部分，这些化合物或部分包含一种键合至两个不同碳原子或杂原子上的氧。例如，该术语包括“烷氧基烷基”(alkoxyalkyl)，它指一种共价键合至氧原子上的烷基、链烯基或炔基基团，该氧原子共价键合至另一个烷基基团。
术语“多核苷酸”(polynucleotide)“核苷酸序列”(nucleotide sequence)“核酸”(nucleic acid)“核酸分子”(nucleic acid molecule)“核酸序列”(nucleic acidsequence)以及“寡核苷酸”(oligonucleotide)指两种或更多核苷酸的聚合物。这些多核苷酸可以是DNA、RNA或其衍生物或经修饰的变体。该多核苷酸可以是单链的或双链的。该多核苷酸可以在碱基部分、糖部分或磷酸酯骨架上进行修饰，例如以改进该分子的稳定性、其杂化参数，等等。该多核苷酸可以包含一种经修饰的碱基部分，该碱基部分选自下组，该组包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲氨基甲基-2-硫尿嘧啶核苷、5-羧基甲氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(beta-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、wybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、以及2,6-二氨基嘌呤。该寡核苷酸可以包含一种经修饰的糖部分(例如，2′-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖、2′-O-甲基胞嘧啶核苷、阿拉伯糖以及己醣)和/或一种经修饰的磷酸酯部分(例如，硫代磷酸酯以及5′-N-亚磷酰胺连接)。核苷酸序列典型地携带遗传信息，包括细胞机器使用来产生蛋白以及酶的信息。这些术语包括双链或单链基因组的以及cDNA、RNA、任何合成与经遗传操作的多核苷酸，以及正义与反义多核苷酸。这包括单链与双链分子，即，DNA-DNA、DNA-RNA以及RNA-RNA杂交体，以及通过将碱基轭合至氨基酸骨架而形成的“蛋白核酸”(protein nucleic acids)(PNA)。
术语“碱基”(base)包括已知的嘌呤与嘧啶杂环碱基、脱氮嘌呤、以及类似物(包括经杂环取代的类似物，例如氨基乙氧基吩噁嗪)、其衍生物(例如，1-烷基-、1-链烯基-、杂芳族-以及1-炔基衍生物)与互变异构体。嘌呤的实例包括腺嘌呤、鸟嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤以及黄嘌呤以及类似物(例如，8-氧-N6-甲基腺嘌呤或7-二氮杂黄嘌呤)及其衍生物。嘧啶包括例如，胸腺嘧啶、尿嘧啶以及胞嘧啶以及它们的类似物(例如，5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(1-丙炔基)尿嘧啶、5-(1-丙炔基)胞嘧啶以及4,4-乙醇胞嘧啶)。合适的碱基的其他实例包括非嘌呤以及非嘧啶碱基，比如2-氨基吡啶以及三嗪。
在一个优选实施方案中，本发明的寡核苷酸的核单体是RNA核苷酸。在另一个优选实施方案中，本发明的寡核苷酸的核单体是经修饰的RNA核苷酸。因此，这些寡核苷酸包含经修饰的RNA核苷酸。
术语”核苷”(nucleoside)包括共价键合至一个糖部分(优选是核糖或脱氧核糖)上的碱基。优选核苷的实例包括核糖核苷以及脱氧核糖核苷。核苷还包括连接至氨基酸或氨基酸类似物(它们可以包含游离羧基基团、游离氨基基团或保护基团)上的碱基。合适的保护基团在本领域内是已知的(参见P.G.M.Wuts以及T.W.Greene，”有机合成中的保护性基团”(Protective Groups in Organic Synthesis)，第二版，Wiley-Interscience公司，纽约，1999)。
术语“核苷”包括进一步包含一种磷酸酯基团或一种磷酸酯类似物的核苷。
这些核酸分子可以与一种疏水部分关联以靶向和/或递送该分子至细胞。在某些实施方案中，该疏水部分是通过一种连接物与该核酸分子相关联。在某些实施方案中，该关联是通过非共价相互作用。在其他实施方案中，该关联是通过一种共价键。任何本领域内已知的连接物都可以用以使该核酸与该疏水部分相关联。本领域内已知的连接物描述于公开国际申请WO 92/03464、WO 95/23162、WO 2008/021157、WO 2009/021157、WO 2009/134487、WO 2009/126933、美国专利申请公开2005/0107325、美国专利5,414,077、美国专利5,419,966、美国专利5,512,667、美国专利5,646,126、以及美国专利5,652,359，通过引用将它们结合于此。该连接物可以简单地是一种至多原子连接物的共价键。该连接物可以是环状或非环的。该连接物可任选地经取代。在某些实施方案中，能够将该连接物从该核酸上切割。在某些实施方案中，能够在生理条件下将该连接物水解。在某些实施方案中，能够通过一种酶(例如，一种酯酶或磷酸二酯酶)将该连接物切割。在某些实施方案中，该连接物包含一种间隔元件(spacer element)以将该核酸与该疏水部分分开。该间隔元件可以包含一个至三十个碳或杂原子。在某些实施方案中，该连接物和/或间隔元件包含可质子化的官能团。此类可质子化的官能团可以促进该核酸分子的内涵体逃逸。这些可质子化的官能团还可以辅助该核酸递送至细胞，例如，中和该分子的总电荷。在其他实施方案中，该连接物和/或间隔元件是生物学上惰性的(也就是，它不向得到的核酸分子给予生物活性或功能)。
在某些实施方案中，具有连接物以及疏水部分的核酸分子具有在此描述的分子式。在某些实施方案中，该核酸分子具有化学式：
Figure BDA0001016238680000311
其中
X是N或CH；
A是一种化学键；经取代或未经取代、环状或非环的、分支或未分支的脂肪族；或经取代或未经取代、环状或非环的、分支或未分支的杂脂肪族；
R1是一个疏水部分；
R2是氢；一种氧保护基团；环状或非环的、经取代或未经取代、分支或未分支的脂肪族；环状或非环的、经取代或未经取代、分支或未分支的杂脂肪族；经取代或未经取代、分支或未分支的酰基；经取代或未经取代、分支或未分支的芳基；经取代或未经取代、分支或未分支的杂芳基；并且
R3是一种核酸。
在某些实施方案中，该分子具有化学式：
Figure BDA0001016238680000312
在某些实施方案中，该分子具有化学式：
在某些实施方案中，该分子具有化学式：
在某些实施方案中，该分子具有化学式：
Figure BDA0001016238680000322
在某些实施方案中，X是N。在某些实施方案中，X是CH。
在某些实施方案中，A是一种化学键。在某些实施方案中，A是经取代或未经取代、环状或非环的、分支或未分支的脂肪族。在某些实施方案中，A是非环的、经取代或未经取代、分支或未分支的脂肪族。在某些实施方案中，A是非环的经取代、分支或未分支的脂肪族。在某些实施方案中，A是非环的经取代、未分支的脂肪族。在某些实施方案中，A是非环的经取代、未分支的烷基。在某些实施方案中，A是非环的经取代、未分支的C1-20烷基。在某些实施方案中，A是非环的经取代、未分支的C1-12烷基。在某些实施方案中，A是非环的经取代、未分支的C1-10烷基。在某些实施方案中，A是非环的经取代、未分支的C1-8烷基。在某些实施方案中，A是非环的经取代、未分支的C1-6烷基。在某些实施方案中，A是经取代或未经取代、环状或非环的、分支或未分支的杂脂肪族。在某些实施方案中，A是非环的经取代或未经取代、分支或未分支的杂脂肪族。在某些实施方案中，A是非环的经取代、分支或未分支的杂脂肪族。在某些实施方案中，A是非环的经取代、未分支的杂脂肪族。
在某些实施方案中，A具有化学式：
Figure BDA0001016238680000323
在某些实施方案中，A具有以下分子式之一：
Figure BDA0001016238680000331
在某些实施方案中，A具有以下分子式之一：
Figure BDA0001016238680000341
在某些实施方案中，A具有以下分子式之一：
Figure BDA0001016238680000351
在某些实施方案中，A具有化学式：
在某些实施方案中，A具有化学式：
Figure BDA0001016238680000353
在某些实施方案中，A具有化学式：
Figure BDA0001016238680000354
其中
每一出现的R独立地是天然或非天然氨基酸的侧链；并且
n是一个1(含)与20(含)之间的整数。在某些实施方案中，A具有化学式：
Figure BDA0001016238680000361
在某些实施方案中，R每次出现独立地是天然氨基酸的侧链。在某些实施方案中，n是一个1(含)与15(含)之间的整数。在某些实施方案中，n是一个1(含)与10(含)之间的整数。在某些实施方案中，n是一个1(含)与5(含)之间的整数。
在某些实施方案中，A具有化学式：
Figure BDA0001016238680000362
其中n是一个1(含)与20(含)之间的整数。在某些实施方案中，A具有化学式：
在某些实施方案中，n是一个1(含)与15(含)之间的整数。在某些实施方案中，n是一个1(含)与10(含)之间的整数。在某些实施方案中，n是一个1(含)与5(含)之间的整数。
在某些实施方案中，A具有化学式：
其中n是一个1(含)与20(含)之间的整数。在某些实施方案中，A具有化学式：
Figure BDA0001016238680000371
在某些实施方案中，n是一个1(含)与15(含)之间的整数。在某些实施方案中，n是一个1(含)与10(含)之间的整数。在某些实施方案中，n是一个1(含)与5(含)之间的整数。
在某些实施方案中，该分子具有化学式：
Figure BDA0001016238680000372
其中X、R1、R2以及R3如在此所定义；并且。
A′是经取代或未经取代、环状或非环的、分支或未分支的脂肪族；或经取代或未经取代、环状或非环的、分支或未分支的杂脂肪族。
在某些实施方案中，A′具有以下分子式之一：
在某些实施方案中，A具有以下分子式之一：
Figure BDA0001016238680000391
在某些实施方案中，A具有以下分子式之一：
Figure BDA0001016238680000401
在某些实施方案中，A具有化学式：
Figure BDA0001016238680000402
在某些实施方案中，A具有化学式：
Figure BDA0001016238680000403
在某些实施方案中，R1是一种类固醇。在某些实施方案中，R1是一种胆固醇。在某些实施方案中，R1是一种脂溶性维生素。在某些实施方案中，R1是维生素A。在某些实施方案中，R1是维生素E。
在某些实施方案中，R1具有化学式：
Figure BDA0001016238680000411
其中RA是经取代或未经取代、环状或非环的、分支或未分支的脂肪族；或经取代或未经取代、环状或非环的、分支或未分支的杂脂肪族。
在某些实施方案中，R1具有化学式：
Figure BDA0001016238680000412
在某些实施方案中，R1具有化学式：
Figure BDA0001016238680000413
在某些实施方案中，R1具有化学式：
Figure BDA0001016238680000414
在某些实施方案中，R1具有化学式：
Figure BDA0001016238680000415
在某些实施方案中，R1具有化学式：
Figure BDA0001016238680000421
在某些实施方案中，该核酸分子具有化学式：
Figure BDA0001016238680000422
其中
X是N或CH；
A是一种化学键；经取代或未经取代、环状或非环的、分支或未分支的脂肪族；或经取代或未经取代、环状或非环的、分支或未分支的杂脂肪族；
R1是一个疏水部分；
R2是氢；一种氧保护基团；环状或非环的、经取代或未经取代、分支或未分支的脂肪族；环状或非环的、经取代或未经取代、分支或未分支的杂脂肪族；经取代或未经取代、分支或未分支的酰基；经取代或未经取代、分支或未分支的芳基；经取代或未经取代、分支或未分支的杂芳基；并且
R3是一种核酸。
在某些实施方案中，该核酸分子具有化学式：
Figure BDA0001016238680000423
其中
X是N或CH；
A是一种化学键；经取代或未经取代、环状或非环的、分支或未分支的脂肪族；或经取代或未经取代、环状或非环的、分支或未分支的杂脂肪族；
R1是一种疏水部分；
R2是氢；一种氧保护基团；环状或非环的、经取代或未经取代、分支或未分支的脂肪族；环状或非环的、经取代或未经取代、分支或未分支的杂脂肪族；经取代或未经取代、分支或未分支的酰基；经取代或未经取代、分支或未分支的芳基；经取代或未经取代、分支或未分支的杂芳基；并且
R3是一种核酸。
在某些实施方案中，该核酸分子具有化学式：
其中
X是N或CH；
A是一种化学键；经取代或未经取代、环状或非环的、分支或未分支的脂肪族；或经取代或未经取代、环状或非环的、分支或未分支的杂脂肪族；
R1是一个疏水部分；
R2是氢；一种氧保护基团；环状或非环的、经取代或未经取代、分支或未分支的脂肪族；环状或非环的、经取代或未经取代、分支或未分支的杂脂肪族；经取代或未经取代、分支或未分支的酰基；经取代或未经取代、分支或未分支的芳基；经取代或未经取代、分支或未分支的杂芳基；并且
R3是一种核酸。在某些实施方案中，该核酸分子具有化学式：
在某些实施方案中，该核酸分子具有化学式：
Figure BDA0001016238680000433
在某些实施方案中，该核酸分子具有化学式：
Figure BDA0001016238680000434
其中R3是一种核酸。
在某些实施方案中，该核酸分子具有化学式：
Figure BDA0001016238680000441
其中R3是一种核酸；并且
n是一个1(含)与20(含)之间的整数。
在某些实施方案中，该核酸分子具有化学式：
Figure BDA0001016238680000442
在某些实施方案中，该核酸分子具有化学式：
在某些实施方案中，该核酸分子具有化学式：
Figure BDA0001016238680000444
在某些实施方案中，该核酸分子具有化学式：
Figure BDA0001016238680000451
在某些实施方案中，该核酸分子具有化学式：
Figure BDA0001016238680000452
如在此使用的，术语“连接”(linkage)包括一种天然发生的、未经修饰的磷酸二酯部分(-O-(PO2-)-O-)，该部分共价偶联邻近的核单体。如在此使用的，术语“替代连接”(substitute linkage)包括该天然磷酸二酯基团的任何类似物或衍生物，它们共价偶联邻近的核单体。替代连接包括磷酸二酯类似物，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯以及P-乙氧基磷酸二酯(P-ethyoxyphosphodiester)、P-乙氧基磷酸二酯(P-ethoxyphosphodiester)、P-烷氧基磷酸三酯、甲基膦酸酯以及含有连接的非磷，例如缩醛以及酰胺。此类替代连接在本领域内是已知的(例如，Bjergarde等人1991.《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)19:5843；Caruthers等人1991.《核苷与核苷酸》(Nucleosides Nucleotides.)10:47)。在某些实施方案中，非水解性连接是优选的，比如硫代磷酸酯连接。
在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含经疏水修饰的核苷酸或“疏水修饰”。如在此使用的“疏水修饰”(hydrophobic modification)指经修饰的碱基，这些碱基经过修饰以至于(1)该碱基的总体疏水性得以显著提高，和/或(2)该碱基仍旧能够形成接近常规的沃森-克里克(Watson-Crick)相互作用。碱基修饰的一些非限制性实例包括5-位尿嘧啶核苷以及胞嘧啶核苷修饰，比如苯基、4-吡啶基、2-吡啶基、吲哚基以及异丁基、苯基(C6H5OH)；色氨酰基(C8H6N)CH2CH(NH2)CO)、异丁基、丁基、氨基苄基；苯基；以及萘基。
另一类型的可以附接至该sd-rxRNA的末端(3’或5’末端)、环区域或任何其他部分的轭合物可以包括一种甾醇、甾醇类型分子、肽、小分子、蛋白，等等。在一些实施方案中，sdrxRNA可以包含多于一种的轭合物(相同或不同化学性质)。在一些实施方案中，该轭合物是胆固醇。
另一个提高靶标基因特异性或降低脱靶沉默效应的途径是在相应于该引导序列的第二个5’-末端核苷酸的位置引入一种2’-修饰(比如2’-O甲基修饰)。这允许这一2’-修饰在Dicer抗性发夹结构中的定位，如此使得能够设计更好的具有更少或没有脱靶沉默的RNAi构建体。
在一个实施方案中，本发明的发夹多核苷酸可以包含一个是DNA的核酸部分以及一个是RNA的核酸部分。本发明的反义(引导)序列可以是包含一种RNA样区域以及一种DNA样区域的“嵌合寡核苷酸”。
用语“RNase H激活区域”(RNase H activating region)包括一种寡核苷酸区域，例如一种嵌合寡核苷酸，该寡核苷酸区域能够募集(recruiting)RNase H以切割该寡核苷酸所结合的靶标RNA链。典型地，该RNase激活区域包含一种最小的DNA或DNA样核单体核心(至少大约3-5，典型地是大约3-12之间，更典型地是大约5-12之间，并且更优选是大约5-10之间的连续核单体)。(参见例如，美国专利号5,849,902)。优选地，该RNase H激活区域包含大约九个连续的包含核单体的脱氧核糖。
用语“非激活区域”(non-activating region)包括一种反义序列区域，例如一种嵌合寡核苷酸，该反义序列区域不募集或激活RNase H。优选地，非激活区域不包含硫代磷酸酯DNA。本发明的寡聚核苷酸包含至少一个非激活区域。在一个实施方案中，该非激活区域可以针对核酸酶稳定化或可以通过与靶标互补并且与该寡核苷酸所结合的靶标核酸分子形成氢键而提供针对靶标的特异性。
在一个实施方案中，这些连续多核苷酸的至少一部分是通过一种替代连接(例如，硫代磷酸酯连接)而连接。
在某些实施方案中，该引导序列之外的核苷酸的多数或全部(2’-修饰或无修饰)是通过硫代磷酸酯连接而连接。此类构建体通常由于其更高的血清蛋白亲和性而具有改进的药物代谢动力学。这些位于该多核苷酸的非引导序列部分中的硫代磷酸酯连接在引导链一旦装载进入RISC后不干扰该引导链的活性。
本发明的反义(引导)序列可以包括“吗啉代寡核苷酸”。吗啉代寡核苷酸是非离子的并且通过一种独立于RNase H的机制起作用。吗啉代寡核苷酸的4种遗传碱基(腺嘌呤、腺胞啶、鸟嘌呤以及胸腺嘧啶/尿嘧啶)中的每一种都连接至一个6元吗啉环上。吗啉代寡核苷酸是通过例如非离子磷二酰胺(phosphorodiamidate)相互连接而连接这4种不同的亚基类型来产生的。吗啉代寡核苷酸具有许多优势，包括：完全的核酸酶抗性(《反义&核酸药物研发》(Antisense&Nucl.Acid Drug Dev.)1996.6:267)；可预测的靶向(《生物化学与生物物理学学报》(Biochemica Biophysica Acta.)1999.1489:141)；可靠的细胞内活性(《反义&核酸药物研发》1997.7:63)；优异的序列特异性(《反义&核酸药物研发》1997.7:151)；最小的非反义活性(《生物化学与生物物理学学报》1999.1489:141)；以及简单的渗透递送或刮擦递送(scrape delivery)(《反义&核酸药物研发》1997.7:291)。吗啉代寡核苷酸由于其在高剂量下的非毒性也是优选的。对吗啉代寡核苷酸的制备的讨论可以在《反义&核酸药物研发》1997.7:187中找到。
基于在此描述的数据，认为在此描述的化学修饰促进了单链多核苷酸装载进入RISC中。单链多核苷酸已经显示在装载进入RISC以及诱导基因沉默方面具有活性。然而，当与双链体多核苷酸相比较时，单链多核苷酸的活性水平似乎低2至4个数量级。
本发明提供了对这些化学修饰模式的描述，它们可以(a)显著提高该单链多核苷酸的稳定性(b)促进该多核苷酸装载进入RISC复合体的效率以及(c)改进细胞对该单链核苷酸的吸收。图18提供了这些化学修饰的一些非限制性实例，对于达到单链多核苷酸在该细胞内的效能而言，它们是有益的。这些化学修饰模式可以包括核糖、骨架、疏水核苷以及轭合物类型的修饰的组合。另外，在一些实施方案中，该单多核苷酸的5’末端可以是经化学磷酸化的。
在又另一个实施方案中，本发明提供了对这些化学修饰模式的描述，它们改进RISC抑制多核苷酸的功能性。已经显示单链多核苷酸通过底物竞争机制而抑制预装载RISC复合体的活性。对于这些类型的通常称作antagomer的分子而言，其活性常常要求高浓度并且体内递送不是非常有效。本发明提供了对这些化学修饰模式的描述，它们可以(a)显著提高该单链多核苷酸的稳定性(b)促进RISC将该多核苷酸作为一种底物进行识别的效率和/或(c)改进细胞对该单链核苷酸的吸收。图6提供了这些化学修饰的一些非限制性实例，对于达到单链多核苷酸在该细胞内的效能而言，它们可以是有益的。这些化学修饰模式可以包括核糖、骨架、疏水核苷以及轭合物类型的修饰的组合。
本发明提供的修饰适用于所有多核苷酸。这包括单链的进入RISC的多核苷酸、单链的抑制RISC的多核苷酸、常规的双链体的不同长度(15-40bp)的多核苷酸、不对称的双链体的多核苷酸，等等。可以用范围广泛的多种化学修饰模式对多核苷酸进行修饰，包括5’末端、核糖、骨架以及疏水核苷修饰。
合成
本发明的寡核苷酸可以通过本领域内任何已知的方法来合成，例如，使用酶促合成和/或化学合成。这些寡核苷酸可以在体外进行合成(例如，使用酶促合成和/或化学合成)或在体内进行合成(利用本领域内熟知的重组DNA技术)。
在一个优选实施方案中，化学合成是针对经修饰的多核苷酸而使用。线性寡核苷酸的化学合成在本领域内是已知的并且可以通过溶液或固相技术来完成。优选地，合成是通过固相方法。寡核苷酸可以通过一些不同的合成程序中的任一种来进行制备，包括亚磷酰胺法、亚磷酸三酯法、H-磷酸酯法以及磷酸三酯法，典型地是通过自动化合成方法来进行制备。
寡核苷酸合成方案在本领域内是熟知的并且可以发现于例如美国专利申请号5,830,653；WO 98/13526；Stec等人1984.《美国化学学会杂志》(J.Am.Chem.Soc.)106:6077；Stec等人1985.《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)50:3908；Stec等人J.Chromatog.1985.326:263；LaPlanche等人1986.《核酸研究》1986.14:9081；Fasman G.D.,1989.《生物化学与分子生物学实用手册》(Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology).1989.CRC Press公司,布卡拉顿，佛罗里达州(Boca Raton,Fla.)；Lamone.1993.《生物化学学会会报》(Biochem.Soc.Trans.)21:1；美国专利申请号5,013,830；美国专利申请号5,214,135；美国专利申请号5,525,719；Kawasaki等人1993.《医药化学杂志》(J.Med.Chem.)36:831；WO 92/03568；美国专利申请号5,276,019；以及美国专利申请号5,264,423中。
所选的合成方法可以取决于所希望的寡核苷酸的长度并且此选择在普通技术人员的技术之内。例如，亚磷酰胺法以及亚磷酸三酯法可以产生具有175或更多核苷酸的寡核苷酸，而H-磷酸酯法对于少于100个核苷酸的寡核苷酸效果良好。如果将经修饰的碱基结合进入该寡核苷酸，并且特别是如果使用经修饰的磷酸二酯连接，则根据已知的程序按需要改变这些合成程序。就这一点而言，Uhlmann等人(1990,《化学综述》(Chemical Reviews)90:543-584)提供了针对利用经修饰的碱基与经修饰的磷酸二酯连接制备寡核苷酸的参考以及概要程序。其他的用于制备寡核苷酸的示例性方法传授于Sonveaux.1994.“寡核苷酸合成中的保护性基团”(“Protecting Groups in Oligonucleotide Synthesis”)；Agrawal.《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)26:1中。示例性的合成方法还传授于“寡核苷酸合成-实用方法”(“Oligonucleotide Synthesis-A PracticalApproach”)(Gait,M.J.IRL牛津大学出版社(Press at Oxford University Press)1984)中。而且，具有确定序列的线性寡核苷酸(包括一些具有经修饰核苷酸的序列)从一些商业资源处轻易可得。
这些寡核苷酸可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过许多色谱方法中的任一种(包括凝胶色谱以及高压液相色谱)来进行纯化。为了确定一种核苷酸序列，尤其是未经修饰的核苷酸序列，可以通过任何已知的方法(包括Maxam与Gilbert测序、桑格测序(Sangersequencing)、毛细管电泳测序、游荡点测序方法(wandering spot sequencingprocedure))或利用结合至尼龙膜(Hybond)纸的寡核苷酸的选择性化学降解来对寡核苷酸进行DNA测序。还可以通过激光解吸质谱法或通过快速原子轰击法来对短寡核苷酸序列进行分析(McNeal等人,1982,《美国化学学会杂志》104:976；Viari等人,1987,《生物医药学与环境学质谱》(Biomed.Environ.Mass Spectrom).14:83；Grotjahn等人,1982,《核酸研究》10:4671)。测序方法对与RNA寡核苷酸也可用。
可以使用例如Bergot与Egan 1992.J.Chrom.599:35的方法利用毛细管电泳与变性强阴离子HPLC(SAX-HPLC)来测试该寡核苷酸而对合成的寡核苷酸的品质进行确证。
其他示例性的合成技术是本领域内熟知的(参见，例如Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册第二版》(Molecular Cloning:a Laboratory Manual,Second Edition)(1989)；《DNA克隆，卷I与II》(DNA Cloning,Volumes I and II)(DN Glover编辑.1985)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(M J Gait编辑,1984)；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridisation)(B D Hames以及S J Higgins编辑.1984)；《分子克隆实用指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning)(1984)；或该系列，《酶学方法》(Methods in Enzymology)(Academic Press,Inc.公司))。
在某些实施方案中，该受试RNAi构建体或其至少部分是转录自编码这些受试构建体的表达载体。任何本领域公认载体可以用于这一目的。经转录的RNAi构建体可以在所希望的修饰(比如用一种经修饰的正义链替代未经修饰的正义链，等)开展之前进行分离以及纯化。
递送/载体
细胞对寡核苷酸的吸收
将寡核苷酸或寡核苷酸组合物与一个或多个细胞或一种细胞裂解液进行接触(即，使接触，在此还指给予或递送至)并且这些寡核苷酸或寡核苷酸组合物被一个或多个细胞或一种细胞裂解液吸收。术语“细胞”(cells)包括原核细胞与真核细胞，优选是脊椎动物细胞，并且更优选是哺乳动物细胞。在一个优选实施方案中，将本发明的寡核苷酸组合物与人类细胞进行接触。
本发明的寡核苷酸组合物可以在体外与细胞接触，例如在试管中或培养皿中(以及可以被引入或不引入受试者中)，或在体内与细胞接触，例如在受试者(比如哺乳动物受试者)中。在一些实施方案中，寡核苷酸是局部地或通过电穿孔而给予。细胞以低速率通过内吞作用吸收寡核苷酸，但是经内吞的寡核苷酸通常是多价鳌合(sequestered)的并且不可用于例如杂交至一种靶标核酸分子上。在一个实施方案中，可以通过电穿孔或磷酸钙沉淀法来促进细胞吸收。然而，这些方法仅对于体外或间接体内实施方案是有用的，它们不方便并且在一些情况下与细胞毒性有关。
在另一个实施方案中，可以通过合适的本领域公认的方法(包括磷酸钙法、DMSO法、甘油或葡聚糖法、电穿孔法)，或者通过转染，例如利用本领域内已知的方法使用阳离子、阴离子或中性脂类组合物或脂质体，来将寡核苷酸递送至细胞(参见例如，WO 90/14074；WO 91/16024；WO 91/17424；美国专利号4,897,355；Bergan等人1993.《核酸研究》21:3567)。还可以通过使用载体(参见例如，Shi,Y.2003.《遗传学趋势》(Trends Genet)2003 Jan.19:9；Reichhart J M等人《生殖》(Genesis).2002.34(1-2):1604；Yu等人2002.《美国科学院院刊》99:6047；Sui等人2002.《美国科学院院刊》99:5515)，病毒，使用多胺或多聚阳离子轭合物的化合物，比如聚赖氨酸、鱼精蛋白、或Ni、N12-双(乙基)精胺(参见例如，Bartzatt,R.等人1989.《生物技术与应用生物化学》(Biotechnol.Appl.Biochem.)11:133；Wagner E.等人1992.《美国科学院院刊》88:4255)来介导寡核苷酸的增强型递送。
在某些实施方案中，本发明的sd-rxRNA可以通过利用不同的含有β-葡聚糖的颗粒来进行递送，这类颗粒称作GeRPs(包囊了葡聚糖装载了RNA颗粒的颗粒)，它们描述于2010年3月4日提交的题目为“靶向递送至吞噬细胞的配制品与方法”(Formulations andMethods for Targeted Delivery to Phagocyte Cells)美国临时申请号61/310,611中，通过引用将其结合于此。此类颗粒还描述于还描述于美国专利申请号US 2005/0281781 A1以及US 2010/0040656，以及PCT申请WO 2006/007372与WO 2007/050643中，通过引用将其结合于此。这些sd-rxRNA分子可以经疏水修饰并且可任选地可以与一种脂类和/或两亲性肽相关联。在某些实施方案中，该β-葡聚糖颗粒是得自酵母。在某些实施方案中，该负载捕获分子(payload trapping molecule)是一种聚合物，比如具有分子量是至少大约1000Da、10,000Da、50,000Da、100kDa、500kDa等等的那些。优选的聚合物包括(但不限于)阳离子聚合物、壳聚糖或PEI(聚乙烯亚胺)，等等。
