KR100315215B1 - 인터디지테이션-융합된리포좀과겔 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지상돌기-융합(IF) 리포좀과 겔에 관계한다. 이와 같은 리포좀과 겔은 생활성제를 포함하는 지질에 비해 높은 용질비로 포획한다. 본 발명은 본 발명에 따라 크기에 대한 함수로써 IF 겔과 리포좀을 생산하기 위한 리포좀 융합방법을 개발한다. 본 발명은 IF 리포좀과 겔을 생산하는 방법에 관계한다. 본 발명의 방법에서 초음파분해, 압출 또는 또다른 공정에 의해 형성된 일정크기 리포좀은 에탄올 또는 다른 유도물질 존재하에 융합된다. 이 공정은 겔형으로 본 발명의 조성물이 된다. 리포좀을 생산하기 위해 겔은 사용된 지질의 Tm 이상의 온도, 반드시는 아니지만 노출된다. 본 발명의 방법에서 요구되는 온도는 혼합물의 물질성질에 변화를 유도할 수 있는 온도이다.

Description

인터디지테이션-융합된 리포좀과 겔

[도면의 간단한 설명]

제 1A 도는 이중층에서 가능한 여러 가지 아실사슬 배열의 예를 든 것이다.

제 1B 도는 포화된 인지질의 인터디지테이션에서 온도 및 유도물질(에탄올)의 효과를 나타낸 것이다.

제 2 도는 리포좀의 초기 크기 및 에탄올 농도에 따라 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)의 인터디지테이션을 나타낸다.

제 3 도는 크기 및 에탄올 농도에 대한 함수로써 DPPC 리포좀의 지질혼합을 나타내는데, 이는 리포좀 표식생산에 결합된 NBD-PE와 로다민-PE 사이의 공명 에너지 전달(RET)로 평가된다.

제 4a 도는 에탄올 농도에 대한 함수로써¹⁴C 슈크로스 포집%를 나타낸 것이다.

제 4b 도는 에탄올 농도를 증가시킬 때 DPPC IF 리포좀의 내용적을 나타낸다.

제 5 도는¹⁴C 슈크로스, TEMPONE EPR와 CAT 1 EPR 방법(□,▨, 그리고 ■ )을 사용하여 다양한 지방으로 부터 형성된 IF 리포좀의 내용적을 나타낸다.

제 6 도는 에탄올 첨가전에 리포좀의 처음 크기에 대한 함수로써 DPPC IF 히포좀의 내용적을 나타낸 것이다.

제 7a 와 7b 도는 DPPG-DPPC IF 리포좀에 결합된 DPPG를 나타낸 것이다.

제 8a 와 8b도는 초기 DPPC 농도에 대한 함수로써 내용적과 포집을 그래프로 나타낸 것이다.

제 9a 와 9b 도는 (A) 10mg/㎖과 (B) 20mg/㎖ 지질에서 IF 리포좀의 알번 입자크기 분포이다.

제 10a 와 10b 도에서 DPPC IF 리포좀의 형성에 콜레스테롤의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

제 11a 와 11b 에서는 IF 리포좀 형성에 디올레일포스파티딜콜린(DOPC)(불포화지질)의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

제 12 도는 IF 리포좀의 형성된 내용적에 DPPC Tm 이상과 이하에서 지질배양시간(5분, 30분, 60분, 120분), 배양과정(실온 "RT" 또는 50℃)의 효과를 설명하고, 이하 본 명세서에서 "RM 온도"는 다른 표시가 없는 한 25℃를 의미한다.

제 13 도는 DPPC 로 구성된 PIF 소포의 형성에서 압력 및 온도의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

제 14 도는 DSPC로 구성된 PIF 소포형성에 압력 및 온도의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

제 15 도는 40℃에서 박테리아의 멸균 압력효과를 그래프로 나타낸 것이다.

제 16 도는 50℃에서 박테리아의 멸균 압력효과를 그래프로 나타낸 것이다.

제 17 도는 60℃에서 박테리아의 멸균 압력효과를 그래프로 나타낸 것이다.

제 18 도는 거대한 DPPC/DPPG 인터디지테이션-융합 소포(IFVs)의 내용적에서 DPPG의 몰비의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

제 19 도는 거대한 DPPC 인터디지테이션-융합 소포(IFVs)의 내용적에서 DOPC 또는 콜레스테롤의 몰비의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

제 20 도는 거대한 DPPC IFVs 의 내용적에서 DMPC SUVs의 후-겔결합 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

제 21 도는 다양한 DMPC, DPPC, DPPC와 DPPC/DMPC IFVs의 막 유동성에 온도의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

제 22 도는 거대한 DPPC IFVs 의 내용적에서 콜레스테롤의 후-결합의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

제 23 도는 거대한 DPPC IFVs의 내용적에서 DOPC SUVs의 후-결합의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

제 24 도는 에탄올-유도된 DPPC 인터디지테이션된 쉬트와 DPPC IFVs의 상대비 광사진을 나타낸 것이다.

제 25 도는 에탄올-유도된 DPPC 인터디지테이션된 쉬트와 DPPC IFVs의 냉동-단편 전자사진을 나타낸 것이다.

제 26 도는 DFPC IFVs의 크기분포를 나타낸 것이다.

제 27 도는 DPPC-IFVs의 내용적에서 인터디지테이션-융합변수들의 효과를 나타낸 것이다.

제 28 도는 다양한 포화된 아실사슬 포스파티딜콜린에서 만들어진 IFVs의 내용적을 나타낸 것이다.

제 29 도는 DPPC IFVs로 콜레스테롤이 결합되는 것을 나타낸다.

본 출원은 1992년 10월 14일자 출원된 미국출원 07/961,271의 연속출원이고 이는 현재 포기된 1991년 3월 5일자 출원된 07/664,576 의 연속출원이고, 이는 현재 포기된 1990년 1월 12일자 출원된 07/464,528 의 연속출원이다.

발명의 분야

본 발명은 인터디지테이션-융합(IF) 리포좀 및 겔에 관계한다. 이와같은 리포좀 및 겔은 지질비율에 대해 많은 양의 포집한다. 용질로는 대비제를 포함하는 생활성제를 포함된다. 본 발명에서 지질이 인터디지테이션에 의해 IF겔 및 리포좀이 만들어지고 본 발명에 따른 이와 같은 인터디지테이션에 의해 만들어지는 리포좀은 크게 의존성을 가진다는 것도 발견하였다.

본 발명은 IF 리포좀과 겔을 만드는 방법에 관계한다. 본 발명의 방법에서, 적절한 유도물질 존재하에, 적정크기로 균질화 과정 가령 초음파, 압출 또는 또다른 크기 감소과정에 의해 형성된 리포좀이다. 이 공정은 겔형태로 본 발명의 조성물을 생산한다. 겔 자체를 생활성 물질의 수송에 바로 이용하거나 IF 리포좀을 만든 후 사용할 수 있고, 이는 매우 큰 내용적을 가지고 있어, 상당량의 용질을 포집하게 된다.

겔로 부터 IF 리포좀을 형성하기 위해, 리포좀을 형성하는데 이용된 지질의 전이온도(Tm) 이상에서 겔을 배양한다. 본 발명에서 요구되는 온도는 지질, 용질,유도물질등의 주어진 혼합물의 물성의 변화를 유도하여 본 발명의 IF 리포좀을 생산하는 온도가 된다. IF 겔로 부터 형성된 리포좀이 IF 리포좀이다. 필수적인 과정은 아니지만, 유도물질은 배양단계동안에 제거하는 것이 바람직하다. 지질 비율에 대해 다량의 용질을 포함하는 리포좀으로 구성된 조성물이 형성된다.

발명의 배경

많은 약들의 치료요법적 특징이 리포좀에 포집된 형으로 투여하는 경우에 급진적으로 개선된다(P.N. Shek and R.F. Barber, Mod. Med. Canada, 41, 314-382, (1986). 특정 경우에서 가령, 암토테리신 B와 독소루비신(Lopez-Berestein, et al., J Infect. Dis., 151, 704-710, (1985) and Rahman, et al., Cancer Res., 40, 1532 (1980)]의 투여에서, 독성은 치료효과는 유지되거나 증가되면서 독성이 감소되었다. 리포좀에 물질을 포집시키는 경우에 얻어진 장점은 우연한 것이고, 포집된 약물의 변형된 약리학적 그리고 생체분포의 결과로 인한 것이다[Ostro, et al., Amer, J. Hosp. Pharm., Vol. 46 Aug 1989].

생활성제를 리포좀에 "충전"시키는데 현재 여러 가지 방법이 이용되고 있다. 가령, 리포좀-약물수송 시스템에서 약물과 같은 생활성제는 리포좀내에 포집시켜 그 다음 치료받은 환자에 투여된다(Rahman et al., U.S. Patent No. 3,993,754; Sears, U.S. Patent No. 4,145,410; Papahadjopoulos, et al., U.S. Patent No. 4,235,871; Lenk et al., U.S. Patent No. 4,522,803; and Fountain et al., U.S. Patent No. 4,588,578). 생활성제를 포집하는 기본방법에 추가하여 생활성제가 친지성인 경우 지질 이중막과 관계한다. 그러나 통상의 방법을 이용하여 생성된 제약학적 제형의 대부분은 지질비율에 대해 약물의 비율이 낮고, 대량 생산 및 독성용매가 이용되는 등의 단점이 있다.

전술한 방법에 추가하여, 상당수의 생활성제는 "원격적재(remote loading)"으로 알려진 부여된 프로톤 또는 이온농도에 반응하여 리포좀에 축적되는 것을 볼 수 있다(Mayer, et al., Blochim. Biophys. Acta, 857,123, (1986), Mayer, et al. , Biochemistry, 27, 2053, (1988)]. 이와 같은 로딩기술은 리포좀 변수의 어떠한 변화에 무관하다. 통상의 기술에 비교하면 지질 비율에 비해 약물 비율이 훨씬 높다[Mayer, et al. Chem. Phys. Lipids, 40, 333 (1986)]. 원격 적재를 위한 과정 및 물질은 Bally et al., U.S. Patent No. 5,007,056, issued December 31, 1991, and Mayer et al., U.S. Serial No. 07/636,015, filed January 4, 1991에 상술되어 있다. 원격 적재와 관련된 특허 출원 및 특허의 관련부분은 참고문헌에 있다.

리포좀은 수용성 용적을 포함하는 완전히 닫힌 지질 이중막이다. 리포좀은 단일층 또는 다중층(다층으로된 양파와 같은 구조로 각층은 수용성층에 의해 그다음 층과 분리되어 있음)이다. 이중층은 소수성 "꼬리"부분과 친수성 "머리"부분을 가지는 두 개 지질단층으로 구성된다. 2중막에서 지질단층의 소수성(비극성) "꼬리"는 이중막의 중앙 방향으로 모이고, 반면에 친수성(극성) "머리"는 수용성상으로 향하고 있다. 리포좀의 기본구조는 본 기술에서 공지된 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.

본 발명의 실행에 이용되는 리포좀의 한 종류는 실제로 라멜라간에 동일한 용질분포를 가진다. 이와 같은 종류의 리포좀은 안정한 다층소포(SPLV)(이는 미국특허 4,522,803(Lenk, et al)., 미국특허 4,588,578(Fountain, et al)) 냉동-해동된 다층 소포(FAT MLV)로 칭하고 이때 소포는 적어도 한번의 냉동과 해동과정에 노출되는데; 이 과정은 "Bally et al., U.S. Patent No. 4,975,282, issued December 4, 1990, entitled "Multilamellar Liposomes Having Improved Trapping Efficiencies 에 기술되어 있다.

리포좀 포집은 다양한 제약학적 물질에 대한 상당한 효과를 제공하고 지질에 대한 약물의 비율이 높은 것이 리포좀내 포집된 물질의 능력을 실행하는데 있어 중요한 것으로 증명되었다. 약물을 투여하기 위한 리포좀을 이용할 경우에 약물포집 및 치료동안에 약물 배출에 대해 문제점이 발생하였다. 가령, 환자에 제공되는 지질 부하량을 최소화하기 위해 지질에 대해 약물비율을 지속적으로 증가시킬 필요가 있다.

지질의 인터디지테이션은 James L. Slater and Ching-Hsien Huang in Progress Lipid Res., 27, 325-359, 1988에 의해 최근에 심도있게 조사된 현상이다. 일반적으로, 본 기술에서는 다양한 유도물질 또는 아실 사슬길이 비대칭의 존재로 인해 생성되는 다양한 지방종의 인터디지테이션을 설명한다. 그러나 본 발명에 따른 IF 겔 및 리포좀을 만들기 위해 인터디지테이션 동안에 리포좀 융합에서 크기 의존성에 대한 보고는 없었다.

본 발명의 목적

본 발명의 목적은 인터디지테이션 융합겔과 리포좀을 제공하고 이는 치료학적 용융을 포함한 다수의 응용분야에서 용질 수송에 이용될 수 있다.

본 발명의 목적은 사람을 포함하는 포유류에 국소 또는 구강으로 투여하기 위한 조성물로써 생활성물질, 포화 지질 및 불포화 지질을 포함하는 인터디지테이션-융합 겔을 제공한다.

본 발명의 목적은 높은 농도로 생활성제를 축적할 수 있는 인터디지테이션-융합 리포좀 및 겔을 생산하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 사람을 포함하는 포유류 동물을 치료하기 위해, 지질에 대해 용질의 비가 높은 인터디지테이션-융합 리포좀 및 겔을 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 목적은 본 발명의 인터디지테이션-융합 겔 및 리포좀에 기초한 제약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 목적은 본 발명의 인터디지테이션 겔 및 IF 리포좀을 만들기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 생활성제를 포집하는 신규의 방법을 제공한다.

이와 같은 본 발명의 목적은 여기에서 상술하는 상세한 설명으로 충분히 이해할 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 용질을 포함할 수 있는 인터디지테이션-융합 리포좀 및 겔에 관계한다. 이와 같은 리포좀 및 겔은 지질에 대해 생활성제를 포함한 많은 양의 용질을 포집한다. 이와 같은 IF 겔 및 리포좀은 화장품, 제약 및 농업등의 분야를 포함하는 다양한 분야에 사용될 수 있다. 사람을 포함하는 포유류와 같은 동물과 식물에생활성제와 복합하여, 이와 같은 리포좀 및 겔을 국소적 또는 전신으로 투여될 수 있다. 전술한 응용에 추가하여 본 발명의 IF 겔 및 리포좀은 수지기술 특히, 페인트 기술과 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 일정 크기 리포좀 적절하게는 직경이 0.4미크론, 보다 적절하게는 0.05 미크론 이하, 가장 적절하게는 0.025 미크론의 직경이 되고, 생활성제와 같은 용질 및 IF 겔을 생산하기 위해 리포좀을 융합시키는데 효과적인 인터디지테이션 유도물질로 구성된다. 초기 리포좀은 FAT MLVs 일 수도 있다. 본 발명의 IF 겔로 부터 IF 리포좀이 생산될 수도 있다.

본 발명의 IF 리포좀과 겔에서, 적절한 포화지방은 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디-0-헥사데실포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 지방의 아실측쇄에 불포화된 탄소-탄소 이중결합이 트란스형으로된 지질 가령, 트란스디에라도일포스파티딜콜린, 디팔미테라도일포스파티딜콜린 및 팔미토일올레일포스파티딜콜린(POPC), 1-스테아로릴-2-올레일 포스파티딜콜린(SOPC)와 같은 혼합형 지방산, 그리고 다른 불포화 지방 등이 이용될 수 있다.

특정 구체예에서, 불포화 지방은 본 발명의 포화지방과 복합하여 이용될 수 있다. 일반적으로 DOPC가 이용된 불포화 지방일 때, 포화지방 DPPC는 불포화 지방의 50물% 이상으로 사용되는 것이 일반적으로 적절하다.

생활성체를 포함하는 또는 포함하지 않는 일정크기의 리포좀을 유도물질 존재하에 융합시키면, 인터디지테이션-융합 겔이 생성되는데, 이것은 추가 변형없이사용할 수 있고, 또는 겔은 지질의 전이온도(Tm) 이상의 온도로 가열시키거나 또는 혼합물의 물성 변화를 유도할 수 있는 온도에서 겔을 배양하고 이에 선택적으로 유도물질을 제거하여 본 발명의 겔 을 변형시켜 IF 리포좀을 만들 수 있다.

본 발명의 IF 리포좀은 지질 비율에 대해 생활성체를 포함하는 용질의 비율을 상당히 크게 포집하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 IF 리포좀은 수정없이 사용될 수 있고, 또는 본 기술에서 흔히 사용할 수 있는 기술과 방법을 사용하여 리포좀의 크기를 조절하여, 다양한 크기의 리포좀 또는 균일한 크기의 리포좀을 생산할 수 있다.

본 발명에서 적절한 인터디지테이션 유도물질은 짧은 사슬 알코올, 가령 1 내지 4개 탄소원자를 가지는 알코올, 적절하게는 에탄올이 되는데, 그 이유는 본 발명의 IF 겔에서 IF 리포좀을 생산하는데 있어서, 후에 유도물질이 용이하게 제거될 수 있기 때문이다. 그러나, 본 발명의 구체예에서는 일정 크기의 리포좀으로 부터 융합된 IF 겔을 생산할 수 있는 임의 유도물질을 사용하였다.

본 발명에서 사용할 수 있는 유도물질로는 가령, 글리세롤, 에틸렌 글리콜과 같은 폴리올, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, n-부탄올과 같은 짧은 사슬 알코올, 클로로프로마진, 테트라카인, 페닐에탄올, 벤질알코올, 페닐 부탄올과 같은 마취제, 폴리믹신, 미엘린 염기성 단백질, 콜린, 아세틸콜린, 트리스 완충액과 같은 기타 물질 및 티오시아네이트와 같은 카오트로픽염이 포함된다. 그러나, 제거가 용이하고, 제약학적 적합성이 좋은 에탄올이 적합하다. 본 발명에 사용된 유도물질은 일정크기 리포좀으로 부터 인터디지테이션-융합 겔을 생산하는데 있어서 효과적인 양을 이용한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 IF 겔 및 리포좀을 만드는데 사용된 포화 지질은 자체-유도물질 즉, 유도물질 첨가없이, 포화 지방이 본 발명의 IF 겔 및 리포좀을 만들 수 있다는 것이다. 특히, 본 발명에서 디-0-헥사데실포스파티딜콜린(DHPC)이 사용되었다. 여기에서 기술한 것과 같이 생활성제인 용질이 자체로 유도물질이 될 수도 있다.

본 발명의 구체예에서, 유체정력학적 압력이 인터디지테이션-융합 유도물질로써 이용될 수 있다. 이 경우에, 작은 리포좀에 유체정력학적 압력을 가하던 IF 겔이 형성된다. 본 발명의 특정 구체예에서 DPPC 또는 DSPC로 구성된 작은 리포좀에 압력을 가하면 인터디지테이션을 유도되고 이 겔을 지질의 상전이온도 이상으로 지방을 가열하면 리포좀이 형성된다.

