JP2627899B2 - 遺伝子封入リポソームの製法 - Google Patents
遺伝子封入リポソームの製法Info
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は遺伝子封入リポソームの製法に係わり，殊に
逆相蒸発法を利用する遺伝子封入リポソームの製法に係
わる． （従来の技術） リポソームは生体膜と基本的に同じ構造を有する脂質
二重層膜からなる閉鎖小胞である．近年，特定の遺伝情
報を組み込んだプラスミドDNA等をリポソーム内に封入
して生体に導入し，標的細胞と融合させることによって
遺伝性疾患や悪性腫瘍の治療を行う，いわゆる「遺伝子
療法」に関する技術が発展しつつある．リポソームとし
ては材料である脂質の種類，その混合比，製法等により
多種多様なものが調製されているが，遺伝子例えばDNA
封入リポソームの調製法としてはSzokaとPapahajopoulo
sにより開発された逆相蒸発法がある（Proc.Natl.Acad.
Sci.USA第75巻第4194−4198頁,1978年）．この方法によ
れば脂質を有機溶媒に溶解させ，この溶液にDNA含有水
溶液を添加し，この混合溶液を超音波処理して逆相ミセ
ルの形成を促し，次いで減圧下に有機溶媒を蒸発させる
ことによりDNA封入リポソームが形成される． 一方，リポソーム封入物を細胞に移入する場合には，
リポソーム構成脂質の種類が細胞へのリポソーム取り込
み量に大きな影響をおよぼし，陰性荷電を有するリン脂
質の割合が高いと細胞へのリポソームの結合能が増加す
ることが知られ，またリポソームの安定性はコレステロ
ール含量に影響されることが知られている． （発明が解決しようとする問題点および発明の目的） 生体にリポソーム殊にDNA,組換えDNA等の遺伝子を封
入したリポソームを注入して標的組織の細胞に融合させ
て遺伝子療法を行うための，遺伝子封入リポソームとし
てはその直径が約100−400nmであることが望ましい．な
ぜならばリポソームが肝臓，脾臓等の細胞内皮系に捕捉
され難くなし，また毛細血管や血液脳関門を通過し易く
なすためにはその径が小さな程好ましく，さらに除菌操
作を容易にするためには除菌フィルター（ポア径0.45μ
ｍ）を通過し得るのが好ましいが，一方においてリポソ
ームの外径が100nm以下であるとその内容積の制限によ
り数1000塩基対のDNAを封入することが困難となるから
である． 一方，上記の逆相蒸発法はリポソームの材料となる脂
質の種類や混合比を任意に選択でき，細胞への結合性や
DNA封入効率を大になすことができるが，直径が100−40
0nmのリポソームへのDNA封入率が低く，またリポソーム
形成時における有機溶媒の減圧除去の際に突沸が生じ易
い問題点を有している． 従って，本発明の目的は，逆相蒸発法による遺伝子封
入リポソームの製法であって，リポソーム形成時に試料
の突沸が生じ難くかつ直径が約100−400nmのリポソーム
においても遺伝子封入率を高くなし得る，遺伝子封入リ
ポソームの製法を提供することにある． （問題点を解決し，目的を達成する手段および作用） 本発明によれば、上記の問題点は、逆相蒸発法による
遺伝子封入リポソームの製法において、超音波処理によ
り乳化した試料中の有機溶媒を減圧除去する途次におい
て多価アルコールを添加することを特徴とする、遺伝子
封入リポソームの製法により解決され、上記の目的が達
成される。
逆相蒸発法を利用する遺伝子封入リポソームの製法に係
わる． （従来の技術） リポソームは生体膜と基本的に同じ構造を有する脂質
二重層膜からなる閉鎖小胞である．近年，特定の遺伝情
報を組み込んだプラスミドDNA等をリポソーム内に封入
して生体に導入し，標的細胞と融合させることによって
遺伝性疾患や悪性腫瘍の治療を行う，いわゆる「遺伝子
療法」に関する技術が発展しつつある．リポソームとし
ては材料である脂質の種類，その混合比，製法等により
多種多様なものが調製されているが，遺伝子例えばDNA
封入リポソームの調製法としてはSzokaとPapahajopoulo
sにより開発された逆相蒸発法がある（Proc.Natl.Acad.