葡聚糖颗粒可以得自真菌细胞壁的不溶解性组分，比如酵母细胞壁。在一些实施方案中，该酵母是面包酵母。得自酵母的葡聚糖分子可以包括一个或多个β-(1,3)-葡聚糖、β-(1,6)-葡聚糖、甘露聚糖以及甲壳质。在一些实施方案中，葡聚糖颗粒包含一种空心的酵母细胞壁，由此该颗粒可以维持一种模拟细胞的三维结构，在其中它可以复合或包囊一种比如RNA分子的分子。与酵母细胞壁颗粒的使用相关联的一些优势是这些组分的可得性、它们的可生物降解性质、以及它们靶向吞噬细胞的能力。
在一些实施方案中，葡聚糖颗粒可以通过从细胞壁提取不可溶解的组分来进行制备，例如通过用1M NaOH/pH 4.0 H2O对面包酵母(Fleischmann进行提取)，接着进行洗涤以及干燥。制备酵母细胞壁颗粒的方法讨论于美国专利4,810,646、4,992,540、5,082,936、5,028,703、5,032,401、5,322,841、5,401,727、5,504,079、5,607,677、5,968,811、6,242,594、6,444,448、6,476,003、美国专利公开2003/0216346、2004/0014715与2010/0040656以及PCT公开申请WO 02/12348中，通过引用将其结合于此。
制备葡聚糖颗粒的方案还描述于以下文献中：Soto与Ostroff(2008),“《生物轭合物化学》-包囊在用于DNA递送的酵母细胞壁颗粒中的多层纳米颗粒的鉴定”(“Characterization of multilayered nanoparticles encapsulated in yeast cellwall particles for DNA delivery.”Bioconjug Chem)19(4):840-8；Soto与Ostroff(2007)，“《纳米技术》第2卷第5章，药物递送，口服的巨噬细胞介导的基因递送系统”(“OralMacrophage Mediated Gene Delivery System,”Nanotech,Volume 2,Chapter 5(“DrugDelivery“)),378-381页；以及Li等人(2007)，“《临床免疫学》-酵母葡聚糖颗粒通过MyD88-与Syk激酶-依赖的途径激活鼠驻留型巨噬细胞分泌促炎细胞因子”(“Yeast glucanparticles activate murine resident macrophages to secrete proinflammatorycytokines via MyD88-and Syk kinase-dependent pathways.”Clinical Immunology)124(2):170-181，通过引用将其结合于此。
包含葡聚糖的颗粒可以商购，比如酵母细胞壁颗粒。一些非限制性实例包括：Nutricell MOS 55，来自Biorigin公司(圣保罗，巴西)，SAF-Mannan(SAF Agri公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州(Minneapolis，Minn.))，Nutrex(森馨技术公司(SensientTechnologies)，密尔沃基，威斯康辛州(Milwaukee，Wis.))，经碱提取的颗粒，比如Nutricepts(Nutricepts Inc.公司，伯恩斯维尔，明尼苏达州(Burnsville，Minn.))与ASA生物技术公司(ASA Biotech)生产的那些，经酸提取的WGP颗粒，来自生物聚合物工程公司(Biopolymer Engineering)，以及经有机溶剂提取的颗粒，比如AdjuvaxTM，来自α-β技术公司(Alpha-beta Technology，Inc.)(伍斯特，马萨诸塞州(Worcester，Mass.))以及微粒葡聚糖，来自Novogen公司(斯坦福德，康涅狄格州(Stamford，Conn.))。
取决于生产和/或提取方法，诸如酵母细胞壁颗粒的葡聚糖颗粒可以具有不同水平的纯度。在一些情况下，颗粒是经碱提取、酸提取或有机溶剂提取的，以除去细胞内组分和/或该细胞壁的外部甘露糖蛋白层。此类方案可以产生具有50％-90％范围的葡聚糖含量(w/w)的颗粒。在一些情况下，较低纯度的颗粒(意为较低葡聚糖w/w含量)是优选的，而在其他实施方案中，较高纯度的颗粒(意为较高葡聚糖w/w含量)是优选的。
葡聚糖颗粒，比如酵母细胞壁颗粒，可以具有一种天然脂类成分。例如，这些颗粒可以含有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或大于20％w/w的脂类。在实例部分，对两种葡聚糖颗粒批次的效果进行了测试：YGP SAF以及YGP SAF+L(含有天然脂类)。在一些情况下，天然脂类的存在可以在RNA分子的复合或捕获方面进行辅助。
包含葡聚糖的颗粒典型地具有大约2-4微米的直径，尽管具有小于2微米直径或大于4微米直径的可以也与本发明的多个方面相兼容。
有待递送的该(这些)RNA分子被复合或“捕获”在该葡聚糖颗粒的之中。可以对该颗粒的壳或RNA组分进行标记而可视化，如描述于Soto与Ostroff(2008)《生物轭合物化学》19:840中的，通过引用将其结合于此。装载GeRP的方法描述于下。
用于寡核苷酸的吸收的最佳方案将取决于许多因素，最为关键的是将要使用的细胞的类型。其他的在吸收方面重要的因素包括但不限于，该寡核苷酸的性质与浓度、这些细胞的融合、这些细胞所在的培养物(例如，悬浮培养物或平板培养物)的类型以及这些细胞在其中生长的介质的类型。
包囊剂
包囊剂将寡核苷酸捕获在囊泡之中。在本发明的在另一个实施方案中，如本领域内的普通技术人员理解的，寡核苷酸可以与一种载体(carrier)或媒介物(vehicle)相联系，例如脂质体或微团(micelle)，尽管可以使用其他载体。脂质体是由具有类似于生物膜结构的脂双层制成的囊泡。此类载体可以用以促进该寡核苷酸的细胞吸收或靶向，或者改进该寡核苷酸的药物代谢动力学或毒理学特性。
例如，本发明的寡核苷酸还可以包囊在脂质体、药物组合物中进行给予，其中该活性成分分散地包含或不同地存在于小体中，这些小体由依附至脂质层的水性同心层构成。取决于溶解度，这些寡核苷酸可以存在于该水性层与该脂质层两者之中，或者存在于通常所称的脂质体悬浮液(liposomic suspension)中。该疏水层总体上但不排外地包含磷脂，比如卵磷脂以及鞘磷脂，类固醇，比如胆固醇，或多或少的离子表面活性剂，比如二乙酰磷酸酯、硬脂酰胺，或者磷脂酸，或其他具有疏水性质的材料。这些脂质体的直径通常是从大约15nm至大约5微米的范围。
脂质体作为药物递送载体的用途提供了一些优势。脂质体提高了细胞内稳定性、增加了吸收效率并且改进了生物活性。脂质体是中空的球形囊泡，由类似于构成细胞膜的脂类的排列方式而安排的脂类组成。它们仅具有一种内部水性空间用以捕获水溶性化合物，并且其直径大小范围是从0.05微米至数微米。一些研究已经证明，脂质体可以递送核酸至细胞并且这些核酸保持是生物活性的。例如，原本作为一种研究工具而设计的脂类递送载体，比如Lipofectin或LIPOFECTAMINETM 2000，可以将完整核酸分子递送至细胞。
使用脂质体的具体优势包括以下：它们在组合物中是非毒性的并且是可生物降解的；它们显示出长循环半衰期；并且可以将识别分子容易地附着至它们的表面用以靶向组织。最后，在成本上有效地生产基于脂质体的药物制剂，无论是液体悬浮液或冻干制品形式的药物制剂，已经证明了这一技术作为可接受的药物递送系统的可行性。
在一些方面，可以就一类自然发生的或化学合成的或经修饰的饱和与不饱和的脂肪酸残基而对与本发明相关的配制品进行选择。脂肪酸能以甘油三酯、甘油二酯或单独脂肪酸的形式存在。在另一个实施方案中，可以利用得以良好确证的脂肪酸的混合物和/或目前在药理学中用以肠外营养的脂肪乳液。
基于脂质体的配制品广泛地应用于寡核苷酸递送。然而，多数可商购的脂类或脂质体配制品包含至少一种带正电荷的脂类(阳离子脂类)。认为这一带正电荷的脂类的存在对于获得高程度的寡核苷酸装载以及对于增强脂质体融合特性是必需的。一些方法已经得以践行并公布，以鉴别最佳的带正电荷的脂类化学物质。然而，这些含有阳离子脂类的可商购的脂质体配制品具有高毒性特征。限于体内的治疗指标已经揭示，含有阳离子脂类的脂质体配制品在仅比达到RNA沉默所需的浓度稍高的浓度处与毒性有关(即，肝酶升高)。
与本发明有关的核酸可以经疏水修饰并且可以包含在中性纳米运载体之中。中性纳米运载体的进一步描述通过引用2009年9月22日提交的题为“中性纳米运载体”(NeutralNanotransporters)的PCT申请PCT/US2009/005251而结合于此。此类颗粒能够将定量的寡核苷酸结合进入无电荷脂类混合物中。在此类中性纳米运载体组合物中没有毒性水平的阳离子脂类是一个重要特征。
如在PCT/US2009/005251中所证明的，寡核苷酸可以有效地结合进入一种无阳离子脂类的脂类混合物中并且这样一种组合物可以有效地将一种治疗性寡核苷酸以其起功能的方式递送进入细胞。例如，当该脂肪混合物是由一种磷脂酰胆碱基脂肪酸以及一种甾醇比如胆固醇构成时，观察到高水平的活性。例如，一种优选的中性脂肪混合物的配制品是由至少20％的DOPC或DSPC以及至少20％的甾醇(比如胆固醇)构成。即使低至1:5的脂类与寡核苷酸的比率也显示出足以得到该寡核苷酸在一种无电荷配制品中的完整包囊。
这些中性纳米运载体组合物能够将寡核苷酸有效地装载进入中性脂肪配制品中。该组合物包括一种用使该分子的疏水性得以提高的方式进行了修饰的寡核苷酸(例如将一种疏水分子附接(共价或非共价)至该寡核苷酸末端或一种非末端核苷酸、碱基、糖或骨架上的疏水分子)，该经修饰的寡核苷酸与一种中性脂肪配制品(例如包含至少25％的胆固醇以及25％的DOPC或其类似物)混合。还可以将一种货物分子(cargo molecule)，比如另一种脂类，包括在该组合物中。这一组合物(其中该配制品的部分成为该寡核苷酸本身的组成部分)能够使寡核苷酸有效地包囊进入中性脂类颗粒中。
在一些方面，将疏水核苷酸与优选的配制品进行复合可以形成范围大小从50nm至140nm的稳定颗粒。有趣的是，该配制品本身典型地不形成小颗粒，但是形成聚结物，这些聚结物在添加经疏水修饰的寡核苷酸时转化成为稳定的50-120nm的颗粒。
本发明的中性纳米运载体组合物包含一种经疏水修饰的多核苷酸、中性脂肪混合物以及可任选的货物分子。如在此使用的“经疏水修饰的多核苷酸”(hydrophobicmodified polynucleotide)是一种本发明的多核苷酸(即，sd-rxRNA)，该多核苷酸具有使该多核苷酸比修饰之前的该多核苷酸更具疏水性的至少一处修饰。该修饰可以通过附接(共价或非共价)一种疏水分子至该多核苷酸来实现。在一些情况下，该疏水分子是或包含一种亲脂性基团。
术语“亲脂性基团”(lipophilic group)意为一种对脂类的亲和性比对水的亲和性更高的基团。亲脂性基团的实例包括但不限于，胆固醇、一种胆甾醇基或经修饰的胆甾醇基残基、金刚烷(adamantine)、双氢氧睪固酮、长链烷基、长链链烯基、长链炔基、油烯基-石胆酸、胆烯酸、油酰基-胆烯酸、棕榈基、十七烷基、十四烷基、胆汁酸、胆酸或牛磺胆酸、脱氧胆酸盐(酯)、油烯基石胆酸、油酰基胆烯酸、糖脂类、磷脂类、鞘脂类、类异戊二烯比如类固醇、维生素比如维生素E、饱和或不饱和的脂肪酸、脂肪酸酯比如甘油三酯、芘、紫菜咸、Texaphyrine、金刚烷(adamantane)、吖啶、生物素、香豆素、荧光黄素、罗丹明、德克萨斯红、地高辛(digoxygenin)、二甲氧三苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如，Cy3或Cy5)、Hoechst 33258染料、补骨脂素或布洛芬。该胆固醇部分可以经还原(例如，还原为胆甾烷)或可以经取代(例如，经卤素取代)。在一个分子中的不同亲脂性基团的组合也是可能的。
该疏水分子可以在该多核苷酸的不同位置进行附接。如以上描述的，该疏水分子可以连接至该多核苷酸的末端残基，比如该多核苷酸的3’或5’末端。可替代地，它可以连接至一种内部核苷酸或该多核苷酸的分支上的核苷酸上。该疏水分子可以附接至例如该核苷酸的2'-位上。该疏水分子还可以附接至该多核苷酸的核苷酸的杂环碱基、糖或骨架上。
该疏水分子可以通过一种连接物部分连接至该多核苷酸上。可任选地，该连接物部分是一种非核苷酸连接物部分。非核苷酸连接物是例如脱碱基残基(d间隔(dSpacer))，寡乙二醇，比如三甘醇(间隔9)或六甘醇(间隔18)，或烷-二醇，比如丁二醇。这些间隔单位优选是通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键而连接的。这些连接物单位可以在该分子中只出现一次或可以例如通过磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或酰胺连接而结合数次。
典型的轭合方案涉及在其序列的一个或多个位置具有氨基连接物的多核苷酸的合成，然而，连接物是不要求的。然后使该氨基基团与利用适当的偶联或激活剂而被连接的分子进行反应。该轭合反应可以利用仍结合在一种固体支持物上的多核苷酸进行或者在于溶液相中的多核苷酸切割之后进行。用HPLC对经修饰的多核苷酸进行纯化典型地产生一种纯材料。
在一些实施方案中，该疏水分子是一种甾醇类型轭合物、植物甾醇轭合物、胆固醇轭合物、侧链长度改变的甾醇类型轭合物、脂肪酸轭合物、任何其他疏水基团轭合物、和/或该内部核苷酸的疏水修饰，它们提供足够的疏水性以被结合进入微团。
出于本发明的目的，术语“甾醇”(sterols)是指类固醇的醇，是在A-环的3位上具有一个羟基基团的类固醇的亚群。它们是经由HMG-CoA还原酶途径从乙酰辅酶A合成的两亲脂类。整个分子是十分扁平的。A环上的羟基基团是极性的。该脂肪族链的其余部分是非极性的。通常认为甾醇在17位上具有一个8碳原子的链。
出于本发明的目的，术语“甾醇类型分子”(sterol type molecules)指类固醇的醇，类固醇的醇在结构上类似于甾醇。主要的不同是附接于21位上的侧链的环结构以及碳数目。
出于本发明的目的，术语“植物甾醇”(PhytoSterols)(也称植物的甾醇plantsterols)指一组在植物中天然发生的植物化学物质类固醇的醇。存在超过200种不同的已知植物甾醇。
出于本发明的目的，术语“甾醇侧链”(Sterol side chain)指一种附接在甾醇类型分子的17位上的侧链的化学组成。在标准定义中，甾醇是限制于一种在17位携带8碳链的4环结构。在本发明中，描述了具有长于或短于常规长度的侧链的甾醇类型分子。该侧链可以是分支或包含双骨架的。
因此，在本发明中有用的甾醇例如包括胆固醇以及其17位已经附接2-7个碳或长于9个碳的侧链的独特甾醇。在一个具体实施方案中，聚碳酸酯尾的长度在5个碳与9个碳之间变化。此类轭合物可以具有显著更好的体内效能，尤其是递送至肝。预计这些类型的分子在比轭合至常规胆固醇的寡核苷酸低5至9倍的浓度处起作用。
可替代地，该多核苷酸可以结合至一种蛋白、多肽或带正电荷的作为疏水分子起功能的化学物质上。这些蛋白可以选自下组，该组有以下各项组成：鱼精蛋白、dsRNA结合结构域以及精氨酸富含多肽。示例性的带正电荷的化学物质包括精胺、亚精胺、尸胺以及腐胺。
在另一个实施方案中，当与该多核苷酸的最佳化学修饰模式(如在此详细描述的)相结合时，疏水分子轭合物可以显示出甚至更高的效能，这些修饰模式包括但不限于疏水修饰、硫代磷酸酯修饰以及2’核糖修饰。
在另一个实施方案中，该甾醇类型分子可以是一种天然发生的植物甾醇。该多碳链可以长于9并且可以是线性的、分支的和/或包含双键。一些包含多核苷酸轭合物的植物甾醇在多核苷酸递送至不同组织方面可以显著地更具效力与活性。一些植物甾醇显示出组织偏好性并且因此可以用作一种特定地递送RNAi至具体组织的方式。
经疏水修饰的多核苷酸与一种中性脂肪混合物混合以形成一种微团。该中性脂肪混合物是一种脂肪混合物，该脂肪混合物在生理pH或其左右具有净中性或稍微带有净负电荷，可以与该经疏水修饰的多核苷酸形成一种微团。出于本发明的目的，术语“微团”(micelle)指一种由无电荷脂肪酸以及磷脂的混合物形成的小纳米颗粒。该中性脂肪混合物可以包含阳离子脂类，只要这些阳离子脂类以不引起毒性的量存在。在优选的实施方案中，该中性脂肪混合物不含阳离子脂类。不含阳离子脂类的混合物是具有低于1％并且优选0％的总脂类是阳离子脂类的混合物。术语“阳离子脂类”(cationic lipid)包括在生理pH或其左右具有净正电荷的脂类或合成脂类。术语“阴离子脂类”(anionic lipid)包括在生理pH或其左右具有净负电荷的脂类或合成脂类。
这些中性脂肪通过一种强的但非共价的吸引(例如，一种静电、范德华、π堆积等相互作用)而结合至本发明的寡核苷酸上。
该中性脂肪混合物可以包括选自一类天然发生的或化学合成的或经修饰的饱和以及不饱和脂肪酸残基的配制品。脂肪酸可以甘油三酯、甘油二酯或单独脂肪酸的形式存在。在另一个实施方案中，可以利用得以良好确证的脂肪酸混合物和/或目前在药理学中用以胃肠外营养的脂肪乳液。
该中性脂肪混合物优选是一种基于胆碱的脂肪酸与一种甾醇的混合物。基于胆碱的脂肪酸包括例如，合成的磷酸胆碱衍生物，比如DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC以及DEPC。DOPC(化学登记号4235-95-4)是二油酰基磷酸卵磷酯酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine)(还称为二反油酰基磷酸卵磷酯胆碱(dielaidoylphosphatidylcholine)、二油酰基-PC、二油酰基磷酸胆碱、二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、二油烯基磷脂酰胆碱(dioleylphosphatidylcholine))。DSPC(化学登记号816-94-4)是二硬脂酰磷脂酰胆碱(还称为1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)。
该中性脂肪混合物中的甾醇可以是例如胆固醇。该中性脂肪混合物可以完全由一种基于胆碱的脂肪酸以及一种甾醇构成或者它可任选地包含一种货物分子。例如，该中性脂肪混合物可以具有至少20％或25％脂肪酸以及20％或25％甾醇。
出于本发明的目的，术语“脂肪酸”(Fatty acids)涉及脂肪酸的常规描述。它们可以作为单独实体或以甘油二酯以及甘油三酯的形式存在。出于本发明的目的，术语“脂肪乳液”(fat emulsions)是指由静脉内给予不能在其饮食中获得足够脂肪的受试者的安全性脂肪配制品。它是大豆油(或其他天然发生的油类)与卵磷脂的乳液。脂肪乳液现用于一些不可溶解的麻醉剂的配制、在本披露中，脂肪乳液可以是可商购制剂的一部分，比如Intralipid、Liposyn、Nutrilipid、经修饰的商品制剂，其中它们富含特定脂肪酸或完全从新配制的脂肪酸与磷脂的组合物。
在一个实施方案中，使有待与本发明的寡核苷酸组合物接触的细胞与一种包含该寡核苷酸的混合物以及一种包含脂类(例如前述的脂类与脂类组合物之一)的混合物接触大约12小时至大约24小时之间。在另一个实施方案中，使有待与本发明的寡核苷酸组合物接触的细胞与一种包含该寡核苷酸的混合物以及一种包含脂类(例如前述的脂类与脂类组合物之一)的混合物接触大约1天与大约五天之间。在一个实施方案中，使这些细胞与包含脂类与该寡核苷酸的混合物接触大约三天至长达大约30天之间。在另一个实施方案中，使包含脂类的混合物保持与这些细胞接触至少大约五天至大约20天。在另一个实施方案中，使包含脂类的混合物保持与这些细胞接触至少大约七天至大约15天。
该配制品的50％-60％可任选地是任何其他脂类或分子。如此一种脂类或分子在此时指一种货物脂类或货物分子。货物分子包括但不限于intralipid、小分子、融合肽或者可以添加脂类或其他小分子以改变细胞吸收、内涵体释放或组织分布特性。容许货物分子的能力对于这些颗粒的特性的调节是重要的，如果此类特性是所希望的话。例如，一些组织特异性代谢产物的存在可以大幅改变组织分布特征曲线。例如，富含较短或较长的具有不同饱和度的脂肪链的Intralipid类型配制品的使用影响这些类型配制品的组织分布特征曲线以及它们的装载。
根据本发明而有用的货物脂类的一个实例是一种融合脂类。例如，两性离子脂类DOPE(化学登记号4004-5-1，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)是一种优选的货物脂类。
Intralipid可以由以下组分构成：1 000mL包含：经纯化的大豆油90g，经纯化的卵磷脂12g，无水甘油22g，注射用水适量添加至1 000mL。用氢氧化钠调节pH至大约8.能量含量：4.6MJ(190kcal)。摩尔渗透压浓度(近似)：300毫渗摩尔/kg水。在另一个实施方案中，脂肪乳液是Liposyn，包含5％红花油、5％大豆油、添加卵磷脂直到1.2％作为乳化剂以及用于注射的2.5％的于水中的甘油。它还可以包含氢氧化钠用于pH调节。pH8.0(6.0-9.0)。Liposyn具有276毫渗摩尔/升的摩尔渗透压浓度(实际的)。
货物脂类的同一性(identity)、量以及比率的变化影响这些化合物的细胞吸收与组织分布特征。例如，脂尾的长度以及饱和性的水平将影响肝、肺、脂肪以及心肌的差别性吸收。特定疏水分子的添加，比如维生素或不同形式的甾醇，可以有利于向参与具体化合物代谢的特定组织的分布。在一些实施方案中，使用维生素A或E。复合体在不同的寡核苷酸浓度下形成，较高浓度有利于更有效地形成复合体。
在另一个实施方案中，该脂肪乳液是基于一种脂类混合物。此脂类可以包括天然化合物、化学合成化合物、经纯化的脂肪酸或任何其他脂类。在又另一个优选的实施方案中，该脂肪乳液的组合物是完全人造的。在一个具体实施方案中，该脂肪乳液是多于70％的亚油酸。在又另一个具体实施方案中，该脂肪乳液是至少1％的心磷脂。亚油酸(LA)是一种不饱和ω-6脂肪酸。它是一种无色液体，由具有一种18碳链以及两个顺式双键的羧酸构成。
在本发明的又另一个实施方案中，该脂肪乳液的组成的变更被用作改变经疏水修饰的多核苷酸的组织分布的一种方式。这一方法学提供了这些多核苷酸向具体组织的特异性递送。
在另一个实施方案中，该货物分子的脂肪乳液包含多于70％的亚油酸(C18H32O2)和/或心磷脂。
诸如intralipid的脂肪乳液先前已经作为一种用于一些非水溶性药物(比如丙泊酚，重新配制为得普利麻)的递送配制品。本发明的独特特征包括(a)将经修饰的多核苷酸与该(这些)疏水化合物进行组合这一概念，因此它可以被结合进入这些脂肪微团以及(b)将其与这些脂肪乳液混合以提供一种可逆的载体。注射进入血流之后，微团可以结合至血清蛋白(包括白蛋白、HDL、LDL以及其他)上。这种结合是可逆的并且最终该脂肪由细胞吸收。结合作为该微团的一部分的多核苷酸然后将被递送接近这些细胞的表面。这之后可以通过不同的机制发生细胞吸收，包括但不限于甾醇类型递送。
复合剂
复合剂通过一种强的但非共价的吸引(例如，一种静电、范德华、π堆积等相互作用)而结合至本发明的寡核苷酸上。在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸可以与一种复合剂进行复合以提高寡核苷酸的细胞吸收。复合剂的实例包括阳离子脂类。阳离子脂类可以用以递送寡核苷酸至细胞。然而，如以上所讨论的，在一些实施方案中，不含阳离子脂类的配制品是优选的的。
术语“阳离子脂类”(cationic lipid)包括多种脂类与合成脂类，这些脂类与合成脂类具有极性与非极性两种结构域并且能够在生理pH或其左右带正电荷并且结合至多聚阴离子(比如核酸)上，并且促进核酸递送进入细胞中。总体而言，阳离子脂类包括饱和与不饱和的烷基以及脂环族醚以及胺酯，酰胺，或其衍生物。阳离子脂类的直链以及分支的烷基与链烯基基团可以包含例如从1至大约25个碳原子。优选的直链或分支的烷基或链烯基基团具有六个或更多个碳原子。脂环族基团包括包括胆固醇或其他类固醇基团。阳离子脂类可以与多种平衡离子(阴离子)来进行制备，包括例如，Cl-、Br-、I-、F-、乙酸盐、三氟乙酸盐、硫酸盐、亚硝酸盐以及硝酸盐。
阳离子脂类的实例包括聚乙烯亚胺、聚酰氨型胺(PAMAM)星形(starburst)树枝状化合物、Lipofectin(DOTMA与DOPE的组合)、Lipofectase、LIPOFECTAMINETM(例如，LIPOFECTAMINETM 2000)、DOPE、Cytofectin(吉利德科学公司(Gilead Sciences)，福斯特城，加利福尼亚州(Foster City、Calif.))以及Eufectins(JBL公司，圣路易斯奥比斯波，加利福尼亚州(San Luis Obispo、Calif.))。示例性的阳离子脂质体可以从以下各项来制备：N-[1-(2,3-二油酰基氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基硫酸盐(DOTAP)、3β-[N-(N′,N′-二甲氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、2,3,-二油烯基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷铵三氟乙酸盐(DOSPA)、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵；以及二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)。例如发现阳离子脂类N-[1-(2,3-二油烯基氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)可以提高硫代磷酸酯寡核苷酸的反义效应1000倍。(Vlassov等人,1994,《生物化学与生物物理学学报》(Biochimica et Biophysica Acta)1197:95-108)。寡核苷酸还可以与例如聚(L-赖氨酸)或抗生物素蛋白相复合并且脂类可以或可以不包含入这一混合物中，例如甾醇基-聚(L-赖氨酸)
阳离子脂类在本领域内已经用以递送寡核苷酸至细胞(参见，例如美国专利号5,855,910；5,851,548；5,830,430；5,780,053；5,767,099；Lewis等人1996.《美国科学院院刊》93:3176；Hope等人1998.《分子膜生物学》(Molecular Membrane Biology)15:1)。其他的可以用以促进瞬时寡核苷酸(instant oligonucleotide)吸收的脂类组合物可以与提出权利要求的方法结合使用。除了以上所列的那些，其他脂类组合物在本领域内也是已知的并且包括例如美国专利号4,235,871；美国专利号4,501,728；4,837,028；4,737,323中所传授的那些。
在一个实施方案中，脂类组合物可以进一步包含多种试剂，例如病毒蛋白，以增强脂类介导的寡核苷酸转染(Kamata等人,1994.《核酸研究》22:536)。在另一个实施方案中，如在美国专利5,736,392中所教授的，寡核苷酸作为一种组合物的一部分与细胞接触，该组合物包含寡核苷酸、多肽以及脂类。改进的抗血清的脂类也已经得以描述(Lewis等人,1996.《美国科学院院刊》93:3176)。阳离子脂类以及其他复合剂起作用以增加通过内吞作用运载进入细胞的寡核苷酸的数目。
在另一个实施方案中，N-取代的甘氨酸寡核苷酸(类肽)可以用以优化寡核苷酸的吸收。类肽已经用以产生针对转染的阳离子脂类类似化合物(Murphy等人,1998.《美国科学院院刊》95:1517)。可以利用标准方法来合成类肽(例如，Zuckermann,R.N.等人,1992,《美国化学学会杂志》114:10646；Zuckermann,R.N.等人,1992,《肽与蛋白杂志国际版》(Int.J.Peptide Protein Res.)40:497)。阳离子脂类与类肽、类脂(liptoids)的组合还可以用以对受试寡核苷酸的吸收进行优化(Hunag等人,1998.《化学与生物学》(Chemistryand Biology.)5:345)。可以通过精心制备类肽寡核苷酸并且将氨基端的亚单体经由其氨基基团连接至一种脂类来制备类脂。(Hunag等人,1998.《化学与生物学》5:345)。
在本领域内已知，带正电荷的氨基酸可以用于产生高活性阳离子脂类(Lewis等人,1996.《美国科学院院刊》93:3176)。在一个实施方案中，用于递送本发明的寡核苷酸的组合物包含许多连接至一种亲脂部分的精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸残基(参见例如，美国专利号5,777,153)。
在另一个实施方案中，用于递送本发明的寡核苷酸的组合物包含具有大约一个至大约四个之间的碱性残基的肽。这些碱性残基可以定位于例如该肽的氨基端、C-端或内部区域。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸(还可以认为是非极性的)、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、缬氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。除了这些碱性氨基酸，该肽的大多数或所有其他残基可以选自非碱性氨基酸，例如除赖氨酸、精氨酸或组氨酸之外的氨基酸。优选地使用优势的具有长中性侧链的中性氨基酸。
在一个实施方案中，用于递送本发明的寡核苷酸的组合物包含具有一个或多个γ羧基谷氨酸残基或γ-Gla残基的天然或合成的多肽。这些γ-羧基谷氨酸残基可以使该多肽彼此结合并结合至膜表面上。换言之，具有一连串γ-Gla的多肽可以用作一种通用递送形式，该形式帮助RNAi构建体依附至与其接触的任何膜上。这可以至少减缓RNAi构建体从血流中的清除并且增强它们靶向(homing)至目标的机会。