본 발명의 한 구체예에서는, 높은 유체정력학적 압력을 이용하여 박테리아를 죽이고 리포좀 조성물을 살균한다. 따라서, 유체정력학적 압력은 인터디지테이션 융합을 유도하고, 생성된 리포좀 조성물을 안정화시키는데 사용될 수 있다.

본 발명의 IF 리포좀 및 겔에는 임의 농도의 용질이 포함되는데, 이때 용질로는 비타민, 호르몬제, 항-대사제, 항균제, 항곰팡이제, 국소마취제, 기관지확장제, 베타아드레날린 차단제, 혈압강하제, 항억제제, 항경련제, 항히스타민제, 항말라리아제, 항원, 영양제, 단백질, 펩티드, 헥산, 올리고와 폴리뉴클레오티드, RNA와 DNA, RNA와 DNA 유사체, 항신조직 형성제, 항히스타민, 안정제와 최면제를 포함하는 신경제약학적 물질, 스테로이드성 및 비스테로이드성 항염증제, 이뇨제, 항부정맥제와 맥관팩창제 그리고 방사선 상대조제, 핵자기공명(NMR) 대조제, 항바이러스제가 포함한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 추가 생활성제는 단백질, 지방산, 탄수화물과 같은 영양제를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 방사능대조제, NMR 대조제, 펩티드, 특정 항체, 가령 세파로스포린이 본 발명에 이용될 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 방사선 대비제는 이오헥솔, 이오파미돌, 이트록산, 이오디파미드, 이오펜톨, 이오디사놀, 메트리자미드, 이들의 혼합물 및 제약학적 수용가능한 염을 포함한다. 생활성제는 자연발생, 합성 또는 반-합성 항균제이다. 항균제로는 젠타마이신, 아미카신, 토브라마이신과 같은 아미노글리코시드가 된다. 본 발명의 적절한 조성물에서 IF 겔 및 리포좀에는 높은 농도의 생합성제를 포함한다. 일반적으로 본 발명의 IF 겔 및 리포좀의 생활성제/지질 중량비는 1:10 내지 15:1 이다. 물론 이와 같은 비는 예를 든 것으로 특정 경우에 이들 비의 전후에서 약물과 지질이 제공될 수도 있다.

본 발명의 특정구체예에서, 용질 또는 생활성제는 유도물질 기능을 할 수 있다. 이와 같은 경우에, 본 발명의 다른 구체예에서 유도물질/생활성제를 제거할 필요는 없다.

본 발명에서 사용하는 적절한 생활성제는 리포좀 또는 겔에 포함되어 국소적으로 또는 전신으로 투여되었을 때, 생물학적 활성을 나타내는 임의물질이 될 수 있다. 국소 또는 구강투여를 위해 상당수의 생활성제가 본 발명의 IF 겔에 포함될 수 있다.

본 발명은 다양한 농도의 생활성제를 포함하는 IF 리포좀과 겔을 생산하는 방법에 관계한다. 본 발명의 발명에서 초음파, 압출, 균질화 과정등에 의해 형성된일정 크기 리포좀, 적절하게는 직경이 0.4 미크론 이하, 좀더 적절하게는 직경이 0.05미크론 이하, 가장 적절하게는 0.025미크론 크기의 리포좀 또는 FAT MLVs 가 에탄올 또는 다른 적절한 유도물질 존재하에 융합된다. 본 발명의 IF 겔 및 리포좀에 사용된 지질과 생활성제의 상호작용에 따라, 유도 물질 첨가전 후에 생활성제를 첨가될 수 있다. 유도물질을 첨가하면 본 발명의 IF 겔이 형성된다. 생활성제를 포함하는 겔을 환자에게 투여하거나 본 발명의 IF 리포좀으로 전환시킨다.

본 발명의 IF 리포좀을 생산하기 위해 IF 겔은 보통 사용된 지방의 전이온도에서 배양시키는데, 이때 반드시 지질 전이온도로 한정되는 것은 아니며, 추가로 유도물질을 제거할 수 있다. 본 발명의 방법에 요구된 온도는 임의 주어진 지질, 용질, 유도물질 혼합물의 물성 변화를 유도할 수 있어, 본 발명의 IF 겔 및 IF 리포좀을 형성시키는 온도를 말한다. 그 결과로 고농도의 생활성제를 포함하는 IF 리포좀 조성물이 만들어진다.

이 방법에 의해 생산된 IF 리포좀은 100 미크론 내지 0.025 미크론, 좀더 적절하게는 20㎛ 내지 0.025㎛의 크기로 다양하고 고농도의 생활성제를 포함한다. 이와 같은 IF 리포좀은 본 기술에서 이용할 수 있는 기술중 하나를 이용하여 크기를 더 감소시킬 수 있다.

본 발명의 다른 한편으로는 하기 실시예 29에서 상술하는 방법을 이용하여 나중에 겔 결합에 의해 제 2 물질을 인터디지테이션-융합 소포에 결합될 수 있다. 제 2 물질은 제 2 지질이 될 수 있거나 인터디지테이션 융합과정을 간섭하는 다른 물질이 될 수 있다.

도면의 설명

1A 도에서 A는 대칭의 포화된 포스포리피드 C(16):C(16) 포스파티딜콜린을 포함하는 인지질로 구성된 인터디지테이션된 안된 이중층을 나타낸다. B는 비대칭의 포화된 포스포리피드 C(16):C(10) 포스포티딜콜린을 구성하는 부분적으로 인터디지테이션된 이중층을 나타낸다. C는 C(16):C(10)포스포티딜콜린으로 구성된 혼합형 인터디지테이션된 이중층을 나타낸다. D는 효과량의 유도물질과 복합하여 C(16):C(10) 포스포티딜콜린으로 구성된 완전히 인터디지테이션된 이중층을 나타낸다.

2 도에서는 인터디지테이션이 디페닐헥사트리엔(DPH) 형광물질 강도에 의해 결정된다. DPH가 지질 이중층에 결합될 때 최대 형광을 가진다. 인터디지테이션에 의해 DPH의 방향이 달라지며, 동시에 형광이 감소된다.

Fo=에탄올 없을 때 DPH 형광; F=에탄올하에 DPH; 방출은 380 내지 580nm에서 무게에 의해 정량화 된다.

제 4b 도에서 ●는¹⁴C 슈크로스 포집에 의해 결정된 내용적을 나타내고; ○은 CAT 1 EFR 측정에 관계한다. 제 4c 도는 1.0M 에탄올 농도에서 IF 리포좀이 형성 안된 경우에 회수된 DPPC의 %를 나타낸다.

제 6 도에서는 이와 같은 리포좀의 내용적은¹⁴C 슈크로스 포집과 CAT 1 EPR와 TEMPONE EPR 방법(■,▨, □)에 의해 계산될 수 있다.

제 7a 도에서는 DPPG의 몰비에 대한 함수로써 IF 리포좀의 내용적을 나타낸다(¹⁴C 포집에 의해 측정, ○; 확장제 TEMPONE EPR 기술에 의해 측정, ●). 제 7b 도에서는 DPPG 에 대한 함수로써 Pi 회수률(●) 및¹⁴C 라벨된 슈크로스의 회수률(○)을 나타낸다.

제 8a 도에서는 슈크로스 포집율은 초기 DPPC 지질농도에 따라 증가하고, 8b 도에서는¹⁴C 슈크로스 방법(●) 및 EPR 방법(○)에 의해 측정된 DPPC IF 리포좀의 내용적을 나타낸다.

제 10a 도에서 에탄올 첨가전에 리포좀의 초기 콜레스테롤 비율에 대한 함수로써 포집된¹⁴C 슈크로스(□)의 최종 %와 IF 리포좀의 최종 콜레스테롤농도(○)를 나타낸다. 10b 도에서는 콜레스테롤 함량에 대한 함수로써 DPPC-콜레스테롤 IF 리포좀의 내용적 감소를 나타낸다(¹⁴C 슈크로스 포집, CAT 1 EPR와 TEMPONE EPR 방법; ○,△,●).

제 11a 도에서는¹⁴C 슈크로스 포집과 TEMMPONE EPR 방법(□,■)에 의해 다양한 양의 DOPC를 포함하는 IF 리포좀의 내용적을 나타낸다. 제 11b 도에서는 다양한 양의 DOPC를 포함하는 IF 리포좀 형성 후에 회수된 치질을 나타낸다.

제 13 도에서 DPPC 작은 리포좀을 Teflon^®폴리테트라플로로에틸렌 샘플 홀더에 두고, 지시한 온도에서 15분간 지시한 압력을 제공한다.

제 14 도에서 DPPC 작은 리포좀을 Teflon 폴리테트라플로로에틸렌 샘플 홀더에 두고, 지시한 온도에서 15분간 지시한 압력을 제공한다.

제 24 도 A 에는 20mg/㎖(3.0M 에탄올, 150mM NaCl. 10mM 트리스-HCl, pH 7.2, 실온)에서 형성된 에탄올-유도된 DPPC 인터디지테이션-쉬트의 현미경사진 (400X)이다. 쉬트 현탁액은 3.0M 에탄올 NaCl/트리스 완충액으로 5배희석에 의해 파괴한다. B 는 3.0M 에탄올, NaCl/트리스 완충액 실온에서 20mg/㎖ DPPC IFVs의 현미경 사진이다(400X). IFVs는 DPPC의 Tm 이상으로 샘플 온도를 상승시켜 에탄올/DPPC 인터디지테이션된 쉬트에서 형성된다. 두 현미경사진에서 □는 10micron을 나타낸다.

제 25 도 A 에서는 에탄올-유도된 DPPC 인터디지테이션된 쉬트(2.5M 에탄올, 150mM NaCl, 10mM 트리스/HCl, pH 7.2 실온). B는 DPPC Tm 이상에서 인터디지테이션된 쉬트의 배양에 의해 형성된 DPPC IFVs 이다. 막대는 1micron을 나타낸다.

제 26 도는 세 가지 DPPC IFVs의 정상화시킨 직경분포는 Malvern 3600ER 레이져 분절입자 크기 측정기를 이용하여 실온에서 측정하였다. 분포는 입자수에 기초하고 이 기구에 의해 측정한다. 평균치와 시료의 표준편차를 나타낸다. 샘플의 평균직경은 3.54+/-0.12 미크론이다. IFVs는 4.0M 에탄올을 이용하여 20mg/㎖에서 DPPC SUVs에서 형성된다.

제 27 도에서는 A 는 에탄올 농도에 대한 함수로써 내용적을 나타낸다. 에탄올 농도가 2.0M 이상일 경우, DPPC IFVs는 20mg/㎖ 에서 DPPC SUVs에 에탄올을 직접 첨가하여 형성된다. 1,5M 이하에서 에탄올은 인공물 혼합을 막기 위해 첨가하기 전에 미리 희석된다. B. 다양간 직경의 DPPC LUVETS 에서 형성된 DPPC IFVs의 내용적을 나타낸다. LUVETS는 두 개 폴리카보네이트 필터로 미리 형성된 MLVs를 밀어넣어서 형성된다. 직경은 과시-전자광 분산에 의해 결정한다. C. DPPC IFVs의 내용적은 상이한 DPPC SUV 농도에서 형성된다. 인터디지테이션-융합은 4.0M 에탄올로 유도된다.

제 28 도에서는 인터디지테이션-융합을 유도하기 위해 4.0M 에탄올을 사용하여 DMPC, DPPC, DHPC 에 대한 평균 내용적을 나타낸다. 에러바는 표준편차를 나타낸다.

제 29 도에서 IFVs에 콜레스테롤 결합을 위한 두 방법 DPPC/콜레스테롤 IFVs의 최종 내용적으로 비교한다. ●은 다양한 롤레스테롤 몰비에서 DPPC/콜 SUVs에서 직접 형성된 DPPC/Chol IFVs를 나타낸다. 이 방법으로 콜레스테롤 함량이 증가함에 따라 생성 IFVs의 내용적은 감소한다. ■은 에탄올-유도된 DPPC 인터디지테이션된 쉬트가 형성된 후에 4.0M 에탄올에서 1:1 DPPC/Chol SUVs에 콜레스테롤을 첨가할 때 형성된 DPPC/Chol IFVs의 내용적을 나타낸다. 사용된 각 몰%에서 상당히 높은 내용적이 생성된다. 편차 스케닝 칼로리메트가 이중층으로 직접 결합된 콜레스테롤 량을 설명하는데 사용된다. 35몰% 콜레스테롤에서 DPPC 겔-지질 결정상 전이가 이들 방법에 의해 형성된 DPPC/콜레스테롤 IFVs에서 제거된다.

발명의 상술

본 발명의 내용을 명료하게 하기 위해, 용어는 다음과 같이 정의한다.

"인터디지테이션"와 "인터디지테이션된"은 이중층에서 한 지질의 아실 사슬부분이 지질 이중층의 다른 층으로 침투 또는 지질 이중층을 말한다. 인터디지테이션 용어에는 완전히 인터디지테이션된, 혼합형 인터디지테이션된 그리고 부분적 인터디지테이션된 것을 포함한다. 완전히 인터디지테이션된 리포좀에는 도면 1A(D)에서와 같이 지질의 아실사슬이 지질이중층의 폭을 완전히 또는 부분적으로 침투한 인터디지테이션된 리포좀을 포함한다. 혼합형 인터디지테이션의 또다른 실시예는 완전히 또는 부분적으로 인터디지테이션된 것을 포함하고, 인터디지테이션 안된 부분도 공존한다. 부분적으로 인터디지테이션된 리포좀에는 도면 1A(B)에서와 같이 한 이중층의 긴 아실사슬이 다른 이중층의 짧은 아실사슬과 쌍을 이루는 것과 같은 비대칭 인지질이 쌍을 있는 인터디지테이션된 리포좀을 포함한다.

명세서에서 사용된 "유도물질"은 리포좀의 지질 이중층 수용상 사이부분에 위치한 일정 크기의 양쪽성분자를 포함하는 분자로써 본 발명에 따른 인터디지테이션-융합 리포좀을 만든다. 이 용어는 "자가-유도물질"로 작용할 수 있는 생활성제와 같은 용질 또는 지질로 생각할 수도 있다. 유체력학적 압력이 유도물질로 작용될 수도 있다.

"압력 유도된 융합"("PIF")은 인터디지테이션-융합 겔을 만들기 위해 일정크기 리포좀에 유체역학적 압력을 제공하여 유도된 인터디지테이션을 말한다. 이 겔로 부터 형성된 리포좀을 여기에서는 PIF 리포좀, 간단히 PIFs라 칭한다.

명세서를 통하여 "인터디지테이션-융합 겔"(IF겔)은 유도물질이 충분한 양으로 일정 크기의 리포좀과 복합할 때 형성된 생성물을 말한다. 생성된 지질막은 지질, 겔, 특정 경우에 고형상태에 가까운 매우 점성있는 물질을 포함한 다양한 점성 생성물을 포함한다.

명세서를 통하여 "인터디지테이션-융합 리포좀"(IF 리포좀)은 일반적으로 지질 전이온도("Tm") 이상의 온도에서 (그러나 어떤 경우에는 Tm에서) IF 겔을 배양하여 겔로 부터 형성된 리포좀을 말한다. 인터디지테이션-융합겔로 부터 유도물질을 추가로 제거할 수는 있으나 반드시 그럴 필요는 없다. 리포좀에 자체 유도 지질 또는 용질이 유도물질인 특정 구체예에서 유도물질을 제거하지 않아도 된다. IF 리포좀에는 생활성제:지질 비가 1:10 내지 15:1 로 상당양의 용질을 포함한다.

명세서를 통하여 "용질"은 본 발명의 리포좀 및 IF 겔에 의해 포집될수 있는 완충액 및 용매를 포함하는 임의 화학물질을 말한다. 용질에는 완충액, 염, 독소, 미생물, 박테리아, 살충제, 곤충제, 제초제, 곰팡이, 제거제, 유화제, 화장품, 단세포 유기체, 상당수의 화학물질 특히 생활성제등이 포함될 수 있다.

명세서를 통하여 "생활성제"는 식물, 동물 특히 사람을 포함하는 포유류를 포함하는 살아있는 유기체에 투여할 때 생물학적 활성을 나타내는 화학물질로써 생활성제에는 여기에서 상술하는 약물, 영양제등이 포함될 수 있다.

"포화된 지질"은 본 발명의 인터디지테이션-융합겔과 리포좀을 생산하는데 이용될 수 있는 지질을 설명한다. 포화된 지질에는 이중결합이 없는 대칭 또는 비대칭 아실 측쇄를 가지는 지질, 불포화 측쇄를 가지는 지질, 이때 불포화된 탄소-탄소 이중결합이 트란스 또는 시스 모양으로 되고, 또는 SOPC 와 POPC 와 같은 혼합형 지방산 지질을 가지나 이에 한정시키지는 않는다.

"조성물을 포함하는 인터디지테이션-융합된 지질"은 본 발명의 IF 겔 및 리포좀을 설명하는데 사용된다.

본 발명은 일정크기 리포좀, 적절하게는 0.4 미크론 내지 0.05 미크론, 더욱 적절하게는 0.025 미크론 직경의 리포좀이고, 용질과 복합하여 리포좀을 융합시키는데 효과적인 유도물질 효과량으로 구성된 지질을 포함하는 조성물에 관계한다. 초기 리포좀은 FAT MLVs일 수 있다. 특정 구체예에서 용질은 생활성제일 수 있다. 본 발명의 조성물은 생확성제:지질비가 1:10 내지 15:1 와 같이 생활성제 비율이 높다.

본 발명에서 본 발명의 IF 겔 및 리포좀을 만드는 일정크기 리포좀은 양쪽성, 양성, 음성 지질로 구성되는데, 이는 포화된, 불포화된, 극성 또는 비극성 지질 및 인지질을 포함하는 12 내지 35 탄소원자로된 지방산 아실사슬로 구성된다.

가령, 본 발명의 포화 지질에는 다음과 같은 것이 포함되나 이에 한정시키지 않는다.

디미리스토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린, 디스테아로일포스파티딜세린, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딘산, 디스테아로일포스파티딘산, 디팔미토일포스파티딘산, 디미리스토일포스파티딜이노시톨, 디스테아로일포스파티딜이노시톨, 디팔미토일포스파티딜이노시톨, 수소화된 소이 포스파티딜콜린, 수소화된 콩 레시틴, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디-0-헥사데실포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤.

다른 포화된 지질에는 이중결합을 가지지 않는 포화된 대칭 또는 비대칭 아실측쇄를 가지는 포화된 지질, 불포화된 탄소-탄소 이중결합의 방향이 트란스 또는 시스방향으로된 불포화된 측쇄를 가지는 지질 또는 SOPC와 POPC와 같은 혼합형 지방산을 포함하나 이에 한정시키지 않는다.

포화된 대칭 지질에 포함되는 다른 지질에는 혼합형 사슬 조성물을 포함하는 합성 또는 천연 인지질을 포함하는 리포좀 형성 지질을 포함하는데 가령, 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜글리세롤 (PG), 포스파티딘산(PA), 포스파티딜이노시톨(PI), 스핑고미엘린(SPM)와 카르디오리핀 또는 다른 것은 복합된 것이 된다.