Sci.USA第75巻第4194−4198頁,1978年）．この方法によ
れば脂質を有機溶媒に溶解させ，この溶液にDNA含有水
溶液を添加し，この混合溶液を超音波処理して逆相ミセ
ルの形成を促し，次いで減圧下に有機溶媒を蒸発させる
ことによりDNA封入リポソームが形成される． 一方，リポソーム封入物を細胞に移入する場合には，
リポソーム構成脂質の種類が細胞へのリポソーム取り込
み量に大きな影響をおよぼし，陰性荷電を有するリン脂
質の割合が高いと細胞へのリポソームの結合能が増加す
ることが知られ，またリポソームの安定性はコレステロ
ール含量に影響されることが知られている． （発明が解決しようとする問題点および発明の目的） 生体にリポソーム殊にDNA,組換えDNA等の遺伝子を封
入したリポソームを注入して標的組織の細胞に融合させ
て遺伝子療法を行うための，遺伝子封入リポソームとし
てはその直径が約100−400nmであることが望ましい．な
ぜならばリポソームが肝臓，脾臓等の細胞内皮系に捕捉
され難くなし，また毛細血管や血液脳関門を通過し易く
なすためにはその径が小さな程好ましく，さらに除菌操
作を容易にするためには除菌フィルター（ポア径0.45μ
ｍ）を通過し得るのが好ましいが，一方においてリポソ
ームの外径が100nm以下であるとその内容積の制限によ
り数1000塩基対のDNAを封入することが困難となるから
である． 一方，上記の逆相蒸発法はリポソームの材料となる脂
質の種類や混合比を任意に選択でき，細胞への結合性や
DNA封入効率を大になすことができるが，直径が100−40
0nmのリポソームへのDNA封入率が低く，またリポソーム
形成時における有機溶媒の減圧除去の際に突沸が生じ易
い問題点を有している． 従って，本発明の目的は，逆相蒸発法による遺伝子封
入リポソームの製法であって，リポソーム形成時に試料
の突沸が生じ難くかつ直径が約100−400nmのリポソーム
においても遺伝子封入率を高くなし得る，遺伝子封入リ
ポソームの製法を提供することにある． （問題点を解決し，目的を達成する手段および作用） 本発明によれば、上記の問題点は、逆相蒸発法による
遺伝子封入リポソームの製法において、超音波処理によ
り乳化した試料中の有機溶媒を減圧除去する途次におい
て多価アルコールを添加することを特徴とする、遺伝子
封入リポソームの製法により解決され、上記の目的が達
成される。
本発明において用いられる多価アルコールとしてはグ
リセロール，エチレングリコール，エリトリトール，ソ
ルビトール等であるが，グリセロールが殊に好ましい．
多価アルコールは水溶液の形で添加され，その濃度とし
てはグリセロールの場合に５％程度が好ましい． リポソーム構成材料の脂質としてはホスファチジルコ
リン，ホスファチジルセリンまたはこれらの両者を主材
とし，コレステロールを副材とするものが好ましい．こ
の場合にコレステロールはリポソームの安定化に寄与す
るものであり，その配合量は40モル％程度までが好まし
い． これらの脂質を溶解させる有機溶媒としてはジエチル
エーテル，イソプロピルアルコール等を挙げることがで
きる． 本発明方法により封入される遺伝子はDNAまたは組換
えDNAであることができる． 本発明方法を実施する場合について若干具体的に説明
すれば，原料脂質の溶液をナス型フラスコに入れ，回転
式蒸発器により有機溶媒を減圧除去してフラスコ内壁に
脂質薄膜を形成させた後，これをジエチルエーテルなど
の有機溶媒で溶解し遺伝子含有水溶液を添加し，超音波
処理して試料を乳化させ，ふたたび回転式蒸発器で有機
溶媒を減圧除去してリポソーム懸濁液を調製する．本発
明方法によれば上記の乳化試料から有機溶媒を減圧除去
する段階で多価アルコール例えばグリセロール水溶液が
添加されるが，この添加時期としては減圧を２段階で行
い，この２段階目の減圧に先立ち添加するのが好まし
い．例えば回転式蒸発器の内圧を約480mmHgに保って有
機溶媒を除去し，試料がペースト状を呈した時点で多価
アルコール水溶液を添加し，次いで内圧を約150mmHgに
保って以降の有機溶媒除去を行うのである．この場合に
形成される遺伝子封入リポソームの直径分布は200−400
nm領域が最も多く，それ以上のものも存在する．そこ
で,100−400nmの直径を有するものを主体とする遺伝子
封入リポソームを得るためには，リポソーム懸濁液を平
均ポアサイズ400nmのニュクリポアフィルターに通せば
良い． （発明の効果） 本発明による遺伝子封入リポソームの製法によれば，
直径400nm以下のリポソームにDNAが効率よく封入される
ので,0.45μｍのフィルターを用いて容易に除菌操作す
ることができ，生体に遺伝子を導入する担体として用い
ることができる．現在，遺伝子療法では約１万塩基対の
