ES2864206T3 - Métodos y composiciones para mejorar la eficacia y la especificidad del ARNi - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro para mejorar la eficacia de un dúplex de ARNip, comprendiendo el dúplex de ARNip una cadena sentido y una cadena antisentido, que comprende disminuir la fuerza del par de bases entre el extremo 5' de la cadena antisentido (5' de AS) y el extremo 3' de la cadena sentido (3' de S) en comparación con la fuerza del par de bases entre el extremo 3' de la cadena antisentido (3' de AS) y el extremo 5' de la cadena sentido (5' de S), de tal manera que se mejore la eficacia, en el que la fuerza del par de bases se reduce debido a al menos un par de bases desemparejados entre el extremo 5' de AS el extremo 3' de S, y además, en el que el extremo 5' de las cadenas antisentido y sentido son los cinco nucleótidos en los terminales 5' de las cadenas respectivas, y en el que la cadena antisentido tiene una secuencia suficientemente complementaria a un ARNm diana para desencadenar la destrucción del ARNm diana por la maquinaria o el proceso de ARNi, en el que el ARNm diana especifica la secuencia de aminoácidos de una proteína asociada con una afección patológica.
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para mejorar la eficacia y la especificidad del ARNi
Antecedentes de la invención
Dos tipos de ARN de ~21 nt desencadenan el silenciamiento génico postranscripcional en animales: ARN de interferencia pequeños (ARNip) y microARN (miARN). Tanto los ARNip como los miARN se producen mediante la escisión de precursores de ARN bicatenario (ARNbc) por Dicer, una de la familia de RNasa III de las endonucleasas específicas de ARNbc (Bernstein et al., 2001; Billy et al., 2001; Grishok et al., 2001; Hutvagner et al., 2001; Ketting et al., 2001; Knight y Bass, 2001; Paddison et al., 2002; Park et al., 2002; Provost et al., 2002; Reinhart et al., 2002; Zhang et al., 2002; Doi et al., 2003; Myers et al., 2003). Los ARNip se producen cuando los transposones, virus o genes endógenos expresan ARNbc largo o cuando el ARNbc se introduce experimentalmente en células vegetales o animales para desencadenar el silenciamiento génico, un proceso conocido como ARN de interferencia (ARNi) (Fire et al., 1998; Hamilton y Baulcombe, 1999; Zamore et al., 2000; Elbashir et al., 2001a; Hammond et al., 2001; Sijen et al., 2001; Catalanotto et al., 2002). Por el contrario, los miARN son productos de genes endógenos no codificantes cuyas transcriptos de ARN precursor pueden formar pequeños bucles de tallo a partir de los cuales Dicer escinde los miARN maduros (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee y Ambros, 2001; Lagos-Quintana et al., 2002; Mourelatos et al., 2002; Reinhart et al., 2002; Ambros et al., 2003; Brennecke et al., 2003; Lagos-Quintana et al., 2003; Lim et al., 2003a; Lim et al., 2003b). Los miARN están codificados en genes distintos de los ARNm cuya expresión controlan.
Los ARNip se identificaron por primera vez como los determinantes de especificidad de la ruta del ARN de interferencia (ARNi) (Hamilton y Baulcombe, 1999; Hammond et al., 2000), que actúan como guías para dirigir la escisión endonucleolítica de sus ARN diana (Zamore et al., 2000; Elbashir et al., 2001a). Los dúplex de ARNip prototípicos son ARN bicatenarios de 21 nt que contienen 19 pares de bases, con extremos salientes 3' en dos nucleótidos (Elbashir et al., 2001a; Nykanen et al., 2001; Tang et al., 2003). Los ARNip activos contienen fosfatos 5' e hidroxilos 3' (Zamore et al., 2000; Boutla et al., 2001; Nykanen et al., 2001; Chiu y Rana, 2002). De manera similar, los miARN contienen grupos fosfato 5' e hidroxilo 3', lo que refleja su producción por Dicer (Hutvagner et al., 2001; Mallory et al., 2002).
En las plantas, los miARN regulan la expresión de proteínas importantes para el desarrollo, a menudo dirigiendo la escisión del ARNm (Rhoades et al., 2002; Reinhart et al., 2002; Llave et al., 2002a; Llave et al., 2002b; Xie et al., 2003; Kasschau et al., 2003; Tang et al., 2003; Chen, 2003). Mientras que los miARN de plantas muestran un alto grado de complementariedad con sus dianas de ARNm, los miARN de animales solo tienen una complementariedad limitada con los ARNm cuya expresión controlan (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993; Olsen y Ambros, 1999; Reinhart et al. al., 2000; Slack et al., 2000; Abrahante et al., 2003; Brennecke et al., 2003; Lin et al., 2003; Xu et al., 2003). Se cree que los miARN de animales reprimen la traducción del ARNm, en lugar de promover la destrucción del ARNm diana (Lee et al., 1993; Wrightman et al., 1993; Olsen y Ambross, 1999; Brennecke et al., 2003). La evidencia reciente sugiere que las dos clases de ARN pequeños son funcionalmente intercambiables, con la elección de la escisión del ARNm o la represión traduccional determinada únicamente por el grado de complementariedad entre el ARN pequeño y su diana (Hutvagner y Zamore, 2002; Doench et al., 2003). Además, los ARNip y los miARN se encuentran en complejos similares, si no idénticos, lo que sugiere que un solo complejo bifuncional, el complejo silenciador inducido por ARN (RISC), media tanto la escisión como el control de la traducción (Mourelatos et al., 2002; Hutvagner y Zamore, 2002; Caudy et al., 2002; Martinez et al., 2002). No obstante, los estudios en plantas y animales muestran que en el estado estacionario, los ARNip y los miARN difieren en al menos un aspecto crucial: in vivo e in vitro, los ARNip son bicatenarios, mientras que los miARN son monocatenarios (Lee et al., 1993; Hamilton y Baulcombe, 1999; Pasquinelli et al., 2000; Reinhart et al., 2000; Elbashir et al., 2001a; Djikeng et al., 2001; Nykanen et al., 2001; Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee y Ambros, 2001; Lagos-Quintana et al., 2002; Reinhart et al., 2002; Llave et al., 2002a; Silhavy et al., 2002; Llave et al., 2002b; Tang et al., 2003).
Los dúplex de ARNip pueden ensamblarse en RISC en ausencia de ARNm diana, tanto in vivo como in vitro (Tuschl et al., 1999; Hammond et al., 2000; Zamore et al., 2000). Cada RISC contiene sólo una de las dos cadenas del dúplex de ARNip (Martinez et al., 2002). Dado que los dúplex de ARNip no tienen conocimiento previo de qué cadena de ARNip guiará la escisión de la diana, ambas cadenas deben ensamblarse con las proteínas apropiadas para formar un RISC. Anteriormente, nosotros y otros demostramos que ambas cadenas de ARNip son competentes para dirigir ARNi (Tuschl et al., 1999; Hammond et al., 2000; Zamore et al., 2000; Elbashir et al., 2001b; Elbashir et al., 2001a; Nykanen et al., 2001). Es decir, la cadena antisentido de un ARNip puede dirigir la escisión de una diana de ARN sentido correspondiente, mientras que la cadena de ARNip sentido dirige la escisión de una diana antisentido. De esta forma, los dúplex de ARNip parecen ser funcionalmente simétricos. La capacidad de controlar qué cadena de un dúplex de ARNip entra en el complejo RISC para dirigir la escisión de una diana de ARN correspondiente proporcionaría un avance significativo tanto para la investigación como para las aplicaciones terapéuticas de la tecnología de ARNi. El documento W02004/080406 divulga modificaciones de alquilo 2'-0 asimétricas de la cadena sentido y modificaciones de fosforotioato asimétricas concomitantes de la cadena antisentido de agentes inhibidores de ARN. Amarzguioui et al. (Nucleic Acid Res. 2003, Vol. 31 (2): 589-595) describen la mutación de un ARNip mediante la introducción de una o dos transversiones G/C, que, sin embargo, no dieron como resultado un par de bases no emparejado y redujeron la resistencia del par de bases. El documento WO03/064621 se refiere a dúplex de ARNip
cuyos extremos difieren en sus contenidos de G a C. Paddison et al., (Genes and Develop. 2002, Vol. 16 (8): 948-958) describen en la Figura 3A dos pares de bases no emparejadas a cada lado de una molécula de T7ARNip, lo que no conduce a una disminución de la fuerza del par de bases entre el extremo 5' de AS y el extremo 3' de S debido a al menos un par de bases no emparejadas. Hutvánger et al., (Science, 2002, Vol. (297 (5589): 2056-2060) describen Let-7 como miARN regulador. La técnica anterior no divulga un dúplex de ARNip en el que la fuerza del par de bases entre el extremo 5' de AS y el extremo 3' de S se reduce en comparación con la fuerza del par de bases entre el extremo 3' de AS y el extremo 5' de S debido a al menos un par de bases no emparejadas entre el extremo 5' de AS y el extremo 3' de S.
Sumario de la invención
Una etapa clave en el ARN de interferencia (ARNi) es el ensamblaje de un complejo proteína-ARN catalíticamente activo, el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que media la escisión del ARN diana. La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que las dos cadenas de un dúplex de ARNip no contribuyen por igual al ensamblaje de RISC. Más bien, tanto la estabilidad absoluta como la relativa de los pares de bases en los extremos 5' de las dos cadenas de ARNip determinan el grado en el que cada cadena participa en la ruta del ARNi. De hecho, el ARNip puede ser funcionalmente asimétrico, y solo una de las dos cadenas puede activar el ARNi. La presente invención también se basa en el descubrimiento de que los miARN monocatenarios se generan inicialmente como dúplex de tipo ARNip cuyas estructuras predestinan una cadena a entrar en el RISC y la otra cadena a ser destruida. Este hallazgo ayuda a explicar la biogénesis de los miARN monocatenarios; la cadena de miARN de un compuesto intermedio similar al dúplex de ARNip de corta vida se ensambla en un complejo de RISC, lo que hace que los miARN se acumulen in vivo como ARN monocatenarios.
La presente invención se basa además en el descubrimiento de que RISC puede escindir dianas de ARN con hasta cinco desemparejamientos contiguos en el extremo 5' del ARNip y ocho desemparejamientos en el extremo 3' del ARNip, lo que indica que las bases 5' contribuyen desproporcionadamente a la unión del ARN diana, pero no juegan un papel en la determinación de la velocidad catalítica, kcat. Este hallazgo explica cómo funcionan las secuencias 5', central y 3' de la cadena guía de ARNip para dirigir la escisión de la diana.
La invención se basa además en el descubrimiento de que las bases 3' del ARNip contribuyen mucho menos que las bases 5' a la fuerza general de unión, pero en cambio ayudan a establecer la geometría helicoidal requerida para la escisión de la diana mediada por RISC, consistente con el punto de vista de que la catálisis por RISC requiere una hélice en forma de A central (Chiu et al., 2003). Este hallazgo indica que la complementariedad es esencial para la represión de la traducción mediante ARNip modificados para actuar como miARN de animales, que normalmente reprimen la traducción (Doench et al., 2004).
La presente invención se basa además en el descubrimiento de que cuando un ARNip no se empareja con los primeros tres, cuatro o cinco nucleótidos del ARN diana, el enlace fosfodiéster cortado en el ARN diana no cambia; para ARNip perfectamente emparejado, RISC mide el sitio de escisión desde el extremo 5' del ARNip (Elbashir et al., 2001; Elbashir et al., 2001). Este hallazgo indica que la identidad del fosfato escindible se determina antes del encuentro del RISC con su ARN diana, quizás porque la endonucleasa de RISC se posiciona con respecto al extremo 5' del ARNip durante el ensamblaje de RISC.
Por consiguiente, la presente invención presenta métodos para mejorar la eficacia y especificidad de ARNi. También se proporciona un método para disminuir el silenciamiento de una diana inadvertida por un agente de ARNi. La invención presenta además composiciones, que incluyen ARNip, ARNhp, así como vectores y transgenes, para mediar ARNi. Los agentes de ARNi de la invención tienen una especificidad y eficacia mejoradas en la mediación del silenciamiento de un gen diana.
Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. ARNi mediado ARNip monocatenario y por dúplex asimétrico. (A) Esquema que muestra porciones relevantes de las secuencias de ARN diana sentido y antisentido. (B) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip y el gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (C) Esquema que muestra las secuencias de ARNip de cadenas sencillas individuales y gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas sencillas. (D) Gráfico de barras que representa la fracción del ARNip total presente como monocatenario. (E) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que contiene un par de bases oscilantes G:U y un gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido.
Figura 2. ARNi mediado por ARNip dúplex asimétrico. (A) Esquema que muestra porciones relevantes de las secuencias de ARN diana sentido y antisentido. (B) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip y el gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (C) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que contiene el desemparejamiento de A:U y un gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas
antisentido y sentido. (D) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que contiene el desemparejamiento de G:U y gráfico que representa el a Rní mediado por las cadenas antisentido y sentido. (E) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que contiene el desemparejamiento de C:A y un gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido.
Figura 3. ARNi mediado por ARNip dúplex asimétrico. (A) Esquema que muestra porciones relevantes de las secuencias de ARN diana sentido y antisentido. (B) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip y el gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (C) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que contiene el desemparejamiento de A:G y un gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (D) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que contiene el desemparejamiento de C:U y gráfico que representa el a Rní mediado por las cadenas antisentido y sentido. (E) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que contiene un par de bases A:U y un gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (F) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que contiene el desemparejamiento de A:G y un gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (G) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que contiene un desemparejamiento de C:U y un gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (H) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que contiene un par de bases A:U y un gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (I) Esquema de cadenas sencillas individuales de ARNip y gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas sencillas individuales.
Figura 4. ARNi mediado por ARNip dúplex asimétrico que contienen inosina. (A) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que tiene inosina en el extremo 5' de la cadena sentido y gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (B) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que tiene inosina en el extremo 5' de la cadena antisentido y gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (C) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que contiene inosina en ambas cadenas y gráfico que representa ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (D) Esquema que muestra cadenas de ARNip individuales que contienen inosina y gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas sencillas individuales.
Figura 5. Escisión simétrica de pre-let-7 por Dicer. (A) Análisis de los productos de escisión producidos en el lado 5' del tallo precursor (let-7). (B) Análisis de los productos de escisión producidos en el lado 3' del tallo precursor (let-7*). (C) Fragmentación conceptual de pre-let-7 a un ARNip de pre-let-7 deducido.
Figura 6. Análisis de genes de miARN de Drosophila para miARN y miARN* predichos. (A) Fragmentación conceptual de 26 genes de miARN de Drosophila publicados a un ARNip dúplex deducido. (B) Cantidades de miR-10 y miR-10* detectadas in vivo.
Figura 7. Esquema que representa el mecanismo de ensamblaje de RISC a partir de pre-miARN o ARNbc.
Figura 8. Reducción del silenciamiento fuera de la diana por cadena sentido. (A) Secuencias de ARN diana sentido y antisentido sod1. (B) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip y el gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (C) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que contiene un par de bases oscilantes G:U y un gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (D) Esquema que muestra cadenas individuales de ARNip y gráfico que representa ARNi mediado por las cadenas sencillas individuales. (E) Análisis termodinámico de los extremos 5' de la cadena de ARNip para el dúplex de ARNip en (B). Se calculó AG (kcal/mol) en NaCl 1 M a 37 °C.
Figura 9. Mejora del silenciamiento por cadena antisentido. (A) Esquema que muestra porciones relevantes de las secuencias de ARN diana sentido y antisentido. (B) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip y el gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (B) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que contiene un par de bases A:U y un gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (C) Esquema que muestra la secuencia dúplex de ARNip que contiene el desemparejamiento de A:G y un gráfico que representa el ARNi mediado por las cadenas antisentido y sentido. (D) Análisis termodinámico de los extremos 5'de la cadena de ARNip para el dúplex de ARNip en (B). Se calculó AG (kcal/mol) en NaCl 1 M a 37 °C.
Figura 10. La estabilidad termodinámica relativa de los primeros cuatro pares de bases de las cadenas de ARNip explica la asimetría funcional de ARNip. Análisis termodinámico de los extremos 5' de la cadena de ARNip para los ARNip en las Figuras 1B e 1E. Se calculó AG (kcal/mol) en NaCl 1 M a 37 °C.
Figura 11. Los primeros cuatro pares de bases del dúplex de ARNip determinan la actividad específica de la cadena. Los desemparejamientos internos de un solo nucleótido (A-F) cerca de los extremos 5' de una cadena de ARNip generan asimetría funcional, pero los pares de oscilación G:U internos (G-I) no lo hacen.
Figura 12. Mayor tasa de eficiencia de ARNip cuando los dúplex tienen colas desemparejadas de dTdT.
Figura 13. La liberación de producto limita la tasa de catálisis por RISC. (a) El ATP estimula múltiples rondas de escisión de RISC del ARN diana. Se incubó ARNip con ATP en lisado de embrión de Drosophila, luego se añadió
NEM para inactivar el ensamblaje de RISC y para inhabilitar el sistema de regeneración de ATP. El sistema de regeneración de energía se restauró agregando creatina quinasa adicional (+ ATP) o la reacción se agotó en ATP agregando hexoquinasa y glucosa (-ATP). La concentración de ARN diana fue 49 nM y la concentración de RISC fue ~ 4 nM. La secuencia de ARNip se muestra en la Figura 21. (b) En ausencia de ATP, la escisión por RISC produce una ráfaga de estado peestacionario igual, dentro del error, a la concentración de RISC activo. La concentración diana fue 110 nM y la concentración de RISC fue ~ 4 nM. (c) La catálisis por RISC no es mejorada por ATP bajo condiciones de rotación única. RISC estaba presente en un exceso de ~ 8 veces sobre la diana. Cada punto de datos representa el promedio de dos ensayos.
Figura 14. En ausencia de ATP, los desemparejamientos entre el extremo 3' de la cadena guía de ARNip y el ARN diana facilitan la liberación del producto, pero reducen la velocidad de escisión de la diana. (a) Se muestran secuencias de ARNip representativas alineadas con la secuencia diana. La cadena guía de ARNip es de color (5' a 3') y el desemparejamiento con el sitio diana está resaltado en amarillo. En la Figura 21 aparece una lista completa de secuencias de ARNip. (b) Se determinó la velocidad de escisión en estado estacionario en presencia y ausencia de ATP para ARNip con cero a cuatro desemparejamientos en 3' con el sitio diana. La concentración de ARN diana fue 49 nM y la concentración de RISC fue ~ 4 nM (sin desemparejamientos) o ~ 6 nM (1 a 4 desemparejamientos). La velocidad de estado estacionario con ATP, relativa a la velocidad sin ATP, se muestra para cada ARNip. (c) Transcurso de tiempo de la escisión para ARNip perfectamente emparejado (exceso de RISC ~ 16 veces con respecto a la diana) y desemparejado (exceso de ~ 80 veces de RISC). (d) Datos representativos de los usados en el análisis en (c) para la escisión de la diana dirigida por ARNip con cero, cuatro y cinco desemparejamientos en 3'.
Figura 15. Tolerancia notable de RISC para desemparejamientos 3'. (a) Cada desemparejamiento 3' adicional redujo aún más la velocidad de escisión por RISC. Las tasas de escisión en estado estacionario se determinaron para ARNip con cero, uno, dos y cuatro desemparejamientos en condiciones de recambio múltiple (ARNm diana ~ 49 nM y RISC ~ 4-6 nM). (b) Análisis de ARNip que tienen de cero a cinco desemparejamientos de 3' con el ARN diana en condiciones de ligero exceso de enzima (~ 2 veces más RISC que diana). Las secuencias de ARNip utilizadas en (a) y (b) se muestran en la Figura 14A y la Figura 21. (c) El análisis de punto final extendido de la escisión de RISC en condiciones de un exceso de enzima de ~80 veces revela que la escisión puede ocurrir para los ARNip con hasta ocho desemparejamientos con el ARN diana. Téngase en cuenta las diferentes escalas de tiempo en (c) versus (b). Todas las reacciones se realizaron en condiciones estándar de ARNi (+ATP) in vitro.
Figura 16. Tolerancia limitada de RISC para desemparejamientos 5'. (a) La escisión de RISC se analizó como en la Figura 21C usando ARNip desemparejados 5', cuyas secuencias se dan en la Figura 21. El ARN diana fue el mismo para todos los ARNip. (b) La escisión de RISC se analizó usando una única secuencia de ARNip. Los desemparejamientos se crearon alterando la secuencia del ARN diana. Para la diana que contiene mutaciones compensatorias, la concentración diana fue 0,25 nM y la concentración de ARNip fue ~ 20 nM; no se determinó la concentración de RISC. El asterisco denota un punto de tiempo de 15 segundos. (c) La escisión de RISC se analizó incubando ARNip 50 nM con ARN diana 0,5 nM. Se crearon desemparejamientos 3' modificando la secuencia diana, y desemparejamientos 5' cambiando el ARNip. Las secuencias diana y ARNip se dan en la Figura complementaria 3. (d) Los ARNip perfectamente emparejados y desemparejados en 5' dirigen la escisión en el mismo enlace fosfodiéster. Las reacciones de escisión se realizaron con RISC ~ 20 nM generado a partir de ARNip 50 nM y ARN diana 0,5 nM y se analizaron en un gel de secuenciación de poliacrilamida desnaturalizante al 8%. El ARNm diana era de 182 nucleótidos y el producto de escisión en 5' era de 148 nt. Después de ensamblar RISC, el extracto se trató con NEM para inactivar las nucleasas (Schwartz et al., 2004). Después del tratamiento con NEM, se restauró el sistema de regeneración de ATP agregando creatina quinasa adicional, luego se agregó ARN diana y la incubación continuó durante el tiempo indicado. OH- denota una escalera de hidrólisis básica.
Figura 17. El análisis de Michaelis-Menten y Ki para ARNip emparejados y desemparejados revela distintas contribuciones a la unión y catálisis para las regiones 5', central y 3' del ARNip. (a) Se ensambló ARNip en RISC en condiciones estándar de ARNi in vitro, luego se diluyó para lograr la concentración de RISC deseada. Las velocidades iniciales de escisión se determinaron para concentraciones crecientes de ARNm diana protegido y radiomarcado con 32P en 5'. Gráfico de velocidad inicial frente a la concentración de sustrato. KM y Vmáx. se determinaron ajustando los datos a la ecuación de Michaelis-Menten. Véase la Tabla 1 para el análisis. Las determinaciones representativas de la velocidad inicial aparecen en la Figura 20A. (b) Los valores de Ki se determinaron en ensayos de competición usando oligonucleótidos 2'-O-metilo que tienen desemparejamientos 5', central y 3' con la cadena guía de ARNip. Los datos representativos se presentan en la Figura 20B, y una lista completa de los oligonucleótidos 2'-O-metilo usados aparece en la Figura 21.
Figura 18. Un modelo para el ciclo de ensamblaje de RISC, reconocimiento de la diana, catálisis y reciclaje.
Figura 19. El RISC programado exógenamente es una enzima auténtica. Se ensambló ARNip en RISC durante 1 hora en una reacción estándar de ARNi in vitro, luego se inactivó el ensamblaje con N-etil maleimida (NEM)2129. La cantidad de RISC formada se determinó midiendo el ARNip radiomarcado con 32P retenido en un oligonucleótido 2'-O-metilo enlazados de 31 nt, biotinilado en 5', complementario a la cadena guía del ARNip. RISC se une esencialmente de manera irreversible a los oligonucleótidos 2'-O-metilo enlazados, pero no puede escindir estos análogos de ARN (Hutvagner et al., 2004; Schwartz et al., 2003). En todos los experimentos, no se detectó actividad de escisión de la
diana en el sobrenadante, lo que demuestra que todo el RISC activo se retuvo en las perlas. (a) Secuencia del ARNip utilizada (cadena guía en rojo, marcada en forma radioactiva con 32P con un asterisco). Let-7 de Drosophila no se expresa en embriones de 0 a 2 horas (Hutvagner et al., 2001), por lo que la única fuente de let-7 en las reacciones in vitro fue el ARNip exógeno de let-7. Se predice que el extremo 5' de la cadena guía del ARNip de let-7 será termodinámicamente más estable que el extremo 5' de la cadena pasajera, lo que explica por qué solo se forman concentraciones bajas de RISC programado con let-7 (Schwartz et al., 2003, Khvorova et al., 2003). La cantidad máxima de RISC ensamblada varía ampliamente con la secuencia de ARNip. Los ARNip utilizados en las Figuras 3 8 se diseñaron para cargar = 5 veces más RISC que contiene cadena guía (Hutvagner et al., 2001; Schwartz et al., 2003). (b) Gel representativo que confirma que el RISC fue eliminado por el oligonucleótido 2'-O-metilo ligado. Se comparó una reacción antes de la incubación con el oligonucleótido 2'-O-metilo ligado (pre) con el sobrenadante de una reacción incubada con perlas únicamente (simulacro), y el sobrenadante de la reacción incubada con el oligonucleótido de 2'-O-metilo ligado complementario (post). La reacción tampón no contenía ARNip. (c) Análisis de la cantidad de RISC ensamblado a diversas concentraciones de ARNip. Se incubó ARNip radiomarcado con 32P en 5' con lisado durante 1 hora, luego se inactivaron las reacciones mediante tratamiento con NEM y se midió la concentración de RISC usando el método del oligonucleótido 2'-O-metilo ligado.
Figura 20. Análisis de Michaelis-Menten y competidor de RISC (a) Datos representativos para la determinación de las velocidades iniciales para el ARNip perfectamente emparejado. Negro, diana 1 nM; rojo, 5 nM; azul, 20 nM; y verde, 60 nM. (b) Tres experimentos independientes para la inhibición por un competidor del oligonucleótido 2'-O-metilo completamente complementario. Se incubaron RISC ~1 nM y ARNm diana protegido y radiomarcado con 32P 5 nM con una concentración creciente de competidor, y se calcularon las velocidades iniciales y se representaron gráficamente frente a la concentración del competidor.
Figura 21. ARNip, sitios diana y oligonucleótidos 2'-O-metilo usados en este estudio. Tabla 1 Análisis cinético de RISC.
Descripción detallada de la invención
Una etapa clave en el ARN de interferencia (ARNi) es el ensamblaje de un complejo proteína-ARN catalíticamente activo, el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que media la escisión del ARN diana. Cada RISC contiene una de las dos cadenas del dúplex de ARN de interferencia pequeño (ARNip) que desencadena el ARNi. La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que las dos cadenas de ARNip no contribuyen por igual al ensamblaje de RISC. Se descubrió que los pequeños cambios en la secuencia de ARNip tienen efectos profundos y predecibles sobre el grado en que las dos cadenas de un dúplex de ARNip entran en la ruta de ARNi, un fenómeno denominado "asimetría" funcional de ARNip. Los descubrimientos descritos en este documento revelan que la fuerza de las interacciones de emparejamiento de bases realizadas por el extremo 5' de cada cadena de ARNip con la región 3' de la cadena a la que está emparejada determina cuál de las dos cadenas participa en la ruta del ARNi. El ensamblaje de RISC parece estar gobernado por una enzima que inicia el desenrollamiento de un dúplex de ARNip en la cadena de ARNip cuyo extremo 5' está menos firmemente emparejado con la cadena de ARNip complementaria.