这些γ-羧基谷氨酸残基可以存在于天然蛋白中(例如，凝血酶原具有10个γ-Gla残基)。可替代地，可以利用例如维生素K-依赖的羧化酶通过羧化作用将它们引入经纯化的、重组产生的或化学合成的多肽中。这些γ-羧基谷氨酸残基可以是连续的或非连续的，并且可以对该多肽中的此类γ-羧基谷氨酸残基的总数目与位置进行调节/细调以实现该多肽的不同水平的“粘性”。
在一个实施方案中，使有待与本发明的寡核苷酸组合物接触的细胞与一种包含该寡核苷酸的混合物以及一种包含脂类(例如前述的脂类与脂类组合物)的混合物接触大约12小时至大约24小时之间。在另一个实施方案中，使有待与本发明的寡核苷酸组合物接触的细胞与一种包含该寡核苷酸的混合物以及一种包含脂类(例如前述的脂类与脂类组合物之一)的混合物接触大约1天与大约五天之间。在一个实施方案中，使这些细胞与包含脂类与该寡核苷酸的混合物接触大约三天至长达大约30天之间。在另一个实施方案中，使包含脂类的混合物保持与这些细胞接触至少大约五天至大约20天。在另一个实施方案中，使包含脂类的混合物保持与这些细胞接触至少大约七天至大约15天。
例如，在一个实施方案中，如在此描述的，寡核苷酸组合物可以在一种脂类的存在下与细胞接触以延长孵育期，该脂类比如细胞转染剂CS或GSV(可购于Glen Research公司，Sterling,Va.)、GS3815、GS2888。
在一个实施方案中，这些细胞与包含脂类与寡核苷酸组合物的混合物进行孵育不降低这些细胞的生存能力。优选地，转染期之后这些细胞基本上是有生存能力的。在一个实施方案中，转染之后，这些细胞至少大约70％与至少大约100％之间是有生存能力的。在另一个实施方案中，这些细胞至少大约80％与至少大约95％之间是有生存能力的。在又另一个实施方案中，这些细胞至少大约85％与至少大约90％之间是有生存能力的。
在一个实施方案中，通过附接一种肽序列而对寡核苷酸进行修饰，该肽序列运输该寡核苷酸进入细胞，在此也称作“运输肽”。在一个实施方案中，该组合物包含一种与编码该蛋白的靶标核酸分子互补的寡核苷酸，以及一种共价附接的运输肽。
用于“运输肽”(transporting peptide)包含一种促进寡核苷酸运输进入细胞中的氨基酸序列。促进其所连接的部分运输进入细胞的示例性多肽在本领域内是已知的，并且包括例如HIV TAT转录因子、乳铁蛋白、Herpes VP22蛋白以及成纤维细胞生长因子2(Pooga等人1998.《自然生物技术》(Nature Biotechnology.)16:857；以及Derossi等人1998.《细胞生物学趋势》(Trends in Cell Biology.)8:84；Elliott与O'Hare.1997.《细胞》(Cell)88:223)。
可以利用已知的技术将寡核苷酸附接至该运输肽上，例如(Prochiantz,A.1996.《神经生物学当前观点》(Curr.Opin.Neurobiol.)6:629；Derossi等人1998.《细胞生物学趋势》8:84；Troy等人1996.《神经科学杂志》(J.Neurosci.)16:253),Vives等人1997.《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem).272:16010)。例如，在一个实施方案中，将具有活化的硫醇基基团的寡核苷酸通过这一硫醇基基团连接至存在于运输肽中的半胱氨酸上(例如，连接至存在于触足(antennapedia)同源结构域的第二与第三螺旋之间的β旋转(turn)中的半胱氨酸上，如传授于Derossi等人1998.《细胞生物学趋势》8:84；Prochiantz.1996.《神经生物学当前观点》6:629；Allinquant等人1995.《细胞生物学杂志》(J Cell Biol.)128:919中的)。在另一个实施方案中，可以将一种Boc-Cys-(Npys)OH基团作为最后的(N-端)氨基酸偶联至该运输肽上并且可以将具有SH基团的寡核苷酸偶联至该肽上(Troy等人1996.《神经科学杂志》16:253)。
在一个实施方案中，可以将一种连接基团附接至核单体上并且可以将该运输肽共价附接至该连接物上。在一个实施方案中，连接物的功能是作为针对运输肽的附着点并且提供抗核酸酶的稳定性。合适的连接物的实例包括经取代的或未经取代的C1-C20烷基链、C2-C20链烯基链、C2-C20炔基链、肽以及杂原子(例如，S、O、NH，等等)。其他的示例性连接物包括双功能交联剂，比如磺基琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)(参见例如，Smith等人《生物化学杂志》(Biochem J)1991.276:417-2)。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸是作为分子轭合物而合成，这些分子轭合物利用受体介导的内吞机制递送基因进入细胞(参见例如，Bunnell等人1992.《体细胞与分子遗传学》(Somatic Cell and Molecular Genetics.)18:559，并且在其中引用的文献)。
靶向剂
还可以通过将寡核苷酸靶向一种细胞受体来改进这些寡核苷酸的递送。可以将这些寻靶部分轭合至这些寡核苷酸或附接至一种连接至这些寡核苷酸的载体基团(即，聚(L-赖氨酸)或脂质体)上。这一方法很好地适用于展示出特异性受体介导的内吞的细胞。
例如，轭合至6-磷酸甘露糖化的(phosphomannosylated)蛋白的寡核苷酸被细胞表达的甘露糖6-磷酸酯特异受体内化的效率比游离寡核苷酸高20倍。还可以利用生物可降解连接物将这些寡核苷酸偶联至一种针对细胞受体的配体上。在另一个实例中，该递送构建体是甘露糖化的抗生蛋白链菌素，它与生物素酰化的寡核苷酸形成一种紧密复合体。发现甘露糖化的抗生蛋白链菌素可以将生物素酰化的寡核苷酸的内化提高20倍。(Vlassov等人,1994,《生物化学与生物物理学学报》1197:95-108)。
另外，可以将特异性配体轭合至基于聚赖氨酸的递送系统的聚赖氨酸部分上。例如，转铁蛋白-聚赖氨酸、腺病毒-聚赖氨酸以及流感病毒红细胞凝集素HA-2N-端融合肽-聚赖氨酸轭合物大幅增强了真核细胞中受体介导的DNA递送。已经采用在肺泡(aveolar)巨噬细胞中轭合至聚(L-赖氨酸)的甘露糖化的糖蛋白以增强寡核苷酸的细胞吸收。Liang等人1999.《药学》(Pharmazie)54:559-566。
因为恶性细胞对必须营养素的需求增加，比如叶酸与转铁蛋白，所以这些营养素可以用以将寡核苷酸靶向癌性细胞。例如，当将叶酸连接至聚(L-赖氨酸)时，在早幼粒细胞白血病(HL-60)细胞以及人黑色素瘤(M-14)细胞中观察到增强的寡核苷酸吸收。Ginobbi等人1997.《抗癌研究》(Anticancer Res.)17:29。在另一个实例中，用马来酰化(maleylated)牛血清白蛋白、叶酸或高铁原卟啉IX进行了包衣的脂质体在鼠巨噬细胞、KB细胞以及2.2.15人肝癌细胞中显示出增强的寡核苷酸细胞吸收。Liang等人1999.《药学》54:559-566。
脂质体天然地在肝、脾以及网状内皮系统中累积(所谓的被动靶向)。通过将脂质体偶联至不同配体，比如抗体与蛋白A，可以将它们积极地靶向特异细胞群体。例如，可以用H-2K特异性抗体对具有蛋白A的脂质体进行预处理，H-2K特异性抗体靶向L细胞上表达的编码主要组织相容性复合体的H-2K蛋白。(Vlassov等人,1994,《生物化学与生物物理学学报》1197:95-108)。
其他的在体外和/或在体内的RNAi试剂递送在本领域内是已知的，并且可以用于递送受试RNAi构建体。参见例如，美国专利申请公开20080152661、20080112916、20080107694、20080038296、20070231392、20060240093、20060178327、20060008910、20050265957、20050064595、20050042227、20050037496、20050026286、20040162235、20040072785、20040063654、20030157030、WO 2008/036825、WO04/065601以及AU2004206255B2，仅是提及一些(将其所有通过引用而结合)。
给予
这些寡核苷酸的给予或递送的最佳过程可以根据所希望的结果和/或有待治疗的受试者而变化。如在此使用的，“给予”指将细胞与寡核苷酸进行接触并且可以在体外或体内进行。例如按照通过RNA稳定性读数器或通过治疗反应而不用过度实验所测量的，可以将寡核苷酸的剂量调节至最佳地降低从靶标核酸分子翻译而来的蛋白的表达。
例如，可以对由该核酸靶标编码的蛋白的表达进行测量以确定是否需要相应地调整剂量方案。另外，细胞中的或由细胞产生的RNA或蛋白的水平的增加或降低可以利用任何本领域公认的技术来进行测量。通过确定转录是否已经降低，可以确定该寡核苷酸在诱导靶标RNA切割方面的效果。
任何上述的寡核苷酸组合物可以单独使用或与一种药学上可接受的载体结合使用。如在此使用的，“药学上可接受的载体”(pharmaceutically acceptable carrier)包括适当的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂以及抗真菌剂、等渗与吸收延迟剂，等等。对于药物活性物质使用此类介质与试剂在本领域内是熟知的。除了任何常规的与该活性成分不兼容的介质或试剂的范围之外，可以在这些治疗性组合物中使用。还可以将补充活性成分结合入这些组合物中。
寡核苷酸可以结合入脂质体或经聚乙二醇修饰的脂质体中或者与阳离子脂类混合用于肠胃外给予。将另外的物质结合进入该脂质体可以帮助将这些寡核苷酸靶向特异细胞类型，这些另外的物质例如对在特异靶标细胞上发现的膜蛋白具有抗性活性的抗体。
就体内施用而言，本发明的配制品能以适用于将该构建体递送至眼睛的多种形式来给予患者。在优选的实施方案中，肠胃外给予是眼部给予。眼部给予可以是玻璃体内、前房内、视网膜下、结膜下或眼球筋膜囊下给予。
用于肠胃外给予的药物制剂包括以水可溶形式或水可分散形式的这些活性化合物的水性溶液。另外，可以给予作为适当的油性注射悬浮液的这些活性化合物的悬浮液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油，或者合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射悬浮液可含有增加该悬浮液黏度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖，可任选地，该悬浮液还可以含有稳定剂。本发明的寡核苷酸可以配制在液体溶液中，优选是在生理上兼容的缓冲液中，比如汉克氏溶液(Hank's solution)或林格氏溶液(Ringer's solution)。另外，这些寡核苷酸能以固体形式进行配制并且在使用之前即刻重溶解或悬浮。本发明中还包括冻干形式。
所选的递送方法将使得进入细胞中。在一些实施方案中，优选的递送方法包括脂质体(10-400nm)、水凝胶、控释聚合物以及其他药学上可应用的载体、以及微注射或电穿孔(用于间接体内治疗)。
本发明的药物制剂可以制备并且配制为乳液。乳液通常是一种液体以直径通常超过0.1μm的微滴形式分散在另一种液体中的非均匀系统。本发明的乳液可以包含辅料，比如乳化剂、稳定剂、染料、脂肪、油类、蜡类、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂以及抗氧化剂，它们可以按需要存在于乳液中。这些辅料能以水相、油相或本身作为一种分离相而作为一种溶液存在。
可以用在本发明的乳液配制品中的天然发生的乳化剂的实例包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂以及阿拉伯胶。精细分散固体也已经用作良好的乳化剂(尤其是与表面活性剂相组合)以及在粘稠制剂中。可以用作乳化剂的精细分散固体的实例包括极性无机固体，比如重金属氢氧化物，非膨胀性粘土，比如膨润土、凹凸棒石、锂蒙脱石、高岭土、蒙脱土(montrnorillonite)，胶体硅酸铝与胶体硅酸镁铝，颜料以及非极性固体，比如碳或三硬脂酸酯。
可以包括在这些乳液配制品中的防腐剂的实例包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、季铵盐、氯化苄烷铵、对羟基苯甲酸的对羟基苯(甲)酸以及硼酸。可以包括在这些乳液配制品中的抗氧化剂的实例包括自由基清除剂，比如生育酚类、五倍子酸烷基酯、丁基化羟基苯甲醚、丁羟甲苯，或还原剂，比如抗坏血酸以及焦亚硫酸钠，以及抗氧化剂增效剂，比如柠檬酸、酒石酸以及卵磷脂。
在一个实施方案中，寡核苷酸的组合物配制为微乳液。微乳液是一种水、油以及两亲物的系统，它是一种单一的光学各向同性并且热力学稳定的液体溶液。典型的微乳液是通过以下进行制备：首先将一种油分散在一种水性表面活性剂溶液中并且然后添加一种足量的第4组分以形成一种透明系统，该第4组分通常是一种中等链长的醇。
可以在微乳液制备中使用的表面活性剂包括但不限于离子表面活性剂、非离子表面活性剂、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油单月桂酸酯(ML310)、四甘油单油酸酯(MO310)、六甘油单油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油单癸酸酯(MCA750)、十甘油单油酸酯(MO750)、十甘油倍半油酸酯(decaglycerol sequioleate)(S0750)、十甘油十油酸酯(DA0750)，单独的或与共表面活性剂组合。该共表面活性剂通常是一种短链醇，比如乙醇、1-丙醇以及1-丁醇，它用来通过渗透入表面活性剂膜中来提高界面流动性并且因此由于在表面活性剂分子间产生的空隙空间而创造出一种无序膜。
然而，微乳液可以不使用共表面活性剂而进行制备并且无醇的自乳化微乳液系统在本领域内是已知的。该水相可以典型地但不限于是水、药物水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇以及丙二醇的衍生物。该油相可以包括但不限于诸如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM的材料，脂肪酸酯，中链(C8-C12)单-、二-以及三-甘油酯，聚氧乙基化的甘油基脂肪酸酯，脂肪醇，聚乙二醇化的甘油酯，饱和的聚乙二醇化的C8-C10甘油酯，植物油以及硅酮油。
从药物溶解以及药物吸收增强的立足点来看，微乳液是尤其有意义的。已经提出基于脂类的微乳液(油/水以及水/油)以增强药物的口服生物利用率。
微乳液提供改进的药物溶解、保护药物免于酶水解、由于表面活性剂引起膜流动性与渗透性的变化而可能增强药物吸收、减轻制备负担、比固体剂量形式更易口服、改进的临床效能以及降低的毒性(Constantinides等人,《药学研究》(PharmaceuticalResearch),1994,11:1385；Ho等人,《药物科学杂志》(J.Pharm.Sci.),1996,85:138-143)。微乳液还在化妆品与药物应用中活性组分的经皮递送方面有效。预期本发明的微乳液组合物以及配制品将促进寡核苷酸从胃肠道的全身性吸收提高，以及改进寡核苷酸在胃肠道、阴道、口腔以及其他给予区域之内的局部性细胞吸收。
有待给予的有用剂量和具体给予模式将取决于以下因素而变化，如：细胞类型，或用于体内用途，年龄，体重和有待治疗的具体动物及其区域，所用的具体寡核苷酸以及递送方法，考虑的治疗或诊断用途，以及该配制品的形式，例如悬浮液、乳液、微团或脂质体，如本领域的普通技术人员将易于明白的。典型地，以较低剂量水平给予并且提高剂量直到达到所希望的效果。当使用脂类来递送这些寡核苷酸时，所给予的脂类化合物的量可以变化并且总体上取决于将要给予的寡核苷酸剂的量。例如，脂类化合物与寡核苷酸剂的重量比率优选是从大约1:1至大约15:1，大约5:1至大约10:1的重量比率是更优选的。总体上，所给予的阳离子脂类化合物的量将在大约0.1毫克(mg)至大约1毫克(mg)之间变化。通过通用性指南，典型地是每千克患者体重给予大约0.1mg与10mg之间的具体寡核苷酸剂以及大约1mg至100mg的脂类组合物，尽管可以使用更高或更低量。
本发明的试剂是以适合于药物给予的生物相容性形式来给予受试者或与细胞相接触。“适合于给予的生物相容性形式”意为该寡核苷酸是以其中该寡核苷酸的治疗效果大于任何毒性效果的形式来进行给予。在一个实施方案中，可以将寡核苷酸给予受试者。受试者的实例包括哺乳动物，例如人类或其他灵长类；母牛、猪、马以及耕作(农业)动物；狗、猫以及其他家养宠物；小鼠、大鼠以及转基因非人类动物。
将本发明的寡核苷酸的活性量的给予定义为一种在剂量上以及对于达到所希望的结果而需要的时间周期的有效量。例如，寡核苷酸的活性量可以根据比如以下因素而变化：细胞类型、所使用的寡核苷酸、以及用于体内用途、疾病状态、年龄、性别、以及个体体重、以及该寡核苷酸在个体中引发所希望的反应的能力。治疗水平的寡核苷酸在细胞中的建立取决于吸收率以及外排率或降解率。降低降解程度延长了该寡核苷酸的细胞内半衰期。因此，经化学修饰的寡核苷酸，例如具有磷酸酯骨架修饰，可以要求不同的剂量。
寡核苷酸的确切剂量以及给予的剂数目将取决于实验以及临床试验中产生的数据。一些因素将影响该剂量，比如所希望的效果、递送媒介物、疾病征候以及给予途径。剂量可以由本领域的普通技术人员容易地确定并且配制成为受试药物组合物。优选地，治疗的持续时间将延长至少经过这些疾病症候的过程。
可以对剂量方案进行调整以提供最佳治疗反应。例如，可以重复给予该寡核苷酸，例如，一天可以给予数次剂量，或者可以按照治疗情况紧急状态所指示的而将该剂量按比例减少。本领域的普通技术人员将容易地能够确定受试寡核苷酸给予的适当剂量与方案，无论该寡核苷酸是有待于给予细胞或受试者。
sd-rxRNA的眼部给予可以通过剂量方案的测试来进行优化，眼部给予包括玻璃体内、前房内、视网膜下、结膜下以及眼球筋膜囊下给予。在一些实施方案中，单一的给予是足够的。为了进一步延长所给予的sd-rxRNA的作用，如本领域内的普通技术人员所熟悉的，可以利用一种缓释配制品或装置来给予该sd-rxRNA。sd-rxRNA复合物的疏水性质使得能够使用范围广泛的多种聚合物，其中一些与常规的寡核苷酸递送不相容。
在其他实施方案中，该sd-rxRNA是多次给予。在一些情况下，它是以如下时间给予：每天、每周两次、每周、每两周、每三周、每月、每两月、每三月、每四月、每五月、每六月或低于每六月的频率。在一些情况下，它是以每天、每周、每月和/或每年多次给予。例如，它可如以下时间给予：大约每小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时或多于十二小时。可以每天给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10次。
本发明的多个方面涉及将sd-rxRNA或rxRNA ori分子给予受试者。在一些情况下，该受试者是一名患者并且该sd-rxRNA分子的给予涉及在医生诊所里给予该sd-rxRNA分子。
图1展示了在玻璃体内或视网膜下给药之后24小时sd-rxRNA的吸收。24小时后，sd-rxRNA已经弥漫于整个视网膜。图2展示了sd-rxRNA与常规RNAi复合物的视网膜吸收比较。在给予后两者都可以即刻被检测到，但48小时之后，只检测到sd-rxRNA。图3展示了在玻璃体内给药之后检测到sd-rxRNA遍及视网膜，但是没有检测到常规RNAi复合物。图4展示了sd-rxRNA透过视网膜至光感受器的外节。
在一些情况下，通过眼部给予而递送的sd-rxRNA的有效量是至少大约0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或多于100μg，包括任何中间值。
通过在此描述的方法而给予的sd-rxRNA分子有效地靶向至眼睛中所有细胞类型。
引入核酸的物理方法包括注射包含该核酸的溶液、用覆盖有该核酸的颗粒轰击、将细胞或有机体浸泡在该核酸的溶液中、在该核酸的存在下对细胞膜进行电穿孔或者将一种包含该核酸的组合物局部施用至眼睛。包装进入病毒颗粒的病毒构建体可以完成一种表达构建体至细胞的有效引入以及由该表达构建体编码的核酸的转录。可以使用其他的在本领域内已知的用于将核酸引入细胞的方法，比如脂类介导的载体运输，化学物质介导的运输，比如磷酸钙，等等。因此，可以将该核酸连同执行以下一种或多种功能的组分进行引入：增强细胞对核酸的吸收、抑制单链退火、稳定单链或要不然则提高靶标基因的抑制。
寡核苷酸稳定性测定
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸是稳定的，即，实质上抗核酸内切酶以及核酸外切酶降解。当一种寡核苷酸对内源细胞核酸酶攻击的抗性比一种相应寡核苷酸高至少大约3倍时，该寡核苷酸被定义为实质上抗核酸酶；并且当一种寡核苷酸对内源细胞核酸酶攻击的抗性比一种相应寡核苷酸高至少大约6倍时，该寡核苷酸是具有高核酸酶抗性。这可以通过利用本领域内已知的技术表明本发明的寡核苷酸实质上抗核酸酶来证明。
证明实质稳定性的一个方式是例如通过测量蛋白水平或通过测量mRNA的切割表明当递送至细胞时，本发明的寡核苷酸起作用，例如，它们降低了靶标核酸分子的转录或翻译。测量靶标RNA稳定性的测定可以在转染后大约24小时处进行(例如，利用本领域内已知的RNA印记技术、RNase保护测定或QC-PCR测定)。可替代地，可以对靶标蛋白的水平进行测量。优选地，除了测试有意义的RNA或蛋白的水平，还将对对照RNA或蛋白的水平、非靶标基因进行测量(例如，肌动蛋白，或优选是一种具有与该靶标类似的序列的对照)而作为一种特异性对照。可以利用任何本领域公认的技术来进行RNA或蛋白测量。优选地，测量将在转染后大约16-24小时处开始进行。(M.Y.Chiang等人1991.《生物化学杂志》(J Biol Chem.)266:18162-71；T.Fisher等人1993.《核酸研究》21 3857)。
可以利用本领域内已知的技术例如通过检测基因转录或蛋白合成方面的抑制来对本发明的寡核苷酸组合物抑制蛋白合成的能力进行测量。例如，可以进行核酸酶S1作图。在另一个实例中，可以使用RNA印记分析来测量编码具体蛋白的RNA的存在。例如，可以用一种氯化铯缓冲物(cesium chloride cushion)来制备总RNA(参见例如，Ausebel等人,1987.《分子生物学流行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)(Greene&Wiley公司,纽约))。然后利用该RNA以及探针进行RNA印记(参见例如，同上)。在另一个实例中，例如利用PCR可以对靶标蛋白产生的特异mRNA的水平进行测量。在又另一个实例中，可以使用蛋白印记来测量存在的靶标蛋白的量。在再另一个实施方案中，可以对受该蛋白的量影响的表型进行检测。用于施行蛋白印记的技术在本领域内是熟知的，参见例如，Chen等人《生物化学杂志》271:28259。
在另一个实例中，可以将靶标基因的启动子序列连接至报告基因并且可以对报告基因转录进行监测(例如，如在以下详细描述的)。可替代地，不靶向启动子的寡核苷酸组合物可以通过以下来进行鉴别：将靶标核酸分子的一部分与一种报告基因进行融合使得该报告基因得以转录。通过监测在该寡核苷酸组合物存在下的该报告基因的表达变化，有可能确定该寡核苷酸组合物在抑制该报告基因的表达方面的效果。例如，在一个实施方案中，有效的寡核苷酸组合物将降低该报告基因的表达。
“报告基因”(reporter gene)是一种表达可检测基因产物的核酸，该产物可以是RNA或蛋白。mRNA表达的检测可以通过RNA印记来实现并且蛋白的检测可以通过用对该蛋白特异的抗体进行染色来实现。优选的报告基因产生一种可容易检测的产物。报告基因可以可操作地与一种调节性DNA序列相连接以至于该报告基因产物的检测提供一种对该调节性序列的转录活性的测量。在优选的实施方案中，报告基因的基因产物是通过与这一产物相关的内在活性来进行检测。例如，该报告基因可以编码一种基因产物，该产物通过酶活性产生一种基于颜色、荧光或冷光的可检测信号。报告基因的实例包括但不限于，对氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶、β-半乳糖苷酶以及碱性磷酸酶的进行编码的那些。
本领域中普通技术人员可以容易的明白适合在本发明中使用的众多报告基因。这些包括但不限于，对氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶、人生长激素(hGH)以及β-半乳糖苷酶。此类报告基因的实例可以于F.A.Ausebel等人,编辑,《分子生物学流行方案》(CurrentProtocols in Molecular Biology),John Wiley&Sons公司,纽约,(1989)中找到。在本发明的方法中，任何编码可检测产物的基因都可以用作报告基因，该可检测产物例如是具有可检测酶活性或针对其可以产生特异性抗体的任何产物。
一种报告基因系统是荧火虫荧光素酶报告系统。(Gould,S.J.,以及Subramani,S.1988.《分析生物化学》(Anal.Biochem.),7:404-408，通过引用将其结合于此)。该荧光素酶测定快速灵敏。在这一测定中，制备测试细胞的溶胞产物并且将其与ATP和该底物萤光素组合。编码的荧光素酶催化快速的、ATP依赖的该底物的氧化，以产生一种发光产物。对总的光输出进行测量并且总的光输出在宽广的酶浓度范围内与存在的荧光素酶成比例。
CAT是另一种频繁使用的报告基因系统；这一系统的一个主要优势是：它已经得以广泛验证并且作为一种启动子活性测量广为接受。(Gorman C.M.,Moffat,L.F.,以及Howard,B.H.1982.《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.),2:1044-1051)。在这一系统中，将测试细胞用CAT表达载体进行转染并且在转染启始2-3天之内与候选物质进行孵育。此后，制备细胞提取物。将这些提取物与乙酰CoA以及放射性氯霉素进行孵育。孵育之后，通过薄层色谱法将乙酰化的氯霉素与非乙酰化形式分离。在这一测定中，乙酰化程度反映了对于具体启动子的CAT基因活性。
另一种合适的报告基因系统是基于hGH的免疫检测。这一系统也快速易用。(Selden,R.,Burke-Howie,K.Rowe,M.E.,Goodman,H.M.,以及Moore,D.D.(1986),《分子细胞生物学》(Mol.Cell,Biol.),6:3173-3179，通过引用结合在此)。hGH系统的优势在于：在介质中而不是细胞提取物中测定表达的hGH多肽。因此，这一系统不要求破坏这些测试细胞。应该理解，这一报告基因系统的原理不限于hGH，而是适合于利用任何对其而言一种具有可接受特异性的抗体可用或可制备的多肽的应用。
在一个实施方案中，将本发明的双链寡核苷酸的核酸酶稳定性进行测量并且与一种对照进行比较，例如一种在本领域内典型地使用的RNAi分子(例如，长度小于25个核苷酸并且包含2个核苷酸碱基突出端的双链寡核苷酸)或一种未经修饰的具有平末端的RNA双链体。
利用本发明的siRNA所达到的靶标RNA切割反应具有高度的序列特异性。可以通过本领域内已知的序列比较以及比对算法来确定序列一致性。为了确定两核苷酸序列(或两氨基酸序列)的一致性百分数，出于最佳的比较目的，将这些序列进行比对(例如，可以在该第一序列或第二序列中引入缺口用以最佳比对)。用于序列比较的局部比对算法的一个优选的非限制性实例是Karlin与Altschul(1990)《美国科学院院刊》87:2264-68中的算法，如Karlin与Altschul(1993)《美国科学院院刊》90:5873-77进行了修饰。BLAST程序中结合进了此种算法(Altschul等人(1990)《分子生物学杂志》215:403-10)。另外，众多商业实体，比如Dharmacon公司以及Invitrogen公司，在其网站上提供算法使用。怀海德研究所(Whitehead Institute)也提供免费的siRNA选择程序。siRNA与靶标基因部分之间大于90％的序列一致性是优选的，比如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的序列一致性。可替代地，该siRNA可以在功能上定义为一种核苷酸序列(或寡核苷酸序列)，它能够与靶标基因转录本的一部分进行杂交。用于多核苷酸杂交的严谨条件的实例提供于Sambrook,J.,E.F.Fritsch,与T.Maniatis,1989,《分子克隆：实验室手册》第9和11章，冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,chapters 9 and11)，以及《分子生物学流行方案》(Current Protocols in Molecular Biology),1995,F.M.Ausubel等人编辑,John Wiley&Sons,Inc.公司,2.10以及6.3-6.4节，通过引用结合在此。
治疗用途
通过抑制基因的表达，本发明的寡核苷酸组合物可以用以治疗任何涉及蛋白表达的疾病。可以通过寡核苷酸组合物进行治疗的疾病的实例仅为说明地包括：癌症、视网膜病、自身免疫性疾病、炎性疾病(即，ICAM-1相关失调、牛皮癣、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病)、病毒性疾病(即，HIV、丙型肝炎)、miRNA失调以及心血管疾病。
如上所述，通过在此描述的方法而给予的sd-rxRNA分子有效地靶向至眼睛中所有细胞类型。
本发明的方面涉及将sd-rxRNA靶向眼睛中的不同细胞类型，这些类型包括但不限于，位于神经节细胞层(GCL)、内网状层内部(IPL)、内核层(INL)、外网状层(OPL)、外核层(ONL)、视杆和视锥的外节(OS)、视网膜色素上皮(RPE)、视杆和视锥的内节(IS)、结膜上皮、虹膜、睫状体、角质层、以及眼皮脂腺上皮的细胞。
在一些情况下，靶向至眼睛的sd-rxRNA能够以一种眼睛特异性基因或在眼睛中表达水平比在其他组织更高的基因为靶标。如本领域内的普通技术人员将理解的，可以利用公开访问的数据库对具有眼睛特异性表达或相对于其他组织在眼睛中表达增加的基因进行鉴别。此类数据库的一些非限制性实例包括TISGED(组织特异性基因数据库)以及用于组织特异性基因表达与调节的TiGER数据库。在其他实施方案中，sd-rxRNA不以眼睛特异性基因为靶标。在其他实施方案中，作为靶标的基因不具有眼睛特异性表达或在眼睛中增强的表达。