プラスミドがよく用いられているが，本発明による製法
で製造した直径400nm以下のリポソームには少なくとも
２万塩基対のDNAまで封入できるので，本発明はプラス
ミドDNAをリポソームに封入する有力な手段を提供する
ものである． （実施例等） 次に，実施例，試験例等に関連して本発明をさらに詳
細に説明する． 尚，実施例等において用いた原料，試験法等は下記の
通りである． （１）DNA MWマーカーVI（商標） 大阪在，株式会社ニッポンジーンより市販のもの． （２）卵黄ホスファチジルコリン 大阪在，日本精化株式会社より市販のもの． （３）ホスファチジルセリン アメリカ合衆国，セントルイス在，シグマ社より市販
のもの． （４）コレステロール アメリカ合衆国，セントルイス在，シグマ社より市販
のもの． （５）リポソームの定量 リポソームの主要構成成分であるホスファチジルコリ
ンおよびコレステロールを，それぞれ大阪在，和光純薬
工業株式会社の「リン脂質Ｂ−テストワコー］（商標）
および「コレステロールＣ−テストワコー」（商標）を
用いて定量． （６）リポソームの直径の測定 電子顕微鏡を用いてフリーズフラクチャー法により測
定． （７）DNAの定量 Anal.Biochem.第100巻第188−197頁,1979年に記載の
方法に従って定量． 実施例１ DNAを封入したリポソームは以下のような方法にて製
造した。
リセロール，エチレングリコール，エリトリトール，ソ
ルビトール等であるが，グリセロールが殊に好ましい．
多価アルコールは水溶液の形で添加され，その濃度とし
てはグリセロールの場合に５％程度が好ましい． リポソーム構成材料の脂質としてはホスファチジルコ
リン，ホスファチジルセリンまたはこれらの両者を主材
とし，コレステロールを副材とするものが好ましい．こ
の場合にコレステロールはリポソームの安定化に寄与す
るものであり，その配合量は40モル％程度までが好まし
い． これらの脂質を溶解させる有機溶媒としてはジエチル
エーテル，イソプロピルアルコール等を挙げることがで
きる． 本発明方法により封入される遺伝子はDNAまたは組換
えDNAであることができる． 本発明方法を実施する場合について若干具体的に説明
すれば，原料脂質の溶液をナス型フラスコに入れ，回転
式蒸発器により有機溶媒を減圧除去してフラスコ内壁に
脂質薄膜を形成させた後，これをジエチルエーテルなど
の有機溶媒で溶解し遺伝子含有水溶液を添加し，超音波
処理して試料を乳化させ，ふたたび回転式蒸発器で有機
溶媒を減圧除去してリポソーム懸濁液を調製する．本発
明方法によれば上記の乳化試料から有機溶媒を減圧除去
する段階で多価アルコール例えばグリセロール水溶液が
添加されるが，この添加時期としては減圧を２段階で行
い，この２段階目の減圧に先立ち添加するのが好まし
い．例えば回転式蒸発器の内圧を約480mmHgに保って有
機溶媒を除去し，試料がペースト状を呈した時点で多価
アルコール水溶液を添加し，次いで内圧を約150mmHgに
保って以降の有機溶媒除去を行うのである．この場合に
形成される遺伝子封入リポソームの直径分布は200−400
nm領域が最も多く，それ以上のものも存在する．そこ
で,100−400nmの直径を有するものを主体とする遺伝子
封入リポソームを得るためには，リポソーム懸濁液を平
均ポアサイズ400nmのニュクリポアフィルターに通せば
良い． （発明の効果） 本発明による遺伝子封入リポソームの製法によれば，
直径400nm以下のリポソームにDNAが効率よく封入される
ので,0.45μｍのフィルターを用いて容易に除菌操作す
ることができ，生体に遺伝子を導入する担体として用い
ることができる．現在，遺伝子療法では約１万塩基対の
プラスミドがよく用いられているが，本発明による製法
で製造した直径400nm以下のリポソームには少なくとも
２万塩基対のDNAまで封入できるので，本発明はプラス
ミドDNAをリポソームに封入する有力な手段を提供する
ものである． （実施例等） 次に，実施例，試験例等に関連して本発明をさらに詳
細に説明する． 尚，実施例等において用いた原料，試験法等は下記の
通りである． （１）DNA MWマーカーVI（商標） 大阪在，株式会社ニッポンジーンより市販のもの． （２）卵黄ホスファチジルコリン 大阪在，日本精化株式会社より市販のもの． （３）ホスファチジルセリン アメリカ合衆国，セントルイス在，シグマ社より市販
のもの． （４）コレステロール アメリカ合衆国，セントルイス在，シグマ社より市販
のもの． （５）リポソームの定量 リポソームの主要構成成分であるホスファチジルコリ
ンおよびコレステロールを，それぞれ大阪在，和光純薬
工業株式会社の「リン脂質Ｂ−テストワコー］（商標）
および「コレステロールＣ−テストワコー」（商標）を