Sorprendentemente, tales dúplex de ARNip altamente asimétricos se parecen a los compuestos intermedios propuestos en la ruta de la biogénesis de microARN (miARN) (Hutvagner y Zamore, 2002; Reinhart et al., 2002; Lim et al., 2003b). Los miARN son ARN monocatenarios endógenos de ~ 21 nt procesados por Dicer a partir de precursores de ARN de tallo-bucle que regulan la expresión génica en animales y plantas. Una característica sorprendente de los precursores de miARN es su falta de complementariedad total en la región del tallo. Los descubrimientos presentados en este documento indican un papel importante para las discontinuidades en la región del tallo de los miARN; es probable que los miARN se generen inicialmente a partir de sus ARN precursores como dúplex similares a ARNip, y que la estructura de estos dúplex predestine la cadena de miARN para que entre en el RISC y la otra cadena sea destruida. Por lo tanto, la naturaleza parece haber optimizado la porción del tallo de los miARN para seguir un conjunto de reglas que dictan qué cadena ingresa al complejo RISC.
Los descubrimientos hechos por los presentes inventores proporcionan reglas de acuerdo con las cuales se pueden diseñar ARNip y ARNhp que son completamente asimétricos, con solo una de las dos cadenas de ARNip competente para entrar en el complejo RISC. Aplicando estas reglas a la selección y diseño de un agente de ARNi dirigido, por ejemplo, ARNip y ARNhp, la cadena antisentido del agente de ARNi puede dirigirse de manera predecible para que entre en el complejo RISC y medie la escisión del ARN diana. De manera similar, se puede evitar que la cadena sentido entre al complejo RISC, reduciendo o eliminando así el silenciamiento no deseado de una diana inadvertida por la cadena sentido.
De acuerdo con un primer aspecto, la invención proporciona un método in vitro para mejorar la eficacia de un dúplex de ARNip, comprendiendo el dúplex de ARNip una cadena sentido y una antisentido, que comprende disminuir la fuerza del par de bases entre el extremo 5' de la cadena antisentido (5' de AS) y el extremo 3' de la cadena sentido (3' de S) en comparación con la fuerza del par de bases entre el extremo 3' de la cadena antisentido (3' de AS) y el extremo 5' de la cadena sentido (5' de S), de manera que la eficacia se mejora, en el que la fuerza del par de bases se reduce debido a al menos un par de bases desemparejadas entre el extremo 5' de AS y el extremo 3' de S, y además en el que el extremo 5' de las cadenas antisentido y sentido son los cinco nucleótidos en los terminales 5' de las respectivas cadenas, y en el que la cadena antisentido tiene una secuencia suficientemente complementaria a un
ARNm diana para desencadenar la destrucción del ARNm diana por la maquinaria o proceso del ARNi, en el que el ARNm diana especifica la secuencia de aminoácidos de una proteína asociada con una afección patológica.
También se divulga, pero no forma parte de la invención, un método para promover la entrada de una cadena deseada de un dúplex de ARNip en un complejo RISC, que comprende mejorar la asimetría del dúplex de ARNip, de modo que se promueva la entrada de la cadena deseada. La asimetría se puede mejorar disminuyendo la fuerza del par de bases entre el extremo 5' de la cadena deseada y el extremo 3' de una cadena complementaria del dúplex en comparación con la fuerza del par de bases entre el extremo 3' de la cadena deseada y el extremo 5' de la cadena complementaria.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un dúplex de ARNip para su uso en terapia que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en el que la fuerza del par de bases entre el extremo 5' de la cadena antisentido (5' de AS) y el extremo 3' de la cadena sentido (3' de S) es menor que la fuerza del par de bases entre el extremo 3' de la cadena antisentido (3' de AS) y el extremo 5' de la cadena sentido (5' de S), de modo que la cadena antisentido guía preferentemente la escisión de un ARNm diana, en el que el extremo 5' de las cadenas antisentido y sentido es de cinco nucleótidos en los terminales 5' de las cadenas respectivas, en las que la cadena antisentido tiene una secuencia suficientemente complementaria al ARNm diana para desencadenar la destrucción del ARNm diana por la maquinaria o proceso de ARNi, y en el que el ARNm diana especifica la secuencia de aminoácidos de una proteína asociada con una afección patológica.
La fuerza del par de bases es menor debido a al menos un par de bases desemparejada entre el extremo 5' de la primera cadena o cadena antisentido y el extremo 3' de la segunda cadena o cadena sentido. Preferiblemente, el par de bases no emparejadas se selecciona del grupo que consiste en G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C y U:U.
El agente de ARNi puede ser un dúplex de ARNip o se deriva de un precursor modificado y puede sintetizarse químicamente o sintetizarse enzimáticamente.
También se describen composiciones que comprenden un dúplex de ARNip de la invención formuladas para facilitar la entrada del dúplex de ARNip en una célula. También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden un dúplex de ARNip de la invención.
Se describe además un pre-miARN modificado que comprende el dúplex de ARNip de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, así como un vector que codifica el pre-miARN. También se describen un pre-miARN que comprende el pre-miARN, así como un vector que codifica el pre-miARN.
También se presentan en la presente invención el ARN de horquilla pequeño (ARNhp) que comprende una secuencia de nucleótidos idéntica a la cadena sentido y antisentido del dúplex de ARNip de cualquiera de las reivindicaciones anteriores. En una realización, la secuencia de nucleótidos idéntica a la cadena sentido está secuencia arriba de la secuencia de nucleótidos idéntica a la cadena antisentido. En otra realización, la secuencia de nucleótidos idéntica a la cadena antisentido está cadena arriba de la secuencia de nucleótidos idéntica a la cadena sentido. Se describen además vectores y transgenes que codifican los ARNhp de la invención.
También se describen células que comprenden los vectores presentados en la presente invención. Preferiblemente, la célula es una célula de mamífero, por ejemplo, una célula humana.
También se describen, pero no forman parte de la invención, métodos para mejorar el silenciamiento de un ARNm diana, que comprende poner en contacto una célula que tiene una ruta de ARNi con el agente de ARNi de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en condiciones tales que se mejore el silenciamiento.
También se describen, pero no forman parte de la invención, métodos para mejorar el silenciamiento de un ARNm diana en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende el agente de ARNi de cualquiera de las reivindicaciones anteriores de manera que se mejore el silenciamiento.
Se describe además, pero no forma parte de la invención, un método para disminuir el silenciamiento de un ARNm diana inadvertido por un agente de ARNibc, comprendiendo el agente de ARNibc una cadena sentido y una cadena antisentido que implica las etapas de: (a) detectar una grado significativo de complementariedad entre la cadena sentido y la diana inadvertida; y (b) mejorar la fuerza del par de bases entre el extremo 5' de la cadena sentido y el extremo 3' de la cadena antisentido en relación con la fuerza del par de bases entre el extremo 3' de la cadena sentido y el extremo 5' de la cadena antisentido; de tal manera que se reduce el silenciamiento del ARNm diana inadvertido. El silenciamiento del ARNm diana inadvertido puede reducirse en relación con el silenciamiento de un ARNm diana deseado.
En las reivindicaciones adjuntas se describen aspectos y realizaciones adicionales.
Para que la invención pueda entenderse más fácilmente, primero se definen ciertos términos.
El término "nucleósido" se refiere a una molécula que tiene una base de purina o pirimidina unida covalentemente a un azúcar ribosa o desoxirribosa. Los ejemplos de nucleósidos incluyen adenosina, guanosina, citidina, uridina y timidina. El término "nucleótido" se refiere a un nucleósido que tiene uno o más grupos fosfato unidos mediante enlaces éster a la fracción de azúcar. Los ejemplos nucleótidos incluyen monofosfatos, difosfatos y trifosfatos de nucleósidos. Los términos "polinucleótido" y "molécula de ácido nucleico" se usan indistintamente en este documento y se refieren a un polímero de nucleótidos unidos entre sí por un enlace fosfodiéster entre átomos de carbono 5' y 3'.
El término "ARN" o "molécula de ARN" o "molécula de ácido ribonucleico" se refiere a un polímero de ribonucleótidos. El término "ADN" o "molécula de ADN" o "molécula de ácido desoxirribonucleico" se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos. El ADN y el ARN se pueden sintetizar de forma natural (por ejemplo, mediante la replicación del ADN o la transcripción del ADN, respectivamente). El ARN se puede modificar postranscripcionalmente. El ADN y el ARN también se pueden sintetizar químicamente. El ADN y el ARN pueden ser monocatenarios (es decir, ARNmc y ADNmc, respectivamente) o multicatenarios (por ejemplo, bicatenarios, es decir, ARNbcy ADNbc, respectivamente). "ARNm" o "ARNm mensajero" es ARN monocatenario que especifica la secuencia de aminoácidos de una o más cadenas polipeptídicas. Esta información se traduce durante la síntesis de proteínas cuando los ribosomas se unen al ARNm.
Como se usa en el presente documento, el término "ARN de interferencia pequeño" ("ARNip") (también denominado en la técnica "ARN de interferencia cortos") se refiere a un ARN (o análogo de ARN) que comprende entre aproximadamente 10-50 nucleótidos (o análogos de nt) que es capaz de dirigir o mediar la ARN de interferencia. Preferiblemente, un ARNip comprende entre aproximadamente 15-30 nucleótidos o análogos de nt, más preferiblemente entre aproximadamente 16-25 nucleótidos (o análogos de nt), incluso más preferiblemente entre aproximadamente 18-23 nucleótidos (o análogos de nt), e incluso más preferiblemente entre aproximadamente 19-22 nucleótidos (o análogos de nt) (por ejemplo, 19, 20, 21 o 22 nucleótidos o análogos de nt).
Como se usa en este documento, el término "nucleótido raro" se refiere a un nucleótido de origen natural que ocurre con poca frecuencia, incluidos los desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos de origen natural que ocurren con poca frecuencia, por ejemplo, un ribonucleótido de origen natural que no es guanosina, adenosina, citosina o uridina. Los ejemplos de nucleótidos raros incluyen, pero no se limitan a, inosina, 1-metil inosina, pseudouridina, 5,6-dihidrouridina, ribotimidina, 2N-metilguanosina y 22N,N-dimetilguanosina.
El término "análogo de nucleótido" o "nucleótido alterado" o "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido no estándar, que incluye ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos de origen no natural. Los análogos de nucleótidos preferidos se modifican en cualquier posición para alterar ciertas propiedades químicas del nucleótido y al mismo tiempo mantener la capacidad del análogo de nucleótido para realizar su función pretendida. Los ejemplos de nucleótidos modificados preferidos incluyen, pero no se limitan a, 2-amino-guanosina, 2-amino-adenosina, 2,6-diamino-guanosina y 2,6-diamino-adenosina. Ejemplos de posiciones del nucleótido que pueden derivarse incluyen la posición 5, por ejemplo, 5-(2-amino)propiluridina, 5-bromouridina, 5-propinuridina, 5-propeniluridina, etc.; la posición 6, por ejemplo, 6-(2-amino)propiluridina; la posición 8 para adenosina y/o guanosina, por ejemplo, 8-bromoguanosina, 8-cloroguanosina, 8-fluoroguanosina, etc. Los análogos de nucleótidos también incluyen desazanucleótidos, por ejemplo, 7-desaza-adenosina; nucleótidos modificados en O y N (por ejemplo, alquilados, por ejemplo, N6-metil adenosina, o como se conoce de otro modo en la técnica); y otros análogos de nucleótidos heterocíclicamente modificados tales como los descritos en Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 10 de agosto de 2000 (4): 297 310.
Los análogos de nucleótidos también pueden comprender modificaciones en la porción de azúcar de los nt. Por ejemplo, el grupo 2'-OH puede ser reemplazado por un grupo seleccionado de H, OR, R, F, Cl, Br, I, SH, SR, NH2, NHR, NR2, COOr u OR, en los que R es o alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo C1-C6 sustituido o no sustituido, etc. Otras posibles modificaciones incluyen las descritas en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.858.988 y 6.291.438.
El grupo fosfato del nucleótido también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo uno o más de los oxígenos del grupo fosfato con azufre (por ejemplo, fosforotioatos), o haciendo otras sustituciones que permitan que el nucleótido realice su función deseada tal como se describe, por ejemplo, en Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10 de abril de 2000 (2): 117-21, Rusckowski et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10 de octubre de 2000 (5): 333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 11 de octubre de 2001 (5): 317-25, Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 11 de abril de 2001 (2): 77-85, y la patente de los Estados Unidos No. 5.684.143. Algunas de las modificaciones mencionadas anteriormente (por ejemplo, modificaciones del grupo fosfato) preferiblemente disminuyen la velocidad de hidrólisis, por ejemplo, de polinucleótidos que comprenden dichos análogos in vivo o in vitro.
El término "oligonucleótido" se refiere a un polímero corto de nucleótidos y/o análogos de nucleótidos. El término "análogo de ARN" se refiere a un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido sintetizado químicamente) que tiene al menos un nucleótido alterado o modificado en comparación con un ARN correspondiente inalterado o no modificado pero que conserva la naturaleza o función igual o similar que el correspondiente ARN inalterado o no modificado. Como se discutió anteriormente, los oligonucleótidos pueden unirse con enlaces que dan como resultado una menor velocidad de hidrólisis del análogo de ARN en comparación con una molécula de ARN con enlaces fosfodiéster. Por
ejemplo, los nucleótidos del análogo pueden comprender enlaces metilendiol, etilendiol, oximetiltio, oxietiltio, oxicarboniloxi, fosforodiamidato, fosforoamidato y/o fosforotioato. Los análogos de ARN preferidos incluyen ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos modificados en el azúcar y/o en la cadena principal. Dichas alteraciones o modificaciones pueden incluir además la adición de material no nucleotídico, tal como en el (los) extremos del ARN o internamente (en uno o más nucleótidos del ARN). Un análogo de ARN solo necesita ser lo suficientemente similar al ARN natural para que tenga la capacidad de mediar la interferencia del ARN.
Como se usa en este documento, el término "ARN de interferencia" ("ARNi") (también denominado en la técnica como "silenciamiento génico" y/o "silenciamiento de diana", por ejemplo, "silenciamiento de ARNm diana") se refiere a una degradación intracelular selectiva del ARN. El ARNi se produce en las células de forma natural para eliminar los ARN extraños (por ejemplo, ARN virales). El ARNi natural procede a través de fragmentos escindidos a partir de ARNbc libre que dirigen el mecanismo de degradación a otras secuencias de ARN similares. Alternativamente, el ARNi puede ser iniciado por la mano del hombre, por ejemplo, para silenciar la expresión de genes diana.
Como se usa en este documento, el término "cadena antisentido" de un ARNip o agente de ARNi se refiere a una cadena que es sustancialmente complementaria a una sección de aproximadamente 10-50 nt, por ejemplo, aproximadamente 15-30, 16-25, 18-23 o 19-22 nucleótidos del ARNm del gen al que se dirige el silenciamiento. La cadena antisentido o primera cadena tiene una secuencia suficientemente complementaria a la secuencia de ARNm diana deseada para dirigir el ARN de interferencia específico de la diana (ARNi), por ejemplo, complementariedad suficiente para desencadenar la destrucción del ARNm diana deseado por la maquinaria o proceso del ARNi. El término "cadena sentido" o "segunda cadena" de un ARNip o agente de ARNi se refiere a una cadena que es complementaria a la cadena antisentido o primera cadena. Las cadenas antisentido y sentido también pueden denominarse primera o segunda cadena, teniendo la primera o segunda cadena complementariedad con la secuencia diana y la respectiva segunda o primera cadena complementaria a dicha primera o segunda cadena.
Como se usa en este documento, el término "cadena guía" se refiere a una cadena de un agente de ARNi, por ejemplo, una cadena antisentido de un dúplex de ARNip, que entra en el complejo RISC y dirige la escisión del ARNm diana.
Un "gen diana" es un gen cuya expresión debe inhibirse o "silenciarse" selectivamente. Este silenciamiento se logra escindiendo el ARNm del gen diana mediante un ARNip o miARN, por ejemplo, un ARNip o miARN que se crea a partir de un precursor de ARN modificado por el sistema ARNi de una célula. Una porción o segmento de un tallo dúplex del precursor de ARN es una cadena antisentido que es complementaria, por ejemplo, suficientemente complementaria para desencadenar la destrucción del ARNm diana deseado por la maquinaria o proceso de ARNi, en una sección de aproximadamente 18 a aproximadamente 40 o más nucleótidos del ARNm del gen diana.
El término "modificado", como en un precursor de ARN modificado, o una molécula de ácido nucleico modificada, indica que el precursor o molécula no se encuentra en la naturaleza, ya que toda o una parte de la secuencia de ácido nucleico del precursor o la molécula es creada o seleccionada por el hombre. Una vez creada o seleccionada, la secuencia se puede replicar, traducir, transcribir o procesar de otro modo mediante mecanismos dentro de una célula. Por lo tanto, un precursor de ARN producido dentro de una célula a partir de un transgén que incluye una molécula de ácido nucleico modificada es un precursor de ARN modificado.
Como se usa en este documento, el término "asimetría", como en la asimetría de un dúplex de ARNip, se refiere a una desigualdad de fuerza de enlace o fuerza de apareamiento de bases entre los terminales del ARNip (por ejemplo, entre nucleótidos terminales en una primera cadena y nucleótidos terminales en una segunda cadena opuesta), de modo que el extremo 5' de una cadena del dúplex se encuentra más frecuentemente en un estado transitorio no emparejado, por ejemplo, estado monocatenario, que el extremo 5' de la cadena complementaria. Esta diferencia estructural determina que una cadena del dúplex se incorpora preferentemente a un complejo RISC. La cadena cuyo extremo 5' está menos emparejado con la cadena complementaria se incorporará preferentemente en RISC y mediará ARNi.
Como se usa en este documento, el término "fuerza de enlace" o "fuerza del par de bases" se refiere a la fuerza de la interacción entre pares de nucleótidos (o análogos de nt) en cadenas opuestas de un dúplex de oligonucleótidos (por ejemplo, un dúplex de ARNip), debido principalmente a enlaces de H, interacciones de Van der Waals y similares entre dichos nucleótidos (o análogos de nucleótidos).
Como se usa en este documento, el "extremo 5'", como en el extremo 5' de una cadena antisentido, se refiere a los nucleótidos terminales 5', por ejemplo, entre uno y aproximadamente 5 nucleótidos en el terminal 5' de la cadena antisentido. Como se usa en este documento, el "extremo 3'", como en el extremo 3' de una cadena sentido, se refiere a la región, por ejemplo, una región de entre uno y aproximadamente 5 nucleótidos, que es complementaria a los nucleótidos del extremo 5'. de la cadena antisentido complementaria.
Como se usa en este documento, el término "ARN aislado" (por ejemplo, "ARNhp aislado", "ARNip aislado" o "agente de ARNi aislado") se refiere a moléculas de ARN que están sustancialmente libres de otro material celular o medio de cultivo cuando se producen mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libres de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente.
Como se usa en este documento, el término "transgén" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico, que se inserta por artificio en una célula y se convierte en parte del genoma del organismo que se desarrolla a partir de la célula. Dicho transgén puede incluir un gen que es parcial o totalmente heterólogo (es decir, extraño) al organismo transgénico, o puede representar un gen homólogo a un gen endógeno del organismo. El término "transgén" también significa una molécula de ácido nucleico que incluye una o más secuencias de ácido nucleico seleccionadas, por ejemplo, ADN, que codifican uno o más precursores de ARN modificados, para ser expresados en un organismo transgénico, por ejemplo, animal, que es parcial o completamente heterólogo, es decir, ajeno al animal transgénico, u homólogo a un gen endógeno del animal transgénico, pero que está modificado para insertarse en el genoma del animal en una ubicación que difiere de la del gen natural. Un transgén incluye uno o más promotores y cualquier otro ADN, tal como intrones, necesarios para la expresión de la secuencia de ácido nucleico seleccionada, todos unidos operativamente a la secuencia seleccionada, y puede incluir una secuencia potenciadora.
El término "in vitro" tiene su significado reconocido en la técnica, por ejemplo, que implica reactivos o extractos purificados, por ejemplo, extractos de células. El término "in vivo" también tiene su significado reconocido en la técnica, por ejemplo, que implica células vivas, por ejemplo, células inmortalizadas, células primarias, líneas celulares y/o células en un organismo.
Un gen "implicado" en un trastorno incluye un gen, cuya expresión o función normal o aberrante afecta o causa una enfermedad o trastorno o al menos un síntoma de dicha enfermedad o trastorno.
Varias metodologías de la presente invención incluyen una etapa que implica comparar un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc. con un "control adecuado", al que en este documento se hace referencia indistintamente como un "control apropiado". Un "control adecuado" o "control apropiado" es cualquier control o estándar familiar para un experto en la técnica útil para fines de comparación. Un "control adecuado" o "control apropiado" es preferiblemente un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc. determinado antes de realizar una metodología de ARNi, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se puede determinar una tasa de transcripción, nivel de ARNm, tasa de traducción, nivel de proteína, actividad biológica, característica o propiedad celular, genotipo, fenotipo, etc. antes de introducir un agente de ARNi de la invención en una célula u organismo. Un "control adecuado" o "control apropiado" también puede ser un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc. determinado en una célula u organismo, por ejemplo, un control o una célula u organismo normal, que exhibe, por ejemplo, rasgos normales. Alternativamente, un "control adecuado" o "control apropiado" es un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc. predefinidos.
Varios aspectos de la invención se describen con más detalle en las siguientes subsecciones.
I. Moléculas y agentes de ARN
La presente invención presenta "moléculas de ARN interferente pequeñas" ("moléculas de ARNip" o "ARNip"), métodos para fabricar dichas moléculas de ARNip y métodos (por ejemplo, métodos de investigación y/o terapéuticos) para usar dichas moléculas de ARNip. Una molécula de ARNip de la invención es un dúplex que consta de una cadena sentido y una cadena antisentido complementaria, teniendo la cadena antisentido suficiente complementariedad con un ARNm diana para mediar el ARNi. Preferiblemente, las cadenas se alinean de modo que haya al menos 1, 2 o 3 bases en el extremo de las cadenas que no se alinean (es decir, para las que no se encuentran bases complementarias en la cadena opuesta) de modo que se produce una saliente de 1, 2 o 3 residuos en uno o ambos extremos del dúplex cuando se hibridan las cadenas. Preferiblemente, la molécula de ARNip tiene una longitud de aproximadamente 1o a 50 o más nt, es decir, cada cadena comprende de 10 a 50 nucleótidos (o análogos de nt). Más preferiblemente, la molécula de ARNip tiene una longitud de aproximadamente 15 a 45 o 15 a 30 nt. Incluso más preferiblemente, la molécula de ARNip tiene una longitud de aproximadamente 16-25 o 18-23 nt. Las moléculas de ARNip de la invención tienen además una secuencia que es "suficientemente complementaria" a una secuencia de ARNm diana para dirigir la ARN de interferencia específico de la diana (ARNi), como se define en este documento, es decir, el ARNip tiene una secuencia suficiente para desencadenar la destrucción del ARNm diana por la maquinaria o proceso de ARNi.
Los ARNip presentados en la invención proporcionan una mayor especificidad y eficacia para mediar la escisión mediada por RISC de un gen diana deseado. En un aspecto preferido, la fuerza del par de bases entre el extremo 5' de la cadena antisentido (5' de AS) y el extremo 3' de la cadena sentido (3' de S) de los ARNip es menor que la fuerza de unión o la fuerza del par de bases entre el extremo 3' de la cadena antisentido (3' AS) y el extremo 5' de la cadena sentido (5 de S'), de modo que la cadena antisentido guía preferentemente la escisión de un ARNm diana. La fuerza de unión o fuerza del par de bases puede ser menor debido a menos pares de bases G:C entre el extremo 5' de la primera cadena o cadena antisentido y el extremo 3' de la segunda cadena o cadena sentido que entre el extremo 3' de la primera. o cadena antisentido y el extremo 5' de la segunda cadena o cadena sentido.
De acuerdo con la invención, la fuerza de unión o fuerza del par de bases es menor debido a al menos un par de bases no emparejado entre el extremo 5' de la primera cadena o cadena antisentido y el extremo 3' de la segunda cadena o cadena sentido. Preferiblemente, el par de bases no emparejadas se selecciona del grupo que consiste en G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C y U:U.
En general, se prefieren las secuencias de nucleótidos que contienen ARNip suficientemente idénticas a una porción del gen diana para efectuar la escisión mediada por RISC del gen diana. No se requiere una identidad de secuencia del 100% entre el ARNip y el gen diana para poner en práctica la presente invención. La invención tiene la ventaja de poder tolerar variaciones de secuencia preferidas de los métodos y composiciones de la invención con el fin de mejorar la eficacia y la especificidad del ARNi. Por ejemplo, las secuencias de ARNip con inserciones, eliminaciones y mutaciones de un solo punto relativas a la secuencia diana también pueden ser eficaces para la inhibición. Alternativamente, las secuencias de ARNip con sustituciones o inserciones de análogos de nucleótidos pueden ser eficaces para la inhibición.
La identidad de secuencia puede determinarse mediante algoritmos de alineación y comparación de secuencia conocidos en la técnica. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido nucleico (o de dos secuencias de aminoácidos), las secuencias se alinean con fines de comparación óptimos (por ejemplo, se pueden introducir espacios en la primera secuencia o en la segunda secuencia para un alineamiento óptimo). A continuación, se comparan los nucleótidos (o residuos de aminoácidos) en las posiciones correspondientes de nucleótidos (o aminoácidos). Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100), penalizando opcionalmente la puntuación por el número de espacios introducidos y/o longitud de los espacios introducidos.
La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático. El alineamiento generado sobre una cierta porción de la secuencia alineada puede tener suficiente identidad, pero no sobre porciones que tienen un bajo grado de identidad (es decir, un alineamiento local). Un ejemplo preferido, no limitante de un algoritmo de alineación local utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77. Dicho algoritmo está incorporado en los programas BLAST (versión 2.0) de Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10.
La alineación se puede optimizar introduciendo espacios apropiados y el porcentaje de identidad se determina a lo largo de la longitud de las secuencias alineadas (es decir, una alineación con espacios vacíos). Para obtener alineaciones con espacios vacíos con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. La alineación se puede optimizar introduciendo espacios apropiados y se determina el porcentaje de identidad en toda la longitud de las secuencias alineadas (es decir, una alineación global). Un ejemplo preferido y no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación global de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) que forma parte del paquete de software de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de espacio de 12 y una penalización por espacio de 4.