전술한 지질에 추가하여, 추가의 지질은 다양한 리소리피드 가령, n-옥타데실-2-메틸포스파티딜콜린, n-옥타데실포스파티딜콜린, 1-라우릴프로판에디올-3-포스포콜린, 에리트로-N-링고세로일스핑고포스파틸콜린, 콜레스테롤 그리고 수용성 유도체 가령, 콜레스테롤 헤미숙시네이트와 알파 토코페롤과 토코페롤 헤미숙시네이트, 그리고 강글리오사이드, 글리코리피드와 글리코고리피드와 같은 수용성 유도체가 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 본 기술에 숙지된 자는 본 발명에 따른 조성물을 생산하기 위해 본 발명의 조성물에 포함되는 지질의 양과 형태를 본 출원의 범위내에서 다양하게 할 수 있음을 인지할 것이다.

본 발명의 조성물에서 적어도 하나의 포화된 지질 상당량을 포함하는 일정 크기 리포좀에 유도물질을 첨가하여 인터디지테이션-융합시킬 수 있다. 포화된 인지질을 포함하는 일반적인 본 발명의 일정크기 리포좀은 인터디지테이션 유도물질효과량과 복합하여, 완전히, 부분적으로 또는 혼합형 인터디지테이션을 하게 된다. 본 이론에 한정하지 않고, 유도물질은 머리기와 관계한 물분자의 일부를 치환시켜 전체적으로 머리기 표면적이 증가하게 된다. 선택된 지질은 유도물질 존재하에 완전한 인터디지테이션을 하게 되는데, 그러나 완전한 인터디지테이션을 제공하지 못하는 지질 즉 혼합형 또는 부분적 인터디지테이션을 고려할 수 있고 이는 본 발명의 영역내에 속한다. 본 발명에서 사용되는 인터디지테이션 유도물질에는 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 그리고 n-부탄올과 같은 짧은 사슬알콜올, 글리세롤과 에틸렌글리콜과 같은 폴리올, 클로로프로마진, 테트라카인, 페닐에탄올, 벤질알코올 그리고 페닐부탄올과 같은 마취제, 트리스와 티오시아네이트 SCN- 와 같은 카오트로픽염과 전술한 것과 같은 것이 포함될 수 있다.

특정 경우에, 본 발명의 IF 겔 및 리포좀을 형성하기 위해 사용된 포함된 지질은 자체-유도물질이 될 수 있는데, 이와 같은 지질은 화학적 유도물질(예를 들면, DHPC)을 첨가하지 않고도, 다양한 온도에서 용질 존재하에 지질과 혼합함시켜 인터디지테이션시켜 IF 겔 및 리포좀을 만든다. 또한 특정 경우에, 유도물질 없이도 초고압을 인터디지테이션을 만드는데 사용할수 있다.

본 발명의 한편에 따르면, 일정 크기 집단의 리포좀에 유체역학 압력을 제공하여 인터디지테이션을 유도할 수 있다. 리포좀에 제공되는 압력을 가하는 기간 및 정도는 인터디지테이션 융합이 일어날 수 있을 정도로 효과가 있어야 한다. 비록 특정 최저압력이 요구되지는 않지만, 포화된 지질로 구성된 리포좀의 적절한 압력수준은 적어도 20,000psi, 적절하게는 약 40,000psi이다. 인터디지테이션 융합이일어날 수 있을 정도의 압력이 가해지는 시간은 1분 내지 1시간이 적절하다.

디팔미토일포스포티딜롤린(DPPC) 또는 디스테아로일포스포티딜클린(DSPC)로 구성된 리포좀을 이용하여 양호한 결과를 얻을 수 있다. 한 실시예에서 약 20,000 psi 압력, 적절하게는 40,000psi 를 약 15분간 제공하여, DPPC 또는 DSPC로 구성된 작은 단층소포(SUVs)를 융합시켜 더 큰 리포좀을 만든다. 이와 같은 테스트 동안에 처음 5분 정도에 작은 리포좀의 일부가 부분적으로 융합된 것을 관찰할 수 있었다. 이 과정은 아래 실시예 27 에서 좀더 상세히 다룬다. DPPC와 DSPC가 압력에 의해 융합(PIF)을 유도하여 성공적으로 인터디지테이션이 되지만, PIF 과정에 의해 비대칭 아실측쇄를 가지는 팔미토일올레일포스포티딜콜린(POPC)의 작은 리포좀에서는 인터디지테이션을 유도하지는 않았다.

본 발명의 구체예의 다른 한편에서 높은 유체력학적 압력을 이용하여 박테리아를 죽이고 리포좀 준비물을 살균시킬 수 있다. 따라서 유체역학적 압력을 이용하여 인터디지테이션 융합을 유도하고, 리포좀 준비물을 살균시킨다. 이와 같은 멸균과정은 인터디지테이션 융합과정의 일부로 이용되거나 미국특허 4,522,803, 4,588,578 와 4,975,282 에서 상술한 방법과 같이 다른 공정에 의해 준비된 리포좀을 살균하는데 이용될 수 있다.

유체역학압력은 세포과정에서 효과를 가지는 것으로 오래전 부터 공지되어 왔다. 현재 고압 및 중간온도는 특정 음식들의 파스퇴르화의 살균에 이용된다. 일반적으로 이와 같은 방법은 75,000psi와 같은 고압 및 중간정도의 온도를 이용한다. 박테리아, 이스트, 바이러스는 고압에 의해 모두 비활성화 된다. 고정 압력을이용하는 비활성화 공정은 온도, 매체의 화학적 조성물, 온도 및 시간에 대한 함수로써 변화시킬 수 있음은 알 수 있다.

본 발명에 따르면, 고압 유체역학적 압력 및 증온을 이용하여 아래 실시예 28 에서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 박테리아를 포함하는 미생물을 죽이고 따라서 리포좀성 준비물을 멸균시킨다. 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)는 멸균과정에서 죽이는데 가장 어려운 미생들중에 하나이기 때문에 이 실시예에서 사용되었다. 실시예 28 에서 여러 가지 압력에서 몇 가지 온도에 대한 비활성화 속도에 대해 상술한다. 도면 15, 16 와 17 에서 제시된 결과에서 볼 때, 멸균 속도는 멸균을 실행하는 온도와 압력에 대한 함수이다.

일반적으로 최단시간에서 선택된 리포좀 조성물에서 본 발명의 멸균과정 실행에 있어서, 조성물에 효과적인 적절한 온도 및 압력을 결정할 수 있다. 가장 신속한 멸균과정 동안에 리포좀 조성물이 견딜 수 있는 최고온도 및 압력을 복합 이용한다. 실시예 28 의 도면 15, 16, 17에 제시한 데이터에서는 이와 같은 멸균과정에서 온도 및 압력 사이의 관계를 제공한다.

본 발명에 따른 효과적인 멸균과정에서 최저수준으로 약 10,000psi 압력이 된다. 적절하게는 약 40,000psi 최저 압력이 좀더 신속한 멸균과정을 실시하는데 사용되고, 요구되는 실제시간은 공정을 실행하는 온도에 따라 달라진다. 압력은 리포좀 구조를 파괴시키거나 또는 조성물 성분중 어떤 것에 영향을 줌으로써 멸균될 특정 리포좀 조성물에 악성효과를 가지는 수준 이하로 유지되어야 한다. 이와 같은 방식으로 최대온도로 리포좀의 구조 또는 화학적 변화와 같은 리포좀 조성물과 조성물의 어느 한 성분에 나쁜 영향을 주게 되는 온도 이하로 유지해야 한다.

일반적으로 본 발명의 조성물은 일정크기 리포좀을 융합하는데 효과적인 유도물질을 포함한다. 리포좀 융합에 이용된 유도물질의 양과 형태는 이용된 리포좀 형태에 대한 함수로써 다양화될 수 있다. 그러나, 일반적으로 이용된 유도물질의 일정크기 리포좀, 유도물질, 용질 복합물을 포함한 총 용액 중량에 1.0 내지 50%로 구성된다. 본 기술에 숙지된 자는 본 발명의 인터디지테이션 겔과 리포좀을 만드는데 본 출원의 범위내에서 유도물질의 농도를 다양하게 할 수 있음을 인지할 것이다.

본 이론에 한정시키지 않고, 일정크기 리포좀은 작은 반경의 만곡에 의해 겹쳐지는 이중층 팽창함을 경감시키기 위해 특정 농도의 유도물질 지질막(겔)로 융합되는 것으로 보인다(실시예, 도면 3). 만들어지는 인터디지테이션-융합겔에는 고농도의 용질이 포함된다. 여기에는 리포좀에서 높은 용질, 지질비로 포집되지 않는 다른 물질이 포집될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 IF 겔을 이들의 L 베타 I-L 알파 전이온도("Tm") 이상의 온도에 노출시키고, (이때 온도는 반드시 전이온도 이상일 필요는 없으며, 혼합물의 물성을 변화시키는 온도이면 된다) IF 리포좀이 형성되는 혼합물의 물질 성질을 변화시키는 온도에서 노출시킬 때, 유도물질을 적절히 제거하면(반드시 필수적인 것은 아님), 매우 높은 용적의 리포좀이 형성된다. 이와같은 리포좀은 용질, 리포좀 이용된 유도물질의 함수에 따라 크기가 다양해지나 일반적으로 100㎛ 내지 0.025 미크론의 범위가 되나, 적절하게는 약 20 미크론이다.

이론에 제한하지 않고, 인터디지테이션은 지질이 리포좀 형성동안에 동요에 덜 민감하도록 하여 보통 때에는 막과 상호작용하여 포집하기가 어려운 물질을 포집할 수 있게 한다. 가령, 본 발명의 인터디지테이션-융합 리포좀은 막과 결합하는 경향으로 인하여 고농도를 포집하기 매우 어려운 아미노글리코사이드를 고농도로 포집하는데 사용되었다. IF 리포좀은 젠타마이신의 경우 1:2(w:w)의 약물:지질비로 젠타마이신을 포집하는 것으로 나타내고, 반면에 일반적으로 변형된 소다층 리포좀 (SPLVs)는 약물/지질비가 악 1:10(w:w)으로 젠타마이신을 포집한다.

본 발명의 인터디지테이션-융합 겔 및 리포좀은 일정크기 리포좀, 즉 직경이 약 0.4 미크론, 좀더 적절하게는 0.05 미크론 이하, 가장 적절하게는 0.025 미크론 이하의 초기 리포좀을 이용하여 만든다. 또는 FAT MLVs 를 이용할 수 있으나 특정 경우에 더 큰 리포좀을 이용할 수 있다. 일정크기 리포좀을 생산하기 위해 상술된 방법에 포함하여 다양한 기술이 사용될 수 있다. 일반적으로, 리포좀은 클로로포름과 같은 유기용매에 지질용액을 진공건조시켜 밑둥근 또는 다른 적절한 플라스크 또는 용기에서 얇은 막으로 만들고, 이어서 수용성 완충액 또는 염용액과 같은 수용성 용매로 지질막을 수화시켜 만들 수 있다. 또는 건조 지질분말에 염용액 또는 수용성 완충액과 같은 수용성 용매를 혼합에서 리포좀을 만들 수 있다.

초음파분해, 압출 또는 균질화 방법등 하기에 전술한 본 기술의 공지된 방법중 하나를 이용하여 리포좀의 크기를 조정한다. 크기가 조정된 리포좀을 만든 후에, 용질, 적절하게는 포집될 생활성제를 수용성 용매에 혼합시키는 것이 일반적이다. 용매와 리포좀이 상호작용하는지에 따라 용매를 포집하는데 일반적인 두 가지방법을 이용한다. 용질이 리포좀과 반응하지 않는 경우에, 일정 크기 리포좀을 만든 다음 용질을 수용성 또는 수용성/완충용매에 혼합시키고, 인터디지테이션 시킨다. 리포좀과 용질이 리포좀과 반응하는 경우에, 인터디지테이션-융합 겔을 만든 후에 용질을 수용성 용매와 혼합시킨다.

물론 본 기술에 숙지된 자는 본 발명의 IF 겔 및 리포좀의 개별 성분이 첨가되는 순서를 다양하게 할 수 있으며, 포집된 용질의 형과 이용된 포화지질의 형에 따라 달라진다는 것을 인지할 수 있을 것이다.

본 발명의 용질을 포집하는데 이용되는 지질의 최종 농도는 바람직한 용질의 형, 이용된 지질의 형 및 농도에 대한 함수로써 다양해질 수 있으나 일반적으로 수용성 용매에서 약물에 대한 지질의 무게비는 최종 지질농도 5내지 100mM 범위내에서 50:1 내지 1:100의 비가 될 수 있다. 본 발명의 인터디지테이션 융합 겔 및 리포좀에서 약물과 지질의 최종무게비는 1:10 내지 15:1로 다양하다.

일정 크기 리포좀을 만든 후에 유도물질을 수용성 용매에 첨가한다. 첨가된 유도물질의 양은 일반적으로 1.0%(지질, 용질 유도물질의 복합 중량기준)에서 최고 중량의 50% 범위가 된다. 유도물질로 에탄올이 사용될 때, 포함된 에탄올 양은 일반적으로 중량의 5%(1.0M) 내지 20%(4.0M)이 되고, 글리세롤이 유도물질인 경우에, 이용된 유도물질의 양은 중량의 90-100%까지 된다. 다른 유도물질의 양도 다양하게 할 수 있다. 에탄올의 경우에, 최종 에탄올 농도는 0.50 내지 10.0 몰, 적절하게는 1.75 내지 4.0 몰 범위가 된다.

효과량의 온도물질을 사용하여 일정 크기의 리포좀을 융합시켜 융합된 지질막이 만들어진다. 이 방법에 의해 생성된 IF 겔은 연성 젤라틴 또는 다른 경구 투약제형에 포집된 제형과 같이, 국소 또는 경구투여에 이용될 수 있다. 또는 본 발명의 IF 리포좀을 만들기 겔을 변형시킬 수도 있다.

본 발명의 IF 리포좀을 생산하기 위해, 혼합들은 겔이 형성되도록 충분한 시간동안 특정 온도에서 배양시켜 겔을 만든다. 일반적으로 시간은 1분 내지 약 1시간이 된다. 온도는 1분 내지 1시간동안 지질의 Tm 이상으로 상승시키지만 반드시 그럴 필요는 없다. 요구되는 배양온도는 혼합물의 Tm이 될 수도 있으나 지질, 용질, 유도물질 혼합물의 물성을 변화시킬 수 있는 온도로써 본 발명의 IF 리포좀을 생산하게 된다. 이와 같은 배양온도를 유지하는 동안에, 기화(특히 에탄올 유도물질의 경우) 양압질소(즉, 혼합물을 통하여 N₂기포를 발생시키는 것으로 구성된 N₂살포) 또는 희석등의 방법에 의해 유도물질을 제거할 수 있다. 이 과정에 의해, 0.025 내지 100㎛의 다양한 크기, 좀더 적절하게는 0.025 내지 20 미크론의 다양한 크기의 IF 리포좀이 만들어진다. 포집 안된 약물은 필요에 따라 용매로 부터 제거할 수 있다. 다양한 또는 크기가 일정한 리포좀을 생산하기 위해 상기 방법에 의해 생성된 IF 리포좀의 크기를 더 감소시킬 수도 있다.

압출에 추가하여, IF 겔 또는 리포좀을 만드는데 이용되는 초기 리포좀(유도물질 첨가전) 및 생성된 IF 리포좀은 초음파 또는 균질화에 의해 크기를 감소시킬 수 있다. 초음파 분해 방법은 초음파 에너지를 이용하여 큰 리포좀을 파괴시켜 자발적으로 작은 리포좀이 되게 한다(Chapman, et al., BBA, 163, 255(1968). 욕조형소니케이터에서 생성되는 초음파 진앙지에 리포좀 현탁액을 포함하는 유리관을 담구어 초음파 분해를 실시된다. 또는 프로브형 소니케이트를 이용하여, 티타늄 프로브의 떨림에 의해 발생되는 초음파 에너지에 리포좀 현탁액이 직접 접촉시킬 수 있다.

균질화 과정에서 큰 리포좀은 작은 것으로 부수는 전단력은 Polytron (Brinkman Instruments Co., Westbury, New York, USA)와 같은 로토 스테이트형 장치, Microfluidizer 와 같은 스테이트-스테이트형 장치, 세포를 파괴시킬 때 흔히 사용되는 다른 다수의 장치에서 발생되는 것을 이용할 수 있다. 상기 모든 방법이 IF 리포좀을 파괴시키는데 관여하기 때문에 IF 리포좀이 이들 과정중 하나를 받게 될 때 포집된 용질은 손실된다. 그러나 포집 안된 용질이 리포좀의 크기 감소전에 리포좀 현탁액에서 제거되지 않는 경우에 손실은 최소화될 수 있다.

상당수의 다른 기술을 이용하여 일정 크기의 리포좀을 만들어 인터디지테이션-융합시키고, 공정이 완료된 후에 일정크기의 IF 리포좀을 만들 수 있다. 이와 같은 방법에는 역상-증발, 융합과정, 균질화 과정, 초음파분해, 마이크로플루이디제이션, 계면활성제 희석 및 이들 복합방법 등이 포함된다. 리포좀을 생산하기 위한 이와 같은 방법은 Liposomes, Marc J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983 에서 복습할 수 있다. 일정크기 리포좀은 압출공정을 이용하여 만들 수도 있다.

압출공정을 이용하여, 약 30nm 내지 1 미크론 직경의 일정크기 리포좀을 생산하기 위해 리포좀은 30nm 내지 미크론 크기의 구멍을 가지는 필터를 통과시킨다.적절하게는 리포좀이 통과하게 되는 필터 구멍크기는 100 nm 내지 1 미크론 범위가 된다. 필터는 일반적으로 폴리카보네이트로 만들어지나 필터는 리포좀과 반응하지 않고 충분한 압력하에 압출될 수 있을 정도의 강한 내구성 재질로 만들어질 수 있다. 적절한 필터에는 본 발명의 적절한 압출과정의 고압을 일반적으로 견디는 "직통필터"가 포함된다. "완곡통로" 필터가 사용될 수도 있다. 본 발명의 적절한 구체예에서 프리-IF 융합 리포좀은 50 내지 100nm의 직경을 가지는 리포좀을 생산하기 위해 50 내지 100nm 폴리카보네이트 필터를 통과시킨다.

본 기술에서 이용될 수 있는 압출과정은 인터디지테이션-융합을 겪게되는 일정크기 리포좀을 생산하는데 이용될 수 있다. 압출과정은 고압하에 연속하여 또는 1회 실시될 수 있다. 특히 적절한 압출공정은 Cullis. et al., PCT Application PCT/US85/01161, Publication Number WO 86/00238 entitled "Extrusion Tehniques for Producing Liposomes", published January 16, 1986에 상술되어 있다.

융합전후에 본 발명의 리포좀의 크기를 조절하는 다른 방법은 Anotec filters according to commonly-assigned copending U.S. Patent application entitled "Liposome Extrusion Process", U.S. Serial No. 593,200, filed October 5,1990에 상술되어 있다.