用いて定量． （６）リポソームの直径の測定 電子顕微鏡を用いてフリーズフラクチャー法により測
定． （７）DNAの定量 Anal.Biochem.第100巻第188−197頁,1979年に記載の
方法に従って定量． 実施例１ DNAを封入したリポソームは以下のような方法にて製
造した。
卵黄ホスファチジルコリン９μmol,コレステロール６
μmolをクロロホルムに溶解してナス型フラスコに入
れ，回転式蒸発器を用いクロロホルムを減圧除去してガ
ラス内壁面に脂質薄膜を作り，水酸化カリウムを入れた
デシケータ中で真空乾燥した．これを1.5mlのジエチル
エーテルに溶解した後,0.5mlの10mMトリス塩酸緩衝液
（pH7.4）に溶解した40μｇのDNAを加えて，約60秒間超
音波処理をした．超音波によって乳化した試料中のジエ
チルエーテルを回転式蒸発器を用いて約480mmHgで減圧
除去し，ペースト状になったところで0.5mlの５％グリ
セロール水溶液を加えて撹はんし，ふたたび回転式蒸発
器を用いて約150mmHgで残余のジエチルエーテルをさら
に減圧除去し，リポソーム懸濁液とした．直径が400nm
以下のリポソームを得るためにリポソーム懸濁液を平均
ポアサイズ400nmのニュクリポアフィルター（アメリカ
合衆国，プレザントン在，ニュクリポア社製）に通し
た．リポソームに封入されなかったDNAはフィコールパ
ク（スウェーデン王国，ウプサラ在，ファルマシア社
製）の密度勾配遠心分離法にてリポソームより除去し
た． このようにして製造したDNA封入リポソームの直径を
電子顕微鏡を用いてフリーズフラクチャー法で調べたと
ころ第１図のようになり，平均ポアサイズ400nmのニュ
クリポアフィルターを通過した試料に含まれるリポソー
ムの90％以上は直径400nm以下であることがわかった。
μmolをクロロホルムに溶解してナス型フラスコに入
れ，回転式蒸発器を用いクロロホルムを減圧除去してガ
ラス内壁面に脂質薄膜を作り，水酸化カリウムを入れた
デシケータ中で真空乾燥した．これを1.5mlのジエチル
エーテルに溶解した後,0.5mlの10mMトリス塩酸緩衝液
（pH7.4）に溶解した40μｇのDNAを加えて，約60秒間超
音波処理をした．超音波によって乳化した試料中のジエ
チルエーテルを回転式蒸発器を用いて約480mmHgで減圧
除去し，ペースト状になったところで0.5mlの５％グリ
セロール水溶液を加えて撹はんし，ふたたび回転式蒸発
器を用いて約150mmHgで残余のジエチルエーテルをさら
に減圧除去し，リポソーム懸濁液とした．直径が400nm
以下のリポソームを得るためにリポソーム懸濁液を平均
ポアサイズ400nmのニュクリポアフィルター（アメリカ
合衆国，プレザントン在，ニュクリポア社製）に通し
た．リポソームに封入されなかったDNAはフィコールパ
ク（スウェーデン王国，ウプサラ在，ファルマシア社
製）の密度勾配遠心分離法にてリポソームより除去し
た． このようにして製造したDNA封入リポソームの直径を
電子顕微鏡を用いてフリーズフラクチャー法で調べたと
ころ第１図のようになり，平均ポアサイズ400nmのニュ
クリポアフィルターを通過した試料に含まれるリポソー
ムの90％以上は直径400nm以下であることがわかった。
リポソームに封入されたDNA量はビスベンズイミドH33
258フルオロクロム（アメリカ合衆国，ラホヤ在，ヘキ
スト社製）を用いるDNA微量定量法によって測定した．
すなわち，約13μmolの脂質を含むリポソーム懸濁液100
μｌに0.1mg/mlのDNA分解酵素ｌを50μｌ加えて37℃で3
0分間処理することによってリポソームに封入されてい
ないDNAを消化したのち，フェノール／クロロホルム溶
液（フェノール：クロロホルム＝1:1,1mMEDTA,10mMトリ
ス塩酸緩衝液,pH8.0）でリポソームからDNAを抽出し
た．次に,1.5μＭのビスベンズイミドH33258フルオロク
ロム水溶液1mlを加えて冷暗所に10分間放置したのち蛍
光分光光度計（東京在，日立製作所製,650−10S型）で3
55nmで励起し,460nmの蛍光を測定し，第２図に示す検量
線と照合してDNA量を求めた．本発明方法にて製造した
リポソームとSzokaとPapahadjopoulosにより開発された
方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA第75巻第4194−4198頁,1
987年）にて製造したリポソームのDNA封入率を比較した
結果，直径400nm以下のリポソームに封入されたDNAの割
合は，本発明による製法にて製造したリポソームの場合
が後者の方法で製造したリポソームの場合より約２倍高
く19.8％であった。
258フルオロクロム（アメリカ合衆国，ラホヤ在，ヘキ