Se prefiere una identidad de secuencia mayor al 80%, por ejemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso 100% de identidad de secuencia, entre la cadena antisentido de ARNip y la porción del gen diana. Alternativamente, el ARNip puede definirse funcionalmente como una secuencia de nucleótidos (o secuencia de oligonucleótidos) que es capaz de hibridar con una porción del transcripto del gen diana (por ejemplo, NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, DEt A 1 mM, hibridación a 50 °C o 70 °C durante 12-16 horas, seguido de lavado). Las condiciones de hibridación preferidas adicionales incluyen hibridación a 70 °C en 1xSSC o 50 °C en 1xSSC, formamida al 50% seguido de lavado a 70 °C en 0,3xSSC o hibridación a 70 °C en 4xSSC o 50 °C en 4xSSC, formamida al 50% seguido de lavado a 67 °C en 1xSSC. La temperatura de hibridación para los híbridos que se prevé que tenga menos de 50 pares de bases de longitud debe ser 5-10 °C menor que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, en la que Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, Tm (°C) = 2(# de bases A T) 4(# de bases G C). Para híbridos entre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tm (°C) = 81,5 16,6(log-i0 [Na+]) 0,41(% de G C) - (600/n ), en la que N es el número de bases en el híbrido y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el tampón de hibridación ([Na+] para 1xSSC = 0,165 M). Se proporcionan ejemplos adicionales de condiciones de rigurosidad para la hibridación de polinucleótidos en Sambrook, J., EF Fritsch y T.Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, capítulos 9 y 11, y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, FM Ausubel et al., Eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4. La longitud de las secuencias de nucleótidos idénticas puede ser de al menos aproximadamente 10, 12, 15, 17, 20, 22, 25, 27, 30, 32, 35, 37, 40, 42, 45, 47 o 50 bases.
Las moléculas de ARN de la presente invención se pueden modificar para mejorar la estabilidad en suero o en medio de crecimiento para cultivos celulares. Para mejorar la estabilidad, los residuos de 3' pueden estabilizarse contra la degradación, por ejemplo, pueden seleccionarse de modo que consistan en nucleótidos de purina, particularmente nucleótidos de adenosina o guanosina. Alternativamente, se tolera la sustitución de nucleótidos de pirimidina por análogos modificados, por ejemplo, la sustitución de uridina por 2'-desoxitimidina y no afecta la eficacia del ARN de interferencia.
En un aspecto preferido, la invención presenta ARN de interferencia pequeños (ARNip) que incluyen una cadena sentido y una cadena antisentido, en la que la cadena antisentido tiene una secuencia suficientemente complementaria a una secuencia de ARNm diana para dirigir el ARN de interferencia específica de la diana (ARNi) y en la que la cadena sentido y/o la cadena antisentido se modifica mediante la sustitución de nucleótidos internos con nucleótidos modificados, de manera que se mejora la estabilidad in vivo en comparación con un ARNip no modificado correspondiente. Como se define en el presente documento, un nucleótido "interno" es uno que se encuentra en cualquier posición distinta del extremo 5' o el extremo 3' de la molécula de ácido nucleico, polinucleótido u oligonucleótido. Un nucleótido interno puede estar dentro de una molécula monocatenaria o dentro de una cadena de una molécula dúplex o bicatenaria. La cadena sentido y/o la cadena antisentido puede modificarse mediante la sustitución de al menos un nucleótido interno. La cadena sentido y/o la cadena antisentido se puede modificar mediante la sustitución de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más nucleótidos internos. La cadena sentido y/o la cadena antisentido se puede modificar mediante la sustitución de al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de los nucleótidos internos. La cadena sentido y/o la cadena antisentido también se puede modificar mediante la sustitución de todos los nucleótidos internos.
La molécula de ARN puede contener al menos un análogo de nucleótido modificado. Los análogos de nucleótidos pueden ubicarse en posiciones en las que la actividad específica de la diana, por ejemplo, la actividad mediadora de ARNi no se ve afectada sustancialmente, por ejemplo, en una región en el extremo 5' y/o el extremo 3' de la molécula de ARN. En particular, los extremos se pueden estabilizar incorporando análogos de nucleótidos modificados.
Los análogos de nucleótidos preferidos incluyen ribonucleótidos modificados en el azúcar y/o en la cadena principal (es decir, incluyen modificaciones en la cadena principal de fosfato-azúcar). Por ejemplo, los enlaces fosfodiéster del ARN natural se pueden modificar para incluir al menos uno de un heteroátomo de nitrógeno o azufre. En los ribonucleótidos preferidos modificados de la cadena principal, el grupo fosfoéster que se conecta a los ribonucleótidos adyacentes se reemplaza por un grupo modificado, por ejemplo, del grupo fosfotioato. En los ribonucleótidos preferidos modificados en el azúcar, el grupo 2'-OH se reemplaza por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 u ON, en los que R es alquilo, alquenilo o alquinilo C1-C6 y halo es F, Cl, Br o I.
También se prefieren los ribonucleótidos modificados en la nucleobase, es decir, ribonucleótidos, que contienen al menos una nucleobase de origen no natural en lugar de una nucleobase de origen natural. Las bases pueden modificarse para bloquear la actividad de la adenosina desaminasa. Los ejemplos de nucleobases modificadas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, uridina y/o citidina, modificadas en la posición 5', por ejemplo, 5-(2-amino) propiluridina, 5-bromo uridina; adenosina y/o guanosinas modificadas en la posición 8, por ejemplo, 8-bromo guanosina; desazanucleótidos, por ejemplo, 7-desaza-adenosina; nucleótidos alquilados en O y N, por ejemplo, N6-metil adenosina. Cabe señalar que las modificaciones anteriores pueden combinarse.
El ARN puede producirse enzimáticamente o mediante síntesis orgánica parcial/total, cualquier ribonucleótido modificado puede introducirse mediante síntesis enzimática u orgánica in vitro. Se puede preparar químicamente un agente de ARNi. Se conocen en la técnica métodos de síntesis de moléculas de ARN, en particular, los métodos de síntesis química descritos en Verma y Eckstein (1998) Annul Rev. Biochem. 67: 99-134. Un ARNip, mc se puede preparar enzimáticamente. Por ejemplo, se puede preparar un ARNip-bc mediante procesamiento enzimático de un ARNbc largo que tenga suficiente complementariedad con el ARNm diana deseado. El procesamiento de ARNbc largo se puede realizar in vitro, por ejemplo, usando lisados celulares apropiados y los ARNip-bc se pueden purificar posteriormente mediante electroforesis en gel o filtración en gel. Después, el ARNip-bc puede desnaturalizarse de acuerdo con metodologías reconocidas en la técnica. De acuerdo con un ejemplo, el ARN se puede purificar a partir de una mezcla mediante extracción con un disolvente o resina, precipitación, electroforesis, cromatografía o una combinación de los mismos. Alternativamente, el ARN se puede usar sin purificación o con un mínimo de purificación para evitar pérdidas debido al procesamiento de la muestra. Alternativamente, el ARNip también se puede preparar mediante transcripción enzimática a partir de moldes de ADN sintéticos o de plásmidos de ADN aislados de bacterias recombinantes. Normalmente, se utilizan ARN polimerasas de fagos tales como ARN polimerasa de T7, T3 o SP6 (Milligan y Uhlenbeck (1989) Methods Enzymol. 180: 51-62). El ARN puede secarse para su almacenamiento o disolverse en una solución acuosa. La solución puede contener tampones o sales para inhibir la hibridación y/o promover la estabilización de las cadenas sencillas.
El ARNm diana de la invención puede especificar la secuencia de aminoácidos de una proteína celular (por ejemplo, una proteína nuclear, citoplasmática, transmembrana o asociada a la membrana). Alternativamente, el ARNm diana de la invención puede especificar la secuencia de aminoácidos de una proteína extracelular (por ejemplo, una proteína de la matriz extracelular o una proteína secretada). Como se usa en el presente documento, la frase "especifica la secuencia de aminoácidos" de una proteína significa que la secuencia de ARNm se traduce en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con las reglas del código genético. Las siguientes clases de proteínas se enumeran con fines ilustrativos: proteínas de desarrollo (por ejemplo, moléculas de adhesión, inhibidores de ciclina quinasa, miembros de la familia Wnt, miembros de la familia Pax, miembros de la familia de Hélice alada, miembros de la familia Hox, citocinas/linfocinas y sus receptores, factores crecimiento/diferenciación y sus receptores, neurotransmisores y sus receptores); proteínas codificadas por oncogenes (por ejemplo, ABLI, BCLI, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSFIR, ERBA,
ERBB, EBRB2, ETSI, ETSI, ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN , MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCLI, MYCN, NRAS, PIM I, PML, RET, SRC, TALI, TCL3 y YES); proteínas supresoras de tumores (por ejemplo, APC, BRCA1, BRCA2, MADH4, MCC, NF I, NF2, RB I, TP53 y WTI); y enzimas (por ejemplo, ACC sintasas y oxidasas, ACP desaturasas e hidroxilasas, ADP-glucosa piroforilasas, ATPasas, alcohol deshidrogenasas, amilasas, amiloglucosidasas, catalasas, celulasas, calcona sintasas, quitinasas, ciclooxigenasas, descarboxilasas, dextriinasas ADN y ARN polimerasas, galactosidasas, glucanasas, glucosa oxidasas, almidón sintasas unidas a gránulos, GTPasas, helicasas, hernicelulasas, integrasas, inulinasas, invertasas, isomerasas, quinasas, lactasas, lipasas, lipoxigenasas, lisozimas, nopalinas sintasas, octopina sintasas, pectinesterasas, peroxidasas, fosfatasas, fosfolipasas, fosforilasas, fitasas, sintasas reguladoras del crecimiento de la planta, poligalacturonasas, proteinasas y peptidasas, pullanasas, recombinasas, transcriptasas inversas, RUBISCO, topoisomerasas y xilanasas).
La molécula de ARNm diana puede especificar la secuencia de aminoácidos de una proteína asociada con una afección patológica. Por ejemplo, la proteína puede ser una proteína asociada a patógenos (por ejemplo, una proteína viral implicada en la inmunosupresión del huésped, la replicación del patógeno, la transmisión del patógeno o el mantenimiento de la infección) o una proteína del huésped que facilita la entrada del patógeno en el huésped, el metabolismo del fármaco por el patógeno o el huésped, la replicación o integración del genoma del patógeno, el establecimiento o diseminación de la infección en el huésped o el ensamblaje de la siguiente generación de patógeno. Alternativamente, la proteína puede ser una proteína asociada a un tumor o una proteína asociada a una enfermedad autoinmune.
La molécula de ARNm diana puede especificar la secuencia de aminoácidos de una proteína endógena (es decir, una proteína presente en el genoma de una célula u organismo). La molécula de ARNm diana puede especificar la secuencia de aminoácidos de una proteína heteróloga expresada en una célula recombinante o un organismo alterado genéticamente. Alternativamente, la molécula de ARNm diana puede especificar la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por un transgén (es decir, un constructo génico insertado en un sitio ectópico en el genoma de la célula). En otro caso más, la molécula de ARNm diana puede especificar la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por un genoma de patógeno que es capaz de infectar una célula o un organismo del que se deriva la célula.
Al inhibir la expresión de dichas proteínas, se puede obtener información valiosa sobre la función de dichas proteínas y los beneficios terapéuticos que pueden obtenerse de dicha inhibición.
Los ARNip se pueden sintetizar in vivo, in situ o in vitro. La ARN polimerasa endógena de la célula puede mediar la transcripción in vivo o in situ, o la ARN polimerasa clonada puede usarse para la transcripción in vivo o in vitro. Para la transcripción de un transgén in vivo o un constructo de expresión, se puede usar una región reguladora (por ejemplo, promotora, potenciadora, silenciadora, donante y aceptora de empalme, poliadenilación) para transcribir el ARNip mc. La inhibición puede dirigirse mediante transcripción específica en un órgano, tejido o tipo de célula; estimulación de una condición ambiental (por ejemplo, infección, estrés, temperatura, inductores químicos); y/o modificación de la transcripción en una etapa de desarrollo o edad. Se puede producir un organismo transgénico que expresa ARNip mc a partir de un constructo recombinante introduciendo el constructo en un cigoto, una célula madre embrionaria u otra célula multipotente derivada del organismo apropiado.
II. ARN de horquilla corta (ARNhc)
En determinadas realizaciones destacadas, la presente invención proporciona ARNhp que tienen mayor especificidad o eficacia en la mediación del ARNi. En contraste con los dúplex de ARNip cortos, los ARN de horquilla corta (ARNhp) imitan a los precursores naturales de los miARN y entran en la parte superior de la ruta del ARNi. Por esta razón, se cree que los ARNhp median el ARNi de manera más eficiente al ser alimentados a través de toda la ruta natural del ARNi.
Un ARNhp preferido de la invención es uno que se ha remodificado para una mayor especificidad o mejora en relación con un ARNhp anterior. El nuevo ARNhp difiere de un ARNhp anterior en que un dúplex de ARNip producido a partir del nuevo ARNhp tiene menos fuerza del par de bases entre el extremo 5' de la cadena antisentido o primera cadena y el extremo 3' de la cadena sentido o segunda cadena que la fuerza del par de bases entre el extremo 3' de la cadena antisentido o primera cadena y el extremo 5' de la cadena sentido o segunda cadena.
1. Precursores de ARN modificados que generan ARNip
Los precursores de miARN de origen natural (pre-miARN) tienen una sola cadena que forma un tallo dúplex que incluye dos porciones que son generalmente complementarias, y un bucle que conecta las dos porciones del tallo. En los pre-miARN típicos, el tallo incluye uno o más protuberancias, por ejemplo, nucleótidos adicionales que crean un "bucle" de un solo nucleótido en una porción del tallo, y/o uno o más nucleótidos desemparejados que crean un espacio en la hibridación de las dos porciones del tallo entre sí. Los ARN de horquilla cortos, o precursores de ARN modificados, de la invención son constructos artificiales basados en estos pre-miARN de origen natural, pero que están modificados para suministrar ARNip deseados.
En los ARNhp, o los ARN precursores modificados, de la presente invención, una porción del tallo dúplex es una
secuencia de ácido nucleico que es complementaria (o antisentido) al ARNm diana. Por lo tanto, los precursores del ARN modificados incluyen un tallo dúplex con dos porciones y un bucle que conecta las dos porciones del tallo. Las dos porciones de tallo tienen una longitud de aproximadamente 18 o 19 a aproximadamente 25, 30, 35, 37, 38, 39 o 40 o más nt. Cuando se usa en células de mamíferos, la longitud de las porciones del tallo debe ser menor de aproximadamente 30 nucleótidos para evitar provocar respuestas inespecíficas como la ruta del interferón. En células de no mamíferos, el tallo puede tener más de 30 nt. De hecho, el tallo puede incluir secciones mucho más grandes complementarias al ARNm diana (hasta, e incluyendo el ARNm completo). Las dos porciones del tallo dúplex deben ser lo suficientemente complementarias para hibridar y formar el tallo dúplex. Por lo tanto, las dos porciones pueden ser, aunque no es necesario, completa o perfectamente complementarias. Además, las dos porciones del tallo pueden tener la misma longitud, o una porción puede incluir una saliente de 1, 2, 3 o 4 nt. Los nucleótidos que sobresalen pueden incluir, por ejemplo, uracilos (U), por ejemplo, todos los U. El bucle en los ARNhp o los precursores de ARN modificados pueden diferir de las secuencias naturales del pre-miARN modificando la secuencia del bucle para aumentar o disminuir el número de nucleótidos emparejados, o reemplazando toda o parte de la secuencia del bucle con un tetrabucle u otras secuencias de bucle. Por lo tanto, el bucle en los ARNhp o los precursores de ARN modificados pueden tener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más, por ejemplo, 15 o 20, o más nucleótidos de longitud.
Los ARNhp de la invención incluyen las secuencias del dúplex de ARNip deseado. El dúplex de ARNip deseado y, por lo tanto, las dos porciones de tallo en el precursor de ARN modificado se seleccionan mediante métodos conocidos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a, seleccionar una secuencia de 18, 19, 20, 21 nucleótidos o más de la secuencia del ARNm del gen diana de una región de 100 a 200 o 300 nucleótidos en el lado 3' del inicio de la traducción. En general, la secuencia se puede seleccionar de cualquier porción del ARNm del gen diana, tal como la UTR (región no traducida) 5', la secuencia codificante o UTR 3'. Opcionalmente, esta secuencia puede seguir inmediatamente después de una región del gen diana que contiene dos nucleótidos AA adyacentes. Los dos últimos nucleótidos de la secuencia de aproximadamente 21 nucleótidos se pueden seleccionar para que sean UU (de modo que la cadena antisentido del ARNip comience con UU). Esta secuencia de aproximadamente 21 nucleótidos se usa para crear una porción de un tallo dúplex en el precursor de ARN modificado. Esta secuencia puede reemplazar una porción de tallo de una secuencia de pre-ARNtp (ARN temporal pequeño precursor) de tipo silvestre, por ejemplo, enzimáticamente, o se incluye en una secuencia completa que se sintetiza. Por ejemplo, se pueden sintetizar oligonucleótidos de ADN que codifican todo el precursor de a Rn modificado de tallo-bucle, o que codifican solo la porción que se insertará en el tallo dúplex del precursor, y utilizando enzimas de restricción para construir el constructo precursor de ARN modificado, por ejemplo, de un pre-ARNtp de tipo silvestre.
Los precursores de ARN modificados incluyen en el tallo dúplex las 21-22 o más secuencias de nucleótidos del ARNip que se desea producir in vivo. Por lo tanto, la porción de tallo del precursor de ARN modificado incluye al menos 18 o 19 pares de nucleótidos correspondientes a la secuencia de una porción exónica del gen cuya expresión se va a reducir o inhibir. Los dos nucleótidos 3' que flanquean esta región del tallo se eligen para maximizar la producción del ARNip a partir del precursor de ARN modificado y para maximizar la eficacia del ARNip resultante en el direccionamiento del ARNm correspondiente para su destrucción por ARNi in vivo e in vitro.
Otra característica definitoria de estos precursores de ARN modificados es que, como consecuencia de su longitud, secuencia y/o estructura, no inducen respuestas no específicas de secuencia, como la inducción de la respuesta al interferón o la apoptosis, o que inducen un nivel más bajo de tales respuestas no específicas de secuencia que el ARN bicatenario largo (> 150 pb) que se ha utilizado para inducir ARNi. Por ejemplo, la respuesta al interferón es desencadenada por ARNbc de más de 30 pares de bases.
2. Precursores de ARN modificados para codificación de transgenes
Los nuevos precursores de ARN modificados pueden sintetizarse mediante métodos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado (como los que están disponibles comercialmente a través de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Estos precursores de ARN sintéticos modificados pueden usarse directamente como se describe a continuación o clonarse en vectores de expresión mediante métodos conocidos en el campo. Los precursores de ARN modificados deben administrarse a células in vitro o in vivo en las que se desea dirigir a un ARNm específico para su destrucción. Se han desarrollado varios métodos para administrar ADN o ARN a las células. Por ejemplo, para administración in vivo, las moléculas pueden inyectarse directamente en un sitio de tejido o administrarse sistémicamente. La administración in vitro incluye métodos conocidos en la técnica tales como electroporación y lipofección.
Para lograr concentraciones intracelulares de la molécula de ácido nucleico suficientes para suprimir la expresión de ARNm endógenos, se puede usar, por ejemplo, un constructo de ADN recombinante en el que el oligonucleótido se coloca bajo el control de una Pol III fuerte (por ejemplo, Promotor U6 o Pol III para H1-ARN) o promotor Pol II. El uso de un constructo de este tipo para transfectar células diana in vitro o in vivo dará como resultado la transcripción de cantidades suficientes del precursor de ARN modificado para conducir a la producción de un ARNip que puede apuntar a una secuencia de ARNm correspondiente para la escisión por ARNi para disminuir la expresión del gen que codifica ese ARNm. Por ejemplo, se puede introducir un vector in vivo de manera que sea captado por una célula y dirija la transcripción de un precursor de ARN modificado. Dicho vector puede permanecer episómico o integrarse cromosómicamente, siempre que pueda transcribirse para producir el precursor de ARNtp deseado.
Estos vectores se pueden construir mediante métodos de tecnología de ADN recombinante conocidos en la técnica. Los vectores pueden ser plásmidos, virales u otros vectores conocidos en la técnica tales como los descritos en este documento, usados para la replicación y expresión en células de mamíferos u otros tipos de células diana. Las secuencias de ácido nucleico que codifican los precursores de ARN modificados pueden prepararse usando técnicas conocidas. Por ejemplo, se pueden sintetizar dos oligonucleótidos de ADN sintéticos para crear un gen novedoso que codifique todo el precursor de ARN modificado. Los oligonucleótidos de ADN, que se emparejarán, dejando 'extremos pegajosos' apropiados para la clonación, se pueden insertar en un sitio de restricción en un plásmido que contiene una secuencia promotora (por ejemplo, un promotor Pol II o Pol III) y secuencias terminadoras apropiadas 3' a las secuencias precursoras de ARN modificadas (por ejemplo, una secuencia señal de escisión y poliadenilación de SV40 o una secuencia terminadora Pol III).
También se describen células huésped modificadas genéticamente que contienen cualquiera de los vectores de expresión anteriores y, por lo tanto, expresan las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento en la célula huésped. Las células huésped se pueden cultivar utilizando técnicas y métodos conocidos (véase, por ejemplo, Culture of Animal Cells (RI Freshney, Alan R. Liss, Inc. 1987); Molecular Cloning, Sambrook et al., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)).
La introducción satisfactoria de los vectores de la invención en las células huésped se puede controlar usando varios métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria se puede señalar con un indicador, tal como un marcador fluorescente, tal como la proteína verde fluorescente (GFP). La transfección estable puede indicarse usando marcadores que proporcionen a la célula transfectada resistencia a factores ambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos), tales como resistencia a higromicina B, por ejemplo, en células de insectos y en células de mamíferos.
3. Secuencias reguladoras
La expresión de los precursores de ARN modificados es realizada por secuencias reguladoras, y los vectores de la invención pueden incluir cualquier secuencia reguladora conocida en la técnica que actúe en células de mamíferos, por ejemplo, células humanas o murinas; en células de insectos; en células vegetales; u otras células. El término secuencia reguladora incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión. Se apreciará que la secuencia reguladora apropiada depende de factores tales como el uso futuro de la célula o animal transgénico en el que se introduce una secuencia que codifica un precursor de ARN modificado y el nivel de expresión del precursor de ARN deseado. Una persona experta en la técnica podrá elegir la secuencia reguladora apropiada. Por ejemplo, los animales transgénicos descritos en el presente documento pueden usarse para determinar el papel de un polipéptido de prueba o los precursores de ARN modificados genéticamente en un tipo de célula particular, por ejemplo, una célula hematopoyética. En este caso, se puede usar una secuencia reguladora que dirige la expresión del transgén de manera ubicua, o una secuencia reguladora específica hematopoyética que expresa el transgén solo en células hematopoyéticas. La expresión de los precursores de ARN modificados en una célula hematopoyética significa que la célula ahora es susceptible a un ARNi específico dirigido de un gen en particular. A continuación, se describen ejemplos de varias secuencias reguladoras.
Las secuencias reguladoras pueden ser inducibles o constitutivas. Las secuencias reguladoras constitutivas adecuadas incluyen la secuencia reguladora de un gen de mantenimiento tal como la secuencia reguladora de aactina, o pueden ser de origen viral tales como secuencias reguladoras derivadas del virus del tumor mamario de ratón (MMTV) o citomegalovirus (CMV).
Alternativamente, la secuencia reguladora puede dirigir la expresión transgénica en órganos o tipos de células específicos (véase, por ejemplo, Lasko et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232). Se conocen en la técnica varias secuencias reguladoras específicas de tejido que incluyen la secuencia reguladora de albúmina para el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1: 268276); la secuencia reguladora de endotelina para células endoteliales (Lee, 1990, J. Biol. Chem. 265: 10446-50); la secuencia reguladora de la queratina para la epidermis; la secuencia reguladora de la cadena ligera 2 de miosina para el corazón (Lee et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 15875-85), y la secuencia reguladora de la insulina para el páncreas (Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2511-2515), o la secuencia reguladora de vav para células hematopoyéticas (Oligvy et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 14943-14948). Otra secuencia reguladora adecuada, que dirige la expresión constitutiva de transgenes en células de origen hematopoyético, es la secuencia reguladora del MHC clase I murino (Morello et al., 1986, EMBO J. 5: 1877 1882). Dado que la expresión de NMC es inducida por citocinas, la expresión de un gen de prueba unido operativamente a esta secuencia reguladora puede sobrerregularse en presencia de citocinas.
Además, la expresión del transgén se puede regular con precisión, por ejemplo, mediante el uso de una secuencia reguladora inducible y sistemas de expresión tales como una secuencia reguladora que sea sensible a ciertos reguladores fisiológicos, por ejemplo, niveles de glucosa circulante u hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8: 20-24). Tales sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de la expresión transgénica en células o en mamíferos como ratones, incluyen la regulación por ecdisona, por estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de dimerización e isopropil-beta-D1-tiogalactopiranósido (IPTG) (denominados colectivamente como "la
molécula reguladora"). Cada uno de estos sistemas de expresión está bien descrito en la bibliografía y permite la expresión del transgén en todo el animal de una manera controlada por la presencia o ausencia de la molécula reguladora. Para una revisión de sistemas de expresión inducibles, véase, por ejemplo, Mills, 2001, Genes Devel. 15: 1461-1467, y las referencias allí citadas.
Los elementos reguladores mencionados anteriormente incluyen, pero no se limitan a, el gen temprano inmediato del citomegalovirus hCMV, los promotores tempranos o tardíos del adenovirus SV40 (Bernoist et al., Nature, 290: 304, 1981), el sistema te t, el sistema Jac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el operador principal y las regiones promotoras del fago A, las regiones de control de la proteína de la cubierta fd, el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa, los promotores de la fosfatasa ácida y los promotores de los factores de apareamiento a de la levadura. Los promotores adicionales incluyen el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., Cell 22: 787-797, 1988); el promotor de la timidina quinasa del herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441, 1981); o las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster et al., Nature 296: 39, 1988).
4. Ensayo para probar precursores de ARN modificados
Pueden usarse lisados de embriones de Drosophila para determinar si un precursor de ARN modificado fue, de hecho, el precursor directo de un ARNtp o ARNip maduro. Este ensayo de lisado se describe en Tuschl et al., 1999, citado anteriormente, Zamore et al., 2000, citado anteriormente, y Hulvdgner et al., 2001, citado anteriormente. Estos lisados recapitulan el ARNi in vitro, lo que permite investigar si el ARN precursor propuesto se escindió en un ARNtp o ARNip maduro mediante un mecanismo similar al ARNi. Brevemente, el ARN precursor se incuba con lisado de embrión de Drosophila varias veces, luego se analiza la producción del ARNip o ARNtp maduro mediante extensión del cebador o hibridación Northern. Al igual que en el entorno in vivo, el ARN maduro se acumula en la reacción sin células. Por lo tanto, se puede demostrar que un ARN correspondiente al precursor propuesto se convierte en un dúplex de ARNtp o ARNip maduro en el lisado de embriones de Drosophila.