在一些情况下，靶向至眼睛的sd-rxRNA用以改善与眼睛相关的病状或失调的至少一种征状。与眼睛相关的病状或失调的一些非限制性实例包括：血管渗漏/新生血管形成(例如，血管造影黄斑囊样水肿、视网膜静脉阻塞继发性黄斑水肿(RVO)、青光眼或新生血管性青光眼(NVG)、早产儿视网膜病(ROP)；纤维增生性疾病(例如，增生性玻璃体视网膜病变(PVR)、视网膜前膜/玻璃体黄斑粘连；与年龄相关的黄斑变性(AMD)(例如，脉络膜新生血管形成(湿性AMD)、地图状萎缩(晚期干性AMD)、早期至中期干性AMD)；糖尿病视网膜病变(例如，非增生性糖尿病视网膜病变(NPDR)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、增生性糖尿病视网膜病变(PDR)；视网膜退行性疾病(以及相关疾病)；视网膜血管阻塞性疾病(例如，视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞)以及其他视网膜疾病；视网膜剥离；炎性疾病，例如眼色素层炎(包括全眼色素层炎)或不明原因(自发性)的或与全身性疾病相关(自身免疫)的脉络膜炎(包括多病灶脉络膜炎)；巩膜外层炎或巩膜炎；鸟枪弹样视网膜脉络膜病变；血管疾病(视网膜缺血、视网膜脉管炎、脉络膜血管功能不全、脉络膜血栓症)；视神经新生血管形成；视神经炎；睑炎；角膜炎；虹膜红变；富克斯异色性虹膜睫状体炎；慢性眼色素层炎或前眼色素层炎；结膜炎；过敏性结膜炎(包括季节性或常年性、春季、特应性以及巨乳头性)；干燥性角膜结膜炎(干眼综合征)；虹膜睫状体炎；虹膜炎；巩膜炎；巩膜表层炎；角膜水肿；巩膜疾病；眼部瘢痕性类天庖疮；睫状体扁平部炎；波-施二氏综合征；贝切特氏病；伏格特-小柳-原田三氏综合征；超敏反应；结膜水肿；结膜静脉充血；眶周蜂窝织炎；急性泪囊炎；非特异性血管炎；肉样瘤病；干燥性角膜结膜炎，一种也称为干眼、干性角膜炎、干燥综合征、眼球干燥症以及干眼综合征(DES)的病状，该病状可以起因于眼泪产生减少和/或由于异常眼泪组合物而增加的泪液膜干燥；一种与自身免疫性疾病类风湿性关节炎、红斑狼疮、糖尿病以及修格兰氏综合征(Sjogren's syndrome)相关的失调。在一些实施方案中，sd-rxRNA是作为一种创伤愈合方法而给予。与眼睛相关的病状或失调的非限制性实例通过引用结合自美国专利公开20100010082以及美国专利6,331,313。
新生血管形成/血管渗漏
本发明的多个方面涉及治疗与新生血管形成和/或血管渗漏相关的疾病与病状。在这些病状中，湿性AMD与DME是最普遍的，PDR与RVO继发性黄斑水肿是次普遍的，罕见的新生血管病状包括ROP以及新生血管性青光眼。认为血管渗漏是DME背后的驱动力，血管渗漏与新生血管形成都驱动PDR。可以基于具体疾病或病状的病因学而对本发明的寡核苷酸组合物进行选择。例如，可以选择包含影响血管渗透性的抗血管形成的寡核苷酸的组合物来治疗DME，而可以选择影响增生的寡核苷酸来治疗PDR。可替代地，寡核苷酸组合物可以包含抗血管形成剂的组合，例如，一种对影响血管渗透性的靶标的功能进行抑制的sd-rxRNA以及一种对影响增生的靶标的功能进行抑制的sd-rxRNA，使得该病状的两种病因学方面都被靶向。
在某些实施方案中，sd-rxRNA是用以治疗新生血管形成和/或血管渗透性。在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向一种血管渗透性抑制因子，血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF是用于治疗湿性AMD的典型的以经及临床验证的靶标并且预期批准用于DME以及RVO-相关的ME。VEGF蛋白是结合于酪氨酸激酶受体的生长因子并且涉及多种失调，比如癌症、与年龄相关的黄斑变性、类风湿性关节炎以及糖尿病视网膜病变。这一蛋白家族的成员包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C以及VEGF-D。提供人类VEGF蛋白的DNA以及蛋白序列信息的代表性Genbank登录号是NM_001171623.1(VEGF-A)、U43368(VEGF-B)、X94216(VEGF-C)以及D89630(VEGF-D)。
本发明的方面涉及针对VEGF的rxRNAori。如在实例部分所描述的，在此鉴别了超过100种的针对VEGF的最佳rxRNA ori序列(表2与9)。rxRNAori可以针对一种包含表2或9中的序列的至少12个连续核苷酸的序列。例如，rxRNAori可以针对一种包含表2或9中的序列的12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，rxRNAori是针对一种包含SEQ ID NO:13(AUCACCAUCGACAGAACAGUCCUUA)或SEQ ID NO:28(CCAUGCAGAUUAUGCGGAUCAAACA)的序列的至少12个连续核苷酸的序列。该rxRNAori分子的正义链可以包含一种选自存在于表2中各序列的序列的至少12个连续核苷酸。在一些实施方案中，该rxRNAori的正义链包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:28的序列的至少12个连续核苷酸。该rxRNAori分子的反义链可以与一种选自表2中各序列的序列的至少12个连续核苷酸进行互补。在一些实施方案中，该rxRNAori的反义链包含SEQ ID NO:1377(UAAGGACUGUUCUGUCGAUGGUGAU)或SEQ ID NO:1378(UGUUUGAUCCGCAUAAUCUGCAUGG)的至少12个连续核苷酸。
针对VEGF的rxRNAori的非限制性实例包括一种rxRNAori，该rxRNAori包含一种含有SEQ ID NO:13的序列的正义链以及一种含有SEQ ID NO:1377的序列的反义链，或者一种rxRNAori，该rxRNAori包含一种含有SEQ ID NO:28的序列的正义链以及一种含有SEQ IDNO:1378的序列的反义链。应了解，多种修饰模式与rxRNAori相容。本发明的多个方面包括针对VEGF的rxRNAori，其中该rxRNAori是经修饰的或未经修饰的。在一些实施方案中，将rxRNAori给予至眼睛。
ori序列还可以转换为sd-rxRNA分子以在眼睛中靶向VEGF。应理解，所披露的ori序列代表了用于sd-rxRNA开发的VEGF之中的序列的非限制性实例。这些序列长度与修饰方面的变化以及VEGF之中的其他序列也是与sd-rxRNA分子的开发相容的。sd-rxRNA可以针对一种选自表2或9中各序列的序列。例如，sd-rxRNA可以针对一种序列，该序列包含一种选自表2或9中各序列的序列的至少12个连续核苷酸。例如，在一些实施方案中，sd-rxRNA可以针对一种序列，该序列包含一种选自表2或9中各序列的序列的12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸。
在一些实施方案中，一种针对VEGF的sd-rxRNA包含选自表8中各序列的一种序列的至少12个核苷酸。在一些实施方案中，该sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:1317(AGAACAGUCCUUA)或SEQ ID NO:1357(UGCGGAUCAAACA)的序列的至少12个连续核苷酸和/或该sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1318(UAAGGACUGUUCUGUCGAU)或SEQ ID NO:1358(UGUUUGAUCCGCAUAAUCU)的序列的至少12个连续核苷酸。在某些实施方案中，针对VEGF的sd-rxRNA包含一种含有SEQ ID NO:1317的正义链以及一种含有SEQ ID NO:1318的反义链。不同的化学修饰模式与sd-rxRNA相容。SEQ ID NO:1317与SEQ ID NO:1318的修饰形式的非限制性实例分别表示为SEQ ID NOs 1379(A.G.A.A.mC.A.G.mU.mC.mC.mU.mU.A.Chl)与1380(P.mU.A.A.G.G.A.fC.fU.G.fU.fU.fC.fU*G*fU*fC*G*A*U)。
在某些实施方案中，针对VEGF的sd-rxRNA包含一种含有SEQ ID NO:1357的正义链以及一种含有SEQ ID NO:1358的反义链。SEQ ID NO:1357与SEQ ID NO:1358的修饰形式的非限制性实例分别表示为SEQ ID NOs 1397(mU.G.mC.G.G.A.mU.mC.A.A.A.mC.A.Chl)与1398(P.mU.G.fU.fU.fU.G.A.fU.fC.fC.G.fC.A*fU*A*A*fU*fC*U)。在某些实施方案中，该sd-rxRNA包含SEQ ID NOs 1397与1398。应了解，在此披露的sd-rxRNA的其他修饰模式也与本发明的各方面相容。
在此还描述了针对编码除VEGF之外的蛋白的基因的sd-rxRNA。此类sd-rxRNA的非限制性实例提供于表3-7中。在一些实施方案中，sd-rxRNA包含一种选自表3-7中各序列的序列的至少12个连续核苷酸。
在一些实施方案中，该sd-rxRNA是针对CTGF。针对CTGF的sd-rxRNA的非限制性实例提供于表5中。在一些实施方案中，针对CTGF的sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:1422(GCACCUUUCUAGA)的序列的至少12个连续核苷酸并且针对CTGF的sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1423(UCUAGAAAGGUGCAAACAU)的序列的至少12个连续核苷酸。SEQ ID NO:1422与SEQ ID NO:1423的修饰形式的非限制性实例分别表示为SEQ ID NOs:947(G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU.A*mG*mA.TEG-Chl)与948(P.mU.fC.fU.A.G.mA.A.mA.G.G.fU.G.mC*A*A*A*mC*A*U.)。在一些实施方案中，针对CTGF的sd-rxRNA的正义链包含SEQID NO:1424(UUGCACCUUUCUAA)的序列的至少12个连续核苷酸并且针对CTGF的sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1425(UUAGAAAGGUGCAAACAAGG)的序列的至少12个连续核苷酸。SEQID NO:1424与SEQ ID NO:1425的修饰形式的非限制性实例表示为SEQ ID NOs 963(mU.mU.G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU*mA*mA.TEG-Chl)与964(P.mU.fU.A.G.A.mA.A.G.G.fU.G.fC.mA.mA*mA*fC*mA*mA*mG*G.)。
在一些实施方案中，针对CTGF的sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:947或SEQ IDNO:963的序列的至少12个连续核苷酸。在某些实施方案中，针对CTGF的sd-rxRNA包含一种含有SEQ ID NO:963的序列的正义链以及一种含有SEQ ID NO:964的序列的反义链。在其他实施方案中，针对CTGF的sd-rxRNA包含一种含有SEQ ID NO:947的序列的正义链以及一种含有SEQ ID NO:948的序列的反义链。
sd-rxRNA可以经疏水修饰。例如，该sd-rxRNA可以连接至一种或多种疏水轭合物上。在一些实施方案中，该sd-rxRNA包含至少一个5-甲基C或U修饰。
本发明的多个方面涉及包含在此描述的rxRNAori和/或sd-rxRNA核酸的组合物。组合物可以包含一种或多种rxRNAori和/或sd-rxRNA。在一些实施方案中，组合物包含多种不同的rxRNAori，这些rxRNAori针对编码不同蛋白的多种基因，和/或包含多种不同的sd-rxRNA，这些sd-rxRNA针对编码不同蛋白的多种基因。在一些实施方案中，组合物包含针对VEGF的sd-rxRNA以及针对另一种基因的sd-rxRNA，这种基因是比如编码CTGF或PTGS2(COX-2)的基因。
在一些实施方案中，一种或多种sd-rxRNA靶向IGTA5、ANG2、CTGF、COX-2、补体因子3或5，或其组合。
在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向结缔组织生长因子(CTGF)，也称为肥大软骨细胞特异性蛋白24。CTGF是一种分泌的涉及创伤愈合以及硬皮病的肝素结合蛋白。结缔组织生长因子在许多细胞类型中是活性的，包括成纤维细胞、肌纤维母细胞、内皮细胞以及上皮细胞。提供人类CTGF的DNA以及蛋白序列信息的代表性Genbank登录号是NM_001901.2以及M92934。
在某些实施方案中，该sd-rxRNA靶向骨桥蛋白(OPN)，也成为分泌型磷蛋白1(SPP1)、骨唾液酸糖蛋白1(BSP-1)以及早期T淋巴细胞活化(ETA-1)。SPP1是一种结合至羟基磷灰石的分泌型糖蛋白。OPN涉及多种生物学过程，包括骨重塑、免疫功能、趋化性、细胞活化以及凋亡。骨桥蛋白由多种细胞类型产生，包括成纤维细胞、前成骨细胞、成骨细胞、骨细胞、成齿质细胞、骨髓细胞、肥大软骨细胞、树状突细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞、骨骼肌成肌细胞、内皮细胞以及内耳、脑、肾、蜕膜(deciduum)以及胎盘中的骨外(非骨)细胞。提供人类骨桥蛋白的蛋白序列信息的代表性Genbank登录号是NM_000582.2以及X13694。
在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向转化生长因子β(TGFβ)蛋白，在哺乳动物中存在其三种亚型(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)。TGFβ蛋白是一种分泌型蛋白，该蛋白属于一种生长因子超家族，该家族参与调节多种细胞过程，包括增殖、迁移、凋亡、粘连、分化、发炎、免疫抑制以及细胞外蛋白的表达。这些蛋白由范围广泛的细胞类型产生，包括上皮细胞、内皮细胞、造血细胞、神经元细胞以及结缔组织细胞。提供人类TGFβ1、TGFβ2以及TGFβ3的DNA以及蛋白序列信息的代表性Genbank登录号分别是BT007245、BC096235以及X14149。在TGFβ家族之中，TGFβ1和TGFβ2但不是TGFβ3代表合适的靶标。在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向环氧化酶-2(COX-2)，也称作前列腺素G/H合酶2(PTGS2)。COX-2残余脂类代谢以及前列腺素类的生物合成并且涉及炎症性的失调，比如类风湿性关节炎。提供人类COX-2的蛋白序列信息的代表性Genbank登录号是AY462100。
在其他实施方案中，该sd-rxRNA靶向HIF-1α——HIF-1转录因子的组分。HIF-1α是细胞缺氧相应的关键调节因子，在VEGF-依赖的以及VEGF-不依赖的前-血管形成途径以及前-纤维途径的上游起作用。HIF-1α抑制子在激光CNV以及OIR模型中有效。提供人类HIF1α的蛋白序列信息的代表性Genbank登录号是U22431。
在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向mTOR。mTOR是PI3K/Akt/mTOR途径中的丝氨酸/苏氨酸激酶组分，并且是细胞生长、增殖、生存、转录以及翻译方面的调节子。mTOR抑制子具有抗血管形成(在激光CNV以及OIR模型中有效)以及抗纤维化活性。雷伯霉素以及其他mTOR抑制子正用于针对AMD以及DME的临床试验。提供人类mTOR的DNA以及蛋白序列信息的代表性Genbank登录号是UL34075。
在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向SDF-1(基质细胞衍生因子-1)，SDF-1是一种刺激造血干细胞以及内皮祖细胞向组织归巢的可溶性因子。SDF-1与VEGF协同作用驱动病理性新生血管形成，而SDF-1信号的抑制可以压制OIR、激光CNV以及VEGF-诱导的啮齿动物模型中的新生血管形成。
在某些实施方案中，该sd-rxRNA靶向PDGF-B(血小板衍生生长因子B)。在转基因小鼠中PDGF-B的视网膜过表达导致纤维血管增生，而PDGF-B信号的抑制增强了激光CNV模型中抗VEGF治疗的疗效。PDGF-B以及VEGF的双抑制可以促进NV的逆行。提供人类PDGF基因以及蛋白的DNA以及蛋白序列信息的代表性Genbank登录号包括X03795(PDGFA)、X02811(PDGFB)、AF091434(PDGFC)、AB033832(PDGFD)。
在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向TIE1(具有免疫球蛋白样以及EGF样结构域的酪氨酸激酶)。
在其他实施方案中，该sd-rxRNA靶向VEGFR1(血管内皮生长因子受体1)，也称为FLT1(fms相关的酪氨酸激酶1)。这一基因编码血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族的成员。VEGFR家族成员是受体酪氨酸激酶(RTKs)，它们包含一种具有免疫球蛋白(Ig)样结构域的胞外配体结合区域、一种跨膜片段以及一种位于胞质区内的酪氨酸激酶(TK)结构域。这一蛋白结合至VEGFR-A、VEGFR-B以及胎盘生长因子并且在血管形成(angiogenesis)以及血管发生(vasculogenesis)方面起重要作用。提供人类VEGFR1基因以及蛋白的DNA以及蛋白序列信息的代表性Genbank登录号包括NM_001159920、NP_001153392、NM_001160030、NP_001153502、NM_001160031、NP_001153503、NM_002019以及NP_002010。
在某些实施方案中，该sd-rxRNA靶向VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)，也称为KDR(激酶插入区域受体)。这一已知为激酶插入区域受体的受体是一种III型受体酪氨酸激酶。它作为VEGF诱导的内皮增殖、生存、迁移、管样形态发生以及出芽(sprouting)的主要中介而起作用。这一受体的信号与运输受多种因子调节，包括Rab GTPase、P2Y嘌呤核苷酸受体、整联蛋白alphaVbeta3、T细胞蛋白酪氨酸磷酸酶，等等。提供人类VEGFR2基因以及蛋白的DNA以及蛋白序列信息的代表性Genbank登录号是NM_002253以及NP_002244。在一些实施方案中，新生血管形成和/或血管渗漏的治疗可以包括使用多种sd-rxRNA的组合，每一sd-rxRNA靶向不同基因。例如，可以使用靶向VEGF的sd-rRNA和靶向HIF-1α的sd-rRNA。又例如，可以使用靶向mTOR的sd-rRNA和靶向SDF-1的sd-rRNA。再又例如，可以使用靶向VEGF的sd-rRNA、靶向mTOR的sd-rRNA和靶向PDGF-B的sd-rRNA。
湿性AMD(脉络膜新生血管形成(CNV))
本发明的多个方面涉及治疗脉络膜新生血管形成，它是发展最快的AMD形式(在美国有约1百万病例)，起因于新生血管不恰当地从脉络膜生长至视网膜下间隙以及从这些血管的液体渗漏。如果不进行治疗，75％的患者将在三年之内发展成为法定盲。玻璃体内的抗VEGF剂可以通过抑制CNV病灶生长以及从CNV病灶的血管渗漏来迅速改善视力；然而，现有的抗VEGF剂在多数患者中不会引起现有病灶的退行。
在某些实施方案中，使用该sd-rxRNA治疗CNV。在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向VEGF。在其他实施方案中，该sd-rxRNA靶向HIF-1α、mTOR、PDGF-B、SDF-1、IGTA5、ANG2、CTGF、COX-2、或者补体因子3或5。在一些实施方案中，CNV的治疗包括使用多种sd-rxRNA的组合，每一sd-rxRNA靶向不同基因。
糖尿病性黄斑水肿(DME)
DME起因于视网膜血管的血管渗漏，这种血管渗漏导致液体在黄斑中的视力威胁性累积，这在约2％-5％的糖尿病患者中发生。目前的标准护理是局灶或格栅样激光光凝。玻璃体内的抗VEGF剂以及皮质甾类已经证明有效，但还未获批准。
在某些实施方案中，使用该sd-rxRNA治疗DMA。在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向VEGF。在其他实施方案中，该sd-rxRNA靶向HIF-1α、mTOR、PDGF-B、SDF-1、IGTA5、ANG2、CTGF、COX-2、或者补体因子3或5。在一些实施方案中，DME的治疗包括使用多种sd-rxRNA的组合，每一sd-rxRNA靶向不同基因。
增生性糖尿病视网膜病变(PDR)
PDR与慢性视网膜缺血相关。视网膜新生血管形成继发于视网膜缺血之后并且可以导致玻璃体出血、玻璃体出血以及牵拉性视网膜脱离。
在某些实施方案中，使用该sd-rxRNA治疗PDR。在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向VEGF。在其他实施方案中，该sd-rxRNA靶向HIF-1α、mTOR、PDGF-B、SDF-1、IGTA5、ANG2、CTGF、COX-2、或者补体因子3或5。在一些实施方案中，PDR的治疗包括使用多种sd-rxRNA的组合，每一sd-rxRNA靶向不同基因。
RVO继发性黄斑水肿
RVO能以缺血性或非缺血性形式发生。缺血性RVO可以导致一些视力威胁性并发症，包括黄斑水肿、视网膜缺血以及新生血管形成。非缺血性RVO具有更良好的预后并且最常见的视力威胁性并发症是黄斑水肿。
在某些实施方案中，使用该sd-rxRNA治疗RVO继发性黄斑水肿。在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向VEGF。在其他实施方案中，该sd-rxRNA靶向HIF-1α、mTOR、PDGF-B、SDF-1、IGTA5、ANG2、CTGF、COX-2、或者补体因子3或5。在一些实施方案中，RVO继发性黄斑水肿的治疗包括使用多种sd-rxRNA的组合，每一sd-rxRNA靶向不同基因。
虹膜新生血管形成/新生血管性青光眼(NVG)
NVG是一种罕见的在眼中发生的失调，患者遭受严重的慢性眼部缺血。最常见的原因是晚期PDR或缺血性CRVO。虹膜新生血管形成由于缺血而发生，并且最终阻塞小梁网，导致严重的继发性青光眼。
在某些实施方案中，使用该sd-rxRNA治疗虹膜新生血管形成和/或NVG。在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向VEGF。在其他实施方案中，该sd-rxRNA靶向HIF-1α、mTOR、PDGF-B、SDF-1、IGTA5、ANG2、CTGF、COX-2、或者补体因子3或5。在一些实施方案中，虹膜新生血管形成和/或NVG的治疗包括使用多种sd-rxRNA的组合，每一sd-rxRNA靶向不同基因。增生性视网膜疾病
增生性视网膜疾病包括增生性玻璃体视网膜病变、增生性糖尿病视网膜病变(PDR)、视网膜前膜(透明细胞层，可以在黄斑表面生长，引起视网膜牵拉)以及湿性AMD。
在某些实施方案中，使用该sd-rxRNA治疗增生性视网膜疾病。在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向TGFβ，而在其他实施方案中，该sd-rxRNA靶向CTGF。在又其他实施方案中，多种sd-rxRNA靶向PDGFRα、mTOR、IGTA5或其组合。在又其他实施方案中，多种sd-rxRNA靶向TGFβ以及CTGF、PDGFRα、mTOR、IGTA5中的至少一个，或其组合。在另外的实施方案中，多种sd-rxRNA靶向CTGF以及TGFβ、PDGFRα、mTOR、IGTA5中的至少一个，或其组合。在某些实施方案中，增生性视网膜疾病的治疗包括使用多种sd-rxRNA的组合，每一sd-rxRNA靶向不同基因。
干性AMD
在某些实施方案中，使用该sd-rxRNA治疗干性AMD，包括地图状萎缩(GA)(发展比湿性AMD更缓慢的晚期AMD形式)以及早期至中期干性AMD(GA或CNV之前的早期干性AMD)。在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向Alu转录。在其他实施方案中，该sd-rxRNA靶向转录因子或其他抑制或调节DICER表达的分子，DICER是RNase III家族中的核糖核酸内切酶，切割双链RNA(dsRNA)以及pre-microRNA(miRNA)成为大约20-25个核苷酸长的称为小干扰RNA(siRNA)的短双链RNA片段。
黄斑囊样水肿
黄斑囊样水肿是术后副中央凹包囊(erofoveal cysts)中视网膜内液体的累积。在某些实施方案中，使用该sd-rxRNA治疗黄斑囊样水肿。在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向COX-2(环氧化酶-2)酶。
视网膜色素变性
视网膜色素变性是一种遗传性视网膜退行性疾病，由一些已知的基因的突变引起。在某些实施方案中，使用该sd-rxRNA治疗视网膜色素变性。在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向NADPH氧化酶。
青光眼
青光眼是一种以视神经退化为特征的缓慢发展的疾病。该疾病在初期边缘视力丧失，在晚期中央视觉丧失。青光眼相关的视力丧失的理解最充分的风险因子是眼压(IOP)。小梁切除术是一种手术程序，设计以创造一种通过巩膜的通道或泡(bleb)以允许过量液体从眼前部排除，使IOP降低。小梁切除术失败的最常见原因是该泡受到瘢痕组织阻塞。
在某些实施方案中，使用该sd-rxRNA预防由于小梁切除术的瘢痕组织的形成。在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向CTGF，而在其他实施方案中，该sd-rxRNA靶向TGFβ。在又其他实施方案中，多种sd-rxRNA靶向CTGF和TGFβ两者。在一些实施方案中，使用一个靶向CTGF并且一个靶向TGFβ的sd-rxRNA的组合来预防瘢痕组织形成。
眼色素层炎
眼色素层炎是一组范围广泛的特征是眼中层发炎的失调，该眼中层叫做色素层，由脉络膜、睫状体以及虹膜构成。这些失调在解剖学上可以分类为前部、中部、后部以及全眼色素层炎，并且在病理学上分类为传染性和非传染性。
在某些实施方案中，使用该sd-rxRNA治疗眼色素层炎。在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向一种细胞因子，例如TNFα。在其他实施方案中，该sd-rxRNA靶向IL-1、IL-6、IL-15、IL-17、IL-2R或CTLA-4。在又其他实施方案中，该sd-rxRNA靶向黏附分子，包括VLA-4、VCAM-1、LFA-1、ICAM-1、CD44或骨桥蛋白。在又其他实施方案中，该sd-rxRNA靶向TNFα、IL-1、IL-6、IL-15、IL-17、IL-2R、CTLA-4、VLA-4、VCAM-1、LFA-1、ICAM-1、CD44以及骨桥蛋白中的至少一个。在一些实施方案中，使用多种sd-rxRNA的组合来预防瘢痕组织形成，每一种sd-rxRNA靶向一种不同基因。
视网膜母细胞瘤(Rb)
视网膜母细胞瘤是一种在视网膜细胞中迅速发展的癌症。在某些实施方案中，使用该sd-rxRNA治疗视网膜母细胞瘤。在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向HMGA2，HMGA2被认为在致瘤性转化中具有作用。
在某些实施方案中，本发明的sd-rxRNA可以用于多基因沉默。在一些实施方案中，可以使用多种sd-rxRNA的组合来靶向多种的、不同的基因。例如，当用于治疗新生血管性失调时，可以将靶向VEGF的sd-rxRNA与靶向HIF-1α的sd-rxRNA一起使用。再例如，当用于治疗眼色素层炎时，可以将靶向TNFα的sd-rxRNA、靶向VCAM-1的sd-rxRNA以及靶向IL-2R的sd-rxRNA结合使用。
在一些实施方案中，可以使用多种sd-rxRNA靶向VEGF、IGTA5、ANG2、CTGF、COX-2、补体因子3、补体因子5、HIF-1α、mTOR、SDF-1、PDGF-β、Alu、NADPH氧化酶、TGF-β、IL-1、IL-6、IL-15、IL-17、IL-2R、CTLA-4、VLA-4、VCAM-1、LFA-1、ICAM-1、CD44、骨桥蛋白(SPP1)，或其任意组合。在一些实施方案中，如果需要的话，此种多靶标基因沉默可以用来治疗多于一种的疾病或病状。
在一些实施方案中，该sd-rxRNA靶向MAP4K4。MAP4K4是一种哺乳动物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于一组与酿酒酵母Sterile 20(STE20)相关的蛋白激酶。MAP4K4(也称作NIK，Nck相互作用激酶(interacting kinase)的简写)在筛选与Nck的SH3结构域相互作用的蛋白的小鼠中得以首次鉴定(Su等人(1997))。自其发现起，已经并继续将MAP4K4与范围广泛的生理功能相联系。
用于RNAi介导的MAP4K4表达抑制的方法描述于2008年11月19日提交的题为“通过RNAi抑制MAP4K4”(Inhibition of MAP4K4 through RNAi)的美国临时申请序列号61/199,661以及2009年11月19日提交的题为“通过RNAi抑制MAP4K4”(Inhibition of MAP4K4through RNAi)的PCT申请PCT/US2009/006211之中，并且通过引用将其结合于此。靶向MAP4K4的sd-rxRNA分子与本发明的各方面相容。在一些实施方案中，可以将靶向VEGF的sd-rRNA分子以及靶向MAP4K4的sd-rRNA分子一起给予。