또한 리포좀은 Gifford Wood 와 같은 클로이드 밀의 밀링과정 또는 균질화 과정을 이용하여 일정크기로 할 수 있다. 리포좀은 적절한 크기가 얻어질 때까지 1회 이상 실시하고, Nicomp Particle Sizer 또는 Malvern Particle Sizer 를 이용하여 크기 분석을 한다. 또는 리포좀은 전술한 것과 같이 Microfluidizer 장치를 통과시킬 수도 있다.

원하는 경우, 생성 리포좀을 분리하기 위해 본 기술에 공지된 방법을 사용하여 집단에서 분리될 수 있고 이 과정은 접선 흐름여과과정이다. 크기에 따라 리포좀을 분리하는데 사용되는 과정은 U.S. 특허 "Method for Sizer Separation of Particles", Serial No. 225,327, filed July 28, 1988 에 상술되어 있다.

이 과정에서 서로 다른 크기로 된 리포좀 이형 집단을 하나이상의 접선 흐름 필터를 통과시켜 좀더 큰 또는 작은 리포좀 집단을 만든다. 가령, 상이한 크기의 두 개 필터가 이용될 때 제 1 필터의 입자크기는 5㎛로 5.0㎛ 이하인 리포좀을 통과시키고, 그 다음 더 작은 크기 즉 2.0㎛의 필터를 통과시키게 된다. 이 경우에 5.0㎛와 2.0㎛ 크기 분포를 가지는 균질한 크기의 리포좀을 얻는다. 또다른 크기의 구멍을 가지는 필터를 이용하면 크기가 더 큰 또는 더 작은 별개 리포좀군을 얻을 수 있다.

유도 물질 존재하에 인터디지테이션-융합을 하게 되는 리포좀의 크기는 0.4 미크론 적절하게는 0.025 미크론, 가장 적절하게는 0.025 미크론이 된다. 본 발명의 초기 일정크기 리포좀은 FAT MLVs이다. 본 발명의 일반적인 방법에 의해 생산된 IF 리포좀의 크기는 100㎛에서, 적절하게는 20 미크론에서 0.025 미크론, 적절하게는 2 내지 20 미크론이다. 생성된 IF 리포좀은 초음파 분해, 균질화, 압출기술 등을 이용하여 크기를 더 감소시킬 수 있다. 그러나 본 발명의 IF 리포좀 크기를 감소시키면 리포좀내에 생활성제가 손실되는 경우가 있다. 따라서, 크기 감소과정 가령, 생산되는 리포좀의 크기를 다양하게 하기 위해 초음파 분해와 균질화와 같은다른 공정 또는 상기 압출공정에 의해 크기를 감소시킨 IF 리포좀에는 포집되는 생활성제 농도가 감소된다.

본 발명에 이용된 생활성제에는 비타민, 호르몬제, 항-대사물질, 항균제, 항곰광이제, 항생제, 단백질, 펩티드, DNA, RNA, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 항히스타민제, 진정제, 최면제와 같은 신경제약학적 물질, 스테로이드성 그리고 비스테로이드성 항염증제, 이뇨제, 혈압강하제, 항부정맥제, 이뮤노겐, 면역조절제, 피임제, 방사선 상대조제, NMR 대조제, 항바이러스제 그리고 맥관확장제등이 포함된다. 본 발명의 특정 적절한 구체예에서 방사대조제, NMR 대조제, 펩티드, 자연, 합성 그리고 반합성 항균제 가령 세팔로스포린과 아미노글리코시드가 본 발명에 유용하다. 본 발명에서 이용된 예시적인 방사대조제에는 이오헥솔, 이파미돌, 이소글레이트, 이오프로미드, 이오펜톨, 이디오사놀, 메트리자미드, 이의 혼합물 및 이의 제약학적 수용가능한 염이 포함한다. 예시적인 아미노글리코시드에는 젠타마이신, 토브라 마이신과 아미카신이 포함된다.

본 발명에 이용되는 적절한 생활성제는 국소 또는 전신으로 투여할 때 양호한 생물학적 활성을 가지고 본 발명의 조성물을 안정화시킬 수 있는 물질이면 된다. 효과적으로 피부에 국소투여될 수 있는 물질은 살리실산, 레조르시놀, 페놀, 레니논산 및 이의 등가체를 포함한다. 본 발명에 유용한 다른 물질에는 특정 탈감성제 가령, 항원과 백신, 비타민과 아미노산, 필수지방과 미네랄과 같은 영양제, 항-신조직 형성과 항-종양제 특히 알킬레이트제등이 포함된다.

본 발명에서 이용되는 추가 활성제에는 벤조디아제핀, 해열제, 항경련제, 지양제, 교감신경흥분제, 충혈제거제, 안정제, 심장활성제, 제토제, 안정제, 마취제. 스테로이드제, 월경전기제, 국소마취제와 항생제가 포함된다. 다른 항균제가 본 발명에 사용될 수 있다.

상기 나열된 생활성제 및 이의 제약학적 수용가능한 염은 본 발명에 이용되는 것으로 볼 수 있다. 본 발명의 조성물에 이용되는 전술한 물질의 적응성과 량의 결정은 조합 기술에 숙지된 것이다. 개별적인 제약학적 물질의 안정성과 응용은 본 기술에 잘 공지된 것이다.

특정 경우에서 이용된 활성제의 실제 적정량은 개별환자에서 생활성제의 예상되는 약리학적 작용, 질병상태에 따라 변화될 수 있다. 주어진 숙주에 대한 약량은 적절한 통상의 제약학적 프로토콜에 의해 주어진 활성제의 여러 가지 활성과 비교하여 결정할 수 있다.

본 발명의 IF 리포좀 및 겔은 사람과 같은 포유류를 포함한 동물에 투여될 수 있다. 고통을 치료하기 위해, 사람에 투여할 때 처방의사는 궁극적으로 주어진 환자에 적절한 양을 결정하는데, 이는 나이, 체중, 개인반응, 환자 증상 및 특징에 따라 다양해질 수 있다. 본 발명은 리포좀성 약물농도를 다양하게 할 수 있는 방법을 제공한다.

조성물이 수송될 유기체내에 부위에 따라 본 발명의 조성물 투여방식을 결정하는 것이다. 가령 감염특정부위에 제공하기 위해서는 국소 응용에 가장 흔히 사용되고(간염이 외부적인 경우, 즉 눈, 피부, 귀 또는 화상부위) 또는 점막 또는 내피 라이닝에 흡수(가령, 비강, 구강, 질, 직장, 위장, 점막등)시킬 수 있다. 이와 같이 국소에 제공하는 경우에는 크림 또는 연고의 형이 될 수 있다. 본 발명의 인터디지테이션-융합겔을 이용하면 조합물이 입 또는 위장관에 접촉될 때 즉시 지질이 리포좀을 만들 수 있다.

생활성제를 포함하는 IF 리포좀은 단독으로 투여될 수 있으나 투여경로 및 표준 제약학적 과정에 따라 선택된 제약학적 담체와 공동 투여되는 것이 일반적이다. 본 발명의 IF 리포좀은 장관외 예를 들면, 점맥내, 근육내, 피하내로 투여된다. 이와 같은 리포좀은 등장액을 만들기 위해 다른용질 예를 들면, 충분한 염, 글루코스, 덱스트로스를 포함하는 멸균 수용액형으로 이용된다.

경구투여를 위해, 본 발명의 리포좀은 정제, 캡슐, 약이든 당과, 트로치, 분말, 시럽, 연금약액, 수용액, 현탁액형으로 이용될 수 있다. 정제의 경우에 사용되는 담체는 락토즈, 구연산 나트륨, 인산염이 포함된다. 전분과 같은 분해제와 윤활제등이 이용될 수 있다. 캡슐형으로 경구 투여시에 유용한 희석제는 락토즈와 고분자량 폴리에틸렌 글리콜이다. 수용성 현탁액이 경구사용에 요구될 때 특정 감미 또는 향제가 첨가될 수도 있다.

본 발명에 이용된 생활성제에는 전술한 것이 포함되나 이에 한정시키지 않고, 이의 제약학적 수용가능한 염을 포함한다. 전술한 물질의 적응성과 본 발명의 조성물에 사용되는 양의 결정은 본 발명의 분야에 공지된 것이다. 개별 제약학적 물질의 안정성과 응용성은 본 기술분야에 숙지된 자에게 공지되어 있다. 특정 경우에 이용되는 생활성제의 실제 적절한 양은 개별환자에서 예측되는 생활성제 제약학적 운동성, 질병상태 또는 병리학적 심각성에 따라 다양해질 수 있다. 주어진 숙주에 대한 약량은 통상의 방식 즉 적절한 제약학적 처방에 의해 주어진 활성제의 차등활성을 비교하여 결정할 수 있다.

리포좀이 생활성제와 결합하기 위해 원거리 적하된 경우에 리포좀은 Janoff, 미국특허 4,880,635; Schneider 미국특허 4,229,360 에 따라 회수시킬 수 있다.

다음의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며 어떠한 방식이로든 본 출원의 범위를 제한시키고자 함은 아니다.

실시예 1

20mM DPPC와 추가로 0.04mM 디페닐헥사트리엔(DPH, purchased from Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) 1㎖ 수용성 완충용액에서 디팔미토일포스파티딜콜린으로 구성된 리포좀이 (DPPC, obtained from Avanti Polar Lipids, Birmingham, Alabama, USA) 형성된다. 리포좀이 형성된 후에 에탄올을 최종농도가 수용액의 0.3M 내지 2.5M 되도록 첨가한다.

DPH는 리포좀 이중층에 결합될 때 최대로 형광을 나타낸다. 인터디지테이션은 이중막에서 DPH를 재배치시키고 동시에 형광발산을 감소시킨다. 도 2 에서 볼 수 있는 것과 같이, 모든 리포좀에 에탄올 농도가 높을수록 인터디지테이션은 더 크다. 또한 동량의 에탄올을 이용하는 경우에 인터디지테이션의 효과는 리포좀의 직경이 클수록 크다. 도 2 에서 Fo는 에탄올이 없이 DPH 의 현광도; 여기=351nm; 방출은 380 내지 580nm에서 감지하고 무게로 정량화한다.

실시예 2

리포좀의 지질 혼합

일정크기 DPPC 리포좀의 지질혼합은 리포좀의 크기와 유도물질의 농도에 대한 함수로써 결정한다. DPPC로 구성된 리포좀은 20mM DPPC를 포함하는 수용성 완충액에서 형성된다. 1㎖ 수용성 완충용액에서 99중량% DPPC, 0.35중량% N-벤질디포스파티딜에탄올아민(NBD-PE) 0.65중량% 로다민-포스파티딜에탄올아민을 포함하는 표식집단의 리포좀이 형성된다. 이들 프로브는 제공자-수용자 쌍으로 형성된다. NBD 부분은 465nm에서 여기하고, RET(공명 에너지 전달)를 경유하여 거리 의존현상에 의해 여기되는 로다민 수용자에 의해 중단된다. 이들 리포좀은 빈 리포좀과 1:10의 비율로 혼합 된다. 에탄올 농도에 대한 함수로써 다양한 크기의 DPPC 리포좀에서 지질혼합은 NBD에서 로다민 부분으로의 RET 손실에 의해 결정될 수 있다. 0.35 몰% NED-PE와 0.65몰% 로다민-PE의 리포좀을 준비하고, 연속하여 각각 0.035와 0.065몰%로 감소된 표준곡선을 만든다. 이 표준곡선에서 1/10 혼합 실험으로부터 직접 비교는 지질혼합의 정도, 막융합을 나타낸다.

실시예 3

다양한 소포형에서 포집된 용질비교

상당수의 리포좀 조합을 준비한다. 포집된 수용성 상의 양은 결정하고 준비된 각 리포좀 "형"과 비교한다. 결과는 아래 표 1 에서 나타낸다.

IF 리포좀 준비에서 NLVs는 최종농도가 수용성 완충액 1㎖당 20μmoles DPPC 되도록 하기와 같이 준비한다. 그다음 MLVs는 반투명이 될 때까지 50℃에서 욕조형 소니케이트로 초음화 분해한다. SUVs를 실온으로 냉각시킨 후 에탄올은 최종 수용성 현탁액에 최종농도가 2.0M이 되도록 첨가한다. 실시예 A1 와 A2(표 1)에서 희석및 세척에 의해 에탄올을 제거한다. B1와 B2에서 N₂를 사용하여 양압대체를 통해 에탄올을 제거하고, 시료는 희석 세척시킨다. C는 A와 B의 초기 지질농도의 절반을 가지고 실시예 1가 같이 에탄올을 제거한다.

MLVs 준비에서 5㎖ 클로로포름에서 100㎎ DPPC는 0.04M 디페닐헥사트리엔을 포함하는 1㎖ 수용성 완충액이 첨가된 밑둥근 플라스크에서 얇은 건조막으로 회전식 기화시킨다. 그 다음 지질혼합물은 모든 지질이 벽에서 제거될 때까지 강력히 교반시킨다.

Bally et al., 미국특허 4,975,282, issued December 4. 1990에서 상술한 것과 같이, 세척 안된 MLVs를 5회 냉동 및 해동과정 거치게 하여 FATMLVs를 만든다.

SPLVs는 상기 전술한 MLVs와 같이 건조막 DPPC를 만들고 0.5㎖ 수용성 완충액이 첨가될 5㎖ 에틸에테르에 액체막을 용해시켜 만든다. 이 혼합물은 욕조형 소니케이터에서 유화시키고 N₂기류를 이용하여 에멀젼을 교반시키고 Lenk, et al., 미국특허 4,522,803 에서 상술하는 것과 같이 에테르를 제거한다. 에테르 제지는 잔류향이 감지되지 않을 때까지(약 5분) 지속한다. 생성지질 혼합물은 1㎖ 수용성 완층액에 재현탁시킨다.

MPVs는 100㎎ DPPC, 5㎖, 클로로포름, 5㎖ 에탄올, 0.5 수용성 완충액으로 단일상을 만들고, 건조시켜, 왕성하게 교반시켜 1㎖ 수용성 완충액에서 현탁된 막을 재현탁시켜 만든다.

포집된 수용액 용적을 결정하기 위해, 20㎕ 10mM 4-트리메틸암모늄TEMPO (4-TMAT) 용액을 0.98㎖ 리포좀 현탁액에 첨가한다. 시료들은 교반시키고, 외측수용층은 원심분리에 의해 리포좀에서 분리될 수 있다. 이 연구에서 사용된 리포좀에 침투하거나 결합되지 않기 때문에 외측 수용층에 농축된다. 4-TMAT의 농도를 측정하면 Perkins, et al., BBA, 943, 103(1988) 에서 상술되는 것과 같이 내부수용상 또는 포집용적을 계산할 수 있다. 이 분석의 결과는 표 1 에 나타내었다. 보는 것과 같이 IF 리포좀은 상당히 큰 용적으로 분리되나 특정 경우에는 다른 리포좀형에서 얻어지는 것의 10배가 되는 경우도 있다.

* 포집된 용적은 EPR 기술을 사용하여 측정되는데(Perkins, et al.(1988) Biochim. Biophys. Acta 943, 103) 시료는 형성 후에 검사한다.

실시예 4

IF 리포좀의 형성과정

디미리스토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테로일포스파티딜콜린과 같은 포화된 지질로 구성된 리포좀(LUVs, MLVs, SPLVs등)을 준비하고 크기는 압출, 초음파분해 또는 균질화 반응에 의해 0.4 미크론 이하(적절하게는 0.025 미크론)로 한다. 지질과 혼합하지 않는 생활성제는 리포좀을 만드는데 이용되는 수용성 용매와 혼합한다(최종 지질농도는 5 내지 100mM 적절하게는 10 내지 35mM이 된다). 리포좀의 온도는 지질의 주요 상전이온도 이하가 된다. 그다음 수용성 용매에 1.75 내지 2.5M의 최종농도로 에탄올을 첨가된다. 지질과 반응하는 생활성제의 경우에, 생활성제는 IF 겔이 만들어지고, 에탄올 첨가후에 용매에 첨가하는 것이 일반적이다. 이 단계에서, 과정을 중단하고 만들어진 겔을 국소와 경구제제로 이용할 수 있다. 또는 본 발명의 IF 리포좀을 형성하는데 겔을 사용될 수 있다.

IF 리포좀을 형성하기 위해, 겔을 1분 내지 1시간동안 지질의 Tm 아래 온도에서, 그리고 1분 내지 1시간동안 지질의 Tm 이상의 농도에서 배양시킨다. 그다음 유도물질은 증발, 양성질소압 또는 희석 등의 방법으로 제거한다. 에탄올 경우에, 에탄올은 0.2M 이하의 농도에서 희석될 수 있다. 유도물질을 제거할 때, 0.25 미크론 내지 약 20 미크론의 다양한 크기의 리포좀이 형성된다.

실시예 5

디아트리조에이트-DPPC IF 리포좀 스케일-업

600mg DPPC는 회전식 증발에 의해 클로로포름에서 막으로 건조되고 그 다음 16시간동안 진공상태에서 추가 건조시킨다. 지질은 약 15분동안 51℃ 욕조에서 배양하여 6㎖ 0.9% 염에 재현탁시킨다. 생성된 다층 리포좀(MLVs)은 30㎖ 코렉스튜브에 옮기고 용액이 불투명이 될 때까지 51℃에서 2시간 초음파 분해시킨다. 이 시점에서 리포좀 4.1㎖ 만이 회수된다. 12㎖ 디아트리조에이트(Renografin-76^TM, available from Bristol-Myers Squibb), 12㎖ 이중수 ("dH₂O")와 2㎖ 에탄올을 50㎖원심분리병에서 혼합하고 4.1㎖ 지질(51℃ 까지)을 첨가하고 간단히 교반시킨다. 10분 이내에 혼합물은 부드러운 부을 수 있을 정도의 겔이 되고 2시간동안 실온에서 세팅시킨다. 그다음 현탁액은 1시간동안 51℃에서 배양시킨다. 여기에서 에탄올 증발을 시키기 위해 샘플을 나눈다. 욕조에 담구어져 있는 동안에 N₂는 12분동안, 각 엘리콧트를 통해 제공한다. 시료는 실온으로 냉각시키고 20㎖ 0.9% 염으로 희석시킨다. 준비물은 3회 10분간 10,000 x g 에서 반복 원심분리시킨다. 샘플은 하기 실시예 6에서와 같이 검사한다. 결과는 표 2에 나타내었다.

1- 첨가된 디아트리조에이트 12㎖에 기초.

실시예 6

디아트리조에이트-HSPC IF 리포좀

400㎎ HSPC(Natterman Phospholipids)은 약 1시간동안 10㎖ dH₂O 70℃에서 수화시키고 불투명해질 때까지(30분) 프로브로 초음파 분해시킨다.