Además, un precursor de ARN modificado puede probarse funcionalmente en los lisados de embriones de Drosophila. En este caso, el precursor de ARN modificado se incuba en el lisado en presencia de un ARNm diana radiomarcado en 5' en una reacción estándar de ARNi in vitro durante varios períodos de tiempo. El ARNm diana puede marcarse radioactivamente en 5' usando guanilil transferasa (como se describe en Tuschl et al., 1999, citado anteriormente y las referencias allí) u otros métodos adecuados. A continuación, los productos de la reacción in vitro se aíslan y analizan en un gel de agarosa o acrilamida desnaturalizante para determinar si el ARNm diana se ha escindido en respuesta a la presencia del precursor de ARN modificado en la reacción. La extensión y posición de tal escisión del ARNm diana indicará si la modificación del precursor creó un pre-ARNip capaz de mediar ARNi específico de la secuencia.
III. Métodos de introducción de ARN, vectores y células huésped
Los métodos físicos para introducir ácidos nucleicos incluyen la inyección de una solución que contiene el ARN, el bombardeo por partículas cubiertas por el ARN, la inmersión de la célula u organismo en una solución del ARN o la electroporación de las membranas celulares en presencia del ARN. Un constructo viral empacado en una partícula viral lograría tanto la introducción eficiente de un constructo de expresión en la célula como la transcripción del ARN codificado por el constructo de expresión. Pueden usarse otros métodos conocidos en la técnica para introducir ácidos nucleicos en las células, tales como transporte de portadores mediado por lípidos, transporte mediado por productos químicos, tales como fosfato de calcio y similares. Por lo tanto, el ARN puede introducirse junto con componentes que realizan una o más de las siguientes actividades: potenciar la captación de ARN por la célula, inhibir la hibridación de cadenas sencillas, estabilizar las cadenas sencillas o bien aumentar la inhibición del gen diana.
El ARN puede introducirse directamente en la célula (es decir, intracelularmente); o introducirse extracelularmente en una cavidad, espacio intersticial, en la circulación de un organismo, introducido oralmente, o puede introducirse bañando una célula u organismo en una solución que contenga el ARN. La circulación vascular o extravascular, el sistema sanguíneo o linfático y el líquido cefalorraquídeo son lugares en los que se puede introducir el ARN.
La célula con el gen diana puede derivarse de o estar contenida en cualquier organismo. El organismo puede ser una planta, un animal, un protozoo, una bacteria, un virus o un hongo. La planta puede ser monocotiledónea, dicotiledónea o gimnosperma; el animal puede ser un vertebrado o un invertebrado. Los microbios preferidos son los que se utilizan en la agricultura o la industria y los que son patógenos para plantas o animales. Los hongos incluyen organismos tanto en la morfología de moho como de levadura. Las plantas incluyen arabidopsis; cultivos de campo (por ejemplo, alfalfa, cebada, frijol, maíz, algodón, lino, guisante, colza, arroz, centeno, cárcamo, sorgo, soja, girasol, tabaco y trigo); cultivos de hortalizas (por ejemplo, espárragos, remolacha, brócoli, repollo, zanahoria, coliflor, apio, pepino, berenjena, lechuga, cebolla, pimiento, patata, calabaza, rábano, espinaca, chayote, taro, tomate y calabacín); cultivos de frutas y nueces (por ejemplo, almendra, manzana, albaricoque, plátano, moras negras, mora, cacao, cereza, coco, arándano rojo, dátil, feijoa, avellana, uva, pomelo, guayaba, kiwi, limón, lima, mango, melón, nectarina, naranja, papaya, maracuyá, melocotón, maní, pera, piña, pistacho, ciruela, frambuesa, fresa, mandarina, nuez y sandía); y ornamentales (por ejemplo, aliso, fresno, álamo temblón, azalea, abedul, boj, camelia, clavel, crisantemo, olmo, abeto,
hiedra, jazmín, enebro, roble, palma, álamo, pino, secoya, rododendro, rosa y caucho). Los ejemplos de animales vertebrados incluyen peces, mamíferos, vacas, cabras, cerdos, ovejas, roedores, hámsters, ratones, ratas, primates y humanos; los animales invertebrados incluyen nematodos, otros gusanos, Drosophila y otros insectos.
El experto en la técnica apreciará que los organismos enumerados también son útiles para poner en práctica otros aspectos de la invención, por ejemplo, preparar organismos transgénicos como se describe más adelante.
La célula que tiene el gen diana puede ser de la línea germinal o somática, totipotente o pluripotente, en división o no, de parénquima o epitelio, inmortalizada o transformada, o similares. La célula puede ser una célula madre o una célula diferenciada. Los tipos de células que se diferencian incluyen adipocitos, fibroblastos, miocitos, cardiomiocitos, endotelio, neuronas, glía, células sanguíneas, megacariocitos, linfocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos, leucocitos, granulocitos, queratinocitos, condrocitos, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos y células de glándulas endocrinas o exocrinas.
Dependiendo del gen diana particular y la dosis de material de ARN bicatenario suministrado, este proceso puede proporcionar una pérdida parcial o completa de la función del gen diana. Es ejemplar una reducción o pérdida de la expresión génica en al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% o más de las células diana. La inhibición de la expresión génica se refiere a la ausencia (o disminución observable) en el nivel de proteína y/o producto de ARNm de un gen diana. La especificidad se refiere a la capacidad de inhibir el gen diana sin efectos manifiestos sobre otros genes de la célula. Las consecuencias de la inhibición se pueden confirmar mediante el examen de las propiedades externas de la célula u organismo (como se presenta a continuación en los ejemplos) o mediante técnicas bioquímicas tales como hibridación en solución de ARN, protección contra nucleasas, hibridación Northern, transcripción inversa, control de la expresión génica con un microarreglos, unión de anticuerpos, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), transferencia Western, radioinmunoensayo (RIA), otros inmunoensayos y análisis de células activadas por fluorescencia (FACS).
Para la inhibición mediada por ARN en una línea celular u organismo completo, la expresión génica se analiza convenientemente mediante el uso de un gen indicador o de resistencia a fármacos cuyo producto proteico se analiza fácilmente. Dichos genes indicadores incluyen acetohidroxiácido sintasa (AHAS), fosfatasa alcalina (AP), beta galactosidasa (LacZ), beta glucoronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), proteína verde fluorescente (GFP), peroxidasa de rábano picante (HRP), luciferasa (Luciferasa), nopalina sintasa (NOS), octopina sintasa (OCS) y sus derivados. Se encuentran disponibles múltiples marcadores seleccionables que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina y tetraciclina. Dependiendo del ensayo, la cuantificación de la cantidad de expresión génica permite determinar un grado de inhibición superior al 10%, 33%, 50%, 90%, 95% o 99% en comparación con una célula no tratada de acuerdo con la presente invención. Dosis más bajas de material inyectado y tiempos más prolongados después de la administración de un agente de ARNi pueden producir inhibición en una fracción más pequeña de células (por ejemplo, al menos 10%, 20%, 50%, 75%, 90% o 95% de las células diana). La cuantificación de la expresión génica en una célula puede mostrar cantidades similares de inhibición al nivel de acumulación de ARNm diana o traducción de proteína diana. Como ejemplo, la eficacia de la inhibición se puede determinar evaluando la cantidad de producto génico en la célula; el ARNm puede detectarse con una sonda de hibridación que tiene una secuencia de nucleótidos fuera de la región utilizada para el ARN inhibidor bicatenario, o el polipéptido traducido puede detectarse con un anticuerpo generado contra la secuencia polipeptídica de esa región.
El ARN puede introducirse en una cantidad que permita el suministro de al menos una copia por célula. Las dosis más altas (por ejemplo, al menos 5, 10, 100, 500 o 1000 copias por célula) de material pueden producir una inhibición más eficaz; las dosis más bajas también pueden ser útiles para aplicaciones específicas.
IV. Métodos de tratamiento:
También se divulgan métodos profilácticos y terapéuticos para tratar a un sujeto en riesgo de (o susceptible a) un trastorno o que tiene un trastorno asociado con una expresión o actividad de gen diana aberrante o no deseada. "Tratamiento" o "tratar" como se usa en este documento, se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico (por ejemplo, un agente de ARNi o vector o transgén que codifica el mismo) a un paciente, o la aplicación o administración de un agente terapéutico a un tejido aislado o línea celular de un paciente, que tiene una enfermedad o trastorno, un síntoma de enfermedad o trastorno o una predisposición a una enfermedad o trastorno, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mejorar, alterar, remediar, mitigar, o afectar la enfermedad o trastorno, los síntomas de la enfermedad o trastorno, o la predisposición a la enfermedad.
Con respecto a los métodos de tratamiento tanto profilácticos como terapéuticos, dichos tratamientos pueden adaptarse o modificarse específicamente, basándose en el conocimiento obtenido en el campo de la farmacogenómica. "Farmacogenómica", como se usa en este documento, se refiere a la aplicación de tecnologías genómicas tales como secuenciación de genes, genética estadística y análisis de expresión génica a fármacos en desarrollo clínico y en el mercado. Más específicamente, el término se refiere al estudio de cómo los genes de un paciente determinan su respuesta a un fármaco (por ejemplo, el "fenotipo de respuesta al fármaco" o el "genotipo de respuesta al fármaco" de un paciente). Por lo tanto, también se describen métodos para adaptar el tratamiento
profiláctico o terapéutico de un individuo con las moléculas del gen diana o los moduladores del gen diana de acuerdo con el genotipo de respuesta al fármaco de ese individuo. La farmacogenómica permite a un clínico o médico dirigir tratamientos profilácticos o terapéuticos a los pacientes que se beneficiarán más del tratamiento y evitar el tratamiento de pacientes que experimentarán efectos secundarios tóxicos relacionados con los medicamentos.
1. Métodos profilácticos
También se describe, pero no forma parte de la invención, un método para prevenir en un sujeto, una enfermedad o afección asociada con una expresión o actividad aberrante o no deseada del gen diana, administrando al sujeto un agente terapéutico (por ejemplo, Un agente de ARNi o vector o transgén que codifica el mismo). Los sujetos en riesgo de una enfermedad que es causada o provocada por la expresión o actividad aberrante o no deseada del gen diana pueden identificarse mediante, por ejemplo, cualquiera o una combinación de ensayos de diagnóstico o pronóstico como se describe en el presente documento. La administración de un agente profiláctico puede ocurrir antes de la manifestación de los síntomas característicos de la aberración del gen diana, de manera que se prevenga una enfermedad o trastorno o, alternativamente, se retrase su progresión. Dependiendo del tipo de aberración del gen diana, por ejemplo, se puede usar un gen diana, un agente agonista del gen diana o antagonista del gen diana para tratar al sujeto. El agente apropiado se puede determinar basándose en los ensayos de selección descritos en el presente documento.
2. Métodos terapéuticos
También se describen, pero no forman parte de la invención, métodos para modular la expresión de genes diana, la expresión o la actividad de la proteína con fines terapéuticos. En consecuencia, dicho método modulador implica poner en contacto una célula capaz de expresar el gen diana con un agente terapéutico (por ejemplo, un agente de ARNi o vector o transgén que codifica el mismo) que es específico para el gen o proteína diana (por ejemplo, es específico para el ARNm codificado por dicho gen o especificando la secuencia de aminoácidos de dicha proteína) de manera que se modula la expresión o una o más de las actividades de la proteína diana. Estos métodos moduladores se pueden realizar in vitro (por ejemplo, cultivando la célula con el agente) o, alternativamente, in vivo (por ejemplo, administrando el agente a un sujeto). Como tal, también se describen métodos para tratar a un individuo que padece una enfermedad o trastorno caracterizado por una expresión o actividad aberrante o no deseada de un polipéptido o molécula de ácido nucleico del gen diana. La inhibición de la actividad del gen diana es deseable en situaciones en las que el gen diana no está regulado de forma anormal y/o en las que es probable que la disminución de la actividad del gen diana tenga un efecto beneficioso.
3. Farmacogenómica
Los agentes terapéuticos (por ejemplo, un agente de ARNi o un vector o transgén que los codifica) pueden administrarse a individuos para tratar (profiláctica o terapéuticamente) trastornos asociados con la actividad aberrante o no deseada del gen diana. Junto con dicho tratamiento, se puede considerar la farmacogenómica (es decir, el estudio de la relación entre el genotipo de un individuo y la respuesta de ese individuo a un compuesto o fármaco extraño). Las diferencias en el metabolismo de los agentes terapéuticos pueden provocar una toxicidad grave o un fracaso terapéutico al alterar la relación entre la dosis y la concentración en sangre del fármaco farmacológicamente activo. Por lo tanto, un médico o clínico puede considerar aplicar el conocimiento obtenido en estudios de farmacogenómica relevantes para determinar si administrar un agente terapéutico, así como adaptar la dosis y/o régimen terapéutico de tratamiento con un agente terapéutico.
La farmacogenómica se ocupa de las variaciones hereditarias clínicamente significativas en la respuesta a los fármacos debido a la disposición alterada del fármaco y la acción anormal en las personas afectadas. Véase, por ejemplo, Eichelbaum, M. et al. (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23 (10-11): 983-985 y Linder, M.W. et al. (1997) Clin. Chem. 43 (2): 254-266. En general, se pueden diferenciar dos tipos de condiciones farmacogenéticas. Las condiciones genéticas transmitidas como un factor único que alteran la forma en que los fármacos actúan en el cuerpo (acción alterada de los fármacos) o las enfermedades genéticas transmitidas como factores únicos que alteran la forma en que el cuerpo actúa sobre los fármacos (metabolismo alterado de los fármacos). Estas condiciones farmacogenéticas pueden ocurrir como defectos genéticos raros o como polimorfismos naturales. Por ejemplo, la deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) es una enzimopatía hereditaria común en la que la principal complicación clínica es la hemólisis tras la ingestión de fármacos oxidantes (antimaláricos, sulfonamidas, analgésicos, nitrofuranos) y el consumo de habas.
Un enfoque de farmacogenómica para identificar genes que predicen la respuesta a un fármaco, conocido como "una asociación de todo el genoma", se basa principalmente en un mapa de alta resolución del genoma humano que consta de marcadores relacionados con genes ya conocidos (por ejemplo, un mapa de marcadores de genes "bialélico" que consta de 60.000-100.000 sitios polimórficos o variables en el genoma humano, cada uno de los cuales tiene dos variantes). Dicho mapa genético de alta resolución se puede comparar con un mapa del genoma de cada uno de un número estadísticamente significativo de pacientes que participan en un ensayo farmacológico de fase II/IN para identificar marcadores asociados con una respuesta farmacológica o efecto secundario observados en particular. Alternativamente, dicho mapa de alta resolución se puede generar a partir de una combinación de unos diez millones
de polimorfismos conocidos de un solo nucleótido (SNP) en el genoma humano. Como se usa en este documento, un "SNP" es una alteración común que ocurre en una base de un solo nucleótido en un tramo de ADN. Por ejemplo, un SNP puede ocurrir una vez por cada 1000 bases de ADN. Un SNP puede estar involucrado en un proceso de enfermedad, sin embargo, la gran mayoría puede no estar asociada a la enfermedad. Dado un mapa genético basado en la aparición de tales SNP, los individuos pueden agruparse en categorías genéticas dependiendo de un patrón particular de SNP en su genoma individual. De esta manera, los regímenes de tratamiento se pueden adaptar a grupos de individuos genéticamente similares, teniendo en cuenta los rasgos que pueden ser comunes entre dichos individuos genéticamente similares.
Alternativamente, se puede utilizar un método denominado "enfoque de gen candidato" para identificar genes que predicen la respuesta al fármaco. De acuerdo con este método, si se conoce un gen que codifica fármacos diana (por ejemplo, un polipéptido de un gen diana como se describe en este documento), todas las variantes comunes de ese gen se pueden identificar con bastante facilidad en la población y se puede determinar si tiene una versión del gen frente a otro asociado con una respuesta a un fármaco particular.
La actividad de las enzimas metabolizadoras de fármacos puede ser un determinante principal tanto de la intensidad como de la duración de la acción del fármaco. El descubrimiento de polimorfismos genéticos de las enzimas metabolizadoras de fármacos (por ejemplo, N-acetiltransferasa 2 (NAT 2) y enzimas del citocromo P450 CYP2D6 y CYP2C19) ha proporcionado una explicación de por qué algunos pacientes no obtienen los efectos farmacológicos esperados o muestran una respuesta farmacológica exagerada y toxicidad grave después de tomar la dosis estándar y segura de un medicamento. Estos polimorfismos se expresan en dos fenotipos en la población, el metabolizador extenso (EM) y el metabolizador pobre (PM). La prevalencia de PM es diferente entre diferentes poblaciones. Por ejemplo, el gen que codifica CYP2D6 es muy polimórfico y se han identificado varias mutaciones en PM, todas las cuales conducen a la ausencia de CYP2D6 funcional. Los metabolizadores pobres de CYP2D6 y CYP2C19 experimentan con bastante frecuencia una respuesta farmacológica exagerada y efectos secundarios cuando reciben dosis estándar. Si un metabolito es la fracción terapéutica activa, el PM no muestran respuesta terapéutica, como se demostró con el efecto analgésico de la codeína mediado por su metabolito morfina formado por CYP2D6. El otro extremo son los denominados metabolizadores ultrarrápidos que no responden a las dosis estándar. Recientemente, se ha identificado que la base molecular del metabolismo ultrarrápido se debe a la amplificación del gen CYP2D6.
Alternativamente, se puede utilizar un método denominado "perfil de expresión génica" para identificar genes que predicen la respuesta al fármaco. Por ejemplo, la expresión génica de un animal al que se le administró un agente terapéutico descrito en el presente documento puede dar una indicación de si se han activado las rutas génicas relacionadas con la toxicidad.
La información generada a partir de más de uno de los enfoques farmacogenómicos anteriores se puede usar para determinar los regímenes de dosificación y tratamiento apropiados para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un individuo. Este conocimiento, cuando se aplica a la dosificación o la selección de fármacos, puede evitar reacciones adversas o fallos terapéuticos y, por lo tanto, mejorar la eficacia terapéutica o profiláctica cuando se trata a un sujeto con un agente terapéutico, como se describe en el presente documento.
Los agentes terapéuticos se pueden probar en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, un agente de ARNi (o vector de expresión o transgén que codifica el mismo) como se describe en el presente documento puede usarse en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad o efectos secundarios del tratamiento con dicho agente. Alternativamente, se puede usar un agente terapéutico en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de dicho agente. Por ejemplo, se puede usar un agente en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad o efectos secundarios del tratamiento con dicho agente. Alternativamente, se puede usar un agente en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de dicho agente.
V. Composiciones farmacéuticas
También se describen usos de los agentes descritos anteriormente para tratamientos terapéuticos como se describe más adelante. Por consiguiente, los moduladores se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Tales composiciones comprenden típicamente la molécula de ácido nucleico, proteína, anticuerpo o compuesto modulador y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en este documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones.
Se puede formular una composición farmacéutica para que sea compatible con su ruta de administración pretendida. Los ejemplos de rutas de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica) y transmucosa. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes
componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELMR (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida para permitir que sea inyectada con facilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. Puede conseguirse una absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada en forma estéril del mismo.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden incluirse en cápsulas de gelatina o comprimirse en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, grageas o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido para usar como enjuague bucal, en el que el compuesto en el vehículo fluido se aplica por ruta oral y se enjuaga y expectora o traga. Se pueden incluir agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, pastillas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente como almidón o lactosa, un agente desintegrante como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante como estearato de magnesio o Esterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosa o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a permear. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa se puede lograr mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, ungüentos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica.
Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.
Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán al compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente a través de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (que incluyen liposomas destinados a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también
pueden usarse como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos No.
4.522.811.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa en este documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación de la invención está dictada y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos. Aunque se pueden usar compuestos que exhiben efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado de diseñar un sistema de administración que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y los estudios en animales se pueden utilizar para formular un intervalo de dosis para su uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en los métodos descritos en este documento, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración EN plasma circulante que incluye la CE50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una respuesta semimáxima) determinada en cultivo celular. Esta información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un recipiente, paquete o dispensador junto con las instrucciones de administración.
VI. Células u organismos bloqueados y/o desactivados
Un uso preferido adicional para los agentes de ARNi de la presente invención (o vectores o transgenes que los codifican) es un análisis funcional para llevarse a cabo en células u organismos eucariotas no humanos, preferiblemente células u organismos de mamíferos y lo más preferiblemente células humanas, por ejemplo, líneas celulares tales como HeLa o 293 o de roedores, por ejemplo, de ratas y ratones. Al administrar un agente de ARNi adecuado que sea suficientemente complementario a una secuencia de ARNm diana para dirigir ARN de interferencia específica de la diana, se puede obtener un fenotipo bloqueado o inactivado específico en una célula diana, por ejemplo, en un cultivo celular o en un organismo diana.
Por lo tanto, también se describe una célula eucariota o un organismo no humano eucariota que muestra un fenotipo de bloqueo o inactivación específico del gen diana que comprende una expresión completa o al menos parcialmente deficiente de al menos un gen diana endógeno en el que dicha célula u organismo es transfectado con al menos un vector que comprende ADN que codifica un agente de ARNi capaz de inhibir la expresión del gen diana. Cabe señalar que la presente invención permite un bloqueo o inactivación específico de la diana de varios genes endógenos diferentes debido a la especificidad del agente de ARNi.
Los fenotipos de bloqueo o inactivación específicos del gen de células u organismos no humanos, particularmente de células humanas o mamíferos no humanos, pueden usarse en procedimientos analíticos, por ejemplo, en el análisis funcional y/o fenotípico de procesos fisiológicos complejos como el análisis de perfiles de expresión génica y/o proteomas. Preferiblemente, el análisis se lleva a cabo mediante métodos de alto rendimiento utilizando chips basados en oligonucleótidos.
Usando tecnologías de bloqueo o inactivación basadas en ARNi, la expresión de un gen diana endógeno puede inhibirse en una célula diana o un organismo diana. El gen endógeno puede complementarse con un ácido nucleico exógeno diana que codifica la proteína diana o una variante o forma mutada de la proteína diana, por ejemplo, un gen o un ADN, que opcionalmente se puede fusionar con una secuencia de ácido nucleico adicional que codifica un péptido o polipéptido detectable, por ejemplo, una etiqueta de afinidad, particularmente una etiqueta de afinidad múltiple.
Las variantes o formas mutadas del gen diana se diferencian del gen diana endógeno en que codifican un producto
génico que difiere del producto génico endógeno en el nivel de aminoácidos por sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de uno o varios aminoácidos. Las variantes o formas mutadas pueden tener la misma actividad biológica que el gen diana endógeno. Por otro lado, el gen diana variante o mutado también puede tener una actividad biológica, que difiere de la actividad biológica del gen diana endógeno, por ejemplo, una actividad parcialmente eliminada, una actividad completamente eliminada, una actividad mejorada, etc. La complementación se puede lograr comprimiendo el polipéptido codificado por el ácido nucleico endógeno, por ejemplo, una proteína de fusión que comprende la proteína diana y la etiqueta de afinidad y la molécula de ARN bicatenario para bloquear el gen endógeno en la célula diana. Esta compresión se puede lograr usando un vector de expresión adecuado que exprese tanto el polipéptido codificado por el ácido nucleico endógeno, por ejemplo, la proteína diana modificada con etiqueta y la molécula de ARN bicatenario o alternativamente usando una combinación de vectores de expresión. Las proteínas y los complejos de proteínas que se sintetizan nuevamente en la célula diana contendrán el producto génico exógeno, por ejemplo, la proteína de fusión modificada. Para evitar la supresión del producto génico exógeno por parte del agente de a Rn í, la secuencia de nucleótidos que codifica el ácido nucleico exógeno puede alterarse a nivel del ADN (con o sin causar mutaciones en el nivel de aminoácidos) en la parte de la secuencia que es homóloga al agente de ARNi. Alternativamente, el gen diana endógeno puede ser complementado con secuencias de nucleótidos correspondientes de otras especies, por ejemplo, de ratón.
VII. Organismos transgénicos
Los precursores de ARN modificados pueden expresarse en animales transgénicos. Estos animales representan un sistema modelo para el estudio de trastornos que son causados por, o exacerbados por, sobreexpresión o subexpresión (en comparación con el tipo silvestre o normal) de ácidos nucleicos (y sus polipéptidos codificados) destinados a la destrucción por los agentes de ARNi, por ejemplo, ARNip y ARNhp, y para el desarrollo de agentes terapéuticos que modulan la expresión o actividad de ácidos nucleicos o polipéptidos destinados a la destrucción.
Los animales transgénicos pueden ser animales de granja (cerdos, cabras, ovejas, vacas, caballos, conejos y similares), roedores (como ratas, cobayas y ratones), primates no humanos (por ejemplo, babuinos, monos y chimpancés) y animales domésticos (por ejemplo, perros y gatos). Pueden usarse invertebrados tales como Caenorhabditis elegans o Drosophila, así como vertebrados no mamíferos como peces (por ejemplo, pez cebra) o aves (por ejemplo, pollos).
Se prefieren los precursores de ARN modificados con tallos de 18 a 30 nucleótidos de longitud para su uso en mamíferos, tales como ratones. Se puede identificar un animal fundador transgénico basándose en la presencia de un transgén que codifica los nuevos precursores de ARN en su genoma y/o la expresión del transgén en tejidos o células de los animales, por ejemplo, usando PCR o análisis Northern. La expresión se confirma mediante una disminución en la expresión (ARN o proteína) de la secuencia diana.
Puede usarse un animal fundador transgénico para criar animales adicionales que portan el transgén. Además, los animales transgénicos que portan un transgén que codifica los precursores de ARN pueden cruzarse con otros animales transgénicos que portan otros transgenes. Además, las células obtenidas del animal fundador transgénico o su descendencia pueden cultivarse para establecer líneas celulares primarias, secundarias o inmortales que contienen el transgén.
1. Procedimientos para la fabricación de animales transgénicos no humanos
Se han utilizado varios métodos para obtener animales transgénicos, no humanos, que son animales que han ganado un gen adicional mediante la introducción de un transgén en sus células (por ejemplo, tanto las células somáticas como las genn), o en la línea genn de un antepasado. En algunos casos, los animales transgénicos pueden ser generados por instalaciones comerciales (por ejemplo, The Transgenic Drosophila Facility en Michigan State University, The Transgenic Zebrafish Core Facility en el Medical College of Georgia (Augusta, Georgia) y Xenogen Biosciences (St. Louis, MO En general, la construcción que contiene el transgén se suministra a la instalación para generar un animal transgénico.
Los métodos para generar animales transgénicos incluyen la introducción del transgén en la línea germinal del animal. Un método es mediante la microinyección de un constructo genética en el pronúcleo de un embrión en etapa temprana (por ejemplo, Antes de la etapa de cuatro células; Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5016; Brinster et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438). Alternativamente, el transgén puede introducirse en el pronúcleo mediante infección retroviral. Se ha descrito un procedimiento detallado para producir tales ratones transgénicos (véase, por ejemplo, Hogan et al., MP1 ulando Mouse ErnbnLo. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1986); Patente de Estados Unidos No. 5.175.383 (1992)). Este procedimiento también se ha adaptado para otras especies animales (por ejemplo, Hammer et al., 1985, Nature 315: 680; Murray et al., 1989, Reprod. Fert. Devl. 1: 147; Pursel et al., 1987, Vet. hnmunol. Histopath. 17: 303; Rexroad et al., 1990, J. Reprod. Fert. 41 (supl.): 119; Rexroad et al., 1989, Molec. Reprod. Devl. 1: 164; Simons et al., 1988, BioTechnology 6: 179; Vize et al., 1988, J. Cell. Sci. 90: 295; y Wagner, 1989, J. Cell. Biochem. 13B (supl.): 164).