スト社製）を用いるDNA微量定量法によって測定した．
すなわち，約13μmolの脂質を含むリポソーム懸濁液100
μｌに0.1mg/mlのDNA分解酵素ｌを50μｌ加えて37℃で3
0分間処理することによってリポソームに封入されてい
ないDNAを消化したのち，フェノール／クロロホルム溶
液（フェノール：クロロホルム＝1:1,1mMEDTA,10mMトリ
ス塩酸緩衝液,pH8.0）でリポソームからDNAを抽出し
た．次に,1.5μＭのビスベンズイミドH33258フルオロク
ロム水溶液1mlを加えて冷暗所に10分間放置したのち蛍
光分光光度計（東京在，日立製作所製,650−10S型）で3
55nmで励起し,460nmの蛍光を測定し，第２図に示す検量
線と照合してDNA量を求めた．本発明方法にて製造した
リポソームとSzokaとPapahadjopoulosにより開発された
方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA第75巻第4194−4198頁,1
987年）にて製造したリポソームのDNA封入率を比較した
結果，直径400nm以下のリポソームに封入されたDNAの割
合は，本発明による製法にて製造したリポソームの場合
が後者の方法で製造したリポソームの場合より約２倍高
く19.8％であった。
次に，本発明による製法にて製造した直径400nm以下
のリポソームに封入されたDNA分子の大きさをアガロー
スゲル電気泳動法によって測定した。DNA MWマーカーVl
には74塩基対から約２万塩基対まで11種類のDNA分子が
含まれているのでリポソームに封入され得るDNA分子の
大きさを検討するのに好都合である．アガロースゲル電
気泳動による解析の結果，直径400nm以下のリポソーム
にも少なくとも約２万塩基対のDNA分子は封入され得る
ことがわかった． 実施例２ グリセロールの最適濃度は蛍光物質であるカルボキシ
フルオレセインを用いて決定した．すなわち,DNA溶液の
代わりに57.5μmolのカルボキシフルオレセインを含む
0.5mlのリン酸緩衝生理食塩水を１μmolの脂質混合液
（ホスファチジルコリン：コレステロール＝6:4）に加
えて超音波処理を行い，有機溶媒の減圧除去によって試
料をペースト状にし，これに１％から10％までのグリセ
ロール水溶液を加え，さらに残余の有機溶媒を減圧除去
することによってリポソームを製造した．第３図に示す
ように直径400nm以下のリポソームに封入されたカルボ
キシフルオレセインの量は５％グリセロール水溶液で製
造したリポソームの場合に最大となった． 参考例１ DNA封入リポソームをProc.Natl.Acad.Sci.USA第75巻
第4194−4198頁,1978年に記載の方法に従って製造し
た．すなわち，ホスファチジルコリン：コレステロール
のモル比が6:4の脂質混合液に40μｇのDNA（DNA MWマー
カーVl）を加えてリポソームを製造し，平均ボアサイズ
400nmのニュクリポアフィルターを通して直径400nm以下
のリポソームを製造した．このリポソームと本発明によ
る製法で製造したリポソームのDNA封入率をビスベンズ
イミドH33258フルオロクロムで測定したDNA量から算出
し，両者を比較した結果，脂質の回収率,DNAの封入率と
もに本発明による製法で製造したリポソームの方が優れ
ていることが判明したが，とりわけ直径400nm以下のリ
ポソームのDNA封入率は約２倍に増加していた． 参考例２ 実施例２記載の製法で製造した148μmolのカルボキシ
フルオレセインを封入したリポソームを，約１×106個
のヒト脳腫瘍由来の培養細胞（U178−MG）と接触させ37
℃で１時間静置した後，リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し
て蛍光顕微鏡で観察した．その結果，各細胞はカルボキ
シフルオレセインを取り込んで強い蛍光を発した。従っ
て，本発明による製法で製造した直径400nm以下のリポ
ソームは細胞に物質を導入するキャリアーとしての機能
を果たし得ることが判明した． 試験例 オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子を組み込ん
だDNAプラスミド（pMOG1）をリポソームに封入し，ヒト
脳腫瘍由来の培養細胞（U178−MG）に接触させオルニチ
ントランスカルバミラーゼ遺伝子が細胞内に取り込まれ
て発現するかどうかを検討した。
のリポソームに封入されたDNA分子の大きさをアガロー
スゲル電気泳動法によって測定した。DNA MWマーカーVl
には74塩基対から約２万塩基対まで11種類のDNA分子が
含まれているのでリポソームに封入され得るDNA分子の
大きさを検討するのに好都合である．アガロースゲル電