약 1μ Ci/㎖¹²⁵I-디아트리조에이트를 포함하는 14㎖ 디아트리조에이트 (Squibb)를 2.1㎖ dH₂O 와 4.9㎖ 에탄올/50㎖ 스크루탑 Corex^TM튜브에 혼합시킨다.혼합하는 동안에 HSPC 소단층 리포좀(SUV) 7㎖을 첨가하는데 이 과정은 SUV가 이의 Tm 이상에서 있을 때 실시한다. 고형겔이 바로 형성되고 약 1시간동안 덮개를 덮고 실온에서 세팅한다. 준비물은 70℃ 덮지 않은 욕조에서 2시간 배양시키고, 23분간 액체 준비물에 N₂를 제공한다. N₂유속은 Manosstat^TM플로메트에서 약 10 이다. 4㎖ 액을 30㎖ corex^TM튜브에 분배하고 실온으로 냉각시킨다. 900 mOsm 메글루민 완충액 10㎖(메글루민, NaCl, 시트레이트, EDTA 에서 만듬)을 첨가하고 간단히 교반시킨다. 포집안된 디아트리조에이트는 3회동안 15분 10,000 x g 18℃에서 반복적 원심분리에 의해 제거된다. 디아트리조에이트(A256)의 UV 분광광도계 검사에서 최종 요오드 농도가 106.3㎎/㎖ 로 결정되었다. 최종 지질 농도는 Chen, et al., Analytical Chem., 28, 11, 1756 (1956)에서 상술한 것과 같이 표준방법에 의해 결정하였을 때 12.1㎎/㎖ 이다. 최종 I:L 비는 8.8(w/w)이다. 최종 리포좀 현탁액은 실온 상태하에서 저장한다.

실시예 7

이오트롤란-HSPC IF 리포좀

1g HSPC(Natterman Phospholipids)은 1시간동안 25㎖ dH₂O 에서 70℃ 수화시키고, 불투명해질 때까지(약 30분) 프로브로 소니케이트 시킨다. 생성된 SUVs는 10㎖ 스크루-탑 Corex^TM튜브에 옮기고, 남아있는 티타늄을 펠렛시키기 위해 5분간 5000 x g 에서 회전시킨다. 티타늄 펠렛에서 SUVs를 분리하여 70℃ 욕조에서 5분간배양하고, 다음의 용액을 첨가한다; 44㎖¹²⁵I-라벨된 이오트롤란은 15.6㎖ 에탄올, 6.4㎖ dH₂O 와 혼합한다. 이 용액은 50㎖ 스크루 탑-Corex^TM튜브에서 4 × 16.5㎖로 나눈다. 5.5㎖ SUVs는 각 튜브에 넣고 혼합하면 부드러운 겔이 형성된다. 겔은 실온에서 1시간동안 덮어둔채 세팅하고, 덮지 않고 가스 플로우메터에서 40 유속으로 13분간 각 튜브에 액체를 통해 N₂를 공급한다. 각 튜브는 250㎖ Erlenmeyer flask에 넣고 실온으로 냉각시킨다. 약 150㎖ 멸균 PBS(Ca 와 Mg 없는 인산완충염, pH 7)을 플라스크를 흔들면서 첨가시킨다. 포집 안된 이오트롤란은 3회 18℃, 10000Xg 10분간 반복원심분리에 의해 제거한다. 최종 요오드 농도는 300㎎/㎖ 요오드에서 초기 이오트롤란 용액의 특이활성에 기초하여 152.7㎎/㎖ 이었다. 최종 인지질 농도는 Chen, et al., Analytical Chem., 28, 11, 1756 (1956) 방법에 의해 32.7㎎/㎖ 임을 알았다. 이 값은 최종 I:L 비가 4.7(w/w)이 되었다. 생성된 리포좀 현탁액은 실온 조건에서 저장한다.

실시예 8

실온조건하에 저장된 방사대비제의 보존기간 안정성

50㎕ 디아트리조에이트 또는 이오트롤란 HSPC IF 리포좀 준비물(방사능 라벨된)은 이들 고유현탁 완충액 1㎖로 희석시키고, 10분간 실온에서 마이크로퓨즈로 16,000xg 에서 원심분리시킨다. 상층액은 제거하고,¹²⁵I로 펠렛과 상층액을 카운트한다. 25℃, 62일 후에 디아트리조에이트 리포좀의 상층액에 4% 방사라벨이 있고54일 뒤에는 이오트롤란 리포좀의 상층액에 3%가 있다. 이 결과들을 기초하여 준비물은 실온 조건하에 저장하였을 때 적어도 1년간 보존기간을 나타낸다.

실시예 9

DPPC IF 리포좀에서 디아트리조에이트 포집에서 초기 지질 농도의 효과

표 3 에서 나타낸 결과에서는 초기 지질농도를 변화시키면서 실시예 5 에서 설명한 과정에 따라 만들어진 IF 리포좀을 나타낸다. 간략하면 15㎖ Corex 튜브에 1㎖ 디아트리조에이트를 dH₂O, DPPC 일정크기 단층 리포좀(SUVs)과 혼합시켜 하기와 같은 최종 용적을 얻는다. 지질 첨가 전에 ㎖당(최종용적 2M) 87.5㎕ 에탄올을 디아트리조에이트 용액에 첨가한다. 준비물은 뚜껑을 덮고 1시간 실온에서 세트하고, 뚜껑을 벗기고 51℃ 욕조에서 배양시킨다. 1시간뒤에, N₂는 2분간 각 시료에 제공하고, 실온으로 냉각시킨후 각 시료는 10㎖ 0.9% 염용액으로 희석시키고, 3회 30℃ 15분간 10,000g 에서 반복 원심분리에 의해 세척시킨다. 샘플은 전술한 것과 같이 검사한다. 결과는 아래 표에 나타내었다.

1-초기 첨가된 1㎖ 디아트리조에이트에 기초함

실시예 10

IF 리포좀을 통한 젠타마이신 포집

젠타마이시설페이트(Sigma Chemicals, St Louis, Missouri, USA) 용액을 최종 농도가 500mg/㎖ 이 되도록 0.9% 염용액에서 준비한다. 100mg DPPC(Avanti Polar Lipids)는 따로 건조시키기 위해 기화시키고 2.5㎖ 염에서 수화시켜 최종농도가 40㎎/㎖ 이 되게 한다. DPPC 혼합물은 맑아질 때까지 욕조 소니케이트에서 초음파 분해시킨다.

다음의 혼합물을 만든다. 단, 에탄올성 유도물질은 젠타마이신 설페이트를 포함하는 용액에 미리 첨가한다.

A. 0.5㎖ DPPC 용액 + 에탄올(EtOH) (최종농도 2M) 그리고 0.5㎖ 젠타마이신 용액;

B. 0.25㎖ DPPC 용액 + 0.25㎖ 0.9% NaCl 염용액, EtOH (최종농도 2M)와 0.5㎖ 젠타마이신 용액;

C. 0.25㎖ DPPC 용액 + 0.75㎖ 염 EtOH (최종농도 2M), 1.0㎖ 젠타마이신 용액;

상기 준비물 각각은 지질:젠타마이신 농도를 결정하기 위해 한천 웰확산검사에 의해 젠타마이신 활성을 검사한다. 간략하면, 각 준비물에서 리포좀을 0.2% 트리톤 X-100(Biorad Laboratories, Richmond CA)로 파괴시키고, 지시 유기체로써 바실러스 서브틸리스(ATCC #6633)로 한천웰 확산 생검을 이용하여 젠타마이신 활성을 검사한다. 지질농도는 Ames, et al., Journal of Biological Chem. 235, 236, 769 (1960)에서 상술하는 표준방법에 의해 결정한다.

생검 결과는 하기 표 4 에 나타내었다. 결과에서 매우 낮은 지질/젠타마이신 질량비가 얻어진다.

실시예 11

DPPC-이오트롤란 IF 리포좀의 스케일-업

DSPC 8g 을 30분간 70℃ WFI 200㎖에 혼합시킨다. 생성된 현탁액은 11,000psi 압력에서 Microfluidizer^TM균질화기로 25회 통과시켜 SUVs 를 형성한다. 생성된 SUVs 는 0.22um 구멍크기의 밀리포어^TM비틀림 통로 고분자 필터를 통하여 여과시킨다.

이오트롤란(92㎖, 300㎖/㎖), 13.4㎖ WFI, 32.6㎖ 에탄올을 2000㎖ 용량 밀둥근 플라스크에서 혼합시킨다. SUVs 는 실온(25℃)에서 플라스크에서 혼합하고 10초간 바나나 패달 믹서기를 사용하여 혼합시킨다. 형성된 겔은 1.25 시간동안 흔들리지 않게 세트시킨다.

밑둥근 플라스크는 70℃ 욕조에 두고 1시간동안 66rpm 으로 바나나 패달을 사용하여 혼합시킨다. 에탄올은 1시간동안 분당 4.7L N₂를 속도로 수용성 표면에 살포하고, 약 135 rpm 으로 증가시키면서 혼합시켜 에탄올을 트랩에서 모은다. 최종 용적은 탄산염 완충액(0.4㎎/㎖ NaHCO₃, 0.1㎎/㎖ 디소듐 EDTA, 0.9% 염)으로 약 400㎖로 조정한다. 생성된 IF 리포좀은 세척하고, 0.2㎛ 마이크로겐 여과장치를 통해 포집 안된 이오트롤란에서 리포좀을 분리한다. 100㎖ 7회 세척하고 농축단계에서 300㎖만 남게 된다. 세척단계는 25분간 진행된다.

실시예 12

에탄올 농도에 대한 함수로써 DPPC-IF 소포의 포집 효과

DPPC(분말)은 10mM 트리스 HCI, 150mM NaCl, 소량¹⁴C 슈크로스 pH7.4 와 혼합하여 2.0㎖에 20mg/㎖ DPPC가 되게 한다. 혼합은 DPPC의 상전이 온도이상에서, 50-53℃ 실시하면, MLVs 가 형성된다. MLVs는 50-53℃에서 1시간 초음파 분해하고, 실온으로 냉각시켜 직경이 30-50nm의 SUVs 를 만든다. 2.0㎖ SUVs에 충분한 에탄올 (100%)를 첨가하여, 3.0M 에탄올 농도(0.43㎖ 에탄올: 20% 에탄올)가 되고, 혼합물은 균질화 시키기 위해 교반시킨다. 현탁액은 실온에서 1시간 흔들리지 않도록 뚜껑을 덮고 세팅하고, DPPC의 상전이온도 이상의 온도 50-55℃에서 1시간동안 배양시킨다. 지질 Tm 이상에서 배양시키는 동안 N₂를 3분간 혼합물을 통하여 제공한다. 샘플(100uL)는¹⁴C 슈크로스 포집연구를 위해 떼어내고 4㎕ 와 8㎕를 Bartlett phosphorous assay of Chen et al. 방법에 따라 Pi 를 결정하기 위해 떼어낸다. 10㎖ 트리스/NaCl 완충액을 최종 IF 리포좀에 첨가하고, 혼합물은 15분간 9000xg에서 원심분리하여, 상층액은 버리고, 펠렛은 트리스/NaCl 완충액에서 재현탁시키고, 총 3회 세척동안 추가 2회 원심분리한다. 펠렛은 최종으로 2.0㎖ 완충액에서 재현탁시킨다. 또다른 샘플 200㎕는 포집연구에 사용하고 Pi 검사에는 4.0uL 와 8.0uL 가 사용된다.

전술한 방법은 용액에서 1.0, 2.0, 2.5, 3.5, 4.0M 농도의 에탄올을 사용하여 반복한다.

IF 리포좀의 내용적은 인산 Pi uM당 ㎕로 표시하고,¹⁴C 슈크로스 포집과 CAT 1 EFR 방법에 의해 측정한다.

¹⁴C 슈크로스 포집은 다음과 같이 실행된다. N₂제공단계 후에¹⁴C 슈크로스 포집연구를 위한 100㎕ 샘플은 Beckman model Ls 6800 신틸레이션카운터에서 카운터 한다. 유사하게, 원심분리 단계에 이어서 카운터 한다. 200㎖ 샘플은 테이블 탑 원심분리기를 사용하여 3,000xg에서 원심분리시키고, 펠렛과 상층액은 신틸레이션 카운터한다. 또한, Pi는 전과 같이 결정한다.¹⁴C 슈크로스 포집을 측정하고 결과는도면 4a와 같이 그래프로 나타낸다.

CAT 1 EPR 연구는 실시예 13과 같이 실행한다.

도면 4C에서 보는 것과 같이 DPFC IF 리포좀의 내용적은 에탄올 농도에 대한 함수로써, 에탄올 농도가 증가되면 증가하고, 즉 더 높은 에탄올 농도에서는 리포좀의 포집능력이 커진다는 것이다. 3회 원심분리후에 회수된 DPPC %는 도면 4C 에 나타내었다.

실시예 13

슈크로스와 EPR 방법에 의해 측정된 DSPC, DHPC, DOPC, EPC IF 소포의 포집 효과

3.0M 에탄올의 최종농도를 사용하여 지질 DSPC, DHPC, DOPC와 EPC를 이용하여 실시예 12의 방법을 반복한다. 저온배양에 이어서 에탄올 첨가는 DOPC 와 EPC 를 위해 50℃에서 실행되었다. 고온 배양은 모든 시료에서 70℃ 실행되었다.

DSPC의 배양은 70℃, DHPC는 50℃, DOPC와 EFC는 5℃ 에서 둔다.

DOPC와 EPC시료는 원심분리에 의해 세척하고, Amicon^TM30K 마이크로농축장치 (Grace Co.) 여과지를 통해 여과시킨다. 100㎕ 액을 여과물에서 제거하고, 포집 효능분석을 위한 여과 전후에 시료를 취한다.

포집효과는 하기에서 언급하는 것과 같은 실행하기 위해, 슈크로스포집, CAT 1 EPR, TEMPONE EPR 방법에 의해 계산된다.

도면 5 에서 보는 것과 같이, 인터디지테이션된 것으로 공지된 세 개 포스파티딜콜린이 높은 내용적을 가지는 IF 리포좀을 만든다. EPC 와 DOPC는 상대적으로 적은 내용적을 가지고, 상대적으로 작아 테이블 탑 원심분리기(9,000xg)를 사용할 경우에는 펠렛을 만들지 못한다. 따라서, CAT 1 EPR 방법을 사용하여 이들 리포좀의 내용적을 측정할 수 없다.

포집의 측정을 위한 CAT 1 EPR 방법

이 방법은 Perkins et al., 1988, Biochim. Biophys. Acta, 943:103-107 에서 상술하는 것과 같이 외부 용매 용적 방법으로 공지된다. 리포좀 현탁액 총 용적에서 리포좀 현탁액의 총 유적에서 막 침투 스핀 프로브의 농도를 측정하여 계산된 외부 용매용적을 빼면, 리포좀의 내용적이 계산된다. 외부 용매용적은 리포좀 현탁액에 스핀 프로브 4-트리메틸암모늄-2,2,6,6-테트라메틸피페르딘-1-옥실-이오다이드("CAT 1") 공지량을 첨가하여 계산할 수 있다. 리포좀 현탁액을 원심분리하여, 리포좀을 펠렛화 한다. 용매에서 CAT 1 의 농도는 EPR 시그날 대 CAT 농도 계산곡선에서 상층액으로 부터 CAT 1 EPR 시그날의 크기를 비교하여 결정할 수 있다. 상층액에서의 CAT농도는 스핀 프로브에서 이용할 수 있는 용적이 프로브가 리포좀의 내측용적으로 부터 제외되기 때문에 감소하여서 첨가된 CAT 1 의 양에 기초하여 계산된다. 지질 자체로 인하여 샘플 용적에 대해 보정하였다.

과정: 10mM CAT 1, 10mM 트리스 HCl(pH 7.4) 150mM NaCl 을 포함하는 원액을 100, 200, 300, 400μM CAT 1을 포함하는 교정 완충액에 사용된다. 각 원액의 EPR 스펙트럼은 Brucker ER 100D 광도계로 기록한다. 각 스펙트럼의 M_I=+1 공명선의 피크와 피크 사이 높이는 각 농도에서 측정되고 피크 높이대 CAT 1 농도 곡선이 만들어진다.

CAT 1 원액(0.20μM)을 1.00㎖ 리포좀 현탁액(Vt)에 첨가하고, 교반시킨다. 리포좀은 9,000xg 로 테이블 탑 원심분리기에서 원심분리에 의해 펠렛화되고, 상층액 일부는 EPR 모세튜브에 넣고 봉한다. M_I=1 공명선의 피크와 피크의 높이를 측정한다. CAT 1 의 용매농도는 샘플 EPR 시그날 크기와 계산곡선에서 결정한다.

외측 용매 용적 Vo 는 교정곡선에서 얻어진다. 외측 용매 용적 Vo는 M/C 와 동일하고, M 이 첨가된 CAT 1 몰이고 C 는 상층액에서 CAT 1 농도이다. V1 는 지질에 의해 점유된 용적이고 Vi=1.00-Vt-V1 으로 나타내고 이때 V1 은 지질의 용적이다. 샘플의 인산함량으로 나눈 내적 Vi 은 리포좀의 내용적을 나타내는 표준 방식인 μM Pi 당 내용적이 된다.

포집 측정을 위한 MEMPONE EPR 방법

이 방법은 Anzai et al., Biochem. Biophys. Acta 1988, 937:73-80에서 상술된 물질확산된 방법으로 공지되어 있다. 리포좀의 내적은 막침투 EPR 스핀 프로브 확산제의 양을 측정하여 결정한다. 보통 신속한 템블린 수용성 EPR 스핀 프로브는 상대적으로 좁은 스펙트럼선을 가지나 상자성체이온의 첨가로 스핀-스핀 이완시간 (T2)이 감소한다. 확산제가 충분히 높은 농도인 경우 스펙트럼 선모양이 급격히 확산되고, EPR 시그날의 피크와 피크 높이는 급격히 감소된다. 효과에 있어 EPR 확산제는 스핀 프로브에 접근하고 프로브 시그날은 제거된다.

리포좀 현탁액에 막침투 EPR 스핀 프로브 4-옥소-2,2,6-6-테트라메틸피페리딘-1-옥실("TEMPONE")의 첨가로 측정이 실행된다. 두 개 200㎕ 는 각 리포좀 현탁액에서 제거한다. 이중 하나는 200㎕ 완충액으로 희석하고 나머지 하나는 200㎕ 완충액 + 막침투 확장제 포타슘 트리스(옥살레토)크레메이트(III)로 희석한다. 완충액으로 희석된 액에서 EPR 시그날은 총 샘플용적에 비례하고 포타슘 트리스(옥살레토)크로메이트(III)로 희석된 액에서의 EPR 시그날은 리포좀 내측 샘플 용적에 비례한다.

과정: 50mM TEMPONE, 10mM 트리스-HCl(pH 7.4), 150mM NaCl 원액으로 구성된 원액을 준비한다. TEMPONE 원액(10㎕)은 리포좀 0.5㎖ 현탁액에 첨가하고 교반시킨다. 200㎕ 액은 각 시료에서 취하고, 200㎕ 완충액으로 희석시킨다. 또다른 200㎕ 액은 취하고 100mM 포타슘 트리스(옥사레토)크로메이트 (III), 50mM NaCl 용액으로 희석시킨다. 완충액과 크로메이트 용액의 염강도는 1-2% 임을 확인하기 위해 진공압력 삼투계로 미리 체크한다. 샘플은 교반시킨다.