En resumen, el procedimiento implica la introducción del transgén en un animal mediante la microinyección del
constructo en los pronúcleos del ovulo u óvulos de mamífero fertilizados para hacer que una o más copias del transgén se retengan en las células del mamífero o mamíferos en desarrollo. Después de la introducción del constructo transgénico en el óvulo fertilizado, el óvulo puede incubarse in vitro durante períodos de tiempo variables, o reimplantarse en un huésped sustituto, o ambos. Un método común es incubar los embriones in vitro durante aproximadamente 1-7 días, dependiendo de la especie, y luego reimplantarlos en el huésped sustituto. La presencia del transgén en la progenie de los embriones modificados transgénicamente puede probarse mediante análisis de transferencia Southern de un segmento de tejido.
Otro método para producir animales transgénicos de línea germinal es mediante el uso de células madre embrionarias (ES). El constructo génico puede introducirse en células madre embrionarias mediante recombinación homóloga (Thomas et al., 1987, Cell 51: 503; Capecchi, Science 1989, 244: 1288; Joyner et al., 1989, Nature 338: 153) en una región transcripcionalmente activa del genoma. También se puede introducir un constructo adecuado en células madre embrionarias mediante transfección mediada por ADN, tal como mediante electroporación (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987). Los procedimientos detallados para cultivar células madre embrionarias (por ejemplo, ES-D3 @ At Cc # CCL-1934, ES-E14TG2a, ATCC # CCL-1821, American Type Culture Collection, Rockville, a M) y los métodos para producir animales transgénicos a partir de células madre embrionarias pueden se puede encontrar en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach, ed. E.J. Robertson (IRL Press, 1987). En resumen, las células ES se obtienen a partir de embriones previamente implantados cultivados in vitro (Evans et al., 1981, Nature 292: 154-156). Los transgenes pueden introducirse de manera eficaz en células ES mediante transfección de ADN o mediante transducción mediada por retrovirus. Las células ES resultantes transformadas pueden combinarse posteriormente con blastocistos de un animal no humano. Las células ES colonizan el embrión y contribuyen a la línea genn del animal quimérico resultante.
En los métodos anteriores, el transgén puede introducirse como un constructo lineal, un plásmido circular o un vector viral, que puede incorporarse y heredarse como un transgén integrado en el genoma del huésped. El transgén también puede construirse para permitir que se herede como un plásmido extracromosómico (Gassmann et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1292). Un plásmido es una molécula de ADN que puede replicarse de forma autónoma en un huésped.
Los animales transgénicos no humanos también se pueden obtener infectando o transfectando células in vivo (por ejemplo, Inyección directa), ex vivo (por ejemplo, Infectando las células fuera del huésped y reimplantando posteriormente) o in vitro (por ejemplo, infectando las células fuera del huésped), por ejemplo, con un vector viral recombinante que porta un gen que codifica los precursores de ARN modificados. Los ejemplos de vectores virales adecuados incluyen vectores retrovirales recombinantes (Valerio et al., 1989, Gene 84: 419; Scharfinan et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 462; Miller y Buttimore, 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 2895), vectores adenovirales recombinantes (Freidman et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 3791; Levrero et al., 1991, Gene 101: 195), y vectores recombinantes del virus del Herpes simplex (Fink et al., 1992, Human Gene Therapy 3:11). Dichos métodos también son útiles para introducir constructos en células para usos distintos de la generación de animales transgénicos.
Otros enfoques incluyen la inserción de transgenes que codifican los nuevos precursores de ARN modificados en vectores virales que incluyen adenovirus recombinante, virus adenoasociado y virus 1 del herpes simple, o plásmidos bacterianos o eucariotas recombinantes. Los vectores virales transfectan células directamente. Otros enfoques incluyen administrar los transgenes, en forma de ADN plasmídico, con la ayuda por ejemplo de, liposomas catiónicos (lipofectina) o conjugados de polilisina derivatizados (por ejemplo, anticuerpos conjugados), gramacidina S, envolturas virales artificiales u otros vehículos intracelulares similares, así como la inyección directa del constructo transgénico o la precipitación con CaPO4 llevada a cabo in vivo. Dichos métodos también pueden usarse in vitro para introducir constructos en células para usos distintos de la generación de animales transgénicos.
Los vectores de retrovirus y los vectores de virus adenoasociados se pueden usar como un sistema recombinante de suministro de genes para la transferencia de genes exógenos in vivo o in vitro. Estos vectores proporcionan un suministro eficaz de genes a las células y los ácidos nucleicos transferidos se integran de forma estable en el ADN cromosómico del huésped. El desarrollo de líneas celulares especializadas (denominadas "células de empaquetamiento") que producen solo retrovirus con replicación defectuosa ha aumentado la utilidad de los retrovirus para la terapia génica, y los retrovirus defectuosos se caracterizan para su uso en la transferencia génica con fines de terapia génica, 1990, Blood 76: 271). Un retrovirus de replicación defectuosa se puede empaquetar en viriones que se pueden usar para infectar una célula diana mediante el uso de un virus auxiliar mediante técnicas estándar. Los protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con tales virus se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al., (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Secciones 99.14 y otros manuales de laboratorio estándar.
Los ejemplos de retrovirus adecuados incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM que son conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de líneas de virus de empaquetamiento adecuadas para preparar tanto sistemas retrovirales ecotrópicos como anfotrópicos incluyen Psi-Crip, PsiCre, Psi-2 y Psi-Am. Los retrovirus se han utilizado para introducir una variedad de genes en muchos tipos de células diferentes, incluidas las células epiteliales, in vitro y/o in vivo (véase, por ejemplo, Eglitis, et al., 1985, Science 230: 1395-1398; Danos y Mulligan, 1988, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 85: 6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 85: 3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. NatI. Acad.
Sci. USA 87: 61416145; Huber et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 8377 -8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254: 1802-1805; van Beusechem. Et al., 1992, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 7640-19; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3: 641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol.150: 4104-4115; patente de los Estados Unidos No.
4.868.116; patente de los Estados Unidos No. 4.980.286; Solicitud PCT WO 89/07136; Solicitud PCT WO 89/02468; Solicitud PCT WO 89/05345; y Solicitud PCT WO 92/07573).
En otro ejemplo, los vectores retrovirales recombinantes capaces de transducir y expresar genes insertados en el genoma de una célula pueden producirse transfectando el genoma retroviral recombinante en líneas celulares de empaquetamiento adecuadas tales como PA317 y Psi-CRIP (Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2: 5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6349). Los vectores adenovirales recombinantes pueden usarse para infectar una amplia variedad de células y tejidos en huéspedes susceptibles (por ejemplo, rata, hámster, perro y chimpancé) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166: 769), y también tienen la ventaja de no requerir células mitóticamente activas para la infección. Otro sistema de administración de genes virales útil en la presente invención también utiliza vectores derivados de adenovirus. El genoma de un adenovirus puede manipularse de modo que codifique y exprese un producto génico de interés, pero se inactive en términos de su capacidad para replicarse en un ciclo de vida viral lítico normal. Véase, por ejemplo, Berkner et al. (1988, BioTechniques 6: 616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252: 431-434) y Rosenfeld et al. (1992, Cell 68: 143-155). Los expertos en la técnica conocen vectores adenovirales adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 d 1324 u otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Ad2, AO, Ad7, etc.). Los adenovirus recombinantes pueden ser ventajosos en determinadas circunstancias porque no son capaces de infectar células que no se dividen y pueden usarse para infectar una amplia variedad de tipos de células, incluidas las células epiteliales (Rosenfeld et al., 1992, citado anteriormente). Además, la partícula de virus es relativamente estable y susceptible de purificación y concentración, y como anteriormente, puede modificarse para afectar el espectro de infectividad. Además, el ADN adenoviral introducido (y el ADN extraño contenido en él) no se integra en el genoma de una célula huésped, pero permanece episomal, evitando así los problemas potenciales que pueden ocurrir como resultado de la mutagénesis de inserción in situ en la que el ADN introducido se integra en el genoma del huésped (por ejemplo, ADN retroviral). Además, la capacidad de carga del genoma adenoviral para el ADN extraño es grande (hasta 8 kilo bases) en relación con otros vectores de administración de genes (Berkner et al., citado anteriormente; Haj-Ahmand y Graham, 1986, J. Virol. 57: 267).
Otro sistema de vector viral más útil para la administración de los transgenes objetivo es el virus adenoasociado (AAV). El virus adenoasociado es un virus defectuoso de origen natural que requiere otro virus, tal como un adenovirus o un virus del herpes, como virus auxiliar para una replicación eficaz y un ciclo de vida productivo. Para una revisión, vease Muzyczka et al., (1992, Curr. Topics in Micro. and Immunol. 158: 97-129). También es uno de los pocos virus que pueden integrar su ADN en células que no se dividen y exhibe una alta frecuencia de integración estable (véase, por ejemplo, Flotte et al. (1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349-356; Samulski et al., 1989, J. Virol. 63: 3822-3828; y McLaughlin et al. (1989, J. Virol. 62: 1963-1973). Vectores que contienen tan solo 300 pares de bases de AAV se pueden empaquetar y se pueden integrar. El espacio para el ADN exógeno está limitado a aproximadamente 4,5 kb. Se puede utilizar un vector de AAV como el descrito en Tratschin et al. (1985) MoL Cell. Biol. 5: 3251-3260 para introducir ADN en las células. Se han introducido una variedad de ácidos nucleicos en diferentes tipos de células utilizando vectores de AAV (véase, por ejemplo, Hennonat et al., (1984) Proc. Nad. Acad. Sci. USA 8 1: 64666470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. BioL 4: 2072-2081; Wondisford et al., (1988) MoL EndocrinoL 2: 32-39; Tratschin et al., (1984) J ViroL 51: 611-619; y Flotte et al., (1993) J BioL Chem. 268: 3781-3790).
Además de los métodos de transferencia viral, como los ilustrados anteriormente, también se pueden emplear métodos no virales para provocar la expresión de un ARNhp o un precursor de ARN modificado en el tejido de un animal. La mayoría de los métodos no virales de transferencia de genes se basan en mecanismos normales utilizados por las células de mamíferos para la captación y el transporte intracelular de macromoléculas. Los sistemas de suministro de genes no virales como se describen en este documento pueden depender de rutas endocíticas para la captación del gen objetivo por la célula diana. Los ejemplos de sistemas de suministro de genes de este tipo incluyen sistemas derivados de liposomas, conjugados de polilisina y envolturas virales artificiales. Otros ejemplos incluyen sistemas de inyección de plásmidos como los descritos en Meuli et al., (2001) J Invest. DerinatoL, 116 (1): 131-135; Cohen et al., (2000) Gene Ther., 7 (22): 1896-905; y Tam et al., (2000) Gene Ther., 7 (21): 186774.
Un gen que codifica un ARNhp o un precursor de ARN modificado se puede atrapar en liposomas que llevan cargas positivas en su superficie (por ejemplo, lipofectinas) y (opcionalmente) que están marcadas con anticuerpos contra los antígenos de la superficie celular del tejido diana (Mizuno et al., (1992) No Shinkei Geka, 20: 547-55 1; publicación PCT WO91/06309; solicitud de patente japonesa 1047381; y publicación de patente europea EP-A-43075).
Los animales que albergan el transgén pueden identificarse detectando la presencia del transgén en el ADN genómico (por ejemplo, usando análisis Southern). Además, la expresión del ARNhp o del precursor de ARN modificado puede detectarse directamente (por ejemplo, mediante análisis Northern). La expresión del transgén también se puede confirmar detectando una disminución en la cantidad de proteína correspondiente a la secuencia diana. Cuando el transgén está bajo el control de un promotor inducible o regulado por el desarrollo, la expresión de la proteína diana disminuye cuando se induce el transgén o en la etapa de desarrollo cuando se expresa el transgén, respectivamente.
2. Clones de animales transgénicos
Los clones de los animales transgénicos no humanos descritos en el presente documento se pueden producir de acuerdo con los métodos descritos en Wilmut et al., ((1997) Nature, 385: 810-813) y las publicaciones PCT números WO 97/07668 y WO 97/07669. En resumen, una célula, por ejemplo, una célula somática del animal transgénico puede aislarse e inducirse a salir del ciclo de crecimiento y entrar en la fase GO para volverse inactiva. La célula inactiva se puede fusionar luego, por ejemplo, mediante el uso de pulsos eléctricos, a un ovocito enucleado de un animal de la misma especie de la que se aísla la célula inactiva. A continuación, el ovocito reconstruido se cultiva de manera que se convierta en una mórula o blastocito y luego se transfiere a una hembra adoptiva pseudopreñada. La descendencia de este animal adoptivo hembra serán clones del animal del que se aisló la célula, por ejemplo, la célula somática.
Una vez que se produce el animal transgénico, se examinan las células del animal transgénico y las células de un animal de control para determinar la presencia de una secuencia de ácido nucleico precursora de ARN, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Alternativamente, las células se pueden cribar para determinar si el precursor de ARN se expresa (por ejemplo, mediante procedimientos estándar tales como el análisis de transferencia Northern o la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, (Laboratorio Cold Spring Harbor, 1989)).
Los animales transgénicos descritos en este documento pueden ser homocigotos o heterocigotos, y uno de los beneficios de la invención es que el ARNm diana se degrada eficazmente incluso en heterocigotos. También se describen animales transgénicos que portan un transgén en todas sus células, así como animales que portan un transgén en algunas, pero no en todas sus células. Es decir, también se describen animales de mosaico. El transgén se puede integrar como un solo transgén o en concatámeros, por ejemplo, tándems cabeza con cabeza o tándems cabeza con cola.
Para una revisión de las técnicas que pueden usarse para generar y evaluar animales transgénicos, los artesanos expertos pueden consultar Gordon (IwL Rev. CytoL 115: 171-229, 1989), y pueden obtener orientación adicional de, por ejemplo: Hogan et al., "Manipulating the Mouse Embryo" (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986; Krimpenfort et al., BiolTechnology 9:86, 1991; Palmiter et al., Cell 41:343, 1985; Kraemer et al., "Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo," Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1985; Hammer et al., Nature 315:680, 1985; Purcel et al., Scieizce, 244:1281, 1986; Wagner et al., patente de los Estados Unidos No. 5.175.385 y Krimpenfort et al., patente de los Estados Unidos No. 5.175.384
3. Plantas transgénicas
Entre los organismos eucariotas presentados se encuentran plantas que contienen un ácido nucleico exógeno que codifica un precursor de ARN modificado.
Por consiguiente, un método descrito comprende elaborar una planta que tenga una molécula o constructo de ácido nucleico, por ejemplo, un transgén, como se describe en el presente documento. Las técnicas para introducir ácidos nucleicos exógenos en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas son conocidas en la técnica e incluyen, sin limitación, transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por vectores virales, electroporación y transformación con pistola de partículas, véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos 5.204.253 y 6.013.863. Si se usa un cultivo celular o de tejido como tejido receptor para la transformación, las plantas pueden regenerarse a partir de cultivos transformados mediante técnicas conocidas por los expertos en el arte. Las plantas transgénicas se pueden ingresar en un programa de reproducción, por ejemplo, para introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido en otras líneas, para transferir el ácido nucleico a otras especies o para una selección adicional de otros rasgos deseables. Alternativamente, las plantas transgénicas se pueden propagar vegetativamente para aquellas especies susceptibles de tales técnicas. La progenie incluye a los descendientes de una planta o línea vegetal en particular. La progenie de una planta incluye semillas formadas en F1, F2, F3 y plantas de generación subsiguiente, o semillas formadas en BQ, BC2, BC3 y plantas de generación subsiguiente. Las semillas producidas por una planta transgénica pueden cultivarse y luego autofecundarse (o cruzarse y autofecundarse) para obtener semillas homocigóticas para el ácido nucleico que codifica un nuevo polipéptido.
Un grupo adecuado de plantas con las que practicar la invención incluye dicotiledóneas, tales como cártamo, alfalfa, soja, colza (alto contenido de ácido erúcico y canola) o girasol. También son adecuadas las monocotiledóneas como maíz, trigo, centeno, cebada, avena, arroz, mijo, amaranto o sorgo. También son adecuados cultivos de hortalizas o tubérculos tales como patata, brócoli, guisantes, maíz dulce, maíz pira, tomate, judías (incluidos frijoles, frijoles de lima, frijoles secos, frijoles verdes) y similares. También son adecuados los cultivos de frutas tales como melocotón, pera, manzana, cereza, naranja, limón, pomelo, ciruela, mango y palma. Por lo tanto, se puede utilizar una amplia gama de plantas, incluyendo especies de los géneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyalnus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panicum, Pannesetum, Persea, Phaseolus, Pisum, Pistachia Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna y Zea.
El experto en la técnica apreciará que los organismos enumerados también son útiles para poner en práctica otros aspectos de la invención, por ejemplo, como células huésped, como se describió anteriormente.
Las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento pueden expresarse en plantas de una manera específica de tejido o célula de acuerdo con los elementos reguladores elegidos para incluir en un constructo de ácido nucleico particular presente en la planta. Las células, tejidos y órganos adecuados en los que expresar un polipéptido quimérico incluyen, sin limitación, óvulo, célula central, célula sinérgica, cigoto, primordios de óvulos, nucelo, tegumentos, endotelio, células garnetofitas femeninas, embrión, eje, cotiledones, suspensor, endospermo, cubierta de la semilla, meristemo molido, haz vascular, cambium, floema, corteza, meristemas apicales de brotes o raíces, meristemas de brotes laterales o de raíces, meristemas florales, primordios foliares, células del mesófilo foliar y células epidérmicas foliares, por ejemplo, células epidérmicas involucradas en fortalecer la capa cuticular. También son adecuadas las células y tejidos que crecen en medios líquidos o en medios semisólidos.
4. Hongos transgénicos
Otros organismos eucariotas son hongos que contienen una molécula exógena de ácido nucleico que codifica un precursor de ARN modificado de la invención. Por consiguiente, un método puede comprender introducir una molécula de ácido nucleico o constructo como se describe en este documento en un hongo. Las técnicas para introducir ácidos nucleicos exógenos en muchos hongos se conocen en la técnica, véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.252.726 y 5.070.020. Los hongos transformados pueden cultivarse mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Tales hongos pueden usarse para introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido en otras cepas de hongos, para transferir el ácido nucleico a otras especies o para una selección adicional de otros rasgos deseables.
Un grupo adecuado de hongos con los que practicar la invención incluye levadura de fisión y levadura de gemación, tales como Saccharomyces cereviseae, S. pombe, S. carlsbergeris y Candida albicans. Hongos filamentosos como Aspergillus spp. y Penicillium spp. también son útiles.
VIII. Genómica funcional y/o proteómica
Las aplicaciones preferidas para la célula u organismo descritos en este documento son el análisis de perfiles de expresión génica y/o proteomas. Puede llevarse a cabo un análisis de una forma variante o mutante de una o varias proteínas diana, en el que dichas formas variantes o mutantes se reintroducen en la célula u organismo mediante un ácido nucleico exógeno diana como se describió anteriormente. La combinación de bloqueo de un gen endógeno y rescate mediante el uso de una diana exógena mutada, por ejemplo, parcialmente eliminada tiene ventajas en comparación con el uso de una célula con bloqueo de genes. Además, este método es particularmente adecuado para identificar dominios funcionales de la proteína diana. Además, se puede llevar a cabo una comparación, por ejemplo, de perfiles de expresión génica y/o proteomas y/o características fenotípicas de al menos dos células u organismos. Estos organismos se seleccionan de: (i) una célula de control u organismo de control sin inhibición del gen diana, (ii) una célula u organismo con inhibición del gen diana y (iii) una célula u organismo con inhibición del gen diana más la complementación del gen diana mediante un ácido nucleico diana exógena.
Además, el método de complementación de bloqueo del ARN puede usarse con fines preparativos, por ejemplo, para la purificación por afinidad de proteínas o complejos de proteínas de células eucariotas, particularmente células de mamíferos y más particularmente células humanas. En este ejemplo, el ácido nucleico diana exógeno preferiblemente codifica una proteína diana que se fusiona con la etiqueta de afinidad de la técnica. Este método es adecuado para el análisis de proteomas funcionales en células de mamíferos, particularmente células humanas.
Otra utilidad de la presente invención podría ser un método para identificar la función génica en un organismo que comprenda el uso de un agente de ARNi para inhibir la actividad de un gen diana de función previamente desconocida. En lugar del lento y laborioso aislamiento de mutantes mediante cribado genético tradicional, la genómica funcional contemplaría determinar la función de genes no caracterizados empleando la invención para reducir la cantidad y/o alterar el tiempo de actividad del gen diana. La invención podría usarse para determinar dianas potenciales para productos farmacéuticos, comprender eventos normales y patológicos asociados con el desarrollo, determinar rutas de señalización responsables del desarrollo/envejecimiento posnatal y similares. La velocidad cada vez mayor de adquirir información de la secuencia de nucleótidos de fuentes genómicas y expresadas, incluidas las secuencias totales de los genomas de levadura, D. melanogaster y C. elegans, se pueden combinar con la invención para determinar la función génica en un organismo (por ejemplo, Nematodo). La preferencia de diferentes organismos para usar codones particulares, buscar en bases de datos de secuencias productos génicos relacionados, correlacionar el mapa de ligamiento de rasgos genéticos con el mapa físico del cual se derivan las secuencias de nt, y se pueden usar métodos de inteligencia artificial para definir marcos de lectura abiertos putativos a partir de las secuencias de nucleótidos adquiridas en tales proyectos de secuenciación. Un ensayo simple sería inhibir la expresión génica de acuerdo con la secuencia parcial disponible a partir de una etiqueta de secuencia expresada (EST). Las alteraciones funcionales en el crecimiento, desarrollo, metabolismo, resistencia a enfermedades u otros procesos biológicos serían indicativos del papel normal del producto génico de EST.
La facilidad con la que se puede introducir ARN en una célula/organismo intacto que contiene el gen diana permite que la presente invención se utilice en el cribado de alto rendimiento (HTS). Las soluciones que contienen agentes de ARNi que son capaces de inhibir los diferentes genes expresados se pueden colocar en pocillos individuales colocados en una placa de microtitulación como una matriz ordenada, y las células/organismos intactos en cada pocillo se pueden analizar para detectar cualquier cambio o modificación en el comportamiento o el desarrollo debido a la inhibición de la actividad del gen diana. El ARN amplificado puede ser alimentado directamente, inyectado en la célula/organismo que contiene el gen diana. Alternativamente, el agente de ARNi se puede producir a partir de un vector, como se describe en el presente documento. Los vectores pueden inyectarse en la célula/organismo que contiene el gen diana. La función del gen diana se puede analizar a partir de los efectos que tiene en la célula/organismo cuando se inhibe la actividad del gen. Este cribado podría ser adecuado para sujetos pequeños que pueden procesarse en gran número, por ejemplo: arabidopsis, bacterias, drosophila, hongos, nematodos, virus, pez cebra y células de cultivo de tejidos derivadas de mamíferos. Un nematodo u otro organismo que produce una señal colorimétrica, fluorogénica o luminiscente en respuesta a un promotor regulado (por ejemplo, transfectado con un constructo de gen indicador) puede ensayarse en un formato HTS.
La presente invención puede ser útil para permitir la inhibición de genes esenciales. Dichos genes pueden ser necesarios para la viabilidad de la célula u organismo solo en etapas particulares de desarrollo o compartimentos celulares. El equivalente funcional de mutaciones condicionales puede producirse inhibiendo la actividad del gen diana cuando o donde no se requiere para la viabilidad. La invención permite la adición del agente de ARNi en momentos específicos de desarrollo y ubicaciones en el organismo sin introducir mutaciones permanentes en el genoma diana.
IX. Ensayos de cribado
Los métodos descritos en el presente documento también son adecuados para su uso en métodos para identificar y/o caracterizar agentes farmacológicos potenciales, por ejemplo, identificar nuevos agentes farmacológicos a partir de una colección de sustancias de prueba y/o caracterizar mecanismos de acción y/o efectos secundarios de agentes farmacológicos conocidos.
Por lo tanto, también se describe un sistema para identificar y/o caracterizar agentes farmacológicos que actúan sobre al menos una proteína diana que comprende: (a) una célula eucariota o un organismo eucariota no humano capaz de expresar al menos un gen diana endógeno que codifica para dicha proteína diana, (b) al menos una molécula de agente de ARNi capaz de inhibir la expresión de dicho al menos un gen diana endógeno, y (c) una sustancia de prueba o una colección de sustancias de prueba en las que las propiedades farmacológicas de dicha sustancia de prueba o dicha colección debe ser identificada y/o caracterizada. Además, el sistema como se describió anteriormente comprende preferiblemente: (d) al menos un ácido nucleico diana exógeno que codifica la proteína diana o una variante o forma mutada de la proteína diana en la que dicho ácido nucleico diana exógeno difiere del gen diana endógeno a nivel acido nucleico de modo que la expresión del ácido nucleico diana exógena sea sustancialmente menos inhibida por el agente de ARNi que la expresión del gen diana endógeno.
Los compuestos de prueba descritos en el presente documento se pueden obtener usando cualquiera de los numerosos enfoques en métodos de biblioteca combinatoria conocidos en la técnica, que incluyen: bibliotecas biológicas; bibliotecas en fase sólida o en fase de solución paralelas espacialmente direccionables; métodos de biblioteca sintética que requieren deconvolución; el método de la biblioteca de 'una perla un compuesto'; y métodos de biblioteca sintética que utilizan selección por cromatografía de afinidad. El enfoque de biblioteca biológica se limita a bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de compuestos de péptidos, oligómeros no peptídicos o moléculas pequeñas (Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145).
Se pueden encontrar en la técnica ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares, por ejemplo, en: DeWitt et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90: 6909; Erb et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al., (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al., (1993) Science 261: 1303; Carrell et al., (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al., (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; y en Gallop et al., (1994) J. Med. Chem. 37: 1233.
Las bibliotecas de compuestos se pueden presentar en solución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421), o en perlas (Lam (1991) Nature 354: 82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364: 555-556), bacterias (Ladner patente de los Estados Unidos No. 5.223.409), esporas (Ladner patente de los Estados Unidos No. 5.223.409), plásmidos (Cull et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865-1869) o en fagos (Scott y Smith (1990) Science 249: 386-390); (Devlin (1990) Science 249: 404-406); (Cwirla et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-310); (Ladner citado anteriormente)).
La biblioteca puede ser una biblioteca de productos naturales, por ejemplo, una biblioteca producida por un cultivo bacteriano, fúngico o de levadura. Alternativamente, la biblioteca puede ser una biblioteca de compuestos sintéticos.
Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes.