表1显示了多种sd-rxRNA靶标以及在其中它们可以应用的领域的非限制性实例。
表1：sd-rxRNA靶标以及应用的实例
Figure BDA0001016238680000771
Figure BDA0001016238680000781
在一个实施方案中，可以将利用寡核苷酸对细胞的体外处理用于对从受试者移来的细胞的间接体内治疗或用于对并非源自该受试者但是有待于给予该受试者的细胞的治疗(例如，以消除有待移植给受试者的细胞上的移植抗原表达)。另外，细胞的体外处理可以在非治疗情况下使用，例如以评估基因功能，以研究基因调节以及蛋白合成或者以评估对设计以调节基因表达或蛋白合成的寡核苷酸的改进情况。细胞的体内处理在某些其中希望抑制蛋白表达的临床环境中是有用的。这些受试核酸可以在具有RNAi途径的任何动物中以基于RNAi的疗法进行施用，这些动物比如人类、非人类灵长动物、非人类哺乳动物、非人类脊椎动物、啮齿类(小鼠、大鼠、仓鼠、兔，等等)、家用牲畜动物、宠物(猫、狗，等等)、非洲蟾蜍、鱼、昆虫(果蝇，等等)以及蠕虫(秀丽线虫)，等等。
本发明提供了通过将本发明的核酸给予受试者而抑制或预防该受试者的与异常的或不需要的靶标基因表达或活性相关的疾病或病状的方法。如果合适，可以首先用一种启动剂(priming agent)对受试者进行处理以便对后继的RNAi治疗响应程度更高。可以通过例如本领域内已知的任何诊断或预后测定或其组合来对处于由异常的或不需要的靶标基因表达或活性引起或促成的疾病风险之中的受试者进行鉴别。预防剂的给予可以在靶标基因异常特有的症状显现之前进行，以至于可以预防疾病或失调或者可替代地延迟其发展。取决于靶标基因异常的类型，例如，可以使用靶标基因、靶标基因促效剂或靶标基因拮抗剂来对该受试者进行治疗。
在另一方面，本发明涉及调节用于治疗目的的靶标基因表达、蛋白表达或活性的方法。因此，在一个示例性方案中，本发明的方法包括将能够表达靶标基因的细胞与本发明的对于该靶标基因或蛋白特异(即，对于由所述基因编码的mRNA特异或特异于所述蛋白的氨基酸序列)的核酸相接触，以至于对靶标蛋白的表达或一种或多种活性进行调节。这些方法可以在体外(例如，通过用该试剂培养细胞)、在体内(例如，通过将该试剂给予受试者)或间接体内进行。如果希望，可以首先用一种启动剂对该受试者进行处理以便对后继的RNAi治疗响应程度更高。按照这样，本发明提供对受一种疾病或失调折磨的受试者进行治疗的方法，该疾病或失调的特征是一种靶标基因多肽或核酸分子的异常或不需要的表达或活性。靶标基因活性的抑制在以下情况中是希望的：靶标基因是异常地不受调节的和/或靶标基因活性降低可能会具有一种有益效果。
因此，本发明的治疗剂可以给予受试者以处理(预防地或治疗性地)与异常或不需要的靶标基因活性相关的失调。结合此类处理，可以考虑药物基因组学(即，个体基因型与个体对外来化合物或药物的反应之间的关系的研究)。治疗上的新陈代谢方面的不同可以通过改变剂量与药理学上具有活性的药物的血液浓度之间的关系而导致严重毒性或治疗失败。因此，内科医师或临床医师可以在确定是否给予治疗剂以及是否调整利用治疗剂进行处理的剂量和/或治疗方案中考虑应用从相关药物基因组学研究中获得的知识。药物基因组学涉及受影响的人中由于改变的药物处置以及异常行为在对药物的反应方面临床上显著的遗传变异。
出于本发明的目的，范围在此表达为从“大约”(about)一个具体值，和/或至“大约”另一个具体值。当表达这样一种范围时，另一个实施方案包括从该一个具体值和/或至该另一个具体值。类似地，当值通过使用上述的“大约”而表达为近似时，应理解，该具体值形成另一个实施方案。应进一步理解，这些范围中每一的端点在与另一端点相关以及与另一端点相独立方面都是由意义的。
而且，出于本发明的目的，术语“一种/一个”(a/an)实体指一种或多种该实体；例如，“一种蛋白”(a protein)或“一种核酸分子”(a nucleic acid molecule)指一种或多种这些化合物或者至少一种化合物。按照这样，术语“一种/一个”(a/an)或“一种或多种”(oneor more)以及“至少一种”可以互换地使用。还应指出，术语“包含”(comprising)、“包括”(including)以及“具有”(having)可以互换地使用。此外，一种“选自下组的化合物，该组由以下项组成”(selected from the group consisting of)指后随的列表中的一种或多种化合物，包括两种或更过种这些化合物的混合物(即，组合物)。根据本发明，分离的或生物学纯的蛋白或核酸分子是一种已经从其自然环境中移出的化合物。按照这样，“分离的”(isolated)“生物学纯的”(biologically pure)不必然反映该化合物经纯化的程度。本发明的一种分离的化合物可以获得自其自然来源，可以利用分子生物学技术产生或可以通过化学合成产生。
通过以下实例来进一步说明本发明，这些实例绝不应该解释为进一步的限制。在本发明通篇引用的所有参考(包括文献参考、授权专利、公开专利申请以及待决专利申请)的全部内容清楚地通过引用结合于此。
实例
实例1：sd-rxRNA分子的眼部给予
发现视网膜下以及玻璃体内给予在将sd-rxRNA分子递送至眼睛中的所有细胞类型方面高度有效。通过视网膜下或玻璃体内给予将靶向MAP4K4或非靶向(带有或不带有DY547标签)的sd-rxRNA进行注射。评估5μg以及10μg剂量。没有检测到炎症迹象。眼睛看起来健康并且没有观察到细胞迁移(炎症反应的指征)的迹象。
化合物吸收通过眼底显微镜检查可视化。将小鼠在24小时以及48小时处处死，收集视网膜，进行固定并且包埋入石蜡，并且通过共聚焦显微镜对化合物吸收与分布进行分析。
图1展示了DIC、DY547以及Hoechst的共聚焦三层叠加。如染色所显示，24小时之后，sd-rxRNA已经弥散于整个视网膜。图2提供了sd-rxRNA与常规RNAi复合物的递送比较。将处于1μl的PBS中的10μg RNA通过玻璃体内进行递送。白光眼底影像证实，视网膜具有正常的眼部组织结构，没有出血或明显的炎症迹象。用眼底照相机(具有低倍显微镜的相机，设计以对眼睛的内部表面进行拍照)拍摄荧光图像。如在图2中所揭示的，sd-rxRNA以及传统RNAi化合物在给予之后都即刻在视网膜中得以检测到。然而，24小时以及48小时之后，只检测到sd-rxRNA分子。
图3展示了在sd-rxRNA的玻璃体内给药之后检测到sd-rxRNA遍及视网膜，但是在PBS或传统RNAi复合物给药之后却没有检测到PBS或传统RNAi复合物遍及视网膜。
图4展示sd-rxRNA透过视网膜至光感受器的外节。
图5A和图5B展示了在ARPE-19细胞中，与rxRNAori相比，sd-rxRNA显示出强力的吸收与沉默。
图6展示了用于在眼部症候中使用的sd-rxRNA的一些非限制性实例。
针对VEGF的sd-rxRNA的效果在图7中得以展示，图7显示了在VEGF特异性的sd-rxRNA给药之后VEGF mRNA水平的百分数(标准化为PPIB)。
图8展示了在玻璃体内给药之后sd-rxRNA的有效渗透。
利用1μl的玻璃体内注射将荧光标记的RNAi复合物给予至小鼠眼部。注射后2-3hrs之后，sd-rxRNA存在于神经节细胞层中并且注射后24hrs之后存在于光感受器外节中。利用激光扫描共聚焦显微镜对荧光进行检测。
图9A和图9B展示了在24h处sd-rxRNA的显著视网膜吸收，但rxRNAori并非如此。给予荧光标记的RNAi复合物并且从在给药后24h处收得的眼睛制备全眼载片。将全眼在4％多聚甲醛中进行固定过夜，接着是福尔马林固定以及石蜡包埋。横切面切割(5μm厚度)，用Hoechst进行染色并且利用Leica SP5共聚焦显微镜进行可视化。显示的图像是Hoechst、DY547(RNAi复合物上的红色标签)以及微分干涉差(DIC)图像的三重叠加。图B展示了显示比图A中的sd-rxRNA样品的更高放大倍数的视图(比例尺是10μm)，揭示了向视网膜色素上皮细胞的递送。
图10与11展示了在给药之后24h兔视网膜中的sd-rxRNA的显著视网膜吸收。经由单一的玻璃体内注射将荧光标记的RNAi复合物(100ug)给予至兔眼部。在注射后24h处获取全眼并且将其冷冻于最佳切片温度(OCT)的凝胶中。将冷冻块进行切片并且用Hoechst进行染色。在玻璃体内给药之后，sd-rxRNA存在于整个视网膜细胞层。利用激光扫描共聚焦显微镜对荧光进行检测。
图12展示了在单一的玻璃体内注射之后，靶标mRNA的显著沉默。以指示的剂量将sd-rxRNA通过玻璃体内注射(以1ul)给予至小鼠眼部。在48小时处获取视网膜，并且通过QPCR对mRNA水平进行量化并且标准化为b-肌动蛋白，n＝5-8(包括来自不同研究的数据，作图为相对于NTC的+/-SD，*p≤0.05，**p≤0.01)。
图13展示了在单一的玻璃体内注射之后，靶标mRNA的显著沉默。经由单一的玻璃体内注射(1ul)将3ug的PPIB或NTC sd-rxRNA给予至小鼠眼部。在注射后1、2、4、7、14、21以及28天处获取视网膜。通过qPCR对mRNA水平进行量化并且标准化为b-肌动蛋白。数据是收集自6个不同的研究，以使得对于每一数据点能够有足够的‘n’(n＝5-8)(在每一研究中作图为相对于PBS的+/-SD，*p≤0.01)。
图14展示了在单一的玻璃体内注射之后，靶标mRNA的显著沉默。经由单一的玻璃体内注射(1ul)将3ug的Map4K4或NTC sd-rxRNA给予至小鼠眼部。在注射后1、2、4、7、14、21以及28天处获取视网膜。通过qPCR对mRNA水平进行量化并且标准化为b-肌动蛋白。数据是收集自6个不同的研究，以使得对于每一数据点能够有足够的‘n’(n＝5-8)(在每一研究中作图为相对于PBS的+/-SD，*p≤0.05，**p≤0.01)。
图15展示了在给药之后三周sd-rxRNA不包括血管渗漏。将sd-rxRNA通过单一的玻璃体内给药(1ul)5μg的Map4k4-TEG与Map4k4-HP两者以及PBS而进行给予。在给药后1、2以及3周的荧光眼底成像之前，经皮下给予荧光素标记的葡聚糖。荧光素血管造影术显示没有视网膜血管渗漏。
图16展示了在给药之后三周sd-rxRNA不包括视网膜结构破坏。将sd-rxRNA通过单一的玻璃体内给药(1ul)5μg的Map4k4-TEG与Map4k4-HP两者以及PBS而进行给予。在给药之后2周以及3周进行光学相干断层成像。代表性图像显示了正常的视网膜结构以及厚度。
图17展示了在给药之后三周sd-rxRNA不损害视网膜功能。将sd-rxRNA通过单一的玻璃体内给药(1ul)5μg的Map4k4-TEG与Map4k4-HP两者以及PBS而进行给予。暗视力视网膜电流图描述术(ERG)记录在给药之后三周进行并且揭示了给药sd-rxRNA以及PBS之后的类似的视网膜功能。还对具有类似结果的明视力记录进行了收集。
图18展示了利用sd-rxRNA的多靶标沉默方法。在经过用靶向多种关注基因的多达4种sd-rxRNA进行了处理的细胞中对一些sd-rxRNA的沉默活性进行了确定。当组合给药时，sd-rxRNA保持其强力效能，这证明了它们用于多靶标沉默的潜力。
表2展示了VEGF之中的25-mer序列。rxRNAori以及sd-rxRNA可以针对表2之中的序列。在一些实施方案中，rxRNAori包含展示于表2中的序列。
表3显示了针对SPP1的sd-rxRNA分子的非限制性实例。
表4显示了针对PTGS2(COX-2)的sd-rxRNA序列的非限制性实例。
表5显示了针对CTGF的sd-rxRNA序列的非限制性实例。
表6显示了针对TGFβ2的sd-rxRNA序列的非限制性实例。
表7显示了针对TGFβ1的sd-rxRNA序列的非限制性实例。
实例2：靶向VEGF的sd-rxRNA的鉴别
利用一种序列选择算法来对用于sd-rxRNA开发的最佳序列进行鉴别(表2)。该算法基于以下标准选择序列：GC含量大于32％小于47％，与具体动物模型(例如，小鼠或大鼠)同源，避免5或更多U/U段序列(streche)和/或2或更多G/C段序列，脱靶打分低于500，并且避免包含于5’UTR中的序列。
一开始将这些序列开发为具有O-甲基修饰的25核苷酸平末端双链体。将此类序列在不同细胞系中进行筛选以鉴别那些在降低基因表达方面最有效的。对这些RNA分子的一些浓度进行测试，比如0.025、0.1以及0.25nM，并且确定合适的浓度。产生剂量反应曲线以确定最具效力的序列。根据本申请通篇描述的参数将这些序列开发成为sd-rxRNA分子。
表8显示了针对VEGF的sd-rxRNA序列的非限制性实例。
表9显示了针对VEGF的rxRNAori序列的非限制性实例。
表10显示了利用多种化学修饰模式对针对VEGF的sd-rxRNA序列进行最佳化的结果。
实例3：连接物化学物质
图19展示了连接物化学物质的变体不影响sd-rxRNA在体外的沉默活性。利用被动吸收测试在多种sd-rxRNA上(靶向Map4k4或PPIB)对两种不同的连接物化学物质(羟脯氨酸连接物以及ribo连接物)进行了评估以确定有利于自身递送的连接物。不存在递送载体(被动转染)情况下，用1uM、0.1uM或0.01uM的sd-rxRNA转染海拉细胞持续48hrs。任一连接物的使用导致sd-rxRNA的有效递送。
在实例1中使用的ribo连接物具有以下结构：
Figure BDA0001016238680000821
表2：hVEGF stealth序列
Figure BDA0001016238680000831
Figure BDA0001016238680000841
Figure BDA0001016238680000851
Figure BDA0001016238680000861
Figure BDA0001016238680000871
Figure BDA0001016238680000881
Figure BDA0001016238680000891
Figure BDA0001016238680000901
表3：SPP1(登录号NM_000582.2)sd-rxRNA序列
Figure BDA0001016238680000911
Figure BDA0001016238680000921
Figure BDA0001016238680000931
Figure BDA0001016238680000941
Figure BDA0001016238680000951
Figure BDA0001016238680000971
Figure BDA0001016238680000981
Figure BDA0001016238680000991
Figure BDA0001016238680001011
Figure BDA0001016238680001021
Figure BDA0001016238680001031
Figure BDA0001016238680001041
Figure BDA0001016238680001051
Figure BDA0001016238680001052
表4：PTGS2(登录号NM_000963.2)sd-rxRNA序列
Figure BDA0001016238680001053
Figure BDA0001016238680001071
Figure BDA0001016238680001081
Figure BDA0001016238680001101
Figure BDA0001016238680001111
Figure BDA0001016238680001121
Figure BDA0001016238680001122
表5：CTGF(登录号：NM_001901.2)sd-rxRNA序列
Figure BDA0001016238680001123
Figure BDA0001016238680001131
Figure BDA0001016238680001141
Figure BDA0001016238680001151
Figure BDA0001016238680001181
Figure BDA0001016238680001191
Figure BDA0001016238680001211
Figure BDA0001016238680001221
Figure BDA0001016238680001231
Figure BDA0001016238680001251
Figure BDA0001016238680001261
Figure BDA0001016238680001271
Figure BDA0001016238680001281
Figure BDA0001016238680001291
Figure BDA0001016238680001301
Figure BDA0001016238680001311
Figure BDA0001016238680001321
Figure BDA0001016238680001331
Figure BDA0001016238680001341
Figure BDA0001016238680001351
Figure BDA0001016238680001381
Figure BDA0001016238680001382
表6：TGFβ2(登录号：NM_001135599.1)sd-rxRNA序列
Figure BDA0001016238680001391
Figure BDA0001016238680001401
Figure BDA0001016238680001411
Figure BDA0001016238680001421
Figure BDA0001016238680001441
Figure BDA0001016238680001451
Figure BDA0001016238680001452
Figure BDA0001016238680001461
表7：TGFβ1(登录号：NM_000660.3)
Figure BDA0001016238680001462
Figure BDA0001016238680001471
Figure BDA0001016238680001481
Figure BDA0001016238680001491
Figure BDA0001016238680001501
Figure BDA0001016238680001511
Figure BDA0001016238680001521
Figure BDA0001016238680001531
Figure BDA0001016238680001551
Figure BDA0001016238680001561
Figure BDA0001016238680001562
表8：VEGF(登录号NM_001171623.1)sd-rxRNA序列的实例
Figure BDA0001016238680001563
Figure BDA0001016238680001571
表9：选择的VEGF rxRNAori序列的实例
Figure BDA0001016238680001572
图10：优化的具有增加的稳定性的VEGF sd-rxRNA序列
Figure BDA0001016238680001573
Figure BDA0001016238680001581
虽然已经如此描述了本发明的至少一个实施方案的几个方面，但是应理解，本领域的技术人员容易进行各种改变，修改和改进。此类改变、修改以及改进意在成为本披露的部分，并且意在处于本发明的精神与范围之中。因此，以上描述以及图仅是用以举例。
等效形式
本领域的普通技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定在此描述的本发明这些具体实施方案的许多等效形式。此类等效形式意在由以下权利要求所囊括。
在此披露的包括专利文献的所有参考以其全文通过引用而结合。本申请通过引用全文结合了以下：2009年9月22日提交的题为“减小的自我递送RNAI复合物”(REDUCED SIZESELF-DELIVERING RNAI COMPOUNDS)的PCT公开号WO2010/033247(申请号PCT/US2009/005247)以及2009年2月11日提交的题为“经修饰的RNAI多核苷酸及其用途”(“MODIFIEDRNAI POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF.”)的PCT公开号WO2009/102427(申请号PCT/US2009/000852)，包括其所有图以及所有部分(包括序列表和/或氨基酸/多核苷酸序列)。
Figure IDA0001016238740000011
Figure IDA0001016238740000021
Figure IDA0001016238740000031
Figure IDA0001016238740000041
Figure IDA0001016238740000051
Figure IDA0001016238740000061
Figure IDA0001016238740000081
Figure IDA0001016238740000091
Figure IDA0001016238740000101
Figure IDA0001016238740000111
Figure IDA0001016238740000121
Figure IDA0001016238740000131
Figure IDA0001016238740000141
Figure IDA0001016238740000151
Figure IDA0001016238740000161
Figure IDA0001016238740000171
Figure IDA0001016238740000201
Figure IDA0001016238740000211
Figure IDA0001016238740000241
Figure IDA0001016238740000251
Figure IDA0001016238740000261
Figure IDA0001016238740000271
Figure IDA0001016238740000301
Figure IDA0001016238740000321
Figure IDA0001016238740000341
Figure IDA0001016238740000351
Figure IDA0001016238740000361
Figure IDA0001016238740000381
Figure IDA0001016238740000391
Figure IDA0001016238740000401
Figure IDA0001016238740000431
Figure IDA0001016238740000441
Figure IDA0001016238740000451
Figure IDA0001016238740000481
Figure IDA0001016238740000491
Figure IDA0001016238740000521
Figure IDA0001016238740000531
Figure IDA0001016238740000541
Figure IDA0001016238740000551
Figure IDA0001016238740000561
Figure IDA0001016238740000571
Figure IDA0001016238740000601
Figure IDA0001016238740000611
Figure IDA0001016238740000621
Figure IDA0001016238740000631
Figure IDA0001016238740000641
Figure IDA0001016238740000661
Figure IDA0001016238740000671
Figure IDA0001016238740000681
Figure IDA0001016238740000691
Figure IDA0001016238740000701
Figure IDA0001016238740000721
Figure IDA0001016238740000741
Figure IDA0001016238740000751
Figure IDA0001016238740000761
Figure IDA0001016238740000771
Figure IDA0001016238740000781
Figure IDA0001016238740000791
Figure IDA0001016238740000801
Figure IDA0001016238740000811
Figure IDA0001016238740000821
Figure IDA0001016238740000831
Figure IDA0001016238740000841
Figure IDA0001016238740000851
Figure IDA0001016238740000861
Figure IDA0001016238740000881
Figure IDA0001016238740000891
Figure IDA0001016238740000901
Figure IDA0001016238740000911
Figure IDA0001016238740000921
Figure IDA0001016238740000931
Figure IDA0001016238740000941
Figure IDA0001016238740000951
Figure IDA0001016238740000961
Figure IDA0001016238740000971
Figure IDA0001016238740000981
Figure IDA0001016238740000991
Figure IDA0001016238740001001
Figure IDA0001016238740001011
Figure IDA0001016238740001041
Figure IDA0001016238740001061
Figure IDA0001016238740001081
Figure IDA0001016238740001091
Figure IDA0001016238740001101
Figure IDA0001016238740001111
Figure IDA0001016238740001121
Figure IDA0001016238740001131
Figure IDA0001016238740001141
Figure IDA0001016238740001151
Figure IDA0001016238740001161
Figure IDA0001016238740001171
Figure IDA0001016238740001181
Figure IDA0001016238740001191
Figure IDA0001016238740001211
Figure IDA0001016238740001231
Figure IDA0001016238740001271
Figure IDA0001016238740001281
Figure IDA0001016238740001301
Figure IDA0001016238740001321
Figure IDA0001016238740001331
Figure IDA0001016238740001341
Figure IDA0001016238740001351
Figure IDA0001016238740001361
Figure IDA0001016238740001371
Figure IDA0001016238740001381
Figure IDA0001016238740001391
Figure IDA0001016238740001401
Figure IDA0001016238740001411
Figure IDA0001016238740001431
Figure IDA0001016238740001441
Figure IDA0001016238740001461
Figure IDA0001016238740001481
Figure IDA0001016238740001491
Figure IDA0001016238740001511
Figure IDA0001016238740001521
Figure IDA0001016238740001531
Figure IDA0001016238740001551
Figure IDA0001016238740001561
Figure IDA0001016238740001571
Figure IDA0001016238740001581
Figure IDA0001016238740001591
Figure IDA0001016238740001601
Figure IDA0001016238740001611
Figure IDA0001016238740001621
Figure IDA0001016238740001651
Figure IDA0001016238740001661
Figure IDA0001016238740001671
Figure IDA0001016238740001681
Figure IDA0001016238740001691
Figure IDA0001016238740001701
Figure IDA0001016238740001711
Figure IDA0001016238740001721
Figure IDA0001016238740001741
Figure IDA0001016238740001751
Figure IDA0001016238740001761
Figure IDA0001016238740001771
Figure IDA0001016238740001781
Figure IDA0001016238740001791
Figure IDA0001016238740001801
Figure IDA0001016238740001811
Figure IDA0001016238740001821
Figure IDA0001016238740001831
Figure IDA0001016238740001841
Figure IDA0001016238740001851
Figure IDA0001016238740001861
Figure IDA0001016238740001871
Figure IDA0001016238740001891