EPR 스펙트라는 Brucker ER 100D 광도계로 기록한다. 시료는 EPR 모세튜브에 넣고 봉한다. 완충액 샘플의 EPR 스펙트럼을 먼저 기록하고, 크로메이트 용액 샘플을 준비하고, 이 샘플의 EPR 스펙트럼을 즉시 기록한다. M_I=1 공명선의 피크 대 피크 높이는 두 개 샘플에서 영향을 받지 않은 스핀프로브의 상대적 농도를 측정하는데 사용된다. 총시료 용적은 광도계 게인세팅(ST)에 의해 나눈 완충액으로 희석된 액의 EPR 시그날에 비례하고, 리포좀의 내적은 게인세팅(SI)으로 나눈 크로메이트용액으로 희석된 액의 EPR 시그날과 비례한다. 내용적(Vi)은 SI/ST x 샘플용적 V 로 주어진다. 샘플의 내용적 Vi 는 리포좀의 내용적으로 표현하기 위한 기준방식인 uM Pi당 내용적을 제공하기 위해 샘플의 인산 함량으로 나눈다.

실시예 14

리포좀 초기 크기에 대한 함수로써 DPPC LUVET-IF 소포의 포집효과

DPPC(422㎎ 분말)은 총 20㎎/㎖ 농도로 실시예 12 의 방법에 따라, 소량¹⁴C 슈크로스, 21㎖ Tris/NaCl 로 수화시킨다. 50-55℃에서 샘플을 혼합하여 DPPC MLVs 가 된다. 총 10회 냉동과 해동과정을 위해 Cullis et al., U.S. Patent No. 4,975,282, issued December 4, 1990 에 따라 FAT MLVs를 준비한다. 생성된 DPPC FATMLVs 는 Cullis et al. PCT Application PCT/US85/01161, Publication Number WO 86/00238 entitled "Extrusion Techniques for Producing Liposomes", published January 16,, 1986 방법에 따라 60-65℃에서 LUVET 기구를 이용하여 10회 압출시킨다. 이때 단일 1.0um 뉴클리포어 포리카보네이트 필터로 이용한다. 2㎖ LUVET 진행된 리포좀을 별도로 둔다.

상기 방법은 2.0㎖ LUVET 샘플이 1.0, 0.2, 0.4, 1.0㎛ 직경이 될 때까지 0.4, 0.2, 0.1㎛ 폴리카보네이트 필터를 이용하여 반복한다.

이 실시예의 목적을 위해 이용될 때 FAT MLV를 압출하지 않고도 사용될 수 있다. SUVs 는 나머지 0.1㎛ 여과된 LUVET를 초음파 분해하여 실시예 12 의 방법에 따라 준비된다.

도면 6 에서 보는 바와 같이 FAT MLVs 이외에 IF 리포좀의 내적은 "시발" 리포좀 즉 에탄올 첨가전의 리포좀의 크기가 작을수록 증가하고; 이 결과는 시발 리포좀의 직경이 IF 리포좀의 최종 용적을 결정하는 중요한 변수임을 나타내는 것이다.

실시예 15

인터디지테이션-융합 소포의 형성

인터디지테이션-융합소포(IFVs)는 DPPC 또는 DSPC 와 같이 인터디지테이션을 하는 인지질 또는 복합 인지질을 이들 인지질로 구성된 작은 단층소포(SUVs)의 인터디지테이션-융합을 유도하여 형성될 수 있다. DPPC SUVs가 인터디지테이션된 쉬트로 융합 및 이 쉬트가 IFVs로의 전환은 각각 광학적 상 대조 현미경과 냉동-분절 전자 현미경에 의해 도면 24와 25에 나타내었다. 광학적 상 대조 현미경은 Wild MPS45 노출미터와 Leitz Laborlux D현미경을 복합사용하여 실시한다. 상을 기록하는 데에는 Kodak GC 134-24 칼라필름을 이용한다. 냉동-분절 전자현미경은 Balzer 구리 서포트판(Nashua, NH) 사이에 0.1 내지 3.0㎕ 샘플액을 끼우고, 그 다음 신속하게 실온의 샘플을 액체 프로판에 담구어서 실행한다. 샘플은 분절되고, 4x10-7mbar 진공에서 -115℃에서 Balzers BAF 400 냉등-분절 유니트에서 모사한다. 모사된 것을 3N 질산에 띄우고, 연속하여 Clorox 용액으로 세척한다. 모사물은 5,000x와 27,000x 확대로 Philips 300 전자현미경에서 관찰하고 사진을 찍을 수 있다.

에탄올을 첨가하면 즉시 DPPC SUVs에서 인터디지테이션된 쉬트가 형성된다. 광학적으로 맑은 SUV 현탁액은 바로 불투명한 매우 점성이 큰 유체로 전환된다. 불투명 현탁액으로 구성된 인터디지테이션된 쉬트는 도면 24a에서 나타낸 바와 같은 수백 미크론의 크기를 가진다. DPPC의 Tm 이상으로 온도를 상승시키면 인터디지테이션된 시트는 신속히 상대적으로 큰 단층소포로 전환된다. 4.0M 에탄올과 20㎎/㎖ 농도에서 만들어진 DPPC IFVs의 평균적 크기분포는 도면 26 에 나타내었다. 리포좀 대부분의 크기가 2 내지 6 미크론 범위로써 상대적으로 균질하다. 도면 26 에서 나타낸 것과 같이, 데이터를 얻기 위해 DPPC IFV 준비물의 평균 내용적은 20.2+/-0.2㎕/㎛이 되고, DPPC 44.3+/-12.5 로 나타낸 NMR로 단층형성능을 측정은 리포좀 외층에서 한다. 통계학적으로, 단층성은 1.13+/-0.32 이다. 따라서, DPPC IFVs는 주로 단층이다.

DPPC IFVs의 내용적에서, 에탄올 농도, 전구체 소포직경, 지질농도등을 다양하게 하였을 때 효과를 도 27 에 나타내었다. 도면 27a 에서는 DPPC SUVs로 부터 인터디지테이션된 쉬트를 생산하는데 사용되는 에탄올 농도를 다양하게 하였을 때 효과를 나타낸다. 내용적은 전술한 것과 같이 EPR 스핀 프로브 CAT-1 을 이용하여 측정한다. 3.0M 및 그 이상의 에탄올 농도에서 DPPC IFVs 는 원심분리에 의해 용매로 부터 분리된다. 2.0M 및 그 이하의 에탄올 농도에서 리포좀은 Whatman 0.02 미크론 Anotop 25필터(Whatman, Inc,, Clifton, NJ)을 통하여 여과에 의해 용매로부터 분리된다. 양이온 스핀 프로브 CAT-1가 여기에 결합하지 않기 때문에 여과를 선택한 것이다.

에탄올 농도를 2.0M에서 4.0M로 증가시키면, DPPC IFVs의 내적이 비례하게 증가된다. 2.0M 에탄올에서 형성된 DPPC IFVs와 4.0M 에탄올에서 형성된 것을 비교하면 입자의 평균 직경에서는 큰 차이가 없었다. 관찰된 내용적이 증가되는 것은 리포좀의 모양이 상이한 것에 기인한 것으로 보인다. IFVs는 5.0M 이상의 에탄올 농도에서는 효과적으로 형성되지 않는다.

도면 27b에서는 인터디지테이션-융합과정이 전구체 DPPC 리포좀의 직경에 따라 어떻게 달라지느냐를 나타낸다. 도면에서 요약된 결과를 보면 에탄올 농도는 4.0M에서 실시하고 이는 DPPC SUVs 로 높은 내용적을 얻기위한 적정 농도에 가까운 것이다. 전구체 DPPC LUVETs 의 직경은 Malvern 3600 E 레이져 분절 입자크기 측정기(Malvern Instruments, Malvern, England)를 사용하여, 콰시-전자 광분사에 의해 결정한다. 측정은 매우 희석된 시료에서 실온으로 실시된다. 하중을 가진 입자 크기 분포는 기계실에서 레이져 회절 패턴에 의해 계산된다. 100nm 이하의 전구체 입자는 최대 내적을 가지는 전구체 소포를 만든다. 전구체 소포의 직경이 150nm 이하가 아닌 경우 큰 IFVs는 관찰되지 않는다. 소포 200nm 또는 그 이상의 크기는 전구체 리포좀으로는 효과가 없다.

4.0M 에탄올에서 형성된 IFVs의 내적에서 초기 DPPC SUV 농도의 효과는 도면 27c에 나타내었다. 지적한 것과 같이 인터디지테이션된 쉬트 현탁액에서 지질 농도가 감소될 때 내적은 10mg/㎖이상으로 증가된다. 지질 농도가 더 높을 경우에, 소포는 내의 수용성 용적비를 제한함에 따라 조밀하게 쌓을 수 있을 것으로 기대된다. 패킹 문제는 고농도 지질에서 형성된 DPPC IFVs 에 대해 라멜라 형성을 상당히 증가시키게 된다. 20㎎/㎖ 에서 형성된 DPPC IFVs 의 값 1.1과 비교할 때 100㎎/㎖에서 형성된 DPPC IFVs 의 통계적 라멜라성은 2.9 이 된다.

DPPC에 대해 최적화시키면 변수를 사용하여, 다양한 포화인지질(DMPC, DHPC, DSPC), DAPC(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL))을 이용하여, IFVs를 만든다. 일반적으로 지질농도 20㎎/㎖ 을 이용하여 4㎖ 배치에서 IFVs를 만든다. 두 개 지질을 가지는 샘플을 30mM 총지질에서 준비된다. 신틸레이션 바이알 또는 캡이 있는 튜브에서 소포를 만든다. 바람직한 인지질 SUV 현탁액을 용기로 옮긴다. DPPC, DSPC, DHPC, DAPC 샘플은 실온에서 균질화 시키고, DMPC, DOPC, EPC 샘플은 4℃ 내지 6℃에서 냉각시킨다. 순수 에탄올 등온 용적을 샘플에 첨가하는데 이때, 에탄올의 최종농도가 4.0M이 된다. 샘플은 즉시 교반시킨다. 이 과정에 의해 투명한 SUV현탁액은 점성이 매우 큰 불투명 흰 현탁액의 인지질 쉬트로 신속히 전환된다. 인터디지테이션을 유도하는데 사용된 최종 에탄올 농도가 1.5M 이하일때, 에탄올 첨가 단계를 수정할 수 있다. 가령, 40㎎/㎖ 에서 SUV 등용적과 바람직한 최종 에탄올 농도의 2배 농도에서 완충액/에탄올 용액을 혼합한다. 이 과정은 완전히 혼합하기 전에 SUV 샘플에서 국소적으로 고농도 에탄올을 가지는 것을 피하기 위함이다. 이 효과는 저농도 에탄올에서 인공적으로 고용적을 혼합하게 한다. 미리 희석된 에탄올을 첨가하는 것과 에탄올을 바로 첨가하는 경우에 2.0M 에탄올 농도에서 형성된 DPPC IFVs의 내적은 별 차이가 없었다.

에탄올 첨가 뒤에, 샘플은 봉하고, 4-6℃에서 배양되는 DMPC, DOPC, EPC 샘플을 제외하고 실온에서 15분간 배양시켰다. 샘플의 뚜껑을 푼 상태에서, 샘플은 추가로 30분간 Tm 보다 높은 동일한 온도에서 배양시킨다. DMPC, DOPC, EPC 샘플은 40-45℃에서 배양시켰다. DPPC 와 DHPC 샘플은 50-55℃에서 배양시키고, DSPC 와DAPC 샘플은 70-75℃에서 배양시킨다. 에탄올은 두-단계 과정에 의해 제거되는데, 지질의 Tm 이상에서 샘플을 통하여 부드럽게 질소 흐름을 발생시켜 샘플에 분무하고, 샘플은 15분간 Sorvall SA-600 로터를 사용하여 Sorvall RE5B 원심분리기 (DuPont Instruments, Wilmington, DE)을 이용한 120,000g 원심분리에 의해 실온에서 3회 세척한다. 이로써 IFVs를 신속히 펠렛시키게 된다. 3.0-4.0M 에탄올이 인터디지테이션-융합 쉬트를 만드는데 사용할 때 초기 인지질의 90-100%가 일반적으로 IFV 펠렛에서 회수된다. IFV 펠렛을 20㎎/㎖ 농도의 NaCl/트리스 완충액에서 연속적으로 현탁하고, 실온에서 저장한다. 변형된 바트레트 검사를 이용하여 IFV 인지질 농도를 측정한다(Bartlett, J. Biol. Chem. 234: 466(1959)).

동일한 과정을 이용하여, 두 개 인지질로부터 IFVs를 준비한다. 에탄올을 혼합물의 Tm 이하에서 첨가한다: 혼합물의 Tm 이상에서 고온 배양을 실행한다.

4.0M 에탄올에서 1:1 몰비 DPPC/Chol SUVs는 4.0M 에탄올에서 DPPC 인터디지테이션된 쉬트에 첨가하여 DPPC IFV로 콜레스테롤을 결합시킨다. 기존 과정에 따라 4.0M 에탄올을 사용하여 30mM 농도의 DPPC SUVs로부터 인터디지테이션된 DPPC 쉬트를 준비된다. 4.0M 에탄올에 있는 DPPC/Chol SUVs를 실온에서 인터디지테이션된 쉬트에 혼합하여 최종 지질 농도가 30mM 인 소요의 Chol:DPPC 몰비를 가질 수 있다. 그 다음 혼합물을 50-55℃에서 45분간 배양하고, 5분동안 지질 Tm 이상에서 질소 분무하여 에탄올을 제거한다. 생성물 DPPC/Chol IFVs의 크기는 콜레스테롤 농도가 증가함에 따라 감소하기 때문에, 원심분리/세척단계는 생략한다. 콘트롤 실험에서는 이 단계를 생략해도 최종 소포 내용적에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.

도면 28 에서는 DMPC, DPPC, DHPC, DSPC, DAPC SUVs 에서 생성된 IFVs 의 내용적을 나타낸다. 에탄올 유도된 인터디지테이션-융합을 하지 않는 즉 EPC, DOPC 와 같은 인지질에서 형성된 소포의 내용적은 1ul/uM Pi 이하이다.

인터디지테이션-융합 기술은 에탄올에 의해 유도된 인터디지테이션 융합을 하는 두 개 이상의 인지질로 구성된 SUVs에 이용될 때 매우 효과적이다. 가령, 3.0M 에탄올을 사용하여, DSPC/DPPC 또는 DPPC/DPPG SUVs로부터 형성된 IFVs의 내적은 13.7+/-0.7 와 16.7+/-1.7 이다. DSPC/DPPC SUVs 의 DSPC 몰 부분은 0, 0.20, 0.50, 0.67, 0.80, 1.00 이고 DPPG 몰 부분은 0, 0.7, 0.50, 0.67, 0.83, 1.00 이다. 전구체 SUVs(즉, 콜레스테롤 또는 DOPC)에 인터디지테이션 안 되는 지질을 첨가하면 인터디지테이션된 쉬트가 만들어지지 않는다. 이는 콜레스테롤이 이중 층 인터디지테이션 형성을 저해한다는 것을 발견한 Komatsu 와 Rowe (Biochem. 30:2463 (1991)와 일치한다. 그러나 인터디지테이션 안 되는 형성 지질을 포함하는 SUVs는 에탄올 다음에 첨가되면 인터디지테이션이 유도되고, 온도를 Tm 이상으로 상승하는 경우에(도면 29), 혼합형 지질 IFV 에서 두 성분이 융합된다.

콜레스테롤 함량을 증가시키면 DPPC/Chol SUVs으로 부터 형성된 IFVs 의 내적은 급격히 감소된다. 20몰% 콜레스테롤에서 생성된 IFVs 의 내적은 4ul/uM Pi 이하이다. 대조적으로, DPPC 인터디지테이션 쉬트 형성뒤에 콜레스테롤 첨가하면 주어진 콜레스테롤 몰당 IFVs의 내적이 상당히 증가된다. 콜레스테롤은 4.0M 에탄올에서 1:1 비의 DPPC/Chol SUVs에 첨가된다. 이들 방법에 의해 준비된 35몰% DPPC/Chol IFVs 의 분별 스캐닝 칼로리메트리에서는 41℃ 에서 DPPC 겔-지질 결정상전이가 두 샘플에서 제거됨을 보여준다. 이는 DPPC 인터디지테이션된 쉬트 형성 후에 첨가되는 콜레스테롤은 생성물 DPPC/Chol IFVs에 결합되는 것을 말하는 것이다.

실시예 16

DPPG 가 DPPC IF 리포좀을 결합

실시예 12을 다음과 같이 변형시켜, DPPC/디팔미토일 포스파티딜글리세롤 (DPPG) SUVs에서 IF 리포좀을 만든다. 총 30mM 인지질(DPPC 와 DPPG)을 이용하고, 클로로포름에서 0.17몰(17몰%) DPPC, DPPC, DPPG를 밑둥근 플라스크(50㎖ 용량)에 넣고 잘 혼합시킨다. 네가티브 압력하에 플라스크에서 지질은 박막으로 건조시키고, 생성된 막은 2.0㎖ 트리스/NaCl 완충액으로 수화시키고, 50-55℃ 온도로 가열시킨다. 총 3.0M 에탄올 농도가 이용된다. 소량의¹⁴C 슈크로스를 샘플에 넣고 현탁액은 맑아질 때까지 초음파분해시킨다. 에탄올을 제거하고 혼합물을 50-55℃ 에서 배양시킬 때 IF 리포좀이 형성된다.

리포좀의 내적은 실시예 13의 방법에 따라¹⁴C 슈크로스 포집과 TEMPONE EPR 방법에 의해 계산된다.

상기 방법을 1.0, 0.83, 0.60, 0.50, 0.00 몰비(100, 83, 66, 50, 0 몰%) DPPG로 반복한다. 결과는 도면 7a와 b에서 나타내었다.

DPPG가 더 많은 경우에 IF 리포좀은 음전하를 띈 리포좀으로 인해 세척단계동안에 펠렛은 잘 형성되지 않기 때문에 회수율이 낮다. 펠렛에서 회수된 IF 리포좀의 내적은 도면 7a에 나타낸다. ○는¹⁴C 포집에 의해 측정된 용적이고; ●은 확장제(TEMPONE) EPR 기술에 의해 측정된 용적이다. 도면 7b 는 Pi의 회수율(●)과 DPPG 에 대한 함수로써¹⁴C 라벨된 슈크로스(○)를 나타낸다.

실시예 17

DPPC 초기 농도에 대한 함수로써 포집된 용적과 포집

실시예 12의 재료와 방법으로 20㎎/㎖ 에서 DPPC IF 리포좀 2.00㎖을 만든다.