Ejemplos
Ejemplo I: Dúplex de ARNip funcionalmente asimétricos
Para evaluar cuantitativamente si las dos cadenas de un dúplex de ARNip son igualmente competentes para dirigir ARNi, se examinaron las tasas individuales de escisión de diana sentido y antisentido para un dúplex de ARNip dirigido contra el ARNm de luciferasa de luciérnaga (Figura 1A). Las porciones relevantes de las secuencias de a Rn diana sentido y antisentido se muestran en la Figura 1A y la secuencia de ARNip en la Figura 1B. Este dúplex de ARNip silencia eficazmente la expresión de luciferasa de luciérnaga en cultivos de células HeLa humanas. Usando una reacción de ARNi in vitro derivada de embriones de Drosophila, se encontró una diferencia significativa en la velocidad de escisión de la diana para las dos cadenas de ARNip; la cadena de ARNip antisentido dirigió ARNi más eficientemente contra una diana de ARN sentido que la cadena de ARNip sentido para una diana antisentido (Figura 1B). (Las cadenas de ARNip antisentido y los ARN diana sentido siempre se muestran en negro, y los ARNip sentido y las dianas antisentido, en gris). Los experimentos de control mostraron que el uso de dúplex de ARNip con fosfatos 5' no alteraron este resultado (datos no mostrados), lo que indica que las diferentes velocidades de fosforilación para las dos cadenas no son la causa de la asimetría observada. Sorprendentemente, los dos grupos del dúplex de ARNip dúplex de luciferasa, usados individualmente como grupos únicos fosforilados en 5', tenían tasas idénticas de escisión de la diana (Figura 1C). El ARNi dirigido por ARNip monocatenario es aproximadamente 10 veces menos eficaz que el desencadenado por dúplex de ARNip, lo que refleja la estabilidad aproximadamente 100 veces menor de ARNip monocatenario in vitro e in vivo (Schwarz et al., 2002). Es poco probable que la diferencia en la velocidad de escisión dirigida por las cadenas sentido y antisentido cuando la reacción se programó con un dúplex de ARNip refleje una diferencia en la susceptibilidad inherente de las dos dianas al ARNi. En cambio, la observación de que las mismas dos cadenas de ARNip son igualmente efectivas como cadenas sencillas, pero muestran actividades dramáticamente diferentes cuando se combinan entre sí, indica que la asimetría en su función se establece en una etapa en la ruta de ARNi antes del encuentro del RISC programado con su correspondiente diana de ARN.
Ejemplo II: El ensamblaje diferencial de RISC explica la asimetría funcional de la cadena de ARNip
Para identificar la fuente de asimetría en la función de este dúplex de ARNip, se midió el desenrollamiento de las dos cadenas de ARNip cuando el dúplex se incubó en una reacción estándar de ARNi in vitro. Se demostró anteriormente que este ensayo determinaba con precisión la fracción de ARNip que se desenrolla en una etapa dependiente de ATP en la ruta de ARNi; no se ensambla ningún RISC funcional en ausencia de ATP (Nykanen et al., 2001). Estudios anteriores muestran que el desenrollado del ARNip se correlaciona con la capacidad de un ARNip para funcionar en la escisión de la diana (Nykanen et al., 2001; Martinez et al., 2002), lo que demuestra que se requiere el desenrollado del dúplex del ARNip para ensamblar un RISC competente para el par de bases con su ARN diana. En este caso, se midió la acumulación de ARNip de cadena sencilla del dúplex de ARNip de luciferasa después de 1 hora de incubación en una reacción de ARNi in vitro en ausencia de ARN diana. Después de una hora de incubación con lisado de embrión de Drosophila en una reacción de ARNi estándar, el 22% de la cadena antisentido del ARNip de luciferasa se convirtió en una sola cadena (Figura 1D; barra negra continua para 'ARNip B'). Sorprendentemente, no se detectó una cantidad correspondiente de ARNip sentido monocatenario. En cambio, solo el 3% de la cadena sentido se acumuló como ARNip monocatenario (Figura 1D; barra gris continua para 'ARNip B'). En los experimentos de control, no se detectó ARN monocatenario sin incubación en lisado (no mostrado), lo que demuestra que el ARNip era completamente bicatenario al comienzo de la reacción. Dado que la producción de ARNip antisentido monocatenario debe ir acompañada de una cantidad igual de ARNip monocatenario sentido, la cadena sentido faltante debe haber sido destruida después de desenrollarse.
Para establecer que la asimetría observada en la acumulación de las dos cadenas sencillas no era un artefacto de nuestro ensayo de desenrollamiento, se utilizó un método independiente para medir la fracción de ARNip presente como cadenas sencillas en complejos proteína-ARN. En este ensayo, se incubó ARNip bicatenario con lisado de embrión de Drosophila en una reacción estándar de ARNi durante 1 h, luego se añadió un oligonucleótido de ARN 2'-O-metilo de 31 nt que contenía una secuencia de 21 nt complementaria a la cadena de ARNip radiomarcada. Los oligonucleótidos 2'-O-metilo no son escindidos por la maquinaria del ARNi, pero pueden unirse de manera estable a ARNip complementario dentro del RISC (Martin Simard, GH, Craig Mello y PDZ, manuscrito en preparación). Para permitir la recuperación de RISC, el oligonucleótido 2-O-metilo se ató a una perla magnética mediante un enlace biotina-estreptavidina. Después de lavar el ARN y la proteína no unidos, se midió la cantidad de ARNip radiactivo unido a la perla. El ensayo se realizó con dúplex de ARNip separados en los que la cadena sentido o antisentido estaba radiomarcada con 32P en 5'. Se observó captura de 32P-ARNip cuando el oligonucleótido 2'-O-metilo contenía una región de 21 nt complementaria a la cadena de ARNip radiomarcada, pero no cuando se usó un oligonucleótido no relacionado. El ensayo captura toda la actividad de RISC dirigida por la cadena de ARNip complementaria al oligonucleótido anclado, lo que demuestra que mide el ARNip presente en el lisado como monocatenario complejado con proteínas de RISC. Este ensayo recapitula los resultados del ensayo de desenrollado descrito anteriormente: para el ARNip de la Figura 1D; Barras sin relleno de 'ARNip B', se detectó casi diez veces más ARNip antisentido que la cadena sentido. Una explicación de estos resultados es que las dos cadenas de este dúplex de ARNip se cargan diferencialmente en el RISC, y que el ARNip monocatenario no ensamblado en RISC se degrada. La asimetría funcional se produjo sólo cuando el ARNip desencadenante era bicatenario, no cuando las dos cadenas de ARNip se probaron individualmente (Figura 1B y 1C). Por lo tanto, el ensamblaje asimétrico de RISC fue una característica del dúplex de ARNip, en lugar de las secuencias de las cadenas de ARNip individuales o la accesibilidad de los sitios
diana para la escisión.
Ejemplo III: El emparejamiento de bases en el extremo 5' de la cadena de ARNip permite el ensamblaje de RISC
El hallazgo de que las dos cadenas de ARNip pueden tener diferentes capacidades para formar RISC cuando se emparejan en un dúplex indica que alguna característica de los 19 pares de bases del dúplex determina la asimetría funcional. Estos pares de bases deben romperse para producir RISC (Nykanen et al., 2001), que contiene ARNip monocatenario (Martinez et al., 2002). Los ARNip utilizados en la Figura 1B se examinaron en busca de características de emparejamiento de bases que pudieran distinguir las dos cadenas de ARNip. Para el ARNip de la Figura 1B, el extremo 5' de la cadena de ARNip antisentido comienza con U y, por lo tanto, se empareja con la cadena de ARNip sentido por un par de bases A: U (2 enlaces de hidrógeno). Por el contrario, el nucleótido 5' de la cadena de ARNip sentido está unido a la cadena antisentido por un par de bases C: G (3 enlaces de hidrógeno). La cadena de ARNip sentido forma de 8 a 10 veces menos RISC y guía la escisión de su ARN diana a una velocidad correspondientemente más lenta que la cadena antisentido. Una hipótesis de trabajo para explicar la asimetría funcional observada es que la cadena de ARNip cuyo extremo 5' está más débilmente unido a la cadena complementaria se incorpora más fácilmente en RISC. En este punto de vista, las fuerzas relativas de emparejamiento de bases de los extremos 5' de las dos cadenas de ARNip determinarían sus extensiones relativas de formación de RISC.
Como prueba inicial de esta idea, el nucleótido 5' de la cadena sentido del ARNip se cambió de C a U (Figura IE). Esto cambió el par de bases formado entre el 5' más nucleótido de la cadena sentido y la posición 19 de la cadena antisentido el par de bases Watson-Crick C: G por el par oscilante más débil y menos estable U: G, dejando la cadena antisentido del ARNip inalterada. Sorprendentemente, el cambio de este único nucleótido no solo mejoró la velocidad de escisión dirigida por la cadena sentido, sino que virtualmente eliminó la capacidad de la cadena antisentido para dirigir el ARNi (Figura IE).
Para determinar la base de la asimetría funcional inversa para el ARNip en la Figura IE, se determinó la cantidad de cada cadena que era monocatenaria después de la incubación del dúplex de ARNip en lisado de embriones de Drosphilia. Después de 1 h, casi el 30% de la cadena de ARNip sentido se convirtió en monocatenaria, pero no se detectó cadena antisentido monocatenaria (Figura 1D; 'ARNip E'). Por lo tanto, la explicación más simple para la función asimétrica de este ARNip es que la cadena sentido, pero no la antisentido, de este dúplex de ARNip se incorporó en RISC. Por lo tanto, una mutación de un solo nucleótido en la cadena de ARNip sentido del ARNip en la Figura 1B invirtió completamente las capacidades relativas de las dos cadenas para ensamblarse en el complejo enzimático que dirige ARNi.
La estabilidad de los cinco pares de bases iniciales de las cadenas de ARNip se calculó en la Figura 1 usando el método del vecino más cercano y el algoritmo de mfold (D.H. Mathews, 1999; Zuker, 2003). Se predice que el extremo 5' de la cadena de ARNip sentido en la Figura IE, pero no el de 1B, existe como un equilibrio de dos confórmeros de energía casi igual (Figura 10). En un confórmero, el nucleótido 5' de la cadena sentido está unido a la cadena antisentido por un par oscilante U: G, mientras que en el otro confórmero el extremo 5' de esta cadena de ARNip no está emparejado. El análisis sugiere que el ensamblaje de RISC favorece a la cadena de ARNip cuyo extremo 5' tiene una mayor propensión a deshilacharse.
Para probar más esta hipótesis, se examinaron las velocidades de escisión específicas de la cadena de las dianas de ARN con superóxido dismutasa-1 (sod1) de Cu, Zn humanas sentido y antisentido (Figura 3A) desencadenadas por el dúplex de ARNip que se muestra en la Figura 3B. Dado que los extremos 5' de ambas cadenas de ARNip de este dúplex están en pares de bases G: C, se anticipó que este dúplex no mostraría una asimetría de escisión pronunciada de la diana. Como se muestra en la Figura 3B, las dos cadenas son similares en sus tasas de escisión de la diana, aunque la velocidad de escisión antisentido dirigida por la cadena sentido es claramente más rápida que la velocidad de escisión de la diana sentido guiada por la cadena antisentido. Esta pequeña diferencia en la velocidad probablemente se explica porque la cadena sentido forma 20 pares de bases con su ARN diana, mientras que la cadena antisentido puede formar solo 19, de acuerdo con informes anteriores de que la penúltima posición de un ARNip hace una pequeña contribución a su eficacia (Elbashir et al., 2001b). A continuación, la C en la posición 19 de la cadena sentido se cambió por A, lo que provocó que la cadena antisentido comenzara con un nucleótido desemparejado. Este cambio, que se realizó en la cadena sentido del ARNip, provocó que la velocidad de escisión de la diana guiada por la cadena de ARNip antisentido se mejorara dramáticamente y se suprimiera la velocidad de la cadena sentido (Figura 3C). Debido a que la mejora de la escisión de la diana sentido fue causada por una mutación en la cadena de ARNip sentido, que no participa en el reconocimiento de la diana sentido, el efecto de la mutación debe estar en una etapa en la ruta de ARNi que está acoplado espacial o temporalmente al desenrollamiento del ARNip. Sin embargo, la supresión de la escisión de la diana antisentido claramente podría haber resultado del desemparejamiento de un solo nucleótido entre la cadena sentido y su ARN diana generado por la sustitución de C por U.
Para probar si la supresión de la velocidad de escisión de la diana antisentido era una consecuencia del desemparejamiento de la posición 19, se usó una estrategia diferente para desemparejar el extremo 5' de la cadena antisentido. La Figura 3D muestra un ARNip en el que la cadena sentido es idéntica a la de la Figura 3B, pero el primer nucleótido de la cadena antisentido se ha cambiado de G por U, creando un desemparejamiento de U-C en su extremo
5', en lugar de G-A de la Figura 3C. No obstante, este dúplex de ARNip mostró una asimetría pronunciada, con la cadena antisentido guiando la escisión de la diana hasta la exclusión casi completa de la cadena sentido (Figura 3D). Por lo tanto, la supresión de la velocidad de escisión de la cadena sentido en la Figura 3C no fue una consecuencia del desemparejamiento de la posición 19. Este hallazgo es consistente con estudios previos que sugieren que los desemparejamientos con el ARN diana son bien tolerados si ocurren cerca del extremo 3' de la cadena guía de ARNip (Amarzguioui et al., 2003). El hallazgo de que los ARNip en las Figuras 3C y 3D muestran una profunda asimetría demuestra que tanto la mejora de la velocidad de escisión de la diana de la cadena antisentido como la supresión de la función de la cadena sentido es una consecuencia de sus capacidades relativas para ingresar a la ruta de ARNi, no su capacidad intrínseca para dirigir la escisión de la diana.
Finalmente, la cadena sentido de la Figura 3C se emparejó con la cadena antisentido de la Figura 3D para crear el dúplex de ARNip que se muestra en la Figura 3E. La cadena sentido de este ARNip, como la de la Figura 3C, contiene un desemparejamiento con la diana antisentido en la posición 19. Al igual que la cadena de ARNip antisentido en la Figura 3D, la cadena antisentido contiene un desemparejamiento con la diana sentido en posición 1. Este dúplex de ARNip dirige la escisión antisentido diana significativamente mejor que el ARNip de la Figura 3C, a pesar del hecho de que los dos ARNip contienen la misma cadena sentido (Figura 3E).
Las Figuras 3F, G y H muestran un análisis similar en el que el extremo 5' de la cadena sentido o la posición 19 de la cadena antisentido del ARNip en la Figura 3B se alteró para producir dúplex de ARNip en los que el extremo 5' de la cadena sentido estaba completamente desemparejada (Figuras 3F y G) o apareada en un par de bases A: U (Figura 3H). De nuevo, el desemparejamiento del extremo 5' de una cadena de ARNip, la cadena sentido, en este caso provocó que la cadena funcionara con exclusión de la otra cadena. Cuando el extremo 5' de la cadena sentido estaba presente en un par de bases A: U y el extremo 5' de la cadena antisentido estaba en un par G: C, la cadena sentido dominaba la reacción (Figura 3H), aunque ahora la cadena antisentido mostró una actividad similar a la observada para el ARNip original (Figura 3B) en la que ambas cadenas estaban en pares G: C en sus extremos 5'. La conversión del extremo 5' no emparejado de los ARNip de la Figura 3 en un par A: U redujo la asimetría funcional de las dos cadenas al mejorar la eficacia de la cadena sentido (Figura 3E) o la cadena antisentido (Figura 3H). La relativa facilidad con la que los extremos 5' de los dos ARNip pueden liberarse del dúplex determina el grado de asimetría. Los datos adicionales que apoyan esta idea se muestran en la Figura 8, utilizando un ARNip diferente. La Figura 8B muestra un ARNip que escindió los dos ARN diana con sodl (Figura 8A) con una asimetría funcional modesta que refleja la fuerza de apareamiento de bases colectivas de los primeros cuatro o cinco nucleótidos de cada cadena de ARNip (Figura 8E; vease más abajo). La asimetría se incrementó drásticamente cuando se introdujo una oscilación G: U en el extremo 5' de la cadena antisentido del ARNip (Figura 8C), pero no se observó asimetría cuando se usaron las cadenas individuales de una sola cadena para activar el ARNi (Figura 8D), lo que demuestra que el ensamblaje diferencial de RISC, no la accesibilidad de la diana explica la asimetría funcional del dúplex de ARNip.
En conjunto, los datos de las Figuras 1, 2 y 8 indican que la simetría del ensamblaje de RISC está determinada por una competencia entre el deshilacliado de los extremos 5' de los dos ARNip en el dúplex. Tal deshilacliado puede iniciar un proceso direccional de desenrollado en el que la cadena en la que se inicia el desenrollado entra preferentemente en RISC. Dicho modelo requiere que los factores de ensamblaje de RISC o los componentes de RISC en sí mismos se carguen en una de las dos cadenas de ARNip antes de que se complete el desenrollado, o que la información sobre las cadenas de ARNip antes del estado de apareamiento sea retenida, tal vez por una proteína tal como la helicasa que permanece unida a una cadena.
Ejemplo IV: Un enlace de hidrógeno simple puede determinar qué cadena de un dúplex de ARNip dirige el ARNi
Para explorar más esta hipótesis, se realizaron cambios adicionales en el ARNip específico de sodl en la Figura 3. Estas modificaciones alteran la función de las dos cadenas del ARNip, pero no cambian el sitio escindido en los dos ARN diana. En la Figura 3A, la cadena antisentido de la Figura 3B se emparejó con una cadena sentido idéntica a la de la Figura 3B, excepto que G en 5' se reemplazó con inosina (I). Al igual que G, I se empareja con C, pero forma dos enlaces de hidrógeno en lugar de tres. En este sentido, un par I: C es similar en energía a un par A: U. El ARNip resultante era funcionalmente asimétrico, cuando la cadena sentido comenzaba con una I, dirigía la escisión de la diana más eficazmente que la cadena antisentido (Figura 4A). La asimetría refleja una mejora en la eficacia de la cadena de ARNip sentido, con poca pérdida en la función de la cadena antisentido. Una inosina en el extremo 5' de la cadena antisentido tuvo el efecto opuesto. Cuando la G en la posición 1 de la cadena antisentido se sustituyó por inosina y la cadena sentido es la de la Figura 3B, la cadena antisentido se mejoró con respecto a la cadena sentido (Figura 4b ). Por lo tanto, la cadena cuyo extremo 5' está en el par de bases más débil fue más eficaz en la escisión de la diana.
Sorprendentemente, cuando los nucleótidos 5' de ambas cadenas de ARNip se acoplan en pares de bases I: C (Figura 4C), la eficacia relativa de las dos cadenas de ARNip se restablece a la informada en la Figura 3B. La velocidad ligeramente más rápida para la escisión de la diana antisentido que para la escisión de la diana sentido también se observa para el ARNi desencadenado con las cadenas individuales que contienen inosina, lo que indica que refleja una diferencia en la capacidad intrínseca de las dos cadenas para guiar la escisión, en lugar de una diferencia en el ensamblaje de RISC. Aunque las velocidades relativas de escisión de las dos cadenas son comparables para los ARNip de la Figura 3B y 4C, las velocidades absolutas son más rápidas para el ARNip de la Figura 4C. Estos datos indican que la producción de RISC a partir de una cadena individual está gobernada tanto por la propensión relativa
del extremo 5' del ARNip a deshilacliarse en comparación con aquella de su cadena complementaria y por la propensión absoluta del extremo 5' del ARNip a deshilacliarse. Este último hallazgo es particularmente inesperado, ya que muestra que una diferencia de un solo enlace de hidrógeno tiene un efecto marcado sobre la velocidad de ensamblaje de RISC. El deshilacliado del extremo del ARNip proporciona un sitio de entrada para una helicasa de ARN dependiente de ATP que desenrolla los dúplex de ARNip (Figura 4). La helicasa hace muchos intentos fallidos de disociar las dos cadenas de ARNip antes de tener éxito en cargar una cadena en RISC. La participación de una helicasa en el ensamblaje de RISC está respaldada por observaciones previas: (1) tanto el desenrollamiento de ARNip como la producción de RISC funcional requieren ATP in vitro (Nykanen et al., 2001) y (2) varias proteínas con homología de secuencia con las helicasas de ARN dependiente de ATP han sido implicadas en el silenciamiento del ARN (Wu-Scharf et al., 2000; Dalmay et al., 2001; Hutvagner y Zamore, 2002; Ishizuka et al., 2002; Kennerdell et al., 2002; Tabara et al., 2002; Tijsterman et al., 2002).
Se ensayó adicionalmente el efecto de los desemparejamientos de un solo nucleótido en esta región del ARNip, usando una serie de ARNip que contienen un desemparejamiento en la segunda, tercera o cuarta posición de cada cadena de ARNip. También se analizaron los ARNip que portan pares de oscilación G: U en la segunda, tercera o en ambas posiciones, segunda y tercera (Figura 1l). Los resultados de esta serie demuestran que los desemparejamientos, pero no las oscilaciones de G: U, en las posiciones 2-4 de una cadena de ARNip alteran la carga relativa de las dos cadenas de ARNip en RISC. Los desemparejamientos en la posición cinco tienen efectos muy modestos sobre la carga relativa de las cadenas de ARNip en RISC (datos no mostrados). Por el contrario, los efectos de los desemparejamientos internos en las posiciones 6 a 15 no pueden explicarse por su influencia en la simetría del ensamblaje de RISC (datos no mostrados). En resumen, estos datos son consistentes con la acción de una helicasa no procesiva que puede unirse a aproximadamente cuatro nucleótidos de ARN.
Ejemplo V: Implicaciones de la asimetría de ARNip en la biogénesis de miARN
Una implicación de los hallazgos presentados en este documento es que, aunque los ARNip están presentes predominantemente como dúplex en estado estacionario in vitro (Nykanen et al., 2001) y quizás in vivo (Hamilton y Baulcombe, 1999; Djikeng et al., 2001), es poco probable que ambas cadenas de un ARNip estén presentes por igual en RISC. Es decir, la fuerza de los pares de bases en los extremos 5' de las dos cadenas de ARNip puede influir en su acumulación como cadenas sencillas. Cuando el extremo 5' de una cadena no está emparejado, esta asimetría puede ser casi absoluta. Esta observación sugirió que la incorporación asimétrica en RISC, como consecuencia del desenrollamiento direccional de un extremo deshilacliado de un dúplex de ARNip, también podría explicar por qué los miARN se acumulan como cadenas sencillas. Los miARN de los animales se derivan del tallo bicatenario de los ARN precursores de tallo-bucle de ~ 70 nt (Lee et al., 1993; Pasquinelli et al., 2000; Reinhart et al., 2000; Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee y Ambros, 2001; Lagos-Quintana et al., 2002). Los tallos de los pre-miARN son sólo parcialmente bicatenarios; el pre-miARN típico contiene desemparejamientos, bucles internos y pares de bases G • U que se predice que distorsionarán una hélice de ARN en forma de A. Los miARN se generan a partir de los pre-miARN mediante la endonucleasa Dicer específica de ARN bicatenario (Hutvagner et al., 2001; Grishok et al., 2001; Ketting et al., 2001). Los presentes inventores propusieron previamente que los miARN son monocatenarios porque las discontinuidades helicoidales obligan a Dicer a romper solo dos, en lugar de cuatro, enlaces fosfodiéster, produciendo un miARN monocatenario, en lugar de un dúplex similar al ARNip (Hutvagner et al., 2001). Tal mecanismo tiene un precedente, porque la RNasa III de E. coli puede verse restringida por distorsiones helicoidales para hacer solo una o dos rupturas en una cadena de ARN (Chelladurai et al., 1993).
Una hipótesis alternativa es que Dicer escinde cuatro enlaces fosfodiéster en todos sus sustratos, tanto ARNbc largo como pre-miARN, y siempre genera un producto con el dúplex de ARNip esencial (Hutvagner y Zamore, 2002; Reinhart et al., 2002; Lim et al., 2003b). Este mecanismo para la producción de miARN fue sugerido originalmente por Bartel y sus colegas. Usando una estrategia de clonación de a Rn pequeño para identificar miARN maduros en C. elegans, recuperaron ARN pequeños correspondientes al lado no miARN del tallo del precursor (Lim et al., 2003b). Aunque estas secuencias de 'miARN*' se recuperaron a una frecuencia aproximadamente 100 veces menor que los miARN mismos, siempre se podrían emparejar con el miARN correspondiente para obtener 'dúplex de miARN' con extremos 3' sobresalientes de 2 nt (Lim et al., 2003b). Sus datos sugieren que los miARN nacen como dúplex, pero se acumulan como cadenas sencillas porque algún proceso posterior estabiliza el miARN, desestabiliza el miARN* o ambos.
La incorporación de miARN en RISC es este proceso. Estos resultados con ARNip sugieren que el ensamblaje preferencial de un miARN en el RISC iría acompañado de la destrucción del miARN. Si la velocidad del ensamblaje asimétrico de RISC fuera más rápida que la producción de los dúplex de miARN, solo se observarían miARN monocatenarios en estado estacionario (Figura 4). La acumulación de monocatenarios y no de dúplex para los miARN sería simplemente una consecuencia de que Dicer sea significativamente menos eficiente en la escisión de los premiARN en comparación con ARNbc largo (Hutvagner et al., 2001). La velocidad de ensamblaje asimétrico de RISC podría ser más rápido que la producción de dúplex de miARN, por lo que solo se observarían miARN monocatenarios en estado estacionario. Dos predicciones clave de esta hipótesis son que (1) Dicer purificado debe escindir los premiARN en cantidades iguales de miARN y productos de miARN* y (2) las estructuras de pre-miARN deben ser procesadas por Dicer en dúplex con el extremo 5' del miARN de cadena deshilacliada o débilmente enlazada con hidrógeno y el extremo 5' de la cadena de miARN* se empareja de forma más segura.
A. Dicer escinde pre-let-7 simétricamente
Para comenzar a probar la idea de que Dicer escinde los pre-miARN para generar un producto con una estructura esencial de un dúplex de ARNip, se incubo el pre-miARN de Drosophila, pre-let-7, con Dicer recombinante purificado y se analizaron los productos por hibridación Northern usando sondas específicas para el lado 5' del tallo precursor que codifica let-7 maduro o para productos derivados del lado 3' del tallo precursor (productos de let-7*). Como control, el ARN precursor de let-7 se incubó en lisado de embriones de Drosophila, que recapitula tanto la maduración de prelet-7 como de ARNi in vitro. Como se informó anteriormente, la incubación de ARN pre-let-7 en el lisado produjo una única banda correspondiente a los productos let-7 auténticos, pero no a los productos let-7* (Hutvagner et al., 2001; Figura 5A y 5B). Por el contrario, la incubación de pre-let-7 con Dicer produjo cantidades aproximadamente iguales de productos let-7 y let-7 * Se generaron al menos tres ARN distintos de cada lado del tallo, en lugar de la banda única correspondiente al let-7 maduro observado en el lisado embrionario. Por lo tanto, la ausencia de let-7 * in vivo y en la reacción de lisado embrionario no puede explicarse por la influencia de la estructura de pre-let-7 en Dicer.