気泳動による解析の結果，直径400nm以下のリポソーム
にも少なくとも約２万塩基対のDNA分子は封入され得る
ことがわかった． 実施例２ グリセロールの最適濃度は蛍光物質であるカルボキシ
フルオレセインを用いて決定した．すなわち,DNA溶液の
代わりに57.5μmolのカルボキシフルオレセインを含む
0.5mlのリン酸緩衝生理食塩水を１μmolの脂質混合液
（ホスファチジルコリン：コレステロール＝6:4）に加
えて超音波処理を行い，有機溶媒の減圧除去によって試
料をペースト状にし，これに１％から10％までのグリセ
ロール水溶液を加え，さらに残余の有機溶媒を減圧除去
することによってリポソームを製造した．第３図に示す
ように直径400nm以下のリポソームに封入されたカルボ
キシフルオレセインの量は５％グリセロール水溶液で製
造したリポソームの場合に最大となった． 参考例１ DNA封入リポソームをProc.Natl.Acad.Sci.USA第75巻
第4194−4198頁,1978年に記載の方法に従って製造し
た．すなわち，ホスファチジルコリン：コレステロール
のモル比が6:4の脂質混合液に40μｇのDNA（DNA MWマー
カーVl）を加えてリポソームを製造し，平均ボアサイズ
400nmのニュクリポアフィルターを通して直径400nm以下
のリポソームを製造した．このリポソームと本発明によ
る製法で製造したリポソームのDNA封入率をビスベンズ
イミドH33258フルオロクロムで測定したDNA量から算出
し，両者を比較した結果，脂質の回収率,DNAの封入率と
もに本発明による製法で製造したリポソームの方が優れ
ていることが判明したが，とりわけ直径400nm以下のリ
ポソームのDNA封入率は約２倍に増加していた． 参考例２ 実施例２記載の製法で製造した148μmolのカルボキシ
フルオレセインを封入したリポソームを，約１×106個
のヒト脳腫瘍由来の培養細胞（U178−MG）と接触させ37
℃で１時間静置した後，リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し
て蛍光顕微鏡で観察した．その結果，各細胞はカルボキ
シフルオレセインを取り込んで強い蛍光を発した。従っ
て，本発明による製法で製造した直径400nm以下のリポ
ソームは細胞に物質を導入するキャリアーとしての機能
を果たし得ることが判明した． 試験例 オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子を組み込ん
だDNAプラスミド（pMOG1）をリポソームに封入し，ヒト
脳腫瘍由来の培養細胞（U178−MG）に接触させオルニチ
ントランスカルバミラーゼ遺伝子が細胞内に取り込まれ
て発現するかどうかを検討した。
pMOG1封入リポソームはホスファチジルコリン：ホス
ファチジルセリン：コレステロール＝3:3:4の脂質混合
液30μmolに対して50μｇのプラスミドを用いて，実施
例１に記載した方法で製造した． 約１×106個の細胞に対して500ngのプラスミドとなる
ようにpMOG1封入リポソームを加えて,24時間培養した
後，細胞内のオルニチントランスカルバミラーゼの活性
を測定した．表に示すように,pMOG1封入リポソームと接
触した細胞のオルニチントランスカルバミラーゼ活性は
無処理の細胞の約３倍に，また，リポソームに封入して
ないpMOG1と接触した細胞の約２倍に上昇した．従っ
て，本発明による製法で製造した遺伝子封入リポソーム
は細胞の中に遺伝子を導入する機能を有することを示し
ている．
ファチジルセリン：コレステロール＝3:3:4の脂質混合
液30μmolに対して50μｇのプラスミドを用いて，実施
例１に記載した方法で製造した． 約１×106個の細胞に対して500ngのプラスミドとなる
ようにpMOG1封入リポソームを加えて,24時間培養した
後，細胞内のオルニチントランスカルバミラーゼの活性
を測定した．表に示すように,pMOG1封入リポソームと接
触した細胞のオルニチントランスカルバミラーゼ活性は
無処理の細胞の約３倍に，また，リポソームに封入して
ないpMOG1と接触した細胞の約２倍に上昇した．従っ
て，本発明による製法で製造した遺伝子封入リポソーム
は細胞の中に遺伝子を導入する機能を有することを示し
ている．
第１図はDNA封入リポソームの直径の分布を示すヒスト
グラムであり，第２図はリポソームに封入されたDNA量
をビスベンズイミドH33258フルオロクロムで測定する時
に用いる検量線であり，第３図は各種濃度のグリセロー
ル存在下で製造した各直径のリポソームに封入されたカ
ルボキシフルオレセインの封入率を表すヒストグラムで
ある．
グラムであり，第２図はリポソームに封入されたDNA量