2.5, 5.0, 10.0, 40.0, 80.0㎎/㎖ DPPC을 이용하여 상기 방법을 반복실행하여 2.00㎖ DPPC IF 리포좀이 5개가 되고 이때 DPPC 농도는 다음과 같다. 2.0, 10.0, 20.0, 80.0, 160㎎.

실시예 13의 방법에 따라 각 샘플 초기 용적과¹⁴C 슈크로스 포집을 계산한다.

결과는 도면 8a와 b에서 그래프로 나타낸다. 도면 8a에서는 초기 DPPC 지질농도에서 슈크로스 포집이 증가함을 설명한다. 도면 8b에서는¹⁴C 슈크로스 방법(□) 또는 EPR 방법(◇)에 의해 측정된 DPPC IF 리포좀의 내적을 나타낸다. DPPC의 초기 농도가 1 내지 20mg/㎖ 일 때, IF 리포좀의 내적은 15 내지 2Oul/uM Pi 이다. Malvern 입자 크기 측정기로 측정할 때, 이들 리포좀(10㎎/㎖ 와 20㎎/㎖ 지질을 포함)의 평균 직경은 7.0-7.5㎛이다(도면 9a 와 9b). 이는 IF 방법에 의해 형성된DPPC 리포좀의 초기용적은 통상의 MLVs 보다 큰 것을 나타낸다.

실시예 18

DPPC IF 리포좀 형성에 콜레스테를 효과

실시예 12의 재료와 과정에 따라 총 3.0M 에탄올을 이용하여 총 30mM 지질에서 DPPC와 콜레스테롤을 이용하여 IF 리포좀을 만든다. 20㎎/㎖ 농도에서 클로로포름 원액에서 제공된 콜레스테롤과 DPPC를 95% DPPC와 5% 콜레스테롤로 50㎖ 용량 밑둥근 플라스크에서 혼합시킨다. 지질은 플라스크 표면에서 박막으로 건조되고 전과 같이 Tris/NaCl로 수화시킨다. 배양 온도는 50-55℃이다.

IF 과정 진행 전후에 몇 방울을 빼내어 콜레스테롤 검사를 하여, 리포좀에 콜레스테롤이 포집되었는지를 확인하고,¹⁴C 슈크로스 포집에 대해서도 검사한다.

상기 방법은 롤레스테롤의 0.00, 0.02, 0.10, 0.15, 30.0 몰비(0, 2.0, 10, 15 와 30몰%)를 이용하여 반복한다.

리포좀의 내용적은¹⁴C 슈크로스 포집과 CAT 1 EPR 와 TEMPONE EPR 방법에 의해 결정한다. IF 리포좀의 콜레스테롤 함량은 Rudel and Morris, 1973, J. Lipid Res., 14:14 방법에 따라 o-프탈알데히드를 이용하여 측정한다.

도면 10a 와 b 에 결과를 나타낸다. 도면 10a 에서는 IF 리포좀(0)와¹⁴C 슈크로스 포집된 최종%(0)의 "최종" 콜레스테롤 농도를 나타낸다. 콜레스테롤 함량이 증가될 때 포집된 슈크로스 양은 감소한다.

도면 10b 는 콜레스테롤 함량에 대한 함수로써 DPPC-롤레스테롤 리포좀의 내적이 감소함을 나타낸다. Cat 1 EPR 와 TEMPONE EPR 방법(▲/●)에서의 데이터가 각각 일치할 때¹⁴C-슈크로스 검사의 데이터는 내적이 상당히 높다. 이론에 한정되지 않고,¹⁴C 슈크로스는 더 큰 내적을 제공하는 리포좀에 결합되는 것으로 나타났다.

이 연구와 도면 10a와 b는 IF 리포좀 크기가 콜레스테롤 함량이 증가할수록 급격히 감소되고, 결과는 Malvern 입자 크기 결과에 의해 서포트되고 0% 콜레스테롤을 포함하는 IF 리포좀의 평균 직경이 7.66㎛ 이고, 30% 콜레스테롤 IF 리포좀은 3.99㎛ 이다.

실시예 19

DPPC IF 리포좀 형성에 디올레일포스파티딜콜린 (DPPC) 효과

실시예 12 의 재료와 방법에 따라 DPPC와 DOPC, 불포화지질을 30mM 농도로, 총 3.0M 에탄올을 사용하여 IF 리포좀을 만든다. 초기 리포좀은 DPPC와 DOPC에서 형성되고, 이는 2.0mole DOPC 와 밑둥근 플라스크에서 혼합하여 20㎎/㎖ 농도의 원액 클로로포름에 제공한다. 지질은 회전 기화를 통하여 플라스크의 표면에서 박막으로 건조시키고, 전과 같이 Tris/NaCl 로 수화시킨다. 배양 온도는 50-55℃이다.

DOPC 의 0.00, 0.11, 0.55, 0.72, 1.00 몰비(0, 11, 55, 72 와 100 몰%)를 이용하여 상기 방법을 반복한다.

IF 리포좀의 내적은¹⁴C 슈크로스 포집방법과 TEMPONE EPR 방법에 의해 측정하고 이 결과는 도면 11A 에 그래프로 나타낸다.

그래프에서 보는 것과 같이, DOPC 양을 증가시키면 IF 리포좀 크기가 감소된다. DOPC 가 10%로 적다 해도 50% 이상의 리포좀 용적이 감소된다. 0.4몰%(40몰%) 이상에서는 DOPC 에탄올-지질 겔은 형성되지 않고, SUVs 는 융합되지 않는다. 0.6 와 0.8몰% DOPC에서, 리포좀의 내적은 SUVs 범위에서 각 0.2 와 0.24ul/uM Pi 이다. 또한, 원심분리에 의해 회수되는 지질%는 0.4몰% DOPC 이상에서 감소된다(도면 11B).

실시예 20

DSPC IF 리포좀에서 방사대비제 이오베르졸의 포집

DSPC(200㎎ 냉동건조된 분말)을 5.0㎖ 증류수에 현탁시키고 투명한 SUV 현탁액으로 초음파 분해시킨다(시간은 약 20분이다). SUV 현탁액은 티타늄 잔기를 펠렛시키기 위해 10,000xg 에서 10분간 원심분리시키고 SUVs는 버린다. 이오베르졸 (Optiray 320R, Mallinckrodt)(11.5mg), 4.1㎖ 에탄올 1.7㎖ 증류수를 혼합시키고, 이 혼합물 3.3㎖을 세 개의 15㎖ 용량 CorexR 튜브로 피펫시킨다. SUV 현탁액(1.1㎖)을 각 튜브에 첨가한다. 튜브에 뚜껑을 eke고, 교반시켜 투명한 겔을 만든다.

튜브는 실온에서 1시간 두고, 뚜껑을 벗기고 간헐적인 수직교반으로 1시간 동안 욕조에 70℃로 배양시킨다. 배양후에 튜브는 8분동안 혼합물에 N₂기포를 제공한다. 실온으로 냉각 후에 완충액(30mM 트리스, 150mM NaCl, 0.6mM Na₂EDTA, pH 6.7)을 각 튜브에 넣고 혼합한다. 포집 안된 이오베르졸은 3회 반복하는 원심분리 세척(3분 5,000xg)로 제거한다.

IF 리포좀에 포집된 생성된 이오베르졸은 245nm에서 분광광도 흡수 및 에탄올에 이오베르졸의 표준곡선에 대해 회귀시켜 분석한다. 지질 농도는 Chem 방법에 의해 결정된다. 포집 결과는 표 6에 나타낸다.

표 6

IF 리포좀은 Malvern 입자크기 분석에 의해 평균 직경이 4.0-5.0㎛이다.

실시예 21

DSPC IF 리포좀에서 방사능 대조제 이옥소글레이트의 포집

실시예 20 의 재료와 방법을 이용하여, IF 리포좀의 상 대조제 이옥소글레이트(HexabrixR, Mallinckrodt)를 포집시킨다. 포집은 실시예 20 의 방법에 따라 실시하고 결과는 하기 표 7 에 나타낸다.

표 7

실시예 22

DSPC IF 리포좀에서 방사능 대조제 이오파미돌의 포집

실시예 20 의 재료와 방법을 이용하여, IF 리포좀의 상대조제 이옥소글레이트(HexabrixR, Mallinckrodt)를 포집시킨다. 포집은 실시예 20 의 방법에 따라 실시하고 결과는 하기 표 8 에 나타낸다.

표 8

실시예 23

IF 리포좀의 내용적에 배양시간의 영향

실시예 12 의 과정과 재료를 이용하고, 20㎎/㎖ DPPC와 에탄올 농도는 3.0M 이고, Tm 전후에서 겔 배양시간은 다양하게 하였다. 배양기간은 5분으로 고정할 때 생성된 IF 리포좀의 내적은¹⁴C 슈크로스 포집방법(□)와 CAT 1 EPR(■)와 TEMPONE EPR 방법(◆)에 의해 측정한다. 측정 결과는 도면 12 에 막대그래프로 설명한다.

상기 방법은 배양시간을 30분, 1시간, 두시간으로 하여 반복한다. 유사하게 내적 측정 후 비교한다.

도면 12 에서 보는 것과 같이, 5분과 2시간 사이의 배양시간에 대해서는 IF 리포좀 내적에 큰 차이가 없었다.

실시예 24

IF 리포좀의 내용적에 대해 배양과정 변화의 효과

실시예 12 의 재료와 과정을 반복하는데, 이때 배양시간을 다양하게하고, DPPC SUVs는 Tm 이상의(즉 50-55℃) 온도가 아닌 실온에서만 배양시켰다. 생성 IF 리포좀의 내적은¹⁴C 슈크로스 포집방법(□), CAT 1 EPR(■) 와 TEMPONE EPR 방법(■)에 의해 결정하고, 결과는 도면 12 의 "RT"로써 막대그래프로 나타낸다.

상기 과정을 실온 배양없이 반복하고, 이때 에탄올이 첨가되고, 배양은 DPPC Tm(50-55℃) 이상의 온도에서 실행한다. 이 배양방법에 의해 생성된 리포좀은 펠렛이 되지 않기 때문에 리포좀은 6배의 10㎖ 트리스/NaCl 완충액으로 DPPC 샘플을 희석하여 세척하고 4.0㎖ 샘플을 취하여 이 샘플을 30,000xg Beckman J-2 원심분리기에서 1시간 교반하여 Amicon^TM30K microconcentrator (Grace Co. )로 농축시킨다. 보유된 샘플 용적은 동과정을 통하여 다시 농축시킨다. 샘플의 결과는 "50℃"로 라벨시킨다.

도면 12 에 따르면 큰 IF 리포좀 형성시에 두 가지 배양과정이 요구되는 것으로 보인다.

실시예 25

IF 리포좀과 MLVs 의 내적 비교

DPPC(80㎎, 분말)(Avanti Polar Lipids)을 실시예 12 의 과정에 따라 2.00㎖ Tris/NaCl 완충액에 첨가한다. DPPC 현탁액은 실시예 12 와 같이 맑아질 때까지 초음파 분해시킨다. IF 리포좀을 형성하는데에 최종 농도는 3.0M 에탄올(0.43㎖ 에탄올 첨가)을 이용한다. 샘플은 실시예 12 와 같이 원심분리에 의해 세척하고, 내적은 실시예 13 에서 상술하는 CAT 1 EFR 방법에 의해 2회 결정한다. 결과는 표 9 에 나타낸다.

II

I 의 방법을 80㎎ DPPC/2.00㎖ Tris/NaCl 완충액을 이용하여 반복시키고,MLVs를 생산하기 위해 50-55℃에서 교반시킨다. 그러나 MLVs를 초음파 분해시키지 않고, 에탄올을 첨가하지도 않는다.

40㎎ DPPC 를 이용하여 동일한 방법을 반복한다. 샘플은 실시예 12와 같이 배양하고 세척한다. 내적은 실시예 13에서 상술한 CAT 1 EPR 방법에 의해 2회 측정하고, 결과는 표 9 에 나타내었다.

III

II 의 방법을 첨가될 에탄올은 최종농도가 3.0M 이 되도록 0.43㎖ 에탄올을 첨가항여 반복한다. 샘플은 실시예 12 와 같이 배양하고, 원심분리에 의해 세척하고, 내적은 실시예 13 에서 상술한 CAT 1 EPR 방법에 의해 2회 측정하고 결과는 표 9 에 나타내었다.

표 9에 따르면, 상대적으로 고농도 에탄올에 노출된 MLVs 또는 통상의 MLVs를 비교하였을 때, IF 리포좀이 상대적으로 큰 내적을 가지는 것을 알 수 있다.

표 9

실시예 26

이오트롤란-DSPC IF 리포좀

실시예 7 의 재료와 과정에 따라 이오트롤란을 포함하는 IF 리포좀을 만든다.

실시예 27

DSPC IF 리포좀에서 방선선대조제 이오프라미드의 포집

실시예 22 의 과정과 재료로 이오프로미드를 포함하는 IF 리포좀을 만든다.

실시예 28

압력에 의해 유도된 인터디지테이션 융합 리포좀

인터디지테이션 융합 리포좀은 융합을 유도하기 위해 유체역학적 압력을 이용한다. 여기에서 압력에 의해 유도된 융합 리포좀 또는 "PIFs"로 칭한다. 작은 리포좀은 맑아질 때까지 20㎎/㎖ DPPC MLVs 또는 DSPC MLVs 를 프로브 초음파 분해하여 만든 것이다. 생성된 작은 단층 소포(USVs)는 프로브 소니케이트에서 유입되는 티타늄 먼지를 제거하기 위해 5분간 3000g에서 원심분리한다. 2-3㎖ SUVs 는 고압반응실내에 유체압력유체내에 침착된 테플론 폴리테트라플로로에틸렌 샘플 홀더내에 둔다. 샘플을 넣기 전에 반응실의 온도는 바람직한 값으로 유도한다. 반응실의 온도를 다양하게 하기 위해 욕조에서 물이 순환할 수 있도록 연성 튜브로 감는다. 일단 챔버내에 샘플을 넣으면 닫고, 유압체는 샘플에 압력을 가하기 위해 펌프시킨다. 압력을 감소시킨 15분간 압력하에 유지시키고, 샘플을 제거한다. Teflon 홀더에 있는 샘플은 유리 바이알로 이동시키고, 소포구조를 만들기 위해 50℃(DPPC) 또는 70℃(DSPC)로 가열한다. 리포좀(PIFs)은 냉각시키고, Perkins, ei al. (1988) Biochim Biophys Acta 943: 103-107 에서 상술된 기술을 이용하여 포집된 용적을 측정한다.

결과는 DPPC 테스트(도면 13), DSPC 테스트(도면 14)로 그래프로 나타낸다. DPPC의 경우, 도면 13과 같이 지질의 상전이온도(DPPC의 경우-41℃) 이하로 압력이 가해진 샘플의 외관은 겔과 같은데 이는 - 상전이 온도이하에서 에탄올 첨가로 인한 것이다. 41℃로 가열한 후, 이들 시료의 점성 특징은 사라진다. 도면 14 에서 나타낸 것과 같이, DSPC의 경우에서, 샘플을 지질의 상전이온도(54℃-DSPC) 이하로 감압시키면 샘플의 외관은 겔과 같다. 70℃로 가열시킨 후에 이들 샘플의 점성은 사라진다. 두 경우에서 가열시키면 인터디지테이션된 쉬트에서 리포좀으로 전환하게 된다.

실시예 29

고압 멸균

무성생식 박테리아, 특히 바실러스 종은 고온과 고압을 포함한 다양한 극단 환경에서 상당히 저항성이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 박테리아 포자를 비활성 시키는데는 1000MPa 이상의 압력이 요구되는 것으로 알려져 있다(Larson, et al.: The Effect of High Pressure on Bacteria, J. Infectious Diseases, 22, 271-279 (1918). 따라서, 바실러스 서브틸리스 ATCC 6633 의 포자 현탁액은 혈액 한천(Remel)에 도말하고, 모든 멸균 연구에서 종자배양으로 이용된다. 한천으로 부터 콜로니는 트립티카스 콩 브로스(Remel)를 이용하여 초기 정지단계까지 배양시킨다. 이들 배양물에는 ㎖당 7.7x10 생존 균을 포함한다.

고압을 받게 되는 배양물은 뚜껑이 있는 Teflon 폴리테트라 플로로에틸렌 튜브에 넣고 고압반응실에 둔다. 반응기에서 압력을 소요 지점까지 증가시키고(HighPressure Equip. Co.,, PS 150 pumping system), 압력에서 시간은 모니터 한다. 배양 종료시에, 샘플은 혈액 한천에 도말하고, 15시간 성장 후에 보이는 콜로니를 헤아린다.

도면 15, 16, 17에서는 40℃, 50℃, 60℃에서 B. 서브틸리스(B. subtilis)를 고압효과를 나타낸다. 각 데이터 시점은 적어도 3 내지 9 별도 결정을 나타낸다. 이 점을 표시하는데 사용하는 심볼보다 적기 때문에 에러 바는 나타나지 않는다. 멸균은 혈액 한천에서 생장되지 않는 것을 말한다. 그래프에서 0에서 나타나는 두 지점은 확실하게 멸균되기 위해 요구되는 시간을 나타낸다. 40℃에서, 80,000psi 에서 90분 후에 멸균이 된다. 이 시간은 50℃에서는 30분으로 감소된다. 비록 엄격히 로그 0를 정의하지 않았으나 log 0는 0으로 나타낸다.

지질의 존재가 박테리아에서 어떠한 보호적인 효과를 제공하지 않는다는 것과 박테리아가 있어 인터디지테이션 상 형성에 영향을 주지 않는 것을 확인하기 위해, DPPC SUVs 샘플에 100,000 살아있는 박테리아를 혼합시킨다. 효과적으로 멸균시키고, 생성된 PIF 리포좀의 포집용적은 박테리아 존재에 의해 영향을 받지 않는다. 따라서, 이 결과는 리포좀 장치를 멸균하는데 고압을 사용할 수도 있음을 나타낸다.

추가 테스트를 실시하여, 압력에 의해 유도된 융합 소포보다 리포좀 산물을 멸균시키기 위해 사용될 수 있는 것을 설명한다. 젠타마이신을 포함하는 다층 난 포스파티딜콜린(EPC) 리포좀을 Lenk et al., U.S. Patent No. 4,522,803 에서 제시한 방법에 따라 만든다. 이 물질의 샘플은 50℃에서 60분간 90,000psi 압력을 받게한다. 이 샘플과 처리 안된 콘트롤 샘플을 원심분리하여 결합된 젠타마이신에서 분리시킨다. 상층액에서 자유 젠타마이신을 측정하고 리포좀은 재현탁시키고, 리포좀에 연합된 젠타마이신에 대해 검사한다. 압력을 가하지 않은 콘트롤 샘플에는 리포좀에 연합 안된 젠타마이신이 0.723㎎/㎖ 그리고 리포좀에 연합된 젠타마이신이 6.687㎎/㎖ 된다. 데이터는 이와 같은 압력과 온도 조건은 EPC 리포좀과 젠타마이신 관계에 나쁜 효과를 가지지 않음을 나타낸다.