B. El ensamblaje asimétrico de RISC explica por qué los miARN son monocatenarios
Si Dicer escinde ambos lados del tallo de pre-let-7, entonces alguna etapa posterior de la acción de Dicer selecciona let-7 maduro de un dúplex similar a ARNip en el que let-7 se empareja con let-7 * Un buen candidato para tal etapa sería la incorporación asimétrica de let-7 en RISC, acompañada por la degradación de let-7*. Para probar esta idea, se dedujo el ARNip que podría formarse si Dicer escindiera el pre-let-7 en una estructura similar a un dúplex de ARNip. La secuencia de este 'ARNip pre-let-7', generado por 'corte conceptual', se muestra en la Figura 6A (vease más adelante). En particular, el extremo 5' de let-7 no está emparejado en este dúplex, mientras que el extremo 5' de la cadena de let-7 * está en un par de bases A: U. Los resultados presentados en las Figuras 2, 3 y 4 sugieren que esta estructura debería hacer que la cadena de let-7 entre en el RISC hasta casi la exclusión de la cadena de let-7*, que en consecuencia se degradaría.
C. selección de miARN frente a miARN* en Drosophila
Este análisis se extendió a continuación a los otros genes de miARN de Drosophila publicados (Lagos-Quintana et al., 2001). Para cada estructura precursora, Dicer predijo que produciría la doble cadena. Estos dúplex conceptualmente cortados en cubitos se muestran en la Figura 6A. Para 23 de los 27 dúplex generados por este análisis (incluido el pre-let-7), la diferencia en el emparejamiento de bases de los primeros cinco nucleótidos de las cadenas de miARN frente a las de miARN* predijo con precisión que el miARN, y no el miARN* se acumula in vivo. El análisis tuvo éxito independientemente de qué lado del tallo de pre-miARN codificaba el miARN maduro. Este análisis, previas observaciones de que los desemparejamientos simples en los primeros cuatro nucleótidos de una cadena de ARNip, un par de oscilación G: U inicial, pero no oscilaciones internas de G: U, dirigieron la incorporación asimétrica de una cadena de ARNip en RISC (Figuras 1, 2, 3, 8, 9 y 11). Sin embargo, no se discernió ninguna diferencia en la propensión a deshilacliarse de los extremos 5' de las cadenas de miARN y miARN* para miR-4, miR-5, los tres parálogos de miR-6-2 y miR-10. Por lo tanto, no se pudo explicar por qué una cadena particular se acumularía como miARN maduro para estos tres precursores de miARN. miR-5 y miR-10, al igual que otros miARN de Drosophila, se identificaron mediante la clonación y secuenciación de a Rn pequeños de embriones (Lagos-Quintana et al., 2001). Otros determinantes además del deshilacliado final parecen funcionar en la selección de miR-4 y miR-6; estos determinantes desconocidos también pueden desempeñar un papel en el ensamblaje de una cadena de ARNip en RISC. Sin embargo, miR-5 y miR-10 se clonaron solo una vez, lo que aumenta la posibilidad de que miR-5* o miR-10* esté presente en los embriones, pero no esté representado entre la biblioteca de ARN pequeños a partir de los cuales se clonaron los miARN. De manera similar, miR-6 está codificado por tres genes parálogos, de los cuales predecimos que sólo uno producirá cantidades detectables de miR*, por lo que esta cadena de miR* también podría haber pasado desapercibida. Para probar si las cadenas de miARN y miARN* podrían acumularse para algunos o todos estos tres genes, se utilizó la hibridación Northern para examinar la abundancia relativa de miR-10 y miR-10* en machos y hembras adultas de Drosophila y en embriones de blastodermo sincitiales. Los resultados detectaron tanto miR-10* como mi-R10 in vivo (Figura 6C). De hecho, los resultados indicaron que se detectó más miR-10* que miR-10 en machos adultos. Este hallazgo refuerza la propuesta de que los genes de miARN (es decir, los pre-miARN) especifican de manera única en qué lado del tallo los residuos de miARN se generan dúplex similares a ARNip a partir de los cuales solo una de las dos cadenas del dúplex se ensambla en RISC. Cuando estos intermedios de doble cadena no contienen características estructurales que imponen el ensamblaje asimétrico de RISC, ambas cadenas se acumulan in vivo. Es posible que los pre-miARN tales como pre-miR-10, que generan cantidades aproximadamente iguales de productos de ARN pequeño de ambos lados del tallo precursor, regulen simultáneamente los ARN diana con complementariedad parcial de ambos productos de ARN pequeño.
Ejemplo VI: mayor tasa de eficacia de ARNip mediante el uso de colas de dTdT
Los protocolos reconocidos en la técnica para diseñar dúplex de ARNip enseñan la inclusión de colas de dTdT (es decir, salientes de 2 nucleótidos que consisten en dT). Se crearon dos dúplex para probar si la adición de colas de dTdT que sobresalen en 3' aumenta la tasa de eficiencia de direccionamiento de ARNip del ARNm de superóxidodismutasa-1 (Sod1) de Cu, Zn. El primer dúplex contenía cadenas sentido y antisentido, cada una de los cuales incluía 21 nucleótidos con 19 bases complementarias más salientes de 2 nucleótidos (las salientes consisten en bases en
común con la secuencia diana). El segundo dúplex contenía cadenas sentido y antisentido, cada una de las cuales incluía 19 nucleótidos complementarios (en común con la diana de Sod1), más colas dTdT de 2 nucleótidos en el extremo 5' de la cadena (que no coinciden con la diana Sod1). Los resultados demuestran que la tasa de eficacia de ARNip mejoró ~ 8 veces aproximadamente cuando se utilizó el dúplex que tiene colas de dTdT no emparejadas (Figura 12).
Discusión de los ejemplos I-VI: implicaciones para el silenciamiento de ARN
Las observaciones descritas en este documento proporcionan reglas para el diseño de ARNip. Claramente, la estructura del ARNip puede influir profundamente en la entrada de la cadena de ARNip antisentido en la ruta del ARNi. Por lo tanto, la secuencia del ARNip, en lugar de la del sitio diana, puede explicar al menos algunos informes previos de dúplex de ARNip ineficaces. Dichos dúplex inactivos pueden volver a ser activos modificando la cadena sentido del ARNip para reducir la fuerza del par de bases en el extremo 5' de la cadena antisentido. Un ejemplo de esto in vitro se muestra en la Figura 9, para un ARNip ineficaz dirigido contra el ARNm de huntingtina (htt) (Figura 9A). Cambiar el par G:C (Figura 9B) por un par A:U (Figura 9C) o un desemparejamiento de GA (Figura 9D) mejoró dramáticamente su tasa de escisión diana in vitro y su eficacia in vivo (Eftim Milkani, NA y PDZ, observaciones no publicadas). De hecho, Khvorova y sus colegas han descubierto que una baja estabilidad de emparejamiento de bases en el extremo 5' de la cadena antisentido, pero no de la cadena sentido, es un requisito previo para la función del ARNip en células de mamífero cultivadas (Anastasia Khvorova, Angela Reynolds y Sumedha D. Jayasena, manuscrito enviado).
Los ARNip diseñados para funcionar asimétricamente también pueden usarse para mejorar la especificidad del ARNi. Recientemente, los estudios de perfiles de expresión han demostrado que la cadena sentido de un ARNip puede dirigir el silenciamiento génico fuera de la diana (A.L. Jackson, et al. (2003) Nature Biotechnology, 18 de mayo). Los datos presentados en este documento proporcionan una estrategia para eliminar tales efectos específicos pero indeseables de la secuencia: rediseñar el ARNip de modo que solo la cadena antisentido entre en la ruta del ARNi.
Las observaciones descritas en este documento proporcionan nuevas reglas de diseño para la construcción de ARN de horquilla pequeña (ARNhp), que producen ARNip transcripcionalmente en células cultivadas o in vivo (Brummelkamp et al., 2002; McManus et al., 2002; Paddison et al., 2002; Paul et al., 2002; Sui et al., 2002; Yu et al., 2002). Las estrategias de ARNhp normalmente emplean un promotor Pol III para impulsar la transcripción, por lo que el ARNhp debe comenzar con varios residuos de G. Como consecuencia, el extremo 5' del ARNip puede estar secuestrado en un par de bases G:C, reduciendo significativamente la entrada de la cadena antisentido en la ruta del ARNi. Para evitar este problema, la cadena antisentido del ARNip deseado se puede colocar en el lado 3' del bucle, para garantizar que su extremo 5' esté en un A:U, en lugar del par G:C típicamente codificado. Alternativamente, la horquilla puede diseñarse para colocar el extremo 5' de la cadena de ARNip antisentido en un par de bases desemparejadas o G:U, en cuyo caso puede colocarse a ambos lados del tallo. Además, un informe reciente sugiere que algunos ARNhp pueden inducir la respuesta del interferón (Bridge et al., 2003). Los datos sugieren que los desemparejamientos y los pares G:U podrían diseñarse en estos ARNhp simultáneamente para promover la entrada de la cadena de ARNip correcta en la ruta de ARNi y disminuir la capacidad del tallo de ARNhp para desencadenar respuestas no específicas de secuencia al ARN bicatenario.
Finalmente, los datos identifican una etapa no anticipada en la ruta del ARNi: el acoplamiento directo de ARNip que se desenrolla con el ensamblaje de RISC. Este hallazgo sugiere que la helicasa responsable de desenrollar los dúplex de ARNip estará íntimamente ligada a otros componentes de la maquinaria del ARNi. Identificar la helicasa y las proteínas con las que funciona para ensamblar el RISC es claramente un desafío importante para el futuro.
Ejemplo VII: El RISC programado con ARNip es una enzima
El RISC programado con ARN pequeño in vivo cataliza la destrucción del ARN diana in vitro sin consumir su guía de ARN pequeño (Tang et al., 2003) (Hutvagner et al., 2002). Para comenzar un análisis cinético de RISC, se confirmó primero que el RISC programado in vitro con ARNip es también una enzima de recambio múltiple. Para modificar una reacción de ARNi que contenía una alta concentración de sustrato en relación con RISC, se utilizó un ARNip en el que la cadena guía es idéntica al miARN let-7, pero a diferencia del miARN, el ARNip let-7 está emparejado con una cadena de ARN antisentido a let-7 (Hutvagner et al., 2002). La cadena let-7 de este ARNip tiene una alta actividad de escisión intrínseca, pero una eficiencia reducida de incorporación en RISC (Figura 19A).
Después de incubar el ARNip let-7 con lisado de embrión de Drosophila en presencia de ATP, el ensamblaje de RISC se inactivó mediante tratamiento con N-etil maleimida (NEM), y la cantidad de RISC generada se midió utilizando el ensayo previamente descrito 2-O-metilo fijado (Hutvagner et al., 2004; Schwartz et al., 2003) (Figura 19 B, C). La cantidad de RISC programada con let-7 aumentó con el incremento de la concentración de ARNip, hasta que la reacción de ensamblaje comenzó a saturarse a aproximadamente 50 nM, alcanzando una asíntota entre 3 y 4 nM de RISC. Usando 0,6 nM de RISC, se observaron más de 50 ciclos de reconocimiento de la diana y escisión por el complejo enzimático (datos no mostrados), lo que confirma que el RISC programado con ARNip es una enzima de recambio múltiple.
Ejemplo VIII: El recambio múltiple está limitado por la liberación del producto
Se realizó además la evaluación de la cinética de la escisión de la diana dirigida por ARNip en presencia o ausencia de ATP (Figura 13). RISC se ensambló en presencia de ATP, luego la enzima regeneradora de energía, la creatina quinasa, se inactivó con NEM y el ATP se redujo mediante la adición de hexoquinasa y glucosa (condiciones sin ATP). Para las mediciones con ATP, se añadió creatina quinasa a la reacción después del tratamiento con NEM y se omitió el tratamiento con hexoquinasa. Se observó una velocidad de escisión más rápida en presencia que en ausencia de ATP. Esta diferencia solo fue aparente al final del curso del tiempo de reacción, lo que indica que la velocidad de escisión dependiente de ATP fue más rápida que la tasa independiente de ATP solo en estado estacionario (Figura 13 A). El análisis se repitió con más detalle (Figura 13 B). En ausencia de ATP, se observó un estallido de producto escindido al principio de la reacción, seguido de una velocidad de escisión de la diana aproximadamente 4 veces más lenta. No se observó explosión en presencia de ATP (Figura 13A). Si el estallido corresponde a un recambio único de enzima, entonces la extrapolación de la velocidad mas lenta en estado estable nuevamente en el eje y debería producir la cantidad de enzima activa en la reacción. La intersección con el eje y al comienzo de la reacción para la velocidad de estado estacionario fue de 4,9 nM, en buen acuerdo con la cantidad de RISC estimada usando el ensayo del oligonucleótido 2'-O-metilo fijado (~4 nM; Figura 13 B).
En principio, el ATP podría mejorar el reconocimiento de la diana por RISC, promover una reordenación del complejo RISC/diana a una forma activa, facilitar la escisión en sí misma, promover la liberación de los productos de escisión de la cadena guía de ARNip o ayudar a restaurar RISC a un estado catalíticamente competente después de la liberación del producto. Todas estas etapas, excepto la liberación del producto y la restauración de la competencia catalítica, deberían afectar la velocidad de las reacciones de recambio único y múltiple. Por lo tanto, se analizó la velocidad de reacción en presencia y en ausencia de ATP en condiciones en las que RISC estaba en exceso sobre el ARN diana. Al inicio bajo estas condiciones, la velocidad de reacción debería reflejar solo eventos de escisión de recambio único, en los que los eventos posteriores a la escisión no determinan la velocidad de reacción. Utilizando condiciones de reacción de recambio único, se observaron velocidades idénticas de escisión mediada por RISC en presencia o ausencia de ATP (Figura 13 C). Por lo tanto, el ATP debe potenciar una etapa que se produce sólo cuando cada RISC cataliza múltiples ciclos de escisión de la diana.
Si la liberación del producto es determinante para la catálisis de recambio múltiple por RISC en ausencia, pero no en presencia, de ATP, entonces las modificaciones que debilitan la fuerza del emparejamiento con el ARN diana podrían mejorar la liberación del producto, pero no se esperaría que aceleren el retorno del RISC a un estado catalíticamente competente. Se incorporaron desemparejamientos entre el ARNip y su ARN diana en el extremo 3' de la cadena guía del ARNip y se diseñaron los ARNip para que fueran funcionalmente asimétricos, lo que garantiza una eficiencia e incorporación predecible de la cadena de let-7 en RISC (Figura 14 A). Se comparó la velocidad de reacción en condiciones de exceso de sustrato en presencia y en ausencia de ATP para ARNip con cero a cuatro desemparejamientos entre el extremo 3' de la cadena guía y el ARN diana. La escisión se midió a partir de 100 y 540 s, cuando más del 90% de la diana permaneció sin escindir, asegurando que la reacción de recambio múltiple estuviera en estado estacionario. Incluso un solo desemparejamiento 3' entre el ARNip y su diana aumentó la tasa sin ATP, en relación con la tasa con ATP, y los ARNip con dos o más desemparejamientos no mostraron diferencias significativas en la velocidad entre la presencia y ausencia de ATP (Figura 14B). Los resultados indicaron que, en ausencia de ATP, la liberación del producto es la etapa determinante de la velocidad para los ARNip que coinciden completamente con sus dianas de ARN.
Ejemplo IX: complementariedad de ARNip:diana y la función de RISC
Los desemparejamientos entre el ARNip y su diana facilitan la liberación del producto, pero no sin costo: la velocidad de reacción, independientemente de la concentración de ATP, disminuye con cada desemparejamiento 3' adicional. Cuando la concentración de RISC era aproximadamente16-80 veces mayor que la concentración de ARN diana, cada desemparejamiento adicional entre el extremo 3' de la cadena guía de ARNip y la diana de ARN ralentizaba aún más la reacción (Figura 14 C, D). En condiciones de exceso de sustrato, el efecto de los desemparejamientos entre el extremo 3' de la cadena guía de ARNip y su ARN diana fue más sorprendente (Figura 15A): la velocidad de escisión disminuyó aproximadamente 20% por cada desemparejamiento adicional. Para probar los límites de la tolerancia de RISC para los desemparejamientos 3', se analizó la escisión bajo un exceso de enzima modesto (8 veces, Figura 15 B) y grande (aproximadamente 80 veces, Figura 15 C y 16 C) sobre el ARN diana. Sorprendentemente, la escisión se detectó para los ARNip con hasta nueve desemparejamientos 3' con el ARN diana (Figura 15 C y 16 C), pero solo después de 24 horas de incubación. No se detectó escisión para un ARNip con diez desemparejamientos 3' con el ARN diana (Figura 15 C).
Linsley y sus colegas han propuesto la subregulación dirigida por ARNip de un ARNm con tan solo once bases contiguas complementarias a la cadena guía de ARNip (Jackson et al., 2003). En ese estudio, la diana de ARNm se emparejó con los nucleótidos 2-5 y los nucleótidos 7-17 de la cadena guía del ARNip, pero no coincidió en los nucleótidos 1 y 6 del ARNip. Los resultados indicaron que se toleran hasta cinco bases mal emparejadas entre el extremo 5' del ARNip y su diana de ARN (Figura 16 A, B). No se detectó escisión para ARNip con seis, siete u ocho desemparejamientos 5' con la diana, incluso después de 24 horas de incubación. El ARNip con ocho desemparejamientos entre su extremo 5' y la diana complementaria de let-7 estaba completamente activa cuando se introdujeron ocho mutaciones compensatorias en el sitio de unión de let-7 (Figura 15C y 16B), lo que demuestra que
la mutación del ARNip no fue la causa por su inactividad contra la diana desemparejada. De manera similar, cuando se crearon ocho desemparejamientos con el extremo 3' o 5' del ARNip al cambiar la secuencia de la diana de ARN, el ARN diana se escinde cuando la diana contenía ocho desemparejamientos con el extremo 3' del ARNip, pero no se detectó con el extremo 5' (Figura 16 B, C).
Para comenzar a estimar el número mínimo de pares de bases entre el ARNip y su diana que permiten la escisión detectable por RISC a las 24 horas de incubación, se combinaron siete, ocho o nueve desemparejamientos 3' con números crecientes de desemparejamientos 5' (Figura 16 C). Se detectó la escisión de hasta nueve desemparejamientos 3'. Sin embargo, no se produjo ninguna escisión detectable cuando se combinaron siete, ocho o nueve desemparejamientos 3' con dos o más desemparejamientos 5'. Por el contrario, un solo desemparejamiento 5' (p1) potenció la escisión de la diana dirigida por los tres ARNip desemparejados en 3'. Solo el 6% del ARN diana se escindió después de 24 horas cuando el ARNip contenía nueve desemparejamientos 3' contiguos con el ARN diana, pero el 10% se escindió cuando el ARNip contenía nueve desemparejamientos 3' y un solo desemparejamiento 5' (p1). La escisión se potenció de manera similar mediante la adición de un desemparejamiento p1 a siete desemparejamientos 3' (escisión del 49% frente escisión del 75% a las 24 horas) o a ocho desemparejamientos 3' (escisión del 21% frente al 42% a las 24 horas). El hallazgo de que el desemparejamiento de la primera base de la cadena guía de ARNip potencia la escisión en condiciones de recambio único indujo que se produzca un cambio conformacional en RISC durante el cual la base p1 emparejada se desempareje antes de la escisión. Curiosamente, a menudo se predice que p1 no está emparejado para los miARN unidos a sus dianas (Lewis et al., 2003; Rhoades et al., 2002; Stark et al., 2003).
Para los ARNip que se aparean completamente con sus ARN dianas, el fosfato escindible siempre se encuentra entre los nucleótidos diana que se aparean con las bases de ARNip 10 y 11 (Elbashir et al., 2001; Elbashir et al., 2001). El análisis a la resolución de un solo nucleótido de los productos de escisión 5' generados por ARNip con tres, cuatro o cinco desemparejamientos 5' (Figura 16 D) o seis desemparejamientos del terminal 3' (datos no mostrados) reveló que el fosfato escindible en el ARN diana permanecía igual, incluso cuando cinco nucleótidos 5' de la cadena guía de ARNip no coincidían con el ARN diana (Figura 16 D). Como se analiza a continuación, este resultado indica que la identidad del fosfato escindible es una consecuencia de la estructura de RISC, en lugar de medirse desde el extremo 5' de la hélice formada entre el ARNip y su diana de ARN.
Ejemplo X: Análisis cinético de la catálisis de RISC
A continuación, se estudió el papel de los nucleótidos en las regiones terminales de la cadena guía de ARNip en la dirección de la actividad de RISC. El emparejamiento reducido entre un ARNip y su objetivo podría interrumpir la unión de RISC a su objetivo. Alternativamente, los desemparejamientos podrían alterar la estructura, pero no la afinidad, de la interacción ARNip/diana. Se cree que los ARNip totalmente emparejados forman una hélice en forma A de 21 pares de bases con el ARN diana (Chiu et al., 2003; Shiu et al., 2002), pero ¿todas las partes de esta hélice contribuyen por igual a la unión de la diana o ¿algunas regiones proporcionan solo una geometría catalíticamente permisiva? Para distinguir entre estas posibilidades, se analizó la cinética de Michaelis-Menten de la escisión del ARN diana dirigida por ARNip para un ARNip perfectamente emparejado y para tres ARNip mal emparejados en sus extremos. Los ARNip se ensamblaron en RISC, luego se diluyeron con tampón de reacción hasta la concentración de RISC deseada y se mezclaron con el ARN diana. Para cada ARNip, se determinó la velocidad inicial de reacción a múltiples concentraciones de sustrato (Figura 21 A), y KM y kcat se determinaron a partir de un ajuste no lineal de mínimos cuadrados de la concentración de sustrato frente a la velocidad inicial (Figura 17 A). Mediante este ensayo, se estimó la KM del ARNip let-7 con complementariedad completa con su diana era de ~ 8,4 nM (Tabla 1). No se detectó una diferencia significativa en KM, dentro del error, entre ARNpi completamente emparejado y las variantes de ARNip que tienen de tres a cinco desemparejamientos en su extremo 3' o tres desemparejamientos en su extremo 5' (Figura 17A y Tabla 1). Para los ARNip no emparejados, se usó una concentración de enzima superior a la óptima para detectar la escisión. Por lo tanto, las mediciones de KM para los ARNip no emparejados representan un límite superior para los valores de KM reales.
Aunque el KM no se alteró para el ARNip let-7 que contenía varios desemparejamientos terminales, el número de recambio, kcat, disminuyó por desemparejamientos terminales (Tabla 1). Tres desemparejamientos en el extremo 3' o 5' del ARNip dividieron a la mitad el valor de kcat. La introducción de cinco desemparejamientos 3' tampoco tuvo un efecto significativo sobre la KM, aunque disminuyó la kcat casi 17 veces (Tabla 1).
La Tabla 1 resume los datos cinéticos del análisis en la Figura 17A. A modo de comparación, se proporcionan los valores de KM y kcat de cuatro enzimas proteicas bien estudiadas. Se informan KM y kcat ± error de ajuste.
Ejemplo XI: KM refleja la fuerza de unión de RISC
Para estimar la contribución de la unión a KM, se utilizó un ensayo de competición que mide la capacidad de los oligonucleótidos 2'-O-metilo para inhibir la escisión de la diana por RISC (Figura 17 B, C). Esta estrategia se usó previamente para analizar el mecanismo de destrucción de la diana por oligonucleótidos antisentido que reclutan RNasa H (Lima et al., 1997). La expectativa era que los oligonucleótidos 2'-O-metilo actuarían como inhibidores competitivos de RISC, porque se unen a RISC que contiene ARNip complementario, pero no a RISC que contiene
ARNip no relacionado (Hutvagner et al., 2004; Meister et al., 2004). Se diseñaron oligonucleótidos 2'-O-metilo de 31 nt de longitud como se describió anteriormente (Hutvagner et al., 2004), teniendo cuidado de excluir las secuencias que se prevé que formen estructuras internas estables. Se eligieron oligonucleótidos 2-O-metilo debido a su marcada estabilidad en el lisado de Drosophila y porque pueden añadirse a la reacción a una concentración pM alta.
La competencia por oligonucleótidos 2-O-metilo y dianas de ARN auténticas fue cuantitativamente similar. Las velocidades de reacción de la escisión dirigida por ARNip de una diana marcada radiactivamente con 32P en presencia de concentraciones crecientes de diana de ARN protegida sin marcar o un oligonucleótido 2-O-metilo de 31 nt correspondiente a la región de la diana que contiene el sitio de unión del ARNip fueron analizadas (Figura 17 B). El análisis de Lineweaver-Burk de los datos confirma que los oligonucleótidos 2-O-metilo actúan como inhibidores competitivos de RISC (datos no mostrados). Estos datos se utilizaron para calcular los valores de Ki para los competidores de ARN y 2'-O-metilo perfectamente emparejados. Para el competidor de ARN protegido, la Ki fue aproximadamente 7,7 ± 4 nM (Figura 17 B), casi idéntica a la KM para este ARNip, 8,4 nM (Tabla 1). La Ki para el oligonucleótido competidor 2'-O-metilo perfectamente emparejado fue de 3,2 ± 1 nM (Figura 17 B), esencialmente la misma, dentro del error, que la del competidor totalmente de ARN. Los resultados indicaron que los oligonucleótidos 2'-O-metilo son buenos modelos para dianas de ARN protegidas en 5' y que la KM para la escisión de la diana por RISC está determinada en gran medida por la afinidad (KD) de RISC por su ARN diana.
Aunque las dianas con más de cinco desemparejamientos contiguos en cualquier extremo del ARNip son sustratos deficientes para la escisión, podrían, no obstante, unirse a RISC y competir con el ARN diana radiomarcado con 32P. Se utilizó el ensayo de competición de oligonucleótido 2'-O-metilo para determinar los valores de Ki para oligonucleótidos que contenían hasta ocho desemparejamientos con la cadena guía de ARNip (Figura 17B). Los oligonucleótidos 2'-O-metilo con desemparejamiento terminal 3' con el ARNip fueron buenos competidores: un desemparejamiento de cuatro nucleótidos con el extremo 3' del ARNip aumentó la Ki solo en aproximadamente 3 veces (9,0 ± 0,9 nM) y un desemparejamiento de ocho nucleótidos con el extremo 3' del ARNip aumentó la Ki en aproximadamente 10 veces (34,8 ± 7 nM). Por el contrario, los desemparejamientos con el extremo 5' del ARNip tuvieron un efecto dramático sobre la unión. Un desemparejamiento de cuatro nucleótidos en el extremo 5' del ARNip aumentó la Ki aproximadamente 12 veces (36,4 ± 9,2 nM) y un desemparejamiento de ocho nucleótidos con el extremo 5' del ARNip aumentó el Ki 53 veces (173 ± 16 nM). El efecto diferencial sobre la unión entre los desemparejamientos 5' y 3' se mantuvo incluso en el centro del ARNip: un oligonucleótido 2'-O-metilo con cuatro desemparejamientos con los nucleótidos 11, 12, 13 y 14 del ARNip (desemparejamiento central 3' de 4 nt, Figura 17 B) se unió más estrechamente a RISC (es decir, tenía una Ki más baja) que un oligonucleótido con cuatro desemparejamientos e las posiciones 7, 8, 9 y 10 de ARNip (desemparejamientos centrales en 5' de 4 nt, Figura 17 B).