Claims (26)

1.有效量的sd-rxRNA在制备用于在对其有需要的受试者的眼睛中促进该sd-rxRNA的RNA干扰的药物中的应用，其中该sd-rxRNA包含引导链与过客链，其中该sd-rxRNA包括双链区域和单链区域，其中该双链区域长度是8-15个核苷酸，其中该单链区域位于该引导链的3’末端并且长度是4-12个核苷酸，其中该单链区域包含3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个硫代磷酸酯修饰，其中该sd-rxRNA的核苷酸的至少40%是经过修饰的，以及其中该sd-rxRNA针对编码TGFβ1或TGFβ2的基因，其中该sd-rxRNA包含表6或表7示出的序列。
2.如权利要求1所述的应用，其中该sd-rxRNA的给予是玻璃体内。
3.如权利要求1所述的应用，其中该药物是一种治疗眼部失调的药物。
4.如权利要求3所述的应用，其中该眼部失调是选自下组，该组由以下各项组成：血管渗漏、新生血管形成、脉络膜新生血管形成（湿性AMD）、地图状萎缩（晚期干性AMD）、早期至中期干性AMD、术后囊样黄斑水肿（CME）、非增生性糖尿病视网膜病变（NPDR）、糖尿病性黄斑水肿（DME）、视网膜静脉阻塞继发性黄斑水肿（RVO）、增生性糖尿病视网膜病变（PDR）、新生血管性青光眼（NVG）、早产儿视网膜病（ROP）、纤维增生性视网膜疾病、增生性玻璃体视网膜病变（PVR）、视网膜前膜/玻璃体黄斑粘连、色素性视网膜炎、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、视网膜母细胞瘤、由于瘢痕的小梁切除术失败以及眼色素层炎。
5.如权利要求3所述的应用，其中该眼部失调是与年龄相关的黄斑变性（AMD）。
6.如权利要求3所述的应用，其中该眼部失调是青光眼。
7.如权利要求3所述的应用，其中该眼部失调是视网膜血管阻塞性障碍。
8.如权利要求3所述的应用，其中该眼部失调是视网膜退行性疾病。
9.如权利要求4所述的应用，其中该眼部失调是糖尿病性黄斑水肿（DME）。
10.如权利要求4所述的应用，其中该眼部失调是增生性玻璃体视网膜病变（PVR）。
11.如权利要求4所述的应用，其中该眼部失调是由于瘢痕的小梁切除术失败。
12.如权利要求1-11中任一项所述的应用，其中该sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1156 (P.mU.fU. A. A.fC. A.fC.fU. G. A.fU. G. A* A*fC*fC*mA*mA* G.)、1158(P.mU.fU. A. A.fC. A.fC.fU. G. A.fU. G.mA*mA*fC*fC*mA*mA* G.)或1314 (P.mU.A.fU. A.fU. G.fC.fU. G.fU. G.fU.mG*fU*mA*fC*mU*fC* U.)的序列；其中该sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO: 1155 (mU*mC*mA.mU.mC.mA.mG.mU.mG.mU.mU*mA*mA.TEG-Chl)、1157 (mU*mC*mA.mU.mC.mA.mG.mU.mG.mU.mU*mA*mA.TEG-Chl)、或1313 (mC*mA*mC.mA.mC.mA.mG.mC.mA.mU.mA*mU*mA.TEG-Chl)的序列。
13.如权利要求1-11中任一项所述的应用，其中将两种或更多种不同的sd-rxRNA给予该受试者的眼睛，所述两种或更多种不同的sd-rxRNA针对为两种或更多种不同的蛋白进行编码的基因。
14.如权利要求13所述的应用，其中这些sd-rxRNA包括针对VEGF 、以及TGFβ2和/或TGFβ1的sd-rxRNA。
15.如权利要求14所述的应用，其中针对VEGF的该sd-rxRNA包含一种选自表10中各序列的序列的至少12个连续核苷酸。
16.如权利要求1-11中任一项所述的应用，其中该sd-rxRNA是经过疏水修饰的。
17.如权利要求16所述的应用，其中该sd-rxRNA连接至一种或多种疏水轭合物上。
18.如权利要求1-11中任一项所述的应用，其中该sd-rxRNA包含至少一个5-甲基C或U修饰。
19.如权利要求14所述的应用，其中针对VEGF的该sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:1317 (AGAACAGUCCUUA)、1357 (UGCGGAUCAAACA)、1379 (A. G. A. A.mC. A.G.mU.mC.mC.mU.mU. A.Chl) 或1397 (mU. G.mC. G. G. A.mU.mC. A. A. A.mC. A.Chl)的序列的至少12个连续核苷酸且其中反义链包含SEQ ID NO: 1318(UAAGGACUGUUCUGUCGAU)、1358 (UGUUUGAUCCGCAUAAUCU)、1380 (P.mU. A. A. G. G.A.fC.fU. G.fU.fU.fC.fU* G*fU*fC* G* A* U)或1398 (P.mU. G.fU.fU.fU. G.A.fU.fC.fC. G.fC. A*fU* A* A*fU*fC* U)的序列的至少12个连续核苷酸。
20.如权利要求19所述的应用，其中该sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:1317(AGAACAGUCCUUA)并且该sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1318(UAAGGACUGUUCUGUCGAU)。
21.如权利要求19所述的应用，其中该sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:1357(UGCGGAUCAAACA)并且该sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1358(UGUUUGAUCCGCAUAAUCU)。
22.如权利要求19所述的应用，其中该sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:1379(A. G.A. A.mC. A. G.mU.mC.mC.mU.mU. A.Chl)并且该sd-rxRNA的反义链包含SEQ ID NO:1380(P.mU. A. A. G. G. A.fC.fU. G.fU.fU.fC.fU* G*fU*fC* G* A* U)。
23.如权利要求19所述的应用，其中该sd-rxRNA的正义链包含SEQ ID NO:1397(mU.G.mC. G. G. A.mU.mC. A. A. A.mC. A.Chl)并且该sd-rxRNA的反义链包含SEQ IDNO:1398(P.mU. G.fU.fU.fU. G. A.fU.fC.fC. G.fC. A*fU* A* A*fU*fC* U)。
24.如权利要求19-23中任一项所述的应用，其中该sd-rxRNA是经过疏水修饰的。
25.如权利要求24所述的应用，其中该sd-rxRNA连接至一种或多种疏水轭合物上。
26.如权利要求19所述的应用，其中该sd-rxRNA包含至少一个5-甲基C或U修饰。
CN201610414959.9A 2010-03-24 2011-03-24 眼部症候中的rna干扰 Active CN106074591B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31725410P 2010-03-24 2010-03-24
US61/317,254 2010-03-24
US31762110P 2010-03-25 2010-03-25
US61/317,621 2010-03-25
CN201180025769.3A CN103200945B (zh) 2010-03-24 2011-03-24 眼部症候中的rna干扰