실시예 30

지용성 분자가 인터디지테이션-융합 리포좀내로 Post-gel 결합

인터디지테이션 융합(IF) 기술은 단일 지질 성분 시스템보다는 2개 이상의 지질성분으로 구성된 SUVs에 제공될 수 있다. SUVs에 두 개 지질이 에탄올에 의해 유도된 인터디지테이션이 된다면, IF 기술은 더 큰 리포좀을 생산하는데 효과가 있을 것이다. 가령, 두 지질 성분이 에탄올-유도된 인터디지테이션을 할 수 있는 온도인 경우 DPPC/DMPC SUVs 또는 DPPC/DPPG SUVs에서 거대 인터디지테이션-융합소포 (IFVs)가 만들어질 수 있다.

도면 18 에서는 DPPC/DPPG SUV에서 내적을 나타낸다. 도면에서 보는 것과 같이, DPPC/DPPG SUVs에서 형성된 IFVs의 내적은 DPPG의 몰비가 증가할 때, 큰 변화가 없없다. 실시예 1에서 상술한 것과 같은 IF 기술은 이와같은 IFVs를 형성하는데 사용하고, 각 실험에서 총 지질농도는 30mM이다. 에탄올에 의해 유도된 DPPC/DPPG 겔 상태는 실온에서 형성된다. 생성물 IFVs 의 내적은¹⁴C 슈크로스 포집과 EPR 프로브 TEMPONE으로 측정할 수 있다.

DPPC/DPPG SUV 실험과는 대조적으로, DPPC SUVs에 DOPC 또는 콜레스테롤과 같은 인터디지테이션 안 되는 지질의 첨가시키는 큰 IFVs가 만들어지는 것을 방해한다. DPPC/DOPC와 DPPC/콜레스테롤 SUVs에서 형성된 IFVs의 내적은 도면 20 에서 DOPC 또는 콜레스테롤의 몰비에 대한 함수로써 나타낸다. 생성 리포좀의 내적은 EPR 프로브 TEMPONE을 사용하여 측정한다. DPPC/DOPC SUVs에서 DOPC 함량이 10몰%에 다다를 때 생성 리포좀의 내적은 악 50% 감소된다. IFV 형성에 요구되는 인터디지테이션된 막 쉬트를 형성하기 위해 융합되지는 50몰% DOPC이상인 SUVs는 않는다. 콜레스테롤은 IF 기술을 방해하는데 특히 효과적이다. DPPC/콜레스테롤 SUVs가 2 내지 5몰% 콜레스테롤을 포함할 때 조차도 IFV 내적은 상당히 감소된다.

따라서, 인터디지테이션 융합전에 SUVs에 인터디지테이션 안 되는 지질이 포함될 때 높은 내적 리포좀을 생산하기 위한 IF 기술 효과가 상당히 감소된다. DOPC와 콜레스테롤과 같은 인터디지테이션 안 되는 지질은 SUV 융합 및 인터디지테이션된 막 쉬트를 유도하는데 요구되는 에탄올에 의해 유도된 이중층 인터디지테이션을 저해한다. 이 효과는 인터디지테이션 되지 않는 지질을 가지는 거대 IFVs 를 만드는 문제점을 제시한다.

그러나, 본 발명에 따르면, 기본적인 IF 기술을 효과적으로 수정하여 인터디지테이션 안 되는 지질을 IFVs로 유도한다. 이와 같은 IF 수정 기술은 에탄올에 의해 유도된 인터디지테이션된 막 쉬트 또는 "겔" 상태가 형성된 후에 인터디지테이션 안 되는 지질을 첨가하는 것으로 구성된다. 일반적으로 인터디지테이션 안 되는지질을 포함하는 SUVs는 에탄올/인지질 겔에 혼합시키고, 온도를 Tm 이상으로 상승시킨다. 인터디지테이션 안 되는 지질을 포함하는 SUVs 와 인지질 쉬트가 융합하게 된다. 이와 같은 IF 기술 수정이 "Post-gel" 결합이라 하는데, 이유는 여분지질이 에탄올/인지질"겔" 상태가 형성된 후에 첨가되기 때문이다.

또한, "Post-gel" 결합기술은 IF 과정과 통상적으로 간섭하는 어떠한 물질이 IF 소포에 결합시키는데 사용된다. 즉, 생활성물질과 같이 IF 소포내로 결합될 수 있는 특정물질이 IF 과정을 간섭할 수 경우에 유용하고 그렇지 않는 경우에는 유용하지 않다. 현재 "Post-gel" 결합 공정은 이와 같은 인터디지테이션-융합 간섭물질이 IF 소포로 결합되는 것을 허용한다. 이 과정은 특히 지용성인 소수성 또는 양수성 물질에 특히 적합하다. IF 소포로 결합될 수 있는 생활성 물질은 이 명세서에서 상술하고 있다.

DMPC가 비록 포화된 인지질인 경우에, 실온에서 DMPC SUVs가 DPPC IFVs의 결합은 "Post-gel" 지질 결합의 좋은 예가 된다. DMPC의 Tm이 23℃이기 때문에, 에탄올은 실온에서 DMPC 이중층에서 인터디지테이션을 유도하지 않는다. 에탄올이 실온에서 DPPC/DMPC SUVs에 첨가될 때 DMPC는 거대 IFVs 형성을 저해시킨다. 그러나, 에탄올이 5℃에서 DPPC/DMPC에 첨가될때, 거대 IFVs가 형성된다. 따라서, 5℃가 아닌 실온에서 DPPC SUVs에 DMPC를 혼합시키면 IF 기술을 방해한다. 그러나, DMPC가 에탄올/DPPC 겔상태가 형성된 후에 샘플에 첨가될 경우에는 실온에서 1:1 DPPC/ DMPC 몰비에서도 상대적으로 큰 DPPC/DMPC IFVs가 형성된다.

DPPC IFVs에 DMPC SUVs 을 Post-gel 상태에서 혼합한다는 것은 도면 20 과21 에 나타낸다. 도면 20에서는 전술한 실시예에서 상술된 과정에 따라 형성된 순수 DPPC IFVs의 평균 내적을 나타낸다. 또한, 표준 IF 기술을 3가지 다른 방식으로 수정된 후에 DPPC/DMPC 1:1 몰비 IFVs가 형성된다. 막대에 "5℃" 및 "RT"로 나타낸 것은 에탄올/지질 겔 상태가 5℃와 실온에서 형성된 DPPC/DMPC 1:1 몰비에서 형성된 IFVs 의 내적을 나타낸다. "post"로 라벨된 것은 "post-gel" 결합 수정법을 사용하여 실온에서 형성된 DPPC/DMPC 1:1 몰비 IFVs 의 내적을 나타낸다.

도면 20 에서 나타낸 결과와 같이, 에탄올에 의해 유도된 DPPC 겔에 DMPC SUVs을 첨가시키면 거대 IFVs이 만들어지는 것이 방해된다. DMPC가 IFVs에 결합되는 것을 설명하기 위해, DPPC/DMPC IFVs의 상전이 특징을 검사한다. 도면 21 은 온도에 대한 함수로써 DPPC, DMPC, DPPC/DMPC IFVs 의 막 유동성을 나타낸다. 막유동성은 Wu와 McConnell 방법에 따라 EPR 프로브 TEMPO로 측정한다. DPPC 및 DMPC IFVs의 겔상태 형성온도는 실온 및 5℃이다. "5℃"로 라벨한 DPPC/DMPC 곡선은 5℃에서 1:1 몰비 SUVs에서 DPPC/DMPC에서 형성된다. "post"로 라벨된 DPPC/DMPC용 DMPC는 에탄올에 의해 유도된 DPPC 겔 상태가 형성된 후에 실온에서 첨가된다. DPPC IFVs에 대한 Tm은 DPPC의 Tm보다 약간 낮은 39℃이다. DPPC와 DMPC는 완전히 겔상태로 혼합된다. DPPC/DMPC 1:1 몰비 IFVs에 상전이 온도는 30℃이다. 이때 겔은 5℃에서 1:1 몰 비 DPPC/DMPC SUVs에서 만들어진다. 이와 같은 상전이온도는 1:1몰이 DPPC/DMPC MLVs의 것과 일치한다. post-gel IF 변형에 의해 만들어지는 DPPC/DMPC IFVs의 Tm은 30℃로 이는 DPPC/DMPC IFVs의 몰비가 1:1이라는 것을 말해주는 것이다. 이는 50-55℃ 배양동안에 대부분의 DMPC SUVs가 DPPC IFVs에 결합된다는 것을 설명하는 것이다.

이상적인 방식으로 혼합되지 않은 인터디지테이션 안 되는 지질도 DPPC IFVs에 혼합될 수도 있다. 도면 22에서 에탄올에 의해 유도된 DPPC 겔이 형성된 후에 콜레스테롤을 샘플에 혼합하여 형성된 DPPC 콜레스테롤 내적을 나타낸다. DPPC/콜레스테롤 IFV에서 회수된 콜레스테롤 몰%에 대한 함수로써 내적을 이 도면에 나타내었다. IFVs에서 콜레스테롤 함량은 방사능 라벨된 콜레스테롤을 이용하여 결정된다. DPPC/콜레스테롤 SUVs에서 형성된 DPPC/콜레스테롤 IFVs의 내적을 도면 22에 비교하였다. 도면 23 에서 post-gel IF 변형을 이용하여, 또는 DPPC/DOPC SUVs를 이용한 표준 IF 기술을 이용하여, DPPC에 인터디지테이션 안 되는 지질 DOPC를 혼합하는 유사실험결과를 나타낸다. DOPC 함량은 방사능 라벨된 DOPC를 이용하여 결정한다. 이 도면에서는 인터디지테이션된 막 쉬트가 형성된 후에 샘플로 인터디지테이션 안 되는 지질의 결합은 혼합된 지질 IFVs의 내적을 상당히 증가시킨다.

post-gel 결합방법에 의해 제 1 지질에서 형성된 인터디지테이션-융합 리포좀으로 결합될 수 있는 제 2 지질은 콜레스테롤, 토코페롤, 계란PC, POPC, DOPC, DMPC, DPPE, 난 PE와 지방산을 포함하나 이에 한정시키지는 않는다. 이들은 실온 이하의 상전이온도(Tm)를 가지는 또는 인터디지테이선 안 된 모든 지질이다. 이 방법에 의해, 90% 지질이 인터디지테이션지질로 형성된 IFVs에 결합될 수 있다. 따라서 제 1 지질 대 제 2 지질의 중량비는 10:90으로 낮다. 한편, 인터디지테이션-융합과정을 간섭하는 제 2 지질량은 제 1 지질의 0.1%로 낮다. 따라서, 제 1 지질 대 제 2 지질의 비는 99.9:0.1 로 높을 수 있다.

본 발명은 여기에서 상술한 특정 구체예로 설명하나, 이는 설명을 위한 것이고 이에 반드시 제한시키는 것은 아니다. 본 기술분야에 숙지된 자는 본 발명의 영역을 벗어나지 않고 수정과 변형이 있음을 인지할 것이다. 따라서, 이와 같은 변화와 수정은 본 발명의 목적과 다음의 청구범위내에 속한다.

Claims (21)

1. 생활성제를 포함하는 인테디지테이션-융합된 겔을 만드는 방법에 있어서,

   -인지질로 구성된 일정 크기의 리포좀을 준비하고, 이때 리포좀의 평균 직경은 약 0.4미크론 미만이 되고;

   -상기 준비된 리포좀을 유체정력학적 압력하에 일정 시간 동안 두어서, 리포좀이 융합되도록 하고, 이때 이용되는 압력은 20,000psi 내지 40,000psi가 되고, 리포좀을 융합시키기 위해 유체정력학적 압력하에 두는 시간은 약 1분 내지 1시간이 되고;

   -리포좀내의 지질들이 서로 인터디지테이션되어, 인테디지테이션-융합된 겔이 만들어지는 것을 특징으로 하는 인터디지테이션-융합된 겔을 만드는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 포화된 인지질은 대칭 아실사슬의 포화 인지질로써 미리스토일 포스파티딜콜린, 디스테아로일 포스파티딜콜린, 디미리스토일 포스파티딜세린, 디팔미토일 포스파티딜세린, 디스테아로일 포스파티딜세린, 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일 포스파티딕산, 디스테아로일 포스파티딕산, 디팔미토일 포스파티딕산, 디미리스토일 포스파티딜이노시톨, 디스테아로일 포스파티딜이노시톨, 디팔미토일 포스파티이노시톨, 수소화된 콩 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜글리세롤, 디-0-헥사데실 포스파티딜콜린, 디스테아로일 포스파티딜글리세롤, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 사용된 리포좀은 포화된 인지질, 불포화된 인지질, 글리코리피드, 글리코스핑고리피드, 스테롤, 알파-토코페롤에서 선택된 인지질로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 이용된 리포좀의 평균 직경은 0.05미크론이하가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 생활성제를 인터디지테이션-융합된 겔에 첨가시키는 방법은 생활성제를 사전에 포집하고 있는 리포좀을 사용하거나, 인터디지테이션-융합된 겔을 만든 후에 생활성제를 첨가시킬 수도 있는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 따른 방법을 이용하여 만들어진 것을 특징으로 하는 생활성제를 포집하고 있는 인터디지테이션-융합된 겔.
7. 생활성제를 포집하고 있는 인터디지테이션-융합된 리포좀을 만드는 방법에 있어서,

   -제1항에 따른 방법에 의해 생성된 인터디지테이션-융합된 겔을 특정온도 하에서 배양하고, 이때 이용되는 온도는 겔상에 있는 인지질의 상전이온도이상의 온도가 되는 것을 특징으로 하는 생활성제를 포집하고 있는 인터디지테이션-융합된 리포좀을 만드는 방법.
8. 제 7 항의 방법에 따라 만들어진 것을 특징으로 하는 생활성제를 포집하고 있는 인터디지테이션-융합된 리포좀.
9. 제 7 항에 있어서, 포집된 생활성제는 항-미생물제, 항-곰팡이제, 항-염증제, 핵산, 요오드화된 방사능 상 대비제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생활성제를 포집하고 있는 인터디지테이션-융합된 리포좀.
10. 제 9 항에 있어서, 생활성제는 요오드화된 방사능 상 대비제이고, 리포좀내에서 요오드에 대한 지질의 중량비는 약 2:1(g/g)이상이 되는 것을 특징으로 하는 생활성제를 포집하고 있는 인터디지테이션-융합된 리포좀.
11. 인테디지테이션-융합된 겔을 만드는 방법에 있어서,

    -포화된 인지질로 구성된 일정 크기의 리포좀을 준비하고, 이때 리포좀의 평균 직경은 약 0.4미크론 미만이 되고;

    -지질이 인터디지테이션 될 수 있도록 유도하는 유도물질하에 리포좀을 약 1분 내지 1시간 동안 두고, 이때 유도물질은 20,000psi 이상의 유체정력학적 압력 또는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-부탄올과 같은 짧은 사슬의 알코올과 같은화학물질 중에서 선택할 수 있고,

    -유도물질에 의해 리포좀내의 지질들이 서로 인터디지테이션되어, 인테디지테이션-융합된 겔이 만들어지는 것을 특징으로 하는 인터디지테이션-융합된 겔을 만드는 방법.
12. 제 11 항에서, 짧은 사슬 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 인터디지테이션-융합 겔을 만드는 방법.
13. 인터디지테이션-융합 겔을 만드는 방법에 있어서,

    -자체적으로 융합을 유도하는 지질은 디-0-헥사데실 포스파티딜콜린(DHPC)과 같은 포화된 인지질로 구성된 일정 크기의 리포좀을 준비하고, 이때 리포좀의 평균 직경은 약 0.4미크론 미만이 되고;

    -지질이 인터디지테이션 될 수 있도록 자체 융합을 유도하는 리포좀을 DHPC의 상 전이 온도 이하에서 약 1분 내지 1시간 동안 두고;

    -리포좀내의 지질들이 서로 인터디지테이션되어, 인테디지테이션-융합된 겔이 만들어지는 것을 특징으로 하는 인터디지테이션-융합된 겔을 만드는 방법.
14. 인터디지테이션-융합된 리포좀을 만드는 방법에 있어서,

    (a)평균 직경이 0.4미크론 미만인 포화된 인지질로 구성된 리포좀과 융합 유도물질로 구성된 조성물을 인지질의 상 전이 온도(Tm)이하의 온도에서 약 1 분 내지 1시간동안 배양하여, 인터디지테이션 융합된 겔을 만들고,

    이때, 이용될 수 있는 유도물질은 짧은 사슬의 알코올, 폴리올, 카오트로픽염(chaotropic salts), 수용성 완충액과 같은 화학물질 또는 20,000psi에서 선택할 수 있으며; 단, 화학적 유도물질이 이용될 경우에는 조성물의 중량에 대해 약 1% 내지 약 50wt%로 포함되고;

    (b) (a) 단계에서 형성된 인터디지테이션-융합된 겔에 생활성제를 첨가하고; 이때 첨가되는 생활성제는 항-미생물제, 항-곰팡이제, 항-염증제, 핵산 등에서 선택될 수 있으며;

    (c) (b)단계에서 형성된 인터디지테이션-융합 겔을 약 1 분 내지 1 시간동안 포화된 인지질의 상 전이 온도 이상의 온도에서 배양시켜, 인터디지테이션 융합된 겔로부터 인터디지테이션 융합된 리포좀이 형성되는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 인터디지테이션-융합된 리포좀을 만드는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, (a) 단계는 실온에서 배양이 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 14 항에 있어서, (a) 단계의 리포좀의 평균 직경은 약 0.05미크론인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 14 항에 있어서, (a) 단계의 리포좀의 평균 직경은 약 0.025미크론인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 14 항에 있어서, 포화된 인지질은 미리스토일 포스파티딜콜린, 디스테아로일 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜세린, 디미리스토일 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜세린, 디스테아로일 포스파티딜세린, 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일 포스파티딕산, 디스테아로일 포스파티딕산, 디팔미토일 포스파티딕산, 디미리스토일 포스파티딜이노시톨, 디스테아로일 포스파티딜이노시톨, 디팔미토일 포스파티이노시톨, 수소화된 콩 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜글리세롤, 디스테아로일 포스파티딜글리세롤, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 14 항에 있어서, 유도물질은 에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 인터디지테이션-융합된 리포좀을 만드는 방법에 있어서,

    (a)평균 직경이 0.4미크론 미만이고, 디-O-헥사데실 포스파티딜콜린과 같은 자체 융합이 유도되는 포화된 인지질로 구성된 리포좀 조성물을 DHPC의 상 전이 온도 이하에서 약 1 분 내지 1시간동안 배양하여, 인터디지테이션 융합된 겔을 만들고,

    (b) (a)단계에서 형성된 인터디지테이션-융합 겔을 약 1 분 내지 1 시간동안DHPC의 상 전이 온도 이상의 온도에서 배양시켜, 인터디지테이션 융합된 겔로부터 인터디지테이션 융합된 리포좀이 형성되는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 인터디지테이션-융합된 리포좀을 만드는 방법.
21. 제 14 항에 있어서, 압력은 40,000psi인 것을 특징으로 하는 방법.