をビスベンズイミドH33258フルオロクロムで測定する時
に用いる検量線であり，第３図は各種濃度のグリセロー
ル存在下で製造した各直径のリポソームに封入されたカ
ルボキシフルオレセインの封入率を表すヒストグラムで
ある．
Claims (10)
- 【請求項１】逆相蒸発法による遺伝子封入リポソームの
製法において、超音波処理により乳化した試料中の有機
溶媒を減圧除去する途次において多価アルコールを添加
することを特徴とする、遺伝子封入リポソームの製法。 - 【請求項２】多価アルコールがグリセロールであること
を特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の遺伝子封
入リポソームの製法。 - 【請求項３】グリセロールの濃度が約５％であることを
特徴とする、特許請求の範囲第１または２項に記載の遺
伝子封入リポソームの製法。 - 【請求項４】リポソームを構成する脂質がリン脂質を必
須としていることを特徴とする、特許請求の範囲第１−
３項のいずれか１つに記載の遺伝子封入リポソームの製
法。 - 【請求項５】リン脂質がホスファチジルコリン、ホスフ
ァチジルセリンおよびこれらの混合物から選ばれたもの
であることを特徴とする、特許請求の範囲第４項に記載
の遺伝子封入リポソームの製法。 - 【請求項６】リポソームを構成する脂質がリン脂質以外
にコレステロールを含有しており、その含量が約40モル
％であることを特徴とする、特許請求の範囲第４または
５項に記載の遺伝子封入リポソームの製法。 - 【請求項７】遺伝子がDNAであることを特徴とする、特
許請求の範囲第１−６項のいずれか１つに記載の遺伝子
封入リポソームの製法。 - 【請求項８】遺伝子が組換えDNAであることを特徴とす
る、特許請求の範囲第１−６項のいずれか１つに記載の
遺伝子封入リポソームの製法。 - 【請求項９】遺伝子封入工程において、試料がペースト
状になるまで回転式蒸発器内の圧力を約480mmHgに保
ち、次いで多価アルコールを添加し、回転式蒸発器内の
圧力を約150mmHgに保って遺伝子の封入を行うことを特
徴とする、特許請求の範囲第１−８項のいずれか１つに
記載の遺伝子封入リポソームの製法。 - 【請求項１０】逆相蒸発法による遺伝子封入リポソーム
の製法において、超音波処理により乳化した試料中の有
機溶媒を減圧除去する途次において多価アルコールを添
加し、次いで得られたリポソーム懸濁液を平均ポアサイ
ズ400nmのニュクリポアフィルターにより処理して直径1
00−400nmを主体とするリポソームとなすことを特徴と
する、遺伝子封入リポソームの製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20418387A JP2627899B2 (ja) | 1987-08-19 | 1987-08-19 | 遺伝子封入リポソームの製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20418387A JP2627899B2 (ja) | 1987-08-19 | 1987-08-19 | 遺伝子封入リポソームの製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6447381A JPS6447381A (en) | 1989-02-21 |
| JP2627899B2 true JP2627899B2 (ja) | 1997-07-09 |
Family
ID=16486211
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20418387A Expired - Lifetime JP2627899B2 (ja) | 1987-08-19 | 1987-08-19 | 遺伝子封入リポソームの製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2627899B2 (ja) |
Families Citing this family (26)
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| US6214804B1 (en) | 1989-03-21 | 2001-04-10 | Vical Incorporated | Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence |
| US5703055A (en) * | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