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180025769.3A Division CN103200945B (zh) 2010-03-24 2011-03-24 眼部症候中的rna干扰

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106074591A CN106074591A (zh) 2016-11-09
CN106074591B true CN106074591B (zh) 2020-01-14

Family

ID=44673630

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610414959.9A Active CN106074591B (zh) 2010-03-24 2011-03-24 眼部症候中的rna干扰
CN201180025769.3A Active CN103200945B (zh) 2010-03-24 2011-03-24 眼部症候中的rna干扰

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180025769.3A Active CN103200945B (zh) 2010-03-24 2011-03-24 眼部症候中的rna干扰

Country Status (6)

Country Link
US (4) US9095504B2 (zh)
EP (2) EP3578183B1 (zh)
JP (3) JP6335968B2 (zh)
CN (2) CN106074591B (zh)
CA (1) CA2794187C (zh)
WO (1) WO2011119871A1 (zh)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009102427A2 (en) * 2008-02-11 2009-08-20 Rxi Pharmaceuticals Corp. Modified rnai polynucleotides and uses thereof
WO2010008582A2 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell drug delivery system
US10138485B2 (en) 2008-09-22 2018-11-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Neutral nanotransporters
WO2010059226A2 (en) 2008-11-19 2010-05-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of map4k4 through rnai
WO2010078536A1 (en) 2009-01-05 2010-07-08 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of pcsk9 through rnai
US9745574B2 (en) 2009-02-04 2017-08-29 Rxi Pharmaceuticals Corporation RNA duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
WO2011109248A1 (en) 2010-03-02 2011-09-09 Hapten Pharmaceuticals, Llc Effective sensitizing dose of a gelled immunomodulating topical composition
US9095504B2 (en) 2010-03-24 2015-08-04 Rxi Pharmaceuticals Corporation RNA interference in ocular indications
RU2615143C2 (ru) * 2010-03-24 2017-04-04 Адвирна Самодоставляющие PHKi соединения уменьшенного размера
KR20180044433A (ko) 2010-03-24 2018-05-02 알엑스아이 파마슈티칼스 코포레이션 진피 및 섬유증성 적응증에서의 ｒｎａ 간섭
AR083445A1 (es) * 2010-10-14 2013-02-27 Univ Mie siARN CONTRA LA FIBROSIS
JP5795072B2 (ja) 2010-10-22 2015-10-14 ソンギュングヮン ユニバーシティ ファウンデーション フォー コーポレート コラボレーション Ｒｎａ干渉を誘導する核酸分子及びその用途
CN108148838A (zh) * 2012-05-22 2018-06-12 奥利克斯医药有限公司 具有细胞内穿透能力的诱导rna干扰的核酸分子及用途
US10369231B2 (en) * 2013-03-11 2019-08-06 Fondazione Telethon MiR-204 and miR-211 and uses thereof
EP3079707A4 (en) 2013-12-02 2017-10-18 RXi Pharmaceuticals Corporation Immunotherapy of cancer
US10221417B2 (en) * 2014-04-22 2019-03-05 Medizinische Hochschule Hannover LncRNAs for therapy and diagnosis of angiogenesis
EP3137119B1 (en) 2014-04-28 2020-07-01 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating cancer using a nucleic acid targeting mdm2
CA2947619A1 (en) 2014-05-01 2015-11-05 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treatment of disorders in the front of the eye utilizing nucleic acid molecules
US20180085391A1 (en) * 2014-08-08 2018-03-29 Modernatx, Inc. Compositions and methods for the treatment of ophthalmic diseases and conditions
CN107073294A (zh) 2014-09-05 2017-08-18 阿克赛医药公司 使用靶向tyr或mmp1的核酸治疗老化和皮肤病症的方法
JP6997623B2 (ja) 2014-12-12 2022-02-04 エム． ウルフ、トッド オリゴヌクレオチドを利用して細胞内の核酸を編集するための組成物および方法
WO2017007825A1 (en) 2015-07-06 2017-01-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treating neurological disorders using a synergistic small molecule and nucleic acids therapeutic approach
JP6983752B2 (ja) 2015-07-06 2021-12-17 フィオ ファーマシューティカルズ コーポレーションPhio Pharmaceuticals Corp. スーパーオキシドディスムターゼ１（ｓｏｄ１）を標的とする核酸分子
CA2995110A1 (en) 2015-08-14 2017-02-23 University Of Massachusetts Bioactive conjugates for oligonucleotide delivery
CA3002744A1 (en) 2015-10-19 2017-04-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering nucleic acid compounds targeting long non-coding rna
KR20180071362A (ko) 2015-11-16 2018-06-27 올릭스 주식회사 MyD88 또는 TLR3을 타겟팅하는 RNA 복합체를 이용한 연령-관련 황반 변성의 치료
CA3011894A1 (en) 2016-01-31 2017-08-03 University Of Massachusetts Branched oligonucleotides
CN108779463B (zh) 2016-02-02 2022-05-24 奥利克斯医药有限公司 使用靶向IL4Rα、TRPA1或F2RL1的RNA复合物治疗特应性皮炎和哮喘
WO2017134526A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of angiogenesis-associated diseases using rna complexes that target angpt2 and pdgfb
CA3020487C (en) 2016-04-11 2022-05-31 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using rna complexes that target connective tissue growth factor
CA3022319A1 (en) 2016-05-06 2017-11-09 Tod M. Woolf Improved methods for genome editing with and without programmable nucleases
US11130951B2 (en) 2016-06-09 2021-09-28 The General Hospital Corporation Modulating the cellular stress response
KR101916652B1 (ko) 2016-06-29 2018-11-08 올릭스 주식회사 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도
CA3033368A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 University Of Massachusetts Conjugated oligonucleotides
CN107177598B (zh) * 2016-08-18 2019-12-27 广州市锐博生物科技有限公司 用于抑制BIRC5靶基因mRNA表达的寡核酸分子及其成套组合物
KR20190108167A (ko) 2017-02-10 2019-09-23 성균관대학교산학협력단 Rna 간섭을 위한 긴 이중가닥 rna
EP3592137A4 (en) * 2017-03-10 2021-01-06 The Medical College of Wisconsin, Inc. RIBOSWITCH-MODULATED GENE THERAPY FOR RETINAL DISEASES
KR20190037166A (ko) * 2017-09-28 2019-04-05 올릭스 주식회사 결합 조직 성장 인자를 표적으로 하는 rna 복합체를 함유하는 노인성 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물
EP3710576A1 (en) 2017-11-17 2020-09-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion from fine needle aspirates and small biopsies
CA3083118A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of peripheral blood lymphocytes (pbls) from peripheral blood
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
BR112020013848A2 (pt) 2018-01-08 2020-12-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. métodos para expandir linfócitos infiltrantes de tumor e para tratar um indivíduo com câncer, população de linfócitos infiltrantes de tumor, e, método para avaliar fatores de transcrição
WO2019136459A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
JP2021533762A (ja) 2018-08-10 2021-12-09 ユニバーシティ・オブ・マサチューセッツUniversity Of Massachusetts Ｓｎｐを標的化する修飾オリゴヌクレオチド
KR20210099573A (ko) 2018-11-05 2021-08-12 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 개선된 종양 반응성 t-세포의 선택
JP2022506586A (ja) 2018-11-05 2022-01-17 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球の産生のためのプロセスおよび免疫療法におけるその使用
KR20210091212A (ko) 2018-11-05 2021-07-21 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 항-pd-1 항체에 불응성인 nsclc 환자의 치료
CA3118493A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors
CA3123392A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
KR20210136050A (ko) 2019-03-01 2021-11-16 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 액상 종양으로부터의 종양 침윤 림프구의 확장 및 그의 치료 용도
WO2020232029A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
JP2023506734A (ja) 2019-12-11 2023-02-20 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球（ｔｉｌ）の産生のためのプロセス及びそれを使用する方法
JP2023523855A (ja) 2020-05-04 2023-06-07 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球の製造方法及び免疫療法におけるその使用
TW202208616A (zh) 2020-05-04 2022-03-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 改良之腫瘤反應性ｔ細胞的選擇
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
EP4225330A1 (en) 2020-10-06 2023-08-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2022125941A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with braf inhibitors and/or mek inhibitors
JP2023554395A (ja) 2020-12-17 2023-12-27 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｃｔｌａ－４及びｐｄ－１阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球療法による治療
WO2022133149A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes
KR20240037185A (ko) 2021-04-19 2024-03-21 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 키메라 공동자극 수용체, 케모카인 수용체, 및 세포 면역치료에서의 이의 용도
EP4359539A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 University Of Massachusetts Optimized anti-flt1 oligonucleotide compounds for treatment of preeclampsia and other angiogenic disorders
WO2023009716A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
AR127482A1 (es) 2021-10-27 2024-01-31 Iovance Biotherapeutics Inc Sistemas y métodos para coordinar la fabricación de células para inmunoterapia específica de paciente
WO2023086803A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
WO2023087062A1 (en) * 2021-11-18 2023-05-25 Resonance Health Analysis Services Pty Ltd Method for treating cyclophilin b associated diseases
WO2023220744A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Single-stranded loop oligonucleotides
WO2024030758A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
WO2024073705A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-04 University Of Massachusetts Ocular delivery of oligonucleotides

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004064760A2 (en) * 2003-01-21 2004-08-05 Archemix Corp. Aptamer therapeutics useful in ocular pharmacotherapy
WO2010033247A2 (en) * 2008-09-22 2010-03-25 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering rnai compounds