Discusión de los ejemplos VII-XI:
RISC programado con ARNip exógeno es una enzima, capaz de múltiples rondas de escisión de la diana. Los estudios previos mostraron que la escisión de un ARN diana por RISC no requiere ATP (Nykanen et al., 2001; Tomari et al., 2004). El análisis cinético más detallado presentado en este documento indica que no hay etapas asistidas por ATP en el reconocimiento de la diana o en la escisión por RISC de Drosophila; no se detectó ninguna diferencia en la velocidad en presencia o ausencia de ATP para las reacciones de a Rní analizadas en condiciones de exceso de sustrato en puntos de tiempo tempranos (estado preestablecido) o en condiciones de exceso de enzima en las que la reacción era esencialmente de recambio único. Por el contrario, la velocidad de escisión en estado estacionario en múltiples condiciones de recambio se multiplicó por cuatro con ATP. Los resultados indican que la liberación de los productos de la endonucleasa de RISC es determinante de la velocidad en estas condiciones en ausencia de ATP, pero no en presencia de ATP. La explicación más sencilla de este hallazgo es que una ARN helicasa dependiente de ATP facilita la disociación de los productos de la escisión de la diana del ARNip unido a RISC. La participación de tal helicasa dependiente de ATP en ARNi in vivo puede explicar por qué los ARNip pueden ser activos dentro de una amplia gama de contenido de GC (Reynolds et al., 2004).
En presencia de ATP, RISC de Drosophila programado con ARNip es una enzima clásica de Michaelis-Menten. La cadena guía del ARNip estudiada en este documento tiene la secuencia de let-7, un miARN endógeno. In vivo, no se cree que let-7 dirija la escisión del ARNm, sino que se cree que reprime la traducción productiva de sus dianas de ARNm. No obstante, el ARNip let-7 se encuentra entre los ARNip más potentes que se han estudiado in vitro y proporciona un buen modelo para ARNip eficaz en general. Con una kcat de aproximadamente 7 x 10'3 s-1, el RISC programado con ARNip let-7 fue lento en comparación con las enzimas con sustratos de moléculas pequeñas (Tabla 1). La KM para este RISC fue de aproximadamente 8 nM. Las enzimas típicamente tienen valores de KM entre 1 y 100 veces mayores que las concentraciones fisiológicas de sus sustratos (Stryer et al., 1981). Los resultados indican que RISC no es una excepción: las especies de ARNm abundantes individuales están presentes en células eucariotas en concentraciones de pM altas o nM bajas. Es probable que la KM de RISC esté determinada principalmente por la fuerza de su interacción con el ARN diana, porque la KM es casi idéntica a la Ki de un inhibidor de oligonucleótidos 2'-O-metilo no escindible.
Recientemente, se describió un estudio de los parámetros cinéticos de la escisión del ARN diana por RISC humano (Martinez et al., 2004). En ese estudio, el RISC humano activo mínimo estaba altamente purificado; en este estudio, se midió la actividad RISC de Drosophila para el holo-RISC intacto, sin purificar, que se cree que es un complejo de
múltiples proteínas 80S (Pham et al., 2004). Se utilizaron diferentes ARNip en los dos estudios. No obstante, los valores de KM y kcat informados en este documento y para el RISC humano mínimo son notablemente similares: la KM fue de 2,7-8,4 nM y el kcat fue de 7,1 x 10-3 seg-1 para el holo-RISC de Drosophila programado con ARNip let-7 frente a una KM de 1,1-2,3 nM y una kcat de 1,7 x 10-2 seg-1 para un ARNip diferente en RISC humano mínimo. Al igual que en este estudio, se observó un estallido previo al estado estacionario en ausencia de ATP, de acuerdo con la idea de que la liberación del producto es asistida por ATP in vivo.
La relación de kcat a KM es una medida clásica de la eficiencia enzimática y corresponde a la constante de velocidad de segundo orden para la reacción cuando la concentración de sustrato es mucho menor que la KM. Para el RISC programado de let-7, kcat KM-1 es igual a aproximadamente 8,4 x 105 M-1 s-1 (aproximadamente 8,4 x 10-4 nM-1 s-1), un valor mucho más lento que la tasa de colisión esperada de RISC con ARNm = 107 M-1 s-1. Es posible que la velocidad de catálisis por RISC esté limitada por la velocidad de cambios conformacionales requeridos para la formación del complejo enzima-sustrato o por posteriores reordenamientos conformacionales requeridos para la catálisis. Es posible que se puedan diseñar ARNip que mejoren significativamente la kcat o la Km de RISC sin comprometer la especificidad.
Aunque típicamente se prevé que los ARNip se unan a sus ARN diana a través de 19 a 21 pares de bases complementarios, se encontró que las regiones 5', central y 3' del ARNip hacen contribuciones distintas a la unión y la catálisis (Figura 18). Las mediciones de KM y Ki sugieren que los nucleótidos 5' del ARNip contribuyen más a la unión de la diana que los nucleótidos 3'. Al menos para el ARNip examinado en este documento, los primeros tres y los últimos cinco nucleótidos de un ARNip de 21 nucleótidos contribuyen poco a la unión. Si el KD de RISC unido a su ARN objetivo es esencialmente su KM, aproximadamente 8 nM, entonces la energía libre (G° = -RT lin KD) de la interacción RISC:diana programada con let-7 es aproximadamente -11 kcal mol'1, considerablemente menor que el -35 kcal mol-1 (KD aproximadamente 10-29) predicha 32 para el ARN let-7 unido a un ARN completamente complementario en K+ 100 mM y Mg2+1,2 mM a 25 °C. Es posible que RISC descarte la energía de enlace potencial al unirse menos estrechamente a su diana, un ARNip en RISC gana la capacidad de discriminar entre dianas bien emparejadas y mal emparejadas, pero solo para bases en la región 5' de la cadena guía del ARNip.
Los desemparejamientos entre las regiones central y 3' de un ARNip y su ARN diana reducen la kcat mucho más que los desemparejamientos en el extremo 5' del ARNip. Estos resultados encajan bien con los hallazgos recientes de Doench y Sharp de que la represión traslacional por ARNip, diseñado para actuar como miARN de animal, se ve dramáticamente alterado por desemparejamientos con el extremo 5' del ARNip, pero no con desemparejamientos similares en el extremo 3' 18. Estos autores proponen que la unión de miARN está mediada principalmente por nucleótidos en el extremo 5' del ARN pequeño. De hecho, la complementariedad entre el extremo 5' de los miARN y sus dianas ha sido requerida por todos los enfoques computacionales para predecir dianas de miARN de animales (Rajewsky et al., 2004; Lewis et al., 2003; Stark et al., 2003; Enright et al., 2003). El presente descubrimiento de que las secuencias de ARNip central y 3' deben emparejarse con la secuencia diana para una escisión efectiva de la diana pero no para la unión a la diana refuerza esta opinión; las secuencias de miARN central y 3' normalmente no coinciden con sus sitios de unión en sus dianas naturales (Lee et al., 1993; Reinhart et al., 2000; Brennecke et al., 2003; Abrahante et al., 2003; Vella et al., 2000; Brennecke et al., 2003; Abrahante et al., 2003; Vella et al., 2004; Xu et al., 2003; Johnston et al., 2003).
Se ha propuesto que la formación de una hélice en forma de A contigua que rodea el fosfato escindible del ARNm diana es una etapa de control de calidad para la escisión de la diana mediada por RISC (Chiu et al., 2003). La presente invención descubre que RISC puede dirigir la escisión cuando el ARNip se empareja con el ARN diana solo en los nucleótidos 2-12 de la cadena guía, correspondiente a una vuelta completa de una hélice ARN: ARN. Esta región del ARNip incluye a los nucleótidos 2-8, que parecen ser críticos para el reconocimiento de miARN de ARNm destinados a la represión traduccional, más dos nucleótidos que flanquean cada lado del fosfato escindible. La presente invención descubre además que el desemparejamiento del primer nucleótido de la cadena guía mejora la actividad de los ARNip con siete, ocho o nueve desemparejamientos 3' con el ARN diana es sorprendente, ya que muchos miARN no se emparejan con sus dianas en esta posición. Además, tal emparejamiento se parece al informado por Linsley y colegas para los efectos fuera de la diana dirigidos por ARNip en células de mamífero cultivadas (Jackson et al., 2003).
El requisito de una vuelta completa de una hélice puede reflejar un mecanismo de 'control de calidad' por parte de RISC. Dado que RISC aparentemente puede ensamblarse en cualquier secuencia de ARNip, debe usar la estructura del ARNip emparejado con su diana para determinar si se escinde o no. A pesar de la aparente vigilancia de la estructura del par de ARNip/diana, la identidad del fosfato escindible no se altera por un desemparejamiento extenso entre el extremo 5' del ARNip y su diana. Sin embargo, el fosfato escindible está determinado por su distancia desde el extremo 5' de la cadena guía de ARNip (Elbashir et al., 2001; Elbashir et al., 2001). La explicación más simple para el presente descubrimiento es que el fosfato escindible se identifica mediante una proteína cargada en el ARNip durante el ensamblaje de RISC, es decir, antes del encuentro de RISC con su ARN diana.
La notable tolerancia de RISC para los desemparejamientos entre el ARNip y sus dianas, hasta nueve nucleótidos 3' contiguos, implica que debe esperarse un gran número de genes fuera de la diana para muchas secuencias de ARNip cuando RISC está presente en exceso sobre sus dianas de ARN. Sin embargo, los RISC con grandes desemparejamientos entre el ARNip y la diana son bastante lentos para escindir, por lo que los efectos fuera de la
diana pueden minimizarse manteniendo la cantidad de RISC lo más baja posible. Estos conocimientos de la base molecular del silenciamiento génico dirigido por ARNip ayudan al experto en la creación de ARNip diseñados para equilibrar las demandas competitivas de la eficacia y especificidad del ARNip.
Procedimientos experimentales
A. Métodos generales
La preparación del lisado de embriones de Drosophila, las reacciones de ARNi in vitro y la marcación de protección de los ARN diana usando guanilil transferasa se llevaron a cabo como se describió previamente (Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000). Se utilizaron ARN diana a una concentración de aproximadamente 5 nM para asegurar que las reacciones se produjeran en condiciones de recambio único. La escisión de la diana en estas condiciones fue proporcional a las concentraciones de ARNip. Los productos de escisión de las reacciones de ARNi se analizaron mediante electroforesis en geles de acrilamida desnaturalizantes al 5% u 8%. El etiquetado del extremo 5' y la determinación del estado de desenrollado del ARNip se realizaron de acuerdo con Nykanen et al., (Nykanen et al., 2001) excepto que se utilizó ARN competidor no marcado con un exceso molar de 100 veces. Los geles se secaron, luego se expusieron a placas para obtención de imágenes (Fuji), que se escanearon con un fosforimager Fuji FLA-5000. Las imágenes se analizaron utilizando Image Reader FLA-5000 versión 1.0 (Fuji) e Image Gauge versión 3.45 o 4.1 (Fuji). El análisis de los datos se realizó utilizando Excel (Microsoft) e IgorPro 5.0 (Wavemetrics).
B. Lisado de embriones de Drosophila
La marcación de ARNip con polinucleótido quinasa (New England Biolabs), la preparación del ARN diana y la marcación con guanilil transferasa se llevaron a cabo como se describe (Hutvagner et al., 2002, Haley et al., 2003) y la secuencia del cebador directo para el ARNm diana de 379 nt fue 5'-c Gc TAA TAC GAC TCA CTA TAG CAG t TG GCG CCG CGA ACG A-3', y 5'-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG TCA CAT CTC ATC TAC CTC C-3 para la diana de 182 nt. Los cebadores inversos usados para generar ARN diana completamente emparejados y desemparejados fueron: 5'-CCC ATT TAG GTG ACA CTA TAG ATT TAC ATC GCG TTG AGT GTA GAA CGG TTG TAT AAA AGG TTG AGG TAG TAG GTT GTA TAG TGA AGA GAG GAG TTC ATG ATC AGT G-3' (emparejamiento perfecto con let-7); 5'-CCC ATT TAG GTG ACA CTA TAG ATT TAC ATC GCG TTG AGT GTA GAA CGG TTG TAT AAA AGG TTG AGG TAG TAG GTT CAT GCA GGA AGA GAG GAG TTC ATG ATC AGT G-3' (desemparejamientos en 3' de 7 nt); 5'-CCC ATT TAG GTG ACA CTA TAG ATT TAC ATC GCG TTG AGT GTA GAA CGG TTG TAT AAA AGG TTG AGG TAG TAG GTA CAU GCA GGA AGA GAG GAG TTC ATG ATC AGT G-3' (desemparejamiento en 3' de 8 nt); 5'-CCC ATT TAG GTG ACA CTA TAG ATT TAC ATC GCG TTG AGT GTA GAA CGG TTG TAT AAA AGG TTG AGG TAG TAG GAA CAT GCA GGA AGA GAG GAG TTC ATG ATC AGT G-3' (desemparejamiento en 3' de 9 nt); 5'-CCC ATT TAG GTG ACA CTA TAG ATT TAC ATC GCG TTG AGT GTA GAA CGG TTG TAT AAA AGG TAC TCC ATC TAG GTT GTA TAG TGA AGA GAG GAG TTC ATG ATC AGT G-3'(desemparejamiento en 5' de 8 nt); 5'-CCC ATT TAG GTG ACA CTA TAG ATT TAC ATC GCG TTG AGT GTA GAA CGG TTG TAT AAA AGG TAC TCG TAG TAG GTT GTA TAG TGA AGA GAG GAG TTC ATG ATC AGT G-3' (desemparejamiento en 5' de 4 nt). En las Figuras 13, 14, 15, 17A, 19 y 20A, la secuencia diana tenía una longitud de 613 nt; 379 nt en las Figuras 16A-C, 17B y 20B; y 182 nt en la Figura 16D. Todos los ARNip se desprotegieron de acuerdo con el protocolo del fabricante (Dharmacon), se marcaron radioactivamente en 5' cuando fue apropiado, luego se purificaron en gel sobre un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 15%. Los oligonucleótidos 2'-O-metilo eran de Dharmacon. Las cadenas de ARNip se hibridaron a altas concentraciones y se diluyeron en serie en tampón de lisis (HEPES 30 nM pH 7,4, KOAc 100 mM y MgCh 2 mM). Los geles se secaron y se formaron imágenes como se describe (Schwartz et al., 2003). Las imágenes se analizaron usando Image Gauge 4.1 (Fuji). Las tasas iniciales se determinaron mediante regresión lineal utilizando Excel X (Microsoft) o IgorPro 5.01 (Wavemetrics). Se utilizó Kaleidagraph 3.6.2 (Synergy Software) para determinar KM y Ki mediante el ajuste global a las ecuaciones: V = (Vmáx. x S) (KM S) -1 y V = (Vmáx. x Ki(app)) (Ki(app) l) -1, en las que V es velocidad, S es la concentración de ARN diana e I es la concentración del competidor del oligonucleótido 2'-O-metilo. Ki se calculó corrigiendo Ki(app) por KM y concentración de sustrato, Ki = Ki(app) (1+ (S KM-1)) -1.
C. preparación de ARNip
Se desprotegieron los ARN sintéticos (Dharmacon) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las cadenas de ARNip se hibridaron (Elbashir et al., 2001a) y se usaron a una concentración final de 50 nM a menos que se indique lo contrario. Se fosforilaron cadenas sencillas de ARNip con polinucleótido quinasa (New England Biolabs) y ATP 1 mM de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se usaron a una concentración final de 500 nM.
D. Preparación de ARN diana
Los ARN diana se transcribieron con ARN polimerasa T7 recombinante marcada con histidina a partir de productos de PCR como se describe (Nykanen et al., 2001; Hutvagner y Zamore, 2002), excepto para el ARNm de sodl sentido, que se transcribió a partir de una plantilla de plásmido. (Crow et al., 1997) linealizado con Bam HI. Se generaron plantillas de PCR para los ARN diana sentido y antisentido de http y sodl mediante la amplificación de la plantilla de plásmido de 0,1 ng/ml (concentración final) que codifica el ADNc de http o sodl utilizando los siguientes pares de cebadores: diana sentido de htt, 5'-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA CAG TAT GTC TCA GAC ATC-3' y 5'UUCG AAG UAU UCC GCG UAC GU-3' ; diana antisentido de http, 5'-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAC AAG CCT AAT TAG TGATGC-3' y 5'-GAA CAG TAT GTC TCA GAC ATC-3'; diana antisentido de sodl, 5'-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TTT GTT AGC AGC CGG AT-3' y 5'-GGG AGA CCA CAA CGG TTT CCC-3'.
Captura del oligonucleótido 2'-O-metilo inmovilizado de RISC
El extremo 5' de la cadena de ARNip que se va a medir se radiomarcó con 32P con PNK. Se inmovilizaron 10 pmol de ARN 2'-O-Metil biotinilado en Dynabeads M280 (Dynal) mediante incubación en 10 ml de tampón de lisis que contenía DTT 2 mM durante 1 h en hielo con el equivalente a 50 ml de la suspensión de perlas proporcionada por el fabricante. A continuación, se lavaron las perlas para eliminar el oligonucleótido no unido. Se incubó previamente ARNip 50 nM en una reacción estándar de ARNi in vitro de 50 ml durante 15 min a 25 °C. Luego, se añadió a la reacción todo el oligonucleótido 2'-O-metilo inmovilizado y la incubación continuó durante 1 h a 25 °C. Después de la incubación, las perlas se lavaron rápidamente tres veces con tampón de lisis que contenía NP-40 al 0,1% (p/v) y DTT 2 mM seguido de un lavado con el mismo tampón sin NP-40. La radiactividad de entrada y unida se determinaron mediante recuento de centelleo (Beckman). La fracción de 5' biotina se unió mediante un brazo espaciador de seis carbonos. Los oligonucleótidos 2'-O-metilo (IDT) fueron: 5'-biotina-ACA UUU CGA AGU AUU CCG CGU ACGUGA UGU U-3' (para capturar la cadena sentido del ARNip), 5'-biotina-CAU CAC GUA CGC GGA AUA CUU CGA AAU GUC C-3' (para capturar la cadena antisentido).
Análisis de mfold
Para modelar el extremo de un ARNip, la siguiente secuencia de ARN de 16 nucleótidos se sometió a mfold 3.1: (37 °C, NaCl 1 M): CGU ACU UUU GUA CGU G, UGU ACU UUU GUA CGU G y UCG AAU UU UUC GAA A.
Procesamiento de Pre-let-7
Se incubó ARN pre-let-7 con Dicer humano marcado con histidina en el terminal N de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Gene Therapy Systems) o en una reacción de ARNi in vitro de embrión de Drosophila estándar como se describió anteriormente ((Hutvagner et al., 2001); Hutvagner y Zamore, 2002).
Hibridación Northern
La hibridación Northern fue esencialmente como se describe (Hutvagner et al., 2001). Se cargaron 50 mg de ARN total por carril. Las sondas de ARN sintéticas radiomarcadas con 32P en 5' (Dharmacon) fueron: 5'-ACA AAU UCG GAU CUA CAG GGU-3' (para detectar miR-10) y 5'-AAA CCU CUC UAG AAC CGA AUU U-3' (para detectar miR-10 *). La cantidad de miR-10 o miR-10* detectada se normalizó a la hibridación no específica de la sonda con el ARNr 5S. La normalización para hibridación de la sonda hasta una cantidad conocida de un control de ARN sintético miR-10 o miR-10* produjo esencialmente el mismo resultado.
Agotamiento de ATP e inhibición de N-etil maleimida (NEM)
Las reacciones de ARNi usando lisado de embriones de Drosophila fueron las descritas (Haley et al., 2003). Para comparar las condiciones de ATP 'menos' y 'más', las muestras se trataron con NEM 10 mM (Pierce) durante 10 min a 4 °C, luego se inactivó NEM con ditiotreitol (DTT) 11 mM. Para el agotamiento de ATP (sin ATP), se añadió 1 unidad de hexocinasa y glucosa 20 mM (concentración final) y la incubación continuó durante 30 min a 25 °C. Para las reacciones de ATP 'mas', 0,05 mg/ml (concentración final) de creatina quinasa y una décima parte del volumen de H2O sustituyen a la hexoquinasa y la glucosa. La adición de creatina quinasa fresca después del tratamiento con NEM no rescató el defecto en el ensamblaje de RISC, pero restauró el ATP a niveles altos (Nykanen et al., 2001). Los niveles de ATP se midieron usando un kit de ensayo de ATP (Sigma) y un luminómetro PhL (Mediators Diagnostika).
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Claims (16)
1. Un método in vitro para mejorar la eficacia de un dúplex de ARNip, comprendiendo el dúplex de ARNip una cadena sentido y una cadena antisentido, que comprende disminuir la fuerza del par de bases entre el extremo 5' de la cadena antisentido (5' de AS) y el extremo 3' de la cadena sentido (3' de S) en comparación con la fuerza del par de bases entre el extremo 3' de la cadena antisentido (3' de AS) y el extremo 5' de la cadena sentido (5' de S), de tal manera que se mejore la eficacia,
en el que la fuerza del par de bases se reduce debido a al menos un par de bases desemparejados entre el extremo 5' de AS el extremo 3' de S, y además, en el que el extremo 5' de las cadenas antisentido y sentido son los cinco nucleótidos en los terminales 5' de las cadenas respectivas, y
en el que la cadena antisentido tiene una secuencia suficientemente complementaria a un ARNm diana para desencadenar la destrucción del ARNm diana por la maquinaria o el proceso de ARNi, en el que el ARNm diana especifica la secuencia de aminoácidos de una proteína asociada con una afección patológica.
2. El método in vitro de la reivindicación 1, en el que se mejora la asimetría del dúplex de ARNip, de tal manera que se promueve la entrada de la cadena antisentido del dúplex de ARNip en un complejo de RISC.
3. El método in vitro de la reivindicación 1 o 2, que comprende además poner en contacto una célula que tiene una ruta de ARNi con el dúplex de ARNip in vitro.
4. El método in vitro de la reivindicación 2, en el que el extremo 5' de las cadenas antisentido y sentido es el nucleótido en los terminales 5' de las cadenas respectivas.
5. El uso in vitro de un dúplex de ARNip en un método para mejorar el silenciamiento de un ARNm diana, que comprende poner en contacto una célula que tiene una ruta de ARNi con el dúplex de ARNip bajo condiciones tales que mejora el silenciamiento,
en el que la fuerza del par de bases entre el extremo 5' antisentido (5' de AS) y el extremo 3' de la cadena sentido (3' de S) del ARNip es menor que la fuerza del par de bases entre el extremo de la cadena antisentido (3' de AS) y el extremo 5' de la cadena sentido (5' de S) del ARNip debido a al menos un par de base desemparejado entre el extremo 5' de AS y el extremo 3' de S, y además, en el que el extremo 5' de las cadenas antisentido y sentido son los cinco nucleótidos en los terminales 5' de las cadenas respectivas,
en el que la cadena antisentido tiene una secuencia suficientemente complementaria al ARNm diana para desencadenar la destrucción del ARNm diana por la maquinaria o proceso de ARNi, y
en el que se introduce el dúplex de ARNip utilizando un constructo viral empaquetado en una partícula viral.
6. Un dúplex de ARNip para uso en terapia,
en el que la fuerza del par de bases entre el extremo 5' antisentido (5' de AS) y el extremo 3' de la cadena sentido (3' de S) del ARNip es menor que la fuerza del par de la base entre el extremo 3' de la cadena antisentido (3' de AS) y el extremo 5' de la cadena sentido (5' de S) del ARNip debido a al menos un par de bases desemparejadas entre el extremo 5' de AS y el extremo 3' de S, y además, en el que el extremo 5' de las cadenas antisentido y sentido es de cinco nucleótidos en los terminales 5' de las cadenas respectivas,
en el que la cadena antisentido tiene una secuencia suficientemente complementaria al ARNm diana para desencadenar la destrucción del ARNm diana por la maquinaria o el proceso de ARNi, y
en el que el ARNm diana especifica la secuencia de aminoácidos de una proteína asociada con una afección patológica.
7. El uso in vitro de la reivindicación 5, en el que el ARNm diana especifica la secuencia de aminoácidos de una proteína asociada con una afección patológica.
8. El dúplex de ARNip para uso de la reivindicación 6, en el que el dúplex de ARNip se introduce utilizando un constructo viral empacado en una partícula viral.
9. El uso in vitro de la reivindicación 5 o el dúplex de ARNip para uso de la reivindicación 8, en el que la partícula viral es un vector adenoviral recombinante.
10. El uso in vitro de la reivindicación 5 o el dúplex de ARNip para uso de la reivindicación 6, en el que el ARNip se introduce en forma de un ARN de horquilla pequeño (ARNhp) que comprende una secuencia de nucleótidos idéntica a la cadena sentido y antisentido del dúplex de ARNip.
11. El uso in vitro o el dúplex de ARNip para uso de la reivindicación 10, en el que la secuencia de nucleótidos idéntica a la cadena antisentido está secuencia arriba de la secuencia de nucleótidos idéntica a la cadena sentido.
12. El uso in vitro o el dúplex de ARNip para uso de la reivindicación 10, en el que la secuencia de nucleótidos idéntica a la cadena sentido está secuencia arriba de la secuencia de nucleótidos idéntica a la cadena antisentido.
13. Un ARNhp como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el ARNhp comprende una secuencia de nucleótidos idéntica a la cadena sentido y antisentido de un dúplex de ARNip,
en el que la fuerza del par de bases entre el extremo 5' antisentido (5' de AS) y el extremo 3' de la cadena sentido (3' de S) del ARNip es menor que la fuerza del par de bases entre el extremo 3' de la cadena antisentido (3' de AS) y el extremo 5' de la cadena sentido (5' de S) del ARNip debido a al menos un par de bases desemparejadas entre el extremo 5' de AS y el extremo 3' de S, y además, en el que el extremo 5' de las cadenas antisentido y sentido es de cinco nucleótidos en los terminales 5' de las cadenas respectivas,
en el que la cadena antisentido tiene una secuencia suficientemente complementaria al ARNm diana para desencadenar la destrucción del ARNm diana por la maquinaria o el proceso de ARNi, y
en el que el ARNm diana especifica la secuencia de aminoácidos de una proteína asociada con una afección patológica.
14. Un vector que codifica el ARNhp de la reivindicación 13.
15. El método in vitro de la reivindicación 1, el uso in vitro de la reivindicación 5 o el dúplex de ARNip para uso de la reivindicación 6, en el que al menos un par de bases desemparejado se selecciona del grupo que consiste en G:A, C: A, C:U, G:G, A:A, C:C y U:U.
16. El método in vitro de la reivindicación 1, el dúplex de ARNip para uso de la reivindicación 6 o el uso in vitro de la reivindicación 7, en el que la proteína asociada con una afección patológica se selecciona del grupo que consiste en (a) una proteína asociada al patógeno, (b) una proteína huésped que facilita la entrada del patógeno en el huésped, el metabolismo del fármaco por parte del patógeno o el huésped, la replicación o la integración del genoma del patógeno, el establecimiento o la propagación de la infección en el huésped, o el ensamblaje de próxima generación del patógeno, (c) una proteína asociada al tumor y (d) una proteína asociada a la enfermedad autoinmune.
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