| US6673776B1 (en) | 1989-03-21 | 2004-01-06 | Vical Incorporated | Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human |
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| AU2002255995A1 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-15 | Avigenics, Inc. | Avian lysozyme promoter |
| CA2453183C (en) | 2001-07-12 | 2016-05-10 | University Of Massachusetts | In vivo production of small interfering rnas that mediate gene silencing |
| CA2841097A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin and g-csf fusion proteins |
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| WO2005037232A2 (en) | 2003-10-17 | 2005-04-28 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods and compositions for modulating adipocyte function |
| US7846438B2 (en) | 2004-08-03 | 2010-12-07 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of promoting neurite outgrowth with soluble TAJ polypeptides |
| ES2409686T3 (es) | 2005-01-25 | 2013-06-27 | Prolexys Pharmaceuticals, Inc. | Derivados de quinoxalina como agentes antitumorales |
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| WO2010096388A2 (en) | 2009-02-18 | 2010-08-26 | Carnegie Mellon University | Quenched dendrimeric dyes for bright detection |
| EP2577309B1 (en) | 2010-05-25 | 2016-11-23 | Carnegie Mellon University | Targeted probes of cellular physiology |
| US20160002316A1 (en) | 2013-02-22 | 2016-01-07 | Joslin Diabetes Center | Serpins: methods of therapeutic beta-cell regeneration and function |
| EP2851086A1 (en) | 2013-09-20 | 2015-03-25 | Sanofi | Serpins: methods of therapeutic ß-cell regeneration and function |
| EP2769732A1 (en) | 2013-02-22 | 2014-08-27 | Sanofi | Serpins: methods of therapeutic beta-cell regeneration and function |
| CN107429075B (zh) | 2014-11-17 | 2022-11-01 | 卡内基梅隆大学 | 可激活的双组份光敏剂 |
| WO2017147128A1 (en) | 2016-02-22 | 2017-08-31 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Peptide inhibitors of calcium channels |
-
1987
- 1987-08-19 JP JP20418387A patent/JP2627899B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6447381A (en) | 1989-02-21 |
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