Family Cites Families (356)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4201860A (en) 1978-05-09 1980-05-06 Bristol-Myers Company Purine derivatives
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US5643889A (en) 1984-07-11 1997-07-01 Temple University-Of The Commonwealth System Of Pennsylvania Cholesterol conjugates of 2'5'-oligoadenylate derivatives and antiviral uses thereof
US5028703A (en) 1988-03-11 1991-07-02 Massachusetts Institute Of Technology Glucan composition and process for preparation thereof
US5082936A (en) 1984-11-28 1992-01-21 Massachusetts Institute Of Technology Glucan composition and process for preparation thereof
US4992540A (en) 1984-11-28 1991-02-12 Massachusetts Institute Of Technology Glucan composition and process for preparation thereof
US4810646A (en) 1984-11-28 1989-03-07 Massachusetts Institute Of Technology Glucan compositions and process for preparation thereof
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
DE3529497A1 (de) 1985-08-17 1987-02-26 Boehringer Mannheim Gmbh N(pfeil hoch)6(pfeil hoch)-disubstituierte purinderivate, verfahren zu deren herstellung sowie diese verbindungen enthaltende arzneimittel
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
EP0260032B1 (en) 1986-09-08 1994-01-26 Ajinomoto Co., Inc. Compounds for the cleavage at a specific position of RNA, oligomers employed for the formation of said compounds, and starting materials for the synthesis of said oligomers
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5750666A (en) 1988-05-26 1998-05-12 Competitve Technologies, Inc. Polynucleotide phosphorodithioate compounds
ZA902710B (en) 1989-05-22 1991-12-24 Univ Georgia Res Found Enzyme luminescence assay
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5032401A (en) 1989-06-15 1991-07-16 Alpha Beta Technology Glucan drug delivery system and adjuvant
WO1991003248A2 (en) 1989-09-08 1991-03-21 Alpha Beta Technology, Inc. Method for immune system activation
JPH05503952A (ja) 1989-09-08 1993-06-24 アルファ　ベータ　テクノロジー，インコーポレイティッド 可溶性グルカン類の製造方法
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5495009A (en) 1989-10-24 1996-02-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs containing thioformacetal linkages
EP0942000B1 (en) 1989-10-24 2004-06-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-Modified oligonucleotides
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US6005087A (en) 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5914396A (en) 1990-01-11 1999-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-modified nucleosides and phosphoramidites
US6153737A (en) 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US6395492B1 (en) 1990-01-11 2002-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US6399754B1 (en) 1991-12-24 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides
US5514786A (en) 1990-01-11 1996-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for inhibiting RNA activity
US6358931B1 (en) 1990-01-11 2002-03-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating RNA
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5658731A (en) 1990-04-09 1997-08-19 Europaisches Laboratorium Fur Molekularbiologie 2'-O-alkylnucleotides as well as polymers which contain such nucleotides
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
CA2040374C (en) 1990-07-06 1998-06-16 Gunnar Rorstad Process for enhancing the resistance of aquatic animals to disease
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
BR9106702A (pt) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Inc Analogo de oligonucleotideos e processos para modular a producao de uma proteina por um organismo e para tratar um organismo
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
JPH0813274B2 (ja) 1990-08-13 1996-02-14 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 遺伝子発現を検出及び変調する糖修飾されたオリゴヌクレオチド
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
EP0547142A1 (en) 1990-08-28 1993-06-23 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Solid support synthesis of 3'-tailed oligonucleotides via a linking molecule
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
CA2092002A1 (en) 1990-09-20 1992-03-21 Mark Matteucci Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
GB9022560D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 G B Biotechnology Limited Processing of waste
US5419966A (en) 1991-06-10 1995-05-30 Microprobe Corporation Solid support for synthesis of 3'-tailed oligonucleotides
US5525719A (en) 1991-08-30 1996-06-11 Chemgenes Corporation N-protected-2'-O-methyl-and N-protected-3'-O-methyl-ribonucleosides and their phosphoramidite derivatives
US5214135A (en) 1991-08-30 1993-05-25 Chemgenes Corporation N-protected-2'-O-methyl-ribonucleosides and N-protected 2'-O-methyl-3'-cyanoethyl-N-,N-diisopropyl phosphoramidite ribonucleosides
US7384634B2 (en) 1991-08-30 2008-06-10 University Of South Florida Connective tissue growth factor
US5770209A (en) 1991-08-30 1998-06-23 University Of South Florida Acceleration of wound healing using connective tissue growth factor
US5607923A (en) 1991-10-15 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating cytomegalovirus having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5599797A (en) 1991-10-15 1997-02-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5661134A (en) 1991-10-15 1997-08-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating Ha-ras or Ki-ras having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5856455A (en) 1991-12-24 1999-01-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2'-modified oligonucleotides
FI115214B (fi) 1992-01-22 2005-03-31 Hoechst Ag Menetelmä oligonukleotidianalogien valmistamiseksi ja niiden käyttö
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5817781A (en) 1992-06-01 1998-10-06 Gilead Sciences, Inc. Modified internucleoside linkages (II)
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
NZ263985A (en) 1993-03-31 1997-07-27 Hybridon Inc Oligonucleotide complementary to an essential amino acid sequence of influenza virus
WO1994022891A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
ES2128535T3 (es) 1993-05-12 1999-05-16 Novartis Ag Nucleosidos y oligonucleotidos con grupos 2'-eter.
FR2705099B1 (fr) 1993-05-12 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Oligonucléotides phosphorothioates triesters et procédé de préparation.
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US5580972A (en) 1993-06-14 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Purine nucleoside modifications by palladium catalyzed methods
US5428149A (en) 1993-06-14 1995-06-27 Washington State University Research Foundation Method for palladium catalyzed carbon-carbon coulping and products
US5534259A (en) 1993-07-08 1996-07-09 Liposome Technology, Inc. Polymer compound and coated particle composition
US5532130A (en) 1993-07-20 1996-07-02 Dyad Pharmaceutical Corporation Methods and compositions for sequence-specific hybridization of RNA by 2'-5' oligonucleotides
US5614621A (en) 1993-07-29 1997-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing oligonucleotides using silyl-containing diamino phosphorous reagents
US5417978A (en) 1993-07-29 1995-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use
JPH09502092A (ja) 1993-09-02 1997-03-04 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 非ヌクレオチドを含有する酵素性核酸
AU679566B2 (en) 1993-09-03 1997-07-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
CA2174339A1 (en) 1993-10-27 1995-05-04 Lech W. Dudycz 2'-amido and 2'-peptido modified oligonucleotides
NZ277616A (en) 1993-11-16 1997-12-19 Genta Inc Synthetic oligomers having phosphonate internucleosidyl linkages of undefined chirality mixed with non-phosphate internucleosidyl linkages
ATE315939T1 (de) 1993-11-19 2006-02-15 Univ Sydney Verfahren zur prophylaxe oder kontrolle des katarakts
US5652359A (en) 1993-12-02 1997-07-29 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides containing n-methyl thiolated bases having antiviral activity
WO1995022553A1 (en) 1994-02-18 1995-08-24 Hybridon, Inc. Oligonucleotides with anti-respiratory syncytial virus activity
US5646126A (en) 1994-02-28 1997-07-08 Epoch Pharmaceuticals Sterol modified oligonucleotide duplexes having anticancer activity
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5651981A (en) 1994-03-29 1997-07-29 Northwestern University Cationic phospholipids for transfection
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5777153A (en) 1994-07-08 1998-07-07 Gilead Sciences, Inc. Cationic lipids
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5591721A (en) 1994-10-25 1997-01-07 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5681940A (en) 1994-11-02 1997-10-28 Icn Pharmaceuticals Sugar modified nucleosides and oligonucleotides
US5767099A (en) 1994-12-09 1998-06-16 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing amino acid or dervatized amino acid groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5948767A (en) 1994-12-09 1999-09-07 Genzyme Corporation Cationic amphiphile/DNA complexes
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
AUPN166195A0 (en) 1995-03-13 1995-04-06 Norvet Research Pty Limited Process for glucan extraction
US6420549B1 (en) 1995-06-06 2002-07-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs having modified dimers
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5851548A (en) 1995-06-07 1998-12-22 Gen-Probe Incorporated Liposomes containing cationic lipids and vitamin D
EP0874910A4 (en) 1995-06-07 1999-04-21 Life Technologies Inc ENHANCED CATIONIC LIPID TRANSFECTION BY PEPTIDES
JP4335310B2 (ja) 1995-06-07 2009-09-30 ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア 疎水性脂質−核酸複合中間体を通して調製される脂質−核酸粒子、及び遺伝子移送のための使用
AUPN398295A0 (en) 1995-07-05 1995-07-27 Carlton And United Breweries Limited Chemical compounds and processes for their production
US5734041A (en) 1995-10-20 1998-03-31 Mcgill University Preparation of chiral phosphorothioate oligomers
US5705621A (en) 1995-11-17 1998-01-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric phosphite, phosphodiester, Phosphorothioate and phosphorodithioate compounds and intermediates for preparing same
US5684143A (en) 1996-02-21 1997-11-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligo-2'-fluoronucleotide N3'->P5' phosphoramidates
US6331617B1 (en) 1996-03-21 2001-12-18 University Of Iowa Research Foundation Positively charged oligonucleotides as regulators of gene expression
US6299895B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Neurotech S.A. Device and method for treating ophthalmic diseases
US6444806B1 (en) 1996-04-30 2002-09-03 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Conjugates and methods of forming conjugates of oligonucleotides and carbohydrates
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US5789416B1 (en) 1996-08-27 1999-10-05 Cv Therapeutics Inc N6 mono heterocyclic substituted adenosine derivatives
US6111085A (en) 1996-09-13 2000-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US6248878B1 (en) 1996-12-24 2001-06-19 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside analogs
US7504493B2 (en) 1997-01-23 2009-03-17 The John Hopkins University Characterization of the yeast transcriptome
US7789841B2 (en) 1997-02-06 2010-09-07 Exogen, Inc. Method and apparatus for connective tissue treatment
DE69841002D1 (de) 1997-05-14 2009-09-03 Univ British Columbia Hochwirksame verkapselung von nukleinsäuren in lipidvesikeln
AU7499198A (en) 1997-05-21 1998-12-11 Johns Hopkins University, The Gene expression profiles in normal and cancer cells
US6028183A (en) 1997-11-07 2000-02-22 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives and oligonucleotides containing same
AU1507199A (en) 1997-12-15 1999-07-05 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Novel pyrimidine-5-carboxamide derivatives
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6562618B1 (en) 1997-12-25 2003-05-13 Japan Tobacco, Inc. Monoclonal antibody against connective tissue growth factor and medicinal uses thereof
US6020475A (en) 1998-02-10 2000-02-01 Isis Pharmeuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
JP2003525017A (ja) 1998-04-20 2003-08-26 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 遺伝子発現を調節しうる新規な化学組成を有する核酸分子
US20040241845A1 (en) 1998-05-22 2004-12-02 Luc Desgroseillers Mammalian staufen and use thereof
US6242589B1 (en) 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
US6277967B1 (en) 1998-07-14 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate or 2′-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages
US6271358B1 (en) 1998-07-27 2001-08-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. RNA targeted 2′-modified oligonucleotides that are conformationally preorganized
US6378526B1 (en) 1998-08-03 2002-04-30 Insite Vision, Incorporated Methods of ophthalmic administration
US20040009938A1 (en) 1998-08-07 2004-01-15 Muthiah Manoharan Methods of enhancing renal uptake of oligonucleotides
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US6020483A (en) 1998-09-25 2000-02-01 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside modifications by palladium catalyzed methods
US6475490B1 (en) 1998-10-19 2002-11-05 Fordham University Compositions and methods for promoting tissue repair using heat shock proteins
US6328765B1 (en) 1998-12-03 2001-12-11 Gore Enterprise Holdings, Inc. Methods and articles for regenerating living tissue
US7115390B1 (en) 1998-12-14 2006-10-03 Fibrogen, Inc. Connective tissue growth factor fragments and methods and uses thereof
ES2304811T3 (es) 1998-12-14 2008-10-16 University Of Miami Fragmentos del factor de crecimiento de tejido conjuntivo.
US6455586B1 (en) 1998-12-15 2002-09-24 Leonard L. Kaplan Topical immunomodulating compositions for treatment of aids, Hepatitis B & C, other infectious diseases, and cancer
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
US6207819B1 (en) 1999-02-12 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds, processes and intermediates for synthesis of mixed backbone oligomeric compounds
EP1152009B2 (en) 1999-02-12 2017-09-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel nucleosides and oligonucleotide analogues
US6121437A (en) 1999-03-16 2000-09-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphate and thiophosphate protecting groups
US6706491B1 (en) 1999-04-09 2004-03-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Reagents and methods for identifying and modulating expression of genes regulated by p21
WO2000064946A2 (en) 1999-04-28 2000-11-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
US6492497B1 (en) 1999-04-30 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Specific binding members for TGFbeta1
AU5485600A (en) 1999-06-16 2001-01-02 Johns Hopkins University, The Characterization of the yeast transcriptome
US6033910A (en) 1999-07-19 2000-03-07 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of MAP kinase kinase 6 expression
US6331313B1 (en) 1999-10-22 2001-12-18 Oculex Pharmaceticals, Inc. Controlled-release biocompatible ocular drug delivery implant devices and methods
GB9925459D0 (en) 1999-10-27 1999-12-29 Plant Bioscience Ltd Gene silencing
US8017742B2 (en) 1999-11-10 2011-09-13 Japan Science And Technology Agency Gene carrier
JP2001206899A (ja) 1999-11-18 2001-07-31 Japan Tobacco Inc ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
US20040072785A1 (en) 1999-11-23 2004-04-15 Wolff Jon A. Intravascular delivery of non-viral nucleic acid
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
DE10160151A1 (de) 2001-01-09 2003-06-26 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens
US7098030B2 (en) 1999-12-31 2006-08-29 Mirus Bio Corporation Polyampholytes for delivering polyions to a cell
US20050032733A1 (en) 2001-05-18 2005-02-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SiNA)
CA2403397A1 (en) 2000-03-16 2001-09-20 Genetica, Inc. Methods and compositions for rna interference
WO2001075164A2 (en) 2000-03-30 2001-10-11 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference
US7108721B2 (en) 2000-05-11 2006-09-19 Massachusetts Institute Of Technology Tissue regrafting
WO2001085941A2 (en) 2000-05-11 2001-11-15 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Myc targets
EP1311277A4 (en) 2000-07-18 2004-08-25 Joslin Diabetes Center Inc FIBROSIS MODULATION METHOD
CA2416442C (en) 2000-07-24 2010-06-08 Krenitsky Pharmaceuticals, Inc. Substituted 5-alkynyl pyrimidines having neurotrophic activity
AU2001283062A1 (en) 2000-08-02 2002-02-13 The Johns Hopkins University Endothelial cell expression patterns
AU2001279796A1 (en) 2000-08-03 2002-02-18 Abac R & D Gmbh Isolation of glucan particles and uses thereof
WO2002022176A1 (en) 2000-09-15 2002-03-21 Genvec, Inc. Method of modulating neovascularization
US20020132788A1 (en) 2000-11-06 2002-09-19 David Lewis Inhibition of gene expression by delivery of small interfering RNA to post-embryonic animal cells in vivo
US6476003B1 (en) 2000-11-06 2002-11-05 Immusonic, Inc. Method for preparing small particle size glucan in a dry material
TR200401292T3 (tr) 2000-12-01 2004-07-21 Max@Planck@Gesellschaft�Zur�F�Rderung�Der�Wissenschaften RNAÁgirişimineÁyolÁaçanÁküçükÁRNAÁmolekülleri
FR2818642B1 (fr) 2000-12-26 2005-07-15 Hoechst Marion Roussel Inc Nouveaux derives de la purine, leur procede de preparation, leur application a titre de medicaments, compositions pharmaceutiques et nouvelle utilistion
WO2002059300A2 (en) 2000-12-28 2002-08-01 J & J Research Pty Ltd Double-stranded rna-mediated gene suppression
DE10100127A1 (de) 2001-01-03 2002-10-02 Henkel Kgaa Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut
DE10100121A1 (de) 2001-01-03 2002-08-01 Henkel Kgaa Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß oder der Hautalterung in vitro
US7044945B2 (en) 2001-03-30 2006-05-16 Sand Bruce J Prevention of regression in thermal ciliary muscle tendinoplasty
CA2443995C (en) 2001-04-11 2014-06-03 The Johns Hopkins University Endothelial cell expression patterns
US20030077829A1 (en) 2001-04-30 2003-04-24 Protiva Biotherapeutics Inc.. Lipid-based formulations
US20050222066A1 (en) * 2001-05-18 2005-10-06 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP1627061B1 (en) 2001-05-18 2009-08-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING CHEMICALLY MODIFIED SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20060211642A1 (en) * 2001-05-18 2006-09-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA inteference mediated inhibition of hepatitis C virus (HVC) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050239731A1 (en) 2001-05-18 2005-10-27 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of MAP kinase gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20070032441A1 (en) 2001-05-18 2007-02-08 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (sina)
DE10131458A1 (de) 2001-06-29 2003-01-09 Aventis Pharma Gmbh Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen zur Therapie von Alterungsprozessen des Herz-Kreislauf Systems
US20030158403A1 (en) 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
DE10133858A1 (de) 2001-07-12 2003-02-06 Aventis Pharma Gmbh Synthetische doppelsträngige Oligonucleotide zur gezielten Hemmung der Genexpression
WO2003012052A2 (en) 2001-07-30 2003-02-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Specific inhibition of gene expression by small double stranded rnas
CN1589403B (zh) 2001-09-18 2011-06-01 法布罗根股份有限公司 测定结缔组织生长因子的方法
US7534774B2 (en) 2001-10-03 2009-05-19 Tissue Repair Company Traversal of nucleic acid molecules through a fluid space and expression in repair cells
US7786094B2 (en) 2001-10-09 2010-08-31 Biopolymer Engineering, Inc. Use of beta-glucans against biological warfare weapons and pathogens including anthrax
US20040248835A1 (en) 2001-10-26 2004-12-09 Anja Krebs Use of a double-stranded ribonucleic acid for treating an infection with a positivestrand rna-virus
JP2005512976A (ja) 2001-10-26 2005-05-12 リボファーマ アーゲー Ｒｎａ干渉により線維化疾患を処置するための医薬
IL161733A0 (en) 2001-11-02 2005-11-20 Insert Therapeutics Inc Methods and compositions for therapeutic use of rna interference
US20040063654A1 (en) 2001-11-02 2004-04-01 Davis Mark E. Methods and compositions for therapeutic use of RNA interference
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
CN1602207A (zh) * 2001-12-11 2005-03-30 法布罗根股份有限公司 抑制眼病理过程的方法
EP1572902B1 (en) 2002-02-01 2014-06-11 Life Technologies Corporation HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES
ATE508188T1 (de) 2002-02-01 2011-05-15 Life Technologies Corp Oligonukleotid-zusammensetzungen mit verbesserter wirksamkeit
ATE416183T1 (de) 2002-02-01 2008-12-15 Univ Mcgill Oligonukleotide mit alternierenden segmenten und deren verwendungen
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
US6923833B2 (en) 2002-04-09 2005-08-02 Ray C. Wasielewski Biologically reabsorbable acetabular constraining components and materials for use with a hip replacement prosthesis and bioreabsorbable materials to augment hip replacement stability and function
WO2003087367A2 (en) 2002-04-18 2003-10-23 Lynkeus Biotech Gmbh Means and methods for the specific inhibition of genes in cells and tissue of the cns and/or eye
US20040014957A1 (en) 2002-05-24 2004-01-22 Anne Eldrup Oligonucleotides having modified nucleoside units
US7148342B2 (en) 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
AU2003260370B2 (en) 2002-08-05 2008-05-22 Silence Therapeutics Gmbh Further novel forms of interfering RNA molecules
WO2004027030A2 (en) 2002-09-18 2004-04-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Efficient reduction of target rna’s by single- and double-stranded oligomeric compounds
US20050020521A1 (en) 2002-09-25 2005-01-27 University Of Massachusetts In vivo gene silencing by chemically modified and stable siRNA
US20040229233A1 (en) 2002-10-16 2004-11-18 Ngk Insulators, Ltd. Human housekeeping genes and human-tissue specific genes
CA2502649A1 (en) 2002-10-18 2004-04-29 Nucleonics Inc. Double-stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
US7309361B2 (en) 2002-10-23 2007-12-18 Wasielewski Ray C Biologic modular tibial and femoral component augments for use with total knee arthroplasty
JP5449639B2 (ja) 2002-11-01 2014-03-19 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア ＨＩＦ−１アルファのｓｉＲＮＡ阻害に関する組成物及び方法
US20040192629A1 (en) 2002-11-04 2004-09-30 University Of Massachusetts Allele-specific RNA interference
US9150605B2 (en) 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation
US7655785B1 (en) 2002-11-14 2010-02-02 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory oligonucleotides and uses thereof
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
JP2006507841A (ja) 2002-11-14 2006-03-09 ダーマコン， インコーポレイテッド 機能的ｓｉＲＮＡおよび超機能的ｓｉＲＮＡ
DE60332277D1 (de) 2002-11-26 2010-06-02 Univ Massachusetts Verabreichung von sirnas
US7217807B2 (en) 2002-11-26 2007-05-15 Rosetta Genomics Ltd Bioinformatically detectable group of novel HIV regulatory genes and uses thereof
WO2004065600A2 (en) 2003-01-17 2004-08-05 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rna interference by palindromic or modified rna molecules
DE10302421A1 (de) 2003-01-21 2004-07-29 Ribopharma Ag Doppelsträngige Ribonukleinsäure mit verbesserter Wirksamkeit
US20040248839A1 (en) 2003-02-05 2004-12-09 University Of Massachusetts RNAi targeting of viruses
US20040162235A1 (en) 2003-02-18 2004-08-19 Trubetskoy Vladimir S. Delivery of siRNA to cells using polyampholytes
US20040167090A1 (en) 2003-02-21 2004-08-26 Monahan Sean D. Covalent modification of RNA for in vitro and in vivo delivery
WO2004078950A2 (en) 2003-03-05 2004-09-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTIVE RNAi MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION IN MAMMAL CELLS
EP1605978B1 (en) 2003-03-07 2010-09-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Therapeutic compositions
US20070054271A1 (en) 2003-03-20 2007-03-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Gene expression in breast cancer
EP1608733B1 (en) 2003-04-02 2011-12-07 Dharmacon, Inc. Modified polynucleotides for use in rna interference
EP2669377A3 (en) 2003-04-17 2015-10-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
WO2004099372A2 (en) 2003-05-01 2004-11-18 University Of Florida Anti-scarring ribozymes and methods
US20060178327A1 (en) 2003-05-30 2006-08-10 Yeung Wah Hin A Inhibition of gene expression by delivery of specially selected double stranded or other forms of small interfering RNA precursors enabling the formation and function of small interfering RNA in vivo and in vitro
ES2864206T3 (es) 2003-06-02 2021-10-13 Univ Massachusetts Métodos y composiciones para mejorar la eficacia y la especificidad del ARNi
US7750144B2 (en) 2003-06-02 2010-07-06 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of RNA silencing
US7405274B2 (en) 2003-06-04 2008-07-29 Fibrogen, Inc. Connective tissue growth factor antibodies
DK3604537T3 (da) 2003-06-13 2022-02-28 Alnylam Europe Ag Dobbeltstrenget ribonukleinsyre med forøget effektivitet i en organisme
US20050026823A1 (en) 2003-06-20 2005-02-03 Biomarin Pharmaceutical Inc. Use of the chaperone receptor-associated protein (RAP) for the delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
AU2004257373B2 (en) 2003-07-16 2011-03-24 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
WO2005019430A2 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Research Development Foundation In vitro selection of aptamer beacons
EP1668130A2 (en) * 2003-09-18 2006-06-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eif4e expression
US20050118625A1 (en) 2003-10-02 2005-06-02 Mounts William M. Nucleic acid arrays for detecting gene expression associated with human osteoarthritis and human proteases
WO2005038013A1 (en) 2003-10-07 2005-04-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Artisense oligonucleotides optimized for kidney targeting
US20080254487A1 (en) 2004-01-16 2008-10-16 Fibrogen, Inc. Connective Tissue Growth Factor Signaling
US20070269889A1 (en) 2004-02-06 2007-11-22 Dharmacon, Inc. Stabilized siRNAs as transfection controls and silencing reagents
US20060069050A1 (en) 2004-02-17 2006-03-30 University Of Massachusetts Methods and compositions for mediating gene silencing
EP1731615A1 (en) 2004-02-20 2006-12-13 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Cytoplasmic localization dna and rna
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
AU2005222902B2 (en) 2004-03-12 2010-06-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. iRNA agents targeting VEGF
US20080300147A1 (en) 2004-03-26 2008-12-04 Nasser Chegini Detection and Treatment of Fibrotic Disorders
KR101147147B1 (ko) 2004-04-01 2012-05-25 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｒｎａ 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드
US20050265957A1 (en) 2004-04-08 2005-12-01 Monahan Sean D Polymerized formamides for use in delivery of compounds to cells
WO2005117938A2 (en) * 2004-04-13 2005-12-15 Regents Of The University Of Minnesota Methods of treating ocular conditions
MXPA06012076A (es) 2004-04-20 2007-01-25 Nastech Pharm Co Metodos y composiciones para mejorar el suministro de arn bicatenario o un acido nucleico hibrido bicatenario para regular la expresion genetica en celulas de mamifero.
US7687616B1 (en) 2004-05-14 2010-03-30 Rosetta Genomics Ltd Small molecules modulating activity of micro RNA oligonucleotides and micro RNA targets and uses thereof
CA2567333C (en) 2004-05-20 2014-11-25 Eden Research Plc Compositions containing a hollow glucan particle or a cell wall particle encapsulating a terpene component, methods of making and using them
AU2005252662B2 (en) 2004-06-03 2011-08-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
ATE536418T1 (de) 2004-06-07 2011-12-15 Protiva Biotherapeutics Inc Lipidverkapselte interferenz-rna
US7740861B2 (en) 2004-06-16 2010-06-22 University Of Massachusetts Drug delivery product and methods
CN105251024A (zh) 2004-08-23 2016-01-20 西伦蒂斯私人股份公司 眼病的治疗
EP1796732B1 (en) 2004-10-01 2013-10-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Modified small interfering rna molecules and methods of use
US20100069620A1 (en) 2004-12-02 2010-03-18 Rxi Pharmaceuticals Corp. Novel compositions of chemically modified small interfering rna
AU2005311684A1 (en) 2004-12-02 2006-06-08 University Of Massachusetts Glucose-transport related genes, polypeptides, and methods of use thereof
EP1827436A4 (en) 2004-12-15 2011-08-10 Merck Sharp & Dohme ACTIVITY INHIBITORS AKT
US20060142228A1 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Ambion, Inc. Methods and compositions concerning siRNA's as mediators of RNA interference
TWI386225B (zh) 2004-12-23 2013-02-21 Alcon Inc 用於治療眼睛病症的結締組織生長因子（ＣＴＧＦ）ＲＮＡ干擾（ＲＮＡｉ）抑制技術
US20060171943A1 (en) 2005-02-01 2006-08-03 Amgen Inc. Compositions and methods of treating fibrotic disorders
WO2006128141A2 (en) 2005-05-27 2006-11-30 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of stromal cell-derived factor-1 (sdf-1) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
WO2007030167A1 (en) 2005-09-02 2007-03-15 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Modification of double-stranded ribonucleic acid molecules
WO2007050643A2 (en) 2005-10-24 2007-05-03 University Of Massachusetts Compositions and their uses for gene therapy of bone conditions
CA2633063A1 (en) 2005-12-16 2007-06-21 Diatos Cell penetrating peptide conjugates for delivering of nucleic acids intocells
US7825099B2 (en) 2006-01-20 2010-11-02 Quark Pharmaceuticals, Inc. Treatment or prevention of oto-pathologies by inhibition of pro-apoptotic genes
US20070231392A1 (en) 2006-01-23 2007-10-04 Ernst Wagner CHEMICALLY MODIFIED POLYCATION POLYMER FOR siRNA DELIVERY
WO2007089607A2 (en) 2006-01-26 2007-08-09 University Of Massachusetts Rna silencing agents for use in therapy and nanotransporters for efficient delivery of same
CN102851291B (zh) 2006-04-03 2016-03-09 斯特拉有限责任公司 包含抗微小rna反义寡核苷酸的药物组合物
ES2390499T3 (es) 2006-06-12 2012-11-13 Opko Pharmaceuticals, Llc Composiciones y métodos para la inhibición de la angiogénesis por sirna
HUE033007T2 (en) 2006-06-23 2017-11-28 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Targeted drug, therapeutic nucleic acid and functional nucleic acid delivery to mammalian cells via intact killed bacterial cells
US20080039415A1 (en) 2006-08-11 2008-02-14 Gregory Robert Stewart Retrograde transport of sirna and therapeutic uses to treat neurologic disorders
CN102614528B (zh) 2006-08-18 2014-02-26 箭头研究公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
WO2008024983A2 (en) 2006-08-24 2008-02-28 Alcon Research, Ltd Rnai-mediated inhibition of gremlin for treatment of iop-related conditions
US8252755B2 (en) 2006-09-22 2012-08-28 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by RNA interference
JP2010507387A (ja) 2006-10-25 2010-03-11 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド 新規のｓｉＲＮＡおよびその使用方法
US20080193443A1 (en) 2006-10-30 2008-08-14 Oxana Beskrovnaya Methods and compositions for the treatment of polycystic diseases
US8039010B2 (en) 2006-11-03 2011-10-18 Allergan, Inc. Sustained release intraocular drug delivery systems comprising a water soluble therapeutic agent and a release modifier
JP2010511692A (ja) * 2006-12-05 2010-04-15 アイゲート ファーマ エスエーエス イオントフォレシスを通じての核酸の強化された網膜送達
WO2008109362A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting vegf gene expression and uses thereof
WO2008109353A1 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting map2k gene expression and uses thereof
US20080311040A1 (en) 2007-03-06 2008-12-18 Flagship Ventures METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMPROVED THERAPEUTIC EFFECTS WITH siRNA
US9884899B2 (en) * 2007-07-06 2018-02-06 Promedior, Inc. Methods for treating fibrosis using CRP antagonists
WO2009020119A1 (ja) 2007-08-06 2009-02-12 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. ＨＩＦ－１αおよびＨＩＦ－２α発現阻害物質含有医薬
WO2009020344A2 (en) 2007-08-06 2009-02-12 Postech Acad Ind Found Small interfering rnas (sirnas) controlling multiple target genes and method for preparing the same
US20090043367A1 (en) 2007-08-09 2009-02-12 Yitzhak Zilberman Apparatus and methods for removing an electronic implant from a body
CA2697043A1 (en) 2007-08-21 2009-02-26 Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation Methods and compositions for treatment or prevention of radiation-induced fibrosis
ES2873350T3 (es) 2007-08-27 2021-11-03 1Globe Health Inst Llc Composiciones de ARN interferente asimétrico y usos de las mismas
CA2702028A1 (en) 2007-10-02 2009-04-09 Rxi Pharmaceuticals Corp. Tripartite rnai constructs
JP5646997B2 (ja) 2007-10-03 2014-12-24 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドＱｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 新規ｓｉＲＮＡ構造
KR100949791B1 (ko) 2007-12-18 2010-03-30 이동기 오프-타겟 효과를 최소화하고 ＲＮＡｉ 기구를 포화시키지않는 신규한 ｓｉＲＮＡ 구조 및 그 용도
WO2009090639A2 (en) * 2008-01-15 2009-07-23 Quark Pharmaceuticals, Inc. Sirna compounds and methods of use thereof
CA2713379A1 (en) 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene
WO2009102427A2 (en) 2008-02-11 2009-08-20 Rxi Pharmaceuticals Corp. Modified rnai polynucleotides and uses thereof
CA2717792A1 (en) 2008-03-07 2009-09-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions for treatment of microrna related diseases
EP2274425A2 (en) 2008-04-11 2011-01-19 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
JP2011527339A (ja) 2008-07-09 2011-10-27 アスプレバ インターナショナル リミテッド 眼障害を処置するためのミコフェノール酸ナトリウムのｐＨ特異的な溶液
US20110218334A1 (en) 2008-07-11 2011-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. PHOSPHOROTHIOATE OLIGONUCLEOTIDES AND NON-NUCLEOSIDIC PHOSPHOROTHIOATES AS DELIVERY AGENTS FOR iRNA AGENTS
JP2011527893A (ja) * 2008-07-15 2011-11-10 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー ＴＧＦ−β受容体遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法
WO2010008582A2 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell drug delivery system
CA2731779A1 (en) 2008-07-24 2010-01-28 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rnai constructs and uses therof
EP3375451A1 (en) 2008-08-25 2018-09-19 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Method for reducing scarring during wound healing using antisense compounds directed to ctgf
EP3081648A1 (en) 2008-08-25 2016-10-19 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides directed against connective tissue growth factor and uses thereof
WO2010027830A2 (en) 2008-08-25 2010-03-11 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulation of connective tissue growth factor expression by administering antisense oligonucleotides through a delivery system so as to reduce scarring from wound healing and threat fibrotic diseases
US8946172B2 (en) 2008-08-25 2015-02-03 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Method for reducing scarring during wound healing using antisense compounds directed to CTGF
EP2346883B1 (en) 2008-09-23 2016-03-23 Scott G. Petersen Self delivering bio-labile phosphate protected pro-oligos for oligonucleotide based therapeutics and mediating rna interference
US8822425B2 (en) 2008-11-14 2014-09-02 Antisense Pharma Gmbh Dosage of oligonucleotides suitable for the treatment of tumors
WO2010059226A2 (en) 2008-11-19 2010-05-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of map4k4 through rnai
SG171952A1 (en) 2008-12-04 2011-07-28 Opko Ophthalmics Llc Compositions and methods for selective inhibition of pro-angiogenic vegf isoforms
WO2010078536A1 (en) * 2009-01-05 2010-07-08 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of pcsk9 through rnai
US9745574B2 (en) 2009-02-04 2017-08-29 Rxi Pharmaceuticals Corporation RNA duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
JP2013512677A (ja) 2009-12-04 2013-04-18 オプコ オプサルミクス、エルエルシー Ｖｅｇｆの阻害のための組成物および方法
WO2011109248A1 (en) 2010-03-02 2011-09-09 Hapten Pharmaceuticals, Llc Effective sensitizing dose of a gelled immunomodulating topical composition
WO2011109698A1 (en) * 2010-03-04 2011-09-09 Rxi Pharmaceuticals Corporation Formulations and methods for targeted delivery to phagocyte cells
RU2615143C2 (ru) 2010-03-24 2017-04-04 Адвирна Самодоставляющие PHKi соединения уменьшенного размера
US9095504B2 (en) 2010-03-24 2015-08-04 Rxi Pharmaceuticals Corporation RNA interference in ocular indications
KR20180044433A (ko) 2010-03-24 2018-05-02 알엑스아이 파마슈티칼스 코포레이션 진피 및 섬유증성 적응증에서의 ｒｎａ 간섭
WO2012106508A1 (en) 2011-02-02 2012-08-09 Pfizer Inc. Method of treating keloids or hypertrophic scars using antisense compounds targeting connective tissue growth factor (ctgf)
US8802839B2 (en) 2011-07-15 2014-08-12 Fibrogen, Inc. Connective tissue growth factor antisense oligonucleotides
US20140072613A1 (en) 2012-09-10 2014-03-13 Cynthia Lander Compositions and Methods for Treating Cutaneous Scarring
EP3079707A4 (en) 2013-12-02 2017-10-18 RXi Pharmaceuticals Corporation Immunotherapy of cancer
JP6883987B2 (ja) 2013-12-04 2021-06-09 フィオ ファーマシューティカルズ コーポレーションＰｈｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ． 化学修飾されたオリゴヌクレオチドを利用する創傷治癒の処置のための方法
EP3137119B1 (en) 2014-04-28 2020-07-01 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating cancer using a nucleic acid targeting mdm2
CA2947619A1 (en) 2014-05-01 2015-11-05 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treatment of disorders in the front of the eye utilizing nucleic acid molecules
CN107073294A (zh) 2014-09-05 2017-08-18 阿克赛医药公司 使用靶向tyr或mmp1的核酸治疗老化和皮肤病症的方法
US20180263925A1 (en) 2014-12-03 2018-09-20 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for the treatment of alopecia areata utilizing gene modulation approaches
EP3277815B1 (en) 2015-04-03 2021-09-22 University of Massachusetts Oligonucleotide compounds for treatment of preeclampsia and other angiogenic disorders
JP6892433B2 (ja) 2015-04-03 2021-06-23 ユニバーシティ・オブ・マサチューセッツＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ 十分に安定化された非対称ｓｉｒｎａ
CA2980337A1 (en) 2015-04-03 2016-10-06 University Of Massachusetts Oligonucleotide compounds for targeting huntingtin mrna
JP6983752B2 (ja) 2015-07-06 2021-12-17 フィオ ファーマシューティカルズ コーポレーションPhio Pharmaceuticals Corp. スーパーオキシドディスムターゼ１（ｓｏｄ１）を標的とする核酸分子
WO2017007825A1 (en) 2015-07-06 2017-01-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treating neurological disorders using a synergistic small molecule and nucleic acids therapeutic approach
US20190029974A1 (en) 2015-09-11 2019-01-31 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treating skin disorders and conditions utilizing haptens
EP3349792A1 (en) 2015-09-14 2018-07-25 Compass Therapeutics LLC Compositions and methods for treating cancer via antagonism of the cd155/tigit pathway and tgf-
CA3002744A1 (en) 2015-10-19 2017-04-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering nucleic acid compounds targeting long non-coding rna
WO2017173453A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Stimuli-responsive nanoparticles for biomedical applications
JP7167059B2 (ja) 2017-04-19 2022-11-08 フィオ ファーマシューティカルズ コーポレーション 核酸化合物の局所送達
AU2018313149A1 (en) 2017-08-07 2020-03-05 Phio Pharmaceuticals Corp. Chemically modified oligonucleotides

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004064760A2 (en) * 2003-01-21 2004-08-05 Archemix Corp. Aptamer therapeutics useful in ocular pharmacotherapy
WO2010033247A2 (en) * 2008-09-22 2010-03-25 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering rnai compounds

Also Published As

Publication number Publication date
US20190233826A1 (en) 2019-08-01
EP2550001B1 (en) 2019-05-22
US10184124B2 (en) 2019-01-22
US20210062195A1 (en) 2021-03-04
CN106074591A (zh) 2016-11-09
JP2016193913A (ja) 2016-11-17
JP2018150328A (ja) 2018-09-27
US10662430B2 (en) 2020-05-26
JP6335968B2 (ja) 2018-05-30
EP3578183A1 (en) 2019-12-11
US20160115482A1 (en) 2016-04-28
EP3578183B1 (en) 2021-09-08
JP2013523650A (ja) 2013-06-17
CA2794187A1 (en) 2011-09-29
CN103200945A (zh) 2013-07-10
JP5940054B2 (ja) 2016-06-29
US11584933B2 (en) 2023-02-21
US9095504B2 (en) 2015-08-04
US20130131142A1 (en) 2013-05-23
JP6815457B2 (ja) 2021-01-20
JP2020023498A (ja) 2020-02-13
EP2550001A1 (en) 2013-01-30
CN103200945B (zh) 2016-07-06
WO2011119871A1 (en) 2011-09-29
CA2794187C (en) 2020-07-14
EP2550001A4 (en) 2015-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11584933B2 (en) RNA interference in ocular indications
JP6899811B2 (ja) 皮膚および線維症適用におけるｒｎａ干渉
US11279934B2 (en) Methods for treating cancer using nucleic acids targeting MDM2 or MYCN
US20170051290A1 (en) Methods for treatment of disorders in the front of the eye utilizing nucleic acid molecules
EP3077050B1 (en) Methods for treatment of wound healing utilizing chemically modified oligonucleotides
JP6983752B2 (ja) スーパーオキシドディスムターゼ１（ｓｏｄ１）を標的とする核酸分子
JP2018502837A (ja) 遺伝子調節アプローチを用いた円形脱毛症の処置方法
JP5940054B6 (ja) 眼への適用におけるｒｎａ干渉

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: Massachusetts, USA

Applicant after: Fio Pharmaceutical Company

Address before: Massachusetts, USA

Applicant before: Rxi Phrmaceuticals Corp.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant